KR100960063B1 - 누블라스틴의 중합체 컨쥬게이트 및 이의 사용 방법 - Google Patents

누블라스틴의 중합체 컨쥬게이트 및 이의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폴리알킬렌 글리콜 부분을 함유하는 중합체에 커플링된 변이체 누블라스틴 폴리펩티드를 포함하는 컨쥬게이트를 형성하기에 적합한 변이체 누블라스틴 폴리펩티드에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 컨쥬게이트는 변형되지 않거나 야생형 누블라스틴에 비해 연장된 생체이용률, 연장된 생물학적 활성을 보유한다. 본 발명의 컨쥬게이트는 치료적 용도뿐 아니라, 비치료적 용도, 예를 들어 진단 용도로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

누블라스틴의 중합체 컨쥬게이트 및 이의 사용 방법{POLYMER CONJUGATES OF NEUBLASTIN AND METHODS OF USING SAME}
본 발명은 일반적으로 폴리펩티드에 관한 것이며, 구체적으로 신경영양성 폴리펩티드 및 이들 변형된 폴리펩티드를 이용하는 방법에 관한 것이다.
신경영양성 인자는 신경 세포 및 조직의 생존을 촉진하고, 표현형 분화를 유지하고, 퇴화를 예방하며, 활성을 증강시키는 자연 발생 단백질이다. 신경영양성 인자는 신경 조직 및 신경계에 의해 자극받는 비신경 조직으로부터 분리되며, 기능적으로 또한 구조적으로 관련된 군, 즉 패밀리, 수퍼패밀리 또는 서브패밀리라 칭하는 군으로 분류되어 왔다. 신경영양성 인자 중 수퍼패밀리는 섬유아세포 성장 인자, 뉴로트로핀 및 전환 성장 인자-β(TGF-β) 수퍼패밀리이다. 신경영양성 인자의 개개의 종은 그들의 물리적인 구조, 그들의 동종 수용체와 그들의 상호작용, 및 여러 유형의 신경 세포에 대한 그들의 영향에 의해 구분된다. TGF-β 수퍼패밀리로 분류된 것으로는 신경교 세포주 유도된 신경영양성 인자(GDNF) 리간드가 있는데, 이는 GDNF, 페르세핀(PSP) 및 누르투린(NTN)을 포함한다.
GDNF 수퍼패밀리의 리간드는 RET 수용체 티로신 키나제를 통한 신호전달을 유도할 수 있는 능력을 공통적으로 보유한다. GDNF 수퍼패밀리의 이들 3개의 리간드는 임의의 신경영양성 수용체 패밀리, 즉 GFRα수용체에 대한 그들의 상대적인 친화성이 다르다.
최근에 기술된 신경영양성 인자는 "누블라스틴(neublastin)" 또는 "NBN"이다. 누블라스틴은 GDNF 서브패밀리로 분류되는데, 그 이유는 RET에 결합하여 이를 활성화시킬 수 있는 그들의 능력 때문이다. 다른 GDNF 리간드와는 달리, 누블라스틴은 GFRα3-RET 수용체 복합체에 매우 선택적이다. 또한, NBN은 그의 아미노산 서열내에 독특한 서브영역을 보유하고 있다.
안타깝게도, 누블라스틴은 신체로부터 신속하게 제거(clear)된다. 이러한 신속한 제거는 치료적 용도로 누블라스틴을 사용하는 길을 막아버린다. 따라서, 생체이용률이 증가된 변이체 누블라스틴(variant neublastin)을 동정할 필요가 있다.
발명의 개요
본 발명은 신규한 형태의 누블라스틴의 발견에 부분적으로 기초하는데, 발견된 신규한 누블라스틴은 생체 내에서 증강된 약동학적 특성 및 생체이용 특성을 나타낸다. 이들 신규한 형태는 중합체 분자에 컨쥬게이션된 변이체 누블라스틴 폴리펩티드를 포함한다.
한 관점에서, 본 발명은 변이체 누블라스틴 폴리펩티드 또는 뮤테인 누블라스틴 폴리펩티드에 관한 것인데, 이들은 성숙 누블라스틴 이량체의 용매 노출된 위 치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 치환은 자연 발생(천연) 중합체 또는 합성 중합체와 같은 물질이 상기 폴리펩티드에 부착하여 생체 내에서 그의 용해도를 증강시킴으로써 그의 생체이용률을 증강시키는 하나 이상의 위치에서 천연 누블라스틴 폴리펩티드 내에 도입된다. 본 발명의 변이체 폴리펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 8-113과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 상기 변이체 누블라스틴 폴리펩티드는 상기 변이체 폴리펩티드의 아미노산 서열의 14번 위치에서의 아르기닌 이외의 아미노산, 상기 변이체 폴리펩티드의 아미노산 서열의 39번 위치에서의 아르기닌 이외의 아미노산, 상기 변이체 폴리펩티드의 68번 위치에서의 아르기닌 이외의 아미노산, 및 상기 변이체 폴리펩티드의 95번 위치에서의 아스파라긴 이외의 아미노산(이 때, 상기 아미노산의 위치는 서열 번호 1의 폴리펩티드 서열에 상응하도록 번호를 부여한 것임)으로 구성되는 아미노산 치환 중 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
본원에 사용한 용어 "야생형 누블라스틴" 또는 "wt-NBN"은 래트, 마우스 또는 인간 누블라스틴(참조: 서열 번호 2, 3 또는 4)과 같은 자연 발생 또는 천연 누블라스틴 폴리펩티드 서열을 의미한다. 본원에서, 특이적인 변이체 누블라스틴 폴리펩티드는 "NBN-X1N1X2" 또는 "X1N1X2-NBN"이라 칭하는데, 이 때 X1은 야생형 누블라스틴 폴리펩티드의 아미노산을 의미하고, N1은 서열 번호 1의 번호 부여 체계를 이용하여 서열 내에서 X1 아미노산의 위치를 의미한다. X2는 서열내 지정된 위치에서 야생형 아미노산을 치환시킨 아미노산을 의미한다. 따라서, 예를 들어, NBN-N95K는 95번 위치의 아스파라긴이 라이신으로 치환된 변이체 누블라스틴 폴리펩티드를 의미한다.
변이체 누블라스틴 폴리펩티드는 다량체 폴리펩티드로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 변이체 누블라스틴 폴리펩티드는 하나 이상의 변이체 누블라스틴 폴리펩티드를 포함하는 이량체로서 제공될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 이량체는 변이체 누블라스틴 폴리펩티드의 동종이량체이다. 다른 구체예에서, 이량체는 하나의 변이체 누블라스틴 폴리펩티드와 하나의 야생형 누블라스틴 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체이다. 다른 이량체는 2개의 상이한 변이체 누블라스틴 폴리펩티드 형태를 포함할 수 있다.
몇몇 구체예에서, 변이체 누블라스틴 폴리펩티드는 아미노산 8-113 이외에 서열 번호 1의 아미노산 1-7을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 변이체 누블라스틴 폴리펩티드는, 이량체화되는 경우, GFRα3에 결합한다. 추가의 바람직한 구체예에서, 변이체 누블라스틴 폴리펩티드는, 이량체화되는 경우, 그 자신 또는 GFRα3에 결합되는 경우 RET 폴리펩티드의 티로신 인산화를 자극한다.
다른 바람직한 구체예에서, 변이체 누블라스틴 폴리펩티드는, 이량체화되는 경우, 뉴런 생존, 예를 들어 감각 뉴런의 생존을 증강시킨다.
다른 바람직한 구체예에서, 변이체 누블라스틴 폴리펩티드는, 이량체화되는 경우, 감각 뉴런과 같은 뉴런의 병리학적 변화를 정상화시킨다.
추가의 바람직한 구체예에서, 변이체 누블라스틴 폴리펩티드는, 이량체화되 는 경우, 뉴런의 생존, 예를 들어 운동 뉴런 또는 도파민 민감성 뉴런의 생존을 증강시킨다.
몇몇 구체예에서, 상기 변이체 폴리펩티드는 상기 변이체 폴리펩티드의 아미노산 서열의 14번 위치에서의 아르기닌 이외의 아미노산, 상기 변이체 폴리펩티드의 아미노산 서열의 39번 위치에서의 아르기닌 이외의 아미노산, 상기 변이체 폴리펩티드의 68번 위치에서의 아르기닌 이외의 아미노산, 및 상기 변이체 폴리펩티드의 95번 위치에서의 아스파라긴 이외의 아미노산으로 구성되는 아미노산 치환으로부터 선택되는 두개, 세개 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 14번 위치, 39번 위치, 68번 위치 및 95번 위치 중 하나 이상의 위치의 아미노산은 라이신이다.
상기 변이체 누블라스틴 폴리펩티드의 아미노산 8-94 및 96-113은 서열 번호 1의 8-94 및 96-113은 서열 번호 1의 아미노산 8-94 및 96-113과 동일한 것이 바람직하다. 상기 아미노산 서열은 거기에 95% 이상 동일한 것이 더 바람직하다. 상기 변이체 누블라스틴 폴리펩티드의 아미노산 서열은 변이체 누블라스틴 폴리펩티드의 아미노산 8-94 및 96-113에서 자연 발생하는 래트, 인간 또는 마우스 누블라스틴 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 것이 가장 바람직하다. 예를 들어, 변이체 누블라스틴 폴리펩티드의 아미노산 8-94 및 96-113은 서열 번호 2, 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 8-94 및 96-113의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 변이체 누블라스틴 폴리펩티드 또는 야생형 누블라스틴 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 2개의 누블라스틴 융합 단백질의 이량체인 단백질을 제공한다. 또한, 누블라스틴 융합 단백질은 생체 내에서 약동학적 특성 및 생체이용 특성을 증강시킨다.
다른 관점에서, 본 발명은 변이체 누블라스틴 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 상기 변이체 누블라스틴 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 벡터, 예를 들어 발현 벡터 내에 제공되는 것이 바람직하다. 변이체 누블라스틴 핵산 또는 이를 포함하는 벡터는 세포 내에 제공될 수 있다. 상기 세포는, 예를 들어 포유동물 세포, 진균 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포일 수 있다. 바람직한 포유동물 세포는 차이니즈 햄스터 난소 세포("CHO 세포")이다.
또한, 본 발명은 변이체 누블라스틴 폴리펩티드의 발현이 가능한 조건 하에서 변이체 누블라스틴 핵산을 암호화하는 핵산을 함유하는 세포를 배양함으로써 변이체 누블라스틴 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다. 이어서, 필요하다면, 변이체 누블라스틴 폴리펩티드를 회수할 수 있다. 본 발명은 상기 세포에 의해 제조된 변이체 누블라스틴 폴리펩티드를 더 포함한다. 유사한 핵산, 벡터, 숙주 세포 및 폴리펩티드 제조 방법은 본 발명의 융합 단백질(예를 들어, 누블라스틴-혈청 알부민 융합 단백질)을 위해 기술한 것이다.
또한, 본 발명은 비-천연 발생 중합체에 커플링된 누블라스틴 폴리펩티드 또는 변이체 누블라스틴 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물 내의 변이체 누블라스틴 폴리펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 8-113에 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직한데, 단 상기 변이체 누블라스틴 폴리펩티드는 상기 변이체 폴리펩티드의 아미노산 서열의 14번 위치에서의 아르기닌 이 외의 아미노산, 상기 변이체 폴리펩티드의 아미노산 서열의 39번 위치에서의 아르기닌 이외의 아미노산, 상기 변이체 폴리펩티드의 68번 위치에서의 아르기닌 이외의 아미노산, 및 상기 변이체 폴리펩티드의 95번 위치에서의 아스파라긴 이외의 아미노산(이 때, 상기 아미노산의 위치는 서열 번호 1의 폴리펩티드 서열에 상응하도록 번호를 부여한 것임)으로 구성되는 아미노산 치환 중 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 상기 중합체는 폴리알킬렌 글리콜 부분, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 부분(PEG)을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 상기 폴리알킬렌 글리콜 부분은 누블라스틴 폴리펩티드의 아민기, 또는 변이체 누블라스틴 폴리펩티드내의 라이신에 커플링된다.
커플링은 N-히드록실석신이미드(NHS) 활성 에스테르에 의해 이루질 수 있다. 활성 에스테르는 예를 들어 PEG 석신이미딜 석시네이트(SS-PEG), 석신이미딜 부티레이트(SPB-PEG) 또는 석신이미딜 프로피오네이트(SPA-PEG)일 수 있다.
상기 폴리알킬렌 글리콜 부분은 예를 들어, 카르복시메틸-NHS, 노르루신-NHS, SC-PEG, 트레실레이트, 알데히드, 에폭사이드, 카르보닐이미다졸, 또는 PNP 카르보네이트일 수 있다.
몇몇 구체예에서, 폴리알킬렌 글리콜 부분은 누블라스틴 폴리펩티드 또는 변이체 누블라스틴 폴리펩티드의 시스테인기에 커플링된다. 예를 들어, 커플링은 말레이미드기, 비닐설폰기, 할로아세테이트기 및 티올기에 의해 이루어질 수 있다.
몇몇 구체예에서, 상기 조성물 내 누블라스틴 폴리펩티드 또는 변이체 누블 라스틴 폴리펩티드는 글리코실화된다. 상기 누블라스틴 폴리펩티드 또는 변이체 폴리펩티드가 글리코실화되는 경우, 상기 중합체는 글리코실화된 누블라스틴 폴리펩티드 또는 변이체 누블라스틴 폴리펩티드의 탄수화물 부분에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 상기 중합체는 상기 글리코실화된 누블라스틴 폴리펩티드 또는 변이체 누블라스틴 폴리펩티드의 히드라졸기 또는 아미노기의 산화, 또는 상기 중합체의 반응성 기의 산화후, 글리코실화된 누블라스틴 폴리펩티드 또는 변이체 누블라스틴 폴리펩티드에 커플링될 수 있다.
다양한 구체예에서, 상기 누블라스틴 폴리펩티드 또는 변이체 누블라스틴 폴리펩티드는 한개, 두개, 세개 또는 네개의 PEG 부분을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 누블라스틴 폴리펩티드, 변이체 누블라스틴 폴리펩티드 또는 중합체 컨쥬게이트는 중합체 부재하의 폴리펩티드 또는 변이체 폴리펩티드의 반감기에 비해 더 긴 혈청 반감기를 보유한다.
바람직한 구체예에서, 복합체내의 누블라스틴 폴리펩티드, 변이체 누블라스틴 폴리펩티드 또는 중합체 컨쥬게이트는 GFRα3 결합, RET 활성화, 뉴런의 병리학적 변화의 정상화 또는 뉴런 생존의 증강으로 구성되는 군으로부터 선택되는 생리학적 활성을 보유한다.
