JP2010503630A - ＨＭＧＢ１のＢｏｘ−ＡおよびＨＭＧＢ１のＢｏｘ−Ａ変異体のポリマー複合体 - Google Patents

ＨＭＧＢ１のＢｏｘ−ＡおよびＨＭＧＢ１のＢｏｘ−Ａ変異体のポリマー複合体 Download PDF

Info

Publication number
JP2010503630A
JP2010503630A JP2009527748A JP2009527748A JP2010503630A JP 2010503630 A JP2010503630 A JP 2010503630A JP 2009527748 A JP2009527748 A JP 2009527748A JP 2009527748 A JP2009527748 A JP 2009527748A JP 2010503630 A JP2010503630 A JP 2010503630A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
hmgb1
box
polymer
seq
polypeptide variant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2009527748A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2010503630A5 (ja
Inventor
シルヴィオ・トラヴェルサ
キアラ・ロレンツェット
ヴァレンティナ・マイネロ
セバスチアーノ・モレーナ
シルヴァノ・フメロ
ルカ・ベッカリア
Original Assignee
クレアビリス・セラピューティクス・エスピーエー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=38969804&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2010503630(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by クレアビリス・セラピューティクス・エスピーエー filed Critical クレアビリス・セラピューティクス・エスピーエー
Publication of JP2010503630A publication Critical patent/JP2010503630A/ja
Publication of JP2010503630A5 publication Critical patent/JP2010503630A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins

Abstract

本発明は、HMGB1高親和性結合ドメインBox-A(HMGB1のBox-A)またはHMGB1のBox-Aの生物活性断片のポリペプチド変異体の新規ポリマー複合体に関する。さらに、本発明は、HMGB1高親和性結合ドメインBox-A(HMGB1のBox-A)のポリペプチド変異体の新規ポリマー複合体に関する。さらに、本発明は、細胞外HMGB1と関連がある病状および/またはRAGEの発現の増大と関連がある病状を診断、予防、軽減および/または治療するための、HMGB1のBox-Aのポリペプチド分子の前記ポリマー複合体の使用に関する。

