HU228973B1 - Polymer conjugates of neublastin and methods of using same - Google Patents

Polymer conjugates of neublastin and methods of using same Download PDF

Info

Publication number
HU228973B1
HU228973B1 HU0500637A HUP0500637A HU228973B1 HU 228973 B1 HU228973 B1 HU 228973B1 HU 0500637 A HU0500637 A HU 0500637A HU P0500637 A HUP0500637 A HU P0500637A HU 228973 B1 HU228973 B1 HU 228973B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
polypeptide
protein
variant
nbn
neublastin
Prior art date
Application number
HU0500637A
Other languages
English (en)
Inventor
Dinah W Y Sah
R Blake Pepinsky
Paula Ann Borjack-Sjodin
Stephan S Miller
Anthony Rossomando
Original Assignee
Biogen Idec Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen Idec Inc filed Critical Biogen Idec Inc
Publication of HUP0500637A2 publication Critical patent/HUP0500637A2/hu
Publication of HUP0500637A3 publication Critical patent/HUP0500637A3/hu
Publication of HU228973B1 publication Critical patent/HU228973B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/4756—Neuregulins, i.e. p185erbB2 ligands, glial growth factor, heregulin, ARIA, neu differentiation factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A61P29/02—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID] without antiinflammatory effect
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)