본원에서 사용한 용어 "뉴런의 병리학적 변화의 정상화"는 본 발명의 컨쥬게이트가 하기하는 세포 파라미터, 즉 신경영양성 인자 수용체, 이온 채널, 신경전달물질 또는 구조 단백질의 발현 수준 중 하나 이상에서 변화를 유발하거나, 또는 세포 형태에서 변화를 유발함을 의미하는데, 각각의 경우에서, 질병, 퇴행, 손상 또 는 장애에 의해 영향받지 않은 동일한 또는 유사한 표현형의 뉴런에서의 수준으로 상기 파라미터의 변화를 실질적으로 회복시키기 위한 것이다. 뉴런의 병리학적 변화의 정상화는 면역조직학적으로 모니터링하거나, 또는 분비되거나 쉐딩된 세포성 생성물의 수준 변화를 평가하거나, 영향받은 뉴런(들)의 기능에 생리학적으로 기여할 수 있는 거동의 생체내 변화를 평가함으로써 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 신경장애성 통증 증후군과 관련된 병리학적 변화의 경우, 통증 거동, 예를 들어 통증에 대한 반응 증가증(hyperalgesia), 통증에 대한 반응 감소증(hypoalgesia) 또는 이질통을 모니터링할 수 있다.
본원에 사용한 용어 "뉴런 생존을 증강시키는"이란 용어는 본 발명의 누블라스틴 컨쥬게이트 또는 융합 단백질로 처리하지 않은, 동일한 유형의 질병, 질환, 손상 또는 장애에 의해 영향받은 상응하는 뉴런에서 관찰된 생존 기간 이상으로 영향받은 뉴런의 생존 기간을 연장시킴을 의미한다.
몇몇 구체예에서, 중합체는 N 말단인 누블라스틴 상의 임의의 위치에서 폴리펩티드에 커플링된다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체는 누블라스틴 폴리펩티드 또는 변이체 누블라스틴 폴리펩티드의 비말단 아미노산내 임의의 위치에서 상기 폴리펩티드에 커플링된다.
바람직한 구체예에서, 상기 중합체는 누블라스틴 폴리펩티드 또는 변이체 누블라스틴 폴리펩티드의 용매 노출된 아미노산에 커플링된다.
바람직한 구체예에서, 상기 중합체는 상기 변이체 폴리펩티드의 아미노산 서열의 14번 위치에서의 아르기닌 이외의 아미노산, 상기 변이체 폴리펩티드의 아미 노산 서열의 39번 위치에서의 아르기닌 이외의 아미노산, 상기 변이체 폴리펩티드의 68번 위치에서의 아르기닌 이외의 아미노산, 및 상기 변이체 폴리펩티드의 95번 위치에서의 아스파라긴 이외의 아미노산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기에서 누블라스틴 폴리펩티드 또는 변이체 누블라스틴 폴리펩티드에 커플링된다.
또한, 본 발명은 본 발명의 누블라스틴 폴리펩티드, 변이체 누블라스틴 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트를 함유하거나, 내부에 분산된 생리적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
추가의 관점에서, 본 발명은 안정한 수용성의 컨쥬게이션된 누블라스틴 폴리펩티드 또는 변이체 누블라스틴 폴리펩티드 복합체를 제공하는데, 이는 폴리에틸렌 글리콜 부분에 커플링된 이량체성 누블라스틴 폴리펩티드 또는 이량체성 변이체 누블라스틴 폴리펩티드를 포함하며, 상기 누블라스틴 폴리펩티드 또는 변이체 누블라스틴 폴리펩티드는 불안정한 결합에 의해 폴리에틸렌 글리콜 부분에 커플링되어 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 불안정한 결합은 생화학적 가수분해, 단백질분해 또는 설프히드릴 절단에 의해 절단될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 불안정한 결합은 생체내 조건 하에서 절단될 수 있다.
또한, 본 발명은 야생형 누블라스틴에 비해 시험관내 또는 생체내에서 연장된 활성을 보유하는 변형된(modified) 누블라스틴 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공하는데, 이는 누블라스틴 폴리펩티드 또는 변이체 누블라스틴 폴리펩티드를 제공하는 단계 및 상기 폴리펩티드 또는 변형된 변이체 누블라스틴 폴리펩티드를 비-천연 발생 중합체 부분에 커플링시킴으로써 커플링된 중합체 누블라스틴 폴리펩티 드 조성물을 형성하는 단계를 포함한다.
추가의 관점에서, 본 발명은 개체(예를 들어, 인간)에서 신경계 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 치료가 필요한 개체에게 치료 유효량의 변이체 누블라스틴 폴리펩티드, 중합체에 커플링된 누블라스틴 폴리펩티드 또는 변이체 누블라스틴 폴리펩티드를 함유하는 조성물, 또는 폴리에티렌 글리콜 부분에 커플링된 누블라스틴 폴리펩티드 또는 변이체 누블라스틴 폴리펩티드를 포함하는 안정한 수용성의 컨쥬게이션된 누블라스틴 폴리펩티드 또는 변이체 누블라스틴 폴리펩티드 복합체를 포함하는 복합체를 투여하는 단계를 포함한다.
신경계 질환은 말초 신경 질환, 예를 들어 말초 신경장애 또는 신경장애성 통증 증후군인 것이 바람직하다. 치료가 바람직한 개체는 인간이다.
투여는 예를 들어 전신 투여할 수도 있고 국소 투여할 수도 있다.
특별한 언급이 없으면, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 학술 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자가 공통적으로 이해하는 것과 동일한 의미이다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있음에도 불구하고, 적합한 방법 및 물질을 후술하였다. 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 본원에 전적으로 참고로 인용한 것임을 밝혀둔다. 상충되는 경우에는, 정의를 포함하는 본원 명세서를 통해 조절될 것이다. 또한, 물질, 방법 및 예들은 단지 예시적인 것이며, 이로써 권리로서 청구하는 범위를 제한하려는 의도는 없다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 후술하는 상세한 설명 및 특허청구의 범위에 의해 명백해질 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 신규한 변이체 누블라스틴 폴리펩티드를 제공하는데, 그들을 변형시켜 그들의 약동학적 특성 및 생체이용 특성을 증강시킬 수 있다. 바람직한 변이체 누블라스틴 폴리펩티드는 폴리알킬렌 글리콜 중합체와 같은 중합체 제제에 대한 커플링을 용이하게 하는 아미노산 서열이 변경된다.
변이체 누블라스틴 폴리펩티드
본 발명은 야생형 누블라스틴 폴리펩티드 서열과 관련된 변이체 아미노산 서열을 보유하는 누블라스틴 폴리펩티드를 제공한다. 인간 및 마우스 누블라스틴 폴리펩티드의 아미노산 서열은 WO00/01815호에 개시되어 있다. 본 발명에 따른 변이체 누블라스틴 폴리펩티드의 예는 하기 표 1에 제시하였다.
변이체 누블라스틴 폴리펩티드의 변경된 잔기는 변형된 아미노산의 위치에서 폴리알킬렌 글리콜 중합체와 같은 중합체의 커플링을 용이하게 하기 위해 선택하는 것이 바람직하다. 누블라스틴 폴리펩티드의 바람직한 변형 부위는 누블라스틴 폴리펩티드의 용매 접근가능한 영역이다. 이러한 부위는 관련된 신경영양성 인자, GDNF의 결정 구조{결정 구조는 문헌[참조: Nat. Struct. Biol. 4: 435-38 (1997)]에 기술되어 있음}의 고찰에 기초하여 선택할 수 있다. 또한, 상기 부위는 페르세핀/누블라스틴 키메라 단백질에 대해 제공된 구조-기능 정보에 기초하여 선택할 수 있다. 이들 키메라는 문헌[참조: J. Biol. Chem. 275:3412-20 (2000)]에 기술되어 있 다. 상기 방법을 통해 확인된 용매 접근가능하거나 표면 노출된 누블라스틴 아미노산의 예시적인 목록은 하기 표 2에 제시되어 있다.
본 발명은 하기 표 1에 나타낸 서열 번호 1의 아미노산 8-113에 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 폴리펩티드 서열에서 14번, 39번, 68번에서 하나 이상의 아르기닌 또는 95번 위치에서의 아스파라긴은 아르기닌 또는 아스파라긴 이외의 아미노산으로 치환된다. 야생형 아미노산은 라이신 또는 시스테인으로 치환되는 것이 바람직하다.
Figure 112009033673780-pat00001
Figure 112009033673780-pat00002
이 때,
Xaa1은 Gly 또는 Thr이다.
Xaa2는 Pro 또는 Arg이다.
Xaa3은 Gly 또는 Ser이다.
Xaa4는 Ala 또는 Thr이다.
Xaa5는 Ala 또는 Thr이다.
Xaa6은 Gly 또는 Asp이다.
Xaa7은 Arg 또는 Ser이다.
Xaa8은 Arg 또는 Ser이다.
Xaa9는 Val 또는 Ile이다.
Xaa10은 Pro 또는 Gln이다.
Xaa11은 Pro 또는 Ser이다.
Xaa12는 Val 또는 Ile이다.
Xaa13은 Arg 또는 His이다.
표 2는 표면 노출될 것으로 예상되는 인간 누블라스틴내 잔기 목록 및 번호를 제공한다. 표면 노출된 잔기는 사슬 A 및 B(PDB 코드 1AGQ)에 의해 형성된 래트 GDNF 이량체의 구조를 조사하고, 잔기가 상기 구조의 표면 상에 존재하는가 여부를 결정함으로써 결정한다. 이어서, 이 구조는 문헌[참조: Baloh 등, Neuron, vol 21, pg 1291 (1998)]의 GDNF 및 누블라스틴의 서열 정렬과 비교하여 누블라스틴내 적합한 잔기를 결정한다. 번호 부여 체계는 표 1에 나타낸 바와 같다.
Figure 112008065235340-pat00003
Figure 112008065235340-pat00004
n/a는 GDNF 내에 잔기가 존재하지 않음을 나타낸다. 이는 GDNF(잔기 68-71)과 비교하여 누블라스틴내 구성물 설계, 유연한 영역, 또는 삽입부중 하나에 기인한다.
-는 잔기가 매몰되어 있고, 표면상에 존재하지 않거나 이황화 결합에 관련된 시스테인 잔기를 의미한다. 이 단백질이 시스테인 노트이기 때문에, 대다수의 잔기는 표면 상에 존재한다.
+는 이 잔기가 GDNF 구조에서 표면 노출됨을 나타내는데, 따라서 잔기 66-75를 함유하는 루프가 단지 GDNF 단량체중 하나(아마도 유연한 단량체)에서만 볼 수 있음에도 불구하고, 누블라스틴에서 표면 노출될 것으로 생각된다. 또한, 이 루프는 GDNF에 비해 누블라스틴내 4개 잔기의 삽입물을 함유한다.
본원에 사용한 용어 "동일성" 및 "상동적" 또는 "상동성"은 호환가능하게 사용되며, 2개의 폴리펩티드, 분자 또는 두개의 핵산 사이의 서열 유사성을 의미한다. 두개의 비교된 서열내 임의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 다량체 서브유닛에 의해 점유되는 경우(예를 들어, 두개의 DNA 분자 각각에서 임의 위치가 아데닌에 의해 점유되거나, 두개의 폴리펩티드 각각에서 임의 위치가 라이신에 의해 점유되는 경우), 각각의 분자는 그 위치에서 상동적이라 칭한다. 두 서열 간의 상동성(%)은 비교된 위치의 수로 두 서열에 의해 공유된 매칭 또는 상동적 위치의 수를 나누어 얻어진 값에 100을 곱하면 얻을 수 있다. 예를 들어, 두 서열에서 10개의 위치중 6개의 위치가 매칭되거나 상동적인 경우, 두 서열간의 상동성은 60%이다. 예를 들어, DNA 서열 CTGACT 및 CAGGTT는 50%의 상동성을 공유한다(총 6개의 위치중 3개의 위치가 매칭됨). 일반적으로, 두 서열을 정렬시키는 경우, 최대 상동성이 얻어진다. 이러한 정렬은 예를 들어, 문헌[참조: Needleman 등, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)]의 방법을 이용하고, 정렬 프로그램(DNA스타, 인크)과 같은 컴퓨터 프로그램에 의해 용이하게 실행할 수 있다. "유사한" 서열은, 유사한 잔기가 정렬된 참조 서열내 상응하는 아미노산 잔기에 대한 상보적 치환인 경우 또는 "허용된 점 돌연변이"의 경우, 정렬시 동일하거나 유사한 아미노산 잔기를 공유하는 것이다. 이 관점에서, 참조 서열내 잔기의 "보존적 치환"은 예를 들어, 유사한 크기, 형태, 전하, 화학적 특성(공유결합 또는 수소결합을 형성할 수 있는 능력) 등을 갖는 상응하는 참조 잔기에 물리적으로 또는 기능적으로 유사한 잔기에 의한 치환이다. 따라서, "보존적 치환 변이체" 서열은 하나 이상의 보존적 치환 또는 허용된 점 돌연변이가 존재하는 야생형 서열 또는 참조서열과 다른 서열이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 8-113에 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다. 몇몇 구체예에서, 변이체 누블라스틴 폴리펩티드의 아미노산 서열은 변이체 누블라스틴 폴리펩티드의 아미노산 1-94 및 96-113에서 자연 발생하는 래트, 인간 또는 마우스 누블라스틴 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는데, 예를 들어 상기 폴리페티드는 이들 위치에서 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함한다.
서열 번호 1 내지 4에 개시된 것과 서열에서 차이가 나는 변이체 누블라스틴 폴리펩티드는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 대안으로, 또는 추가로, 상기 변이체 누블라스틴 폴리펩티드는 하나 이상의 비보존적 아미노산 치환, 또는 결실 또는 삽입에 의해 차이가 난다. 상기 치환, 결실 또는 삽입은 분리된 단백질의 생물학적 활성을 상실시키지 않는 것이 바람직하다.
보존적 치환은 전형적으로 하기 군내의 치환과 같이 한 아미노산의 유사한 특성을 가진 다른 아미노산으로의 치환을 포함한다: 발린, 알라닌 및 글리신; 루신, 발린 및 이소루신; 아스파르트산 및 글루탐산; 아스파라긴 및 글루타민; 세린, 시스테인 및 트레오닌; 라이신 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 티로신. 비극성의 소수성 아미노산은 알라닌, 루신, 이소루신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성의 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 상기한 극성, 염기성 또는 산성 기중 한 구성원의 동일한 군내의 다른 구성원으로의 치환은 보존적 치환으로 간주할 수 있다.