Description

本発明は、HMGB1高親和性結合ドメインBox-A(HMGB1のBox-A)またはHMGB1のBox-Aの生物活性断片の新規ポリマー複合体に関する。さらに、本発明は、HMGB1高親和性結合ドメインBox-A(HMGB1のBox-A)またはHMGB1のBox-Aの生物活性断片のポリペプチド変異体の新規ポリマー複合体に関する。さらに、本発明は、細胞外HMGB1と関連がある病状および/またはRAGEの発現の増大と関連がある病状を診断、予防、軽減および/または治療するための前記ポリマー複合体の使用に関する。
HMGB1タンパク質は、高移動度グループ(HMG)タンパク質のファミリーに属する。ポリアクリルアミドゲル中でのその高い電気泳動移動度のためにそう呼ばれるHMGタンパク質は、真核生物細胞中で単離クロマチンと結合した最も偏在する非ヒストンタンパク質である。これらのタンパク質は、DNAの湾曲、ループ化、フォールディングおよびラッピングにおいて一般的な「構造上の」役割を果たす、何故ならそれらはDNA構造および転写因子またはヒストンとの複合体を変形させるか、湾曲または修飾するからである(Andersson et al、2002;Agresti et al、2003;Degryse et al、2003)。高移動度グループ1(HMGB1)タンパク質は通常は核因子、特にDNAを湾曲させ幾つかの転写複合体の結合を容易にする転写制御分子である。
構造上、HMGB1タンパク質は哺乳動物間で高度に保存された配列を有する約25kDaのタンパク質であり、214個のアミノ酸のうちの2個が全哺乳動物種で保存的置換を有する。HMGB1は全ての脊椎動物の核中の至る所に存在し、特に繊維芽細胞、ニューロン、肝細胞、グリア中、および単球/マクロファージ、好中球および血小板を含めた造血幹細胞由来の細胞中において見ることができる。HMGB1分子は、3つの異なるドメイン:HMGのbox-Aおよびbox-Bと呼ばれる2つのDNA結合ドメイン、およびそれを両極帯電状態にする酸性カルボキシル末端から構成される三部構造を有する。
2つのHMGB1ボックスは、非配列特異的な構造上のDNA結合要素としてタンパク質の機能に関与し、認識される変形DNA構造にDNAを結合させる能力をもたらし、ヌクレオソーム構築を安定させ、リモデリングおよびスライディングする。A-HMGboxとB-HMGboxの両方が、高度に保存された84のアミノ酸残基で構成されており、強く正に帯電しており、類似のL型フォールディングを有する3つのαらせん構造中に配置している。「L」の長いアームはN末端延長鎖およびらせん構造IIIを含み(Andersson et al、2002;Agresti et al、2003;Thomas、J.O.2001)、一方短いアームはらせん構造IおよびIIを含む。構造-機能分析は、HMGB1の前炎症性サイトカインドメインはB-Box、特にその最初の20アミノ酸の配列であることを明らかにする。A-BoxはHMGB1によって誘発される炎症性サイトカイン放出の非常に弱いアゴニストであり、B-Boxおよびタンパク質全体の前炎症性活性を競合的に阻害する。したがって、薬理学的観点から、A-BoxはB-BoxおよびHMGB1によって誘導および/または持続される病的状態のアンタゴニストとして作用する。
第三のドメイン、カルボキシル末端または酸性尾部は、極端に負に帯電している。何故ならそれは、30の反復アスパラギン酸およびグルタミン酸残基を含み、約20残基の塩基性領域によってボックスと結合しているからである。マウスとラットのHMGB1は、この連続的なC末端延長部分に局在するわずか2つの置換によってヒトの形と異なる。
その核局在性および転写因子制御物質としての役割以外に、HMGB1は細胞外培地において免疫系の活性化細胞(単球およびマクロファージ)によって能動的に放出され、あるいは損傷または壊死細胞によって受動的に放出されることも分かってきている(Andersson et al、2002;Scaffidi et al、2002;Bonaldi et a、2002;Taniguchi et al、2003;Friedman et al、2003;Palumbo et al、2004)。
細胞外に放出されたHMGB1は強力なサイトカインとして、および非常に強力なマクロファージ刺激因子として作用する。HMGB1は細胞膜と結合することによって直接作用し、シグナル伝達および走化性を誘導し、ケモカイン様機能を有し(Yang et al、2001)、かつ前炎症性サイトカインの発現および分泌を上方制御することによってさらに間接的に作用する。これによって細胞外HMGB1タンパク質は、有効な炎症免疫応答を促進する強力な走化性および免疫制御タンパク質となる。さらに、HMGタンパク質のファミリーに属し、DNAを湾曲させることができる他のタンパク質が、細胞外培地においてHMGB1と共に放出される。これらのタンパク質は、特にHMGB2、HMGB3、HMG-1L10、HMG-4LおよびSP100-HMGである。それらは非常に相同的なアミノ酸配列をHMGB1と共有する。HMGB1と同様に、それらは同じ受容体と相互作用する炎症病状を誘発/持続し、相互作用の同じ下流経路に至る。
正常細胞において、HMGB1は受動輸送と能動輸送の両方によって細胞質に移動する。しかしながら、全ての培養細胞および休止状態の単球は核中に多数のHMGB1を含み、ベースライン状態では輸入は輸出よりはるかに有効であることを示す。HMGB1中に多量に存在するリシン残基をアセチル化することで細胞は核からHMGB1を輸送し得、それによってその塩基性電荷が中和され、それらを核局在シグナルとして機能することができなくなる。核HMGB1の高アセチル化は、(例えば、繊維芽細胞における)核から細胞質へのこのタンパク質の移動、または(例えば、活性化単球およびマクロファージにおける)分泌エンドリソソームへのその蓄積、および非古典的小胞介在型分泌経路を介した後の放出への切り換えを決定する。既に活性化された単球によるHMGB1分泌が生物活性リソホスファチジルコリン(LPC)によって次いで誘発され、これは活性化後数時間で単球によって生成される分泌性ホスホリパーゼsPLA2の作用によってホスファチジルコリンから炎症部位において後に生じる。したがって、HMGB1の分泌は2つのシグナルによって誘導され(Bonaldi et al、2003)、かつ3ステップで起こるようである:1)最初に、炎症シグナルはHMGB1のアセチル化および核から細胞質へのその移動を促進し(ステップ1)、および細胞質分泌小胞内への貯蔵(ステップ2)、次いで、分泌シグナル(細胞外ATPまたはリソホスファチジルコリン)がエキソサイトーシスを促進する(第三のステップ)(Andersson et al、2002;Scaffidi et al.2002;Gardella et al、2002;Bonaldi et al、2003;Friedman et al、2003)。
放出されるHMGB1は、RAGE受容体と結合するリガンドの1つとして同定されている。この受容体は大部分の細胞型で、かつ主に内皮細胞中、血管平滑筋細胞中、単球およびマクロファージ中、ならびに単核食細胞中において高レベルで発現される。認識はHMGB1のC末端を含む。HMGB1とRAGEの相互作用は、RAGEの上方制御および受容体依存性のシグナル伝達によって介在される持続的な細胞活性期間を誘発する。特に、HMGB1とRAGEの相互作用は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)、Cdc-42、p2lras、Racおよび核転移因子kB(NF-kB)といった、古典的に炎症プロセスと関係する転移因子を含めた、幾つかの細胞内シグナル伝達経路を活性化する(Schmidt et al、2001)。
幾つかの実験的証拠によれば、放出されるHMGB1は、トール様受容体のファミリーの1つまたは複数のサブクラスに属する受容体と相互作用する可能性もある。さらにHMGB1は、トロンボモジュリンの機能的N末端レクチン様ドメイン(D1)と相互作用する可能性もある。トロンボモジュリンの機能的D1ドメインが循環中のHMGB1を捕捉し結合できるため、RAGE受容体およびトール様受容体との相互作用は妨げられる。
in vivoで放出されるとき、HMGB1は非常に強力なサイトカインおよび強力なマクロファージ刺激因子である。実際、内毒素血症の他のサイトカインメディエーターと同様に、HMGB1はヒトマクロファージ由来の多数の前炎症性サイトカイン(TNF、IL-1α、IL-1β、IL-Ra、IL-6、IL-8、MIP-1αおよびMIP-1β)のカスケードをin vitroで活性化する。したがって、HMGB1は急性炎症中に後期メディエーターとして作用し、初期メディエーターの応答が消散した後に全身炎症の病原の重要な経路に関与する。
さらに、前炎症性環境において観察されたRAGEの上方制御、および様々な急性および慢性炎症疾患におけるこの受容体の証明済みの発現の増大は、炎症に関する将来の医学的介入の魅力的な標的としてRAGEを支援する。
in vitroで観察されたHMGB1の前炎症性効果、および循環HMGB1レベルとin vivoにおける病原性の一連の全身炎症の進展の間の相関関係は、このサイトカイン様分子を治療上標的化することは関連する臨床的価値があるに違いないことを示し、HMGB1の細胞外活性の(選択的)アンタゴニスト/阻害剤の「後期」投与による新規の治療手法を示唆する。
したがって、この細胞外HMGB1ケモ-サイトカインタンパク質を阻害するための幾つかの試みが実施された。幾つかの重要な手法は、HMGB1に対する抗体、RAGEに対する抗体のHMGB1断片(例えばHMGB1のBox)に対する抗体、可溶性RAGE(sRAGE)、ピルビン酸エチル(Czura et al、2003;Lotze et al、2003)およびトロンボモジュリンのN末端レクチン様ドメイン(D1)の投与に取り組んだ。
HMGB1中の2つのDNA結合ドメインの1つであるHMGB1のBox-Aは、HMGB1の特異的アンタゴニストとして同定されており、高度に精製された組換えA-Boxは、病状誘導後に24時間初期治療が遅れたときでさえ致死的実験的敗血症からマウスを保護しており、他の知られているサイトカインに使用するそれより広い治療関連範囲で、HMGB1アンタゴニストを首尾良く投与することができることがさらに示唆される(Yang et al、2004)。
HMGB1切断突然変異体の構造機能分析は、HMGB1のA-BoxドメインはHMGB1とマクロファージの飽和結合を競合的に置換し、特にHMGB1活性をアンタゴナイズすることを明らかにしている。抗HMGB1抗体の防御活性に関して既に見られているように、A-Boxの投与は、治療を敗血症の外科的誘導後24時間でようやく開始したときでさえ、敗血症からマウスを救済する(Yang H.et al、2004)。HMGB1タンパク質、HMGB1遺伝子のアンチセンス配列およびHMGB1受容体アンタゴニストと結合する抗体または抗体断片の群から選択されるHMGB1アンタゴニストまたは阻害剤は、米国特許第6,468,533号、WO02/074337およびUS2003/0144201から知られている。
したがって、細胞外HMGB1ケモ-サイトカインタンパク質を阻害および/またはアンタゴナイズするための有望な試みは、DNAに対する2つの高親和性結合ドメイン、すなわちHMGB1分子中に存在するHMGB1のBox-AおよびHMGB1のBox-Bは、細胞外空間に放出されるタンパク質において2つの相反する役割を有するという実験的証拠に基づく。HMGB1のBox-Bの主な活性は、HMGB1タンパク質に起因する炎症促進活性を媒介することである。他方でHMGB1のBox-Aは、Box-Bドメインの炎症促進活性と競合するアンタゴニストとして作用する。
特許出願WO2006/024547は、野生型HMGB1のBox-Aタンパク質の単一アミノ酸の系統的突然変異によって得られる、HMGB1のBox-A、またはHMGB1のBox-Aの生物活性断片のポリペプチド変異体を開示する。したがってWO2006/024547は、細胞外HMGB1の選択的阻害剤および/またはアンタゴニストとしての新たな作用物質、ならびに細胞外HMGB1ケモカインおよび/またはHMGB1ケモカインタンパク質の細胞外放出によって引き起こされる多数の炎症性サイトカインのカスケードと関連があり、それらによって誘導される広範囲の病的状態を予防、軽減および/または治療するためのそれらの使用を提供する。
合成タンパク質薬剤の投与の有効性は、生理的pHにおける溶解性、糸球体濾過による迅速な除去、細胞のクリアランスおよび代謝および容易な吸収などの要因によってin vivoで妨げられる可能性がある。経口摂取する場合タンパク質は消化されるため、例えば経口投与の有効性は妨げられる。他方で全身投与の有効性は、65〜70kDa未満のタンパク質は身体から迅速に除去されるため妨げられる。多くの場合、このような悪影響は低下した患者のコンプライアンスおよび低下した薬剤有効性をもたらし、このようなタンパク質作用物質の有効な治療用途を妨げる。
タンパク質作用物質の効果の有効性および期間を改善するため、および潜在的な毒性効果を低下させるための成功した戦略は、多様なポリマーと生物活性があるタンパク質作用物質の共有結合である。活性作用物質の薬理学的性質および毒性を改善するために、当技術分野で最もよく使用されるポリマーの1つは、ポリエチレングリコール、略してPEGである。ポリエチレングリコール(PEG)ポリマーは両親媒性、非毒性および免疫学的に不活性であり、薬剤と結合させて、薬理学的性質および毒性の多くを操作することが可能である。
当技術分野では、治療上有用なタンパク質とポリエチレングリコール(PEG)の多くの共有結合修飾が報告されている。PEGとタンパク質の共有結合(「ペグ化」)はタンパク質の循環半減期を延長するのに有用である。何故ならそれは、タンパク質の有効サイズを増大させ身体からの除去速度を低下させるからである。さらに、タンパク質のPEG修飾はタンパク質の溶解性、安定性を増大させ、かつタンパク質の免疫原性を低下させる。
米国特許第6,468,533号 WO02/074337 US2003/0144201 特許出願WO2006/024547 WO2004/7022593 PCT/FR00/03503 PCT/FR01/01366 米国特許出願第10/022,249号 米国特許出願第10/022,390号 米国特許出願第10/375,192号 米国特許出願第60/409,898号 米国特許出願第60/457,135号 米国特許出願第60/410,258号 米国特許出願第60/410,263号 米国仮出願第60/584,678号 国際特許出願No.PCT/EP2005/007198 国際特許出願No.PCT/EP2005/008258
Schagger and von Jagow、「Tricine-sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100kDa」、Anal.Biochem.166、368〜379、1987
したがって、本発明の根底にある課題は、細胞外HMGB1の選択的阻害剤および/またはアンタゴニストとして作用する、新規の治療上有用なタンパク質作用物質の提供であった。したがって、本発明の範囲は、幾つかのポリマー、特にPEGの独特な特徴を利用して、非複合体であるHMGB1のBox-Aのポリペプチドと比較して一層高い薬理学的活性、さらに改善された薬物動態的および毒物学的性質でない場合でも同じ状態を示し、様々な考えられる投与経路においてHMGB1のBox-Aまたはその生物活性断片の最高の利用性を得ることができる、HMGB1高親和性結合ドメインBox-A(HMGB1のBox-A)の新たな投与形態を開発することであった。
したがって本発明は、ヒトおよび/または非ヒト野生型HMGB1高親和性結合ドメインBox-A(HMGB1のBox-A)またはHMGB1のBox-Aの生物活性断片の新規ポリマー複合体を対象とする。ヒトHMGB1のBox-Aのアミノ酸配列は配列番号1で示す。好ましい非ヒトHMGB1のBox-Aは、ガンビアハマダラカ(Anapheles gambia)HMGB1のBox-Aであり、その配列を配列番号301で示す。
本発明の他の態様は、ヒトおよび/または非ヒトHMGB1高親和性結合ドメインBox-AまたはHMGB1のBox-Aの生物活性断片のポリペプチド変異体のポリマー複合体であって、前記ポリペプチド変異体のアミノ酸配列が、1つまたは複数の単一アミノ酸の突然変異によって野生型HMGB1のBox-Aのアミノ酸配列と異なるポリマー複合体を対象とする。
本発明の文脈では、「HMGB1」は、非アセチル化型または/およびアセチル化型のHMGB1を含む。同様に、「HMGB1相同タンパク質」は、非アセチル化型または/およびアセチル化型のHMGB1相同タンパク質を含む。好ましいHMGB1相同タンパク質は、HMGB2、HMGB3、HMG-1L10、HMG-4Lまたは/およびSP100-HMGである。
本発明の新規ポリマー複合体は、非複合体であるHMGB1ポリペプチドまたはポリペプチド変異体と比較して、水溶性の向上、薬剤管理容易性の改善、薬物動態的および生物学的利用能の改善ならびに/または低下した毒性および/もしくは免疫原性の低下を示す。さらに、驚くべきことに、HMGB1のBox-Aのポリペプチドまたはポリペプチド変異体および/または断片の複合体形成はタンパク質の生物活性を変えないことが、分かった。
本発明によるポリマー部分は生体適合性でなければならず、天然または半合成または合成起源であってよく、かつ直鎖状または分岐状構造を有することができる。代表的なポリマーは、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアクリル酸、ポリアクリレート、ポリアクリルアミドまたはそのN-アルキル誘導体、ポリメタクリル酸、ポリメタクリレート、ポリアクリル酸エチル、ポリエチルアクリレート、ポリビニルピロリドン、ポリ(ビニルアルコール)、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ乳酸グリコール酸共重合体、デキストラン、キトサン、ポリアミノ酸を非制限的に含む。
本発明の非常に好ましい実施形態では、ポリマーはポリエチレングリコール(PEG)、または末端OH基を例えばC1〜C5アルキル基またはC1〜C5アシル基、好ましくはC1-、C2-またはC3アルキル基またはC1-、C2-またはC3アシル基で場合によっては修飾することができるポリエチレングリコールである。修飾ポリエチレングリコールは、メトキシ-ポリエチレン-グリコール(m-PEG)であることが好ましい。
本発明によって使用するポリマーは、100〜100,000Da、好ましくは5,000〜50,000Daの範囲の分子量を有する。本発明の非常に好ましい実施形態では、ポリマーは10,000〜40,000Daの、好ましくは20,000〜40,000Daの範囲の分子量を有する、末端OHおよび/またはメトキシ基を好ましくは有するPEGである。最も好ましい実施形態では、20,000Daまたは40,000Daの平均分子量を有する、末端OHおよび/またはメトキシ基を好ましくは有するPEGを、本発明において使用する。
本発明のポリマー複合体のポリマー部分は、共有化学結合によってHMGB1ポリペプチドまたはポリペプチド変異体と結合して、安定した複合体をもたらす。
HMGB1のBox-A部分上の好ましい結合部位は、リシン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、チロシン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基から、またはタンパク質部分のN末端アミノ基から選択される。
本発明のポリマー複合体は、モノ-、ジ-およびマルチペグ化複合体であってよい。本発明のポリマー複合体は、モノ-ペグ化であることが好ましい。
ポリマー部分は通常、リンカー基によってHMGB1のBox-A部分と共有結合する。特に、本発明の文脈では、用語リンカー基は、ポリペプチド部分とポリマー部分の間の化学反応によって得られる基を意味する。リンカー基は、HMGB1のBox-A部分のアミノ酸残基上の活性基とポリマーまたは反応基によって活性化されるポリマーの反応によって得られるポリマー複合体の、当業者に知られている任意の残基であってよい。代表的なリンカー基は、アルキレン、アミン、アミド、カルバメート、カルボキシレート、カルボニル、エステル、エーテル、チオエーテルおよびジスルフィド基を非制限的に含む。リンカー基は、N末端アミノ酸残基とアルデヒド反応基によって活性化されるポリマー部分の反応およびその後の還元によって得られる、アミン結合であることが好ましい。