Description

NEUBLASZTIN POLIMER KONJUGÁTUMAI ÉS ALKALMAZÁSI ELJÁRÁSAI
Áltaiáoosságbaí! a találmány tárgyát képezik poiipeptidek és közelebbről módosított, neurotróf poiipeptidek és a módosított poiipeptidek alkalmazásának eljárásai.
A neurotróf faktorok a természetben előforduló fehérjék, amelyek elősegítik a túlélést, fenntartják a fenotipikus differenciáétól, megakadályozzák a degenerációt és fokozzák az idegsejtek és az idegszövetek aktivitását, Neurotróf faktorokat idegszövetből és olyan nem idegszövetből izoláltak, amelyet az idegrendszer idege·?, be, és fbnkeionáiisan és szerkezetileg rokon csoportokba sorolhatók, amelyeket családoknak, szupercsaládoknak vagy alcsaiádoknak neveznek, Neurotrólfaktor-szuperesaládok a fibroblaszt növekedési faktor, a neurotrofin. és a ttanszformáíó növekedési faktor-β (TGF-β) szuperesaíádok, A neurotróf faktorok egyedi fajtái a fizika! szerkezetük, a kogrsát receptorukkal történő kölcsönhatásuk és a különböző típusú idegsejtekre való hatásuk alapján különböztethetők meg, Á TGF-p-szupercsaládba osztályozhatók a gliasejtvonal eredetű neurotróf faktor (GDNP) ügandok, amelyek például a GDNP, a persephin (PSP) és a neurturín (NTN).
A GDNF-alesalád ligandjai megegyeznek abban, hogy a RET-receptor tirozin-kmázoa keresztül szignált indukálnak. A GDNF-alcsaíád ezen három ligandja különbözik a neurotróf receptorok családja, a GFRareceptorok felé irányuló relatív affinitásukban.
A közelmúltban leírt egyik neurotróf faktor a neublasztin vagy ”NBN. Á neublasztin a CDNFalcsaládba tartozik, mivel más GDNF-ligandokkai homológ szakaszok találhatok benne, és mivel kötődni képes a RET-hez ós aktiválni tudja. Más GDNF-ligandoktól eltérően a neublasztin erősen szelektív s GFRa3-RETreceptorkompiexre. Ezen kívül az NBN egyedi aíszakaszokat tartalmaz az aminosavszekveneiájában.
Sajnos a neablasztmt a szervezet gyorsan kiüríti. A gyors kiürülés gátolja a neublasztin terápiás alkalmazásait, Szükség van tehát jobb biológia! hozzáférhetőségü neubiasztin-variánsok azonosítására.
A találmány részben neublasztin olyan ój formáinak felismerésén alapul, amelyek ój vivő kedvezőbb farmakokinetikaí tolajdonságúak és jobb a biológiai hozzáférhetőségük. ilyen új formák például a polimer molekulákhoz kapcsolt, variáns neublasztin-polipeptidek.
Egyik vonatkozásában a találmány tárgyát képezi variáns neublasztin-polipeptid vagy muteiuooublasgfio-ix'lipepíid (megváltozott antinos&vszekvencíájű neublasztin-polipeptid), amely például olyan aminosavszekvencia, amelyben egy vagy több aminosavszubsztitúeió található az érett neubíasztin-dimer oldószernek kitett helyzeteiben, A szubsztitúciók egy vagy több helyes alakítanak ki ís natív nenhiasztinpolipeptidben, amelynél anyagok, például természetesen előforduló vagy szintetikus polimerek kapcsolhatók a poiipeptidhez, és ezáltal jobb lesz az oldhatósága és & biológiai hozzáférhetősége ín Avo, Előnyösen a találmány szerioti variáns poiipeptidek olyan aminosavszekvenciát tartalmaznak, amely legalább 70%-ban azonos az 1. azonosítószámú szekvencia szerinti szekvencia S-113 helyzetű aminosavaivaí. A variáns neublasztinpolipeptidben egy vagy több ammosavszubsztítúélő van, ahol argiuintól eltérő aminosav található a variáns polipeptid aminosavszekvenciájának 14, helyzetében, arginintói eltérő aminosav található a variáns polipeptid aminosavszekvenciájának 39. helyzetében, arginintói eltérő aminosav található a variáns polipeptid aminosavszekveneiájáaak ŐS. helyzetében, asispísragiotöl eltérő aminosav található a variáns polipeptid antinosavszekvenctájának 93. helyzetében, amikor a?, axninosavakat az 1. azonosítószámú szekvencia szerinti poiipeptid-szekvencia szerint számozzuk.
A leírás szerinti értelemben a vad típusú neublasztin” vagy vt-NBN” kifejezéseken temészeteseo előtekdó vagy mtív oeteiésteo'tókwi^aekveriosái óétek, gdteal pastóny, <ár vsgy hmste eredtei tó?btetósi (tód például a A, 3, vagy 4, aaoÍwáóssdani m:elsvesse.íákaO. A kxmktó, smrtes sseobtózimixsfevjpítótó a lefeás éseste: *N8N-XiNsXs* (0 W Χ^Χ^-Ι’ΒΝ* (1.1) képletekkel jeföljdk» tóét X; Jeted a vad liptói estetóztó»m4lp®itót agy stewsvsi, X) Jeted a tekveoelsbaa tód Xs amtósav szám swíad belystei ez 1, azmatetetesd atevsmeta azmm sdom. Az X; Jeted tó aa mmmtóvsg amely a vsad dpetó ssmooAsvai tetetek? a szeteetea tetetóeti, szám mtf teyeetexm, Az 148N-N95K például tó a vertes stedsastio'pokpepddoí lelete, melyben a 95, deiytebesi tód as?ivmigte üzlo tsalyedetek
A vtófcs oessfetó'tess-pokpepte mdltlmes polspepíM letek A variáns omtóasstegetegte pektel dimes tetet amely bgalább ®gv varíéua nesÍbbszttópsskpopdáei tartalom, Egyes megvaldaitói módok saerím a dióssá vtóáes oatótetómtetptóiAisk tómmllasesje, Más megtóótótó módok szerte a slteer itóateteer, amely egy vadam neubtaísa-potipepíMet ka egy vad dpsná sstebbsste'poitpeóikte tettesem. Máa áteerek te teteted stedss ésoofetózlfepískpepdódórmái tettesomivteak.
Ntetey megvalósítói mód szetei a variáns .mtelatós-ptópspdd aa 1, szmmsdtetetó oekwtóa mmüsd szekvencia 1-7 ímtytóó stósmssvaít A tartalmam a §413 ímíytóií stoiootsvakoo kitel, kitevői ssegtóósitel módok swbt a variáns msblssatm-polipepUd, amikor dmmr állspobsao vám kdtóllk a GFted-daoz, További eldnyte megvalósítói módok szerte a vattása seaistóategaoiipepdík. atekor diámé stejxteta vsa, smkete XBT-polipepild itóatótóteéétókikd, tód önmaga éttó, akár OERtó-koz kbiddve.
További előnyös magvaídstósí módok atóisd a vadító oeobiéssife-gxslpmisikl, endkor dteer áSspedsaa vas, odvte a smsasm, póktól egy órsönenron lóletérók
További elönyós inegv,teteted módok tserte a varsám oeokiaatóa-jxíl.pxapiki, amíkn? átmér tesgotem vsa, a sasaim, póktól agy feőnweo pamióglás vátetóte ooeetóktóte
Tatebbl elOsyós megvalósítási módok szerte a varsám stóbtotóin-itóipeptó, aszókor álmer állapotban van, átesik a tótóm póktól agy aakmte somos vagy agy áep«wrg számon látélései.
kgyss megválódtól módok szerte. a variáns stóztózStsz-poitpepód kói, bárom vagy több mtersssvszníztótóemi letetem a ktetekezók kdzbl: asymteól eltérő sjsmssmv testeid & wite potpsepikt «tess vázákvetó&tóak 14., helyzetében, srgmmíól eted smmosav adliteld a vartós gotlgepiid anszmísavszsstótneldjétsak 39, telyzsdóbesr ítsyitesiói oltód amtetó teteted a vartós polipéitól smstemévéstevnssemjénte ód. ttóysekteo, aszparagítel etted asaíaosav isűtete a variáns polípep^d aisismeévazekvenciáitótó: 95, ítóyzetexm,
Eiteyds megvalósítói módok szerint a 14,» a. 39., a ók, és s 93, ttóystóek egyikében vagy söbbiében lévő sstónosav Utó,
Előnyősén a vértes ssetslztaszteypokpeptid 3-94 es kó- i 13 tested smtesavaó logtóbh IWkteo azm uosak as I . msmodtestem eetevetea mated teksmoeb 3-94 és Só-l 13 kelytóó tótesetevat, .tsteyósokbssa az aotetów.eteeaote iegakWb atóxtek, Btóiydsebboa a. vartóa 5seobteateteWw44 amlsmsavéateveteáíé tómteaetóen ekkfetóstó patósök teste vagy égik esedekl íseabtezifetedipepste tókmasvtóakvesmkijíd imsatetóo a vertes otóMtóteagtóipapte áz 95-113 tested amsaotesbtó. kdkitel a vartes sm?tóte:km^x?k|5epdd 3-94 sk* 9ó413 helyteó tótesévéi kmtótótedják s 2., a 3, vagy a.4, stóotekistemó sstówtóák 3-94 se 95-11.3 Mytóó msskatevteak «tesévmsskvesmskte
A tósbtóy tegylk képsal któbba. tetős ίόοόφ W tefeteM amely savi» mtebatós' W ligete osiobtóabtótetepBte vagy tói tó?blaszte Ifekteelteie skmeéjtedl étid lekérte
?
χχ χ * tartalmaz. A neubl&sztit; fúziós fehérjékssk szintén jobbak a fermakokínetikai tulajdonságai és a biológiai hozzáférhetősége 8« V8W.
Egy másik szempont szerint a találmány tárgyát képezi variáns aeublasztin-polipeptidet kódoló nukleinsavmolekula. A variáns neublasztin-polipeptidet kódoló nukleinsav előnyösen vektorban, például expressziós vektorban van. A variáns neublasztin-aukieinsav vagy az ezt tartalmazó vektor sejtben lehet. A sejt lehet például emlőssejt, gombasejt» élesztősejt, rovarsejt vagy bakteriális sejt. Előnyös emlőssejt kínai hörcsög petefészeksejtje (Cbinese h&mster ovary cell, CHO-sejtek),
A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás variáns neublasztin-polgjeptid készítésére oly módon, hogy a variáns neubfeszím-polípeptídet kódoló nukieinsavat tartalmazó sejtet olyan körülmények között tenyésztjük, amely lehetővé teszi a variáns neebiasztin-polipepód expresszióját. Kívánt esetben a variáns neíárisszsks-poiipeptíd ezután kinyerhető. A találmány tárgyát képezi továbbá a sejt által előállított variáns neublasztin-polipeptid. Hasonló nukleissavakra, vektorokra, gazd&sejtekre és pohpeptid-termelési eljárásokra a leírásban .közlünk kitanílást a találmárty szériád fúziós fehétjék számára (például neublasztin-szérumalbuntin-föriósfebétjék).
A találmány tárgyát képezi továbbá egy természetben elő nem forduló polimerhez kapcsolt neubiasztmpoiipeptideí vagy variáns neublasztin-polipeptidet tartalmazó készítmény. A készítményben lévó variáns neublasztin-polipeptid olyan aminosavszekvenciát tartalmaz, amely legalább 70%-ban azonos az 1. azonosítószámú szekvencia szerinti, 8-11:5 helyzetű aminosavakkal, feltéve, ha a variáns neublasztin-polipeptid egy vagy több atninosav-sziíbsztitóciót tartalmaz az alábbiak közük atgmintol eltérő aminosav Iniáíhatő a variáns polipeptid «mmosavszekveacityának 14. helyzetében, arginintói eltérő aminosav Salálhstó a variáns polipeptid aminosavszekvenciájának 39. helyzetében, arginintói eltérő aminosav található a variáns .polipeptid aminosavszekvenciájának 68, helyzetében, ass^togintói eltérő aminosav található a variáns polipepíid aminosavszekvenciájának 95. helyzetében, ahol az aminosavak helyzeteit az I. azonosítószámú szekvencia szerinti potipeptid-szekvesciának megfelelően számozzuk.
Előnyös megvalósítási módok szerint a polimer egy polialkilén-glikoi-részt, például polietilén- glikoh részt (PEG) tartalmaz.
Előnyös megvalósítási módok szerint a polsalkiiétí-glikol-részt a neubiasztin-polipeptíd aneinocsoportjához vagy a variáns neublasztin-poiipeptidben lévő Iizmhez kapcsoljuk.
A kapcsolás N-hidroxil-szukcínimid (NHS) aktív észteren kérésziül valósulhat meg. Az aktív észter például PEG-szukesnimidil-szukcmát (SS-PEG), PEG-szukcinimidil-butirát (SEB-PEG) vagy PEG-szukcinimidílpropionát (SPA-PEG) lehet.
A polialküén-glikol-rész például karfeoxímetii-NHS, norieucin-NHS, SC-PEG, txesyiate, aldehid, epoxíd, karbomi-tmidazoi vagy PNP-kaxbonát lehet
Egyes megvalósítási módok szerint a poliaJkiién-gliko!.-részt a aeublasztin-poíipeptid vagy a variáns neublasztin-polipeptid eiszíeinesoportjához kapcsoljuk, A kapcsolás például maieimid-esoportoa, viniiszulfoncsopoxton, hsloaceiáí-csoporton és tiolesoporton keresztül töriét-heí.
Egyes tstogvalóslSásI módok szerint a készítményben lévó neublasztin-polipeptid vagy variáns seublasztbi-polipeptid glikozilált. Ha a aeublsszils-polípeptiá vagy s variáns polipeptid glikozilált, a polimer a glikozilált neublasztin-polipeptid vagy variáns neublasztin-polipeptid szénhidrátiészéhez kapcsolható. A polimer például a glikozilált neublasztin-polipeptid vagy variáns neuhlasztin-polípeptidhez ts glikozilált seubiasztinpolipeptíd vagy variáns neublasztin-polipeptid hidmzol- vagy aminocsoportjának, vagy a polimer reaktív csőportjának oxidációin után kspcsofnató.
hfás megvalósítási. módok szerbi a. senbi-eszdn-pokpeprid vagy & variáns aeublasxtm-polipeptiá egy, két, három vagy négy EBG-fest tartalmazhat.
Előnyös megvalósítási módok szerint a neubiasztlo-potipepddnek, a variáns aooblas»rin-pöhpqrtidnek vagy a polimtzkonjogtennak hosszabb a szfem-feléteridoje a polimer sélkali pohpepbd vagy variáns polipepttá föléieridejébes képest.
Előnyős megvalósítást módok szerint a komplexben lévő neufeiasztín-polipqriíd, variáns neoblaszlinpolipepdd vagy pohmerkoiyúgátum a kóve&ezŐ ííziölőgiai. aktivitások bármelyikével bírhat:; GFRoJ-kötós, RET-aktiváció, neuron patológiás változásainak nmmalizálása vagy ideg túlélésének növelése,
A K«evs»s patológiás változásainak normalizálása* kifejezésen azt értjük, hogy a konjugátum a kővetkező sek.es jellemzők egyikénél vagy többnél változást okoz: szerkezed fehérje, neorotróífaktor-metsptor, íoncsatoraa vagy egy fcanszmiiter expmsszlós szintében, vagy a sejtes morfoiógsábast okoz változási, mindegyik esetben oly módon, hogy a neurosbaa ezeknek a patztmétemfotsk a szintjét lényegesen visszaállta a betegségtől, degenerációtól, sérüléstől vagy sebesüléstől nem érintett iboobposssl megegyező vagy hasonló szintre, A neuron patológiás változásainak normalizálása immonhisztokéraíai módszerrel követhető nyomon, vagy a kiválasztott vagy levált sejtes termékek szintjében íörióm változás mérésével, vagy az érintett aeusonfok) fenketójához feioh>gisi.te köthető viselkedésben történt változások mérésével áiiapitbató meg. Például soeropsriás fájdafem tünettel kapcsolt patológiás változások esetén Bjásinú viselkedés, például hlperaigesia, hipcalgeria vagy allodynis vizsgálható.
Az ideg túlélésének növelésén’1 az érintett neuron túlélésének meghosszabbodását értjük, amely hoszazahb az ugyanilyen liposú bstogsóggei, rendellenességgel, sérüléssel vagy sebesüléssel érinteti, de a találmány szerinti neuhfesztm-ktmlu^tmamal vagy füziós fehérjével sem kezelt, megfelelő aeurotmál megfigyelt túlélési periódusnál.
Egyes megvalósítási módok szerint a polimert a polipeptídhez a neobhsriin N-terminális Ítélvén kapcsoljuk. Egyes megvalósítási módok szerint a polimert a polipeptídhez a neubhsztin-polipeptid vagy variáns mmblasztin-polipeptiá nem terminális ammosavánál lévő helyhez kapcsoljak.
Előnyös megvalósítási módok szerint a polimert a neublasztin-polipeptid vagy variáns neublaszriu*polipeptid oldószernek kitéri amínosaváhez kapcsoljuk.
Előnyös megvalósítási módok szerint a polimert & ncablasztin-polipepridhez vagy variáns nenhlaszímpolipeptfcfeez az alábbi helyeken lévő aminosavak bármelyikéhez kapcsoljuk; a variáns polipeprid aminoterminális atninosaváitoz, a neublasriia-polipeptíd vagy variáns neublaszíin-poiipeptid anmrmvszokvwasiájónak 14. helyzetéhez, a neublasztm-pol^eprid vagy variáns neablaszőa-polipepíid winosavsmkvencíájának 39. helyzetéhez, a xmhiaszím-pelipepííd vagy variáns nenblasztih-pötípeplid amiaosavsmkvesciájáask óh, helyzetéhez, a risnbbtsztín-tmlgtsptid vagy variáns poüpeptid gsnmösamékvsöeiájának 95. helyzetéhez,
A találmány tárgyát képezi továbbá gyógyfesd készítmény, amely fiziológiailag elfogadható hordozóban iévó vagy abban eloszlatott, találmány szerinti neubíasrito^lsp^ttdet, variáns neahlmzriu-polipepíidet vagy kopjngsüonot tartalmaz,
A iniékséay egy további szempontja szerint a tahVnoány tárgyát képezi stabil, vízben oldható, kotgugált ísoobiafeb-polípeptid vagy variáns neublferin-pelspeprid-k&mptes, amely na'obissztb-polipeptidét vagy variáns seobinszbn-prdipopíiáet íambnsz polteídén-ghlmi-tészhez kapcsolva, ahol a rsenbbsszrin-pribpepíid vagy variáns neublasztin-polipeptid a polietilén-glikol-részhez labilis kötéssel kapcsolódik. Egyes megvalósítási módok szerint a labilis kötés szulfhidril-hasítással bontható. Előnyős megvalósítás? módok szerint a labilis kötés í'k v/vo körülmények között hasítható.
A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás olyan módosított neublasztin-poiípeptid előállítására, amelynek hosszabb az aktivitása in wrro és /» vivő a vad típusit neublaszttnhoz képest oly módon, hogy előállítunk egy neublasztin-polipeptidet vagy variáns neublasztin-polipeptidet, és a polipeptidet vagy módosított variáns neublasztírs-polipeptídet egy természetben elő nem forduló polimerrészhez kapcsoljuk, igy egy kapcsok poíimer-neuhlasztin-polipeptid készítményt kapunk.
Egy további szempont szerint a találmány tárgyát képezi eljárás idegrendszeri. rendellenesség kezelésére vagy megelőzésére egy egyedben (például emberben) oly módon, hogy az egyednek szükség esetén variáns neublasztta-polipeptid, polimerhez kapcsolt neublasztin-polipeptidet vagy variáns neublasztin-polipeptidet tartalmazó készítmény terápiásán hatékony mennyiségét, vagy stabil, vízben oldható. konjugált neublasztinpolipeptidet tartalmazó komplex vagy polietilén-glikol-részhez kapcsolt neublasztin-polipeptidet vagy variáns neublasztin-polipeptidet tartalmazó variáns neublasztin-polipeptid-komplex terápiásán hatékony mennyiségét adagolj uk.
Előnyösen az idegrendszeri rendellenesség perifériás idegi rendellenesség, például perifériás neuropátia vagy ?ieuropátsás fájdalmi tünet A kezelésre előnyös «gyedek a humán szervezetek,
A beadás mód ja lehet például szisztémás vagy lokális.
Hacsak más nincs feltüntetve, a leírásban alkalmazott valamennyi technológiai és tudományos kifejezést ugyanolyan értelemben alkalmazzuk, amely szakember számára, akire a találmány tartozik, jói isnaert. A leírásban ismertetett eljárásokhoz és anyagokhoz hasonlók vagy azonosak· a találmány gyakorlása vagy vizsgálata során alkalmazhatók, a megfelelő eljárásokat és anyagokat az alábbiakban Ismertetjük. A leírásban említett valamennyi publikáció, szabadalmi bejelentés, szabadalmi irat vagy más hivatkozás teljes egészében a leírás részét képezi. Vita esetén a leírás a meghatározásokkal együtt irányadó. Az anyagok, eljárások és példák csak .a szemléltetést szolgálják, de nem korlátozzák a találmányt.
A találmány egyéb vonásai és előnyei a kővetkező részletes leírásból és a szabadalmi igénypontokból nyi Iván valóak lesznek,
A következőkben részletesen ismertetjük a találmányt. A találmány tárgyát képezik áj, variáns neublasztin-poüpeptidek, amelyek úgy módosíthatók, hogy a farmakokinetíkai tulajdonságaik és a biológiai hozzáférhetőségük kedvezőbb legyen. Előnyös variáns neublaszttn-polípeptideknek megváltozott az aminosavszekvenciájuk, amely elősegíti egy polimer anyaghoz, például polietílén-glikol-polimerhez történő kapcsolásukat.
VffiánsneiAlasztin^ohpeetiágk
A találmány tárgyát képezik neubíasztin-polipeptidek, amelyeknek a vad típusú neublasztin-polipeptid szekvenciájához képest változott az aminosavszekvenctájuk. Humán és egér eredetű neubíasztin-polipeptidek aminosavszekvenciáit a WOOÖ/Ö1S15 számú atrterikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban teszik közzé. A találmány szerinti variáns neubíasztin-polipeptidek példáit az 1. táblázatban mutatjuk be.
A variáns neubiasztin-polipepttdhen a megváltozott aminosavakat előnyösen úgy választjuk, hogy elősegítsék egy' polimer, például polialkiléa-glikoi-polimer kapcsolódását a módosított aminosav helyénél. A neublasztin-polipeptid módosítására előnyős helyek a neuhlasztin-polipeptidben az oldószernek kitett szakaszoknál lévő helyek. Esek a helyek a rokon neurotróf faktor, a GDNF kristályszerkezetének vizsgálata alapján
Φ X Φ * V φ
Φ* ΧΦ X χ χχ «
Φ ΦΦΧΦ ΦΦ φχ vábszfatők ki, «mely tóstáíyswkezei ouBsífee a N&t Stotct Biot 4,435-38 (1997) folyúiratóan biálholó. Ilyen helyek kiváhsshfa a p«tz<?phitro.«oblaszttK kiméta fehérjék által szolgáltatott sztakezeti-fimkcíonálts ibhnnfaón is alapulhat A hfesMk issnartebso a 3, Biot Chem. 225, 3412-20 ¢2000) ikúyéhatbim található, ilyen siapos azonosítód, öktószet számfa hnazáféthetó vagy fehöeíro kitolt neablasztin-aiöinosavak példán) szolgáló felsorolása a 2, hibláfahs» látható.
A tótáhnány tóxgyát képezi wifa nenbisfampolipqnkt smefaek: aohimssvwkvefaája legalább 70%baa azonos az 1. amtmítószátsú sfavesmia. ssodoti amfawmmk várnia 8-113 helyzetű aatíaosavaml, amelyet «« 1. tábiázofan tooisbnk b«. Egyes megvalósítási módok szerbi a polipeptid «tnitsozavzzekvweiái^s a 14., 39., 68. Myzetóhhen lévő egy vagy több atgtnint vagy a 95. helyzeiheo lévő aszparagfnt «ergísíntóí vagy aszparagántól khfaböző amroosavra cseréljük, Előnyösen a vad típusban lévő aminosavai Imímml vagy efaekmel heíyeöesbjök.