다른 치환은 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 알라닌의 경우, 치환은 D-알라닌, 글리신, 베타-알라닌, L-시스테인 및 D-시스테인중 하나로부터 수행할 수 있다. 라이신의 경우, 치환은 D-라이신, 아르기닌, D-아르기닌, 호모아르기닌, 메티오닌, D-메티오닌, 오르니틴 또는 D-오르니틴중 임의의 하나일 수 있다. 일반적으로, 분리된 폴리펩티드의 특성에 변화를 유발할 것으로 예상될 수 있는 기증적으로 중요한 영역에서의 치환은 (i) 극성 잔기, 예를 들어 세린 또는 트레오닌의 소수성 잔기, 예를 들어 루신, 이소루신, 페닐알라닌 또는 알라닌으로의 치환(또는 상기한 치환의 역치환); (ii) 시스테인 잔기의 임의의 다른 잔기로의 치환(또는 상기한 치환의 역치환); (iii) 전기적으로 양성인 측쇄를 보유하는 잔기, 예를 들어 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘의 전기적으로 음성인 측쇄를 보유하는 잔기, 예를 들어 글루탐산 또는 아스파르트산으로의 치환(또는 상기한 치환의 역치환); 또는 (iv) 대형 측쇄를 보유하는 잔기, 예를 들어 페닐알라닌의 그러한 측쇄를 보유하지 않은 아미노산, 예를 들어 글리신으로의 치환(또는 상기한 치환의 역치환)이다. 아마도 상기한 비보존적 치환 중 한 치환이 단백질의 기능적 특성을 변경시킬 수 있는 가능성은 단백질의 기능적으로 중요한 영역과 관련된 치환의 위치와 관련되어 있을 수 있으며; 따라서, 몇몇 비보존적 치환은 생물학적 특성에 영향을 거의 미치지 않거나, 미치지 않는다.
또한, 본 발명에 따라 변이체 누블라스틴 폴리펩티드를 포함하는 다량체성 폴리펩티드가 제공된다. 다량체성 폴리펩티드는 정제된 다량체성 폴리펩티드로 제공되는 것이 바람직하다. 다량체성 폴리펩티드의 예로는 이량체성 복합체를 들 수 있다. 다량체 복합체는 이종체성(heteromeric) 복합체 또는 동종체성(homomeric) 복합체로 제공될 수 있다. 따라서, 다량체성 복합체는 하나의 변이체 누블라스틴 폴리펩티드 및 하나의 비변이체 누블라스틴 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체성 복합체 또는 2개 이상의 변이체 누블라스틴 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체성 복합체일 수 있다.
몇몇 구체예에서, 변이체 누블라스틴 폴리펩티드는 GFRα3을 결합한다. 변이체 누블라스틴 폴리펩티드의 결합은 RET 폴리펩티드의 인산화를 자극하는 것이 바람직하다. 폴리펩티드가 GFRα3을 결합하는 지 여부를 결정하기 위해, WO00/01815호에 기재된 바와 같이 분석을 수행하였다. 예를 들어, CHO 세포주 상청액의 배지 내에 누블라스틴의 존재는 문헌[참조: Sanicola 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 6238 (1997)]에 기술된 바와 같은 삼원 복합 분석의 변형된 형태를 이용하여 기술할 수 있다. 이 분석에서, GDNF-유사 분자의 능력은 RET의 외세포성 도메인과 여러가지 보조 수용체, GFRα1, GFRα2 및 GFRα3 사이의 결합을 매개할 수 있는 그들의 능력에 대해 평가할 수 있다. 가용형 RET 및 보조 수용체는 융합 단백질로서 생성된다. 래트 RET의 외세포성 도메인과 태반 알카리성 포스파타제 사이의 융합 단백질(RET-AP) 및 GFRα-1(본원에 참고 인용한 WO97/44356호(1997.11.27)에 개시됨)과 IgG1(rGFR(α1-Ig) 사이의 융합 단백질이 개시되어 있다[참조: Sanicola 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 6238 (1997)].
몇몇 구체예에서, 변이체 누블라스틴 폴리펩티드는 뉴런의 생존을 증강시키거나, 뉴런의 병리학적 변화를 정상화시기거나, 상기 두가지 역할 모두를 수행한다. 폴리펩티드가 뉴런의 생존을 증강시키거나 뉴런의 병리학적 변화를 정상화시키는지 여부를 결정하기 위한 분석법은 예를 들어 WO00/01815호에 기재되어 있다. 뉴런은 감각 뉴런, 운동 뉴런 또는 도파민 민감성 뉴런이 바람직하다.
변이체 누블라스틴 폴리펩티드의 합성 및 분리
변이체 누블라스틴 폴리펩티드는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 분리할 수 있다. 자연 발생 누블라스틴 폴리펩티드는 표준 단백질 정제 기법을 이용하는 적합한 정제 계획에 의해 세포 또는 조직 공급원으로부터 분리할 수 있다. 대안으로, 변이체 누블라스틴 폴리펩티드는 표준 펩티드 합성 기법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 짧은 아미노산 서열의 합성은 펩티드 기술 분야에 잘 알려져 있다[참조: 예를 들어, Stewart 등, Solid Phase Peptide Synthesis(2판, 1984)].
다른 구체예에서, 변이체 누블라스틴 폴리펩티드는 재조합 DNA 기법에 의해 생성된다. 예를 들어, 변이체 누블라스틴 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자는 벡터, 예를 들어 발현 벡터 내로 삽입될 수 있고, 상기 핵산은 세포내로 도입될 수 있다. 적합한 세포로는 예를 들어, 포유동물 세포(예를 들어, 인간 세포 또는 차이니즈 햄스터 난소 세포), 진균 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 및 박테리아 세포를 들 수 있다. 재조합 세포에서 발현되는 경우, 세포는 변이체 누블라스틴 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는 조건 하에서 배양시키는 것이 바람직하다. 변이체 누블라스틴 폴리펩티드는 필요에 따라 세포 현탁액으로부터 회수할 수 있다. 본원에 사용한 용어 "회수(된)"는 변이체 폴리펩티드를 세포 또는 배양 배지의 그들 성분으로부터 제거함을 의미하는데, 회수 과정 이전에 상기 배지에는 변이체 폴리펩티드가 존재하고 있다. 회수 과정은 하나 이상의 리폴딩 단계 또는 정제 단계를 포함할 수 있다.
변이체 누블라스틴 폴리펩티드는 당업계에 공지된 임의의 몇가지 방법을 이용하여 구성할 수 있다. 한가지 방법은 위치 지정 돌연변이유발법인데, 이 방법에서 특정 뉴클레오티드(또는 필요에 따라 소수의 특정 뉴클레오티드)가 변경되어 암호화된 누블라스틴 폴리펩티드내 단일 아미노산(또는 필요에 따라 소수의 미리정해진 아미노산 잔기)을 변경시킨다. 당업자에게는 상기 위치 지정 돌연변이유발법은 일반적인 것이며 널리 사용하고 있는 기법이다. 실제로, 다수의 위치-지정된 돌연변이유발법 키트가 시판되고 있으며, 한 예로는 클론테크 래보러토리즈(칼리프 팔로 알토)에서 시판되는 "트랜스포퍼 사이트 디렉티드 뮤타제네시스 키트"를 들 수 있다.
본 발명의 실시는 특별한 언급이 없는 한 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 단백질 화학 및 면역학을 이용하여 수행되며, 이는 당업자에게는 공지된 것들이다. 이러한 기법들은 문헌[참조: 예를 들어, Moleclar cloning: A Laboratory Manual(2판)(Sambrook, Fritsch 및 Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Vol I 및 II(D.N. Glover, ed), 1985; Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait, ed), 1984; 미국 특허 4,683,195호(Mullis 등); Nucleic Acid Hybridization(B.D. Haines 및 S.J. Higgins, eds.), 1984; Transciption and Translation(B.D. Haines 및 S.J. Higgins, eds.), 1984; Culture of Animal Cells(R.I. Freshney, ed). Alan R. Liss, INc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning(13. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Vol. 154 and 155(Wu 등, eds), Acasemic Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.H.Miller 및 M.P. Calos, eds), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Mayer 및 Walker, eds.), Academic Press, London, 1987; Handbook og Experiment Immunology, Volumes I-IV(D.M. Weir 및 C.C. Blackwell, eds.), 198; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986]에 기재되어 있다.
변이체 누블라스틴 융합 단백질
필요에 따라, 변이체 누블라스틴 폴리펩티드는 융합 단백질로서 제공될 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질의 융합 폴리펩티드 유도체는 생물학적 활성을 보유하는 1차 단백질의 다양한 구조적 형태를 포함한다. 본원에 사용한 용어 "융합"은 두개 이상의 단백질 또는 이의 단편이 그들 개개의 펩티드 백본, 가장 바람직하게는 동일한 리딩 프레임내(즉, "프레임내")에서 그들 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자의 유전자 발현을 통한 상기 단백질의 동시 선형 공유 결합을 의미한다. 단백질 또는 이의 단편은 상이한 공급원으로부터 유래하는 것이 바람직하다. 따라서, 바람직한 융합 단백질은 변이체 누블라스틴이 아닌 제2 부분에 공유결합된 변이체 누블라스틴 폴리펩티드 또는 단편을 포함한다. 바람직하게는, 상기 제2 부분은 단량체로서 존재하는 폴리펩티드로부터 유도되며, 누블라스틴 폴리펩티드에 대한 증강된 가용성 및/또는 생체이용 특성을 부여하기에 충분하다.
예를 들어, "변이체 누블라스틴/인간 혈청 알부민 융합체"는 C-말단 또는 N-말단이 인간 혈청 알부민 폴리펩티드에 프레임내 결합된 이종 누블라스틴 폴리펩티드를 포함한다[참조: Syed 등, Blood, 1997, 89: 3243 및 Yeh 등, P.N.A.S. USA 1992, 89: 1904 및 미국 특허 제5,876,969호 및 제5,302,697호]. 본원에 사용한 용어 "융합 단백질"은 변이체 누블라스틴 단백질이 아니고, 후술하는 바와 같이 정제된 단백질로부터 새롭게 제조된 제2 부분에 모노- 또는 헤테로-작용성 분자에 의해 화학적으로 결합된 변이체 누블라스틴을 포함한다.
누블라스틴-혈청 알부민 융합체는 당업계에 공지된 방법으로 구성할 수 있다. 상응하는 아미노 반응성기 및 티올 반응성기를 함유하는 임의의 다수 가교제를 이용하여 누블라스틴과 혈청 알부민을 결합시킬 수 있다. 적합한 링커의 예로는 티올 반응성 말레이미드를 삽입하는 아민 반응성 가교 링커를 포함한다. 이들의 예로는 SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS 또는 GMBS를 들 수 있다. 다른 적합한 링커는 티올 반응성-할로아세테이트기를 삽입한다. 이들의 예로는, 예를 들어 SBAP, SIA, SIAB를 포함하며, 환원성 결합을 생성하기 위해 설프히드릴기와 반응하기 위한 보호된 티올기 또는 보호되지 않은 티올기는 SPDP, SMPT, SATA 또는 SATP(모두 예를 들어 피어스 케미칼스에서 시판됨)이다. 당업자는 유사하게 누블라스틴의 N-말단과 혈청 알부민을 결합할 대안을 고려할 수 있다.
또한, 당업자는 NBN의 N-말단 또는 혈청 알부민의 티올 부분에 표적화하지 않는 혈청 알부민에 대한 컨쥬게이트를 생성할 수 있을 것으로 생각된다. 필요에 따라, NBN-혈청 알부민 융합체는 유전 공학 기법을 이용하여 생성할 수 있는데, 이때 NBN은 N-말단, C-말단 또는 이들 모두에서 혈청 알부민 유전자에 융합된다.
또한, 동물(인간을 포함함) 내에서 연장된 반감기를 가진 생성물로 귀착되는 임의의 NBN 컨쥬게이트는 유사한 방법을 이용하여 생성할 수 있다는 것도 고려된다.
변이체 누블라스틴의 다른 유도체는 변이체 누블라스틴 또는 그의 단편과, 추가의 N-말단 또는 C-말단으로서 재조합 배양에서의 합성에 의한 다른 단백질 또는 폴리펩티드의 공유 컨쥬게이트 또는 응집체 컨쥬게이트를 포함한다. 예를 들어, 컨쥬게이션된 펩티드는 세포막 또는 세포벽의 내부 또는 외부에서 합성 부위로부터 작용 부위로 단백질의 전달을 번역과 동시에 또는 번역후에 유도하는, 단백질의 N-말단 영역의 신호(또는 리더) 폴리펩티드 서열(예를 들어, 효모 알파-인자 리더)일 수 있다. 누블라스틴 수용체 단백질은 누블라스틴의 정제 또는 확인을 용이하게 하기 위해 첨가된 펩티드를 포함할 수 있다(예를 들어, 히스티딘/누블라스틴 융합체). 또한, 누블라스틴의 아미노산 서열은 펩티드 Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DYKDDDDK)에 결합될 수 있다[참조: Hopp 등, Biotechnology 6: 1204 (1988)]. 후자의 서열은 매우 항원성이며, 특정 모노클로날 항체에 의해 가역적으로 결합된 에피토프를 제공하여 발현된 재조합 단백질의 신속한 분석 및 용이한 정제를 가능하게 한다.
또한, 이 서열은 Asp-Lys 쌍 형성 직후 상기 잔기에서 소 점막 엔테로키나제에 의해 특이적으로 절단된다.
중합체에 컨쥬게이션된 변이체 누블라스틴 폴리펩티드
하나 이상의 중합체 분자가 부착될 수 있음이 고려됨에도 불구하고, 필요에 따라, 누블라스틴 폴리펩티드와의 켠쥬게이션을 위해 단일 중합체 분자를 사용할 수 있다. 본 발명의 컨쥬게이션된 누블라스틴 조성물은 생체내에서의 적용 및 비생체내에서의 적용 둘 다에서 유용성을 확인할 수 있다. 또한, 컨쥬게이션하는 중합체는 임의의 다른 기, 부분, 또는 기타 컨쥬게이션된 종을 최종 용도에 맞게 사용할 수 있음을 인식할 수 있을 것이다. 예를 들어, 몇몇 용도에서 중합체에 UV-분해 내성, 또는 항산화 특성, 또는 다른 특성 또는 특징을 부여하는 작용 부위를 중합체에 공유결합시킬 수 있다. 추가예로서, 몇몇 용도에서, 반응성 또는 가교결합성을 부여하도록 중합체를 작용화하고, 전체적으로 컨쥬게이션된 물질의 여러가지 특성 또는 특징을 증강시키기 위해 중합체를 작용화하는 것이 이로울 수 있다. 따라서, 상기 중합체는 임의의 작용기, 반복기, 결합 또는 의도한 목적을 위해 컨쥬게이션된 누블라스틴 뮤테인 조성물의 효능을 방해하지 않는 기타 구성 조직을 함유할 수 있다.
이들 바람직한 특징들을 획득하기 위해 유용하게 사용할 수 있는 예시적인 중합체는 본원에 후술하는 예시적인 반응식에 기술되어 있다. 공유결합된 펩티드 용도에서, 상기 중합체는 작용화되고 이어서 상기 펩티드(들)의 유리 아미노산(들)에 커플링되어 불안정한 결합을 형성할 수 있다.
