TWI592424B - 新穎免疫結合物 - Google Patents

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TWI592424B
TWI592424B TW101115308A TW101115308A TWI592424B TW I592424 B TWI592424 B TW I592424B TW 101115308 A TW101115308 A TW 101115308A TW 101115308 A TW101115308 A TW 101115308A TW I592424 B TWI592424 B TW I592424B
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彼得 布倫克
湯瑪士 哈福
羅夫 荷斯
克里斯汀 克萊
依哈德 摩斯那
帕伯羅 優瑪那
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Description

新穎免疫結合物
本發明一般係關於選擇性傳遞影響細胞活性之效應子部分的抗原特異性免疫結合物。此外，本發明係關於編碼該等免疫結合物之聚核苷酸，及包含該等聚核苷酸之載體及宿主細胞。本發明另外係關於製造本發明免疫結合物之方法，及使用此等免疫結合物治療疾病之方法。
在多種臨床環境中通常需要選擇性破壞個別細胞或特定細胞類型。舉例而言，癌症療法之主要目標為特異性破壞腫瘤細胞同時使健康細胞及組織完整且未損傷。細胞中之大量信號傳導路徑與細胞存活及/或死亡有關。因此，細胞存活或死亡中涉及之路徑因子的直接傳遞可用於促成細胞之維持或破壞。類似地，可傳遞刺激腫瘤微環境中之免疫效應細胞(諸如自然殺手(NK)細胞或細胞毒性T淋巴細胞(CTL))的特定因子以攻擊及破壞腫瘤細胞。
細胞激素為參與調控免疫系統之細胞信號傳導分子。當用於癌症療法中時，細胞激素可用作具有抗腫瘤作用且可提高一些類型腫瘤之免疫原性的免疫調節劑。然而，快速血液清除及缺乏腫瘤特異性需要全身性投與高劑量細胞激素以在腫瘤部位達到足以活化免疫反應或具有抗腫瘤作用之細胞激素濃度。此等高含量之全身性細胞激素可能導致嚴重毒性及不良反應。
為了用於療法中，因此需要將信號傳導路徑因子(諸如 細胞激素)特異性傳遞至活體內特定位點(例如癌症療法情形中之腫瘤或腫瘤微環境)。此可藉由使因子與對該位點有特異性之靶向部分(例如抗體或抗體片段)結合來實現。早期策略旨在將信號傳導路徑因子(諸如細胞激素)傳遞至活體內特異性位點，該位點包括與多種細胞激素(包括淋巴毒素、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、介白素-2(IL-2)及顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF))結合之免疫球蛋白重鏈(例如在Lode等人，Pharmacol Ther 80,277-292(1998)中有綜述)。
研究者觀測到，其不僅能夠使細胞激素靶向活體內特異性位點，而且亦能夠利用單株抗體之血清半衰期比大多數其他蛋白質之血清半衰期長的事實。由於與高劑量之特定未結合細胞激素(例如IL-2)相關的全身性細胞毒性，因此免疫球蛋白-細胞激素融合蛋白在較低劑量下使所要位點(例如腫瘤中)之治療有益生物活性最大同時保持全身性副作用最低的能力使研究者相信免疫球蛋白-細胞激素免疫結合物為最佳治療劑。
然而，存在與此項技術中已知的免疫球蛋白-細胞激素免疫結合物相關的特定缺陷。舉例而言，此等免疫結合物具有至少一個與兩個免疫球蛋白重鏈中之每一者偶聯的細胞激素，產生具有二價目標結合及兩個或兩個以上細胞激素部分的免疫結合物(例如在Chang等人，Expert Opin Drug Discovery 4,181-194(2009)或Ortiz-Sanchez等人，Expert Opin Biol Ther 8,609-632(2008)中有綜述)。圖1描 繪如此項技術中已知之習知免疫球蛋白-細胞激素免疫結合物，其中細胞激素與兩個抗體重鏈之每一者的C端融合。由於存在兩個或兩個以上細胞激素部分，所以該免疫結合物對各別細胞激素受體具有高親合力(例如在IL-2情形中之皮莫耳親和力)，且因此靶向表現細胞激素受體之免疫效應細胞而非連接細胞激素之免疫球蛋白的目標抗原(nM親和力)。此外，習知免疫結合物已知與輸注反應相關(參看例如King等人，J Clin Oncol 22,4463-4473(2004))，此至少部分由免疫結合物之細胞激素部分活化周邊血液中免疫效應細胞上的細胞激素受體引起。
此外，免疫球蛋白-細胞激素免疫結合物可經其Fc結構域活化補體且與Fc受體相互作用。此固有免疫球蛋白特徵被視為不利的，這是因為治療性免疫結合物可靶向表現Fc受體之細胞而非具有較佳抗原之細胞。此外，同時活化細胞激素受體及Fc受體信號傳導路徑導致細胞激素釋放，與長半衰期之免疫球蛋白融合蛋白組合時尤其如此，使其在治療環境中之應用因全身性毒性而變得困難。
克服此問題之一個手段為使用免疫結合物中無Fc結構域之免疫球蛋白片段，諸如scFv或Fab片段。免疫球蛋白片段-細胞激素免疫結合物之實例包括如PCT公開案WO 2001/062298中所述之scFv-IL-2免疫結合物、如PCT公開案WO 2006/119897中所述之scFv-IL-12-scFv免疫結合物(其中兩個scFv片段中之每一者連接於由二硫鍵固持在一起的IL-12雜二聚體之次單元)或如PCT公開案WO 2011/020783 中所述之Fab-IL-2-Fab免疫結合物。多數此等類型之免疫結合物中保持免疫球蛋白母分子之腫瘤結合反應性及細胞激素之功能活性兩者，然而，該等構築體之半衰期比免疫球蛋白融合蛋白顯著較短。
因此，為了較大治療效用及此等產品之副作用(例如毒性、非腫瘤細胞之破壞等)數量及嚴重程度的降低，仍需要具有改良性質之免疫結合物。
本發明提供免疫球蛋白樣免疫結合物，其相對於已知免疫結合物展現改良之功效、高作用特異性、降低之毒性，及改良之血液半衰期及穩定性。
本發明部分基於本發明者之以下認識：包含一個以上效應子部分(諸如細胞激素)之免疫結合物可靶向各別效應子部分受體而非免疫結合物之抗原結合部分的目標抗原。因此，在一個態樣中，本發明提供一種免疫結合物，其包含第一抗原結合部分、由兩個次單元組成之Fc結構域及效應子部分，其中存在不超過一個效應子部分。在一個實施例中，效應子部分視情況經連接子肽融合於Fc結構域之兩個次單元中之一者的胺基或羧基端胺基酸。在一個實施例中，第一抗原結合部分視情況經連接子肽或免疫球蛋白鉸鏈區融合於Fc結構域之兩個次單元中之一者的胺基端胺基酸。
在一個實施例中，第一抗原結合部分包含抗體之抗原結合域。在一特定實施例中，第一抗原結合部分為Fab分 子。在某些實施例中，Fc結構域包含促進兩個不相同多肽鏈之雜二聚合的修飾。在一特定實施例中，該修飾為杵臼修飾，其包含在Fc結構域之一個次單元中的杵修飾及在Fc結構域之兩個次單元之另一者中之臼修飾。在一特定實施例中，效應子部分融合於包含杵修飾之Fc結構域之次單元的胺基或羧基端胺基酸。
在一個實施例中，Fc結構域為IgG Fc結構域，尤其是IgG1 Fc結構域。在一特定實施例中，Fc結構域為人類。
在本發明之某些實施例中，Fc結構域經工程改造以具有與Fc受體之經改變結合，尤其與Fcγ受體之經改變結合，及/或經改變效應子功能，尤其是經改變抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
儘管Fc結構域之存在對於延長免疫結合物之半衰期不可缺少，但本發明者認識到在一些情形中，消除Fc受體與Fc結構域之嚙合相關的效應子功能將有益處。因此，在特定實施例中，與Fc受體之經改變結合及/或效應子功能為降低之結合及/或效應子功能。在一所述特定實施例中，Fc結構域包含一或多個降低Fc結構域與Fc受體，尤其是與Fcγ受體之結合的胺基酸突變。該胺基酸突變較佳不會降低與FcRn受體之結合。在一個實施例中，Fc結構域在位置P329處包含胺基酸取代。在一特定實施例中，Fc結構域在其每一個次單元中包含胺基酸取代L234A、L235A及P329G。
另一方面，可存在需要提高免疫結合物之效應子功能的 情形。因此，在某些實施例中，本發明免疫結合物之Fc結構域經工程改造以具有與Fc受體，特定言之Fcγ受體，更特定言之FcγIIIa受體的經改變結合，及/或經改變效應子功能，其中經改變結合及/或效應子功能為提高之結合及/或效應子功能。在一個所述實施例中，Fc結構域經工程改造以具有相較於未經工程改造之Fc結構域改變之寡醣結構。在一所述特定實施例中，Fc結構域相較於未經工程改造之Fc結構域包含增加比例之非海藻糖基化寡醣。在一更特定實施例中，Fc結構域包含至少20%，尤其至少50%，更尤其至少70%非海藻糖基化寡醣。在另一特定實施例中，Fc結構域相較於未經工程改造之Fc結構域包含增加比例之等分寡醣。在另一特定實施例中，Fc結構域相較於未經工程改造之Fc結構域包含增加比例之等分非海藻糖基化寡醣。在一些實施例中，該經改變寡醣結構由用於表現免疫結合物之宿主細胞中增加之β(1,4)-N-乙醯基葡糖胺基轉移酶III(GnTIII)活性產生。
在一特定態樣中，本發明提供一種免疫結合物，其包含第一及第二抗原結合部分、由兩個次單元組成之Fc結構域及效應子部分，其中存在不超過一個效應子部分。在一個實施例中，第一及第二抗原結合部分及Fc結構域為免疫球蛋白分子之部分。在某些實施例中，免疫結合物基本上由免疫球蛋白分子及效應子部分及視情況存在之一或多個連接子序列組成。在一特定實施例中，免疫球蛋白分子為IgG類免疫球蛋白。在一甚至更特定實施例中，免疫球蛋 白為IgG1子類免疫球蛋白。在一個實施例中，效應子部分視情況經連接子肽融合於免疫球蛋白重鏈中之一者的羧基端胺基酸。
在一特定實施例中，本發明之免疫結合物包含免疫球蛋白分子，其包含兩個抗原結合部分及Fc結構域，及融合於免疫球蛋白重鏈中之一者的羧基端胺基酸上之效應子部分，其中存在不超過一個效應子部分且其中Fc結構域經工程改造以具有與Fc受體之降低結合，特定言之與Fcγ受體之經改變結合，及/或降低之效應子功能。
在某些實施例中，該第一抗原結合部分或該第一及該第二抗原結合部分針對與病理狀況相關之抗原，諸如腫瘤細胞上或腫瘤細胞環境中在發炎位點處或在病毒感染細胞上呈現之抗原。在一更特定實施例中，該抗原係選自以下之群：纖維母細胞活化蛋白(FAP)、肌糖蛋白(Tenascin)-C之A1結構域(TNC A1)、肌糖蛋白-C之A2結構域(TNC A2)、纖維結合蛋白之額外結構域B(EDB)、癌胚抗原(CEA)及黑素瘤相關之硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)。
在某些實施例中，效應子部分為單鏈效應子部分。在一特定實施例中，效應子部分為細胞激素。在一個實施例中，該細胞激素係選自以下之群：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IFN-α及IFN-γ。在一特定實施例中，該細胞激素為IL-2。在一甚至更特定實施例中，該細胞激素為對IL-2受體之α次單元具有降低之結合親和力的突變IL-2多肽。在一特定實施例中，該突變IL-2多肽在選自對應於人 類IL-2之殘基42、45及72之位置的一或多個位置處包含胺基酸取代。在另一特定實施例中，細胞激素為IL-10。在另一實施例中，細胞激素為對IL-15受體之α次單元具有降低之結合親和力的IL-15，尤其是突變IL-15多肽。在另一實施例中，細胞激素為IFN-α。
根據本發明之另一態樣，提供編碼本發明免疫結合物或其片段之經分離聚核苷酸。本發明另外提供包含本發明之經分離聚核苷酸之表現載體，及包含本發明之經分離聚核苷酸或表現載體之宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞為真核細胞，尤其是哺乳動物細胞。在一些實施例中，宿主細胞經操作以表現增加含量之一或多種具有β(1,4)-N-乙醯基葡糖胺基轉移酶III(GnTIII)活性的多肽。在一個所述實施例中，宿主細胞經進一步操作以表現增加含量之一或多種具有α-甘露糖苷酶II(ManII)活性之多肽。
在另一態樣中，提供製造本發明免疫結合物之方法，其包含以下步驟：a)在適於表現免疫結合物之條件下培養本發明宿主細胞及b)回收免疫結合物。本發明亦涵蓋由本發明方法製造之免疫結合物。
本發明另外提供包含本發明免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
本發明亦涵蓋使用本發明之免疫結合物及醫藥組合物之方法。在一個態樣中，本發明提供本發明之免疫結合物或醫藥組合物，其用作藥物。在一個態樣中，提供本發明之免疫結合物或醫藥組合物，其用於治療有需要個體之疾 病。在一特定實施例中，該疾病為癌症。在其他實施例中，該疾病為發炎病症。在一所述特定實施例中，免疫結合物包含IL-10效應子部分。
亦提供本發明免疫結合物之用途，其用於製造用以治療有需要個體之疾病的藥物；以及治療個體之疾病的方法，其包含向該個體投與治療有效量之包含醫藥學上可接受形式之本發明免疫結合物的組合物。在一特定實施例中，該疾病為癌症。在其他實施例中，該疾病為發炎病症。在一所述特定實施例中，免疫結合物包含IL-10效應子部分。
在任何上述實施例中，個體較佳為哺乳動物，尤其是人類。
定義
除非下文中另外定義，否則術語以此項技術中一般使用之形式用於本文中。
如本文所用，術語「免疫結合物」係指融合多肽分子，其包括一個效應子部分、至少一個抗原結合部分及Fc結構域，其限制條件為存在不超過一個效應子部分。在某些實施例中，免疫結合物包含一個效應子部分、兩個抗原結合部分及Fc結構域。本發明之特定免疫結合物基本上由一個效應子部分、兩個抗原結合部分及Fc結構域組成，其經一或多個連接子序列接合。抗原結合部分與效應子部分可經多種相互作用且以本文所述之多種組態接合於Fc結構域。在一特定實施例中，兩個抗原結合部分與Fc結構域以形成 完整免疫球蛋白分子之組態彼此接合。本文提及之免疫結合物為融合蛋白，亦即免疫結合物之組分由肽鍵直接連接或經連接子肽彼此連接。
如本文所用，術語「抗原結合部分」係指特異性結合於抗原決定子之多肽分子。在一個實施例中，抗原結合部分能夠使其所連接之實體(例如效應子部分或第二抗原結合部分)針對目標位點，例如特定類型之腫瘤細胞或具有抗原決定子之腫瘤基質。抗原結合部分包括如本文另外定義之抗體及其片段。特定抗原結合部分包括抗體之抗原結合域，其包含抗體重鏈可變區及抗體輕鏈可變區。在某些實施例中，抗原結合部分可包含如本文另外定義且此項技術中已知之抗體恆定區。適用之重鏈恆定區包括5種同型中之任一種：α、δ、ε、γ或μ。適用輕鏈恆定區包括兩種同型中之任一種：及λ。
如本文所用，術語「抗原決定子」與「抗原」及「抗原決定基」同義，且係指多肽大分子上與抗原結合部分結合形成抗原結合部分-抗原複合物的位點(例如胺基酸之連續延伸段或由不同非連續胺基酸區域形成之構形組態)。適用抗原決定子可見於例如腫瘤細胞之表面上、病毒感染細胞之表面上、其他患病細胞之表面上、游離於血清中，及/或在胞外基質(ECM)中。在一特定實施例中，抗原決定子為人類抗原。
「特異性結合」意謂結合對抗原具有選擇性且可與非所要或非特異性相互作用加以區分。抗原結合部分結合特異 性抗原決定子之能力可經酶聯結免疫吸附分析法(ELISA)或熟習此項技術者熟悉的其他技術量測，例如表面電漿子共振(SPR)技術(在BIAcore儀器上分析)(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))及傳統結合分析法(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))。在一個實施例中，例如藉由SPR所量測，抗原結合部分與無關蛋白質的結合程度小於抗原結合部分與抗原之結合的約10%。在某些實施例中，結合於抗原之抗原結合部分或包含彼抗原結合部分之免疫結合物具有1 μM、100 nM、10 nM、1 nM、0.1 nM、0.01 nM或0.001 nM(例如10-8 M或10-8 M以下，例如10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M)之解離常數(KD)。
「親和力」係指分子(例如受體)之單個結合位點與其結合搭配物(例如配位體)之間的非共價相互作用的總強度。如本文所用，除非另外指出，否則「結合親和力」係指反映結合對成員(例如受體及配位體)之間1：1相互作用的固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一般可由解離常數(KD)表示，其為解離速率常數與締合速率常數(分別為koff及kon)的比率。因此，相等親和力可包含不同速率常數，只要速率常數之比率保持相同即可。親和力可藉由此項技術中已知之充分確立方法(包括本文所述之方法)量測。量測親和力之特定方法為表面電漿子共振(SPR)。
「降低之結合」(例如與Fc受體或CD25降低之結合)係指例如藉由SPR所量測，各別相互作用之親和力降低。為清 楚起見，該術語亦包括親和力降至0(或分析法之偵測限度以下)，亦即完全消除相互作用。相反地，「提高之結合」係指各別相互作用之結合親和力提高。
如本文所用，關於抗原結合部分等之術語「第一」及「第二」在存在一個以上各類型之部分時用於方便區別。除非明確說明，否則使用此等術語不欲賦予免疫結合物以特定順序或方向。
如本文所用，術語「效應子部分」係指影響細胞活性(例如經信號傳導或其他細胞路徑)之多肽，例如蛋白質或醣蛋白。因此，本發明之效應子部分可與受體介導之信號傳導相關，該信號傳導傳輸來自細胞膜外部之信號以調節具有一或多個針對效應子部分之受體之細胞中的反應。在一個實施例中，效應子部分可引發具有一或多個針對效應子部分之受體之細胞中的細胞毒性反應。在另一實施例中，效應子部分可引發具有一或多個針對效應子部分之受體之細胞中的增殖反應。在另一實施例中，效應子部分可引發具有針對效應子部分之受體之細胞的分化。在另一實施例中，效應子部分可改變具有針對效應子部分之受體之細胞中的內源性細胞蛋白質之表現(亦即上調或下調)。效應子部分之非限制性實例包括細胞激素、生長因子、激素、酶、受質及輔因子。效應子部分可與多種組態之抗原結合部分或Fc結構域締合形成免疫結合物。
如本文所用，術語「細胞激素」係指介導及/或調控生物或細胞功能或過程(例如免疫性、發炎及造血)之分子。 如本文所用，術語「細胞激素」包括「淋巴因子」、「趨化因子」、「單核球激素」及「介白素」。適用細胞激素之實例包括(但不限於)GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α及TNF-β。特定細胞激素為IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IFN-α及IFN-γ。在特定實施例中，細胞激素為人類細胞激素。如本文所用，術語「細胞激素」亦包括細胞激素變異體，其包含相應野生型細胞激素之胺基酸序列中之一或多個胺基酸突變，諸如Sauvé等人，Proc Natl Acad Sci USA 88,4636-40(1991)；Hu等人，Blood 101,4853-4861(2003)及美國專利公開案第2003/0124678號；Shanafelt等人，Nature Biotechnol 18,1197-1202(2000)；Heaton等人，Cancer Res 53,2597-602(1993)及美國專利第5,229,109號；美國專利公開案第2007/0036752號；WO 2008/0034473；WO 2009/061853；或PCT專利申請案第PCT/EP2012/051991號中所述之IL-2變異體。本文描述其他細胞激素變異體，例如IL-15之變異體。在某些實施例中，細胞激素經突變以消除糖基化。
如本文所用，術語「單鏈」係指包含由肽鍵線性連接之胺基酸單體的分子。在一個實施例中，效應子部分為單鏈效應子部分。單鏈效應子部分之非限制性實例包括細胞激素、生長因子、激素、酶、受質及輔因子。當效應子部分 為細胞激素且所關注之細胞激素通常在自然界中以多聚體形式發現時，多聚細胞激素之各次單元由效應子部分之單鏈依序編碼。因此，適用單鏈效應子部分之非限制性實例包括GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α及TNF-β。
如本文所用，術語「對照效應子部分」係指未結合之效應子部分。舉例而言，當比較本文所述之IL-2免疫結合物與對照效應子部分時，對照效應子部分為游離的未結合IL-2。同樣，例如當比較IL-12免疫結合物與對照效應子部分時，對照效應子部分為游離的未結合IL-12(例如以p40及p35次單元僅共用二硫鍵之雜二聚合蛋白質形式存在)。
如本文所用，術語「效應子部分受體」係指能夠特異性結合於效應子部分之多肽分子。舉例而言，若IL-2為效應子部分，則結合於IL-2分子(例如包含IL-2之免疫結合物)的效應子部分受體為IL-2受體。類似地，例如當IL-12為免疫結合物之效應子部分時，效應子部分受體為IL-12受體。當效應子部分特異性結合於一個以上受體時，特異性結合於效應子部分之所有受體均為彼效應子部分之「效應子部分受體」。
術語「免疫球蛋白分子」係指具有天然存在抗體之結構的蛋白質。舉例而言，IgG類免疫球蛋白為約150,000道爾頓(dalton)且由經二硫鍵鍵結之兩個輕鏈及兩個重鏈構成之雜四聚醣蛋白。自N端至C端，各重鏈具有可變區 (VH)(亦稱為可變重鏈結構域或重鏈可變域)，繼之以三個恆定域(CH1、CH2及CH3)，亦稱為重鏈恆定區。類似地，自N端至C端，各輕鏈具有可變區(VL)(亦稱為可變輕鏈結構域或輕鏈可變域)，繼之以恆定輕鏈(CL)結構域，亦稱為輕鏈恆定區。免疫球蛋白之重鏈可歸為5種類型中之一種，稱為α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中一些可進一步分成亞型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)及α2(IgA2)。免疫球蛋白輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列歸為兩種類型中之一種，稱為及λ。免疫球蛋白基本上由經免疫球蛋白鉸鏈區連接之兩個Fab分子及Fc結構域組成。
