JP2023551563A - pH依存性変異体インターロイキン-2ポリペプチド - Google Patents

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Abstract

本発明は、概して、中性のpHにおいて低減したIL-2受容体結合を呈し、低下したpHでIL-2受容体結合を保持するpH依存性変異体インターロイキン-2ポリペプチドに関する。加えて、本発明は、前記pH依存性変異体IL-2ポリペプチドと、pH依存性変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチド分子と、そのようなポリヌクレオチド分子を含むベクター及び宿主細胞とを含むイムノコンジュゲートに関する。本発明はさらに、pH依存性変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを生成するための方法、それを含む医薬組成物、及びその使用に関する。【選択図】図1

Description

本発明は概して、pH依存性変異体インターロイキン-2ポリペプチドに関する。さらに詳細には、本発明は、免疫療法薬剤としての使用のための改善された特性を呈する変異体IL-2ポリペプチドに関する。加えて、本発明は、イムノコンジュゲートSpH依存性変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲート、並びにそのようなポリヌクレオチド分子を含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明はさらに、pH依存性変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを生成するための方法、それを含む医薬組成物、及びその使用に関する。
インターロイキン-2(IL-2)は、T細胞成長因子(TCGF)としても知られ、リンパ球の生成、生存及びホメオスタシスにおいて中心的な役割を果たす15.5kDaの球状糖タンパク質である。IL-2は、133アミノ酸長であり、その機能に必須の四次構造を形成する4つの平行ではない両親媒性αらせんからなる(Smith,Science 240、1169-76(1988);Bazan,Science 257,410-413(1992))。異なる種由来のIL-2の配列は、NCBI RefSeq番号NP000577(ヒト)、NP032392(マウス)、NP446288(ラット)又はNP517425(チンパンジー)に認められる。
IL-2は、最大3個の個々のサブユニットからなるIL-2受容体(IL-2R)に結合することによってその作用を媒介し、その異なる会合によってIL-2に対する親和性が異なる受容体形態を生成することができる。α(CD25)、β(CD122)及びγ(γ、CD132)サブユニットの会合によって、IL-2の三量体型高親和性受容体が得られる。βサブユニット及びγサブユニットからなる二量体型IL-2受容体は、中程度親和性IL-2Rと呼ばれる。αサブユニットは、単量体型低親和性IL-2受容体を形成する。二量体型中程度親和性IL-2受容体は、三量体型高親和性受容体よりも約100分の1低い親和性でIL-2に結合するが、二量体型及び三量体型IL-2受容体バリアントの両方は、IL-2に結合するとシグナルを伝達することができる(Minami et al.,Annu Rev Immunol 11,245-268(1993))。したがって、α-サブユニットCD25は、IL-2シグナル伝達に必須ではない。α-サブユニットは、その受容体に対して高い親和性結合を与え、一方、βサブユニットCD122及びγサブユニットは、シグナル伝達にとって重要である(Krieg et al.,Proc Natl Acad Sci 107,11906-11(2010))。CD25を含む三量体型IL-2受容体は、(休止状態の)CD4フォークヘッドボックスP3(FoxP3)制御性T(Treg)細胞によって発現される。これらは、従来の活性化されたT細胞でも一時的に誘導され、一方、休止状態では、これら細胞は二量体型IL-2受容体のみを発現する。Treg細胞は、in vivoで一貫して最も高いレベルのCD25を発現する(Fontenot et al.,Nature Immunol 6,1142-51(2005))。
IL-2は、活性化T細胞、特に、CD4ヘルパーT細胞によって主に合成される。IL-2は、T細胞の増殖及び分化を刺激し、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の生成並びに末梢血リンパ球の細胞毒性細胞及びリンホカイン活性化キラー(LAK)細胞への分化を誘導し、T細胞によるサイトカイン及び細胞溶解性分子の発現を促進し、B細胞の増殖及び分化並びにB細胞による免疫グロブリンの合成を容易にし、ナチュラルキラー(NK)細胞の生成、増殖及び活性化を刺激する(例えば、Waldmann,Nat Rev Immunol 6,595-601(2009);Olejniczak and Kasprzak,Med Sci Monit 14,RA179-89(2008);Malek,Annu Rev Immunol 26,453-79(2008)にまとめられている)。
IL-2がリンパ球の集合をin vivoで拡張し、これら細胞のエフェクター機能を増加させる能力は、IL-2に抗腫瘍効果を与え、IL-2免疫療法を、特定の転移性がんにとって魅力的な治療選択肢にしている。その結果、高用量IL-2治療は、転移性腎臓癌及び悪性黒色腫を有する患者における使用について承認された。
しかしながら、IL-2は、エフェクター細胞の拡張及び活性を媒介するだけではなく、末梢性免疫寛容の維持に大きく関わっているという点で、免疫応答において二重の機能を有する。
末梢性セルフトレランスの根底にある主要な機序は、T細胞におけるIL-2誘導活性化誘導細胞死(AICD)である。AICDは、完全に活性化されたT細胞が、CD95(Fasとしても知られる)等の細胞表面で発現するデスレセプター又はTNF受容体の係合を通してプログラム細胞死を受けるプロセスである。増殖中に高親和性IL-2受容体を発現する抗原活性化T細胞(IL-2に以前に曝露された後の)が、T細胞受容体(TCR)/CD3複合体を介して抗原により再刺激されると、Fasリガンド(FasL)及び/又は腫瘍壊死因子(TNF)の発現が誘導され、細胞が、Fas介在性アポトーシスに感受性となる。このプロセスは、IL-2依存性であり(Lenardo、Nature 353,858-61(1991))、STAT5を介して媒介される。Tリンパ球トレランスにおけるAICDのプロセスによって、耐性が、自己抗原に対して確立されるだけではなく、腫瘍抗原等の明確に宿主構成物の一部ではない持続性抗原に対しても確立されうる。
さらに、IL-2は、末梢CD4CD25制御性T(Treg)細胞の維持にも関与し(Fontenot et al.,Nature Immunol 6,1142-51(2005);D’Cruz and Klein,Nature Immunol 6,1152-59(2005);Maloy and Powrie,Nature Immunol 6,1171-72(2005))、これらは、サプレッサーT細胞としても知られる。これらは、エフェクターT細胞がその(自己)標的を破壊することを、T細胞の補助及び活性化を阻害することにより細胞間接触を通して、又はIL-10又はTGF-β等の免疫抑制性サイトカインの放出を通して、抑制する。Treg細胞を消耗させると、IL-2誘導抗腫瘍免疫が高まることが示された(Imai et al.,Cancer Sci 98,416-23(2007))。
したがって、IL-2の存在下では、生成されたCTLが、腫瘍を自身として認識してAICDを受けるか、又は免疫応答が、IL-2依存性Treg細胞によって阻害されるため、IL-2は腫瘍成長の阻害にとって最適とはいえない。
IL-2免疫療法に関連するさらなる懸案事項は、組み換えヒトIL-2治療によって生じる副作用である。高用量IL-2治療を受けている患者は、重篤な心血管、肺、腎臓、肝臓、胃腸、神経、皮膚、血液及び全身の有害事象を頻繁に経験し、これには集中的なモニタリングと入院患者管理が必要となる。これら副作用の大部分は、いわゆる血管(又は毛細血管)漏出症候群(VLS)の発生、複数の臓器における流体漏出を引き起こす血管透過性の病的な増加(例えば、肺及び皮膚の浮腫並びに肝細胞の損傷を引き起こす)、血管内の流体枯渇(血圧の低下、心拍の補償的増加を引き起こす)によって説明することができる。IL-2の使用中止以外のVLSの治療は存在しない。低用量IL-2レジメンは、VLSを回避するために患者で試験されたが、最適とはいえない治療結果であった。VLSは、IL-2によって活性化されたNK細胞からの腫瘍壊死因子(TNF)-α等の炎症誘発性サイトカインの放出によって引き起こされると考えられていたが、近年、IL-2誘導肺浮腫が、低レベルから中程度のレベルの機能性αβγ IL-2受容体を発現する肺内皮細胞に対するIL-2の直接的な結合によって生じることが示された(Krieg et al.,Proc Nat Acad Sci USA 107,11906-11(2010))。
IL-2免疫療法に関連するこれら問題を克服するために、いくつかの手法が行われてきた。例えば、IL-2と特定の抗IL-2モノクローナル抗体との組み合わせは、in vivoでIL-2の治療効果を高める(Kamimura et al.,J Immunol 177,306-14(2006);Boyman et al.,Science 311,1924-27(2006))。代替的な手法では、IL-2は、その毒性を低下させるため、及び/又はその有効性を高めるために、種々の様式で変異された。Hu et al.(Blood 101,4853-4861(2003)、米国特許出願公開第2003/0124678号)は、IL-2の血管浸透活性を排除するために、IL-2の位置38のアルギニン残基をトリプトファンにより置換した。Shanafelt et al.(Nature Biotechnol 18,1197-1202(2000))は、NK細胞よりもT細胞に対する選択性を高めるために、アスパラギン88をアルギニンに変異させた。Heaton et al.(Cancer Res 53,2597-602(1993);米国特許第5,229,109号)は、NK細胞からの炎症性サイトカインの分泌を減らすために、2つの変異、Arg38Ala及びPhe42Lysを導入した。Gillies et al.(米国特許第2007/0036752号)は、VLSを減らすために、中程度親和性IL-2受容体に対する親和性に寄与するIL-2の3つの残基(Asp20Thr、Asn88Arg、及びGln126Asp)を置換した。Gillies et al.(国際公開第2008/0034473号)はまた、有効性を高めるために、アミノ酸置換Arg38Trp及びPhe42LysによってIL-2とCD25との接触面を変異させ、CD25との相互作用、及びTreg細胞の活性化を低下させた。同じ目的のために、Wittrup et al.(国際公開第2009/061853号)は、CD25に対する親和性を高めたが、受容体を活性化せず、したがってアンタゴニストとして作用するIL-2変異体を生成した。導入される変異は、受容体のβ-サブユニット及び/又はγ-サブユニットとの相互作用を破壊することを目的としたものであった。
IL-2免疫療法に関連する上述の問題(VLSの誘導によって引き起こされる毒性、AICDの誘導によって引き起こされる腫瘍耐性、及びTreg細胞の活性化によって引き起こされる免疫抑制)を克服するために設計された特定の変異体IL-2ポリペプチドが、国際公開第2012/107417号に記載されている。アラニンによる位置42のフェニルアラニン残基の置換、アラニンによる位置45のチロシン残基の置換、及びグリシンによるIL-2の位置72のロイシン残基の置換は、IL-2受容体(CD25)のα-サブユニットに対するこの変異体IL-2ポリペプチドの結合を本質的に消失させる。
しかしながら、既知のIL-2変異体の中で、IL-2免疫療法に関連付けられる上述の問題のすべて、すなわちVLSの誘導によって引き起こされる毒性、AICDの誘導によって引き起こされる腫瘍耐性、及びTreg細胞の活性化によって引き起こされる免疫抑制を克服することを示したものはなかった。
上述の手法に加えて、IL-2免疫療法は、例えば腫瘍細胞に発現された抗原に結合するか又は腫瘍環境内でエフェクター細胞に結合する抗体を含むイムノコンジュゲートの形態で、腫瘍に対してIL-2を選択的に標的化することによって向上させることができる。いくつかのこのようなイムノコンジュゲートが記載されている(例えば、Ko et al.,J Immunother(2004)27,232-239;Klein et al.,Oncoimmunology(2017)6(3),e1277306;国際公開第2018/184964号を参照されたい)。
PD-1/PD-L1チェックポイント阻害剤の臨床的成功及び前例のない有効性を考慮すると、既存のT細胞免疫を有する患者における応答率及び持続期間を増加させる大きな医学的ニーズがさらに残っている。最近の報告は、腫瘍特異的CD8T細胞の2つの集団、すなわち枯渇したTILと、幹様特性を有するそれらの新しく記載されたTCF1+前駆体であるTResource細胞は、PD-1抗体によって標的とされる。これら2つのうち、後者は好ましい疾患予後と相関し、抗PD-1療法に応答する。インターロイキン-2のようなサイトカインはまた、TResource細胞の増殖/分化を機能的エフェクターT細胞に向かって誘導することが記載されている。
IL-2は、転移性黒色腫及び腎細胞癌を治療するために使用される最初の有効ながん免疫療法であった。残念なことに、高濃度のIL-2は、血管漏出症候群(VLS)を誘導することにより毒性であり、CD25への結合に起因して制御性T細胞を有害に拡大し、活性化誘導性細胞死を誘導する。野生型IL2/Proleukinのこれら制限を克服するために、消失したCD25結合を有するIL-2vバリアントが記載されている。しかしながら、ヘテロ二量体の中程度の親和性を通したIL-2シグナル伝達の機序に起因して、IL-2Rbg複合体IL2v及び他のIL2バリアントは、IL-2Rに出会うとすぐ自動的にIL-2Rシグナル伝達を活性化し、その結果、血液、脈管構造及びリンパ組織において腫瘍の外側の非特異的な周縁の末梢免疫細胞活性化を媒介し、用量制限毒性をもたらす。結果として、最大の治療効果を達成するために望まれるIL-2又はIL2vを患者に投与することは可能でない。
PD1-IL2vは、CD25に対する結合が抑止されたIL-2バリアントを、同じT細胞上にある腫瘍反応性PD-1発現T細胞にシスで送達することにより、これら制限のいくつかを克服するために開発された(国際公開第2018/184964号)。結果として、PD1-IL2vは、PD-1陰性T細胞と比較してPD-1発現T細胞上で10~40倍強力である。腫瘍中において、PD1-IL2vは、新鮮でよりよいエフェクターT細胞と呼ばれる完全に機能する細胞傷害性T細胞においてCD8 TResource細胞の分化を促進し、膵臓がんのマウスモデルにおいて有効で長期間にわたる抗腫瘍免疫応答と完全な腫瘍根絶をもたらす。
まとめると、PD1-IL2vをシスでPD-1+ T細胞に標的化することにより、PD1-IL2vのより強力な治療効果を達成することができる。実際に、適切な抗原特異的T細胞サブセットへのPD1-IL2vのシス標的化は、PD-1/-L1阻害と併せて、内因性の免疫を治療的に活用するよりよい方法であり、がん免疫療法にとって内因性の免疫を解放することが知られている最も強力な免疫調節経路のうちの1つである。しかしながら、PD1-IL2vについても、IL2v部分が末梢でIL-2Rシグナル伝達をトリガーする可能性があるため、末梢の非腫瘍特異的IL-2Rの活性化により、所望される最大用量を投与することができない。したがって、治療指数は狭い範囲に留まると考えられ、MTDはヒトで>10~30mgのフラット用量であると予想され、これは完全な経路可能性の利用を制限しうる。
したがって、抗原経験T細胞にシス標的化された次世代のIL-2分子を、より広い治療指数を有する量で生成することが重要である。
PD1/PDL1軸に向けられている現行の免疫療法は複数のがんの症候において前例のない有効性を示したが、治療に応答しないか又は再発するかなり多くの患者が存在し、他の腫瘍型はそのような療法に対して大部分が難治性のままである。したがって、何らかの種類の既存のT細胞免疫応答を有する患者のうちの相当ながん患者の集団には、明らかで満たされていない高いニーズが存在する。PD1の拮抗作用が客観的応答をもたらした症候の例は、例えば進行性又は転移性黒色腫、メルケル細胞癌、NSCLC、SCLC、RCC、胃がん、肝細胞がん、頭頚部癌、乳がん、卵巣がん、自家造血幹細胞移植及びHL後のDLBCL及びPMBCLのようなミスマッチ修復不全対十分なCRC及び血液系腫瘍である(Editiorial:PD-Loma:a cancer entity with a shared sensitivity to the PD-1/PD-L1 pathway blockade,British Journal of Cancer(2019)120:3-5;https://doi.org/10.1038/s41416-018-0294-4)。
PD-1は、そのリガンド(PD-L1及びPD-L2)に結合すると、TCRの下流のシグナル伝達を弱めうる免疫チェックポイントである。PD-1は、抗原経験T細胞上に発現され、それより弱い程度でNK細胞及びB細胞上に発現される。T細胞表面上でのその上方制御が強力で持続的なTCRトリガーの後に起こり、それは慢性ウイルス感染及びがんの状況におけるT細胞の枯渇/機能不全と関連している。したがって、PD-1は、腫瘍関連抗原(TAA)を認識するそれら腫瘍浸潤リンパ球TILをマークし(Simon et al,Oncoimmunology,2015 Oct 29;5(1):e1104448;Simon et al,Oncoimmunology.2018;7(1):e1364828.)、したがってがん免疫療法のための魅力的な治療標的である。
最近では、PD-1が、腫瘍微小環境におけるように、最終分化細胞上だけでなく、幹細胞様リソースT細胞(TResource)と呼ばれる新しく同定された(neo)抗原特異的T細胞集団の表面上にも発現されることが報告されている。この細胞サブセットは、抗原経験T細胞のより分化したサブセットの自己再生及び補充を両方行うことのできる多能性前駆細胞により構成される(Im SJ et al,Nature,2016 Sep 15;537(7620):417-421).したがって、PD-1関連枯渇/機能不全は、腫瘍特異的TILのエフェクター機能の低下に加えてTResourceの自己再生及び分化能の低下を含むさらに複雑な全体像を提示する。興味深いことに、慢性LCMV感染中にPD-1ブロッケードと一緒にIL-2を投与すると、著しい相乗効果が誘導されることが報告されており(West E. E. et al,J Clin Invest,2013 Jun;123(6):2604-15)、これは、ウイルス特異的エフェクターT細胞及びTResourceに対する両分子の二重治療効果の結果であると思われる。IL-2は、リンパ球の生成、活性化、分化、増殖、エフェクター機能、生存及びホメオスタシスにおいて中心的な多面的役割を果たし、またそれは、主に活性化されたT細胞、具体的にはCD4Tヘルパーにより合成される。IL-2は、高親和性IL-2R(10 pM)としても知られる、3つの個別のサブユニット、すなわちα(CD25)、β(CD122)、及びγ(γc;CD132)からなるIL-2Rに結合する。二量体型IL-2Rβγは、高親和性の受容体の概ね50~100分の1の低さの親和性でIL-2に結合する中程度の親和性の受容体である。二量体型IL-2Rは、NK細胞、メモリー及びエフェクターメモリーT細胞上に発現され、それより低いレベルで休止CD4、CD8T細胞、及び単球/マクロファージ上に発現される。CD25は、従来の方法で活性化されたT細胞及びNK細胞上に一過性に誘導され、一方Tregs(天然に存在する)上に高レベルで恒常的に発現される。IL-2モードの作用の結果として、抗腫瘍効果は、Tregs及び活性化誘導細胞死(AICD)の誘導により損なわれる場合がある。
しかしながら、腫瘍は、抗体の標的抗原を削減し、変異させ、又は下方制御することによって、このような標的化から逃避することができる。さらに、腫瘍を標的とするIL-2は、リンパ球を能動的に除外する腫瘍微小環境において、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)等のエフェクター細胞と最適な接触をしない場合がある。
固形腫瘍の生理的微小環境は、通常、不十分な灌流と高い代謝率を特徴とする。腫瘍及び腫瘍間質では、乳酸及びH+の有意な生成における組織の酸素状態とは関係なく、増加したグルコース異化作用が起こる(ワールブルク効果)。組織化していない腫瘍脈管構造は、細胞外培地中に放出されるこのようなH+イオンの効率的な洗い流しを防ぐだけでなく、解糖代謝へのさらなるシフトに関連付けられる腫瘍低酸素領域の発生に有利に働く。共通の結果は、固形腫瘍における細胞外pHの酸性化、腫瘍アシドーシスとして知られるホールマーク状態である(Zhang X et al.,J Nucl Med.,2010 Aug;51(8):1167-70.;Corbet et al.,Nat Rev Cancer 17,577-593(2017);Damgaci et al.,Immunology.2018 Jul;154(3):354-362)。腫瘍細胞及びがん関連線維芽細胞は、平均pH7.2~7.4のpHを有する健常組織に対し、腫瘍環境を約pH6.0~6.8のpH値に酸性化する(Viklund J et al.,Curr Med Chem. 2017;24(26):2827-2845)。腫瘍アシドーシスは、浸潤及び転移、遺伝的不安定性、足場非依存性成長、腫瘍発生、化学療法抵抗性及びアポトーシスへの抵抗性、血管新生、並びに免疫系からの逃避を含む、がん病理生物学の多くの面において貢献することが示された(Viklund J et al.,Curr Med Chem. 2017;24(26):2827-2845;Kolosenko et al.,Semin Cancer Biol. 2017 Apr;43:119-133;Corbet et al.,Nat Rev Cancer 17,577-593(2017))。
いくつかの外部pH条件付きがん免疫療法手法は、腫瘍アシドーシスが条件付き薬物活性のために利用できることを支持している。他には、ともにBioAtlaにより開発された、CCT-301-59、pH依存性抗ROR2条件付き活性生物学的-CarT細胞療法、及びpH依存性CTLA-4チェックポイント阻害剤(https://www.bioatla.com/technology/cab/)、並びにワクチン接種用のpH感受性リポソーム送達がん抗原(Yuba et al.,Biomaterials.2013 Apr;34(12):3042-52)がある。
腫瘍アシドーシスは、Corbet、C.,Feron、O. Tumour acidosis:from the passenger to the driver’s seat. Nat Rev Cancer 17,577-593(2017)or Damgaci et al.,Immunology. 2018 Jul;154(3):354-362において考察されている。
このように、当技術分野には、IL-2タンパク質の治療的有用性をさらに高めるためのニーズが依然として存在する。
本発明は、部分的に、(i)腫瘍微小環境(TME)が末梢において中性pH、すなわち中性全身pHと比較して低下したpHレベルを呈すること、及び(ii)pH依存性変異体インターロイキン-2ポリペプチドが、中性pHにおいて低下した又は消失した全身活性を有し、酸性pHにおいて腫瘍微小環境で完全な活性を有することの認識に基づいている。
したがって、第1の態様において、本発明は、それぞれ野生型IL-2、好ましくは配列番号144によるヒトIL-2との比較で、1つ以上のアミノ酸置換を含む変異体インターロイキン-2(IL-2)ポリペプチドを提供し、1つ以上のアミノ酸置換が、中性pHにおいて、IL-2受容体への結合、好ましくは中程度親和性IL-2受容体(IL2Rβγ)への結合を消失させ又は低減し、かつ低下したpHにおいて、IL-2受容体への結合、好ましくは中程度親和性IL-2受容体(IL2Rβγ)への結合を容易にする。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、pH7.4及び/又はpH7.0において、低減又は消失したIL-2受容体結合、好ましくは中程度親和性IL-2受容体結合を呈し、pH6及び/又はpH6.5において、IL-2受容体結合、好ましくは中程度親和性IL-2受容体結合を保持していた。一実施態様では、前記1つ以上のアミノ酸置換は、配列番号144によるヒトIL-2の残基6、8、11、12、13、15、16、19、20、22、23、81、84、87、91、95、120、123、126、130、133に対応する位置の群から選択される位置にある。一実施態様では、前記1つ以上のアミノ酸置換は、S6Y、K8E、Q11E、Q11T、L12D、L12E、L12Q、L12S、L12T、Q13H、Q13R、E15Q、H16D、H16E、H16N、H16Q、L19D、L19Q、D20E、D20Q、Q22D、Q22E、Q22H、M23E、M23N、M23Q、R81D、R81E、R81H、R81N、R81Q、D84E、D84Q、S87D、S87E、S87N、S87Q、V91D、V91E、V91N、E95D、E95Q、R120E、R120H、T123E、T123Q、Q126E、Q126H、S130E、T133D、T133E、T133N、T133Qの群から選択される。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換(i)L12E、D20E、M23N、R81N、D84E、S87E、R120E、T123E、S130E、T133N;(ii)Q11E、D20Q、M23E、R81D、D84E、S87E、S130E、T133N;(iii)L12E、L19D、R81D、R120E、T123E、S130E、T133E;(iv)R81Q、S87E、V91D、T123E、S130E、T133D;(v)Q11E、L12E、M23Q、R81D、S87E、V91D、S130E、T133Q;(vi)Q11E、L19D、R81D、D84E、S130E、T133D;(vii)R81D、D84Q、S87D、V91N、T123Q、S130E、T133D;(viii)L19D、R81E、D84E、S87Q、R120H、S130E、T133E;(iix)L19D、M23N、R81D、T133E;(ix)Q11E、L12E、M23Q、R81Q、S87D、V91N、E95Q、R120H、T123E、S130E、T133E;(x)L19D、R81E、S130E、T133D;(xi)R81Q、S87E、V91D、R120E、S130E、T133D;(xii)L12Q、L19Q、R81H、V91E、T123E、S130E、T133E;(xiii)K8E、D20E、M23N、R81H、D84Q、S87E、R120H、S130E、T133D;(xiv)L12E、L19Q、R81H、R120E、T133D;(xv)H16E、L19D、Q22E、M23Q、R81D、D84E、S87D、R120H、S130E、T133E;(xvi)Q11E、L12E、H16Q、L19D、Q22E、M23N、R81E、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E(配列番号21);(xvii)Q11E、H16E、L19D、M23E、R81D、S87E、R120H、Q126E、T133D;(xviii)Q11E、L12S、E15Q、H16N、L19D、M23E、R81E、D84E、S87D、R120H、S130E、T133E;(xix)Q11E、H16E、M23E、R81N、D84E、S87E、R120H、Q126E、S130E、T133E;(xx)Q11E、E15Q、H16E、Q22E、M23E、R81H、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D;(xxi)Q11E、L12D、Q13H、E15Q、H16E、Q22E、M23E、R81N、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E;(xxii)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81E、S87E、R120H、S130E、T133E;(xxiii)H16E、L19D、M23Q、R81N、D84E、S87D、R120H、S130E、T133D;(xxiv)Q11E、L12T、E15Q、H16E、L19D、Q22H、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E;(xxv)Q11E、L12T、E15Q、H16E、L19D、Q22H、M23E、R81E、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E;(xxvi)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81E、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E;(xxvii)H16E、Q22E、M23Q、S87N、R120H、S130E、T133E;(xxviii)H16E、L19D、Q22D、M23Q、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E;(xxiix)Q11E、L12E、Q13H、E15Q、H16N、L19D、Q22E、M23Q、R81E、D84E、S87D、E95D、R120H、T133E;(xxix)Q11E、L12T、H16E、L19D、Q22E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D;(xxx)Q11T、L12E、E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E、R120E、S130E、T133D;(xxxi)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E;(xxxii)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81Q、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E;(xxxiii)Q11E、L12S、H16E、L19D、M23Q、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E;(xxxiv)S6Y、L12E、Q13R、H16Q、Q22E、M23Q、R81N、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D;(xxxv)H16D、M23N、R81D、D84E、R120H、S130E、T133E;(xxxvi)Q11E、L12TE、H16Q、L19D、M23E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E;(xxxvii)Q11E、L12E、H16NE、M23N、R81E、D84E、R120H、S130E、T133E;(xxxviii)E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E;(xxxix)Q11E、R120H、S130E、T133D;又は(xl)Q11E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133Dを含む。
一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換Q11E(配列番号44にあるように)を含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換E15Q(配列番号45にあるように)を含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換H16E(配列番号46にあるように)を含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換L19D(配列番号47にあるように)を含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換Q22E(配列番号48にあるように)を含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換M23Q(配列番号49にあるように)を含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換R81D(配列番号50にあるように)を含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換D84E(配列番号51にあるように)を含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換S87E(配列番号52にあるように)を含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換R120H(配列番号53にあるように)を含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換Q126E(配列番号54にあるように)を含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換Q126H(配列番号55にあるように)を含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換S130E(配列番号56にあるように)を含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換T133E(配列番号57にあるように)を含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換T133D(配列番号58にあるように)を含む。
一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E及びS87E(配列番号59にあるように)を含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換Q11E、R120H、S130E及びT133D(配列番号60にあるように)を含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換Q11E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E及びT133D(配列番号61にあるように)を含む。
一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、それぞれ野生型IL-2ポリペプチドとの比較で、高親和性IL-2受容体に対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性を消失させるか又は低減し、中程度親和性IL-2受容体に対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性を保存する第1のアミノ酸変異を含む。一実施態様では、前記第1のアミノ酸変異は、ヒトIL-2の残基72に対応する位置にある。一実施態様では、前記アミノ酸変異は、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R、及びL72Kの群から選択されるアミノ酸置換である。さらに具体的な実施態様では、前記第1のアミノ酸変異は、アミノ酸置換L72Gである。一部の実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、それぞれ野生型IL-2ポリペプチドとの比較で、高親和性IL-2受容体に対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性を消失させるか又は低減し、中程度親和性IL-2受容体に対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性を保存する第2のアミノ酸変異を含む。一実施態様では、前記第2のアミノ酸変異は、ヒトIL-2の残基35、38、42、43、及び45に対応する位置から選択される位置にある。具体的な実施態様では、前記第2のアミノ酸変異は、ヒトIL-2の残基42に対応する位置にある。さらに具体的な実施態様では、前記第2のアミノ酸変異は、F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、及びF42Kの群から選択されるアミノ酸置換である。それよりもさらに具体的な実施態様では、前記第2のアミノ酸変異は、アミノ酸置換F42Aである。一部の実施態様では、変異体インターロイキン-2ポリペプチドは、それぞれ野生型IL-2ポリペプチドとの比較で、高親和性IL-2受容体に対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性を消失させるか又は低減し、中程度親和性IL-2受容体に対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性を保存する第3のアミノ酸変異を含む。特定の実施態様では、変異体インターロイキン-2ポリペプチドは、それぞれ野生型IL-2ポリペプチドとの比較で、高親和性IL-2受容体に対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性を消失させるか又は低減し、中程度親和性IL-2受容体に対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性を保存する3つのアミノ酸変異を含み、前記3つのアミノ酸変異は、ヒトIL-2の残基42、45、及び72に対応する位置にある。一実施態様では、前記3つのアミノ酸変異は、F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、Y45K、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R、及びL72Kの群から選択されるアミノ酸置換である。具体的な実施態様では、前記3つのアミノ酸変異は、アミノ酸置換F42A、Y45A及びL72Gである。一部の実施態様では、変異体インターロイキン-2ポリペプチドは、ヒトIL-2の残基3に対応する位置にあるIL-2のO-グリコシル化部位を除去するアミノ酸変異をさらに含む。一実施態様では、ヒトIL-2の残基3に対応する位置にあるIL-2のO-グリコシル化部位を除去する前記アミノ酸変異は、T3A、T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R、T3K、及びT3Pの群から選択されるアミノ酸置換である。具体的な実施態様では、ヒトIL-2の残基3に対応する位置にあるIL-2のO-グリコシル化部位を除去するアミノ酸変異はT3Aである。一部の実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、ヒトIL-2の残基125に対応する位置にあるアミノ酸をさらに含む。具体的な実施態様では、ヒトIL-2の残基125に対応する位置にあるアミノ酸はC125Aである。一部の実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、本質的に、全長IL-2分子、特にヒト全長IL-2分子である。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、群T3A、F42A、Y45A、L72G、C125Aから選択されるアミノ酸置換を含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換T3A、F42A、Y45A、L72G及びC125Aを含む。
一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、非IL-2部分に結合している。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、第1の非IL-2部分及び第2の非IL-2部分に結合している。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、第1の非IL-2部分及び第2の非IL-2部分に結合している。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、前記第1の非IL-2部分とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、前記第2の非IL-2部分とアミノ末端ペプチド結合を共有する。一部の実施態様では、非IL-2部分は標的化部分である。一部の実施態様では、前記非IL-2部分は、抗原結合部分又はエフェクター細胞結合部分である。一実施態様では、前記抗原結合部分は抗体である。別の実施態様では、前記抗原結合部分又はエフェクター細胞結合部分は抗体断片である。さらに具体的な実施態様では、前記抗原結合部分エフェクター細胞結合部分は、Fab分子及びscFv分子から選択される。特定の実施態様では、前記抗原結合部分又はエフェクター細胞結合部分はFab分子である。別の実施態様では、前記抗原結合部分又はエフェクター細胞結合部分はscFv分子である。一実施態様では、前記抗原結合部分又はエフェクター細胞結合部分は免疫グロブリン分子である。さらに具体的な実施態様では、前記抗原結合部分又はエフェクター細胞結合部分は、IgGクラス、特にIgGサブクラスの免疫グロブリン分子である。一部の実施態様では、前記抗原結合部分は、腫瘍細胞上又は腫瘍細胞環境内に提示される抗原、特に線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、テネイシン-CのA1ドメイン(TNC A1)、テネイシン-CのA2ドメイン(TNC A2)、フィブロネクチンのエキストラドメインB(EDB)、がん胎児性抗原(CEA)及び黒色腫関連コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン(MCSP)の群から選択される抗原に向けられている。一部の実施態様では、前記エフェクター細胞結合部分は、シス・ターゲティング、特にCD8、PD-1、LAG3、TIM3、TIGIT、CD28、4-1BB、OX40、GITR、ICOS、CXCR3、CXCR5の群から選択される標的を達成するために、腫瘍細胞環境に存在するエフェクター細胞に向けられている。
さらなる態様では、本発明は、ここに記載される変異体IL-2ポリペプチド、及び抗原結合部分及び/又はエフェクター細胞結合部分を含むイムノコンジュゲートを提供する。本発明によるイムノコンジュゲートの一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ末端又はカルボキシ末端ペプチド結合を、前記抗原結合部分又は前記エフェクター細胞結合部分と共有する。特定の実施態様では、イムノコンジュゲートは、第1の抗原結合部分と第2の抗原結合部分、又は第1のエフェクター細胞抗原結合部分と第2のエフェクター細胞抗原結合部分、又は抗原結合部分とエフェクター細胞結合部分を含む。このような一実施態様では、本発明によるイムノコンジュゲートに含まれる変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ末端又はカルボキシ末端のペプチド結合を前記第1の抗原結合部分と共有し、前記第2の抗原結合部分は、アミノ末端又はカルボキシ末端のペプチド結合を、a)前記変異体IL-2ポリペプチド又はb)前記第1の抗原結合部分と共有する。別の実施態様では、本発明によるイムノコンジュゲートに含まれる変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ末端又はカルボキシ末端のペプチド結合を、前記第1のエフェクター細胞結合部分と共有し、前記第2のエフェクター細胞結合部分は、アミノ末端又はカルボキシ末端のペプチド結合を、a)前記変異体IL-2ポリペプチド又はb)前記第1のエフェクター細胞結合部分と共有する。別の実施態様では、本発明によるイムノコンジュゲートに含まれる変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ末端又はカルボキシ末端のペプチド結合を、抗原結合部分と共有し、エフェクター細胞結合部分は、アミノ末端又はカルボキシ末端のペプチド結合を、a)前記変異体IL-2ポリペプチド又はb)前記抗原結合部分と共有する。別の実施態様では、本発明によるイムノコンジュゲートに含まれる変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ末端又はカルボキシ末端のペプチド結合を、エフェクター細胞結合部分と共有し、抗原結合部分は、アミノ末端又はカルボキシ末端のペプチド結合を、a)前記変異体IL-2ポリペプチド又はb)前記エフェクター細胞結合部分と共有する。
