ES2606490T3 - Citocinas dirigidas por anticuerpos para terapia - Google Patents
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Abstract
Proteína de fusión que comprende: (i) un anticuerpo, fragmento funcional o derivado funcional del mismo que tiene afinidad de unión específica o bien al dominio extracelular de fibronectina oncofetal (ED-B) o bien a al menos uno de los dominios extracelulares de tenascina oncofetal fusionado a (ii) citocina IL-10, o fragmentos funcionales de la misma.
Description
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Un fragmento de anticuerpo muy conveniente para aplicaciones de direccionamiento es el fragmento Fv de cadena sencilla, en el que se unen entre sí un domino pesado variable y un dominio ligero variable mediante un ligador polipeptídico. Otros fragmentos de anticuerpos para aplicaciones de direccionamiento vascular incluyen fragmentos Fab, fragmentos Fab2, minianticuerpos (también denominados proteínas inmunitarias pequeñas), fusiones scFv-scFv en tándem así como fusiones de scFv con dominios adecuados (por ejemplo con la parte Fc de una inmunoglobulina). Para una revisión de determinados formatos de anticuerpos, véase Holliger P, Hudson PJ.; Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nat Biotechnol. Septiembre de 2005, 23(9):1126-36.).
El término “derivado funcional” de un anticuerpo para su uso en la presente invención pretende incluir cualquier anticuerpo o fragmento del mismo que se haya modificado química o genéticamente en su secuencia de aminoácidos, por ejemplo mediante adición, sustitución y/o deleción de residuo(s) de aminoácido y/o se haya modificado químicamente en al menos uno de sus átomos y/o grupos químicos funcionales, por ejemplo mediante adiciones, deleciones, transposición, oxidación, reducción, etc. siempre que el derivado tenga sustancialmente la misma afinidad de unión que su antígeno original y, preferiblemente, tenga una constante de disociación en el intervalo micro-, nano-o picomolar. El derivado más preferido de los anticuerpos para su uso en la presente invención es una proteína de fusión de anticuerpo que se definirá en más detalle más adelante.
En una realización preferida, el anticuerpo, fragmento o derivado funcional del mismo para su uso en la invención es uno que se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos injertados con CDR, fragmentos Fv, fragmentos Fab y fragmentos Fab2 y proteínas de unión similares a anticuerpos, por ejemplo afilinas, anticalinas y aptámeros.
Para una revisión de proteínas de unión similares a anticuerpos véase Binz et al. On engineering binding proteins from non-immunoglobulin domains en Nature Biotechnology, vol. 23, n.º 10, octubre de 2005, 12571268. El término “aptámero” describe ácidos nucleicos que se unen a un polipéptido con alta afinidad. Pueden aislarse aptámeros de un gran conjunto de moléculas de ARN monocatenarias diferentes mediante métodos de selección tales como SELEX (véase, por ejemplo, Jayasena, Clin. Chem., 45, págs. 1628 -1650, (1999); Klug y Famulok, M. Mol. Biol. Rep., 20, págs. 97 -107 (1994); documento US 5.582.981). También pueden sintetizarse y seleccionarse aptámeros en su forma especular, por ejemplo, como el L-ribonucleótido (Nolte et al., Nat. Biotechnol., 14, págs. 1116 -1119, (1996); Klussmann et al., Nat. Biotechnol., 14, págs. 1112 -1115, (1996)). Formas aisladas de este modo tienen la ventaja de que no se degradan por ribonucleasas que se producen de manera natural y, por tanto, tienen una mayor estabilidad.
Otra proteína de unión similar a anticuerpos y alternativa a anticuerpos clásicos son los denominados “armazones proteicos”, por ejemplo, anticalinas, que se basan en lipocalina (Beste et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, págs. 1898 -1903, (1999)). Los sitios de unión a ligando naturales de las lipocalinas, por ejemplo, de la proteína de unión a retinol o la proteína de unión a bilina, pueden cambiarse, por ejemplo, empleando un enfoque de “diseño proteico combinatorio”, y en un modo tal que pueden unirse a haptenos seleccionados (Skerra, Biochem. Biophys. Acta, 1482, págs. 337 -350, (2000)). Para otros armazones proteicos también se sabe que hay alternativas para anticuerpos (Skerra, J. Mol. Recognit, 13, págs. 167 -287, (2000)). (Hey, Trends en Biotechnology, 23, págs. 514522, (2005)).