さらにリンカー基は、1つまたは複数のスペーサー基を場合によっては含むことができる。本発明の文脈では、スペーサー基は、反応性官能末端基を両末端に有する二官能基として定義する。1つの反応性末端基によって、スペーサーはポリマー部分またはポリマー部分上の反応基と反応する。他の末端上の他の官能基によって、スペーサー基はHMGB1のBox-A部分のアミノ酸残基上の官能基と結合する。適切なスペーサー基は当業者に知られている。スペーサー基の例には、ヘテロ-、二官能性小分子またはポリマーがあるが、これらだけには限られない。例えば、スペーサー基は、N、SおよびOから選択される1〜3個のヘテロ原子または中間段階の短い二官能性PEG鎖を含む、二官能性C6〜C12アルキル基またはヘテロ二官能性アルキル基によって表すことができる。
本発明のポリマー複合体を得るためのポリマーとHMGB1のBox-A部分の共有結合は、知られている化学合成技法によって実施することができる。例えば、本発明の代表的な一実施形態では、ポリマー複合体形成は、N-ヒドロキシスクシンイミドポリマー(es.NHS-PEG)とアミノ酸残基上の、好ましくはリシン残基上の、またはHMGB1のBox-AポリペプチドのN末端アミノ酸における遊離アミン基を反応させることによって実施することが可能である。あるいは、ポリマー複合体形成は、還元的アミノ化によるPEGアルデヒドとポリペプチドのN末端の反応によって実施する。さらに、PEG-マレイミドとHMGB1のBox-Aポリペプチドまたはポリペプチド変異体のCys残基を反応させることによって、ポリマー複合体を得ることもできる。
本発明の文脈では、用語「HMGB1のBox-A部分」は、ポリマー複合体化合物内のポリペプチド部分を示す。したがって、この用語は、野生型HMGB1のBox-Aおよびその生物活性断片、ならびにHMGB1のBox-Aのポリペプチド変異体およびその生物活性断片を指す。
本発明の文脈では、用語「HMGB1のBox-AまたはHMGB1のBox-Aのアミノ酸配列」を言及する場合、それはヒトHMGB1のBox-Aと非ヒトHMGB1のBox-Aの両方を指す。本発明の好ましい実施形態では、HMGB1のBox-A部分は、野生型のヒトHMGB1のBox-Aタンパク質、および野生型のガンビアハマダラカHMGB1のBox-Aタンパク質に由来する。
本明細書で使用する「HMGB1のBox-Aの生物活性断片」は、既知の試験を使用しているときに対応する成熟タンパク質の少なくとも1つの生物活性が依然として観察可能である、知られている野生型のHMGB1のBox-Aタンパク質の一部分を含むことを意味する。HMGB1のB-BoxおよびHMGB1タンパク質の炎症促進活性に対するアンタゴニスト活性を総じて決定することができる場合、成熟タンパク質の断片は生物活性があると考えることが好ましい。天然HMGB1のBox-Aの生物活性断片は、少なくとも20、25、30、35、45、50、55、60、65、70、75または80アミノ酸の断片である。本発明の文脈において使用する天然HMGB1のBox-Aの好ましい生物活性断片は、それぞれ少なくとも77または少なくとも54アミノ酸の断片を含む。
本発明の文脈において使用する用語「突然変異」は、標的配列中の単一アミノ酸の置換、欠失および/または付加として理解することができる。本発明における標的配列の突然変異は、置換であることが好ましい。置換は、遺伝的にコードされた異なるアミノ酸または遺伝的にコードされていないアミノ酸で起こり得る。遺伝的にコードされていないアミノ酸の例は、ホモシステイン、ヒドロキシプロリン、オルニチン、ヒドロキシリシン、シトルリン、カルニチンなどである。
本発明の最も好ましい実施形態では、HMGB1のBox-Aのポリペプチド変異体またはその生物活性断片は、参照により本明細書に組み込まれている、いずれもNautilus Biotech S.A.(パリ、フランス)の名の下の、WO2004/7022593中および幾つかのさらなる特許出願(PCT/FR00/03503、PCT/FR01/01366、米国特許出願第10/022,249号、米国特許出願第10/022,390号、米国特許出願第10/375,192号、米国特許出願第60/409,898号、米国特許出願第60/457,135号、米国特許出願第60/410,258号および米国特許出願第60/410,263号)中にその技術が広く記載される、定方向進化の手法を使用することによって得る。
定方向進化の技術を使用することによって得られる本発明のポリペプチド変異体は、1つまたは複数の単一アミノ酸の突然変異によって野生型HMGB1のBox-Aのアミノ酸配列と異なる突然変異タンパク質である。本発明の非常に好ましい実施形態では、天然タンパク質の配列上でわずか1個のアミノ酸の置換が起こる。しかしながら、複数、例えば2個以上のアミノ酸置換の置換によって天然タンパク質をさらに最適化できることは、本発明の主題によって含まれる。したがって、修飾ポリペプチド変異体は、1〜10、好ましくは2、3、4、5および6個の異なるアミノ酸標的位置におけるアミノ酸置換によって野生型タンパク質配列と異なる可能性がある。
特に、本発明のポリマー複合体のHMGB1のBox-A部分として使用する、HMGB1のBox-Aまたはその生物活性断片の非常に好ましいポリペプチド変異体は、出願WO2006/024547中に記載されたポリペプチド変異体である。
したがって、本発明の好ましい一実施形態では、ポリマー複合体のHMGB1のBox-A部分はヒトHMGB1のBox-Aから始めて誘導する。特に、ポリペプチド変異体の1つの基は、ヒトHMGB1のBox-A由来の完全長アミノ酸配列(84アミノ酸)(配列番号1)に導入される1つの突然変異から誘導される(図1a)。これらの好ましいポリペプチド変異体は、配列番号2〜116の配列において定義する(図1b)。
他の好ましいポリペプチド変異体は、それぞれ77アミノ酸(配列番号117)(図2a)および54アミノ酸(配列番号223)(図3a)の、ヒトHMGB1のBox-Aの生物活性断片から始めて得る。77アミノ酸のヒトHMGB1断片のBox-Aのポリペプチド変異体は、配列番号118〜222の配列において定義する(図2b)。54アミノ酸のヒトHMGB1断片のBox-Aのポリペプチド変異体は、配列番号224〜300の配列において定義する(図3b)。
本発明の他の好ましい実施形態では、ポリマー複合体のHMGB1のBox-A部分はガンビアハマダラカHMGB1のBox-Aから始めて誘導する。特に、ポリペプチド変異体の1つの基は、ガンビアハマダラカHMGB1のBox-A由来の完全長アミノ酸配列(84アミノ酸)(配列番号301)に導入される1つの突然変異から誘導される(図4a)。これらのポリペプチド変異体は、配列番号302〜418の配列において同定する(図4b)。他の好ましいポリペプチド変異体は、それぞれ77アミノ酸(配列番号419)(図5a)および54アミノ酸(配列番号529)(図6a)の、ガンビアハマダラカHMGB1のBox-Aの生物活性断片から始めて作成する。77アミノ酸のHMGB1断片のBox-Aのポリペプチド変異体は、配列番号420〜528の配列において定義する(図5b)。54アミノ酸のHMGB1のガンビアハマダラカ(XP_311154)断片のBox-Aのポリペプチド変異体は、配列番号530〜610の配列において定義する(図6b)。
本発明のポリマー複合体のHMGB1のBox-A部分として使用する、HMGB1のBox-Aの最も好ましいポリペプチド変異体を同定するために、幾つかの試験を実施して、野生型HMGB1のBox-Aのタンパク質と比較して同等または一層改善された活性と増大したプロテアーゼ耐性の両方を示す、ポリペプチド変異体を決定している。この目的のために、HMGB1誘導型NIH/3T3細胞移動を阻害する際の、配列番号1のヒトHMGB1のBox-AのBox-Aポリペプチド変異体の活性を、ヒトHMGB1のBox-Aの野生型自体のアンタゴニスト活性と比較して走化性アッセイにおいて決定した(実施例1および図7.1〜7.9)。さらに、配列番号1の天然HMGB1のBox-Aのタンパク質と同等またはそれより一層高いアンタゴニスト活性を示すポリペプチド変異体に関して、プロテアーゼによる消化に対するin vitroでの耐性を、トリプシン、α-キモトリプシン、エンドプロテイナーゼAsp-NおよびエンドプロテイナーゼGlu-C(シグマ)の混合物と、これらのポリペプチド変異体のそれぞれのインキュベーションによって決定した。このプロテアーゼ耐性試験は実施例2中に記載し、天然HMGB1のBox-Aと比較した前記変異体のプロテアーゼ耐性プロファイルの結果は図9.1〜9.67中に示す。
これらの結果から、本発明のポリマー複合体のHMGB1のBox-A部分として有用なHMGB1のBox-Aの好ましいポリペプチド変異体は、同等またはより高いアンタゴニスト活性および増大したプロテアーゼ耐性を示す変異体であると結論を下すことができる。特に、好ましいポリペプチド変異体は、配列番号33、35、37〜39、42〜45、47〜49、52、55、57、59、62、64、67、69および104のポリペプチドである。これらの好ましいポリペプチド変異体の中で、最も好ましい変異体は、配列番号45、49、52、55、59、64および67において定義する変異体である。これらの非常に好ましいポリペプチド変異体は、配列番号1の野生型ヒトHMGB1のBox-Aと比較して劇的に改善されたプロテアーゼ耐性プロファイルを示す(実施例2の結果を参照)。
本明細書に示す様々なアミノ酸配列中に存在するアミノ酸は、それらの知られている一文字コードの略語に従って同定されることに留意されたい。それらの一文字略語コードによって本明細書に表す全てのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシル末端の従来の方向で左から右への配向性を有することを、さらに留意すべきである。
本発明では、驚くべきことに、前に記載したポリマー複合体が、非複合体であるHMGB1のBox-Aポリペプチド部分と比較して、改善された薬物動態的および毒物学的性質を示し、改善された生物学的利用能をもたらすことが分かった。非複合体形態と比較した、HMGB1のBox-Aポリペプチドおよびその変異体のポリマー複合体形成、特にこれらのポリペプチドのペグ化の特に有利な効果は、タンパク質の流体力学的体積の増大である。これは、腎クリアランスの無効化、すなわち糸球体濾過率の低下が原因である複合体化合物の薬物動態的性質の有意かつ予想外の改善をもたらす。
さらに、本発明のポリマー複合体は、プロテアーゼおよび/またはペプチダーゼのタンパク質分解活性に対して増大した耐性を示し、特にヒトプロテアーゼおよび/またはペプチダーゼ、特にヒト血清プロテアーゼおよび/またはヒト胃腸プロテアーゼまたはペプチダーゼのタンパク質分解活性に対して増大した耐性を示す。
特に、タンパク質分解に対する耐性は、非複合体であるHMGB1のBox-Aと比較して、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、70%、80%、90%、95%またはそれより高い。プロテアーゼ耐性は、20μgのBox-Aの野生型または変異体とタンパク質全体の1%w/wのプロテアーゼの混合物のインキュベーション後に25℃において、異なる時点(5分と8時間の間)で測定した。プロテアーゼの混合物は、エンドプロテイナーゼGlu-C(SIGMA)200μg/ml、トリプシン(SIGMA)400μg/mlおよびα-キモトリプシン(SIGMA)400μg/mlのストック溶液から、それぞれのアッセイにおいて新たに調製した。プロテアーゼのインキュベーション後、10μlのアンチプロテアーゼ溶液(Roche)を加えて反応を停止させ、生物活性アッセイ用にサンプルは-20℃で保存した。
プロテアーゼ活性に対して増大した耐性により安定性が増大した結果として、本発明のポリマー複合体は、非複合体であるHMGB1のBox-Aと比較して長い体液中半減期も示す。特に、血清中および/または血中半減期が増大し、それによって非複合体であるHMGB1のBox-Aと比較して少なくとも10分、20分、30分、60分またはさらに長い増大を観察する。
タンパク質の流体力学的体積の増大により、タンパク質分解に対する増大した耐性、したがってより高い安定性にもより、本発明のポリマー複合体は、改善された治療的および生物学的性質および活性も示す。実際それらは、非複合体であるHMGB1のBox-Aタンパク質およびタンパク質変異体より好ましい薬物動態的および薬力学的プロファイルを示す。
したがって、本発明は、医薬品中の活性作用物質としての、前述のHMGB1のBox-Aのポリマー複合体の使用を対象とする。
したがって、本発明のさらに他の態様は、細胞外HMGB1関連病状またはHMGB1相同タンパク質と関連がある病状を予防および/または治療するための医薬品を製造するための本発明のポリマー複合体の使用である。特に、HMGB1関連病状は、多数の炎症性サイトカインカスケードにより媒介される病状である。
HMGB1ケモカインおよび炎症性サイトカインのHMGB1誘導型カスケードによって誘導される広範囲の病的状態は、以下の範疇:炎症性疾患、自己免疫疾患、全身性炎症反応症候群、臓器移植後の再潅流障害、心臓血管疾患、産科および婦人科疾患、感染性(ウイルス性および細菌性)疾患、アレルギー性およびアトピー性疾患、固形および非固形腫瘍の病状、移植片拒絶反応疾患、先天性疾患、皮膚疾患、神経疾患、カヘキシー、腎疾患、医原性中毒状態、代謝性および突発性疾患に分類される。
本発明によるHMGB1関連病状は、炎症性サイトカインカスケードの活性化により媒介される病的状態であることが好ましい。本発明を使用して有効に治療することができる状態の非制限的な例には、以下の範疇:再狭窄および他の心臓血管疾患、再潅流障害、炎症性腸疾患などの炎症性疾患、全身性炎症反応症候群、例えば敗血症、成人呼吸窮迫症候群など、関節リウマチおよび変形性関節炎などの自己免疫疾患、産科および婦人科疾患、感染性疾患、例えば喘息、湿疹などのアトピー性疾患、腫瘍の病状、例えば臓器または組織移植、臓器移植後の再潅流障害、臓器拒絶反応および移植片対宿主病などと関係がある固形または非固形腫瘍の病状、先天性疾患、乾癬または脱毛症などの皮膚疾患、神経疾患、眼科疾患、腎疾患、代謝性または突発性疾患および中毒状態、例えば医原性毒性およびベーチェット病に分類される、HMGB1ケモカインおよび炎症性サイトカインのHMGB1誘導型カスケードによって誘導される広範囲の病的状態があり、前述の疾患はHMGB1タンパク質の放出によって引き起こされ、それと関係があり、および/またはそれに付随する。
特に、炎症性疾患および自己免疫疾患に属する病状には、関節リウマチ/血清反応陰性関節症、変形性関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、腸梗塞、全身性エリテマトーデス、虹彩炎/ブドウ膜炎、視神経炎、特発性肺線維症、全身性血管炎/ウェグナー肉芽腫症、サルコイドーシス、睾丸炎/精管切除術、全身性硬化症および強皮症がある。全身性炎症反応症候群には、敗血症症候群(グラム陽性菌敗血症、グラム陰性菌敗血症、培養陰性敗血症、真菌性敗血症、好中球減少性発熱、尿性敗血症、敗血症結膜炎を含む)、髄膜炎菌血症、外傷性出血、口ごもり、電離放射線暴露、急性および慢性前立腺炎、急性および慢性膵炎、虫垂炎、消化管、胃および十二指腸潰瘍、腹膜炎、潰瘍性、偽膜性、急性および虚血性大腸炎、憩室炎、アカラシア、胆管炎、胆嚢炎、腸炎、成人呼吸窮迫症候群(ARDS)がある。再潅流障害には、ポンプ不全後症候群および虚血再潅流障害がある。心臓血管疾患には、心臓性失神症候群、心筋梗塞および虚血、アテローム性動脈硬化症、静脈血栓症、心内膜炎、心膜炎、うっ血性心不全および再狭窄がある。産科および婦人科疾患には、早期分娩、子宮内膜症、流産、膣炎および不妊症がある。感染性疾患には、HIV感染/HIVニューロパシー、髄膜炎、B型およびC型肝炎、単純ヘルペス感染、敗血症性関節炎、腹膜炎、大腸菌0157:H7、肺炎喉頭蓋炎、溶血性尿毒症症候群/血栓性血小板減少性紫斑病、カンジダ症、フィラリア症、アメーバ症、マラリア、デング出血熱、リーシュマニア症、らい病、毒素性ショック症候群、連鎖球菌性筋炎、ガス炭疽、ヒト型結核菌、細胞内トリ型結核菌、ニューモシスティスカリニ肺炎、骨盤内炎症性疾患、睾丸炎/精巣上体炎、レジオネラ、ライム病、インフルエンザA、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス、ウイルス関連血球貪食症候群、ウイルス性脳炎/無菌性髄膜炎がある。アレルギー性およびアトピー性疾患には、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体病、花粉症、アレルギー性鼻炎、湿疹、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性結膜炎、過敏性肺炎がある。悪性腫瘍(液状および固形腫瘍の病状)には、ALL、AML、CML、CLL、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、結腸直腸癌、鼻咽腔癌、悪性組織球増殖症および腫瘍随伴症候群/悪性高カルシウム血症がある。移植病には、臓器移植拒否反応および移植片対宿主病がある。先天性疾患には、嚢胞性線維症、家族性血球食細胞性リンパ組織球症および鎌状赤血球貧血がある。皮膚疾患には、乾癬、乾癬性関節炎および脱毛症がある。神経疾患には、神経変性疾患(多発性硬化症、偏頭痛、頭痛、アミロイド関連病状、プリオン病/クロイツフェルト-ヤコブ病、アルツハイマー病およびパーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症)および末梢性ニューロパシー、偏頭痛、頭痛がある。腎疾患には、ネフローゼ症候群、血液透析および尿毒症がある。医原性中毒状態には、OKT3療法、抗CD3療法、サイトカイン療法、化学療法、放射線療法および慢性サリチル酸塩中毒がある。代謝性または突発性疾患には、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、α-1アンチトリプシン欠乏症、糖尿病および糖尿病の合併症、体重減少、食欲不振、カヘキシー、肥満、橋本甲状腺炎、骨粗鬆症、視床下部-下垂体-副腎系の評価および原発性胆汁性肝硬変がある。眼科疾患には、緑内障、網膜症およびドライアイがある。他の病状の雑集には、多臓器不全症候群、筋ジストロフィー、敗血性髄膜炎、アテローム性動脈硬化症、喉頭蓋炎、ウィップル病、喘息、アレルギー、アレルギー性鼻炎、臓器壊死、発熱、敗血症、エンドトキシンショック、超高熱、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、感染流産、尿道炎、肺気腫、鼻炎、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、上皮バリア機能不全、塵肺症、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス感染、播種性菌血症、包虫嚢胞、皮膚筋炎、火傷、日焼け、蕁麻疹、ワースト(warst)、膨疹、血管炎、脈管炎、心筋炎、動脈炎、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、セリアック病、脳炎、脳塞栓、ギランバレー症候群、神経炎、神経痛、医原性合併症/末梢神経病変、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、滑膜炎、重症筋無力症、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、強直性脊椎炎、バーガー病、レティアー症候群、水疱性皮膚炎(水疱性類天疱瘡)、類天疱瘡および尋常性天疱瘡および脱毛症がある。
他の好ましい実施形態では、本発明のポリマー化合物を、RAGE関連病状を予防、軽減および/または治療するための活性作用物質として使用する。RAGE関連病状は、RAGEの発現の増大と関係がある病的状態として定義する。
RAGE(後期糖化最終産物受容体)は、細胞表面分子の免疫グロブリンスーパーファミリーのマルチリガンド構成要素である。それは3つの免疫グロブリン様領域(1つのV型免疫グロブリンドメイン、次に2つのC型免疫グロブリンドメイン)、膜貫通ドメインおよびRAGE後シグナル伝達に必要である高電荷の短い細胞質尾部から構成される。老化状態の血管組織中に、糖尿病では加速的に蓄積するAGEという非酵素的グリコシル化および酸化タンパク質の結合標的として、RAGEは1992年に初めて同定された。RAGEは内皮細胞、平滑筋細胞、単核食細胞およびニューロンを含めた広範囲の細胞で発現される。RAGEは特に中枢神経系において発生中は高レベルで存在するが、そのレベルは成熟中に低下する。
