CN116635403A - pH依赖性突变型白细胞介素-2多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明总体涉及pH依赖性突变型白细胞介素‑2多肽，其在中性pH下表现出降低的IL‑2受体结合并在降低的pH下保持IL‑2受体结合。此外，本发明涉及包含所述pH依赖性突变型IL‑2多肽的免疫缀合物、编码所述pH依赖性突变型IL‑2多肽或免疫缀合物的多核苷酸分子以及包含此类多核苷酸分子的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于产生所述pH依赖性突变型IL‑2多肽或免疫缀合物的方法；包含所述pH依赖性突变型IL‑2多肽或免疫缀合物的药物组合物；以及其用途。

Description

pH依赖性突变型白细胞介素-2多肽
技术领域
本发明一般涉及pH依赖性突变型白细胞介素-2多肽。更具体地，本发明涉及突变型IL-2多肽，其表现出用作免疫治疗剂的经改善的特性。此外，本发明涉及免疫缀合物SpH依赖性突变型IL-2多肽或免疫缀合物，以及包含此类多核苷酸分子的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于产生所述pH依赖性突变型IL-2多肽或免疫缀合物的方法；包含所述pH依赖性突变型IL-2多肽或免疫缀合物的药物组合物；以及其用途。
背景技术
白细胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)，也称为T细胞生长因子(T cell growthfactor，TCGF)，是在淋巴细胞产生、存活和体内平衡中起着核心作用的15.5kDa球状糖蛋白。它具有133个氨基酸的长度并且由四个反向平行的两亲性α-螺旋组成，所述四个反向平行的两亲性α-螺旋形成其功能必不可少的四元结构(Smith,Science 240,1169-76(1988)；Bazan,Science257,410-413(1992))。来自不同物种的IL-2的序列见于NCBI RefSeq号NP000577(人)、NP032392(小鼠)、NP446288(大鼠)或NP517425(黑猩猩)下。
IL-2通过与IL-2受体(IL-2R)结合来介导其作用，所述IL-2受体由至多三个单独亚基组成，所述至多三个单独亚基的不同缔合可以产生IL-2亲和力不同的受体形式。α(CD25)、β(CD122)和γ(γc，CD132)亚基的缔合产生高亲和力的三聚IL-2受体。由β亚基和γ亚基组成的二聚IL-2受体被称为中等亲和力IL-2R受体。α亚基形成低亲和力的单体IL-2受体。尽管中等亲和力的二聚IL-2受体以比高亲和力的三聚受体低约100倍的亲和力结合IL-2，但是二聚和三聚IL-2受体变体都能够在IL-2结合时传递信号(Minami等人，Annu RevImmunol 11,245-268(1993))。因此，α-亚基CD25对IL-2信号传导不是必需的。α-亚基赋予与其受体的高亲和力结合，而β亚基CD122和γ亚基对信号传导至关重要(Krieg等人，ProcNatl Acad Sci 107,11906-11(2010))。包含CD25的三聚IL-2受体由(静息)CD4+叉头框P3(FoxP3)+调节性T(Treg)细胞表达。它们也在常规活化的T细胞上被瞬时诱导，而在静息状态下，这些细胞仅表达二聚IL-2受体。Treg细胞在体内始终表达最高水平的CD25(Fontenot等人，Nature Immunol 6,1142-51(2005))。
IL-2主要由活化的T细胞合成，特别是由CD4+辅助T细胞合成。它刺激T细胞的增殖和分化、诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte，CTL)的产生和外周血淋巴细胞向细胞毒性细胞和淋巴因子激活杀伤(lymphokine-activated killer，LAK)细胞的分化、促进T细胞的细胞因子和溶细胞分子表达、有助于B细胞的增殖和分化以及B细胞的免疫球蛋白合成，并刺激自然杀伤(natural killer，NK)细胞的产生、增殖和活化(例如在Waldmann,Nat Rev Immunol 6,595-601(2009)；Olejniczak和Kasprzak,Med Sci Monit14,RA179-89(2008)；Malek,Annu Rev Immunol 26,453-79(2008)中所综述)。
其在体内扩增淋巴细胞群并增加这些细胞的效应功能的能力赋予了IL-2抗肿瘤作用，使得IL-2免疫疗法成为用于某些转移性癌症的有吸引力的治疗选择。因此，高剂量IL-2治疗已被批准用于患有转移性肾细胞癌和恶性黑素瘤的患者。
然而，IL-2在免疫应答中具有双重功能，因为它不仅介导效应细胞的扩增和活性，而且还在维持外周免疫耐受中起关键作用。
外周自身耐受的主要机制是IL-2诱导T细胞的活化诱导细胞死亡(activation-induced cell death，AICD)。AICD是一种通过接合细胞表面表达的死亡受体(诸如CD95(也称为Fas))或TNF受体而使完全活化的T细胞经历程序性细胞死亡的过程。当在增殖期间表达高亲和力IL-2受体(在先前暴露于IL-2之后)的抗原活化的T细胞经由T细胞受体(T cellreceptor，TCR)/CD3复合物而被抗原再次刺激时，Fas配体(Fas ligand，FasL)和/或肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)的表达被诱导，使得细胞对Fas介导的凋亡敏感。该过程为IL-2依赖性的(Lenardo,Nature353,858-61(1991))并经由STAT5介导。通过AICD在T淋巴细胞中的过程，不仅可以针对自身抗原建立耐受性，而且还可以针对明显不是宿主构成的组成部分的持久性抗原(诸如肿瘤抗原)建立耐受性。
此外，IL-2还参与维持外周CD4+CD25+调节性T(Treg)细胞(Fontenot等人，NatureImmunol 6,1142-51(2005)；D’Cruz和Klein，Nature Immunol 6,1152-59(2005)；Maloy和Powrie，Nature Immunol 6,1171-72(2005))，所述细胞还被称为抑制性T细胞。它们通过在抑制性T细胞的帮助和活化下进行细胞间接触，或通过释放诸如IL-10或TGF-β之类的免疫抑制性细胞因子，来抑制效应T细胞对它们的(自身的)靶标的破坏。Treg细胞的耗竭显示为增强IL-2诱导的抗肿瘤免疫性(Imai等人，Cancer Sci 98,416-23(2007))。
因此，IL-2对于抑制肿瘤生长不是最佳的，因为在IL-2存在下，产生的CTL可能将肿瘤识别为自身并经历AICD，或者免疫应答可能被IL-2依赖性Treg细胞抑制。
与IL-2免疫疗法有关的另一个问题是因重组人IL-2治疗产生的副作用。接受高剂量IL-2治疗的患者经常经历严重的心血管、肺、肾、肝、胃肠、神经、皮肤、血液和全身不良事件，所述不良事件需要进行密切监测和住院治疗。这些副作用中的大多数可以通过所谓的血管(或毛细血管)渗漏综合征(vascular leak syndrome，VLS)的发展来解释，所述VLS是血管通透性的病理性增大导致多个器官中的流体外渗(导致例如肺和皮肤水肿以及肝细胞损伤)和血管内流体耗尽(导致血压下降和心率补偿性增高)。除了消除IL-2之外，VLS没有别的治疗方法。已经在患者中测试了低剂量IL-2方案来避免VLS，但是代价是次优的治疗结果。VLS被认为是由于从IL-2活化的NK细胞释放诸如肿瘤坏死因子(tumor necrosisfactor，TNF)-α之类的促炎细胞因子而引起的，然而最近已显示IL-2诱导的肺水肿是因IL-2与肺内皮细胞直接结合而引起的，所述肺内皮细胞表达低至中等水平的功能性αβγIL-2受体(Krieg等人，Proc Nat Acad Sci USA 107,11906-11(2010))。
已经采取了几种方法来克服与IL-2免疫疗法相关的这些问题。例如，已发现IL-2与某些抗IL-2单克隆抗体的组合增强IL-2的体内治疗效果(Kamimura等人，J Immunol177,306-14(2006)；Boyman等人，Science311,1924-27(2006))。在另选方法中，IL-2已经以各种方式突变以降低其毒性和/或增强其功效。Hu等人(Blood 101,4853-4861(2003)，美国专利公开号2003/0124678)已经用色氨酸取代IL-2的位置38处的精氨酸残基以消除IL-2的血管通透性活性。Shanafelt等人(Nature Biotechnol 18,1197-1202(2000))已将天冬酰胺88突变为精氨酸以使T细胞的选择性增强超过NK细胞的选择性。Heaton等人(Cancer Res53,2597-602(1993)；美国专利号5,229,109)已经引入两种突变Arg38Ala和Phe42Lys来减少NK细胞的促炎细胞因子分泌。Gillies等人(美国专利公开号2007/0036752)已经取代了IL-2的三个残基(Asp20Thr、Asn88Arg和Gln126Asp)，该三个残基有助于对中等亲和力的IL-2受体的亲和力以减少VLS。Gillies等人(WO 2008/0034473)还已经通过氨基酸取代Arg38Trp和Phe42Lys而使IL-2与CD25的界面突变，以减少与CD25的相互作用和Treg细胞的活化，从而增强功效。为了同样的目的，Wittrup等人(WO 2009/061853)已经产生了IL-2突变体，所述IL-2突变体具有增强的CD25亲和力，但不会使受体活化，因此充当拮抗剂。引入的突变旨在破坏与受体的β亚基和/或γ亚基的相互作用。
在WO 2012/107417中描述了被设计用于克服上述与IL-2免疫疗法相关的问题(由VLS诱导引起的毒性、由AICD诱导引起的肿瘤耐受以及由Treg细胞活化引起的免疫抑制)的特定突变型IL-2多肽。用丙氨酸取代IL-2的42位的苯丙氨酸残基，用丙氨酸取代的45位的酪氨酸残基并且用甘氨酸取代的72位的亮氨酸残基，从而基本上消除了该突变型IL-2多肽与IL-2受体(CD25)的α亚基的结合。
然而，已知的IL-2突变体中无一被证明为可以克服上述与IL-2免疫疗法相关联的所有问题，即由VLS诱导引起的毒性、由AICD诱导引起的肿瘤耐受以及由Treg细胞活化引起的免疫抑制。
此外，对于上述方法，可以通过将IL-2选择性靶向至肿瘤来改善IL-2免疫疗法，例如以包含与肿瘤细胞上表达的抗原结合或与肿瘤环境中的效应细胞结合的抗体的免疫缀合物的形式。已经描述了几种此类免疫缀合物(参见例如Ko等人,J Immunother(2004)27,232-239；Klein等人,Oncoimmunology(2017)6(3),e1277306；WO 2018/184964 A1)。
鉴于PD-1/PD-L1检查点抑制剂的临床成功和前所未有的疗效，仍有重大的医疗需求，即进一步增加预先存在T细胞免疫的患者的反应率和反应持续时间。最近的报道表明，PD-1抗体靶向两个肿瘤特异性CD8 T细胞群：耗尽的TIL和新描述的具有干细胞样特性的TCF1+前体TResource细胞。在这两者中，后者与有利的疾病预后和对于抗PD-1疗法的反应相关。细胞因子，如白细胞介素-2，也被描述为诱导TResource细胞朝向功能性效应T细胞的增殖/分化。
IL-2是第一个用于治疗转移性黑色素瘤和肾细胞癌的有效癌症免疫疗法。不幸的是，高浓度的IL-2通过诱导血管渗漏综合征(VLS)而具有毒性，并且有害地扩增调节性T细胞并因与CD25结合而诱导活化诱导的细胞死亡。为了克服野生型IL2/阿地白介素(Proleukin)的这些限制，已经描述了具有消除CD25结合的IL-2v变体。然而，由于IL-2经由异二聚的中等亲和力IL-2Rbg复合物进行信号传导的机制，IL2v和其他IL2变体在一遇到IL-2R时就会自动活化IL-2R信号传导，并且因此介导血液、脉管系统和淋巴组织中肿瘤外的非特异性和外周免疫细胞活化，从而导致剂量限制性毒性。因此，不可能向患者施用为获得最大治疗益处所需数量的IL-2或IL2v。
已开发PD1-IL2v以克服其中一些限制，其方法是将消除与CD25结合的IL-2变体递送至同一T细胞上顺式表达肿瘤反应性PD-1的T细胞(WO 2018/184964A1)。因此，PD1-IL2v对表达PD-1的T细胞的效力是与对PD-1阴性T细胞的效力相比的10-40倍。在肿瘤中，PD1-IL2v促进全功能性细胞毒性T细胞(称为新鲜和更好的效应T细胞)中的CD8 TResource细胞分化，从而在小鼠胰腺癌模型中产生有效、长期的抗肿瘤免疫反应和引起完全肿瘤根除。
与通过将PD1-IL2v顺式靶向至PD-1+T细胞结合，可以实现PD1-IL2v更强的治疗效果。事实上，将PD1-IL2v顺式靶向至适当的抗原特异性T细胞亚群，连同PD-1/-L1抑制，是一种在治疗上利用内源性免疫的更好方法，并且是已知用于释放针对癌症免疫疗法的内源性免疫的最强免疫调节途径之一。然而，由于IL2v部分可能在外周触发IL-2R信号传导，因此对于PD1-IL2v而言，由于外周非肿瘤特异性IL-2R活化，也不可以施用最大所需剂量。因此，治疗指数被认为仍然很窄，预期的MTD在人类中具有>10-30mg的固定剂量(flat dose)，这可能会限制利用完整途径的潜力。
因此，生成顺式靶向至经历抗原刺激的T细胞但具有更广泛治疗指数的下一代IL-2分子至关重要。
尽管目前针对PD1/PDL1轴的免疫疗法已在多种癌症适应症中显示出前所未有的疗效，但仍有相当一部分患者对治疗无反应或出现复发，而其他肿瘤类型在很大程度上仍难以用这些疗法治疗。因此，在具有某类预先存在的T细胞免疫反应的患者中，相当大的癌症患者群体存在明显的、高度未满足的需求。PD1拮抗作用导致客观反应的适应症的实例为例如晚期或转移性黑色素瘤、Merkel细胞癌、NSCLC、SCLC、RCC、胃癌、肝细胞癌、头颈癌、乳腺癌、卵巢癌、错配修复缺陷与充分的CRC以及血液系统恶性肿瘤，如DLBCL和PMBCL(自体干细胞移植后)和HL(Editiorial:PD-Loma:a cancer entity with a shared sensitivityto the PD-1/PD-L1 pathway blockade,British Journal of Cancer(2019)120:3–5；https://doi.org/10.1038/s41416-018-0294-4)。
PD-1是一种免疫检查点，其在与其配体(PD-L1和PD-L2)结合后，可以减弱TCR下游的信号传导。PD-1在经历过抗原刺激的T细胞上表达，并且在较小程度上在NK细胞和B细胞上表达。其在T细胞表面上的上调遵循强烈和持续的TCR触发，并且在慢性病毒感染和癌症的情况下与T细胞耗竭/功能障碍相关联。因此，PD-1标记那些识别肿瘤相关抗原(TAA)的肿瘤浸润性淋巴细胞TIL(Simon等人,Oncoimmunology,2015年10月29日；5(1):e1104448；Simon等人,Oncoimmunology.2018；7(1):e1364828.)，并因此代表对于癌症免疫疗法而言有吸引力的治疗靶标。
最近有报道称，PD-1不仅如在肿瘤微环境中的终末分化细胞上表达，而且还在新识别的(新)抗原特异性T细胞群(称为干细胞样资源T细胞(resource T cell))(TResource)的表面表达。该细胞亚群由多能祖细胞组成，这些多能祖细胞可以自我更新和补充更多的经历抗原刺激的T细胞的分化亚群(Im SJ等人,Nature,2016年9月15日；537(7620):417-421)。因此，与PD-1相关的耗竭/功能障碍呈现出更复杂的情况，包括肿瘤特异性TIL的效应功能降低加上TResource的自我更新和分化能力降低。有趣的是，据报道，在慢性LCMV感染期间施用IL-2连同PD-1阻断剂可诱导惊人的协同效应(West E.E.等人,J ClinInvest,2013年6月；123(6):2604-15)，这可能是两种分子对病毒特异性效应T细胞和TResource的双重治疗作用的结果。IL-2在淋巴细胞生成、活化、分化、增殖、效应功能、存活和体内平衡中起着重要的多效性作用，并且其主要由活化的T细胞(特别是CD4 T辅助细胞)合成。IL-2与IL-2R结合，后者由3个单独的亚基α(CD25)、β(CD122)和γ(γc；CD132)组成，也称为高亲和力IL-2R(10pM)。二聚体IL-2Rβγ是一种中等亲和力受体，其与IL-2的结合亲和力比与高亲和力受体的结合亲和力低约50-100倍。二聚体IL-2R在NK细胞、记忆和效应记忆T细胞上表达，并以较低水平在静息CD4、CD8 T细胞和单核细胞/巨噬细胞上表达。CD25在常规活化的T细胞和NK细胞上被瞬时诱导，而其在Treg(天然存在)上以高水平组成型表达。作为IL-2作用模式的结果，Treg的诱导以及活化诱导的细胞死亡(AICD)可能会损害抗肿瘤功效。
然而，肿瘤可能能够通过使抗体的靶抗原脱落、突变或下调来逃避这种靶向。此外，在主动排除淋巴细胞的肿瘤微环境中，靶向肿瘤的IL-2可能不会与诸如细胞毒性T淋巴细胞(CTL)之类的效应细胞最佳接触。
实体瘤的生理微环境通常以灌流不良和高代谢率为特征。在肿瘤和肿瘤间质中，葡萄糖分解代谢增加会导致乳酸和H+大量产生(沃伯格效应(Warburg effect))，而与组织氧状态无关。杂乱无章的肿瘤脉管系统会阻止释放到细胞外介质中的这些H+离子的有效清除，但也有利于与进一步向糖酵解代谢转变相关的肿瘤缺氧区域的发展。一个常见的后果是实体瘤中细胞外pH值的酸化，这是一种称为肿瘤酸中毒的标志性病状(Zhang X等人,JNucl Med.,2010Aug；51(8):1167-70.；Corbet等人,Nat Rev Cancer 17,577–593(2017)；Damgaci等人,Immunology.2018年7月；154(3):354-362)。肿瘤细胞和癌症相关的成纤维细胞使肿瘤环境酸化至pH 6.0–6.8左右的pH值，相对于健康组织的pH平均值为pH 7.2–7.4(Viklund J等人,Curr Med Chem.2017；24(26):2827-2845)。肿瘤酸中毒已被证明与癌症病理生物学的许多方面有关，这些方面包括侵袭和转移、遗传不稳定性、非锚定依赖性生长、肿瘤发生、化学抗性和对细胞凋亡的抗性、血管生成和逃避免疫系统(Viklund J等人,Curr Med Chem.2017；24(26):2827-2845；Kolosenko等人,Semin Cancer Biol.2017年4月；43:119-133；Corbet等人,Nat Rev Cancer17,577–593(2017))。
一些外部pH条件性癌症免疫疗法方法支持，可利用肿瘤酸中毒以实现条件性药物活性。其中包括CCT-301-59(一种pH依赖性抗ROR2条件性活性生物制剂–CarT细胞疗法，以及一种pH依赖性CTLA-4检查点抑制剂，均由BioAtla(https://www.bioatla.com/technology/cab/)开发)和递送用于疫苗接种的癌症抗原的pH敏感性脂质体(Yuba等人,Biomaterials.2013Apr；34(12):3042-52)。
肿瘤酸中毒在以下中论述：Corbet,C.,Feron,O.Tumour acidosis:from thepassenger to the driver's seat.Nat Rev Cancer 17,577–593(2017)或Damgaci等人,Immunology.2018年7月；154(3):354-362。
因此，本领域仍然需要进一步增强IL-2蛋白的治疗有用性。
发明内容
本发明部分基于以下认识：(i)肿瘤微环境(TME)表现出与外周中性pH(即中性的全身pH)相比降低的pH水平，和(ii)pH依赖性突变型白细胞介素-2多肽在中性pH下具有降低或消除的全身活性并在酸性pH下在肿瘤微环境中具有完全活性。
因此，在第一个方面，本发明提供一种突变型白细胞介素-2(IL-2)多肽，其包含一个或多个氨基酸取代，各自与野生型IL-2，优选根据SEQ ID NO:144的人IL-2相比，其中一个或多个氨基酸取代在中性pH下消除或降低与IL-2受体、优选与中等亲和力IL-2受体(IL2Rβγ)的结合，并在降低的pH下促进与IL-2受体、优选与中等亲和力IL-2受体(IL2Rβγ)的结合。在一个实施例中，突变型IL-2多肽在pH 7.4和/或pH 7.0下表现出降低或消除的IL-2受体结合、优选中等亲和力IL-2受体结合，并在pH 6和/或pH6.5下保留IL-2受体结合、优选中等亲和力IL-2受体结合。在一个实施例中，所述一个或多个氨基酸取代位于选自与根据SEQ ID NO:144的人IL-2的残基6、8、11、12、13、15、16、19、20、22、23、81、84、87、91、95、120、123、126、130、133对应的位置的组的位置处。在一个实施例中，所述一个或多个氨基酸取代选自下组：S6Y、K8E、Q11E、Q11T、L12D、L12E、L12Q、L12S、L12T、Q13H、Q13R、E15Q、H16D、H16E、H16N、H16Q、L19D、L19Q、D20E、D20Q、Q22D、Q22E、Q22H、M23E、M23N、M23Q、R81D、R81E、R81H、R81N、R81Q、D84E、D84Q、S87D、S87E、S87N、S87Q、V91D、V91E、V91N、E95D、E95Q、R120E、R120H、T123E、T123Q、Q126E、Q126H、S130E、T133D、T133E、T133N、T133Q。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代：(i)L12E、D20E、M23N、R81N、D84E、S87E、R120E、T123E、S130E、T133N；(ii)Q11E、D20Q、M23E、R81D、D84E、S87E、S130E、T133N；(iii)L12E、L19D、R81D、R120E、T123E、S130E、T133E；(iv)R81Q、S87E、V91D、T123E、S130E、T133D；(v)Q11E、L12E、M23Q、R81D、S87E、V91D、S130E、T133Q；(vi)Q11E、L19D、R81D、D84E、S130E、T133D；(vii)R81D、D84Q、S87D、V91N、T123Q、S130E、T133D；(viii)L19D、R81E、D84E、S87Q、R120H、S130E、T133E；(iix)L19D、M23N、R81D、T133E；(ix)Q11E、L12E、M23Q、R81Q、S87D、V91N、E95Q、R120H、T123E、S130E、T133E；(x)L19D、R81E、S130E、T133D；(xi)R81Q、S87E、V91D、R120E、S130E、T133D；(xii)L12Q、L19Q、R81H、V91E、T123E、S130E、T133E；(xiii)K8E、D20E、M23N、R81H、D84Q、S87E、R120H、S130E、T133D；(xiv)L12E、L19Q、R81H、R120E、T133D；(xv)H16E、L19D、Q22E、M23Q、R81D、D84E、S87D、R120H、S130E、T133E；(xvi)Q11E、L12E、H16Q、L19D、Q22E、M23N、R81E、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E(SEQ ID NO:21)；(xvii)Q11E、H16E、L19D、M23E、R81D、S87E、R120H、Q126E、T133D；(xviii)Q11E、L12S、E15Q、H16N、L19D、M23E、R81E、D84E、S87D、R120H、S130E、T133E；(xix)Q11E、H16E、M23E、R81N、D84E、S87E、R120H、Q126E、S130E、T133E；(xx)Q11E、E15Q、H16E、Q22E、M23E、R81H、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D；(xxi)Q11E、L12D、Q13H、E15Q、H16E、Q22E、M23E、R81N、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E；(xxii)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81E、S87E、R120H、S130E、T133E；(xxiii)H16E、L19D、M23Q、R81N、D84E、S87D、R120H、S130E、T133D；(xxiv)Q11E、L12T、E15Q、H16E、L19D、Q22H、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E；(xxv)Q11E、L12T、E15Q、H16E、L19D、Q22H、M23E、R81E、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E；(xxvi)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81E、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E；(xxvii)H16E、Q22E、M23Q、S87N、R120H、S130E、T133E；(xxviii)H16E、L19D、Q22D、M23Q、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E；(xxiix)Q11E、L12E、Q13H、E15Q、H16N、L19D、Q22E、M23Q、R81E、D84E、S87D、E95D、R120H、T133E；(xxix)Q11E、L12T、H16E、L19D、Q22E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D；(xxx)Q11T、L12E、E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E、R120E、S130E、T133D；(xxxi)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E；(xxxii)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81Q、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E；(xxxiii)Q11E、L12S、H16E、L19D、M23Q、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E；(xxxiv)S6Y、L12E、Q13R、H16Q、Q22E、M23Q、R81N、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D；(xxxv)H16D、M23N、R81D、D84E、R120H、S130E、T133E；(xxxvi)Q11E、L12TE、H16Q、L19D、M23E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E；(xxxvii)Q11E、L12E、H16NE、M23N、R81E、D84E、R120H、S130E、T133E；(xxxviii)E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E；(xxxix)Q11E、R120H、S130E、T133D；或(xl)Q11E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D。
在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代Q11E(如在SEQ ID NO:44中)。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代E15Q(如在SEQ ID NO:45中)。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代H16E(如在SEQ ID NO:46中)。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代L19D(如在SEQ ID NO:47中)。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代Q22E(如在SEQ ID NO:48中)。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代M23Q(如在SEQ ID NO:49中)。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代R81D(如在SEQ ID NO:50中)。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代D84E(如在SEQ ID NO:51中)。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代S87E(如在SEQ IDNO:52中)。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代R120H(如在SEQ ID NO:53中)。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代Q126E(如在SEQ ID NO:54中)。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代Q126H(如在SEQ ID NO:55中)。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代S130E(如在SEQ ID NO:56中)。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代T133E(如在SEQ ID NO:57中)。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代T133D(如在SEQ ID NO:58中)。
在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E和S87E(如在SEQ ID NO:59中)。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代Q11E、R120H、S130E和T133D(如在SEQ ID NO:60中)。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代Q11E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E和T133D(如在SEQ ID NO:61中)。
在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含第一氨基酸突变，各自与野生型IL-2多肽相比，该第一氨基酸突变消除或降低突变型IL-2多肽对高亲和力IL-2受体的亲和力并保留突变型IL-2多肽对中等亲和力IL-2受体的亲和力。在一个实施例中，所述第一氨基酸突变位于与人IL-2的残基72对应的位置处。在一个实施例中，所述氨基酸突变是氨基酸取代，选自L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R和L72K的组。在更具体的实施例中，所述第一氨基酸突变是氨基酸取代L72G。在某些实施例中，突变型IL-2多肽包含第二氨基酸突变，各自与野生型IL-2多肽相比，该第二氨基酸突变消除或降低突变型IL-2多肽对高亲和力IL-2受体的亲和力并保留突变型IL-2多肽对中等亲和力IL-2受体的亲和力。在一个实施例中，所述第二氨基酸突变位于选自与人IL-2的残基35、38、42、43和45对应的位置处。在具体实施例中，所述第二氨基酸突变位于与人IL-2的残基42对应的位置处。在更具体的实施例中，所述第二氨基酸突变是氨基酸取代，选自下组：F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R和F42K。在甚至更具体的实施例中，所述第二氨基酸突变是氨基酸取代F42A。在某些实施例中，突变型白细胞介素-2多肽包含第三氨基酸突变，各自与野生型IL-2多肽相比，该第三氨基酸突变消除或降低突变型IL-2多肽对高亲和力IL-2受体的亲和力并保留突变型IL-2多肽对中等亲和力IL-2受体的亲和力。在特定实施例中，突变型白细胞介素-2多肽包含三个氨基酸突变，各自与野生型IL-2多肽相比，该三个氨基酸突变消除或降低突变型IL-2多肽对高亲和力IL-2受体的亲和力并保留突变型IL-2多肽对中等亲和力IL-2受体的亲和力，其中所述三个氨基酸突变位于与人IL-2的残基42、45和72对应的位置处。在一个实施例中，所述三个氨基酸突变是选自以下项的组的氨基酸取代：F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、Y45K、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R，以及L72K。在具体的实施例中，所述三个氨基酸突变是氨基酸取代F42A、Y45A和L72G。在某些实施例中，突变型白细胞介素-2多肽进一步包含氨基酸突变，该氨基酸突变消除在与人IL-2的残基3对应的位置处的IL-2的O-糖基化位点。在一个实施例中，消除在与人IL-2的残基3对应的位置处的IL-2的O-糖基化位点的所述氨基酸突变是选自T3A、T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R、T3K和T3P的组的氨基酸取代。在具体的实施例中，消除在与人IL-2的残基3对应的位置处的IL-2的O-糖基化位点的氨基酸突变是T3A。在某些实施例中，突变型IL-2多肽在与人IL-2的残基125对应的位置处进一步包含氨基酸。在具体的实施例中，与人IL-2的残基125对应的位置处的氨基酸是C125A。在某些实施例中，突变型IL-2多肽基本上是全长IL-2分子，特别是人全长IL-2分子。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含选自组T3A、F42A、Y45A、L72G、C125A的氨基酸取代。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代T3A、F42A、Y45A、L72G和C125A。
在一个实施例中，突变型IL-2多肽与非IL-2部分连接。在一个实施例中，突变型IL-2多肽与第一非IL-2部分和第二非IL-2部分连接。在一个实施例中，突变型IL-2多肽与第一非IL-2部分和第二非IL-2部分连接。在一个实施例中，突变型IL-2多肽与所述第一非IL-2部分共享羧基末端肽键并且与所述第二非IL-2部分共享氨基末端肽键。在某些实施例中，非IL-2部分是靶向部分。在某些实施例中，所述非IL-2部分是抗原结合部分或效应细胞结合部分。在一个实施例中，所述抗原结合部分是抗体。在另一实施例中，所述抗原结合部分或效应细胞结合部分是抗体片段。在更具体的实施例中，所述抗原结合部分、效应细胞结合部分选自Fab分子和scFv分子。在特定实施例中，所述抗原结合部分或效应细胞结合部分是Fab分子。在另一实施例中，所述抗原结合部分或效应细胞结合部分是scFv分子。在一个实施例中，所述抗原结合部分或效应细胞结合部分是免疫球蛋白分子。在更具体的实施例中，所述抗原结合部分或效应细胞结合部分是IgG类、特别是IgG1亚类免疫球蛋白分子。在某些实施例中，所述抗原结合部分针对在肿瘤细胞上存在或在肿瘤细胞环境中存在的抗原，特别是选自下组的抗原：成纤维细胞活化蛋白(FAP)、腱生蛋白-C的A1结构域(TNC A1)、腱生蛋白-C的A2结构域(TNC A2)、纤连蛋白的外结构域B(EDB)、癌胚抗原(CEA)和黑色素瘤相关的硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)。在某些实施例中，所述效应细胞结合部分针对肿瘤细胞环境中存在的效应细胞以实现顺式靶向，特别是选自下组的靶标：CD8、PD-1、LAG3、TIM3、TIGIT、CD28、4-1BB、OX40、GITR、ICOS、CXCR3、CXCR5。
在另一方面，本发明提供一种免疫缀合物，其包含如本文所述的突变型IL-2多肽以及抗原结合部分和/或效应细胞结合部分。在根据本发明的免疫缀合物的一个实施例中，突变型IL-2多肽与所述抗原结合部分或所述效应细胞结合部分共享氨基末端肽键或羧基末端肽键。在特定实施例中，免疫缀合物包含第一抗原结合部分和第二抗原结合部分或第一效应细胞抗原结合部分和第二效应细胞抗原结合部分或抗原结合部分和效应细胞结合部分。在一个此类实施例中，根据本发明的免疫缀合物中所包含的突变型IL-2多肽与所述第一抗原结合部分共享氨基末端肽键或羧基末端肽键，并且所述第二抗原结合部分与a)所述突变型IL-2多肽或b)所述第一抗原结合部分共享氨基末端肽键或羧基末端肽键。在另一实施例中，根据本发明的免疫缀合物中所包含的突变型IL-2多肽与所述第一效应细胞结合部分共享氨基末端肽键或羧基末端肽键，并且所述第二效应细胞结合部分与a)所述突变型IL-2多肽或b)所述第一效应细胞结合部分共享氨基末端肽键或羧基末端肽键。在另一实施例中，根据本发明的免疫缀合物中所包含的突变型IL-2多肽与抗原结合部分共享氨基末端肽键或羧基末端肽键，并且效应细胞结合部分与a)所述突变型IL-2多肽或b)所述抗原结合部分共享氨基末端肽键或羧基末端肽键。在另一实施例中，根据本发明的免疫缀合物中所包含的突变型IL-2多肽与效应细胞结合部分共享氨基末端肽键或羧基末端肽键，并且抗原结合部分与a)所述突变型IL-2多肽或b)所述效应细胞结合部分共享氨基末端肽键或羧基末端肽键。
在一个实施例中，根据本发明的免疫缀合物中所包含的抗原结合部分和/或效应细胞结合部分是抗体。在另一实施例中，所述抗原结合部分和/或效应细胞结合部分是抗体片段。在具体的实施例中，所述抗原结合部分和/或效应细胞结合部分选自Fab分子和scFv分子。在特定实施例中，所述抗原结合部分和/或效应细胞结合部分是Fab分子。在另一特定实施例中，所述抗原结合部分和/或效应细胞结合部分是免疫球蛋白分子。在更具体的实施例中，所述抗原结合部分和/或效应细胞结合部分是IgG类、特别是IgG1亚类免疫球蛋白分子。在某些实施例中，所述抗原结合部分针对在肿瘤细胞上存在或在肿瘤细胞环境中存在的抗原，特别是选自下组的抗原：成纤维细胞活化蛋白(FAP)、腱生蛋白-C的A1结构域(TNCA1)、腱生蛋白-C的A2结构域(TNC A2)、纤连蛋白的外结构域B(EDB)、癌胚抗原(CEA)和黑色素瘤相关的硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)。在某些实施例中，效应细胞结合部分针对肿瘤细胞环境中存在的效应细胞以实现顺式靶向，特别是选自下组的靶标：CD8、PD-1、LAG3、TIM3、TIGIT、CD28、4-1BB、OX40、GITR、ICOS、CXCR3、CXCR5。
本发明进一步提供编码如本文所述的突变型IL-2多肽或免疫缀合物的分离的多核苷酸、包含所述多核苷酸的表达载体以及包含多核苷酸或表达载体的宿主细胞。
还提供一种产生如本文所述的突变型IL-2多肽或免疫缀合物的方法、包含如本文所述的突变型IL-2多肽或免疫缀合物和药用载体的药物组合物、以及使用如本文所述的突变型IL-2多肽或免疫缀合物的方法。
特别地，本发明涵盖如本文所述的突变型IL-2多肽或免疫缀合物，其用于治疗有此需要的个体的疾病。在特定实施例中，所述疾病是癌症。在特定实施例中，个体是人。
本发明还涵盖如本文所述的突变型IL-2多肽或免疫缀合物的用途，其用于制造供治疗有此需要的个体的疾病的药物。
进一步提供一种治疗个体的疾病的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的组合物，该组合物包含如本文所述的突变型IL-2多肽或免疫缀合物。所述疾病优选是癌症。
还提供一种刺激个体的免疫系统的方法，其包括向所述个体施用有效量的组合物，该组合物包含药用形式的本文所述的突变型IL-2多肽或免疫缀合物。
附图说明
图1.包含IL2Rβ和γ(IL2Rβγ)亚基胞外结构域(ECD)的构建体的示意图。
图2.通过ELISA分析IL2v在pH 6和pH 7.4下与受体IL2Rβγ的结合。将含有IL2v的细菌上清液与先前包被的IL2Rβγ一起孵育。在通过抗Flag/HRP二抗检测之前，在pH 6或pH7.4下进行30分钟的大量洗涤。
图3.通过ELISA针对在pH 6和pH 7.4下第一组选定的pH依赖性IL2v变体与IL2Rβγ的结合分析。将含有克隆pH依赖性IL2v变体的细菌上清液与先前包被的IL2Rβγ一起孵育。在通过抗Flag/HRP二抗检测之前，在pH 6或pH 7.4下进行30分钟的大量洗涤。将pH 6下的吸收归一化为值1，并比较吸收水平的比率。