本文之術語「抗體」以最廣泛含義使用且涵蓋多種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體及展現所要抗原結合活性之抗體片段。
「抗體片段」係指並非完整抗體之分子，其包含結合完整抗體所結合之抗原的完整抗體之一部分。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)及單結構域抗體。某些抗體片段之綜述參看Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)。scFv片段之綜述參看例如Plückthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編，Springer-Verlag,New York，第269-315頁(1994)；亦參看WO 93/16185；及美國專利第5,571,894號 及第5,587,458號。包含救助受體結合抗原決定基殘基且活體內半衰期增加之Fab及F(ab')2片段的論述參看美國專利第5,869,046號。雙功能抗體為可為二價或雙特異性之具有兩個抗原結合位點之抗體片段。參看例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)中。單結構域抗體為包含抗體之所有或一部分重鏈可變域或所有或一部分輕鏈可變域之抗體片段。在某些實施例中，單結構域抗體為人類單結構域抗體(Domantis,Inc.,Waltham,MA；參看例如美國專利第6,248,516 B1號)。抗體片段可藉由多種技術製備，包括(但不限於)如本文所述之完整抗體之蛋白水解消化以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌(E.coli)或噬菌體)產生。
術語「抗原結合域」係指包含特異性結合於部分或所有抗原且與部分或所有抗原互補之區域的抗體部分。抗原結合域可由例如一或多個抗體可變域(亦稱為抗體可變區)提供。特定言之，抗原結合域包含抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)。
術語「可變區」或「可變域」係指抗體與抗原結合中所涉及之抗體重鏈或輕鏈的結構域。原生抗體之重鏈及輕鏈之可變域(分別為VH及VL)一般具有類似結構，各結構域包含四個保守構架區(FR)及三個高變區(HVR)。參看例如 Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91頁(2007)。單個VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。
如本文所用，術語「高變區」或「HVR」係指序列高度可變及/或形成結構上限定之環(「高變環」)的抗體可變域之各區。一般而言，原生四鏈抗體包含6個HVR；3個在VH(H1、H2、H3)中且3個在VL(L1、L2、L3)中。HVR一般包含來自高變環及/或來自「互補決定區」(CDR)之胺基酸殘基，互補決定區具有最高序列可變性及/或牽涉於抗原辨識中。除VH中之CDR1外，CDR一般包含形成高變環之胺基酸殘基。高變區(HVR)亦稱為「互補決定區」(CDR)，且此等術語在提及形成抗原結合區之可變區之一部分時在本文中可互換使用。此特定區域已由Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services,Sequences of Proteins of Immunological Interest(1983)及Chothia等人，J Mol Biol 196：901-917(1987)描述，其中定義包括胺基酸殘基彼此比較時的重疊或子集。然而，涉及抗體或其變異體之CDR之任一定義的應用欲在如本文所定義及使用之術語範疇內。涵蓋如由上文所引用之參考文獻之每一者所定義之CDR的適當胺基酸殘基闡明於下表1中作為比較。涵蓋特定CDR之精確殘基數目將視CDR之序列及大小而變化。在給定抗體之可變區胺基酸序列下，熟習此項技術者可常規確定哪種殘基構成特定CDR。
Kabat等人亦定義適用於任何抗體之可變區序列的編號系統。一般技術人員可在不依靠超出序列本身以外的任何實驗數據的情形下對任何可變區序列明確指定此「Kabat編號」系統。如本文所用，「Kabat編號」係指由Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services,「Sequence of Proteins of Immunological Interest」(1983)所闡述之編號系統。除非另外說明，否則提及特定胺基酸殘基位置在抗體可變區中之編號係根據Kabat編號系統進行。
序列列表之多肽序列(亦即SEQ ID NO 23、25、27、29、31等)不根據Kabat編號系統編號。然而，序列列表之序列編號轉換為Kabat編號的操作充分處於一般技術者能力範圍內。
「構架」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基之外的可變 域殘基。可變域之FR一般由4個FR結構域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，HVR及FR序列一般以以下順序出現於VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
抗體或免疫球蛋白之「類別」係指其重鏈具有之恆定域或恆定區的類型。存在5種主要抗體類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且其中若干可進一步分為子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
本文之術語「Fc結構域」或「Fc區」用於定義免疫球蛋白重鏈之含有至少一部分恆定區的C端區。該術語包括原生序列Fc區及變異Fc區。儘管IgG重鏈之Fc區的邊界可能稍微變化，但人類IgG重鏈Fc區一般定義為自Cys226或Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而，Fc區之C端離胺酸(Lys447)可存在或不存在。除非本文另外說明，否則Fc區或恆定區中之胺基酸殘基編號係根據EU編號系統(亦稱為EU指數)進行，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版。Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。如本文所用之Fc結構域的「次單元」係指形成二聚Fc結構域之兩個多肽中之一者，亦即包含免疫球蛋白重鏈之C端恆定區且能夠穩定自身締合之多肽。舉例而言，IgG Fc結構域之次單元包含IgG CH2及IgG CH3恆定域。
「促進雜二聚合之修飾」為減少或防止多肽與相同多肽 締合形成均二聚體的肽主鏈之操作或多肽之轉譯後修飾。如本文所用之促進雜二聚合之修飾尤其包括對兩個多肽中之每一者所作出的形成二聚體所需之各別修飾，其中修飾彼此互補以便促進兩個多肽之締合。舉例而言，促進雜二聚合之修飾可改變形成二聚體所需之一個或兩個多肽之結構或電荷，以使其締合分別在空間上或靜電學上有利。雜二聚合出現於兩個不相同多肽之間，諸如Fc結構域之兩個次單元，其中與各次單元(例如抗原結合部分、效應子部分)融合之其他免疫結合物組分不相同。在本發明之免疫結合物中，促進雜二聚合之修飾在Fc結構域中。在一些實施例中，促進雜二聚合之修飾包含胺基酸突變，特別是胺基酸取代。在一特定實施例中，促進雜二聚合之修飾在Fc結構域之兩個次單元之每一者中包含各別胺基酸突變，特別是胺基酸取代。
術語「效應子功能」係指由抗體之Fc區引起的彼等生物活性，其隨抗體同型而改變。抗體效應子功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)；細胞激素分泌；免疫複合物介導之抗原呈現細胞的抗原攝取；細胞表面受體(例如B細胞受體)下調；及B細胞活化。
如本文所用，術語「工程改造」被視為包括肽主鏈之任何操作或天然存在或重組多肽或其片段之轉譯後修飾。工程改造包括胺基酸序列、糖基化模式或個別胺基酸之側鏈 基團的修飾以及此等方法之組合。「工程改造」(尤其是具有字首「糖-」)以及術語「糖基化工程改造」包括細胞之糖基化機制的代謝工程改造，包括對寡醣合成路徑進行遺傳操作以實現細胞中表現之醣蛋白的經改變糖基化。此外，糖基化工程改造包括突變及細胞環境對糖基化之作用。在一個實施例中，糖基化工程改造為糖基轉移酶活性之改變。在一特定實施例中，工程改造導致改變之葡糖胺基轉移酶活性及/或海藻糖基轉移酶活性。可使用糖基化工程改造獲得「具有增加之GnTIII活性的宿主細胞」、「具有增加之ManII活性的宿主細胞」或「具有降低之α(1,6)海藻糖基轉移酶活性的宿主細胞」。
如本文所用，術語「胺基酸突變」欲涵蓋胺基酸取代、缺失、插入及修飾。可對取代、缺失、插入及修飾作出任何組合以獲得最終構築體，只要最終構築體具有所要特徵即可，例如與Fc受體降低之結合或與CD25降低之結合。胺基酸序列缺失及插入包括胺基酸之胺基及/或羧基端缺失及插入。特定胺基酸突變為胺基酸取代。為了改變例如Fc區或細胞激素(諸如IL-2)之結合特徵，非保守胺基酸取代(亦即以具有不同結構及/或化學性質之另一胺基酸置換一個胺基酸)尤其較佳。胺基酸取代包括以非天然存在胺基酸或20個標準胺基酸之天然存在胺基酸衍生物(例如4-羥基脯胺酸、3-甲基組胺酸、鳥胺酸、高絲胺酸、5-羥基離胺酸)進行置換。可使用此項技術中熟知之遺傳或化學方法製造胺基酸突變。遺傳方法可包括定點突變誘發、 PCR、基因合成及其類似方法。預期藉由除遺傳工程改造之外的方法改變胺基酸側鏈基團的方法(諸如化學修飾)亦適用。本文可使用多個名稱表示同一胺基酸突變。舉例而言，在Fc結構域之位置329處將脯胺酸取代為甘胺酸可表示為329G、G329、G329、P329G或Pro329Gly。
如本文所用，術語「多肽」係指由醯胺鍵(亦稱為肽鍵)線性連接之單體(胺基酸)構成的分子。術語「多肽」係指具有兩個或兩個以上胺基酸之任何鏈，且不是指產物之特定長度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、「蛋白質」、「胺基酸鏈」或用於指示具有兩個或兩個以上胺基酸之鏈的任何其他術語均包括於「多肽」之定義內且術語「多肽」可代替此等術語中之任一者使用或可與其互換使用。術語「多肽」亦欲指多肽之表現後修飾的產物，包括(但不限於)糖基化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、由已知保護/封端基團進行衍生、蛋白水解裂解或由非天然存在之胺基酸進行修飾。多肽可源自天然生物來源或藉由重組技術產生，但不必由指定核酸序列轉譯。其可以任何方式產生，包括藉由化學合成。本發明之多肽的大小可為約3個或3個以上、5個或5個以上、10個或10個以上、20個或20個以上、25個或25個以上、50個或50個以上、75個或75個以上、100個或100個以上、200個或200個以上、500個或500個以上、1,000個或1,000個以上、或2,000個或2,000個以上胺基酸。多肽可具有限定三維結構，但其並非必須具有該結構。具有限定三維結構之多肽被稱為經摺疊的，而不具有 限定三維結構之多肽可採用許多不同構形，且被稱為未經摺疊的。
「經分離」多肽或其變異體或衍生物欲為其天然環境中不存在之多肽。無需特定程度之純化。舉例而言，經分離多肽可自其原生或天然環境中移出。重組產生之多肽及宿主細胞中表現之蛋白質對於本發明而言被視為經分離的，如同已藉由任何適合技術分離、分餾或部分或實質上純化的原生或重組多肽一般。
相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」被定義為在比對參考多肽序列與候選序列且必要時引入間隙以達成最大序列一致性百分比之後，且在不將任何保守取代視為序列一致性之一部分的情形下，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分比。可以熟習此項技術者已知之多種方式達成比對以測定胺基酸序列一致性百分比，例如使用公開可得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於比對序列之適當參數，包括在所比較序列的整個長度上實現最大比對所需的任何演算法。然而，對於本文，使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生胺基酸序列一致性百分比值。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech,Inc.編寫，且原始程式碼已與使用者說明書一起在美國版權局(U.S.Copyright Office),Washington D.C.,20559存檔，其中其以美國版權登記號第TXU510087號登記。ALIGN-2程式可自Genentech,Inc., South San Francisco,California公開獲得，或可自原始程式碼編譯。ALIGN-2程式應編譯用於UNIX操作系統，包括數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數均由ALIGN-2程式設定且不改變。在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形下，如下計算給定胺基酸序列A與給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(其或者可被解釋為給定胺基酸序列A相對於給定胺基酸序列B具有或包含特定胺基酸序列一致性百分比)：100×分數X/Y其中X為藉由序列比對程式ALIGN-2對A與B進行程式比對時評為一致匹配的胺基酸殘基數目，且其中Y為B中胺基酸殘基之總數。應瞭解，當胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度時，A與B之胺基酸序列一致性百分比將不等於B與A之胺基酸序列一致性百分比。除非另外明確說明，否則本文中使用之所有胺基酸序列一致性百分比值均使用ALIGN-2電腦程式如前一段中所述獲得。
術語「聚核苷酸」係指經分離核酸分子或構築體，例如信使RNA(mRNA)、病毒產生之RNA或質體DNA(pDNA)。聚核苷酸可包含習知磷酸二酯鍵或非習知鍵(例如醯胺鍵，諸如於肽核酸(PNA)中所發現的)。術語「核酸分子」係指聚核苷酸中存在的任何一或多個核酸區段，例如DNA或RNA片段。
「經分離」核酸分子或聚核苷酸為已自其原生環境中移出之核酸分子、DNA或RNA。舉例而言，對於本發明，載 體中所含之編碼治療性多肽的重組聚核苷酸被視為經分離的。經分離聚核苷酸之其他實例包括保持在異源宿主細胞中之重組聚核苷酸或溶液中之經純化(部分或實質上經純化)之聚核苷酸。經分離聚核苷酸包括包含於通常含有該聚核苷酸分子之細胞中的聚核苷酸分子，但該聚核苷酸分子存在於染色體外或存在於不同於其天然染色體位置的染色體位置處。經分離RNA分子包括本發明之活體內或活體外RNA轉錄物，以及正股及負股形式，及雙股形式。本發明之經分離聚核苷酸或核酸另外包括以合成方式產生之該等分子。此外，聚核苷酸或核酸可為或可包括調控元件，諸如啟動子、核糖體結合位點或轉錄終止子。
核酸或聚核苷酸具有與本發明之參考核苷酸序列至少例如95%「一致」之核苷酸序列，欲指除聚核苷酸序列可包括每100個參考核苷酸序列之核苷酸至多5點突變以外，聚核苷酸之核苷酸序列與參考序列一致。換言之，為獲得具有與參考核苷酸序列至少95%一致之核苷酸序列的聚核苷酸，在參考序列中至多5%核苷酸可缺失或經另一核苷酸取代，或一定數目之核苷酸(至多5%之參考序列之總核苷酸)可插入參考序列中。參考序列之此等改變可發生於參考核苷酸序列之5'端位置或3'端位置處或彼等末端位置之間的任何位置，個別地散佈於參考序列中之殘基間或參考序列內之一或多個鄰接基團中。就實踐而言，可使用已知電腦程式(諸如上文針對多肽所述者(例如ALIGN-2))習知測定任何特定聚核苷酸序列與本發明之核苷酸序列是否有 至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。
術語「表現卡匣」係指重組或合成產生之聚核苷酸，其具有一系列允許特定核酸在目標細胞內轉錄的指定核酸元件。重組表現卡匣可併入質體、染色體、粒線體DNA、質體DNA、病毒或核酸片段中。通常，表現載體之重組表現卡匣部分尤其包括待轉錄之核酸序列及啟動子。在某些實施例中，本發明之表現卡匣包含編碼本發明免疫結合物或其片段之聚核苷酸序列。
術語「載體」或「表現載體」與「表現構築體」同義且係指用於引入及指導在目標細胞中與其可操作地締合之特定基因之表現的DNA分子。該術語包括作為自身複製核酸結構的載體以及併入已引入該載體之宿主細胞的染色體組中之載體。本發明之表現載體包含表現卡匣。表現載體允許轉錄大量穩定mRNA。表現載體一旦處於目標細胞內，即藉由細胞轉錄及/或轉譯機制產生由基因編碼之核糖核酸分子或蛋白質。在一個實施例中，本發明之表現載體包含具有編碼本發明免疫結合物或其片段之聚核苷酸序列的表現卡匣。
術語「人造」係指合成組合物或非宿主細胞源性組合物，例如以化學方式合成之寡核苷酸。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」在本文中可互換使用且係指已引入外源核酸的細胞，包括該等細胞之子代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型 細胞」，其包括一次轉型細胞及源自其之子代(不管繼代次數)。子代之核酸含量與母細胞可能不完全相同，但可含有突變。本文包括針對原始轉型細胞篩選或選擇具有相同功能或生物活性之突變子代。宿主細胞為可用於產生用於本發明之免疫結合物的任何類型之細胞系統。在一個實施例中，宿主細胞經工程改造以允許產生在其Fc區具有經修飾寡醣之免疫結合物。在某些實施例中，宿主細胞經操作以表現增加含量之一或多種具有β(1,4)-N-乙醯基葡糖胺基轉移酶III(GnTIII)活性之多肽。在某些實施例中，宿主細胞經進一步操作以表現增加含量之一或多種具有α-甘露糖苷酶II(ManII)活性之多肽。宿主細胞包括經培養細胞，例如哺乳動物培養細胞，諸如CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細胞及植物細胞，僅舉例而言，亦包括轉殖基因動物、轉殖基因植物或經培養植物或動物組織內包含之細胞。
如本文所用，術語「具有GnTIII活性之多肽」係指能夠催化β-1,4鍵之N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)殘基加成至N-連接之寡醣之三甘露糖基核心的β-連接之甘露糖上的多肽。此包括融合多肽，如在有或無劑量依賴性存在之情形中在特定生物分析法中所量測，融合多肽展現與β(1,4)-N-乙醯基葡糖胺基轉移酶III(亦稱為β-1,4-甘露糖基-醣蛋白4-β-N-乙醯基葡糖胺基-轉移酶(EC 2.4.1.144)，根據生物化學及分子生物學國際聯合會之名詞委員會(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology，NC-IUBMB))之活性相似但未必相同之酶活性。在存在劑量依賴性給藥的情形中，其不必與GnTIII相同，而是與相較於GnTIII之既定活性中的劑量依賴性實質上類似(亦即候選多肽相對於GnTIII將展現較大活性或小不超過約25倍，且較佳小不超過約10倍活性，且最佳小不超過約3倍活性)。在某些實施例中，具有GnTIII活性之多肽為包含GnTIII之催化結構域及異源高基(Golgi)駐留多肽之高基定位結構域的融合多肽。高基定位結構域尤其為甘露糖苷酶II或GnTI之定位結構域，最尤其為甘露糖苷酶II之定位結構域。或者，高基定位結構域係選自由以下組成之群：甘露糖苷酶I之定位結構域、GnTII之定位結構域及α1,6核心海藻糖基轉移酶之定位結構域。製造該等融合多肽及其用於製造具有提高之效應子功能之抗體的方法揭示於WO 2004/065540、美國臨時專利申請案第60/495,142號及美國專利申請公開案第2004/0241817號中，其全部內容以引用的方式明確併入本文中。
如本文所用，術語「高基定位結構域」係指高基駐留多肽之胺基酸序列，其負責將多肽錨定於高基複合體內的位置。一般而言，定位結構域包含酶之胺基端「尾」。
如本文所用，術語「具有ManII活性之多肽」係指能夠催化N-連接之寡醣的分支鏈GlcNAcMan5GlcNAc2甘露糖中間物中之末端1,3-及1,6-連接之α-D-甘露糖殘基之水解的多肽。此包括展現與高基α-甘露糖苷酶II(亦稱為甘露糖基 寡醣1,3-1,6-α-甘露糖苷酶II(EC 3.2.1.114)，根據生物化學及分子生物學國際聯合會之名詞委員會(NC-IUBMB))之活性類似但未必相同之酶活性的多肽。
「活化Fc受體」為經抗體(或免疫結合物)之Fc區嚙合後引發刺激具有受體之細胞執行效應子功能之信號傳導事件的Fc受體。活化Fc受體包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)及FcαRI(CD89)。
抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)為導致免疫效應細胞溶解塗覆抗體之目標細胞的免疫機制。目標細胞為包含Fc區之抗體、免疫結合物或其片段一般經作為Fc區之N端的蛋白質部分特異性結合的細胞。如本文所用，術語「增加之ADCC」被定義為在既定時間內，在既定免疫結合物濃度下，藉由上文定義之ADCC機制溶解於目標細胞周圍之介質中的目標細胞數目之增加，及/或藉由ADCC機制在既定時間內實現既定數目之目標細胞溶解所需的目標細胞周圍介質中之免疫結合物濃度的降低。ADCC之增加與使用相同標準製造、純化、調配及儲存方法(熟習此項技術者已知)由相同類型之宿主細胞產生但未經工程改造之相同免疫結合物介導之ADCC有關。舉例而言，經工程改造以具有改變之糖基化模式(例如表現糖基轉移酶GnTIII或其他糖基轉移酶)的宿主細胞藉由本文所述方法產生的免疫結合物介導之ADCC增加與藉由未經工程改造之相同類型宿主細胞產生的相同免疫結合物介導之ADCC有關。