몇몇 구체예에서, 누블라스틴 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드 상의 말단 반응성기에 의해 중합체에 결합된다. 대안으로, 또는 추가로, 누블라스틴 폴리펩티드는 내부 라이신 잔기, 예를 들어 자연 발생하는 누블라스틴 폴리펩티드의 아미노산 서열내로 도입된 라이신 잔기의 측쇄 아미노기에 의해 결합될 수 있다. 따라서, 컨쥬게이션은 비말단 반응성기로부터 분지될 수도 있다. 반응성기(들)를 가진 중합체는 본원에서 "활성화된 중합체"라 칭한다. 반응성기는 상기 단백질 상의 유리 아미노기 또는 기타 반응성 아미노기와 선택적으로 반응한다.
부착은 활성화된 중합체 내에서 일어날 수 있는데, 임의의 이용가능한 누블라스틴 아미노기, 예를 들어 누블라스틴 폴리펩티드 또는 이의 변이체 아미노산 서열 내에 도입된 잔기 또는 라이신 잔기의 알파 아미노기 또는 엡실론 아미노기에서 일어날 수 있다. 누블라스틴의 유리 카르복실기, 적절히 활성화된 카르보닐기, 히드록실, 구아니딜, 이미다졸, 산화된 탄수화물 부분 및 머캅토기(이용할 수 있는 경우)도 부착 부위로 사용할 수 있다.
일반적으로, 단백질 농도에 따라 단백질 1 몰당 활성화된 중합체 약 1.0 내지 약 10 몰을 사용한다. 최종 양은 반응 정도를 최대화하는 동시에 생성물의 비특이적 변형을 최소화하도록 균형을 이루어야 한다. 이렇게 하면 최적 활성을 유지하면서 필요에 따라 단백질의 반감기를 최적화할 화학을 결정할 수 있다. 단백질의 약 50% 이상의 생물학적 활성이 유지되는 것이 바람직하며, 100% 가깝게 유지되는 것이 가장 바람직하다.
반응성 기가 N-말단의 알파 아미노기인 경우, 약 pH 5-8, 예를 들어 pH 5, 6, 7 또는 8에서 생물학적 활성 물질과 불활성 중합체를 반응시키기 위해 사용된 임의의 방법으로 상기 반응을 수행할 수 있다. 일반적으로, 상기 과정은 활성화된 중합체를 제조하는 단계와 그 후의 상기 단백질과 활성화된 중합체를 반응시켜 제형화에 적합한 가용성 단백질을 생성하는 단계를 포함한다. 상기 변형 반응은 하나 이상의 단계를 포함하는 몇몇 방법으로 수행할 수 있다.
상기 중합체는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 변이체 누블라스틴 폴리펩티드에 커플링시킬 수 있다. 예를 들어, 한 구체예에서, 폴리알킬렌 글리콜 부분은 누블라스틴 폴리펩티드 또는 변이체 누블라스틴 폴리펩티드의 라이신 기에 커플링된다. 라이신 기에 대한 결합은 N-히드록실석신이미드(NHS) 활성 에스테르, 예를 들어 PEG 석신이미딜 석시네이트(SS-PEG) 및 석신이미딜 프로피오네이트(SPA-PEG)를 이용하여 수행할 수 있다. 적합한 폴리알킬렌 글리콜 부분은 예를 들어, 카르복시메틸-NHS, 노르루신-NHS, SC-PEG, 트레실레이트, 알데히드, 에폭사이드, 카르보닐이미다졸 및 PNP 카르보네이트를 포함한다.
추가의 아민 반응성 PEG 링커는 석신이미딜 부분을 대체할 수 있다. 이들의 예로는 이소시아누레이트, 니트로페닐카르보네이트, 에폭사이드, 및 벤조트리아졸 카르보네이트를 들 수 있다. 선택성 및 반응 정도를 최대화하기 위한 조건을 선택하는 것이 바람직하다. 선형 PEG 및 분지형 PEG 뿐만 아니라 다른 알킬 형태를 사용할 수도 있다. PEG의 길이는 변화시킬 수 있다. 가장 공통적인 형태는 크기가 2K에서 100K 범위에서 변화할 수 있다. 본 발명의 실시예는 N-말단에서 표적화된 페길화가 약동학적 특성에 영향을 미치지 않는다고 보고하고 있으며, 상기 물질이 생리적 기능을 보유한다는 사실은 본원에 개시된 부위(들)에서 변형이 유해하지 않음을 나타내는 것이다. 결과적으로, 라이신의 삽입을 통해 추가의 부착 부위를 제공할 수 있는 NBN의 돌연변이 형태를 생성함에 있어서, 이들 형태가 라이신 및 N-말단 모두에서 페길화된 산물은 허용가능한 것으로 간주된다.
필요에 따라, 누블라스틴 변이체 폴리펩티드는 태그, 예를 들어 단백질 분해에 의해 후속적으로 방출될 수 있는 태그를 함유할 수 있다. 따라서, 라이신 부분은 일차로 his-태그 변이체와, 라이신 및 N-말단 모두와 반응할 저분자량 링커, 예를 들어 트라우트 시약(피어스)을 반응시키고, 이어서 his 태그를 방출시킴으로써 선택적으로 변형시킬 수 있다. 이어서, 상기 폴리펩티드는 말레이미드기, 비닐설폰기, 할로아세테이트기, 또는 유리 또는 보호된 SH와 같은 티올 반응성 헤드기를 함유하는 PEG를 이용하여 선택적으로 변형될 수 있는 유리 SH 기를 함유할 것이다.
트라우트 시약은 PEG 부착을 위한 특정 부위를 구성할 임의의 링커로 대체할 수 있다. 예를 들어, 트라우트 시약은 SPDP, SMPT, SATA 또는 SATP(모두 피어스에서 시판됨)로 대체할 수 있다. 유사하게, 상기 단백질은 말레이미드를 삽입하는 아민 반응성 링커(예를 들어, SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS 또는 GMBS), 할로아세테이트기를 삽입하는 아민 반응성 링커(SBAP, SIA, SIAB) 또는 비닐설폰기를 삽입하는 아민 반응성 링커와 반응할 수 있고, 유리 SH를 함유하는 PEG와 획득한 생성물을 반응시킬 수도 있다. 사용되는 링커의 크기에 대한 유일한 제한은 이것이 N-말단 태그의 후속 제거를 차단할 수 없다는 것이다.
따라서, 다른 구체예에서, 폴리알킬렌 글리콜 부분은 누블라스틴 폴리펩티드 또는 변이체 누블라스틴 폴리펩티드의 시스테인 기에 커플링된다. 커플링은 예를 들어 말레이미드기, 비닐설포네이트기, 할로아세테이트기, 및 티올기를 이용하여 수행할 수 있다.
변이체 누블라스틴 폴리펩티드 상의 하나 이상의 부위는 중합체에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 한개, 두개, 세개, 네개 또는 다섯개의 PEG 부분이 중합체에 부착될 수 있다. 몇몇 구체예에서, PEG 부분은 아미노 말단 및/또는 표 1에 도시한 바와 같은 번호 부여 체계에서 누블라스틴 폴리펩티드의 14번, 39번, 68번 및 95번 아미노산에 부착된다.
바람직한 구체예에서, 상기 조성물내 변이체 누블라스틴 폴리펩티드는 중합체 부재하의 변이체 폴리펩티드의 반감기 보다 더 긴 혈청 반감기를 보유한다. 대안으로, 또는 추가로, 상기 조성물내 변이체 누블라스틴 폴리펩티는 GFRα3을 결합하고, RET를 활성화시키고, 뉴런의 병리학적 변화를 정상화시키고 또는 이들 생리학적 기능을 연합하여 수행한다.
바람직한 구체예에서, 상기 조성물은 안정한 수용성 컨쥬게이션된 누블라스틴 폴리펩티드 또는, 폴리에틸렌 글리콜 부분에 커플링된 누블라스틴 폴리펩티드 또는 변이체 누블라스틴 폴리펩티드를 포함하는 변이체 누블라스틴 폴리펩티드 복합체로 제공된다. 필요에 따라, 상기 누블라스틴 폴리펩티드 또는 변이체 누블라스틴 폴리펩티드는 불안정한 결합에 의해 폴리에틸렌 글리콜 부분에 커플링될 수 있다. 상기 불안정한 결합은 예를 들어, 생화학적 가수분해, 단백질분해, 또는 설프히드릴 절단에 의해 절단될 수 있다. 예를 들어, 상기 결합은 생체내(생리적) 조건 하에서 절단될 수 있다.
변이체 누블라스틴 -중합체 컨쥬게이트를 함유하는 약학 조성물
또한, 본 발명의 변이체 누블라스틴-중합체 컨쥬게이트를 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 본원에 사용한 용어 "약학 조성물"은 본 발명의 누블라스틴 단백질 또는 컨쥬게이트를 포함하는 의미로 사용되는데, 상기 누블라스틴 또는 컨쥬게이트는 생리학적으로 상용성인 비히클 내에 분산되고, 필요에 따라 1종 이상의 생리학적으로 상용성인 성분을 함유한다. 따라서, 약학 조성물은 부형제, 예를 들어 물, 1종 이상의 미네랄, 당, 세정제 및 1종 이상의 담체, 예를 들어 불활성 단백질(예를 들어, 헤파린 또는 알부민)을 함유할 수 있다.
본 발명의 중합체-누블라스틴 컨쥬게이트는 그 자체 뿐만 아니라 약학적으로 허용가능한 에스테르, 염 및 이의 다른 생리학적 작용성 유도체로 투여될 수 있다. 이러한 약학 제제 및 약제 조성물에 있어서, 변이체 누블라스틴 컨쥬게이트는 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체(들) 및 필요에 따라 임의의 다른 치료 성분과 함께 사용하는 것이 바람직하다.
상기 담체(들)는 제제내의 다른 성분들과 상용성이라는 의미에서 약학적으로 허용가능해야하며, 이의 수용체에게 부적절한 유해 효과를 일으키지 않아야 한다. 변이체 누블라스틴은 본원에 기술한 바와 같이 소정의 약리 효과 또는 의학적으로 이로운 효과를 획득하기 위한 유효량 및 생체내 투여 또는 농도에서 소정의 생체이용률을 획득하기에 적합한 양으로 제공된다.
상기 제제는 비경구 투여 및 비경구 경로가 아닌 투여 경로에 적합한 것을 포함하며, 이러한 투여 경로의 예로는 경구 투여, 직장 투여, 설하 투여, 국소 투여, 코를 통한 투여, 눈을 통한 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 정맥내 투여, 경피 투여, 수막강내 투여, 관절내 투여, 동맥내 투여, 지주막하 투여, 기관지를 통한 투여, 림프 투여, 질 투여 및 자궁내 투여를 들 수 있다. 에어로졸 및 비경구 투여에 적합한 제제는 국소 투여 제제 및 전신 투여 제제 모두 바람직하다.
변이체 누블라스틴이 액상 용액을 포함하는 제제에 사용되는 경우, 제제는 경구, 기관지 또는 비경구 투여하는 것이 이로울 수 있다. 상기 누블라스틴이 액상 현탁 제제 또는 생체적합성 담체 제제내의 분말로 사용되는 경우, 상기 제제는 경구, 직장 또는 기관지 투여하는 것이 이로울 수 있다. 대안으로, 상기 제제는 코를 통한 투여 또는 기관지 투여하는 것이 이로울 수 있는데, 이러한 경우는 담체 가스내에서 분말의 분무에 의해 분말의 기체상 분산액을 형성하며, 이는 적합한 분무 장치를 포함하는 호흡 키트로부터 환자가 흡인할 수 있다.
본 발명의 단백질을 포함하는 제제는 단위 제형으로 제공하거나 약학 분야에 널리 알려진 임의의 방법으로 제조할 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 1종 이상의 보조 성분을 구성하는 담체와 함께 활성 성분(들)을 혼합하는 단계를 포함한다.
전형적으로, 상기 제제는 활성 성분(들)과 액상 담체, 미분 고형 담체 또는 둘다와 균일하고 철저히 혼합하고, 필요에 따라 소정 제제의 제형으로 생성물을 성형함으로써 제조한다.
경구 투여에 적합한 본 발명의 제제는 캡슐, 교갑, 정제, 또는 로젠지와 같은 불연속 유닛으로 구성할 수 있는데, 이들은 각각 미리 지정된 양의 활성 성분을 분말이나 과립으로 함유하며; 또는 수성 액체 또는 비수성 액체내의 현탁액, 예를 들어 시럽, 엘릭시르, 에멀션 또는 드라우트로 구성할 수도 있다.
비경구 투여용으로 적합한 제제는 활성 컨쥬게이트의 멸균 수성 제제를 포함하는 것이 편리한데, 이는 수용체의 혈액과 등장성인 것이 바람직하다(예를 들어,생리적 염 용액). 이러한 제제는 현탁제 및 점증제 또는 혈액 성분 또는 하나 이상의 장기에 화합물을 표적화하도록 설계된 기타 미세결정성 시스템을 포함할 수 있다. 상기 제제는 단위투여형 또는 다중투여형으로 제공할 수 있다.
코 스프레이 제제는 활성 컨쥬게이트와 보존제 및 등장제의 정제된 수용액을 포함한다. 이러한 제제는 pH를 조정하여 코 점막과 상용성인 등장 상태를 유지하는 것이 바람직하다.
직장 투여용 제제는 코코아 버터, 수소화된 지방 또는 수소화된 지방 카르복실산과 같은 적합한 담체와 함께 좌약으로 구성할 수 있다. 안약과 같은 눈을 통한 투여 제제는 코 스프레이의 제조 방법과 유사한 방법으로 제조할 수 있는데, 단 pH 및 등장성 인자는 눈의 그것과 부합되도록 조정하는 것이 바람직하다.
국조 제제는 1종 이상의 매질, 예를 들어 광유, 석유, 폴리히드록시 알콜, 또는 기타 국소 약학 제제에 사용되는 기타 기재내에 용해 또는 현탁된 본 발명의 컨쥬게이트를 포함한다.