图4.通过ELISA针对在pH 6、pH 6.5、pH 7和pH 7.4下第二组选定的pH依赖性IL2v变体与IL2Rβγ的结合分析。将含有克隆pH依赖性IL2v变体的细菌上清液与先前包被的IL2Rβγ一起孵育。在通过抗Flag/HRP二抗检测之前，在pH 6或pH 7.4下进行30分钟的大量洗涤。将pH 6下的吸收归一化为值1，并比较吸收水平的比率。
图5A-U.通过SPR在pH 6和pH 7.4下选定的pH依赖性IL2v变体与IL2Rβγ的结合分析。图5A中提供了例示性结合分析。如图5B、图5C、图5D、图5E、图5F、图5G、图5H、图5I、图5J、图5K、图5L、图5M、图5N、图5O、图5P、图5Q、图5R、图5S、图5T和图5U中所指示的选定的克隆在与如图5A中所示相同的条件下进行分析。
图6A-B.在正常pH(图6A)或低pH(图6B)下，人NK细胞中通过抗CD8-IL2v(pH)构建体进行的浓度依赖性pSTAT5诱导
图7.在正常和低pH下，在人NK细胞中通过抗CD8-IL2v(pH)构建体进行的pSTAT5活化(AUC)的比较
图8.具有与空Fc杵链的C末端融合的IL2v或其pH依赖性变体的单臂CD8靶向IgGPG LALA。
图9A-D.通过抗CD8-IL2v(pH)构建体对CD8+T细胞在pH 6.5下(图9A)、NK细胞在pH6.5下(图9B)、CD8+T细胞在pH 7.4下(图9C)和NK细胞在pH 7.4下(图9D)的增殖诱导。
图10A-F.在体外孵育5天的期间，测定CD8+T细胞(图10A)或NK细胞(图10B)在pH6.5和pH7.5下的pH依赖性增殖，以及通过抗CD8-IL2v(pH)构建体介导的CD69表达(分别为图10C和图10D)和CD25表达(分别是图10E和图10F)对这些细胞的活化。
图11.基于免疫细胞活化和增殖的曲线下面积(AUC)值对抗CD8-IL2v(pH)构建体在pH6.5至pH7.4下的活性比率的测定。
图12.具有与Fc杵链的C末端融合的IL2v或其pH依赖性变体的二价PD1靶向IgG PGLALA。
图13A-D.体外测定通过抗PD1-IL2v(pH)构建体诱导的对在pH6.5、pH6.8和pH7.4下通过CD25表达(图13A和图13B)和CD69表达(图13C和图13D)进行的经aCD3刺激的CD4+T细胞活化和CD8+T细胞活化的增强。
图14：具有与Fc杵链的C末端融合的wt IL2或其pH依赖性变体的非靶向Fc PGLALA融合物。
图15A-F.在孵育5天后在体外，在pH6.5与pH 7.4下，如由CD69确定的人CD8+T细胞(图15A、图15B和图15C)和NK细胞(图15D、图15E和图15F)的活化和通过IL2wt(pH)构建体诱导的增殖。
具体实施方式
定义
除非在下文中另外定义，否则本文使用的术语通常如本领域中所使用的。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“白细胞介素-2”或“IL-2”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然IL-2，所述脊椎动物来源包括诸如灵长类动物(例如人)之类的哺乳动物，以及啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括未加工的IL-2以及通过细胞中加工产生的任何形式的IL-2。该术语还涵盖天然存在的IL-2变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性人IL-2的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:144中。
如本文所用的术语“IL-2突变体”或“突变型IL-2多肽”旨在涵盖各种形式的IL-2分子的任何突变形式，包括全长IL-2、截短形式的IL-2，以及IL-2与另一分子诸如通过融合或化学缀合连接的形式。当关于IL-2使用时，“全长”旨在表示成熟的天然长度IL-2分子。例如，全长人IL-2是指具有133个氨基酸的分子(参见例如SEQ ID NO:144)。各种形式的IL-2突变体表征为具有至少一种影响IL-2与CD25相互作用的氨基酸突变。该突变可涉及对通常位于该位置的野生型氨基酸残基的取代、缺失、截短或修饰。通过氨基酸取代获得的突变体是优选的。除非另外指明，否则IL-2突变体在本文中可称为IL-2突变肽序列、IL-2突变多肽、IL-2突变蛋白质或IL-2突变类似物。
本文中关于SEQ ID NO:144所示的序列进行了对各种形式的IL-2的命名。本文可使用各种名称来指示相同的突变。例如，42位从苯丙氨酸到丙氨酸的突变可以表示为42A、A42、A42、F42A或Phe42Ala。
如本文所用的术语“氨基酸突变”表示涵盖氨基酸取代、缺失、插入和修饰。可以进行取代、缺失、插入和修饰的任何组合以获得最终构建体，前提条件是所述最终构建体具有所需特征，例如减少的与CD25的结合。氨基酸序列缺失和插入包括氨基酸的氨基末端和/或羧基末端缺失和插入。末端缺失的实例是全长人IL-2的位置1中的丙氨酸残基的缺失。优选的氨基酸突变是氨基酸取代。出于改变例如IL-2多肽的结合特征的目的，非保守氨基酸取代，即用具有不同结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代一种氨基酸，是特别优选的。优选的氨基酸取代包括用亲水性氨基酸取代疏水性氨基酸。氨基酸取代包括用非天然存在的氨基酸或用二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟基脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟基赖氨酸)进行替代。可以使用本领域熟知的遗传或化学方法来产生氨基酸突变。遗传方法可包括定点诱变、PCR、基因合成等。设想通过除基因工程之外的方法(诸如化学修饰)改变氨基酸侧链基团的方法也是有用的。
如本文所用，“野生型”形式的IL-2是IL-2的一种形式，所述野生型形式与突变型IL-2多肽在其他方面相同，不同之处在于野生型形式在突变型IL-2多肽的每个氨基酸位置处具有野生型氨基酸。例如，如果IL-2突变体是全长IL-2(即IL-2未与任何其他分子融合或缀合)，则该突变体的野生型形式是全长天然IL-2。如果IL-2突变体是IL-2与IL-2下游编码的另一种多肽(例如抗体链)之间的融合体，则该IL-2突变体的野生型形式是与相同的下游多肽融合的、具有野生型氨基酸序列的IL-2。此外，如果IL-2突变体是IL-2的截短形式(IL-2的非截短部分内的突变或修饰的序列)，则该IL-2突变体的野生型形式是具有野生型序列的类似截短的IL-2。出于比较各种形式的IL-2突变体与相应的野生型形式的IL-2的IL-2受体结合亲和力或生物活性的目的，术语野生型涵盖这样形式的IL-2，所述形式包含与天然存在的天然IL-2相比不影响IL-2受体结合的一个或多个氨基酸突变，例如将对应于人IL-2的残基125的位置处用半胱氨酸取代丙氨酸。在一些实施例中，用于本发明目的的野生型IL-2包含氨基酸取代C125A。在根据本发明的某些实施例中，与突变型IL-2多肽相比较的野生型IL-2多肽包含如SEQ ID NO:144所示的氨基酸序列。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“CD25”或“IL-2受体的α亚基”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD25，所述脊椎动物来源包括诸如灵长类动物(例如人)之类的哺乳动物，以及啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括“全长”的未加工CD25，以及通过细胞中加工产生的任何形式的CD25。该术语还涵盖天然存在的CD25变体，例如剪接变体或等位基因变体。在某些实施例中，CD25是人CD25。
如本文所用的术语“高亲和力IL-2受体”是指异源三聚形式的IL-2受体，其由受体γ亚基(也称为共同细胞因子受体γ亚基、γc或CD132)、受体β亚基(也称为CD122或p70)和受体α亚基(也称为CD25或p55)组成。相比之下，术语“中间亲和力IL-2受体”是指仅包含γ亚基和β亚基，而不含α亚基的IL-2受体(综述请参见例如Olejniczak和Kasprzak，Med SciMonit 14,RA179-189(2008))。
“亲和力”是指分子(例如，受体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，配体)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如，受体与配体)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)表示，所述解离常数是解离速率常数与缔合速率常数(分别为koff和kon)的比率。因此，等效亲和力可以包括不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同即可。亲和力可以通过本领域中已知的完善确立的方法(包括本文所述的那些方法)来测量。
突变型或野生型IL-2多肽对各种形式的IL-2受体的亲和力可以根据实例中阐述的方法，通过表面等离子体共振(SPR)，使用诸如BIAcore仪器(GE Healthcare)的标准仪器和诸如可通过重组表达获得的受体亚基来测定(参见例如Shanafelt等人,NatureBiotechnol 18,1197-1202(2000))。或者，可以使用已知表达一种或另一种该形式的受体的细胞系来评估IL-2突变体对不同形式的IL-2受体的结合亲和力。下文将描述用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施例。
“调节性T细胞”或“Treg细胞”是指能够抑制其他T细胞的应答的特殊类型的CD4+T细胞。Treg细胞表征为表达IL-2受体(CD25)的α亚基和转录因子叉头框P3(FOXP3)(Sakaguchi,Annu Rev Immunol 22,531-62(2004))，并且在诱导和维持对抗原(包括由肿瘤表达的抗原)的外周自身耐受性中起关键作用。Treg细胞需要IL-2来实现其功能和发展及诱导其抑制特征。
如本文所用，术语“效应细胞”是指介导IL-2的细胞毒性效应的淋巴细胞群体。效应细胞包括效应T细胞，诸如CD8+细胞毒性T细胞、NK细胞、淋巴因子激活杀伤(LAK)细胞和巨噬细胞/单核细胞。
如本文所用，术语“抗原结合部分”是指特异性地结合抗原决定簇的多肽分子。在一个实施例中，抗原结合部分能够将其所附接的实体(例如细胞因子或第二抗原结合部分)引导至靶位点，例如引导至带有抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞或肿瘤基质。抗原结合部分包括如本文进一步定义的抗体及其片段。优选的抗原结合部分包括抗体的抗原结合结构域，其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。在某些实施例中，抗原结合部分可包括如本文进一步定义且在本领域中已知的抗体恒定区。可用的重链恒定区包括以下五种同种型中的任一种：α、δ、ε、γ或μ。可用的轻链恒定区包括以下两种同种型中的任一种：κ和λ。
“特异性结合”意指结合对于抗原具有选择性，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合部分与特定抗原决定簇结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术(例如表面等离子体共振技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等人,Glyco J 17,323-329(2000)))以及传统的结合测定法(Heeley,Endocr Res28,217-229(2002))来测量。
如本文所用，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义，并且是指多肽大分子上的位点(例如一段连续的氨基酸或由非连续氨基酸的不同区域组成的构象构型)，抗原结合部分与该位点结合，从而形成抗原结合部分-抗原复合物。有用的抗原决定簇可以在例如肿瘤细胞的表面上、病毒感染细胞的表面上、其他患病细胞的表面上、血清中的游离物和/或细胞外基质(ECM)中找到。
如本文所用，术语“多肽”是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指具有两个或更多个氨基酸的任何链，而不是指产物的特定长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指代具有两个或更多个氨基酸的链的任何其他术语包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任何一者使用，或与这些术语中的任何一者可互换地使用。术语“多肽”还旨在指代多肽的表达后修饰产物，所述表达后修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、用已知保护/阻断基团衍生化、蛋白水解切割，或用非天然存在的氨基酸进行修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，而不一定从指定的核酸序列翻译而来。它可以以任何方式生成，包括通过化学合成。本发明的多肽的大小可以为约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个，或2,000个或更多个氨基酸。多肽可以具有确定的三维结构，但它们不一定具有这种结构。具有确定的三维结构的多肽被称为折叠的；并且不具有确定的三维结构，而是可以采用大量不同构象的多肽则被称为未折叠的。
“分离的”多肽或变体或其衍生物意指不是处于其天然环境中的多肽。不需要特定的纯化水平。例如，可以从多肽的天然或自然环境中移出分离的多肽。在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白被认为是出于本发明的目的而分离的，已经通过任何合适的技术分离、分级或部分或实质上纯化的天然或重组多肽也被认为是出于本发明的目的而分离的。
相对于参考多肽序列的“氨基酸序列相同的百分比(％)”被定义为在比对候选序列与参考多肽序列并且引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列相同的百分比之后，并且在不考虑将任何保守取代作为序列相同的组成部分的情况下，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成氨基酸序列同一性％的值。ALIGN-2序列比较计算机程序由基因泰克公司(Genentech,Inc.)编写，并且源代码已经与用户文档一起提交到U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559，在那里以美国版权登记号TXU510087注册。ALIGN-2程序可从基因泰克公司(Genentech,Inc.,South San Francisco,California)公开获得，或者可以从该源代码编译。ALIGN-2程序应经编译以在UNIX操作系统上使用，该UNIX操作系统包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置并且不变。在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(其可以另选地表达为给定氨基酸序列A具有或包含与给定氨基酸序列B的某一氨基酸序列同一性％)计算如下：
100乘以分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序对A和B的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，而其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的氨基酸序列同一性％将不等于B与A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别指明，否则本文所使用的所有氨基酸序列同一性％的值是如前一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。
术语“多核苷酸”是指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)、病毒来源的RNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，诸如在肽核酸(PNA)中存在的)。术语“核酸分子”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸区段，例如DNA或RNA片段。
“分离的”核酸分子或多核苷酸意指已从其天然环境中取出的核酸分子、DNA或RNA。例如，编码包含在载体中的治疗性多肽的重组多核苷酸出于本发明的目的被视为分离的。分离的多核苷酸的另外的实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或处于溶液中的纯化的(部分地或实质上纯化的)多核苷酸。分离的多核苷酸包括多核苷酸分子，该多核苷酸分子包含在通常包含多核苷酸分子的细胞中，但该多核苷酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置上。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录物，以及正链和负链形式及双链形式。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括通过合成产生的此类分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可包括调控元件，诸如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
关于与本发明的参考核苷酸序列具有至少例如95％“一致”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，是指除了多核苷酸序列可包括参考核苷酸序列的每100个核苷酸至多五个点突变之外，多核苷酸的核苷酸序列与参考序列是一致的。换句话讲，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中至多5％的核苷酸可缺失或被另外的核苷酸取代，或参考序列中总核苷酸的至多5％的数量的核苷酸可插入到参考序列中。参考序列的这些改变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置或那些末端位置之间的任意位置，或单独地散布在参考序列的残基之中，或以一个或多个连续的组散布在参考序列内。作为一种实际情况，可以使用已知的计算机程序，诸如上文针对多肽所讨论的程序(例如ALIGN-2)，常规确定任何特定多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
术语“表达盒”是指通过重组或合成生成的多核苷酸，其具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列特定核酸元件。重组表达盒可以掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。典型地，表达载体的重组表达盒部分除其他序列之外还包括待转录的核酸序列和启动子。在某些实施例中，本发明的表达盒包含编码本发明的突变型IL-2多肽或免疫缀合物或其片段的多核苷酸序列。
术语“载体”或“表达载体”与“表达构建体”同义并且是指用于将特定基因引入与其可操作地关联的靶细胞中并指导该基因的表达的DNA分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及并入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体允许大量稳定mRNA的转录。一旦表达载体处于靶细胞内部，即通过细胞转录和/或翻译机制产生由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白。在一个实施例中，本发明的表达载体包含表达盒，该表达盒包含编码本发明的突变型IL-2多肽或免疫缀合物或其片段的多核苷酸序列。
术语“人工”是指合成的或非宿主细胞衍生的组合物，例如化学合成的寡核苷酸。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸已被引入其中的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于该原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
术语“全长抗体”、“完整抗体”及“全抗体”在本文中可互换地用于指代具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，该分子包含完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、双体抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如，scFv)以及由抗体片段形成的多特异性抗体。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun，载于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag,New York，第269至第315页(1994)；还可参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。对于包含挽救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab片段和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见例如EP404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)；以及Hollinger等人，Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)。在Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)中也描述了三体抗体和四体抗体。抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。
术语“免疫球蛋白分子”是指具有天然存在的抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由通过二硫键键合的两条轻链和两条重链组成。从N末端到C末端，每条重链具有可变区(VH)(也称为可变重链结构域或重链可变结构域)，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)(也称为重链恒定区)。类似地，从N末端到C末端，每条轻链具有可变区(VL)(也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域)，接着是一个恒定轻链(CL)结构域(也称为轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可配属为以下五种类别中的一种：称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，它们中的一些可进一步分为亚类，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而被配属为以下两种类型中的一种：称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)。免疫球蛋白实质上由通过免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和一个Fc结构域组成。
术语“抗原结合结构域”是指抗体的一部分，该部分包含与抗原的部分或全部特异性结合并互补的区域。抗原结合结构域可以由例如一个或多个抗体可变结构域(也称为抗体可变区)提供。优选地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如，Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指在序列上高变及/或形成结构上限定的环(“高变环”)的抗体可变结构域区域中的任一个。通常，天然四链抗体包含六个HVR：三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自互补决定区(CDR)的氨基酸残基，来自互补决定区的氨基酸残基具有最高的序列可变性和/或参与抗原识别。除VH中的CDR1外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(HVR)也称为“互补决定区”(CDR)，并且这些术语在本文中可互换地用于指形成抗原结合区的可变区部分。该特定区域已由Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services,Sequences ofProteins of Immunological Interest(1983)以及Chothia等人，J Mol Biol 196:901-917(1987)描述，其中所述定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，使用这两者中的任一定义来指代抗体的CDR或其变体应在如本文所定义和使用的术语的范围内。作为比较，在下表1中列出了包含如上文引用的参考文献中的每一者所定义的CDR的相应氨基酸残基。包含特定CDR的确切残基数将根据CDR的序列和大小而变化。在给定抗体的可变区氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可以常规地确定哪些残基包含特定CDR。
表1.CDR定义1
CDR Kabat Chothia AbM2
VH CDR1 31-35 26-32 26-35
VH CDR2 50-65 52-58 50-58
VH CDR3 95-102 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32 24-34
VL CDR2 50-56 50-52 50-56
VL CDR3 89-97 91-96 89-97
1表1中所有CDR定义的编号是根据Kabat等人提出的编号惯例(参见下文)。
2如表1中所用的具有小写字母“b”的“AbM”是指由Oxford Molecular的“AbM”抗体建模软件定义的CDR。
Kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员可以明确地将该“Kabat编号”系统分配给任何可变区序列，而不依赖于序列本身之外的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”是指由Kabat等人，U.S.Dept.of Health andHuman Services,"Sequence of Proteins of Immunological Interest"(1983)该的编号系统。除非另有说明，否则提及抗体可变区中特定氨基酸残基位置的编号是根据Kabat编号系统。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些抗体中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，该C末端区包含恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管IgG重链Fc区的边界可能略有不同，但是人IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226或从Pro230延伸至该重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。
“促进异二聚化的修饰”是对多肽(例如免疫球蛋白重链)的肽骨架或翻译后修饰的操控，其减少或阻止多肽与相同的多肽缔合以形成同二聚体。如本文所用的促进异二聚化的修饰特别包括对形成二聚体所需的两个多肽中的每一个进行的单独修饰，其中修饰彼此互补以便促进两个多肽的缔合。例如，促进异二聚化的修饰可以改变形成二聚体所需的多肽中的一者或两者的结构或电荷，以便分别使它们的缔合在空间上或静电上有利。异二聚化发生在两条不相同的多肽之间，诸如两条免疫球蛋白重链，其中与这些重链(例如IL-2多肽)中的每个融合的其他免疫缀合物组分不相同。在本发明的免疫缀合物中，促进异二聚化的修饰位于免疫球蛋白分子的重链中，特别是位于Fc结构域中。在一些实施例中，促进异二聚化的修饰包含氨基酸突变，特别是氨基酸取代。在特定实施例中，促进异二聚化的修饰包含两条免疫球蛋白重链中的每一个中的单独氨基酸突变，特别是氨基酸取代。
当关于抗体使用时，术语“效应功能”是指可归因于抗体的Fc区的那些生物学活性，这些生物学活性随抗体同种型而变化。抗体效应功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调以及B细胞活化。
“活化性Fc受体”是如下Fc受体，其在抗体的Fc区接合后，引起刺激携带受体的细胞执行效应功能的信号传导事件。活化性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。
如本文所用，术语“工程化、工程化的、工程改造”被认为包括对肽骨架的任何操纵，或对天然存在的或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程改造包括对氨基酸序列、糖基化模式或单独氨基酸的侧链基团的修饰，以及这些方法的组合。
如本文所用，术语“免疫缀合物”是指包括至少一个IL-2部分和至少一个抗原结合部分的多肽分子。在某些实施例中，免疫缀合物包含至少一个IL-2部分和至少两个抗原结合部分。根据本发明的特定免疫缀合物基本上由通过一个或多个接头序列接合的一个IL-2部分和两个抗原结合部分组成。抗原结合部分可以通过各种相互作用和以如本文所述的各种构型与IL-2部分接合。
如本文所用，术语“对照抗原结合部分”是指在其存在时不含其他抗原结合部分和效应部分的抗原结合部分。例如，当将本发明的Fab-IL2-Fab免疫缀合物与对照抗原结合部分进行比较时，对照抗原结合部分是游离Fab，其中Fab-IL2-Fab免疫缀合物和游离Fab分子都可以特异性结合于相同的抗原决定簇。
如本文所用，关于抗原结合部分等的术语“第一”和“第二”在部分的每种类型多于一种时用于方便区分。除非明确说明，否则这些术语的使用并非旨在赋予免疫缀合物特定次序或取向。
药剂的“有效量”是指在其所施用的细胞或组织中产生生理学变化所需的量。
药剂(例如药物组合物)的“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段下有效实现所需治疗或预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、减少、延迟、最小化或预防疾病的不良影响。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。优选地，个体或受试者是人。
术语“药物组合物”是指一种制备物，该制备物的形式使得包含在其中的活性成分的生物活性有效，并且该制备物不含对将施用该组合物的受试者具有不可接受的毒性的附加组分。
“药用载体”是指药物组合物中除活性成分外的对受试者无毒的成分。药用载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂，或防腐剂。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变体，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的疾病的自然病程，并且可以执行以用于预防或在临床病理学过程中执行的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
如本文所用，“pH依赖性”是指分子，特别是IL-2变体的特性，其依赖于环境的pH，例如在第一pH范围或pH值下促进受体结合，但在第二pH范围或pH值下不以相同质量促进，其中第一和第二pH范围不重叠或第一和第二pH值不相同。
如本文所用，“pH依赖性IL-2受体结合”是指分子，特别是IL-2变体的结合特性，其中所述分子以pH依赖性方式结合于IL-2受体、特定IL-2受体亚基或IL-2受体亚基组合。所述“pH依赖性IL-2受体结合”涉及但不限于以下情况，其中pH依赖性IL-2与IL-2受体、IL-2受体亚基或IL-2受体亚基组合在弱酸性pH下，例如在pH 6.0和/或pH 6.5下结合，并显示在全身pH下，例如在pH 7.0和/或pH 7.4下受体结合减少或消除。
具体实施方式
本发明旨在提供一种具有改进的免疫疗法特性的突变型IL-2多肽。特别地，本发明旨在消除导致毒性但对IL-2的功效不是必需的IL-2的药理学特性。如上所述，不同形式的IL-2受体由不同的亚基组成，并且表现出不同的IL-2亲和力。由β和γ受体亚基组成的中等亲和力IL-2受体在静息效应细胞上表达，并且足以用于IL-2信号传导。另外包含该受体的α亚基的高亲和力IL-2受体，主要在调节性T(Treg)细胞上以及活化的效应细胞上表达，其中该受体与IL-2的接合可分别促进Treg细胞介导的免疫抑制或活化诱导的细胞死亡(AICD)。因此，不受理论的束缚，降低或消除IL-2对该IL-2受体的α亚基的亲和力应当减少IL-2诱导的调节性T细胞对效应细胞功能的下调和通过AICD过程实现的肿瘤耐受性的发展。在另一方面，保持对中等亲和力IL-2受体的亲和力应该保持IL-2对如NK和T细胞等效应细胞的增殖和活化的诱导。
本领域中已经存在几种IL-2突变体，然而，发明人已发现特别适合赋予IL-2用于免疫疗法所需特征的IL-2多肽及其组合的新颖氨基酸突变。
此外，本发明旨在提供在中性pH下具有降低或消除的全身活性并且在酸性pH下在肿瘤微环境中具有完全活性的pH依赖性IL-2多肽。
在第一个方面，本发明提供一种突变型白细胞介素-2(IL-2)多肽，其包含一个或多个氨基酸取代，各自与野生型IL-2，优选根据SEQ ID NO:144的人IL-2相比，其中一个或多个氨基酸取代在中性pH下消除或降低与IL-2受体、优选与中等亲和力IL-2受体(IL2Rβγ)的结合，并在降低的pH下促进与IL-2受体、优选与中等亲和力IL-2受体(IL2Rβγ)的结合。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含一个或多个氨基酸取代，各自与根据SEQ ID NO:144的人IL-2相比，其中一个或多个氨基酸取代在中性pH下消除或降低与中等亲和力IL-2受体(IL2Rβγ)的结合，并在降低的pH下促进与中等亲和力IL-2受体(IL2Rβγ)的结合。
在一个实施例中，突变型IL-2多肽在pH 7.4和/或pH 7.0下表现出降低或消除的IL-2受体结合、优选中等亲和力IL-2受体结合，并在pH 6和/或pH 6.5下保留IL-2受体结合、优选中等亲和力IL-2受体结合。在一个实施例中，所述一个或多个氨基酸取代位于选自与根据SEQ ID NO:144的人IL-2的残基6、8、11、12、13、15、16、19、20、22、23、81、84、87、91、95、120、123、126、130、133对应的位置的组的位置处。在一个实施例中，所述一个或多个氨基酸取代选自下组：S6Y、K8E、Q11E、Q11T、L12D、L12E、L12Q、L12S、L12T、Q13H、Q13R、E15Q、H16D、H16E、H16N、H16Q、L19D、L19Q、D20E、D20Q、Q22D、Q22E、Q22H、M23E、M23N、M23Q、R81D、R81E、R81H、R81N、R81Q、D84E、D84Q、S87D、S87E、S87N、S87Q、V91D、V91E、V91N、E95D、E95Q、R120E、R120H、T123E、T123Q、Q126E、Q126H、S130E、T133D、T133E、T133N、T133Q。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代(i)L12E、D20E、M23N、R81N、D84E、S87E、R120E、T123E、S130E、T133N；(ii)Q11E、D20Q、M23E、R81D、D84E、S87E、S130E、T133N；(iii)L12E、L19D、R81D、R120E、T123E、S130E、T133E；(iv)R81Q、S87E、V91D、T123E、S130E、T133D；(v)Q11E、L12E、M23Q、R81D、S87E、V91D、S130E、T133Q；(vi)Q11E、L19D、R81D、D84E、S130E、T133D；(vii)R81D、D84Q、S87D、V91N、T123Q、S130E、T133D；(viii)L19D、R81E、D84E、S87Q、R120H、S130E、T133E；(iix)L19D、M23N、R81D、T133E；(ix)Q11E、L12E、M23Q、R81Q、S87D、V91N、E95Q、R120H、T123E、S130E、T133E；(x)L19D、R81E、S130E、T133D；(xi)R81Q、S87E、V91D、R120E、S130E、T133D；(xii)L12Q、L19Q、R81H、V91E、T123E、S130E、T133E；(xiii)K8E、D20E、M23N、R81H、D84Q、S87E、R120H、S130E、T133D；(xiv)L12E、L19Q、R81H、R120E、T133D；(xv)H16E、L19D、Q22E、M23Q、R81D、D84E、S87D、R120H、S130E、T133E；(xvi)Q11E、L12E、H16Q、L19D、Q22E、M23N、R81E、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E；(xvii)Q11E、H16E、L19D、M23E、R81D、S87E、R120H、Q126E、T133D；(xviii)Q11E、L12S、E15Q、H16N、L19D、M23E、R81E、D84E、S87D、R120H、S130E、T133E；(xix)Q11E、H16E、M23E、R81N、D84E、S87E、R120H、Q126E、S130E、T133E；(xx)Q11E、E15Q、H16E、Q22E、M23E、R81H、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D；(xxi)Q11E、L12D、Q13H、E15Q、H16E、Q22E、M23E、R81N、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E；(xxii)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81E、S87E、R120H、S130E、T133E；(xxiii)H16E、L19D、M23Q、R81N、D84E、S87D、R120H、S130E、T133D；(xxiv)Q11E、L12T、E15Q、H16E、L19D、Q22H、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E；(xxv)Q11E、L12T、E15Q、H16E、L19D、Q22H、M23E、R81E、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E；(xxvi)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81E、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E；(xxvii)H16E、Q22E、M23Q、S87N、R120H、S130E、T133E；(xxviii)H16E、L19D、Q22D、M23Q、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E；(xxiix)Q11E、L12E、Q13H、E15Q、H16N、L19D、Q22E、M23Q、R81E、D84E、S87D、E95D、R120H、T133E；(xxix)Q11E、L12T、H16E、L19D、Q22E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D；(xxx)Q11T、L12E、E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E、R120E、S130E、T133D；(xxxi)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E；(xxxii)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81Q、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E；(xxxiii)Q11E、L12S、H16E、L19D、M23Q、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E；(xxxiv)S6Y、L12E、Q13R、H16Q、Q22E、M23Q、R81N、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D；(xxxv)H16D、M23N、R81D、D84E、R120H、S130E、T133E；(xxxvi)Q11E、L12TE、H16Q、L19D、M23E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E；(xxxvii)Q11E、L12E、H16NE、M23N、R81E、D84E、R120H、S130E、T133E；(xxxviii)E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E；(xxxix)Q11E、R120H、S130E、T133D；或(xl)Q11E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D。