Utófefel
AGGPGSPARAAGAKGCSX»RSQt:VPVPALGLGHP,SOSLV&P' barnán AGTRSSSARTTSAAGCRLPSQLVPVSALGLGIISSLELiRPegét AGTRSSRAHATDARGCRLRSQLVPVSALGLGHSSOSLIRF patkány «g---srar-~'~argcrlxsqlvpv-silgigh-z;:bl~rf konszenzus
RPCSGSCRP.ARSPHÖLSLASLLGAGh.LRPPPGSRPVSQPC barnán RGGSGGGRRARSÖRGLSLASLLGAGALRSÜÜGSRRISQPGegét RRGGGSGRRARSPhDLSLASLLGAGALRSPRGSRülSGPC pbkáay r fcsoscrrars-bdlslssllgagal r-ppgsrp~sqpc konszenzus
CRPTRYEAVSí^DVKSTWRTVDRLSATACGCLG hamsa (2. azonosítószámú szekvencia) CRPTRYEAVS^t'SVtlSTWRTVDHLSATACGCLG snoase (3. azonosítószámú szekvencia) CRRTRYfaVSyMDVfaTERTVÜHlbATAÜGCLG tat (4, azosfatéfamú szekvencia) orptryeavsfadvrxstwrfcvd-lse fcacgclg coosensös (1. azonositősfaná szekvencia)
Konszenzas szekvencia:
Alá Gly Xaoj Xaa2 X««3 Sas? Arg Alá Arg Kaa^ Xsa5 Xaa« Alá Arg Gly Cys Arg Len Arg Sor Gin Len Val Pro Val. Xas? Alá Geo Gly Leu Gly Kis Xsa$, Ser
Asp Gin Leó Xaa.·) Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Gys Arg Arg Alá Arg
Ser Xaax;) His Asp Lea Ser Leu Alá Ser Lea tea Gly Alá Gly Alá Leu Arg Xaau Pro Pro Gly Ser Arg Pro Xeai2 Ser Gin Pro Gye Gye Arg Pro Thr Arg Tyr Glo Alá Val Ser Phe Plet Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Xaa13
Lan Ser Alá Thr Alá Cys Gly Cyo Lea Gly shol
XísíSj Gly vsgy ián
Xss3 Pro vagy Aíg
Xstg Gly vagy fa
Xmí Ála vagy l.bc .Xfa Alá vágj' Thr .Xfa Gly vsgy Ásp
Xas)· Atg vagy Ser * » φ ·>
Xs3s Arg v&gy Ser Xam Vai vsgy Se
Xa&i» ?ro v&gy <3ln
Xíu; i bre vsgy Ser Xaa® Val vagy He Xas» Arg vagy His
A 2, táblázatban a barnán ersetóü nenblaaaxinbat) lévő azon aminosavakat és számozásaikat tüntetjük fel, amelyek várhatóan a felülete» helyezkednek el. A felületen található aminosavakat patkány eredetű, Á- és BfeacokbOl álló GDNT-őimsr (FDB kód 1AGQ) szerkezetének vizsgálatával határozik meg, annak mssgálatíívsl, hagy ve|sm az asainosav a szerkezei felületé» verne. Ezt a szerkezetet azntáa GDMF ás neablaszba [Balok ás mtsai.» Mm® 21,. 1291 (1998)] szekvmcia egymás mellé rendezésével kssoidítottak Össze, hogy meghatározzuk a neublasztíahan lévő. megfelelő sminosavakat. A számozás ogyaaaz, mint az 1. táblázatban.
2. táblázat
t Ab ;vs
2 Gly ats
3 Gly rés
4 Ά» rés
5 Gb? sfe
Oteréa
7 Arg rés
ÜAferés
g Arg rés
ÍÜAfesafe
11 Aisata
BGly8·
BAH-
15 Gly 8
te cys -
17 Arg *
BAee-r
19 Arg v
.28 fe-8
2tGLv8
2.2 b-s's.v-8'
23 Vsl -
24 hr© -v
25 Vsl-
SéArgv
27Ab-r
ΐ LSÁetr- 24 Gly 8'
35 Asg *
34 Gén 8
37Uv-v
33 vsl·
39 Arg *
40 rése-
41 Arg v
4'2fem-
43 Cys-
44 fe ···
45 Gb'·8
44 Ser *
47 Cys-
4kArg·8
49 Arg 8
SÖAfe-
52 Sérv
S3 Áss v
54 His ·
55 Asö -
59 Alá 8
éO.fev
Ő1 fe -
CJ Lsa v
03 Gly ©
$4 .Al& ί·
OS Gly V
04Afe +
07 Les -
OS Asg réa
09 réss rés
70 the rés
71 fefe
72 Gly φ
73 fe ©
74 Arg rés
75 Fr© ré»
7SW-
77 fe-
79Gfe-
7ViA.cs··
SŐ Cys-
§1 Cys.:.. 22 Arg33 rh© ·
I §ő tea *' J 1 ábhar-'j
LSJőT.d
547¾- tS Argv ág Tyr 8 ί tGGfe* j
áh AU -
55 Val©
90fe ©
91 fe -
§2M«s©
43 Asy v
§4 Ved *·
05 Asn *
M Ser -
47 Ths *
ASfea·
73Asg8
tOSTbr©
^.Mt.·.· 192 Asp8
KGArg©
l«ü»-
tos fe-
100 AH-
187 Tbr©
108 AH©
fetfe-
uow*
mcys-
Ü2.fe©
IBGÍy
rés
n/a jelsah azokat az smsnoaavskat» amelyek ameaenek a öSNÉ szerkezetében, Ezek részben kosstokcsófervo' zás rnimt miálbtiék itt meg, részben flexibilis smkaszok» részben neabiamkiaban lévő összérték a GDW-hez fc^est (6S-? 1 asaioossvsfe).
~ jelend azokat az amixrosavslea^ amelyek mélyekben bolyeshedímk el ás nem a fehiterém, vagy pedig a kisselφφ φφ rtAkétésbee tteí vev§ «tana miemmvskst, Mivel ex a egy élmeiebég («ayatón ksébü, aa eattssmvsk többsége a ielöieme idMhsiö, *· jeteikl a GDNF smfesdébsg a íriöfetns khett wiamvafeak melyekről igy leltéteieaéietö, hegy- a asctette is a Mm MélbsiéK Mr & M-75 awsomakaí tartabmé Iwök csak egy öDWMMbe» tétlmtö (vetésshséteg rtesibitts), Be s hmssk a ®NP4a képest egy 4 mlsössvhél étté hssertet is tartalma a mtblésrtirthes.
A leirtis ssetttstt éeiéiesebe:s ax ew®ö«8^ és 'xlxsmittögK vsgy Gxseélégkrt kilejeaéseket egymással feltwéltaö fogateWiM hamsak, és két gsttiyeyed, me-lehtts vagy köt aakfetasav krtsötti saakwxdak&seelöságet ésstLek ebrts, Ha mhéket ésssehsseakteti saekvetóábaa egy feiasmyos helyveiises agyasaa a bdrts vagy misem me&mmxsiegység található (fjáláásl, ha a két DNS-s»<ttstelábaa ax adott helyxafee» edeaét található, vagy a két poiipepiidbee ax adott tóyxathe» Ua$a trtáfetö), ekte a megfelelő moletelák m a helyxette aéxve homolégtA. A két ssekvessis kösrtti a aaáaaltos homelégis a két seekvesds páaos&bató vsgy homológ helyxetaísak ax ómabasoaUtött helyietek sxámával tértéoö tamásával és löCMsal vslé sxojaással ssáerttbató ki. Példáid, be a két wkveactáhaa H5 beiysetbél é gsmkhasé vsgy- homológ, skksr a kér aaakvrta«is ikW'bass beaxdög. Péittásl a CRI.ACT és s CAGOTT WS~axdtvwíák öttés-bse homölégtik (aa össeeseo. δ iseiyseibél 3 egyesek). ÁtekUw ax ömebtwdiiÁsf skkm végmttk, amikig a két szekveaeiát oly módos vmteák egymás kegy axaafcaáhs Immelégiát kapjeek. llysa. egysed» omtté «Μ példásé Nserthx töaa és «skálám! eiífertával vágtstbetö [Mseátesem és rntssl,, X Mai Üké, 4g, 443-453 (IttAl)], mely egysssrkss seámlíégépes programokkal, péklástt Állgo-ppogrsmmal (DNAstar, Ide,) kivltebsfietö, IdámdéA saekvsasíák sxok, smlyekbeo, bs egymás esetté .asatteók éket, axoaos vagy hasonló mhtosevyk találhatók, és shstt a bmeló sesisessvsk a esetté reetiexett tetewissxekvesKkt megfelaló asskwsvsteak ksexervsttv sirnK srtltéeiéi vagy !>megesg«óett ixmisesláeléiA Pbbee a vmtstkombrt&st a rofesveeiesztAveeelábies tévé amlsosav Imsitóv sxobaahióoiójs*’ oly® obasraií iérsesö hetyetetHk, amely fbikíbbg vagy feskolosátts® hasonló & ismgttsleté teiemeomaoésessevbex, példáéi hasonló a ssérste, alakja, alokttttSW töltése, kémiai kttsyóooságal, beleértve a ksvaleas vagy bhlrogéskőtések kislaWssesk képességét, vagy Imsoslö áttsgdsmságek, A Wmfc m?bstWtóés vasiá»* mktmda sfebas khléohögik a mfemeolmek®o«látöl vagy s vasi tipmrt rnkvesssiálol, hogy agy vagy több taamiiv s®bsxldéoíé vagy ospgeogmlett psertssetáeié található hasasa.
Séoyds sesgsrtiésMsi mértek seertot atalátaáoy ssmsti pol^opöá 3ό%-Μο5 83%-haa, ittrtá-bsst, $5%« bee, 98%4m vagy kööb-bae axössw ax i. ;mmsskésmimé wfevwafe $n»t aaakwada k-113 belyzskö ásd'· aoaavaíval Egyes mgvskkkéé ®éás>k ssermt a vadáes aebbbe£ke''éSílbs«?öiki am^öaavwkwsema dmé~ szataaea aiűgsúuló· pélkéey, hmke vagy ekét eretfestt eeebhsg&r'psilipsgttid amtoavw^wsmájáí tattíttieseas a vsriétss m&Iwib-$öl^af»Sá 1-5)4 és §§·Ί 13 helyseik atehiesevaíeéi, yéisiéitt a pisllpeprtsi atósmmekveaeiéja a 2 ., a 3. vsgy a 4. .weesrtémáieil saekvesesék seertsb ;mkesmv§seAvsieeés «kbess a imiyeeieklxvs,
Aa i-4. smsertkGvémé mkvesteiék yyvkki sgsAvmééksél ktttebttxő vsrkte swbhtóbixiigxgsrtábee egy vsgy iébb fetwtvertv smkmeawstetitrtesé Mélhssé. ggy másik iefeeiséségkést. va^ sxm khrttt « vartátts eeebfeádie-ixkipé^tkl egy vagy lébb a® temvattv .ambxmivsmtertiédsfes vagy sleléstkrtsse vagy Imwselébssts ktttrtssWrtmt. Blitttyésee s méssxbWlék, ktssetelék vagy rteiéelék w wdk testtsm ax Igéiéit btéléglai ekbvttését,
Kmswvsttv mtbsMléesék jelfemées példád egy mimmtvegk egy másik, iwwki jdtemtlífcd hité sieiesssasvsl tértéért bslyetedésés jetertk, géláést a kévettart esegssrttm betttti ssafemttéeiéksrt vett®, atasa κ χ és glicin, íeucín, valin és izoíeucin; aszparaginsav és glutaminsav; aszparagirt és glutamin; szer;», ciszteis és treonró; lizin és arginin; és fenilalanin és tirozin. Nem poláros, hidrofób aminosavak például az alanin, a ieucin, az izoíeucin, a valin, a prolin, a fetül&laam, & triptofáa és a metrónin. Poláros, semleges aminosavak például a glicin, a széria, a treonin, a cisztein, a tirozin, az aszparagin és a glutamin. Pozitívan töltött (bázisos) aminosavak például az arginin, a lizin és a hisztidm. Negatívan töltött (savas) aminosavak például az aszpamginsav és a glutaminsav. Az előzőekben felsorolt, poláros, báztsos vagy savas csoportok egy tagjának bármilyen helyettesítése ugyajrezen csoport egy másik tagjával konzervatív szubsztitúciónak tekinthető.
Egyéb szubsztitúciók szakember számára könnyen azonosíthatók. Például alanin amlnosavat D-alanin, glic in, béta-alamn, L-cisztein és D-cisztein bármelyike helyettesíthet. Lizin esetében D-íizia, arginin, D-argmin, homo-arginia, metionin, D-metionin, omítin vagy D-oroitm bármelyike helyettesíthet. Általában íunkciooáEísan fontos szakaszokban történő, az izolált polipeptid tulajdonságaiban várhatóan változást okozó szubsztitúciók azok, amelyeknél: (í) poláros aminosavat, például szerint vagy treoniat hidrofób aminosavra (vagy aminosavvaí) cserélünk, például ieucisra, tzoleucinm, femlalaninm vagy alaninra, (ii) ciszteint bármilyen más aminosavra (aminosavval) cserélünk, (ül) pozitív tőltéeő oldaliártccal bíró aminosavat, például liánt, arginint vagy hisztídint negatív töltésű oldallánccal bíró aminosavra (vagy aminosavval) cserélünk, például glutaminsavra vagy aszparaginsavm, vagy (iv) terjedelmes oldailánecal bíró aminosavat, például fenílalanint olyanra (vagy olyannal) cserélünk, amelynek nincs ilyen oldaliánca, például glícinte, Annak a valószínűsége, hogy az előzőekben említett, nem konzervatív szubsztitúciók egyike megváltoztathatja a fehérje funkcionális tulajdonságait, összefügg a szubsztitúció helyével, a fehérje funkcionálisan fontos szakaszainak unatkozásában: egyes nem konzervatív szubsztitúcióknak ezek szerint a biológiai tulajdonságokra kis mértékű hatása lehet vagy egyáltalán nincs hatása.
A találmány tárgyát képezik multimer poltpeptiáek, például egy variáns neufelasztin-pölipeptid. A multimer polipeptidek előnyösen tisztított muítimer polipeptidek. Muhimer komplexek például a dimer komplexek. A muítimer komplexek lehetnek heteromer vagy homomer komplexek. A multímer komplex lehet egy variáns neablaszria-polipeptídet és egy nem variáns nenblasztint tartalmazó heterpdimer 'komplex, vagy két vagy több variáns seublasztin-polipeptidet tartalmazó heterodhner komplex.
Egyes megvalósítási módok szerint a variáns neublasztín-polipeptid kötődik' GFR.a3-hoz, Előnyösen a variáns neublasztín-polipeptid kötődése serkenti RET-polipeptíd foszforilációját. A vizsgálatot, hogy egy polipeptid kötődik-e GFR«3-hoz a WOÖO/OISIS számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban ismertetettek szerint végeztük. A CHO-sejtvonal léiúlúszójának fcápközegében lévő neublasztin jelenléte .például Sanicoia és munkatársai hármas komplex vizsgálatának módosított formájával hható le [Sanicola és mtsai,, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, Ó23S (i 997)]. Ebben a vizsgálatban a GDNF-szerú molekulák azon képessége értékelhető, hogy RÉT extraceiluláris doménje és különböző koreceptorok, GFRal, GFRa2 és GFR«3 között kötődési közvetítenek. A RÉT és a koreceptorok oldható fonnál &?.íós fehérjékként állíthatók elő. Patkány~RET extraceiluláris doménje és placeatóiís alkahkus-foszfatáz közötti rófeós fehérjét (RET-AP), és patkány-GFRal extraceiluláris doménje (feltárva a 1997. november 27-én közzétett WO9744356 sz. nemzetközi közzétételi iratban, amely a leírás részét képezi) és humán-lgGl Fc-doménje közötti fúziós fehérjét (rGFR.(al-lg)j már leírták (Sanicola és mtsai., Proc. Natí. Acad. Ser. USA 94, 6233 (199?)].
Egyes megvalósítási módok szerint a s'aríáas neublasztín-polipeptid növeli a neuron túléléséi vagy normalizálja a neuron patológiás változásait vagy mindkettőre hat. Olyan vizsgálatokat, amelyekkel meghatározható, hogy egy polipeptid nőveli-e a neuron túlélését, vagy nonnaltzálja-e a neuron patológiás változásait például a
X X
WOGÖ/Ö1815 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban ismertetnek. Előnyösen a neuron érzőneuron, autonóm neuron vagy dopaminetg neuron.
Variáns
Variáns neublasztin-poiipeptidek szakember számára jól ismert eljárásokkal izolálhatok. Természetesen előforduló neublasztin-poiipeptidek sejtes és szöveti forrásokból izolálhatók megfelelő tisztítási módszerrel, hagyományos fehérjetisztitási technológiák alkalmazásával. Egy másik lehetőségként, variáns neublasztinpoiipeptidek kémiailag szintetizálhatok hagyományos peptidszintézis-technológiákkal. Rövid aminosavszekvenciák szintézise a pepiidkémiábatt a technika állása szerint alaposan kidolgozott. Lásd például Stewart és mtsai., Solíd Phase Pepiidé Synthesis (2. kiadás, 1984).
Eg y másik megvalósítási mód szerint a variáns neublasztin-poiipeptidek rekombináns DNS-technoiógiákkal állíthatók elő. Például a variáns neublasztin-polipeptidet kódoló nukleinsavmolekula vektorba, például expressziós vektorba építhető, és a nukleinsav sejtbe vihető. Alkalmas sejtek például az emlőssejtek (például huroánsejtek vagy kinaí hörcsög petefészeksejtjeí), gombasejtek, élesztőseitek, rovarsejtek és bakteriális sejtek. Amikor a rekombináns sejtben expresszijük, a sejtet előnyösen olyan körülmények között tenyésztjük, amely lehetővé teszi a variáns neublasztin-polipeptíd expresszióját. A variáns neublaszlin-polipeptid kívánt esetben a sejtszuszpenzióhől kinyerhető. A kinyerhető kifejezésen azt érijük, hogy a variáns polipeptideí elválasztjuk a sejt vagy a tápkőzeg azon komponenseitől, amelyekben a kinyerési folyamat sióit volt. A kinyerési folyamat egy vagy több félgombolyttásr és iiszíhási lépést jelenthet.
Variáns neublasztin-poiipeptidek a technika állása szerint jól ismert, számos eljárás bármelyikével készíthetők. Egyik ilyen eljárás a helyspecifíkus rautagenezis, amely során egy bizonyos nukleotídot (vagy kívánt, őseiben kevés számú bizonyos nukleotídot) változtatunk meg annak érdekében, hogy egyetlen aminosav {vagy kívánt esetben kevés számú, előre meghatározott. aminosav) megváltozzon a kódolt neublasztin-polipepiídben. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a helyspecifíkus mutagesezis rutin és széles körben alkalmazott technológia. Gyakorlatilag sokféle helyspecifíkus mutagenezisre szolgáló reagenskészlet kapható kereskedelmi forgalomban. Egy ilyen reagenskészlet például a Transformer Site Dixected Mutagenesís Kit Clonteeb Laboratories forgalmazásában (Palo Alto, Caltf.).
A találmány szerint, hacsak más nincs feltüntetve, hagyományos sejtbiológiái, sejttenyésztési, molekuláris biológiai, mikrobiológiai, rekombináns DNS, fehérjekémiai és immunológiai technológiákat alkalmazunk, amelyek szakember számára jói ismertek. Ilyen technológiákat az- irodalomban ismertetnek. Lásd például Molecular Cioning: Á Laboratory Manual, 2. kiad., szerk.: Sambrook, Fritsch és Maniatis, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory Press (l 989): DNA Cloníng, I. és Π. kötet, szerk.: Glover, D. N, (1985); Oligonucieoíide Synthesis, szerk.: Gait, M, J. (1984); US 4.683.195 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat (Mullis és mtsai.); Nucíeic Acíd Hybridization, szerk.: Haines, S. D. és Higgins, S, J. (1984); Transcription and Transiation, szerk.: Hames, B. D. és Higgins, S. L (1984); Culture of Animál Cells, szerk .: Freshney, R. L, kiad.: Alán R. Liss, Inc, (1987); Immobilized Cells and Fnzymes, kiad.: IRC Press (1986); A Praebcal Guide to Molecular Cioning (15, Perbal) (1984); Methods in Enzymology, 154. és 155. kötet, szerk.: Wa és mtsai,, kiad.: Aeademic Press, New York; Gene Transfer Vectors fór Mammalían Cells, szerk,: Miller, L H. és Calos, Μ. P., kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Immunochemical Metbods in Cell and Molecular Biology, szerk..: Mayer és Walker, kiad.: Aeademic Press, London (1987); Handbook of Experiment Iramunology, I-IV kötetek, S2erk.: Weir, D. M. és Blackweil, C. C. (1986); Manipulating the Mouse Embryo, kiad.: Cold Spring Harbor
ΧΦΦΦ φφ ·:
ΦΦ φχ φφ tafeemímy fotós (Fktói), fcvéss essek» e wíám ssessbtósstós'gisíspejjs:® Atóés feböj«.tet ásbitótó ekk A tófolestóy amfcrt fe> késjék gfokks pébtók ax tóstótógss fetóyfo kfobssrösé sssskesert tóméi, ssselyek megvs-yák ss feselőgjai aktivitást A bitó sxemti ámüemtón a *&i&* kifcssé-m tót vagy tóbb bkéyfo vagy fmgmsnsetfc tó-tótótó, temleaa késését értjük, mely ax e®edi mpüdvtóístóti .teesxtöl vssktórt meg, elfeyöse&tóa eseksé « bMpétós: axcmos leolvasást kmttóa (sm ÍStówtós) fetótóő peiimtótekfo-exűstótó gmtókssi expressxiójával vslősfikató mag. kltóytó, Ki a febésjék vssgsy ftagamseík köfostóbó fotóstól axármaxnafe. Blfoytó ütóitó fofojék tótó egy második réssámx, mely m vártám m&tartm, Mtem kapmfe vsrttas tóstósstósvfebésje vagy Előnyösen a stóstósk tóé mmemetkám b fotóé stósyegtótól sxAtmaxiig.
és elegendő afetóx, bégy föfcsmtó mártákü tódtótófotó étósyy jobb bfofoyisb tómtóheifoégfo bsrtoslbssst x stóbisstói.tstósbtsepbstók.
A vasfaj aefoktófo.tóbstófoís^bntstóbwib fotód” példán! olyas fotófo, mely a találmány awinti vtótós oesssfosssstfo-pebpegBíbs vagy ifognstótós wtalmaxax, amelynek tó vagy Ctórstósélb vége kemtóts tóymstóük a hmtóa-stórmnaltórnöt-pal^ti^ex [Lásd Syed és mtsai,, Bfofo §§, 3243 {199?), Yeb és mtsai, B'foÁS USA |g, 1VS4 {WS) és US 5.87$,§Ő§ és S.tófotó? axámó mérttel egyestül élfomktób axafeaáslmi fotótó.], A tótóltó fehérje* Hfótóós® fofobbé olyan vártám neefelasxtmt ss értóifo amely mem vsgy tótótótótó-tósiktss ötóékfoin toe^dl kőmsaüag kagsesolőősk egy második sfotótó, amely tm variáos sefoltótótóhésjss, és mely tó nevo késtói fotótól btókjétói ax aiébtótów imertetertak swfet
Netsbitóistótséstófotómbt-tótóék ts tótóátó tótós siserfos femert efofotódtó tótófestótó Stastifem tóstóstótóst kialakító msbfesfo, amely megfelelő smirwatóv cselem és tótesitóv «sportot tartxbnax, aiteteaxfeníd a tótótertámtó axámmalbmintóx tbrtésfo tóstótó. A&abm kapcsold moleteiák {üsitórtó} például sx smmmsktlv tóssstóstóést fobstó molekulák, svstóytó tfofostöv maleimidet ápiieaak tó. Ihwek fotótól ax SMCC, ax AMAS, & SMFS, ax MBS, xx BMUS, ax Μ», ax SMFH, a KMVS vagy a OMBS, W tóbbs alkalmsa kapcsoló ntóvtelék tótótórtv tebaeetát-ea^mtot égstósek tó. .Ilyenek fokból sn SSAK ax SlA, ax SiÁlk, és sstó, ssgtóytó vtótó vagy nm váltó, tóit ahkttsnsk ki wfobidnfosístórtfosfo tstóétó teák«fotóz, .fogy íítófóÖtóté kapcsolatot látásimnak, fotótól nx $BBF, ss SMF'í, ax SATA vagy ax FATF, amelyek sfotósyyska kamtkedetó Intgaimatea tepkaáS (pl, .Ffosvs Öbemfeafe). Saskemfest kitalálhat hasonló stótó ssmtók sstsehtótól ssssWtófe NXmétóisss sssémstókstóksisex Whtók g&épstótósé tó ss, hogy stótósstóv sxéstsssssltóísstóssös tdyae .tósgísgétssstóka? is ks tói alskfemi, maelysk am an MBK Atóetsstóáltók vagy a tóétóstótósxsks tófeétóés. tófossak meg, Kívánt ese&en KBHsxésvssssakstóshtótótók géstóvtówktótós mátorekke.1 éltófotók elő, stól KMt stónsstóitósxsks gtógétós. .fosttókfosk ax NBstótótóitóksv a C-tósstóisltófo vssgy mtótótó tógstó
NsélvtówM foysíbtó, tógy sskstón ofesrn NBtófotótófe^k wtóy sdtótes (embert tó stóértve) kössssslfo btóktóáét mtóstóytó tómtö stókégfokkfo efoéltótófo.