상기한 성분들 이외에, 본 발명의 제제는 희석제, 완충제, 향미제, 붕해제, 게면활성제, 점증제, 윤활제, 보존제(산화방지제 포함) 등으로부터 선택된 1종 이상의 보조 성분(들)을 포함할 수 있다. 이러한 고려는 본 발명의 누블라스틴 융합 단백질(예를 들어, 누블라스틴-HSA 융합체)에도 적용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 바람직한 예시적인 적용예로서 용액내 변이체 누블라스틴 컨쥬게이트의 시험관내 안정화를 위해 적합한 융합 단백질을 고려한다. 상기 융합 단백질은 예를 들어 변이체 누블라스틴 폴리펩티드의 효소적 분해에 대한 내성을 증가시키는 데 사용할 수 있으며, 저장 수명, 실온 안정성 등을 개선시키기 위한 수단을 제공한다. 전술한 고려는 본 발명의 누블라스틴-혈청 알부민 융합 단백질(인간 누블라스틴-인간 혈청 알부민 융합 단백질을 포함함)에 적용할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
치료 방법
변이체 누블라스틴 폴리펩티드, 뿐만 아니라 이의 융합 단백질 또는 이의 컨쥬게이트는 살아있는 동물체, 바람직하게는 포유동물, 더 바람직하게는 인간을 포함하는 영장류의 장애 또는 질병을 치료 또는 경감하기 위해 사용할 수 있는데, 이때 장애 또는 질병이라 함은 신경영양성 제제의 활성에 반응하는 것들이다.
본 발명의 조성물은 예를 들어, 주입, 이식 또는 소화된 약학 조성물에 의해 직접적으로 사용하여 누블라스틴 폴리펩티드에 대해 반응하는 병리학적 과정을 치료할 수 있다. 상기 조성물은 살아있는 동물체, 예를 들어 인간에서 신경영양성 인자의 활성에 대해 반응하는 장애 또는 질병을 치료 또는 예방하기 위해 사용할 수 있다. 상기 장애 또는 질병은 외상, 수술, 빈혈, 감염, 대사 장애, 영양 결핍, 악성 또는 독성 제제 및 유전적 과정 또는 특발성 과정에 의해 유발되는 신경계의 손상을 특히 포함할 수 있다.
상기 손상은 특히 척수의 배측 루트 신경절 또는 하기 조직의 임의의 조직내 뉴런을 포함하는 감각 뉴런 또는 망막 신경절 세포에서 발생할 수 있다: 슬상 신경절, 추체 신경절 및 결절 신경절; 8번 두개 신경의 전정음향 복합체; 삼중 신경절의 상하악골 로브의 복부외측극; 및 중뇌 삼중핵.
본 발명의 방법의 바람직한 구체예에서, 질병 또는 장애는 손상된 외상성 뉴런과 관련된 신경퇴행성 질병, 예를 들어 말초 신경, 수질 및/또는 척수의 외상성 병변, 대뇌 빈혈성 뉴런 손상, 신경장애 및 특히 말초 신경장애, 말초 신경 외상 또는 손상, 허혈성 발작, 급성 뇌 손상, 급성 척수 손상, 신경계 종양, 다발성 경화증, 신경독소에 대한 노출, 대상 장애, 예를 들어 당뇨병 또는 신부전 및 감염성 제제에 의해 유발된 손상, 신경퇴행성 장애, 예를 들어 알츠하이머병, 헌팅톤병, 파킨슨병, 파킨슨-플러스 증후군, 진행성 핵상 마비(스틸-리차드슨-올스제브스키 증후군), 올르브교소뇌위축(OPCA), 샤이-드라거 증후군(다발성 시스템 위축증), 구아마니안 파킨슨증-치매 복합증, 근위축성 측면 경화증 또는 임의의 다른 선천성 또는 신경퇴행성 질병, 및 치매와 관련된 기억 손상이다.
바람직한 구체예에서, 감각 및/또는 운동 시스템 뉴런을 치료할 수 있다. 특히, 외상수용성 및 기계수용성 뉴런을 치료할 수 있으며, 특히 델타 섬유 및 C-섬유 뉴런을 치료할 수 있다. 또한, 운동 시스템의 교감신경 뉴런 및 부교감신경 뉴런을 치료할 수 있다.
다른 바람직한 구체예에서, 운동 뉴런 질병, 예를 들어 근위축성 측면 경화증("ALS") 및 척추 근 위축증을 치료할 수 있다. 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 누블라스틴 분자를 이용하여 외상성 손상후의 신경 회복을 증강시킬 수 있다. 대안으로, 또는 추가로 변이체 누블라스틴 폴리펩티드, 또는 변이체 누블라스틴 폴리펩티드의 융합체 또는 컨쥬게이트를 함유하는 매트릭스를 가진 신경 유도 채널은 본원에 기술한 방법에서 사용할 수 있다. 이러한 신경 유도 채널은 예를들어 미국 특허 제5,834,029호(본원에 참고 인용함)에 기술되어 있다.
바람직한 구체예에서, 본원에 개시된 조성물(및 이를 함유하는 약학 조성물)은 말초 신경장애의 치료에 사용된다. 본 발명의 분자를 이용하는 치료를 위해 고려된 말초 신경장애로는 외상-유도된 신경장애, 예를 들어 물리적인 손상 또는 질병 상태에 의해 유발된 질병, 뇌에 대한 물리적 손상, 척수에 대한 물리적 손상, 뇌 손상과 관련된 발작, 및 신경 퇴행과 관련된 신경학적 장애를 들 수 있다. 또한, 본원에는 감염, 독소 노출 및 약물 노출에 2차적인 신경장애도 포함된다. 또한, 전신성 질병 또는 대사 질병에 2차적인 신경장애도 포함된다. 또한, 본원에 개시된 조성물은 화학요법-유도된 신경징애(예를 들어, 화학요법제, 예를 들어 탁솔 또는 시스플라틴의 절단에 의해 유도된 것); 독소 유도된 신경장애, 약물 유도된 신경장애, 비타민 결핍 유도된 신경장애; 특발성 신경장애; 및 당뇨병성 신경장애를 치료하는데 사용할 수도 있다[참조: 예를 들어, 미국 특허 제5,496,804호 및 제5,916,555호, 본원에 참고 인용함].
본원에 개시한 조성물을 이용하여 치료할 수 있는 추가 질환은 단발신경장애. 단발-다발 신경장애, 및 다발신경장애가 있는데, 이들에는 축삭 신경장애 및 탈수질 신경장애를 들 수 있다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물(및 이를 함유하는 약학 조성물)은 여러가지 안질환, 예를 들어 각막반 퇴행, 망막염 색소, 녹내장 및 유사 질환을 앓고 있는 환자에서 망막내 광수용체 상실을 치료하는 데 사용된다.
본 발명은 후술하는 비제한적인 실시예에 의해 추가로 예시될 것이다.
본 발명은 신규한 변이체 누블라스틴 폴리펩티드를 제공하는데, 그들을 변형시켜 그들의 약동학적 특성 및 생체이용 특성을 증강시킬 수 있다.
실시예 1
N-말단 페길화된 누블라스틴의 생체이용률
CHO 세포 유도된 재조합 인간 누블라스틴은, 래트에게 정맥내 투여되는 경우, 순환계로부터 신속하게 제거되는 것으로 관찰되었다. 피하 투여후 혈청 내에서 관찰된 단백질은 없었다. 누블라스틴의 생체이용률을 증가시키기 위해, 페길화된 형태를 구성하였다.
NBN 서열 내에는 라이신이 존재하지 않기 때문에, 아민-특이성 페길화 화학은 그의 아미노 말단에서 NBN 폴리펩티드의 페길화를 초래할 것이다. 따라서, 각각의 누블라스틴 이량체에서, 2개의 PEG 부분이 부착되어야만 한다. 결국, PEG 형태는 아민 특이성 화학을 통해 N-말단에 먼저 직접적으로 표적화되었다. 놀랍게도, 2개의 부착된 20 K PEG를 이용하는 페길화는 반감기에 대한 잇점을 거의 나타내지 못했는데, 이는 제거 경로에 기초한 메카니즘이 페길화에 의해 획득될 것으로 예상되는 반감기의 증강을 소실시킴을 나타내는 것이다.
실시예 2
페길화된 누블라스틴 N95K 뮤테인의 구성
다음으로, 내부 아미노산 잔기에서 페길화된 NBN 돌연변이형의 생체이용률을 조사하였다. 14번, 39번, 68번 및 95번 위치에서 자연 발생하는 잔기를 치환하는 일련의 4개의 돌연변이체는 상기 서열 내의 선택된 위치에서 라이신을 삽입하도록 구성하였다. 이들 라이신은 PEG 부착을 위해 교대로 반복되는 위치를 제공하였다. 이들 위치는 표면 잔기를 확인하기 위한 구조로서 GDNF[참조: Nat. Struct. Biol. 4: 435-8 (1997)]의 결정 구조 및 회피해야하는 구조의 기능적으로 중요한 영역을 확인하기 위한 페르세핀/누블라스틴 키메라 돌연변이유발 연구[참조: J. Biol. Chem. 275: 3412-20 (2000)]를 이용하여 선택하였다.
돌연변이 중 두개의 돌연변이(R39 및 R68)는 표면 상의 양전하 분포에 기초하여 단백질의 신속한 제거에 기여할 것으로 생각되는 단백질의 특성인 헤파린 결합 부위를 나타낼 수 있는 영역에 표적화되었다. 제3 부위는 N95, 즉 야생형 NBN내 천연 글리코실화 부위에 표적화되었다. 이 부위는 복합 탄수화물 구조에 의해 자연적으로 변형된다. 따라서, 이 부위에서 PEG에 의한 변형은 기능에 영향을 미칠것으로는 예상되지 않았다. 제4 부위(R14)는 임의의 다른 변형에 의해 관찰되지 않는 영역에서 선택하였다. 95번 위치의 아스파라긴 잔기가 라이신으로 치환된 돌연변이체("N95K 돌연변이체")는 본원에 개시된 연구를 위해 선택하였다.
래트 누블라스틴 폴리펩티드의 야생형 서열내에 하나 이상의 변경을 함유하는 4개의 상이한 래트 누블라스틴 뮤테인을 구성하였다. 상기 뮤테인들은 단일 N95K 뮤테인 및 래트 누블라스틴의 아미노산 서열내의 다른 부위에서 단일 치환을 함유하는 뮤테인을 포함한다: R14K; R68K; 및 R39K. "X1N1X2" 명명법에서, X1은 야생형 누블라스틴 폴리펩티드의 아미노산 서열을 의미하고, N1은 상기 서열 내에서 X1 아미노산의 위치(번호)를 나타내는데, 번호는 서열 번호 1의 번호 부여 체계에 따른 것이다. X2는 상기 서열 내의 지정된 위치에서 야생형 아미노산을 치환치킨 아미노산을 의미한다.
래트 N95K 누블라스틴 돌연변이를 구성하기 위해, 위치 지정된 돌연변이유발법을 pCMB020(야생형 래트 누블라스틴을 암호화하는 플라스미드)에 대해 수행하였다. 상기 야생형 래트 누블라스틴 핵산 및 암호화된 폴리뉴클레오티드의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure 112008065235340-pat00005
Figure 112008065235340-pat00006
올리고뉴클레오티드 KD2-310 및 KD3-211을 이용하는 pCM020의 돌연변이유발은 플라스미드 pCMB027을 형성하였다:
Figure 112008065235340-pat00007
pCMB027에서, 95번 위치에 아스파라긴을 암호화하는 코돈은 라이신을 암호화하는 코돈으로 대체하였다.
pCMB020의 누블라스틴 암호 서열 내에서 14번 위치의 아르기닌을 암호화하는 코돈을 라이신을 암호화하는 코돈으로 대체하여 R14K 누블라스틴 뮤테인을 형성하였다. 올리고뉴클레오티드 KD3-254 및 KD3-255를 이용하여 pCMB020에 대해 위치 지 정된 돌연변이유발법을 수행하였다:
Figure 112008065235340-pat00008
생성된 구성물은 pCMB029라 칭하였다.
pCMB020의 누블라스틴 암호 서열 내에서 68번 위치의 아르기닌을 암호화하는 코돈을 라이신을 암호화하는 코돈으로 대체함으로써 R68K 누블라스틴 뮤테인을 형성하였다. 올리고뉴클레오티드 KD3-258 및 KD3-259를 이용하여 pCMB020에 대해 위치 지정 돌연변이유발법을 수행하였다:
Figure 112008065235340-pat00009
생성된 구성물은 pCMB030이라 칭하였다.
pCMB020의 누블라스틴 암호 서열 내에서 39번 위치의 아르기닌을 라이신으로 대체함으로써 R39K 누블라스틴 뮤테인을 형성하였다 올리고뉴클레오티드 KD3-256 및 KD3-257을 이용하여 pCMB027의 위치 지정된 돌연변이유발법을 수행하였다:
Figure 112008065235340-pat00010
발현 및 정제를 위해, 래트 NBN N95K 뮤테인을 암호화하는 플라스미드는 성숙 113 아미노산 NBN 서열의 출발 부위에 근접하여 엔테로키나제 절단 부위를 가진 His-태깅된 융합 단백질로서 이. 콜리 내에서 발현시켰다. 상기 이. 콜리는 500 L 발효조에서 성장시켰으며, 냉동된 세포 페이스트가 제공되었다. 상기 이. 콜리 세 포는 맨톤 가울린 프레스 내에서 용해시켰으며, 래트 NBN NK는 불용성의 세척된 펠릿 분획으로부터 회수하였다.
NBN은 구아니딘 히드로클로라이드를 이용하여 펠릿으로부터 추출하고, 리폴딩시키고, 엔테로키나제를 이용하여 His-태그를 제거하였다. 이어서, 상기 생성물은 Ni NTA 아가로즈(퀴아젠) 및 베이커본드 WP CBX 양이온 교환 수지 상에서 크로마토그래피하였다.
His-태깅된 생성물의 엔테로키나제 처리는 성숙 서열 내의 7번 아르기닌에서 단백질의 부적절한 절단을 초래하였다. 생성된 des 1-7 NBN 생성물은 KIRA ELISA 내에서 완전한 활성을 나타냈으며, 구아니딘 유도된 변성에 대한 민감성으로 보아 성숙 형태와 구조적으로 구별할 수 없었다. 따라서, 다음 절차에 사용하였다.
래트 NBN N95K는 반응물로서 분자량이 10,000 Da인 메톡시폴리(에틸렌 글리콜)-석신이미딜 프로피오네이트(SPA-PEG)를 이용하여 분자당 3.3 PEG 부분으로 페길화하였다. 생성된 페길화 생성물에 대해서는 SDS-PAGE, 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 역상 HPLC, 매트릭스 지지된 레이저 탈착/이온화 질량 분광법(MALD/IMS), 펩티드 지도화, KIRA ELISA에서의 활성 평가 및 내독소 함량의 측정을 포함하는 분석 기법을 동원하여 그 특성을 규명하였다. SDS-PAGE 및 SEC에 의해 측정된 바와 같이 페길화 이전의 NBN N95K 생성물의 순도는 95% 이상이었다. NBN N95K 생성물은 비환원 조건 하에서 이량체로서 이동하였는데, 이는 그의 예상된 구조와 일치하는 것이었다. 페길화후, 생성된 생성물은 2 PEG/생성물의 분자 5%, 3 PEG/생성물의 분자 60%, 4 PEG/생성물의 분자 30%를 함유하는 일련의 부가반응 생성물, 및 더 큰 분자량의 몇몇 부 형태로 구성되어 있었다. 페길화된 샘플에서, 응집체의 존재 징후는 없었다. 생성물내 변형되지 않은 NBN의 잔여 수준은 정량화 한계치 미만이었다. 상기 물질의 내독소 함량은 일반적으로 1 EU/mg 이었다. KIRA ELISA에서 페길화된 NBN의 특이 활성은 10 nM이었다. 페길화 생성물은 PBS(pH 6.5) 내에서 1.1 mg/ml로 제형화되었다. wt-NBN과 효능 면에서 유사한 물질은 -70℃에서 동결된 액체로 공급될 수 있다.