在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代(i)L12E、D20E、M23N、R81N、D84E、S87E、R120E、T123E、S130E、T133N、F42A、Y45A、L72G；(ii)Q11E、D20Q、M23E、R81D、D84E、S87E、S130E、T133N、F42A、Y45A、L72G；(iii)L12E、L19D、R81D、R120E、T123E、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G；(iv)R81Q、S87E、V91D、T123E、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G；(v)Q11E、L12E、M23Q、R81D、S87E、V91D、S130E、T133Q、F42A、Y45A、L72G；(vi)Q11E、L19D、R81D、D84E、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G；(vii)R81D、D84Q、S87D、V91N、T123Q、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G；(viii)L19D、R81E、D84E、S87Q、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G；(iix)L19D、M23N、R81D、T133E、F42A、Y45A、L72G；(ix)Q11E、L12E、M23Q、R81Q、S87D、V91N、E95Q、R120H、T123E、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G；(x)L19D、R81E、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G；(xi)R81Q、S87E、V91D、R120E、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G；(xii)L12Q、L19Q、R81H、V91E、T123E、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G；(xiii)K8E、D20E、M23N、R81H、D84Q、S87E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G；(xiv)L12E、L19Q、R81H、R120E、T133D、F42A、Y45A、L72G；(xv)H16E、L19D、Q22E、M23Q、R81D、D84E、S87D、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G；(xvi)Q11E、L12E、H16Q、L19D、Q22E、M23N、R81E、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G；(xvii)Q11E、H16E、L19D、M23E、R81D、S87E、R120H、Q126E、T133D、F42A、Y45A、L72G；(xviii)Q11E、L12S、E15Q、H16N、L19D、M23E、R81E、D84E、S87D、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G；(xix)Q11E、H16E、M23E、R81N、D84E、S87E、R120H、Q126E、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G；(xx)Q11E、E15Q、H16E、Q22E、M23E、R81H、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G；(xxi)Q11E、L12D、Q13H、E15Q、H16E、Q22E、M23E、R81N、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G；(xxii)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G；(xxiii)H16E、L19D、M23Q、R81N、D84E、S87D、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G；(xxiv)Q11E、L12T、E15Q、H16E、L19D、Q22H、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G；(xxv)Q11E、L12T、E15Q、H16E、L19D、Q22H、M23E、R81E、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G；(xxvi)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81E、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G；(xxvii)H16E、Q22E、M23Q、S87N、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G；(xxviii)H16E、L19D、Q22D、M23Q、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G；(xxiix)Q11E、L12E、Q13H、E15Q、H16N、L19D、Q22E、M23Q、R81E、D84E、S87D、E95D、R120H、T133E、F42A、Y45A、L72G；(xxix)Q11E、L12T、H16E、L19D、Q22E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G；(xxx)Q11T、L12E、E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E、R120E、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G；(xxxi)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G；(xxxii)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81Q、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G；(xxxiii)Q11E、L12S、H16E、L19D、M23Q、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G；(xxxiv)S6Y、L12E、Q13R、H16Q、Q22E、M23Q、R81N、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G；(xxxv)H16D、M23N、R81D、D84E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G；(xxxvi)Q11E、L12TE、H16Q、L19D、M23E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G；(xxxvii)Q11E、L12E、H16NE、M23N、R81E、D84E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G；(xxxviii)E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E、F42A、Y45A、L72G；(xxxix)Q11E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G；或(xl)Q11E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G。
在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代(i)L12E、D20E、M23N、R81N、D84E、S87E、R120E、T123E、S130E、T133N、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(ii)Q11E、D20Q、M23E、R81D、D84E、S87E、S130E、T133N、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(iii)L12E、L19D、R81D、R120E、T123E、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(iv)R81Q、S87E、V91D、T123E、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(v)Q11E、L12E、M23Q、R81D、S87E、V91D、S130E、T133Q、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(vi)Q11E、L19D、R81D、D84E、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(vii)R81D、D84Q、S87D、V91N、T123Q、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(viii)L19D、R81E、D84E、S87Q、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(iix)L19D、M23N、R81D、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(ix)Q11E、L12E、M23Q、R81Q、S87D、V91N、E95Q、R120H、T123E、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(x)L19D、R81E、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(xi)R81Q、S87E、V91D、R120E、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(xii)L12Q、L19Q、R81H、V91E、T123E、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(xiii)K8E、D20E、M23N、R81H、D84Q、S87E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(xiv)L12E、L19Q、R81H、R120E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(xv)H16E、L19D、Q22E、M23Q、R81D、D84E、S87D、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(xvi)Q11E、L12E、H16Q、L19D、Q22E、M23N、R81E、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(xvii)Q11E、H16E、L19D、M23E、R81D、S87E、R120H、Q126E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(xviii)Q11E、L12S、E15Q、H16N、L19D、M23E、R81E、D84E、S87D、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(xix)Q11E、H16E、M23E、R81N、D84E、S87E、R120H、Q126E、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(xx)Q11E、E15Q、H16E、Q22E、M23E、R81H、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(xxi)Q11E、L12D、Q13H、E15Q、H16E、Q22E、M23E、R81N、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(xxii)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(xxiii)H16E、L19D、M23Q、R81N、D84E、S87D、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(xxiv)Q11E、L12T、E15Q、H16E、L19D、Q22H、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(xxv)Q11E、L12T、E15Q、H16E、L19D、Q22H、M23E、R81E、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(xxvi)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81E、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(xxvii)H16E、Q22E、M23Q、S87N、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(xxviii)H16E、L19D、Q22D、M23Q、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(xxiix)Q11E、L12E、Q13H、E15Q、H16N、L19D、Q22E、M23Q、R81E、D84E、S87D、E95D、R120H、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(xxix)Q11E、L12T、H16E、L19D、Q22E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(xxx)Q11T、L12E、E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E、R120E、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(xxxi)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(xxxii)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81Q、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(xxxiii)Q11E、L12S、H16E、L19D、M23Q、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(xxxiv)S6Y、L12E、Q13R、H16Q、Q22E、M23Q、R81N、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(xxxv)H16D、M23N、R81D、D84E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(xxxvi)Q11E、L12TE、H16Q、L19D、M23E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(xxxvii)Q11E、L12E、H16NE、M23N、R81E、D84E、R120H、S130E、T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(xxxviii)E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A；(xxxix)Q11E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A、T3A、C125A；或(xl)Q11E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A、C125A。
在特定实施例中，本发明的突变型IL-2多肽包含与选自下组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽序列：SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6；SEQID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:12；SEQ IDNO:13；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:16)；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:18；SEQID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24；SEQID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:30；SEQID NO:31；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:36；SEQID NO:37；SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:40；SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:42；SEQID NO:43；SEQ ID NO:59；SEQ ID NO:60；SEQ ID NO:61。
在特定实施例中，突变型IL-2多肽包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:5；SEQID NO:6；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ IDNO:12；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:16)；SEQ ID NO:17；SEQID NO:18；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQID NO:24；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29；SEQID NO:30；SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:35；SEQID NO:36；SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:40；SEQ ID NO:41；SEQID NO:42；SEQ ID NO:43；SEQ ID NO:59；SEQ ID NO:60；SEQ ID NO:61。
在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代Q11E。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代E15Q。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代H16E。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代L19D。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代Q22E。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代M23Q。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代R81D。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代D84E。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代S87E。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代R120H。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代Q126E。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代Q126H。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代S130E。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代T133E。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代T133D。
在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代Q11E、F42A、Y45A和L72G。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代E15Q、F42A、Y45A和L72G。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代H16E、F42A、Y45A和L72G。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代L19D、F42A、Y45A和L72G。在一个实施例，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代Q22E、F42A、Y45A和L72G。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代M23Q、F42A、Y45A和L72G。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代R81D、F42A、Y45A和L72G。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代D84E、F42A、Y45A和L72G。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代S87E、F42A、Y45A和L72G。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代R120H、F42A、Y45A和L72G。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代Q126E、F42A、Y45A和L72G。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代Q126H、F42A、Y45A和L72G。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代S130E、F42A、Y45A和L72G。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代T133E、F42A、Y45A和L72G。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代T133D、F42A、Y45A和L72G。
在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代Q11E、F42A、Y45A、L72G、T3A和C125A。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代E15Q、F42A、Y45A、L72G、T3A和C125A。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代H16E、F42A、Y45A、L72G、T3A和C125A。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代L19D、F42A、Y45A、L72G、T3A和C125A。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代Q22E、F42A、Y45A、L72G、T3A和C125A。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代M23Q、F42A、Y45A、L72G、T3A和C125A。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代R81D、F42A、Y45A、L72G、T3A和C125A。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代D84E、F42A、Y45A、L72G、T3A和C125A。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代S87E、F42A、Y45A、L72G、T3A和C125A。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代R120H、F42A、Y45A、L72G。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代Q126E、F42A、Y45A、L72G、T3A和C125A。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代Q126H、F42A、Y45A、L72G、T3A和C125A。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代S130E、F42A、Y45A、L72G、T3A和C125A。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代T133E、F42A、Y45A、L72G、T3A和C125A。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A和C125A。
在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:44；SEQ ID NO:45；SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:47；SEQ ID NO:48；SEQ ID NO:49；SEQ ID NO:50；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:52；SEQ ID NO:53；SEQ ID NO:54；SEQ ID NO:55；SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:57；SEQ ID NO:58。
在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E和S87E。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代Q11E、R120H、S130E和T133D。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代Q11E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E和T133D。
在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E、F42A、Y45A和L72G。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代Q11E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A和L72G。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代Q11E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A和L72G。
在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E、F42A、Y45A、L72G、T3A和C125A。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代Q11E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A和C125A。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含氨基酸取代Q11E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D、F42A、Y45A、L72G、T3A和C125A。
在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含选自SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ IDNO:61的组的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供一种突变型白细胞介素-2(IL-2)多肽，其包含氨基酸突变，各自与野生型IL-2多肽相比，该氨基酸突变消除或降低突变型IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力并且保留突变型IL-2多肽对中等亲和力IL-2受体的亲和力。
对CD25具有降低亲和力的人IL-2(hIL-2)的突变体可以例如通过氨基酸位置35、38、42、43、45或72或它们的组合处的氨基酸取代产生。示例性氨基酸取代包括K35E、K35A、R38A、R38E、R38N、R38F、R38S、R38L、R38G、R38Y、R38W、F42L、F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、K43E、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、Y45K、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R，以及L72K。根据本发明的特定IL-2突变体包含在与人IL-2的残基42、45或72，或它们的组合对应的氨基酸位置处的突变。与IL-2突变体的野生型形式相比，这些突变体表现出对中等亲和力的IL-2受体基本上相似的结合亲和力，并且对IL-2受体的α亚基和高亲和力IL-2受体具有大幅降低的亲和力。
有用突变体的其他特征可包括诱导携带IL-2受体的T细胞和/或NK细胞增殖的能力，在携带IL-2受体的T细胞和/或NK细胞中诱导IL-2信号传导的能力，使NK细胞产生干扰素(IFN)-γ作为次级细胞因子的能力，降低的诱导外周血单核细胞(PBMC)对次级细胞因子(特别是IL-10和TNF-α)进行加工(elaboration)的能力，降低的活化调节性T细胞的能力，降低的诱导T细胞凋亡的能力，以及降低的体内毒性特征。
在根据本发明的一个实施例中，消除或降低突变型IL-2多肽对高亲和力IL-2受体的亲和力并保留突变型IL-2多肽对中等亲和力IL-2受体的亲和力的氨基酸突变位于与人IL-2的残基72对应的位置处。在一个实施例中，所述氨基酸突变是氨基酸取代。在一个实施例中，所述氨基酸取代选自下组：L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R和L72K。在更具体的实施例中，所述氨基酸突变是氨基酸取代L72G。
在特定方面，本发明提供一种突变型IL-2多肽，其包含第一氨基酸突变和第二氨基酸突变，该第一氨基酸突变和第二氨基酸突变消除或降低突变型IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力并且保留突变型IL-2多肽对中等亲和力IL-2受体的亲和力。在一个实施例中，所述第一氨基酸突变位于与人IL-2的残基72对应的位置处。在一个实施例中，所述第一氨基酸突变是氨基酸取代。在具体的实施例中，所述第一氨基酸突变是选自下组的氨基酸取代：L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R和L72K。在甚至更具体的实施例中，所述氨基酸取代是L72G。所述第二氨基酸突变位于与所述第一氨基酸突变不同的位置处。在一个实施例中，所述第二氨基酸突变位于选自与人IL-2的残基35、38、42、43和45对应的位置处。在一个实施例中，所述第二氨基酸突变是氨基酸取代。在具体的实施例中，所述氨基酸取代选自下组：K35E、K35A、R38A、R38E、R38N、R38F、R38S、R38L、R38G、R38Y、R38W、F42L、F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、K43E、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R和Y45K。在特定实施例中，所述第二氨基酸突变位于与人IL-2的残基42或45对应的位置处。在具体的实施例中，所述第二氨基酸突变是氨基酸取代，选自下组：F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R和Y45K。在更具体的实施例中，所述第二氨基酸突变是氨基酸取代F42A或Y45A。在更特定的实施例中，所述第二氨基酸突变位于与人IL-2的残基42对应的位置处。在具体的实施例中，所述第二氨基酸突变是氨基酸取代，选自下组：F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R和F42K。在更具体的实施例中，所述氨基酸取代是F42A。在另一实施例中，所述第二氨基酸突变位于与人IL-2的残基45对应的位置处。在具体的实施例中，所述第二氨基酸突变是氨基酸取代，选自下组：Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R和Y45K。在更具体的实施例中，所述氨基酸取代是Y45A。在某些实施例中，突变型IL-2多肽包含第三氨基酸突变，各自与野生型IL-2多肽相比，该第三氨基酸突变消除或降低突变型IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力并保留突变型IL-2多肽对中等亲和力IL-2受体的亲和力。所述第三氨基酸突变位于与所述第一氨基酸突变和第二氨基酸突变不同的位置处。在一个实施例中，所述第三氨基酸突变位于选自与人IL-2的残基35、38、42、43和45对应的位置处。在优选的实施例中，所述第三氨基酸突变位于与人IL-2的残基42或45对应的位置处。在一个实施例中，所述第三氨基酸突变位于与人IL-2的残基42对应的位置处。在另一实施例中，所述第三氨基酸突变位于与人IL-2的残基45对应的位置处。在一个实施例中，所述第三氨基酸突变是氨基酸取代。在具体的实施例中，所述氨基酸取代选自下组：K35E、K35A、R38A、R38E、R38N、R38F、R38S、R38L、R38G、R38Y、R38W、F42L、F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、K43E、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R和Y45K。在更具体的实施例中，所述氨基酸取代选自下组：F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R和Y45K。在甚至更具体的实施例中，所述氨基酸取代是F42A或Y45A。在一个实施例中，所述氨基酸取代是F42A。在另一实施例中，所述氨基酸取代是Y45A。在某些实施例中，突变型IL-2多肽在与人IL-2的残基38对应的位置处不包含氨基酸突变。
在本发明的甚至更特定的方面，提供一种突变型IL-2多肽，其包含三个氨基酸突变，该三个氨基酸突变消除或降低突变型IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力但保留突变型IL-2多肽对中等亲和力IL-2受体的亲和力。在一个实施例中，所述三个氨基酸突变位于与人IL-2的残基42、45和72对应的位置处。在一个实施例中，所述三个氨基酸突变是氨基酸取代。在一个实施例中，所述三个氨基酸突变是选自以下项的组的氨基酸取代：F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、Y45K、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R，以及L72K。在具体的实施例中，所述三个氨基酸突变是氨基酸取代F42A、Y45A和L72G。
在某些实施例中，所述氨基酸突变使突变型IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力降低至少5倍，具体地至少10倍，更具体地至少25倍。在存在多于一个降低突变型IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力的氨基酸突变的实施例中，这些氨基酸突变的组合可使突变型IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力降低至少30倍、至少50倍，或甚至至少100倍。在一个实施例中，所述氨基酸突变或氨基酸突变的组合消除突变型IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力，使得通过如下文所述的表面等离子体共振检测不到结合。