Yartfe stótóWstók egyéb stósmsséfctó gékfetó wbbss sseobtótób vssgy Mgsxsessstók sstó tófeésyékkel W7 tókyegtósktói sslfotórt femfotó ta^tgátómi W stgysvgétó&sú. gékfetó otótósbtótós tebfeíbtó W~ iétó ssstótótó tódfe fovébbl M- vagy C'tsmitólfostóaí mtótóssysss, A tóssgssgéM pspsfó gékltól sfogoá (vssgy tótófo} peii^e^&mlrtweía Iától a fofeétó tótetótótó mtetófetó, amely íeolmmdtósőm vagy jtótówssósstóWs sstóKyigs a febéíjfo eljstótó a tófobtófo tótyáről a tó&skléss tólyése a sejtestó>tóísöe vagy sejtfalon belülre vagy kívülre (pí. élesztő alfa-faktor vezető). Neublasztin-recepiorfehérjék tartalmazhatnak, olyan peptídeket, amelyeket a neublasztin tisztításának vagy azonosításának megkönnyítése érdekében adtunk hozzá (pl. hisztiáin/neublasztia fúziók). A neublasztin annnos&vszekvenciája az Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-AspAsp-Lys pepiidhez (DYKDDDDK) is kapcsolható [Hopp és mtsai., Biotechnology ő, 1204 (1988)}. Ez utóbbi szekvencia erős antigéntulajdonságó és specifikus monoklonálís ellenanyag által reverzibilisen kötött epitópot biztosít, amely az expresszált rekombináns fehérje gyors vizsgálatát és könnyű tisztítását teszt lehetővé.
Ez a szekvencia marha nyálkahártyájából származó cnterokinázzal is hasítható az Asp-Lys párt közvetlenül követő aminosavnái.
Kívánt esetben egyetlen polimermolekula alkalmazható a neublasztin-poiipeptiddei történő konjugátum kialakításához, bár elképzelhető, hogy egynél több polimermolekula ugyanúgy' kapcsolható. A találmány szerinti, konjugált neublasztin-készitméayek mind m vivő, máid nem in vivő alkalmazásoknál hasznosíthatók.. Nyilvánvaló továbbá, hogy a konjugátumot képző polimer bármilyen más csoportot, részi vagy egyéb konjugált formát használhat, amely a végső felhasználáshoz megfelelő. Egyes alkalmazásoknál hasznos lehet például a polimerhez kovalensen kötni olyan funkcionális részt, amely UV-homiással szemben rezisztenciát vagy amíoxidációs tulajdonságot. vagy egyéb tulajdonságot vagy jeltezöí biztosit a polimernek. További példaként, egyes alkalmazásoknál előnyös lehet úgy alakítani a polimert, hogy reaktívvá vagy keresztkötés kialakítására alkalmassá váljon, a teljes konjugált anyag különböző tulajdonságainak vagy jellemzőinek kedvezőbbé tétele érdekében. Ezek szerint a polimer bármilyen működést, ismétlődő csoportot, kötést vagy más, állandó szerkezetet tartalmazhat, amely nem akadályozza a konjugált neubiasztínmutein-készítmény hatásosságát a szándékolt célra.
Ilyen kedvező jellemzők elérésére alkalmazható polimerekre szemléltető példákat a leírásban, az alábbiakban ismertetünk, a például szolgáló reakcióvázlatokbas. A kovalensért kötött pepíidek alkalmazásánál a polimer valamely működésre alkalmassá tehető, majd a peptid(ek) szabad aminosavához/atninosavaíhoz kapcsolhatók, hogy labilis kötéseket alakítsanak ki.
Egyes megvalósítási módok szerint a neublasztin-polipeptid a polimerhez a polipeptiden lévő terminális reaktív csoporton keresztül kapcsolható. Egy másik lehetőségként vagy ezen kívül a neublasztin-polipeptid egy belső iizin aminosav, pl, egy természetesen előforduló neublasztin-polipeptid aminosavszekvenciájába bevitt Iizin oldallánci aminocsoportján keresztül kapcsolható. Ilyen konjugációk netn terminális, reaktív csoportokból ts leágazhatnak. A reaktív csoporttaVcsoportokkal bíró polimert a leírás szerint aktíváit polimernek nevezzük. .A reaktív csoport szelektíven reagál a fehérjén lévő szabad arumocsoporttai vagy más, reaktív csoporttal.
A kapcsolódás az aktivált polimerben bármelyik hozzáférhető neublasztín-aminocsoporton történhet, például Iizin aminosav alfa-aminocsoportján vagy az epszilon-aminocsoportokon, vagy a neublasztin-polipeptid vagy variánsa aminosavszekvenciájába bevitt amioosavakon. Kapcsolódási helyekként a neublasztin· szabad karboxilcsoportjai, alkalmas aktivál;, karbonilcsoportjai, hidroxil-, guaaídi.1-, ímidazolcsoportjai, oxidált szénhidrátrészei és merkaptocsoportjai (amennyiben rendelkezésre állnak) is alkalmazhatók.
Általánosságban a fehésjekoocentrációtól függően a fehérje egy móljára vonatkoztatva 1,0 móltól körülijeiül lö mól aktivált polimer; alkalmazunk. A végső mennyiség kialakításában szerepet játszik a reakció mértékének maximalizálása a termék nem specifikus módosításainak minimalizálása melleik valamint annak az optimális aktivitást eredményező, alkalmazandó kémiának a meghatározása, amely ugyanakkor optimalizálja, ha
lehetséges, a fehérje íéléletldejéí. Előnyösen a fehérje biológiai aktivitásának legalább körülbelül 50%-a, és előnyösebben közel !00%-a megmarad,
Á reakciók biológiailag aktív anyagoknak inért polimerekkel történő reagáitatására alkalmas bármilyen módszerrel történhetnek, előnyösen körülbelül pH 5-8 között, pl. pH 5, 6, 7 vagy 8 értéknél, ha a reaktív csoport az alfa-atninocsoportoa van az N-terminálisnál. Általában az eljárás során aktivált polimert készítünk, majd a fehérjét reagáltatok az aktivált polimerrel, hogy kiszerelésre alkalmas, oldható fehérjét kapjunk, A fenti módosítási reakciók számos eljárással kivireíezhesök, amelyek egy vagy több lépésből állhatnak.
A polimer a variáns neubiasztín-polipeptidhez a technika állása szerint jól ismert eljárásokkal kapcsolható, Egy megvalósítási mód szerint például a polialkilén-glikol-rész a neuhlasztín-polipeptid vagy a variáns neublasztm-poiipeptid Iizincsoportjához kapcsolható, A lizincsoportnái történő kapcsolás 'N-hidroxil-szukcinimíá (NHS) aktív észterrel, példán! PEö-szukcmimidii-szukcináttai ÍSS-PEG) és FEG-szukcithtnidii-propionáttai (SPA-PEG) végezhető. Alkalmas polialkilén-glikoi-részek például a kathoximetil-NHS, a norleocin-NHS, az SC-PEG, a íresylate, az aldehid, az epoxid, a karbonil-imidazol és .a PNP-karbonát,
A szukcinimidil-tész további aroinreaktív PEG-kapcsosó molekulákkal helyettesíthető. Ilyenek például az izotiocíanátok, a nitroferol-kafbonátok, az epoxidok és a benzotriazol-karbonátok, A körülményeket előnyösen úgy választjuk, hogy a reakció szelektivitását és méretét maximalizáljuk, A PEG lineáris vagy elágazó formái ugyanúgy alkalmazhatók, mint az egyéb alkil- formák. A PEG hosszúsága változó lehet. A legáltalánosabb formák mérete 2K és 100K között változik. A példákban bemutatjuk, hogy a célzott PEG-képzés az Nterminálison nem befolyásolja a farmakckinetikai tulajdonságokat; az a tény, hogy az anyag megtartotta a fiziológiai funkciókat, azt mutatja, hogy a leírásban ismertetett helyiek fért történő módosítás nem káros. Az NBN mutáns formáinak előállítása során tehát Iizin amínosavak beépítésével további kapcsolódási helyeket 'alakítunk ki, és elfogadhatónak tűnik az a valószínű végeredmény, hogy ezek a fonnák mind a lizínnél, mind az Nterminálisnál PEG-származékoi képeznek.
Kívánt esetben a neublaszfin variáns polipeptidek címkét tartalmazhatnak, például olyan címkét, amely később proteolízissel iehasltható, A lizin-rész tehát szeiektiven módosítható először a his-eímkés variánsnak kis molekulatőmegö kapcsoló moiekuiávaí, például Traut-reagenssel (Pierce) történő reagáltatásával, amely mind a lizinnel, mind az N-terminálissal reagál, majd a his-csmke lehasításával. A polipeptid ezután egy szabad SHcsoportot tartalmaz, amely szelektíven módosítható tioireaktív főcsoportot, például maleim id-csoportot, vinilszulfoa-csoportoí, haloacetát-csoportoí, vagy szabad vagy védett SH-csoportot tartalmazó PEG-gel.
A Traut-reagens bármilyen kapcsoló molekulával helyettesíthető, amely a PEG kapcsolódásához specifikus helyet alakít ki. Á Traut-reagens például SPDP-vel, SMPT-vel, SAT.A-val vagy SATP-vel (Pieree-tői valamennyi beszerezhető) helyettesíthető. Hasonló módon a fehérje aroinreaktív kapcsoló molekulával reagáltatható, amely maleimidet (például SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KIMOS vagy GMBS), haloacetáf-csoportot (SBAP, SÍA, SÍAB) vagy vinilszulfon-csoportot épít be, majd a képződő termék szabad SH-t tartalmazó PEG-gel 'reagáltathatö, Az alkalmazott kapcsoló molekula méretére az egyetlen korlátozás, hogy ne gátolja az N-terminális címke későbbi iehasításái.
Más megvalósítási rasSdok szerint a polialkílén-glikpl-rész a neublasztm-poiipeptid vagy variáns neubíasztin-polipeptid ciszteincsoportjához kapcsolható. A kapcsolás például maleimid-csoporttal, viniiszulfencsoporttal, haloacetát-csoporttai és tioicsoporttal történhet.
A variáns neublasztin-poiipeptiden egy vagy több hely kapcsolható polimerhez. Például egy, két, három, φφ φ * ΦΦ négy vagy δί PbO-sm kapcsolható s poúswte, megvalósítási mártok awtot s kbö-tosz az ammetessahrélsshoz és/vagy a aeahiaszhaisöypsptid 14., 39,, óh, A 95, helyzeté amisrosavaihoz <· as: I, tobte«atban tattMác ««st eatosrn - kapsseSrató,
Bktoyös megvalósítási módok ssertoi a készítményben tevő vwtos twhl«to-pel^ptídat& hemabb a sstomn~tototet.kte|s s gohmer sátkóB variáns ptokpsptoá BUtódejébez képest. Hasonló módon w «sert ktoto s krtoztosésyi» teste variáns twblamrs-poi^^id kólótok ÖFRe3«hoz, htóvtoto a RBT-χ neras^toHjn a esem» patológiás vtotostosk, vagy bAssssé & mm túlélését» vagy ezen biológiát funkciók femsfetoációját valósiba mag, ktottyös megvalósífés? módok szerint a kfeíhnény stabil, vtótss sddkshó, konjugált rseöbtestoto pobpeptto vagy variáns rmtotottóö-jjeb-tsepbtokmsipiéx, amely polietd^s-gltoel-rtetosz ksgseseit öertbirntto pdjpsptotot vagy variáns mblasztto-jxrl^s^tidet tartalmaz, Kívánt ssetfees a amtblmm-pöbp^tid vagy variáns aenbtaitin-pöiipeptíd a pöhtotoáe-pkköbíáséi» labilis kötéssel kapcsolható, A tobibs kötés péktátd biokémiai hktototeksto, proteolbsssei vagy szaldsidrii-hssiiásasi bontható. A kétes példán! to vés? (Sztológláa) körSbn&iyek .kdebh kesktosró,
A íáiábaáay tárgyát képezik tevtotoá a ktestotony szerinti, variáns Mbbstote-ptotosér kmjugámmot torteá gyógyászait készítmények. A iekás wrind értelemben a “oógytad készítmény* kUk>sdm olyan késtemxtoyt értőnk, amely fhdológjaíisg elfogadható hordozóba» ekssbte&m, találmány misti ömsbksvteteBbérfét vagy totjögíteaoi tartalom, és adott esetet «© vagy több, stos, teológiailag teetorbétö alkotó» részt is tartalmaz. A ^ógyászari késriímény tehát mrtahnmtet tohbtor kbtoto kötőanyagot, példán! wep egy vagy tobh ásványi sót, «torokat, detergeaseket és agy vsgy több beedosót, példfcl egy inért fehérét (pl. kaparint vagy totomtojte).
A taláhnáay smtob jx5lto»ögto>l»ton ko^ngáhanok önmagákban beat&aiök, vagy pedig gyógyásxaiídg rtobpstobtoó észterek, sók ss más, tototoópteitog tosktoö»é& sztam&a& ítoss adhatok iíymt gyógyászati vagy gyógysssstewsdsskbsss s variáns smöbtesKton-'krsjjö^mnmk előnyőse» egy vagy több gyógyászatitag sMbgsdtotö hordozóval és áttett emtoen básmilyen ásás srvtoptos alkotórésszel egyék bsmtolbstók.
A hordozó(k}8&k győgyászatiiag elfogadhatóknak kelt .lesmiök sfebírs az értelemben, hogy a kiemelés egyéb alkotórészeivel össsebtobstok legyen^, ás ne legyenek túlságosan károsak & készítmény Bgadójéra nézve. A vmtotos neablasztlnt olyan mennyiségben adjak, mely hatásosan tóvtotja » kívánt totakológbi vagy orvosilag kedvezd batóst, a leírás szerinti értelemben, és olyan mennyiségben, amely megfelelő a kívánt biológiai Imxtoöhstoség eléréséhez to tevő adagban vagy knneeníráeióbse.
A kássserelések mind pwntóbs, jattod m pamterális beadásra atelmasak lehetnek, és speeölktss beadási módok to tokötoépssek, példáéi ötobs, töttolto, hw-dto, topfebto, sassíto, öghtotetoahs, mtektofe, totovmsstatisris, btoavóoás, tmssdetmks, tteslto, tetssatokalátte, totowtotokbs, snbamámoié, bronetaalis, bm&ttköa, vsgte&to és teiwtosrtö bs&dési módok. Btosydssk sx asmsofes év pstssketálto beadásra tokaköss kötetesek, tartsd tekibsszj,. tartsd satoémásais.
Amiker a vsaién» sreeblmtost toiyákcsöy ektetoi i&rtotemö kissm-aktotxst alkakswAk, a ktswsdés elé» nyősös ottebtsfi, ferensbísaBa» vsgy pateaíeráUssm sdktob. .Amikor a sttobla&toto felytony íAWpmtslto kis»* rétest» s&tomtesk vsgy pmfctot, btetegtojtog összefetekö Mráözóvto ktostob ktosmtoósbmh a Jtesfe előnyösen ottei»,, mmaitossx vsgy brasrehíaism adbétö. Bgy mátok tehtobsógkéto trasaUsats vagy bronétotolssm is beadható a pornak egy hordozó gázba történő porlasztásával, hogy a por gáz halmazállapotú diszperzióját kapjuk, amelyet & beteg egy alkalmas porlasztó eszközt tartalmazó légzökőrből belélegez.
A találmány szerinti fehérjéket tartalmazó kiszerelések alkalmas módon egységnyi adag formában állíthatók elő, és a gyógyszerészeti technika állása szerint ismert bárt»ilyen eljárással készíthetők. Ilyen eljárások általában az aktív alkotórész(ek)nek egy vagy több kiegészítő alkotórészt tartalmazó hordozóval történő kapcsolatba hozásának lépéséből állnak.
A kiszereléseket jellemzően az aktív alkotórészeknek egy folyékony hordozóval, egy finoman eloszlatott szilárd hordozóval vagy mindkettővel egyformán és alaposan történő kapcsolatba hozásával készítjük, és, ha szükséges, a terméket a kívánt kiszerelés adagformájára alakítjuk.
A találmány szerinti, orális 'beadása alkalmas kiszerelések különálló egységekben állíthatók elő, például kapszula, ostya, tabletta vagy szögletes tabletta formájában, amelyek mindegyike az aktív alkotórész előre meghatározott mennyiségét tartalmazza por vagy granulátum alakban, vagy pedig vizes folyadékban vagy nem vizes foiyadékbsas lévő szuszpeozióban áílítbsiók elő, például szirupként, eltxirkéní, emulzióként vagy kanalas orvosságként.
Parenteráüs beadásra alkalmas kiszerelések alkalmas módon az aktóv konjugátum steril vizes készítményét tartalmazzák, amely előnyösen izotóniás a fogadó alany vérével (pl, fiziológiás sóoldat). Ilyen kiszerelések szuszpendáló anyagokat és sűrítő anyagokat vsgy más mikropmrikulunr-rendszereket tartalmazhatnak, amelyeket arra terveztek, hogy a vegyüietet a vérkomponensekltez vagy egy vagy több szervhez irányítsák. A kiszerelések egységnyi adagokban vagy több adag formájában állíthatók elő.
Az oxrspray-ksszerelések. az aktív konjugátum tisztított vizes oldalát tartalmazzák konzerváló anyagokkal és izotóniás anyagokkal. Hyen kiszereléseket előnyösen az örcnyáikaháriyávai megegyező pH és izotóniás állapotra állítjuk.
A rectaüs beadásra tervezett kiszereléseket végbélkúpként állítjuk elő alkalmas hordozóval, például kakaóvajjal, hidrogénezett zsírokkal vagy hidrogénezett zsírkarhoxtísawaí. Az pphtalmíkus kiszereléseket, például szemcseppeket az otxsprayhez hasonló eljárással készítjük, azzal a kivétellel, hogy a pH-t és az izotóniás faktorokat előnyösen a szemhez állítjuk be.
A tcpikálís kiszerelések a találmány szerinti konjugáíumokat tartalmazzák egy vagy több tápkőzegben feloldva vagy szuszpendálva, például ásványi olajban, petróleumban, polshidroxi-aíkoholokban vagy más, topikáüs gyógyászati kiszerelésekhez használt alapokban.
Áz előzőekben említett alkotórészeken kívül a találmány szerinti kiszerelések egy vagy több kiegészítő alkotórészt Is tartalmazhatnak, amely a kővetkezők bármelyike lehet; hígítószerek, pufferek, ízesítőanyagok, dezmtegraió anyagok, felületaktív anyagok, sűrítő anyagok, síkosító anyagok, konzerváló szerek ('példád antsoxidáusok) és hasonlók. Az előzőekben említett megfontolások a találmány szerinti neubiasztm-füziósfehésjékre is alkalmazhatók (pl, neublasztía-HSA-fúzíók),
A találmány tárgyát képezi ezek szerint alkalmas fóziós fehérjék biztosítása variáns neablaszíinkonjugáhun fe vitro stabilizálására oldatban, amely a találmány egy előnyős szemléltető példája, A fúziós fehérjék például a variáns neublasztm-poüpeptíd enzimes bomlással szembeni jobb etíenáíiőképességénék fokozására alkalmazhatók, amellyel javítható a tárolási idő, a szobahőmérsékleten való stabilitás és hasonlók. Nyilvánvaló, hogy az előzőekben említ ott megfontolások a találmány szerint ueublmth5-szétumalbum.tn-fúzíósf5riiériéfcre is alkalmazhatók (például & hümán-aeublasztín/hamán-szérunsaibumín-hiziósfehéíjékre).
» * * *
e-s« ex
5#
Kezelési eljárások
A variáns neublasztin-polipeptidek, valamint fúziós fehérjék vagy konjugátumaik egy élő állati szervezet, előnyösen egy emlős, előnyösebben egy főemlős, például ember betegségének vagy rendellenességének kezelésére vagy enyhítésére alkalmazhatók, amely betegség vagy rendellenesség neurotróf anyagok aktivitására érzékenyen reagál
A találmány szerinti készítmények közvetlenül például beinjektált, beültetett vagy lenyelt gyógyászati készítményeken keresztül alkalmazhatók a neubkssztín-polipeptídekre érzékeny patológiás folyamat kezelésére. A készítmények élő állati szervezet, például ember betegségének vagy rendellenességének enyhítésére alkalmazhatók, amely betegség vagy rendellenesség neurotróf anyagok aktivitására érzékenyen reagál. A betegség vagy rendellenesség konkrétan az idegrendszer sérülése, műtéti beavatkozása, ischaemíája, .fertőzése, anyagcsere-betegségei. élrendi hiányosságai, malignus vagy toxikus anyagok miatts. és genetikus vagy idiopádás folyamatai miatti károsodásából eredhet.
A károsodás konkrétan az érző neorenokon vagy a retina gangiionsejtjein fordulhat elő, .például a gerincvelő háti győkérganglionjaíbán lévő neuronokon vagy a kővetkező szövetek bármelyikén: a téráestestí, a sziklacsonti és a csomós ganglionokon (gong#»» gentetoV, peírawa, ilt «orfosm»), a nyolcadik agyideg veszdbuíoakusztikus komplexén, a trigeminális ganglion maxiliomandihuláris lebenyének ventmlaterális részén, a középagyi trigeminális magon.
A találmány szerinti eljárás egy előnyős megvalósítási módja szerint a betegség vagy rendellenesség neurodegenerativ betegség, amely sérült és traumatíkus neuronokat érint, például a perifériás Idegek, a nyúltagy és/vagy a gerincvelő traumatíkus sérülései, agyi ischaemiás Idegi károsodás, neutopátia és különösen perifériás neuropátía, perifériás idegi trauma vagy sérülés, ischaemiás roham, akut agysérülés, akut gerincvelőt sérülés, idegrendszeri tumorok, multiplex sclerosis, oeurotoxinokkal történő kapcsolatba kerülés, anyagcserebetegségek, példán! cukorbetegség vagy veserendelienesség és fertőző anyagok okozta károsodás, neurodegenerativ rendellenességek, példán! Alzheimer-kór, Huatsngton-kőr, Parkmson-kór, Parkinson-Plusszindróma, progressiv supraauclearis bénulás (Sleele-Richardson-Olszetvski-szmdróma), oiivopontocerebellaris airófia 1.OPCA), Shy-Drager-szindróma (többszörös szisztémás atrófía), Guamanian parkmsonizmus demenlia komplex, amyotrophias laterális sclerosis vagy bármilyen más, veleszületett vagy neurodegenerativ betegség és dementiával társult memóriaromlás.
Egy előnyős megvalósítási mód szerint érző és/vagy autonóm rendszer ideget kezelhetők. Előnyösen nocteeptív és mechanoreceptív neuronok kezelhetők, előnyösebben delta-rost- és C-rost-neuronok. Ezen kívül az; autonóm rendszer szimpatikus és paraszimpatikus neuronjai kezelhetők.
Egy további előnyős megvalósítási mód szerint a motoros neuron betegségei, például arayotroph laterális sclerosis (”ÁLS) és gerincvelőt izomatrófía kezelhető, Egy további előnyős megvalósítási mód szerint a találmány szerinti aenblasztin-molekulák traumatíkus sérülés utáni ideggyógyuiás setkentésére alkalmazhatók, Egy másik lehetőségként vagy ezen kívül ídegvezető csatorna („nerve guídance charmel”) variáns neuhlasztinpcdipepiideksi vagy variáns neublasztin-polipeptidek fúzióját vagy konjugátumát tartalmazó mátrixszal alkalmazható a leírásban ismertetett eljárásokban. Ilyen idegvezetó csatornákról az US 5.834.(129 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi Iratban adnak kítanítást, amely a leírás részét képezi.