Según la invención el término derivado de anticuerpo funcional pretende incluir dichas alternativas derivadas de proteínas para anticuerpos, es decir proteínas de unión similares a anticuerpos, por ejemplo afilinas, anticalinas y aptámeros que reconocen específicamente al menos un dominio extracelular de fibronectina oncofetal o tenascina oncofetal.
En resumen, los términos anticuerpo, fragmento funcional y derivado funcional del mismo indican todas las sustancias que tienen la misma afinidad de unión específica o similar a uno cualquiera de los dominios extracelulares de fibronectina oncofetal o tenascina oncofetal como anticuerpo completo que tiene afinidad de unión específica a estas dianas.
Para la tenascina hay varias isoformas disponibles, por ejemplo tenascina-C, tenascina-R y tenascina-X. Para la práctica de la presente invención los dominios extracelulares de la isoforma grande de tenascina-C son los más preferidos como dianas específicas para el anticuerpo, fragmento funcional o derivado funcional del mismo que es parte de las proteínas de fusión de la presente invención.
En una realización preferida el anticuerpo, fragmento funcional o derivado funcional del mismo, que es parte de una proteína de fusión de la invención, tiene una afinidad de unión específica a al menos uno de los dominios extracelulares de tenascina-C oncofetal, más preferiblemente a al menos uno de los dominios extracelulares de la isoforma grande de tenascina-C.
Los dominios extracelulares de tenascina-C se indican como dominios A1, A2, A3, A4, B, C y D. Hay ya varios anticuerpos disponibles que se dirigen contra uno de estos dominios (véase Siri A. et al., Different susceptibility of small and large human tenascin-C isoforms to degradation by matrix metalloproteinases. J. Biol. Chem., 14 de abril de 1995, 270(15):8650-4; Carnemolla B. et al., Identification of a glioblastoma-associated tenascin-C isoform by a
7
SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de aminoácidos de IL-15 humana; n.º de registro: P40933 (SwissProt); Grabstein et al., Science 264 (5161), 965-968 (1994).
SEQ ID NO: 3 muestra la secuencia de aminoácidos de IL-24 humana; n.º de registro: Q13007 (SwissProt); Jiang et 10 al., Oncogene 11 (12), 2477-2486 (1995).
SEQ ID NO: 4 muestra la secuencia de aminoácidos de GM-CSF humano; n.º de registro: P04141 (SwissProt); Lee 15 et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (13), 4360-4364 (1985).
SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia de aminoácidos de GM-CSF murino; n.º de registro: P01587 (SwissProt); 20 Miyatake et al., EMBO J. 4 (10), 2561-2568 (1985).
SEQ ID NO: 6 muestra la secuencia de aminoácidos de L19 (largo); Viti et al., Cancer Res., 59(2): 347-52 (1999).
(Las letras en negrita indican el ligador de 14 aminoácidos) 30 SEQ ID NO: 7 muestra la secuencia de aminoácidos de L19 (corto) (aún no publicado).
10
SEQ ID NO: 13 muestra la secuencia de aminoácidos de G11 (corto).
SEQ ID NO: 14 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión L19 (largo) -hulL-10:
SEQ ID NO: 15 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión L19 (corto) -huIL15:
SEQ ID NO: 16 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión huIL15 -L19 (corto):
SEQ ID NO: 17 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión huIL24-L19 (corto):
12
intravenosa (i.v.) en la vena lateral de la cola solución salina (círculos negros), L19-IL2 (triángulos negros, línea discontinua), L19-TNFalfa (cruces, línea discontinua) o L19-IL10 (cuadrados blancos) diluido en un volumen de 200 l de solución salina. Se iniciaron las inyecciones en el día 1 tras la aparición de la artritis y se repitieron luego cada dos días durante 3 inyecciones por animal tal como se indica mediante las flechas. Las dosis acumulativas
5 para las proteínas de fusión fueron: 20 g de equivalentes de IL2, 6 g de equivalentes de TNFalfa y 150 g de equivalentes de IL 10 por ratón, respectivamente. Se evaluó la puntuación artrítica diariamente y se expresó como medias EEM. Se midió la hinchazón de las patas cada dos días y se asignó la media de las 4 patas como grosor de la pata a cada animal. Los resultados presentados son medias EEM de cada grupo. Cada grupo consistía en 7 ratones.