当IL-2突变体表现出大于该IL-2突变体的野生型形式对中等亲和力IL-2受体的亲和力的大于约70％时，实现了基本上相似的与中等亲和力受体的结合，即保留突变型IL-2多肽对所述受体的亲和力。本发明的IL-2突变体可表现出大于约80％，甚至大于约90％的此种亲和力。
本发明人已发现，降低IL-2对IL-2受体的α亚基的亲和力与消除IL-2的O-糖基化的组合产生了具有改善特性的IL-2蛋白。例如，当突变型IL-2多肽在诸如CHO或HEK细胞之类的哺乳动物细胞中表达时，消除O糖基化位点导致更均质的产物。
因此，在某些实施例中，根据本发明的突变型IL-2多肽包含另外的氨基酸突变，该另外的氨基酸突变消除在与人IL-2的残基3对应的位置处的IL-2的O-糖基化位点。在一个实施例中，消除与人IL-2的残基3对应的位置处的IL-2的O糖基化位点的所述另外的氨基酸突变是氨基酸取代。示例性氨基酸取代包括T3A、T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R、T3K，以及T3P。在一个具体实施例中，所述另外的氨基酸突变是氨基酸取代T3A。
在某些实施例中，突变型IL-2多肽基本上是全长IL-2分子。在某些实施例中，突变型IL-2多肽是人IL-2分子。在一个实施例中，突变型IL-2多肽包含具有至少一个氨基酸突变的SEQ ID NO:144所示氨基酸序列，与包含不具有所述突变的SEQ ID NO:144所示氨基酸序列的IL-2多肽相比，该至少一个氨基酸突变消除或降低突变型IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力但保留突变型IL-2多肽对中等亲和力IL-2受体的亲和力。
在一个具体实施例中，突变型IL-2多肽可以引发选自由以下项组成的组的细胞反应中的一种或多种细胞反应：活化T淋巴细胞的增殖、活化T淋巴细胞的分化、细胞毒性T细胞(CTL)活性、活化B细胞的增殖、活化B细胞的分化、自然杀伤(NK)细胞的增殖、NK细胞的分化、活化T细胞或NK细胞进行细胞因子分泌，以及NK/淋巴细胞活化杀伤(LAK)抗肿瘤细胞毒性。
在一个实施例中，与野生型IL-2多肽相比，突变型IL-2多肽具有降低诱导调节性T细胞中IL-2信号传导的能力。在一个实施例中，与野生型IL-2多肽相比，突变型IL-2多肽在T细胞中诱导较少的活化诱导细胞死亡(AICD)。在一个实施例中，与野生型IL-2多肽相比，突变型IL-2多肽具有降低的体内毒性特征。在一个实施例中，与野生型IL-2多肽相比，突变型IL-2多肽具有延长的血清半衰期。
根据本发明的特定突变型IL-2多肽在与人IL-2的残基3、42、45和72对应的位置处包含四个氨基酸取代。具体的氨基酸取代是T3A、F42A、Y45A和L72G。如所附实例中所证实，所述四重突变型IL-2多肽表现为没有可检测的与CD25的结合、降低的诱导T细胞凋亡的能力、降低的诱导Treg细胞中IL-2信号传导的能力，以及降低的体内毒性概况。然而，它保留了在效应细胞中活化IL-2信号传导、诱导效应细胞增殖，以及通过NK细胞产生IFN-γ作为次级细胞因子的能力。
此外，如实例中所述，所述突变型IL-2多肽具有进一步有利的特性，诸如降低的表面疏水性、良好的稳定性和良好的表达产率。出乎意料的是，与野生型IL-2相比，所述突变型IL-2多肽还提供延长的血清半衰期。
本发明的IL-2突变体，除了在形成IL-2与CD25或糖基化位点的界面的IL-2区域中具有突变外，还可以在这些区域之外的氨基酸序列中具有一个或多个突变。人IL-2中的此类另外突变可提供额外的优点，诸如增强的表达或稳定性。例如，如在美国专利号4,518,584中所述，125位的半胱氨酸可以用中性氨基酸(诸如丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸或缬氨酸)替代，从而分别产生C125S IL-2、C125A IL-2、C125T IL-2或C125V IL-2。如其中所述，还可以使IL-2的N末端丙氨酸残基缺失，从而产生诸如des-A1C125S或des-A1 C125A之类的突变。另选地或结合地，IL-2突变体可包括这样的突变，通过所述突变通常在野生型人IL-2的104位存在的甲硫氨酸被诸如丙氨酸之类的中性氨基酸替代(参见美国专利号5,206,344)。所得突变体，例如des-A1 M104A IL-2、des-A1 M104A C125S IL-2、M104A IL-2、M104A C125AIL-2、des-A1 M104A C125A IL-2、或M104A C125S IL-2(这些和其他突变体可见于美国专利号5,116,943中和Weiger等人，Eur JBiochem 180,295-300(1989)中)可以与本发明的特定IL-2突变结合使用。
因此，在某些实施例中，根据本发明的突变型IL-2多肽在与人IL-2的残基125对应的位置处包含另外的氨基酸突变。在一个实施例中，所述另外的氨基酸突变是氨基酸取代C125A。
技术人员将能够确定哪些另外的突变可以为本发明的目的提供额外的优点。例如，将理解IL-2序列中的降低或消除IL-2对中等亲和力的IL-2受体的亲和力的氨基酸突变，诸如D20T、N88R或Q126D(参见例如US 2007/0036752)，可能不适合包括在根据本发明的突变型IL-2多肽中。
本发明的突变型IL-2多肽特别适用于IL-2融合蛋白，诸如带有IL-2的免疫缀合物的情况。此类融合蛋白包含与非IL-2部分融合的本发明的突变型IL-2多肽。非IL-2部分可以是合成或天然蛋白质或其一部分或变体。例示性非IL-2部分包括白蛋白或抗体结构域，诸如免疫球蛋白的Fc结构域或抗原结合结构域。
带有IL-2的免疫缀合物是包含抗原结合部分和IL-2部分的融合蛋白。这些免疫缀合物通过直接靶向IL-2(例如进入肿瘤微环境)而显著增加IL-2疗法的功效。根据本发明，抗原结合部分可以是完整抗体或免疫球蛋白，或其具有生物学功能(诸如抗原特异性结合亲和力)的部分或变体。
免疫缀合物疗法的益处是显而易见的。例如，免疫缀合物的抗原结合部分识别肿瘤特异性表位并导致免疫缀合物分子靶向至肿瘤部位。因此，可以将高浓度的IL-2递送到肿瘤微环境中，从而使用比未缀合的IL-2所需的低得多的剂量的免疫缀合物导致本文提及的多种免疫效应细胞的活化和增殖。此外，由于IL-2以免疫缀合物的形式应用允许细胞因子本身的较低剂量，所以IL-2的不良副作用的可能性被限制，并且借助于免疫缀合物将IL-2靶向体内的特定部位也可导致与使用未缀合的IL-2获得的相比减少的全身暴露和因此更小的副作用。此外，与未缀合的IL-2相比，免疫缀合物的循环半衰期延长有助于该免疫缀合物的功效。然而，IL-2免疫缀合物的该特征可能再次加重IL-2分子的潜在副作用：由于IL-2免疫缀合物在血流中的循环半衰期相对于未缀合的IL-2显著延长，因此IL-2或融合蛋白分子的其他部分活化通常存在于脉管系统中的组分的可能性增加。同样的问题适用于含有与另一部分(诸如Fc或白蛋白)融合的IL-2的其他融合蛋白，会导致循环中IL-2的半衰期延长。因此，包含根据本发明的突变型IL-2多肽的免疫缀合物与IL-2的野生型形式相比具有降低的毒性是特别有利的。
因此，本发明进一步提供与至少一个非IL-2部分连接的如上文所述的突变型IL-2多肽。在一个实施例中，突变型IL-2多肽和非IL-2部分形成融合蛋白，即突变型IL-2多肽与非IL-2部分共享肽键。在一个实施例中，突变型IL-2多肽与第一非IL-2部分和第二非IL-2部分连接。在一个实施例中，突变型IL-2多肽与第一抗原结合部分共享氨基末端肽键或羧基末端肽键，并且第二抗原结合部分与i)突变型IL-2多肽或ii)第一抗原结合部分共享氨基末端肽键或羧基末端肽键。在特定实施例中，突变型IL-2多肽与所述第一非IL-2部分共享羧基末端肽键并且与所述第二非IL-2部分共享氨基末端肽键。在一个实施例中，所述非IL-2部分是靶向部分。在特定实施例中，所述非IL-2部分是抗原结合部分(因此与突变型IL-2多肽形成免疫缀合物，如下文更详细地描述)。在某些实施例中，抗原结合部分是抗体或抗体片段。在一个实施例中，抗原结合部分是全长抗体。在一个实施例中，抗原结合部分是免疫球蛋白分子，特别是IgG类免疫球蛋白分子，更特别是IgG1亚类免疫球蛋白分子。在一个此类实施例中，突变型IL-2多肽与免疫球蛋白重链中的一个重链共享氨基末端肽键。在另一实施例中，抗原结合部分是抗体片段。在一些实施例中，所述抗原结合部分包含抗体的抗原结合结构域，其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。在更具体的实施例中，抗原结合部分是Fab分子或scFv分子。在优选的实施例中，抗原结合部分是Fab分子。在另一实施例中，抗原结合部分是scFv分子。在一个实施例中，所述抗原结合部分针对在肿瘤细胞上存在或在肿瘤细胞环境中存在的抗原。在优选的实施例中，所述抗原选自下组：成纤维细胞活化蛋白(FAP)、腱生蛋白-C的A1结构域(TNC A1)、腱生蛋白-C的A2结构域(TNC A2)、纤连蛋白的外结构域B(EDB)、癌胚抗原(CEA)和黑色素瘤相关的硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)。在突变型IL-2多肽与多于一个的抗原结合部分(例如第一抗原结合部分和第二抗原结合部分)连接的情况下，每个抗原结合部分可以独立地选自各种形式的抗体和抗体片段。例如，第一抗原结合部分可以是Fab分子，并且第二抗原结合部分可以是scFv分子。在一个具体实施例中，所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分中的每一者是scFv分子，或者所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分中的每一者是Fab分子。在一个特定实施例中，所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分中的每一者是Fab分子。同样地，当突变型IL-2多肽与多于一个的抗原结合部分(例如第一抗原结合部分和第二抗原结合部分)连接的情况下，可以独立地选择每个抗原结合部分所针对的抗原。在一个实施例中，所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分针对不同的抗原。在另一实施例中，所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分针对同一抗原。如上所述，抗原特别是在肿瘤细胞上存在或在肿瘤细胞环境中存在的抗原，更特别是选自下组的抗原：成纤维细胞活化蛋白(FAP)、腱生蛋白-C的A1结构域(TNC A1)、腱生蛋白-C的A2结构域(TNC A2)、纤连蛋白的外结构域B(EDB)、癌胚抗原(CEA)和黑色素瘤相关的硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)。抗原结合区可以进一步单独或组合地结合本文中关于免疫缀合物的抗原结合结构域描述的任何特征。
免疫缀合物
在特定方面，本发明提供一种免疫缀合物，其包含如本文所公开的突变型IL-2多肽，该多肽包含一个或多个氨基酸突变，其中一个或多个氨基酸取代在中性pH下消除或降低与IL-2受体、优选与中等亲和力IL-2受体(IL2Rβγ)的结合并且在降低的pH下促进与IL-2受体、优选与中等亲和力IL-2受体(IL2Rβγ)的结合。在一个实施例中，免疫缀合物包含突变型IL-2多肽，其在pH 7.4和/或pH 7.0下表现出降低或消除的IL-2受体结合、优选中等亲和力IL-2受体结合，并在pH 6和/或pH 6.5下保留IL-2受体结合、优选中等亲和力IL-2受体结合，如本文所公开。
在特定方面，本发明提供一种免疫缀合物，其包含突变型IL-2多肽，该多肽包含一个或多个氨基酸突变，该一个或多个氨基酸突变消除或降低突变型IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力并保留突变型IL-2多肽对中等亲和力IL-2受体的亲和力；和至少一个抗原结合部分。在根据本发明的一个实施例中，消除或降低突变型IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力并保留突变型IL-2多肽对中等亲和力IL-2受体的亲和力的氨基酸突变位于选自与人IL-2的残基42、45和72对应的位置处。在一个实施例中，所述氨基酸突变是氨基酸取代。在一个实施例中，所述氨基酸突变是选自由以下项组成的组的氨基酸取代：F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、Y45K、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R和L72K，更具体地是选自F42A、Y45A和L72G的组的氨基酸取代。在一个实施例中，氨基酸突变位于与人IL-2的残基42对应的位置处。在具体的实施例中，所述氨基酸突变是选自下组的氨基酸取代：F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R和F42。在甚至更具体的实施例中，所述氨基酸取代是F42A。在另一实施例中，氨基酸突变位于与人IL-2的残基45对应的位置处。在具体的实施例中，所述氨基酸突变是选自下组的氨基酸取代：Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R和Y45K。在甚至更具体的实施例中，所述氨基酸取代是Y45A。在又另一实施例中，氨基酸突变位于与人IL-2的残基72对应的位置处。在具体的实施例中，所述氨基酸突变是选自下组的氨基酸取代：L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R和L72K。在甚至更具体的实施例中，所述氨基酸取代是L72G。在某些实施例中，根据本发明的突变型IL-2多肽在与人IL-2的残基38对应的位置处不包含氨基酸突变。在特定实施例中，本发明的免疫缀合物中所包含的突变型IL-2多肽至少包含第一氨基酸突变和第二氨基酸突变，该第一氨基酸突变和第二氨基酸突变消除或降低突变型IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力并保留突变型IL-2多肽对中等亲和力IL-2受体的亲和力。在一个实施例中，所述第一氨基酸突变和第二氨基酸突变位于选自与人IL-2的残基42、45和72对应的位置的两个位置处。在一个实施例中，所述第一氨基酸突变和第二氨基酸突变是氨基酸取代。在一个实施例中，所述第一氨基酸突变和第二氨基酸突变是选自下组的氨基酸取代：F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、Y45K、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R和L72K。在特定实施例中，所述第一氨基酸突变和第二氨基酸突变是选自F42A、Y45A和L72G的组的氨基酸取代。突变型IL-2多肽可以进一步单独或组合地结合前述段落中关于本发明的突变型IL-2多肽描述的任何特征。在一个实施例中，所述突变型IL-2多肽与免疫缀合物中所包含的所述抗原结合部分共享氨基末端肽键或羧基末端肽键，即免疫缀合物是融合蛋白。在某些实施例中，所述抗原结合部分是抗体或抗体片段。在一些实施例中，所述抗原结合部分包含抗体的抗原结合结构域，其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。抗原结合区可以单独或组合地结合上文或下文关于抗原结合结构域描述的任何特征。
免疫缀合物形式
特别适合的免疫缀合物形式描述于PCT公开号WO 2011/020783中，该专利全文以引用方式并入本文。这些免疫缀合物包含至少两个抗原结合结构域。因此，在一个实施例中，根据本发明的免疫缀合物包含至少如本文所述的第一突变型IL-2多肽，以及至少第一抗原结合部分和第二抗原结合部分。在一个特定实施例中，所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分独立地选自由以下项组成的组：Fv分子，特别是scFv分子；以及Fab分子。在具体实施例中，所述第一突变型IL-2多肽与所述第一抗原结合部分共享氨基末端肽键或羧基末端肽键，并且所述第二抗原结合部分与i)第一突变型IL-2多肽或ii)第一抗原结合部分共享氨基末端肽键或羧基末端肽键。在特定实施例中，免疫缀合物基本上由第一突变型IL-2多肽以及通过一个或多个接头序列接合的第一抗原结合部分和第二抗原结合部分组成。这种形式具有以下优点：它们以高亲和力与靶抗原(诸如肿瘤抗原)结合，但仅为与IL-2受体的单体结合，从而避免将免疫缀合物靶向至在除了靶位点以外的其他位置处的携带IL-2受体的免疫细胞。在特定实施例中，第一突变型IL-2多肽与第一抗原结合部分共享羧基末端肽键，并且进一步与第二抗原结合部分共享氨基末端肽键。在另一实施例中，第一抗原结合部分与第一突变型IL-2多肽共享羧基末端肽键，并且进一步与第二抗原结合部分共享氨基末端肽键。在另一实施例中，第一抗原结合部分与第一突变型IL-2多肽共享氨基末端肽键，并且进一步与第二抗原结合部分共享羧基末端肽。在一个特定实施例中，突变型IL-2多肽与第一重链可变区共享羧基末端肽键，并且还与第二重链可变区共享氨基末端肽键。在另一个实施例中，突变型IL-2多肽与第一轻链可变区共享羧基末端肽键，并且还与第二轻链可变区共享氨基末端肽键。在另一实施例中，第一重链或轻链可变区通过羧基末端肽键与第一突变型IL-2多肽接合，并且进一步通过氨基末端肽键与第二重链或轻链可变区接合。在另一实施例中，第一重链或轻链可变区通过氨基末端肽键与第一突变型IL-2多肽接合，并且进一步通过羧基末端肽键与第二重链或轻链可变区接合。在一个实施例中，突变型IL-2多肽与第一Fab重链或轻链共享羧基末端肽键，并且还与第二Fab重链或轻链共享氨基末端肽键。在另一实施例中，第一Fab重链或轻链与第一突变型IL-2多肽共享羧基末端肽键，并且进一步与第二Fab重链或轻链共享氨基末端肽键。在其他实施例中，第一Fab重链或轻链与第一突变型IL-2多肽共享氨基末端肽键，并且进一步与第二Fab重链或轻链共享羧基末端肽键。在一个实施例中，免疫缀合物至少包含与一个或多个scFv分子共享氨基末端肽键，并且进一步与一个或多个scFv分子共享羧基末端肽键的第一突变型IL-2多肽。
其他特别适合的免疫缀合物形式包含免疫球蛋白分子作为抗原结合部分。在一个此类实施例中，免疫缀合物包含至少一种如本文所述的突变型IL-2多肽和免疫球蛋白分子，特别是IgG分子，更特别是IgG1分子。在一个实施例中，免疫缀合物包含不超过一种突变型IL-2多肽。在一个实施例中，免疫球蛋白分子是人。在一个实施例中，突变型IL-2多肽与免疫球蛋白分子共享氨基末端肽键或羧基末端肽键。在一个实施例中，免疫缀合物基本上由以下组成：通过一个或多个接头序列接合的突变型IL-2多肽和免疫球蛋白分子，特别是IgG分子，更特别地是IgG1分子。在具体的实施例中，突变型IL-2多肽在其氨基末端氨基酸处与免疫球蛋白重链中的一条免疫球蛋白重链的羧基末端氨基酸接合。在某些实施例中，免疫球蛋白分子在Fc结构域中包含促进两条不相同的免疫球蛋白重链异二聚化的修饰。人IgG Fc结构域的两条多肽链之间最广泛的蛋白质间相互作用位点在Fc结构域的CH3结构域中。因此，在一个实施例中，所述修饰位于Fc结构域的CH3结构域中。在具体的实施例中，所述修饰是杵臼修饰，该修饰包含免疫球蛋白重链中的一条免疫球蛋白重链中的杵修饰和免疫球蛋白重链中的另一条免疫球蛋白重链中的臼修饰。杵臼结构技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng 9，617-621(1996)和Carter，J ImmunolMeth 248，7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得该突起可以定位在该空腔中，以便促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。突起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与突起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。突起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成。在具体的实施例中，杵修饰包含两条免疫球蛋白重链中的一条免疫球蛋白重链中的氨基酸取代T366W，并且臼修饰包含两条免疫球蛋白重链中的另一条免疫球蛋白重链中的氨基酸取代T366S、L368A和Y407V。在另一具体的实施例中，包含杵修饰的免疫球蛋白重链另外包含氨基酸取代S354C，并且包含臼修饰的免疫球蛋白重链另外包含氨基酸取代Y349C。引入这两个半胱氨酸残基导致在两条重链之间形成二硫桥，从而进一步稳定二聚体(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
在特定实施例中，突变型IL-2多肽接合到包含杵修饰的免疫球蛋白重链的羧基末端氨基酸。
在替代实施例中，促进两条不相同的多肽链异二聚化的修饰包含介导静电转向效应的修饰，例如如在PCT公开WO 2009/089004中所述。通常，该方法涉及通过带电荷的氨基酸残基取代两条多肽链的界面处的一个或多个氨基酸残基，使得同二聚体形成变得在静电上不利，但异二聚化在静电上有利。
Fc结构域赋予免疫缀合物有利的药代动力学特性，包括有助于在靶组织中良好积聚的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。然而，同时，其可能导致免疫缀合物不期望地靶向至表达Fc受体的细胞，而不是优选的抗原携带细胞。此外，Fc受体信号传导通路的共活化可导致细胞因子释放，所述细胞因子释放与IL-2多肽和免疫缀合物的长半衰期组合，在全身施用后导致对细胞因子受体的过度活化和严重的副作用。与此一致，已经描述了与输注反应相关的常规IgG-IL-2免疫缀合物(参见例如King等人，JClin Oncol 22,4463-4473(2004))。
因此，在某些实施例中，在根据本发明的免疫缀合物中所包含的免疫球蛋白分子经工程化以具有降低的对Fc受体的结合亲和力。在一个此类实施例中，免疫球蛋白在其Fc结构域中包含一个或多个降低免疫缀合物对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变。典型地，相同的一个或多个氨基酸突变存在于两条免疫球蛋白重链中的每一条免疫球蛋白重链中。在一个实施例中，所述氨基酸突变将免疫缀合物对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。在存在多于一个降低免疫缀合物对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施例中，这些氨基酸突变的组合可以将Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少10倍、至少20倍或甚至至少50倍。在一个实施例中，如与包含非工程化的免疫球蛋白分子的免疫缀合物相比，包含工程化的免疫球蛋白分子的免疫缀合物表现出对Fc受体的结合亲和力的小于20％，特别地小于10％，更特别地小于5％。在一个实施例中，Fc受体是活化Fc受体。在具体的实施例中，Fc受体是Fcγ受体，更特别地是FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa受体。优选地，与这些受体中的每一个的结合降低。在一些实施例中，对补体组分的结合亲和力，特别是对C1q的结合亲和力也降低。在一个实施例中，对新生Fc受体(FcRn)的结合亲和力没有降低。当免疫球蛋白(或包含所述免疫球蛋白的免疫缀合物)表现出非工程化形式的免疫球蛋白(或包含所述非工程化形式的免疫球蛋白的免疫缀合物)与FcRn的结合亲和力的大于约70％时，实现了基本上相似的与FcRn的结合，即保留免疫球蛋白对所述受体的结合亲和力。免疫球蛋白或包含所述免疫球蛋白的免疫缀合物可表现出大于约80％，且甚至大于约90％的此类亲和力。在一个实施例中，氨基酸突变是氨基酸取代。在一个实施例中，免疫球蛋白在免疫球蛋白重链的位置P329(Kabat编号)处包含氨基酸取代。在更具体的实施例中，氨基酸取代是P329A或P329G，特别是P329G。在一个实施例中，免疫球蛋白在选自免疫球蛋白重链的S228、E233、L234、L235、N297和P331的位置处包含进一步的氨基酸取代。在更具体的实施例中，进一步的氨基酸取代是S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在特定实施例中，免疫球蛋白在免疫球蛋白重链的位置P329、L234和L235处包含氨基酸取代。在更特定的实施例中，免疫球蛋白包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(LALA P329G)。这种氨基酸取代组合几乎完全消除了人IgG分子的Fcγ受体结合，并因此降低了效应功能，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
在某些实施例中，免疫缀合物包含位于突变型IL-2多肽和抗原结合部分之间的一个或多个蛋白水解切割位点。
免疫缀合物的组分(例如抗原结合部分和/或突变型IL-2多肽)可以直接连接或经由各种接头，特别是包含一个或多个氨基酸、通常约2-20个氨基酸的肽接头连接，这些接头在本文中描述或在本领域中是已知的。合适的非免疫原性接头肽包括例如(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n肽接头，其中n通常为介于1与10之间的数字，通常介于2与4之间。
抗原结合部分
本发明的免疫缀合物的抗原结合部分通常是一种多肽分子，其结合于特定的抗原决定簇并能够将与其附接的实体(例如突变型IL-2多肽或第二抗原结合部分)引导至靶位点，例如带有抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞或肿瘤间质。免疫缀合物可以结合于例如在肿瘤细胞的表面上、病毒感染细胞的表面上、其他患病细胞的表面上、血清中的游离物和/或细胞外基质(ECM)中发现的抗原决定簇。
肿瘤抗原的非限制性实例包括MAGE、MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、亲环蛋白b、结肠直肠相关抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)以及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2，etv6、aml1、前列腺特异性抗原(PSA)以及其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3，前列腺特异性膜抗原(PSMA)、T细胞受体/CD3-ζ链、肿瘤抗原MAGE家族(例如，MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、肿瘤抗原GAGE家族(例如，GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-胎蛋白、E-钙粘蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白和γ-连环蛋白、p120ctn、gp100 Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性结肠息肉病蛋白(APC)、胞衬蛋白、连接蛋白37、Ig-独特型、p15、gp75、GM2和GD2神经节苷脂、病毒产物(诸如人乳头瘤病毒蛋白)、肿瘤抗原Smad家族、lmp-1、P1A、编码EBV的核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7以及c-erbB-2。
病毒抗原的非限制性实例包括流感病毒血凝素、爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒LMP-1、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、HIV gp160和HIV gp120。
ECM抗原的非限制性实例包括多配体蛋白聚糖、乙酰肝素酶、整合素、骨桥蛋白、连接蛋白、钙粘蛋白、层粘连蛋白、层粘连蛋白型EGF、凝集素、纤连蛋白、notch、腱生蛋白和基质金属蛋白酶。
本发明的免疫缀合物可以结合于以下细胞表面抗原的具体非限制性实例：FAP、Her2、EGFR、IGF-1R、CD2(T细胞表面抗原)、CD3(与TCR相关的异源多聚体)、CD22(B细胞受体)、CD23(低亲和力IgE受体)、CD30(细胞因子受体)、CD33(骨髓细胞表面抗原)、CD40(肿瘤坏死因子受体)、IL-6R(IL6受体)、CD20、MCSP和PDGFβR(β血小板衍生生长因子受体)。
在一个实施例中，本发明的免疫缀合物包含两个或更多个抗原结合部分，其中这些抗原结合部分中的每一个特异性结合于相同的抗原决定簇。在另一实施例中，本发明的免疫缀合物包含两个或更多个抗原结合部分，其中这些抗原结合部分中的每一个特异性结合于不同的抗原决定簇。
抗原结合部分可以是保持与抗原决定簇特异性结合的任何类型的抗体或其片段。抗体片段包括但不限于VH片段、VL片段、Fab片段、F(ab’)2片段、scFv片段、Fv片段、微型抗体、双体抗体、三体抗体和四体抗体(参见例如Hudson和Souriau,Nature Med 9,129-134(2003))。
特别适合的抗原结合部分描述于PCT公开号WO 2011/020783中，该专利全文以引用方式并入本文。
在一个实施例中，免疫缀合物包含至少一个，通常是两个或更多个对纤连蛋白的外结构域B(EDB)具有特异性的抗原结合部分。在另一实施例中，免疫缀合物包含至少一个，通常是两个或更多个可以与单克隆抗体L19竞争结合于EDB的表位的抗原结合部分。参见例如，PCT公开WO 2007/128563A1(通过引用整体并入本文)。在又另一实施例中，免疫缀合物包含多肽序列，其中源自L19单克隆抗体的第一Fab重链与突变型IL-2多肽共享羧基末端肽键，后者又与源自L19单克隆抗体的第二Fab重链共享羧基末端肽键。在又另一实施例中，免疫缀合物包含多肽序列，其中源自L19单克隆抗体的第一Fab轻链与突变型IL-2多肽共享羧基末端肽键，后者又与源自L19单克隆抗体的第二Fab轻链共享羧基末端肽键。在进一步的实施例中，免疫缀合物包含多肽序列，其中源自L19单克隆抗体的第一scFv与突变型IL-2多肽共享羧基末端肽键，后者又与源自L19单克隆抗体的第二scFv共享羧基末端肽键。
在具体的实施例中，免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO 64-79和SEQ ID NO 82-143的组的多肽序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:65或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:66或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:67或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:68或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:69或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:70或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:71或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:72或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:73或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:74或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:75或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:76或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:77或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:78或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:79或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:82或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:83或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:84或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:85或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:86或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:87或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:88或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:89或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:90或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:91或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:92或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:93或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:94或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:95或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:96或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:97或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:98或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:99或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:100或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:101或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:102或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:103或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:104或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:105或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:106或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:107或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:108或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:109或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:110或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:111或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:112或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:113或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:114或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:115或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:116或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:117或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:118或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:119或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:120或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:121或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:122或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:123或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:124或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:125或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:126或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:127或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:128或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:129或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:80和SEQ ID