.Egv előnyös megvalósítási mód szerint a leírásban közzétett készítményeket (és az ezeket tartalmazó gyógyászati készítményeket) perifériás neuropátía kezelésére alkalmazzuk. A találmány szerinti molekulákkal történő kezelés tárgykörébe tartozó perifériás neuropátiák a trauma okozta neuropátiák, pl. amelyeket fizikai sérülés vagy betegség, az agy fizikai károsodása, a gerincvelő fizikai károsodása, szélütéssel kapcsolatos agyi károsodás és ueatödegeaeráeióval kapcsolatos neurológiai rendellenességek okoznak. A találmány tárgykörébe tartoznak továbbá a fertőzések, íexinnal és hatóanyaggal történő kapcsolatba kerülés okozta másodlagos neuropátiák. A találmány tárgykörébe tartoznak továbbá a szisztémás vagy anyagcsere-betegségek okozta másodlagos neuropátiák. A találmányi leírásban közzétett készítmények kemoterápiás kezelés okozta neuropátiák (például, amelyeket kemoterápiás anyagok, pl. taxol vagy eiszplatía bevitele váltott ki), teáin által indukált neuropátiák, hatóanyag által indukált neuropátiák, vitaminhiány okozta neuropátiák, idiepátiás neuropátiák, és cukorbetegség okozta neuropátiák kezelésére alkalmazhatók. Lásd például US 5,496.804 és S.916,555 számó amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat, amelyek a leírás részét képezik,
A leírásban ismertetett készítményekkel kezelhető, további körülmények a mono-ueuropátiák, a monomultiplex neuropátiák és a poli-neuropátiák, például az axonális és demyelisizácíós neuropátiák.
Egy további előnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti készítmények (és az ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények) a szem különböző betegségeinek kezelésére alkalmazhatók, például a retinában fotoreceptorok elvesztése esetén, maculadegenerációban, festékes szemideghártya-gyulladásban, zöld hályogban és hasonló betegségekben szenvedő betegeknél.
A találmányt a kővetkező, nem korlátozó példákkal szemléltetjük,
Idgéida
NdpnréoáHsosP^sgéOTp^ékptképegpttaeijblasgtrélbpl^idl^áí&hcíősége
CHÖ-Sejtekhől származó, rekombínáns, humán eredetű oesibiasziismál azt tapasztaltuk, .hogy patkányokba intravénásán beadva gyorsan kiürül a keringésből, A szérumban egyetlen fehérjét sem mutattunk ki sznbkután beadást követően. A neublasztin biológiai hozzáférhetőségének növelése érdekében. PEG-gel származékot képezett (pegilezett) formákat készítettünk.
Mivel az NBN-szekvenciában lizin nem található, .PEG-gel történő, aminspeciükus reakció az N8Npohpepiid amnsoíermiaális PEG-származékát eredményezi. így tehát mindegyik neublasztin-dimemél két PEGrész kapcsolódik. A PEG-formákkal tehát először közvetlenül az N-terminálist céloztuk meg aminspeciíikus reakciókkal. Meglepő módon a pegileződésnek még két, 2Ö K nagyságú, hozzákapcsolt PEG-gel is csak kis mértékű hatása volt a féiéletidőre, amely azt matatja, hogy a kiürülést útvonalat meghatározó mechanizmus felülmúlja a pegilezéstől várható növekedést a féléletidöben.
PEG-stfenpzékótk^>sgsÜneabÍaszdn-N95K-mtttein készítése
Ezt követően belső aminosavon PEG-származékot képezett NBN mutáns fonnák biológiai hozzáférhetőségét vizsgáltuk. Négy mutánst terveztünk, amelyekben a természetesen előforduló aminosavakat a 14., a 39., a 68. és a 95, helyzetekben helyettesítettük, hogy iizinéket építsünkhe a -szekvencia kiválasztott helyeibe, Ezek a lizinek a PEG kapcsolódásához alternatív helyeket biztosítanak, Ezeket a helyeket GDNF kristályszerkezetének [Nat. Struct. Bioi. 4,, 435-8 (1997)? mintaként történő felhasználásával választottuk ki, hogy azonosítsuk a felületi aminosavakat, valamim persephin/neubiasztin kimére mntageríezis-vízsgáiatt&l [I. Bioi, Chem. 27.5, 341220 (2000)], hogy a szerkezet funkcionálisan fontos szakaszait azonosítsuk, amelyeket el kell kerülni.
Két mutáció (R39 és Fiók) azt a szakaszt célozza meg, amely a felületen pozitív töltések elosztásával heparinkőtő helyet képvisel, a feltétjének azon tulajdonságát, amely valószínűleg hozzájárul a gyors kiürülésÍS hez, A harmadik hely az N95-öt célozza meg, a vad típusú NBN tcratesctes giíkozílációs helyét. Ezt a helyet egy komplex széuhtdrát-swkezet természetesen módosba. Ezen a helym a PEG-gel történő módosítás várhatóan nem hcfclyásolja s möködést. A .negyedik helyet (KM) olyas szakaszban választottuk ki, ahol egyetlen íoás módosítás sem hat. A leírásban közzétett vizsgálatokhoz azt a mntánst választottuk, amelyben a 95, helyzetben lévő aszpamgint tersei helyettesi tettük (az M'95K.-mntáns).
Négy különböző, patkány eredetű ncuhl&sztio-mnteim készítetitek,. amelyek a patkány etedetö ncublasztia-polipeptid vad típusú .szekvenciájában egy vagy több változást hordozssk, A műiéinek példáid az egyelte N95K-mntet8 és a patkány eredetű. neuhíasztm minosavaz^kveaaájátsak egyéb helyeibe» egyetlen szubsztitúciót tartalmazó műiéinek, az R14K, az RőűK és az R3SK. Áz “XtNjXj elnevezés szerint Xf leteti a vad típusú oeebteztiu-txíjlpeptíd aminosavát, az Nj jelenti a szekveaciában az Xj aminosav szánt szerinti helyzetét az 1. azonosítószámú szekvencia szerinti szekvencia szerint számozva, és Xj jelenti azt az aminosavat, amely a szekvencia feltűntetett szám szerinti helyzetében lévé vad ttesú aminosavai helyettesíti.
A patkány eredetű- N95K neublasztin-mnláctó eikésatíiése- érdekében hely-specifikus mutegenezist végezitek a vad típusú patitey-neubiasztint .kódoló píazmidoa, a. pCMBö2Ö-os. A vad tipusó patkány-aeublasztin auUejnmvszefcvenciáját és az álísla kődoli polipeptid amínösavszekveacíáját az alábbiakban mutatjuk be.
?, ATGGAACTGG GACTTGGAŐÖ GCCTACTGGA ’TTG-TCCCACT GCCTGCGGGG 51 GAGGTGGGAA GCAGCG2TGT GGGGAAGCGT AGGGGGGGTA GGCCTGGTGA 101 GGAGCGTCAC AGAAGGTTGG CTGGACGGAA TGGCCCGGAG CCCGGCCGCT ISI CGCGATGTTC GGTCGCCGG? CCTGGCGCCC CCAACAGAGG ACCTACCTGG 201 GGGACAGAGG GCAGATGTGT GCAGGGAAAG AGCCCGGCGA CCACGGCCGG 251 AGTCTGGTCA GCCCGCACCC GCACGAGCGG GTCGOGGGGT CCAGTCTGCT .'ÍVJ .V ·.;.i'wV'ívx^VvítjvvSl ?-V<.,<.,v..\>-V..rt-V;;GG V-v, .AlGÁGG/V-V vvCU.GA.GGAG
351 CCGCGCAÜGG GCTACAGATG CGCGCGGCTG CGGCCGGGGG TGACAGCTGG
401 GGCGGGTGAG CGCTCGCGGC CTGGGGCACA GCTCCGAGGA GCTGAGACGG
451 TTCCGCTTC? GCAGCGGTGC GGGGCGGCGA GCACGCTCCC CGCACGATCT
501 CAGCGTGGGC AGCGTGGTGG GGGCGGGGGC CCTGCGGTCT CCTCCCGGGT
551 GCCGGCCGAT CAGCCAGCCC TGTTGCCGGC CCACTCGCTA TGAGGCAGTC
Söl TCCTTCATGG ACGTSAACAG CACCTGGAGA ACCGTGGACC ATCTCTCCGC §51 CAGCGCCTGC GGCTGTCTGG GCTGA (5. azonositőszámú szekvencia)
AGGGLGHACA LSRCASPKWQ 2AACPTLAAL ALLGSVTGAS 1BPNSASCAS 51 ADypSPVLAP PTDTCGGGHT AHLCSE3AAR PÖÓCSPC2A2 tePGPALQSb 1.01 FAAAGGARAA RAÖTRSSKAA ATDAAGCRLR teLVPVSALG LGHSSDSL1R 151 FSFCSGSCRS ARSbRCLSLA SLLGAGAVAS FFGSRFÍSQR CGRFTRYSAV
201 SFRCWSTWR TVDFLSATAC GCLG* (4, aamosftőszámú mkveneia)
A pCMÖkÖ KD2-31Ö és XD3-211 jelű öbgsvnuteoíidoteü végzett mutageneziséveí kaptuk, a pCMB03?-ptemídot
FG2-350 5 ’ -GTATCTTTCATGGACGl’AAAGTCTACATGGAGAACCGTAGArCATCTATCTGCAACC 3' (ó, stenöteWfeiű szekvencia)
02-355 δ’ teSTCGCAGATAGÁTGATCTteGGTTCTGCACGTAÖAteTTÁCGTCCATGAAAGA.TAC 3>
(?, azemesítósssámú szekvencia)
A pCM0Ö2? tea a 95. helyzetben lévő nszpatsgíAt kódoló tetet teoí kódoló kodonml heJyWéélteötik.
Í9 < ΛΦ *X $ Φ ♦ * ·Λ # ♦ v χ * * x ü ί« * * Φ * «
X X ΦΦΦ * χ φφ
A pCMBOCO aeshlasztíst kódold szekvenciájába» a db helyzeten lévő ai'gimsó kódold kódosnak Üsánt kósóski kotesal teteö heiyeíteaítésével kaptak az M.Í4K. steSamin»m«íeiat Helysj&eeiSkas stuiagenesbt végesetek a pCMBOkÖxsn KD3-254 As W3-2S5 jelű oligosssskteíidsskkók
KCteteé Sr -CCTSGAACTCÖCAGCTCTCOTCCTCÖTSCAACGCATGCAAÖACCCTÖ TCG~3‘ (Ó. zwstete .temű szekvencia) teó-SSS S‘-OSACASCCTTTTGCóTCCGTySGACGAGCPCÖóóAGCTGGÖAGTTCC AGC-te (9, azonosítótete szekvencia)
A képződd kotemktet pCMBCÜb-xek nevwíűk,
A pCMBCBO neublastíint kódöló zzeksxwiáíábus a 68. beiyzotte lévő atginiot kódold kódosnak 1test kótiold kódosnál történő belytesiitevct kapóik a® RÓte steisólssidós-'sxistuist. Heiyspseifíkss rsaiagesezist végeztek a pCMB CGO-on KD3 -2SÓ és KD3-2SR jelő oligonnkleotítfckkak
KO3-258 S ’ (sítAGCCGGAGCACTAAAATCTCCCCG<rGA7GTAGACC~3 * (10. sawtetóstesd teteted XD3-25S S * -GűTCTAGATCCCGGGGóAÓAyyTTAGÓGCTCÓGGCPCC-Ó ‘ (l 1, mtíwtetebssó szekvencia)
A kbpzlkló teódstkcbA pCMBCÖCMscó nevetek
A pCMBO? stebtetess kódold stevunofeábAs a 3§. helyzete® lévű argódénak ttete tetóssó belyebssltdted kaptok az R3RK sasblsmisrmteist. A pCMÖÖ2? hólyspeesdtes osotagóstotebi KD3-2ÓÓ ba KD3-25? jte <tlfeöítokseöódokk;R végeztük:
RS3-25Ö S * -'SACGAATTAAT;'AAGT’j?TGG7!,rT32GTTCAGG'35 (Ϊ2, ^tetteted szekvencia)
KO3-2S? S>-CCTŐAACAAAAACŐAAACTTMTTAATTC-STC--3· (ö. sasswköszsm assífesósb)
Bcpressxiéltoz éa tisztításhoz a psttey-B’BN'-tedK-jsuíieisó kódoló pbtedei A. estem expmstehsk Hitetekével eüáíotí íósbds fehéreként· estoatónáz haaítási hellyel közvetlenül az érett, 113 aateosavbél álló HBBteekmsda starthelyével szomszédossá, Az A. <te sejteket 500 i-es ferntesíorbs® szaporítottuk, éa &gyazstotí sejüsasszát készítettek. .Az & «©& tetet Mztttoteteltetete MzOttk és s pstkóny-BBN-BK'-i az tótetebsy. mMt őledétóskeiöbél nyertük ki
Az N8R az üledékből goubdin-fesátetetdíbl vontak bt felgmbolyodoit állapotát óelyteitettsk ótebláfete ds a Hitetekéi esiietel&áwd tetetette, A terméket Al ATA agsrézos (Qbgoa) és Atetete IBP CWfeAkwa«fSsd gyantán footpsissgi.teibk.
A klb-tekável jelölt testek esterokisá» kezelése a fehérje nem mtetib .telókabí estebsósy^e az éreti szteeseb 7, testes ss'gbiojésbl, A képződő, 1>? aminosavak nélküli MBN-iesmék telje® mértékben aktív volt a KIRA BUSA vizsgálatban» ba az érett formától szetteetíleg ssscgkóldatetebetetlon a gnasiáin álul kiváltott. deaatortóö tekintetében, ás azért felhasználtok az éó tevőid munkához.
A pzttey-N.RteteSK átlagosan 3,3 RBÖ-tétemteteb FBGtestessőkái resktéasként· 1ÖÖÖG D& melekulatötscgű steiöxBptetelbö-glbtestecssótetRbpwpőteital (RFA-BBö) késtetek el A képződő, BBüzztamzékos fetete kbitette vizsgáltuk SDS-AAOB-te, tetebtete kteteiógtebv&l Cste eaefesion teteái»pmpbyNs SBC), tedtell Mi HRtC-te, tette ssgibte tetesteiptes itetetetl elltek te itegapehtetedplávid. (MAUMMS), pepstetetewted, az zktíteteak OkA BUSA-val teteit teteted de az· étetetetezótem sughateteteal. Az MBteMlldtetemlk títetegs & pegtete tett 8ΧΜ*ΡΑΟΒ~vei. bs SBGte terve Rtekte sagyteb vte Az WteWStetete nem teteáld Rikblteoyte Módit tettesei tetete útey nutgugytek a jósolt: xstettete A PBö-ústeztetepzte követte a kbptelö tetek tetetett ótebktetete ssntztebdl álló asteyte a tértek tetess stetoláskte 2 teGte a teste éÖ%20 ában molekulánként 3 PEG-et, a termék 30%-ában molekulánként 4 PEG-et, és számos, nagyobb molekulatőroegú minőt formál: tartalmaztak. A pegílezett mintában aggregátumoknak nem volt nyoma. A visszamaradt, nem módosított NBN szintje a termékben a kamutathatósági határ alatt volt. Az anyag endotoxín-tartalma rendszerint 1 EU/mg-nál kevesebb volt. A pegílezett NBN specifikus aktivitása KIRA ELISA vizsgálatban 10 nM, A pegílezett terméket 1,1 mg/ml koncentrációban PBS, pH ő,5 püffedjen szereltük ki. Az anyag, amely hathatósságában hasonló a vad típusú NB'N-hez fagyasztott folyadékként tárolható -TíTC-on.
Az R14R-, R39K- és RóSK-muteineket A. eo/iban expresszáltak és hasonló tissffiíáss. pegilezési és működési vizsgálatoknak vetettük alá, mint amelyeket az N95R-NBN esetében leírtunk.
EEÖ^ánna^osNBN.készitése
Az £. co/tban előállított, és 4®C~on, 5 mM nátrium-foszfát, pH 6,5, 100 mM nátrium-klorid pufferben tárolt, űjrafelgombelyított („refolded”) patkány-NBN-N95K. (2,6 mg/ml) 230 ml-ét 77 ml vízzel, 14,4 mi 1M HEPES, pH 7,5 puffenrel hígítottuk és 2,8 g (10 mg/ml végkonc.) PEG SPA-t 10000 Da (Shearwaíer Polymers, Inc.) adtunk hozzá. A mintát szobahőmérsékleten, 4 órán keresztöl, sötétben ínkubáítuk, majd 5 mM imídazoilal (végkonc.) kezeltük, szűrtök, és egy éjszakán keresztül é'XO-o» tároltuk. A terméket két külön saraiban állítottuk elő, az egyik a idírsdoláss N8N-N95K. 130 mi-ét tartalmazta, a másik 100 nal-t. A PEG-származékos NBN-t a reakeiókeverékböl Aree/ege/ &W3 SOj-on (Μ) (EM Industries) tisztítottuk. Áz oszlopot szobahőmérsékleten használtuk. Valamennyi puffért pirogénmentesen készlteitlmk. A reakciókeverékhez nátrium-kloridot adtunk 87 mM végkoncenteációbaa, és a mintát 45 ml-es AracfogeZ oszlopra töltöttük (5 cm belső átmérőjű).
Az oszlopot egy oszloptérfogatttyi 5 mM nátrium-foszfáttal, pH 6,5, 80 mM nátrium-kloriddal mostuk, majd háromszor egy oszloptérfogatnyi 50 mM nátrium-kloridot tartalmazó 5 mM nátrium-foszfáttal mostuk, A gyantát 2,5 cm átmérőjű oszlopra vittük, és a pegílezett NBN-t sz oszlopról é x 10 ml 5 mM nátrium-foszfát, pH 6,5,400 mM nátrium-kloriddal, 3 x 10 ml 500 mM' nátrium-kloriddal, és b x 10 ml 600 mM nátrium-kioriddal elnáltuk le. .Az eluáló frakciókban 280 nm-néi mért abszorbanciával vizsgáltuk a fehérjetartalmat, a módosítás mértékét pedig SDS-PAGE-val. A kiválasztott frakciókat egyesítettük, 0,2 pm szőrön -szűrtök keresztül, és vízzel hígítottuk 1,1 mg pegílezett patkány-NBN/ml koncentrációig, Áz egyedi saraik endotoxin-szintjének kiértékelése után egyesítettük őket, és 0,2 pm membránon újra keresztülszörtök. A végterméket kisebb térfogatokra osztottuk szét és -?0°C-on. tároltuk,
Átiszdsoitp^ilgzeit.HBN^..yV-^küuma
A pegílezett NBN-NK UV-spektromát (240-340 orr,) a hsgiíatian minién mértük. A mintát háromszoros ismétlésben vizsgáltuk. A pegílezett minta abszorhanciamaximuma 275-27? nm-néi van, az abszorhaneiammimuma 247-249 nm-néi. Ez az eredmény összhangban van a .nem módosított, eredeti NBNitttensediersél raegfígyelhetővel. A pegílezett tennék fehétjekoiscettttációját a spektrumból becsültük meg G:so'X!% “ 0,50 exüukcíós koefficienssel. A pegílezett NBN fehérjekoscenteációja 1,1 mg/ml. Zavarosságot nem figyeltünk meg a mintánál, amely abból ís látszik, hogy 320 nm-néi nem tapasztaltunk abszorbanciát.
A.pegsl§zeíí,i^Nd^jellemg^lWfolGE^
A pegílezett NBN kis részleteit, amelyek 3, 1,5, 0,75 és 0,3 pg terméket tartalmaznak, SDS-PAGE-val vizsgáltuk 4-20% gradiens gélen (Owl). A. gélt Coomassie briifonrt blue R-250 festékkel festettük. A gélét? mo~ iekulatömeg-markeréket (G1BCÖ-BRE) ís futtattunk.
A pegílezett NBN-NK nem redukáló körülmények között végzett SDS-PAGB-vizsgálatával olyan sávokat, azonosítottunk, amelyek 2,3,4 és 4-aél több PEG/molekula módosításnak felelnek meg, A 98 kDa íátszóla21 ,s * * * χ gos tömegű fósáv 3 pEG/molekulát tartalmaz, A tisztított, pegilezeít termékben nem módosított NBN nem volt kimutatható. A termékben a 2, 3 és 4 kapcsolódott PEG-et tartalmazó keverék jelenlétét MALDÍtőmegspek&oszkóptával igazoltuk, A 2, 3 és 4 PEG-et tartalmazó tennék arányát denzxtométerreí határoztuk meg, és az összes mennyiség 7, $2, illetve 30 százalékának mértük.
Áú^ks&LNBNieUem^méreiló^^
A pegilezeít 'NBN-t méretkizárásos fcromatográisávsl vizsgáltok analitikai Sapemse 6' Lfrí./Öóií? PPLCoszlopon mozgó fázisként 5 mM MES, pH 6.5, 300 m.M nátrium-klorid oldatos: alkalmazva. Az. oszlop áramlási sebessége 20 mVh. A lemosódó frakciók abszorbanciáját 2SÖ nm-nél vizsgáltuk. A pegilezeti. NBN egyetlen csúcsban eluálódott le körülbelül 200 kDa látszólagos molekulatömegnél, amely összhangban van a PEG nagy hidrodinamikai térfogatával. Aggregátumokra utaló jeleket nem tapasztaltunk. Szabad NBN-t, amely körülbelül 30 kDa látszólagos molekulatömegnél eluálódik le, nem tudtunk kimutatni a készítményben.
Apegilsztoi
A pegilezeti NBN-NK-t fotdított fázisú HPLC-vel vizsgáltok Fydoc €’,· oszlopon (5 pro, 1 x 250 mm). Az· oszlopot 60 mm, 4Ö-őÖ% B gradienssel fejlesztettük ki (A-puffer. 0,1% trifíuorecetsav, B-p«ffer: 75% aeetooltal/0,085% trifluoreeetsay), Az oszlopról lemosódé folyadék abszorbanciáját 214 nm-nél néztük, és a frakciókat későbbi vizsgálathoz összegyűjtöttük. A pegilezeít NBN-NK-t a különböze dí- (60,5 mm), tti- (63,3 mm) és toka- (67,8 mm) pegilezeti komponenseire választottuk szét fordított fázisú HPLC-vel, C4-oszlopon. A csúcsok egymáshoz viszonyított intenzitásai alapján a komponensek aránya 5,4%, 60,5% és 30,1%. A csúcsok azonosságát MALDl-MS-sel igazoltuk, A termékben nem pegilezeít NBN-NiCsak nem találtuk nyomát (5-15 mm-nél eluálódik le).
A pegilezeti NBN-NK-t C? 2(p 7'ip-en sömentesítettük, és tömegspektroszkóppal vizsgáltuk Foyager573? (PerSepttve Biosystems) mátrix segítette lézerdeszorpciós ionforrással ellátóit repülésxidötömegspektrométerrel (MAI.D1-TOF) mátrixként szmapinsayai alkalmazva, A tisztított fehérje 0.5 μΐ-éi 0,5 μΐ mátrixszal kevertük össze a célíemezen. A pegilezeít NBN tőm^spektregrammja három melléktermék egyszeresen és kétszereset! töltött formáit mutatta ki. A megfigyelt, 43803 Da, 54046 Da és 64438 Da tömegek összhangban vannak a 2,3 és 4 PBG/moiekula módosításokkal.
A pegOezési reakció specifitását peptidtérképezéssel értékeltük ki.
A pegilezeít NBN-í di-, irt- és tetrapegiíezett komponensekre választottuk szét, amelyeket azután redukáltunk, alkiláltunk és tovább szeparáltunk egyetlen lánckomponensükre HPLC-vel. C4-oszlopon. Ezeket a komponenseket és a redukált és aikiiálí, nem módosított NBN-NK-t, mint kontrollt Asp-N proteinázzai emésztettük, és a képződő basitási terméket fordított fázisú HPLC-n választottuk eí bi-we C)# oszlopost (5 pm, 1 x 250 mm) 60 mm, 0-60% B gradienssel (A-puffer: 0,1% trifiuorecetsav, B-puöer: 75% acetonítrii/Ö,085% trifluorecetsav), Az oszlopról í.emosódő folyadék abszosbanci^át 214 nm-nél vizsgáltuk.
A patkány-NBN-szekvencia négy belső aszparagínsavat tartalmaz, és várhatóan egyszerű hasítást képet mutat Asp-N endopreteinázzal történő emésztést kővetően, Patkány-NBN-NK Asp-N-nel történő emésztésből származó, valamennyi csúcsot azonosítottuk tömegspektroszkópiával éfe'vagy Edmaa N-terminális szekvenálással, és így a peptidtérkép egyszerű eszközként használható a módosítások helyének vizsgálatára a csúcs meglétének vsgy hiányának kimutatásával. A különböző csúcsok azonosítását a?, alábbi, 3, táblázatban mutatjuk be.
φ· φ φ φφ * ΦΦΧ φ φ * φ* * Φ * χ * φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφ
Csúcs & réténél- ás iáüvel (tstta) Meghgysh iátstsg étiega khttéleti tömeg átlaga lelálás Amírtosav-swkwacia
3Ká 12914 (M) 12x52,4 102-113 0HL0ATACSCLG
w 1090,0 1992,2 23-101 OVKSTtikCV
44,á 2500,4 2508,0 35-54 DELXRFheCSCSCkhARShH
2437,0 2437,3 12-34 0MGCMLRSQLV PVSALGWH9S
Sl;4 3450,7 3450,0 S5-IM 9LSXAS ClWTRk
51,9 4134,4 55-92(íSXstl) DLS hhS CkÓTRYkAVS 2H
53,2 41303* 4139,3 53-92 DhoLAS CtiéThYKhOSFN
(Μ) ítsenomotápos tömeg * MAWI-aáí a amtiortbtstiá&té pepiid osidheiéj-fesk kSszőAsfSaa
Mivel &χ MBH hetmstismet, a psíkásy*WN«NK.-tmnék aágy lehetságsss helyet tartalmaz a FEG száméta, kettőt mhtiegylk lkáéból az N'-tetíttittálH asalaoa és keltik. az W5K-tóytk«a> amelyiket géttieeimstlágisi dtots tdstimk he a kéntiiméstybe. Ά ttipegileseii láss peptidiérképébsz a FtiCj-teéitisskksssl esek az a esdes váte> t-oti meg, nmely az K90-mtsiseiáv«l ormiéit geptidei tartalmazza. Egyetlen mb esess som változott a PEOmódosítással, A térképezési sástok azt onmhjék, hogy s FHG-íéss apeeitiknsms ehhez a pepddlses: kspesokMtk, és egyede-a más, vizsgált peptidhea sem ksptsökkhk. A második lehetséges kapcsolódási hely az N-ieremsrális sgy psptldesg amely csak bárom ammesav hosszá és a smptiásérképms aem mntsibdó ki Arca kőveikeztetimk, hogy ama a helyet; további F.EG'hapitiv>ié<lés leheti E«l a lehéteietéssei egyssöee a pstikány-NBN'-HK kis szsaeláks ttom esőnk®, és sz érett Ab4-ssakveeetéi tartalmam. Ex a peptid 30 pm^tél ehsélOdik,, és a sem pegfeett etoústtioány peplidsétképen látitslá, viszont a peglH:mtiNBhbHK-emésstn5áoyeklsől hítevxik.
A pegtieteti pnikMsy-NW hatékonyságát eltet KBN-á^gS itktlvéiksévsi9ltstlotiiéi;isávnl mértük az NBNmktiHsés bpottemkést olyan BUSA Mssgélailsm, amely foszfotiláh RÉT jelenlétére spemifikes, Az hlBdlAémdkltihspitekeg sgy adhetens, egét eredetű semtíhlnszióma. sajtvöSálsk amely RliT-oi éz öíB.a3-sl oxgremxái, 2 x 19s seftilyok súrnséggel terheíték '24-lynké lemezekre Hl% magzati masfemtesmml kiegészíted, Öollmeetohde nvkfossioti Imgle-tápkősegbe (DM'Hbá), ás lé árén keresetűi tenyésztettek 3ΉΟ-οη, 5% COS Patáimé légkörben,