10 La figura 5 demuestra que la administración dirigida de IL10 a sitios de inflamación es superior al tratamiento con IL10 sistémico. Se les inyectó a ratones artríticos por vía intravenosa (i.v.) en la vena lateral de la cola solución salina (círculos negros), L19-IL10 (cuadrados blancos) o HyHel10-IL10 (cruces, línea discontinua) diluido en un volumen de 200 I de solución salina. Se iniciaron las inyecciones en el día 1 de aparición de la artritis y luego se
15 repitieron cada dos días durante 3 inyecciones por animal tal como se indica mediante las flechas. Las dosis acumulativas para las proteínas de fusión fueron 150 g de equivalentes de IL10 por ratón. Se evaluó la puntuación artrítica diariamente y se expresó como medias EEM. Se midió la hinchazón de las patas cada dos días y se asignó la media de las 4 patas como grosor de la pata a cada animal. Los resultados presentados son medias EEM de cada grupo. Cada grupo contenía 6 ratones.
20 La figura 6 ilustra la terapia de tumores F9 s.c. con diferentes cantidades de L19-GM-CSF. Inyecciones i.v. diarias durante cuatro días consecutivos (flechas) con 60 g de L19-GM-CSF demostraron un retardo del crecimiento tumoral significativo en comparación con el grupo tratado con solución salina (PBS).
25 La figura 7 ilustra la terapia de tumores F9 s.c. con L19-IL15. Inyecciones i.v. diarias durante cuatro días consecutivos (flechas) con 50 g de L19-IL15 demostraron un retardo del crecimiento tumoral significativo en comparación con el grupo de control (PBS).
La figura 8 ilustra the terapia de tumores F9 s.c. con IL24-L19. Inyecciones i.v. diarias durante cuatro días
30 consecutivos (flechas) con 50 g de IL24-L19 mostraron un retardo del crecimiento tumoral significativo en comparación con el grupo de control (PBS).
Ejemplos
35 Ejemplo 1 -Preparación de proteínas de fusión
Se fusionaron genéticamente las citocinas al extremo o bien C-o bien N-terminal de los fragmentos de anticuerpos scFv separados por un ligador de 15 aminoácidos. Se clonaron los fragmentos resultantes, precedidos por una secuencia de secreción requerida para la secreción de proteínas recombinantes, en un vector de expresión de
40 mamíferos y se expresaron las proteínas de fusión en células HEK 293 transfectadas de manera estable. Se purificaron los constructos del medio de cultivo mediante cromatografía de afinidad en columnas de antígenos a rendimientos de 1-2 mg / l. Se realizó el control de calidad mediante SDS-PAGE y filtración en gel.
Ejemplo 2 -Formulación y administración de proteínas de fusión
45 imagen21 Se almacenan las proteínas en uno de los siguientes tampones dependiendo de su punto isoeléctrico y el tiempo de almacenamiento deseado. Las proteínas se mantienen durante un almacenamiento de tiempo largo (más de un mes) a menos 80ºC. Para evitar la agregación por ciclos de congelación y descongelación repetidos, pueden
50 añadirse glicerol al 1% y Tween 80 al 0,04%.
PBS (solución salina tamponada con fosfato): NaCl 100 mM, Na2HPO4 30 mM x 2 H2O, NaH2PO4 20 mM x 2 H2O, pH 7,4
55 K-PBS: NaCl 137 mM, Na2HPO4 8 mM x 2 H2O, KCI 2,7 mM, KH2PO4 1,5 mM, pH 7,4
PBS Siena: NaCl 20 mM, Na2HPO4 6,7 mM x 2 H2O, KCI 1,8 mM, manitol 133 mM, pH 6,3
TBS (solución salina tamponada con Tris): Tris 20 mM, NaCl 130 mM, pH 8,2
60 Se administran normalmente las inyecciones 3-5 veces, diariamente o cada dos días. La dosificación se selecciona según valores de la bibliografía siguiendo experimentación de rutina.
Ejemplo 3 -Eficacia de direccionamiento de la proteína de fusión en ratones 129Sv injertados con tumores F9 65 subcutáneos
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imagen1
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