NO:130或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:131或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:132或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:133或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:134或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:135或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:136或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:137或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:138或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:139或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:140或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:141或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:142或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:143或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:147或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:148或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:149或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:150或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:151或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:152或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:153或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:154或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:155或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:156或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明的免疫缀合物包含与选自SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:157或其保留功能的变体的组的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:63的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:64的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:63的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:65的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:63的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:66的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:63的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:67的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:63的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:68的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:63的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:69的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:63的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:70的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:63的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:71的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:63的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:72的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:63的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:73的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:63的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:74的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:63的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:75的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:63的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:76的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:63的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:77的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:63的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:78的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:63的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:79的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:81的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:82的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:83的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:84的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:85的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:86的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:87的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:88的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:89的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:90的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:91的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:92的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:93的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:94的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:95的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:96的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:97的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:98的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:99的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:100的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:101的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:102的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:103的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:104的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:105的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:106的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:107的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:108的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:109的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:110的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:111的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:112的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:113的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:114的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:115的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:116的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:117的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:118的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:119的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:120的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:121的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:122的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:123的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:124的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:125的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:126的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:127的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:128的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:129的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:130的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:131的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:132的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:133的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:134的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:135的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:136的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:137的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:138的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:139的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:140的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:141的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:142的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:62的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:80的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:143的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:145的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:146的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:147的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:145的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:146的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:148的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:145的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:146的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:149的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:145的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:146的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:150的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:145的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:146的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:151的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:145的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:146的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:152的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:145的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:146的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:153的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:145的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:146的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:154的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:145的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:146的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:155的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:145的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:146的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:156的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在具体的实施例中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含：包含与SEQ ID NO:145的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:146的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:157的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
多核苷酸
本发明进一步提供分离的多核苷酸，其编码突变型IL-2多肽或包含如本文所述的突变型IL-2多肽的免疫缀合物。
本发明的多核苷酸包括编码与如下所示的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽的多核苷酸：SEQ ID NO 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157(包括其功能片段或变体)。
不与非IL-2部分连接的编码突变型IL-2多肽的多核苷酸通常表达为编码整个多肽的单个多核苷酸。
编码本发明免疫缀合物的多核苷酸可以表达为编码完整免疫缀合物的单个多核苷酸，或表达为共表达的多个(例如，两个或更多个)多核苷酸。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其他方式缔合以形成功能性免疫缀合物。例如，抗原结合部分的重链部分可以由来自包含抗原结合部分的轻链部分和突变型IL-2多肽的免疫缀合物的部分的单独多核苷酸编码。当共表达时，重链多肽将与轻链多肽缔合以形成抗原结合部分。可替代地，在另一实例中，抗原结合部分的轻链部分可以由来自包含抗原结合部分的重链部分和突变型IL-2多肽的免疫缀合物的部分的单独多核苷酸编码。在一个实施例中，本发明的分离的多核苷酸编码包含突变型IL-2多肽和抗原结合部分的免疫缀合物的片段。在另一实施例中，本发明的分离的多核苷酸编码抗原结合部分的重链和突变型IL-2多肽。在另一实施例中，本发明的分离的多核苷酸编码抗原结合部分的轻链和突变型IL-2多肽。
在具体的实施例中，本发明的分离的多核苷酸编码包含至少一个突变型IL-2多肽和至少一个、优选两个或更多个抗原结合部分的免疫缀合物的片段，其中第一突变型IL-2多肽与第一抗原结合部分共享氨基末端肽键或羧基末端肽键，并且第二抗原结合部分与第一突变型IL-2多肽或第一抗原结合部分共享氨基末端肽键或羧基末端肽键。在一个实施例中，抗原结合部分独立地选自由以下项组成的组：Fv分子，特别是scFv分子；以及Fab分子。在另一具体的实施例中，多核苷酸编码两个抗原结合部分中的重链和一个突变型IL-2多肽。在另一具体的实施例中，多核苷酸编码两个抗原结合部分中的轻链和一个突变型IL-2多肽。在另一具体的实施例中，多核苷酸编码一个抗原结合部分中的一条轻链、第二抗原结合部分的一条重链和一个突变型IL-2多肽。
在另一具体的实施例中，本发明的分离的多核苷酸编码免疫缀合物的片段，其中多核苷酸编码两个Fab分子中的重链和突变型IL-2多肽。在另一具体的实施例中，本发明的分离的多核苷酸编码免疫缀合物的片段，其中多核苷酸编码两个Fab分子中的轻链和突变型IL-2多肽。在另一具体的实施例中，本发明的分离的多核苷酸编码免疫缀合物的片段，其中多核苷酸编码一个Fab分子中的重链、第二Fab分子中的轻链和突变型IL-2多肽。
在一个实施例中，本发明的分离的多核苷酸编码包含至少一个在氨基末端氨基酸和羧基末端氨基酸处与一个或多个scFv分子接合的突变型IL-2多肽的免疫缀合物。
在一个实施例中，本发明的分离的多核苷酸编码免疫缀合物的片段，其中多核苷酸编码免疫球蛋白分子(特别是IgG分子，更特别是IgG1分子)中的重链和突变型IL-2多肽。在更具体的实施例中，分离的多核苷酸编码免疫球蛋白分子中的重链和突变型IL-2多肽，其中突变型IL-2多肽与免疫球蛋白重链共享氨基末端肽键。
在某些实施例中，多核苷酸或核酸是DNA。在其他实施例中，本发明的多核苷酸是RNA，例如以信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。
重组方法
可使用本领域中熟知的遗传或化学方法通过缺失、取代、插入或修饰来制备本发明的突变型IL-2多肽。遗传方法可包括对编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。可以例如通过测序来验证正确的核苷酸变化。就此而言，天然IL-2的核苷酸序列已由Taniguchi等人(Nature302,305-10(1983))描述，并且编码人IL-2的核酸可从诸如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(Rockville MD)之类的公共保藏机构获得。天然人IL-2的序列示出于SEQ ID NO:144中。取代或插入可涉及天然和非天然的氨基酸残基。氨基酸修饰包括众所周知的化学修饰方法，诸如添加糖基化位点或碳水化合物附接等。
本发明的突变型IL-2多肽和免疫缀合物可以例如通过固态肽合成或重组生产获得。对于重组生产，将例如如上所述的编码所述突变型IL-2多肽或免疫缀合物(片段)的一种或多种多核苷酸分离并插入至一个或多个载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类多核苷酸可使用常规方法容易地分离并且测序。在一个实施例中，提供了一种载体，优选为表达载体，该载体包含本发明的多核苷酸中的一种或多种多核苷酸。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建含有突变型IL-2多肽或免疫缀合物(片段)的编码序列以及适当转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见，例如在Maniatis等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989)；和Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y(1989)中描述的技术。表达载体可以是质粒、病毒的一部分，或者可以是核酸片段。表达载体包括表达盒，编码IL-2突变体或免疫缀合物(片段)的多核苷酸(即编码区)与启动子和/或其他转录或翻译控制元件可操作缔合地克隆至该表达盒中。如本文所用，“编码区”是核酸的一部分，该部分由翻译成氨基酸的密码子组成。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)未被翻译成氨基酸，但其(如果存在的话)可被认为是编码区的一部分，而任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5'和3'非翻译区等不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中(例如在单个载体上)，或在单独的多核苷酸构建体中(例如在单独的(不同的)载体上)。此外，任何载体可含有单一编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一种或多种多蛋白，该一种或多种多蛋白在翻译后或翻译时经由蛋白水解切割分离成最终的蛋白质。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码异源编码区，这些异源编码区与编码本发明的多肽的第一或第二多核苷酸或其变体或衍生物融合或不融合。异源编码区包括但不限于特化元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能结构域。可操作缔合是当基因产物(例如多肽)的编码区以某种方式与一个或多个调控序列缔合，以使基因产物的表达处于调控序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的键结性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或干扰待转录的DNA模板的能力，则该两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其相关的启动子)是“可操作地缔合的”。因此，如果启动子能够影响该核酸的转录，则启动子区域将与编码多肽的核酸可操作地缔合。启动子可以是细胞特异性启动子，该细胞特异性启动子仅在预定细胞中指导DNA的实质转录。除启动子外，其他转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号，可以与多核苷酸可操作地缔合以指导细胞特异性转录。本文公开了合适的启动子和其他转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些转录控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，诸如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子结合内含子-A)、猿猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(诸如例如劳氏肉瘤病毒)。其他转录控制区包括来源于脊椎动物基因(诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β珠蛋白)的那些转录控制区，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。其他合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素可诱导启动子)。类似地，各种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子，以及来源于病毒系统的元件(特别是内部核糖体进入位点，或IRES，也称为CITE序列)。表达盒还可以包括其他特征，诸如复制起点，和/或染色体整合元件，诸如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)，或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的附加编码区缔合，该附加编码区指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果需要分泌突变型IL-2多肽，那么可以将编码信号序列的DNA置于编码突变型IL-2的成熟氨基酸的核酸上游。这同样适用于本发明的免疫缀合物或其片段。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦已经起始跨粗面内质网输出生长的蛋白质链，该信号肽或分泌前导序列就被从成熟蛋白质上切割下来。本领域普通技术人员知道由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与该多肽的N末端融合的信号肽，该信号肽被从翻译的多肽上切割下来以生产该多肽的分泌或“成熟”形式。例如，人IL-2被翻译为在多肽的N末端具有20个氨基酸的信号序列，随后将该信号序列切除以产生成熟的133个氨基酸的人IL-2。在某些实施例中，使用天然信号肽(例如IL-2信号肽或免疫球蛋白重链或轻链信号肽)，或保留指导与其可操作地缔合的多肽分泌的能力的该序列的功能性衍生物。可替代地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以被人组织纤溶酶原活化剂(TPA)或小鼠β葡糖醛酸酶的前导序列取代。
编码可用于促进后续纯化的短蛋白质序列(例如组氨酸标签)或帮助标记IL-2突变体或免疫缀合物的DNA可包含在编码IL-2突变体或免疫缀合物(片段)的多核苷酸的内部或末端处。
在另一实施例中，提供了包含一种或多种本发明的多核苷酸的宿主细胞。在某些实施例中，提供了包含一种或多种本发明的载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独或组合地渗入本文中分别关于多核苷酸和载体描述的任何特征。在一个此类实施例中，宿主细胞包含一种载体(例如已经用一种载体转化或转染)，该载体包含编码氨基酸序列的多核苷酸，该氨基酸序列包含本发明的突变型IL-2多肽。如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以被工程化以产生本发明的突变型IL-2多肽或免疫缀合物或其片段的任何种类的细胞系统。适于复制和支持突变型IL-2多肽或免疫缀合物表达的宿主细胞是本领域中熟知的。此类细胞可以用特定的表达载体适当地转染或转导，并且可以生长大量含有载体的细胞以用于接种大规模发酵罐来获得足够量的IL-2突变体或免疫缀合物用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物，诸如大肠杆菌，或各种真核细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，多肽可以在细菌中生产，特别是当不需要糖基化时。多肽在表达后可以在可溶性级分中从细菌细胞糊状物中分离，并可以进一步纯化。除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物也是用于编码多肽的载体的合适克隆或表达宿主，包括这样的真菌和酵母菌株，该真菌和酵母菌株的糖基化途径已经被“人源化”，从而导致生产具有部分或完全人糖基化模式的多肽。参见Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004)和Li等人，NatBiotech 24,210-215(2006)。用于表达(糖基化)多肽的合适宿主细胞还来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了许多可以与昆虫细胞一起使用的杆状病毒株，特别是用于转染草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞。植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例为由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如例如在Graham等人，J Gen Virol 36,59(1977)中该)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞尔托利氏细胞(TM4细胞，如例如在Mather,Biol Reprod23,243-251(1980)中该)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(HepG2)、小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562)、TRI细胞(如例如在Mather等人，Annals N.Y.AcadSci 383,44-68(1982)中该)、MRC 5细胞，以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA77,4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。关于适用于蛋白质生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，请参见例如Yazaki和Wu，Methods in MolecularBiology，第248卷(B.K.C.Lo编辑，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268页(2003)。宿主细胞包括培养细胞，例如仅举几个例子而言哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞，还包括转基因动物、转基因植物或培养植物或动物组织中所包含的细胞。在一个实施例中，宿主细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。
用于在这些系统中表达外源基因的标准技术是本领域已知的。表达与抗原结合部分(诸如抗体)的重链或轻链融合的突变型IL-2多肽的细胞可以经工程化以便也表达抗体链中的另一条抗体链，使得表达的突变型IL-2融合产物是具有重链或轻链两者的抗体。
在一个实施例中，提供了生产根据本发明的突变型IL-2多肽或免疫缀合物的方法，其中该方法包括在适于表达突变型IL-2多肽或免疫缀合物的条件下培养包含编码如本文所提供的突变型IL-2多肽或免疫缀合物的多核苷酸的宿主细胞，以及任选地从该宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收突变型IL-2多肽或免疫缀合物。
在根据本发明的某些实施例中，突变型IL-2多肽与至少一个非IL-2部分连接。可以制备IL-2突变体，其中突变型IL-2多肽区段与一个或多个分子连接，诸如多肽、蛋白质、碳水化合物、脂质、核酸、多核苷酸或作为这些分子的组合的分子(例如糖蛋白类、糖脂类等)。突变型IL-2多肽也可以与有机部分、无机部分或药物连接。如本文所用，药物是约5,000道尔顿或更小的含有机物的化合物。突变型IL-2多肽还可以与任何生物制剂连接，包括治疗性化合物，诸如抗肿瘤剂、抗微生物剂、激素、免疫调节剂、抗炎剂等。还包括放射性同位素，诸如可用于成像以及疗法的放射性同位素。
突变型IL-2多肽还可以与相同类型的多个分子或多于一种类型的分子连接。在某些实施例中，与IL-2连接的分子可以赋予将IL-2靶向至动物中特定组织或细胞的能力，并且在本文中称为“靶向部分”。在这些实施例中，靶向部分可以对靶组织或细胞中的配体或受体具有亲和力，从而将IL-2导向至靶组织或细胞。在特定实施例中，靶向部分将IL-2导向至肿瘤。靶向部分包括例如对细胞表面或细胞内蛋白质、生物受体的配体等具有特异性的抗原结合部分(例如抗体和其片段)。此类抗原结合部分可能对肿瘤相关抗原(诸如本文所述的那些)具有特异性。
突变型IL-2多肽可以与另一种多肽(例如单链抗体，或抗体重链或轻链的(部分))遗传融合，或可以与另一分子化学缀合。实例中描述了突变型IL-2多肽与抗体重链的部分的融合物。IL-2突变体，作为突变型IL-2多肽与另一种多肽之间的融合物，可经设计以使得IL-2序列直接与多肽融合或经由接头序列间接与多肽融合。接头的组成和长度可以根据本领域熟知的方法测定，并且可以测试接头的功效。在WO 2012/107417 A1的序列SEQ ID NO209、211、213中发现了IL-2与抗体重链之间的接头序列的实例。如果需要的话，还可包括另外的序列(例如内肽酶识别序列)以掺入切割位点来分离融合的各个组分。另外，IL-2突变体或其融合蛋白也可以使用本领域熟知的多肽合成方法(例如Merrifield固相合成)来化学合成。突变型IL-2多肽可以使用熟知的化学缀合方法与其他分子(例如，另一种多肽)化学缀合。双官能交联剂(诸如本领域熟知的同官能和异官能交联剂)可用于此目的。使用的交联剂的类型取决于与IL-2偶联的分子的性质，并且可以由本领域技术人员容易地鉴定。可替代地或另外，突变IL-2和/或其预期缀合的分子可以化学衍生化，使得突变IL-2和/或其预期缀合的分子两者可以在单独的反应中缀合，这也是本领域中熟知的。
在某些实施例中，突变型IL-2多肽与一个或多个抗原结合部分(即，作为免疫缀合物的部分)连接，这些抗原结合部分至少包含能够结合抗原决定簇的抗体可变区。可变区可形成天然或非天然存在的抗体及其片段的一部分并由其衍生。产生多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域熟知的(参见例如Harlow和Lane，"Antibodies,a laboratory manual",Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成来构建，可以重组产生(例如，如在美国专利号4,186,567中该)，或者可以例如通过筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库来获得(参见例如McCafferty的美国专利号5,969,108)。免疫缀合物、抗原结合部分及其生产方法也详细描述于PCT公开号WO 2011/020783中，其全部内容以引用方式并入本文。
任何动物种类的抗体、抗体片段、抗原结合结构域或可变区可与突变型IL-2多肽连接。可用于本发明的非限制性抗体、抗体片段、抗原结合结构域或可变区可以是鼠、灵长类动物或人来源的。如果突变型IL-2/抗体缀合物或融合物旨在用于人类使用，那么可以使用嵌合形式的抗体，其中该抗体的恒定区来自人。也可以根据本领域熟知的方法来制备人源化或完全人形式的抗体(参见例如Winter的美国专利号5,565,332)。人源化可通过各种方法实现，该各种方法包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)CDR移植到人(例如受体抗体)架构和恒定区上，该架构和恒定区有或没有保留关键架构残基(例如对于保持良好的抗原结合亲和力或抗体功能来说重要的关键架构残基)，(b)仅将非人特异性决定区(SDR或a-CDR；对抗体-抗原相互作用至关重要的残基)移植到人架构和恒定区上，或者(c)移植整个非人可变结构域，但通过替换表面残基而用人样区段“隐藏”它们。人源化抗体及其制备方法在例如Almagro and Fransson,Front Biosci 13,1619-1633(2008)中综述，并且进一步描述于例如Riechmann等人,Nature332,323-329(1988)；Queen等人,Proc Natl Acad SciUSA 86,10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Jones等人,Nature 321,522-525(1986)；Morrison等人,Proc Natl Acad Sci 81,6851-6855(1984)；Morrison and Oi,Adv Immunol 44,65-92(1988)；Verhoeyen等人,Science239,1534-1536(1988)；Padlan,Molec Immun 31(3),169-217(1994)；Kashmiri等人,Methods 36,25-34(2005)(描述了SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol Immunol 28,489-498(1991)(描述了“表面再塑”)；Dall’Acqua等人,Methods 36,43-60(2005)(描述了“FR改组”)；以及Osbourn等人,Methods 36,61-68(2005)和Klimka等人,Br JCancer 83,252-260(2000)(描述了用于FR改组的“指导选择”方法)中。可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体和人可变区。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel,Curr Opin Pharmacol5,368-74(2001)和Lonberg,Curr Opin Immunol 20,450-459(2008)中。人可变区可以形成通过杂交瘤方法制备的人单克隆抗体的一部分并衍生自该抗体(参见，例如MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。也可以通过以下方式来制备人抗体和人可变区：将免疫原施用于转基因动物，该转基因动物已被修饰以产生具有对抗原激发作出应答的人可变区的完整人抗体或完整抗体(参见例如Lonberg,Nat Biotech 23,1117-1125(2005))。也可通过以下方式来产生人抗体和人可变区：分离选自人来源的噬菌体展示文库的Fv克隆可变区序列(参见，例如Hoogenboom等人Methods in Molecular Biology 178,1-37(O’Brien等人,ed.,HumanPress,Totowa,NJ,2001)；以及McCafferty等人,Nature 348,552-554；Clackson等人,Nature 352,624-628(1991))。噬菌体通常将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。通过噬菌体展示制备用于免疫缀合物的抗原结合部分的详细描述可见于PCT公开号WO2011/020783所附的实例中。