A seíiekei PBS-sel mostak, XBN soroeatidgilásávnl kotehhk 0,25 éti CMBM-bno, 19 peren® kerevstnl, 37Η>οη és 5% €€Mw.. Mindegyik ntintét kteetss ismétlésben vizsgáitimk. A sejteket 1 ml PHS-sel mosttsk.
ás I ősin ketesalol Imáitok 4öC-oe, 9,30 tsti 19 aM Ttia-HCl, pH §5(i, 9,5% Honidat F40, 0,2% ttátiintndeoalknlék éli aM nétómtidisotkk 0,í tsM náitbtm-’.nmsdát, 1 tsM HmllmntifemdbssibHnotid iéttetetá oldntbán a lemezek enyhe záxatáaa közben. A llzátitmnt tátibsedt Mié pigeiiéxtnk, és 9,25 ad twiéi Űődyekú S-lSA-lontezte vittünk ét, mtedyei 5 ggtnti noti-Kot mnnoákmális gllemsysggól (AA.C3B7..3) tatioiitzok 50 rnM ksiémnáóptdfelrtrt, pH 9Λ dHIMm, IS été® ketessédl, nsstjd seMmbfeMtsékietes gátoltuk I ásást keteszttii gáilápnfeml [i% marnál egásstértmsot és 3% mmdss-saétteniilhntMnt W&ámazti 20 mM 2ns-BCl, pH 7,5,159 ssM sséirmat’-klotkl 9,1% Ttvee®-29 (TBST) oldatba®]
Két ára szobúitöméméxkleíe® tihiáeá htktshélshá kővetisnp a lyttokái hst&sot mostok TBST-vol. A •·η thszéeritáti RETmt a lyukaknak a gáilti pefehen lévő 3 tugőal imznmgemzklázaal (HRP, “fcemmatiM perosidase) kaptok totozibilroans 4ö iö^l.tamynggal szslathöináméktidan, két önls kérésztől történő inknhátásával, majő TBST-vd történd temi nsosással, véglti kelraintettiás khsto&ttó R^wti 45Ö ntn-nél a BRPtotivhás tnárésével ámítok kk A tizátmnmal vagy » ilzispnilsrjzíi kezelt lyukakból méri ebszototelaértékeket és a háttérrel kíigatoti jelet az aktiválási keverékben lévő NkN koneenitoiöjónak Ixiggvdnyéhen ábrázoltuk. A pegiíeaeti Í8JN batoonyaága RtiEA BUSA vizsgálatban lő nM, amely nem kik ltotok az NBNNK kuosktoi anyag batákonyyágátóí· Ot fegymitoslvtóks etklusnak tm volt Itosa a haíékonysámn, és a kezelést kővetően szignifikáns növekedés a minta zastotogéban nem to tapatotlhalö, amét y azt mutatja, hogy a minták a vizsgalathoz biztonságosan lágyassdhalök.· Fögtolen vlesgibtokto értékel tök a három és négy 1(1 kön PECktmtiekula ssbante tetsnék aktivitását, és a«t tapasztaltok, hogy a három PEGmi toritoszó termék teljeses aktív, atig a négy EEG-sti iatoktntző Rátok aktivitása tokként.
Rőlöoh&sö pegöesseu és nem pesziezsté Wtosrosékek faxmatekmstifcst ínhjdosrtágati vimgáhnk gatkány- és egézzuodelldkhen,
Áz totók szerist pattoy-NBN-to 3,3, ltot) Da FEÍh-gel iörtésiö pegitezése szlgntijkáns hatot gyakorol a nenblasziín tilláletidejéne és tibltigsal htstoéthettiségére, Spmgne Dawtey patkányokba 1 mg/kg inttnvénás beadási követően 3öÖö ngtinl pegtiezoh NBN estlesszluiel mntatutnk ki 7 pere elteltével, és ?Ö0 ng/tnhes szintet 24 óm múlva, 2ŐŐ ag,tintit 4ti óta nutíva és 100 eg/ml-i 72 lka múlva. Ezzel szemben a sw peglleeatt NBN esetében .1 mg/kg Intravénás beadást ktottien löÖÖ ag/hti szintet tapasztaltunk 7 pere ntólva, vteat a szint gyorsan titokként 713 aghul szintté 3 óm tova, és 7 esz elteltével már nem volt klnmtatito. A pegiltos hatása még ktiöjezetiebb a pegilezeii NBbtimd szsbkstán btoéssal kosait óitokban.
Szubkután I ntg/kg beadást kővetően a pegltizeit NBN keringési szbto elérte e ntomátisan 200 ag/tnl szintet 24 óra múlva, és ezen a szintest tn&to a három napos vizsgálat klóttonsa alatti Ezzel szemben nem módosított NBN beadását követőéit egyetlen időgontim sem lőhetett Wötií khnaiattu,
A pegüezeíi NBN-miaták vizsgálatát a molekulánként 2> 3 és 4 EBöuk ttoltnaaó tolektsanékek jalets léte bonyolítok stiwl ezek. mtittogyikének más a iannakotoe-tikai profilja, A korai &ros«k«kfeetiksá vizsgák tokban egereket álkahnazúmk, hogy segítsék a vizsgálatot a tolels vizsgálandó anyag és a hatost mód vizsgád tokán. .Az. egéren végzett vizsgálatok jelentés kölöntiségeket totok ki a vizsgálati anyagok biológiai hozzá ferbettiségében, Antikor azonban a 3,3, lökön PEGtotoket vrzsgálúrk patkányokban,, a bmlóglai Imzzááérhe tösdgp kevésbé jónak bizonyok, térni egerekben. Ez a khltinbséz a htelóglal hozzáletolhséglsen kttitishsan kitejezart i.p. beadási követően, Egetekben a színt elérte az l áöti ngönl szintet 7 (ka után és átiö ágból szákon tnseadt 24 öra ntslva. Ezzel mnében gsásáayíáám altit to, 1ÖÖ ngnkties szintet tnértökk Örst alatt,
Mind vad tipssti patkány-ntototot (toNSN), ttod & §3, helyzetben Asrt-Lyv .holytoattol htoload nenhlasztlst (toktobt) Ihlgottilktlytott állapotát belytolltottnk és ttoihstok ETE dishetikes ρη.ο· kto''^ös>pátiatstxiellheu történő togálatoktoz, A vtoBNrt állati vizsgálatra kő&vetlenill nlkalnres módos szerebák ki, ang se to-NWd 10 kPa PEGtilPAto történő ptoezáshez állítotok elő. Az ^saRlgootoybási (5ye(bldlrtg>s) ás tlsztitáal «ólokhoz tsémfeátoos towogtátiát (SBC) alkalmazó, éjötirtlgssttolytoi eljárást tejiesztePllnk ki, antsályel NBN ntntotteiöja ál to ektottyiatokbtil hagy menynylaégekben tk nagy kxanmnháttoaa végezhető, A SEC-en kivéti nto Ni-HTÁ, stbtil Ctoszitlkts· oszlopkromatogsáftás lépéseket is alkalmaztunk a végtermékfehérje tisztaságának növelése érdekében. A fehérjéket alaposan jellemeztük SDS-PAGE, méreíkizárásos kromatográfiás, ESMS vizsgálatokkal, az aktivitásnak KiRA ELíSA-val töríésiö vizsgálatával és az endoíoxin-tartalom meghatározásával. A végterraékíehérje tisztasága SDS-PAGE és SEC alapjain 95%-nál nagyobb, Az egyes termékek endotoxmszintje <0,2 EU»'rog. Mindkét fehérje specifikus aktivitása KIRA EÍJSA-val körülbelül 10 nM. A vt-NBN-t 1,0 mg/ml koncentrációban szereltük ki, az NK-NBN-t 2,ő mg/ml koncentrációban foszfáttal puffereit sóoldatban (PBS), pH 6,5 szereltük ki. A vt-NBN-t 15 mi-es csövekbe osztottuk szét, és -fÖ^C-on fagyasztva tároltok, az NK-NBN-t a szétosztás és fagyasztás előtt pegileztök, l^élda
AjvadiipusúneublaszíiiLÚs.^N^
Mindkét NBN-formát. S. coliban expresszáituk His-cimkével jelölt fúziós fehérjékként egy enterokináz hasítási hellyel közvetlenöl az érett, 113 aminosavból álló szekvencia starthelyével szomszédosán. Mind a vtNBN-t (1,8 kg üledék), mind az NK-NBN-t (2,5 kg üledék) expresszáló baktériumokat 2 liter PBS-ben lizáltok Gaulin-présben. A zárványlestek centrifugálássai (10000 rpm) történő kiülepítése után a készítményekből származó folüiüszókat elöntöttük. A zárványtestet tartalmazó üledéket pufferrel (0,02 M Tris-HCl pH 8,5, 0,5 mM EDTA) kétszer mostuk, majd TritonX- 100-at tartalmazó (2% tf'tí), ugyanezen pufferrel kétszer mostuk, amelyet további két, detergens nélküli mosás .követett Mimikét üledéket ÓM jpnmidin-hídroklorid, 0,1 M Tris pH 8,5, Ö, 1 M DTT és I mM EDTA oldatban oldottuk. Az oldást folyamatot segítendő az üledékeket poiytron homoge nizálóvai homogenizáltok, majd egy éjszakán keresztül szobahőmérsékleten keveríettük. A feloldott fehérjéket centrifugálássai tisztítottuk denaturáló kreraatográfia előtt Supmíex 2ŐÖ-os keresztül (5,5 liter oszlop ekvilibrálva 0,05 M glicinneVfoszforsav pH 3,0-mai, 2 M guaaidin-HCi-lel) percenként 2ö ml-tel.
A denaturált NBN-t SDS-PAGE-va! azonosítottuk. Mind a vt-NBN-t, mind az NK-NBN-t tartalmazó frakciókat egyesítettük, és körülbelül 250 ml-re koncentráltok Amicoit 2,5 1-es, kevertetett sejtkoxtcentrátortal. Msután szűréssel minden csapadékot eltávolítottunk, a koncentrált fehérjét teuatutáló méretkromatográfiának vetettük alá Swperdex 2öő-on keresztül, 0,1 M Tris-HCl-lel, pH 7,8, 0,5 M guanidin-HCl-lel, 8,8 M redukált gluatabonn&l és 0,22 rnM oxidált glutatíonnai ekvilibrálva. Az oszlopot 0,5 M guanidin-HCl-dal fejlesztettük 20 mi per pete sebességgel. A renatorált vt-NBN-í és NK-NBN-t tartalmazó frakciókat SDS-PAGE-val azonosítottuk, egyesítettük, és 4’C-on tároltok, amíg a Hls-címke eltávolítására nem volt szükség. AzNSHkoncgaíráriója Afc//2HtoínatogíáfrM:dITR59m51}
A renatorált NBN-t legalább 24 órán keresztül 4’C-on tároltok, mielőtt a tisztítást tovább folytattuk, hogy elősegítsük a dlszulfid-kötések kialakulását az NBN-monomerek között. Ez idő alatt csapadék képződött, amelyet 0,2 μ PES-szüröegységen keresztül történő szűréssel távolítottunk el. .A nem specifikus kötődés csökkentése érdekében a fehérjeoldatboz 20 mM imidazolt adtunk a 100 mi-es Λ7-Ν7Χ (Qíagen) oszlopra töltés élőit, amelyet oszioppufferrel ekvilibráltuok (0,5 M guanídín és 20 mM imidazoi) 50 ml per perc sebességgel. A fehérje feltöltése után az oszlopot alapvonalig mostuk ugyanezzel a pufferrel. Az NBN-t a gyantáról körülbelül 300 ml eluciós pufferrel (0,5 M guanidin-HCi és 0,4 M imidazoi) eluáhuk le. Elúcíót követően az NBN-t egy éjszakán keresztül dsalizélíuk (KI kDa dializisesőveí) szobahöruérsékieten tíz térfogatnyi 5 mM sósavval szemben. A dialízis elősegíti a szennyező anyagok hidrolíziséi, és a guanidin-HCl és az imidazoi koncentrációkat 0,05 M-ra, illetve 0,04 M-ra csökkenti.
A Hls<friike hasítása liril^ndooeotidázzal vasv entmoki agaajjsF φφφφ φ Κ Φ Φ Φ *
X Φ V Φ Φ * »««»'« χ * * *
Sf ΦΦΦ» «* ΦΦ
A kővetkező napon a dialízis alatt keletkezett csapadékot szűréssel eltávolítotíuk. A fehérjeminiához 0,1 M nátrium-kloridot adtunk 5 M törzsoldatból, hogy a végső sókoncentrámót a visszamaradt guanidin-HCi-dal egyőn körülbelül ISO mM-ra állítsuk. A koncentrációt koaduktométerrel ellenőriztük. Továbbá 1 M HEPES, pH 8 puffért adtunk 25 saM végkoncentrációban. A címke lehasítása érdekében iizil-endopeptidázt adtunk a vtNBN-hez és enteroklnázt az NK-NBN-hez, mindkét esetben körülbelül 1:30Ö proíeáz:NBN arányban. Az NKNBK esetében enterokinázt alkalmaztunk lízil-endopeptidáz helyett, mivel a mutáns fehérje Lys95-helyénél egy további proteáz hasítási hely található. A mintákat szobahőmérsékleten keverteítük 2 órán keresztül, és az emésztést SDS-PAGE-val követtük nyomon.
AHis-efeikeöTÁ2Hji^
A proteázzal kezelt NBN-t 100 ml Ní-NTÁ-oszlopra töltöttük, amelyet 0,5 M gnanidin-HCl-áal és 20 mM nnidazoilal ekvilibráitunk 50 ml per perc sebességgel. Az oszlopot alapvonalig mostuk ugyanezzel a pufferrel, Minden, az oszlopról eluálódó fehérjéi egyesítettünk a His-címke nélküli NBN-t tartalmazó keresztüláramló fehérjével.
CM-sHiikfecmmatogfega
As ΛΤ-ΛΤ-ί kromatográüát kővetően a fehérjét azonnal tovább tisztítottuk CM-sziiikagyantán. A tőhöpufierrei <5 mM foszfát, pH 6,5, 150 mM nátrium-klorid) ékviíibráíí CM-szllikagyaxstára (20 ml) töltöttük az NBN-t 20 mi per perc sebességgel. Az oszlopot húsz oszioptérfogatnyí mosó parféméi mostuk (5 mM foszfát pH 6,5,400 mM nátrmm-kiorid) és a fehérjét lépcsőben pH 6,5-ön eluáltuk az ugyancsak 5 mM foszfátot, de 1 M nátnum-kioridot tartalmazó eidciös pufferrel. Áz eluálódott fehérjéi egy éjszakán keresztül dializáltuk csak a foszfáttal szemben, hogy a sókoncemrációt 100 mM-ra állítsuk HK-NBN esetében és 150 mM-ra vt-NBNesetében. Mindkét mintát 0,2 μ PES-szürőegységen szűrtük keresztül, SDS-PAOE-val vizsgáltuk, és 4*C-on tároltuk, mig a további vizsgálatokhoz vagy pegilezésbez nem kellettek.
A vt-NE'N és az NK-NBN UV-spektrumát vizsgáltuk, hogy a 288 nm-néi lévő abszorhaneiájukat értékeljük. Mikrokvaré-küveüa alkalmazásával, a pufferrel szemben mérve 180 μί vt-NBN-t és N’K-NBN-1 folyamatosan mértünk 238 és 330 nm között Beeámon spektrofotométerrel. Eseo vizsgálat szerint a vt-'NBN 1,1 mg/ml koncentrációjú., az NK-NBN 2,6 mg/mi (A288 nm Es'í% ~ 0,5, mindkét fehérje esetében). A 338 sm-xfel tapasztalt abszorbancia alapján 1%-nái kevesebb a kicsapódott anyag.
A két fehérjekészítmény tisztaságának ellenőrzése érdekében mindegyik mintát (8,5 mg) méretkizárásos kromatográfiávai vizsgáltuk /0/38 Swpmfer 73 oszlopon. Az oszlopot 400 mM nátrium-kloridot tartalmazó 5 mM foszfáttal, pH 6,5 ekvilibráltuk és 1,5 tnl/perc áramlási sebességgel fejlesztettük ki. A 280 nm-néi mért abszorbancia alapján mfed a vt-NBN, mfed az NK-NBN egyetlen csúcsban vándorol a várt molekulatömeggel (23-24 kDa), és nem tartalmaz semmilyen szignifikáns fehérjeszenuyezödést
Mind a vt-NBN-t, mind az NK-NBN-t 2,5 M guanídin-HCl-ben, -50 mM Tris-ben pH 8,8 és lő mM DTT-bea redukáltuk. A redukált mintákat sómcntesítettük egy rövid Q-oszlopoa keresztül és on-liae vizsgáltuk ESMS-sel Pipié quadjupole készülékkel. A nyers BSMS-adatokat MaxShr programmal dolgoztuk fel, hogy megkapjuk a íőmegspekttumot Ezzel az eljárással a többszörösén töltött jelek egyetlen csúcsba esnek, amelyközvetlenül a kílodaitonban (kPa) kifejezett molekulatömegnek telel meg. A vt-NBN feldolgozott tömegspektruma 12046 kPa nagyságú típus sólshlyáí snntatta, amely megegyezik» várt, a fehérje 113 aminosavas fonalának ínegfelélö 12846,7 köa molekulatömegének. Egy mater komponenst is megfigyeltünk (12063 kDa), amely egy oxidációs termék jelenlétére utal. Az. NK-NBN-míntáb&n három csúcsot azonosítottunk. A fo komponens fcfc fc fcfcfc tesaélsgos 1134S Hb, megegyezik & fehérje löb ammosavsa formátok várt íttetötötöttert gtötö, A másik tó esáes tömege i1302 ás 12001 kltö, amely ss N&~NBN oxidációjára, illetve & I13 smiaosavas forma jelenlétére utttl
Ax NX-'RBN kétets^ényten lévé Ite és IB aminesavas fennék jelenléte ax mttxeklnázxal történő emésztésnek stötökntötetö, A Bisssyssrt-töl sztenazó greúte; Mejtötöl ssteifetefelyöjáMl itetttett, természete «stesstkétökmény, és lakták, hogy kis mértékű Bipsxls «snyexSdórt tartalmaz (0,25 ag tripssdn p«r pg cotarokináx). Á kipsatö ax NK-NSN karboxtotnlnális oldatén lévé Asg'ten btötök, amely s töltelytönt lévé, löé amlnosavas fetmát «rttötttönysíxi, Másrészről a vt-Wtö hasítására ailmlmaxott Itel-mdtttWtrdáznak egytölm protaáz aktivitása vas, mely a Htecímkében lévő irefe kzEboxitensltells oldalán hasít, ás ss érett, 113 amhmsavas NBN-töretöt eredményezi. A« NBN-nek telné a löó, tettö a 113 stnkwcw formái egyfermáa aktívak vtöamennyt alkalmazott vizsgálatba»» és hasonló módon viseltettek a geantöteHCl stabilitási vteígátölbnn,
Ax RBH'stóvitást tw képessége slagján határoztak meg, hogy stetnntl n-töri feszforiláesóját BB41 A3-m&L3-s^ttkfeen a 3- pé!4ébas tenedetett QiA .BUSA vtógálafeaa. A. feezferílék RBT-tö a megkötött receptornak 2 órán kérésztől HRPtöss kötött foszfotjrezia tenssnyaggtö (ÖCllö; 0,2 pgAynk} történő fetafeástójévnl otottötö ki. Ax tötebétööt kővetően a iynfetktö hatszor Mk TBST-vel, és a ÍW-töMtöttöt 450 am«nál matattak tö kofernnettiáa vimgéfettak A teátmmanl vsgy osafc a Ites pofferrel kezek lyttka&tól mért stöxntöwwrtékeket a háttérrel korrigáltak, és az adatokat ax aktivációs kevetökhen lévő neublatóm fess» rációjának töggvésyéten ábrázoltuk. Ax adatok szedet, a Úszóiért NBN tösstödlsit BBT megjelenését emdtsó· nyext, sntey matötte hogy a tisztbe» K8N aktív ebben a vixsgátötbaa.
A vad tlpntö mmblasxiiní 1 nxghtö konrimtrádóhan FBtöb® 1 tsM sztöfo-SMCC-vel (Eleme) fessetek, és sómmtesttettttk, hogy ebávolítsek a tewtkStést kfefeteé molekula töfesfcgök Mivel a vad típusú N8Ntöhtöfe csak egyeőeo ambt fertstess ax Rtöntetölksnn M néros sxsbad mtfifeMl-esogor^a, az SMCC-rd történő reakció várhatöm az NBN hetyspedfikas reötöteiktöt eredményezi, vagyis SMCC kötötök az Rtöntönúlrtfa;
Az NBR-SMCC-koujugétömtei te pg-tö mtebálteok Ctö pg marte-szfemrmfemsdnoal, és SDS-EACIB* val vizsgállak a kereszíkötések mértékét A BSA egyetlen szabad SH-eseportot tartalmaz, ezért ue NBNSMCC-köttjagtermnaí történő reakció várhatóan éren a helyen történő rtódnsittör eredményez az SMCX-bea lévé ntetönnttön kérésztől Ilyen kőrtíteények köteti kép nagyobb nteeketeőstetök további sáv Jeten meg, amelyek wgsgyeznte ax NBStöaek ugytöfen. BSA-xésazel, Illetve két BSA-wtónlával történő módosításénak teseg:éreis tevéi mindegyt RBKteteéknkt két bMermínálirt tsrtstesa, amelyen renkelő történhet, Így összhangban wn a lapasfetekkktö, A két fed wgitöteéterel egy ®öen ax NBteSMCC tö a BSA tövek imentöttös ötökként. A vtezammaát Wtötev teetttötön tönpjktt a restetö égy tötök Sitetetöben mag végbe.
Az «gyammsen nsetötetnék tmte a rentöteknvntöktel katöwwátö tettnatogféMval és stetökktöttöos ktörttöegtöfetö Sptmtvfe 5te <xstörtpeo (Ptererttöa) osteitötök, lényegdxtö az eióteekbte tárgyak trtglfestöi vtegtettoknél Istnertetöttek szerint A gétötöttöböi sabwé nteegtetetöktö SPSteAGB-vtö tömgétek, tö etekben, melyek az ngyrtswm töetetöitökit tönséket ttötönwtök, mérték a töbtölfeartstetö teö nnt-nél lését atözortöntetötö. Mivel a BSA tönsege köritlbehM telsrerese a nenbteztöténtö, a fetszófeges kést>7 ,\· :· v <« ·χχ. *♦*·*
V * * * « X
X Φ X· Ο Ο * is .£·*.♦ * * * * ·*
χ. χ.«ΟΧ XX Ο* ecoimelót hároauoal osztottuk, hegy megkapjuk sz ΝΒΧ-ekvlvalcttst, Bas s hnkoiót a mékhdés vizsgálata ^dekteoa KIRÁ BUSA-val stótótedt. Áz ICőlTórtékek mind vt-, mind BSÁ-kssp'agé.S ΝΒ&» 3-é abk amely azt moisthg hogy BSA-hez. itktóob kapcsolás oetu hefolyősogo a odtködést.
Ezeket sz slőzetes vizsgálatokat BSÁ-v&i végezáSk, de putkésybét ás emberből szfeawő, megfelelő seÁmnafeusumSfeifejőtefe «etette van szabad SH-csopor^^r, Esek szettet hasonló ínegkőgslitéA mód sltótsa®» ható gatkstoy eredeté szteuaslbumte-patetey-NBN kötgugtem «hWkásfe femkokioatikai ős htókonyságl vizsgálatokhoz patkányban, és hmnte-^sértauatómiötósste-NBN előállítóra klinikai kísérletek kivitelezéséhez, Hasonló módon SMCC bámoíym más, kerssztkőíési kialakító nmlekulával helyettesíthető, amely amteteafctív csoportot tetetem® ez égjék. oldalán és tloteeateív' csoportot a másik oldalán, Ánsteresfctív bietfkötést kialakító molekulák, amelyek Pohnakliv mstelmiáet építések be, például m AMAS, a BMW, az MBS, sz KMCS, ez SMPB, az SMPH, a XhdBS vagy a OMBS, tevéhbá amelyek tiefeestóv halosoetát-essipehoi épk testek he, például ez SBAXh e SÍA, a XlÁB, ós amelyek védett vagy oem védte iiolt tótetenak ki szeüddrücsoporttal történő ráátóóhez, hegy redukálható kapcsolatot sietettetek te, például az SFDF, ez SMFT, a SATA vagy a SATP, aaaelyek mindegyike femereárető Pmree-tdh Ezek a kereszlkótést kialakító molekulák csak például szolgálnak, ós asgyott sok, hasonló stratégia képzelhető el sz N8N N-temőtetóaak mémmalfeummhox főrtteő kötetese, Szakember ssdrustebumis fconjugátuxotet elő tudja állítani ágy te, hogy nem sz NBN Nterminálisát vagy a szárusotehtunin doiráaeái célozza meg. Gésteolsmléglól hton előállítóit NBNsséíumslimmia feedök, ahol NBN-t szómmalbisuln gépjéhez fcmséllsk sz Nnonalnáh&ka, a C-ienmuáhaán vagy mindkét végéé, várhatói azmáh móköBóképezek,
Bz sz. eljárás rutin alkalmazások. során kiterjeszthető ml&óett NSN-szőramalhóostn tatógtómra, amalyek a termékouk hamsabb feláieiidót biztosltete hllsinkbáu és igy embetektót is.
A mkvvaeblistébass található .nem kádolt szövegrészek (223 kód) ferditáa&fc «210» I
«.223» A mcsáeíaéges szekvencia,lekéss: hmztezus szekvencia «223» ahol Xte Oly vagy Thr «223» ahol .kas Pro vagy Arg «223» ahol Xaa Oly vagy &sr «223» shöl Kas Alá vagy Thr «223» ahol Xaa Alá vagy Thr <223» ahöl Xaa Oly vagy Asp <223» ahol Xaa Arg vagy Ser <223» ahol Xaa Arg vagy Ser <223» ahol Xaa. Vsl vagy Se <223» ahol Xaa Vad vagy Se <223» Ahol Xsia Pto vagy öls <223» «tói Xaa Pto vagy Sor <223» almi Xaa Vai vagy Se «223» ahol Xaa Arg vagy H «210»ö * Φ X ΦΦ <·
χ.ΦΦφ * Λ- Φ » φ » *φφχ ** X* <223» A mesterséges szekvencia leimsa: KÖ2-310 stlig<axnkkx5fel <219» ?
<223» A mesterséges xsekveoeln lelntssn OÖ-2Íl eligtmakfeeító <2io»s <223» A mesterséges wkwnda lehÁsa: XD3-254 oligoaukieotiíi <210»§ <223» A mestes-séges szekvencia leírása: KE&-25S tOlgonnbieotiá <210» 10 <223» A mesterséges szekvencia leírása; KD3-25Ű ohgonetáetxiá <210» Π <223» A mesterséges szekvencia letósa: RD3-259 Gligtwfcfeötkl <210» 12 <223» A mesterséges szekvencia lefeiez: KD3-250 ölígömskleotíd <210» 13 <223» A mesterséges rsdtvem teáésn; KD3-257 oligamddeotíd