前に報告したように、RAGEは細胞外HMGB1に関して同定された最初の受容体であった。細胞表面上のHMGB1の結合は、RAGEの転写の上方制御を誘導する。RAGE関連病状の例は、糖尿病性血管障害、ニューロパシー、網膜症などの糖尿病、およびアルツハイマー病および血管壁の免疫/炎症反応を含めた他の障害と関係がある糖尿病および障害である。この文脈におけるRAGE関連病状の非常に好ましい例は、I型糖尿病および/またはII型糖尿病である。
本発明の他の態様では、前に記載したポリマー複合体のHMGB1のBox-Aの使用をさらなる活性作用物質と組み合わせる。
さらなる作用物質は、炎症性サイトカインカスケードの初期メディエーターを阻害することができる作用物質であることが好ましい。このさらなる作用物質は、TNF、IL-1α、IL-1β、IL-Ra、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、IL-18、IFN-γ、MIP-1α、MIF-1β、MIP-2、MIFおよびPAFからなる群から選択されるサイトカインのアンタゴニストまたは阻害剤であることが好ましい。
ポリマー複合体と組み合わせて使用するさらなる作用物質は、RAGEの阻害剤、例えばRAGEを対象とする抗体、RAGE発現を阻害することができる核酸または核酸類似体、例えばアンチセンス分子、リボザイムまたはRNA干渉分子、またはHMGB1とRAGEの相互作用、好ましくは非アセチル化型または/およびアセチル化型のHMGB1とRAGE、または可溶性RAGE(sRAGE)の相互作用の合成小分子アンタゴニストであってもよい。RAGEに対する抗体は、好ましくはモノクローナル抗体、より好ましくはキメラまたはヒト化抗体または組換え抗体、単鎖抗体など、またはこのような抗体の抗原結合断片である。可溶性RAGE類似体が、例えばヒト抗体のFcドメインとの融合タンパク質として、場合によっては存在する可能性がある。HMGB1とRAGEの相互作用の合成小分子アンタゴニストは、1000ダルトン未満の分子量を有することが好ましい。合成小分子アンタゴニストは、非アセチル化型または/およびアセチル化型のHMGB1、および非アセチル化型または/およびアセチル化型のHMGB1相同タンパク質、特にHMGB2、HMGB3、HMG-1L10、HMG-4Lまたは/およびSP100-HMGとRAGEの相互作用を阻害することが好ましい。
ポリマー複合体と組み合わせて使用するさらなる作用物質は、トール様受容体(TLR)、例えばTLR2、TLR4、TLR7、TLR8または/およびTLR9とHMGB1の相互作用の阻害剤であってもよく、この阻害剤はモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、TLR発現を阻害することができる核酸もしくは核酸類似体、例えばアンチセンス分子、リボザイムもしくはRNA干渉分子、または好ましくは1000ダルトン未満のサイズを有する合成分子であることが好ましい。阻害剤はトール様受容体、特にTLR2、TLR4、TLR7、TLR8または/およびTLR9の知られている阻害剤であってよい。阻害剤は、非アセチル化型または/およびアセチル化型のHMGB1、および非アセチル化型または/およびアセチル化型のHMGB1相同タンパク質、特にHMGB2、HMGB3、HMG-1L10、HMG-4Lまたは/およびSP100-HMGとトール様受容体の相互作用を阻害することが好ましい。
さらに他の実施形態では、さらなる作用物質はトロンボモジュリンの機能的N末端レクチン様ドメイン(D1)である。トロンボモジュリンのD1ドメインは、非アセチル化型および/またはアセチル化型の放出されるHMGB1および放出されるHMGB1相同タンパク質、特にHMGB2、HMGB3、HMG-1L10、HMG-4Lまたは/およびSP100-HMGを阻止することができ、したがってRAGEおよびトール様受容体とそれらの相互作用を妨げることができる。トロンボモジュリンのD1ドメインは、それをプロテアーゼ耐性にするために天然または突然変異型であってよい。
さらなる作用物質は、HMGB1タンパク質と結合することができる、湾曲形構造、特に二本鎖湾曲DNA、PNAまたはDNA/PNAキメラまたはハイブリッド、または二本鎖十字形DNA、PNAまたはDNA/PNAキメラまたはハイブリッド構造を有する合成二本鎖核酸または核酸類似体分子であってもよい。好ましい核酸および核酸類似体分子は、参照により本明細書に組み込まれている、(2004年7月2日に出願された米国仮出願第60/584,678号の優先権を主張する)2005年7月4日に出願された、共有に係る同時係属中の国際特許出願No.PCT/EP2005/007198中に開示されている。湾曲形構造を有する合成二本鎖核酸または核酸類似体分子は、非アセチル化型または/およびアセチル化型のHMGB1、および非アセチル化型または/およびアセチル化型のHMGB1相同タンパク質、特にHMGB2、HMGB3、HMG-1L10、HMG-4Lまたは/およびSP100-HMGと結合することができることが好ましい。
さらに他の実施形態では、ポリマー複合体と組み合わせて使用するさらなる作用物質は、K-252aまたは/およびその塩もしくは誘導体、あるいはK-252aのポリマー複合体または/およびその誘導体である。K-252aまたはK-252aのポリマー複合体およびその誘導体の使用は、参照により本明細書に組み込まれている、2005年8月25日に出願された共有に係る同時係属中の国際特許出願No.PCT/EP2005/008258中に開示されている。
したがって、本発明の他の態様は、HMGB1関連病状を治療するための活性成分として、有効量のHMGB1のBox-Aのポリペプチドまたはポリペプチド変異体またはその生物活性断片の少なくとも1つのポリマー複合体、ならびに薬剤として許容される担体、希釈剤および/またはアジュバントを含む医薬組成物である。本発明の医薬組成物は、非アセチル化または/およびアセチル化型のHMGB1および/またはHMGB1相同タンパク質と関連がある病状の治療に適していることが好ましい。他の好ましい実施形態では、少なくとも1つのポリマー複合体を含む本発明の医薬組成物は、前に定義したさらなる作用物質も含む。本発明の医薬組成物は、診断用途または治療用途で使用することができる。
正確な配合、投与の経路および用量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択することができる。投与は1回用量または間隔を置いた反復用量で実施することができる。用量および間隔は、患者の症状を軽減し、または生存期間が延長する治療効果をもたらすように個別に調節することができる。投与する組成物の実際の量は、当然ながら、治療する対象、対象の体重、苦痛の重度、投与の形式および処方医師の判断に依存する。適切な1日当たりの用量は0.001mg/kgと10mg/kgの間、特に0.1〜5mg/kgである。
投与は知られている方法によって、例えば注射によって、特に静脈内、筋肉内、経粘膜、皮下または腹膜内注射によって、および/または経口、局所、鼻腔、吸入、エアロゾルおよび/または直腸施用などによって実施することができる。投与は局所または全身であってよい。
さらに、本発明の目的のHMGB1部分のBox-Aのポリマー複合体は、医療機器または薬剤放出/輸送システム(ミクロスフェア)の表面および/または内部に可逆的に固定化し、かつ/またはそこに吸着させることが可能である。医療機器またはミクロスフェアの表面、またはその表面をコーティングする層へのそれらの結合、含浸および/または吸着によって、本発明のポリマー複合体を医療機器およびミクロスフェアに可逆的に充填することが可能である。医療機器またはミクロスフェアが生体液と接触するとき、可逆的に固定化されたポリマー複合体が放出される。したがって、医療機器およびミクロスフェアは、治療により必要とされるとき、それらの放出動態を制御して制御放出または持続放出を確実にすることができるような方法で、本発明の目的の分子を溶出する薬剤放出ツールとして作用する。医療機器のコーティング/含浸およびミクロスフェアの充填のための方法は、これらの技術分野における専門家によってよく知られている。
したがって、本発明の他の態様は、複合体分子が医療機器またはミクロスフェアの表面上に可逆的に固定化されている、またはそれらの内部に吸着している、HMGB1のBox-Aのポリマー複合体の使用である。これらの医療機器は、外科手術器具、インプラント、カテーテルまたはステント、例えば血管形成術用ステント、および特に薬用薬剤溶出ステントであることが好ましい。
本発明の他の態様は、本発明の少なくとも1つのポリマー複合体で可逆的にコーティングされた医療機器に関する。このような医療機器は、外科手術器具、インプラント、カテーテルまたはステントから選択することができる。このような医療機器は、血管形成術に有用である可能性がある。
以下の図面によって本発明をさらに例示する:
84アミノ酸残基から構成される天然ヒトHMGB1のBox-Aのアミノ酸配列(配列番号1)を示す図である。 完全長ヒトHMGB1のBox-Aのポリペプチド変異体を生成するために選択したそれぞれの標的位置における置換アミノ酸の型を示す図である。さらに、生成したポリペプチド変異体の具体的なアミノ酸配列は配列番号2〜116で示す。 図1b-1の続きである。 図1b-2の続きである。 図1b-3の続きである。 図1b-4の続きである。 図1b-5の続きである。 図1b-6の続きである。 図1b-7の続きである。 図1b-8の続きである。 図1b-9の続きである。 77アミノ酸残基から構成されるヒトHMGB1のBox-Aの生物活性断片のアミノ酸配列(配列番号117)を示す図である。 77アミノ酸残基から構成されるヒトHMGB1のBox-Aの生物活性断片のポリペプチド変異体を生成するために選択したそれぞれの標的位置における置換アミノ酸の型を示す図である。さらに、生成したポリペプチド変異体の具体的なアミノ酸配列は配列番号118〜222で示す。 図2b-1の続きである。 図2b-2の続きである。 図2b-3の続きである。 図2b-4の続きである。 図2b-5の続きである。 図2b-6の続きである。 図2b-7の続きである。 図2b-8の続きである。 54アミノ酸残基から構成されるヒトHMGB1のBox-Aの生物活性断片のアミノ酸配列(配列番号223)を示す図である。 54アミノ酸残基から構成されるヒトHMGB1のBox-Aの生物活性断片のポリペプチド変異体を生成するために選択したそれぞれの標的位置における置換アミノ酸の型を示す図である。さらに、生成したポリペプチド変異体の具体的なアミノ酸配列は配列番号224〜300で示す。 図3b-1の続きである。 図3b-2の続きである。 図3b-3の続きである。 図3b-4の続きである。 図3b-5の続きである。 84アミノ酸残基から構成される天然ガンビアハマダラカHMGB1のBox-Aのアミノ酸配列(配列番号301)を示す図である。 完全長のガンビアハマダラカHMGB1のBox-Aのポリペプチド変異体を生成するために選択したそれぞれの標的位置における置換アミノ酸の型を示す図である。さらに、生成したポリペプチド変異体の具体的なアミノ酸配列は配列番号302〜418で示す。 図4b-1の続きである。 図4b-2の続きである。 図4b-3の続きである。 図4b-4の続きである。 図4b-5の続きである。 図4b-6の続きである。 図4b-7の続きである。 図4b-8の続きである。 図4b-9の続きである。 77アミノ酸残基から構成されるガンビアハマダラカHMGB1のBox-Aの生物活性断片のアミノ酸配列(配列番号419)を示す図である。 77アミノ酸残基から構成されるガンビアハマダラカHMGB1のBox-Aの生物活性断片のポリペプチド変異体を生成するために選択したそれぞれの標的位置における置換アミノ酸の型を示す図である。さらに、生成したポリペプチド変異体の具体的なアミノ酸配列は配列番号420〜528で示す。 図5b-1の続きである。 図5b-2の続きである。 図5b-3の続きである。 図5b-4の続きである。 図5b-5の続きである。 図5b-6の続きである。 図5b-7の続きである。 図5b-8の続きである。 図5b-9の続きである。 54アミノ酸残基から構成されるガンビアハマダラカHMGB1のBox-Aの生物活性断片のアミノ酸配列(配列番号529)を示す図である。 54アミノ酸残基から構成されるガンビアハマダラカHMGB1のBox-Aの生物活性断片のポリペプチド変異体を生成するために選択したそれぞれの標的位置における置換アミノ酸の型を示す図である。さらに、生成したポリペプチド変異体の具体的なアミノ酸配列は配列番号530〜610で示す。 図6b-1の続きである。 図6b-2の続きである。 図6b-3の続きである。 図6b-4の続きである。 図6b-5の続きである。 本発明のポリマー複合体のHMGB1のBox-A部分として使用した配列番号2〜配列番号116のHMGB1のBox-Aのポリペプチド変異体に実施した、実施例1に記載した走化性アッセイの結果を示す図および表である。それぞれの図中では、HMGB1誘導型NIH/3T3細胞移動の阻害における一組のポリペプチド変異体の活性を、配列番号1のヒト野生型HMGB1のBox-Aの完全長断片の活性と比較して試験する。それぞれの図は、統計分析の数値データを報告する表および走化性アッセイの結果を示す縦列棒グラフを示す。図７−１は、配列番号1のヒトHMGB1のBox-Aの野生型(CT500)および配列番号2〜15のポリペプチド変異体(表および図中では、それぞれコードCT501、CT568、CT569、CT570、CT571、CT502、CT572、CT503、CT573、CT504、CT574、CT575、CT576およびCT505で識別する)によるHMGB1誘導型NIH/3T3細胞の阻害における、走化性移動アッセイの結果の棒グラフおよび統計データを示す図および表である。図７−２は、配列番号1のヒトHMGB1のBox-Aの野生型(CT500)および配列番号16〜23および25〜29のポリペプチド変異体(表および図中では、それぞれコードCT577、CT578、CT506、CT579、CT580、CT581、CT507、CT582、CT584、CT508、CT509、CT510およびCT585で識別する)によるHMGB1誘導型NIH/3T3細胞の阻害における、走化性移動アッセイの結果の棒グラフおよび統計データを示す図および表である。図７−３は、配列番号1のヒトHMGB1のBox-Aの野生型(CT500)および配列番号30〜35および37〜43のポリペプチド変異体(表および図中では、それぞれコードCT511、CT512、CT513、CT514、CT586、CT515、CT516、CT517、CT518、CT519、CT520、CT521およびCT522で識別する)によるHMGB1誘導型NIH/3T3細胞の阻害における、走化性移動アッセイの結果の棒グラフおよび統計データを示す図および表である。図７−４は、配列番号44〜57のヒトHMGB1のBox-Aの野生型(表および図中では、それぞれコードCT523、CT524、CT525、CT526、CT527、CT528、CT588、CT529、CT530、CT589、CT590、CT531、CT591およびCT532で識別する)によるHMGB1誘導型NIH/3T3細胞の阻害における、走化性移動アッセイの結果の棒グラフおよび統計データを示す図および表である。図７−５は、配列番号1のヒトHMGB1のBox-Aの野生型(CT500)および配列番号58〜67および69〜71のポリペプチド変異体(表および図中では、それぞれコードCT592、CT533、CT593、CT534、CT535、CT536、CT537、CT594、CT538、CT539、CT540、CT541およびCT542で識別する)によるHMGB1誘導型NIH/3T3細胞の阻害における、走化性移動アッセイの結果の棒グラフおよび統計データを示す図および表である。図７−６は、配列番号1のヒトHMGB1のBox-Aの野生型(CT500)および配列番号72〜85のポリペプチド変異体(表および図中では、それぞれコードCT596、CT597、CT598、CT599、CT600、CT601、CT602、CT603、CT543、CT544、CT545、GT546、CT547およびCT604で識別する)によるHMGB1誘導型NIH/3T3細胞の阻害における、走化性移動アッセイの結果の棒グラフおよび統計データを示す図および表である。図７−７は、配列番号1のヒトHMGB1のBox-Aの野生型(CT500)および配列番号86〜99のポリペプチド変異体(表および図中では、それぞれコードCT548、CT549、CT605、CT606、CT607、CT608、CT609、CT610、CT550、CT551、CT611、CT552、CT553およびCT554で識別する)によるHMGB1誘導型NIH/3T3細胞の阻害における、走化性移動アッセイの結果の棒グラフおよび統計データを示す図および表である。図７−８は、配列番号1のヒトHMGB1のBox-Aの野生型(CT500)および配列番号100〜113のポリペプチド変異体(表および図中では、それぞれコードCT555、CT556、CT557、CT558、CT559、CT612、CT560、CT561、CT613、CT562、CT563、CT564、CT565およびCT566で識別する)によるHMGB1誘導型NIH/3T3細胞の阻害における、走化性移動アッセイの結果の棒グラフおよび統計データを示す図および表である。図７−９は、配列番号1のヒトHMGB1のBox-Aの野生型(CT500)および配列番号114〜116のポリペプチド変異体(表および図中では、それぞれコードCT567、CT614およびCT615で識別する)によるHMGB1誘導型NIH/3T3細胞の阻害における、走化性移動アッセイの結果の棒グラフおよび統計データを示す図および表である。 実施例2中に記載するプロテアーゼ耐性試験のプロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号1のヒトHMGB1のBox-Aの野生型(CT500)を載せたトリシンSDS-PAGEゲルの画像を示す図である。プロテアーゼ耐性に関して試験したBox-Aの野生型タンパク質は、ヒスタグタンパク質である。消化の5分後、CT500は2つの主なバンドを示し、1つはサンプル中の元のタンパク質に対応し、第二のバンドはN末端ヒスタグを含まない84アミノ酸のタンパク質に対応する(この図上では矢印で示す)。この第二のバンドのプロファイルは30分間プロテアーゼに対する耐性を示す。このゲルおよび図9.1〜図9.67の他のゲル上に存在する小さなバンドは、Box-Aの消化断片に対応する。 実施例2中に記載するプロテアーゼ耐性試験のプロテアーゼによる消化後の異なる時点における、本発明のポリマー複合体のHMGB1のBox-A部分のポリペプチド変異体を載せたトリシンSDS-PAGEゲルの画像を示す図である。プロテアーゼ耐性に関して試験したBox-Aのポリペプチド変異体は、ヒスタグタンパク質である。消化の5分後、ポリペプチド変異体のSDS-PAGEゲルの画像は2つの主なバンドを示し、1つはサンプル中の元のタンパク質に対応し、第二のバンドはN末端ヒスタグを含まないBox-Aの84アミノ酸のタンパク質変異体に対応する。図９−１は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号2(CT501)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−２は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号7(CT502)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−３は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号9(CT503)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−４は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号11(CT504)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−５は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号15(CT505)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−６は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号18(CT506)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−７は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号22(CT507)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−８は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号26(CT508)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−９は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号27(CT509)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−１０は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号28(CT510)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−１１は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号30(CT511)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−１２は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号31(CT512)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−１３は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号32(CT513)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−１４は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号33(CT514)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−１５は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号35(CT515)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−１６は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号37(CT516)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−１７は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号38(CT517)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−１８は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号39(CT518)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−１９は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号40(CT519)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−２０は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号41(CT520)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−２１は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号42(CT521)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−２２は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号43(CT522)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−２３は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号44(CT523)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−２４は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号45(CT524)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−２５は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号46(CT525)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−２６は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号47(CT526)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−２７は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号48(CT527)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−２８は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号49(CT528)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−２９は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号51(CT529)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−３０は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号52(CT530)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−３１は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号55(CT531)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−３２は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号57(CT532)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−３３は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号59(CT533)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−３４は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号61(CT534)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−３５は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号62(CT535)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−３６は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号63(CT536)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−３７は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号64(CT537)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−３８は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号66(CT538)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−３９は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号67(CT539)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−４０は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号69(CT540)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−４１は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号70(CT541)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−４２は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号71(CT542)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−４３は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号80(CT543)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−４４は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号81(CT544)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−４５は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号82(CT545)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−４６は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号83(CT546)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−４７は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号84(CT547)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−４８は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号86(CT548)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−４９は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号87(CT549)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−５０は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号94(CT550)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−５１は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号95(CT551)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−５２は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号97(CT552)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−５３は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号98(CT553)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−５４は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号99(CT554)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−５５は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号100(CT555)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−５６は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号101(CT556)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−５７は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号102(CT557)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−５８は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号103(CT558)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−５９は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号104(CT559)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−６０は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号106(CT560)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−６１は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号107(CT561)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−６２は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号109(CT562)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−６３は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号110(CT563)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−６４は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号111(CT564)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−６５は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号112(CT565)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−６６は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号113(CT566)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。図９−６７は、プロテアーゼによる消化後の異なる時点における、配列番号19(CT567)のポリペプチド変異体のトリシンSDS-PAGEを示す図である。 トリシンSDS-PAGEの結果を要約する表を示す図である。×印は、HMGB1のBox-Aの野生型またはHMGB1のBox-Aのポリペプチド変異体の84アミノ酸長のタンパク質断片に対応する、ゲル上のバンドの存在を示す。 図10-1の続きである。 1mg/kgの用量でのBoxAの野生型(WT)およびBoxAの変異体番号64(64)の1回皮下投与後の、平均血漿濃度/時間を示す図である。データ表示:平均±SEM。 1mg/kgの用量でのBoxAの野生型(WT)およびBoxAの変異体番号64(64)、および5mg/kgの用量でのペグ化BoxAの野生型(PEG-WT)およびペグ化BoxAの変異体番号64(PEG-64)の1回皮下投与後の、平均血漿濃度/時間を示す図である。データ表示:平均±SEM。
(実施例)
1. IN VITRO活性試験:NIH/373細胞移動アッセイ
この試験の目的は、配列番号2〜116において定義するHMGB1のBox-Aのポリペプチド変異体のそれぞれの活性を評価すること、およびそれらの活性を配列番号1のヒト野生型HMGB1のBox-Aの完全長断片の活性と比較して、野生型と同等または野生型より優れた活性を有する全ての変異体を選択することであった。
HMGB1のBox-Aの活性は、HMGB1誘導型NIH/3T3細胞移動の阻害としてin vitroで評価する。
1.1 材料
HMGB1のBox-Aの野生型および変異体(Nautilus Biotech)
NIH/3T3細胞(ATCCn.CRL-1658)
D-MEM培地(GIBCO;カタログ番号31966-021)
ウシ胎児血清(GIBCO;カタログ番号10270-106)
ペニシリン-ストレプトマイシン10,000U/ml(GIBCO;カタログ番号15140-122)
L-グルタミン200mM(GIBCO;カタログ番号25030-024)
TrypLE Select(GIBCO;カタログ番号12563-011)
リン酸緩衝生理食塩水(0.138MのNaCl、0.0027MのKCl、0.01Mのリン酸、pH7.4)
PVP不含フィルター(8μmの孔径;13mmの全体径)(Neuro Probe;カタログ番号PFA8)
ヒトフィブロネクチン(Roche;カタログ番号1080938)
ブラインドウエル走化性チャンバー(Neuro Probe;カタログ番号BW25)
GIEMSA Stain Modified(Sigma;カタログ番号GS1L)
1.2 フィルター調製
ポリカーボネート膜PVPを含まないフィルター(8μmの孔径、13mmの全体径)を、フィルターの不透明側に施す30μl/フィルターのフィブロネクチンの50μg/ml溶液でそれらをコーティングすることによって、実験を実施する前に約1時間調製する。フィブロネクチンのストック溶液は、1mg/mlの最終濃度までddH2Oに凍結乾燥フィブロネクチンを希釈すること、および完全に溶かすために37℃で約1時間溶液を保つことによって調製する。このストック溶液は-20℃で保存することができる。
次いでフィルターを層流フード下で放置乾燥させる(約1時間)。
1.3 細胞調製
NIH/3T3細胞を実験前日に(実験を実施する約22〜24時間前に)細胞106個/プレートで接種する。
フィルターを使用する準備ができたときに、トリプシンを用いて細胞を脱着させ、計数し細胞106個/mlで無血清培養培地に再懸濁させる。
1.4 走化性アッセイ
それぞれの走化性の実験において、配列番号1のヒトHMGB1のBox-Aの完全長断片の14の異なるポリペプチド変異体を試験する。
血清添加剤を含まない増殖細胞培地(w/oFBS)を、自発的移動を表す陰性対照として使用する。
1nMのHMGB1は陽性対照として使用する。HMGB1のBox-A野生型または試験するポリペプチド変異体0.5/1nMを1nMのHMGB1に加えて、HMGB1誘導型NIH/3T3細胞移動を阻害する。
陰性対照(w/oFBS)および陽性対照(1nMのHMGB1)を、それぞれの実験において三連で試験する。
HMGB1誘導型細胞移動を阻害する際のHMGB1のBox-A野生型(配列番号1)の活性を、それぞれの実験において三連で試験する。
HMGB1のBox-Aのポリペプチド変異体のそれぞれ(配列番号2〜116)を二連で試験する。
ブラインドウエル走化性チャンバーを使用する。それぞれのチャンバーのクリーンな、乾燥状態の下側ウエルに、適切な走化作用物質および阻害剤を加えたFBSを含まない50μlのDMEMを充填する。ウエル充填時にわずかに陽性のメニスカスが形成されるはずであり、これはフィルター施用時に気泡の捕捉を妨げるのを助長する。小さなかん子を用いて、気泡を捕捉せず指でフィルターを触らないように注意しながら、フィルターを充填ウエル上に置く(フィブロネクチン処理側が上)。フィルターリテーナーは手作業によってねじで取り付ける。細胞懸濁液(細胞50000個/50μl)を上側ウエルにピペットで移し、150μlの無血清培地を加えてチャンバーの上側ウエルを充填する。充填チャンバーは3時間(37℃、5%のC02)インキュベートして細胞を移動させる。インキュベーション後、流体をフィルターから除去する。リテーナーはねじを取りはずし冷却蒸留水に浸す。かん子を用いてフィルターを取り出し、クリーンな表面(固形パラフィン)上に置き(移動細胞側が上)、針で固定する(境界領域に置く)。
1.5 移動細胞のギムザ染色
フィルターをエタノールで1回固定し、次いで流水下で3回洗浄する。ddH2Oに1:10希釈したGIEMSA Stain Modifiedの希釈標準溶液を使用直前に調製する。フィルターを洗浄した後、染色液を加え、放置して20分間インキュベートする。染色液の洗浄を流水下で実施する。次いでフィルターを移動細胞側を下にしてスライド上に置き、フィルターを動かさないように注意しながら、非移動細胞側は湿った綿棒で軽く拭う(2本の綿棒または二先端綿棒の両端を使用して2回拭う)。クリーニング後、カバースライドをフィルター上に置き、顕微鏡下において40倍で10のランダムな領域/フィルター中の細胞を計数する。
1.6 データ表示および統計分析
実施したNIH/3T3移動アッセイの結果は、図および表7.1〜図および表7.9中に示す表および棒グラフ中に報告する。
データは平均±95%CIとして棒グラフで表す。
一元配置ANOVA次にDunnettの事後検定(対照列データ:1nMのHMGB1サンプル+HMGB1のBox-Aの野生型サンプル)統計分析を実施する。
結果のデータを評価すると、0.05未満の事後検定p値を有するHMGB1のBox-Aの変異体のデータは、HMGB1のBox-Aの野生型と有意に異なると考えられる。Box-Aのポリペプチド変異体の平均がBox-Aの野生型の平均より高い場合、図7.1〜7.9中に示す実験のグラフ中の列を赤で着色する。これらの赤い列は、HMGB1誘導型細胞移動を阻害する際の野生型より低い活性を示す、HMGB1のBox-Aのポリペプチド変異体を表す。
ポリペプチド変異体の結果の平均が野生型Box-Aの平均より低い場合、図7.1〜7.9中に示す実験のグラフ中の列をライトブルーで着色する。これらの変異体は、HMGB1誘導型細胞移動を阻害する際のHMGB1のBox-Aの野生型より高い活性を示す、HMGB1のBox-Aの変異体を表す。
0.05を超える事後検定p値を有するHMGB1のBox-Aの変異体のデータは、HMGB1のBox-Aの野生型と有意に異ならないと考えられる。これらの変異体の棒グラフは緑色で着色する。これらの変異体は、HMGB1誘導型細胞移動を阻害する際の野生型と同じ活性を示す、HMGB1のBox-Aの変異体を表す。
1.7 結果
配列番号2〜116のヒトHMGB1高親和性結合ドメインBox-Aのポリペプチド変異体の活性を、HMGB1誘導型細胞移動の阻害として配列番号1のヒトHMGB1のBox-A野生型と比較して評価して、本発明の好ましいポリマー複合体のHMGB1のBox-A部分として有用な好ましいポリペプチド変異体を決定した。
走化性アッセイの結果は、26のポリペプチド変異体に関して、本発明による突然変異は、野生型ヒトHMGB1のBox-Aの活性と比較して細胞移動の阻害において、より高い活性をもたらす可能性があることを明らかにした(図7.1〜7.9)。特に、細胞移動の阻害におけるより高い活性は、配列番号30〜32、35、38、40〜41、43、48、51、57、63〜64、69、70、94、95、100、103〜104、106〜107、109〜111および113のポリペプチド変異体に関して示された。
さらに、走化性アッセイの結果は、41のポリペプチド変異体は、Box-Aの野生型ポリペプチドの活性と比較してHMGB1誘導型細胞移動を阻害する際に、それらの活性の変化を示さなかったことを明らかにした(図7.1〜7.9)。特に、これは配列番号2、7、9、11、15、18、22、26〜28、33、37、39、42、44〜47、49、52、55、59、61、62、66〜67、71、80〜84、86〜87、97〜99、101〜102、112および114のポリペプチド変異体の場合である。
Box-Aの野生型と同等またはそれより高い活性を示す、全てのこれらのBox-Aのポリペプチド変異体をin vitroプロテアーゼ耐性に関して試験して、少なくともBox-Aの野生型ほど活性がある最も耐性がある変異体を選択した(実施例2中のプロテアーゼ耐性試験を参照)。
2. IN VITROプロテアーゼ耐性試験
この試験の目的は、実施例1中に示すHMGB1のBox-Aの変異体のin vitroプロテアーゼ耐性を評価すること、およびその耐性と配列番号1の野生型HMGB1のBox-Aの耐性を比較して、野生型ポリペプチドに対して改善されたプロテアーゼ耐性を有する変異体を同定することであった。
2.1 材料
HMGB1のヒスタグBox-Aの野生型および選択した変異体(Nautilus Biotech)
トリプシン(Sigma;カタログ番号T8658;ロット番号045K5113)
α-キモトリプシン(Sigma;カタログ番号C6423;ロット番号109H74858)、
エンドプロテイナーゼAsp-N(Sigma;カタログ番号P3303;ロット番号046K1049)
エンドプロテイナーゼGlu-C(Sigma;カタログ番号P6181;ロット番号075K5100)
完全、最少のEDTAを含まないプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche;カタログ番号11836170001)
Trizma基剤(Sigma;カタログ番号T6066)
アクリルアミド/ビス40%水溶液(Sigma;カタログ番号01709)
SDS(Sigma;カタログ番号71729)
グリセロール99%(Sigma;カタログ番号G9012)
Temed(Sigma;カタログ番号87689)
APS(Sigma;カタログ番号A3678)
ポリペプチドSDS-PAGE分子量標準(Bio-Rad;カタログ番号161-0326)
予め混合した10×トリス/トリシン/SDSバッファー(Bio-Rad;カタログ番号161-0744)
β-メルカプトエタノール(Sigma;カタログ番号M7154)
メタノール(VWR;カタログ番号20864.320)
酢酸(VWR;カタログ番号20104.323)
ブリリアントブルーR(Sigma;カタログ番号B0149)
ブロモフェノールブルー(Sigma;カタログ番号B0126)
塩酸(Merck;カタログ番号1.00319.2511)
トリシンゲル用の3×サンプルローディングバッファー(組成:150mMのトリス-HCl、pH6.8;12%SDS;36%グリセロール;6%β-メルカプトエタノール;0.04%ブロモフェノールブルー)
2.2. プロテアーゼ混合物の調製
トリプシン、α-キモトリプシン、エンドプロテイナーゼAsp-NおよびエンドプロテイナーゼGlu-Cを含むプロテアーゼの混合物を使用する。表1は、この試験中で使用したプロテアーゼのそれぞれの特異性を報告する。
それぞれの凍結乾燥プロテアーゼを製造者の推奨に従い溶解し、ストック溶液を得て、それを等分し-80℃で保存する。
100μgのトリプシンを100μlのdH2Oに溶かして、1μg/μlのストック溶液を得る。25μgのα-キモトリプシンを50μlの溶液1mMHCl、2mMCaCl2に溶かして、0.5μg/μlのストック溶液を得る。2μgのエンドプロテイナーゼAsp-Nを50μlのdH2Oに溶かして、0.04μg/μlのストック溶液を得る。25μgのエンドプロテイナーゼGlu-Cを50μlのdH2Oに溶かして、0.5μg/μlのストック溶液を得る。
実験を実施する前に、それぞれのプロテアーゼストック溶液の1つのアリコートを放置して氷上で解凍する。
トリプシンおよびエンドプロテイナーゼGlu-CのストックアリコートをdH2Oに希釈して、0.1μg/μlの最終希釈標準溶液を得る。α-キモトリプシンのストックアリコートを溶液1mMHCl、2mMCaCl2に希釈して、最終0.1μg/μlの希釈標準溶液を得る。エンドプロテイナーゼAsp-Nのアリコートは希釈せずに使用する。実験を実施する直前に、(サンプル中に含まれる全Box-Aの重量当たりの重量で)1%のそれぞれのプロテアーゼを含むプロテアーゼの混合物を新たに調製し、消化するHMGB1のBox-Aにすぐに加える。
2.3. HMGB1のBox-Aの野生型および変異体のプロテアーゼによる消化
合計18μgのそれぞれのHMGB1のBox-A(野生型または変異体)を、それぞれの実験において消化する。
試験するHMGB1のBox-Aを放置して氷上で解凍し、18μgに相当する体積を得る。次いでこの溶液の体積はdH2Oを用いて90μlの最終体積にして、試験するそれぞれのHMGB1のBox-Aに関して同じ最終体積を得る。
(2μgのHMGB1のBox-Aに相当する)10μlのこの溶液を、プロテアーゼの混合物を加える前に得る。このサンプルは、「時間ゼロ」の未消化サンプルに相当する。
残りのサンプル(16μgのHMGB1のBox-A)を、8.8μlの(新たに調製した混合物;2.2参照のそれぞれのプロテアーゼの0.16μgに相当)消化用プロテアーゼ混合物と共に加える。
プロテアーゼによる消化は25℃で実施し、(混合物中に元来存在する)2μgのHMGB1のBox-Aに相当する体積を、定義した時点でサンプル採取する。(10mlのdH2Oに1つの錠剤を溶かした)完全最少のEDTAを含まないプロテアーゼ阻害剤カクテルの4μlの溶液を加えて消化を停止する。
サンプル採取の時点は、0、5分、15分、30分、1時間、1.5時間、2時間および4時間である。
プロテアーゼ阻害の直後に、サンプルを適量のサンプルローディングバッファー3×と共に加え、約3分間95℃でインキュベートする。
2.4. 消化されたHMGB1のBox-Aの野生型および変異体のトリシンSDS-PAGE
プロテアーゼによる消化およびサンプル調製後、それぞれのHMGB1のBox-Aの時点のサンプルを、トリシンSDSPAGEゲル上に載せる(参照文献:Schagger and von Jagow、「Tricine-sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100kDa」、Anal.Biochem.166、368〜379、1987を参照)。
5μlのポリペプチドSDS-PAGE分子量標準(Bio-Rad)を、それぞれのゲル上に参照用に載せる。
ゲルのそれぞれのウエルに、10μlのサンプル(消化前の1μgのHMGB1のBox-Aに相当する体積)を充填する。
電気泳動は、ブロモフェノールブルーがゲルの分離部分に入るまでは30Vで、次いで作業の最後までは120V(Mini Protean 3 System;Bio-Rad)で実施する。
ゲルはクーマシーブリリアントブルーR染色溶液(0.1%w/v、50%メタノール、10%酢酸中)中に1時間浸すことによって染色し、脱染色溶液(30%メタノール、10%酢酸)中で一晩脱染色する。
ゲルの画像はGelDoc2000(Bio-Rad)画像システムを用いて得る。
2.5 結果
前に報告したアッセイ条件において、HGMB1の野生型タンパク質は完全なプロテアーゼによる消化に約30分間耐えた。図8中では、配列番号1のタンパク質のヒトHMGB1のBox-A野生型の84アミノ酸の完全長断片に相当するバンドは、プロテアーゼによる消化の30分まで目に見える。
試験した21のBox-Aのポリペプチド変異体は、プロテアーゼに対して増大した耐性を示した(図10)。報告したアッセイ条件において、これらの変異体はプロテアーゼによる消化に1時間〜2時間耐える。配列番号33、35、37、38、39、42、43、44、47、48、57、62、69および104のポリペプチド変異体は、プロテアーゼによる消化に対して1時間の耐性を示した。図9.14、9.15、9.16、9.17、9.18、9.21、9.22、9.23、9.26、9.27、9.32、9.35、9.40および9.59は、84アミノ酸の非ヒスタグタンパク質に相当するバンドを示し、このバンドはプロテアーゼによる消化の1時間まで目に見える。
配列番号45、49、52、55および67のポリペプチド変異体は、プロテアーゼによる消化に対して1.5時間の耐性を示した。図9.24、9.28、9.30、9.31および9.39は、84アミノ酸の非ヒスタグタンパク質に相当するバンドを示し、このバンドはプロテアーゼによる消化後の1.5時間明らかに目に見える。配列番号59および64のポリペプチド変異体は、プロテアーゼによる消化に対して2時間までの耐性をさらに示す。図9.33および9.37は、84アミノ酸の非ヒスタグタンパク質のバンドを示し、このバンドはプロテアーゼによる消化後の2時間まで明らかに目に見える。
3. マウスにおける1回皮下投与後のBOXA(野生型および変異型)およびペグ化BOXA(野生型および変異型)の薬物動態試験。
3.1. 試験の目的
この試験の目的は、マウスにおける化合物の1回皮下投与後に、BoxA(野生型および変異型)およびペグ化BoxA(野生型および変異型)の薬物動態プロファイルを評価して比較することであった。
3.2. 材料および方法
被験物質:BoxAの野生型および変異型および相当するペグ化分子。ペグ化分子は、還元的アミノ化により線状mPEG-アルデヒド(40kDa)とそれぞれのBoxA分子のN末端を反応させることによって得た。
3.3 In vivo実験
動物:実験時に22.2〜22.4gの平均体重を有していた、マウス(Balb/c、オス、7〜9週齢、実験一週間前にCharles River Laboratories Italia SpA、Calcoによって供給された)。
動物の飼育:12時間の明/暗サイクルで、温度および相対湿度をそれぞれ22℃±2℃および55±15%に維持するように設定した換気型恒温コンテナ中に動物を収容した。マウスはケージ当たり10匹まで、透明ポリカーボネート製ケージ(Techniplast、Buguggiate、イタリア)中に収容し、水筒によって飲料水、および市販の実験用げっ歯類の餌(4RF21、Mucedola s.r.l.、Settimo Milanese、イタリア)を随意で与えた。
実験群:4(4つの被験物質)、20匹の動物/群、ランダムにグループ分け。
投与した用量:BoxAの野生型および変異型を皮下に1mg/kg投与した。ペグ化BoxAの野生型および変異型は皮下に5mg/kg投与した。これらの用量は試験化合物の等モル濃度を確実にした。
被験物質の投与:0.45×12mm(26G×1/2’’)の針を取り付けたインスリン用注射筒を使用することによって、0.25mL/マウス(10mL/体重1kg)の体積で被験物質を皮下投与した。
被験物質の配合物:リン酸緩衝生理食塩水溶液
動物の殺傷および血液採取:
血液サンプルは治療後に以下の時点で採取した:
BoxAの野生型および変異型:試験化合物の投与後5、20および40分、1.5および2.5時間;
ペグ化BoxAの野生型および変異型:試験化合物の投与後5、40分、1.5、5および10時間。
試験化合物間の血液サンプル採取に関する異なる時点は、血流中でのペグ化分子の予想される長い耐久性に基づいて決定した。
それぞれのサンプル採取時間に、約0.4mLの血液サンプルを、深いエーテル麻酔下でインスリン用注射筒を使用して、それぞれの動物の腹側大動脈から採取し、5μLのヘパリン(5000Ul/mL)を含むポリエチレン製エッペンドルフチューブに移して血液凝固を防止した。血液サンプルは冷凍遠心器(2〜4℃)における5分間1400gでの遠心分離まで氷中に保った。それぞれのチューブから血漿サンプルを次いで回収し、新しいエッペンドルフチューブ中に置き、分析するまで-80℃に凍結した。
3.4 分析測定
BoxA(野生型および変異型)およびペグ化BoxA(野生型および変異型)の血漿中濃度を、ELISA法によってマウスの血漿において決定した。
簡単に言うと、100mM炭酸塩-重炭酸塩コーティングバッファー中にBoxAのN末端に対するモノクローナル抗体を10ng/mlに希釈することによって、コーティング溶液を調製した。100μLをNunc Maxisorp ELISAプレートのそれぞれのウエルに等分し、4℃で一晩インキュベートした。プレートはPBS0.05%Tweenで6回洗浄し、5%ミルクをPBS1%Tweenに溶かした300μLをそれぞれのウエルに加えて、プレート上の残りの結合部位を阻害した。プレートは300rpmで室温において1時間インキュベートした。サンプルはPBS1%Tween中に1:20に希釈した。
プレートは6回洗浄し、100μLの標準および希釈サンプルはコーティングプレートの指定のウエルに移し、300rpmで室温において1時間インキュベートした。BoxAのC末端に対する二次抗体(1:200)を加える前に、プレートを再度6回洗浄した。1時間のインキュベーションおよび6回の洗浄後、ビオチン-ヤギ抗-ウサギ複合体1:20000溶液をそれぞれのウエルに加えた(100μL/ウエル)。1時間のインキュベーション(室温で、300rpm)および6回の洗浄後、300rpmで25分間100μl/ウエルのストレプトアビジン-HRP溶液1:100000と共にプレートをインキュベートした。プレートは6回洗浄し、100μlの予め温めたTMB基質をそれぞれのウエルに加えた。シグナルを卓上において室温で現像し、30分後、100μL/ウエルの停止溶液を加え、プレートは450nmですぐに読み取った。
3.5 結果
BoxA(野生型および変異型)およびペグ化BoxA(野生型および変異型)の平均血漿中濃度を、前に記載したPKサンプルのそれぞれに関して計算し、薬物動態プロファイルを決定した。結果は図11および12中に示す。
実施例として、本明細書で以下に、BoxAの野生型および変異体番号64(M51I)およびペグ化BoxAおよびペグ化BoxAの変異体番号64(M51I)のPKプロファイルを報告する。結果は平均値±誤差(SEM)として報告する(それぞれの時点に関して4匹のマウス、二連で分析)。
以下の表中に、BoxAの野生型、BoxAの変異体番号64、ペグ化BoxAの野生型およびペグ化BoxAの変異体番号64の曲線に関する計算上のAUClast(最後の実験地点で計算した曲線下の領域)を報告する。
3.6 考察
突然変異によって野生型に与えられたAUClastの相対利得は、1.68X(野生型対64)であり、これはサブキュート(sub cute)区画における高いプロテアーゼ耐性による可能性が最も高い。ペグ化によって野生型に与えられたAUClastの相対利得は31X(野生型対PEG-野生型)であり、これは主に阻害されたPEG複合体の腎臓濾過だけでなく、プロテアーゼ作用からの保護にも原因がある。まとめて考えると、突然変異およびペグ化は37X(野生型対PEG-64)のAUClastの相対利得をもたらす。予想外に、この2つの修飾は1つになって、1つ修飾の貢献度の合計より優れた、タンパク質への動物の曝露に対するプラスの効果がある(すなわち、37X>1.68X+31X)。したがって、単一の点突然変異およびペグ化は、天然タンパク質の薬物動態プロファイルに対して相乗的、協同的効果がある。この現象について考えられる説明は、ペグ化タンパク質はsub cute区画においてタンパク質分解から完全には保護されないということであり得る。単一の点突然変異の導入はこの区画における耐性を高め、より多量のタンパク質が血液循環中に入り、したがっての大きなPEG鎖によって腎臓濾過から保護されるのを可能にする。

Claims (41)

  1. ヒトおよび/または非ヒト野生型HMGB1高親和性結合ドメインBox-A(HMGB1のBox-A)またはHMGB1のBox-Aの生物活性断片のポリマー複合体。
  2. ヒトおよび/または非ヒトHMGB1高親和性結合ドメインBox-A(HMGB1のBox-A)またはHMGB1のBox-Aの生物活性断片のポリペプチド変異体のポリマー複合体であって、前記ポリペプチド変異体のアミノ酸配列が、1つまたは複数の単一アミノ酸の突然変異によって野生型HMGB1のBox-Aのアミノ酸配列と異なるポリマー複合体。
  3. ポリマーが、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアクリル酸、ポリアクリレート、ポリアクリルアミドまたはそのN-アルキル誘導体、ポリメタクリル酸、ポリメタクリレート、ポリアクリル酸エチル、ポリエチルアクリレート、ポリビニルピロリドン、ポリ(ビニルアルコール)、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ乳酸グリコール酸共重合体、デキストラン、キトサンまたはポリアミノ酸からなる群から選択される直鎖状または分岐状ポリマー部分である、請求項1または2に記載のポリマー複合体。
  4. ポリマーが、ポリエチレングリコール(PEG)またはメトキシ-ポリエチレングリコール(m-PEG)から選択される直鎖状または分岐状ポリマー部分である、請求項1または2に記載のポリマー複合体。
  5. ポリマーが100〜100,000、好ましくは5,000〜50,000Daの分子量を有する、請求項1から4のいずれかに記載のポリマー複合体。
  6. PEGポリマー部分が20,000の平均分子量または40,000Daの平均分子量を有する、請求項4または5に記載のポリマー複合体。
  7. ポリマー部分がHMGB1のBox-Aのポリペプチド、HMGB1のBox-Aまたはポリペプチド変異体またはその生物活性断片と共有結合している、請求項1から6のいずれかに記載のポリマー複合体。
  8. ポリマー部分が、アミン、アミド、カルバメート、カーボネート、炭素、エステル、エーテル、チオエーテル、およびジスルフィド結合から選択される共有結合によって、HMGB1のBox-Aのポリペプチド、そのポリペプチド変異体または生物活性断片において結合している、請求項7に記載のポリマー複合体。
  9. HMGB1のBox-Aのポリペプチド、そのポリペプチド変異体または生物活性断片上の結合部位が、リシン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、チロシン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸残基またはN末端アミノ基から選択される、請求項1から8のいずれかに記載のポリマー複合体。
  10. ポリペプチド変異体が1〜10個の単一アミノ酸、好ましくはわずか1個の単一アミノ酸の突然変異によって野生型HMGB1のBox-Aの配列と異なる、請求項2から9のいずれかに記載のポリマー複合体。
  11. 突然変異が、単一アミノ酸の置換、欠失または付加である、請求項10に記載のポリマー複合体。
  12. 置換が、遺伝的にコードされた異なるアミノ酸または遺伝的にコードされていないアミノ酸によって得られる、請求項11に記載のポリマー複合体。
  13. 置換が保存的または非保存的置換である、請求項11または12に記載のポリマー複合体。
  14. 非ヒトHMGB1のBox-Aがガンビアハマダラカ(Anopheles gambia)HMGB1のBox-A(配列番号301)である、請求項1から13のいずれかに記載のポリマー複合体。
  15. ヒトHMGB1のBox-Aのポリペプチド変異体が、配列番号2〜116のいずれかにおいて定義するアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項2から14のいずれかに記載のポリマー複合体。
  16. ヒト野生型HMGB1のBox-Aの生物活性断片がそれぞれ少なくとも77または少なくとも54アミノ酸の断片であり、それぞれ配列番号117または223において定義するアミノ酸配列を含む、請求項1から14のいずれかに記載のポリマー複合体。
  17. ヒトHMGB1のBox-Aの生物活性断片のポリペプチド変異体が、配列番号118〜222または224〜300のいずれかにおいて定義するアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項16に記載のポリマー複合体。
  18. ガンビアハマダラカHMGB1のBox-Aのポリペプチド変異体が、配列番号302〜418のいずれかにおいて定義するアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項2から14のいずれかに記載のポリマー複合体。
  19. ガンビアハマダラカ野生型HMGB1のBox-Aの生物活性断片が、それぞれ少なくとも77または少なくとも54アミノ酸の断片であり、それぞれ配列番号419または529において定義するアミノ酸配列を含む、請求項1から14のいずれかに記載のポリマー複合体。
  20. ガンビアハマダラカHMGB1のBox-Aの生物活性断片のポリペプチド変異体が、配列番号420〜528または530〜610のいずれかにおいて定義するアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項19に記載のポリマー複合体。
  21. 活性成分として請求項1から20のいずれかに記載の有効量の少なくとも1つのポリマー複合体、および場合によっては薬剤として許容される担体、アジュバント、希釈剤または/および添加剤を一緒に含む医薬組成物。
  22. 診断用途の請求項21に記載の組成物。
  23. 治療用途の請求項21に記載の組成物。
  24. HMGB1関連病状を予防、軽減または治療するための医薬品を製造するための、請求項1から20のいずれかに記載のポリマー複合体の使用。
  25. HMGB1関連病状およびHMGB1相同タンパク質と関連がある病状が、炎症性サイトカインカスケードの活性化により媒介される病的状態である、請求項24に記載の使用。
  26. 病的状態が、炎症性疾患、自己免疫疾患、全身性炎症反応症候群、臓器移植後の再潅流障害、心臓血管疾患、産科および婦人科疾患、感染性(ウイルス性および細菌性)疾患、アレルギー性およびアトピー性疾患、固形および液状腫瘍の病状、移植片拒絶反応疾患、先天性疾患、皮膚疾患、神経疾患、カヘキシー、腎疾患、医原性中毒状態、代謝性および突発性疾患、および眼科疾患からなる群から選択される、請求項24または25に記載の使用。
  27. RAGE関連病状を予防、軽減または治療するための医薬品を製造するための、請求項1から20のいずれかに記載のポリマー複合体の使用。
  28. RAGE関連病状がI型糖尿病および/またはII型糖尿病である、請求項27に記載の使用。
  29. 炎症性サイトカインカスケードの初期メディエーターを阻害することができるさらなる作用物質と組み合わせた、請求項24から28のいずれか一項に記載の使用。
  30. さらなる作用物質が、TNF、IL-1α、IL-1β、IL-Ra、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、IL-18、IFN-γ、MIP-1α、MIF-1β、MIP-2、MIFおよびPAFからなる群から選択されるサイトカインのアンタゴニストまたは阻害剤である、請求項29に記載の使用。
  31. さらなる作用物質が、RAGEに対する抗体、RAGE発現を阻害することができる核酸または核酸類似体、例えばアンチセンス分子、リボザイムまたはRNA干渉分子、またはRAGEもしくは可溶性RAGE(sRAGE)とのHMGB1相互作用の合成小分子アンタゴニストである、請求項29に記載の使用。
  32. さらなる作用物質が、トール様受容体(TLR)、特にTLR2、TLR4、TLR7、TLR8または/およびTLR9とHMGB1の相互作用の阻害剤、好ましくはモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、TLR発現を阻害することができる核酸もしくは核酸類似体、例えばアンチセンス分子、リボザイムもしくはRNA干渉分子、または1000ダルトン未満のサイズを有する合成分子である、請求項29に記載の使用。
  33. さらなる作用物質が、天然または突然変異型トロンボモジュリンのN末端レクチン様ドメイン(D1)である、請求項29に記載の使用。
  34. さらなる作用物質が湾曲または十字形DNA、PNAまたはDNA/PNAキメラまたはハイブリッドから選択される湾曲形構造を有する合成二本鎖核酸または核酸類似体分子である、請求項29に記載の使用。
  35. さらなる作用物質が、K-252aまたは/およびその塩もしくは誘導体、あるいはK-252aのポリマー複合体または/およびその誘導体である、請求項25に記載の使用。
  36. 少なくとも1つのポリマー複合体を、請求項27から35のいずれか一項において定義した少なくとも1つのさらなる作用物質と組み合わせる、請求項21に記載の組成物。
  37. 炎症性サイトカインカスケードのHMGB1活性化によって特徴付けられる患者における状態を治療する方法であって、HMGB1によって誘導される病的活性をアンタゴナイズおよび/または阻害することができる、有効量の少なくとも1つの請求項1から20のいずれか一項に記載のポリマー複合体を患者に投与するステップを含む方法。
  38. 請求項1から20のいずれか一項に記載の少なくとも1つのポリマー複合体の使用であって、前記複合体が医療機器の表面上に可逆的に固定化されている使用。
  39. 前記医療機器が外科手術器具、インプラント、カテーテルまたはステントである、請求項38に記載の使用。
  40. 請求項1から20のいずれか一項に記載の少なくとも1つのポリマー複合体で可逆的にコーティングされた医療機器。
  41. 外科手術器具、インプラント、カテーテルまたはステントから選択される、請求項40に記載の医療機器。
JP2009527748A 2006-09-15 2007-09-14 ＨＭＧＢ１のＢｏｘ−ＡおよびＨＭＧＢ１のＢｏｘ−Ａ変異体のポリマー複合体 Pending JP2010503630A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP06019362 2006-09-15
US90477607P 2007-03-05 2007-03-05
PCT/EP2007/008029 WO2008031612A1 (en) 2006-09-15 2007-09-14 Polymer conjugates of box-a of hmgb1 and box-a variants of hmgb1

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015139496A Division JP2015193646A (ja) 2006-09-15 2015-07-13 ＨＭＢＧ１のＢｏｘ−ＡおよびＨＭＧＢ１のＢｏｘ−Ａ変異体のポリマー複合体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2010503630A true JP2010503630A (ja) 2010-02-04
JP2010503630A5 JP2010503630A5 (ja) 2010-10-21

Family

ID=38969804

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2009527748A Pending JP2010503630A (ja) 2006-09-15 2007-09-14 ＨＭＧＢ１のＢｏｘ−ＡおよびＨＭＧＢ１のＢｏｘ−Ａ変異体のポリマー複合体
JP2015139496A Pending JP2015193646A (ja) 2006-09-15 2015-07-13 ＨＭＢＧ１のＢｏｘ−ＡおよびＨＭＧＢ１のＢｏｘ−Ａ変異体のポリマー複合体
JP2017113232A Pending JP2017200930A (ja) 2006-09-15 2017-06-08 ＨＭＢＧ１のＢｏｘ−ＡおよびＨＭＧＢ１のＢｏｘ−Ａ変異体のポリマー複合体

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015139496A Pending JP2015193646A (ja) 2006-09-15 2015-07-13 ＨＭＢＧ１のＢｏｘ−ＡおよびＨＭＧＢ１のＢｏｘ−Ａ変異体のポリマー複合体
JP2017113232A Pending JP2017200930A (ja) 2006-09-15 2017-06-08 ＨＭＢＧ１のＢｏｘ−ＡおよびＨＭＧＢ１のＢｏｘ−Ａ変異体のポリマー複合体

Country Status (11)

Country Link
US (3) US8546547B2 (ja)
EP (1) EP2068935B8 (ja)
JP (3) JP2010503630A (ja)
AU (1) AU2007296843C1 (ja)
CA (1) CA2663300C (ja)
HK (1) HK1134779A1 (ja)
HR (1) HRP20110487T1 (ja)
IL (1) IL197441A (ja)
MX (1) MX2009002820A (ja)
PL (1) PL2068935T3 (ja)
WO (1) WO2008031612A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019107530A1 (ja) * 2017-12-01 2019-06-06 株式会社ステムリム 炎症性腸疾患の治療薬
US10364276B2 (en) 2011-04-26 2019-07-30 StemRIM Inc. Peptide for inducing regeneration of tissue and use thereof
WO2020085506A1 (ja) * 2018-10-25 2020-04-30 国立大学法人大阪大学 軟骨疾患の治療薬
US11191786B2 (en) 2009-10-28 2021-12-07 StemRIM Inc. Agents for promoting tissue regeneration by recruiting bone marrow mesenchymal stem cells and/or pluripotent stem cells into blood
US11197895B2 (en) 2008-04-30 2021-12-14 StemRIM Inc. Method for collecting functional cells in vivo with high efficiency

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120165244A1 (en) * 2008-10-30 2012-06-28 Hua-Lin Wu Methods for binding lewis y antigen
JP5467313B2 (ja) * 2009-09-28 2014-04-09 国立大学法人 岡山大学 アテローム動脈硬化抑制剤
CN101691580B (zh) * 2009-09-28 2012-02-15 中国人民解放军第三军医大学 人HMGB1 A box和酸性尾端的新型融合蛋白及其应用
US20110123483A1 (en) * 2009-11-23 2011-05-26 Deutsches Krebsforschungszentrum Hmgb1 for cancer treatment
US8981025B2 (en) 2011-02-10 2015-03-17 Corning Incorporated Polymerizable catonic peptide monomers and polymers
WO2014016417A1 (en) 2012-07-26 2014-01-30 Ospedale San Raffaele Srl Hmgb1 variants and uses thereof
GB201508337D0 (en) 2015-05-15 2015-06-24 Hmgbiotech S R L Novel peptides
RU2768186C2 (ru) 2015-12-11 2022-03-23 Рупрехт-Карлс-Университет Гейдельберг Комбинированные лекарственные средства, содержащие модуляторы pkm2 и hmgb1
US11684653B2 (en) * 2019-03-06 2023-06-27 The Cleveland Clinic Foundation Compositions and method for reducing virulence of microorganisms
KR20220111315A (ko) 2019-12-18 2022-08-09 에프. 호프만-라 로슈 아게 연속 표지화 방식을 사용하는 합성에 의한 시퀀싱 방법

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62503171A (ja) * 1985-06-26 1987-12-17 シタス　コ−ポレイシヨン ポリマ−接合を利用する医薬組成物用蛋白質の可溶化
JP2006510619A (ja) * 2002-11-20 2006-03-30 クリティカル セラピューティクス，インコーポレイテッド 抗炎症剤としてのｈｍｇｂ断片の使用
JP2008511300A (ja) * 2004-09-03 2008-04-17 クレアビリス・セラピューティクス・エスピーエー プロテアーゼ抵抗性ヒトおよび非ヒトＨＭＧＢ１Ｂｏｘ−Ａ変異体、ならびにそれらの治療／診断への使用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2260872B1 (en) 1998-10-16 2017-08-30 Biogen MA Inc. Polymer conjugates of interferon beta-1A and uses thereof
DK1355936T3 (da) 2001-02-01 2007-10-29 Biogen Idec Inc Polymerkonjugater af neublastin og fremgangsmåder til anvendelse af samme
ITMI20010562A1 (it) 2001-03-16 2002-09-16 Marco E Bianchi Inibitori o antagonisti della proteina hmg1 per il trattamento di disordini vascolari
MXPA03010449A (es) 2001-05-15 2004-12-06 Univ Pittsburgh Uso de fragmentos hmg como agentes anti-inflamatorios.
KR101145990B1 (ko) 2002-12-19 2012-08-23 더 거번먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카 애즈 레프리젠티드 바이 더 세크러터리 오브 더 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 써비시즈 시아노비린 변이체-중합체 콘쥬게이트
EP1613274B1 (en) 2003-04-15 2010-03-03 GlaxoSmithKline LLC Human il-18 substitution mutants and their conjugates
WO2006012373A2 (en) * 2004-07-20 2006-02-02 Critical Therapeutics, Inc. Combination therapies of hmgb and complement inhibitors against inflammation
BRPI0519430A2 (pt) 2004-12-22 2009-02-10 Ambrx Inc hormânio do crescimento humano modificado
AU2006284096B2 (en) 2005-08-25 2012-03-29 Avro Life Sciences, Inc. Polymer conjugates of K-252a and derivatives thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62503171A (ja) * 1985-06-26 1987-12-17 シタス　コ−ポレイシヨン ポリマ−接合を利用する医薬組成物用蛋白質の可溶化
JP2006510619A (ja) * 2002-11-20 2006-03-30 クリティカル セラピューティクス，インコーポレイテッド 抗炎症剤としてのｈｍｇｂ断片の使用
JP2008511300A (ja) * 2004-09-03 2008-04-17 クレアビリス・セラピューティクス・エスピーエー プロテアーゼ抵抗性ヒトおよび非ヒトＨＭＧＢ１Ｂｏｘ−Ａ変異体、ならびにそれらの治療／診断への使用

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11197895B2 (en) 2008-04-30 2021-12-14 StemRIM Inc. Method for collecting functional cells in vivo with high efficiency
US11191786B2 (en) 2009-10-28 2021-12-07 StemRIM Inc. Agents for promoting tissue regeneration by recruiting bone marrow mesenchymal stem cells and/or pluripotent stem cells into blood
US10364276B2 (en) 2011-04-26 2019-07-30 StemRIM Inc. Peptide for inducing regeneration of tissue and use thereof
US10550165B2 (en) 2011-04-26 2020-02-04 StemRIM Inc. Peptide for inducing regeneration of tissue and use thereof
WO2019107530A1 (ja) * 2017-12-01 2019-06-06 株式会社ステムリム 炎症性腸疾患の治療薬
US11298403B2 (en) 2017-12-01 2022-04-12 StemRIM Inc. Therapeutic agent for inflammatory bowel disease
WO2020085506A1 (ja) * 2018-10-25 2020-04-30 国立大学法人大阪大学 軟骨疾患の治療薬
JPWO2020085506A1 (ja) * 2018-10-25 2021-09-16 国立大学法人大阪大学 軟骨疾患の治療薬
JP7448126B2 (ja) 2018-10-25 2024-03-12 国立大学法人大阪大学 軟骨疾患の治療薬

Also Published As

Publication number Publication date
AU2007296843B2 (en) 2012-02-23
JP2017200930A (ja) 2017-11-09
MX2009002820A (es) 2009-06-04
AU2007296843A1 (en) 2008-03-20
EP2068935B8 (en) 2011-09-14
US20090324677A1 (en) 2009-12-31
EP2068935B1 (en) 2011-04-13
PL2068935T3 (pl) 2011-11-30
HK1134779A1 (en) 2010-05-14
JP2015193646A (ja) 2015-11-05
US9707298B2 (en) 2017-07-18
US8546547B2 (en) 2013-10-01
HRP20110487T1 (hr) 2011-08-31
EP2068935A1 (en) 2009-06-17
CA2663300C (en) 2014-10-07
WO2008031612A1 (en) 2008-03-20
US20140065094A1 (en) 2014-03-06
CA2663300A1 (en) 2008-03-20
AU2007296843C1 (en) 2012-08-16
US20170304398A1 (en) 2017-10-26
IL197441A (en) 2013-07-31
IL197441A0 (en) 2009-12-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2017200930A (ja) ＨＭＢＧ１のＢｏｘ−ＡおよびＨＭＧＢ１のＢｏｘ−Ａ変異体のポリマー複合体
US7635679B2 (en) Protease resistant mutant of human HMGB1 high affinity binding domain Box-A (HMGB1 Box-A)
US20180360977A1 (en) Interleukin-15 Compositions and Uses Thereof
US11879001B2 (en) Conjugate comprising an IL-2 moiety
BRPI0613332A2 (pt) isoformes de fator estimulante de colÈnia granulocìtica humana
CN101528266B (zh) Hmgb1的a盒和hmgb1的a盒变体的聚合体缀合物
CA3189715A1 (en) Glycosylated il-2 proteins and uses thereof
KR20110039274A (ko) 기능화 폴리펩티드
US10098960B2 (en) Polymer conjugate
ES2362244T3 (es) Conjugados polímeros de la caja a de hmgb1 y variantes de la caja a de hmgb1.
EP3872084A1 (en) Epi-x4 based peptides and derivatives thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20100830

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20100830

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20120925

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20121220

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20130305

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20130705

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20130805

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20130729

A912 Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912

Effective date: 20130823

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20150713