「具有增加之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC) 的免疫結合物」意謂如藉由一般技術人員已知的任何適合方法所測定具有增加之ADCC的免疫結合物。一種公認的活體外ADCC分析法如下：1)該分析法使用已知表現由免疫結合物之抗原結合部分所辨識之目標抗原的目標細胞；2)該分析法使用自隨機選擇之健康供體血液分離之人類周邊血液單核細胞(PBMC)作為效應細胞；3)該分析法根據如下方案進行：i)PBMC使用標準密度離心程序分離且以5×106個細胞/ml懸浮於RPMI細胞培養基中；ii)該等目標細胞藉由標準組織培養方法生長，自存活力高於90%之指數生長期收集，在RPMI細胞培養基中洗滌，以100微居里(micro-Curie)之51Cr標記，以細胞培養基洗滌兩次，且以每毫升105個細胞之密度再懸浮於細胞培養基中；iii)將100微升上述最終目標細胞懸浮液轉移至96孔微量滴定板之各孔中；iv)免疫結合物在細胞培養基中自4000 ng/ml連續稀釋至0.04 ng/ml且向96孔微量滴定板中之目標細胞中添加50 μl所得免疫結合物溶液，在覆蓋上述整個濃度範圍的多個免疫結合物濃度下一式三份進行測試；v)對於最大釋放(MR)對照組，含有經標記目標細胞之板中的3個額外孔接受50 μl 2%(V/V)非離子清潔劑之水溶液(Nonidet,Sigma,St.Louis)代替免疫結合物溶液(上文之 點iv)；vi)對於自發釋放(SR)對照組，含有經標記目標細胞之板中的3個額外孔接受50 μl RPMI細胞培養基代替免疫結合物溶液(上文之點iv)；vii)96孔微量滴定板接著在50×g下離心1分鐘且在4℃下培育1小時；viii)向各孔中添加50 μl PBMC懸浮液(上文之點i)，產生25：1之效應：目標細胞比率，且在5% CO2氛圍下在37℃下將板置於培育器中4小時；ix)自各孔收集無細胞上清液且使用伽馬計數器(gamma counter)定量實驗釋放之放射性(ER)；x)根據式(ER-MR)/(MR-SR)×100計算針對各免疫結合物濃度之特定溶解百分比，其中ER為針對彼免疫結合物濃度定量之平均放射性(參看上文之點ix)，MR為針對MR對照組(參看上文之點v)定量之平均放射性(參看上文之點ix)，且SR為針對SR對照組(參看上文之點vi)定量之平均放射性(參看上文之點ix)；4)「增加之ADCC」定義為上文測試之免疫結合物濃度範圍內觀測到的最大比溶解百分比之增加，及/或達到上文測試之免疫結合物濃度範圍內觀測到的最大比溶解百分比之一半所需的免疫結合物濃度之降低。ADCC之增加與使用熟習此項技術者已知的相同標準製造、純化、調配及儲存方法由相同類型之宿主細胞產生但未經工程改造之相同免疫結合物介導之ADCC(使用上文分析法進行量測)有 關。
試劑之「有效量」係指在投與試劑之細胞或組織中引起生理學改變所必需的量。
試劑(例如醫藥組合物)之「治療有效量」係指在必需劑量下且歷時必需時段有效實現所要治療或防治結果的量。試劑之治療有效量例如消除、減少、延遲、最小化或預防疾病之不良反應。
「個體(individual或subject)」為哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)家養動物(例如牛、綿羊、貓、犬及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、家兔及齧齒動物(例如小鼠及大鼠)。個體尤其為人類。
術語「醫藥組合物」係指呈使其中所含之活性成分的生物活性有效之形式的製劑，且其不含對將投與調配物之個體具有不可接受毒性之其他組分。
「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥組合物中除活性成分以外且對個體無毒之成分。醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝液、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
如本文所用，「治療(treatment)(及其諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」之語法變化形式)」係指試圖改變所治療個體之天然疾病病程的臨床干預，且其可出於防治目的進行或在臨床病理過程期間進行。所要治療作用包括(但不限於)預防疾病出現或復發、緩解症狀、減少疾病之任何直接或間接病理後果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或減輕疾病病狀、及緩和或改善預後。在一些實 施例中，本發明免疫結合物用於延遲疾病發展或減緩疾病進展。
術語「藥品說明書」用於指示市售治療產品包裝中慣常包括之說明，其含有關於適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌症之資訊及/或關於使用該治療產品之警告。
實施例之詳細描述
在第一態樣中，本發明提供一種免疫結合物，其包含第一抗原結合部分、由兩個次單元組成之Fc結構域及效應子部分，其中存在不超過一個效應子部分。無其他效應子部分之存在可降低免疫結合物對存在各別效應子部分受體之位點的靶向，藉此提高對存在抗原結合部分所辨識的免疫結合物之實際目標抗原之位點的靶向及於其中之積聚。此外，對各別效應子部分受體不存在親合力作用可降低靜脈內投與免疫結合物後周邊血液中效應子部分受體-陽性細胞的活化。此外，僅包含單個效應子部分之免疫結合物的血清半衰期看似比包含兩個或兩個以上效應子部分之免疫結合物的血清半衰期長。
免疫結合物型式
免疫結合物之組分可以多種組態彼此融合。例示性組態描繪於圖2中。在一個實施例中，效應子部分融合於Fc結構域之兩個次單元之一者的胺基或羧基端胺基酸。在一個實施例中，效應子部分融合於Fc結構域之兩個次單元之一者的羧基端胺基酸。效應子部分可直接或經包含一或多個 胺基酸，通常約2-20個胺基酸之連接子肽融合於Fc結構域。連接子肽為此項技術中已知或於本文中描述。適合的非免疫原性連接子肽包括例如(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n連接子肽。「n」一般為1至10，通常2至4之數字。或者，若效應子部分連接於Fc結構域次單元之N端，則其可在有或無其他連接子肽之情況下經免疫球蛋白鉸鏈區或其一部分連接。
類似地，第一抗原結合部分可融合於Fc結構域之兩個次單元之一者的胺基或羧基端胺基酸。在一個實施例中，第一抗原結合部分融合於Fc結構域之兩個次單元之一者的胺基端胺基酸。第一抗原結合部分可直接或經連接子肽融合於Fc結構域。在一特定實施例中，第一抗原結合部分經免疫球蛋白鉸鏈區融合於Fc結構域。在一特定實施例中，免疫球蛋白鉸鏈區為人類IgG1鉸鏈區。
在一個實施例中，第一抗原結合部分包含抗體之抗原結合域，其包含抗體重鏈可變區及抗體輕鏈可變區。在一特定實施例中，第一抗原結合部分為Fab分子。在一個實施例中，Fab分子之重鏈或輕鏈羧基端融合於Fc結構域之兩個次單元之一者的胺基端胺基酸。在一特定實施例中，Fab分子之重鏈羧基端融合於Fc結構域之兩個次單元之一者的胺基端胺基酸。在一更特定實施例中，Fab分子經免疫球蛋白鉸鏈區融合於Fc結構域。在一特定實施例中，免疫球蛋白鉸鏈區為人類IgG1鉸鏈區。
在一個實施例中，免疫結合物基本上由抗原結合部分、 由兩個次單元組成之Fc結構域、效應子部分及視情況存在之一或多個連接子肽組成，其中該抗原結合域為Fab分子且其重鏈羧基端融合於Fc結構域之兩個次單元之一者的胺基端胺基酸，且其中該效應子部分(i)融合於Fc結構域之兩個次單元之另一者的胺基端胺基酸，或(ii)融合於Fc結構域中兩個次單元之一者的羧基端胺基酸。在後一情形中，效應子部分及第一抗原結合部分可融合於Fc結構域之同一次單元，或可各自融合於Fc結構域之兩個次單元之不同次單元。
具有單個抗原結合部分之免疫結合物型式(例如圖2B及圖2C中所示)尤其適用於結合高親和力抗原結合部分後預期目標抗原進行內化的情形中。在該等情形中，每個免疫結合物存在一個以上抗原結合部分可提高內化，藉此降低目標抗原之可用性。
然而，在許多其他情形中，宜使包含兩個或兩個以上抗原結合部分及單個效應子部分之免疫結合物靶向目標抗原相對於效應子部分受體及免疫結合物之醫藥窗最佳化。
因此，在一特定實施例中，本發明免疫結合物包含第一及第二抗原結合部分。在一個實施例中，第一及第二抗原結合部分中之每一者融合於Fc結構域之兩個次單元之一者的胺基端胺基酸。第一及第二抗原結合部分可直接或經連接子肽融合於Fc結構域。在一特定實施例中，該第一及第二抗原結合部分中之每一者經免疫球蛋白鉸鏈區融合於Fc結構域之次單元。在一特定實施例中，免疫球蛋白鉸鏈區 為人類IgG1鉸鏈區。
在一個實施例中，該第一及第二抗原結合部分中之每一者包含抗體之抗原結合域，其包含抗體重鏈可變區及抗體輕鏈可變區。在一特定實施例中，該第一及第二抗原結合部分中之每一者為Fab分子。在一個實施例中，該等Fab分子中之每一者的重鏈或輕鏈羧基端融合於Fc結構域之兩個次單元之一者的胺基端胺基酸。在一特定實施例中，該等Fab分子中之每一者的重鏈羧基端融合於Fc結構域之兩個次單元之一者的胺基端胺基酸。在一更特定實施例中，該等Fab分子中之每一者經免疫球蛋白鉸鏈區融合於Fc結構域之次單元。在一特定實施例中，免疫球蛋白鉸鏈區為人類IgG1鉸鏈區。
在一個實施例中，第一及第二抗原結合部分及Fc結構域為免疫球蛋白分子之部分。在一特定實施例中，免疫球蛋白分子為IgG類免疫球蛋白。在一甚至更特定實施例中，免疫球蛋白為IgG1子類免疫球蛋白。在另一特定實施例中，免疫球蛋白為人類免疫球蛋白。在其他實施例中，免疫球蛋白為嵌合免疫球蛋白或人類化免疫球蛋白。在一個實施例中，效應子部分融合於免疫球蛋白重鏈之一者的羧基端胺基酸。效應子部分可直接或經連接子肽融合於免疫球蛋白重鏈。在一特定實施例中，免疫結合物基本上由免疫球蛋白分子、融合於免疫球蛋白重鏈之一者的羧基端胺基酸之效應子部分及視情況存在之一或多個連接子肽組成。
在一個實施例中，免疫結合物包含Fab重鏈與Fc結構域次單元共用羧基端肽鍵之多肽及Fc結構域次單元與效應子部分多肽共用羧基端肽鍵之多肽。在另一實施例中，免疫結合物包含第一Fab重鏈與Fc結構域次單元共用羧基端肽鍵之多肽，及第二Fab重鏈與Fc結構域次單元共用羧基端肽鍵之多肽，其又與效應子部分多肽共用羧基端肽鍵。在另一實施例中，免疫結合物包含Fab重鏈與Fc結構域次單元共用羧基端肽鍵之多肽及效應子部分多肽與Fc結構域次單元共用羧基端肽鍵之多肽。在一些實施例中，免疫結合物另外包含Fab輕鏈多肽。在某些實施例中，多肽例如經二硫鍵共價連接。
根據上述實施例中之任一者，免疫結合物之組分(例如效應子部分、抗原結合部分、Fc結構域)可直接或經多種連接子，尤其是包含一或多個胺基酸，通常約2-20個胺基酸之肽連接子連接，其如本文所述或為此項技術中已知。適合的非免疫原性連接子肽包括例如(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n連接子肽，其中n一般為1至10，通常2至4之數字。
Fc結構域
免疫結合物之Fc結構域由包含免疫球蛋白分子之重鏈結構域的一對多肽鏈組成。舉例而言，免疫球蛋白G(IgG)分子之Fc結構域為二聚體，其每一次單元包含CH2及CH3 IgG重鏈恆定域。Fc結構域之兩個次單元能夠彼此穩定締合。在一個實施例中，本發明免疫結合物包含不超過一個 Fc結構域。
在本發明之一個實施例中，免疫結合物之Fc結構域為IgG Fc結構域。在一特定實施例中，Fc結構域為IgG1 Fc結構域。在另一實施例中，Fc結構域為IgG4 Fc結構域。在另一特定實施例中，Fc結構域為人類。人類IgG1 Fc區之例示性序列在SEQ ID NO：1中給出。
Fc結構域賦予免疫結合物以相較於缺乏Fc結構域之免疫結合物型式的極長血清半衰期。尤其當免疫結合物包含相當弱活性(但例如降低之毒性)之效應子部分時，長半衰期可能對於達到最佳活體內功效不可缺少。此外，如下文將進一步論述，Fc結構域可介導效應子功能。
促進雜二聚合之Fc結構域修飾
本發明免疫結合物僅包含一個融合於Fc結構域之兩個次單元之一者的單個效應子部分，因此其包含兩個不相同多肽鏈。此等多肽之重組共表現及隨後二聚化產生兩種多肽之若干可能組合，其中兩個不相同多肽中僅雜二聚體適用於本發明。為了提高重組生產中免疫結合物之產率及純度，宜在免疫結合物之Fc結構域中引入如下修飾，其阻礙形成兩個相同多肽(亦即包含效應子部分之兩個多肽或缺乏效應子部分之兩個多肽)之均二聚體及/或促進形成包含效應子部分之多肽與缺乏效應子部分之多肽之雜二聚體。
因此，在本發明之某些實施例中，免疫結合物之Fc結構域包含促進兩個不相同多肽鏈之雜二聚合的修飾。人類IgG Fc結構域之兩個多肽鏈之間最廣泛的蛋白質-蛋白質相 互作用位點為Fc結構域之CH3結構域。因此，在一個實施例中，該修飾在Fc結構域之CH3結構域中。
在一特定實施例中，該修飾為杵臼修飾，其包含Fc結構域之兩個次單元之一者中的杵修飾及Fc結構域之兩個次單元之另一者中之臼修飾。
杵臼技術描述於例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng 9,617-621(1996)及Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中。一般而言，該方法涉及在第一多肽之界面處引入隆凸(「杵」)且在第二多肽之界面中引入相應凹穴(「臼」)，使得隆凸可位於凹穴中，以便促進雜二聚體形成及阻礙均二聚體形成。可藉由以較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換第一多肽界面之小胺基酸側鏈建構隆凸。藉由以較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換大胺基酸側鏈在第二多肽之界面中形成針對隆凸之相同或類似尺寸之代償凹穴。可藉由改變編碼多肽之核酸，例如藉由定點突變誘發或藉由肽合成形成隆凸及凹穴。在一特定實施例中，杵修飾包含Fc結構域之兩個次單元之一者中的胺基酸取代T366W，且臼修飾包含Fc結構域之兩個次單元之另一者中的胺基酸取代T366S、L368A及Y407V。在另一特定實施例中，包含杵修飾之Fc結構域的次單元另外包含胺基酸取代S354C，且包含臼修飾之Fc結構域的次單元另外包含胺基酸取代Y349C。此兩個半胱胺酸殘基之引入導致在Fc區之兩個次單元之間形成二硫橋，使二聚體進一步穩定(Carter,J Immunol Methods 248, 7-15(2001))。
在一替代實施例中，促進兩個不相同多肽鏈雜二聚合之修飾包含介導靜電操縱作用之修飾，例如PCT公開案WO 2009/089004中所述。一般而言，此方法涉及以帶電胺基酸殘基置換兩個多肽鏈之界面處的一或多個胺基酸殘基，使得均二聚體形成在靜電學上變得不利但雜二聚合在靜電學上變得有利。
在一特定實施例中，效應子部分融合於包含杵修飾之Fc結構域之次單元的胺基或羧基端胺基酸。不希望受理論約束，效應子部分與含有杵之Fc結構域次單元的融合將使包含兩個效應子部分之均二聚免疫結合物的產生進一步最小化(兩個含有杵之多肽的空間對撞)。
改變Fc受體結合之Fc結構域修飾
在本發明之某些實施例中，免疫結合物之Fc結構域經工程改造以相較於未經工程改造之Fc結構域具有對Fc受體改變之結合親和力，特定言之對Fcγ受體改變之結合親和力。
例如藉由ELISA或藉由表面電漿子共振(SPR)使用標準儀器(諸如BIAcore儀器(GE Healthcare))容易測定與Fc受體之結合，且Fc受體諸如可藉由重組表現獲得。適合的結合分析法描述於本文中。或者，可使用已知表現特定Fc受體之細胞株(諸如表現FcγIIIa受體之NK細胞)評估Fc結構域或包含Fc結構域之免疫結合物對Fc受體之結合親和力。
在一些實施例中，免疫結合物之Fc結構域經工程改造以 相較於未經工程改造之Fc結構域具有改變之效應子功能，尤其改變之ADCC。
藉由此項技術中已知之方法量測Fc結構域或包含Fc結構域之免疫結合物的效應子功能。本文描述用於量測ADCC之適合分析法。評定所關注分子之ADCC活性的活體外分析法之其他實例描述於美國專利第5,500,362號；Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)及Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美國專利第5,821,337號；Bruggemann等人，J Exp Med 166,1351-1361(1987)中。或者，可採用非放射性分析法(參看例如用於流動式細胞測量術之ACTITM非放射性細胞毒性分析法(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；及CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析法(Promega,Madison,WI))。適用於該等分析法之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，可例如在諸如Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中揭示之動物模型中活體內評定所關注分子之ADCC活性。
在一些實施例中，Fc結構域與補體組分(特定言之C1q)之結合經改變。因此，在一些實施例中，其中Fc結構域經工程改造以具有改變之效應子功能，該改變之效應子功能包括改變之CDC。亦可進行C1q結合分析法以確定免疫結合物是否能夠結合C1q且因此具有CDC活性。參看例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合 ELISA。可進行CDC分析來評定補體活化作用(參看例如Gazzano-Santoro等人，J Immunol Methods 202,163(1996)；Cragg等人，Blood 101,1045-1052(2003)；以及Cragg及Glennie,Blood 103,2738-2743(2004))。
a)降低之Fc受體結合性及/或效應子功能
Fc結構域賦予免疫結合物有利之藥物動力學性質，包括有助於在目標組織中良好積聚之長血清半衰期及有利的組織-血液分佈率。然而，同時，其可能導致使免疫結合物不良地靶向表現Fc受體之細胞而非靶向較佳的具有抗原之細胞。此外，Fc受體信號傳導路徑之共活化可導致細胞激素釋放，其與免疫結合物之效應子部分及長半衰期組合，而在全身投與後導致細胞激素受體過度活化及嚴重副作用。與此一致，已描述習知IgG-IL-2免疫結合物與輸注反應相關(參看例如King等人，J Clin Oncol 22,4463-4473(2004))。
因此，在本發明之特定實施例中，免疫結合物之Fc結構域經工程改造，以降低與Fc受體之結合親和力。其中一項實施例中，Fc結構域包含一或多個降低Fc結構域與Fc受體之結合親和力的胺基酸突變。通常，Fc結構域之兩個次單元之每一者中存在相同的一或多個胺基酸突變。在一個實施例中，該胺基酸突變使Fc結構域與Fc受體之結合親和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。其中一個降低Fc結構域與Fc受體之結合親和力的胺基酸突變的實施例中，此等胺基酸突變之組合可使Fc結構域與Fc受體之結合親和力降 低至少10倍、至少20倍或甚至至少50倍。在一個實施例中，包含經工程改造之Fc結構域的免疫結合物相較於包含未經工程改造之Fc結構域的免疫結合物展現小於20%，尤其小於10%，更尤其小於5%對Fc受體之結合親和力。在一個實施例中，Fc受體為活化Fc受體。在一特定實施例中，Fc受體為Fcγ受體，更特定言之為FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa受體。較佳地，與此等受體中每一者之結合均降低。在一些實施例中，亦降低與補體組分之結合親和力，特定言之與C1q之結合親和力。在一個實施例中，與新生兒Fc受體(FcRn)之結合親和力不降低。當Fc結構域(或包含該Fc結構域之免疫結合物)對FcRn展現大於約70%未經工程改造形式之Fc結構域(或包含該未經工程改造形式之Fc結構域的免疫結合物)的結合親和力時，達到與FcRn實質上類似之結合，亦即維持Fc結構域與該受體之結合親和力。Fc結構域或包含該等Fc結構域之本發明免疫結合物可展現大於約80%且甚至大於約90%該親和力。在一個實施例中，胺基酸突變為胺基酸取代。在一個實施例中，Fc結構域在位置P329處包含胺基酸取代。在一更特定實施例中，胺基酸取代為P329A或P329G，尤其是P329G。在一個實施例中，Fc結構域在選自S228、E233、L234、L235、N297及P331之位置處包含另一胺基酸取代。在一更特定實施例中，另一胺基酸取代為S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在一特定實施例中，Fc結構域在位置P329、L234及L235處包含胺基酸取 代。在一更特定實施例中，Fc結構域包含胺基酸突變L234A、L235A及P329G(LALA P329G)。如歐洲專利申請案第EP 11160251.2號(全文以引用方式併入本文中)中所述，此胺基酸取代之組合幾乎完全消除人類IgG Fc結構域之Fcγ受體結合。EP 11160251.2亦描述製備該等突變Fc結構域之方法及測定其性質(諸如Fc受體結合或效應子功能)之方法。
可藉由胺基酸缺失、取代、插入或修飾，使用此項技術中熟知之遺傳或化學方法製備突變Fc結構域。遺傳方法可包括編碼DNA序列之定點突變誘發、PCR、基因合成及其類似方法。可例如藉由定序驗證正確核苷酸變化。