R14K, R39K 및 R68K 뮤테인은 이. 콜리 내에서 발현되었으며, N95K-NBN에 대해 상기한 것과 동일한 방법을 이용하여 정제, 페길화 및 기능을 평가할 수 있다.
페길화된 NBN 의 제조
이.콜리에서 생성하고, 5 mM 인산 나트륨 pH 6.5, 100 mM NaCl 내의 4℃에서 저장한 리폴딩된 래트 NBN N95K(2.6 mg/ml) 230 ml는 물 77 ml, 1M HEPES pH7.5 14.4 ml 및 PEG SPA 10,000 Da 2.8 g(10 mg/ml 최종)(쉬어워터 폴리머즈, 인크.)로 희석하였다. 샘플은 실온의 암실에서 4 시간 동안 항온처리하고, 이어서 5 mM 이미다졸(최종)로 처리하고, 여과하고, 4℃에서 하룻밤 동안 저장하였다. 생성물은 2개의 배치(한 배치는 NBN N95K 벌크 130 ml를 함유하였으며, 다른 배치는 상기 벌크 100 ml를 함유함) 내에서 생성되었다. 페길화된 NBN은 프락토겔 EMD SO3 -(M)(EM 인더스트리즈) 상에서 반응 혼합물로부터 정제하였다. 상기 컬럼은 실온에서 조작하였다. 모든 완충액은 발열원이 없는 상태로 제조하였다. 염화 나트륨을 최종 농도 87 mM로 반응 혼합물에 첨가하고, 샘플은 45 ml 프락토겔 컬럼(내경 5 cm)에 로딩 하였다.
상기 컬럼은 5 mM 인산 나트륨 pH 6.5, 80 mM NaCl의 1 컬럼 용적으로 세척하고, 이어서 50 mM NaCl을 함유하는 5 mM 인산 나트륨의 3개의 1 컬럼 용적 분취물로 세척하였다. 상기 수지는 2.5 cm 직경의 컬럼으로 이전하고, 페길화된 NBN은 5 mM 인산 나트륨 pH 6.5, 400 mM NaCl을 함유하는 6개의 10 ml 스텝, 500 ml NaCl을 함유하는 3개의 스텝 및 600 mM NaCl을 함유하는 6개의 스텝으로 용출시켰다. 용출 분획은 280 nm에서의 흡광도로 단백질 함량에 대해 분석하고, 이어서 SDS-PAGE에 의해 변형의 정도를 분석하였다. 선택된 분획은 수집하고, 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과하고, 물로 1.1 mg의 페길화된 래트 NBN/ml까지 세척하였다. 개개의 배치 내에서 내독소 수준을 평가한 후, 이들을 수집하고, 0.2 ㎛ 막을 통해 재여과하였다. 최종 물질은 소량의 분취물로 나누고, -70℃에서 저장하였다.
정제된 페길화된 NBN NK 의 UV 스펙트럼
페길화된 NBN NK의 UV 스펙트럼(240-340 nm)는 니트 샘플에서 취하였다. 상기 샘플은 3회 분석하였다. 페길화된 샘플은 275-277 nm에서 최대 흡광도를 나타냈으며, 247-249 nm에서 최소 흡광도를 나타냈다. 이 결과는 변형되지 않은 NBN 벌크 중간체에서 관찰된 것과 일치하였다. 페길화된 생성물의 단백질 농도는 소멸 계수 ∑280 0.1% = 0.50을 이용하는 스펙트럼으로부터 예상하였다. 페길화된 NBN 벌크의 단백질 농도는 1.1 mg/ml였다. 320 nm에서 흡광도 결손에 의해 입증되는 바와 같이, 샘플 내에서 탁함은 존재하지 않았다.
SDS - PAGE 에 의한 페길화된 NBN NK 의 특성 규명
상기 생성물 3, 1.5, 0.75 및 0.3 ㎍을 함유하는 페길화된 NBN의 분취물에 대해 4-20% 구배 겔(Owl)에서 SDS-PAGE를 수행하였다. 상기 겔은 쿠마지 브릴란트 블루 R-250으로 염색하였다. 분자량 마커(기브코-비알엘)를 함께 사용하였다.
비환원 조건 하에서 페길화된 NBN NK의 SDS-PAGE 분석을 통해 2, 3, 4 및 4 이상의 PEG/분자를 갖는 변형에 상응하는 일련의 밴드를 확인하였다. 겉보기 분자량 98 kDa의 주 밴드는 3 PEG/분자를 함유하였다. 정제된 페르길화된 생성물에서, 변형되지 않은 NBN은 검출되지 않았다. 생성물과 부착된 2, 3 및 4 PEG의 혼합물의 존재는 MALDI 질량 분광 분석에 의해 입증하였다. 2, 3, 및 4 PEG를 함유하는 생성물의 비는 덴시토미터로 측정하였으며, 각각 전체의 7%, 62% 및 30%로 측정되었다.
크기 배제 크로마토그래피에 의한 페길화된 NBN 의 특성 규명
페길화된 NBN은 이동상으로서 5 mM MES pH 6.5, 300 mM NaCl을 이용하는 분석용 수퍼로즈 6HR1O/30 FPLC 컬럼 상에서 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 상기 컬럼은 20 ml/시간으로 조작하였다. 용출 분획은 280 nm에서 흡광도에 대해 모니터링하였다. 페길화된 NBN은 약 200 kDa의 겉보기 분자량을 가진 단일 피크로 용출되었으며, 이는 PEG의 대형 수력학적 용적과 일치하는 것이다. 응집체의 증거는 관찰되지 않았다. 약 30 kDa의 겉보기 분자량으로 용출되는 유리 NBN은 상기 제조물 내에서 검출되지 않았다.
역상 HPLC 에 의한 페길화된 NBN 의 분석
페길화된 NBN NK는 Vydac C4(5 ㎛, 1 x 250 mm) 상에서 역상 HPLC를 수행하였다. 상기 컬럼은 40%로부터 60%까지 60 mm 구배를 이용하여 전개시켰다(완충액 A: 0.1% TFA, 완충액 B: 75% 아세토니트닐/0.085% TFA). 상기 컬럼 용출액은 214 nm에서 흡광도에 대해 모니터링하고, 후속 분석을 위해 분획을 수집하였다. 페길화된 NBN NK는 C4 컬럼 상에서 역상 HPLC에 의해 그의 여러가지 디(60.5 mm), 트리(63.3 mm) 및 테트라(67.8 mm) 페길화된 성분으로 분별하였다. 피크의 상대적인 세기는 상기 성분들의 비가 각각 5.4%, 60.5% 및 30.1%임을 암시하는 것이다. 피크 세기는 MALDI-MS로 입증하였다. 상기 생성물내에 비페길화된 NBN NK(5 내지 15 mm에서 용출됨)의 증거는 없었다.
질량 분광분석법에 의한 페길화된 NBN 의 분석
페길화된 NBN NK는 C4 Zip Tip 상에서 탈염하고, 매트릭스로서 시나핀산을 이용하는 보이저-DE(상표명)(퍼셉티브 바이오시스템즈) 매트릭스-지원된 레이저 탈착/이온화 비행 시간(MALDI-TOF) 질량 분광기로 분석하였다. 정제된 단백질 0.5 ㎕는 표적 플레이트 상에서 매트릭스 0.5 ㎕와 혼합하였다. 페길화된 NBN의 질량 분광 분석을 통해 3가지 부가반응 생성물의 단일 및 이중 하전된 형태를 확인하였다. 관찰된 분자량 43803 Da, 54046 Da 및 64438 Da는 2, 3 및 4 PEG/분자의 변형과 일치하는 것이었다.
펩티드 지도화에 의한 페길화된 NBN 의 분석
페길화 반응의 특이성은 펩티드 지도화를 통해 평가하였다. 페길화된 NBN은 디, 트리, 및 테트라 페길화된 성분으로 분리하였으며, 이어서 환원시키고, 알킬화시키고, C4 컬럼 상에서 HPLC에 의해 그들의 단일 사슬 성분으로 더 분리하였다. 이들 성분 및 대조용으로서 환원되고 알킬화된 변형되지 않은 NBN NK는 Asp-N 프로테이나제로 분해하고, 생성된 분해 생성물은 0부터 60% 까지 60 mm 구배(완충액 A: 0.1% TFA, 완충액 B: 75% 아세토니트릴/0.085% TFA)를 이용하는 Vydac C18(5 ㎛, 1 x 250 mm) 컬럼 상에서 역상 HPLC에 의해 분별하였다. 상기 컬럼 용출액은 214 mm에서 흡광도에 대해 모니터링하였다.
래트 NBN 서열은 4개의 내부 아스파르트산을 함유하며, 따라서 엔도프로테이나제 Asp-N을 이용하여 분해하는 경우 단순한 절단 프로필이 얻어질 것으로 예상된다. 래트 NBN NK의 Asp-N 분해로부터 유래한 모든 피크는 질량 분광법 및/또는 에드만 N-말단 서열결정법으로 확인하고, 펩티드 지도는 피크의 존재 또는 부재에 의해 변경 부위를 탐침하기 위한 단순한 도구로서 사용할 수 있다. 여러가지 피크의 실체는 하기 표 3에 요약하였다.
체류시간에 의한 피크
(mm)		 관찰된
중량 평균		 이론적인
중량 평균		 할당 아미노산 서열
38.8 1261.1(M) 1262.4 102-113 DHLSATACGCLG
40.7 1090.9 1092.2 93-101 DVKSTWRTV
44.6 2508.4 2508.9 35-54 DELIRFRCSGSCRRARSPH
46.0 2437.0 2437.8 12-34 DARGCRLRSQLVPVSALGLGHSS
51.4 3456.7 3456.0 55-86 DLSLAS.....CRPTRY
51.9 4134.4 55-92(산화) DLSLAS CRPTRYEAVSFM
53.2 4136.3* 4120.8 55-92 DLSLAS CRPTRYEAVSFM
(M)은 모노로스토픽 중량
*: MALDI 상에서 메티오닌 함유 펩티드의 산화에 기인함.
NBN은 동종이량체로서 존재하기 때문에, 래트 NBN NK 생성물은 4개의 가능한 페르길화 부위, 각각의 사슬로부터 2개의 N-말단 아민 및 구성물로 조작된 2개의 N95K 부위를 함유한다. 디페르길화된 사슬의 펩티드 지도에서, 단지 NK 돌연변이를 가진 펩티드를 함유하는 피크만 PEG 변형에 의해 변경되었다. 다른 피크 중에서 PEG 변형에 의해 변경된 것은 없었다. 따라서, 지도화 데이타는 PEG 분자가 이 펩티드에 특이적으로 부착되고 스크리닝된 다른 임의의 펩티드에는 부착되지 않음을 나타내고 있다. 두번째 가능한 부착 부위인 N-말단은 단지 3개의 아미노산 길이인 펩티드 상에 존재하며, 상기 펩티드 지도에서는 검출되지 않았다. 추가의 PEG 부착 부위는 이 부위에 존재하는 것으로 예상된다. 이러한 개념에 부합되기 때문에, 래트 NBN NK의 적은 비율은 절두되지 않으며, 성숙 Ala-1을 함유한다. 상기 펩티드는 30 ㎛에서 용출되었으며, 비페길화된 분해로부터 유래한 펩티드 지도에서는 볼 수 있었으나, 페길화된 NBN NK 분해로부터 유래한 펩티드 지도에는 존재하지 않았다.
실시예 3
키나제 수용체 활성화( KIRA ) ELISA 에서 내부 페길화된 누블라스틴의 효능 평가
페길화된 래트 NBN의 효능은 인산화된 RET의 존재에 대해 특이적인 ELISA의 NBN 활성에 대한 리포터로서 c-Ret의 NBN 의존성 활성화/인산화를 이용하여 측정하였다. NB41A3-mRL3 세포, 즉 Ret 및 GFRα3을 발현하는 부착성 쥐과동물 신경아세포종 세포주는 10% 태아 소 혈청으로 보충된 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM)내의 24 웰중에서 웰당 2 x 105 세포로 플레이팅하고, 37℃ 및 5% CO2에서 18시간 동안 배양하였다.
세포는 PBS로 세척하고, DMEM 0.25 ml 내에서 일련의 NBN 희석물을 이용하여 37℃ 및 5% CO2에서 10분 동안 처리하였다. 세포는 PBS 1 ml로 세척하고, 플레이트를 가볍게 흔들어 주면서 10 mM 트리스 HCl 0.30 ml, pH 8.0, 0.5% 노니데트 P40, 0.2% 나트륨 데옥시콜레이트, 50 mM NaF, 0.1 mM Na3VO4, 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드를 이용하여 4℃에서 1 시간 동안 용해시켰다. 용해물은 반복 피펫팅에 의해 추가로 교반하고, 샘플 0.25 ml는 50 mM 탄산염 완충액(pH 9.6) 내의 항-Ret mAb(AA.GE7.3) 5 ㎍/ml로 4℃에서 18시간 동안 코팅된 96웰 ELISA 플레이트에 이전하고, 차단 완충액(20 mM 트리스 HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% 정상 마우스 혈청 및 3% 소 혈청 알부민을 함유하는 0.1% 트윈-20(TBST))을 이용하여 실온에서 1 시간 동안 차단하였다.
실온에서 2 시간 동안 항온처리한 후, 웰은 TBST를 이용하여 6회 세척하였다. 인산화 Ret는 상기 웰을 실온에서 차단 완충액 내의 2 ㎍/ml의 호스래디시 퍼옥시다제(HRP)-컨쥬게이션된 항-포스포티로시나제 4G10 항체와 함께 2시간 동안 항온처리하고, TBST로 6회 세척하고, 비색 검출 시약을 이용하여 450 nM에서 HRP 활성을 측정함으로써 검출하였다. 용해물 또는 용해 완충액으로 처리한 웰의 흡광도 값을 측정하고, 바탕값 보정된 신호는 활성 화합물내에 존재하는 NBN 농도의 함수로서 플로팅하였다. KIRA ELISA내 페길화된 NBN의 효능은 10 nM이었으며, NBN NK 출발 물질의 그것과는 구별할 수 없었다. 2회의 동결-해동 사이클은 효능에 대해 영향을 미치지 못했으며, 이러한 처리 후에 상기 샘플의 유의적인 탁도 증가는 없었는데, 이는 샘플이 상기 연구를 위해 안전하게 해동될 수 있음을 나타내는 것이다. 분자당 별도로 3개 및 4개의 10 kDa PEG를 갖는 생성물의 활성을 평가하는 독립적인 연구에서, 3개의 PEG를 가진 부가반응 생성물이 완전한 활성을 나타내는 반면, 4개의 PEG 생성물은 감소된 활성을 보유함을 결정하였다.