一実施態様では、本発明によるイムノコンジュゲートに含まれる抗原結合部分及び/又はエフェクター細胞結合部分は抗体である。別の実施態様では、前記抗原結合部分及び/又はエフェクター細胞結合部分は抗体断片である。具体的な実施態様では、前記抗原結合部分及び/又はエフェクター細胞結合部分は、Fab分子及びscFv分子から選択される。特定の実施態様では、前記抗原結合部分及び/又はエフェクター細胞結合部分はFab分子である。別の特定の実施態様では、前記抗原結合部分及び/又はエフェクター細胞結合部分は免疫グロブリン分子である。さらに具体的な実施態様では、前記抗原結合部分及び/又はエフェクター細胞結合部分は、IgGクラス、特にIgGサブクラスの免疫グロブリン分子である。一部の実施態様では、前記抗原結合部分は、腫瘍細胞上又は腫瘍細胞環境内に提示される抗原、特に線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、テネイシン-CのA1ドメイン(TNC A1)、テネイシン-CのA2ドメイン(TNC A2)、フィブロネクチンのエキストラドメインB(EDB)、がん胎児性抗原(CEA)及び黒色腫関連コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン(MCSP)の群から選択される抗原に向けられている。一部の実施態様では、エフェクター細胞結合部分は、シス・ターゲティング、特にCD8、PD-1、LAG3、TIM3、TIGIT、CD28、4-1BB、OX40、GITR、ICOS、CXCR3、CXCR5の群から選択される標的を達成するために、
腫瘍細胞環境に存在するエフェクター細胞に向けられている。
本発明は、ここに記載される変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートをコードする単離されたポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記ポリヌクレオチド又は発現ベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。
さらに提供されるのは、ここに記載される変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを生成する方法、ここに記載される変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物、及びここに記載される変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを使用する方法である。
特に、本発明は、治療を必要とする個体の疾患の治療における使用のための、ここに記載される変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを包含する。特定の実施態様では、前記疾患はがんである。特定の実施態様では、個体はヒトである。
本発明にさらに包含されるのは、治療を必要とする個体の疾患を治療するための医薬の製造のための、ここに記載される変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの使用である。
さらに提供されるのは、ここに記載される変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを含む組成物の治療的有効量を個体に投与することを含む、前記個体の疾患を治療する方法である。前記疾患は、好ましくはがんである。
さらに提供されるのは、薬学的に許容される形態の、ここに記載される変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを含む組成物の有効量を個体に投与することを含む、前記個体の免疫系を刺激する方法である。
IL2Rベータ及びガンマ(IL2Rβγ)サブユニットの細胞外ドメイン(ECD)を含むコンストラクトの概略図である。 pH6及びpH7.4におけるIL2v結合の受容体IL2Rβγへの結合の、ELISAによる分析を示している。IL2vを含有する細菌の上清を、以前にコーティングされたIL2Rβγと共にインキュベートした。抗Flag/HRP二次抗体による検出に先立ち、30分間の大規模洗浄をpH6又はpH7.4で実施した。 ELISAによるpH6及びpH7.4での選択されたpH依存性IL2vバリアントの第1の組のIL2Rβγに対する結合分析を示している。クローンpH依存性IL2vバリアントを含有する細菌の上清を、以前にコーティングされたIL2Rβγと共にインキュベートした。抗Flag/HRP二次抗体による検出に先立ち、30分間の大規模洗浄をpH6又はpH7.4で実施した。pH6での吸収を値1に正規化し、吸収レベルの比率を比較した。 ELISAによるpH6、pH6.5、pH7及びpH7.4での選択されたpH依存性IL2vバリアントの第2の組のIL2Rβγに対する結合分析を示している。クローンpH依存性IL2vバリアントを含有する細菌の上清を、以前にコーティングされたIL2Rβγと共にインキュベートした。抗Flag/HRP二次抗体による検出に先立ち、30分間の大規模洗浄をpH6又はpH7.4で実施した。pH6での吸収を値1に正規化し、吸収レベルの比率を比較した。 SPRによるpH6及びpH7.4での選択されたpH依存性IL2vバリアントのIL2Rβγに対する結合分析である。例示的結合分析が提供されている。 選択されたクローンを、図5Aに示したものと同じ条件下で分析した。 選択されたクローンを、図5Aに示したものと同じ条件下で分析した。 選択されたクローンを、図5Aに示したものと同じ条件下で分析した。 選択されたクローンを、図5Aに示したものと同じ条件下で分析した。 A~Bは、通常のpH(図6A);又は低いpH(図6B)でのヒトNK細胞における抗CD8-IL2v(pH)コンストラクトによる濃度依存性pSTAT5誘導を示している。 正常なpH及び低いpHでのヒトNK細胞中の抗CD8-IL2v(pH)コンストラクトによるpSTAT5 活性化(AUC)の比較を示している。 空のFcノブ鎖のC末端に融合したIL2v又はそのpH依存性バリアントを有するワンアーム型CD8標的化IgG PG LALAを示している。 A~Dは、抗CD8-IL2v(pH)コンストラクトによる、pH6.5でのCD8+ T細胞(A)、pH6.5でのNK細胞(B)、pH7.4でのCD8+ T細胞(図9C)及びpH7.4でのNK細胞(図9D)の増殖誘導を示している。 CD8+ T細胞(A)又はNK細胞(B)のpH6.5及びpH7.5でのpH依存性増殖の決定を示している。 in vitroでの5日間のインキュベーションの間に抗CD8-IL2v(pH)コンストラクトにより媒介された、CD8+ T細胞及びNK細胞の、CD69発現による活性化(それぞれC及びD)と、CD25発現による活性化(それぞれE及びF)とを示している。 免疫細胞活性化及び増殖の曲線下面積(AUC)値に基づく、pH6.5からpH7.4での抗CD8-IL2v(pH)コンストラクト活性率の決定を示している。 Fcノブ鎖のC末端に融合したIL2v又はそのpH依存性バリアントを有する二価のPD1標的化IgG PG LALAを示している。 A~Dは、in vitroにおいて抗PD1-IL2v(pH)コンストラクトにより誘導されるpH6.5、pH6.8及びpH7.4でのCD25の発現(A及びB)及びCD69の発現による(C及びD)による、CD3刺激CD4+T細胞活性化及びCD8+T細胞活性化の強化の測定を示している。 Fcノブ鎖のC末端に融合したIL2又はそのpH依存性バリアントとの非標的化Fc PG LALA-融合物を示している。 5日間のインキュベーション後の、CD69により測定されたヒトCD8+ T細胞の活性化、及びin vitroにおいてpH6.5対pH7.4でIL2wt(pH)コンストラクトにより誘導された増殖を示している。 5日間のインキュベーション後の、CD69により測定されたヒトNK細胞の活性化と、in vitroにおいてpH6.5対pH7.4でIL2wt(pH)コンストラクトにより誘導された増殖を示している。
定義
以下で別段の定義がない限り、ここでは、当技術分野で一般的に使用される用語を使用する。
ここで使用される「インターロイキン-2」又は「IL-2」という用語は、別途指示がない限り、哺乳動物、例えば、霊長類(例えばヒト)及びげっ歯類(例えば、マウス及びラット)を含め、任意の脊椎動物源由来の任意の天然IL-2を指す。この用語は、未処理のIL-2と、細胞の処理から生じるIL-2の任意の形態を包含する。この用語は、IL-2の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトIL-2のアミノ酸配列を配列番号144に示す。
ここで使用される「IL-2変異」又は「変異体IL-2ポリペプチド」という用語は、全長IL-2、IL-2の切断型、及びIL-2が融合又は化学的コンジュゲーション等によって別の分子に結合した形態を含め、IL-2分子の種々の形態の任意の変異形態を包含することを意図している。「全長」は、IL-2を参照して使用される場合、成熟した天然の長さのIL-2分子を意味することを意図している。例えば、全長ヒトIL-2は、133個のアミノ酸を含む分子を指す(例えば、配列番号144)。種々の形態のIL-2変異体は、IL-2とCD25との相互作用に影響を与える少なくとも1つのアミノ酸変異を有することを特徴とする。この変異は、その位置に通常配置される野生型アミノ酸残基の置換、欠失、トランケーション又は修飾を含みうる。アミノ酸置換によって得られる変異体が好ましい。別途指示がない限り、IL-2変異体は、ここでは、IL-2変異体ペプチド配列、IL-2変異体ポリペプチド、IL-2変異タンパク質又はIL-2変異アナログと呼ばれうる。
IL-2の種々の形態の命名は、ここでは、配列番号144に示される配列に対して行われる。同じ変異を示すために、ここでは種々の名称が使用されうる。例えば、位置42でのフェニルアラニンからアラニンへの変異は、42A、A42、A42、F42A又はPhe42Alaとして示すことができる。
ここで使用される「アミノ酸変異」という用語は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び修飾を包含することを意味する。置換、欠失、挿入及び修飾の任意の組み合わせは、最終コンストラクトが、所望の特徴、例えば、CD25に対する結合の低下を有する限り、最終コンストラクトに到達するように行うことができる。アミノ酸配列の欠失及び挿入は、アミノ末端及び/又はカルボキシ末端のアミノ酸の欠失及び挿入を含む。末端の欠失の一例は、全長ヒトIL-2の位置1にあるアラニン残基の欠失である。好ましいアミノ酸変異はアミノ酸置換である。例えば、IL-2ポリペプチドの結合特徴を変える目的のために、非保存的アミノ酸置換(すなわち、1つのアミノ酸を、構造特性及び/又は化学特性が異なる別のアミノ酸と置き換えること)が特に好ましい。好ましいアミノ酸置換は、疎水性アミノ酸を親水性アミノ酸によって置き換えることを含む。アミノ酸置換には、天然に存在しないアミノ酸による、又は20の標準アミノ酸(例えば、4-ヒドロキシプロリン、3-メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、5-ヒドロキシリジン)の天然に存在するアミノ酸誘導体による置き換えが含まれる。アミノ酸変異は、当技術分野で既知の遺伝的方法又は化学的方法を使用して生成することができる。遺伝的方法には、特定部位の突然変異誘発、PCR、遺伝子合成などが含まれ得る。化学修飾等の遺伝子工学以外の方法によってアミノ酸の側鎖基を変更する方法も又有用でありうることが企図される。
ここで使用されるIL-2の「野生型」形態は、野生型形態が、変異体IL-2ポリペプチドのそれぞれのアミノ酸位置に野生型アミノ酸を有する以外は、変異体IL-2ポリペプチドと同じIL-2の形態である。例えば、IL-2変異体が全長IL-2である(すなわち、IL-2が、任意の他の分子に融合又はコンジュゲートしていない)場合、この変異体の野生型形態は全長天然ヒトIL-2である。IL-2変異体が、IL-2とIL-2の下流がコードされた別のポリペプチド(例えば、抗体鎖)との融合である場合、このIL-2異性体の野生型形態は、同じ下流のポリペプチドに融合した、野生型アミノ酸配列を有するIL-2である。さらに、IL-2変異体が、IL-2の切断型(IL-2のトランケートされていない部分の中の変異した形態又は修飾された形態)である場合、このIL-2変異体の野生型形態は、同様に、野生型配列を有するトランケートされたIL-2である。種々の形態のIL-2変異体のIL-2受容体結合親和性又は生物活性を、対応するIL-2の野生型形態と比較する目的のために、野生型という用語は、天然に存在する天然IL-2と比較して、IL-2受容体結合に影響を与えない1つ以上のアミノ酸変異、例えば、ヒトIL-2の残基125に対応する位置のシステインのアラニンへの置換を含むIL-2の形態を包含する。いくつかの実施態様では、本発明の目的のための野生型IL-2は、アミノ酸置換C125Aを含む。本発明による一部の実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドと比較される野生型IL-2ポリペプチドは、配列番号144のアミノ酸配列を含む。
ここで使用される「CD25」又は「IL-2受容体のα-サブユニット」という用語は、別途指示がない限り、哺乳動物、例えば、霊長類(例えばヒト)及びげっ歯類(例えば、マウス及びラット)を含め、任意の脊椎動物源由来の任意の天然CD25を指す。この用語は、「全長」の未処理のCD25と、細胞の処理から生じるCD25の任意の形態を包含する。この用語は、CD25の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。一部の実施態様では、CD25はヒトCD25である。
ここで使用される「高親和性IL-2受容体」という用語は、受容体γサブユニット(一般的なサイトカイン受容体γサブユニット、γ、又はCD132としても知られる)、受容体βサブユニット(CD122又はp70としても知られる)及び受容体αサブユニット(CD25又はp55としても知られる)からなるIL-2受容体のヘテロ三量体形態を指す。「中程度親和性IL-2受容体」という用語は、対照的に、γ-サブユニット及びβ-サブユニットのみを含み、α-サブユニットを含まないIL-2受容体を指す(総説として、例えば、Olejniczak and Kasprzak,Med Sci Monit 14,RA179-189(2008)を参照されたい)。
「親和性」は、分子の単一の結合部位(例えば、受容体)と、その結合パートナー(例えば、リガンド)との間の非共有結合的相互作用の合計強度を指す。別途指示がない限り、ここで使用される「結合親和性」は、結合対(例えば、受容体及びリガンド)のメンバー間の1:1の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子XのそのパートナーYに対する親和性は、概して、解離定数(K)によって表すことができ、解離速度定数と会合速度定数(それぞれkoff及びkon)の比である。したがって、速度定数の比率が同じままである限り、等価の親和性は、異なる速度定数を含みうる。親和性は、ここに記載するものを含め、当技術分野で既知の十分に確立された方法によって測定することができる。
IL-2受容体の種々の形態の変異体又は野生型のIL-2ポリペプチドの親和性は、実施例に示される方法に従って、表面プラズモン共鳴(SPR)によって、BIAcore装置(GE Healthcare)等の標準的な装置と、組み換え発現によって得られうるもの等の受容体サブユニットとを使用して決定することができる(例えば、Shanafelt et al.,Nature Biotechnol 18,1197-1202(2000)を参照されたい)。代替的に、IL-2受容体の異なる形態に対するIL-2変異体の結合親和性は、1つの又は他のそのような形態の受容体を発現することが知られている細胞株を使用して評価されうる。結合親和性を測定するための具体的で説明的な例示的実施態様を、以下に記載する。
「制御性T細胞」又は「Treg細胞」は、他のT細胞の応答を抑制することのできる特殊な種類のCD4 T細胞を意味する。Treg細胞は、IL-2受容体(CD25)のα-サブユニット及び転写因子フォークヘッドボックスP3(FOXP3)の発現を特徴とし(Sakaguchi,Annu Rev Immunol 22,531-62(2004))、腫瘍によって発現されるものを含め、抗原に対する末梢性セルフトレランスの導入及び維持に重要な役割を果たす。Treg細胞は、その機能及び成長、並びにその抑制特徴の誘導のために、IL-2を必要とする。
ここで使用される「エフェクター細胞」という用語は、IL-2の細胞毒性効果を媒介するリンパ球の集合を指す。エフェクター細胞には、エフェクターT細胞、例えば、CD8細胞傷害性T細胞、NK細胞、リンホカイン活性化キラー(LAK)細胞及びマクロファージ/単球が含まれる。
ここで使用される用語「抗原結合部分」は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施態様では、抗原結合部分は、結合している実体(例えば、サイトカイン又は第2の抗原結合部分)を標的部位、例えば抗原決定基を持つ特定の種類の腫瘍細胞又は腫瘍間質に向けることができる。抗原結合部分は、ここにさらに定義される抗体及びその断片を含む。好ましい抗原結合部分は、抗体重鎖可変領域と抗体軽鎖可変領域とを含む、抗体の抗原結合ドメインを含む。特定の実施態様では、抗原結合部分は、ここでさらに定義され、当技術分野で知られているような抗体定常領域を含んでいてもよい。有用な重鎖定常領域は、α、δ、ε、γ又はμの5つのアイソタイプのいずれかを含む。有用な軽鎖定常領域は、κ及びλの2つのアイソタイプのいずれかを含む。
「特異的に結合する」とは、結合が抗原選択性であり、望ましくない相互作用又は非特異的な相互作用とは判別することができることを意味する。抗原結合部分の、特定の抗原決定基への結合能は、酵素結合免疫吸着法(ELISA)又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴法(BIAcore機器で分析)(Liljeblad et al.,Glyco J 17,323-329(2000))及び古典的な結合アッセイ(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))により測定することができる。
ここで使用される「抗原決定基」という用語は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分-抗原複合体を形成する、抗原結合部分が結合するポリペプチド巨大分子上の部位(例えば、アミノ酸の連続伸長部又は非連続アミノ酸の異なる領域から構成される配座構成)を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染した細胞の表面上に、他の罹患細胞の表面上に、血清中で遊離して、及び/又は細胞外マトリックス(ECM)内に認めることができる。
ここで使用される用語「ポリペプチド」は、アミノ結合(ペプチド結合としても知られる)により直鎖状に結合した単量体(アミノ酸)で構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、2つ以上のアミノ酸の鎖を指すのであって、特定の長さの生成物を指すのではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」又は2つ以上のアミノ酸の鎖を指すために使用される他の任意の用語は「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これら用語の代わりに、又はこれらのいずれかと互換可能に使用されうる。用語「ポリペプチド」は、ポリペプチドの発現後修飾の生成物を指すことも意図されており、このような生成物には、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基/ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解性切断、又は天然に存在しないアミノ酸による修飾が含まれる。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源から誘導されてもよく、又は組み換え技術によって生成されてもよいが、指定の核酸配列から必ずしも翻訳されない。ポリペプチドは、化学合成によるものを含め、任意の様式で生成されうる。本発明のポリペプチドは、約3以上、5以上、10以上、20以上、25以上、50以上、75以上、100以上、200以上、500以上、1,000以上、又は2,000以上のアミノ酸の大きさであってよい。ポリペプチドは、規定の三次元構造を有することができるが、そのような構造を必ずしも有するものではない。規定の三次元構造を有するポリペプチドは、折りたたまれていると称され、規定の三次元構造を有するのではなく多数の異なる立体配座を採用することのできるポリペプチドは、折りたたまれていないと称される。
「単離された」ポリペプチド若しくはバリアント又はその誘導体は、その自然の環境にないポリペプチドを意図している。特定のレベルの精製は、必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然又は自然の環境から取り出すことができる。宿主細胞に発現される組み換え生成されたポリペプチド及びタンパク質は、任意の適切な技術によって、分離され、断片化され、又は部分的に若しくは実質的に精製された天然ポリペプチド又は組み換えポリペプチドと同様に、本発明の目的のために単離されると考えられる。
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列の同一性パーセント(%)」は、配列を整列させ、必要ならばギャップを導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後、配列同一性の一部としてどのような保存的置換も考慮せずに、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当技術分野における技術の範囲内にある種々の方法において、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、又はMegalign(DNASTAR)ソフトウェア等の公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含め、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、ここでの目的のために、アミノ酸配列同一性%の値は、配列比較コンピュータープログラムALIGN-2を使用して生成される。ALIGN-2配列比較コンピュータープログラムは、Genentech,Inc.が作成したものであり、ソースコードは、使用者用書類と共に、米国著作権局、Washington D.C.,20559に提出され、米国著作権登録番号TXU510087として登録されている。ALIGN-2プログラムは、Genentech,Inc.(South San Francisco,California)から公的に入手可能であるか、又はそのソースコードからコンパイルされうる。ALIGN-2プログラムは、デジタルUNIX V4.0Dを含め、UNIXオペレーティングシステムで使用するためにコンパイルされるべきである。すべての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され、変化しない。ALIGN-2がアミノ酸配列比較に用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Bへの、アミノ酸配列Bとの、又はアミノ酸配列Bに対する、所与のアミノ酸配列Aのアミノ酸配列同一性%(あるいは、所与のアミノ酸配列Bへの、アミノ酸配列Bとの、又はアミノ酸配列Bに対する、特定のアミノ酸配列同一性%を有する又は含む、所与のアミノ酸配列Aとして記述することができる)は、以下のように計算される:
100×分数X/Y
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN-2により、AとBのそのプログラムのアラインメントにおいて同一であるとして一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対するアミノ酸配列同一性%は、BのAに対するアミノ酸配列同一性%とは異なることは理解されるであろう。特に別段の既述がない限り、ここで使用されるすべてのアミノ酸配列同一性%の値は、ALIGN-2コンピュータープログラムを使用して、直前の段落に記載されるようにして得られる。
「ポリヌクレオチド」という用語は、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA)、ウイルス由来のRNA、又はプラスミドDNA(pDNA)を指す。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合又は従来の結合以外の結合(例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸(PNA)中に見出されるもの)を含んでいてもよい。「核酸分子」という用語は、任意の1つ以上の核酸セグメント、例えば、ポリヌクレオチド中に存在するDNA又はRNA断片を指す。
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドは、その天然環境から取り除かれた核酸分子、DNA又はRNAである。例えば、ベクターに含有される治療的ポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞において維持された組み換えポリヌクレオチド、又は溶液中の精製された(部分的に又は実質的に)、ポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、元々ポリヌクレオチド分子を含有する細胞において含有されているポリヌクレオチド分子を含むが、ポリヌクレオチド分子は、染色体外に存在するか、又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。単離されたRNA分子は、本発明のin vivo又はin vitroRNA転写物と、陽性及び陰性の鎖形態、及び二本鎖形態とを含む。本発明による単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成によって生成されるそのような分子をさらに含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーター等の調節要素であってもよいか、又は調節要素を含んでいてもよい。
本発明の参照ヌクレオチド配列と、例えば、少なくとも95%「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の各100ヌクレオチドあたり5つまでの点変異を含みうること以外は、参照配列と同一であることを意味する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大5%のヌクレオチドが欠失しているか又は別のヌクレオチドで置換されていてもよく、或いは参照配列中の全ヌクレオチドの最大5%の数のヌクレオチドが参照配列に挿入されていてもよい。参照配列のこのような変更は、参照ヌクレオチド配列の5’若しくは3’末端位置で、又はこれら末端位置の間のどの位置で起こってもよく、参照配列中の残基間に個々に散在してもよいし、又は参照配列内に1つ以上の連続した群として散在してもよい。実際の様式として、任意の特定のポリヌクレオチド配列は、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるかどうかは、既知のコンピュータープログラム、例えばポリペプチドについて上に記載したもの(例えばALIGN-2)を使用して、従来通りに決定することができる。
用語「発現カセット」は、標的細胞内の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いて、組み換え又は合成で生成されたポリヌクレオチドを指す。組み換え発現カセットには、プラスミド、染色体、ミトコンドリアDNA、プラスチドDNA、ウイルス又は核酸断片を組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組み換え発現カセット部分は、配列の中でも特に、転写される核酸配列と、プロモーターとを含む。一部の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の変異体IL-2ポリペプチド若しくはイムノコンジュゲート又はその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞内で作用可能に会合する特定の遺伝子を導入し、その発現を指示するために使用されるDNA分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造体としてのベクター、及びそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、安定したmRNAの大量転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞転写及び/又は翻訳機構によって生成される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の変異体IL-2ポリペプチド若しくはイムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
用語「人工的」は、合成組成物、又は非宿主細胞から得られる組成物、例えば化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを指す。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は、交換可能に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、それには初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は、親細胞と核酸含有量の点で完全に同一でない場合があるが、変異を含んでもよい。元々形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体の子孫は、本明細書に含まれる。
用語「抗体」は、ここでは最も広い意味で使用され、種々の抗体構造を包含し、限定されないが、所望な抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、及び抗体断片を含む。
「全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、ここでは交換可能に使用され、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、又はここに定義されるFc領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子(例えば、scFv)、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。一部の抗体断片の総説として、Hudson et al.,Nat Med 9、129-134(2003)を参照されたい。scFv断片の総説としては、例えば、Pluckthun,in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol. 113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)を参照されたい。また、国際公開第93/16185号及び米国特許第5,571,894号及び同第5,587,458号を参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、in vivo半減期が長くなったFab及びF(ab’)断片の説明については、米国特許第5,869,046号を参照されたい。ダイアボディは、二価又は二重特異性でありうる2つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、EP第404,097号、国際公開第1993/01161号、Hudson et al.,Nat Med 9,129-134(2003);及びHollinger et al.,Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディも、Hudson et al.,Nat Med 9,129-134(2003)に記載されている。抗体断片は、限定されないが、ここに記載されるインタクトな抗体のタンパク質分解性の消化、及び組み換え宿主細胞(例えば、大腸菌又はファージ)による生成を含め、種々の技術によって作製することができる。
「免疫グロブリン分子」という用語は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、IgGクラスの免疫グロブリンは、約150,000ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質であり、ジスルフィド結合した2つの軽鎖と2つの重鎖で構成される。N末端からC末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VH)を有し、それに重鎖定常領域とも呼ばれる3つの定常ドメイン(CH1、CH2及びCH3)が続いている。同様に、N末端からC末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VL)を有し、それに軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖(CL)ドメインが続いている。免疫グロブリンの重鎖は、α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)又はμ(IgM)と呼ばれる5つのクラスの1つに割り当てられてもよく、このいくつかは、例えば、γ(IgG)、γ(IgG)、γ(IgG)、γ(IgG)、α(IgA)及びα(IgA)等のサブタイプにさらに分けられてもよい。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる2種類のうちの1つに割り当てられてもよい。免疫グロブリンは、本質的に、免疫グロブリンヒンジ領域を介して接続する2つのFab分子と1つのFcドメインからなる。
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し且つ抗原の一部又は全部に相補的な領域を含む、抗体の部分を指す。抗原結合ドメインは、例えば、1つ以上の抗体可変ドメイン(抗体可変領域とも呼ばれる)によって提供されうる。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域(VL)と、抗体重鎖可変領域(VH)とを含む。
「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体と抗原との結合に関与する、抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン(それぞれVH及びVL)は、一般に、類似の構造を有しており、各ドメインは、4つの保存されたフレームワーク領域(FR)と、3つの超可変領域(HVR)とを含む。例えば、Kindt et al.,Kuby Immunology、6th ed.,W.H. Freeman and Co.,page 91(2007)を参照されたい。単一のVH又はVLドメインは、抗原結合特異性を与えるために十分でありうる。
ここで使用される用語「超可変領域」又は「HVR」は、配列が超可変であり且つ/又は構造的に定義されたループ(「超可変ループ」)を形成する抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般に、天然4鎖抗体は、VHに3つ(H1、H2、H3)、及びVLに3つ(L1、L2、L3)、計6つのHVRを含む。一般に、HVRは、超可変ループ由来及び/又は相補性決定領域(CDR)由来のアミノ酸残基を含み、後者は配列可変性が最も高く、且つ/又は抗原認識に関与している。VHにおけるCDR1を除き、CDRは、概して、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域(HVR)は、「相補性決定領域」(CDR)とも呼ばれ、ここでこれら用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して交換可能に使用される。この特定の領域は、Kabat et al.,U.S. Dept. of Health and Human Services,Sequences of Proteins of Immunological Interest(1983)、及びChothia et al.,J Mol Biol 196:901-917(1987)によって記載されており、ここで、この定義は、互いに対して比較されたとき、アミノ酸残基の重複又はサブセットを含む。とはいえ、抗体又はそのバリアントのCDRを指すことを意図したいずれかの定義の適用は、ここで定義及び使用される用語の範囲内にあることを意図している。上記引用文献の各々により定義されるCDRを包含する適切なアミノ酸残基を、比較として以下の表1に示す。特定のCDRを包含する正確な残基番号は、CDRの配列と大きさに応じて変化するであろう。当業者であれば、抗体の可変領域アミノ酸配列があれば、どの残基が特定のCDRを含むかを常套的に決定することができる。
表1.CDRの定義
Figure 2023551563000002
表1のすべてのCDR定義の番号付けは、Kabatらによって規定された番号付け規則に従っている(下記を参照)。
表1で使用されている、「b」が小文字の「AbM」は、Oxford Molecularの「AbM」抗体モデル化ソフトウェアによって定義されているCDRを指す。
Kabatらは、あらゆる抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者であれば、配列自体を超える実験データに頼らなくとも、この「Kabat番号付け」のシステムを任意の可変領域配列に明確に割り当てることができる。ここで使用される「Kabat番号付け」は、Kabat et al.,U.S. Dept. of Health and Human Services,”Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)により規定された番号付けシステムを指す。別途指定のない限り、抗体可変領域における特定のアミノ酸残基位置の番号付けへの言及は、Kabat番号付けシステムによるものである。
「フレームワーク」又は「FR」は、超可変領域(HVR)残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのFRは、一般に、4つのFRドメイン:FR1、FR2、FR3及びFR4からなる。したがって、HVR及びFR配列は、一般に、VH(又はVL)中において以下の配列に現れる:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
抗体の「クラス」は、その重鎖によって保有される定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には、次の5種類の主要なクラス:IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMがあり、これらのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG、IgG、IgG、IgG、IgA、及びIgAにさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
用語「Fc領域」は、ここでは定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Fc領域及びバリアントFc領域を含む。IgG重鎖のFc領域の境界は、わずかに変動してもよいが、ヒトIgG重鎖Fc領域は、通常、Cys226から、又はPro230から、重鎖のカルボキシ末端まで延びるよう規定されている。しかしながら、Fc領域のC末端リジン(Lys447)は、存在してもしてなくてもよい。
「修飾促進ヘテロ二量体化」は、ポリペプチドが同一のポリペプチドと会合してホモ二量体を形成することを低減又は防止する、ペプチド骨格の操作又はポリペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖の翻訳後修飾である。ここで使用される修飾促進ヘテロ二量体化は、特に、二量体を形成することが望ましい2つのポリペプチドの各々に対して行われる別個の修飾を含み、この修飾は、2つのポリペプチドの会合を促進するように、互いに対して相補性である。例えば、修飾促進ヘテロ二量体化は、ポリペプチドの会合をそれぞれ立体的に又は静電的に好ましいものにするように、二量体を形成することが望ましいポリペプチドの一方又は両方の構造又は電荷を変化させうる。ヘテロ二量体化は、2つの非同一のポリペプチド、例えば重鎖の各々に融合したさらなるイムノコンジュゲート成分(例えばIL-2ポリペプチド)が同じでない2つの免疫グロブリン重鎖の間で起こる。本発明のイムノコンジュゲートでは、修飾促進ヘテロ二量体化は、免疫グロブリン分子の1つ又は複数の重鎖、具体的にはFcドメインで起こる。いくつかの実施態様では、修飾促進ヘテロ二量体化は、アミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、修飾促進ヘテロ二量体化は、2つの免疫グロブリン重鎖の各々に、別個のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。
「エフェクター機能」という用語は、抗体に言及して使用されるとき、抗体のFc領域に起因する生物活性を指し、抗体アイソタイプによって変わる。抗体エフェクター機能の例には:C1q結合及び補体依存性細胞傷害(CDC)、Fc受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)、抗体依存性細胞貪食(ADCP)、サイトカイン分泌、細胞表面受容体(例えばB細胞受容体)の下方制御、並びにB細胞活性化が含まれる。
「活性化Fc受容体」は、抗体のFc領域による係合の後に、エフェクター機能を発揮するために受容体を有する細胞を刺激するシグナル伝達事象を誘発するFc受容体である。活性化Fc受容体には、FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)及びFcαRI(CD89)が含まれる。
ここで使用される用語「操作する、操作された、操作」は、ペプチド骨格の任意の操作、又は天然に存在するポリペプチド若しくは組み換えポリペプチド又はその断片の翻訳後修飾を含むと考えられる。操作には、アミノ酸配列、グリコシル化パターン、又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾、及びこれらの手法の組み合わせが含まれる。
ここで使用される用語「イムノコンジュゲート」は、少なくとも1つのIL-2部分と少なくとも1つの抗原結合部分とを含むポリペプチド分子を指す。一部の実施態様では、イムノコンジュゲートは、少なくとも1つのIL-2部分と、少なくとも2つの抗原結合部分とを含む。本発明による特定のイムノコンジュゲートは、本質的に、1つのIL-2部分と、1つ以上のリンカー配列によって接合された2つの抗原結合部分とからなる。抗原結合部分は、様々な相互作用により、ここに記載される様々な構成で、IL-2部分に接合させることができる。
ここで使用される用語「制御抗原結合部分」は、他の抗原結合部分及びエフェクター部分を含まずに存在する場合の抗原結合部分を指す。例えば、本発明のFab-IL2-Fabイムノコンジュゲートを制御抗原結合部分と比較するとき、制御抗原結合部分はFabを含まず、Fab-IL2-Fabイムノコンジュゲートと遊離Fab分子は、ともに同じ抗原決定基に特異的に結合する。
ここで使用される、抗原結合部分等に関する「第1の」及び「第2の」という用語は、各種類の部分が複数存在するときに区別する便宜上使用される。これらの用語の使用は、そのように明示的に示されていない限り、イムノコンジュゲートの特定の順序又は向きを与えることを意図していない。
「有効量」の薬剤は、それが投与される細胞又は組織の生理的変化をもたらすために必要な量である。
薬剤、例えば、医薬組成物の「治療的有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するために必要な投薬量及び期間において有効な量を指す。薬剤の治療的有効量は、例えば、疾患の有害作用を除去し、低下させ、遅延させ、最小化し、又は予防する。
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物(例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ)、霊長類(例えば、ヒト及びサル等の非ヒト霊長類)、ウサギ、げっ歯類(例えば、マウス及びラット)が含まれる。好ましくは、個体又は対象はヒトである。
「医薬組成物」という用語は、その中に含まれる有効成分の生物活性を有効にし、組成物が投与される対象に許容不能なほど毒性であるさらなる成分を含有しない形態の調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」は、有効成分以外の、医薬組成物中の成分であって、対象にとって毒性でない成分を指す。薬学的に許容される担体には、バッファー、賦形剤、安定剤、又は防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。
ここで使用される、「治療(treatment)」(及びその文法的な変化形、例えば、「治療する(treat)」又は「治療すること(treating)」)は、治療される個体において疾患の本来の経過を変えようとする試行における臨床的介入を指し、予防のために又は臨床病理の経過の間に実施することができる。治療の所望の効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症候の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的帰結の減弱、転移を予防すること、疾患進行率を低下させること、病状の改善又は緩和、及び回復又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるため、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
ここで使用される「pH依存性」は、環境のpHに依存する、分子、特にIL-2バリアントの特性、特にIL-2バリアントの特性を指し、例えば、第1のpH範囲と第2のpH範囲は重複しないか又は第1のpH値と第2のpH値は同一でない場合に、受容体結合は第1のpH範囲又はpH値において促されるが、第2のpH範囲又はpH値においては同じ品質で促されない。
ここで使用される「pH依存性IL-2受容体結合」は、前記分子が、pH依存性に、IL-2受容体、特異的IL-2受容体サブユニット又はIL-2受容体サブユニットの組み合わせに結合する、分子、特にIL-2バリアントの結合特性を指す。前記「pH依存性IL-2受容体結合」は、pH依存性IL-2が、IL-2受容体、IL-2受容体サブユニット又はIL-2受容体サブユニットの組み合わせに、やや酸性のpH、例えばpH6.0及び/又はpH6.5において結合し、全身pH、例えばpH7.0及び/又はpH7.4において低減又は消失した受容体結合を示す状況に関連するが、それに限定されない。
実施態様の詳細な説明
本発明は、免疫療法の改善された特性を有する変異体IL-2ポリペプチドを提供することを目指している。特に、本発明は、毒性に寄与するがIL-2の有効性に必須でないIL-2の薬理的特性を除去することを目指している。上述のように、異なる形態のIL-2受容体は、異なるサブユニットからなり、IL-2に対して異なる親和性を呈する。中程度親和性IL-2受容体は、β及びγ受容体サブユニットからなり、休止状態のエフェクター細胞上に発現し、IL-2シグナル伝達にとって十分である。高親和性IL-2受容体は、受容体のα-サブユニットをさらに含み、制御性T(Treg)細胞及び活性化されたエフェクター細胞で主に発現し、IL-2による係合によって、それぞれ、Treg細胞介在性免疫抑制又は活性化誘導細胞死(AICD)を促進することができる。したがって、理論によって束縛されることを望まないが、IL-2受容体のα-サブユニットに対するIL-2の親和性が低下するか又はなくなると、制御性T細胞によるエフェクター細胞機能のIL-2誘導下方制御、及びAICDのプロセスによる腫瘍耐性の進行が低減されるはずである。一方、中程度親和性IL-2受容体に対する親和性の維持は、IL-2によるNK細胞及びT細胞のようなエフェクター細胞の増殖及び活性化の誘導を保存するはずである。
複数のIL-2変異体が当技術分野に既存であるが、本発明者らは、免疫療法に望ましい特性をIL-2に付与するために特に適している、IL-2ポリペプチドの新規のアミノ酸変異及びそれらの組み合わせを発見した。
さらに、本発明は、中性pHにおいて低減又は消失した全身活性と、酸性pHにおいて腫瘍微小環境内に完全な活性とを有するpH依存性IL-2ポリペプチドを提供することを目指している。
第1の態様において、本発明は、それぞれ野生型IL-2、好ましくは配列番号144によるヒトIL-2との比較で、1つ以上のアミノ酸置換を含む変異体インターロイキン-2(IL-2)ポリペプチドを提供し、1つ以上のアミノ酸置換は、中性pHにおいて、IL-2受容体への結合、好ましくは中程度親和性IL-2受容体(IL2Rβγ)への結合を消失させるか又は低減し、かつ低下したpHにおいて、IL-2受容体への結合、好ましくは中程度親和性IL-2受容体(IL2Rβγ)への結合を容易にする。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、それぞれ配列番号144によるヒトIL-2との比較での1つ以上のアミノ酸置換を含み、1つ以上のアミノ酸置換は、中性pHにおいて、中程度親和性IL-2受容体(IL2Rβγ)への結合を消失させるか又は低減し、かつ低下したpHにおいて、中程度親和性IL-2受容体(IL2Rβγ)への結合を容易にする。
一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、pH7.4及び/又はpH7.0において、低減又は消失したIL-2受容体結合、好ましくは中程度親和性IL-2受容体結合を呈し、pH6及び/又はpH6.5において、IL-2受容体結合、好ましくは中程度親和性IL-2受容体結合を保持していた。一実施態様では、前記1つ以上のアミノ酸置換は、配列番号144によるヒトIL-2の残基6、8、11、12、13、15、16、19、20、22、23、81、84、87、91、95、120、123、126、130、133に対応する位置の群から選択される位置にある。一実施態様では、前記1つ以上のアミノ酸置換は、S6Y、K8E、Q11E、Q11T、L12D、L12E、L12Q、L12S、L12T、Q13H、Q13R、E15Q、H16D、H16E、H16N、H16Q、L19D、L19Q、D20E、D20Q、Q22D、Q22E、Q22H、M23E、M23N、M23Q、R81D、R81E、R81H、R81N、R81Q、D84E、D84Q、S87D、S87E、S87N、S87Q、V91D、V91E、V91N、E95D、E95Q、R120E、R120H、T123E、T123Q、Q126E、Q126H、S130E、T133D、T133E、T133N、T133Qの群から選択される。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換(i)L12E、D20E、M23N、R81N、D84E、S87E、R120E、T123E、S130E、T133N;(ii)Q11E、D20Q、M23E、R81D、D84E、S87E、S130E、T133N;(iii)L12E、L19D、R81D、R120E、T123E、S130E、T133E;(iv)R81Q、S87E、V91D、T123E、S130E、T133D;(v)Q11E、L12E、M23Q、R81D、S87E、V91D、S130E、T133Q;(vi)Q11E、L19D、R81D、D84E、S130E、T133D;(vii)R81D、D84Q、S87D、V91N、T123Q、S130E、T133D;(viii)L19D、R81E、D84E、S87Q、R120H、S130E、T133E;(iix)L19D、M23N、R81D、T133E;(ix)Q11E、L12E、M23Q、R81Q、S87D、V91N、E95Q、R120H、T123E、S130E、T133E;(x)L19D、R81E、S130E、T133D;(xi)R81Q、S87E、V91D、R120E、S130E、T133D;(xii)L12Q、L19Q、R81H、V91E、T123E、S130E、T133E;(xiii)K8E、D20E、M23N、R81H、D84Q、S87E、R120H、S130E、T133D;(xiv)L12E、L19Q、R81H、R120E、T133D;(xv)H16E、L19D、Q22E、M23Q、R81D、D84E、S87D、R120H、S130E、T133E;(xvi)Q11E、L12E、H16Q、L19D、Q22E、M23N、R81E、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E;(xvii)Q11E、H16E、L19D、M23E、R81D、S87E、R120H、Q126E、T133D;(xviii)Q11E、L12S、E15Q、H16N、L19D、M23E、R81E、D84E、S87D、R120H、S130E、T133E;(xix)Q11E、H16E、M23E、R81N、D84E、S87E、R120H、Q126E、S130E、T133E;(xx)Q11E、E15Q、H16E、Q22E、M23E、R81H、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D;(xxi)Q11E、L12D、Q13H、E15Q、H16E、Q22E、M23E、R81N、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E;(xxii)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81E、S87E、R120H、S130E、T133E;(xxiii)H16E、L19D、M23Q、R81N、D84E、S87D、R120H、S130E、T133D;(xxiv)Q11E、L12T、E15Q、H16E、L19D、Q22H、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E;(xxv)Q11E、L12T、E15Q、H16E、L19D、Q22H、M23E、R81E、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E;(xxvi)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81E、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E;(xxvii)H16E、Q22E、M23Q、S87N、R120H、S130E、T133E;(xxviii)H16E、L19D、Q22D、M23Q、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E;(xxiix)Q11E、L12E、Q13H、E15Q、H16N、L19D、Q22E、M23Q、R81E、D84E、S87D、E95D、R120H、T133E;(xxix)Q11E、L12T、H16E、L19D、Q22E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D;(xxx)Q11T、L12E、E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E、R120E、S130E、T133D;(xxxi)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E;(xxxii)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81Q、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E;(xxxiii)Q11E、L12S、H16E、L19D、M23Q、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E;(xxxiv)S6Y、L12E、Q13R、H16Q、Q22E、M23Q、R81N、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D;(xxxv)H16D、M23N、R81D、D84E、R120H、S130E、T133E;(xxxvi)Q11E、L12TE、H16Q、L19D、M23E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E;(xxxvii)Q11E、L12E、H16NE、M23N、R81E、D84E、R120H、S130E、T133E;(xxxviii)E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E;(xxxix)Q11E、R120H、S130E、T133D;又は(xl)Q11E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133Dを含む。
一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換(i)L12E、D20E、M23N、R81N、D84E、S87E、R120E、T123E、S130E、T133N、F42A、Y45A、L72G;(ii)Q11E、D20Q、M23E、R81D、D84E、S87E、S130E、T133N、F42A、Y45A、L72G;(iii)L12E、L19D、R81D、R120E、T123E、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G;(iv)R81Q、S87E、V91D、T123E、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G;(v)Q11E、L12E、M23Q、R81D、S87E、V91D、S130E、T133Q、F42A、Y45A、L72G;(vi)Q11E、L19D、R81D、D84E、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G;(vii)R81D、D84Q、S87D、V91N、T123Q、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G;(viii)L19D、R81E、D84E、S87Q、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G;(iix)L19D、M23N、R81D、T133E、F42A、Y45A、L72G;(ix)Q11E、L12E、M23Q、R81Q、S87D、V91N、E95Q、R120H、T123E、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G;(x)L19D、R81E、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G;(xi)R81Q、S87E、V91D、R120E、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G;(xii)L12Q、L19Q、R81H、V91E、T123E、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G;(xiii)K8E、D20E、M23N、R81H、D84Q、S87E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G;(xiv)L12E、L19Q、R81H、R120E、T133D、F42A、Y45A、L72G;(xv)H16E、L19D、Q22E、M23Q、R81D、D84E、S87D、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G;(xvi)Q11E、L12E、H16Q、L19D、Q22E、M23N、R81E、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G;(xvii)Q11E、H16E、L19D、M23E、R81D、S87E、R120H、Q126E、T133D、F42A、Y45A、L72G;(xviii)Q11E、L12S、E15Q、H16N、L19D、M23E、R81E、D84E、S87D、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G;(xix)Q11E、H16E、M23E、R81N、D84E、S87E、R120H、Q126E、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G;(xx)Q11E、E15Q、H16E、Q22E、M23E、R81H、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G;(xxi)Q11E、L12D、Q13H、E15Q、H16E、Q22E、M23E、R81N、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G;(xxii)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G;(xxiii)H16E、L19D、M23Q、R81N、D84E、S87D、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G;(xxiv)Q11E、L12T、E15Q、H16E、L19D、Q22H、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G;(xxv)Q11E、L12T、E15Q、H16E、L19D、Q22H、M23E、R81E、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G;(xxvi)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81E、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G;(xxvii)H16E、Q22E、M23Q、S87N、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G;(xxviii)H16E、L19D、Q22D、M23Q、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G;(xxiix)Q11E、L12E、Q13H、E15Q、H16N、L19D、Q22E、M23Q、R81E、D84E、S87D、E95D、R120H、T133E、F42A、Y45A、L72G;(xxix)Q11E、L12T、H16E、L19D、Q22E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G;(xxx)Q11T、L12E、E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E、R120E、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G;(xxxi)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G;(xxxii)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81Q、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G;(xxxiii)Q11E、L12S、H16E、L19D、M23Q、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G;(xxxiv)S6Y、L12E、Q13R、H16Q、Q22E、M23Q、R81N、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G;(xxxv)H16D、M23N、R81D、D84E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G;(xxxvi)Q11E、L12TE、H16Q、L19D、M23E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G;(xxxvii)Q11E、L12E、H16NE、M23N、R81E、D84E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G;(xxxviii)E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E、F42A、Y45A、L72G;(xxxix)Q11E、R120H、S130E、T133D F42A、Y45A、L72G;又は(xl)Q11E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72Gを含む。
一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換(i)L12E、D20E、M23N、R81N、D84E、S87E、R120E、T123E、S130E、T133N、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(ii)Q11E、D20Q、M23E、R81D、D84E、S87E、S130E、T133N、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(iii) L12E、L19D、R81D、R120E、T123E、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(iv)R81Q、S87E、V91D、T123E、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(v)Q11E、L12E、M23Q、R81D、S87E、V91D、S130E、T133Q、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(vi)Q11E、L19D、R81D、D84E、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(vii)R81D、D84Q、S87D、V91N、T123Q、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(viii)L19D、R81E、D84E、S87Q、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(iix)L19D、M23N、R81D、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(ix)Q11E、L12E、M23Q、R81Q、S87D、V91N、E95Q、R120H、T123E、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(x)L19D、R81E、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(xi)R81Q、S87E、V91D、R120E、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(xii)L12Q、L19Q、R81H、V91E、T123E、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(xiii)K8E、D20E、M23N、R81H、D84Q、S87E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(xiv)L12E、L19Q、R81H、R120E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(xv)H16E、L19D、Q22E、M23Q、R81D、D84E、S87D、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(xvi)Q11E、L12E、H16Q、L19D、Q22E、M23N、R81E、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(xvii)Q11E、H16E、L19D、M23E、R81D、S87E、R120H、Q126E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(xviii)Q11E、L12S、E15Q、H16N、L19D、M23E、R81E、D84E、S87D、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(xix)Q11E、H16E、M23E、R81N、D84E、S87E、R120H、Q126E、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(xx)Q11E、E15Q、H16E、Q22E、M23E、R81H、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(xxi)Q11E、L12D、Q13H、E15Q、H16E、Q22E、M23E、R81N、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(xxii)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(xxiii)H16E、L19D、M23Q、R81N、D84E、S87D、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(xxiv)Q11E、L12T、E15Q、H16E、L19D、Q22H、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(xxv)Q11E、L12T、E15Q、H16E、L19D、Q22H、M23E、R81E、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(xxvi)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81E、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(xxvii)H16E、Q22E、M23Q、S87N、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(xxviii)H16E、L19D、Q22D、M23Q、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(xxiix)Q11E、L12E、Q13H、E15Q、H16N、L19D、Q22E、M23Q、R81E、D84E、S87D、E95D、R120H、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(xxix)Q11E、L12T、H16E、L19D、Q22E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(xxx)Q11T、L12E、E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E、R120E、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(xxxi)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(xxxii)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81Q、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(xxxiii)Q11E、L12S、H16E、L19D、M23Q、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(xxxiv)S6Y、L12E、Q13R、H16Q、Q22E、M23Q、R81N、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(xxxv)H16D、M23N、R81D、D84E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(xxxvi)Q11E、L12TE、H16Q、L19D、M23E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(xxxvii)Q11E、L12E、H16NE、M23N、R81E、D84E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(xxxviii)E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A;(xxxix)Q11E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A、T3A、C125A;又は(xl)Q11E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125Aを含む。
具体的な実施態様では、本発明の変異体IL-2ポリペプチドは、配列番号5;配列番号6;配列番号7;配列番号8;配列番号9;配列番号10;配列番号11;配列番号12;配列番号13;配列番号14;配列番号15;配列番号16);配列番号17;配列番号18;配列番号19;配列番号20;配列番号21;配列番号22;配列番号23;配列番号24;配列番号25;配列番号26;配列番号27;配列番号28;配列番号29;配列番号30;配列番号31;配列番号32;配列番号33;配列番号34;配列番号35;配列番号36;配列番号37;配列番号38;配列番号39;配列番号40;配列番号41;配列番号42;配列番号43;配列番号59;配列番号60;配列番号61の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるポリペプチド配列を含む。
具体的な実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、配列番号5;配列番号6;配列番号7;配列番号8;配列番号9;配列番号10;配列番号11;配列番号12;配列番号13;配列番号14;配列番号15;配列番号16);配列番号17;配列番号18;配列番号19;配列番号20;配列番号21;配列番号22;配列番号23;配列番号24;配列番号25;配列番号26;配列番号27;配列番号28;配列番号29;配列番号30;配列番号31;配列番号32;配列番号33;配列番号34;配列番号35;配列番号36;配列番号37;配列番号38;配列番号39;配列番号40;配列番号41;配列番号42;配列番号43;配列番号59;配列番号60;配列番号61の群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換Q11Eを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換E15Qを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換H16Eを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換L19Dを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換Q22Eを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換M23Qを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換R81Dを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換D84Eを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換S87Eを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換R120Hを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換Q126Eを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換Q126Hを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換S130Eを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換T133Eを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換T133Dを含む。
一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換Q11E、F42A、Y45A及びL72Gを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換E15Q、F42A、Y45A及びL72Gを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換H16E、F42A、Y45A及びL72Gを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換L19D、F42A、Y45A及びL72Gを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換Q22E、F42A、Y45A及びL72Gを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換M23Q、F42A、Y45A及びL72Gを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換R81D、F42A、Y45A及びL72Gを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換D84E、F42A、Y45A及びL72Gを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換S87E、F42A、Y45A及びL72Gを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換R120H、F42A、Y45A及びL72Gを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換Q126E、F42A、Y45A及びL72Gを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換Q126H、F42A、Y45A及びL72Gを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換S130E、F42A、Y45A及びL72Gを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換T133E、F42A、Y45A及びL72Gを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換T133D、F42A、Y45A及びL72Gを含む。
一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換Q11E、F42A、Y45A、L72G、T3A及びC125Aを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換E15Q、F42A、Y45A、L72G、T3A及びC125Aを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換H16E、F42A、Y45A、L72G、T3A及びC125Aを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換L19D、F42A、Y45A、L72G、T3A及びC125Aを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換Q22E、F42A、Y45A、L72G、T3A及びC125Aを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換M23Q、F42A、Y45A、L72G、T3A及びC125Aを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換R81D、F42A、Y45A、L72G、T3A及びC125Aを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換D84E、F42A、Y45A、L72G、T3A及びC125Aを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換S87E、F42A、Y45A、L72G、T3A及びC125Aを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換R120H、F42A、Y45A、L72Gを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換Q126E、F42A、Y45A、L72G、T3A及びC125Aを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換Q126H、F42A、Y45A、L72G、T3A及びC125Aを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換S130E、F42A、Y45A、L72G、T3A及びC125Aを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A及びC125Aを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A及びC125Aを含む。
一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、配列番号44;配列番号45;配列番号46;配列番号47;配列番号48;配列番号49;配列番号50;配列番号5;配列番号52;配列番号53;配列番号54;配列番号55;配列番号56;配列番号57;配列番号58の群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E及びS87Eを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換Q11E、R120H、S130E及びT133Dを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換Q11E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E及びT133Dを含む。
一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E、F42A、Y45A及びL72Gを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換Q11E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A及びL72Gを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換Q11E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A及びL72Gを含む。
一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E、F42A、Y45A、L72G、T3A及びC125Aを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換Q11E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A及びC125Aを含む。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ酸置換Q11E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A及びC125Aを含む。
一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、配列番号59;配列番号60;配列番号61の群から選択されるアミノ酸配列を含む。
別の態様では、本発明は、それぞれ野生型IL-2ポリペプチドとの比較で、IL-2受容体のα-サブユニットに対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性を消失させるか又は低減し、中程度親和性IL-2受容体に対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性を保存するアミノ酸変異を含む変異体インターロイキン-2(IL-2)ポリペプチドを提供する。
CD25に対する親和性が低下したヒトIL-2(hIL-2)の変異体は、例えば、アミノ酸位置35、38、42、43、45若しくは72におけるアミノ酸置換、又はそれらの組み合わせによって生成されうる。例示的なアミノ酸置換には、K35E、K35A、R38A、R38E、R38N、R38F、R38S、R38L、R38G、R38Y、R38W、F42L、F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、K43E、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、Y45K、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R及びL72Kが含まれる。本発明による特定のIL-2変異体は、ヒトIL-2の残基42、45、若しくは72に対応するアミノ酸位置における変異体、又はそれらの組み合わせを含む。これら変異体は、中程度親和性IL-2受容体と実質的に同様の結合親和性を呈し、IL-2変異体の野生型形態と比較して、IL-2受容体のα-サブユニット及び高親和性IL-2受容体に対する親和性が顕著に低下している。
有用な変異体の他の特徴には、IL-2受容体を有するT細胞及び/又はNK細胞の増殖を誘導する能力、IL-2受容体を有するT細胞及び/又はNK細胞においてIL-2シグナル伝達を誘導する能力、NK細胞によって二次サイトカインとしてインターフェロン(IFN)-γを生成する能力、末梢血単核細胞(PBMC)による二次サイトカイン(特に、IL-10及びTNF-α)の生成を誘導する能力の低下、制御性T細胞を活性化する能力の低下、T細胞においてアポトーシスを誘導する能力の低下、及びin vivoでの毒性プロファイルの低下が含まれうる。
本発明による一実施態様では、高親和性IL-2受容体に対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性を消失させるか又は低減し、中程度親和性IL-2受容体に対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性を保存するアミノ酸変異は、ヒトIL-2の残基72に対応する位置にある。一実施態様では、前記アミノ酸変異はアミノ酸置換である。一実施態様では、前記アミノ酸置換は、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R、及びL72Kの群から選択される。さらに具体的な実施態様では、前記アミノ酸変異は、アミノ酸置換L72Gである。
特定の態様では、本発明は、IL-2受容体のα-サブユニットに対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性を消失させるか又は低減し、中程度親和性IL-2受容体に対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性を保存する第1のアミノ酸変異及び第2のアミノ酸変異を含む変異体IL-2ポリペプチドを提供する。一実施態様では、前記第1のアミノ酸変異は、ヒトIL-2の残基72に対応する位置にある。一実施態様では、前記第1のアミノ酸変異はアミノ酸置換である。具体的な実施態様では、前記第1のアミノ酸変異は、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R、及びL72Kの群から選択されるアミノ酸置換である。それよりもさらに具体的な実施態様では、前記アミノ酸置換はL72Gである。前記第2のアミノ酸変異は、前記第1のアミノ酸変異とは異なる位置にある。一実施態様では、前記第2のアミノ酸変異は、ヒトIL-2の残基35、38、42、43及び45に対応する位置から選択される位置にある。一実施態様では、前記第2のアミノ酸変異はアミノ酸置換である。具体的な実施態様では、前記アミノ酸置換は、K35E、K35A、R38A、R38E、R38N、R38F、R38S、R38L、R38G、R38Y、R38W、F42L、F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、K43E、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、及びY45Kの群から選択される。特定の実施態様では、前記第2のアミノ酸変異は、ヒトIL-2の残基42又は45に対応する位置にある。具体的な実施態様では、前記第2のアミノ酸変異は、F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、及びY45Kの群から選択されるアミノ酸置換である。さらに具体的な実施態様では、前記第2のアミノ酸変異は、アミノ酸置換F42A又はY45Aである。さらに詳細な実施態様では、前記第2のアミノ酸変異は、ヒトIL-2の残基42に対応する位置にある。具体的な実施態様では、前記第2のアミノ酸変異は、F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、及びF42Kの群から選択されるアミノ酸置換である。さらに具体的な実施態様では、前記アミノ酸置換はF42Aである。別の実施態様では、前記第2のアミノ酸変異は、ヒトIL-2の残基45に対応する位置にある。具体的な実施態様では、前記第2のアミノ酸変異は、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、及びY45Kの群から選択されるアミノ酸置換である。さらに具体的な実施態様では、前記アミノ酸置換はY45Aである。一部の実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、それぞれ野生型IL-2ポリペプチドとの比較で、IL-2受容体のα-サブユニットに対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性を消失させるか又は低減し、中程度親和性IL-2受容体に対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性を保存する第3のアミノ酸変異を含む。前記第3のアミノ酸変異は、前記第1のアミノ酸変異及び第2のアミノ酸変異とは異なる位置にある。一実施態様では、前記第3のアミノ酸変異は、ヒトIL-2の残基35、38、42、43及び45に対応する位置から選択される位置にある。好ましい実施態様では、前記第3のアミノ酸変異は、ヒトIL-2の残基42又は45に対応する位置にある。一実施態様では、前記第3のアミノ酸変異は、ヒトIL-2の残基42に対応する位置にある。別の実施態様では、前記第3のアミノ酸変異は、ヒトIL-2の残基45に対応する位置にある。一実施態様では、前記第3のアミノ酸変異はアミノ酸置換である。具体的な実施態様では、前記アミノ酸置換は、K35E、K35A、R38A、R38E、R38N、R38F、R38S、R38L、R38G、R38Y、R38W、F42L、F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、K43E、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、及びY45Kの群から選択される。さらに具体的な実施態様では、前記アミノ酸置換は、F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、及びY45Kの群から選択される。それよりもさらに具体的な実施態様では、前記アミノ酸置換は、F42A又はY45Aである。一実施態様では、前記アミノ酸置換はF42Aである。別の実施態様では、前記アミノ酸置換はY45Aである。一部の実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、ヒトIL-2の残基38に対応する位置にアミノ酸変異を含まない。
本発明のさらにより詳細な態様では、IL-2受容体のα-サブユニットに対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性を消失させるか又は低減するが、中程度親和性IL-2受容体に対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性を保存する3つのアミノ酸変異を含む変異体IL-2ポリペプチドが提供される。一実施態様では、前記3つのアミノ酸変異は、ヒトIL-2の残基42、45及び72に対応する位置にある。一実施態様では、前記3つのアミノ酸変異はアミノ酸置換である。一実施態様では、前記3つのアミノ酸変異は、F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、Y45K、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R、及びL72Kの群から選択されるアミノ酸置換である。具体的な実施態様では、前記3つのアミノ酸変異は、アミノ酸置換F42A、Y45A及びL72Gである。
一部の実施態様では、前記アミノ酸変異は、IL-2受容体のα-サブユニットに対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性を少なくとも5分の1、具体的には少なくとも10分の1、より具体的には少なくとも25分の1まで低下させる。IL-2受容体のα-サブユニットに対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性を低下させる複数のアミノ酸変異が存在する実施態様では、これらのアミノ酸変異の組み合わせが、IL-2受容体のα-サブユニットに対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性を少なくとも30分の1、少なくとも50分の1、又はさらに少なくとも100分の1まで低下させうる。一実施態様では、前記アミノ酸変異、又はアミノ酸変異の組み合わせは、表面プラズモン共鳴によって結合が検出可能でないように、IL-2受容体のα-サブユニットに対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性を消失させる。
中程度親和性受容体に対して実質的に同様に結合すること、すなわち、前記受容体に対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性の保存は、IL-2変異体が、中程度親和性IL-2受容体に対するIL-2変異体の野生型の親和性の約70%より大きな親和性を呈するときに達成される。本発明のIL-2変異体は、そのような親和性の約80%より大きく、さらには約90%より大きい親和性を呈しうる。
本発明者らは、IL-2のO-グリコシル化の除去と組み合わせたIL-2受容体のα-サブユニットに対するIL-2の親和性の低下により、改善された特性を有するIL-2 タンパク質が得られることを発見した。例えば、変異体IL-2ポリペプチドがCHO細胞又はHEK細胞等の哺乳動物細胞で発現されるとき、O-グリコシル化部位の除去はより均一な生成物をもたらす。
したがって、一部の実施態様では、本発明による変異体IL-2ポリペプチドは、ヒトIL-2の残基3に対応する位置にあるIL-2のO-グリコシル化部位を除去する、さらなるアミノ酸変異を含む。一実施態様では、ヒトIL-2の残基3に対応する位置にあるIL-2のO-グリコシル化部位を除去する前記さらなるアミノ酸変異は、アミノ酸置換である。例示的なアミノ酸置換には、T3A、T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R、T3K及びT3Pが含まれる。具体的な実施態様では、前記さらなるアミノ酸変異は、アミノ酸置換T3Aである。
一部の実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、本質的に全長IL-2分子である。一部の実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドはヒトIL-2分子である。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、前記変異を有さない配列番号144を含むIL-2ポリペプチドと比較して、IL-2受容体のα-サブユニットに対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性を消失させるか又は低減するが、中程度親和性IL-2受容体に対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性を保存する少なくとも1つのアミノ酸変異を有する配列番号144の配列を含む。
具体的な実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、活性化されたTリンパ球細胞の増殖、活性化されたTリンパ球細胞の分化、細胞傷害性T細胞(CTL)活性、活性化されたB細胞の増殖、活性化されたB細胞の分化、ナチュラルキラー(NK)細胞の増殖、NK細胞の分化、活性化されたT細胞又はNK細胞によるサイトカイン分泌、及びNK/リンパ球活性化キラー(LAK)抗腫瘍細胞毒性の群から選択される細胞応答のうちの1つ以上を誘発することができる。
一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、野生型IL-2ポリペプチドと比較して、制御性T細胞におけるIL-2シグナル伝達を誘導する能力が低下している。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、野生型IL-2ポリペプチドと比較して、T細胞における活性化誘導細胞死(AICD)の誘導が少ない。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、野生型IL-2ポリペプチドと比較して、in vivoでの毒性プロファイルが低下している。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、野生型IL-2ポリペプチドと比較して、血清半減期が長くなっている。
本発明による特定の変異体IL-2ポリペプチドは、ヒトIL-2の残基3、42、45及び72に対応する位置に4つのアミノ酸置換を含む。具体的なアミノ酸置換は、T3A、F42A、Y45A及びL72Gである。実施例で実証されるように、前記四重変異体IL-2ポリペプチドは、CD25に対する検出可能な結合を呈さず、T細胞においてアポトーシスを誘導する能力の低下、Treg細胞においてIL-2シグナル伝達を誘導する能力の低下、及びin vivoでの毒性プロファイルの低下を呈する。しかしながら、それは、エフェクター細胞においてIL-2シグナル伝達を活性化する能力、エフェクター細胞の増殖を誘導する能力、及びNK細胞により二次サイトカインとしてIFN-γを生成する能力を保持している。
さらに、前記変異体IL-2ポリペプチドは、実施例に記載されるように、表面疎水性の低下、良好な安定性及び良好な発現収率といったさらに有利な特性を有する。予想外に、前記変異体IL-2ポリペプチドは、野生型IL-2と比較して、延長された血清半減期も提供する。
本発明のIL-2変異体は、CD25又はグリコシル化部位を有するIL-2の接触面を形成する、IL-2の領域内の変異を有することに加え、これら領域の外側のアミノ酸配列に1つ以上の変異を有しうる。ヒトIL-2におけるそのようなさらなる変異は、発現又は安定性の増加といったさらなる利点を提供しうる。例えば、位置125のシステインは、セリン、アラニン、トレオニン又はバリン等の中性アミノ酸で置き換えられて、米国特許第4,518,584号に記載されるように、それぞれ、C125S IL-2、C125A IL-2、C125T IL-2又はC125V IL-2を生成しうる。ここに記載されるように、システインはまた、IL-2のN末端アラニン残基を欠失させて、des-A1C125S又はdes-A1C125A等の変異体を生成しうる。これに代えて、又はこれと組み合わせて、IL-2変異体は変異を含んでいてもよく、それにより、野生型ヒトIL-2の位置104に通常存在するメチオニンが、アラニン等の中性アミノ酸により置き換えられている(米国特許第5,206,344号を参照されたい)。得られる変異体、例えば、des-A1M104A IL-2、des-A1M104A C125S IL-2、M104A IL-2、M104A C125A IL-2、des-A1M104A C125A IL-2、又はM104A C125S IL-2(これら変異体及び他の変異体は、米国特許第5,116,943号及びWeiger et al.,Eur J Biochem 180,295-300(1989)に見出される)は、本発明の特定のIL-2変異と組み合わせて使用されうる。
したがって、一部の実施態様では、本発明による変異体IL-2ポリペプチドは、ヒトIL-2の残基125に対応する位置に、さらなるアミノ酸変異を含む。一実施態様では、前記さらなるアミノ酸変異は、アミノ酸置換C125Aである。
当業者は、さらなる変異のいずれが、本発明の目的にとってさらなる利点を提供しうるかを決定することができる。例えば、当業者であれば、中程度親和性IL-2受容体に対するIL-2の親和性を低減するか又は消失させるIL-2配列のアミノ酸変異、例えば、D20T、N88R又はQ126D(例えば、米国特許出願公開第2007/0036752号を参照されたい)は、本発明による変異体IL-2ポリペプチドに含めることが適切ではない場合があることを理解するであろう。
本発明の変異体IL-2ポリペプチドは、IL-2を有するイムノコンジュゲート等のIL-2融合タンパク質の状況において特に有用である。このような融合タンパク質は、非IL-2部分に融合した本発明の変異体IL-2ポリペプチドを含む。非IL-2部分は、合成若しくは天然タンパク質、又はそのバリアントの一部分とすることができる。例示的非IL-2部分は、アルブミン、又は抗体ドメイン、例えば免疫グロブリンのFcドメイン又は抗原結合ドメインを含む。
IL-2を有するイムノコンジュゲートは、抗原結合部分及びIL-2部分を含む融合タンパク質である。このようなイムノコンジュゲートは、IL-2を、例えば腫瘍微小環境に直接的に標的化することによって、IL-2療法の有効性を有意に高める。本発明によれば、抗原結合部分は、全抗体若しくは免疫グロブリン、又は抗原特異的結合親和性等の生物学的機能を有するこれらの一部分若しくはバリアントとすることができる。
イムノコンジュゲート療法の利益は、容易に明らかである。例えば、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、腫瘍特異的エピトープを認識し、腫瘍部位へのイムノコンジュゲート分子の標的化をもたらす。したがって、高濃度のIL-2を腫瘍微小環境に送達することができ、それによって、非コンジュゲートIL-2に必要とされるよりもかなり少ない用量のイムノコンジュゲートを使用して、ここに記述される様々な免疫エフェクター細胞の活性化及び増殖がもたらされる。さらに、イムノコンジュゲートの形態でIL-2を適用すると、サイトカイン自体を低用量にすることが可能であるため、IL-2の望ましくない副作用の可能性が制限され、イムノコンジュゲートによる身体の特定の部位へのIL-2の標的化によっても、全身曝露量が減り、それにより、非コンジュゲートIL-2を用いて得られるよりも副作用が小さくなる。加えて、非コンジュゲートIL-2と比較して、イムノコンジュゲートの循環半減期が増加することは、イムノコンジュゲートの有効性に寄与する。しかしながら、IL-2イムノコンジュゲートのこの特徴は、IL-2分子の潜在的な副作用を再び悪化させうる。血流中のIL-2イムノコンジュゲートの循環半減期が非コンジュゲートIL-2と比較して顕著に長いため、IL-2又は融合タンパク質の他の部分が、血管系内に通常存在する成分を活性化する可能性が高まる。同じ懸念は、Fc又はアルブミン等の別の部分に融合したIL-2を含有する他の融合タンパク質にも当てはまり、循環するIL-2の半減期を長くする。したがって、本発明による変異体IL-2ポリペプチドを含むイムノコンジュゲートは、IL-2の野生型形態と比較して低い毒性を有し、特に有利である。
したがって、本発明はさらに、少なくとも1つの非IL-2部分に結合した、上述の変異体IL-2ポリペプチドを提供する。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドと非IL-2部分は融合タンパク質を形成し、すなわち、変異体IL-2ポリペプチドは、非IL-2部分とペプチド結合を共有する。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、第1の非IL-2部分及び第2の非IL-2部分に結合している。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、第1の抗原結合部分と、アミノ末端ペプチド結合又はカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第2の抗原結合部分は、(i)変異体IL-2ポリペプチド又は(ii)第1の抗原結合部分と、アミノ末端ペプチド結合又はカルボキシ末端ペプチド結合を共有する。具体的な実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、前記第1の非IL-2部分とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、前記第2の非IL-2部分とアミノ末端ペプチド結合を共有する。一実施態様では、前記非IL-2部分は標的化部分である。特定の実施態様では、前記非IL-2部分は抗原結合部分である(したがって、以下にさらに詳細に記載するように、変異体IL-2ポリペプチドとイムノコンジュゲートを形成する)。一部の実施態様では、抗原結合部分は抗体又は抗体断片である。一実施態様では、抗原結合部分は全長抗体である。一実施態様では、抗原結合部分は、免疫グロブリン分子、特にIgGクラスの免疫グロブリン分子、さらに詳細にはIgGサブクラスの免疫グロブリン分子である。このような一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖の1つとアミノ末端ペプチド結合を共有している。別の実施態様では、抗原結合部分は抗体断片である。いくつかの実施態様では、前記抗原結合部分は、抗体重鎖可変領域と抗体軽鎖可変領域とを含む抗体の抗原結合ドメインを含む。さらに具体的な実施態様では、抗原結合部分は、Fab分子又はscFv分子である。特定の実施態様では、抗原結合部分はFab分子である。別の実施態様では、抗原結合部分はscFv分子である。一実施態様では、前記抗原結合部分は、腫瘍細胞上又は腫瘍細胞環境内に存在する抗原に向けられる。好ましい実施態様では、前記抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、テネイシン-CのA1ドメイン(TNC A1)、テネイシン-CのA2ドメイン(TNC A2)、フィブロネクチンのエキストラドメインB(EDB)、がん胎児性抗原(CEA)及び黒色腫関連コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン(MCSP)の群から選択される変異体IL-2ポリペプチドが、1つを超える抗原結合部分、例えば第1の抗原結合部分と第2の抗原結合部分とに結合している場合、各抗原結合部分は、独立して、種々の形態の抗体及び抗体断片から選択することができる。例えば、第1の抗原結合部分はFab分子とすることができ、第2の抗原結合部分はscFv分子とすることができる。具体的な実施態様では、前記第1の抗原結合部分及び前記第2の抗原結合部分の各々はscFv分子であるか、又は前記第1の抗原結合部分及び第2の抗原結合部分の各々はFab分子である。特定の実施態様では、前記第1の抗原結合部分及び第2の抗原結合部分の各々はFab分子である。同様に、変異体IL-2ポリペプチドが、1つを越える抗原結合部分、例えば第1の抗原結合部分と第2の抗原結合部分に結合している場合、抗原結合部分の各々が向けられる抗原は、独立して選択することができる。一実施態様では、前記第1の抗原結合部分及び前記第2の抗原結合部分は、異なる抗原に向けられる。別の実施態様では、前記第1の抗原結合部分及び前記第2の抗原結合部分は、同じ抗原に向けられる。上述のように、抗原は、特に、腫瘍細胞上又は腫瘍細胞環境内に存在する抗原、さらに詳細には、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、テネイシン-CのA1ドメイン(TNC A1)、テネイシン-CのA2ドメイン(TNC A2)、フィブロネクチンのエキストラドメインB(EDB)、がん胎児性抗原(CEA)及び黒色腫関連コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン(MCSP)の群から選択される抗原である。抗原結合領域にはさらに、イムノコンジュゲートの抗原結合ドメインに関連してここに記載される特徴のいずれかを、単独で又は組み合わせて組み込むことができる。
イムノコンジュゲート
特定の態様では、本発明は、1つ以上のアミノ酸変異を含む、ここに開示される変異体IL-2ポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供し、1つ以上のアミノ酸置換は、中性pHにおいて、IL-2受容体に対する結合、好ましくは中程度親和性IL-2受容体(IL2Rβγ)に対する結合を消失させるか又は低減し、かつ低下したpHにおいて、IL-2受容体に対する結合、好ましくは中程度親和性IL-2受容体(IL2Rβγ)に対する結合を容易にする。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、ここに開示されるように、pH7.4及び/又はpH7.0において、低減又は消失したIL-2受容体結合、好ましくは中程度親和性IL-2受容体結合を呈し、pH6及び/又はpH6.5において、保持されたIL-2受容体結合、好ましくは中程度親和性IL-2受容体結合を呈する変異体IL-2ポリペプチドを含む。
特定の態様では、本発明は、IL-2受容体のα-サブユニットに対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性を消失させるか又は低減し、かつ中程度親和性IL-2受容体に対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性を保存する1つ以上のアミノ酸変異を含む変異体IL-2ポリペプチドと、少なくとも1つの抗原結合部分とを含むイムノコンジュゲートを提供する。本発明による一実施態様では、IL-2受容体のα-サブユニットに対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性を消失させるか又は低減し、かつ中程度親和性IL-2受容体に対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性を保存するアミノ酸変異は、ヒトIL-2の残基42、45及び72に対応する位置から選択される位置にある。一実施態様では、前記アミノ酸変異はアミノ酸置換である。一実施態様では、前記アミノ酸変異は、F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、Y45K、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R及びL72Kの群から選択されるアミノ酸置換であり、具体的には、F42A、Y45A及びL72Gの群から選択されるアミノ酸置換である。一実施態様では、アミノ酸変異は、ヒトIL-2の残基42に対応する位置にある。具体的な実施態様では、前記アミノ酸変異は、F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、及びF42の群から選択されるアミノ酸置換である。さらに具体的な実施態様では、前記アミノ酸置換はF42Aである。別の実施態様では、アミノ酸変異は、ヒトIL-2の残基45に対応する位置にある。具体的な実施態様では、前記アミノ酸変異は、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、及びY45Kの群から選択されるアミノ酸置換である。さらに具体的な実施態様では、前記アミノ酸置換はY45Aである。また別の実施態様では、アミノ酸変異は、ヒトIL-2の残基72に対応する位置にある。具体的な実施態様では、前記アミノ酸変異は、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R、及びL72Kの群から選択されるアミノ酸置換である。それよりもさらに具体的な実施態様では、前記アミノ酸置換はL72Gである。一部の実施態様では、本発明による変異体IL-2ポリペプチドは、ヒトIL-2の残基38に対応する位置にアミノ酸変異を含まない。特定の実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートに含まれる変異体IL-2ポリペプチドは、IL-2受容体のα-サブユニットに対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性を消失させるか又は低減し、かつ中程度親和性IL-2受容体に対する変異体IL-2ポリペプチドの親和性を保存する少なくとも第1のアミノ酸変異と第2のアミノ酸変異とを含む。一実施態様では、前記第1のアミノ酸変異及び第2のアミノ酸変異は、ヒトIL-2の残基42、45及び72に対応する位置から選択される2つの位置にある。一実施態様では、前記第1のアミノ酸変異及び第2のアミノ酸変異はアミノ酸置換である。一実施態様では、前記第1のアミノ酸変異及び第2のアミノ酸変異は、F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、Y45K、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R及びL72Kの群から選択されるアミノ酸置換である。特定の実施態様では、前記第1のアミノ酸変異及び第2のアミノ酸変異は、F42A、Y45A及びL72Gの群から選択されるアミノ酸置換である。変異体IL-2ポリペプチドにはさらに、本発明の変異体IL-2ポリペプチドに関連して先行する段落に記載された特徴のいずれかを、単独で又は組み合わせて組み込むことができる。一実施態様では、前記変異体IL-2ポリペプチドは、アミノ末端又はカルボキシ末端のペプチド結合を、イムノコンジュゲートに含まれる前記抗原結合部分と共有し、すなわちイムノコンジュゲートは融合タンパク質である。一部の実施態様では、前記抗原結合部分は、抗体又は抗体断片である。いくつかの実施態様では、前記抗原結合部分は、抗体重鎖可変領域と抗体軽鎖可変領域とを含む抗体の抗原結合ドメインを含む。抗原結合領域には、抗原結合ドメインに関連して上述又は後述される特徴のいずれかを、単独で又は組み合わせて組み込むことができる。
イムノコンジュゲートフォーマット
特に適切なイムノコンジュゲートフォーマットは、その全体が参照によりここに援用される、国際公開第2011/020783号に記載されている。これらイムノコンジュゲートは、少なくとも2つの抗原結合ドメインを含む。したがって、一実施態様では、本発明によるイムノコンジュゲートは、少なくとも、ここに記載される第1の変異体IL-2ポリペプチドと、少なくとも第1の抗原結合部分及び第2の抗原結合部分とを含む。特定の実施態様では、前記第1の抗原結合部分及び第2の抗原結合部分は、独立して、Fv分子、特にscFv分子、及びFab分子からなる群から選択される。具体的な実施態様では、前記第1の変異体IL-2ポリペプチドは、前記第1の抗原結合部分と、アミノ末端ペプチド結合又はカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、前記第2の抗原結合部分は、(i)第1の変異体IL-2ポリペプチド又は(ii)第1の抗原結合部分と、アミノ末端ペプチド結合又はカルボキシ末端ペプチド結合を共有する。特定の実施態様では、イムノコンジュゲートは、本質的に、1つ以上のリンカー配列によって接合された、第1の変異体IL-2ポリペプチドと、第1の抗原結合部分及び第2の抗原結合部分とからなる。このようなフォーマットは、標的抗原(例えば腫瘍抗原)に対して高い親和性で結合するが、IL-2受容体には単量体結合のみで結合し、したがって標的部位以外の他の位置にあるIL-2受容体を有する免疫細胞に対するイムノコンジュゲートの標的化が回避されるという利点を有する。特定の実施態様では、第1の変異体IL-2ポリペプチドは、第1の抗原結合部分とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらに第2の抗原結合部分とアミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施態様では、第1の抗原結合部分は、第1の変異体IL-2ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらに第2の抗原結合部分とアミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施態様では、第1の抗原結合部分は、第1の変異体IL-2ポリペプチドとアミノ末端ペプチド結合を共有し、さらに第2の抗原結合部分とカルボキシ末端ペプチドを共有する。特定の実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、第1の重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらに第2の重鎖可変領域とアミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、第1の軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらに第2の軽鎖可変領域とアミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施態様では、第1の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域は、カルボキシ末端ペプチド結合によって第1の変異体IL-2ポリペプチドに接合し、さらに、アミノ末端ペプチド結合によって第2の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域に接合する。別の実施態様では、第1の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域は、アミノ末端ペプチド結合によって第1の変異体IL-2ポリペプチドに接合し、さらに、カルボキシ末端ペプチド結合によって第2の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域に接合する。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、第1のFab重鎖又は軽鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらに第2のFab重鎖又は軽鎖とアミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施態様では、第1のFab重鎖又は軽鎖は、第1の変異体IL-2ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらに第2のFab 重鎖又は軽鎖とアミノ末端ペプチド結合を共有する。他の実施態様では、第1のFab重鎖又は軽鎖は、第1の変異体IL-2ポリペプチドとアミノ末端ペプチド結合を共有し、さらに第2のFab重鎖又は軽鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、1つ以上のscFV分子とアミノ末端ペプチド結合を共有し、さらに1つ以上のscFV分子とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する、少なくとも第1の変異体IL-2ポリペプチドを含む。
他の特に適切なイムノコンジュゲートフォーマットは、抗原結合部分として免疫グロブリン分子を含む。このような一実施態様では、イムノコンジュゲートは、ここに記載される少なくとも1つの変異体IL-2ポリペプチドと、免疫グロブリン分子、特にIgG分子、さらに詳細にはIgG分子とを含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、1つ以下の変異体IL-2ポリペプチドを含む。一実施態様では、免疫グロブリン分子はヒトである。一実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、免疫グロブリン分子とアミノ末端ペプチド結合又はカルボキシ末端ペプチド結合を共有する。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、本質的に、1つ以上のリンカー配列によって連結された、変異体IL-2ポリペプチドと、免疫グロブリン分子、特にIgG分子、より詳細にはIgG分子とからなる。具体的な実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、そのアミノ末端アミノ酸で、免疫グロブリン重鎖のうちの1つのカルボキシ末端アミノ酸に接合している。一部の実施態様では、免疫グロブリン分子は、Fcドメインに、2つの同一でない免疫グロブリン重鎖の修飾促進ヘテロ二量体化を含む。ヒトIgG Fcドメインの2つのポリペプチド鎖間のタンパク質間相互作用が最も広範囲に及ぶ部位は、FcドメインのCH3ドメイン内にある。したがって、一実施態様では、前記修飾は、FcドメインのCH3ドメイン内にある。具体的な実施態様では前記修飾は、免疫グロブリン重鎖の一方にノブ修飾を、及び免疫グロブリン重鎖の他方にホール修飾を含む、ノブ・イントゥー・ホール修飾である。ノブ・イントゥー・ホール技術は、例えば、米国特許第5,731,168号、米国特許第7,695,936号、Ridgway et al.,Prot Eng 9,617-621(1996)and Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)に記載されている。一般に、この方法は、突起が空洞内に位置することにより、ヘテロ二量体形成を促進してホモ二量体形成を妨害することができるように、第1のポリペプチドの接触面にある突起(「ノブ」)と、第2のポリペプチドの接触面にある対応する空洞(「ホール」)とを導入することを含む。突起は、第1のポリペプチドの接触面からの小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖(例えば、チロシン又はトリプトファン)で置き換えることによって構築される。突起と同一又は同様の大きさの相補的な空洞は、大きなアミノ酸側鎖を、より小さなアミノ酸側鎖(例えば、アラニン又はトレオニン)で置き換えることによって、第2のポリペプチドの接触面に形成される。突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的突然変異誘発によって、又はペプチド合成によって、作製することができる。具体的な実施態様では、ノブ修飾は、2つの免疫グロブリン重鎖の一方にアミノ酸置換T366Wを含み、ホール修飾は、2つの免疫グロブリン重鎖の他方にアミノ酸置換T366S、L368A及びY407Vを含む。さらに具体的な実施態様では、ノブ修飾を含む免疫グロブリン重鎖は加えてアミノ酸置換S354Cを含み、ホール修飾を含む免疫グロブリン重鎖は加えてアミノ酸置換Y349Cを含む。これら2つのシステイン残基の導入によって、2つ重鎖間にジスルフィド架橋が形成され、二量体がさらに安定化する(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
特定の実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、ノブ修飾を含む免疫グロブリン重鎖のカルボキシ末端アミノ酸に接合される。
代替的な実施態様では、2つの同一でないポリペプチド鎖の修飾促進ヘテロ二量体化は、例えば国際公開第2009/089004に記載さているように、静電的操縦効果を媒介する修飾を含む。一般に、この方法は、ホモ二量体形成が静電的に不利になるが、ヘテロ二量体化が静電的に有利になるように、2つのポリペプチド鎖の接触面にある1つ以上のアミノ酸残基を、帯電したアミノ酸残基で置き換えることを含む。
Fcドメインは、イムノコンジュゲートに、標的組織における良好な蓄積に寄与する長い血清半減期を含む好ましい薬物動態特性と、好ましい組織血液分布比を付与する。しかしながら、同時に、好ましい抗原担持細胞ではなく、Fc受容体を発現する細胞への、イムノコンジュゲートの望ましくない標的化をもたらすことがある。さらに、Fc受容体シグナル伝達経路の共活性化はサイトカイン放出に繋がることがあり、これは、IL-2ポリペプチドと、長い半減期のイムノコンジュゲートと組み合わさり、全身投与すると、サイトカイン受容体の過剰な活性化、及び重篤な副作用をもたらす。これと一致して、従来のIgG-IL-2イムノコンジュゲートは、注入反応と関連していることが記載されている(例えば、King et al.,J Clin Oncol 22,4463-4473(2004)を参照されたい)。
したがって、一部の実施態様では、本発明によるイムノコンジュゲートに含まれる免疫グロブリン分子は、低下したFc受容体に対する結合親和性を有するように操作される。このような一実施態様では、免疫グロブリンは、そのFcドメインに、Fc受容体に対するイムノコンジュゲートの結合親和性を低下させる1つ以上のアミノ酸変異を含む。一般的に、同じ1つ以上のアミノ酸変異が、2つの免疫グロブリン重鎖の各々に存在する。一実施態様では、前記アミノ酸変異は、Fc受容体に対するイムノコンジュゲートの結合親和性を、少なくとも2分の1、少なくとも5分の1、又は少なくとも10分の1低下させる。Fc受容体に対するイムノコンジュゲートの結合親和性を低下させる複数のアミノ酸変異が存在する実施態様では、これらアミノ酸変異の組み合わせは、Fc受容体に対するFcドメインの結合親和性を少なくとも10分の1、少なくとも20分の1又はさらには少なくとも50分の1低下させうる。一実施態様では、操作された免疫グロブリン分子を含むイムノコンジュゲートは、操作されていない免疫グロブリン分子を含むイムノコンジュゲートと比較して、20%未満、特に10%未満、さらに詳細には5%未満のFc受容体に対する結合親和性を呈する。一実施態様では、Fc受容体は、活性化Fc受容体である。具体的な実施態様では、Fc受容体は、Fcγ受容体、具体的にはFcγRIIIa、FcγRI又はFcγRIIa受容体である。好ましくは、これら受容体の各々への結合が低減される。いくつかの実施態様では、相補性成分に対する結合親和性、具体的にはC1qに対する結合親和性も低下する。一実施態様では、新生児型Fc受容体(FcRn)に対する結合親和性は低下しない。FcRnに対する実質的に同様の結合、すなわち、前記受容体に対する免疫グロブリンの結合親和性の保存は、免疫グロブリン(又は前記免疫グロブリンを含むイムノコンジュゲート)が、FcRnに対する操作されていない形態の免疫グロブリン(又は前記操作されていない形態の免疫グロブリンを含むイムノコンジュゲート)の約70%を上回る結合親和性を呈するとき、達成される。免疫グロブリン、又は前記免疫グロブリンを含むイムノコンジュゲートは、約80%を上回るそのような親和性、場合によっては約90%を上回るそのような親和性を呈しうる。一実施態様では、アミノ酸変異はアミノ酸置換である。一実施態様では、免疫グロブリンは、免疫グロブリン重鎖の位置P329(カバット番号付け)にアミノ酸置換を含む。具体的な実施態様では、アミノ酸置換は、P329A又はP329G、特にP329Gである。一実施態様では、免疫グロブリンは、免疫グロブリン重鎖のS228、E233、L234、L235、N297及びP331から選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含む。具体的な実施態様では、さらなるアミノ酸置換は、S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D又はP331Sである。特定の実施態様では、免疫グロブリンは、免疫グロブリン重鎖の位置P329、L234及びL235にアミノ酸置換を含む。さらに詳細な実施態様では、免疫グロブリンは、アミノ酸変異L234A、L235A及びP329G(LALA P329G)を含む。アミノ酸置換のこのような組み合わせは、ヒトIgG分子のFcγ 受容体結合をほぼ完全に消失させ、したがって抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を含むエフェクター機能を低下させる。
一部の実施態様では、イムノコンジュゲートは、変異体IL-2ポリペプチドと抗原結合部分との間に位置する1つ以上のタンパク質分解性切断部位を含む。
イムノコンジュゲートの成分(例えば抗原結合部分及び/又は変異体IL-2ポリペプチド)は、直接的に、又はここに記載されるか若しくは当技術分野で既知である、種々のリンカー、特に1つ以上のアミノ酸、一般的に約2~20のアミノ酸を含むペプチドリンカーを通して結合されうる。適切な非免疫原性リンカーペプチドには、例えば、(G4S)、(SG又はG(SGリンカーペプチド(ここで、nは通常1と10との間、一般的には2と4との間の数である)が含まれる。
抗原結合部分
本発明のイムノコンジュゲートの抗原結合部分は、通常、特異的抗原決定基に結合し、それが結合する実体(例えば変異体IL-2ポリペプチド又は第2の抗原結合部分)を、標的部位、例えば特定の種類の腫瘍細胞又は抗原決定基を有する腫瘍間質に向けることができるポリペプチド分子である。イムノコンジュゲートは、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染細胞の表面上に、他の罹患細胞の表面上に、血清中に遊離して、及び/又は細胞外マトリックス(ECM)に認められる抗原決定基に結合することができる。
腫瘍抗原の非限定的な例には、MAGE、MART-1/Melan-A、gp100、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPPIV)、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質(ADAbp)、シクロフィリンb、結腸直腸関連抗原(CRC)-C017-1A/GA733、がん胎児性抗原(CEA)及びその免疫原性エピトープCAP-1及びCAP-2、etv6、aml1、前立腺特異的抗原(PSA)及びその免疫原性エピトープPSA-1、PSA-2、及びPSA-3、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、T細胞受容体/CD3-ゼータ鎖、腫瘍抗原のMAGE-ファミリー(例えば、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、腫瘍抗原のGAGE-ファミリー(例えば、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、チロシナーゼ、p53、MUCファミリー、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-フェトプロテイン、E-カドヘリン、α-カテニン、β-カテニン及びγ-カテニン、p120ctn、gp100 Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、大腸腺腫性ポリポーシスタンパク質(APC)、フォドリン、Connexin 37、Ig-idiotype、p15、gp75、GM2及びGD2ガングリオシド、ウイルス生成物、例えばヒト乳頭腫ウイルスタンパク質、腫瘍抗原のSmadファミリー、lmp-1、P1A、EBV-コード化核抗原(EBNA)-1、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1及びCT-7、並びにc-erbB-2が含まれる。
ウイルス抗原の非限定的な例には、インフルエンザウイルス血液凝集素、エプスタイン・バーウイルスLMP-1、C型肝炎ウイルスE2糖タンパク質、HIV gp160、及びHIV gp120が含まれる。
ECM抗原の非限定的な例には、シンデカン、ヘパラナーゼ、インテグリン、オステオポンチン、リンク、カドヘリン、ラミニン、ラミニン型EGF、レクチン、フィブロネクチン、ノッチ、テネイシン、及びマトリキシンが含まれる。
本発明のイムノコンジュゲートは、細胞表面抗原の以下の特定の非限定的な例に結合することができる:FAP、Her2、EGFR、IGF-1R、CD2(T細胞表面抗原)、CD3(TCRに関連付けられるヘテロ多量体)、CD22(B細胞受容体)、CD23(低親和性IgE 受容体)、CD30(サイトカイン受容体)、CD33(骨髄細胞表面抗原)、CD40(腫瘍壊死因子受容体)、IL-6R(IL6受容体)、CD20、MCSP、及びPDGFβR(β血小板由来成長因子受容体)。
一実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、2つ以上の抗原結合部分を含み、これら抗原結合部分の各々は同じ抗原決定基に特異的に結合する。別の実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、2つ以上の抗原結合部分を含み、これら抗原結合部分の各々は異なる抗原決定基に特異的に結合する。
抗原結合部分は、抗原決定基への特異的結合を保持する任意の種類の抗体又はその断片とすることができる。抗体断片には、限定されないが、V断片、V断片、Fab断片、F(ab’)断片、scFv断片、Fv断片、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディ(例えばHudson and Souriau,Nature Med 9,129-134(2003)参照)。
特に適切な抗原結合部分は、その全体が参照によりここに援用される、国際公開第2011/020783号に記載されている。
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、フィブロネクチンのエキストラドメインB(EDB)に特異的な、少なくとも1つ、一般的には2つ以上の抗原結合部分を含む。別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、EDBのエピトープへの結合についてモノクローナル抗体L19と競合することのできる、少なくとも1つ、一般的には2つ以上の抗原結合部分を含む。例えば、国際公開第2007/128563号(参照によりその全体がここに援用される)を参照されたい。また別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、L19モノクローナル抗体から得られる第1のFab重鎖が、変異体IL-2ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、変異体IL-2ポリペプチドが、L19モノクローナル抗体から得られる第2のFab重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する、ポリペプチド配列を含む。また別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、L19モノクローナル抗体から得られる第1のFab軽鎖が、変異体IL-2ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、変異体IL-2ポリペプチドが、L19モノクローナル抗体から得られる第2のFab軽鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する、ポリペプチド配列を含む。さらなる実施態様では、イムノコンジュゲートは、L19モノクローナル抗体から得られる第1のscFvが、変異体IL-2ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、変異体IL-2ポリペプチドが、L19モノクローナル抗体から得られる第2のscFvとカルボキシ末端ペプチド結合を共有する、ポリペプチド配列を含む。
具体的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号64~79及び配列番号82~143の群から選択されるポリペプチド配列と、少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列を含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号63及び配列番号64の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号63及び配列番号65の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号63及び配列番号66の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号63及び配列番号67の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号63及び配列番号68の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号63及び配列番号69の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号63及び配列番号70の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号63及び配列番号71の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号63及び配列番号72の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号63及び配列番号73の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号63及び配列番号74の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号63及び配列番号75の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号63及び配列番号76の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号63及び配列番号77の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号63及び配列番号78の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号63及び配列番号79の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号81の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号82の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号83の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号84の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号85の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号86の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号87の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号88の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号89の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号90の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号91の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号92の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号93の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号94の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号95の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号96の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号97の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号98の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号99の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号100の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号101の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号102の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号103の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号104の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号105の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号106の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号107の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号108の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号109の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号110の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号111の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号112の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号113の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号114の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号115の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号116の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号117の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号118の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号119の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号120の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号121の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号122の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号123の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号124の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号125の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号126の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号127の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号128の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号129の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号130の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号131の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号132の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号133の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号134の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号135の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号136の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号137の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号138の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号139の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号140の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号141の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号142の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号62、配列番号80及び配列番号143の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号145、配列番号146及び配列番号147の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号145、配列番号146及び配列番号148の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号145、配列番号146及び配列番号149の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号145、配列番号146及び配列番号150の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号145、配列番号146及び配列番号151の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号145、配列番号146及び配列番号152の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号145、配列番号146及び配列番号153の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号145、配列番号146及び配列番号154の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号145、配列番号146及び配列番号155の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号145、配列番号146及び配列番号156の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号145、配列番号146及び配列番号157の群から選択される配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号63の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号64の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号63の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号65の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号63の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号66の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号63の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号67の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号63の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号68の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号63の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号69の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号63の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号70の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号63の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号71の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号63の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号72の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号63の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号73の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号63の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号74の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号63の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号75の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号63の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号76の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号63の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号77の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号63の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号78の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号63の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号79の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号81の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号82の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号83の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号84の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号85の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号86の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号87の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号88の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号89の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号90の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号91の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号92の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号93の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号94の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号95の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号96の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号97の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号98の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号99の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号100の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号101の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号102の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号103の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号104の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号105の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号106の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号107の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号108の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号109の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号110の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号111の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号112の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号113の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号114の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号115の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号116の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号117の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号118の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号119の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号120の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号121の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号122の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号123の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号124の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号125の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号126の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号127の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号128の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号129の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号130の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号131の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号132の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号133の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号134の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号135の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号136の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号137の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号138の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号139の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号140の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号141の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号142の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号62の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号80の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号143の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号145の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号146の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号147の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号145の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号146の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号148の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号145の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号146の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号149の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号145の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号146の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号150の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号145の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号146の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号151の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号145の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号146の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号152の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号145の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号146の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号153の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号145の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号146の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号154の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号145の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号146の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号155の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号145の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号146の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号156の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号145の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号146の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号157の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
ポリヌクレオチド
本発明はさらに、ここに記載される、変異体IL-2ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、又は変異体IL-2ポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
本発明のポリヌクレオチドには、機能的断片又はそのバリアントを含め、配列番号5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157に示される配列と、少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるポリペプチドをコードするものが含まれる。
非IL-2部分に結合しない変異体IL-2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、通常、ポリペプチド全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして発現される。
本発明のイムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドは、完全なイムノコンジュゲートをコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は共発現される複数の(例えば、2つ以上の)ポリヌクレオチドとして発現される場合もある。共発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能的なイムノコンジュゲートを形成しうる。例えば、抗原結合部分の重鎖部分は、抗原結合部分の軽鎖部分と変異体IL-2ポリペプチドとを含むイムノコンジュゲートの部分とは別個のポリヌクレオチドによってコードされていてもよい。共発現されると、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと会合して抗原結合部分を形成する。代替的に、別の実施例では、抗原結合部分の軽鎖部分は、抗原結合部分の重鎖部分と変異体IL-2ポリペプチドとを含むイムノコンジュゲートの部分とは別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。一実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、変異体IL-2ポリペプチドと抗原結合部分とを含むイムノコンジュゲートの断片をコードする。一実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、抗原結合部分の重鎖と変異体IL-2ポリペプチドとをコードする。別の実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、抗原結合部分の軽鎖と変異体IL-2ポリペプチドとをコードする。
具体的な実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、少なくとも1つの変異体IL-2ポリペプチドと、少なくとも1つ、好ましくは2つ以上の抗原結合部分とを含むイムノコンジュゲートの断片をコードし、第1の変異体IL-2ポリペプチドは、第1の抗原結合部分とアミノ末端又はカルボキシ末端のペプチド結合を共有し、第2の抗原結合部分は、第1の変異体IL-2ポリペプチド又は第1の抗原結合部分とアミノ末端又はカルボキシ末端のペプチド結合を共有する。一実施態様では、抗原結合部分は、独立して、Fv分子、特にscFv分子、及びFab分子からなる群から選択される。別の具体的な実施態様では、ポリヌクレオチドは、抗原結合部分のうちの2つの重鎖及び1つの変異体IL-2ポリペプチドをコードする。別の具体的な実施態様では、ポリヌクレオチドは、抗原結合部分のうちの2つの軽鎖及び1つの変異体IL-2ポリペプチドをコードする。別の具体的な実施態様では、ポリヌクレオチドは、抗原結合部分のうちの1つの1つの軽鎖、第2の抗原結合部分の1つの重鎖、及び1つの変異体IL-2ポリペプチドをコードする。
別の具体的な実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドはイムノコンジュゲートの断片をコードし、ポリヌクレオチドは、2つのFab分子の重鎖、及び変異体IL-2ポリペプチドをコードする。別の具体的な実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、イムノコンジュゲートの断片をコードし、ポリヌクレオチドは、2つのFab分子の軽鎖、及び変異体IL-2ポリペプチドをコードする。別の具体的な実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドはイムノコンジュゲートの断片をコードし、ポリヌクレオチドは、1つのFab分子の重鎖、第2のFab分子の軽鎖、及び変異体IL-2ポリペプチドをコードする。
一実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、そのアミノ末端及びカルボキシ末端アミノ酸で1つ以上のscFv分子に接合された、少なくとも1つの変異体IL-2ポリペプチドを含むイムノコンジュゲートをコードする。
一実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドはイムノコンジュゲートの断片をコードし、ポリヌクレオチドは、免疫グロブリン分子の重鎖、特にIgG分子、さらに詳細にはIgG分子、及び変異体IL-2ポリペプチドをコードする。さらに具体的な実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、免疫グロブリン分子の重鎖及び変異体IL-2ポリペプチドをコードし、変異体IL-2ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖とアミノ末端ペプチド結合を共有する。
一部の実施態様では、ポリヌクレオチド又は核酸はDNAである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーRNA(mRNA)の形態の、RNAである。本発明のRNAは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
組み換え法
本発明の変異体IL-2ポリペプチドは、当技術分野で周知の遺伝的方法又は化学的方法を使用して、欠失、置換、挿入又は修飾によって調製することができる。遺伝的方法には、コード化DNA配列の部位特異的突然変異誘発、PCR、遺伝子合成等が含まれうる。正確なヌクレオチド変化は、例えば配列決定によって確認することができる。この観点で、天然IL-2のヌクレオチド配列は、Taniguchi et al.(Nature 302,305-10(1983))によって記載されており、ヒトIL-2をコードする核酸は、American Type Culture Collection(Rockville MD)等の公的な寄託機関から入手可能である。天然ヒトIL-2の配列は配列番号144に示される。置換又は挿入は、天然アミノ酸残基及び非天然アミノ酸残基を含みうる。アミノ酸修飾は、例えば、グリコシル化部位の付加又は炭水化物の接続等といった化学修飾の周知の方法を含む。
本発明の変異体IL-2ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、例えば、固体のペプチド合成又は組み換え生成によって得ることができる。組み換え生成の場合、例えば、上述のように、前記変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲート(断片)をコードする1つ以上のポリヌクレオチドは、宿主細胞でのさらなるクローニング及び/又は発現のために、単離されて1つ以上のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、従来の手順を使用して容易に単離及び配列決定されうる。一実施態様では、本発明のポリヌクレオチドの1つ以上を含むベクター-、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用して、適切な転写/翻訳制御シグナルと共に、変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲート(断片)のコード配列を含有する発現ベクターを構築することができる。これら方法には、in vitro組み換えDNA技術、合成技術及びin vivo組み換え/遺伝子組み換えが含まれる。例えば、the techniques described in Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989);and Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y(1989)に記載される技術を参照されたい。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部とすることができるか、又は核酸断片でありうる。発現ベクターは、IL-2変異体又はイムノコンジュゲート(断片)をコードするポリヌクレオチド(すなわちコード領域)が、プロモーター及び/又は他の転写要素若しくは翻訳制御要素と作用可能に会合してクローニングされる発現カセットを含む。ここで使用される「コード領域」は、アミノ酸中に翻訳されたコドンからなる核酸の一部分である。「停止コドン」(TAG、TGA又はTAA)は、アミノ酸中に翻訳されないが、存在する場合はコード領域の一部であると考えられる。但し、あらゆる隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、5’及び3’未翻訳領域等は、コード領域の一部ではない。2つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば単一のベクター上に、又は別個のポリヌクレオチドコンストラクト中、例えば別個の(異なる)ベクター上に、存在することができる。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、2つ以上のコード領域を含有していてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断によって翻訳後に又は翻訳と同時に最終タンパク質中に分離される1つ以上のポリタンパク質をコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明のポリペプチド又はそのバリアント若しくは誘導体をコードする第1のポリヌクレオチド又は第2のポリヌクレオチドに融合しているか又は融合していない、異種コード領域をコードしうる。異種コード領域には、限定されないが、分泌シグナルペプチド又は異種機能性ドメイン等の特殊な要素又はモチーフが含まれる。作用可能な会合は、遺伝子生成物、例えばポリペプチドのコード領域が、遺伝子生成物の発現を1つ又は複数の制御配列の影響下又は制御下に置くように、1つ以上の制御配列と会合している場合である。2つのDNA断片(ポリペプチドコード領域とそれに関連付けられたプロモーター等)は、プロモーター機能の誘導により、所望の遺伝子生成物をコードするmRNAが転写される場合、及び2つのDNA断片間の結合の性質が、遺伝子生成物の発現を指示する発現調節配列の能力を妨げないか、又はDNAテンプレートの転写能力を妨げない場合、「作用可能に会合」されている。したがって、プロモーターが、ポリペプチドをコードする核酸の転写を行うことができた場合、プロモーター領域は、ポリペプチドをコードする核酸と作用可能に会合していると思われる。プロモーターは、所定の細胞においてのみDNAの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターでありうる。プロモーター以外の他の転写制御要素、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルをポリヌクレオチドと作用可能に会合させて、細胞特異的転写を指示することができる。適切なプロモーター及び他の転写制御領域がここに開示されている。様々な転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント(例えば、イントロンAと組み合わせた最初期プロモーター)、シミアンウイルス40(例えば初期プロモーター)、及びレトロウイルス(例えばラウス肉腫ウイルス等)が含まれる。他の転写制御領域には、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβグロビン等の脊椎動物遺伝子由来のもの、並びに真核細胞における遺伝子発現を制御できる他の配列が含まれる。さらなる適切な転写制御領域には、組織特異的プロモーター及びエンハンサー、並びに誘導性プロモーター(例えば、テトラサイクリン類を誘導可能なプロモーター)が含まれる。同様に、種々の翻訳制御要素は当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、及びウイルス系由来の要素(特に、CITE配列とも呼ばれる内部リボソーム侵入部位又はIRES)が含まれる。発現カセットはまた、複製起点、及び/又はレトロウイルスの長い末端反復(LTR)又はアデノ随伴ウイルス(AAV)逆方向末端反復(ITR)等の染色体組み込み要素等の他の特徴を含みうる。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードする追加のコード領域と関連しうる。例えば、変異体IL-2ポリペプチドの分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするDNAは、変異体IL-2の成熟アミノ酸をコードする核酸の上流に配置されうる。同じことが、本発明のイムノコンジュゲート又はその断片に当てはまる。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、粗い小胞体を横切る成長中のタンパク質鎖の輸送が開始されると成熟タンパク質から切断される、シグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、通常、ポリペプチドのN末端に融合されたシグナルペプチドを有し、これが、翻訳されたポリペプチドから切断されて、ポリペプチドの分泌形態又は「成熟」形態を生成することを承知している。例えば、ヒトIL-2は、ポリペプチドのN末端にある20のアミノ酸シグナル配列を用いて翻訳され、その後、開裂されて、133の成熟アミノ酸ヒトIL-2を生成する。一部の実施態様では、天然シグナルペプチド、例えばIL-2シグナルペプチド又は免疫グロブリンの重鎖若しくは軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、又は作用可能に会合するポリペプチドの分泌を指示する能力を保持する配列の機能性誘導体が使用される。代替的に、異種哺乳動物シグナルペプチド又はその機能的誘導体が使用されてもよい。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)又はマウスβ-グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されうる。
後の精製を容易にするために使用されうる(例えばヒスチジンタグ)、又はIL-2変異体若しくはイムノコンジュゲートの標識を助けうる短いタンパク質配列をコードするDNAが、ポリヌクレオチドをコードするIL-2変異体又はイムノコンジュゲート(断片)の末端に又は末端中に含まれていてもよい。
さらなる実施態様では、本発明の1つ以上のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。一部の実施態様では、本発明の1つ以上のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターには、ポリヌクレオチド及びベクターのそれぞれに関連してここに記載される特徴のいずれかを、単独で又は組み合わせて組み込むことができる。このような一実施態様では、宿主細胞は、本発明の変異体IL-2ポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む(例えばそのようなベクターで形質転換又はトランスフェクトされている)。ここで使用される用語「宿主細胞」は、本発明のイムノコンジュゲート又はその断片を生成するように操作することのできる任意の種類の細胞系を指す。変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを複製するため、及びその発現を補助するために適した宿主細胞は、当技術分野で周知である。そのような細胞は、特定の発現ベクターを用いて適宜トランスフェクト又は形質導入されてもよく、大規模発酵機に播種するために大量のベクター含有細胞を成長させ、臨床用途に十分な量の変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを得ることができる。適切な宿主細胞は、原核微生物、例えば大腸菌、又は種々の真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、昆虫細胞等を含む。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要でないとき、細菌中で生成されうる。発現後、ポリペプチドを細菌細胞ペーストから可溶性画分に単離し、さらに精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母等の真核微生物は、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌及び酵母株を含む、ポリペプチドをコードするベクターの適切なクローニング又は発現宿主であり、部分的又は完全にヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの生成をもたらす。Gerngross、Nat Biotech 22,1409-1414(2004),and Li et al.,Nat Biotech 24,210-215(2006)を参照されたい。(グリコシル化)ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物(無脊椎動物及び脊椎動物)に由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。昆虫細胞と組み合わせて、特にヨトウガ(Spodoptera frugiperda))細胞のトランスフェクションに使用されうる多数のバキュロウイルス株が同定された。植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第5,959,177号、第6,040,498号、第6,420,548号、第7,125,978号、及び第6,417,429号(トランスジェニック植物において抗体を生成するためのPLANTIBODIESTM技術を記載)を参照されたい。脊椎動物細胞も、宿主として使用されうる。例えば、懸濁液中で成長するように適合された哺乳動物細胞株は有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40(COS-7)によって形質転換されたサル腎臓CV1株、ヒト胚腎臓株(例えばGraham et al.,J Gen Virol 36,59(1977)に記載される293細胞又は293T細胞)、ベビーハムスター腎臓細胞(BHK)、マウスセルトリ細胞(例えばMather,Biol Reprod 23,243-251(1980)に記載されるTM4細胞)、サル腎臓細胞(CV1)、アフリカミドリサル腎臓細胞(VERO-76)、ヒト子宮頸癌細胞(HELA)、イヌ腎臓細胞(MDCK)、バッファローラット肝臓細胞(BRL 3A)、ヒト肺細胞(W138)、ヒト肝臓細胞(Hep G2)、マウス乳房腫瘍細胞(MMT 060562)、TRI細胞(例えばMather et al.,Annals N.Y. Acad Sci 383,44-68(1982)に記載されるもの)、MRC 5細胞、及びFS4細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、dhfrCHO細胞(Urlaub et al.,Proc Natl Acad Sci USA 77、4216(1980))を含むチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞;及びYO、NS0、P3X63、及びSp2/0等の骨髄腫細胞株を含む。タンパク質生成に適した特定の哺乳動物宿主細胞の総説としては、例えば、Yazaki and Wu,Methods in Molecular Biology,Vol. 248(B.K.C. Lo,ed.,Humana Press,Totowa、NJ),pp.255-268(2003)を参照されたい。宿主細胞には、培養細胞、例えば、哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が含まれるが、数例を挙げると、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは動物組織内に含まれる細胞も含まれる。一実施態様では、宿主細胞は、真核細胞、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胎児性腎(HEK)細胞又はリンパ球細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)等の哺乳動物細胞である。
これら系で外来遺伝子を発現させるための標準的な技術は、当技術分野で既知である。抗体等の抗原結合部位の重鎖又は軽鎖に融合する変異体IL-2ポリペプチドを発現する細胞は、発現された変異体IL-2の融合生成物が、重鎖と軽鎖の両方を含む抗体であるように、抗体鎖の他方も発現するように操作されてもよい。
一実施態様では、本発明による変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを生成する方法が提供され、この方法は、ここに提供される変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの発現に適した条件下で培養すること、及び任意選択的に、変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを宿主細胞(又は宿主細胞培地)から回収することを含む。
本発明による一部の実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、少なくとも1つの非IL-2部分に結合している。IL-2変異体は、変異体IL-2ポリペプチドのセグメントが1つ以上の分子、例えばポリペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸、ポリヌクレオチド又はこれら分子の組み合わせである分子(例えば糖タンパク質、糖脂質等)に結合している場合、調製することができる。変異体IL-2ポリペプチドはまた、有機部分、無機部分又は医薬品に結合していてもよい。ここで使用される場合、医薬品は、約5,000ダルトン以下の有機含有化合物である。変異体IL-2ポリペプチドはまた、抗新生物剤、抗微生物剤、ホルモン、免疫調節物質、及び抗炎症薬等といった治療化合物を含む任意の生物学的薬剤に結合していてもよい。さらに含まれるのは、放射性同位体、例えばイメージング並びに療法のために有用なものである。
変異体IL-2ポリペプチドはまた、同種の複数の分子に、又は複数種の分子に結合していてもよい。一部の実施態様では、IL-2に結合する分子は、IL-2を、動物の特定の組織又は細胞に標的化する能力を付与することができ、ここでは「標的化部分」と呼ばれる。これら実施態様では、標的化部分は、標的組織又は細胞中のリガンド又は受容体に対する親和性を有し、それによりIL-2を標的組織又は細胞に向けることができる。特定の実施態様では、標的化部分は、IL-2を腫瘍に向ける。標的化部分には、例えば、細胞表面又は細胞内タンパク質、及び生物学的受容体のリガンド等に特異的な抗原結合部分(例えば抗体及びその断片)が含まれる。このような抗原結合部分は、腫瘍関連抗原、例えばここに記載されるものに特異的でありうる。
変異体IL-2ポリペプチドは、通常別のポリペプチド、例えば単鎖抗体、又は抗体重鎖若しくは軽鎖(の一部)に融合していても、又は別の分子に化学的にコンジュゲートしていてもよい。抗体重鎖の一部に対する変異体IL-2ポリペプチドの融合は、実施例に記載される。変異体IL-2ポリペプチドと別のポリペプチドとの間の融合であるIL-2変異体は、ポリペプチドに対して直接的に又はリンカー配列を通して間接的に融合されるように設計することができる。リンカーの組成及び長さは、当技術分野で周知の方法に従って決定することができ、有効性について試験することができる。IL-2と抗体重鎖との間のリンカー配列の例は、国際公開第2012/107417号の配列配列番号209、211、213に見出される。融合の個々の成分を分離するための切断部位を組み込むために、追加の配列、例えばエンドペプチダーゼ認識配列を必要に応じて含めることもできる。加えて、IL-2変異体又はその融合タンパク質は、当技術分野で周知であるように、ポリペプチド合成方法(例えば、Merrifield固相合成)を使用して、化学的に合成されてもよい。変異体IL-2ポリペプチドは、周知の化学抱合方法を使用して、他の分子、例えば別のポリぺプチドに化学的にコンジュゲートされてもよい。二官能架橋試薬、例えば当技術分野で周知のホモ官能性及びヘテロ官能性架橋試薬をこの目的のために使用することができる。使用する架橋試薬の種類は、IL-2に結合される分子の性質に依存し、当業者によって容易に特定されうる。これに代えて、又は加えて、変異体IL-2及び/又はコンジュゲートされることが意図される分子は、これも当技術分野で周知であるように、2つを別個の反応でコンジュゲートさせることができるように化学的に誘導体化されてもよい。
一部の実施態様では、変異体IL-2ポリペプチドは、抗原決定基に結合することのできる少なくとも抗体可変領域を含む1つ以上の抗原結合部分に結合している(すなわちイムノコンジュゲートの一部である)。可変領域は、天然に存在するか又は天然に存在しない抗体及びその断片の一部を形成することができ、且つそれらに由来しうる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生成する方法は、当技術分野で周知である(例えば、Harlow and Lane,”Antibodies,a laboratory manual”,Cold Spring Harbor Laboratory,1988を参照されたい)。天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を使用して構築することができ、組み換えによって生成することができる(例えば、米国特許第4,186,567号に記載されるように)か、又は例えば、可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって、得ることができる(例えば、McCaffertyに対する米国特許第5,969,108号参照)。イムノコンジュゲート、抗原結合部分及びそれらを生成するための方法はまた、その内容全体が参照によりここに援用される国際公開第2011/020783号に詳細に記載されている。
任意の動物種の抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域は、変異体IL-2ポリペプチドに結合することができる。本発明において有用な非限定的抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域は、マウス、霊長類又はヒト起源のものとすることができる。変異体IL-2/抗体コンジュゲート又は融合物がヒトへの使用を意図されている場合、抗体のキメラ形態は、抗体の定常領域がヒト由来のものである場合使用されうる。抗体のヒト化形態又は完全なヒト形態は、当技術分野で周知の方法に従って調製することもできる(例えば、Winterに対する米国特許第5,565,332号を参照されたい)。ヒト化は、限定されないが、(a)重要なフレームワーク残基(例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するために重要なもの)を保持しつつ、又は保持せずに、非ヒト(例えば、ドナー抗体)のCDRをヒト(例えば、レシピエント抗体)のフレームワーク領域及び定常領域上に移植すること、(b)非ヒト特異性決定領域(SDR又はa-CDR;抗体-抗原相互作用にとって重要な残基)のみをヒトフレームワーク及び定常領域上に移植すること、又は(c)非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置き換えによってヒト様切片でそれらを「クローキング」することを含め、種々の方法によって達成されてもよい。ヒト化抗体及びそれらの作製方法は、例えば、Almagro and Fransson,Front Biosci 13,1619-1633(2008)に概説されており、例えば、Riechmann et al.,Nature 332,323-329(1988);Queen et al.,Proc Natl Acad Sci USA 86,10029-10033(1989);米国特許第5,821,337号、同第7,527,791号、同第6,982,321号及び同第7,087,409号;Jones et al.,Nature 321,522-525(1986);Morrison et al.,Proc Natl Acad Sci 81,6851-6855(1984);Morrison and Oi,Adv Immunol 44,65-92(1988);Verhoeyen et al.,Science 239,1534-1536(1988);Padlan,Molec Immun 31(3),169-217(1994);Kashmiri et al.,Methods 36,25-34(2005)(SDR(a-CDR)移植を記載);Padlan,Mol Immunol 28,489-498(1991)(「リサーフェシング(resurfacing)を記載);Dall’Acqua et al.,Methods 36,43-60(2005)(「FRシャフリング」を記載);並びにOsbourn et al.,Methods 36,61-68(2005)及びKlimka et al.,Br J Cancer 83,252-260(2000)(FRシャフリングに対する「ガイド選択」手法を記載)にさらに記載されている。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当技術分野において既知の種々の技術を使用して生成することができる。ヒト抗体は、一般に、van Dijk and van de Winkel,Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)及びLonberg,Curr Opin Immunol 20,450-459(2008)に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成することができ、同抗体に由来しうる(例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York、1987))を参照されたい)。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を生成するように修飾されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製することができる(例えば、Lonberg、Nat Biotech 23、1117-1125(2005)を参照されたい。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリー(例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178,1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001);及びMcCafferty et al.,Nature 348,552-554;Clackson et al.,Nature 352,624-628(1991)を参照されたい)から選択されるFvクローン可変領域配列を単離することによって生成されうる。ファージは、一般的には、単鎖Fv(scFv)断片として、又はFab断片として、抗体断片を提示する。ファージディスプレイによるイムノコンジュゲーのための抗原結合部分の調製の詳細な記載は、国際公開第2011/020783号の実施例に見出すことができる。
一部の実施態様では、本発明に有用な抗原結合部分は、例えば、その内容全体が参照によりここに援用される、国際公開第2011/020783号(親和性成熟に関する実施例参照)又は米国特許出願公開第2004/0132066号に開示された方法に従って、増強された結合親和性を有するように操作される。特定の抗原決定基に対する本発明のイムノコンジュゲートの結合能は、酵素結合免疫吸着法(ELISA)又は当業者によく知られている他の手法、例えば表面プラズモン共鳴法(BIACORE T 100システムで分析)(Liljeblad,et al.,Glyco J 17,323-329(2000))、又は従来の結合アッセイ(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))によって測定することができる。競合アッセイを使用して、特定の抗原に対する結合について参照抗体と競合する抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変ドメイン、例えばフィブロネクチンのエキストラドメインB(EDB)に対する結合についてL19抗体と競合する抗体を特定することができる。一部の実施態様では、そのような競合抗体は、参照抗体により結合されるのと同じエピトープ(例えば、線状又は立体構造エピトープ)に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法が、Methods in Molecular Biology vol. 66(Humana Press,Totowa、NJ)のMorris(1996)“Epitope Mapping Protocols”に提供されている。例示的な競合アッセイにおいて、固定化抗原(例えばEDB)は、抗原に結合する第1の標識抗体(例えばL19抗体)と、抗原への結合について第1の抗体と競合する能力について試験される第2の非標識抗体とを含む溶液中でインキュベートされる。第2の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在しうる。コントロールとして、固定化抗原が、第1の標識抗体を含むが第2の非標識抗体は含まない溶液中でインキュベートされる。第1の抗体の抗原への結合を許容する条件下でのインキュベーション後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化抗原に関連付けられる標識の量が測定される。固定化抗原に関連付けられる標識の量がコントロール試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第2の抗体が、抗原への結合について第1の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)を参照されたい。
本発明の変異体IL-2変異体又はイムノコンジュゲートのさらなる化学修飾が望ましい場合がある。例えば、免疫原性及び半減期の問題は、ポリエチレングリコール(PEG)又はポリプロピレングリコール(PPG)等の実質的に直鎖のポリマーへのコンジュゲーションによって改善されうる(例えば、国際公開第87/00056号を参照されたい)。
ここに記載されるように調製されるIL-2変異体及びイムノコンジュゲートは、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、及びサイズ排除クロマトグラフィー等の当技術分野で既知の技術によって精製されうる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、正味の電荷、疎水性、親水性等といった要因に部分的に依存し、当業者には明らかであろう。アフィニティークロマトグラフィー精製の場合、抗体、リガンド、受容体又は抗原を、変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートが結合するものに対して使用することができる。例えば、変異体IL-2ポリペプチドに特異的に結合する抗体が使用されうる。本発明のイムノコンジュゲートのアフィニティークロマトグラフィー精製の場合、プロテインA又はGを含むマトリックスを使用してもよい。例えば、連続的なプロテインA又はプロテインGアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、本質的に実施例に記載されるようにイムノコンジュゲートを単離することができる。変異体IL-2ポリペプチド及びその融合タンパク質の純度は、ゲル電気泳動、及び高速液体クロマトグラフィー等を含め、様々な周知の分析方法のいずれかにより決定することができる。例えば、実施例に記載されるように発現させた重鎖融合タンパク質は、還元SDS-PAGEにより実証されるように、インタクトであり、適切に組み立てられていることが示された(図14参照)。2つのバンドが、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖/IL-2融合タンパク質の予測分子量に対応する概ねMr25,000及びMr60,000において分解された。
アッセイ
ここに提供される変異体IL-2ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、当技術分野で既知の種々のアッセイにより、それらの物理的/化学的特性及び/又は生物活性について特定、スクリーニング、又は特徴づけされうる。
親和性アッセイ
IL-2受容体の種々の形態に対する、変異体又は野生型のIL-2ポリペプチドの親和性は、表面プラズモン共鳴(SPR)により実施例に示される方法に従って、BIAcore装置(GE Healthcare)等の標準的な装置と、組み換え発現によって得られうるもの等の受容体サブユニットとを使用して決定することができる(例えば、Shanafelt et al.,Nature Biotechnol 18,1197-1202(2000)を参照されたい)。組み換えIL-2受容体β/γ-サブユニットヘテロ二量体は、サブユニットの各々を、ノブ・イントゥー・ホール技術(例えば米国特許第5,731,168号参照)によって修飾された抗体Fcドメイン単量体に融合して、適切な受容体サブユニット/Fc融合タンパク質のヘテロ二量体化を促進することにより、生成することができる(配列番号102及び103参照)。代替的に、IL-2受容体の異なる形態に対するIL-2変異体の結合親和性は、1つの又は他のそのような形態の受容体を発現することが知られている細胞株を使用して評価されうる。結合親和性を測定するための特定の説明的及び例示的な実施態様は、以下及び後述の実施例に記載されている。一実施態様によれば、Kは、CM5チップ上に固定化されたIL-2受容体を用いて25℃でBIACORE(登録商標)T100マシン(GE Healthcare)を使用して表面プラズモン共鳴によって測定される。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5、GE Healthcare)を、供給業者の説明書に従ってN-エチル-N’-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(EDC)及びN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)で活性化する。組み換えIL-2受容体は、10mMの酢酸ナトリウム、pH5.5を用いて0.5~30μg/mlに希釈された後、10μl/分の流量で注入され、概ね200~1000(IL-2R α-サブユニットの場合)又は500~3000(IL-2R βγノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体の場合)反応単位(RU)の結合タンパク質を達成する。IL-2受容体の注入に続いて、未反応基をブロックするために、1Mのエタノールアミンが注入される。動力学測定のために、変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの3倍の段階希釈物(略0.3nMから300nMの範囲)が、25℃で概ね30μl/分の流量で、HBS-EP+(GE Healthcare、10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05% Surfactant P20、pH7.4)に注入される。会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることによる単純な1対1ラングミュア結合モデル(BIACORE(登録商標)T100 Evaluation Softwareバージョン1.1.1)を使用して、会合速度(kon)と解離速度(koff)が計算される。平衡解離定数(K)は、koff/kon比として計算される。例えば、Chen et al.,J Mol Biol 293,865-881(1999)を参照されたい。
本発明のイムノコンジュゲートのFc受容体に対する結合は、例えばELISAによって、又はBIAcore機器(GE Healthcare)等の標準的な機器と、組み換え発現により得られるようなFc受容体とを使用して、表面プラズモン共鳴(SPR)により容易に決定することができる。代替的に、Fc受容体に対するFcドメイン又はFcドメインを含むイムノコンジュゲートの結合親和性は、特定のFc受容体を発現することが知られている細胞株、例えば、FcγIIIa受容体を発現するヒトNK細胞を使用して評価してもよい。一実施態様によれば、Kは、CM5チップ上に固定化されたFc受容体を用いて25℃でBIACORE(登録商標)T100マシン(GE Healthcare)を使用して表面プラズモン共鳴により測定される。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5、GE Healthcare)を、供給業者の説明書に従ってN-エチル-N’-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(EDC)及びN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)で活性化する。組み換えFc受容体は、10mMの酢酸ナトリウム、pH5.5を用いて0.5~30μg/mlに希釈された後、10μl/分の流量で注入され、概ね100~5000反応単位(RU)の結合されたタンパク質を達成する。Fc受容体の注入に続いて、未反応基をブロックするために、1Mのエタノールアミンが注入される。動力学測定のために、イムノコンジュゲートの3倍から5倍の段階希釈物(略0.01nMから300nMの範囲)が、25℃で概ね30~50μl/分の流量で、HBS-EP+(GE Healthcare、10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05% 界面活性剤 P20、pH7.4)に注入される。会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることによる単純な一対一ラングミュア結合モデル(BIACORE(登録商標)T100 Evaluation Softwareバージョン1.1.1)を使用して、会合速度(kon)と解離速度(koff)が計算される。平衡解離定数(K)は、koff/kon比として計算される。例えば、Chen et al.,J Mol Biol 293、865-881(1999)を参照されたい。
活性アッセイ
IL-2受容体に対するIL-2変異体の結合能は、受容体結合の下流で起こる免疫活性化の効果をアッセイすることにより、間接的に測定することができる。
一態様において、生物活性を有する変異体IL-2ポリペプチドを同定するためのアッセイが提供される。生物活性には、例えば、IL-2受容体を有するT細胞及び/又はNK細胞の増殖を誘導する能力、IL-2受容体を有するT細胞及び/又はNK細胞においてIL-2シグナル伝達を誘導する能力、NK細胞によって二次サイトカインとしてインターフェロン(IFN)-γを生成する能力、末梢血単核細胞(PBMC)による二次サイトカイン、特にIL-10及びTNF-αの生成を誘導する能力の低下、T細胞においてアポトーシスを誘導する能力の低下、腫瘍縮小を誘導する及び/又は生存率を向上させる能力、及びin vivoでの毒性特性の低下、特に血管透過性の低下が含まれる。in vivo及び/又はin vitroでこのような生物活性を有する変異体IL-2ポリペプチドも提供される。
一部の実施態様では、本発明の変異体IL-2ポリペプチドは、このような生物活性について試験される。IL-2の生物活性を決定するための様々な方法が当技術分野において周知であり、またこれら方法の多くの詳細は以下の実施例に開示される。実施例には、本発明のIL-2変異体を、NK細胞によってIFN-γを生成するそれらの能力について試験するための適切なアッセイが提供される。培養されたNK細胞は、本発明の変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートと共にインキュベートされ、培地中のIFN-γ濃度がその後ELISAによって測定される。
L-2誘導シグナル伝達は、複数のシグナル伝達経路を誘導し、JAK(Janusキナーゼ)及びSTAT(シグナルトランスデューサー及び転写の活性化因子)シグナル伝達分子を伴う。IL-2と受容体β-サブユニット及びγ-サブユニットとの相互作用は、それぞれβ-サブユニット及びγ-サブユニットに関連付けられる、受容体と、JAK1及びJAK3とのリン酸化をもたらす。次いでSTAT5は、リン酸化受容体と関連し、重要なチロシン残基上でそれ自体がリン酸化される。これは、受容体からのSTAT5の解離、STAT5の二量体化、及びSTAT5二量体の、それらが標的遺伝子の転写を促進する核への転位置をもたらす。変異体IL-2ポリペプチドの、IL-2受容体を通してシグナル伝達を誘導する能力は、したがって、例えば、STAT5のリン酸化を測定することにより、評価することができる。この方法の詳細は実施例に開示される。PBMCは、本発明の変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートで処理され、リン酸化STAT5のレベルはフローサイトメトリーによって決定される。
IL-2に応答したT細胞又はNK細胞の増殖は、血液から単離されたT細胞又はNK細胞を本発明の変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートと共にインキュベートし、続いて処理された細胞の溶解物中のATP含有量を決定することにより測定されうる。処理の前に、T細胞は、フィトヘマグルチニン(PHA-M)で事前刺激されてもよい。実施例に記載されるこのアッセイは、生細胞の数の高感度定量を可能にするが、当技術分野で既知の多数の適切な代替的アッセイ(例えば[H]-チミジン取り込みアッセイ、Cell Titer Glo ATPアッセイ、Alamar Blueアッセイ、WST-1アッセイ、MTTアッセイ)が存在する。
T細胞のアポトーシス及びAICDの決定のためのアッセイも実施例に提供され、そこでT細胞は、本発明の変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートとのインキュベーションの後でアポトーシス誘導抗体で処理され、アポトーシス細胞は、ホスファチジルセリン/アネキシン曝露のフローサイトメトリーによる検出によって定量化される。他のアッセイが当技術分野で既知である。
腫瘍増殖及び生存率に対する変異体IL-2の影響は、当技術分野で既知の様々な動物腫瘍モデルにおいて評価することができる。例えば、実施例に記載されるように、ヒトがん細胞株の異種移植片を、免疫不全マウスに移植し、本発明の変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートで処理することができる。
本発明の変異体IL-2ポリペプチド及びイムノコンジュゲートのin vivoでの毒性は、死亡率、生存中の観察結果(有害作用の可視症状、例えば挙動、体重、体温)並びに臨床及び解剖病理学(例えば血液化学値の測定値及び/又は病理組織学的分析)に基づいて決定することができる。
IL-2での治療によって誘導された血管透過性は、事前処理血管透過性動物モデルにおいて試験することができる。一般に、本発明のIL-2変異体又はイムノコンジュゲートは、適切な動物、例えばマウスに投与され、その後、動物は、脈管構造からの流布が血管透過性の度合いを反映する血管漏出レポーター分子を注入される。血管漏出レポーター分子は、好ましくは、事前処理に使用される野生型形態のIL-2の透過性を明らかにするために十分に大きい。血管漏出レポーター分子の一例は、血清タンパク質、例えばアルブミン又は免疫グロブリンでありうる。血管漏出レポーター分子は、好ましくは、分子の組織内分布の定量的決定を容易にする放射性同位体などで、検出可能に標識される。血管透過性は、様々な内臓、例えば肝臓、及び肺等、並びに異種移植される腫瘍を含め、腫瘍のいずれかに存在する血管について測定されうる。肺は、全長IL-2変異体の血管透過性を測定するために好ましい器官である。
組成物、製剤、及び投与経路
さらなる態様では、本発明は、例えば、以下の治療方法のいずれかにおける使用のための、ここに提供される変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートのいずれかを含む医薬組成物を提供する。一実施態様では、医薬組成物は、ここに提供される変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートのいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の実施態様では、医薬組成物は、ここに提供される変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートのいずれかと、例えば以下に記載される、少なくとも1つの追加の治療剤とを含む。
さらに提供されるのは、in vivoでの投与に適した形態の、本発明のIL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを生成する方法であり、この方法は、(a)本発明による変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを得ること、及び(b)変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを、少なくとも1つの薬学的に許容される担体と製剤化し、それによって、in vivoでの投与のために、変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの調製物を製剤化することを含む。
本発明の医薬組成物は、治療的有効量の、薬学的に許容される担体に溶解又は分散した1つ以上の変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを含む。「薬学的に許容される又は薬理学的に許容される」という表現は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに対して一般に無毒である、すなわち、例えばヒト等の動物に必要に応じて投与されたとき、有害作用、アレルギー反応又は他の有害反応を生じない、分子実体及び組成物を指す。少なくとも1つの変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートと、任意選択的に追加の有効成分とを含有する医薬組成物の調製は、参照によりここに援用されるRemington’s Pharmaceutical Sciences,18th Ed. Mack Printing Company,1990により例示されているように、本開示に照らして当業者に既知であろう。さらに、動物(例えば、ヒト)への投与について、製剤は、FDA生物基準局又は他の国の対応する機関によって要求される無菌状態、発熱性、一般的な安全性及び純度基準を満たすべきであることが理解されよう。好ましい組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。例示的なIL-2組成物は、米国特許第4,604,377号及び同第4,766,106号に記載されている。ここで使用される「薬学的に許容される担体」は、当業者に既知であるように(例えば、参照によりここに援用されるRemington’s Pharmaceutical Sciences,18th Ed. Mack Printing Company,1990,pp.1289-1329を参照されたい)、任意の及びすべての溶媒、バッファー、分散媒体、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤(例えば抗菌剤、抗真菌剤)、等張化剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、酸化防止剤、タンパク質、薬物、薬物安定化剤、ポリマー、ゲル、バインダー、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、染料、そのような類似の材料及びこれらの組み合わせを含む。従来の担体が有効成分と不適合でない限り、治療組成物又は医薬組成物におけるその使用が企図される。
組成物は、それが固体、液体又はエアロゾルの形態で投与されるかどうか、及び注射等の投与経路のために無菌である必要があるかどうかに応じて、異なる種類の担体を含みうる。本発明の変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲート(及び任意の追加の治療剤)は、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、脾臓内に、腎臓内に、胸膜内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、膣内に、直腸内に、腫瘍内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、結膜下に、小胞内に、経粘膜で、心膜内に、臍内に、眼内に、経口で、局所的に、局所的に、吸入(例えばエアロゾル吸入)により、注射により、注入により、持続注入により、標的細胞を直接浸す局所灌流で、カテーテルを介して、洗浄液を介して、クリームで、脂質組成物(例えばリポソーム)で、又は当業者に既知であろう他の方法若しくは上記の任意の組み合わせによって、投与することができる(例えば、参照によりここに援用されるRemington’s Pharmaceutical Sciences,18th Ed.Mack Printing Company,1990参照)。非経口投与、特に 静脈内注入が、本発明の変異体IL-2ポリペプチド及びイムノコンジュゲート等のポリペプチド分子を投与するために、最も一般的に使用される。
非経口組成物には、注射による投与、例えば、皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内注射用に設計されたものが含まれる。注射のために、本発明の変異体IL-2ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、水溶液、好ましくは生理学的に適合するバッファー、例えばハンクス溶液、リンゲル液、又は生理食塩水バッファー中において製剤化されうる。溶液は、懸濁剤、安定剤及び/又は分散剤等の調合剤を含有しうる。代替的に、変異体IL-2ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、使用前に、適切なビヒクル、例えば、滅菌パイロジェンフリー水を用いた構成のための粉末形態であってもよい。滅菌注射用溶液は、必要に応じて、以下に列挙する他の様々な成分と共に、本発明のIL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを必要な量で、適切な溶媒中に組み込むことによって調製される。無菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を通した濾過によって、容易に達成されうる。一般に、分散液は、様々な滅菌された有効成分を、基本的な分散媒体及び/又は他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液、懸濁液又は乳濁液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分の粉末に加えて、事前に無菌濾過されたその液体媒体から任意の追加の所望の成分を生成する真空乾燥又は凍結乾燥技術である。必要に応じて液体培地を適切に緩衝し、液体希釈剤をまず等張にしてから十分な食塩水又はグルコースを注射する必要がある。組成物は、製造及び保管の条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌等の微生物の汚染から保存されなければならない。エンドトキシン汚染は安全レベルの最小限に、例えば、0.5ng/mgタンパク質未満に抑える必要があることが理解されよう。適切な薬学的に許容される担体には、限定されないが、リン酸、クエン酸、及びその他の有機酸等のバッファー;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化物質;防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;ヘキサメトニウムクロリド;ベンザルコニウムクロリド;ベンゼトニウムクロリド;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾール等);低分子量(約10残基未満)のポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸;単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含む他の炭水化物;EDTA等のキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトール等の糖類;ナトリウム等の塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体);及び/又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤が含まれる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストラン等の、懸濁液の粘度を増加させる化合物を含有してもよい。任意選択的に、懸濁液は、化合物の溶解度を高めて高濃度溶液の調製を可能にする適切な安定剤又は薬剤も含有してよい。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製されてもよい。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ゴマ油等の脂肪油、又はエチルクリート又はトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル、又はリポソームが含まれる。
有効成分は、例えば、コアセルベーション技術によって又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル中、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル)内に、又はマクロエマルジョン中に、封入されうる。このような技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences(18th Ed. Mack Printing Company,1990)に開示されている。徐放性調製物が調製されてもよい。徐放性調製物の適切な例には、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、注射可能な組成物の持続性吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、アルミニウムモノステアレート、ゼラチン又はこれらの組み合わせの、組成物における使用によってもたらすことができる。
先述の組成物に加えて、イムノコンジュゲートは、持続性製剤として製剤化されてもよい。そのような長期間にわたって作用する製剤は、移植(例えば、皮下又は筋肉内)又は筋肉内注射によって投与されうる。したがって、例えば、変異体IL-2ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、適切なポリマー材料若しくは疎水性材料(例えば許容されるオイル中のエマルジョンとして)又はイオン交換樹脂を用いて、又は可溶性の低い誘導体、例えば、可溶性の低い塩として、製剤化されうる。
本発明の変異体IL-2ポリペプチド及びイムノコンジュゲートを含む医薬組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥の方法を用いて製造されうる。医薬組成物は、薬学的に使用できる調製物へのタンパク質のプロセッシングを促進する、1つ以上の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、又は助剤を使用して、従来の方法で製剤化されうる。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。
変異体IL-2ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、遊離酸若しくは遊離塩基、中性又は塩の形態で組成物中に製剤化されうる。薬学的に許容される塩は、遊離酸又は遊離塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されるもの、又は有機酸で形成されるもの、例えば、塩酸若しくはリン酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、又はマンデル酸等の有機酸が含まれる。遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム若しくは水酸化第二鉄等の無機塩基から;又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン若しくはプロカイン等の有機塩から誘導することもできる。薬学的塩は、対応する遊離塩基形態よりも水性及び他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向がある。
治療方法及び組成物
ここに提供される変異体IL-2ポリペプチド及びイムノコンジュゲートのいずれもが、治療方法において使用されうる。本発明の変異体IL-2ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、免疫療法薬剤として、例えばがんの治療において使用することができる。
治療方法における使用のために、本発明の変異体IL-2ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、医学行動規範と一致した様式で、製剤化、用量決定、及び投与される。これに関連する考慮要因には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に既知である他の要因が含まれる。
本発明の変異体IL-2ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、宿主の免疫系の刺激が有益である病状、特に細胞性免疫応答の増強が望ましい状態の治療に有用である。これらは、宿主免疫応答が不十分であるか又は不足している病状を含みうる。本発明の変異体IL-2ポリペプチド及びイムノコンジュゲートを投与することのできる病状は、例えば、細胞性免疫応答が特異的免疫にとって重要な機序であると思われる腫瘍又は感染を含む。本発明のIL-2変異体を用いることのできる特定の病状には、がん、例えば腎細胞癌又は黒色腫;具体的にはHIV陽性患者、免疫抑制された患者、及び慢性感染症等における免疫不全が含まれる。本発明の変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートは、それ自体を又は任意の適切な医薬組成物に含めて投与されうる。
一態様では、医薬としての使用のための本発明の変異体IL-2ポリペプチド及びイムノコンジュゲートが提供される。さらなる態様では、疾患の治療における使用のための本発明の変異体IL-2ポリペプチド及びイムノコンジュゲートが提供される。一部の実施態様では、治療方法における使用のための本発明の変異体IL-2ポリペプチド及びイムノコンジュゲートが提供される。一実施態様では、本発明は、治療を必要としている個体の疾患の治療における使用のための、ここに記載される変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを提供する。一部の実施態様では、本発明は、疾患を有する個体に対して治療的有効量の変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを投与することを含む、そのような個体を治療する方法における使用のための変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを提供する。一部の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。好ましい実施態様では、疾患はがんである。一部の実施態様では、本方法は、個体に対して、治療的有効量の少なくとも1つの追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんである場合は抗がん剤を投与することをさらに含む。さらなる実施態様では、本発明は、免疫系の刺激における使用のための、変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを提供する。一部の実施態様では、本発明は、個体に対して有効量の変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを投与して免疫系を刺激することを含む、個体の免疫系を刺激する方法における使用のための変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを提供する。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。上記実施態様のいずれかによる「免疫系の刺激」は、免疫機能の一般的な増加、T細胞機能の増加、B細胞機能の増加、リンパ球機能の回復、IL-2受容体の発現の増加、T細胞応答性の増加、及びナチュラルキラー細胞活性又はリンホカイン活性化キラー(LAK)細胞活性の増加等のうちの任意の1つ以上を含みうる。
さらなる態様では、本発明は、治療を必要とする個体の疾患の治療のための医薬の製造又は調製における、本発明の変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの使用を提供する。一実施態様では、医薬は、疾患を有する個体に、治療的有効量の医薬を投与することを含む、疾患を治療する方法における使用のためのものである。一部の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。好ましい実施態様では、疾患はがんである。このような一実施態様では、本方法は、個体に対して、治療的有効量の少なくとも1つの追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんである場合は抗がん剤を投与することをさらに含む。さらなる実施態様では、医薬は、免疫系を刺激するためのものである。さらなる実施態様では、医薬は、個体に対して有効量の医薬を投与して免疫系を刺激することを含む、個体の免疫系を刺激する方法における使用のためのものである。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであってよい。上記実施態様のいずれかによる「免疫系の刺激」は、免疫機能の一般的な増加、T細胞機能の増加、B細胞機能の増加、リンパ球機能の回復、IL-2受容体の発現の増加、T細胞応答性の増加、及びナチュラルキラー細胞活性又はリンホカイン活性化キラー(LAK)細胞活性の増加等のうちの任意の1つ以上を含みうる。
さらなる態様では、本発明は、個体に対して治療的有効量の本発明の変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを投与することを含む、前記個体の疾患を治療するための方法を提供する。一実施態様では、本発明の変異型IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを薬学的に許容される形態で含む組成物が、前記個体に投与される。一部の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。好ましい実施態様では、疾患はがんである。一部の実施態様では、本方法は、個体に対して、治療的有効量の少なくとも1つの追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんである場合は抗がん剤を投与することをさらに含む。さらなる態様では、本発明は、個体に対して有効量の変異型IL-2又はイムノコンジュゲートを投与して免疫系を刺激することを含む、個体の免疫系を刺激するための方法を提供する。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであってよい。上記実施態様のいずれかによる「免疫系の刺激」は、免疫機能の一般的な増加、T細胞機能の増加、B細胞機能の増加、リンパ球機能の回復、IL-2受容体の発現の増加、T細胞応答性の増加、及びナチュラルキラー細胞活性又はリンホカイン活性化キラー(LAK)細胞活性の増加等のうちの任意の1つ以上を含みうる。
上記治療方法のいずれもが変異体IL-2ポリペプチドに代えて又は加えて本発明のイムノコンジュゲートを使用して実行されうることが理解される。
一部の実施態様では、治療される疾患は、増殖性疾患、好ましくはがんである。がんの非限定的な例には、膀胱がん、脳がん、頭頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨がん、及び腎臓がんが含まれる。本発明のIL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを使用して治療することのできる他の細胞増殖性疾患には、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺(副腎、副甲状腺、脳下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺)、眼、頭頸部、神経系(中枢及び末梢)、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部領域及び泌尿生殖器系に位置する新生物が含まれる。前がんの状態又は病変及びがん転移も含まれる。一部の実施態様では、がんは、腎細胞がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳がん、頭頸部がんからなる群から選択される。同様に、他の細胞増殖性疾患も、本発明の変異体IL-2ポリペプチド及びイムノコンジュゲートによって治療することができる。このような細胞増殖性疾患の例には、限定されないが、上述の器官系に位置する、新生物以外の、高ガンマグロブリン血症、リンパ増殖性疾患、パラプロテイン血症、紫斑病、サルコイドーシス、セザリー症候群、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ゴーシェ病、ヒスチオサイトーシス、及び他のいずれかの細胞増殖性疾患が含まれる。別の実施態様では、疾患は、自己免疫、移植拒絶反応、外傷後免疫応答及び感染症(例えばHIV)に関する。具体的には、変異体IL-2ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、リンパ腫;自己免疫、移植拒絶反応、移植片対宿主病、虚血及び卒中を含め、免疫細胞媒介性障害に関与する細胞の排除において使用されうる。当業者であれば、多くの場合、変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートが、治癒を提供せずに部分的な利益を提供するのみである場合があることを容易に認識する。いくつかの実施態様では、何らかの利益を有する生理的変化も治療的に有益であると考慮される。したがって、いくつかの実施態様では、生理的変化を提供するある量の変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートは、「有効量」又は「治療的有効量」と考慮される。治療を必要とする対象、患者、又は個体は、典型的には哺乳動物であり、具体的にはヒトである。
本発明のイムノコンジュゲートは、診断試薬としても有用である。抗原決定基に対するイムノコンジュゲートの結合は、IL-2ポリペプチドに特異的な二次抗体を使用することにより容易に検出することができる。一実施態様では、二次抗体及びイムノコンジュゲートは、細胞又は組織の表面上に位置する抗原決定基に対するイムノコンジュゲートの結合の検出を容易にする。
いくつかの実施態様では、有効量の本発明の変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートが、細胞に投与される。他の実施態様では、治療的有効量の本発明の変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートが、疾患の治療のために個体に投与される。
疾患の予防又は治療のために、本発明の変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの適切な投薬量は(単独で又は1つ以上の他の追加の治療剤と組み合わせて使用されるとき)、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、ポリペプチドの種類(例えば、コンジュゲートしていないIL-2又はイムノコンジュゲート)、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的で投与されるか又は治療目的で投与されるか、以前又は現在の治療的介入、患者の病歴及び変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートに対する応答、及び主治医の判断に依存するであろう。いずれにせよ、投与を担当する施術者は、組成物中の1つ又は複数の有効成分の濃度及び個々の対象に対する1つ又は複数の適切な用量を決定する。単回の又は種々の時点にわたる複数回の投与、ボーラス投与、及びパルス点滴を含むが、これらに限定されない種々の投薬スケジュールが、ここでは企図される。
本発明の変異体IL-2ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、一般に、意図した目的を達成するために有効な量で使用されるであろう。疾患状態を治療又は予防するための使用のために、本発明のIL-2ポリペプチド若しくはイムノコンジュゲート、又はその医薬組成物が、治療的有効量で投与又は適用される。治療的有効量の決定は、特にここに提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
全身投与の場合、治療的に有効な用量は、in vitroアッセイ、例えば細胞培養アッセイから最初に推定することができる。次いで、細胞培養物中で決定されるIC50を含む血中濃度範囲を達成するために、用量を動物モデルで配合してもよい。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をさらに正確に決定するために使用することができる。
また、初期投薬量を、in vivoデータから、例えば、動物モデルから、当技術分野で周知の技術を使用して概算することができる。当業者であれば、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化することができるであろう。
局所投与又は選択的な取り込みの場合には、イムノコンジュゲートの有効な局所濃度は、血漿濃度と関係がない場合がある。当業者であれば、過度の実験をせずとも、治療的に有効な局所投与量を最適化することができるであろう。
治療的有効量の、本明細書に記載される変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートは、通常、実質的な毒性を引き起こすことなく治療的利益を与えるであろう。IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの毒性及び治療有効性は、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬事手順によって決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物研究を使用して、LD50(集団の50%に対する致死量)及びED50(集団の50%で治療的に有効な用量)を決定することができる。毒性効果と治療効果の用量比は治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。大きな治療指数を呈するIl-2変異体及びイムノコンジュゲートが好ましい。一実施態様では、本発明による変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートは、高い治療指数を呈する。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトでの使用に適した投薬量の範囲を製剤化するために使用することができる。投薬量は、好ましくは、毒性がほとんど又はまったくない、ED50を含む血中濃度の範囲内にある。投薬量は、様々な要因、例えば、用いられる剤形、利用される投与経路、及び対象の状態等に応じて、この範囲内で変動しうる。正確な製剤、投与経路及び投薬量は、患者の状態という観点から、個々の医師によって選択されうる。(例えば、その全体が参照によりここに援用されるFingl et al.,1975、In:The Pharmacological Basis of Therapeutics,Ch. 1,p. 1を参照されたい)。
本発明のIL-2変異体又はイムノコンジュゲートで治療される患者の主治医は、毒性、臓器不全等に起因して、どのように、いつ、投与を中止、中断、又は調整するかを知っているであろう。逆に、主治医は、臨床応答が適切でない場合(毒性を除いて)、治療をより高いレベルに調整することも知っている。対象である障害の管理における投与用量の大きさは、治療される状態の重症度、及び投与経路等によって変化する。状態の重症度は、例えば、標準的な予後評価方法によって部分的に評価されうる。さらに、用量及びおそらく投与頻度も、個々の患者の年齢、体重、及び応答に応じて変化するであろう。
前記ポリペプチドを含む変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの最大治療用量は、それぞれ野生型IL-2又は野生型IL-2を含むイムノコンジュゲートに使用されるものから増加されうる。
他の薬剤及び治療
本発明による変異体IL-2ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、治療法において、1つ以上の他の薬剤と組み合せて投与されてもよい。例えば、本発明の変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートは、少なくとも1つの追加の治療剤と共投与されうる。「治療剤」という用語は、そのような治療を必要とする個体の症状又は疾患を治療するために投与される任意の薬剤を包含する。このような追加の治療剤は、治療される特定の適応症に適した任意の有効成分、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含みうる。一部の実施態様では、追加の治療剤は、免疫調節剤、細胞分裂阻害剤、細胞接着阻害剤、細胞傷害性剤、細胞アポトーシスの活性化因子、又はアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を高める薬剤である。特定の実施態様では、追加の治療剤は、抗がん剤、例えば微小管破壊剤、抗代謝剤、トポイソメラーゼ阻害剤、DNAインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化因子、又は抗血管新生剤である。
このような他の薬剤は、意図された目的に有効な量の組み合わせで適切に存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用される変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの量、障害又は治療の種類、上述の他の因子に依存する。変異体IL-2ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、通常、ここに記載されるものと同じ投薬量及び投与経路を用いて、又はここに記載される投薬量の約1から99%で、又は経験的に/臨床的に適切であると決定される任意の投薬量でかつ任意の経路により、使用される。
上述のこのような併用療法は、併用投与(2つ以上の治療剤が、同じ又は別個の組成物に含まれる)、及び別個の投与を包含し、この場合、本発明の変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの投与は、追加の治療剤及び/又はアジュバントの投与前、投与と同時に及び/又は投与後に行うことができる。本発明の変異体IL-2ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。
製造品
本発明の別の態様では、上述の障害の治療、予防及び/又は診断に有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器と、容器上の又は容器に付随するラベル又は添付文書を含む。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、注射器、IV溶液バッグ等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成されうる。容器は、それだけで、又は状態を治療、予防及び/又は診断するために有効な別の組成物との組み合わせで組成物を保持し、無菌アクセスポートを有しうる(例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって穿通可能なストッパーを有するバイアルであってもよい)。組成物中の少なくとも1つの活性剤は、本発明の変異体IL-2ポリペプチドである。ラベル又は添付文書は、組成物が、選択される状態を治療するために使用されることを示す。さらに、製造品は、(a)中に、本発明の変異体IL-2ポリペプチドを含む組成物を有する第1の容器と、(b)中に、さらなる細胞毒性剤又は他の治療剤を含む組成物を有する第2の容器とを含みうる。本発明のこの実施態様における製造品は、組成物が特定の状態を治療するために使用することができることを示す添付文書をさらに含みうる。代替的に、又は追加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば、注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液を含む第2の(又は第3の)容器をさらに含みうる。それは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及び注射器を含め、商業的な観点及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含みうる。
上記の製造品はいずれもが、IL-2ポリペプチドの代わりに、又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含みうることが理解されよう。
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上記に提供された一般的な記載を前提として、他の種々の実施態様が実施されうることが理解される。
実施例1
抗原の調製及びIL2vのクローニング
組み換えDNA技術
標準的な方法を使用して、Sambrook,J. et al,Molecular cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold spring Harbor,New York,1989に記載されるように、DNAを操作した。分子生物学的試薬は、製造者の説明書に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、以下に与えられる:Kabat,E.A. et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Ed.,NIH Publication No 913242。
遺伝子合成
必要な場合、望ましい遺伝子セグメントは、適切なテンプレートを使用してPCRにより生成されたか、又はGeneart AG(Regensburg,Germany)で合成オリゴヌクレオチドとPCR生成物から自動遺伝子合成によって合成した。単一の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準的なクローニング/配列決定ベクター内へとクローニングした。プラスミドDNAを形質転換細菌から精製し、濃度をUV分光法によって決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列は、DNA配列決定によって確認した。それぞれの発現ベクターへのサブクローニングを可能にするために、適切な制限部位を有する遺伝子セグメントを設計した。
抗原発現ベクターのクローニング
ベータ及びガンマサブユニット(IL2Rbg)からなるIL2受容体コンストラクトの生成のために、Fcに基づくノブ・イントゥー・ホール融合コンストラクトを生成し、発現させた。IL2Rベータユニットの細胞外ドメイン(ECD)をN末端のFc-ノブ鎖に融合させ、ガンマユニットのECDをFc-ホール鎖のN末端に融合させた(配列番号2及び3)。Fc-ノブ鎖のC末端に融合したaviタグ(GLNDIFEAQKIEWHE)は、BirAビオチンリガーゼとの共発現の間に特異的ビオチン化を可能にした。図1は、このコンストラクトの概略図である。
真核細胞中でのFc融合コンストラクトの生成及び精製
IL2R(bg)-Fcコンストラクト(配列番号2及び3)を、HEK293 EBNA細胞の一過性トランスフェクションによって生成した。細胞を遠心分離し、培地を、予め暖めたCD CHO培地(Thermo Fisher、カタログ番号10743029)により置き換えた。CD CHO培地中で発現ベクターを混合し、PEI(ポリエチレンイミン、Polysciences,Inc、カタログ番号239661)を付加し、溶液をボルテックスして室温で10分間インキュベートした。その後、細胞(2Mio/mL)をベクター/PEI溶液と混合し、フラスコに移し、5%CO雰囲気の振盪インキュベーター内で、3時間37℃でインキュベートした。同時に共トランスフェクトされた、ビオチンリガーゼBirAをコードするプラスミドは、in vivoでのaviタグ特異的なビオチン化を可能にした。インキュベーションの後、補充物(総容積の80%)を含むExcell培地を付加した(W. Zhou and A. Kantardjieff,Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing,DOI:10.1007/978-3-642-54050-9;2014)。トランスフェクションの1日後、補充物(Feed、総容積の12%)を付加した。遠心分離及びその後の濾過(0.2μmフィルター)により、7日後に細胞上清を回収した。
標準的なプロトコールを参照して、濾過した細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡潔には、Fc含有タンパク質を細胞培養上清からプロテインA-アフィニティークロマトグラフィーにより精製した(平衡バッファー:20mMのクエン酸ナトリウム,20mMのリン酸ナトリウム、pH7.5;溶出バッファー:20mMのクエン酸ナトリウム、pH3.0)。溶出はpH3.0 で達成され、続いて直ちに試料のpHが中和された。遠心分離(Millipore Amicon(登録商標)ULTRA-15(Art.Nr:UFC903096)によりタンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、20mMヒスチジン、140mM塩化ナトリウム、pH6.0のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。ビオチン化は、ストレプトアビジンを加えることによって確認された。得られたビオチン化タンパク質/ストレプトアビジン複合体は、分析用SECクロマトグラムにおいて保持時間のシフトを示した。
ファージミドベクターへのIL2vのクローニング
DNA配列コード化IL2v(配列番号4)を、PCRによって増幅し、制限酵素NcoI/NotIを使用して本発明者らのファージミドベクター中にクローニングした。このクローニングにより、細菌PelBシグナル配列の転写/翻訳と、続いてIL2v配列及びC末端に融合したHisタグ及びFlagタグを得た。タグ間のアンバー終止コドン及びp3タンパク質をコードするファージ由来のDNA配列は、M13ファージ上に表示される可溶型IL2v及びIL2v両方の発現を可能にした。
pH7.4及びpH6におけるIL2Rに対するIL2v結合の評価
IL2vがELISAにおいていずれかのpH依存性挙動示すかどうかを評価するために、可溶型IL2vを含有する細菌の上清を、以前に生成されたIL2vファージミドを担持するTG1バクテリアを指数関数的に増殖させるIPTG誘導によって生成した。細菌の上清を遠心分離によって回収し、Bis-Trisバッファー(最終濃度:50mM BisTris、140mM NaCL)を使用してpHをpH6又はpH7.4に調節した。上清を、ビオチン化IL2R(bg)-Fcコンストラクトで以前にコーティングされたニュートラアビジンプレートでインキュベートし、BSAでブロックした。1時間後に、それぞれpH6又は7.4のBis-Tris洗浄バッファー(50mM BisTris、140mM NaCL、0.1% Tween)を用いて広範囲の洗浄を実施するとともに、すべての後続の工程をpH6で実施して、あらゆるpH依存性の二次的影響を回避した。IL2R(bg)-Fcコンストラクトに対するIL2vの結合を、抗Flag/HRP二次抗体を使用することによりFlagタグを介して検出した。2つの条件(pH6対pH7.4)間のシグナルの比較により等しく強力なシグナルが明らかになり、親IL2vタンパク質がその受容体に対してpHに依存しない挙動を示すという結論が得られた(図2)。
実施例2
IL2vに基づくpH依存性IL2vライブラリーの設計
IL-2(PDBコード:2b5i及び5m5e)の結晶構造が、基礎として使用された。IL-2とIL2受容体ベータ及びガンマ鎖(IL2Rbg)との間の接触面を、PyMolにおいて分析した。pH滴定可能特性を有する側鎖を担持する受容体のアミノ酸、特に水素結合のドナー又はアクセプターに特別に重点を置いた。受容体サブユニット上でそれらpH滴定可能残基の半径<8オングストローム内に位置するIL2残基を、pH操作のために考慮した。IL2はバクテリオファージ上に以前に表示されたため(Buchli et al.,Arch Biochem Biophys 1997;339:79-84;Vispo et al.,Immunotechnology Int J Immunol Eng 1997;3:185-93)、同様の手法を適用してpH依存性結合特性を導入した。
本発明者らは、事前に、IL2v(配列番号4)が固有のpH依存性結合特性を示さないことを確認した。これがライブラリー設計及びファージ選択スキームに影響すると思われるためである。図2は、IL2vが、in vitroIL2Rbg結合に関して、pH7.4及び6.0において同一に挙動することを示している。対照的に、Fallonと同僚らは、IL2がpH7.2においてpH6より高い親和性で結合するような、IL2のpH依存性を同定した(Fallon et al.,J. Biol. Chem. 275、6790-6797(2000)。
初期コンビナトリアルライブラリーは、以下の位置に無作為化アミノ酸を含むファージディスプレイについて生成された:K8、Q11、L12、L19、D20、M23、R81、D84、S87、N88、V91、E95、R120、T123、Q126、S130、T133(切断されたシグナルペプチドを有するUniProtエントリーP60568として番号付け)。無作為化は、得られる残基が、pH依存性にIL2受容体鎖に対する水素結合又は塩架橋を形成するように選択された。
2つのpH依存性IL2vライブラリーの生成
IL2vの配列と、受容体サブユニットベータ及びガンマの接触面における無作為化とに基づく2つのファージディスプレイライブラリーの生成のために、無作為化IL2v配列を包含し、制限酵素認識部位NcoI及びNotIに隣接するそれぞれのDNA断片を合成した。断片は、等しく切断された親IL2vアクセプターファージミドベクターと一緒に、NcoI/NotIで消化された。ライブラリー挿入物を、4℃で一晩ファージミドベクターでライゲートした。精製されたライゲーション生成物を、細菌形質転換に使用して、ライブラリー1については5x10の形質転換体を、ライブラリー2については1.66x1010の形質転換体を得た。IL2vライブラリーを表示するファージミド粒子を救出し、PEG/NaCl精製により精製して選択のためにさらに使用した。
実施例3
ファージディスプレイによるpH依存性IL2vバリアントの選択
pH依存性IL2vバリアントの選択を、組み換えビオチン化IL2R(bg)-Fcコンストラクト(配列番号:2及び3)を使用して行った。選択工程は、pH6.0又はpH7.4において、Bis-Trisに基づくバッファー(50mM BisTris、140mM NaCL)を使用して実施された。
パニングラウンドは、以下のパターンに従って溶液中で実施した:1.)1mlの総容積中での0.5時間にわたる100nMのビオチン化抗原タンパク質に対する概ね1012個のファージミド粒子の結合;2.)10分間にわたる5.4×10個のストレプトアビジン被覆磁気ビーズの付加によるビオチン化抗原の捕捉及び特異的結合ファージの結合;3.)Bis-Trisに基づくバッファーを使用したビーズの洗浄:4.)ファージ粒子の溶出。インキュベーションはpH7.4又はpH6において実施したが、洗浄工程は常にpH6で処理した。結合したファージ粒子は、1mlの100mMトリエチルアミン(TEA)を10分付加するか、又はバッファーをpH7.4に変更することにより、溶出した。
溶出したファージを、指数関数的に増殖する大腸菌TG1細胞の再感染に使用した。ヘルパーファージVCSM13での重複感染及びその後のPEG/NaCl沈殿の後、単離されたファージミド粒子を、その後の選択ラウンドに使用した。合計で、4回の選択ラウンドを実行した。
ELISAによるpH依存性IL2vバリアントの同定
pH依存性IL2vバリアントの同定のために、可溶型IL2v含有細菌上清を生成し、以下のようにELISAにより試験した:
ウェルあたり25μlの50nMビオチン化抗原を、pH6で384ウェルニュートラアビジンプレート上にコーティングし、2% BSA(50mM BisTris 140mM NaCl、2% BSA、pH6)でブロックした。IL2vの可溶型バリアントを含有する細菌の上清を、pH6にリバファリングし、プレートに加え、1時間インキュベートした。その後、複数の洗浄工程をpH6又はpH7.4において実施し、続いて洗浄バッファー中で30分間それぞれのpHでインキュベーション工程を行った。IL2R(bg)-Fcコンストラクトに対するpH依存性IL2vバリアントの結合を、抗Flag/HRP二次抗体を使用することによりFlagタグを介して検出した。2つの条件(pH6対pH7.4)間でのシグナルの比較により、pH依存性に結合するコンストラクトを同定することができた。親IL2vコンストラクトを発現するファージミドを、内部のpH非依存性コントロールとして使用した。pH7に対してpH6で最大の結合率を示すコンストラクト、すなわちpH6.0において強力な結合を示し、pH7.4において有意に低下した結合を示すか又は結合しないコンストラクト(図3)を選択し(配列番号5~19)、ワンアーム型(OA)標的化コンジュゲートへと変換した。
ワンアーム型CD8標的化IgG IL2v融合物へのpH依存性IL2vバリアントの変換-第1のファージディスプレイキャンペーン由来の第1の組のバリアント
第1のキャンペーン中でのやや酸性のpHにおける優先的結合のためにファージディスプレイによって選択された、15のpH依存性IL2バリアント(配列番号5~19)を、哺乳動物細胞(CHO K1)における発現、並びにプロテインAアフィニティークロマトグラフィー及び分取サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によるその後の精製のために、ワンアーム型CD8標的化IgG PG LALA IL2v融合物へと変換した。pH依存性IL2vバリアントを、末端リジン(K)を有さない「ノブ」重鎖のC末端に融合させ、(G4S)3グリシン-セリンリンカーを介して接続した。得られたCD8標的化IgG IL2v融合物は、配列番号62、63及び65;配列番号62、63及び66;配列番号62、63及び67;配列番号62、63及び68;配列番号62、63及び69;配列番号62、63及び70;配列番号62、63及び71;配列番号62、63及び72;配列番号62、63及び73;配列番号62、63及び74;配列番号62、63及び75;配列番号62、63及び76;配列番号62、63及び77;配列番号62、63及び78;又は配列番号62、63及び79から構成されていた。図8は、生成された融合物の分子フォーマットを模式的に示している。親IL2vを、コンストラクトの組にコントロールとして含めた(配列番号62、63及び64)。対応するcDNAを、従来の(非PCR系)クローニング技術を使用してevitriaのベクター系にクローニングした。evitriaベクタープラスミドを遺伝子合成した。プラスミドDNAを、陰イオン交換クロマトグラフィーに基づく低エンドトキシン条件下で調製した。DNA濃度は、波長260nmでの吸収を測定することによって決定した。配列の正確さは、サンガー配列決定により確認した(cDNAのサイズに応じてプラスミドあたり最大2つの配列決定反応)。懸濁液適合CHO K1細胞(元々はATCCから受け取り、evitriaにおいて懸濁培養での無血清増殖に適合させた)を生成に使用した。種子を、既知組成の、動物成分を含まない無血清培地であるeviGrow培地中で成長させた。細胞をeviFect(evitriaの特注の独自のトランスフェクション試薬)でトランスフェクトし、トランスフェクション後、動物成分を含まない無血清培地であるeviMake2で細胞を増殖させた。遠心分離及びその後の濾過(0.2μmフィルター)により、上清を回収した。ワンアーム型CD8標的化IgG IL2v融合コンストラクトを、その後プロテインAアフィニティークロマトグラフィー(MabSelect SuRe)及び分取サイズ排除クロマトグラフィー(HiLoad 26/60 Superdex 200)により精製し、20mM His、140mM Nacl、0,01% Tween20 pH6,0中に製剤化した。濃度は、波長280nmでの吸収を測定することによって決定した。単量体含有量を、分析的サイズ排除クロマトグラフィー及びキャピラリー電気泳動(CE-SDS)による純度によって決定した。エンドトキシンのレベルが決定され、それはすべての試料について<0.231 EU/mlであった。
表面プラズモン共鳴(SPR)を使用したIL2Rbgに対するpH依存性OA CD8標的化IgG IL2v融合物の結合キネティクスの決定
ヒトヘテロ二量体IL-2受容体ベータ/ガンマ(IL2Rbg)に対するワンアーム型CD8標的化IgG IL2v融合コンストラクトの結合を、Biacore T200機器(Cytiva)を使用する表面プラズモン共鳴(SPR)により調査した。簡潔には、マウス抗PG LALA抗体(Roche Diagnostics)を、製造者の説明書に従って標準的なアミンカップリング化学を使用してシリーズsセンサーチップCM3(Cytiva、29104990)に固定化した。概ね4000共鳴単位(RU)の最終的な表面密度が得られた。その後、IgG IL2v融合コンストラクトを、各々30秒間0.25μg/mlの濃度で第2のフローセルに注入した。第1のフローセルは基準面として使用された。流量を30μl/分に増加させた後、IL2Rbgを、単回サイクルキネティクスモード(動的滴定)において両方のフローセルに、90秒間300から11.1nMの範囲の濃度で(1:3希釈系列)注入した。最後の被分析物注入後の解離を、900秒間モニターした。その後、10mM NaOHを60秒間5μl/分の流量で注入することにより表面を再生した。バルク屈折率の差異は、フローセル1(基準面)から得られた応答を差し引くことにより、及びバッファー注入を差し引くことにより(二重参照)、修正した。得られたセンサーグラムを、BIAevaluationソフトウェア(Cytiva)を使用して1:1ラングミュア結合モデルにフィッティングした。すべての実験は、ランニング及び希釈バッファーとしてHBS-P+(10mM HEPES、150mM NaCl pH7.4、0.05%界面活性剤P-20)、PIPES pH6.1、PIPES pH6.5及びPIPES pH7.0(各々20mM PIPES、154mM NaCl、0.05% Tween-20)を使用して25℃で実施した。結果を以下の表1~4にまとめる。
表1.pH7.4におけるIL2Rbgに対するpH依存性IL2vバリアント結合の動的速度定数、親和性及びt1/2
表2.pH7.0におけるIL2Rbgに対するpH依存性IL2vバリアント結合の動的速度定数、親和性及びt1/2
表3:pH6.5におけるIL2Rbgに対するpH依存性IL2vバリアント結合の動的速度定数、親和性及びt1/2
表4:pH6.1におけるIL2Rbgに対するpH依存性IL2vバリアント結合の動的速度定数、親和性及びt1/2
SPRを使用して、親IL2v(OA CD8 IgG IL2v)について、pH7.4及びpH7.0におけるヒトIL2Rbgに対する結合と、pH6.5及びpH6.1におけるヒトIL2Rbgに対する結合との間に若干の親和性の低下(それぞれ、pH7.4において0.6nM、pH7.0において0.5nM、pH6.5において3nM、及びpH6.1において2nM)を観察することができる。IL2Rbgからのその解離速度は、pHが低下するほど高くなる。対照的に、pH依存性IL2vバリアントの大部分は(例えばOA CD8 IgG IL2v P031.226及びOA CD8 IgG IL2v P043.217を除いて)、pH7.4及びpH7.0において、親IL2v(OA CD8 IgG IL2v)より有意に弱い結合を呈するが、それらの親和性は上昇し、ヒトIL2Rbgからのそれらの解離速度は、pHが低下するほど低下する。したがって、親IL2v(OA CD8 IgG IL2v)と比較して、第1のファージディスプレイキャンペーンから選択されたpH依存性IL2vバリアントの大部分の、ヒトIL2Rbgに対する結合は、中性pHにおいて比較的弱いが、やや酸性のpH(pH6.5及びpH6.1)では親和性が上昇した。
ヒトNK細胞におけるpH依存性OA CD8 IgG IL2vコンストラクトによるpSTAT5誘導
pH依存性OA CD8 IgG IL2vコンストラクトの活性を、ヒトPBMCを使用して決定した。簡潔には、pH依存性OA CD8 IgG IL2vコンストラクトの希釈物(最終濃度100nM、1nM、0.01nM、ネガティブコントロール:未処理;ポジティブコントロール:proleukin)を、細胞の固定化(37℃で10分)のためにCytofix(BD #554655)を付加する前にインキュベーター内において新鮮なヒトPBMCと共に20分間37℃でインキュベートした。細胞を、遠心分離し(350xg、5分)、PhosflowPermバッファー(BD #558050)に再懸濁し、4℃で30分間インキュベートした。その後、細胞を、FACSバッファー(PBS+2% FCS+5mM EDTA+0.25%アジ化ナトリウム)で洗浄し、フローサイトメトリー(FACS)染色を、以下の抗体を使用して30分間4℃で実施した:抗ヒトCD3-Pacific Blue、抗ヒトCD4 PECy7、抗ヒトCD8 PerCPCy5.5、抗ヒトCD25-PE、抗ヒトCD56-APC、抗ヒトFoxP3-PE-CF594、抗pSTAT5-AlexaFluor 488(すべてabs BD、抗ヒトCD56のみBiolegendから得た)。試料を、BD FACS Fortessaを使用して測定し、陽性細胞のパーセンテージとpSTAT5シグナルの平均蛍光発光強度を、NK細胞集団において決定した(CD3 neg CD56pos)。
表5:pSTAT5アッセイのためのpH依存性OA CD8 IgG IL2vコンストラクト
結果を図6及び図7に示す。図6は、サイトカインの生物活性を媒介する、IL-2シグナル伝達時に活性化される転写因子であるリン酸化STAT5(Signal Transducer And Activators Of Transcription、pSTAT)について陽性であるNK細胞のパーセンテージを示している。Proleukin及びOA CD8 IgG IL2vコントロールコンストラクト、さらにはバリアントOA CD8 IgG IL2v P043.217は、pH7.4において同等で濃度依存性のpSTAT5の活性化を示す。これとは反対に、他のすべてのpH依存性OA CD8 IgG IL2vコンストラクトは、pH7.4において、抗体濃度に応じて低下した活性を示す。pH6.5では、IL-2刺激時に、pSTAT5誘導の全体的な低減を観察することができる。図7は、OA CD8 IgG IL2v(コントロール)によるpSTAT5の誘導に正規化された、計算された曲線下面積(AUC)を示している(pH7.4で100%活性に設定)。すべてのpH依存性コンストラクトは、pH7.4においてpSTAT5活性化の31~66%の低減を示した(表2、中央の列)。例外として、OA CD8 IgG IL2v P043.217は、proleukinと同様の挙動を示し、CD8 IgG IL2vと比較して>100%の活性を示した。pH6.5では、すべてのコンストラクトが、pH7.4において、CD8 IgG IL2vと比較して40~75%の活性しか示さない(表6、右の列)。
表6:pSTAT5アッセイにおいてpH7.4でのCD8 IgG IL2vに正規化されたpH依存性OA CD8 IgG IL2vコンストラクトのAUC値の%
実施例4
第1のpH依存性IL2vライブラリーから選択されたIL2vバリアントのコンセンサス配列に基づく第2のpH依存性IL2ライブラリーの生成及び特徴づけ
第2のライブラリーを、第1のキャンペーンに観察される特定の濃縮パターンに基づいて設計した。例えば位置K11において、本発明者らは、ファージ選択後に最初のリジン残基の回収のみを観察した。したがって、次のラウンドとして、この残基を再びリジンへと変異させて戻した。精緻化したライブラリーのために考慮した残基は以下の通りである:Q11、L12、Q13、E15、H16、L19、D20、Q22、M23、R81、D84、S87、E95、R120、Q126、S130、及びT133。いくつかの位置は、親アミノ酸でない1つの特定のアミノ酸の明らかな濃縮を示した。例えば、Q11は、第1のキャンペーン後に、Eについて濃縮を示した。R81は、明らかにDによって置き換えられていた。このようなパターンは、第2バージョンのライブラリーの設計に含めた。第2のライブラリーは、第1のキャンペーンと同一に扱った。
新しいpH依存性IL2vファージディスプレイライブラリーの生成のために、それぞれのDNA断片を合成した。これは無作為化されたIL2v配列からなり、制限酵素認識部位NcoI及びNotIに隣接している。断片は、等しく切断された親IL2vアクセプターファージミドベクターと一緒にNcoI/NotIで消化させた。第1のファージミドベクターとは対照的に、V5タグの配列(GKPIPNPLLGLDST)を、ファージミドのhisタグ領域とflagタグとの間に挿入した。V5タグは、抗V5抗体を使用してSPR実験の間に分子の特異的捕捉を可能にする。ライブラリー挿入物を、4℃で一晩ファージミドベクターでライゲートした。精製されたライゲーションは細菌形質転換のために使用され、2x1010個の形質転換体を上回る複雑性を有するライブラリーを得た。
IL2vライブラリーを表示するファージミド粒子を救出し、PEG/NaCl精製により精製して選択のために使用した。
実施例5
改善されたpH依存性IL2vバリアントの選択及び特徴づけ
ファージディスプレイによるpH依存性IL2vバリアントの選択
pH依存性IL2vバリアントの選択を、第1のライブラリーの選択と同様の手順に従って実施した。簡潔には、組み換えビオチン化IL2R(bg)-Fcコンストラクトを、選択のための抗原として使用した。すべての選択工程は、Bis-Trisに基づくバッファー(50mM Bis-Tris140mM NaCl、最終濃度、pH6又はpH7.4)を使用して実施した。パニングラウンドを、以下のパターンに従って溶液中で行った:1.)1mlの総容積中での0.5時間にわたる100nM ビオチン化抗原タンパク質に対する概ね1012個のファージミド粒子の結合;2.)10分間にわたる5.4×10個のストレプトアビジンコート磁気ビーズの付加によるビオチン化抗原の捕捉及び特異的結合ファージの結合;3.)Bis-Trisに基づくバッファーを使用したビーズの洗浄;4.)ファージ粒子の溶出。インキュベーション工程はpH7.4又はpH6において実施したが、洗浄工程は常にpH6で処理した。結合したファージ粒子は、1mlの100mM トリエチルアミン(TEA)を10分付加するか、又はバッファーをpH7.4に変更することにより、溶出した。
溶出したファージを、指数関数的に増殖する大腸菌TG1細胞の再感染に使用した。ヘルパーファージVCSM13での重複感染及びその後のPEG/NaCl沈殿の後、単離されたファージミド粒子を、その後の選択ラウンドに使用した。抗原濃度の(100nMから20nMへの)低下を使用して選択を4ラウンド実行した。
ELISAによるpH依存性IL2vバリアントのスクリーニング及び特徴づけ
pH依存性IL2vバリアントの同定のために、可溶型IL2v含有細菌上清を生成し、以下のようにELISAにより試験した:
ウェルあたり25μlの50nMビオチン化抗原を、pH6で384ウェルニュートラアビジンプレート上にコーティングし、2% BSA(50mM ビストリス140mM NaCL、2% BSA、pH6)でブロックした。IL2vの可溶型バリアントを含有する細菌の上清を、pH6にリバファリングし、プレートに加え、1時間インキュベートした。その後、複数の洗浄工程をpH6又はpH7.4において実施し、続いて洗浄バッファー中で30分間それぞれのpHでインキュベーション工程を行った。IL2R(bg)-Fcコンストラクトに対するpH依存性IL2vバリアントの結合を、抗Flag/HRP二次抗体を使用することによりFlagタグを介して検出した。2つの条件(pH6対pH7.4)間でのシグナルの比較により、pH依存性に結合するクローンを同定することができた。親IL2vコンストラクトを発現するファージミドを、pH依存性シグナルの内部コントロールとして使用した。10より大きなpH6対pH7での結合率を有するクローンを、それらのpH依存性を確認するために、最終的に選択し、再試験した。
選択されたpH依存性IL2vバリアントをさらに特徴づけるために、pH6、pH6.5、pH7、及びpH7.4を含む4つの異なるpH条件下で、それらを、IL2R(bg)-Fcに対する結合について分析した。それぞれのpH値を用いたELISAを、実施例3において記載されたように実施した。結果を図4に示す。すべてのクローン間の結合をよりよく比較するために、pH6における結合を1に正規化した。興味深いことに、多くのバインダーは、pH6と比較してpH6.5において同様に強力に結合する(例えばP172.0344、P173.0087、P173.0364、P174.0040、P174.0281、P177.0156)が、一方他のクローンは、既に低減した結合を示している(例えばP173.0127、P173.0156、P173.0239、P173.0259、P173.0371、P0174.0277、P175.0368、P177.0035、P177.0036)。一般に、pH7及びpH7.4における結合強度は、10分の1~100分の1に減少した。
SPRによるpH依存性IL2vバリアントのスクリーニング及び特徴づけ
選択されたpH依存性IL2v-クローンの個々の結合挙動を調べるために、ProteOn XPR36機器(Biorad)を使用して表面プラズモン共鳴を実施した。市販の抗V5タグ抗体(20μg/ml)を、アミンカップリングによりGLMチップに固定化し、垂直方向で約8000反応単位(RU)の固定化レベルを達成した。可溶型IL2vクローンバリアントを含有する細菌の上清を、Bis-Tris(pH7.4)で1:5に希釈し、垂直方向のチップ上に抗V5 mAbに対するリガンドとして捕捉し、100RUと300RUの間の捕捉レベルを得た。タンパク質発現のない細菌の上清を参照用に使用した。
共注入実験では、組み換えIL2R(bg)-Fc(50nM)を水平方向において被分析物として使用し、3つの異なる条件で同時にpH依存性IL2vクローンバリアントの結合特性を調査した:1)Bis-Trisバッファー(pH6)との会合及びBis-Trisバッファー(pH6)との解離;2)Bis-Trisバッファー(pH6)との会合及びBis-Trisバッファー(pH7.4)との解離;並びに3)Bis-Trisバッファー(pH7.4)との会合及びBis-Trisバッファー(pH7.4)との解離。実験条件を示す一実施例を図5Aに示す。会合及び解離の両方は毎秒50μlの流量で200秒続いた。条件1(pH6での会合及び解離)により、IL2vバインダーバリアントに対するIL2R(bg)-Fcの強力な結合が得られ、pH6(会合)からpH7.4(解離)へのバッファー変更により、急速な結合の消失が誘導され、IL2R(bg)-Fcと固定化されたpH依存性IL2vバリアントとの間の相互作用が数秒で消失した。多くのクローンバリアントについて、pH7.4での会合相の間に相互作用は検出されないか、又は極めて弱い相互作用しか検出されなかった。試験した3つの条件における最良の20個のクローンのセンサーグラムを図5B-Uに示す。定性的SPR測定値から得られる極めて明らかなpH依存性結合の結果に基づいて、24個のクローン(配列番号20~43)を、抗CD8標的化IgG融合コンストラクトへのIL2vバリアントの最終的な変換のために選択した。
ワンアーム型CD8標的化IgG IL2v融合物へのpH依存性IL2vバリアントの変換-第2のファージディスプレイキャンペーン由来の第2の組のバリアント
第2のキャンペーン中でのやや酸性のpHにおける優先的結合のためにファージディスプレイによって選択された24個のpH依存性IL2vバリアント(配列番号20~43)を、哺乳動物細胞(CHO K1)における発現、並びにプロテインAアフィニティークロマトグラフィー及び分取サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によるその後の精製のために、ワンアーム型CD8標的化IgG PG LALA IL2v融合へと変換した。pH依存性IL2vバリアントを、末端リジン(K)を有さない「ノブ」重鎖のC末端に融合させ、(G4S)2G5グリシン-セリンリンカーを介して接続した(図8は、生成された融合物の分子フォーマットを模式的に示している)。加えて、この組は、選択されたpH依存性IL2vバリアントだけでなく、単一変異又は組み合わせたコンセンサス変異体を有するIL2vバリアントを含む。得られたCD8標的化IgG IL2v融合物は、配列番号62、80及び81;配列番号62、80及び82;配列番号62、80及び83;配列番号62、80及び84;配列番号62、80及び85;配列番号62、80及び86;配列番号62、80及び87;配列番号62、80及び88;配列番号62、80及び89;配列番号62、80及び90;配列番号62、80及び91;配列番号62、80及び92;配列番号62、80及び93;配列番号62、80及び94;配列番号62、80及び95;配列番号62、80及び96;配列番号62、80及び97;配列番号62、80及び98;配列番号62、80及び99;配列番号62、80及び100;配列番号62、80及び101;配列番号62、80及び102;配列番号62、80及び103;配列番号62、80及び104;配列番号62、80及び105;配列番号62、80及び106;配列番号62、80及び107;配列番号62、80及び108;配列番号62、80及び109;配列番号62、80及び110;配列番号62、80及び111;配列番号62、80及び112;配列番号62、80及び113;配列番号62、80及び114;配列番号62、80及び115;配列番号62、80及び116;配列番号62、80及び117;配列番号62、80及び118;配列番号62、80及び119;配列番号62、80及び120;配列番号62、80及び121;配列番号62、80及び122;配列番号62、80及び124;配列番号62、80及び125;配列番号62、80及び126;配列番号62、80及び127;配列番号62、80及び128;配列番号62、80及び129;配列番号62、80及び130;配列番号62、80及び131;配列番号62、80及び132;配列番号62、80及び133;配列番号62、80及び134;配列番号62、80及び135;配列番号62、80及び136;配列番号62、80及び137;配列番号62、80及び138;配列番号62、80及び139;配列番号62、80及び140;配列番号62、80及び141;配列番号62、80及び142;又は配列番号62、80及び143から構成されていた。
実施例6
バイオレイヤー干渉法(BLI)を使用した、IL2Rbgに対するワンアーム型CD8標的化IgG IL2v融合物(第2のファージディスプレイキャンペーン由来の第2の組のバリアント)の結合キネティクスの決定
異なるpH値におけるIL-2Rbgに対するワンアーム型CD8標的化IgG IL2v融合物の結合を、Octet RED384機器(Sartorius)を使用してバイオレイヤー干渉法により調査した。簡潔には、抗体-IL2v融合物を、20mM PIPES、140mM NaCl pH7.4、0.05% Tween 20中5μg/mlの濃度で90秒間抗ヒトFab CH1センサーの先端(FAB2G、Sartorius no. 18-5125)上に捕捉した。既に対応する希釈バッファーを使用して追加の洗浄/ベースライン工程を行った後、100nMのヒトIL2Rbg(P1AA4193)又はマウスIL2Rbg(P1AD6727)を、180秒の会合時間と300秒の解離時間を用いて、それぞれpH6.0、6.2、6.5、6.8、7.1、又は7.4の20mM PIPES、140mM NaCl、0.05% Tween 20中で希釈した、捕捉された抗体-IL2v融合物に結合させた。その後、センサーの先端を、10mM グリシン pH1.7で3回30秒再生した。得られた結合曲線を、Data Analysis Software(Sartorius)を使用して1:1結合モデルにフィッティングした。この結果を表7にまとめる。
表7:異なるpH値におけるヒトIL-2Rbgに対するワンアーム型CD8標的化IgG IL2v融合物の結合キネティクス
選択されたIL2vバリアントの大部分について、BLIデータは、それらがpH7.4及びpH7.0においてあまり結合しないこと、及びそれらの受容体結合の強度がpHが低下するにつれて減少することを示している。全体として、親和性(KD)とpHとの間には逆相関が存在し、pHがpH7.4からpH6.0へと低下するにつれて増加する親和性は、主に次第に減少する解離速度定数(kd)により引き起こされる。pH依存性について選択されたIL2vバリアントとは対照的に、親IL2v(P1AG0738、ワンアーム型CD8 IgG-親IL2v)は、試験したすべてのpH値において、特に中性pH周辺のより高いpH値において、より高い親和性とより小さい解離速度定数とを呈する。重要なことに、pH依存性について選択されたIL2vバリアントは、中性pH(pH7.4、pH7.0、pH6.8)周辺において、親IL2vと比較してはるかに弱いヒトIL2Rbgに対する親和性を呈し、したがって全身の受容体動員の減少をもたらすはずである。しかしながら、やや酸性の腫瘍微小環境(TME)では、これらバリアントは、TMEの外側で、末梢よりも良好な、受容体動員とその後のIL2R経路を介したシグナル伝達を呈すると予想される。IL2vへの単一変異の導入は、同程度のpH依存性をもたらさない。一般に、pH7.4とpH6.0との間のそれらの親和性範囲は、pH依存性について選択されたIL2vバリアントよりも、親IL2vに近い。選択されたpH依存性IL2vバリアントの大部分は、マウスIL2Rbgに対して交差反応性であるが、ヒトIL2Rbg上と同程度のpH依存性を呈さない。この結果を表8にまとめる。
表8:異なるpH値におけるマウスIL-2Rbgに対するワンアーム型CD8標的化IgG IL2v融合物の結合キネティクス
実施例7
BIACORE単回サイクルキネティクスを使用した、IL2Rbgに対するワンアーム型CD8標的化IgG IL2v融合物(第2のファージディスプレイキャンペーン由来の第2の組のバリアント)の結合キネティクスの決定
11個の最終的に選択されたIL2vバリアントの組を、Biacore T200機器(Cytiva)を使用して表面プラズモン共鳴(単回サイクルキネティクス)によりIL-2Rbgに対するpH依存性結合について追加で試験した。実験は、それぞれpH7.4、pH7.1、pH6.8、及びpH6.5において、PBS-T(10mM HPO、140mM NaCl、0.05% Tween-20)中で実施した。IL2vバリアントの捕捉のために、ビオチン化抗ヒトFab(抗CH1)抗体(ThermoScientific no. 7103202100)を、Series S Sensor Chip SA(Cytiva no. BR-1005-31)に、2つのフローセル上で略2500共鳴単位(RU)の表面密度で固定化した。IL2vバリアントをフローセル2に注入した。得られた表面密度は略10から30 RUにわたっており、フローセル1は基準面として使用された。その後、希釈系列11.1、33.3、及び100nMのヒトIL-2Rbg(P1AA4193)を90秒間注入し、最も高い濃度について解離を900秒間モニターした。バルク屈折率の差異は、フローセル1(モック表面)から得られた応答を差し引くことにより、及びバッファー注入を差し引くことにより(二重参照)、修正した。得られた曲線を、BIAevaluationソフトウェア(Cytiva)を使用して1:1ラングミュア結合モデルにフィッティングした。
11個すべてのIL2vバリアントは、pH6.5からpH7.4まで継続的に減少するpH依存性結合を呈する。このような親和性の減少の推進力は、すべてのバリアントの解離速度定数(kd)であり、一方バリアントのいくつかについては、pH6.5からpH7.4へと会合速度定数(ka)も明らかに減少しており、それらは例えばP1AG0709、P1AG0710、P1AG0712、P1AG0713、P1AG0715、P1AG0717、及びP1AG0720である。この結果を表9にまとめる。
表9:SPR動力学的データ
実施例8
ワンアーム型CD8標的化IgG Il2v融合物によるヒトPBMCの活性化及び増殖の誘導
ヒトPBMC活性化及び増殖に対する抗CD8-IL2v(pH)コンストラクトの影響を、pH7.4及びpH6.5において決定した。簡潔には、抗CD8-IL2v(pH)希釈物(最終濃度100nM、10nM、1nM、0.1nM)を、pH6.5又はpH7.4でカスタムRPMI培地(Gibco/Thermofisher)中のインキュベーター内で、新鮮なCFSE標識ヒトPBMCと共に、5日間37℃、5% COでインキュベートした。5日後、細胞を回収し、フローサイトメトリー(Live/Dead(life technologies #L34976)、抗ヒトCD4 BV605、抗ヒトCD8 BV711、抗ヒトCD56 BV421、抗ヒトCD25 PE-Dazzle 594及び抗ヒトCD69 PECy7)のために染色した。CD4+ T細胞、CD8+ T細胞又はNK細胞を発現するCD25、CD69又は4-1BBのパーセンテージと、3つの免疫集団の活性化マーカーの蛍光強度の中央値(MFI)とを、増殖細胞のパーセンテージと共に決定した。
抗CD8-IL2v(pH)コンストラクトによるCD8+T細胞及びNK細胞増殖の誘導に関する結果を図9に示す。CD4+ T細胞は、さらなる刺激の非存在下において増殖の有意な誘導を示さなかった(データは示さない)。すべてのコンストラクトは、pH6.5においてCD8+ T細胞及びNK細胞の濃度依存性増殖を誘導し、一方、試験したすべての条件下で有意な増殖を誘導したpH非依存性コントロールコンストラクトP1AG0738 ctr.と比較して、pH依存性コンストラクトのうちのいくつかは最も高い濃度のみでpH7.4においていくらかの増殖を誘導した(図9)。
図10に示されるように、増殖に加えて、抗CD8-IL2v(pH)コンストラクトは、T細胞及びNK細胞の活性化(CD25、CD69)も誘導する。ここで、増殖細胞のパーセンテージと、CD25及びCD69の発現について陽性の細胞のパーセントは、培地のpHに依存していることが示されている。pH非依存性コントロールP1AG0738 ctr.とは対照的に、コンストラクトの大部分について観察される明らかなpH依存性が存在する。
異なる免疫サブセット及び活性化/増殖マーカーにわたって、pH6.5においてより高い活性を有するが、pH7.4では低い活性を有するか又は活性を有さない最も有望な候補を選択するために、コンストラクトの滴定曲線に基づいて、すべての読み出しについて曲線下面積(AUC)の値を決定した。pH6.5におけるAUCとpH7.4におけるAUCとの比を計算した(図11)。これに基づき、PD1標的化IL2v(pH)コンストラクトへの変換時に、pH6.5及びpH7.4における活性の最高平均比を有する上位5つの分子が、in vitro試験のために選択された(表10)。
実施例9
第2世代pH-dep IL2vバリアントの2価のPD1標的化フォーマットへの変換
図12に示されるように、最終的に11のpH依存性IL2vバリアントが、2価のPD1標的化複合体フォーマットへの変換のために選択された。これら11のpH依存性IL2vバリアントは、P172.0344(配列番号145、146及び147)、P173.0364(配列番号145、146及び148)、P174.0040(配列番号145、146及び149)、P174.0173(配列番号145、146及び150)、P174.0238(配列番号145、146及び151)、P174.0281(配列番号145、146及び152)、P174.0326(配列番号145、146及び153)、P174.0327(配列番号145、146及び154)、P175.0125(配列番号145、146及び155)、P177.0035(IL2v(コンセンサスすべて))(配列番号145、146及び156)、並びにP178.0145(配列番号145、146及び157))であった。これらPD1標的化pH依存性IL2vバリアントのうちの5つを、in vitroでの細胞ベースアッセイにおいて試験した。以下の表は、対応するワンアーム型CD8標的化対2価のPD1標的化pH依存性IL2vバリアントコンストラクトを示している。
表10:pH6.5からpH7.4において活性の最高平均比を有する大部分のpH依存性IL2vバリアントが、2価のPD1標的化コンストラクトとしてin vitroでの試験のために選択された。
PD1への第2世代pH-dep IL2vバリアントの2価の標的化によるヒトPBMCの活性化及び増殖の誘導
ヒトPBMC活性化及び増殖に対する抗PD1-IL2v(pH)コンストラクトの影響を、pH7.4、pH6.8及びpH6.5において決定した。簡潔には、抗PD1-IL2v(pH)希釈物(最終濃度10nM、1nM)を、コーティングした抗ヒトCD3抗体(1μg/ml)の非存在下又は存在下において、pH6.5又はpH7.4でカスタムRPMI培地(Gibco/Thermofisher)中のインキュベーター内で、新鮮なCFSE標識ヒトPBMCと共に5日間37℃、5% CO2でインキュベートした。5日後、細胞を回収し、フローサイトメトリー(Live/Dead(life technologies #L34976)、抗ヒトCD4 BV605、抗ヒトCD8 BV711、抗ヒトCD56 BV421、抗ヒトCD25 PE-Dazzle 594、抗ヒトCD69 PECy7及び抗ヒト4-1BB APC)のために染色した。CD4+ T細胞、CD8+ T細胞又はNK細胞を発現するCD25、CD69又は4-1BBのパーセンテージと、3つの免疫集団の活性化マーカーの蛍光強度の中央値(MFI)とを、増殖細胞のパーセンテージと共に決定した。
CD8標的化-IL2v(pH)コンストラクトとは対照的に、抗PD1-IL2v(pH)コンストラクトの活性は、他の刺激の非存在下でPD1を発現しない新鮮なヒトPBMCにおいては低いか又は存在しなかった(データは示さない)。これとは対照的に、CD3誘導活性化及び増殖の有意な強化が、特に5日間のインキュベーション時にpH6.8において観察することができた(この時活性化T細胞はPD1発現も上方制御する)(図13)。
実施例10
野生型IL2へのpH依存性付与変異の導入
IL2vにpH依存性を付与する変異が野生型IL2にもpH依存性を付与するかどうかを試験するために、選択された変異体の組を、ヒトFcノブ鎖のC末端(配列番号158(非標的化Fc-野生型IL2融合物のための「空の」HCホール)、配列番号159~164(非標的化Fc-野生型IL2融合物のためのHCノブ)に融合させて、野生型IL2配列中に導入した。これら選択された変異の組は、それぞれ、P174.0040(配列番号158及び159を有するコンストラクトに関連)、P174.0326(配列番号158及び160を有するコンストラクトに関連)、P172.0344(配列番号158及び162を有するコンストラクトに関連)、P175.0125(配列番号158及び163を有するコンストラクトに関連)、並びにP174.0238(配列番号158及び164を有するコンストラクトに関連)に対応し、野生型IL2を含む同様のコンストラクトがコンパレータ(P1AG7463(配列番号158及び161を有するコンストラクトに関連))として使用された。野生型IL2はin cisでCD25に結合することができるので、CD8又はPD1への標的化はこれらコンストラクトでは省略した。フォーマットを図14に示す。
BIACORE単回サイクルキネティクスを使用したIL2Rbgに対するpH依存性非標的化Fc-wt IL2融合物の結合キネティクスの決定
ワンアーム型CD8標的化IgG IL2v融合物との比較でのIL2Rbgに対する非標的化Fc-wt IL2融合物のpH依存性結合を、Biacore T200機器(Cytiva)を使用した表面プラズモン共鳴により調査した。実験は、それぞれpH7.4、7.1、6.8及びpH6.5において、PBS-T(10mM H3PO4、140mM NaCl、0.05% Tween-20)で実施した。IL2融合コンストラクトの捕捉のために、マウス抗ヒトFc PGLALA抗体を、概ね5000共鳴単位(RU)の表面密度でSeries S Sensor Chip CM3(Cytiva、29104990)に固定化した。IL2融合コンストラクトをフローセルに注入した。得られた表面密度RUは概ね10から100 RUに達した。第1のフローセルは基準面として保持された。その後、希釈系列33.3、100及び300nM(親IL2融合コンストラクトをコントロールとして使用したとき11.1、33.3及び100nM)のヒトIL-2Rbg(P1AA4193)を90秒間注入し、解離を600秒までモニターした。バルク屈折率の差異は、フローセル1(基準面)から得られた応答を差し引くことにより、並びにバッファー注射を差し引くことにより(二重参照)、修正した。導出された曲線を、BIAevaluationソフトウェア(Cytiva)を使用して1:1ラングミュア結合モデルにフィッティングした。4つの異なるpH値における得られたKDを表11にまとめる。IL2vバリアント(P1AG0697、P1AG0708、P1AG0710、P1AG0713、及びP1AG0715)と野生型IL2バリアント(P1AG7464、P1AG7461、P1AG7466、P1AG7462、及びP1AG7465)との比較により理解できるように、選択された変異の組は、IL2vだけでなく野生型IL2にもpH依存性を付与する。
表11.異なるpH(低=低結合シグナルと極めて低い親和性のみ)におけるpH依存性IL2v及び野生型IL2バリアントの平衡解離定数(KD)の集計表
pH依存性非標的化Fc-wt IL2融合物によるヒトPBMCの活性化及び増殖の誘導
ヒトPBMCの活性化及び増殖に対するpH依存性非標的化Fc-wt IL2融合物(表12)の影響を、pH7.4及びpH6.5において決定した。簡潔には、IL2wt(pH)希釈物を、pH6.5又はpH7.4でカスタムRPMI培地(Gibco/Thermofisher)中のインキュベーター内で、新鮮なCFSE標識ヒトPBMCと共に、5日間37℃、5% CO2でインキュベートした。5日後、細胞を回収し、フローサイトメトリーのために染色した。CD69発現CD8+ T細胞又はNK細胞のパーセンテージと、2つの免疫集団の活性化マーカーの蛍光強度の中央値(MFI)とを、増殖細胞のパーセンテージと共に決定した。
表12.pH依存性非標的化Fc-wt IL2融合物
図15は、pH7.4と比較した、pH6.5での100nMのpH依存性非標的化Fc-wt IL2融合物の活性を示している。試験したすべてのpH依存性IL2wtコンストラクトから、P1AG7464(P172.0344)は、pH6.5において最も高い活性示し、pH7.4において、pH非依存性コントロールコンストラクトP1AG7463_ctrと比較して顕著により低い活性を示した。P1AG7461(P174.0040)及びP1AG7462(P174.0326)は、pH6.5においていくらかの活性を示し、pH7.4においてほとんど活性を示さず、一方P1AG7465(P175.0125)及びP1AG7466(P174.0238)は、すべてにおいてほとんど活性を示さなかった。
上述の発明は、理解を明確にする目的で、説明及び実施例によって、ある程度詳細に説明されたが、これら説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。ここに引用されるすべての特許及び科学文献の開示は、参照によりその全体が明示的に援用される。

Claims (32)

  1. それぞれ野生型IL-2、好ましくは配列番号144によるヒトIL-2との比較で、1つ以上のアミノ酸置換を含む変異体インターロイキン-2(IL-2)ポリペプチドであって、1つ以上のアミノ酸置換が、中性pHにおいて、IL-2受容体に対する結合、好ましくは中程度親和性IL-2受容体(IL2Rβγ)に対する結合を消失させるか又は低減し、かつ低下したpHにおいて、IL-2受容体に対する結合、好ましくは中程度親和性IL-2受容体(IL2Rβγ)に対する結合を容易にする、変異体IL-2ポリペプチド。
  2. 前記1つ以上のアミノ酸置換が、配列番号144によるヒトIL-2の残基6、8、11、12、13、15、16、19、20、22、23、81、84、87、91、95、120、123、126、130、133に対応する位置の群から選択される位置にある、請求項1に記載の変異体IL-2ポリペプチド。
  3. 前記1つ以上のアミノ酸置換が、S6Y、K8E、Q11E、Q11T、L12D、L12E、L12Q、L12S、L12T、Q13H、Q13R、E15Q、H16D、H16E、H16N、H16Q、L19D、L19Q、D20E、D20Q、Q22D、Q22E、Q22H、M23E、M23N、M23Q、R81D、R81E、R81H、R81N、R81Q、D84E、D84Q、S87D、S87E、S87N、S87Q、V91D、V91E、V91N、E95D、E95Q、R120E、R120H、T123E、T123Q、Q126E、Q126H、S130E、T133D、T133E、T133N、T133Qの群から選択される、請求項1又は2に記載の変異体IL-2ポリペプチド。
  4. アミノ酸置換
    (i)L12E、D20E、M23N、R81N、D84E、S87E、R120E、T123E、S130E、T133N;
    (ii)Q11E、D20Q、M23E、R81D、D84E、S87E、S130E、T133N;
    (iii)L12E、L19D、R81D、R120E、T123E、S130E、T133E;
    (iv)R81Q、S87E、V91D、T123E、S130E、T133D;
    (v)Q11E、L12E、M23Q、R81D、S87E、V91D、S130E、T133Q;
    (vi)Q11E、L19D、R81D、D84E、S130E、T133D;
    (vii)R81D、D84Q、S87D、V91N、T123Q、S130E、T133D;
    (viii)L19D、R81E、D84E、S87Q、R120H、S130E、T133E;
    (iix)L19D、M23N、R81D、T133E;
    (ix)Q11E、L12E、M23Q、R81Q、S87D、V91N、E95Q、R120H、T123E、S130E、T133E;
    (x)L19D、R81E、S130E、T133D;
    (xi)R81Q、S87E、V91D、R120E、S130E、T133D;
    (xii)L12Q、L19Q、R81H、V91E、T123E、S130E、T133E;
    (xiii)K8E、D20E、M23N、R81H、D84Q、S87E、R120H、S130E、T133D;
    (xiv)L12E、L19Q、R81H、R120E、T133D;
    (xv)H16E、L19D、Q22E、M23Q、R81D、D84E、S87D、R120H、S130E、T133E;
    (xvi)Q11E、L12E、H16Q、L19D、Q22E、M23N、R81E、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E;
    (xvii)Q11E、H16E、L19D、M23E、R81D、S87E、R120H、Q126E、T133D;
    (xviii)Q11E、L12S、E15Q、H16N、L19D、M23E、R81E、D84E、S87D、R120H、S130E、T133E;
    (xix)Q11E、H16E、M23E、R81N、D84E、S87E、R120H、Q126E、S130E、T133E;
    (xx)Q11E、E15Q、H16E、Q22E、M23E、R81H、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D;
    (xxi)Q11E、L12D、Q13H、E15Q、H16E、Q22E、M23E、R81N、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E;
    (xxii)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81E、S87E、R120H、S130E、T133E;
    (xxiii)H16E、L19D、M23Q、R81N、D84E、S87D、R120H、S130E、T133D;
    (xxiv)Q11E、L12T、E15Q、H16E、L19D、Q22H、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E;
    (xxv)Q11E、L12T、E15Q、H16E、L19D、Q22H、M23E、R81E、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E;
    (xxvi)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81E、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E;
    (xxvii)H16E、Q22E、M23Q、S87N、R120H、S130E、T133E;
    (xxviii)H16E、L19D、Q22D、M23Q、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E;
    (xxiix)Q11E、L12E、Q13H、E15Q、H16N、L19D、Q22E、M23Q、R81E、D84E、S87D、E95D、R120H、T133E;
    (xxix)Q11E、L12T、H16E、L19D、Q22E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D;
    (xxx)Q11T、L12E、E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E、R120E、S130E、T133D;
    (xxxi)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E;
    (xxxii)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81Q、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E;
    (xxxiii)Q11E、L12S、H16E、L19D、M23Q、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E;
    (xxxiv)S6Y、L12E、Q13R、H16Q、Q22E、M23Q、R81N、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D;
    (xxxv)H16D、M23N、R81D、D84E、R120H、S130E、T133E;
    (xxxvi)Q11E、L12T、H16Q、L19D、M23E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E;
    (xxxvii)Q11E、L12E、H16N、M23N、R81E、D84E、R120H、S130E、T133E;
    (xxxviii)E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E;
    (xxxix)Q11E、R120H、S130E、T133D;又は
    (xl)Q11E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D
    を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の変異体IL-2ポリペプチド。
  5. 群T3A、F42A、Y45A、L72G、C125Aから選択されるいずれかのアミノ酸置換を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の変異体IL-2ポリペプチド。
  6. アミノ酸置換F42A、Y45A及びL72Gを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の変異体IL-2ポリペプチド。
  7. アミノ酸置換T3A、F42A、Y45A、L72G及びC125Aを含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の変異体IL-2ポリペプチド。
  8. 非IL-2部分に結合している、請求項1から7のいずれか一項に記載の変異体IL-2ポリペプチド。
  9. 第1の非IL-2部分及び第2の非IL-2部分に結合している、請求項1から8のいずれか一項に記載の変異体IL-2ポリペプチド。
  10. 前記第1の非IL-2部分とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、前記第2の非IL-2部分とアミノ末端ペプチド結合を共有する、請求項9に記載の変異体IL-2ポリペプチド。
  11. 前記非IL-2部分が抗原結合部分又はエフェクター細胞結合部分である、請求項8から10のいずれか一項に記載の変異体IL-2ポリペプチド。
  12. 請求項1から7のいずれか一項に記載の変異体IL-2ポリペプチドと、抗原結合部分又はエフェクター細胞結合部分とを含むイムノコンジュゲート。
  13. 前記変異体IL-2ポリペプチドが、前記抗原結合部分又はエフェクター細胞結合部分とアミノ末端又はカルボキシ末端のペプチド結合を共有する、請求項12に記載のイムノコンジュゲート。
  14. 第1の抗原結合部分と第2の抗原結合部分、又は第1のエフェクター細胞抗原結合部分と第2のエフェクター細胞抗原結合部分、又は抗原結合部分とエフェクター細胞結合部分を含む、請求項12又は13に記載のイムノコンジュゲート。
  15. (i)前記変異体IL-2ポリペプチドが、前記第1の抗原結合部分とアミノ末端又はカルボキシ末端のペプチド結合を共有し、前記第2の抗原結合部分が、a)前記変異体IL-2ポリペプチド又はb)前記第1の抗原結合部分とアミノ末端又はカルボキシ末端のペプチド結合を共有するか;
    (ii)前記変異体IL-2ポリペプチドが、前記第1のエフェクター細胞結合部分とアミノ末端又はカルボキシ末端のペプチド結合を共有し、前記第2のエフェクター細胞結合部分が、a)前記変異体IL-2ポリペプチド又はb)前記第1のエフェクター細胞結合部分とアミノ末端又はカルボキシ末端のペプチド結合を共有するか;
    (iii)前記変異体IL-2ポリペプチドが、抗原結合部分とアミノ末端又はカルボキシ末端のペプチド結合を共有し、エフェクター細胞結合部分が、a)前記変異体IL-2ポリペプチド又はb)前記抗原結合部分とアミノ末端又はカルボキシ末端のペプチド結合を共有するか;又は
    (iv)前記変異体IL-2ポリペプチドが、エフェクター細胞結合部分とアミノ末端又はカルボキシ末端のペプチド結合を共有し、抗原結合部分が、a)前記変異体IL-2ポリペプチド又はb)前記エフェクター細胞結合部分とアミノ末端又はカルボキシ末端のペプチド結合を共有する、
    請求項14に記載のイムノコンジュゲート。
  16. 前記抗原結合部分が抗体又は抗体断片である、請求項11に記載の変異体IL-2ポリペプチド、又は請求項12から15のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  17. 前記抗原結合部分及び/又は前記エフェクター細胞結合部分が、Fab分子及びscFv分子から選択される、請求項11に記載の変異体IL-2ポリペプチド、又は請求項12から16のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  18. 前記抗原結合部分及び/又は前記エフェクター細胞結合部分が、免疫グロブリン分子、特にIgG分子である、請求項11に記載の変異体IL-2ポリペプチド、又は請求項12から17のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  19. 前記抗原結合部分が、腫瘍細胞上又は腫瘍細胞環境内に存在する抗原に向けられている、及び/又は前記エフェクター細胞結合部分が、シス・ターゲティングを達成するために、腫瘍細胞環境内に存在するエフェクター細胞に向けられている、請求項11に記載の変異体IL-2ポリペプチド、又は請求項12から18のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  20. 請求項1から19のいずれか一項に記載の変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートをコードする単離されたポリヌクレオチド。
  21. 請求項20に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  22. 請求項20に記載のポリヌクレオチド又は請求項21に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  23. 請求項22に記載の宿主細胞を、変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの発現に適した条件下で培養することを含む、変異体IL-2ポリペプチド又はそのイムノコンジュゲートを生成する方法。
  24. 請求項23に記載の方法により生成された変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲート。
  25. 請求項1から19のいずれか一項又は24に記載の変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  26. 治療を必要としている個体の疾患の治療における使用のための、請求項1から19のいずれか一項又は24に記載の変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲート。
  27. 前記疾患ががんである、請求項26に記載の変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲート。
  28. 治療を必要とする個体の疾患を治療するための医薬の製造のための、請求項1から19のいずれか一項又は24に記載の変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの使用。
  29. 個体の疾患を治療する方法であって、前記個体に対して、薬学的に許容される形態で請求項1から19のいずれか一項又は24に記載のIL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを含む治療的有効量の組成物を投与することを含む方法。
  30. 前記疾患ががんである、請求項29に記載の方法。
  31. 個体の免疫系を刺激する方法であって、前記個体に対して、薬学的に許容される形態で請求項1から19のいずれか一項又は24に記載の変異体IL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを含む有効量の組成物を投与することを含む方法。
  32. 先に記載されるとおりの発明。
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