在一個實施例中，Fc結構域經工程改造以相較於未經工程改造之Fc結構域具有降低之效應子功能。降低之效應子功能可包括(但不限於)以下一或多者：降低之補體依賴性細胞毒性(CDC)、降低之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、降低之抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、降低之細胞激素分泌、降低之免疫複合物介導之抗原呈現細胞的抗原攝取、降低的與NK細胞之結合、降低的與巨噬細胞之結合、降低的與單核細胞之結合、降低的與多形核細胞之結合、降低之直接信號傳導誘發之細胞凋亡、降低之目標結合抗體之交聯、降低之樹突狀細胞成熟或降低之T細胞激活。
在一個實施例中，降低之效應子功能為選自以下之群的一或多者：降低之CDC、降低之ADCC、降低之ADCP及降 低之細胞激素分泌。在一特定實施例中，降低之效應子功能為降低之ADCC。在一個實施例中，降低之ADCC小於20%由未經工程改造之Fc結構域(或包含未經工程改造之Fc結構域的免疫結合物)誘導之ADCC。
除了上文及歐洲專利申請案第EP 11160251.2號中所述之Fc結構域外，具有降低之Fc受體結合及/或效應子功能之Fc結構域亦包括具有Fc結構域殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者之取代者(美國專利第6,737,056號)。該等Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或兩者以上處具有取代之Fc突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸之所謂的「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
IgG4抗體相較於IgG1抗體展現對Fc受體降低之結合親和力及降低之效應子功能。因此，在一些實施例中，本發明之T細胞活化的雙特異性抗原結合分子之Fc結構域為IgG4 Fc結構域，詳言之人類IgG4 Fc結構域。在一個實施例中，IgG4 Fc結構域在位置S228處包含胺基酸取代，特定言之胺基酸取代S228P。為了進一步降低其對Fc受體之結合親和力及/或其效應子功能，在一個實施例中，IgG4 Fc結構域在位置L235處包含胺基酸取代，特定言之胺基酸取代L235E。在另一實施例中，IgG4 Fc結構域在位置P329處包含胺基酸取代，特定言之胺基酸取代P329G。在一特定實施例中，IgG4 Fc結構域在位置S228、L235及P329處包含胺基酸取代，特定言之胺基酸取代S228P、L235E及 P329G。該等IgG4 Fc結構域突變體及其Fcγ受體結合性質描述於歐洲專利申請案第EP 11160251.2號中，其全文以引用的方式併入本文中。
b)提高之Fc受體結合及/或效應子功能
相反地，可能存在需要維持或甚至提高免疫結合物之Fc受體結合及/或效應子功能的情形，例如當免疫結合物靶向高特異性腫瘤抗原時。因此，在某些實施例中，本發明免疫結合物之Fc結構域經工程改造以具有與Fc受體提高之結合親和力。提高之結合親和力可為Fc結構域對Fc受體之結合親和力提高至少2倍、至少5倍或至少10倍。在一個實施例中，Fc受體為活化Fc受體。在一特定實施例中，Fc受體為Fcγ受體。在一個實施例中，Fc受體係選自以下之群：FcγRIIIa、FcγRI及FcγRIIa。在一特定實施例中，Fc受體為FcγRIIIa。
在一個所述實施例中，Fc結構域經工程改造以相較於未經工程改造之Fc結構域具有改變之寡醣結構。在一所述特定實施例中，Fc結構域相較於未經工程改造之Fc結構域包含增加比例之非海藻糖基化寡醣。在一更特定實施例中，免疫結合物之Fc結構域中至少約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約100%，尤其至少約50%，更尤其至少約70% N連接之寡醣未經海藻糖基化。非海藻糖基化寡醣可為雜合物型或複合物型。在另一特定實施例中，Fc結構域相較於未經工 程改造之Fc結構域包含增加比例之等分寡醣。在一更特定實施例中，免疫結合物之Fc結構域中至少約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約100%，尤其至少約50%，更尤其至少約70% N連接之寡醣為等分寡醣。等分寡醣可為雜合物型或複合物型。在另一特定實施例中，Fc結構域相較於未經工程改造之Fc結構域包含增加比例之等分非海藻糖基化寡醣。在一更特定實施例中，免疫結合物之Fc結構域中至少約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約100%，尤其至少約15%，更尤其至少約25%、至少約35%或至少約50% N連接之寡醣為等分非海藻糖基化寡醣。等分非海藻糖基化寡醣可為雜合物型或複合物型。
免疫結合物Fc結構域中之寡醣結構可藉由此項技術中熟知之方法分析，例如Umana等人，Nat Biotechnol 17,176-180(1999)或Ferrara等人，Biotechn Bioeng 93,851-861(2006)中所述之MALDI TOF質譜法。非海藻糖基化寡醣之百分比為缺乏海藻糖殘基之寡醣相對於與Asn 297連接之所有寡醣(例如複合物、雜合物及高甘露糖結構)的量，且藉由MALDI TOF MS在N-糖苷酶F處理之樣品中識別。Asn 297係指位於Fc結構域中大致位置297(Fc區殘基之EU編號) 處之天冬醯胺殘基；然而，由於免疫球蛋白中之微小序列變化，所以Asn297亦可位於位置297之上游或下游大致±3個胺基酸處，亦即位置294至300處。類似地測定等分或等分非海藻糖基化寡醣之百分比。
免疫結合物之Fc結構域中的糖基化修飾可由在宿主細胞中製造免疫結合物產生，該宿主細胞已經操作以表現改變含量之一或多種具有糖基轉移酶活性之多肽。
在一個實施例中，藉由在具有一或多種改變活性之糖基轉移酶的宿主細胞中製造免疫結合物，免疫結合物之Fc結構域經工程改造以相較於未經工程改造之Fc結構域具有改變之寡醣結構。糖基轉移酶包括例如β(1,4)-N-乙醯基葡糖胺基轉移酶III(GnTIII)、β(1,4)-半乳糖基轉移酶(GalT)、β(1,2)-N-乙醯基葡糖胺基轉移酶I(GnTI)、β(1,2)-N-乙醯基葡糖胺基轉移酶II(GnTII)及α(1,6)-海藻糖基轉移酶。在一特定實施例中，藉由在具有增加之β(1,4)-N-乙醯基葡糖胺基轉移酶III(GnTIII)活性之宿主細胞中製造免疫結合物，免疫結合物之Fc結構域經工程改造以相較於未經工程改造之Fc結構域包含增加比例之非海藻糖基化寡醣。在一甚至更特定實施例中，宿主細胞另外具有提高之α-甘露糖苷酶II(ManII)活性。已在Umana等人，Nat Biotechnol 17,176-180(1999)；Ferrara等人，Biotechn Bioeng 93,851-861(2006)；WO 99/54342(美國專利第6,602,684號；EP 1071700)；WO 2004/065540(美國專利申請公開案第2004/0241817號；EP 1587921)；WO 03/011878(美國專利 申請公開案第2003/0175884號)中極詳細描述可用於糖基化工程改造本發明免疫結合物之糖基化工程改造方法，該等文獻每一者之內容以全文引用的方式明確併入本文中。
一般而言，任何類型之經培養細胞株(包括本文所述之細胞株)可用於產生供製造具有改變之糖基化模式之免疫結合物用的細胞株。特定細胞株包括CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞，及其他哺乳動物細胞。在某些實施例中，宿主細胞經操作以表現增加含量之一或多種具有β(1,4)-N-乙醯基葡糖胺基轉移酶III(GnTIII)活性的多肽。在某些實施例中，宿主細胞經進一步操作以表現增加含量之一或多種具有α-甘露糖苷酶II(ManII)活性之多肽。在一特定實施例中，具有GnTIII活性之多肽為包含GnTIII之催化結構域及異源高基駐留多肽之高基定位結構域的融合多肽。詳言之，該高基定位結構域為甘露糖苷酶II之高基定位結構域。產生該等融合多肽之方法及其用於製造具有提高之效應子功能之抗體的方法揭示於Ferrara等人，Biotechn Bioeng 93,851-861(2006)及WO 2004/065540中，該等文獻之全部內容以引用的方式明確併入本文中。
含有本發明免疫結合物之編碼序列及/或具有糖基轉移酶活性之多肽的編碼序列且表現生物活性基因產物之宿主細胞可例如藉由DNA-DNA或DNA-RNA雜交、有或無「標記」基因功能存在、評定如各別mRNA轉錄物在宿主細胞 中之表現所量度的轉錄程度、或如免疫分析法或此項技術中熟知之其生物活性方法所量測的基因產物之偵測來識別。可例如藉由採用分別結合於GnTIII或Man II之生物合成產物的凝集素偵測GnTIII或Man II活性。該凝集素之實例為E4-PHA凝集素，其優先結合於含有等分GlcNAc之寡醣。亦可藉由對表現該等多肽之細胞產生的醣蛋白釋放之寡醣進行質譜分析來偵測具有GnTIII或ManII活性之多肽的生物合成產物(亦即特定寡醣結構)。或者，可使用功能分析法，其量測由經具有GnTIII或ManII活性之多肽工程改造之細胞產生的免疫結合物所介導的提高之效應子功能及/或增加之Fc受體結合。
在另一實施例中，藉由在具有降低之α(1,6)-海藻糖基轉移酶活性之宿主細胞中製造免疫結合物工程改造Fc結構域以相較於未經工程改造之Fc結構域包含增加比例之非海藻糖基化寡醣。具有降低之α(1,6)-海藻糖基轉移酶活性之宿主細胞可為α(1,6)-海藻糖基轉移酶基因已破壞或去活化(例如剔除)的細胞(參看Yamane-Ohnuki等人，Biotech Bioeng 87,614(2004)；Kanda等人，Biotechnol Bioeng 94(4),680-688(2006)；Niwa等人，J Immunol Methods 306,151-160(2006))。
能夠製造去海藻糖基化免疫結合物之細胞株的其他實例包括蛋白質海藻糖基化不足的Lec13 CHO細胞(Ripka等人，Arch Biochem Biophys 249,533-545(1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108號；及WO 2004/056312，特 定言之實例11處)。本發明免疫結合物或者可根據EP 1 176 195 A1、WO 03/084570、WO 03/085119及美國專利申請公開案第2003/0115614號、第2004/093621號、第2004/110282號、第2004/110704號、第2004/132140號、美國專利第6,946,292號(Kyowa)中揭示之技術(例如藉由降低或消除用於免疫結合物製造之宿主細胞中的GDP-海藻糖轉運蛋白之活性)經糖基化工程改造以在Fc結構域中具有減少之海藻糖殘基。
亦可在產生經修飾醣蛋白之表現系統(諸如WO 2003/056914(GlycoFi,Inc.)或WO 2004/057002及WO 2004/024927(Greenovation)中所教示者)中製造糖基化工程改造之本發明免疫結合物。
在一個實施例中，免疫結合物之Fc結構域經工程改造以相較於未經工程改造之Fc結構域具有提高之效應子功能。提高之效應子功能可包括(但不限於)以下一或多者：提高之補體依賴性細胞毒性(CDC)、提高之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、提高之抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、增加之細胞激素分泌、增加之免疫複合物介導之抗原呈現細胞的抗原攝取、增加的與NK細胞之結合、增加的與巨噬細胞之結合、增加的與單核細胞之結合、增加的與多形核細胞之結合、增加之直接信號傳導誘發之細胞凋亡、增加之目標結合抗體之交聯、增加之樹突狀細胞成熟或增加之T細胞激活。
在一個實施例中，提高之效應子功能為選自以下之群的 一或多者：提高之CDC、提高之ADCC、提高之ADCP及增加之細胞激素分泌。在一特定實施例中，提高之效應子功能為提高之ADCC。在一個實施例中，工程改造之Fc結構域(或包含工程改造之Fc結構域的免疫結合物)誘導之ADCC相較於未經工程改造之Fc結構域(或包含未經工程改造之Fc結構域的免疫結合物)誘導之ADCC增加至少2倍。
效應子部分
用於本發明之效應子部分一般為例如經信號傳導路徑影響細胞活性的多肽。因此，適用於本發明之免疫結合物的效應子部分可與受體介導之信號傳導相關，該信號傳導傳輸來自細胞膜外部之信號以調節細胞內之反應。舉例而言，免疫結合物之效應子部分可為細胞激素。在特定實施例中，效應子部分為人類效應子部分。
在某些實施例中，效應子部分為單鏈效應子部分。在一特定實施例中，效應子部分為細胞激素。適用細胞激素之實例包括(但不限於)GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-21、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α及TNF-β。在一個實施例中，免疫結合物之效應子部分為選自以下之群的細胞激素：GM-CSF、IL-2、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、IFN-α、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β及TGF-β。在一個實施例中，免疫結合物之效應子部分為選自以下之群的細胞激素：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IFN-α及IFN-γ。在某 些實施例中，細胞激素效應子部分經突變以移除N-及/或O-糖基化位點。消除糖基化會提高重組製造中可獲得之產物的均質性。
在一特定實施例中，免疫結合物之效應子部分為IL-2。在一特定實施例中，IL-2效應子部分可引發選自由以下組成之群的細胞反應中之一或多者：經活化T淋巴細胞中之增殖、經活化T淋巴細胞中之分化、細胞毒性T細胞(CTL)活性、經活化B細胞中之增殖、經活化B細胞中之分化、自然殺手(NK)細胞中之增殖、NK細胞中之分化、經活化T細胞或NK細胞之細胞激素分泌及NK/淋巴細胞活化之殺手(LAK)抗腫瘤細胞毒性。在另一特定實施例中，IL-2效應子部分為對IL-2受體之α-次單元具有降低之結合親和力的突變IL-2效應子部分。與β-及γ-次單元(亦分別稱為CD122及CD132)一起，α-次單元(亦稱為CD25)形成雜三聚高親和力IL-2受體，而僅由β-及γ-次單元組成之二聚受體被稱為中間物-親和力IL-2受體。如全文以引用的方式併入本文中之PCT專利申請案第PCT/EP2012/051991號中所述，對IL-2受體之α-次單元具有降低之結合的突變IL-2多肽相較於野生型IL-2多肽在調節T細胞中誘導IL-2信號傳導之能力降低，在T細胞中誘導較少之活化誘導之細胞死亡(AICD)，且具有降低之活體內毒性型態。該具有降低毒性之效應子部分的使用在由於存在Fc結構域而具有長血清半衰期的本發明免疫結合物中尤其有利。在一個實施例中，本發明免疫結合物之突變IL-2效應子部分相較於未突變IL-2效應子 部分包含至少一個減少或消除突變IL-2效應子部分對IL-2受體之α-次單元(CD25)的親和力的胺基酸突變，但保留突變IL-2效應子部分對中間物-親和力IL-2受體(由IL-2受體之β-及γ-次單元組成)的親和力。在一個實施例中，一或多個胺基酸突變為胺基酸取代。在一特定實施例中，突變IL-2效應子部分在選自對應於人類IL-2之殘基42、45及72之位置處的1、2或3個位置處包含1、2或3個胺基酸取代。在一更特定實施例中，突變IL-2效應子部分在對應於人類IL-2之殘基42、45及72的位置處包含三個胺基酸取代。在一甚至更特定實施例中，突變IL-2效應子部分為包含胺基酸取代F42A、Y45A及L72G之人類IL-2。在一個實施例中，突變IL-2效應子部分在對應於人類IL-2之位置3的位置處另外包含胺基酸突變，其消除IL-2之O-糖基化位點。特定言之，該其他胺基酸突變為以丙胺酸殘基置換蘇胺酸殘基的胺基酸取代。適用於本發明之特定突變IL-2效應子部分在人類IL-2之殘基3、42、45及72的位置處包含4個胺基酸取代。特定胺基酸取代為T3A、F42A、Y45A及L72G。如PCT專利申請案第PCT/EP2012/051991號及隨附實例中所表明，該四倍突變IL-2多肽(IL-2 qm)展現對CD25無可偵測之結合、在T細胞中誘導細胞凋亡之能力降低、在Treg細胞中誘導IL-2信號傳導之能力降低及活體內毒性型態降低。然而，其仍保留在效應細胞中活化IL-2信號傳導、誘導效應細胞增殖及產生IFN-γ作為NK細胞之二級細胞激素的能力。
根據上述實施例中任一者之IL-2或突變IL-2效應子部分可包含其他突變，該等突變提供諸如增加之表現或穩定性之其他優勢。舉例而言，位置125處之半胱胺酸可以諸如丙胺酸之中性胺基酸置換，以避免形成二硫橋鍵結之IL-2二聚體。因此，在某些實施例中，本發明免疫結合物之IL-2或突變IL-2效應子部分在對應於人類IL-2之殘基125的位置處包含其他胺基酸突變。在一個實施例中，該其他胺基酸突變為胺基酸取代C125A。
在一特定實施例中，免疫結合物之IL-2效應子部分包含SEQ ID NO：2之多肽序列。在另一特定實施例中，免疫結合物之IL-2效應子部分包含SEQ ID NO：3之多肽序列。
在另一實施例中，免疫結合物之效應子部分為IL-12。在一特定實施例中，該IL-12效應子部分為單鏈IL-12效應子部分。在一甚至更特定實施例中，單鏈IL-12效應子部分包含多肽序列SEQ ID NO：4。在一個實施例中，IL-12效應子部分可引發選自由以下組成之群的細胞反應中之一或多者：NK細胞中之增殖、NK細胞中之分化、T細胞中之增殖及T細胞中之分化。
在另一實施例中，免疫結合物之效應子部分為IL-10。在一特定實施例中，該IL-10效應子部分為單鏈IL-10效應子部分。在一甚至更特定實施例中，單鏈IL-10效應子部分包含多肽序列SEQ ID NO：5。在另一特定實施例中，IL-10效應子部分為單體IL-10效應子部分。在一更特定實施例中，單體IL-10效應子部分包含多肽序列SEQ ID NO： 6。在一個實施例中，IL-10效應子部分可引發選自由以下組成之群的細胞反應中之一或多者：抑制細胞激素分泌、抑制抗原呈現細胞之抗原呈現、減少氧自由基釋放及抑制T細胞增殖。效應子部分為IL-10之本發明免疫結合物尤其適用於下調發炎，例如治療發炎病症。
在另一實施例中，免疫結合物之效應子部分為IL-15。在一特定實施例中，該IL-15效應子部分為對IL-15受體之α-次單元具有降低之結合親和力的突變IL-15效應子部分。不希望受理論約束，對IL-15受體之α-次單元具有降低之結合的突變IL-15多肽相較於野生型IL-15多肽結合全身之纖維母細胞的能力降低，導致改良之藥物動力學及毒性型態。具有降低之毒性的效應子部分(諸如所述突變IL-2及突變IL-15效應子部分)尤其適宜用於由於存在Fc結構域而具有長血清半衰期之本發明免疫結合物中。在一個實施例中，本發明免疫結合物之突變IL-15效應子部分相較於未突變IL-15效應子部分包含至少一個減少或消除突變IL-15效應子部分對IL-15受體之α-次單元的親和力的胺基酸突變，但保留突變IL-15效應子部分對中間物-親和力IL-15/IL-2受體(由IL-15/IL-2受體之β-及γ-次單元組成)的親和力。在一個實施例中，胺基酸突變為胺基酸取代。在一特定實施例中，突變IL-15效應子部分在對應於人類IL-15之殘基53的位置處包含胺基酸取代。在一更特定實施例中，突變IL-15效應子部分為包含胺基酸取代E53A之人類IL-15。在一個實施例中，突變IL-15效應子部分在對 應於人類IL-15之位置79的位置處另外包含胺基酸突變，其消除IL-15之N-糖基化位點。特定言之，該其他胺基酸突變為以丙胺酸殘基置換天冬醯胺殘基的胺基酸取代。在一甚至更特定實施例中，IL-15效應子部分包含多肽序列SEQ ID NO：7。在一個實施例中，IL-15效應子部分可引發選自由以下組成之群的細胞反應中之一或多者：經活化T淋巴細胞中之增殖、經活化T淋巴細胞中之分化、細胞毒性T細胞(CTL)活性、經活化B細胞中之增殖、經活化B細胞中之分化、自然殺手(NK)細胞中之增殖、NK細胞中之分化、經活化T細胞或NK細胞之細胞激素分泌及NK/淋巴細胞活化之殺手(LAK)抗腫瘤細胞毒性。
可使用此項技術中熟知之遺傳或化學方法藉由缺失、取代、插入或修飾製備適用作免疫結合物中之效應子部分的突變細胞激素分子。遺傳方法可包括編碼DNA序列之定點突變誘發、PCR、基因合成及其類似方法。可例如藉由定序驗證正確核苷酸改變。取代或插入可涉及天然以及非天然胺基酸殘基。胺基酸修飾包括熟知化學修飾方法，諸如添加或移除糖基化位點或碳水化合物連接及其類似方法。
在一個實施例中，免疫結合物之效應子部分(詳言之單鏈效應子部分)為GM-CSF。在一特定實施例中，GM-CSF效應子部分可引發粒細胞、單核細胞或樹突狀細胞之增殖及/或分化。在一個實施例中，免疫結合物之效應子部分(詳言之單鏈效應子部分)為IFN-α。在一特定實施例中，IFN-α效應子部分可引發選自由以下組成之群的細胞反應 中之一或多者：抑制病毒感染細胞中之病毒複製及上調主要組織相容性複合物I(MHC I)的表現。在另一特定實施例中，IFN-α效應子部分可抑制腫瘤細胞中之增殖。在一個實施例中，免疫結合物之效應子部分(詳言之單鏈效應子部分)為IFN-γ。在一特定實施例中，IFN-γ效應子部分可引發選自由以下組成之群的細胞反應中之一或多者：提高之巨噬細胞活性、提高之MHC分子表現及提高之NK細胞活性。在一個實施例中，免疫結合物之效應子部分(詳言之單鏈效應子部分)為IL-7。在一特定實施例中，IL-7效應子部分可引發T及/或B淋巴細胞之增殖。在一個實施例中，免疫結合物之效應子部分(詳言之單鏈效應子部分)為IL-8。在一特定實施例中，IL-8效應子部分可引發嗜中性白血球中之趨化性。在一個實施例中，免疫結合物之效應子部分(詳言之單鏈效應子部分)為MIP-1α。在一特定實施例中，MIP-1α效應子部分可引發單核細胞及T淋巴細胞中之趨化性。在一個實施例中，免疫結合物之效應子部分(詳言之單鏈效應子部分)為MIP-1β。在一特定實施例中，MIP-1β效應子部分可引發單核細胞及T淋巴細胞中之趨化性。在一個實施例中，免疫結合物之效應子部分(詳言之單鏈效應子部分)為TGF-β。在一特定實施例中，TGF-β效應子部分可引發選自由以下組成之群的細胞反應中之一或多者：單核細胞中之趨化性、巨噬細胞中之趨化性、在經活化巨噬細胞中上調IL-1表現及在經活化B細胞中上調IgA表現。