Claims (12)

  1. SZARAI AtMriGÉWKWOK
    1. Foiipqtllá, amety az L szöncsltószámú szekvencia 8-H3 helyzetű amlnommav^ legalább 90%-baa sesítxe? «mlmwvsjtóvmoát fasmhsmx, ás amely próipepfetes az 1, astwssltóssámú szekvencia 05. feelymbb mk ategfelelé Myzefeea ssaparagfetóí elíétó ammnsay található, ahol a 05, helyzetnek megfelelő helyzetben ásobsztimbll smimssm? olyan helyet jedstbe, amely ímiyen ixfe-etlléeglfel kapcsolható a pehpepfeSbsz.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti polípepriá, amelyben az 1. azenesitónsámé mekvmcis §5, helyzetének megfelelő helyzetbe® miálható amítmsav Bab,
    A A 1, vagy 2, igénypernek bármelyike wáati goiipsptié, amelyben a polipeptid ez alább: szekvenciák feámelyikéí tartalmam;
    (s> a 2, aztmosilésaámti szekvencia S-H. és 90- il 3, ammmsavai;
    <>} a 3, azonosítószámú szekvencia 3-94. és 90-113, sstema, valamint <e> a 4. azssosltószteá szekvencia 3-94, és 90-í 13.. amínosavai.
    4, Az 1. igénypont szerinti pnSpephá, amdy a X, 3. vagy a 4. azrmniri'tósgámű szekvencia 1-04. ás 95113. aminosavait tartalmazza, 0s amelyben a 95. helyzetben zszgsmgk helyett lizin tzléihotó,
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont száritól tnzlipspihf, amelyben sót az I, azmwfeSszfem szckvenein 9-113, wmmM lagaláhh 955Áhanaztnw, §< Az-b-5. igényponfek bénnotythe szerinti pollpoptiő.amely™ íltnwlzselOja esetén -- az; nléhlnek kbzlti legalább egy biológiai aktivitással Ont a, OFtóMtóz veié feOtóáés,
    h. XEIrtAfeifegiai tisezm tnasánttiéeiígstnA: stámOéláss, a smron tniéléképosségánek kfezfey valamte á, pátólégias; véfezzéscA: tnmmfesaibsá nsnnavfean.
  4. 7, Fássós fetirijs, annáy K feéttyinntfek titesteyfea «« pokpeptiótít lamtem egy tfenriik mofe» knkterim testenéltsn.
    S, A 7. igénypont szerinti Bnlés fehérje, sta^m a mferife nfeetefeésn tente száma Annin pelipepthL $, Nnkfennav, smtriy tsz l-fe igfetypontek fefennéyiks szerinti grfepepfefet vagy ss 7, vagy 8, igénypont szerinti Briós tetejét kódol,
    1ti. A §, igénypont «rinti ntfetinnssval tsteínmó vektor,
  5. 11. A10- Igénypont «mii vetett tettemé gazásssgt.
  6. 12. A11. igénypont szerinti gsztiasejt, amely ktiüti hfensóg pefeössehsejtje,
  7. 13. E|teés az 1-S. igénypontok fefeaelyike szerinti polipagtiti vagy a 7, vagy ti, igénypont szerinti Briós fehérje előállítására, snseiy sósán (a) a 11. vagy 12. igénypont szerinti gnnfesejtei olyan tmrSteateyak közte tenyésztjük, amely lehetővé Wri az I~é, igénypostek hrisnelyike szerinti gotipéptiá vagy a 7, vagy g. igénypont szerinti Briós fehérje expraateójét és (k) a potipeptióet vagy a Briós tetejét kteyoíjSk,
  8. 14. Dlsw, amely kteti, l-Ő. igénypontok bármelyike swfeti peíipeptiáet vagy keltik 7, vagy 8, igényim! szerinti Briós tetejét tatetem.
    1$, Konjogtenn, amely az l-S. igénypontok bteteyike szerinti pelgscptídet fetirikikfe-gtitolte; koejngüte tartalmazza, ahol a pfesifefegfeB a potipeptidhns az 1, saonoriióaztoé szekvenriáfcsn a 95, helyzetnek megfelelő helyzetben sztesztittet atomosavnél van risssfegriva, ió, KfefeBfe amely a 7, vagy 8, igénypont szerinti pollpeptídeí poilalkitea-gt&oifeöx tegsgáítaa tartalmazza, ahol a polialtölte-glikol a polipeptidhez ax 1, azonorisősssfeú «kveneiéhao a 95, feáytesek rn^telelő helyzetben ssmhsxtitaélt aminosavnái van konjugálva.
  9. 17, A IS, vsgy lő, igénypont szerinti konjugtem, atnriyiw a potiafexlte glite potietilón-glikei.
  10. 18. A15-17, igénypontok bármelyike szerinti kfettfeifep oötriylw a poüpeptiá glikozilált.
    14, Áa iri. igénypontok ófeselyske szerinti pohpsptiári, a 7, vagy 8. igénypont «rinti Briós fehérjét vagy a 15-18. igénypontok bármelyike «rinti konjngtennró és tirifeógirifeg élfegaáhsíő honánzót tartalmazó gyégytemti készítmény.
    2Ö. Az l-ő, igénypontok bármelyike wári polipeptid, 8 7. vsgy 8, igénypont szerinti. Briós fehérje vagy a 15-18, igénypontok bórsnóiyikn szerinti konjogtem teéptea» való alkalmazásra.
  11. 21. Az l-ő, igénypontok bármefyika szerinti polgngrtiá, a 7. vsgy §. igénypont szerinti Briós fehérje vagy a 15-18. igénypontok ferimelyike szerinti fepngaintn stikrinnfess felfessen renánllettesség vagy betegség kezdésére vagy nsegeiőxesése· szolgáié ggfeoyfetstl késritinány elMWséBso.
  12. 22·. A 2L igénypont szeritstisókfemfe, ted a betegség vagy rendstimesség perifériába netsntpáiri vagy oetnngstiés í^dahni ténntegyéttss.
HU0500637A 2001-02-01 2002-01-25 Polymer conjugates of neublastin and methods of using same HU228973B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US26607101P 2001-02-01 2001-02-01
PCT/US2002/002319 WO2002060929A2 (en) 2001-02-01 2002-01-25 Polymer conjugates of neublastin and methods of using same