在某些实施例中，根据例如PCT公开号WO 2011/020783(参见与亲和力成熟有关的实例)或美国专利申请公开号2004/0132066中公开的方法将可用于本发明的抗原结合部分工程化以具有增强的结合亲和力，这些专利的全部内容以引用方式特此并入。本发明的免疫缀合物与特定抗原决定簇结合的能力可以经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术(例如表面等离子体共振技术(在BIACORE T100系统上分析)(Liljeblad等人,Glyco J 17,323-329(2000))以及传统的结合测定法(Heeley,EndocrRes 28,217-229(2002))来测量。竞争测定法可用于鉴别与参考抗体竞争结合至特定抗原的抗体、抗体片段、抗原结合结构域或可变结构域，例如与L19抗体竞争结合至纤连蛋白的外结构域B(EDB)的抗体。在某些实施例中，此类竞争抗体与参考抗体所结合的相同表位(例如，线性或构象表位)结合。关于映射抗体所结合的表位的详细示例性方法提供于Methodsin Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中的Morris(1996)“EpitopeMapping Protocols”中。在示例性竞争测定法中，将固定化的抗原(例如EDB)在包含与抗原结合的第一标记抗体(例如，L19抗体)和正在检测其与第一抗体竞争结合至抗原的能力的第二未标记抗体的溶液中孵育。该第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化抗原在包含第一标记抗体而非包含第二未标记抗体的溶液中孵育。在容许第一抗体与抗原结合的条件下孵育之后，去除过量未结合的抗体，并且测量与固定化抗原缔合的标记的量。如果相对于对照样品，测试样品中与固定化的抗原缔合的标记的量大幅降低，则表明该第二抗体在与该第一抗体竞争以结合至抗原。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:ALaboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
可能需要对本发明的突变型IL-2突变体或免疫缀合物进行进一步的化学修饰。例如，通过与基本上直链的聚合物(例如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG))缀合，可以改善免疫原性和短半衰期的问题(参见例如WO 87/00056)。
如本文所述制备的IL-2突变体和免疫缀合物可通过本领域已知的技术纯化，这些技术诸如高效液相色谱、离子交换色谱、凝胶电泳、亲和色谱、尺寸排阻色谱等。用于纯化特定蛋白质的实际条件将部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。对于亲和色谱纯化，可以使用与突变型IL-2多肽或免疫缀合物结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，可以使用特异性结合突变型IL-2多肽的抗体。对于本发明免疫缀合物的亲和色谱纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。例如，基本上如实例中所述，可使用顺序蛋白A或G亲和色谱和尺寸排阻色谱来分离免疫缀合物。突变型IL-2多肽和其融合蛋白的纯度可以通过多种众所周知的分析方法中的任一种来确定，这些分析方法包括凝胶电泳法、高压液相色谱法等。例如，如实例中所述表达的重链融合蛋白显示为完整且正确组装的，如通过还原SDS-PAGE所证明(参见例如图14)。对应于免疫球蛋白轻链和重链/IL-2融合蛋白的预测分子量，在约Mr 25,000和Mr 60,000处分辨出两条带。
测定
可通过本技术领域中已知的各种测定，对本文所提供的突变型IL-2多肽和免疫缀合物的物理/化学特性和/或生物活性来进行鉴别、筛选或表征。
亲和力测定
突变型或野生型IL-2多肽对各种形式的IL-2受体的亲和力可以根据实例中阐述的方法，通过表面等离子体共振(SPR)，使用诸如BIAcore仪器(GE Healthcare)的标准仪器，和诸如可通过重组表达获得的受体亚基来测定(参见例如Shanafelt等人,NatureBiotechnol 18,1197-1202(2000))。重组IL-2受体β/γ-亚基异二聚体可以通过使每个亚基与通过杵臼技术修饰的抗体Fc结构域单体融合来产生(参见例如美国专利号5,731,168)，以促进适当的受体亚基/Fc融合蛋白的异二聚化(参见SEQ ID NO 102和103)。或者，可以使用已知表达一种或另一种该形式的受体的细胞系来评估IL-2突变体对不同形式的IL-2受体的结合亲和力。下文和下述实例描述用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施例。根据一个实施例，在25℃下使用T100机器(GE Healthcare)通过表面等离子体共振来测量KD，其中IL-2受体固定在CM5芯片上。简而言之，根据供应商说明书，用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化的葡聚糖生物感测器芯片(CM5,GE Healthcare)。将重组IL-2受体用10mM乙酸钠(pH 5.5)稀释至0.5-30μg/ml，之后以10μl/分钟的流速注射，以获得约200-1000(对于IL-2Rα-亚基)或500-3000(对于IL-2Rβγ杵臼异二聚体)响应单位(RU)的偶联蛋白。注射IL-2受体之后，注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。对于动力学测量，将突变型IL-2多肽或免疫缀合物的四倍系列稀释液(范围在约0.3nM至300nM之间)在25℃以约30μl/min的流速注入到HBS-EP+(GE Healthcare，10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％表面活性剂P20，pH 7.4)中。使用简单的一对一朗缪尔结合模型(/>T100 EvaluationSoftware 1.1.1版)，通过同时拟合缔合与解离传感图来计算缔合速率(kon)与解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)计算为比率koff/kon。参见例如Chen等人，J Mol Biol 293,865-881(1999)。
本发明的免疫缀合物与Fc受体的结合可以例如通过ELISA或通过表面等离子体共振(SPR)使用标准仪器(诸如BIAcore仪器(GE Healthcare))容易地确定，并且Fc受体诸如可以通过重组表达获得。可替代地，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系(诸如表达FcγIIIa受体的NK细胞)来评估Fc结构域或包含Fc结构域的免疫缀合物对Fc受体的结合亲和力。根据一个实施例，在25℃下使用T100机器(GE Healthcare)通过表面等离子体共振来测量KD，其中Fc受体固定在CM5芯片上。简而言之，根据供应商说明书，用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化的葡聚糖生物感测器芯片(CM5,GE Healthcare)。将重组Fc受体用10mM乙酸钠pH 5.5稀释至0.5-30μg/ml，之后以10μl/分钟的流速进行注射以获得约100-5000响应单位(RU)的偶联蛋白。注射Fc受体之后，注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。对于动力学测量，将免疫缀合物的三倍至五倍系列稀释液(范围在约0.01nM至300nM之间)在25℃以约30-50μl/min的流速注入到HBS-EP+(GE Healthcare，10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％表面活性剂P20，pH 7.4)中。使用简单的一对一朗缪尔结合模型(/>T100EvaluationSoftware 1.1.1版)，通过同时拟合缔合与解离传感图来计算缔合速率(kon)与解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)计算为比率koff/kon。参见例如Chen等人，J Mol Biol 293,865-881(1999)。
活性测定
IL-2突变体与IL-2受体结合的能力可以通过测定受体结合下游发生的免疫活化作用来间接测量。
在一个方面，提供了用于鉴别具有生物活性的突变型IL-2多肽的测定。生物活性可包括例如，诱导携带IL-2受体的T细胞和/或NK细胞增殖的能力，在携带IL-2受体的T细胞和/或NK细胞中诱导IL-2信号传导的能力，使NK细胞产生干扰素(IFN)-γ作为次级细胞因子的能力，降低的诱导外周血单核细胞(PBMC)对次级细胞因子(特别是IL-10和TNF-α)进行加工(elaboration)的能力，降低的诱导T细胞中细胞凋亡的能力，诱导肿瘤消退和/或提高存活率的能力以及降低的体内毒性概况，尤其降低的血管通透性。还提供了在体内和/或体外具有此类生物活性的突变型IL-2多肽。
在某些实施例中，测试本发明的突变型IL-2多肽的此类生物活性。用于测定IL-2的生物活性的多种方法是本领域中熟知的，并且许多这些方法的细节还公开于本文所附的实例中。这些实例提供合适的测定法以用于测试本发明的IL-2突变体通过NK细胞产生IFN-γ的能力。将培养的NK细胞与本发明的突变型IL-2多肽或免疫缀合物一起孵育，并随后通过ELISA测量培养基中的IFN-γ浓度。
IL-2诱导的信号传导会诱导多种信号传导途径，并涉及JAK(Janus激酶)和STAT(信号转导和转录活化因子)信号传导分子。IL-2与受体β-亚基和γ-亚基的相互作用导致受体以及JAK1和JAK3的磷酸化，其分别与β-亚基和γ-亚基相关联。随后STAT5与磷酸化受体缔合，并在关键的酪氨酸残基上进行自身磷酸化。这导致STAT5从受体解离、STAT5二聚化和STAT5二聚体易位到细胞核，在此处，这些二聚体促进靶基因的转录。因此可以例如通过测量STAT5的磷酸化来评定突变型IL-2多肽诱导经由IL-2受体进行信号传导的能力。该方法的细节在实例中公开。用本发明的突变型IL-2多肽或免疫缀合物处理PBMC，并通过流式细胞术测定磷酸化STAT5的水平。
响应于IL-2的T细胞或NK细胞的增殖可以通过将从血液中分离的T细胞或NK细胞与本发明的突变型IL-2多肽或免疫缀合物一起孵育，之后测定经处理细胞的裂解物中的ATP含量来测量。在处理之前，可以用植物血凝素(PHA-M)预刺激T细胞。实例中描述的这种测定允许对活细胞的数量进行灵敏定量，然而本领域已知有许多合适的替代测定(例如，[3H]-胸苷掺入测定、Cell Titer Glo ATP测定、阿尔玛蓝(Alamar Blue)测定、WST-1测定、MTT测定)。
实例中还提供了用于确定T细胞和AICD凋亡的测定，其中在与本发明的突变型IL-2多肽或免疫缀合物一起孵育后，用诱导凋亡的抗体处理T细胞，并通过对磷脂酰丝氨酸/膜联蛋白暴露的流式细胞术检测对凋亡细胞进行定量。其他测定是本领域中已知的。
可以在本领域中已知的多种动物肿瘤模型中评定突变型IL-2对肿瘤生长和存活的影响。例如，可以将人癌细胞系的异种移植物植入免疫缺陷小鼠，并用本发明的突变型IL-2多肽或免疫缀合物处理，如实例中所述。
本发明的突变型IL-2多肽和免疫缀合物的体内毒性可以基于死亡率、生活观察(不良作用的可见症状，例如行为、体重、体温)以及临床和解剖病理学(例如血液化学值测量和/或组织病理学分析)来确定。
可以在预处理血管通透性动物模型中检查由IL-2处理诱导的血管通透性。通常，将本发明的IL-2突变体或免疫缀合物施用于合适的动物，例如小鼠，且稍后向动物注射血管渗漏报告分子，该分子从血管系统的散播反映了血管通透性的程度。血管渗漏报告分子优选足够大以显示在野生型形式的IL-2用于预处理情况下的通透性。血管渗漏报告分子的实例可以是血清蛋白，诸如白蛋白或免疫球蛋白。血管渗漏报告分子优选地被可检测地标记，诸如用放射性同位素标记以促进对分子组织分布的定量测定。可以针对存在于多种内部身体器官(诸如肝、肺等)以及肿瘤(包括异种移植的肿瘤)中的任一者中的血管，测量血管通透性。肺是用于测量全长IL-2突变体的血管通透性的首选器官。
组合物、配方和施用途径
在进一步的方面，本发明提供包含本文提供的突变型IL-2多肽或免疫缀合物中的任一者的药物组合物，其例如用于以下治疗方法中的任一种。在一个实施例中，药物组合物包含本文提供的突变型IL-2多肽或免疫缀合物中的任一者，以及药用载体。在另一实施例中，药物组合物包含本文提供的突变型IL-2多肽或免疫缀合物中的任一者，以及至少一种额外治疗剂，例如如下所述。
进一步提供一种以适于体内施用的形式产生本发明的突变型IL-2多肽或免疫缀合物的方法，该方法包括(a)获得根据本发明的突变型IL-2多肽或免疫缀合物，以及(b)调配突变型IL-2多肽或免疫缀合物与至少一种药用载体，由此调配突变型IL-2多肽或免疫缀合物制剂以用于体内施用。
本发明的药物组合物包含治疗有效量的溶于或分散于药用载体中的一种或多种突变型IL-2多肽或免疫缀合物。短语“药学上或药理学上可接受的”是指分子实体和组合物在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，即当视情况而定施用于动物(诸如例如人)时不产生不利的、过敏的或其他不良反应。含有至少一种突变型IL-2多肽或免疫缀合物和任选的额外活性成分的药物组合物的制备将鉴于本公开而为本领域的技术人员已知，如由Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版Mack Printing Company,1990所示例，该文献以引用方式并入本文。此外，对于动物(例如，人)施用，应理解制备物应满足FDA生物标准办公室或其他国家/地区相应当局所要求的无菌性、产热原性、一般安全性和纯度标准。优选的组合物是冻干制剂或水溶液。示例性IL-2组合物描述于美国专利号4,604,377和4,766,106中。如本文所使用的，“药用载体”包括任何和所有的溶剂、缓冲液、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、抗氧化剂、蛋白质、药物、药物稳定剂、聚合物、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料，类似物质以及它们的组合，如本领域普通技术人员应已知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company,1990，第1289-1329页，该文献通过引用并入本文)。除了任何常规载体与活性成分不相容的情况之外，所述载体在治疗或药物组合物中的用途是可预期的。
组合物可以包含不同类型的载体，这取决于其是以固体、液体还是气雾剂形式施用，以及对于诸如注射的施用途径是否需要是无菌的。本发明的突变型IL-2多肽或免疫缀合物(和任何额外的治疗剂)可以静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、脾内、肾内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、肿瘤内、肌肉内、腹膜内、皮下、结膜下、囊内、黏膜内、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局部、通过吸入(例如气溶胶吸入)、注射、输液、连续输液、局部输液直接沐浴靶细胞、经由导管、经由灌洗、以乳膏形式、以脂质组合物(例如脂质体)形式施用，或通过本领域普通技术人员已知的其他方法或前述的任何组合施用(参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版MackPrinting Company,1990，其以引用方式并入本文)。肠胃外施用，特别是静脉内注射，最常用于施用多肽分子，诸如本发明的突变型IL-2多肽和免疫缀合物。
肠胃外组合物包括经设计用于通过注射(例如，皮下、皮内、病灶内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射)施用的那些组合物。对于注射，本发明的突变型IL-2多肽和免疫缀合物可以在水溶液中调配，优选在生理上相容的缓冲液(诸如Hanks溶液、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理盐水缓冲液)中调配。溶液可含有配制剂(formulatoryagent)，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可替代地，突变型IL-2多肽和免疫缀合物可以是粉末形式，以用于在使用前用合适的媒介物(例如无菌无热原水)重构。通过根据需要将本发明的IL-2多肽或免疫缀合物以所需的量与下面列举的各种其他成分一起掺入适当的溶剂中来制备无菌可注射溶液。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基础分散介质和/或其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液、悬浮液或乳液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥或冻干技术，该真空干燥或冻干技术产生来自先前无菌过滤的液体介质的活性成分加上任何附加所需成分的粉末。如果需要的话，液体介质应适当缓冲，并且在注射之前应首先使用足够的盐水或葡萄糖来使液体稀释剂等渗。该组合物必须是在制造和贮存条件下稳定的，并且保存为抗诸如细菌和真菌等微生物的污染作用。应当理解，内毒素污染应以例如低于0.5ng/mg蛋白质的安全水平保持最低。合适的药用载体包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的化合物，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、葡聚糖等。任选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂或增大化合物溶解度的试剂，以允许制备高浓度溶液。另外，活性化合物的悬浮液可以制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，诸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯；或脂质体。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；包埋在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或包埋在粗乳液中。此类技术在Remington'sPharmaceutical Sciences(第18版，Mack Printing Company,1990)中公开。可以制备缓释制备物。缓释制备物的合适示例包括含有多肽的固态疏水聚合物的半透性基质，该基质是例如膜或微胶囊等成型制品的形式。在特定实施例中，可注射组合物的延长吸收可以通过在该组合物中使用延迟吸收的试剂(诸如例如单硬脂酸铝、明胶或它们的组合)来实现。
除了先前描述的组合物之外，免疫缀合物还可以配制成贮库制剂。此类长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内植入)或通过肌内注射施用。因此，例如，突变型IL-2多肽和免疫缀合物可以用合适的聚合或疏水材料调配(例如作为可接受油中的乳液)或用离子交换树脂调配，或调配为微溶的衍生物，例如调配为微溶盐。
包含本发明的突变型IL-2多肽和免疫缀合物的药物组合物可借助于常规混合、溶解、乳化、包封、包埋或冻干工艺制造。药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式调配，这些载体、稀释剂、赋形剂或助剂有助于将蛋白质加工成可以在药学上使用的制剂。适当的配方取决于所选择的施用途径。
突变型IL-2多肽和免疫缀合物可以调配成游离酸或碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐是基本上保留游离酸或碱的生物活性的盐。这些药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如与蛋白质组合物的游离氨基形成的酸加成盐，或与无机酸(诸如盐酸或磷酸)或有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的酸加成盐。用游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或者有机碱，诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。与相应的游离碱形式相比，药用盐倾向于更易溶于水性和其他质子溶剂中。
治疗方法和组合物
本文提供的任何突变型IL-2多肽和免疫缀合物可用于治疗方法。本发明的突变型IL-2多肽和免疫缀合物可用作免疫治疗剂，例如用于治疗癌症。
为了用于治疗方法中，本发明的突变型IL-2多肽和免疫缀合物将以符合良好医学实践的方式配制、投配和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。
本发明的突变型IL-2多肽和免疫缀合物可用于治疗对宿主免疫系统的刺激是有益的疾病状态，特别是需要增强的细胞免疫应答的病状。这些疾病状态可包括宿主免疫应答不足或缺乏的疾病状态。可以施用本发明的突变型IL-2多肽或免疫缀合物的疾病状态包含例如其中细胞免疫应答会是特异性免疫的关键机制的肿瘤或感染。可以使用本发明的IL-2突变体的具体疾病状态包括癌症，例如肾细胞癌或黑色素瘤；免疫缺陷，特别是HIV阳性患者、免疫抑制患者、慢性感染等。本发明的突变型IL-2多肽或免疫缀合物可以本身或以任何合适的药物组合物形式施用。
在一个方面，提供了用作药物的本发明的突变型IL-2多肽和免疫缀合物。在其他方面，提供了用于治疗疾病的本发明的突变型IL-2多肽和免疫缀合物。在某些实施例中，提供了用于治疗方法的本发明的突变型IL-2多肽和免疫缀合物。在一个实施例中，本发明提供如本文所述的突变型IL-2多肽或免疫缀合物，以用于治疗有此需要的个体的疾病。在某些实施例中，本发明提供突变型IL-2多肽或免疫缀合物以用于治疗患有疾病的个体的方法中，该方法包括向个体施用治疗有效量的突变型IL-2多肽或免疫缀合物。在某些实施例中，待治疗的疾病是增殖性疾病。在优选实施例中，该疾病是癌症。在某些实施例中，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如果待治疗的疾病是癌症，则使用抗癌剂。在进一步的实施例中，本发明提供突变型IL-2多肽或免疫缀合物以用于刺激免疫系统。在某些实施例中，本发明提供突变型IL-2多肽或免疫缀合物以用于刺激个体的免疫系统的方法中，该方法包括向个体施用有效量的突变型IL-2多肽或免疫缀合物以刺激免疫系统。根据任何上述实施例的“个体”是哺乳动物，优选人。根据任何上述实施例的“对免疫系统的刺激”可以包括以下项中的任何一种或多种：免疫功能的普遍增强、T细胞功能的增强，B细胞功能的增强、淋巴细胞功能的恢复、IL-2受体表达的增多、T细胞反应性的增强，自然杀伤细胞活性或淋巴因子活化杀伤(LAK)细胞活性的增强，等等。
在进一步的方面，本发明提供本发明的突变型IL-2多肽或免疫缀合物用于制造或制备用于治疗有此需要的个体的疾病的药物的用途。在一个实施例中，所述药物用于治疗疾病的方法中，所述方法包括向具有所述疾病的个体施用治疗有效量的所述药物。在某些实施例中，待治疗的疾病是增殖性疾病。在优选实施例中，该疾病是癌症。在一个此类实施例中，该方法进一步包括向个体施用治疗有效量的至少一种额外的治疗剂，例如如果待治疗的疾病是癌症，那么使用抗癌剂。在另一实施例中，所述药物用于刺激免疫系统。在进一步的实施例中，该药物用于刺激个体的免疫系统的方法中，该方法包括向个体施用有效量的药物以刺激免疫系统。根据上述实施例中的任一实施例的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。根据任何上述实施例的“对免疫系统的刺激”可以包括以下项中的任何一种或多种：免疫功能的普遍增强、T细胞功能的增强，B细胞功能的增强、淋巴细胞功能的恢复、IL-2受体表达的增多、T细胞反应性的增强，自然杀伤细胞活性或淋巴因子活化杀伤(LAK)细胞活性的增强，等等。
在另一方面，本发明提供用于治疗个体疾病的方法，该方法包括向所述个体施用治疗有效量的本发明的突变型IL-2多肽或免疫缀合物。在一个实施例中，向所述个体施用组合物，该组合物包含药用形式的本发明的突变型IL-2多肽或免疫缀合物。在某些实施例中，待治疗的疾病是增殖性疾病。在优选实施例中，该疾病是癌症。在某些实施例中，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如果待治疗的疾病是癌症，则使用抗癌剂。在另一方面，本发明提供刺激个体的免疫系统的方法，该方法包括向个体施用有效量的突变型IL-2多肽或免疫缀合物以刺激免疫系统。根据上述实施例中的任一实施例的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。根据任何上述实施例的“对免疫系统的刺激”可以包括以下项中的任何一种或多种：免疫功能的普遍增强、T细胞功能的增强，B细胞功能的增强、淋巴细胞功能的恢复、IL-2受体表达的增多、T细胞反应性的增强，自然杀伤细胞活性或淋巴因子活化杀伤(LAK)细胞活性的增强，等等。
应当理解，任何上述治疗方法都可以使用本发明的免疫缀合物代替或补充突变型IL-2多肽来进行。
在某些实施例中，待治疗的病症是增殖性疾病，优选是癌症。癌症的非限制性实例包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌，以及肾癌。可以使用本发明的突变型IL-2多肽或免疫缀合物治疗的其他细胞增殖病症包括但不限于位于以下部位中的肿瘤：腹部、骨骼、乳房、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼睛、头颈部、神经系统(中枢和外周神经系统)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部以及泌尿生殖系统。还包括癌前病症或病变和癌转移。在某些实施例中，癌症选自由以下项组成的组：肾细胞癌、皮肤癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌。类似地，其他细胞增殖病症也可以通过本发明的突变型IL-2多肽和免疫缀合物来治疗。此类细胞增殖病症的实例包括但不限于：高丙种球蛋白血症、淋巴增生性病症、副蛋白血症、紫癜、结节病、塞扎里综合征(Sezary Syndrome)、华氏巨球蛋白血症(Waldenstron's Macroglobulinemia)、戈谢病(Gaucher's Disease)、组织细胞增生症以及位于上文所列的器官系统中的除瘤形成之外的任何其他细胞增殖疾病。在另一实施例中，该疾病与自身免疫、移植排斥、创伤后免疫反应和传染性疾病(例如HIV)有关。更具体地，突变型IL-2多肽和免疫缀合物可用于消除参与以下的细胞，免疫细胞介导的病症，包括淋巴瘤；自身免疫、移植排斥、移植物抗宿主病、缺血和中风。技术人员容易认识到，在许多情况下，突变型IL-2多肽或免疫缀合物可能不提供治愈，而可能仅提供部分益处。在一些实施例中，具有一些益处的生理变化也被认为是治疗上有益的。因此，在一些实施例中，提供生理变化的突变型IL-2多肽或免疫缀合物的量被认为是“有效量”或“治疗有效量”。需要治疗的受试者、患者或个体通常是哺乳动物，更特别地是人。
本发明的免疫缀合物也可用作诊断试剂。免疫缀合物与抗原决定簇的结合可以通过使用对IL-2多肽具有特异性的二抗容易地检测到。在一个实施例中，二抗和免疫缀合物有助于检测免疫缀合物与位于细胞或组织表面上的抗原决定簇的结合。
在一些实施例中，将有效量的本发明的突变型IL-2多肽或免疫缀合物施用于细胞。在其他实施例中，将治疗有效量的本发明的突变型IL-2多肽或免疫缀合物施用于个体以治疗疾病。
为预防或治疗疾病，本发明的突变型IL-2多肽或免疫缀合物的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他额外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病类型、施用途径、患者的体重、多肽的类型(例如未缀合的IL-2或免疫缀合物)、疾病的严重程度和病程、抗体是出于预防目的还是治疗目的施用、既往或同时进行的治疗干预、患者的临床病史和对突变型IL-2多肽或免疫缀合物的反应，以及主治医师的判断。在任何情况下，负责施用的执业者将针对个体受试者来确定组合物中活性成分的浓度和适当剂量。本文考虑了各种投配时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。
本发明的突变型IL-2多肽和免疫缀合物将通常以有效实现预期目的的量使用。为用于治疗或预防疾病病症，将本发明的突变型IL-2多肽和免疫缀合物或其药物组合物以治疗有效量施用或施加。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容。
对于全身施用，治疗有效剂量可以最初根据体外测定(诸如细胞培养物测定)来进行估计。可以随后在动物模型中配制剂量，以实现包括如在细胞培养中测定的IC50循环浓度范围。此类信息可用于更准确地确定对人类的有用剂量。
初始剂量也可以使用本领域公知的技术，根据体内数据(例如动物模型)来估计。本领域的普通技术人员可以基于动物数据来容易地优化对人的施用。
在局部施用或选择性摄取的情况下，免疫缀合物的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员将能够在无需过多实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。
本文所述的治疗有效剂量的突变型IL-2多肽或免疫缀合物将通常在不会引起实质毒性的情况下提供治疗益处。IL-2突变体或免疫缀合物的毒性和治疗功效可通过标准药学方法在细胞培养或实验动物中测定。细胞培养测定和动物研究可以用于测定LD50(致死群体的50％的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数，所述治疗指数可以表示为比率LD50/ED50。表现出大治疗指数的IL-2突变体和免疫缀合物是优选的。在一个实施例中，根据本发明的突变型IL-2多肽或免疫缀合物表现出高治疗指数。从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制适用于人类的一系列剂量。剂量优选在包括几乎没有毒性或没有毒性的ED50的循环浓度的范围内。剂量可以取决于多种因素而在该范围内变化，所述多种因素为例如所采用的剂型、所利用的施用途径、受试者的病症等。确切的配方、施用途径和剂量可以由个体医师根据患者的状况进行选择。(参见例如Fingl等人，1975，在：The Pharmacological Basis of Therapeutics，第1章，第1页中，该文献的全部内容以引用方式并入本文中)。
用本发明的IL-2突变体或免疫缀合物治疗的患者的主治医师应知道由于毒性、器官功能障碍等而如何以及何时终止、中断或调节施用。相反地，如果临床反应不充分(排除毒性)，则主治医师也会知道将治疗调节到更高水平。在目标疾患的管理中施用的剂量的大小将随着待治疗病症的严重程度、施用途径等而变化。例如，可以部分地通过标准预后评估方法来评估病症的严重性。此外，剂量和可能的剂量频率也将根据个体患者的年龄、体重和应答而变化。
突变型IL-2多肽或包含所述多肽的免疫缀合物的最大治疗剂量可分别从用于野生型IL-2或包含野生型IL-2的免疫缀合物的最大治疗剂量增加。
其他药剂和治疗
根据本发明的突变型IL-2多肽和免疫缀合物可以与疗法中的一种或多种其他药剂组合施用。例如，本发明的突变型IL-2多肽或免疫缀合物可以与至少一种额外的治疗剂共同施用。术语“治疗剂”包括被施用以治疗需要这种治疗的个体的症状或疾病的任何药剂。此类附加治疗剂可包含适合于所治疗的具体适应症的任何活性成分，优选地是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。在某些实施例中，另外的治疗剂是免疫调节剂、细胞生长抑制剂、细胞粘附抑制剂、细胞毒性剂、细胞凋亡激活剂，或增加细胞对凋亡诱导剂的敏感性的试剂。在一个特定实施例中，另外的治疗剂是抗癌剂，例如微管破坏剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、DNA嵌入剂、烷化剂、激素疗法、激酶抑制剂、受体拮抗剂、肿瘤细胞凋亡活化剂，或抗血管生成剂。
此类其他药剂适当地以对预期目的有效的量组合存在。此类其他药剂的有效量取决于所用突变型IL-2多肽或免疫缀合物的量、病症或治疗的类型以及上面讨论的其他因素。突变型IL-2多肽和免疫缀合物通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以本文所述剂量的约1％至99％使用，或以经验地/临床上确定为合适的任何剂量和任何途径使用。
上文所指出的此类组合疗法涵盖联合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或不同的组合物中)和单独施用，在单独施用的情况下，本发明的突变型IL-2多肽或免疫缀合物的施用可以在施用额外的治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后进行。本发明的突变型IL-2多肽和免疫缀合物也可以与放射疗法组合使用。
制品
在本发明的另一方面中，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上述疾患的物质。该制品包括容器和在该容器上或与该容器相关的标签或包装插页(packageinsert)。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉注射(IV)溶液袋等。该容器可以由诸如玻璃或塑料等多种材料形成。所述容器容纳组合物，该组合物本身或与另一种组合物组合能够有效地用于治疗、预防和/或诊断病症，并且所述容器可以具有无菌进入口(例如，所述容器可以是具有能够被皮下注射针刺穿的塞子的静脉注射溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的突变型IL-2多肽。标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选择的病症。此外，制品可包括(a)第一容器，该第一容器中含有组合物，其中该组合物包含本发明的突变型IL-2多肽；以及(b)第二容器，该第二容器中含有组合物，其中该组合物包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂。本发明的此实施例中的制品可以进一步包含包装插页，该包装插页指示组合物可用于治疗特定病症。替代性地或附加地，制品可以进一步包含第二(或第三)容器，该第二(或第三)容器包含药用缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。制品可以进一步包括从商业和用户角度所需的其他物质，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
应当理解，任何上述制品可以包括本发明的免疫缀合物来代替或补充突变型IL-2多肽。
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实例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施例。
实例1
抗原的制备和IL2v的克隆
重组DNA技术
使用标准方法来操纵DNA，如在Sambrook,J.等人，Molecular cloning:Alaboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold spring Harbor,NewYork,1989中所述。根据制造商的说明来使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在以下参考文献中给出：Kabat,E.A.等人，(1991)Sequencesof Proteins of Immunological Interest，第五版，NIH Publication No 91-3242。
基因合成
在需要时，通过使用适当模板进行PCR生成所需的基因区段，或在Geneart AG(Regensburg,Germany)处通过自动化基因合成从合成寡核苷酸和PCR产物合成所需的基因区段。将侧接有单个限制性内切酶切割位点的基因区段克隆到标准克隆/测序载体中。从转化的细菌中纯化出质粒DNA，并通过紫外光谱法确定浓度。通过DNA测序来确认亚克隆基因片段的DNA序列。设计具有合适限制性位点的基因区段，以允许亚克隆到相应的表达载体中。
抗原表达载体的克隆
为了生成由β亚基和γ亚基组成的IL2受体构建体(IL2Rbg)，生成并表达了基于Fc的杵臼融合构建体。当IL2Rβ单元的细胞外结构域(ECD)与Fc杵链的N末端融合时，γ单元的ECD与Fc臼链的N末端融合(SEQ ID NO 2和3)。avi标签(GLNDIFEAQKIEWHE)与Fc杵链的C末端融合，允许在与BirA生物素连接酶共表达期间进行特异性生物素化。图1显示构建体的示意图。
在真核细胞中生产和纯化Fc融合构建体
IL2R(bg)-Fc构建体(SEQ ID NO 2和3)通过瞬时转染HEK293EBNA细胞生成。对细胞进行离心，并由经过预热的CD CHO培养基(Thermo Fisher，目录号10743029)代替原培养基。将表达载体在CD CHO培养基中混合，加入PEI(聚乙烯亚胺，Polysciences，Inc，目录号23966-1)，将溶液涡旋混合，并且在室温下孵育10分钟。然后，将细胞(2Mio/ml)与载体/PEI溶液混合，将其转移至烧瓶中，并且置于振荡培养箱中，在5％ CO2的气氛下于37℃下孵育3小时。同时共转染的编码生物素连接酶BirA的质粒允许在体内进行avi标签特异性生物素化。孵育后，加入含有补充剂(占总体积的80％)的Excell培养基(W.Zhou和A.Kantardjieff，Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing，DOI：10.1007/978-3-642-54050-9；2014)。转染后1天，加入补充剂(饲料，占总体积的12％)。7天后，通过离心和随后的过滤(0.2μm过滤器)收获细胞上清液。