在一個實施例中，本發明免疫結合物以比對照效應子部分大至少約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍的解離常數(KD)結合於效應子部分受體。在另一實施例中，免疫結合物以比包含兩個或兩個以上效應子部分之相應免疫結合物分子大至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的KD結合於效應子部分受體。在另一實施例中，免疫結合物以比包含兩個或兩個以上效應子部分之相應免疫結合物分子大約10倍的解離常數KD結合於效應子部分受體。
抗原結合部分
本發明免疫結合物包含至少一個抗原結合部分。在特定實施例中，免疫結合物包含兩個抗原結合部分，亦即第一及第二抗原結合部分。在一個實施例中，免疫結合物包含不超過兩個抗原結合部分。
本發明免疫結合物之抗原結合部分一般為結合於特異性抗原決定子之多肽分子且能夠使其所連接之實體(例如效應子部分及Fc結構域)針對目標位點，例如針對具有抗原決定子的特定類型之腫瘤細胞或腫瘤基質。免疫結合物可與見於例如腫瘤細胞之表面上、病毒感染細胞之表面上、其他患病細胞之表面上、游離於血清中及/或胞外基質(ECM)中的抗原決定子結合。
在某些實施例中，抗原結合部分針對與病理狀況相關之抗原，諸如在腫瘤細胞上或腫瘤細胞環境中、在發炎位點處或在病毒感染細胞上呈現之抗原。
腫瘤抗原之非限制性實例包括MAGE、MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷去胺酶結合蛋白(ADAbp)、親環素b、結腸直腸相關之抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性抗原決定基CAP-1以及CAP-2、etv6、am11、前列腺特異性抗原(PSA)及其免疫原性抗原決定基PSA-1、PSA-2以及PSA-3、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、腫瘤抗原之MAGE家族(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、腫瘤抗原之GAGE家族(例如GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪胺酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-胎蛋白、E-鈣黏素、α-索烴素、β-索烴素及γ-索烴素、p120ctn、gp100 Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性結腸息肉病蛋白(APC)、胞襯蛋白、連接蛋白37、Ig-個體基因型、p15、gp75、GM2及GD2神經結醣脂、諸如人類乳頭狀瘤病毒蛋白之病毒產物、腫瘤抗原之Smad家族、lmp-1、P1A、EBV編碼之核抗原(EBNA)-1、腦肝糖磷酸酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1及 CT-7、以及c-erbB-2。
病毒抗原之非限制性實例包括流行性感冒病毒血球凝集素、EB病毒(Epstein-Barr virus)LMP-1、C型肝炎病毒E2醣蛋白、HIV gp160以及HIV gp120。
ECM抗原之非限制性實例包括多配體蛋白聚糖(syndecan)、肝素酶、整合素、骨橋蛋白、連接蛋白(link)、鈣黏素、層黏連蛋白、層黏連蛋白型EGF、凝集素、纖維結合蛋白、洛奇蛋白(notch)、固生蛋白及基質金屬蛋白酶(matrixin)。
本發明免疫結合物可結合於細胞表面抗原之以下特定非限制性實例：FAP、Her2、EGFR、IGF-1R、CD22(B細胞受體)、CD23(低親和力IgE受體)、CD30(細胞激素受體)、CD33(骨髓細胞表面抗原)、CD40(腫瘤壞死因子受體)、IL-6R(IL6受體)、CD20、MCSP及PDGFβR(β血小板源生長因子受體)。在特定實施例中，抗原為人類抗原。
在某些實施例中，抗原結合部分係針對在腫瘤細胞上或腫瘤細胞環境中呈現之抗原。在其他實施例中，抗原結合部分係針對在發炎位點呈現之抗原。在一特定實施例中，該抗原結合部分係針對選自以下之群的抗原：纖維母細胞活化蛋白(FAP)、肌糖蛋白-C之A1結構域(TNC A1)、肌糖蛋白-C之A2結構域(TNC A2)、纖維結合蛋白之額外結構域B(EDB)、癌胚抗原(CEA)及黑素瘤相關之硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)。
在一個實施例中，本發明免疫結合物包含兩個或兩個以 上抗原結合部分，其中此等抗原結合部分中之每一者特異性結合於同一抗原決定子。
抗原結合部分可為保持與抗原決定子之特異性結合的任何類型之抗體或其片段。抗體片段包括(但不限於)VH片段、VL片段、Fab片段、F(ab')2片段、scFv片段、Fv片段、微型抗體、雙功能抗體、三功能抗體及四功能抗體(參看例如Hudson及Souriau,Nature Med 9,129-134(2003))。在一特定實施例中，抗原結合部分為Fab分子。在一個實施例中，該Fab分子為人類。在另一實施例中，該Fab分子為人類化分子。在另一實施例中，該Fab分子包含人類重鏈及輕鏈恆定區。
在一個實施例中，免疫結合物包含至少一個，通常兩個或兩個以上對纖維結合蛋白之額外結構域B(EDB)有特異性之抗原結合部分。在另一實施例中，免疫結合物包含至少一個，通常兩個或兩個以上可與單株抗體L19競爭結合EDB之抗原決定基的抗原結合部分。參看例如PCT公開案WO 2007/128563 A1(其全文以引用的方式併入本文中)。
在另一實施例中，免疫結合物包含多肽序列，其中源自L19單株抗體之Fab重鏈與包含杵修飾之Fc結構域次單元共用羧基端肽鍵，該次單元又與IL-2多肽共用羧基端肽鍵。在一更特定實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：215或其保留功能性之變異體。在一個實施例中，免疫結合物包含多肽序列，其中源自L19單株抗體之Fab重鏈與包含臼修飾之Fc結構域次單元共用羧基端肽鍵。在一更 特定實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：213或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，免疫結合物包含源自L19單株抗體之Fab輕鏈。在一更特定實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：217或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：215及SEQ ID NO：217或其保留功能性之變異體。在另一特定實施例中，多肽例如經雙硫鍵共價連接。在一些實施例中，Fc結構域次單元各自包含胺基酸取代L234A、L235A及P329G。
在一特定實施例中，免疫結合物包含由與序列SEQ ID NO：216至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸序列編碼的多肽序列。在另一特定實施例中，免疫結合物包含由聚核苷酸序列SEQ ID NO：216編碼之多肽序列。在另一特定實施例中，免疫結合物包含由與序列SEQ ID NO：214至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸序列編碼的多肽序列。在另一特定實施例中，免疫結合物包含由聚核苷酸序列SEQ ID NO：214編碼之多肽序列。在另一特定實施例中，免疫結合物包含由與序列SEQ ID NO：218至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸序列編碼的多肽序列。在另一特定實施例中，免疫結合物包含由聚核苷酸序列SEQ ID NO：218編碼之多肽序列。
在一個實施例中，本發明免疫結合物包含至少一個，通 常兩個或兩個以上對肌糖蛋白C之A1結構域(TNC-A1)有特異性之抗原結合部分。在另一實施例中，免疫結合物包含至少一個，通常兩個或兩個以上可與單株抗體F16競爭結合TNC-A1之抗原決定基的抗原結合部分。參看例如PCT公開案WO 2007/128563 A1(其全文以引用的方式併入本文中)。在一個實施例中，免疫結合物包含至少一個，通常兩個或兩個以上對肌糖蛋白C之A1及/或A4結構域(TNC-A1或TNC-A4或TNC-A1/A4)有特異性之抗原結合部分。
在一特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分包含與SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：35至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區序列或其保留功能性之變異體。在另一特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分包含與SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：31至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區序列或其保留功能性之變異體。在一更特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分包含與SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：35至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區序列或其保留功能性之變異體，及與SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：31至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區序列或其保留功能性之變異體。
在另一特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分的重鏈可變區序列由與SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：36至少約 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的聚核苷酸序列編碼。在另一特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分的重鏈可變區序列由聚核苷酸序列SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：36編碼。在另一特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分的輕鏈可變區序列由與SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：32至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的聚核苷酸序列編碼。在另一特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分的輕鏈可變區序列由聚核苷酸序列SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：32編碼。
在一個實施例中，免疫結合物包含多肽序列，其中對肌糖蛋白C之A1結構域有特異性之Fab重鏈與包含杵修飾之Fc結構域次單元共用羧基端肽鍵，該次單元又與IL-2多肽共用羧基端肽鍵。在另一實施例中，免疫結合物包含多肽序列，其中對肌糖蛋白C之A1結構域有特異性之Fab重鏈與包含臼修飾之Fc結構域次單元共用羧基端肽鍵。在一更特定實施例中，免疫結合物包含此等多肽序列兩者。在另一實施例中，免疫結合物另外包含對肌糖蛋白C之A1結構域有特異性之Fab輕鏈。在另一特定實施例中，多肽例如經雙硫鍵共價連接。在一些實施例中，Fc結構域次單元各自包含胺基酸取代L234A、L235A及P329G。
在一特定實施例中，免疫結合物包含至少一個，通常兩個或兩個以上對肌糖蛋白C之A2結構域(TNC-A2)有特異性之抗原結合部分。在一特定實施例中，免疫結合物之抗原 結合部分包含與選自以下之群的序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之重鏈可變區序列：SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：183及SEQ ID NO：187；或其保留功能性之變異體。在另一特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分包含與選自以下之群的序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之輕鏈可變區序列：SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：181及SEQ ID NO：185；或其保留功能性之變異體。在一更特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分包含與選自以下之群的序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之重鏈可變區序列：SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：183及SEQ ID NO：187；或其保留功能性之變異體，及與選自以下之群的序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之輕鏈可變區序列：SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：181及SEQ ID NO：185；或其保留功能 性之變異體。在一特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分包含SEQ ID NO：27之重鏈可變區序列及SEQ ID NO：25之輕鏈可變區序列。
在另一特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分的重鏈可變區序列由與選自以下之群的序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸序列編碼：SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：184及SEQ ID NO：188。在另一特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分的重鏈可變區序列由選自以下之群的聚核苷酸序列編碼：SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：184及SEQ ID NO：188。在另一特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分的輕鏈可變區序列由與選自以下之群的序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸序列編碼：SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：182及SEQ ID NO：186。在另一特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分的輕鏈可變區序列由選自以下之群的聚核苷酸序列編碼：SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：166、 SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：182及SEQ ID NO：186。
在另一實施例中，免疫結合物包含多肽序列，其中對肌糖蛋白C之A2結構域有特異性之Fab重鏈與包含臼修飾之Fc結構域次單元共用羧基端肽鍵，該次單元又與IL-10多肽共用羧基端肽鍵。在一更特定實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：235或SEQ ID NO：237，或其保留功能性之變異體。在一個實施例中，免疫結合物包含多肽序列，其中對肌糖蛋白C之A2結構域有特異性之Fab重鏈與包含杵修飾之Fc結構域次單元共用羧基端肽鍵。在一更特定實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：233或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，免疫結合物包含對肌糖蛋白C之A2結構域有特異性之Fab輕鏈。在一更特定實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：239或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：233、SEQ ID NO：235及SEQ ID NO：239或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：233、SEQ ID NO：237及SEQ ID NO：239或其保留功能性之變異體。在另一特定實施例中，多肽例如經雙硫鍵共價連接。在一些實施例中，Fc結構域次單元各自包含胺基酸取代L234A、L235A及P329G。
在一特定實施例中，免疫結合物包含由與序列SEQ ID NO：236或SEQ ID NO：238至少約80%、85%、90%、 95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸序列編碼的多肽序列。在另一特定實施例中，免疫結合物包含由聚核苷酸序列SEQ ID NO：236或SEQ ID NO：238編碼之多肽序列。在另一特定實施例中，免疫結合物包含由與序列SEQ ID NO：234至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸序列編碼的多肽序列。在另一特定實施例中，免疫結合物包含由聚核苷酸序列SEQ ID NO：234編碼之多肽序列。在另一特定實施例中，免疫結合物包含由與序列SEQ ID NO：240至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸序列編碼的多肽序列。在另一特定實施例中，免疫結合物包含由聚核苷酸序列SEQ ID NO：240編碼之多肽序列。
在另一實施例中，免疫結合物包含多肽序列，其中對肌糖蛋白C之A2結構域有特異性之Fab重鏈與包含杵修飾之Fc結構域次單元共用羧基端肽鍵，該次單元又與IL-2多肽共用羧基端肽鍵。在一更特定實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：285或其保留功能性之變異體。在一個實施例中，免疫結合物包含多肽序列，其中對肌糖蛋白C之A2結構域有特異性之Fab重鏈與包含臼修飾之Fc結構域次單元共用羧基端肽鍵。在一更特定實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：287或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，免疫結合物包含對肌糖蛋白C之A2結構域有特異性之Fab輕鏈。在一更特定實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：239或其保留功能性之變 異體。在另一實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：285、SEQ ID NO：287及SEQ ID NO：239或其保留功能性之變異體。在另一特定實施例中，多肽例如經雙硫鍵共價連接。在一些實施例中，Fc結構域次單元各自包含胺基酸取代L234A、L235A及P329G。
在一特定實施例中，免疫結合物包含由與序列SEQ ID NO：286至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸序列編碼的多肽序列。在另一特定實施例中，免疫結合物包含由聚核苷酸序列SEQ ID NO：286編碼之多肽序列。在另一特定實施例中，免疫結合物包含由與序列SEQ ID NO：288至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸序列編碼的多肽序列。在另一特定實施例中，免疫結合物包含由聚核苷酸序列SEQ ID NO：288編碼之多肽序列。在另一特定實施例中，免疫結合物包含由與序列SEQ ID NO：240至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸序列編碼的多肽序列。在另一特定實施例中，免疫結合物包含由聚核苷酸序列SEQ ID NO：240編碼之多肽序列。