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0500637A2 HUP0500637A2 (hu) 2005-09-28
HUP0500637A3 HUP0500637A3 (en) 2010-01-28
HU228973B1 true HU228973B1 (en) 2013-07-29

Family

ID=23013042

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0500637A HU228973B1 (en) 2001-02-01 2002-01-25 Polymer conjugates of neublastin and methods of using same

Country Status (36)

Country Link
EP (2) EP1862475A1 (hu)
JP (2) JP4259868B2 (hu)
KR (2) KR100960063B1 (hu)
CN (1) CN1500095B (hu)
AR (1) AR035077A1 (hu)
AT (1) ATE365748T1 (hu)
AU (1) AU2002247037B2 (hu)
BG (1) BG66393B1 (hu)
BR (1) BR0206852A (hu)
CA (1) CA2436407C (hu)
CY (1) CY1106886T1 (hu)
CZ (1) CZ20032080A3 (hu)
DE (1) DE60220879T2 (hu)
DK (1) DK1355936T3 (hu)
EA (1) EA009771B1 (hu)
EE (1) EE05537B1 (hu)
ES (1) ES2289091T3 (hu)
GE (1) GEP20063916B (hu)
HK (1) HK1057759A1 (hu)
HU (1) HU228973B1 (hu)
IL (2) IL156941A0 (hu)
IS (1) IS2867B (hu)
MX (1) MXPA03006805A (hu)
MY (1) MY143685A (hu)
NO (1) NO332150B1 (hu)
NZ (1) NZ527863A (hu)
PL (1) PL211162B1 (hu)
PT (1) PT1355936E (hu)
RS (1) RS50857B (hu)
SG (1) SG149685A1 (hu)
SI (1) SI1355936T1 (hu)
SK (1) SK288123B6 (hu)
TR (1) TR200301208T2 (hu)
UA (2) UA100967C2 (hu)
WO (1) WO2002060929A2 (hu)
ZA (1) ZA200305733B (hu)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7442370B2 (en) 2001-02-01 2008-10-28 Biogen Idec Ma Inc. Polymer conjugates of mutated neublastin
WO2002060929A2 (en) * 2001-02-01 2002-08-08 Biogen, Inc. Polymer conjugates of neublastin and methods of using same
US7276580B2 (en) 2001-03-12 2007-10-02 Biogen Idec Ma Inc. Neurotrophic factors
EP1395279B1 (en) * 2001-03-28 2011-10-05 Biogen Idec MA Inc. Use of neublastin polypeptides for treating neuropathic pain
HUE028163T2 (hu) * 2002-01-18 2016-11-28 Biogen Ma Inc Polialkilén polimervegyületek és felhasználásuk
EA008743B1 (ru) * 2003-01-31 2007-08-31 Байоджен Айдек Ма Инк. Полимерные конъюгаты мутантного неубластина
NZ574121A (en) 2003-04-18 2011-06-30 Biogen Idec Inc Polyethylene glycol-conjugated gylcosylated neublastin and uses thereof for treatment of pain
BRPI0411243A (pt) 2003-06-10 2006-07-11 Nsgene As método de produzir um polipeptìdio de neublastina biologicamente ativo, ácido nucléico, vetor de expressão, composição farmacêutica, célula, linha de células de compactação, mamìfero não-humano transgênico, dispositivo de cultura de células implantável, uso do vetor, método de tratar uma doença do sistema nervoso, e, polipetìdio de neublastina
US7598059B2 (en) 2003-10-02 2009-10-06 Biogen Idec Ma Inc. Neublastin expression constructs
NZ553431A (en) 2004-08-19 2010-04-30 Biogen Idec Inc Neublastin variants with decreased heparin binding
CA2577690C (en) * 2004-08-19 2013-08-06 Biogen Idec Ma Inc. Refolding transforming growth factor beta family proteins
TWI501774B (zh) 2006-02-27 2015-10-01 Biogen Idec Inc 神經性病症之治療
US20100056440A1 (en) * 2006-03-01 2010-03-04 Biogen Idec Ma Inc. Compositions and methods for administering gdnf ligand family proteins
JP2010503630A (ja) 2006-09-15 2010-02-04 クレアビリス・セラピューティクス・エスピーエー ＨＭＧＢ１のＢｏｘ−ＡおよびＨＭＧＢ１のＢｏｘ−Ａ変異体のポリマー複合体
EP2142205B1 (en) * 2007-05-01 2014-04-02 Biogen Idec MA Inc. Neublastin peptides for use in increasing vascularisation in tissue with impaired blood flow
PL2773438T5 (pl) * 2011-11-02 2022-01-17 F.Hoffmann-La Roche Ag Chromatografia przeciążenia i elucji
RU2488635C1 (ru) * 2012-03-22 2013-07-27 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития Способ получения рекомбинантного антиангиогенного полипептида

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6472178B1 (en) * 1998-02-27 2002-10-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acids encoding a modified ciliary neurotrophic factor and method of making thereof
US5770577A (en) * 1994-11-14 1998-06-23 Amgen Inc. BDNF and NT-3 polypeptides selectively linked to polyethylene glycol
US6593133B1 (en) * 1998-07-06 2003-07-15 Nsgene A/S Neurotrophic factors
AU2354600A (en) * 1998-12-09 2000-06-26 Amgen, Inc. Grnf4 a neurotrophic factor
WO2002060929A2 (en) * 2001-02-01 2002-08-08 Biogen, Inc. Polymer conjugates of neublastin and methods of using same

Also Published As

Publication number Publication date
EA200300852A1 (ru) 2004-06-24
NO20033441D0 (no) 2003-08-01
IL156941A (en) 2008-11-03
DK1355936T3 (da) 2007-10-29
EE200300355A (et) 2003-10-15
CA2436407A1 (en) 2002-08-08
EE05537B1 (et) 2012-04-16
SI1355936T1 (sl) 2007-12-31
HK1057759A1 (en) 2004-04-16
EP1355936A2 (en) 2003-10-29
PL211162B1 (pl) 2012-04-30
EA009771B1 (ru) 2008-04-28
IS2867B (is) 2014-02-15
MXPA03006805A (es) 2003-11-13
CY1106886T1 (el) 2012-09-26
PL372101A1 (en) 2005-07-11
GEP20063916B (en) 2006-09-11
EP1862475A1 (en) 2007-12-05
JP2009039135A (ja) 2009-02-26
BG108111A (bg) 2004-12-30
ES2289091T3 (es) 2008-02-01
YU61003A (sh) 2006-05-25
CN1500095B (zh) 2010-06-16
ATE365748T1 (de) 2007-07-15
CZ20032080A3 (cs) 2003-10-15
UA82983C2 (ru) 2008-06-10
SK9712003A3 (en) 2004-01-08
EP1355936B1 (en) 2007-06-27
IS6879A (is) 2003-07-17
WO2002060929A2 (en) 2002-08-08
TR200301208T2 (tr) 2005-05-23
CN1500095A (zh) 2004-05-26
RS50857B (sr) 2010-08-31
KR100960063B1 (ko) 2010-05-31
NO20033441L (no) 2003-10-01
HUP0500637A2 (hu) 2005-09-28
AR035077A1 (es) 2004-04-14
DE60220879T2 (de) 2008-03-06
IL156941A0 (en) 2004-02-08
BG66393B1 (bg) 2013-11-29
UA100967C2 (ru) 2013-02-25
JP4423338B2 (ja) 2010-03-03
SK288123B6 (sk) 2013-09-03
WO2002060929A3 (en) 2003-03-06
AU2002247037B2 (en) 2007-08-16
NO332150B1 (no) 2012-07-09
NZ527863A (en) 2006-09-29
SG149685A1 (en) 2009-02-27
KR20080098662A (ko) 2008-11-11
CA2436407C (en) 2011-08-30
MY143685A (en) 2011-06-30
KR20030074766A (ko) 2003-09-19
PT1355936E (pt) 2007-09-28
HUP0500637A3 (en) 2010-01-28
BR0206852A (pt) 2005-05-03
JP4259868B2 (ja) 2009-04-30
DE60220879D1 (de) 2007-08-09
JP2005503763A (ja) 2005-02-10
ZA200305733B (en) 2005-02-23
KR100872807B1 (ko) 2008-12-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI250988B (en) Thrombopoietic compounds
HU228973B1 (en) Polymer conjugates of neublastin and methods of using same
CN106565836B (zh) 高亲和力的可溶性pdl-1分子
WO2013130684A1 (en) Xten-folate conjugate compositions and methods of making same
TW200902068A (en) GLP-1 peptide having sugar chain attached thereto
CZ88298A3 (cs) Upravený neurotrofní faktor odvozený z gliové buněčné linie
US20230416337A1 (en) Intestinal expression of programmed death ligand 1
US20050142098A1 (en) Polymer conjugates of mutated neublastin
AU2002247037A1 (en) Polymer conjugates of neublastin and methods of using same
TW200836761A (en) N-terminal pegylated prolactin receptor molecules
ES2450115T3 (es) Conjugados poliméricos de neublastina mutada
KR101025352B1 (ko) 생리활성 복합체

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees