JPS62503171A - ポリマ−接合を利用する医薬組成物用蛋白質の可溶化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリマー接合を利用する医薬組成物用蛋白質の可溶化この発明は、生物学的に活 性な蛋白質の化学的及び／又は生理学的性質を変化せしめる該蛋白質の化学的修 飾に関する。

さらに詳しくは、この発明は生理的ｐＨにおいて蛋白質を可溶性にするための、 ポリマーへの親脂性水不溶性蛋白質の選択的接合に関する。

微生物宿主細胞中で生産される多くの異種性蛋白質は屈折体中の不二寮性物質と して見出される。一般に見出される培養条件において屈折体を形成する異種性蛋 白質の例にはインターロイキン２　（ＩＬ−２）　、インターフェロン−β（Ｉ ＦＮ−β）、ネコ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）外皮蛋白質、ヒト成長ホルモン（ ｈＧＨ）、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）、及びＦ ＭＤウィルスのごときウィルスでコートされ又はこれらの融合した幾つかの蛋白 質が含まれる。

さらに、これらの蛋白質の多くは疎水性であり、そして溶液のままであるのでは なく、物質及びそれ自体に付着しやすい（すなわち、凝集しやすい）。また、こ れら組換蛋白質の多くはグリコジル化されておらず、これらの天然対応物は水溶 性のグリコジル化された分子である。その溶解性を変化せしめるであろうこれら の蛋白質の修飾は、これらの蛋白質の製造収量を上昇せしめ、そしてそれら、の 療法的使用のための製剤化を容易にするために好ましいであろう。さらに、修飾 は、蛋白質が生体内に導入された場合に蛋白質の凝集を減少せしめ又は除去し、 これによってその免疫原性を低下せしめるであろう。

特定の生理的反応を生じさせるための、循環系へのポリペプチドの使用は医学分 野において良く知られている。ポリペプチドの臨床的使用に由来する潜在的な療 法的利益に対する限界は、循環系において免疫反応を惹起するその能力である。

この免疫反応は、Ｒ，１１１ｉｎｇ（１９７０）、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｅｎｄｒｏ ｃｒ、、３１．６７９−６８８；Ｗ、Ｍｏｏｒｅ（１９８０）＋Ｊ、Ｃｌ１ｎ、 Ｅｎｄｒｏｃｒｉｎｏ１．Ｍｅｔａｂ、、４６．２０−２７；並びに−、　Ｍｏ ｏｒｅ及びＰ、Ｌｅｐｐｅｒｔ（１９８０）　、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｅｎｄｒｏｃ ｒｉ−ｎｏｌ、Ｍｅｔａｂ、、　５１，６９１−６９７により記載されているよ うに、注射に先立つ物質の凝集により惹起されるであろう。この反応は、ポリペ プチドが注射された循環系による該ポリペプチドに対する抗体の生産を含む。こ の抗体生産は、時として循環系での持続時間を短縮する（半減期の短縮）ことに より、又は抗体−ポリペプチド相互作用によって分子を変形せしめることにより 、該ポリペプチドの所望の生物学的機能を低下せしめ又は除去するであろう。

これらの潜在的に有用な療法的ポリペプチドを修飾して該ポリペプチドの所望の 生理的活性を維持しながら免疫反応を排除し又は少なくとも減少せしめることに より、上記の欠点を伴わないで哺乳類の循環系中に該ポリペプチドを使用するこ とが可能となるであろう。さらに、循環中のポリペプチドの延長された半減期の ため、所望の療法的効果のために今まであろう。

前記の免疫原性の問題及び循環中の短い半減期の問題並びに幾つかの蛋白質の他 の不所望の性質はよく認識されており、そしてこれらを解決するためにポリペプ チドの種々の修飾が行われている。これらには、ポリエチレングリコール（ＰＥ Ｇ）又はポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）のごとき実質的に直鎖のポリマー による蛋白質の修飾が含まれる。例えば、米国特許ｍ４，２６Ｌ９７３は、免疫 原性アレルゲン分子とＰＥＧのごとき非免疫原性水溶性ポリマーとの接合による アレルゲンの免疫原性の減少を記載している。米国特許１に４，３０１，１４４ はＰＥＧ、ＰＰＧ、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー 、又はこれらのポリマーのエーテル、エステルもしくは脱水生成物へのヘモグロ ビンの接合によるヘモグロビン分子の酸素担持能力の増加を記載している。１９ ８４年１月１１日に公開されたヨーロッパ特許出願公開Ｎｃｉ９Ｂ、　１１０は 、ポリオキシエチレンーポリオキシプロピレンコポリマーへのポリペプチド又は 糖蛋白質の接合がその生理的活性の長さを延長することを記載している。好まし くは、ポリペプチド又は糖蛋白質は水溶性の酵素又は天然インターフェロンであ る。

米国特許に４．１７９．３３７はＰＥＧ又はＰＰＧへの酵素及びインシュリンの ごとき水溶性ポリペプチドの接合により、その生理的活性の実質的部分を保持し ながらポリペプチドの免疫原性を低下せしめることを開示している。米国特許ｍ ４，００２，５３１はアルデヒド誘導体を介してＰＥＧに酵素を接合せしめる異 る方法を開示している。

米国特許！１ｈ４．０５５，６３５は、ポリサンカライドのごときポリマー基剤 に共有結合した蛋白質分解酵素の水溶性複合体を含んで成る医薬組成物を開示し ている。

米国特許１１ｈ３．９６０．８３０はポリエチレングリコールのごときポリアル キレングリコールポリマーに結合したペプチドを開示している。

米国特許Ｎ［１４，０８８，５３８は、ポリエチレングリコールのごとき有機ポ リマーに共有結合した酵素を含んで成る可逆的に可溶性で酵素的に活性なポリマ ー酵素生成物を開示している。

米国特許１１ｈ４，４１５，６６５は、少なくとも１個の第１又は第２７ミノ基 、少なくとも１個のチオール基及び／又は少なくとも１個の芳香族ヒドロキシ基 を含有する有機リガンド（第３カラム、第１９〜３６行目に記載されている）を 少なくとも１個のヒドロキシ基を有するポリマーキャリヤー（第３カラム、第４ ２〜６６行目に記載されている）に接合せしめる方法を開示している。

米国特許Ｔｈ４，４９５．２８５は、カンプリング剤を介してポリエチレングリ コールにそのアミノ酸側鎖が連結されている非免疫原性プラスミノーゲンアクチ ベーターを開示している。

米国特許Ｎ１１Ｌ４，４１２．９８９は、アミド結合を介してポリエチレン又は ポリプロピレングリコールに共有結合しているヘモクロビン又はその誘導体を含 有する酸素担持材料を開示している。

米国特許１＆４，４９６．６８９は、α−１−プロティナーゼインヒビターとＰ ＥＧ又はメトキシポリエチレングリコールのごときポリマーとの共有結合で連結 された複合体を開示している。

米国特許＆３，６１９．３７１は生物学的に活性な物質が化学的に結合している ポリマーマトリクスを開示している。

米国特許１’に３．７８８．９４８は蛋白質をポリマーに結合せしめるための有 機シアネート化合物の使用を開示している。

米国特許１ｔ３．８７６．５０１は臭化シアンにより水溶性炭水化物を活性化し て酵素又は他の蛋白質へのその結合を改良することを開示している。

米国特許＆４．０５５．６３５はポリマー基剤に共有結合した蛋白質分解酵素の 医薬組成物を開示している。

ＥＰ１５２．８４７は酵素接合体、カルシウム塩及びポリエチレングリコールを 含んで成る酵素接合体組成物を開示している。

１９８２年１１月２６日に公開されたＪＰ　５７９２４３５はアミノ基のすべて 又は一部分がポリエチレン成分により置換されている修飾されたポリペプチドを 開示している。１９７３年９月２７日に公開されたＤＥ　２３１２６１５はヒド ロキシ又はアミノ基を含有する化合物へのポリマーの接合を開示している。

ＥＰ　１４７．７６１はα−１−プロティナーゼインヒビター及び水溶性ポリマ ー（このポリマーはポリエチレングリコールであることができる）の共有結合接 合体を開示している。

米国特許Ｎ１１４，４１４．１４７は、インターフェロンをポリ（エチレン無水 コハク酸）のごときジカルボン酸の無水物に接合せしめることによりその疎水性 を少なくすることを記載している。

これらの特許及び特許公表に加えて、幾つかの論文が、酵素、ＩｇＧおよびアル ブミンのごとき蛋白質の修飾剤として活性化ＰＥＧ又はＰＰＧを使用する概念を 検討している。例えば、イナダ等、」」劇猥二」工ｄ　Ｂｉｔ臣垣慢」釦ｌ四μ ザよ、１２２．８４５−８５０　（１９８４）は、ＰＥＧと接合せしめるために シアヌル酸クロリドを使用することによってベンゼンのごとき有機溶剤に可溶性 であるようにするために水溶性リポプロティンリパーゼを修飾することを開示し ている。Ｔａｋａｈａｓｈｉ等、ｊＢｉｏｃｈｅｍ。

ａｎｄ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ｒｅｓ、ｃｏｍｍ、＋１２１　＋２６１−２６５（１ ９８４）は、水溶性酵素をベンゼン中で活性で且つ可溶性である様にするために ＰＥＧと共にシアヌル酸クロリドトリアジンを用いてホースラディツシュパーオ キシダーゼを修飾することを開示している。５ｕｚｕｋｉ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏ　ｈｓ、Ａｃｔａ、、　７８８．２４８　２５５（１９８４，）は、シア ヌル酸クロリドで活性化されたＰＥＧを用いるＴｇＧの凝集の抑制を開示してい る。Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ等、ＣａｎｃｅｒＢｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、 、ユ、　１７５−１８６　（１９８４）は、サクシンイミジルサクシネートによ り活性化されたＰＥＧを用いるＥ、コリ（Ｅ、Ｃｏ１１）及びビブリオ・サクシ ノゲネス（ν１ｂｒｉｏ　５ｕｃｃｉｎｏ−７からのアスパラギナーゼの修飾が 該蛋白質の半減期を延長しそして免疫原性を低下せしめることを述べている。

Ｄａｖｉｓ等、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａユ」〉刀」且ヒ−にューヨーク、アカデミツ クプレス、１９８０）　ｐ４４１−４５１は、通常は不溶性である酵素がＰＥＧ 付加により可溶化され得ることを開示しているが、これ以上の詳細は記載されて いない。幾つかの他の論文は、サクシンイミジルサクシネート又はシアヌル酸ク ロリドにより活性化されたＰＥＧによる酵素、例えばウリカーゼ、ストレプトキ ナーゼ、カタラーゼ、アルギナーゼ及びアスパラギナーゼの修飾により該蛋白質 の半減期を延長しそして免疫原性を減少せしめることを検討している。

しかしながら、これらの文献はいずれも、生理的ｐＨにおいて疎水性でありそし てそれ故に水性媒体中での製剤化に抵抗する水溶性組換蛋白質に対してポリマー 修飾法をいかに使用するかについての詳細は開示していない、従って、種々の蛋 白質の薬理動態及び物理性の大きな差異のため、選択されたどの蛋白質がポリマ ーによる処理に好都合に反応するかを推定することは先験的に不可能である。さ らに、いずれの文献も蛋白質の凝集、すなわち蛋白質が生体内に導入された場合 に免疫反応を惹起する現象を低下せしめ又は排除することを開示していない。

１９８５年９月１１日に公開された成田薬品のＥＰ　１５４．３１６は、リンホ カインの少なくとも１個のアミノ基に直接結合したＰＥＧを含有する化学的に修 飾されたリンホカイン、例えばＩＬ−２を開示し、そしてクレームしている。

従ってこの発明は、β−インターフェロン、インターロイキン−２、及びイムノ トキシンから選択される、周囲条件下で医薬として許容されるｐＨ範囲において 水中に通常不溶性である蛋白質を修飾してこれらをこの様な条件下で水性緩衝液 中に溶解するようにすることを提供する。この修飾は蛋白質のグリコジル化を模 倣し、これによって天然のグリコジル化蛋白質が可溶性であるのと同様に蛋白質 を驚くほど可溶性にする。この修飾はまた、蛋白質を溶液状に維持するために洗 剤又は変性剤のごとき外来性可溶化添加剤の添加を回避する。

修飾された蛋白質は、最初及び時間の経過後のいずれにおいても修飾されていな い蛋白質の生物学的活性を保持する。

第２の利点として、ある条件下での修飾は、蛋白質の凝集を減少せしめもしくは 排除することにより又は抗原決定基をマスクすることによって、蛋白質の生理的 半減期を延長し、そしてその免疫原性を低下せしめるであろう。インビボ半減期 は適切な条件及びポリマーを選択することにより調節することができる。

さらに詳しくは、この発明は、β−インターフェロン、インターロイキン−２及 びイムノトキシンから成る群から選ばれた生物学的に活性な選択的に接合した蛋 白質が溶解している、非毒性で不活性な医薬として許容される水性キャリヤー媒 体を含んで成る医薬組成物に関し、この医薬組成物においては前記蛋白質がポリ エチレングリコールホモポリマー及びポリオキシエチル化ポリオールから成る群 から選択された水溶性ポリマーに共有結合しており、ここで前記ホモポリマーは 置換されていないか又は一端においてアルキル基により置換されており、そして 前記ポリオールは置換されておらず、そして前記蛋白質はその未接合形において は通常は疎水性でありそして可溶化剤の非存在下ｐＨ６〜８においては前記水性 キャリヤー媒体に溶解しない。

好ましくは、前記ポリマーは非置換ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）　、モノ メチルＰＥＧ（ｍＰＥＧ）又はポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）であ り、そしてこのものは、ＰＥＧ、ｍＰＥＧ又はＰＯＧカルボン酸の４−ヒドロキ シ−３−ニトロベンゼンスルホン酸エステル又はＮ−ヒドロキシサクシンイミド エステルから形成されるアミド結合を介して前記蛋白質にカップリングする。

この発明の他の観点は医薬組成物の製造方法に関し、この方法は： （ａ）少なくとも１個の末端反応性基を有する水溶性ポリマーを用意し、ここで このポリマーはポリエチレングリコールホモポリマー及びポリオキシエチル化ポ リオールから成る群から選択されたものであり、ここで該ホモポリマーは置換さ れていないか又は一端においてアルキル基により置換されており、そして該ポリ オールは置換されておらず；（ｂ）　β−インターフェロン、インターロイキン −２及びイムノトキシンから成る群から選択された生物学的に活性で通常疎水性 であり水不溶性である蛋白質を前記ポリマーの反応性基と反応せしめることによ り水溶性であり生物学的に活性である選択的に接合した蛋白質を得；そして（ｃ ）この蛋白質を非毒性であり不活性な医薬として許容される水性キャリヤー媒体 中に配合する；ことを含んで成る。

第１図は、ＩＬ−２モル当り活性化されたＰＥＧ（ＰＥＧ”）０．１０．２０． ５０及び１００モルにおける反応から得られたＥＰＧ−修飾（ＰＥＧ化）ＩＬ− ２の分子量分析のための１４％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのデンシトメー ター分析スキャンを示す。

第２図は、２つの異るｐＨにおける未修飾ＩＬ−２に比較したＰＥＧ化ＩＬ−２ の溶解性を２００〜６５０ｎｍの吸光スキャンにより示す。

第３図は、マウスに静脈内注射した後のＰＥＧ化ＩＬ−２及び未修飾ＩＬ−２の 薬理動態（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）を示す。

第４図はマウスに皮下注射した後のＰＥＧ化ＩＬ−２及び未修飾ＩＬ−２の薬理 動態を示す。

第５図はＩＦＮ−βモル当りＰＥＧ”　０．１０．２０及び５０モルにおける反 応から得られたＰＥＧ化ＩＦＮ−βの分子量分析のための１４％非還元５ＤＳ− ポリアクリルアミドゲルのデンシトメーター測定スキャンを示す。

第６図は２つの異るｐＨにおける未修飾ＩＦＮ−βと比較したＰＥＧ化ＩＦＮ− βの溶解性を２００〜６５０ｎｍの吸光スキャンにより示す。

この明細書において使用する場合、蛋白質を記載する“通常疎水性で水不溶性” なる語は、約６〜８のｐＨすなわちおよそ中性の又は生理的ｐＨにおける室温及 び大気圧の周囲条件下で水又は水性媒体に不溶であるか又は難溶である蛋白質に 閏な生理的条件にかけられた場合にそれらの溶解性を増加せしめる様に作用する 。この発明の目的のため、溶解度は（１）分光光度法により測定される濁度、（ ２）超遠心分離（ここでは、非常に大きな凝集体の沈降速度ではなくモノマー蛋 白質の沈降速度が溶解度を示す）により測定されるＳ値、及び（３）サイズ排除 クロマトグラフィーにより測定される見かけの自然分子量（この場合、不溶性蛋 白質よりも可溶性蛋白質がこの値に近い）により試験することができる。これら の試験のそれぞれについて、溶解度を示すであろう正確な数値は蛋白質がその中 に配合される緩衝液のタイプ、該緩衝液のｐＨ１及び該緩衝液のイオン強度に依 存するであろう。

この発明においてインターフェロンβ及びインターロイキン−２は組織培養から 又は組換技法により、そして任意の哺乳類源、例えばマウス、ラット、ラビット 、霊長類、ブタ、及びヒトから得ることができる。ＩＦＮ−β、好ましくはヒ） ＩＦＮ−βについて命名される“組換β−インターフェロン”なる語は、天然Ｉ ＦＮ−βに匹敵する生物学的活性を有する、従来技術において記載されている組 換ＤＮＡ技法により調製される線維芽細胞インターフェロンに関する。一般に、 インターフェロンをコードする遺伝子はその天然プラスミドから切り出され、そ してクローン化するためのクローニングベクターに挿入され、そして次に発現ベ クターに挿入され、これは宿主生物、好ましくは微生物、そして最も好ましくは Ｅ、コリを形質転換するために用いられる。この宿主生物はある条件下でインタ ーフェロン遺伝子を発現せしめることによりＩＦＮ−βを生産する。さらに好ま しくは、ＩＦＮ−βは米国特許＆４，５８８．５８５に記載されているようなミ ューティン（ｍｕｔｅｉｎ）であり、このミューティンにおいては野性型又は天 然分子の１７位に通常存在するシスティンがセリン又はアラニンのごとき中性ア ミノ酸により置き換えられている。最も好ましくは、ＩＦＮ−βミューティンは ＩＦＮ−β５ｅｒ１７である。

ＩＬ−２、好ましくはヒトＩＬ−２について命名される“組換インターロイキン −２”なる語は、天然ＩＬ−２に匹敵する生物学的活性を有し、例えばタニグチ 等、Ｎａｔｕｒｅ、　３０２　：３０５−３１０　（１９８３）及びＤｅｖｏｓ 、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、旦：４３０７−４３２３　 （１９８３）により記載されている組換ＤＮＡ技法により調製されるインターロ イキン−２に関する。一般ニ、ＩＬ−２をコードする遺伝子はその天然プラスミ ドから切り出され、そしてクローン化するためのクローニングベクターに挿入さ れ、そして次に発現ベクターに挿入され、このものは宿主生物、好ましくは微生 物、そして特に好ましくはＥ、コリを形質転換するために使用される。この宿主 は発現条件下で外来遺伝子を発現せしめることによりＩＬ−２を生産する。

さらに好ましくは、ＩＬ−２は米国特許階４，５１８，５８４に記載されている 様なミューティンであり、このミューティンにおいては野性型又は天然分子の１ ２５位に通常存在するシスティンがセリン又はアラニンのごとき中性アミノ酸に より置き換えられている。これに代って又はこれと組合わせて、ＩＬ−２ミユー テインは野性型又は天然分子の１０４位に通常存在するメチオニンがアラニンの ごとき中性アミノ酸により置き換えられているものである。

好ましくは、ＩＬ−２は、天然ヒトＩＬ−２のアミノ酸配列のジスルフィド結合 を天然ヒトＩＬ−２のアミノ酸配列に少な（とも実質的に同一のアミノ酸配列を 有しそして天然ヒトＩＬ−２と共通の生物学的活性を有する蛋白質をコードする ＩＬ−２のヒトＣＤＮＡ配列により形質転換された微生物又は酵母により生産さ れる蛋白質である。アミノ酸配列の実質的同一とは、同一であるか又は合成蛋白 質と天然ヒ）ＩＬ−２との間の不都合な機能的相違を惹起しない１個又はそれよ り多くのアミノ酸の変更（除去、付加、置換）により異る配列を意味する。この 様な性質を有するＩＬ−２蛋白質の例にはタニグチ等、前掲；　Ｄｅｖｏｓ　％ 前掲；ヨーロッパ出願公開Ｎ１１９１，５３９及び隘８８．１９５　；米国特許 隘４．５１８，５８４　、前掲に記載されているものが含まれる。最も好ましく はＩＬ−２は５ｅｒｔｚＳＩ　Ｌ　−２％　ｄｅｓ−ａｌａ、ｓｅｒ＋ｚｓ　Ｉ 　Ｌ　−２、ｄｅｓ−ａｌａＩＩ　Ｌ　−２、、ｄｅｓ−ａｌａ、ａｌａ＋ｏａ 　Ｉ　Ｌ　−２、又はｄｅｓ−ａｌａ１ａｌａ＋ｏ４ｓｅｒ＋ｚｓＩＬ−２であ り、ここで”　ｄｅｓ−ａｌａ、はＩＬ−２のＮ−末端アラニン残基が除去され ていることを示す。

本発明の蛋白質の正確な化学構造は多数の因子に依存するであろう。分子中にイ オン化可能なアミノ基及びカルボキシル基が存在すれば、特定の蛋白質は酸性塩 もしくは塩基性塩として又は中性の形で得られるであろう。適切な環境条件下に 置かれた場合にそれらの生物活性を保持しているこれらすべての調製物は本発明 の蛋白質の定義に含まれる。さらに、蛋白質の一次アミノ酸配列は糖成分を用い る誘導体化（グリコジル化）により、又は他の補完的分子、例えばリピド、リン 酸基、アセチル基等により、そしてより一般的にサツカライドとの接合により付 加され得る。この様な付加の幾つかの観点は生産宿主の翻訳後プロセシング系を 介して達成され、他のこの様な変形はインビトロで誘導されるであろう。ともか く、この様な変形は、蛋白質の生物活性が破壊されない限り本発明の定義に含ま れる。言うまでもなく、この様な変形は、種々のアッセイにおいて蛋白質の活性 を増強し又は低下せしめることにより量的又は質的に生物活性に影響を与えるこ とができる。

しばしば、組換ＤＮＡを含有する形質転換された宿主細胞から生産されたＩＬ− ２及びＩＦＮ−βのごとき疎水性組換蛋白質は、細胞培養培地中に溶解するので はなく、細胞内に沈澱する。細胞内に生産された蛋白質は、精製された生物学的 に活性な材料に調製される前に、細胞破片から分離されそして細胞から回収され なければならない。この様な屈折体を単離するための方法においては、形質転換 された宿主微生物の細胞膜が破砕され、この破砕物から９９重量％以上の塩が除 去され、脱塩された破砕物が再破砕され、この破砕物に物質、例えば糖、例えば シュークロースが添加され、破砕物内の液中に密度又は粘度の勾配が形成され、 そして高速遠心分離すなわち約１０．０００〜４０．　ＯＯＯｘｇにより屈折体 が細胞破片から分離される。好ましくは、ダイアフィルトレージョン又は遠心分 離により破砕物から塩が除去され、そして液の密度を約１．１〜１．３ｇ／ａｆ に上昇せしめるためにシュークロースが添加される。

遠心分離段階の後、屈折体を含有するペレットを変性剤、例えばドデシル硫酸ナ トリウムにより可溶化し、生成した怒濁液を遠心し、そして蛋白質を含有する上 清を処理して蛋白質を単離する。蛋白質は適切な手段、例えば逆相高圧液体クロ マトグラフィー（ＲＰ　−１１ＰＬＣ）及び／又はゲル濾過クロマトグラフィー により上清から分離される。この様な分離の後、好ましくは蛋白質を酸化して、 その天然対応物に最も類似する配置にある組換蛋白質の高収量の生産を保証する 。この様な酸化はＺ、５ｈａｋｅｄ等の米国特許Ｎｎ４．５３０．７８７に記載 されている。酸化はまた、Ｋ、Ｋｏｔｈｓ等の米国特許隘４，５７２．７９８に 記載されている様に、可溶化された形の蛋白質を含有する水溶液を約５．５〜９ のｐＨにおいて、空気の存在下で、Ｃｕ−陽イオンを含有する少なくとも有効量 の酸化促進剤と反応せしめることにより行うこともできる。好ましい酸化促進剤 又は酸化剤はＣｕＣＩｔ　ｚ又は（０−フェナンスロリン）　２Ｃｕ＋　＋であ る。

酸化の後、蛋白質を場合によっては脱塩し、そしてＲＰ　−ＨＰＬＣ。

稀釈／ダイアフィルトレージョン、Ｓ−２００ゲル濾過クロマトグラフイー、及 び限外濾過技法によりさらに脱塩及び精製した後に、後に記載する様に活性化ポ リマーにより修飾する。

この修飾を行う時点は最終医薬製剤及び用途のために要求される蛋白質の最終純 度に依存するであろう。

この明細書において蛋白質の第３のクラスに適用するために使用する場合、“イ ムノトキシン”なる語は、抗体と細胞変性成分との接合体に関する。イムノトキ シンの細胞変性成分は細胞変性剤、細菌又は植物由来の酵素的に活性な毒素、あ るいはこの様な毒素の酵素的に活性な断片（“Ａ鎖”）を包含する。酵素的に活 性な毒素及びその断片の例にはジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合断片、 エキソトキシンＡ鎖〔シュードモナス・アエルギノーサー卯α澱吏狸ｍすｌ」シ １幻ユｎｏｓａ）から〕、リシンＡ鎖、アブリン（ａｂｒｉｎ）　Ａ鎖、モデフ シン（ｍｏｃｌｅｃｃｉｎ）　Ａ鎖、α−サルシン、アロイリテス・ホルディー （Ａｌｅｕｒｉｔｉｓ　ｆｏｒｄｉｉ）蛋白質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ ）蛋白質、フィトラフ力・アメリカーナ（ハハ旦匹印」懸賞−９促）蛋白質（Ｐ ＡＰＩ、ＰＡＰＩ［、及びＰＡＰ−３）モノルディカ・カランチア（ｍｏｎｏｒ ｄｉａ　ｃｈａｒａｎｔｉａ）インヒビ−ター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、ク ロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サポナリア・オフィシナリス（ｓａｐｏｎａｒｉａ　 ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビ−ター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）　、ミ トゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリフトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃ ｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、及びエノマイシン（ｅｎｏ ｍｙｃｉｎ）が含まれる。リシンＡ鎖、ジフテリア毒素の非活性断片、アブリン Ａ鎖、及びＰＡＰｎが好ましい。

ポリマーとの反応により修飾されるリシンＡ鎖が最も好ましい。

イムノトキシンにおいて使用される抗体は好ましくは、特定の疾患状態、例えば 癌、例えば乳癌、前立腺癌、直腸癌又は卵巣癌、黒色腫、骨髄腫等に対して向け られたモノクローナル抗体である。

抗体と細胞毒性成分との接合体は種々の２官能性蛋白質修飾剤を用いて行うこと ができる。この様な試薬の例にはＮ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルジ チオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）　、イミノチオレート（ＩＴ）、イミドエス テルの２官能誘導体、例えばジメチルアジビミデート・Ｈ（１、活性エステル、 例えばジサクシンイミジルスベレート、アルデヒド、例えばグルタルアルデヒド 、ビス・アジド化合物、例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン 、ビス−ジアゾニウム誘導体、例えばビス−（ｐ−ジアゾニウム−ベンゾイル） −エチレンジアミン、ジイソシアネート、例えばトリレン−２，６−ジイソシア ネート、及びビス−活性弗素化合物、例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニ トロベンゼンが含まれる。

この明細書において蛋白質に適用するために使用する場合、“選択的に接合した ′なる語は、主として反応条件、最終用途、ポリマーの分子量、及び使用される 特定の蛋白質に依存結合した蛋白質に関する。この残基は蛋白質上の任意の反応 性アミノ酸、例えば１個もしくは２個のシスティン又はＮ−末端アミノ酸基であ ることができるが、好ましくは反応性アミノ酸はリジンであってその遊離ε−ア ミノ基を介して活性化されたポリマーの反応性基に連結され、又はグルタミン酸 もしくはアスパラギン酸であってアミド結合を介してポリマーに連結される。

蛋白質の１つの好ましい態様においては、蛋白質の１個又は２個のアミノ酸残基 、好ましくは最大生物活性のためリジンを介して共有結合される。他の好ましい 態様においては、蛋白質は、蛋白質の循環寿命を一般に増加せしめる高度な置換 を伴って、蛋白質の１０個までのアミノ酸残基、好ましくはリジンを介して共有 結合される。

この発明の方法に従えば、通常は疎水性でありそして水不溶性である上記の３つ のタイプの蛋白質は、可溶化剤を使用することなく、特定のポリマーへの接合に より蛋白質を修飾することにより、好ましくは約５〜８、さらに好ましくは約６ 〜８、そして最も好ましくは６．５〜７．８のｐＨにおいて水性キャリヤー媒体 中に可溶化される。蛋白質がそのリジン残基を介して反応する場合、反応のｐＨ は好ましくは約７〜９、さらに好ましくは８〜９である。これらの蛋白質のこの 様な修飾の成功は、従来の水溶性酵素及びホルモンのポリマー修飾の使用から予 想することができない。

蛋白質が付加されるポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のホモポリマ ー又はポリオキシエチル化ポリオールであり、すべての場合においてポリマーが 室温において水溶性であることが条件となる。ポリオキシエチル化ポリオールの 例には、例えば、ポリオキシエチル化グリセロール、ポリオキシエチル化ソルビ トール、ポリオキシエチル化グルコース等が含まれる。

ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール骨格は、例えば動物及びヒトに おいてモノ−、ジ−トリーグリセライドとして天然に存在するのと同じ骨格であ る。従って、この分岐は体内における外来物質として必然的に見られることはな いであろう。

ポリマーはある特定の分子量を有することを必要としないが、しかし、例えば使 用される特定の蛋白質に依存して、分子量が約３００〜ｉｏｏ、ｏｏｏ　、さら に好ましくは３５０〜４０．０００の範囲であることが好ましい。

好ましくは、ＰＥＧホモポリマーは置換されていないが、しかしそれは一端にお いてアルキル基により置換されていてもよい。好ましくは、このアルキル基はＣ ７〜Ｃ４アルキル基、そして最も好ましくはメチル基である。最も好ましくは、 ポリマーはＰＥＧの非置換ホモポリマー、ＰＥＧのモノメチル置換ホモポリマー 、又はポリオキシエチル化グリセロールであり、約３５０〜４０，０００の分子 量を有する。

蛋白質はポリマー上の末端活性基を介して接合される。活性基を有するポリマー を、この明細書において活性化されたポリマー（又は活性化ポリマー）と称する 。活性基は蛋白質上の遊離アミノ基又は他の反応性基と反応する。しかしながら 、最適の結果を得るために選択される反応性基のタイプ及び量並びに使用される ポリマーのタイプは、該反応性基が蛋白質上の多過ぎる特に活性な基と反応する のを回避するために、使用される蛋白質に依存するであろう。これを完全に回避 することが不可能な場合、蛋白質の濃度に依存して蛋白質モル当り一般に約０． １〜１０００モル、好ましくは２〜２００モルの活性化されたポリマーを使用す ることが推奨される。特にＩＬ−２の場合、使用される活性化されたポリマーの 量はＩＬ−２のモル当り５０モル以下であり、そして最も好ましくは、最終的に 所望される特定の性質に依存してＩＬ−２のモル当り約２〜２０モルである。す なわち、最終量は、最適活性を維持し、同時に可能であれば蛋白質の半減期を最 適化する均衡である。好ましくは、蛋白質の生物活性の約５０％が維持され、そ して最も好ましくは１００％が維持される。

共有結合修飾反応は、不活性ポリマーを用いて反応性の生物学的に活性な材料の ために一般に使用される任意の適当な方法により、蛋白質上の反応性基がリジン 基である場合には好ましくは約ｐＨ５〜９において、行うことができる。一般に 、この方法は、活性化されたポリマー（少なくとも１個の末端ヒドロキシ基を有 する）を調製し、そしてその後で蛋白質を活性化されたポリマーと反応せしめる ことにより配合に適する可溶化された蛋白質を生成せしめることを含む。

上記の修飾反応は、１又は複数の段階を含む幾つかの方法により行うことができ る。一段階反応において活性化されたポリマーを生成せしめるために使用するこ とができる適切な修飾剤の例にはシアヌル酸クロリド（２、４、６−ドリクロロ ーＳ−）リアジン）及びシアヌル酸フルオリドが含まれる。

好ましい態様において、修飾反応は２段階において行われ、この場合まずポリマ ーを酸無水物、例えば無水コハク酸、又は無水グルタル酸と反応せしめることに よりカルボン酸を形成せしめ、そして次にこのカルボン酸を該カルボン酸と反応 することができる化合物と反応せしめることにより蛋白質と反応することができ る反応性エステル基を有する活性化されたポリマーを形成せしめる。この様な化 合物の例にはＮ−ヒドロキシサクシンイミド、４−ヒドロキシ−３−二トロベン ゼンスルホン酸等が含まれ、そして好ましくはＮ−ヒドロキシサクシンイミド又 は４−ヒドロキシ−３−二トロベンゼンスルホン酸が使用される。例えば、モノ メチル置換されたＰＥＧは上昇した温度、好ましくは約１００〜１１０℃にて４ 時間、無水グルタル酸と反応せしめることができる。次に、こうして生成したモ ノメチルＰＥＧ−グルタル酸を、カルボジイミド試薬、例えばジシクロへキシル カルボジイミド又はイソプロピルカルボジイミドの存在下でＮ−ヒドロキシサク シンイミドと反応せしめることにより活性化されたポリマー・メトキシポリエチ レン−グリコリル−Ｎ−サクシンイミジルグルタレートを生成せしめる。これは 次に蛋白質と反応することができる。この方法は、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋ　ｉ等、 Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

！、１．１７５−１８６　（１９８４）に詳細に記載されている。他の例におい て、モノメチル置換されたＰＥＧを無水グルタル酸と反応せしめ、次にジシクロ へキシルカルボジイミドの存在下で４−ヒドロキシ−３−二トロベンゼンスルホ ンａ　（ＩＮＳＡ）と反応せしめることにより活性化されたポリマーを生成せし めることができる。ＨＮＳＡは、Ｂｈａ　ｔｎａｇａｒ等、ム狙月Ａす」−Ｓ　 ｎｔｈｅｓｉｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ 　ｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｅｖｅｎｔｈ担明Ｌ■且り旦胛↓回亘ヨ壮」ド±＊ｍ　 、　Ｒｉｃｈ等（編集）（ピースケミカル社、ロックホードＩ　Ｌ、　１９８１ ）　９７−１００頁、並びにＮ　ｉ　ｔｅＣｋ　ｉ等、肛肢４匹鳳吐吐り肢虱り 旦ユ江肋」匹虹匣しく米国微生物学会：　１９８６）　Ｎｏｖｅｌ　Ａｇｅｎｔ 　ｆｏｒ　Ｃｏｕｐｌｉｎｇ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃＰ、ｅｐｔｉｄｅｓ　ｔｏ　 Ｃａｒｒｉｅｒｓ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、”に開示されて いる。

エステル結合はアミド結合に比べて化学的及び生理学的に安定でないため、エス テルの同時的生成を伴わないでカルボン酸又はアミドを生成する接合反応生化学 的転換を用いるのが好ましいであろう。

こうして修飾された蛋白質は次に非毒性の不活性な医薬として許容される水性キ ャリヤー媒体中に、好ましくは約３〜８、さらに好ましくは６〜８のｐＨにおい て配合する。インビトロでの適用のため、例えば診断目的で使用されるイムノト キシンのため、適用及び製剤化の態様は臨界的ではない。培養又はがん流媒体と 相溶性の水性製剤が一般に使用されるであろう。療法のためにインビボで使用さ れる場合、無菌生成物は、混合物が再溶解された場合に医薬として許容されるｐ Ｈをもたらす量の水性緩衝液中に溶解した蛋白質混合物から成るであろう。この 媒体には場合によってはマンニトールのごとき水溶性キャリヤーが添加されるで あろう。現在製剤化されている未修飾ＩＬ−２は４℃において少なくとも６ケ月 間安定である。

製剤中の蛋白質の薬量レベルは前臨床試験において得られるインビボ効力データ ーに依存し、そして主として使用される蛋白質及び最終用途に依存するであろう 。

製剤を凍結乾燥する場合、この凍結乾燥混合物は、バイアル中に常用の非経口水 性注射剤、例えば蒸留水を注入することにより再溶解せしめることができる。

上記の様にして調製された再溶解された製剤は、ヒト又は他の動物゛に、これら に治療をもたらすのに療法的に効果的な量（すなわち患者の疾患状態を除去し又 は緩和せしめる量）において非経口投与するために適当であり、療法のタイプは 蛋白質のタイプに依存する。例えば、ＩＬ−２療法は種々の免疫調節症状、例え ばＴ細胞変異誘発、細胞変性Ｔ細胞の誘導、ナチュラルキラー細胞活性の増強、 ＩＦＮ−ｒの誘導、細胞性免疫の回復又は増強（例えば、免疫不全症状の治療） 、及び細胞性抗腫瘍活性の増強のために適当である。

ＩＬ−２の直接投与に代えて、ＩＬ−２は用いられる免疫原において、単離され リンホカイン−活性化されたリンパ球と一緒に、医薬として許容されるキャリヤ ー中で投与することができ、この場合リンパ球は腫瘍を有するヒトにＩＬ−２と 共に投与された場合腫瘍と反応する。この方法は、Ｓ、Ｒｏｓ−ｅｎｂｅｒｇ等 、Ｎｅｗ　Ｅｎ　１ａｎｄ　Ｊｏｕｒｎｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　（１９ ８５）＋３１３　：１４８５−１４９２により十分に記載されている。

ＩＦＮ−β療法は抗癌、抗ウィルス及び抗乾唐治療のために適当である。ＩＦＮ −βなんらかの効果を示す特定の癌にはリンパ腫、骨髄腫、ヘアリー細胞白血病 、並びに性病及びライノウィルスを含む幾つかのウィルス性疾患が含まれる。

イムノトキシン療法は、それに対する標的抗体が有効である疾患、通常は癌に対 して適当である。特に、イムノトキシンは乳癌のごとき癌に向けられる。

イムノトキシンの投与量及び使用方法は、例えば薬剤の薬理動態、癌の種類及び その集団、ポリマーのタイプ及び長さ、特定のイムノトキシンの性質、例えばそ の療法係数、患者、並びに患者の病歴に依存するであろう。ＩＬ−２及びＩＦＮ −βの投与量及び使用方法は同様に例えば薬剤の薬理動体、疾患の種類、ＩＬ− ２又はＩＦＮ−βの性質、患者、笈び患者の病歴に依存するであろう。例えば、 異る修飾されたＩＬ−２蛋白質はミ異る投与経路のために有利な異る薬理動態的 及び療法的性質を有すると予想される。長期に作用する薬剤は３〜４日ごと、１ 週間〜２週間ごとに１回投与すれば足りるであろう。クリアランス速度は、例え ば付加するポリマーのタイプ及びポリマーのサイズを変えることによって、患者 の特定の要求に合致するように最終的柔軟性を与えることによって変更すること ができる。

この発明をさらに説明する次の例において、特にことわらない限りすべての部及 び％は重量により、すべての温度は℃ＰＥＧ化されたインターフェロン−２（Ｉ Ｌ−２）の調製Ａ、ＰＥＧ−エステルの調製 商業的に入手可能なモノメチルＰ　Ｅ　Ｇ−５０００をまず１゛００℃〜１１０ ℃にて４時間にわたりグルタルアルデヒドと反応せしめることにより、又はＡｂ ｕｃｈｏｗｓｋｉ等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ−且ｂ」ユ、７ ，１７５−１８６（１９８４）の方法と同様の方法により、分子量５０００のＰ ＥＧの線状のモノメチル置換されたエステルを得ることができる。生ずるＰＥＧ −グルタレートを、Ａｂｕｃｈ−ｏｗｓｋｉ等、前掲、１７６頁に詳細に記載さ れている様にして、ジシクロへキシルカルボジイミドの存在下でＮ−ヒドロキシ サクシンイミドと反応せしめる。生ずる生成物はメトキシポリエチレングリコー ルＮ−サクシンイミジルグルタレートであり、以後ＰＥＧ”と称する。

同様にして、無水コハク酸をモノメチルＰ　Ｅ　Ｇ　−５０００と反応せしめ、 そして生ずるＰＥＧ−サクシネートをＮ−ヒドロキシサクシンイミドと反応せし めた。生ずる生成物はメトキシポリエチレングリコールＮ−サクシンイミジルサ クシネートである。

他の段階において、そして類似の方法により、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドの 代りにＨＮＳＡを使用してＰＥＧカルボン酸エステル−ＨＮＳＡを調製した。こ のエステルの調製はＢｈａｔ−ｎａｇａｒ等、前掲、及びＮ１ｔｅｃｋｉ等、前 掲に記載されている。

ＰＥＧカルボン酸エステル−ＨＮＳＡはこの例及び後続の例に記載する方法にお いて活性化されたＰＥＧとして使用することができる。

Ｂ、ＩＬ−２へのＰＥＧ”の接合 この例のため、米国特許隘４．５１８．５８４及び４，５３０．７８７（前掲） に記載されている様にして調製された、ＲＰ　−ＨＰＬＣ精製された組換ｄｅｓ −ａｌａｎｙｌ、５ｅｒＢｓ　Ｉ　Ｌ　−２（１２５位のシスティンがセリンに より置き換えられており、そしてＮ−末端アラニン残基が除去されている）、又 は前記の製造方法からのダイアフィルトレージョン後のｄｅｓ−ａｌａ、、ｓｅ ｒ＋ｚｓ　Ｉ　Ｌ　−２を用いた。１−の緩衝液（硼酸ナトリウム、ｐＨ９；０ ．１％５ＤＳ）中０．５■のこの精製されたＩＬ−２に、ＩＬ−２モル当り０， ２．５゜５．１０．２０．５０及び１００モルのＰＥＧ”のモル比で、新しく調 製した水性ＰＥＧ“を添加した。十分に混合した後、この溶液を室温（２３°Ｃ ）にて３０分間攪拌した。各反応混合物をセファデックスＧ−２５カラム）ファ ルマシアに適用して低分子量種からＩＬ−２及びＰＥＧ−Ｉ　Ｌ−２を分離した 。

セファデックスＧ−２５カラムはＳＤＳを含有しない１０ｍＭ硼酸ナトリウム（ ｐＨ９）中で使用し、そして蛋白質からＳＤＳのほとんどを除去するためにも役 立てた。はとんどの未修飾のＩＬ−２及びＳＤＳは、混合床イオン阻止樹脂（ビ オ−ラドＡＧ１１Ａ８）に反応混合物を添加することによっても除去した。ＰＥ Ｇ化ＩＬ−２サンプル中の残留ＳＤＳのレベルは、Ｒ，５ｏｋｏｌｏｆｆ及びＲ ，Ｆｒｉｇｏｎ、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋１１８　＋１３８　１４１１ ９８１）により記載されたアクリジン−オレンジ試験により測定した場合、蛋白 質■当り３〜７ｎのＳＤＳであった。

Ｃ０修飾されたＩＬ−２の精製 疎水性交換クロマトグラフィー（ビオ−ラド；バイオゲル−フェニル−５−四） を用いて、精製されたＰＥＧ化ＩＬ−２を得た。減少する塩を用いる直線状グラ ジェント〔溶剤Ａは５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）中１．７　Ｍ　（ＮＨ ４）ＺＳＯ４である；１５分間で１ｏｏ−ｏ％のＡ）は、ＰＥＧ化ＩＬ−２と未 修飾ＩＬ−２の良好な分離をもたらした。溶剤Ｂへの１０％エタノールの添加、 及び水浴中でのカラムの保持がそれぞれ、ＰＥＧ化ＩＬ−２の回収及び分離を顕 著に増強した。両分のアリコートを、Ｇ１１１１ＳＩＳ−等、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ ｌ、１２０　、２０２７−２０３２　（１９７Ｂ）に一般に記載されている方法 により、ＩＬ−２の生物活性（細胞増殖）についてアッセイした。

■−↓ ＰＥＧ化ＩＬ−２の特徴付け Ａ１種々のＰＥＧ”対ＩＬ−２のモル比を用いる反応からの修飾されたＩＬ−２ 生成物のサイズの特徴付けＩＬ−２モル当り０．１０．２０．５０又は１００モ ルのＰＥＧ″″を含む、例Ｔ、Ａ、に記載した反応からの生成物の５Ｏ５−ＰＡ ＧＥ　（１４％）は、ＰＥＧ“とＩＬ−２のモル比の増加と共に修飾の程度が増 加することを示した。第１図に示す様に、島津２波長スキャンナを用いて、種々 のゲルレーンのデンシトメータースキャンを得た。ｌ０ＰＥＧ’″／ＩＬ−２サ ンプル、及び２０ＰＥＧ”／ＩＬ−２サンプルは、少量の未修飾ＩＬ−２のほか に約２５ｋｄの見かけ分子量を有する明瞭な１種を示した。５０ＰＥＧ”／ＩＬ −２及び１００　Ｐ　Ｆ、　Ｇ　”／ＩＬ−２においては、高分子量領域に、極 度にＰＥＧ化された蛋白質に特徴的な汚れ（ｓｍｅａｒ）が存在し、そして未修 飾ＩＬ−２は存在しなかった。

ＴＳＫ　−２５０カラム（ビオ−ラド；２５Ｘ　Ｏ，４ａｎ、　Ｐ　Ｂ　Ｓ中） 上でのＰＥＧ−ＩＬ−２溶液のサイズ排除は、ＰＥＧ”対ＩＬ−２の比率の増加 に伴い修飾が増加するという他の証明を与えた。

Ｂ、修飾の程度の関数としてのＰＥＧ化ＩＬ−２の生物活性ＩＬ−２のモル当り ０　、２．５　、５．１０，２０．５０及び１００モルのＰＥＧ”を含有するＩ Ｌ−２ＰＥＧ化反応の前記のビオゲル−フェニルカラムからの両分を、例１．　 Ｃ，に記載したＩＬ−２細胞増殖バイオアフセイによりアッセイした。結果を第 １表に増加的に示す。より多くのアミノ基が修飾されるに従って、ＩＬ−２の不 活性化は徐々に増加した。１００ＰＥＧ”／ＩＬ−２のモル比で行われた反応に おいて、修飾されたＩＬ−２生成物の比活性は未修飾ＩＬ−２のそれの約１０％ に有意に低下した。

第−」−二表 修飾の程度の関数としてのＰＥＧ化ＴＬ−２の生物活性１、ＯＰＥＣ”／ＩＬ− ２７，３６±４．８３　Ｘ　１０’２、　２．５ＰＥＧ”／ＩＬ−２９，２０± ３．４５Ｘ１０’３、　５　ＰＥＧ”／ＩＬ−２１１，５０±２．３０　Ｘ　１ ０’４、　１０　ＰＥＧ”／ＩＬ−２１０，３５±４．３７　Ｘ　１０’５、　 ２０　ＰＥＧ“／ＩＬ−２７，８２±２．７６　Ｘ　１０”６、　５０　ＰＥＧ ”／ＩＬ−２３，４５±２．３０Ｘ　１０’７、　１００　ＰＥＧ”／ＩＬ−２ ０，６９±０．２３　Ｘ　１０’＊これらの数値はｒＬ−２バイオアツセイにお ける大きな変動を反映している。

Ｃ０未修飾ＩＬ−２と比較したＰＥＧ化ＩＬ−２の溶解度修飾反応、及びこれに ’１ｔｔｔ　＜　Ｓ　Ｄ　Ｓの除去をもたらすセファデックスＧ−２５クロマト グラフイーの後、ＰＥＧ化ＩＬ−２のｐｕを６．５〜７に低下せしめた。低ＳＤ Ｓ中での未修飾ｒＬ−２はｐＨ５〜７において沈澱した。第１表中のＰＥＧ”／ ＩＬ−２の量について低分子比において行われた反応からの修飾されたＩＬ−２ は、ＡＧ１１Ａ８樹脂又はビオゲル−フェニル（ＨＰＬＣ）クロマトグラフィー によりその後除去され得る未修飾のＩＬ−２のために、いくらかの濁りを有して いた。ＰＥＧ”／ＩＬ−２の高分子比からの修飾されたＩＬ−２の溶液は長時間 透明なままであった。ｐＨｔ’ＦＩ整された溶液を超遠心分Ｒ（５０，００Ｏｒ ｐｍ、５Ｗ６０ローター、５℃にて１２時間）した。

上清を取り出し、そして貯蔵した。　５ＯＳ−ＰＡＧＥによる残渣及び上清の両 者の７リコートの分析は、残渣が未修飾ＩＬ−２であり、他方上清がＰＥＧ化！ Ｌ−２を含有することを示した。ＳＤＳ又は他の変性剤の不存在下中性ｐＨの水 性媒体中でのＰＥＧ化ＩＬ−２及び未修飾ＩＬ−２の溶解度の劇的な差は第２図 の吸光スキャン（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ　８４５０Ａスペクトロフオ トメーター）により示される。特徴的スペクトルの喪失により示される様に、未 修飾ＩＬ−２はｐＨ７において溶液から沈澱する。

精製されたＰＥＧ化Ｉ　Ｌ　−２（ＨＰＬＣ−フェニルカラムの後）は、洗荊又 は変性剤を含まない水性緩衝液中にｐＨ７において完全に可溶性であった。精製 されたＰＥＧ化ＩＬ−２は、試験された期間（少なくとも５ケ月間）にわたり溶 液のままであり、そしてその生物活性を維持した。ＳＤＳを伴わないで中性ｐｌ （において可溶性であったＰＥＧ化ＩＬ−２は、０．１％のＳＤＳの存在下での 未修飾のＩＬ−２に比較して次の比活性を有していた。

０　７．３６　ｘ　１０’ １０　１２．８８Ｘ１０’ ２０　Ｂ、５１ＸｌＯ’ １０ＰＥＧ”／ＩＬ−２及び２０ＰＥＧ”／ｆＬ−２のＮＫ活性（ナチュラルキ ラー活性；米国特許ＩＩｋ１４．５１８．５８４に記載されている）、及びＬＡ Ｋ活性〔リンホカイン−活性化キラー活性；　Ｇｒｉｍ−等、ムｈＬムム、　１ ５５　、１８２３−４１（１９８２）に記載されている）は未修飾ＩＬ−２のそ れらと同一であった。未修飾ＩＬ−２に対して２０倍過剰の遊離ＰＥＧ　（４に ダルトン）の添加はＮＫ又はＬＡＫ活性に影響を与えなかった。

Ｄ、ｐＨの関数としてのＰＥＧ化ＩＬ−２の安定性ＩＬ−２のモル当り５０モル のＰＥＧ”を用いる修飾反応からのＰＥＧ化ＩＬ−２を、種々のｐ）ｌで、室温 にて３時間インキュベートし、そして次に１４％ＳＯＳ　−ＰＡＧＥによりＩＬ −２ポリペプチドからのアミド結合ＰＥＧの加水分解について測定した。ＰＥＧ 化ＩＬ−２を、Ｏ，１％のトリフルオロ酢酸を含有する１０％アセトニトリル（ ｐＨ２，５）中に３倍に稀釈し、そしてさらにｐＨ７，５、１０、及び１１にて インキュベートした。アルカリ性ｐＨはｐ）１９の硼酸塩緩衝液にＮａＯＨを添 加することにより達成された。これらの条件下でｐＨ１１より低いｐ）において 加水分解の証拠は得られなかった。しかしながら、ＰＨＩＩにおいてＰＥＧ化Ｉ Ｌ−２は加水分解に感受性であった。室温（２０〜２３℃）にて３時間にわたり ＰＥＧ化ＩＬ−２が安定であるという観察は、類僚の条件下で行われるＲＰ　− １１ＰＬｃ段階を含むＩＬ−２回収方法を記載する、１９８６年２月１１日に与 えられた米国特許Ｎ１４．５６９．７９０の観点から特に有用である。

Ｅ、マウスにおいて未修飾１Ｌ−２と比較したＰＥＧ化ＩＬ−２の薬理動態 １、静脈内投与 未修飾ＩＬ−２及びＰＥＧ化ＩＬ−２の２種類の調製物の薬理動態データを、合 計３６匹のマウスにおいて各マウスにＤ５Ｗ（水中５％デキストロース）中１２ ．５ｘの蛋白質の静脈内投与の後に得た。注射のために使用したサンプル（１０ ０ｍポルス）は下に示す通りであり、そして下記の活性を有していた。

Ａ、未修飾ルー２（ロットＬＰ−２６３）　５．９８±０．４６　Ｘ　１０’Ｂ 、ＰＥＧ化ＩＬ−２（１０モルＰＥＧ’／　１２．１９±４．１４Ｘ１０”１モ ルＩＬ−２の反応から） サンプルＡは、最終濃度０．１％のＳＤＳを含有するＤＳＷ中での注射により材 料が凝集しない様にされた。ＰＥＧ化！Ｌ−２サンプル（Ｂ及びＣ）にはＳＤＳ を含めなかった。

これらは通常の水性条件下で凝集することなく完全に溶解したからである。

１２匹の雌性Ｂａ１ｂ／Ｃマウスの３群の各マウスに、３種類のサンプルの１つ を尾部静脈に注射し、そして１．５分間目にすべての動物から眼窩後から採血し た。注射の後種々の時間に１０Ｑ１１１の血液サンプルを眼窩後からヘパリン処 理した毛細管に取り出した。遠心分離（１分間）によりすぐに血漿を調製し、そ してアリコートを例１．Ｃ，に記載したバイオアッセイのためのアッセイ媒体中 に稀釈した。第３図は未変性ＩＬ−２及びＰＥＧ化ＩＬ−２サンプルの２つの調 製物の薬理動態を示す。第３図からの、ＩＬ−２の最初の分布の半減期（５０％ 生物活性）は次の通りである。

Ａ、未修飾ＩＬ−２２分 Ｂ、’ＰＥＧ化ＩＬ−２（ＩＯＰＥＧ”／ＩＬ−２）１０分すなわち、ｌ０ＰＥ Ｇ“／ＩＬ−２を用いるＩＬ−２のＰＥＧ化は、細胞増殖アッセイにより測定し た場合、マウスにおける循環半減期の５倍の延長をもたらし、そして５０ＰＥＧ ”／ＩＬ−２を用いる場合、循環半減期の一層劇的な１７倍の延長をもたらす。

未修飾ＩＬ−２、ＰＥＧ化Ｉ　Ｌ−２（１０−ＥルＰＥＧ”１モルＩＬ−２（７ ）反応から）、及びＰＥＧ化ＩＬ−２（５０モルＰＥＧ”１モルＩＬ−２の反応 から）を、ＩＬ−２のタイプ当り１２匹のマウスに静脈内注射した場合、ＩＬ− ２の注射された合計ユニットに対する１、５分間目に回収された生物活性の％は 次に示す通りである。

Ａ、未修飾ＩＬ−２５７ Ｂ、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２（ＩＯＰＥＧ”／ＩＬ−２）７２Ｃ，ＰＥＧ修飾ＩＬ− ２（５０ＰＥＧ″’／ＴＬ−２）　１００これらの結果は、ＰＥＧ”による修飾 の程度にょるＩＬ−２生物活性の回収の％の劇的な増加を示し、ＩＬ−２のモル 当り５０モルのＰＥＧ”の修飾レベルにおいて１００％の回収が生ずる。

２、皮下投与 無菌水中１２．５ｇの蛋白質を４８匹のマウスに皮下投与した後に未修飾ＩＬ− ２及びＰＥＧ化ＩＬ−２の薬理動態的データーを得た。マウスにおいて肩甲骨皮 下注射に使用されたサンプル（１個の１００バボルス）は未修飾ＩＬ−２、ＰＥ Ｇ化ＩＬ−２（２０モルＰＥＧ”１モルＩＬ−２反応からの）、及びＰＥＧ化Ｉ Ｌ−２（５０モルＰＥＧ”１モルＩＬ−２反応からの）を含有した。３種類すべ てのサンプルは０．１２５■／ｍ！であった。未修飾ＩＬ−２サンプルは、中性 ｐＨの水性溶液中に不溶性であるため、０．１％のＳＤＳを含有した。

種々の時点において、１００Ｉのサンプルを眼窩後よりヘパリン処理したチュー ブに前記の様にして取り出した。血漿を調製し、そしてバイオアッセイのために アリコートを取った。

４５分間の時点では３種類のサンプルのそれぞれについて１６匹のマウスを用し た。他のすべての時点においては、サンプル当り２〜５匹のマウスを用いた。第 ４図は、マウスへの皮下注射の後の未修飾ＩＬ−２及びＰＥＧ化ＩＬ−２の薬理 動態を示す。下に示す様に、注射された全ＩＬ−２活性の最大％がＰＥＧ化分子 について非常に高く血漿中に見出されるのみならず、ＰＥＧ化ＩＬ−２のクリア ランス速度は有意に低下した（第４図を参照のこと）。

Ａ、未修飾　０．５ Ｂ、ＰＥＧ化ＩＬ−２（２０ＰＥＧ”／ＩＬ−２）７．０Ｃ，ＰＥＧ化ＩＬ−２ （５０ＰＥＧ′″／ＩＬ−２）　１７．５Ｆ、ＰＥＧ化ＩＬ−２及び未修飾ＩＬ −２の注射の後のラビットにおける免疫反応 この研究では、各群４頭のラビットからなる３群を用いた。

Ａ群は、前記の製造方法からの、未修飾の、ダイアフィルトレージョン後のｄｅ ｓ−ａｌａｎｙＬｓｅｒ＋ｔｓ　Ｉ　Ｌ　−２（ロフトＬＰ３０４）を注射され たラビットであった。Ｂ群は、上記の様にして。２０倍過剰のＰＥＧ”を用いて ロフトＬＰ　３０４から調製したＰＥＧ／ＩＬ−２を注射されたラビットであっ た。０群は、５０倍過剰のＰＥＧ”を用いてやはりＬＰ　３０４から調製しＰＥ Ｇ／ＩＬ−２を注射されたラビットであった。各ＩＬ−２調製物は注射の前に無 菌水で稀釈した。

雌性ニュージランド白色ラビット（体重約２．５ｋｇ）のそれぞれに、部位当り ０．５＋ｆ（１〜２Ｘ１０’ユニツト）の該当するＩＬ−２又はＰＥＧ化ＩＬ− ２を２部位において筋肉内注射した。

種々の時間間隔において、すべてのラビットの耳縁の静脈又は耳の中央の動脈か ら採血した。血液を凝固せしめ、そして遠心して血清を得た。血清のアリコート をＩＬ−２アッセイ媒体中に５倍に稀釈し、そして例１．Ｃ，の細胞増殖アッセ イによりバイオアッセイした。筋肉内注射後の循環血中のＩＬ−２及びＰＥＧ化 ＩＬ−２の薬理動態プロフィールはマウスについて得られたそれに類似していた 。

上記の注射の後１週間目に、すべてのラビットに、該当するＩＬ−２又はＰＥＧ 化ＩＬ−２を用いて第２シリーズの筋肉内注射を行った。

最初の注射の後３週間目に、すべてのラビットに該当する未修飾ＩＬ−２又はＰ ＥＧ化ＩＬ−２を１〜２×１０４ユニツト／　ｋｇで追加した。標識試薬として ホースラディツシュパーオキシダーゼが連結されたヤギ抗ラビットＩｇＧを用い そして基質としてオルトフェニレンジアミンを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより 、規則定間隔で血清（上記の様にして得られた）中で抗原特異的抗体反応を測定 した。４９２ｎｍにおける吸光を測定した。グイナテック・ラボラドリース社か ら得られるポリスチレン及びポリビニルの２つのタイプのＥＬＩＳ八ブへ−ト上 に抗原をコートした。血清に対して試験した抗原は未修飾ＩＬ−２（ＬＰ　３０ ４）　、ＰＥＧ／Ｉ　Ｌ−２（２０倍過剰ＰＥＧ”）及びＰＥＧ／ＴＬ−２（５ ０倍過剰ＰＥＧ”）であった。最初の注射の後５週間目の結果は次の通りであっ た。

」　これらのラビットはすべて、ＥＬＩＳＡにおいて１０４〜１０’への稀釈に おいて見られるＩＬ−２特異的ＴｇＭを生じさせていた。４ラビツトの内の２頭 （Ａ３及びＡ４）はまた、１０“稀釈まで高いＩＬ−２特異的ＩｇＧを有してい た。ラビットＡ２はわずかに低いレベルのＩｇＧを有していた。ラビットＡ１は 最低のＩＬ−２特異的１ｇＧを有していた。

■　これらのラビットは検出し得るＩＬ−２特異的１ｇＧを生じさせなかった。

すべてが、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて１０２ｆ４釈まで検出されるＩＬ−２特 異的ＩｇＭを有していた。これらのアッセイを、ＥＬＩＳＡ７°レート上の抗原 としてＰＥＧ／ＩＬ−２を用いて反復し、同じ結果が得られた。

」　これらのラビットは検出し得るＩＬ−２特異的１ｇＧを有しなかった。すべ てが、抗原としてＰＥＧ／ＩＬ−２を用いて行われたＥＬＩＳＡアッセイにおい て１０２稀釈まで検出されるＩＬ−２特異的ＩｇＭを有してした。

これらの研究は、ＰＥＧ／ＩＬ−２が抗原である場合に抗原特異的ＩｇＧ反応が 低下し、他方未修飾ＩＬ−２を用いる場合、抗原特異的１ｇＧが時間と共に出現 することを示している。

Ｇ、　Ｂａ１ｂ／ｃマウスにおけるＭｅｔｈＡを用いるＰＥＧ化ＩＬ−２の効果 の検討 マウスに毎日投与するこの実験においては、未修飾のＩＬ−２がわずかしか効果 を示さない投与量においてＭｅｔｈＡ肉腫に対して非常に効果的であった。

６６医のＢａ１ｂ／ｃマウスのそれぞれに、スローン・ケツタリングから得られ る６Ｘ１０’のメタコランセン−Ａ（Ｍｅｔｈａ−ｃｈｏｌａｎｔｈｅｎｅ−Ａ ）　（ＭｅｔｈＡ）マウス線維肉腫セルラインをＢａ１ｂ／ｃマウス中の腹水か らの細胞懸濁液として、首の背部に皮下注射した。マウスを同様な数の大形、中 形及び小形の腫瘍（５〜１００ｎ）を有するの３群に分けた。次に、３群に試験 物質を腹腔内注射した。Ａ群には０．０１■／ｍＺのＰＥＧ　（モノメチル５０ ００）を含有する０、　５　ｍｌのＰＢＳを与えた。Ｂ群には１０％のウシ血清 ＋ＩＬ−２に対して２０倍過剰のＰＥＧ”を用いて得られた３ＬｇのＰＥＧ”／ ＩＬ−２を含有する組織培養培地０．’５ｍｌを与えた。０群には１０％のウシ 血清＋前記の未修飾のダイアフィルトレージョン後の３℃１ｇのｄｅｓ−ａｌａ 、、ｓｅｔ、、５ＩＬ−２を含有する組織培養培地を与えた。

３群に７日間にわたり毎日注射した。４日目にマウスの重量を測定し、そしてそ れらの腫瘍の体積を測定した。

８日目には、３群の体重が異っていた。

ＰＥＧ対照　２６．０ｇ ＰＥＧ”／　Ｉ　Ｌ　−２２１，１ｇ ＩＬ−２２３，６ｇ ０日　６日　８日　９日 Ｂ群（ＰＥＧ／ＩＬ−２）　１２９±４２　４２４±１２９　３４１±２１８　 ３５３±１４８Ｃ群（ＩＬ−２）　１３０±６３　２５２３±８０８　２０３４ ±９９７　４４０５±１４７１８日目において、配合されたＩＬ−２により処理 されたマウスは６４％の腫瘍増殖阻害を示した。しかしながら、９日目までに阻 害は４０％に過ぎず、そして腫瘍は急速に成長した。これらの群は苦痛を除去す るために殺した。ＰＥＧ”／ＩＬ−２で処理されたマウスは８日目及び９日目の 両方において９４％の腫瘍の増殖阻害を示した。これらのマウスもまた苦痛を除 去するために殺した。

分子量３５０のＰＥＧによるＰＥＧ化ＩＬ−２の調製Ａ、ＰＥＧ−エステルの調 製 分子量３５０のＰＥＧの線状モノメチル置換エステルを次の方法により得た。

アルトリフチ・ケミカル社製の合計１０ｇのモノメチルＰＥＧ３５０を１１０℃ に加熱した。これに１４．３ｇの無水コハク酸（アルトリフチ）を加えた。この 混合物を１１０℃にて一夜攪拌し、そして次に冷却した。ベンゼンを添加し、そ してベンゼン溶液を濾過した。試薬を濾液から単離した。

得られたＰＥＧ−３５０−サクシネート２ｇを２５−のジメチルホルムアミド、 ３．５３１ｇのジクロロへキシルカルボジイミド、及び例Ｉに記載した様にして 調製した６、９１４ｇのＨＮＳＡと混合した。この混合物を室温にて４８時間暗 中で攪拌し、そして濾過した。この濾液に１１のエーテルを徐々に添加して試薬 を沈澱せしめた。合計１５０■の粗混合物を１ｍｌの水に加え、遠心し、そして デカントした。上清を水中セファデックスＧ−２５カラムに適用し、そして適切 な両分をプールし、そして凍結乾燥した。得られる精製された生成物を今後ＰＥ Ｇ”と称する。

Ｂ、ＩＬ−２へのＰＥＧ”の接合 この例のために、米国特許隘４，５１８，５８４及び隘４．５７２．７９８（前 掲）に記載されている様にして調製されたｄｅｓ−ａｌａ、ｓｅｒ、、５ＩＬ− ２を使用した。１．０　ｍｌの緩衝液（０，１Ｍ硼酸ナトリウム、ｐＨ９，０， １％５ＤＳ）中０．４■のこの精製されたＩＬ−２に、１モルのＩＬ−２当り１ ０モルのＰＥＧ”のモル比で、新しく調製された水性ＰＥＧ”を加えた。十分に 混合した後、この溶液を３２℃にて１５分間、１時間、５時間及び２０時間攪拌 した。各時点において１２５１１１の溶液を取り出し、そして４０Ｊ１１の１■ ／ｍＺε−Ｎ）１２−カプロン酸に加え、そして４℃にて貯蔵した。

Ｃ，ＰＥＧ化ＩＬ−２の特徴付は 反応Ｂからの生成物の５Ｏ５−ＰＡＧＥ　（１４％、還元）分析は、１５分間ま でに実質的な量の修飾が生じたことを示した。

例１．Ｃ，において前記したＩＬ−２細胞増殖バイオアフセイによりインビトロ で試験した場合、ＰＥＧ−３５０１Ｌ−２は活性であった。

Ｄ、マウスにおいて未修飾ＩＬ−２と比較したＰＥＧ化ＩＬ−２の薬理動態 例１１．　Ｅ、において前記したのと同様にして、薬理動態分析のため、ＰＥＧ −３５０ＩＬ−２、及び未修飾ＩＬ−２をマウスに静脈内注射した。結果を第■ 表に示す。

第−ニー表 ＰＥＧ化Ｉ　Ｌ−２（ＰＥＧ−３５０１Ｌ−２）　（７）！理動態ＰＲＭＰ標準 ユニット″／回収％ ト×２０倍稀釈）である。

＊＊　カッコはその群中に４匹より少数のマウスがいる場分子量４００及び１０ ００ｆ７）　Ｐ　Ｅ　Ｇを用いるＰＥＧ化ＩＬ−２（７）８周製 分子量４００及び１０００の線状ジヒドロキシ（非置換）ＰＥＧのＩＬ−２誘導 体を、それぞれ非置換ＰＥＧ−４００及びＰＥＧ−１０００を用いて例■に記載 した方法を一般的に使用して調分子量１０，０００　、２０，０００及び３５， ０００（７）　Ｐ　Ｅ　Ｇ　ニよるＰＥＧ化ＩＬ−２の調製 分子量１０．０００の線状モノメチル置換ＰＥＧのＩＬ−２誘導体を、ユニオン カーバイド製Ｐ　Ｅ　Ｇ１０．ＯＯＯを用いて例１　、Ａ。

に記載した方法に一般的に従って調製した。分子量２０，０００及び３５．００ ０のジヒドロキシＰＥＧのＩＬ−２誘導体を、フル力製ノＰ　Ｅ　Ｇ−２０，０ ００及びＰ　Ｅ　Ｇ−３５，０００を用いて、例１．Ａ。

において言及したＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉ等（前掲）に類似する方法（上昇した温 度ではなく室温において溶剤中で塩基を使用する）に従って得た。得られる変形 されたＩＬ−２蛋白質は前記の細胞増殖アッセイによりアッセイした場合生物活 性であった。

貫一旦 Ｐ　Ｅ　Ｇ−５０００を用いるＰＥＧ化インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）の 調製 活性化されたＰＥＧ−エステルの調製、及び米国特許隘４．５１８．５８４に記 載されている様な１７位のシスティン残基がセリン残基によって置き換えられて いるＲＰ　−）ＩＰＬＣ精製された組換ＩＦＮ−β（ｓｅｒ、、Ｉ　Ｆ　Ｎ−β ）への前記活性化されたＰＥＧ−Ｌステル（Ｄ接合を、１モルのＩＦＮ−β当り ０．１０゜２０又は５０モルのＰＥＧ“を含む反応において、例１．Ａ、及び１ ．Ｂ、においてＩＬ−２について記載したのと本質的に同じ方法により行った。

未修飾ＩＦＮ−βからのＰＥＧ化ＩＦＮ−βの分離は、０．１％ＳＤＳを含む５ ０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中セファクリルＳ−２００カラムを用いる分子 排除クロマトグラフィーを用いて達成することができる。Ｓ−２００画分からの アリコートを、Ｗ、Ｅ、Ｓｔｅｗａｒｔ、”Ｔｈｅ　ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＳｙ ｓｔｅｍ”、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ、１７−１８頁（１９７８）によ り一般的に記載されている細胞変性効果（ｓｙｔｏｐａｔｈｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ ；ＣＰＥ）アッセイを用いてＩＦＮ−β抗ウィルス活性についてアッセイし、そ して例■に記載する様に活性であることが見出された。

ＣＰＥアッセイは、インターフェロンがそれにより処理された細胞をウィルスの 効果から保護するという原理に基いて機能する。ウィルスに対してより耐性であ る細胞は生存し、他方ウィルスに対して感受性である細胞は細胞変性効果を経験 し、そして死ぬであろう。

■−夏 Ｐ　Ｅ　Ｇ−５０００により修飾されたＰＥＧ化ＩＦＮ−βの特徴付け Ａ０種々のＰＥＧ”対ＩＦＮ−βモル比の反応からの修飾されたＩＦＮ−β生成 物のサイズの特徴付け１分子のＩＦＮ−β当り０，１０．２０又は５０分子のＰ ＥＧ”を含む例■に記載した反応からの生成物の５ＯＳ−ＰＡＧＥ　（１４％、 非還元的）、ＩＬ−２の場合の様に、ＰＥＧ”対ＩＦＮ−βのモル比の増加に伴 う修飾の程度の増加を示す。デンシトメータースキャン（第５図）は、ＰＥＧ’ ″対ＩＦＮ−βのモル比の増加に伴う２０．０００の分子量で動く未変性ＴＦＮ −βの量の減少を示す。３０〜３５，０００の見かけ分子量を有する明瞭な１種 が試験された３種類すべての分子比（ＩＯＰＥＧ“／ＩＦＮ−β、２０ＰＥＧ” ／Ｉ　ＦＮ−β、及び５０ＰＥＧ”／ＩＦＮ−β）のＰＥＧ修飾の後に存在した 。おそらく一層高度に修飾されたＩＦＮ−β種を代表する一層高分子量の種の増 加が１分子のＩＦＮ−β当り５０分子のＰＥＧ”で行われた反応において明らか であった。

Ｂ、未修飾ＩＦＮ−βに比較したＰＥＧ化ＩＦＮ−βの生物活性 １モルのＩＦＮ−β当り０，１０．２０又は５０モルのＰＥＧ’″を含有するＰ ＥＧ化反応のＳ−２００分離の両分を例■に記載されている様にして抗ウィルス 活性についてアッセイした。

３種類すべての修飾反応から得られたＰＥＧ化ＩＦＮ−βの生物活性は第■表に 示す様に未修飾ＩＦＮ−βに匹敵した。

莱−１−表 ＣＰＥアッセイにより測定した場合の未修飾ＩＦＮ−β及びＰＥＧ化ＩＦＮ−β の生物活性０　２．２±０．６Ｘ１０’ １０　２．２±１．６　ＸＩＯ’ ２０　２．０±０．ｌＸ１０７ ５０　４、１±０．８Ｘ１０７ Ｃ９未修飾ＩＦＮ−βに比較したＰＥＧ化ＩＦＮ−βの溶解性 修飾反応及びＳ−２００画分の後、ＰＥＧ化ＩＦＮ−β及び未修飾ＩＦＮ−βの すべてをそれぞれｐＨ７に調整し、例■に記載したのと同様にしてセファデック スＧ−２５クロマトグラフイーを用いてＳＤＳを除去した。２００〜６５０ｎｍ の吸光スキャンにより示される様にＰＥＧ化ＩＦＮ−βは溶液状に維持されたが 、未修飾ＩＦＮ−βはｐＨ７において溶液から沈澱した（第７図）、修飾された ＩＦＮ−β及び未修飾Ｉ　ＦＮ−βの両者はｐＨ９において可溶性であった。試 験されたすべてのＰＥＧ化ＩＦＮ−βサンプルについて同様の結果が得られた。

Ｄ、未修飾ＩＦＮ−βに比較したＰＥＧ化ＩＦＮの薬理動態ＰＥＧ化ＩＦＮ−β を用いた場合未修飾ＩＦＮ−βに対して、ラット及びマウスにおいて、ＩＬ−２ のそれと同様にインビボ半減期が改善された。

貫−！ ＰＥＧ化リシすＡの調製及び特徴付け Ａ、ＰＥＧ化リシすＡ鎖の調製 精製にかけるため及び細胞毒性を示すために可溶化を必要としない可溶性の組換 りシンＡを下記の方法に従って調製した。リーダー配列がリーダー／リシンＡキ メラのＮ−末端部分である様に仮定的融合ペプチドを形成するためにリシンＡの コード配列がｐｈｏへのリーダー配列をコードするＤＮＡと直接リーディングフ レーム内に置かれた場合、この様に配置されたリシンＡ配列は可溶性の細胞毒性 物質をもたらす。

ｐＲＴ　３（１９８６年３月７日に寄託されたＡＴＣＣ寄託隘６３．０２７）、 ｐＲＴ１７　（１９８６年３月７日に寄託されたＡＴＣＣ寄託階６７．０２６） 　、及びｐＲＴ３２　（１９８６年３月７日に寄託されたＡＴＣＣ寄託隘６７、 ０２５）中に含まれる前駆体蛋白質のための遺伝子を含有する発現ベクター又は これらの変異形を造成した。これらの発現ベクターによる宿主細胞の形質転換が コードされた前駆体蛋白質の可溶化をもたらした。ａｒｇ−ａｒｇ変形された前 駆体をトリプシンにより開裂せしめ、ここに記載する様に前駆体のＡ部分及びＢ 部分を別個の蛋白質として製造した。

ｐｈｏＡ発現系発現−て、必須成分は、リシンＡコード配列の上流にあり、ここ に近位にありそしてフレームが合っていない（リシンＡコード配列はＡＴＧコド ンにより開始される）停止されたｐｈｏＡリーダー配列である。言うまでもなく 、２つのコード配列は完全な細菌プロモーターを備えていなければならず、これ はリーダーにすでに結合しているｐｈｏＡプロモーターであった。さらに、Ｂ、 チューリンジエンシス（Ｂ、　ｔｈｕ−亘■圏旦鎚）の結晶蛋白質と関連する正 のレトロレギュレーター配列である正のレトロレギュレーター配列の存在により 生産が改良された。これはレプリコン及び選択マーカーを含む細菌性輸送ベクタ ー上に置かれた。

次に、これらのベクターを使用して適当な原核性宿主を形質転換し、この宿主を 、選択された特定の宿主のために適切な条件下で、最もしばしば、発現系の制御 のもとに置かれたプロモーターが制御される条件下で増殖せしめる。次に、選択 されたプロモーターの制御のもとで発現を行う条件を与えることによってリシン Ａの生産を誘導し、そして生成物の所望の蓄積が得られるのに十分な時間にわた って生産を進行せしめた。次に、細胞を破砕することにより蛋白質生成物を単離 し、そして細胞破片を除去した。次に自由に溶解する蛋白質に適用されるものと して当業界において知られている標準的技法を用いて、生産された蛋白質をさら に精製した。しかしながら、抽出及び精製の効率は、部分精製された抽出物をフ ェニルセファロースで処理することにより増強された。音波処理物中のりシンＡ （膜又は他の結合物から一旦分離されたもの）の溶解度は、音波処理物を高速の １００．　ＯＯＯｘｇにて３０分間遠心分離して不溶性蛋白質を回転沈降せしめ た場合になお上清に残るその能力により示した。

合計２ｆｒ１１のこの可溶性リシンＡ　（９，Ｏｒｒｇ／　ｍＺ）を、２Ｉの新 鮮なβ−メルカプトエタノールを加え（０，１％に）そして室温にて一夜インキ ユベートすることにより還元した。２ｄの還元されたりシンＡを、０．１０Ｍ　 ＮａＰＯａ　（ｐ）（８，０）で平衡化されたＧ−２５カラム（ファルマシア） に適用し、次に０．５−の緩衝液によりサンプル適用容量を２．５−とじた。次 の３．０−の溶出液（緩衝液を適用した）を脱塩されたりシンＡとして集めた。

１、　ＯｍｌＯ脱塩されたりシンＡ（約６■）を１．５−のミクロフユージチュ ーブに移した。このリシンＡに、例１．Ａ、において記載したようにして得られ たポリエチレングリコール２０００のＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（ 活性化されたＰＥＧ）４．５■を加えた。４．５■の活性化されたＰＥＧはリシ ンＡに対して１１倍過剰量の活性化されたＰＥＧを意味した。

活性化されたＰＥ（１，を、おだやかに混合することによりリシンＡ溶液に溶解 した。種々の時点において、反応混合物の１００４のアリコートを次の方法によ りＧ−２５カラム上で脱塩して未反応の活性化ＰＥＧを除去しそしてＰＥＧ化反 応を停止せしめた。

１００Ｉ１１のＰＥＧ／リシンＡを適用し、２、４　ｍＺの０．１０Ｍ　ＮａＰ Ｏｔ　（ｐＨ８，０）を適用し、１、１　ｍＺの０．１０Ｍ　ＮａＰＯ３（ｐＨ ８，０）を適用し、そして、溶出液を脱塩されたりシンＡとして集める。

採用した時点は、１０分、２０分、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、 ４時間、及び５時間であった。

反応混合物は０時から氷上に維持した。

ＰＥＧ化の程度を決定するために１５％ミニゲルを流した。

その結果、ＰＥＧ化は良好に行われそして反応は急速に生ずる様であった。

ＰＥＧ化リシすＡの新サンプルを抗体への接合のために調製した。約４０■の上 記のりシンＡを、１％のβ−メルカプトエタノールを含有する約１０−のＴｒｉ ｓ緩衝液（ｐＨ８，５）と混合した。これを約５ａｆに濃縮し、そして２本のＧ −２５カラム上ＥＤＴＡ緩衝液中で脱塩して６．３７ｍＺＯ前溶出液を得た。

ＰＥＧ　（約２０００）のＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル合計２４．６ ■をリシンＡに加え、そしてこの混合物を氷上で１５分間反応せしめた。（これ は、１０倍過剰の活性化されたＰＥＧに相当する。） ＰＥＧ化リシすシを３本のＧ−２５カラム上で脱塩し９．７０−の最終溶出液容 量を得た。β−メルカプトエタノールを５ｍＭ　（約０．０５％）に添加した。

ＰＥＧ化リシすシ混合物を４℃にて貯蔵した。

合計５０ｔ＝ｇＯＰＥＧ化リシンＡ混合物を分取用Ｚｏｒｂａｘ　ＧＦ−２５０ サイズ分離カラム（デュポン）に、１−７分の流速で、５０ｍＭ　（ＮＨ４）ｚ ｓＯａ、５０　ｍＭ　ＮａＰＨｔ　（ｐＨ６，５）の緩衝液を用いて注入した。

分取用分画の５−画分の１３．５％ミニゲル処理により決定した場合、最初のピ ークはＰＥＧ化リシすシであった。

最初の試行において得られたプールを約２ｍｌに濃縮し、そして次に２８０ｎｍ の吸光をモニターすることによりＺｏｒｂａｘ　ＧＦ−２５０カラム上でのＨＰ ＬＣにより精製した。各試行の両分１５〜２３をＰＥＧ化リシすシとしてプール した。

次に、ＰＥＧ化リシすシの分子量を、前記の精製方法に類似する条件下でＨＰＬ Ｃにおいて分子量標準（ビオ−ラド）を移動せしめることにより決定した。線形 回帰を行い、ＰＥＧ化リシリジン２２Ｋ（１量体）、４４Ｋ（２量体）、及び５ ９Ｋ（多量体）の見かけ分子量を有することが示された。

Ｂ、ＰＥＧ化リシすシの特徴付け Ｚｏｒｂａｘ　ＧＦ−２５０で処理した２■のＰＥＧ化リシすシからの了りコー トを、プロメガ・プロチク（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｒｏｔｅｃ）製のキットを用い て、綱状赤血球アッセイ　（翻訳）における生物活性について試験した。与えら れたサンプルは両分２８（高分子量）、３４（２量体）、４０　（単量体）、及 び幾つかの未精製ＰＥＧ化リシすシ／未修飾リシすＡ混合物であった。ラビット 網状赤血球無細胞翻訳系アッセイは、放射性メチオニンの取り込みにより蛋白質 合成を測定する。

第■表に示される結果は、精製された単量体のみが遊離リシンＡのそれに接近す る阻害を示すことを示した。２量体及び多量体画分は５０％における阻害投与量 （ＩＤ５０）の上昇により測定した場合、非常に低下した阻害を示した。

材料　１１０５０（ｎ／ｍｆ）　１０１０５０（リシンＡ　Ｏ，１６５，２Ｘ１ ０−１２高分子量　１５Ｂ、５　５．２　ｘ　１０−’２量体　５０１１．９　 − すなわち、リジンをＰＥＧ化して単量体のみを生成せしめ、そして混合物から多 量体を除去する必要があるようである。

ＰＥＧ化の溶解性の利点は観察された。すなわち、ＰＥＧ化リシすシの２０■／ ｒｒ１１への濃縮の達成はＰＥＧ化されていないリシンＡを用いては不可能であ った。

Ｃ８抗体へのＰＥＧ化リシすシの接合 ５２０Ｃ９と称する乳癌モノクローナル抗体は１９８５年１月８日に、アメリカ ン・タイプ・カルチュアー・コレクション、ロックビル、ＭＤにｘ、ｕｓｓ６９ ｓとして寄託されている。この抗体を室温にて５，５′−ジチオビス−（２−二 トロ安息香酸）と反応せしめ、そして次に冷却し、そして次に抗体分子当り２． ５の１７分子を与えるのに十分な２−イミノチオラン（Ｉ　Ｔ）を加えた。

合計１６６　Ｉｉのプロピレングリコールを０．８４ｍ１のＩＴｔｉ１体化抗体 に加えた。２．３２ｍｆの上記のＰＥＧ化リジすＡｔＪｆを加えて接合反応を開 始した。混合物を室温にて２時間インキュベートした。

接合反応混合物を、Ｚｏｒｂａｘ　−ＧＦ　−２５０サイズ分画（ゲル濾過）　 ＨＰＬＣカラムに適用し、０．１５Ｍ　ＮａＰＯ４（ｐＨ８−０）の溶出緩衝液 を用いた。カラムからの精製された免疫接合体の合計７８％の回収が得られた。

Ｄ、接合体の特徴付け １、　リボゾーム翻訳アッセイ 接合体プールを無菌フードのもとて無菌チューブ中に濾過除菌し、このチューブ からアリコートを種々の無菌ミクロフユージチューブに無菌的にピペット輸送し た。最終無菌化イムノトキシンの１００４のアリコートを、ラビット網状赤血球 からの精製された抽出物、３５Ｓ−メチオニン、ｍＲＮＡ及びｍＲＮＡ合成のた めの他の要素と共にインキュベートした。

リポゾーム翻訳の阻害剤を伴わないで、及び伴ってアッセイを行った。投与量応 答曲線は蛋白質合成を測定する。対照サンプルは非ＰＥＧ化イムノトキシン、リ シンＡ鎖、及びＰＥＧ化リシすシ鎖を包含した。結果は次の通りであった。

ＩＤ５０　（リシンＡ 試　験　材　料　鎖に基くＭ数） リシンＡ鎖　５．９　Ｘｌ０−” ＰＥＧ化リシすシ鎖　５２．ＯＸ　１０−　’　２リシンＡ鎖と５２０Ｃ９との 接合体　６０．８　Ｘ　１０−　’　”このアッセイは、ＰＥＧ化接合接合体非 ＰＥＧ化接合体のＩｔ）５０がそれぞ１５．８５及び７．９４ｎｇ／ｍｊである ことを示した。このアッセイの精度はおよそ±１００％より良くはないため、両 者の阻害は同じである。リシンＡｔＸへの抗体のみの付加は非接合リシンＡに比 べてＩ　０５０を減少せしめる様である。すなわち、ＰＥＧ化は抗体の付加以上 にリシンＡ活性を害しない。

トキシンのみのＰＥＧ化ではなくイムノトキシンのＰＥＧ化が結果を改良すると 予想される。

２、　インビボ細胞変性アッセイ １ｍＺの培地中４０００個の乳癌細胞（公衆が入手可能なセルライン５ＫＢＲ３ から）を、１セントの８ｍＺガラスバイアルに加え、次にＰＥＧ化接合接合体稀 釈物非ＰＥＧ化接合体稀釈物（１１００ｕ／ｍｌのウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ 　Ａ）を含有するリン酸緩衝化塩溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）中〕を加えた。３７℃にて ２２時間インキュベートした後、培地を吸引除去し、単層をＰＢＳで洗浄し、そ してメチオニン不含有培地に３５Ｓ−メチオニンを添加したものを加えた。バイ アルを３７℃にて２時間さらにインキュベートし、培地を除去し、そして細胞を １■／−のメチオニンを含有する１０％のトリクロロ酢酸２−により２回洗浄し た。細胞を乾燥し、シンチレーション流体を加え・そしてシンチレーションカウ ンター中で放射能を測定した・細胞変性を、対照（未処理）の蛋白質合成の５０ ％（ＴＣＩＤ５０％）をもたらす接合体の組織培養阻害投与量として表現した。

アッセイの結果は次の通りであった。

非ＰＥＧ化　０．２１６ ＰＥＧ化　＜０．４２２ このアッセイの精度もまた釣上】００％より良好ではなく、そしてそれ由に両者 のＴＣＩＤ値は同一である。細胞毒性の観点から、律速段階はりシンＡ鎖活性を 含むのではなく、他の事象、最も高い可能性として接合体結合、トランスロケー ション、及び／又は細胞内移動を含むであろう。

勇−■ ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）により修飾されたＩＬ−２の調製及 び特徴付け Ａ、活性ＰＯＧ−Ｉ　Ｌ−２の調製 分子量５０００のポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）はポリサイエンシ ス（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）により注量合成されたものである。１０ｇのＰ ＯＧに２．２８ｇの無水グルタル酸（ＰＯＧに対して１０倍過剰）を加えた。こ の混合物を１１０℃にて２時間攪拌しそして冷却した。これを２０ｒｎｌのＣＨ Ｃｆｆｉ。

に溶解し、そして激しく攪拌しながら５００ｍ１のエーテル中に徐々に注いだ。

生成物を集め、エーテルですすいで約９０％のＰＯＧ−グルタレート生成物を得 た。この生成物を、例Ｉ。

Ａ、に記載したようにしてＮ−ヒドロキシサクシンイミドと反応せしめることに より活性エステルであるＰＯＧ−グルタリルＮ−ヒドロキシザクシンイミド（Ｐ ＯＧ”）を得た。次に、例１．Ｂ、に記載した様に、０．１Ｍ硼酸ナトリウム（ ｐＨ９）、０．ＩＭＳＤＳ中０．２５ｍｇ／　Ｉ　Ｌ　−２の溶液２ｏ−を５■ のＰＯＧ”と室温にて３０分間反応せしめた。

１０ｍ１の反応混合物を２−に濃縮し、そして１０ｍＭ硼酸ナトリウム（ｐＨ９ ）中セファデックスＧ−２５カラムに適用した。これをｐＨ７に調整しく溶解） そして濃縮した。２ｍｊの濃縮物に１．７　Ｍ　（ＮＨ４）　ｚｓＯ４，５０ｍ Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７）から成る溶剤を加えた。次に、これを０℃にてフ ェニル−ＴＳＫカラムに適用した。両分の５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１４％、還元） は良好な分離を示した。

他の１０ｎｔ［ＤＰＯＧ−Ｉ　Ｌ−２をｐＨ５に調整した後に３ｍＺに濃縮した 。これをセファクリルＳ−２００カラムに通用した。

両分（７）　５Ｏ３−ＰＡＧＥ　（１４％、還元）は均一なＰＯＧ−Ｉ　Ｌ−２ 生成物を示した。

Ｂ、ＰＯＧ−ＩＬ−２の特徴付は 反応混合物のＳ−２００分離からの両分を例１．Ｃ，に記載した様にして生物活 性についてアッセイした。結果を第７表に示す。

第一ひＮ−表 寄皿 リシンＡ鎖を調製するために使用されたプ・ラスミド及び抗体５２０Ｃ９を生産 するハイブリドーマは、アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（ＡＴ ＣＣ）　、１２３０１バークラウンドライブ、ロックビル、メリーランド、２０ ８５２−１７７６、米国、に寄託された。寄託されたサンプルのＡＴＣＣ受託番 号及び寄託日は次の通りである。

ベクター／ハイブリ　寄託日　受託番号ドーマの名称 ５２０Ｃ９１／　８　／８５　ＨＢ　８６９６ｐＲＴ３　３　／　７　／　８６ 　６７、０２７ｐＲＴ１７　３　／　７　／８６　６７．０２６上記の寄託はＡ ＴＣＣとこの特許出願の承継人であるシタス・コーポレイションとの間の契約に 基いて行われた。ＡＴＣＣとの契約は、これらのプラスミド及びセルラインの子 孫の永久的入手可能性を公衆に対して、該寄託又は公表を記載しそして特定して いる米国特許が発せられた後、又は米国もしくは外国の特許出願が公衆に公表さ れた後に、どちらが先に到来するかにかかわらず与え、そして、これらのプラス ミド及びセルラインの子孫の入手可能性を、米国特許商標局長官により３５ＵＳ Ｃｆｌ　１２２及びこれに基く長官規則（８８６０Ｇ６３Ｂへの特別の言及を伴 う３７ＣＦＲ＠　１．１４を含む）に従って定められた者に与える。この特許出 願の承継人は、寄託中のプラスミド及びセルラインが適切な条件下で培養された 場合に死滅し、失われ又は破壊された場合には、通知の後これらが同じプラスミ ド及びセルラインの生存培養物によりすみやかに置き換えられることに同意する 。

要約すれば、この発明は、ＰＥＧホモポリマー又はポリオキシエチル化ポリオー ルに選択的に接合されそしてそれによって生理的ｐｎにおける水性媒体中に可溶 化されているか又はのような媒体中に溶解している医薬組成物を提供するものと 見られる。接合は、通常疎水性である水不溶性の蛋白質をｐｉ６〜８の水に可溶 性にするために役立つのみならず、その生理的半減期を延長し、そして通常疎水 性である蛋白質の凝集を減少せしめもしくは除去することにより又は抗原決定基 をシールすることによりその免疫原性を低下せしめる。接合を伴わない場合、蛋 白質は洗剤又は変性剤のごとき可溶化剤の添加により、安定剤の添加と組合わせ てｐＨを上げることにより、あるいはｐＨを下げることにより溶解されなければ ならない。

以上の記載は、当業者がこの発明を実施するのに十分てあると考えられる。寄託 された具体例はこの発明の１つの観点の単なる例示であると考えられ、そして機 能的に同等なすべてのプラスミド及びセルラインはこの発明の範囲に属すること が意図されるから、この発明は寄託されたプラスミド及びセルラインの範囲に限 定されない。、この発明における材料の寄託は、この明細書の記載が、最良の形 態を含むこの発明のすべての観点の実施を可能にするのに不適当であるとの自白 を構成するものではなく、これらは請求の範囲をそれらが示す特定の例示に限定 するものとして理解されるものでもない。

単量体 ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、　３ 時　間（分、注射後） ＦＩＧ、　４ 時間（Ｓ、Ｃ，注射の後２時） ＦＩＧ、　６ 国際調査報告 １°”°”ａｍ　Ａｅｅｈｔｏｏｌ””’　ＰＣＴ／ＵＳ　８６１０１２５２Ａ ＮＮＥＸ　Ｔｏ　’ｎｉＥ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥＰ ＯＲＴ　０ＮＺＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＡＰＰＬＩＣＡτＩＯＮ　Ｎｏ、　 ＰＣＴ／ＩＪＳ　８６１０１２５２　（ＳＡ　１３５６６）・――・＋・・−− −―＋＋―・―−−＋−−−−−−−−角一一一・−――争・−―――−―−― −―＋＋＋＋＋−一鐙―

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．非毒性で不活性な医薬として許容される水性キャリヤー媒体を含んで成る医 薬組成物であって、該媒体中にβ−インターフェロン、インターロイキン−２及 びイムノトキシンから成る群から選ばれた生物学的に活性な選択的に接合した蛋 白質が溶解しており、該蛋白質はポリエチレングリコールホモポリマー及びポリ オキシエチル化ポリオールから成る群から選ばれた水溶性ポリマーに共有結合的 に接合しており、該ホモポリマーは置換されていないか又は一端においてアルキ ル基により置換されておりそして該ポリオールは置換されておらず、そして前記 蛋白質はその接合していない形において通常は疎水性でありそして可溶化剤の非 存在下でｐＨ６〜８の前記水性キャリヤー媒体中に不溶性である、前記医薬組成 物。
2. ２．前記ポリマーが約３００〜１００，０００の分子量を含有する、請求の範囲 第１項に記載の組成物。
3. ３．前記ポリマーが、前記ポリマーのカルボン酸のＮ−ヒドロキシサクシンイミ ドエステル又は４−ヒドロキシ−３−ニトロベンゼンスルホネートエステルを介 して蛋白質に接合する、請求の範囲第１項又は第２項に記載の組成物。
4. ４．前記ポリマーが非置換ポリエチレングリコールホモポリマー、モノメチルポ リエチレングリコールホモポリマー、又はポリオキシエチル化グリセロールであ る、請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の組成物。
5. ５．前記蛋白質がヒト由来の組換蛋白質である請求の範囲第１項〜第４項のいず れか１項に記載の組成物。
6. ６．前記蛋白質がヒト由来の組換蛋白質である請求の範囲第１項〜第５項のいず れか１項に記載の組成物。
7. ７．前記蛋白質がミューティンである請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項 に記載の組成物。
8. ８．前記蛋白質がｓｅｒ１２５ＩＬ−２、ｄｅｓ−ａｌａ１ＩＬ−２、ｄｅｓ− ａｌａ１ｓｅｒ１２５ＩＬ−２、ｄｅｓ−ａｌａ１ａｌａ１Ｏ４ＩＬ−２、ｄｅ ｓ−ａｌａ１ａｌａ１０４ｓｅｒ１２５ＩＬ−２、ｓｅｒ１７ＩＦＮ−β、又は 組換リシンＡ鎖とのイムノトキシンである、請求の範囲第１項〜第７項のいずれ か１項に記載の組成物。
9. ９．前記蛋白質が蛋白質上の１〜１０個のリジン残基を介して選択的に接合して いる、請求の範囲第１項〜第８項のいずれか１項に記載の組成物。
10. １０．医薬組成物の製造方法であって、（ａ）少なくとも一端に反応性基を有す る水溶性ポリマーを用意し、ここで該ポリマーはポリエチレングリコールホモポ リマー及びポリオキシエチル化ポリオールから成る群から選択されたものであり 、該ホモポリマーは置換されていないか又は一端においてアルキル基により置換 されており、そして該ポリオールは置換されておらず； （ｂ）β−インターフェロン、インターロイキン−２及びイムノトキシンから成 る群から選ばれた生物学的に活性であり通常は疎水性であり、水に不溶性である 蛋白質を前記ポリマーの反応性基と反応せしめることにより水溶性の生物学的に 活性な選択的に接合した蛋白質を得；そして（ｃ）この蛋白質を非毒性で不活性 な、医薬として許容される水性媒体中に配合する； ことを含んで成る方法。