参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简言之，利用蛋白A亲和色谱法(平衡缓冲液：20mM柠檬酸钠，20mM磷酸钠，pH7.5；洗脱缓冲液：20mM柠檬酸钠，pH3.0)从经过滤的细胞培养上清液中纯化含Fc的蛋白质。在pH 3.0下实现洗脱，随后立即中和样品的pH。通过离心(MilliporeULTRA-15(Art.Nr.:UFC903096))浓缩蛋白质，并利用尺寸排阻色谱法在20mM组氨酸、140mM氯化钠(pH 6.0)中将聚集蛋白质与单体蛋白质分离。通过添加链霉亲和素来确认生物素化。所得的生物素化蛋白/链霉亲和素复合物在分析SEC色谱图中显示出保留时间的变化。
将IL2v克隆到噬菌粒载体中
将编码IL2v的DNA序列(SEQ ID NO:4)通过PCR扩增，并使用限制酶NcoI/NotI克隆到我们的噬菌粒载体中。该克隆导致细菌PelB信号序列的转录/翻译，随后是IL2v序列以及C末端融合的His标签和Flag标签。标签和编码p3蛋白的噬菌体衍生DNA序列之间的琥珀终止密码子允许M13噬菌体上展示的可溶性IL2v和IL2v二者的表达。
在pH 7.4和pH 6下评估IL2v与IL2R的结合
为了评估IL2v在ELISA中是否表现出任何pH依赖性行为，通过对呈指数生长的携带先前生成的IL2v噬菌粒的TG1细菌进行IPTG诱导来生成含有可溶性IL2v的细菌上清液。通过离心收集细菌上清液，并使用Bis-Tris缓冲液(最终浓度：50mM BisTris、140mM NaCL)将pH调整至pH6或pH 7.4。将上清液在中性抗生物素蛋白板中孵育，这些板先前用生物素化IL2R(bg)-Fc构建体包被并用BSA阻断。虽然在1h后使用Bis-Tris洗涤缓冲液在各自的pH 6或7.4(50mM BisTris、140mM NaCL、0.1％Tween)下进行大量洗涤，但所有后续步骤均在pH6下进行以避免任何pH依赖性二次效应。使用抗Flag/HRP二抗经由Flag标签检测IL2v与IL2R(bg)-Fc构建体的结合。两种条件(pH 6与pH 7.4)之间的信号比较显露出同样强烈的信号，结论是亲本IL2v蛋白对其受体显示出pH依赖性行为(图2)。
实例2
基于IL2v的pH依赖性IL2v文库设计
IL-2的晶体结构(PDB代码：2b5i和5m5e)用作基础。在PyMol中分析了IL-2与IL2受体β和γ链(IL2Rbg)之间的界面。特别强调了携带具有pH可滴定特性的侧链的受体(特别是氢键供体或受体)的氨基酸。位于受体亚基上那些pH可滴定残基<8埃半径内的IL2残基被考虑用于pH工程化。由于IL2先前曾展示在噬菌体上(Buchli等人,Arch BiochemBiophys1997；339:79–84；Vispo等人,Immunotechnology Int J Immunol Eng1997；3:185–93)，因此将类似的方法应用于引入pH依赖性结合特性。
我们预先确认IL2v(SEQ ID NO:4)不显示内在的pH依赖性结合特性。因为这会影响文库设计和噬菌体选择方案。图2显示IL2v在pH 7.4和6.0下在体外IL2Rbg结合方面表现相同。相比之下，Fallon及其同事已鉴别出IL2的pH依赖性，以致IL2在pH 7.2下相较于在pH6下以更高的亲和力结合(Fallon等人,J.Biol.Chem.275,6790–6797(2000))。
生成噬菌体展示的初始组合文库，其包括以下位置处的随机氨基酸：K8、Q11、L12、L19、D20、M23、R81、D84、S87、N88、V91、E95、R120、T123、Q126、S130、T133(编号如同已切割掉信号肽的UniProt条目P60568)。以如下方式选择随机化，使得所得残基可能以pH依赖性方式形成连到IL2受体链的氢键或盐桥。
生成两个pH依赖性IL2v文库
为了基于IL2v序列和受体亚基β和γ的界面中的随机化生成两个噬菌体展示文库，合成包含随机化IL2v序列且两侧为限制性位点NcoI和NotI的相应DNA片段。将片段与同样切割的亲本IL2v受体噬菌粒载体一起用NcoI/NotI消化。将文库插入物与噬菌粒载体在4℃下连接过夜。使用纯化的连接产物进行细菌转化，从而为文库1产生5x105个转化体并为文库2产生1.66x1010个转化体。拯救展示IL2v文库的噬菌粒颗粒，并通过PEG/NaCl纯化进行纯化以进一步用于选择。
实例3
通过噬菌体展示选择pH依赖性IL2v变体
使用重组生物素化IL2R(bg)-Fc构建体(SEQ ID NO:2和3)进行pH依赖性IL2v变体的选择。使用基于Bis-Tris的缓冲液(50mM BisTris、140mM NaCL)在pH 6.0或pH 7.4下执行选择步骤。
根据以下模式在溶液中执行多个淘选轮次：1.)使约1012个噬菌粒颗粒与100nM生物素化抗原蛋白结合0.5h，总体积为1ml；2.)通过添加5.4×107个链霉亲和素包被的磁珠持续10min，捕获生物素化抗原并附着特异性结合噬菌体；3.)使用基于Bis-Tris的缓冲液洗涤磁珠；4.)洗脱噬菌体颗粒。虽然在pH 7.4或pH 6下进行孵育，但洗涤步骤始终在pH 6下进行。通过添加1ml 100mM三乙胺(TEA)10min或通过将缓冲液更改为pH 7.4来洗脱结合的噬菌体颗粒。
使用洗脱的噬菌体来重新感染呈指数生长的大肠杆菌TG1细胞。在用辅助噬菌体进行VCSM13重叠感染和后续的PEG/NaCl沉淀后，将分离的噬菌粒颗粒用于后续选择轮次。总共进行了4轮选择。
通过ELISA鉴别pH依赖性IL2v变体
为了鉴别pH依赖性IL2v变体，生成可溶性的含有IL2v的细菌上清液并通过ELISA进行测试，方法如下：
将每孔25μl的50nM生物素化抗原在pH 6下在384孔中性抗生物素蛋白板上包被，并用2％ BSA(50mM BisTris 140mM NaCl、2％ BSA，pH6)阻断。将含有IL2v可溶性变体的细菌上清液重新缓冲至pH 6，添加到板中并孵育1h。随后，在pH 6或pH 7.4下执行几个洗涤步骤，之后在洗涤缓冲液中在各自的pH下执行孵育步骤30min。使用抗Flag/HRP二抗经由Flag标签检测pH依赖性IL2v变体与IL2R(bg)-Fc构建体的结合。两种条件(pH 6与pH 7.4)之间的信号比较允许鉴别以pH依赖性方式结合的构建体。将表达亲本IL2v构建体的噬菌粒用作内部pH非依赖性对照。选择在pH 6与pH 7下显示出最大结合比率，即在pH 6.0下强结合并在pH7.4下显著降低结合或无结合(图3)的构建体(SEQ ID NO 5-19)并转化为单臂(OA)靶向缀合物。
将pH依赖性IL2v变体转化为单臂CD8靶向IgG IL2v融合物-来自第一次噬菌体展示活动的第一组变体
将已在第一次活动中由噬菌体展示选择用于在弱酸性pH下优先结合的十五个pH依赖性IL2变体(SEQ ID NO 5-19)，转化为单臂CD8靶向IgG PG LALA IL2v融合物，以用于在哺乳动物细胞(CHO K1)中表达并随后通过蛋白A亲和色谱和制备型尺寸排阻色谱(SEC)进行纯化。使pH依赖性IL2v变体与没有末端赖氨酸(K)的‘杵’重链的C末端融合，并经由(G4S)3甘氨酸-丝氨酸接头连接。所得的CD8靶向IgG IL2v融合物由以下构成：SEQ ID NO62、63和65；SEQ ID NO 62、63和66；SEQ ID NO 62、63和67；SEQ ID NO 62、63和68；SEQ IDNO 62、63和69；SEQ ID NO 62、63和70；SEQ ID NO 62、63和71；SEQ ID NO 62、63和72；SEQID NO 62、63和73；SEQ ID NO 62、63和74；SEQ ID NO 62、63和75；SEQ ID NO 62、63和76；SEQ ID NO 62、63和77；SEQ ID NO 62、63和78；或SEQ ID NO 62、63和79。图8示意性地显示所生成的融合物的分子形式。亲本IL2v作为对照包含在一组构建体中(SEQ ID NO 62、63和64)。使用常规(非基于PCR的)克隆技术将相应的cDNA克隆到evitria的载体系统中。Evitria载体质粒是基因合成的。基于阴离子交换色谱法，在低内毒素条件下制备质粒DNA。DNA浓度是通过测量260nm波长处的吸收来确定的。序列的正确性通过Sanger测序确认(每个质粒最多两个测序反应，取决于cDNA的大小)。悬浮调整的CHO K1细胞(最初从ATCC接收并适应evitria悬浮培养中的无血清生长)用于生产。种子在eviGrow培养基中生长，这是一种化学成分明确、无动物成分、无血清的培养基。用eviFect转染细胞，eviFect是evitria定制的专有转染试剂，转染后细胞在eviMake2(一种不含动物成分的无血清培养基)中生长。通过离心和随后的过滤(0.2μm过滤器)收集上清液。随后通过蛋白A亲和色谱(MabSelectSuRe)和制备型尺寸排阻色谱(HiLoad 26/60Superdex 200)纯化单臂CD8靶向IgG IL2v融合构建体，并调配至20mM His、140mM Nacl、0,01％ Tween20(pH 6,0)中。通过测量在280nm波长处的吸收来确定浓度。通过分析尺寸排阻色谱测定单体含量，并通过毛细管电泳(CE-SDS)测定纯度。测定内毒素水平，并且所有样品均<0.231EU/ml。
使用表面等离子体共振(SPR)测定pH依赖性OA CD8靶向IgG IL2v融合物与IL2Rbg的结合动力学
使用Biacore T200仪器(Cytiva)通过表面等离子共振(SPR)研究单臂CD8靶向IgGIL2v融合构建体与人异二聚IL-2受体β/γ(IL2Rbg)的结合。简而言之，根据制造商的说明，使用标准胺偶联化学将小鼠抗PG LALA抗体(Roche Diagnostics)固定在系列s传感器芯片CM3(Cytiva,29104990)上。获得约4000个共振单位(RU)的最终表面密度。随后，将IgG IL2v融合构建体以每个0.25μg/ml的浓度注射到第二个流通池上30s。第一个流通池用作参考表面。在将流速增加到30μl/min后，将IL2Rbg在单循环动力学模式(动力学滴定)中以300至11.1nM(1:3稀释系列)范围内的浓度在两个流动池上注射90s。监测在最后一次分析物注射后的解离持续900s。随后，通过以5μl/min的流速注射10mM NaOH 60s使表面再生。通过减去从流动池1(参考表面)获得的响应以及减去缓冲液注射(双重参考)来校正本体折射率差异。使用BIAevaluation软件(Cytiva)将导出的传感图拟合至1:1朗缪尔结合模型。所有实验均在25℃下使用HBS-P+(10mM HEPES、150mM NaCl pH 7.4、0.05％表面活性剂P-20)、PIPES pH 6.1、PIPES pH 6.5和PIPES pH 7.0(每个20mM PIPES、154mM NaCl、0.05％Tween-20)作为运行和稀释缓冲液进行。结果汇总在下表1-4中。
表1.pH依赖性IL2v变体在pH 7.4下与IL2Rbg结合的动力学速率常数、亲和力和t1/2
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表2.pH依赖性IL2v变体在pH 7.0下与IL2Rbg结合的动力学速率常数、亲和力和t1/2
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表3：pH依赖性IL2v变体在pH 6.5下与IL2Rbg结合的动力学速率常数、亲和力和t1/2
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表4：pH依赖性IL2v变体在pH 6.1下与IL2Rbg结合的动力学速率常数、亲和力和t1/2
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对于亲本IL2v(OA CD8 IgG IL2v)，可使用SPR观察到在pH 7.4和pH 7.0下与人IL2Rbg结合与在pH 6.5和pH 6.1下与人IL2Rbg结合之间的亲和力略有降低(分别在pH 7.4下为0.6nM、在pH 7.0下为0.5nM、在pH 6.5下为3nM且在pH 6.1下为2nM)。随着pH降低，其与IL2Rbg的解离速率变得更快。相比之下，大多数pH依赖性IL2v变体(除了例如OA CD8 IgGIL2v P031.226和OA CD8 IgG IL2v P043.217)在pH 7.4和pH7.0下表现出比亲本IL2v(OACD8 IgG IL2v)显著更弱的结合，但随着pH降低，它们的亲和力增加并且它们与人IL2Rbg的解离速率变慢。因此，与亲本IL2v(OA CD8 IgG IL2v)相比，来自第一次噬菌体展示活动的大多数选定的pH依赖性IL2v变体在中性pH下与人IL2Rbg的结合更弱，但在弱酸性pH(pH6.5和pH 6.1)下亲和力增加。
人NK细胞中通过pH依赖性OA CD8 IgG IL2v构建体进行的pSTAT5诱导
使用人PBMC确定pH依赖性OA CD8 IgG IL2v构建体的活性。简而言之，将pH依赖性OA CD8 IgG IL2v构建体稀释液(终浓度100nM、1nM、0.01nM，阴性对照：未处理；阳性对照：阿地白介素)与新鲜人PBMC在37℃于孵育箱中孵育20min，然后添加Cytofix(BD#554655)以固定细胞(在37℃持续10min)。将细胞离心(350xg,5min)，重新悬浮在PhosflowPerm缓冲液(BD#558050)中，并在4℃孵育30min。其后，用FACS缓冲液(PBS+2％ FCS+5mM EDTA+0.25％叠氮化钠)洗涤细胞，并使用以下抗体在4℃进行流式细胞术(FACS)染色30min：抗人CD3-太平洋蓝(Pacific Blue)、抗人CD4 PECy7、抗人CD8 PerCPCy5.5、抗人CD25-PE、抗人CD56-APC、抗人FoxP3-PE-CF594、抗pSTAT5-AlexaFluor 488(所有abs BD，仅抗人CD56源自Biolegend)。使用BD FACS Fortessa测量样品，并确定NK细胞群(CD3 neg CD56pos)中阳性细胞的百分比以及pSTAT5信号的平均荧光强度。
表5：用于pSTAT5测定的pH依赖性OA CD8 IgG IL2v构建体
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结果在图6和图7中示出。图6显示磷酸化STAT5(信号转导和转录活化因子，pSTAT)(其为在IL-2信号传导后活化的转录因子，介导细胞因子的生物活性)呈阳性的NK细胞的百分比。阿地白介素以及OA CD8IgG IL2v对照构建体以及变体OA CD8 IgG IL2v P043.217在pH 7.4下显示对pSTAT5的相当且浓度依赖性的活化。与此相反，所有其他pH依赖性OA CD8IgG IL2v构建体在pH 7.4下显示降低的活性，此取决于抗体浓度。在pH 6.5下，在IL-2刺激后可以观察到pSTAT5诱导的普遍降低。图7显示相对于OA CD8 IgG IL2v(对照)(在pH 7.4下设为100％活性)对pSTAT5的诱导归一化的所计算的曲线下面积(AUC)。所有pH依赖性构建体均显示pSTAT5活化在pH 7.4下降低31％-66％(表2，中间栏)，但OA CD8 IgG IL2vP043.217除外，其表现类似于与CD8 IgG IL2v相比显示>100％活性的阿地白介素。在pH6.5下，所有构建体仅显示与pH 7.4下的CD8 IgG IL2v相比40％-75％的活性(表6，右栏)。
表6：在pSTAT5测定中在pH7.4下pH依赖性OA CD8 IgG IL2v构建体的AUC值百分比相对于CD8 IgG IL2v归一化
实例4
基于从第一pH依赖性IL2v文库中选择的IL2v变体的共有序列生成和表征第二pH依赖性IL2文库
第二文库是基于在第一次活动中观察到的某些富集模式设计的。例如，在K11位置处，我们观察到噬菌体选择后仅回收了初始赖氨酸残基。因此，在下一轮中，该残基再次回复突变为赖氨酸。精制文库所考虑的残基如下：Q11、L12、Q13、E15、H16、L19、D20、Q22、M23、R81、D84、S87、E95、R120、Q126、S130和T133。一些位置显示出对一种并非亲本氨基酸的特定氨基酸的明显富集。例如，在第一次活动之后，Q11显示E的富集。R81明显被D替换。此类模式被包含在第二版文库的设计中。第二文库的处理方式与第一次活动相同。
为了生成新的pH依赖性IL2v噬菌体展示文库，合成相应的DNA片段。其由随机化的IL2v序列组成，并且两侧是限制位点NcoI和NotI。将该片段与同样切割的亲本IL2v受体噬菌粒载体一起用NcoI/NotI消化。与第一噬菌粒载体相反，V5标签序列(GKPIPNPLLGLDST)被插入到噬菌粒的标志标签和his标签区域之间。V5标签允许在使用抗V5抗体的SPR实验期间特异性捕获分子。将文库插入物与噬菌粒载体一起在4℃连接过夜。使用纯化的连接物进行细菌转化，从而产生复杂度超过2x1010个转化体的文库。拯救展示IL2v文库的噬菌粒颗粒，并通过PEG/NaCl纯化进行纯化以用于选择。
实例5
改进的pH依赖性IL2v变体的选择和表征
通过噬菌体展示选择pH依赖性IL2v变体
pH依赖性IL2v变体的选择是根据与上述第一文库的选择类似的程序进行的。简而言之，将重组生物素化IL2R(bg)-Fc构建体用作抗原以进行选择。所有选择步骤均使用基于Bis-Tris的缓冲液(50mM BisTris 140mM NaCl，最终浓度，pH 6或pH 7.4)进行。根据以下模式在溶液中执行多个淘选轮次：1.)使约1012个噬菌粒颗粒与100nM生物素化抗原蛋白结合0.5h，总体积为1ml；2.)通过添加5.4x107个链霉亲和素包被的磁珠持续10min，捕获生物素化抗原并附着特异性结合噬菌体；3.)使用基于Bis-Tris的缓冲液洗涤磁珠；4.)洗脱噬菌体颗粒。虽然在pH 7.4或pH 6下执行孵育步骤，但洗涤步骤始终在pH 6下进行。通过添加1ml 100mM三乙胺(TEA)10min或通过将缓冲液更改为pH 7.4来洗脱结合的噬菌体颗粒。
使用洗脱的噬菌体来重新感染呈指数生长的大肠杆菌TG1细胞。在用辅助噬菌体进行VCSM13重叠感染和后续的PEG/NaCl沉淀后，将分离的噬菌粒颗粒用于后续选择轮次。使用降低(从100nM至20nM)的抗原浓度进行4轮选择。
通过ELISA筛选和表征pH依赖性IL2v变体
为了鉴别pH依赖性IL2v变体，生成可溶性的含有IL2v的细菌上清液并通过ELISA进行测试，方法如下：
将每孔25μl的50nM生物素化抗原在pH 6下在384孔中性抗生物素蛋白板上包被，并用2％ BSA(50mM BisTris 140mM NaCL、2％ BSA，pH 6)阻断。将含有IL2v可溶性变体的细菌上清液重新缓冲至pH 6，添加到板中并孵育1h。随后，在pH 6或pH 7.4下执行几个洗涤步骤，之后在洗涤缓冲液中在各自的pH下执行孵育步骤30min。使用抗Flag/HRP二抗经由Flag标签检测pH依赖性IL2v变体与IL2R(bg)-Fc构建体的结合。两种条件(pH6与pH7.4)之间的信号比较允许鉴别以pH依赖性方式结合的克隆。将表达亲本IL2v构建体的噬菌粒用作pH非依赖性信号内部对照。将在pH 6下与在pH 7下的结合比率大于10的克隆列入候选名单并重新测试，以确认其pH依赖性。
为了进一步表征所选的pH依赖性IL2v变体，分析了它们在四种不同pH条件(包括pH 6、pH 6.5、pH 7和pH 7.4)下与IL2R(bg)-Fc的结合。如以上实例3中所描述进行在相应pH值情况下的ELISA，并且结果在图4中示出。将pH 6下的结合归一化为1，以便更好地比较所有克隆之间的结合。有趣的是，与在pH 6下相比，许多结合剂在pH 6.5下的强结合程度相似，例如P172.0344、P173.0087、P173.0364、P174.0040、P174.0281、P177.0156，而其他克隆已显示降低的结合，例如P173.0127、P173.0156、P173.0239、P173.0259、P173.0371、P0174.0277、P175.0368、P177.0035、P177.0036。一般而言，pH 7和pH 7.4下的结合强度降低10-100倍
通过SPR筛选和表征pH依赖性IL2v变体
为了检查所选pH依赖性IL2v克隆的个别结合行为，使用ProteOn XPR36仪器(Biorad)进行表面等离子体共振：通过胺偶联将市售的抗V5标签抗体(20μg/ml)固定在GLM芯片上，以达到垂直方向上约8000个响应单位(RU)的固定水平。将含有可溶性IL2v克隆变体的细菌上清液用Bis-Tris(pH 7.4)1:5稀释，并作为配体在垂直方向上捕获到芯片上的抗V5 mAb上，从而产生在100与300RU之间的捕获水平。将不含蛋白质表达的细菌上清液用于参考。
在共注射实验中，重组IL2R(bg)-Fc(50nM)用作水平方向的分析物，以同时研究3种不同条件下pH依赖性IL2v克隆变体的结合特性：1)与Bis-Tris缓冲液(pH 6)缔合并与Bis-Tris缓冲液(pH 6)解离；2)与Bis-Tris缓冲液(pH 6)缔合并与Bis-Tris缓冲液(pH7.4)解离；和3)与Bis-Tris缓冲液(pH 7.4)缔合并与Bis-Tris缓冲液(pH 7.4)解离。说明实验条件的说明性实例在图5A中显示。缔合和解离均以每秒50μl的流速持续200秒。虽然条件1(在pH 6下缔合和解离)导致IL2R(bg)-Fc与IL2v结合剂变体的强结合，但缓冲液从pH 6(缔合)到pH 7.4(解离)的变化会引起结合迅速丧失并且IL2R(bg)-Fc与固定化pH依赖性IL2v变体之间的相互作用会在几秒内消失。对于许多克隆变体，在pH 7.4下的缔合阶段期间的相互作用无法检测到或仅微弱检测到。在三个所测试条件下最好的二十个克隆的传感图在图5B-U中显示。基于来自定性SPR测量的极明显pH依赖性结合结果，选择二十四个克隆(SEQ ID NO 20-43)以用于将IL2v变体最终转化为抗CD8靶向IgG融合构建体。
将pH依赖性IL2v变体转化为单臂CD8靶向IgG IL2v融合物-来自第二次噬菌体展示活动的第二组变体
将已在第二次活动中由噬菌体展示选择用于在弱酸性pH下优先结合的二十四个pH依赖性IL2v变体(SEQ ID NO 20-43)，转化为单臂CD8靶向IgG PG LALA IL2v融合物，以用于在哺乳动物细胞(CHO K1)中表达并随后通过蛋白A亲和色谱和制备型尺寸排阻色谱(SEC)进行纯化。使pH依赖性IL2v变体与没有末端赖氨酸(K)的‘杵’重链的C末端融合，并经由(G4S)2G5甘氨酸-丝氨酸接头连接(图8示意性地显示所生成融合物的分子形式)。此外，该组不仅包括选定的pH依赖性IL2v变体，还包括具有单一突变或组合的共有突变的IL2v变体。所得的CD8靶向IgG IL2v融合物由以下构成：SEQ ID NO 62、80和81；SEQ ID NO 62、80和82；SEQ ID NO 62、80和83；SEQ ID NO 62、80和84；SEQ ID NO 62、80和85；SEQ ID NO62、80和86；SEQ ID NO 62、80和87；SEQ ID NO 62、80和88；SEQ ID NO 62、80和89；SEQ IDNO 62、80和90；SEQ ID NO 62、80和91；SEQ ID NO 62、80和92；SEQ ID NO 62、80和93；SEQID NO 62、80和94；SEQ ID NO 62、80和95；SEQ ID NO 62、80和96；SEQ ID NO 62、80和97；SEQ ID NO 62、80和98；SEQ ID NO 62、80和99；SEQ ID NO 62、80和100；SEQ ID NO 62、80和101；SEQ ID NO 62、80和102；SEQ ID NO 62、80和103；SEQ ID NO 62、80和104；SEQ IDNO 62、80和105；SEQ ID NO 62、80和106；SEQ ID NO 62、80和107；SEQ ID NO 62、80和108；SEQ ID NO 62、80和109；SEQ ID NO 62、80和110；SEQ ID NO 62、80和111；SEQ ID NO 62、80和112；SEQ ID NO 62、80和113；SEQ ID NO 62、80和114；SEQ ID NO 62、80和115；SEQ IDNO 62、80和116；SEQ ID NO 62、80和117；SEQ ID NO 62、80和118；SEQ ID NO 62、80和119；SEQ ID NO 62、80和120；SEQ ID NO 62、80和121；SEQ ID NO 62、80和122；SEQ ID NO 62、80和124；SEQ ID NO 62、80和125；SEQ ID NO 62、80和126；SEQ ID NO 62、80和127；SEQ IDNO 62、80和128；SEQ ID NO 62、80和129；SEQ ID NO 62、80和130；SEQ ID NO 62、80和131；SEQ ID NO 62、80和132；SEQ ID NO 62、80和133；SEQ ID NO 62、80和134；SEQ ID NO 62、80和135；SEQ ID NO 62、80和136；SEQ ID NO 62、80和137；SEQ ID NO 62、80和138；SEQ IDNO 62、80和139；SEQ ID NO 62、80和140SEQ ID NO 62、80和141；SEQ ID NO 62、80和142；或SEQ ID NO 62、80和143。
实例6
使用生物层干涉法(BLI)测定单臂CD8靶向IgG IL2v融合物(来自第2次噬菌体展示活动的第2组变体)与IL2Rbg的结合动力学
使用Octet RED384仪器(Sartorius)通过生物层干涉法研究单臂CD8靶向IgGIL2v融合物在不同pH值下与IL-2Rbg的结合。简而言之，在于20mM PIPES、140mM NaCl pH7.4、0.05％ Tween 20中的5μg/ml浓度下，将抗体-IL2v融合物捕获到抗人Fab CH1传感器尖端(FAB2G，Sartorius编号18-5125)上持续90s。在已经使用相应的稀释缓冲液进行额外的洗涤/基线步骤后，使100nM人IL2Rbg(P1AA4193)或鼠IL2Rbg(P1AD6727)与捕获的抗体-IL2v融合物结合，其中缔合时间为180s且解离时间为300s，在20mM PIPES、140mM NaCl、0.05％ Tween 20中加以稀释，pH分别为6.0、6.2、6.5、6.8、7.1或7.4。随后，使传感器尖端用10mM甘氨酸pH1.7再生三次30秒。使用数据分析软件(Sartorius)将获得的结合曲线拟合至1:1结合模型。结果汇总于表7中。
表7：不同pH值下单臂CD8靶向IgG IL2v融合物与人IL-2Rbg的结合动力学
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对于大多数选定的IL2v变体，BLI数据显示它们在pH 7.4和pH 7.0下的结合极差，并且它们的受体结合强度随着pH降低而增加。总的来说，亲和力(KD)和pH之间存在负相关关系，并且亲和力随着pH从pH 7.4降低到pH 6.0而提高主要是由越来越慢的解离速率常数(kd)引起的。与已针对pH依赖性选择的IL2v变体相反，亲本IL2v(P1AG0738，单臂CD8IgG-亲本IL2v)在所有所测试的pH值下，而且特别是在中性pH附近的更高pH值下表现出更高的亲和力和更慢的解离速率常数。重要的是，与亲本IL2v相比，已针对pH依赖性选择的IL2v变体在中性pH附近(pH 7.4、pH 7.0、pH 6.8)对人IL2Rbg表现出弱的多的亲和力，并且因此应导致全身受体募集减少。然而，在弱酸性肿瘤微环境(TME)中，与TME外的外周相比，预期这些变体会经由IL2R途径表现出更好的受体募集和后续信号传导。将单个突变引入IL2v不会导致相同程度的pH依赖性。一般而言，它们在pH 7.4和pH 6.0之间的亲和力范围与已针对pH依赖性选择的IL2v变体相比与亲本IL2v更相当。大多数选定的pH依赖性IL2v变体与鼠IL2Rbg具有交叉反应性，然而，这些变体不会表现出与对人IL2Rbg相同程度的pH依赖性。结果汇总于表8中。
表8：单臂CD8靶向IgG IL2v融合物与鼠IL-2Rbg在不同pH值下的结合动力学
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实例7
使用BIACORE单循环动力学确定单臂CD8靶向IgG IL2v融合物(来自第2次噬菌体展示活动的第2组变体)与IL2Rbg的结合动力学
使用Biacore T200仪器(Cytiva)通过表面等离子体共振(单循环动力学)另外测试一组十一个候选的IL2v变体与IL-2Rbg的pH依赖性结合。实验分别在pH 7.4、pH 7.1、pH6.8和pH 6.5下在PBS-T(10mM H3PO4、140mM NaCl、0.05％ Tween-20)中进行。为了捕获IL2v变体，将生物素化的抗人Fab(抗CH1)抗体(ThermoScientific编号7103202100)固定在系列S传感器芯片SA(Cytiva编号BR-1005-31)上，在两个流通池上的表面密度为约2500个共振单位(RU)。将IL2v变体注射到流通池2中，并且获得的表面密度范围为约10至30RU，而流通池1用作参考表面。随后，注射11.1、33.3和100nM稀释系列的人IL-2Rbg(P1AA4193)持续90s，并针对最高浓度监测解离900s。通过减去从流动池1(模拟表面)获得的响应以及减去缓冲液注射(双重参考)来校正本体折射率差异。使用BIAevaluation软件(Cytiva)将导出的曲线拟合至1:1朗缪尔结合模型。
所有十一个IL2v变体都表现出pH依赖性结合，其从pH 6.5到pH 7.4不断降低。这种亲和力降低的驱动因素是所有变体的解离速率常数(kd)，而对于一些变体，缔合速率常数(ka)从pH 6.5到pH 7.4也明显降低，例如对于P1AG0709、P1AG0710、P1AG0712、P1AG0713、P1AG0715、P1AG0717和P1AG0720。结果汇总于表9中。
表9：SPR动力学数据
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实例8
单臂CD8靶向IgG IL2v融合物对人PBMC的活化和增殖诱导
在pH7.4和pH6.5下确定抗CD8-IL2v(pH)构建体对人PBMC活化和增殖的影响。简而言之，将抗CD8-IL2v(pH)稀释液(终浓度100nM、10nM、1nM、0.1nM)与新鲜的CFSE标记的人PBMC一起在37℃、5％CO2下于孵育箱中在定制RPMI培养基(Gibco/Thermofisher)中在pH6.5或pH7.4下孵育5天。5天后，收获细胞并进行流式细胞术染色(活/死细胞(lifetechnologies#L34976)、抗人CD4 BV605、抗人CD8 BV711、抗人CD56 BV421、抗人CD25 PE-Dazzle 594和抗人CD69 PECy7。确定表达CD25、CD69或4-1BB的CD4+T细胞、CD8+T细胞或NK细胞的百分比和三个免疫群体上活化标志物的中值荧光强度(MFI)以及增殖细胞的百分比。
抗CD8-IL2v(pH)构建体诱导CD8+T细胞和NK细胞增殖的结果在图9中显示。在不存在进一步刺激的情况下，CD4+T细胞未显示出显著诱导增殖(数据未示出)。所有构建体在pH6.5下诱导CD8+T细胞和NK细胞的浓度依赖性增殖，而与pH非依赖性对照构建体P1AG0738ctr.(其在所有所测试条件下诱导显著增殖)相比，仅最高浓度的一些pH依赖性构建体在pH7.4下诱导一些增殖(图9)。
除了增殖之外，抗CD8-IL2v(pH)构建体还诱导T细胞和NK细胞活化(CD25、CD69)，如图10中所示。在此处，增殖细胞的百分比以及CD25和CD69表达的阳性细胞百分比显示为依赖于培养基的pH。与pH非依赖性对照P1AG0738 ctr相反，观察到大多数构建体具有明显的pH依赖性。
为了在不同的免疫亚群和活化/增殖标志物中选择在pH6.5下具有更高活性但在pH7.4下具有低活性或无活性的最有希望的候选物，基于构建体的滴定曲线确定所有读数的曲线下面积(AUC)值。计算pH6.5下的AUC与pH7.4下的AUC的比率(图11)。基于此，已选择在pH6.5与pH7.4下具有最高平均活性比的前5个分子以在转化为PD1靶向IL2v(pH)构建体后用于体外测试(表10)。
实例9
将第2代pH依赖性IL2v变体转化为二价PD1靶向形式
如图12中所描绘，已选择十一个pH依赖性IL2v变体的候选物以用于转化成二价PD1靶向复合物形式。这十一个pH依赖性IL2v变体是P172.0344(SEQ ID NO 145、146和147)、P173.0364(SEQ ID NO 145、146和148)、P174.0040(SEQ ID NO 145、146和149)、P174.0173(SEQ ID NO 145、146和150)、P174.0238(SEQ ID NO 145、146和151)、P174.0281(SEQ ID NO 145、146和152)、P174.0326(SEQ ID NO 145、146和153)、P174.0327(SEQ IDNO 145、146和154)、P175.0125(SEQ ID NO 145、146和155)、P177.0035(IL2v(共有序列全部))(SEQ ID NO 145、146和156)以及P178.0145(SEQ ID NO 145、146和157)。这些PD1靶向pH依赖性IL2v变体中的五个已在体外基于细胞的测定中进行了测试，并且下表显示了相应的单臂CD8靶向与二价PD1靶向pH依赖性IL2v变体构建体。
表10：已选择在pH6.5至pH7.4下具有最高平均活性比的pH依赖性最强的IL2v变体作为二价PD1靶向构建体用于体外测试
二价靶向至PD1的第2代pH依赖性IL2v变体对人PBMC的活化和增殖诱导
在pH7.4、pH6.8和pH6.5下确定抗PD1-IL2v(pH)构建体对人PBMC活化和增殖的影响。简而言之，将抗PD1-IL2v(pH)稀释液(终浓度10nM、1nM)与新鲜的CFSE标记的人PBMC一起在37℃、5％ CO2下于孵育箱中在定制RPMI培养基(Gibco/Thermofisher)中在pH6.5或pH7.4下在不存在或存在包被的抗人CD3抗体(1μg/ml)的情况下孵育5天。5天后，收获细胞并进行流式细胞术染色(活/死细胞(life technologies#L34976)、抗人CD4 BV605、抗人CD8 BV711、抗人CD56 BV421、抗人CD25 PE-Dazzle 594、抗人CD69 PECy7和抗人4-1BBAPC)。确定表达CD25、CD69或4-1BB的CD4+T细胞、CD8+T细胞或NK细胞的百分比和三个免疫群体上活化标志物的中值荧光强度(MFI)以及增殖细胞的百分比。
与CD8靶向IL2v(pH)构建体相反，在不存在其他刺激的情况下，抗PD1-IL2v(pH)构建体的活性在不表达PD1的新鲜人PBMC上低直至不存在(数据未示出)。与此相反，可以观察到aCD3诱导的活化和增殖的显著增强，尤其是在孵育5天后(活化的T细胞也上调PD1表达的时间)在pH6.8下更是如此(图13)。
实例10
将赋予pH依赖性的突变引入野生型IL2
为了测试赋予IL2v pH依赖性的突变是否也会赋予野生型IL2 pH依赖性，将选定的突变组引入至与人Fc杵链的C末端融合的野生型IL2序列中(SEQ ID NO:158(非靶向Fc–野生型IL2融合物的‘空’HC臼)、SEQ ID NO 159-164(非靶向Fc–野生型IL2融合物的HC杵))。这些选定的突变组分别对应于P174.0040(与具有SEQ ID NO 158和159的构建体有关)、P174.0326(与具有SEQ ID NO 158和160的构建体有关)、P172.0344(与具有SEQ ID NO158和162的构建体有关)、P175.0125(与具有SEQ ID NO 158和163的构建体有关)和P174.0238(与具有SEQ ID NO 158和164的构建体有关)，并且类似的包含野生型IL2的构建体已用作比较物(P1AG7463(与具有SEQ ID NO 158和161的构建体有关))。由于野生型IL2可以顺式结合于CD25，因此在这些构建体中省略了靶向CD8或PD1。形式在图14中显示。
使用BIACORE单循环动力学确定pH依赖性非靶向Fc–wt IL2融合物与IL2Rbg的结合动力学
使用Biacore T200仪器(Cytiva)通过表面等离子体共振研究与单臂CD8靶向IgGIL2v融合物相比，非靶向Fc–wt IL2融合物与IL2Rbg的pH依赖性结合。实验分别在pH 7.4、7.1、6.8和pH 6.5下在PBS-T(10mM H3PO4、140mM NaCl、0.05％ Tween-20)中进行。为了捕获IL2融合构建体，将小鼠抗人Fc PGLALA抗体以约5000个共振单位(RU)的表面密度在系列S传感器芯片CM3(Cytiva,29104990)上固定。将IL2融合构建体注射到流通池上，获得的表面密度达到约10至100RU。第一个流通池保留为参考表面。随后，注射33.3、100和300nM(当使用亲本IL2融合构建体作为对照时为11.1、33.3和100nM)稀释系列的人IL-2Rbg(P1AA4193)持续90s，监测解离长达600s。通过减去从流动池1(参考表面)获得的响应以及减去缓冲液注射(双重参考)来校正本体折射率差异。使用BIAevaluation软件(Cytiva)将导出的曲线拟合至1:1朗缪尔结合模型，并且在表11中汇总在四种不同pH值下的所得KD。如通过比较IL2v变体(P1AG0697、P1AG0708、P1AG0710、P1AG0713和P1AG0715)与野生型IL2变体(P1AG7464、P1AG7461、P1AG7466、P1AG7462和P1AG7465)可以理解，选定的突变组不仅赋予IL2v而且也赋予野生型IL2pH依赖性。
表11.pH依赖性IL2v和野生型IL2变体在不同pH下的解离平衡常数(KD)的汇总表(低＝仅有低结合信号和极低亲和力)
/>
pH依赖性非靶向Fc–wt IL2融合物对人PBMC的活化和增殖诱导
在pH7.4和pH6.5下测定pH依赖性非靶向Fc–wt IL2融合物(表12)对人PBMC活化和增殖的影响。简而言之，将IL2wt(pH)稀释液与新鲜的CFSE标记的人PBMC一起在37℃、5％CO2下于孵育箱中在定制RPMI培养基(Gibco/Thermofisher)中在pH6.5或pH7.4下孵育5天。5天后，收获细胞并进行流式细胞术染色。确定表达CD69的CD8+T细胞或NK细胞的百分比和两个免疫群体上活化标志物的中值荧光强度(MFI)以及增殖细胞的百分比。
表12.pH依赖性非靶向Fc–wt IL2融合物
非靶向Fc–wt IL2融合物 pH依赖性IL2变体标识符
P1AG7461 P174.0040
P1AG7462 P174.0326
P1AG7463_ctr 未分析(野生型IL2)
P1AG7464 P172.0344
P1AG7465 P175.0125
P1AG7466 P174.0238
图15显示100nM pH依赖性非靶向Fc–wt IL2融合物在pH6.5下与在pH7.4下相比的活性。根据所有所测试的pH依赖性IL2wt构建体，与pH非依赖性对照构建体P1AG7463_ctr相比，P1AG7464(P172.0344)在pH6.5下显示最高活性并且在pH7.4下显示显著降低的活性。P1AG7461(P174.0040)和P1AG7462(P174.0326)在pH6.5下显示出一定活性，并且在pH7.4下几乎没有显示出任何活性，而P1AG7465(P175.0125)和P1AG7466(P174.0238)在所有条件下几乎没有显示出任何活性。
***
尽管为了清楚理解的目的先前已通过举例说明和实施方案相当详细地描述了本发明，但是这些描述和实施方案不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容均全文以引用方式明确地并入。
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司
<120> pH 依赖性突变型白细胞介素-2 多肽
<130> P36497
<160> 164
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
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225
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<220>
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<210> 71
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<220>
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<400> 71
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<223> 合成构建体
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<400> 76
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 77
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595
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<211> 595
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 78
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595
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<211> 595
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 79
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595
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<223> 合成构建体
<400> 80
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225
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 81
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595
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<213> 人工序列
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<223> 合成构建体
<400> 82
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Arg Glu Leu Ile Glu Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly
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565 570 575
Val Glu Phe Leu Asn His Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Glu
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Thr Leu Glu
595
<210> 83
<211> 595
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 83
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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<210> 103
<211> 595
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
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<223> 合成构建体
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<223> 合成构建体
<400> 107
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<211> 595
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 108
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<400> 109
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Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
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<223> 合成构建体
<400> 125
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<213> 人工序列
<220>
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225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ala Pro
450 455 460
Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Glu Leu Gln Leu Glu His Leu Leu
465 470 475 480
Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro
485 490 495
Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala
500 505 510
Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu
515 520 525
Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Asp Pro
530 535 540
Arg Glu Leu Ile Glu Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly
545 550 555 560
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565 570 575
Val Glu Phe Leu Asn His Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Glu
580 585 590
Thr Leu Asp Ala
595
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<211> 596
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 142
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Leu Tyr Ala Ser Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Tyr Gly Tyr Tyr Val Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
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115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
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145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
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290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
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355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
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420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ala Pro
450 455 460
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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Thr Leu Glu Ala
595
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<211> 596
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 143
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ala Pro
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Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu
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485 490 495
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500 505 510
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595
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 144
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
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130
<210> 145
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 145
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser
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65 70 75 80
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100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
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130 135 140
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195 200 205
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210 215
<210> 146
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 146
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
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130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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195 200 205
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225 230 235 240
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435 440 445
Gly
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<211> 597
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 147
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ala Pro Ala Ser Ser Tyr Thr Lys Lys Thr Gln Glu Arg Leu Glu Gln
465 470 475 480
Leu Leu Leu Asp Leu Glu Gln Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
485 490 495
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys
500 505 510
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
515 520 525
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
530 535 540
Asn Pro Arg Glu Leu Ile Glu Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
545 550 555 560
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565 570 575
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn His Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
580 585 590
Ile Glu Thr Leu Asp
595
<210> 148
<211> 597
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 148
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Val Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp Ser Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
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275 280 285
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Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Asp
465 470 475 480
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Asn Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
485 490 495
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys
500 505 510
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
515 520 525
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
530 535 540
Asp Pro Arg Glu Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
545 550 555 560
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565 570 575
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Ile Glu Thr Leu Glu
595
<210> 149
<211> 597
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 149
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp Ser Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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465 470 475 480
Leu Leu Asp Asp Leu Glu Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
485 490 495
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys
500 505 510
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
515 520 525
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
530 535 540
Asp Pro Arg Glu Leu Ile Glu Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
545 550 555 560
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
565 570 575
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn His Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
580 585 590
Ile Glu Thr Leu Asp
595
<210> 156
<211> 597
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 156
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp Ser Trp Gly Gln
100 105 110
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Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
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Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
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Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Glu Leu Gln Leu Gln Glu
465 470 475 480
Leu Leu Asp Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
Asp Pro Arg Glu Leu Ile Glu Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
545 550 555 560
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565 570 575
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn His Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
580 585 590
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595
<210> 157
<211> 597
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 157
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Glu Glu Gln Leu Glu Asn
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Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
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565 570 575
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580 585 590
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595
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 158
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225
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 159
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<211> 374
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 160
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370
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<211> 374
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 161
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Gly Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu
245 250 255
His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
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275 280 285
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370
<210> 162
<211> 374
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 162
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Gly Ala Pro Ala Ser Ser Tyr Thr Lys Lys Thr Gln Glu Arg Leu Glu
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370
<210> 163
<211> 374
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 163
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Gly Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Glu Thr Gln Leu Glu
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Ile Ile Glu Thr Leu Asp
370
<210> 164
<211> 374
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 164
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
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130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Glu Thr Gln Leu Gln
245 250 255
Glu Leu Leu Asp Asp Leu His Glu Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
260 265 270
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro
275 280 285
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu
290 295 300
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His
305 310 315 320
Leu Glu Pro Arg Glu Leu Ile Glu Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu
325 330 335
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr
340 345 350
Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn His Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser
355 360 365
Ile Ile Glu Thr Leu Glu
370

Claims (32)

1.一种突变型白细胞介素-2(IL-2)多肽，其包含一个或多个氨基酸取代，各自与野生型IL-2，优选根据SEQ ID NO:144的人IL-2相比，其中所述一个或多个氨基酸取代在中性pH下消除或降低与IL-2受体、优选与中等亲和力IL-2受体(IL2Rβγ)的结合，并在降低的pH下促进与所述IL-2受体、优选与所述中等亲和力IL-2受体(IL2Rβγ)的结合。
2.根据权利要求1所述的突变型IL-2多肽，其中所述一个或多个氨基酸取代位于选自与根据SEQ ID NO:144的人IL-2的残基6、8、11、12、13、15、16、19、20、22、23、81、84、87、91、95、120、123、126、130、133对应的位置的组的位置处。
3.根据权利要求1或2所述的突变型IL-2多肽，其中所述一个或多个氨基酸取代选自下组：S6Y、K8E、Q11E、Q11T、L12D、L12E、L12Q、L12S、L12T、Q13H、Q13R、E15Q、H16D、H16E、H16N、H16Q、L19D、L19Q、D20E、D20Q、Q22D、Q22E、Q22H、M23E、M23N、M23Q、R81D、R81E、R81H、R81N、R81Q、D84E、D84Q、S87D、S87E、S87N、S87Q、V91D、V91E、V91N、E95D、E95Q、R120E、R120H、T123E、T123Q、Q126E、Q126H、S130E、T133D、T133E、T133N、T133Q。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的突变型IL-2多肽，其中所述突变型IL-2多肽包含氨基酸取代
(i)L12E、D20E、M23N、R81N、D84E、S87E、R120E、T123E、S130E、T133N；
(ii)Q11E、D20Q、M23E、R81D、D84E、S87E、S130E、T133N；
(iii)L12E、L19D、R81D、R120E、T123E、S130E、T133E；
(iv)R81Q、S87E、V91D、T123E、S130E、T133D；
(v)Q11E、L12E、M23Q、R81D、S87E、V91D、S130E、T133Q；
(vi)Q11E、L19D、R81D、D84E、S130E、T133D；
(vii)R81D、D84Q、S87D、V91N、T123Q、S130E、T133D；(viii)L19D、R81E、D84E、S87Q、R120H、S130E、T133E；
(iix)L19D、M23N、R81D、T133E；
(ix)Q11E、L12E、M23Q、R81Q、S87D、V91N、E95Q、R120H、T123E、S130E、T133E；
(x)L19D、R81E、S130E、T133D；
(xi)R81Q、S87E、V91D、R120E、S130E、T133D；
(xii)L12Q、L19Q、R81H、V91E、T123E、S130E、T133E；
(xiii)K8E、D20E、M23N、R81H、D84Q、S87E、R120H、S130E、T133D；
(xiv)L12E、L19Q、R81H、R120E、T133D；
(xv)H16E、L19D、Q22E、M23Q、R81D、D84E、S87D、R120H、S130E、T133E；
(xvi)Q11E、L12E、H16Q、L19D、Q22E、M23N、R81E、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E；
(xvii)Q11E、H16E、L19D、M23E、R81D、S87E、R120H、Q126E、T133D；
(xviii)Q11E、L12S、E15Q、H16N、L19D、M23E、R81E、D84E、S87D、R120H、S130E、T133E；
(xix)Q11E、H16E、M23E、R81N、D84E、S87E、R120H、Q126E、S130E、T133E；
(xx)Q11E、E15Q、H16E、Q22E、M23E、R81H、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D；
(xxi)Q11E、L12D、Q13H、E15Q、H16E、Q22E、M23E、R81N、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E；
(xxii)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81E、S87E、R120H、S130E、T133E；
(xxiii)H16E、L19D、M23Q、R81N、D84E、S87D、R120H、S130E、T133D；
(xxiv)Q11E、L12T、E15Q、H16E、L19D、Q22H、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E；
(xxv)Q11E、L12T、E15Q、H16E、L19D、Q22H、M23E、R81E、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E；
(xxvi)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81E、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E；
(xxvii)H16E、Q22E、M23Q、S87N、R120H、S130E、T133E；
(xxviii)H16E、L19D、Q22D、M23Q、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E；
(xxiix)Q11E、L12E、Q13H、E15Q、H16N、L19D、Q22E、M23Q、R81E、D84E、S87D、E95D、R120H、T133E；
(xxix)Q11E、L12T、H16E、L19D、Q22E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D；
(xxx)Q11T、L12E、E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E、R120E、S130E、T133D；
(xxxi)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E；
(xxxii)Q11E、E15Q、H16E、L19D、R81Q、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E；
(xxxiii)Q11E、L12S、H16E、L19D、M23Q、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E；
(xxxiv)S6Y、L12E、Q13R、H16Q、Q22E、M23Q、R81N、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D；
(xxxv)H16D、M23N、R81D、D84E、R120H、S130E、T133E；
(xxxvi)Q11E、L12T、H16Q、L19D、M23E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133E；
(xxxvii)Q11E、L12E、H16N、M23N、R81E、D84E、R120H、S130E、T133E；
(xxxviii)E15Q、H16E、L19D、R81D、D84E、S87E；
(xxxix)Q11E、R120H、S130E、T133D；或
(xl)Q11E、R81D、D84E、S87E、R120H、S130E、T133D。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的突变型IL-2多肽，其中所述突变型IL-2多肽包含选自下组的任何氨基酸取代：T3A、F42A、Y45A、L72G、C125A。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的突变型IL-2多肽，其中所述突变型IL-2多肽包含氨基酸取代F42A、Y45A和L72G。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的突变型IL-2多肽，其中所述突变型IL-2多肽包含氨基酸取代T3A、F42A、Y45A、L72G和C125A。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的突变型IL-2多肽，其中所述突变型IL-2多肽与非IL-2部分连接。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的突变型IL-2多肽，其中所述突变型IL-2多肽与第一非IL-2部分和第二非IL-2部分连接。
10.根据权利要求9所述的突变型IL-2多肽，其中所述突变型IL-2多肽与所述第一非IL-2部分共享羧基末端肽键并且与所述第二非IL-2部分共享氨基末端肽键。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的突变型IL-2多肽，其中所述非IL-2部分为抗原结合部分或效应细胞结合部分。
12.一种免疫缀合物，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的突变型IL-2多肽和抗原结合部分或效应细胞结合部分。
13.根据权利要求12所述的免疫缀合物，其中所述突变型IL-2多肽与所述抗原结合部分或所述效应细胞结合部分共享氨基末端肽键或羧基末端肽键。
14.根据权利要求12或13所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含第一抗原结合部分和第二抗原结合部分或第一效应细胞抗原结合部分和第二效应细胞抗原结合部分或抗原结合部分和效应细胞结合部分。
15.根据权利要求14所述的免疫缀合物，
(i)其中所述突变型IL-2多肽与所述第一抗原结合部分共享氨基末端肽键或羧基末端肽键，并且所述第二抗原结合部分与a)所述突变型IL-2多肽或b)所述第一抗原结合部分共享氨基末端肽键或羧基末端肽键；
(ii)其中所述突变型IL-2多肽与所述第一效应细胞结合部分共享氨基末端肽键或羧基末端肽键，并且所述第二效应细胞结合部分与a)所述突变型IL-2多肽或b)所述第一效应细胞结合部分共享氨基末端肽键或羧基末端肽键；
(iii)其中所述突变型IL-2多肽与所述抗原结合部分共享氨基末端肽键或羧基末端肽键，并且所述效应细胞结合部分与a)所述突变型IL-2多肽或b)所述抗原结合部分共享氨基末端肽键或羧基末端肽键；或
(iv)其中所述突变型IL-2多肽与所述效应细胞结合部分共享氨基末端肽键或羧基末端肽键，并且所述抗原结合部分与a)所述突变型IL-2多肽或b)所述效应细胞结合部分共享氨基末端肽键或羧基末端肽键。
16.根据权利要求11所述的突变型IL-2多肽或根据权利要求12至15中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗原结合部分为抗体或抗体片段。
17.根据权利要求11所述的突变型IL-2多肽或根据权利要求12至16中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗原结合部分和/或所述效应细胞结合部分选自Fab分子和scFv分子。
18.根据权利要求11所述的突变型IL-2多肽或根据权利要求12至17中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗原结合部分和/或所述效应细胞结合部分为免疫球蛋白分子，特别是IgG分子。
19.根据权利要求11所述的突变型IL-2多肽或根据权利要求12至18中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗原结合部分针对在肿瘤细胞上存在或在肿瘤细胞环境中存在的抗原，并且/或者其中所述效应细胞结合部分针对在肿瘤细胞环境中存在的效应细胞，以实现顺式靶向。
20.一种分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1至19中任一项所述的突变型IL-2多肽或免疫缀合物。
21.一种表达载体，其包含根据权利要求20所述的多核苷酸。
22.一种宿主细胞，其包含根据权利要求20所述的多核苷酸或根据权利要求21所述的表达载体。
23.一种产生突变型IL-2多肽或其免疫缀合物的方法，所述方法包括在适合表达所述突变型IL-2多肽或所述免疫缀合物的条件下培养根据权利要求22所述的宿主细胞。
24.一种突变型IL-2多肽或免疫缀合物，其通过根据权利要求23所述的方法产生。
25.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至19或24中任一项所述的突变型IL-2多肽或免疫缀合物以及药用载体。
26.根据权利要求1至19或24中任一项所述的突变型IL-2多肽或免疫缀合物，其用于治疗有此需要的个体的疾病。
27.根据权利要求26所述的突变型IL-2多肽或免疫缀合物，其中所述疾病为癌症。
28.根据权利要求1至19或24中任一项所述的突变型IL-2多肽或免疫缀合物用于制造用于治疗有此需要的个体的疾病的药物的用途。
29.一种治疗个体的疾病的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含药用形式的根据权利要求1至19或24中任一项所述的突变型IL-2多肽或免疫缀合物。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述疾病为癌症。
31.一种刺激个体的免疫系统的方法，其包括向所述个体施用有效量的组合物，所述组合物包含药用形式的根据权利要求1至19或24中任一项所述的突变型IL-2多肽或免疫缀合物。
32.如前所述的本发明。
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