在一特定實施例中，免疫結合物包含至少一個，通常兩個或兩個以上對纖維母細胞活化蛋白(FAP)有特異性之抗原結合部分。在一特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分包含與選自由以下組成之群的序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之 重鏈可變區序列：SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：151及SEQ ID NO：155；或其保留功能性之變異體。在另一特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分包含與選自由以下組成之群的序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之輕鏈可變區序列：SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：149及SEQ ID NO：153；或其保留功能性之變異體。在一更特定實施例中， 免疫結合物之抗原結合部分包含與選自由以下組成之群的序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之重鏈可變區序列：SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：151及SEQ ID NO：155；或其保留功能性之變異體，及與選自由以下組成之群的序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之輕鏈可變區序列：SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO： 149及SEQ ID NO：153，或其保留功能性之變異體。在一特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分包含SEQ ID NO：111之重鏈可變區序列及SEQ ID NO：109之輕鏈可變區序列。在另一特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分包含SEQ ID NO：143之重鏈可變區序列及SEQ ID NO：141之輕鏈可變區序列。在另一特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分包含SEQ ID NO：51之重鏈可變區序列及SEQ ID NO：49之輕鏈可變區序列。
在另一特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分的重鏈可變區序列由與選自由以下組成之群的序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸序列編碼：SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：152及SEQ ID NO：156。在另一特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分的重鏈可變區序列由選自由以下組成之群的聚核苷酸序列編碼：SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO： 52、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：152及SEQ ID NO：156。在另一特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分的輕鏈可變區序列由與選自由以下組成之群的序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸序列編碼：SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：150及SEQ ID NO：154。在另一特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分的輕鏈可變區序列由選自由以下組成之群的聚核苷酸序列編碼：SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO： 44、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：150及SEQ ID NO：154。
在一個實施例中，免疫結合物包含多肽序列，其中對FAP有特異性之Fab重鏈與包含杵修飾之Fc結構域次單元共用羧基端肽鍵，該次單元又與IL-2多肽共用羧基端肽鍵。在一更特定實施例中，免疫結合物包含選自以下之群的多肽序列：SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：271及SEQ ID NO：273；或其保留功能性之變異體。在一個實施例中，免疫結合物包含多肽序列，其中對FAP有特異性之Fab重鏈與包含杵修飾之Fc結構域次單元共用羧基端肽鍵，該次單元又與IL-15多肽共用羧基端肽鍵。在一更特定實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：199或其保留功能性之變異體。在一個實施例中，免疫結合物包含多肽序列，其中對FAP有特異性之Fab重鏈與包含臼修飾之Fc結構域次單元共用羧基端肽鍵。在一更特定實施例中，免疫結合物包含選自以下之群的多肽序列：SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：201及SEQ ID NO：207；或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，免疫結合物包含對FAP有特異性之Fab輕鏈。在一更特定實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：205或SEQ ID NO：211，或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：205、多肽序列SEQ ID NO：193及選自以下之群的多肽序列：SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：199及SEQ ID NO：269，或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：203及SEQ ID NO：205或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：209及SEQ ID NO：211或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：193及SEQ ID NO：269或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：211、SEQ ID NO：207及SEQ ID NO：271或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：211、SEQ ID NO：207及SEQ ID NO：273或其保留功能性之變異體。在另一特定實施例中，多肽例如經雙硫鍵共價連接。在一些實施例中，Fc結構域次單元各自包含胺基酸取代L234A、L235A及P329G。
在另一實施例中，免疫結合物包含多肽序列，其中對FAP有特異性之Fab重鏈與包含臼修飾之Fc結構域次單元共 用羧基端肽鍵，該次單元又與IL-10多肽共用羧基端肽鍵。在一更特定實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：243或SEQ ID NO：245，或其保留功能性之變異體。在一個實施例中，免疫結合物包含多肽序列，其中對FAP有特異性之Fab重鏈與包含杵修飾之Fc結構域次單元共用羧基端肽鍵。在一更特定實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：241或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，免疫結合物包含對FAP有特異性之Fab輕鏈。在一更特定實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：205或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：241及SEQ ID NO：243或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：241及SEQ ID NO：245或其保留功能性之變異體。在另一特定實施例中，多肽例如經雙硫鍵共價連接。在一些實施例中，Fc結構域次單元各自包含胺基酸取代L234A、L235A及P329G。
在一特定實施例中，免疫結合物包含由與選自以下之群的序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的聚核苷酸序列編碼之多肽序列：SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：210、SEQ ID NO：244、SEQ ID NO：246、SEQ ID NO：270、SEQ ID NO：272及SEQ ID NO：274。在另一特定實施例中，免疫結合物包含由選自以下 之群的聚核苷酸序列編碼之多肽序列：SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：210、SEQ ID NO：244、SEQ ID NO：246、SEQ ID NO：270、SEQ ID NO：272及SEQ ID NO：274。在另一特定實施例中，免疫結合物包含由與選自以下之群的序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸序列編碼的多肽序列：SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：208及SEQ ID NO：242。在另一特定實施例中，免疫結合物包含由選自以下之群的聚核苷酸序列編碼之多肽序列：SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：208及SEQ ID NO：242。在另一特定實施例中，免疫結合物包含由與序列SEQ ID NO：206或SEQ ID NO：212至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸序列編碼的多肽序列。在另一特定實施例中，免疫結合物包含由聚核苷酸序列SEQ ID NO：206或SEQ ID NO：212編碼之多肽序列。
在一個實施例中，免疫結合物包含至少一個，通常兩個或兩個以上對癌胚抗原(CEA)有特異性之抗原結合部分。在一特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分包含與序列SEQ ID NO：191或SEQ ID NO：295至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區序列或其保留功能性之變異體。在另一特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分包含與序列SEQ ID NO：189或SEQ ID NO：293至少約80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區序列或其保留功能性之變異體。在一更特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分包含與序列SEQ ID NO：191至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區序列或其保留功能性之變異體，及與序列SEQ ID NO：189至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區序列或其保留功能性之變異體。在另一特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分包含與序列SEQ ID NO：295至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區序列或其保留功能性之變異體，及與序列SEQ ID NO：293至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區序列或其保留功能性之變異體。
在另一特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分的重鏈可變區序列由與序列SEQ ID NO：192或SEQ ID NO：296至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的聚核苷酸序列編碼。在另一特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分的重鏈可變區序列由聚核苷酸序列SEQ ID NO：192或SEQ ID NO：296編碼。在另一特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分的輕鏈可變區序列由與序列SEQ ID NO：190或SEQ ID NO：294至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的聚核苷酸序列編碼。在另一特定實施例中，免疫結合物之抗原結合部分 的輕鏈可變區序列由聚核苷酸序列SEQ ID NO：190或SEQ ID NO：294編碼。
在一個實施例中，免疫結合物包含多肽序列，其中對CEA有特異性之Fab重鏈與包含杵修飾之Fc結構域次單元共用羧基端肽鍵，該次單元又與IL-2多肽共用羧基端肽鍵。在一更特定實施例中，免疫結合物包含選自由以下組成之群的多肽序列：SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：275、SEQ ID NO：277及SEQ ID NO：279；或其保留功能性之變異體。在一個實施例中，免疫結合物包含多肽序列，其中對CEA有特異性之Fab重鏈與包含臼修飾之Fc結構域次單元共用羧基端肽鍵。在一更特定實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：227或SEQ ID NO：281，或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，免疫結合物包含對CEA有特異性之Fab輕鏈。在一更特定實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：231或SEQ ID NO：283，或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：229及SEQ ID NO：231或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：275、SEQ ID NO：281及SEQ ID NO：283或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：277、SEQ ID NO：281及SEQ ID NO：283或其保留功能性之變異體。在另一實施例中，免疫結合物包含多肽序列SEQ ID NO：279、SEQ ID NO：281及SEQ ID NO：283或其保留功能性 之變異體。在另一特定實施例中，多肽例如經雙硫鍵共價連接。在一些實施例中，Fc結構域多肽鏈包含胺基酸取代L234A、L235A及P329G。
在一特定實施例中，免疫結合物包含由與選自由以下組成之群的序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸序列編碼的多肽序列：SEQ ID NO：230、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：278及SEQ ID NO：280。在另一特定實施例中，免疫結合物包含由選自由以下組成之群的聚核苷酸序列編碼之多肽序列：SEQ ID NO：230、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：278及SEQ ID NO：280。在另一特定實施例中，免疫結合物包含由與序列SEQ ID NO：228或SEQ ID NO：282至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸序列編碼的多肽序列。在另一特定實施例中，免疫結合物包含由聚核苷酸序列SEQ ID NO：228或SEQ ID NO：282編碼之多肽序列。在另一特定實施例中，免疫結合物包含由與序列SEQ ID NO：232或SEQ ID NO：284至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸序列編碼的多肽序列。在另一特定實施例中，免疫結合物包含由聚核苷酸序列SEQ ID NO：232或SEQ ID NO：284編碼之多肽序列。
在一些實施例中，免疫結合物包含多肽序列，其中效應子部分多肽與包含杵修飾之Fc結構域次單元共用羧基端肽鍵。在一更特定實施例中，免疫結合物包含選自以下之群 的多肽序列：SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：249及SEQ ID NO：251；或其保留功能性之變異體。在一個所述實施例中，免疫結合物另外包含多肽序列，其中對FAP有特異性之Fab重鏈與包含臼修飾之Fc結構域次單元共用羧基端肽鍵。在一更特定實施例中，免疫結合物另外包含選自以下之群的多肽序列：SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：201及SEQ ID NO：207；或其保留功能性之變異體。在另一所述實施例中，免疫結合物另外包含多肽序列，其中對EDB、TNC A1、TNC A2或CEA有特異性之Fab重鏈與包含臼修飾之Fc結構域次單元共用羧基端肽鍵。在一些實施例中，Fc結構域次單元各自包含胺基酸取代L234A、L235A及P329G。根據上述實施例中之任一者，免疫結合物可另外包含對相應抗原有特異性之Fab輕鏈。
本發明免疫結合物包括序列與以下所述序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致者：SEQ ID NO 23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、293、295、193、195、197、199、201、203、 205、207、209、211、213、215、217、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、269、271、273、275、277、279、281、283、285及287，包括其功能片段或變異體。本發明亦涵蓋包含具有保守胺基酸取代之此等序列的免疫結合物。
聚核苷酸
本發明另外提供編碼如本文所述之免疫結合物或其片段的經分離聚核苷酸。
本發明聚核苷酸包括與以下所述序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸：SEQ ID NO 24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、294、296、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、270、272、274、276、278、280、282、284、286及288，包括其功能片段或變異體。
編碼本發明免疫結合物之聚核苷酸可表現為編碼整個免 疫結合物之單個聚核苷酸或共表現之多個(例如兩個或兩個以上)聚核苷酸。由共表現之聚核苷酸編碼之多肽可經例如二硫鍵或其他方式締合形成功能性免疫結合物。舉例而言，抗原結合部分之輕鏈部分可由來自包含抗原結合部分之重鏈部分、Fc結構域次單元及視情況存在之效應子部分的免疫結合物之部分的各別聚核苷酸編碼。當共表現時，重鏈多肽將與輕鏈多肽締合形成抗原結合部分。在另一實例中，包含第一抗原結合部分之重鏈部分、兩個Fc結構域次單元中之一者及效應子部分的免疫結合物之部分可由來自包含第二抗原結合部分之重鏈部分及兩個Fc結構域次單元中之另一者的免疫結合物之部分的各別聚核苷酸編碼。當共表現時，Fc結構域次單元將締合形成Fc結構域。
在一個實施例中，本發明之經分離聚核苷酸編碼包含第一抗原結合部分、由兩個次單元組成之Fc結構域及單個效應子部分的免疫結合物之片段，其中抗原結合部分為包含重鏈可變區及輕鏈可變區之抗原結合域，詳言之Fab分子。在一個實施例中，本發明之經分離聚核苷酸編碼第一抗原結合部分之重鏈、Fc結構域之次單元及效應子部分。在另一實施例中，本發明之經分離聚核苷酸編碼第一抗原結合部分之重鏈及Fc結構域之次單元。在另一實施例中，本發明之經分離聚核苷酸編碼Fc結構域之次單元及效應子部分。在一更特定實施例中，經分離聚核苷酸編碼Fab重鏈與Fc結構域次單元共用羧基端肽鍵的多肽。在另一特定實施例中，經分離聚核苷酸編碼Fc結構域次單元與效應子 部分多肽共用羧基端肽鍵的多肽。在另一特定實施例中，經分離聚核苷酸編碼Fab重鏈與Fc結構域次單元共用羧基端肽鍵，該次單元又與效應子部分多肽共用羧基端肽鍵的多肽。在另一特定實施例中，經分離聚核苷酸編碼效應子部分多肽與Fc結構域次單元共用羧基端肽鍵的多肽。