실시예 4
래트 및 마우스에서 내부 페길화된 래트 누블라스틴의 약동학적 연구
래트 및 마우스 모델에서 여러가지 페길화된 및 페길화되지 않은 NBN 생성물의 약동학적 특성을 조사하였다.
데이타를 통해 확인할 수 있는 바와 같이, 3.3, 10000 Da PEG를 이용하는 래트 NBN NK의 페길화는 누블라스틴의 반감기 및 생체이용률에 유의적인 효과를 나타냈다. Sprague Dawley 래트에 1 mg/kg 정맥내 투여후, 3000 ng/ml의 페길화된 NBN의 피크 레벨은 7분후에 검출하였으며, 700 ng/ml의 레벨은 24시간 후에, 200 ng/ml의 레벨은 48시간 후에, 100 ng/ml의 레벨은 72시간후에 검출하였다. 1 mg/kg 정맥내 투여후 페길화되지 않은 NBN의 경우와는 대조적으로 7분후에 1500 ng/ml의 레벨을 검출하였으나, 3시간 후에는 70 ng/ml로 신속히 감소하였으며, 7시간 후에는 검출할 수 없었다. 페길화의 효과는 피하 투여에 의해 페길화된 NBN을 이용하여 처리한 동물에서 훨씬 더 현저하였다.
1 mg/kg 피하 투여후, 퍼길화된 NBN의 순환 수준은 24시간 후에 최대 200 ng/ml에 도달하였으며, 이 수준은 3일 동안의 지속 기간 동안 유지되었다. 대조적으로, 비변형된 NBN의 투여후 임의의 시간에서 검출가능한 NBN은 관찰되지 않았다.
페길화된 NBN 샘플의 분석은 각각 상이한 PK 프로필을 나타내는, 분자당 2개, 3개 및 4개의 PEG를 함유하는 부가반응 생성물의 존재에 의해 복잡해진다. 초기 PK 연구에서, 마우스를 이용하여 다양한 후보 및 투여 경로를 통해 스크리닝을 용이하게 할 수 있었다. 마우스 연구 결과 밝혀진 바와 같이, 후보들 간의 생체이용률 차이는 현저하였다. 그러나, 3.3 10 K PEG 부가반응 생성물을 래트 내에서 평가하는 경우, 마우스에서 평가하는 경우보다 래트에서 생체이용률이 보다 낮은 것으로 확인되었다. 이러한 생체이용률의 차이는 복강내 투여후에 특히 현저하였다. 마우스 내에서의 레벨은 7시간 후 1600 ng/ml에 이르렀으며, 24시간후 400 ng/ml에서 유지되었다. 대조적으로, 래트 레벨은 4 내지 48 시간 동안 100 ng/ml로 일정하였다.
야생형 래트 누블라스틴(wt-NBN) 및 Asn-대-Lys 치환을 95번 위치에 가진 누블라스틴(NK-NBN) 둘 다 STZ 당뇨병 래트 신경장애 모델의 효능 테스트에서 >95% 리폴딩되고, 정제되었다. Wt-NBN은 제형화하여 직접 동물 테스트에 사용한 반면, NK-NBN은 10 kDa PEG-SPA로 페길화하기 위해 제조하였다. 리폴딩 및 정제 목표를 달성하기 위해, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 이용하는 리폴딩 방법을 개발하여 이. 콜리 봉입체로부터 NBN의 대량 및 고농도의 재생을 가능하게 하였다. SEC 이외에, Ni-NTA 및 CM 실리카 컬럼 크로마토그래피 단계 모두를 이용하여 최종 단백질 순도를 증가시켰다. 상기 단백질에 대해서는 여러 분석 기법을 이용하여 특성을 분석하였는데, 사용된 분석 기법의 예로는 SDS-PAGE, 크기 배제 크로마토그래피, ESMS, KIRA ELISA에 의한 활성의 평가 및 내독소 함량의 측정을 들 수 있다. 최종 단백질 생성물의 SDS-PAGE 및 SEC는 95% 이상의 순도를 나타냈다. 각 생성물의 내독소 레벨은 0.2 EU/mg이었다. KIRA ELISA에서 양 단백질의 특이 활성은 약 10 nM 이었다. Wt-NBN은 인산염 완충 염수(PBS) pH 6.5 내에서 1.0 mg/ml 및 NK-NBN은 2.6 mg/ml로 제형화하였다. wt-NBN은 15 ml 튜브에 분취하였으며, -70℃에서 냉동저장한 반면, NK-NBN은 일단 페길화를 수행한 후에 분취 및 냉동하였다.
실시예 5
야생형 누블라스틴 및 N95K 누블라스틴 뮤테인의 리폴딩
NBN 형태 둘 다를 성숙 113 아미노산 서열의 출발 부위에 근접하는 엔테로키나제 절단 부위를 가진 His-태깅된 융합 단백질로서 이. 콜리 내에서 발현시켰다. Wt-(1.8 kg 펠릿) 또는 NK-NBN(2.5 kg 펠릿)을 발현하는 박테리아는 가울린 프레스를 이용하여 PBS 2 리터 내에서 용해시켰다. 봉입체를 펠릿화하기 위해 원심분리(10,000 rpm)한 후, 각 제조물로부터의 상청액은 폐기하였다. 봉입체 펠릿은 완충액(0.02 M 트리스-HCl pH 8.5, 0.5 mM EDTA)으로 2회 세척하고, 트리톤 X-100(2%, v/v)를 함유하는 동일한 완충액으로 2회 세척하고, 세정제 없이 2개의 추가 완충액으로 세척하였다. 펠릿 둘 다는 6 M 구아니딘 히드로클로라이드, 0.1 M 트리스 pH 8.5, 0.1 M DTT 및 1 mM EDTA를 이용하여 가용화하였다. 가용화 과정에 조력하기 위해, 각각의 펠릿은 폴리트론 균질화기를 이용하여 균질화한 후, 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 가용화된 단백질은 원심분리한 후, 수퍼덱스 200(0.05 M 글리신/H3PO4 pH 3.0 2M 구아니딘-HCl으로 평형처리된 5.5 리터 컬럼)을 통해 20 ml/분의 속도로 변성 크로마토그래피하여 세정하였다.
변성된 NBN은 SDS-PAGE에 의해 확인하였다. Wt-NBN 또는 NK-NBN을 함유하는 분획은 수집하고, 아미콘 2.5-리터 교반 세포 농축기를 이용하여 250 ml로 농축시켰다. 여과하여 임의의 침전물을 제거한 후, 농축 단백질은 0.1 M 트리스-HCl pH 7.8, 0.5 M 구아니딘-HCl, 8.8 mM 환원된 글루타치온 및 0.22 mM 산화된 글루타치온으로 평형처리한 수퍼덱스 200을 통해 재생 사이징 크로마토그래피를 수행하였다. 상기 컬럼은 0.5M 구아니딘-HCl을 이용하여 1분당 20 ml의 속도로 전개시켰다. 재생된 wt-NBN 또는 NK-NBN을 함유하는 분획은 SDS-PAGE로 확인하고, 수집하고, His 태그를 제거할 필요가 있을 때까지 4℃에서 저장하였다.
Ni - NTA 크로마토그래피( TR5919 -138)에 의한 NBN 의 농도
재생된 NBN은 24시간 이상 동안 4℃에서 저장한 후, NBN 단량체 사이의 이황화결합 형성을 촉진하기 위해 정제 처리하였다. 이 시간중, 침전이 형성되었으며, 이는 0.2 μPES 필터 유닛을 통해 여과하여 제거하였다. 비특이성 결합을 감소시키기 위해, 단백질 용액은 20 mM 이미다졸로 처리하고, 이어서 1분당 50 ml의 컬럼 완충액(0.5 M 구아니딘 및 20 mM 이미다졸)로 평형처리한 100 ml Ni-NTA(퀴아젠) 컬럼 상에 로딩하였다. 단백질 적용후, 상기 컬럼은 동일한 완충액을 이용하여 기준치까지 세척하였다. NBN은 0.5 M 구아니딘-HCl 및 0.4 M 이미다졸을 함유하는 용출 완충액 약 300 ml를 이용하여 상기 수지로부터 용출시켰다. 용출후, NBN은 실온에서 5 mM HCl의 10 용적에 대해 하룻밤 투석하였다(10 kDa 투석 튜빙을 이용함). 투석은 오염 물질의 가수분해를 촉진시켰으며, 구아니딘-HCl 및 이미다졸 농도를 각각 0.05 M 및 0.04 M로 감소시켰다.
라이실 엔도펩티다제 또는 엔테로키나제에 의한 His 태그의 절단
다음날, 투석중에 형성된 임의의 침전은 여과에 의해 제거하였다. 단백질 샘플은 약 150 mM의 잔류 구아니딘-HCl을 포함하는 최종 염 농도를 위해 5 M 스톡을 첨가함으로써 0.1 M NaCl로 제조하였다. 이 농도는 전도성 측정기를 통해 확인하였다. 추가로, 1 M HEPES pH 8은 최종 농도 25 mM을 위해 첨가하였다. 태그를 절단하기 위해, wt-NBN에 라이실 엔도펩티다제를 첨가하고, NK-NBN에 엔테로키나젤르 첨가하였으며, 양자의 경우 프로테아제 대 NBN의 비는 약 1:300이었다. 엔테로키나제는 NK-NBN에 대해서는 라이실 엔도펩티타제 대신에 사용하였는데, 이는 Lys95에서 돌연변이된 단백질내 추가의 프로테아제 절단 부위에 기인한 것이다. 상기 샘플은 실온에서 2 시간 동안 교반하였으며, 분해는 SDS-PAGE로 모니터링하였다.
Ni - NTA 크로마토그래피에 의한 His 태그의 제거
프로테아제 처리된 NBN은 1분당 50 ml의 속도로 0.5 M 구아니딘-HCl 및 20 mM 이미다졸로 평형처리한 Ni-NTA 100 ml에 적용하였다. 상기 컬럼은 동일한 완충액을 이용하여 기준치까지 세척하였다. 컬럼으로부터 유래한 임의의 단백질 세척물은 His 태그 없는 NBN을 함유하는 단백질을 통해 수집하였다.
CM 실리카 크로마토그래피
Ni-NTA 크로마토그래피후, 단백질은 즉시 CM 실리카 수지를 통해 추가 정제하였다. 로딩 완충액(5 mM 포스페이트 pH 6.5, 150 mM NaCl)으로 평형처리한 20 ml CM 실리카 컬럼에 1분당 20 ml의 속도로 NBN을 로딩하였다. 상기 컬럼은 세척 완충액(5 mM 포스페이트 pH 6.5, 400 mM NaCl) 20 컬럼 용적으로 세척하고, 상기 단백질은 1 M NaCl이 아니라 5 mM 포스페이트 pH 6.5을 함유하는 용출 완충액으로 용출시켰다. 용출된 단백질은 포스페이트 단독에 대해 하룻밤 투석하여 염 농도를 NK-NBN에 대해서는 100 mM 및 wt-NBN에 대해서는 150 mM로 감소시켰다. 양 샘플은 0.2 μ PES 필터 유닛을 통해 여과하고, SDS-PAGE에 의해 분석하고, 추가의 특징 분석 및/또는 페길화가 필요할 때까지 4℃에서 저장하였다.
Wt-NBN 및 NK-NBN은 UV 스펙트럼 분석을 통해 280 nm에서 그들의 흡광도를 평가하였다. 마이크로 수정 큐벳 및 완충액 단독에 대한 블랭킹을 이용하여 wt-NBN 또는 NK-NBN 100 ㎕를 베크만 분광광도계를 이용하여 230에서 330 nm까지 연속적ㅇ로 스캐닝하였다. 상기 분석에 기초하여 Wt-NBN의 농도는 1.1 mg/ml로 결정되었으며, NK-NBN의 경우 2.6 mg/ml로 결정되었다(A280 nm-E0 .1%=0.5를 각각의 단백질에 대해 사용하였음). 1% 미만의 침전 물질은 330 nm에서의 흡광도에 기초하여 확인하였다.
상기 두가지 단백질 제조물의 순도를 평가하기 위해, 각각의 샘플(0.5 mg)은 16/30 수퍼덱스 75 컬럼을 통해 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 상기 컬럼은 400 mM NaCl을 함유하는 5 mM 포스페이트 pH 6.5로 평형처리하고, 1분당 1.5 ml의 유속으로 전개시켰다. 280 nm에서 측정한 흡광도에 기초하여, wt-NBN 및 NK-NBN 둘다는 예상된 분자량(23-24 kDa)의 단일 피크로 이동하였으며, 이들은 임의의 유의적인 단백질 오염을 함유하지 않았다.
wt-NBN 및 NK-NBN 둘다는 2.5 M 구아니딘-HCl, 60 mM 트리스 pH 8.0 및 16 mM DTT에서 감소되었다. 감소된 샘플은 짧은 C4 컬럼을 통해 탈염하고, 3중 4극자 기구를 이용하여 ESMS에 의해 온라인 분석하였다. 상기 ESMS 생 데이타는 MaxEnt 프로그램에 의해 디컨볼류트(deconvolute)시켜 질량 스펙트럼을 생성하였다. 이 과정은 다중 하전된 신호의 킬로달톤(kDa)의 분자량에 직접적으로 상응하는 하나의 피크로 붕괴되는 것을 가능하게 한다. wt-NBN에 대한 디컨볼류트된 질량 스펙트럼은 우세한 종이 12046 kDa임을 나타내는데, 이는 상기 단백질의 113 아미노산 형태에 대한 예상 분자량 12046.7 kDa과 상응하는 것이다. 또한, 부 성분(12063 kDa)도 관찰되었는데, 이는 산화 생성물의 존재를 암시하는 것이다. 3개의 피크가 NK-NBN 샘플에서 확인되었다. 주 성분은 커보기 분자량이 11345 kDa임을 입증하였는데, 이는 상기 단백질의 106 아미노산의 예상된 분자량에 일치하는 것이다. 다른 2개의 피크는 11362 및 12061 kDa의 분자량을 나타냈는데, 이는 각각 NK-NBN 산화 및 113 아미노산 형태의 존재를 암시하는 것이다.
NK-NBN 제조물내 106 및 113 아미노산 형태의 존재의 원인인 엔테로키나제를 이용한 분해에서 찾을 수 있다. 바이오자임으로부터 유래한 이 프로테아제는 송아지 장 점막으로부터 정제한 천연 효소 제제이며, 약한 트립신 오염(엔테로키나제 1 ㎍당 트립신 0.25 ng)을 함유하는 것으로 보고되어 있다. 따라서, 트립신은 Arg7의 카르복시 말단 측면 상에서 NK-NBN에 작용하여 우세한 106 아미노산 형태를 생성할 수 있다. 한편, Wt-NBN을 절단하기 위해 사용한 라이실 엔도펩티다제는 His 태그내에 함유된 라이신 잔기의 카르복시 말단 측면 상에 작용하는 단일 프로테아제 활성을 보유하여 성숙 113 아미노산 NBN 형태를 생성한다. NBN의 106 및 113 아미노산 형태 둘 다는 동일하게 테스트한 모든 분석에서 활성이 있었으며, 구아니딘-HCl 안정성 면에서는 유사하게 거동하였다.
NBN 활성은 실시예 3에 기술한 KIRA ELISA를 이용하여 NB41A3-mRL3 세포내에서 c-Ret 인산화를 자극할 수 있는 그의 능력에 의해 측정하였다. 인산화된 Ret는 포획된 수용체를 HRP-컨쥬게이션된 포스포티로신 항체(4G10; 웰당 0.2 ㎍)와 함께 (2시간 동안) 항온처리하였다. 항온처리후, 상기 웰은 TBST로 6회 세척하고, HRP 활성은 비색 분석을 통해 450 nm에서 검출하였다. 용해물 또는 용해 완충액 단독으로 처리한 웰로부터 얻은 흡광도 값을 측정하고, 바탕값에 의해 보정하고, 테이타는 활성화 혼합물내 존재하는 누블라스틴 농도의 함수로서 플로팅하였다. 상기 데이타로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 정제된 NBN은 인산화된 RET의 출현을 초래하였으며, 이는 정제된 NBN은 상기 분석에서 활성이 있음을 의미하는 것이다.
실시예 6
혈청 알부민- 누블라스틴 컨쥬게이트의 제조
PBS내의 1 mg/ml의 농도의 야생형 래트 누블라스틴은 1 mM 설포-SMCC(피어스)로 처리하고, 탈염하여 과량의 가교제를 제거하였다. 야생형 NBN 단백질은 단지 그의 N-말단에 단일 아민을 함유하고 유리 설프히드릴기를 보유하지 않기 때문에, SMCC와의 반응은 그의 N-말단에 부착된 SMCC를 이용하는 NBN의 위치 특이적 변형을 초래할 것으로 예상된다.
NBN-SMCC 컨쥬게이트 60 ㎍은 소 혈청 알부민 120 ㎍과 함께 항온처리하고, SDS-PAGE에 의해 가교의 정도를 분석하였다. BSA는 단일 유리 SH기를 함유하였으며, 결과적으로 NBN-SMCC 컨쥬게이트와의 반응은 SMCC 상의 말레이미드를 통해 이 부위에서 변형을 초래할 것으로 예상된다. 이들 조건 하에서, 더 큰 분자량의 2개의 추가 밴드가 관찰되었으며, 이는 단일 BSA 부분 및 2개의 BSA 분자를 이용하는 NBN의 변형에서 질량 면에서 일치하였는데, 그 이유는 각각의 NBN 분자는 반응을 수행할 수 있는 2개의 N-말단을 함유하며, 결과적으로 상기 개념과 부합되기 때문이다. 이들 밴드의 형성과 동시에, NBN-SMCC 및 BSA 밴드의 세기는 감소하였다. 잔류 NBN 밴드의 세기에 기초하여, 상기 반응은 70-80% 완료된 것으로 확인되었다.
단일치환된 생성물은 주로 상기한 페길화 연구에 대해 기술한 바와 같이 수퍼덱스 200 컬럼(파마시아) 상에서 양이온 교환 크로마토그래피 및 크게 배제 크로마토그래피를 상기 물질에 대해 수행하여 반응 혼합물로부터 정제하였다. 겔 여과로 얻은 컬럼 분획은 SDS-PAGE로 분석하고, 일치환된 생성물을 함유하는 것들은 280 nm에서 흡광도를 측정하여 단백질 함량에 대해 분석하였다. BSA의 질량은 누블라스틴의 질량에 비해 약 2배였기 때문에, 겉보기 농도는 3의 비율로 나누어 NBN 등가물을 얻었다. 이 분획은 KIRA ELISA에서 기능에 대해 분석하였다. wt- 및 BSA-컨쥬게이션된 NBN 둘 다에 대한 IC50 값은 3-6 nM이었는데, 이는 BSA에 대한 컨쥬게이션이 훼손된 기능을 보유하지 않음을 나타내는 것이다.
이들 예비적인 연구들은 BSA를 이용하여 이루어졌지만, 래트 및 인간으로부터 유래한 상응하는 혈청 알부민 단백질 또한 유리 SH를 함유한다. 결과적으로, 유사한 방법을 이용하여 래트에서 PK 및 효능 연구를 수행하기 위한 래트 혈청 알부민-래트 NBN 컨쥬게이트 및 임상 시험을 수행하기 위해 인간 혈청 알부민-인간 NBN 컨쥬게이트를 생성할 수 있다. 유사하게, SMCC는 한 측면에 아미노 반응성기 및 다른 측면에 티올 반응성기를 함유하는 임의의 다수의 가교제로 대체할 수 있다. 티올 반응성 말레이미드를 삽입하는 아민 반응성 가교제의 예로는 AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS 또는 GMBS이며, 반응성 할로아세테이트를 삽입하는 것은 SBAP, SIA, SIAB이며, 환원성 결합을 생성하기 위해 설프히드릴기와 반응하는 보호된 또는 비보호된 티올을 제공하는 것은 SPDP, SMPT, SATA 또는 SATP이며 이들 모두는 피어스에서 시판되고 있다. 이러한 가교제는 단지 예시적인 것이며, 다수의 대체적인 방법들을 NBN의 N-말단과 혈청 알부민을 결합시키기 위해 사용할 수 있다. 또한, 당업자는 NBN의 N-말단 또는 혈청 알부민상의 티올 부분에 표적화하지 않는 혈청 알부민에 대한 컨쥬게이트를 생성할 수 있다. NBN이 그의 N-말단, C-말단, 또는 상기 양 말단에서 혈청 알부민에 융합되는 경우 유전자 조작을 이용하여 생성된 NBN-혈청 알부민 융합체는 작용성일 것으로 예상된다.
이 방법은 일상적인 적용을 통해 동물, 결과적으로 인간에서 연장된 반감기를 가진 생성물을 생성할 수 있는 임의의 NBN-혈청 알부민 컨쥬게이트로 확장될 수 있을 것이다.
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Pepinsky, Blake R Borjack-Sjodin, Paula Ann Miller, Stephan S Rossomando, Anthony <120> Polymer Conjugates of Neublastin and Methods of Using Same <130> 00689-506-061 <140> Not Yet Assigned <141> 2002-01-23 <150> 60/266,071 <151> 2001-02-01 <160> 13 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Consensus Sequence <220> <221> VARIANT <222> (3) <223> Wherein Xaa is Gly or Thr <220> <221> VARIANT <222> (4) <223> Wherein Xaa is Pro or Arg <220> <221> VARIANT <222> (5) <223> Wherein Xaa is Gly or Ser <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> Wherein Xaa is Ala or Thr <220> <221> VARIANT <222> (11) <223> Wherein Xaa is Ala or Thr <220> <221> VARIANT <222> (12) <223> Wherein Xaa is Gly or Asp <220> <221> VARIANT <222> (26) <223> Wherein Xaa is Arg or Ser <220> <221> VARIANT <222> (33) <223> Wherein Xaa is Arg or Ser <220> <221> VARIANT <222> (38) <223> Wherein Xaa is Val or Ile <220> <221> VARIANT <222> (51) <223> 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Rattus norvegicus <400> 4 Ala Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Ala Thr Asp Ala Arg Gly Cys 1 5 10 15 Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly Leu Gly His 20 25 30 Ser Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg 35 40 45 Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala 50 55 60 Gly Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser Gln Pro Cys 65 70 75 80 Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser 85 90 95 Thr Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu 100 105 110 Gly <210> 5 <211> 675 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 5 atggaactgg gacttggaga gcctactgca ttgtcccact gcctccggcc taggtggcaa 60 ccagccttgt ggccaaccct agctgctcta gccctgctga gcagcgtcac agaagcttcc 120 ctggacccaa tgtcccgcag ccccgcctct cgcgatgttc cctcgccggt cctggcgccc 180 ccaacagact acctacctgg gggacacacc gcacatctgt gcagcgaaag agccctgcga 240 ccaccgccgc agtctcctca gcccgcaccc ccaccaccgg gtcccgcgct ccagtctcct 300 cccgctgcgc tccgcggggc acgcgcggcg cgtgcaggaa cccggagcag ccgcgcacgg 360 gctacagatg cgcgcggctg ccgcctgcgc tcacagctgg tgccggtgag cgctctcggc 420 ctgggccaca gctccgacga gctgatacgt ttccgcttct gcagcggttc gtgccgccga 480 gcacgctccc cgcacgatct cagcctggcc agcctgctgg gcgccggggc cctgcggtct 540 cctcccgggt cccggccgat cagccagccc tgttgccggc ccactcgcta tgaggcagtc 600 tccttcatgg acgtgaacag cacctggaga accgtggacc atctctccgc caccgcctgc 660 ggctgtctgg gctga 675 <210> 6 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: KD2-310 Oligonucleotide <400> 6 gtatctttca tggacgtaaa gtctacatgg agaaccgtag atcatctatc tgcaacc 57 <210> 7 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: KD3-211 Oligonucleotide <400> 7 ggttgcagat agatgatcta cggttctcca tgtagacttt acgtccatga aagatac 57 <210> 8 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: KD3-254 Oligonucleotide <400> 8 gctggaactc gcagctctcg tgctcgtgca acggatgcaa aaggctgtcg 50 <210> 9 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: KD2-255 Oligonucleotide <400> 9 cgacagcctt ttgcatccgt tgcacgagca cgagagctgc gagttccagc 50 <210> 10 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: KD3-258 Oligonucleotide <400> 10 ggagccggag cactaaaatc tccccgggat ctagacc 37 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: KD3-259 Oligonucleotide <400> 11 ggtctagatc ccgggggaga ttttagtgct ccggctcc 38 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: KD3-256 Oligonucleotide <400> 12 gacgaattaa ttaagtttcg tttttgttca gg 32 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: KD3-257 Oligonucleotide <400> 13 cctgaacaaa aacgaaactt aattaattcg tc 32

Claims (34)

  1. 서열 번호 2의 아미노산 8-113과 95% 내지 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 2의 95번 위치에 해당하는 위치에서 아스파라긴 이외의 아미노산을 포함하고, 상기 폴리펩티드는, 이량체화되는 경우, 신경세포 유도된 향신경성 인자 훼밀리 수용체 알파-3[Glial-Derived Neurotrophic Factor Family Receptor Alpha-3 (GFRα3)]에 결합하고, 95번 위치에 해당하는 위치에서 치환된 아미노산은 폴리에틸렌글리콜이 상기 폴리펩티드에 부착될 수 있는 부위를 도입하는 것인 폴리펩티드.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 서열 번호 2의 95번 위치에 해당하는 위치의 아미노산은 라이신인 것인 폴리펩티드.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제2 부분(moiety)에 융합된 제1항의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질.
  9. 제8항에 있어서, 상기 제2 부분은 인간 혈청 알부민 폴리펩티드인 것인 융합 단백질.
  10. 제1항의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.
  11. 제8항의 융합 단백질을 코딩하는 핵산.
  12. 제10항의 핵산을 포함하는 벡터.
  13. 제11항의 핵산을 포함하는 벡터.
  14. 제12항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  15. 제13항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  16. 제14항에 있어서, 상기 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 세포인 것인 숙주 세포.
  17. 제15항에 있어서, 상기 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 세포인 것인 숙주 세포.
  18. (a) 제1항 또는 제3항의 폴리펩티드의 발현이 가능한 조건 하에서 제14항의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계
    를 포함하는, 제1항 또는 제3항의 폴리펩티드의 제조 방법.
  19. (a) 제8항의 융합 단백질의 발현이 가능한 조건 하에서 제15항의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 융합 단백질을 회수하는 단계
    를 포함하는, 제8항의 융합 단백질의 제조 방법.
  20. 제1항 또는 제3항의 2개의 폴리펩티드를 포함하는 이량체.
  21. 제8항의 2개의 융합 단백질을 포함하는 이량체.
  22. 폴리에틸렌글리콜에 컨쥬게이션된 제1항 또는 제3항의 폴리펩티드를 포함하는 컨쥬게이트로서, 상기 폴리에틸렌글리콜은 서열 번호 2의 95번 위치에 해당하는 위치에서 치환된 아미노산에서 상기 폴리펩티드에 컨쥬게이션된 것인 컨쥬게이트.
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 폴리에틸렌글리콜에 컨쥬게이션된 제8항의 융합 단백질을 포함하는 컨쥬게이트로서, 상기 폴리에틸렌글리콜은 서열번호 2의 95번 위치에 해당하는 위치에서 치환된 아미노산에서 상기 융합 단백질에 컨쥬게이션된 것인 컨쥬게이트.
  26. 제22항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 글리코실화되어 있는 것인 컨쥬게이트.
  27. 제1항 또는 제3항에 따른 폴리펩티드 및 생리적으로 허용 가능한 비히클을 포함하는, 신경계 질병 또는 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  28. 제8항의 융합 단백질 및 생리적으로 허용 가능한 비히클을 포함하는, 신경계 질병 또는 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  29. 제22항의 컨쥬게이트 및 생리적으로 허용 가능한 비히클을 포함하는, 신경계 질병 또는 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  30. 제25항의 컨쥬케이트 및 생리적으로 허용 가능한 비히클을 포함하는, 신경계 질병 또는 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  31. 제27항에 있어서, 상기 신경계 질병 또는 질환이 말초 신경병증 또는 신경병증성 통증 증후군인 것인 약학 조성물.
  32. 제28항에 있어서, 상기 신경계 질병 또는 질환이 말초 신경병증 또는 신경병증성 통증 증후군인 것인 약학 조성물.
  33. 제29항에 있어서, 상기 신경계 질병 또는 질환이 말초 신경병증 또는 신경병증성 통증 증후군인 것인 약학 조성물.
  34. 제30항에 있어서, 상기 신경계 질병 또는 질환이 말초 신경병증 또는 신경병증성 통증 증후군인 것인 약학 조성물.
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