在另一實施例中，本發明係關於編碼免疫結合物或其片段之經分離聚核苷酸，其中聚核苷酸包含編碼如以下所示之可變區序列的序列：SEQ ID NO 23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、293或295。在另一實施例中，本發明係關於編碼免疫結合物或其片段之經分離聚核苷酸，其中聚核苷酸包含編碼如以下所示之多肽序列的序列：SEQ ID NO 193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、269、271、273、275、277、279、281、283、285或287。在另一實施例中，本發明另外係關於編碼免疫結合物或其片段之經分離聚核苷酸，其中聚核苷酸包含與以下所示之核苷酸序列 至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的序列：SEQ ID NO 24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、294、296、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、270、272、274、276、278、280、282、284、286或288。在另一實施例中，本發明係關於編碼免疫結合物或其片段之經分離聚核苷酸，其中聚核苷酸包含以下所示之核酸序列：SEQ ID NO 24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、294、296、194、196、198、200、202、 204、206、208、210、212、214、216、218、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、270、272、274、276、278、280、282、284、286或288。在另一實施例中，本發明係關於編碼免疫結合物或其片段之經分離聚核苷酸，其中聚核苷酸包含編碼與以下之胺基酸序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的可變區序列：SEQ ID NO 23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、293或295。在另一實施例中，本發明係關於編碼免疫結合物或其片段之經分離聚核苷酸，其中聚核苷酸包含編碼與以下之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽序列之序列：SEQ ID NO 193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、269、271、273、275、277、279、281、283、285或287。本發明涵蓋編碼免疫結合物或其片段之經分離聚核苷酸，其中聚核苷酸包含編碼以下之可變 區序列的序列：具有保守胺基酸取代之SEQ ID NO 23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、293或295。本發明亦涵蓋編碼本發明免疫結合物或其片段之經分離聚核苷酸，其中聚核苷酸包含編碼以下之多肽序列的序列：具有保守胺基酸取代之SEQ ID NO 193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、269、271、273、275、277、279、281、283、285或287。
在某些實施例中，聚核苷酸或核酸為DNA。在其他實施例中，本發明聚核苷酸為RNA，例如信使RNA(mRNA)形式。本發明RNA可為單股或雙股RNA。
重組方法
本發明免疫結合物可例如藉由固態肽合成(例如梅里菲爾德固相合成(Merrifield solid phase synthesis))或重組製造獲得。對於重組製造，分離一或多種例如上文所述之編碼免疫結合物(片段)之聚核苷酸且插入一或多個載體中以 供在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。該聚核苷酸易於使用習知程序進行分離及定序。在一個實施例中，提供包含一或多個本發明聚核苷酸之載體(較佳表現載體)。熟習此項技術者熟知之方法可用於建構含有免疫結合物(片段)之編碼序列以及適當轉錄/轉譯控制信號的表現載體。此等方法包括活體外重組DNA技術、合成技術及活體內重組/遺傳重組。參看例如Maniatis等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989)；及Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y(1989)中所述之技術。表現載體可為質體、病毒之部分，或可為核酸片段。表現載體包括其中編碼免疫結合物(片段)之聚核苷酸(亦即編碼區)以與啟動子及/或其他轉錄或轉譯控制元件可操作締合之方式選殖的表現卡匣。如本文所用，「編碼區」為由轉譯成胺基酸之密碼子組成的核酸之一部分。儘管「終止密碼子」(TAG、TGA或TAA)不轉譯成胺基酸，但其可被視為編碼區(若存在)之部分，但任何側接序列(例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子、5'及3'非轉譯區及其類似物)均不為編碼區之部分。兩個或兩個以上編碼區可存在於單個聚核苷酸構築體中(例如單個載體上)或各別聚核苷酸構築體中(例如各別(不同)載體上)。此外，任何載體均可含有單個編碼區，或可包含兩個或兩個以上編碼區，例如本發明載體可編碼一 或多個多肽，其經蛋白水解分解以轉譯後或共轉譯方式分離成最終蛋白質。此外，本發明之載體、聚核苷酸或核酸可編碼融合或未融合於編碼本發明免疫結合物(片段)之聚核苷酸上的異源編碼區，或其變異體或衍生物。異源編碼區包括(但不限於)專門元件或基元，諸如分泌信號肽或異源功能域。可操作締合為基因產物(例如多肽)之編碼區與一或多個調節序列締合，以使得基因產物之表現受調節序列影響或控制。若誘導啟動子功能可導致編碼所要基因產物之mRNA的轉錄且若兩個DNA片段之間的鍵聯之性質並不干擾表現調節序列指導基因產物表現之能力或干擾DNA模板被轉錄之能力，則兩個DNA片段(諸如多肽編碼區及與其締合之啟動子)「可操作地締合」。因此，若啟動子能夠實現編碼多肽之核酸的轉錄，則啟動子區將與該核酸可操作地締合。啟動子可為僅指導預定細胞內之DNA實質轉錄之細胞特異性啟動子。除啟動子外，其他轉錄控制元件(例如強化子、操縱子、抑制子及轉錄終止信號)可與聚核苷酸可操作地締合以指導細胞特異性轉錄。本文揭示適合啟動子及其他轉錄控制區。熟習此項技術者已知多種轉錄控制區。此等包括(但不限於)在脊椎動物細胞中起作用之轉錄控制區，諸如(但不限於)細胞巨大病毒之啟動子及強化子區段(例如與內含子-A聯合之即刻早期啟動子)、猴病毒40(例如早期啟動子)及反轉錄病毒(諸如勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))。其他轉錄控制區包括源自脊椎動物基因者，諸如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素及家兔 -血球蛋白，以及能夠控制真核細胞中之基因表現的其他序列。其他適合轉錄控制區包括組織特異性啟動子及強化子，以及誘導性啟動子(例如四環素誘導性啟動子)。類似地，一般技術人員已知多種轉譯控制元件。此等包括(但不限於)核糖體結合位點、轉譯起始及終止密碼子，及源自病毒系統之元件(詳言之，內部核糖體進入位點，或IRES，亦稱為CITE序列)。表現卡匣亦可包括其他特徵，諸如複製起點，及/或染色體整合元件，諸如反轉錄長末端重複序列(LTR)，或腺相關病毒(AAV)反向末端重複序列(ITR)。
本發明之聚核苷酸及核酸編碼區可與編碼分泌肽或信號肽之其他編碼區締合，該等肽指導由本發明聚核苷酸編碼之多肽的分泌。舉例而言，若需要分泌免疫結合物，則編碼信號序列之DNA可置於編碼本發明免疫結合物或其片段之核酸的上游。根據信號假設，由哺乳動物細胞分泌之蛋白質具有信號肽或分泌前導序列，其在開始跨越粗糙內質網排出生長蛋白質鏈後自成熟蛋白質分解。一般技術人員知曉，由脊椎動物細胞分泌之多肽一般具有與多肽之N端融合之信號肽，其自經轉譯多肽裂解產生經分泌或「成熟」形式之多肽。在某些實施例中，使用原生信號肽(例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽)，或彼序列之保留指導與其可操作地締合之多肽分泌之能力的功能衍生物。或者，可使用異源哺乳動物信號肽或其功能衍生物。舉例而言，野生型前導序列可經人類組織纖維蛋白溶酶原活化子 (TPA)或小鼠β-葡萄醣醛酸酶之前導序列取代。分泌性信號肽之例示性胺基酸及相應聚核苷酸序列顯示於SEQ ID NO 8-16中。
編碼可用於促進隨後純化(例如組胺酸標籤)或幫助標記免疫結合物之短蛋白質序列的DNA可包括於編碼免疫結合物(片段)之聚核苷酸的末端內或末端處。
在另一實施例中，提供包含一或多個本發明聚核苷酸之宿主細胞。在某些實施例中，提供包含一或多個本發明載體之宿主細胞。聚核苷酸及載體可單獨或組合併入本文分別關於聚核苷酸及載體描述的任何特徵。在一個所述實施例中，宿主細胞包含具有編碼本發明免疫結合物(之部分)之聚核苷酸的載體(例如已經該載體轉型或轉染)。如本文所用，術語「宿主細胞」係指可經工程改造產生本發明免疫結合物或其片段的任何種類之細胞系統。此項技術中熟知適於複製及支持免疫結合物之表現的宿主細胞。該等細胞在適當時可經特定表現載體轉染或轉導，且可生長大量含有載體之細胞以接種大規模醱酵槽，獲得用於臨床應用之足量免疫結合物。適合宿主細胞包括原核微生物(諸如大腸桿菌)或多種真核細胞(諸如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、昆蟲細胞或其類似物)。舉例而言，可在細菌中(詳言之無需糖基化時)製造肽。表現後，多肽可在可溶部分中自細菌細胞漿分離且可經進一步純化。除了原核生物外，真核微生物(諸如絲狀真菌或酵母)為適用於編碼多肽之載體的選殖或表現宿主，包括糖基化路徑經「人類化」 導致產生具有部分或完全人類糖基化模式之多肽的真菌及酵母菌株。參看Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004)，及Li等人，Nat Biotech 24,210-215(2006)。適用於表現(糖基化)多肽之宿主細胞亦源自多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已識別出可與昆蟲細胞聯合使用且尤其用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞之眾多桿狀病毒病毒株。植物細胞培養物亦可用作宿主。參看例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(描述用於在轉殖基因植物中製造抗體的PLANTIBODIESTM技術)。脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，可使用適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株。適用哺乳動物宿主細胞株之其他實例為經SV40(COS-7)轉型之猴腎CV1細胞株；人類胚腎細胞株(例如Graham等人，J Gen Virol 36,59(1977)中所述之293或293T細胞)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠賽特利細胞(mouse sertoli cell)(例如Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)中所述之TM4細胞)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；布法羅大鼠肝細胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；猴乳房腫瘤細胞(MMT 060562)；TRI細胞(例如Mather等人，Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)中所述)；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他適用哺乳動物宿主細胞株包括中國 倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括dhfr- CHO細胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如YO、NS0、P3X63及Sp2/0。適於蛋白質製造之特定哺乳動物宿主細胞株之綜述參看例如Yazaki及Wu,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268頁(2003)。宿主細胞包括培養細胞，例如哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、細菌細胞及植物細胞，僅舉例而言，且亦包括轉殖基因動物、轉殖基因植物或培養植物或動物組織內包含之細胞。在一個實施例中，宿主細胞為真核細胞，較佳為哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人類胚腎(HEK)細胞或淋巴祖細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。
此項技術中已知在此等系統中表現外來基因之標準技術。表現包含抗原結合域之重鏈或輕鏈之多肽(諸如抗體)的細胞可經工程改造，以便亦表現另一抗體鏈，使得所表現產物為具有重鏈及輕鏈兩者之抗體。
在一個實施例中，提供製造本發明免疫結合物之方法，其中該方法包含在適於表現免疫結合物之條件下培養如本文提供之包含編碼免疫結合物之聚核苷酸的宿主細胞，且自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收免疫結合物。
免疫結合物之組分以遺傳方式彼此融合。免疫結合物可經設計，以使其組分直接彼此融合或經連接子序列間接融合。可根據此項技術中熟知之方法測定連接子之組成及長度且可測試其功效。效應子部分與Fc結構域之間的連接子 序列之實例見於SEQ ID NO 195、197、199、203、209、215、229、235、237、243、245、247、249、251、269、271、273、275、277、279及285中所示之序列中。亦可包括其他序列以併入裂解位點，從而在需要時分離融合之各別組分，例如肽鏈內切酶識別序列。
在某些實施例中，免疫結合物之一或多個抗原結合部分包含至少一個能夠結合抗原決定子之抗體可變區。可變區可形成天然或非天然存在之抗體及其片段之部分或源自天然或非天然存在之抗體及其片段。此項技術中熟知製造多株抗體及單株抗體之方法(參看例如Harlow及Lane,「Antibodies,a laboratory manual」,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。非天然存在之抗體可使用固相肽合成建構，可重組製造(例如美國專利第4,186,567號中所述)或可例如藉由篩選包含可變重鏈及可變輕鏈之組合文庫獲得(參看例如McCafferty之美國專利第5,969,108號)。抗原結合部分及其製造方法亦詳細描述於PCT公開案WO 2011/020783中，其全部內容以引用的方式併入本文中。
本發明免疫結合物中可使用任何動物物種之抗體、抗體片段、抗原結合域或可變區。適用於本發明之非限制性抗體、抗體片段、抗原結合域或可變區可為鼠類、靈長類或人類來源。若免疫結合物欲用於人類用途，則可使用嵌合形式之抗體，其中抗體恆定區來自人類。亦可根據此項技術中熟知之方法製備人類化或完全人類形式之抗體(參看例如Winter之美國專利第5,565,332號)。可藉由多種方法 實現人類化，包括(但不限於)(a)將非人類(例如供體抗體)CDR移植至保留或未保留關鍵構架殘基(例如對保留良好抗原結合親和力或抗體功能重要者)之人類(例如接受抗體)構架區及恆定區，(b)僅將非人類特異性決定區(SDR或a-CDR；對抗體-抗原相互作用關鍵之殘基)移植至人類構架及恆定區上，或(c)移植整個非人類可變域，但藉由置換表面殘基以類人類區段對其進行「掩蓋(cloak)」。人類化抗體及其製備方法論述於例如Almagro及Fransson,Front Biosci 13,1619-1633(2008)中，且進一步描述於例如Riechmann等人，Nature 332,323-329(1988)；Queen等人，Proc Natl Acad Sci USA 86,10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Jones等人，Nature 321,522-525(1986)；Morrison等人，Proc Natl Acad Sci 81,6851-6855(1984)；Morrison及Oi,Adv Immunol 44,65-92(1988)；Verhoeyen等人，Science 239,1534-1536(1988)；Padlan,Molec Immun 31(3),169-217(1994)；Kashmiri等人，Methods 36,25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol Immunol 28,489-498(1991)(描述「表面重塑」)；Dall'Acqua等人，Methods 36,43-60(2005)(描述「FR改組」)；及Osbourn等人，Methods 36,61-68(2005)及Klimka等人，Br J Cancer 83,252-260(2000)(描述FR改組之「導向選擇」法)中。可使用此項技術中已知之多種技術產生人類抗體及人類可變區。人類抗體一般描述於van Dijk及van de Winkel,Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)以及Lonberg,Curr Opin Immunol 20,450-459(2008)中。人類可變區可形成藉由融合瘤法產生之人類單株抗體之部分且源自該等人類單株抗體(參看例如Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。人類抗體及人類可變區亦可藉由向已經修飾以回應於抗原攻擊產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體的轉殖基因動物投與免疫原來製備(參看例如Lonberg,Nat Biotech 23,1117-1125(2005))。人類抗體及人類可變區亦可藉由分離選自源自人類之噬菌體呈現文庫的Fv純系可變區序列產生(參看例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178,1-37(O'Brien等人編，Human Press,Totowa,NJ,2001)；及McCafferty等人，Nature 348,552-554；Clackson等人，Nature 352,624-628(1991))。噬菌體通常以單鏈Fv(scFv)片段或Fab片段形式呈現抗體片段。藉由噬菌體呈現製備免疫結合物之抗原結合部分的詳細描述可見於PCT公開案WO 2011/020783隨附之實例中。
在某些實施例中，適用於本發明之抗原結合部分根據例如PCT公開案WO 2011/020783(參看與親和力成熟有關之實例)或美國專利申請公開案第2004/0132066號中所揭示之方法工程改造，以具有提高之結合親和力，該等文獻全部內容以引用的方式併入本文中。本發明免疫結合物結合特異性抗原決定子之能力可經酶聯結免疫吸附分析法 (ELISA)或熟習此項技術者熟悉的其他技術量測，例如表面電漿子共振技術(在BIACORE T100系統上分析)(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))及傳統結合分析法(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))。可使用競爭分析法識別與參考抗體競爭結合特定抗原的抗體、抗體片段、抗原結合域或可變域，例如與L19抗體競爭結合纖維結合蛋白之額外結構域B(EDB)的抗體。在某些實施例中，該競爭抗體結合於與參考抗體結合的相同抗原決定基(例如線性或構形抗原決定基)。用於定位結合抗體之抗原決定基之詳細例示性方法提供於Morris(1996)「Epitope Mapping Protocols,」Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中。在例示性競爭分析法中，由固定化抗原(例如EDB)在包含會結合抗原之第一經標記抗體(例如L19抗體)及測試與第一抗體競爭結合抗原之能力的第二未經標記抗體的溶液中培育。第二抗體可存在於融合瘤上清液中。對照組中，由固定化抗原在包含第一經標記抗體但不包含第二未經標記抗體之溶液中培育。在允許第一抗體與抗原結合之條件下培育後，移除過量未結合抗體，且量測與固定化抗原締合之標記量。若測試樣品中與固定化抗原締合之標記量比對照樣品實質上降低，則表示該第二抗體與第一抗體競爭結合抗原。參看Harlow及Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
如本文所述製備之免疫結合物可藉由此項技術已知之技術純化，諸如高效液相層析法、離子交換層析法、凝膠電泳、親和力層析法、尺寸排阻層析法及其類似方法。用於純化特定蛋白質之實際條件將部分取決於諸如以下之因素：淨電荷、疏水性、親水性等，且將為熟習此項技術者顯而易知。對於親和力層析純化法，可使用會與免疫結合物結合之抗體、配位體、受體或抗原。舉例而言，對於本發明免疫結合物之親和力層析純化法，可使用具有蛋白質A或蛋白質G之基質。依序蛋白質A或G親和力層析法及尺寸排阻層析法可基本上如實例中所述用於分離免疫結合物。免疫結合物之純度可藉由多種熟知分析方法中之任一者測定，包括凝膠電泳、高壓液相層析法及其類似方法。舉例而言，如實例中所述表現之重鏈融合蛋白顯示為完整的且如還原SDS-PAGE所證明經適當組裝(參看例如圖4)。在約Mr 25,000、Mr 50,000及Mr 60,000下解析三個條帶，該三個分子量對應於免疫球蛋白輕鏈、重鏈及重鏈/效應子部分融合蛋白的預測分子量。
分析法
本文提供之免疫結合物可藉由此項技術中已知之多種分析法針對其物理/化學性質及/或生物活性進行識別、篩選或表徵。
親和力分析法
可根據實例中所述之方法，藉由表面電漿子共振(SPR)，使用標準儀器，諸如BIAcore儀器(GE Healthcare) 測定免疫結合物對效應子部分受體(例如IL-10R或IL-2R之多種形式)、Fc受體或目標抗原之親和力，且受體或目標蛋白諸如可藉由重組表現獲得。或者，可使用表現特定受體或目標抗原之細胞株，例如藉由流動式細胞測量術(FACS)評估免疫結合物對不同受體或目標抗原之結合。用於量測結合親和力之特定說明性及例示性實施例描述於下文及以下實例中。
根據一個實施例，藉由表面電漿子共振，在25℃下使用配位體(例如效應子部分受體、Fc受體或目標抗原)固定於CM5晶片上之BIACORE® T100機器(GE Healthcare)量測KD。簡言之，根據供應商說明書以N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)活化羧甲基化聚葡萄糖生物感測器晶片(CM5,GE Healthcare)。重組配位體以10 mM乙酸鈉(pH 5.5)稀釋至0.5-30 μg/ml，隨後在10 μl/min之流動速率下注射以達成約100-5000個反應單位(RU)之偶聯蛋白。注射配位體後，注射1 M乙醇胺以阻斷未反應之基團。對於動力學量測，在25℃下，以約30-50 μl/min之流動速率注射免疫結合物於HBS-EP+(GE Healthcare、10 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05%界面活性劑P20，pH 7.4)中之3至5倍連續稀釋液(約0.01 nM至300 nM範圍)。使用簡易一對一朗繆爾結合模型(simple one-to-one Langmuir binding model，BIACORE® T100 Evaluation軟體第1.1.1版)藉由同時擬合締合與解離感測器圖譜計算締合速率(kon)及解離速 率(koff)。根據比率koff/kon計算平衡解離常數(KD)。參看例如Chen等人，J Mol Biol 293,865-881(1999)。
活性分析法
可藉由如實例中所述之多種分析法量測本發明免疫結合物之生物活性。生物活性可例如包括誘導具有效應子部分受體之細胞的增殖、誘導具有效應子部分受體之細胞的信號傳導、誘導具有效應子部分受體之細胞分泌細胞激素及誘導腫瘤退化及/或提高存活。
組合物、調配物及投藥途徑
在另一態樣中，本發明提供包含本文提供之任一種免疫結合物的醫藥組合物，例如用於以下治療法中之任一者中。在一個實施例中，醫藥組合物包含本文提供之任一種免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑。在另一實施例中，醫藥組合物包含本文提供之任一種免疫結合物及至少一種額外治療劑，例如下文所述。
另外提供以適於活體內投與之形式製造本發明免疫結合物的方法，該方法包含(a)獲得本發明免疫結合物，及(b)將免疫結合物與至少一種醫藥學上可接受之載劑一起調配，藉此免疫結合物製劑經調配以供活體內投與。
本發明醫藥組合物包含治療有效量之一或多種溶解或分散於醫藥學上可接受之載劑中的免疫結合物。「醫藥學或藥理學上可接受」一詞係指在所採用劑量及濃度下一般對接受者無毒的分子實體及組合物，亦即在向動物(適當時諸如人類)投與時不產生不良、過敏或其他非所要反應。 熟習此項技術者根據本發明將已知含有至少一種免疫結合物及視情況存在之其他活性成分的醫藥組合物的製劑，如以引用之方法併入本文中的Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版。Mack Printing Company,1990所舉例說明。此外，對於動物(例如人類)投與，應瞭解，製劑應滿足生物標準FDA局(FDA Office of Biological Standards)或其他國家的相應管理機構所要求的滅菌、發熱性、一般安全性及純度標準。較佳組合物為凍乾調配物或水溶液。如本文所用，如一般技術者已知，「醫藥學上可接受之載劑」包括任何及所有溶劑、緩衝劑、分散介質、塗料、界面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗細菌劑、抗真菌劑)、等張劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、抗氧化劑、蛋白質、藥物、藥物穩定劑、聚合物、凝膠、黏合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、染料、所述類似材料及其組合(參看例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版。Mack Printing Company,1990，第1289頁至第1329頁，其以引用的方式併入本文中)。除非任何習知載劑與活性成分不相容，否則預期其可用於治療性或醫藥組合物中。
組合物可包含不同類型之載劑，視是否將以固體、液體或氣溶膠形式投與及是否需要滅菌以用於諸如注射之投藥途徑而定。本發明免疫結合物(及任何額外治療劑)可靜脈內、皮內、動脈內、腹膜內、病灶內、顱內、關節內、前列腺內、脾內、腎內、胸膜內、氣管內、鼻內、玻璃體 內、陰道內、直腸內、腫瘤內、肌肉內、腹膜內、皮下、結膜下、囊泡內、經黏膜、心包內、臍帶內、眼內、經口、表面、局部、經吸入(例如氣溶膠吸入)、注射、輸注、連續輸注、直接定位灌注浸浴目標細胞、經導管、經灌洗、精華液中、脂質組合物(例如脂質體)中投與，或藉由一般技術人員已知的其他方法或前述之任何組合投與(參看例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版。Mack Printing Company,1990，其以引用的方式併入本文中)。非經腸投與(詳言之靜脈內注射)最常用於投與多肽分子，諸如本發明免疫結合物。
非經腸組合物包括經設計以藉由注射(例如皮下、皮內、病灶內、靜脈內、動脈內、肌肉內、鞘內或腹膜內注射)投與者。為了注射，本發明免疫結合物可於水溶液、較佳生理學上相容之緩衝液(諸如韓克氏溶液(Hank's solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理食鹽水緩衝液)中調配。溶液可含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。或者，免疫結合物可呈在使用前以適合媒劑(例如無菌無熱原質水)復原之粉末形式。無菌可注射溶液藉由將所要量之本發明免疫結合物併入適當溶劑(需要時具有下文列舉之多種其他成分)中來製備。容易例如藉由經無菌過濾膜過濾實現滅菌。一般而言，藉由將多種滅菌活性成分併入含有基礎分散液介質及/或其他成分之無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液、懸浮液或乳液之無菌粉末的情形中，較佳製備方法為真空乾 燥或冷凍-乾燥技術，該等技術自其先前無菌過濾之液體介質產生活性成分加任何其他所要成分之粉末。液體介質在需要時應經適合緩衝，且在注射前，首先以足量生理食鹽水或葡萄糖賦予液體稀釋劑以等張性。組合物在製造及儲存條件下必須穩定，且防止微生物(諸如細菌及真菌)之污染作用。應瞭解，內毒素污染應保持在安全含量的最低限度，例如小於0.5 ng/mg蛋白質。醫藥學上可接受之適合載劑包括(但不限於)：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨；苄索氯銨(benzethonium chloride)；酚，丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)之多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、菌藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。水性注射懸浮液可含有提高懸浮液黏度之化合物，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、聚葡萄糖或其類似物。視情況而言，懸浮液亦可含有適合穩定劑或提高化合物溶解度之 試劑，以允許製備高度濃縮之溶液。另外，活性化合物之懸浮液可製備成適當油性注射懸浮液。適合親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油，諸如芝麻油，或合成脂肪酸酯，諸如油酸乙酯或三酸甘油酯，或脂質體。
可例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合將活性成分裹入所製備之微囊中，例如分別裹入膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米囊劑)中或於巨乳液中的羥甲基纖維素或明膠微囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊。該等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版。Mack Printing Company,1990)中。可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含有多肽之固體疏水性聚合物之半透性基質，該等基質呈成型物品形式，例如薄膜或微囊。在特定實施例中，可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中使用延遲吸收之試劑(例如單硬脂酸鋁、明膠或其組合)來達成。
除了上文所述組合物之外，免疫結合物亦可調配成儲槽式製劑。該等長效調配物可藉由植入(例如皮下或肌肉內)或藉由肌肉內注射來投與。因此，舉例而言，免疫結合物可與適合聚合或疏水性物質(例如調配成可接受油中之乳液)或與離子交換樹脂一起調配；或調配成微溶性衍生物(例如調配成微溶性鹽)。
可藉助於習知混合、溶解、乳化、囊封、裹入或凍乾製程製造包含本發明免疫結合物之醫藥組合物。醫藥組合物可以習知方式使用一或多種生理學上可接受之載劑、稀釋 劑、賦形劑或助劑調配，該等試劑有助於將蛋白質加工成醫藥學上可使用之製劑。合適調配物視所選投藥途徑而定。
免疫結合物可調配成游離酸或鹼、中性或鹽形式的組合物。醫藥學上可接受之鹽為實質上保留游離酸或鹼之生物活性的鹽。此等包括酸加成鹽(例如與蛋白質組合物之游離胺基形成者)，或其係以諸如鹽酸或磷酸之無機酸形成，或以諸如乙酸、乙二酸、酒石酸或順丁烯二酸之有機酸形成。以游離羧基形成之鹽亦可衍生自諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵之無機鹼；或諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸或普魯卡因(procaine)之有機鹼。醫藥鹽傾向於比相應游離鹼形式更易溶於水性及其他質子性溶劑中。
治療方法及組合物
本文提供之任一種免疫結合物均可用於治療方法中。本發明免疫結合物可用作免疫治療劑，例如用於治療癌症。
為了用於治療方法中，本發明免疫結合物將以與良好醫療實踐一致的方式調配、給藥及投與。本文考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症起因、藥劑傳遞位點、投藥方法、投藥時程及醫師已知之其他因素。
在一個態樣中，提供本發明免疫結合物用作藥物。在其他態樣中，提供本發明免疫結合物用於治療疾病。在某些實施例中，提供本發明免疫結合物用於治療方法中。在一 個實施例中，本發明提供用於治療有需要之個體之疾病的本文所述之免疫結合物。在某些實施例中，本發明提供用於治療患有疾病之個體之方法中的免疫結合物，其包含向個體投與治療有效量之免疫結合物。在某些實施例中，待治療之疾病為增生病症。在一特定實施例中，該疾病為癌症。在其他實施例中，待治療之疾病為發炎病症。在某些實施例中，該方法另外包含向個體投與治療有效量之至少一種其他治療劑，例如若待治療之疾病為癌症，則投與抗癌劑。任一上述實施例之「個體」為哺乳動物，較佳為人類。
在另一態樣中，本發明提供本發明免疫結合物之用途，其用於製造或製備用以治療有需要之個體之疾病的藥物。在一個實施例中，該藥物用於治療疾病之方法中，該方法包含向患有疾病之個體投與治療有效量之藥物。在某些實施例中，待治療之疾病為增生病症。在一特定實施例中，該疾病為癌症。在其他實施例中，待治療之疾病為發炎病症。在一個實施例中，該方法另外包含向個體投與治療有效量之至少一種其他治療劑，例如若待治療之疾病為癌症，則投與抗癌劑。任一上述實施例之「個體」可為哺乳動物，較佳為人類。
在另一態樣中，本發明提供治療個體之疾病的方法，其包含向該個體投與治療有效量之本發明免疫結合物。在一個實施例中，向該個體投與包含醫藥學上可接受形式之本發明免疫結合物的組合物。在某些實施例中，待治療之疾 病為增生病症。在一特定實施例中，該疾病為癌症。在其他實施例中，待治療之疾病為發炎病症。在某些實施例中，該方法另外包含向個體投與治療有效量之至少一種其他治療劑，例如若待治療之疾病為癌症，則投與抗癌劑。任一上述實施例之「個體」可為哺乳動物，較佳為人類。
在某些實施例中，待治療之疾病為增生病症，尤其為癌症。癌症之非限制性實例包括膀胱癌、腦癌、頭頸癌、胰腺癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮膚癌、鱗狀細胞癌、骨癌及腎癌。可使用本發明免疫結合物治療之其他細胞增殖病症包括(但不限於)位於以下之贅瘤：腹部、骨骼、乳房、消化系統、肝臟、胰臟、腹膜、內分泌腺(腎上腺、副甲狀腺、垂體、睪丸、卵巢、胸腺、甲狀腺)、眼睛、頭頸、神經系統(中樞及周邊)、淋巴系統、骨盆、皮膚、軟組織、脾臟、胸部及泌尿生殖系統。亦包括癌前病狀或病灶及癌症轉移。在某些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：腎細胞癌、皮膚癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、腦癌、頭頸癌。在一些實施例中，尤其當免疫結合物之效應子部分為IL-10時，待治療之疾病為發炎病症。發炎病症之非限制性實例包括類風濕性關節炎、牛皮癬或克羅恩氏病(Crohn's disease)。熟練技術人員容易認識到，在許多情形中，免疫結合物可能不提供治癒，而僅可提供部分益處。在一些實施例中，具有一些益處之生理學改變亦被視為治 療有益的。因此，在一些實施例中，提供生理學改變之免疫結合物之量被視為「有效量」或「治療有效量」。需要治療之個體(subject)、患者或個體(individual)通常為哺乳動物，更特定言之為人類。
本發明免疫結合物亦適用作診斷試劑。免疫結合物與抗原決定子之結合容易藉由使用對效應子部分有特異性之二次抗體偵測。在一個實施例中，二次抗體及免疫結合物促進偵測免疫結合物與位於細胞或組織表面上之抗原決定子的結合。
在一些實施例中，向細胞投與有效量之本發明免疫結合物。在其他實施例中，向個體投與治療有效量之本發明免疫結合物用於治療疾病。
為了預防或治療疾病，適當劑量之本發明免疫結合物(當單獨使用或與一或多種其他治療劑組合使用時)將視待治療之疾病類型、投藥途徑、患者體重、免疫結合物類型、疾病嚴重程度及過程、投與免疫結合物係出於預防抑或治療目的、先前或並行治療干預、患者臨床病史及對免疫結合物之反應，及主治醫師之判斷而定。無論如何，負責投藥之從業人員將確定活性成分在組合物中之濃度及用於個別個體之適當劑量。本發明涵蓋多種給藥時程，包括(但不限於)在多個時間點單次或多次投與、團式投與及脈衝輸注。
免疫結合物適合一次性或經一系列治療向患者投與。視疾病類型及嚴重程度而定，約1 μg/kg至15 mg/kg(例如0.1 mg/kg-10 mg/kg)免疫結合物可為例如藉由一或多次單獨投與或藉由連續輸注向患者投與之初始候選劑量。視上文提及之因素而定，一個典型日劑量可為約1 μg/kg至100 mg/kg或100 mg/kg以上之範圍。為了經數天或更長時間重複投與，視病狀而定，治療一般將持續直至疾病症狀出現所要抑制。免疫結合物之一個例示性劑量將在約0.005 mg/kg至約10 mg/kg範圍內。在其他非限制性實例中，劑量亦可包含每次投與每公斤體重約1 μg、每公斤體重約5 μg、每公斤體重約10 μg、每公斤體重約50 μg、每公斤體重約100 μg、每公斤體重約200 μg、每公斤體重約350 μg、每公斤體重約500 μg、每公斤體重約1 mg、每公斤體重約5 mg、每公斤體重約10 mg、每公斤體重約50 mg、每公斤體重約100 mg、每公斤體重約200 mg、每公斤體重約350 mg、每公斤體重約500 mg至每公斤體重約1000 mg或每公斤體重約1000 mg以上，及其中可衍生出之任何範圍。在可自本文所列數字衍生之範圍的非限制性實例中，基於上文所述之數字，可投與每公斤體重約5 mg至每公斤體重約100 mg、每公斤體重約5 μg至每公斤體重約500 mg等之範圍。因此，可向患者投與約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、5.0 mg/kg或10 mg/kg中之一或多個劑量(或其任何組合)。該等劑量可間歇投與，例如每週或每三週(例如使得患者接受約2至約20個，或例如約6個免疫結合物劑量)。可投與較高起始劑量，隨後一或多次較低劑量。然而，其他劑量方案亦可適用。此療法之進程容易藉由習知 技術及分析法監測。
本發明免疫結合物一般將以有效實現預期目的之量使用。為了用於治療或預防疾病病狀，以治療有效量投與或施用本發明免疫結合物或其醫藥組合物。治療有效量之確定充分處於熟習此項技術者之能力範圍內，尤其是根據本文提供之詳細揭示內容。
對於全身投與，可由活體外分析法(諸如細胞培養分析法)初始估算治療有效劑量。接著可在動物模型中調配劑量，以實現包括如細胞培養物中所測定之IC50的循環濃度範圍。該資訊可用於更準確確定人類中之適用劑量。
亦可使用此項技術中熟知之技術自活體內數據(例如動物模型)估算初始劑量。一般技術人員可容易基於動物數據使向人類之投藥最佳化。
可個別調整劑量及時間間隔以提供足以維持治療作用之免疫結合物的血漿含量。藉由注射投與之一般患者劑量在每天約0.1至50 mg/kg範圍內，通常每天約0.5至1 mg/kg。可藉由每天投與多個劑量實現治療有效血漿含量。可例如藉由HPLC量測血漿含量。
在局部投與或選擇性攝取的情形中，免疫結合物之有效局部濃度可能不與血漿濃度有關。熟習此項技術者將無需過度實驗即能夠使治療有效局部劑量最佳化。
治療有效劑量之本文所述免疫結合物一般將提供治療益處，而不引起實質毒性。免疫結合物之毒性及治療功效可藉由標準醫藥程序在細胞培養物或實驗動物中測定。可使 用細胞培養分析法及動物研究測定LD50(使50%群體致死之劑量)及ED50(在50%群體中治療有效之劑量)。毒性與治療作用之間的劑量比為治療指數，其可表示為比率LD50/ED50。展現大治療指數之免疫結合物較佳。在一個實施例中，本發明免疫結合物展現高治療指數。自細胞培養分析法及動物研究獲得之資料可用於調配適用於人類之劑量範圍。劑量較佳在包括ED50的幾乎無毒性或無毒性之循環濃度範圍內。劑量可視多種因素(例如所採用劑量形式、所利用投藥途徑、個體病狀及其類似因素)而在此範圍內變化。精確配方、投藥途徑及劑量可由個別醫師鑒於患者病狀進行選擇(參看例如Fingl等人，1975,The Pharmacological Basis of Therapeutics，第1章，第1頁，其全文以引用的方式併入本文中)。
以本發明免疫結合物治療之患者的主治醫師將知曉如何及何時由於毒性、器官功能障礙及其類似因素終止、中斷或調整投藥。相反，主治醫師亦將知曉若臨床反應不足應如何調整治療至較高水準(排除毒性)。處理所關注病症所投與劑量之量值將隨待治療病狀之嚴重程度、投藥途徑及其類似因素而變化。病狀嚴重程度可例如藉由標準預後評估法部分評估。此外，劑量及可能的給藥頻率亦將根據個別患者之年齡、體重及反應而變化。
其他藥劑及治療
本發明免疫結合物可與療法中之一或多種其他藥劑組合投與。舉例而言，本發明免疫結合物可與至少一種額外治 療劑共投與。術語「治療劑」涵蓋治療需要該治療之個體的症狀或疾病所投與之任何藥劑。該額外治療劑可包含適用於治療特定適應症的任何活性成分，較佳具有不會彼此不利影響的互補活性者。在某些實施例中，額外治療劑為免疫調節劑、細胞生長抑制劑、細胞黏附抑制劑、細胞毒性劑、細胞凋亡活化劑或提高細胞對細胞凋亡誘導劑之敏感性的藥劑。在一特定實施例中，額外治療劑為抗癌劑，例如微管破裂劑、抗代謝物、拓撲異構酶抑制劑、DNA插入劑、烷基化劑、激素療法、激酶抑制劑、受體拮抗劑、腫瘤細胞凋亡活化劑或抗血管生成劑。
該等其他藥劑適當地以對預期目的有效之量存在於組合中。該等其他藥劑之有效量視所用免疫結合物之量、病症或治療之類型、及上文所述之其他因素而定。免疫結合物一般以與本文所述相同之劑量及投藥途徑、或約1%至99%本文所述之劑量、或以經驗上/臨床上判斷適當的任何劑量及藉由任何途徑使用。
上文所述之該等組合療法涵蓋組合投藥(其中兩種或兩種以上治療劑包括於同一或單獨組合物中)及單獨投藥，在該情形中，本發明免疫結合物可在投與額外治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後投與。本發明免疫結合物亦可與放射療法組合使用。
製造物品
在本發明之另一態樣中，提供一種含有適用於治療、預防及/或診斷上文所述病症之材料的製造物品。該製造物 品包含容器及在該容器上或與該容器相關聯之標籤或藥品說明書。適合容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由諸如玻璃或塑膠之多種材料形成。容器容納單獨或與有效治療、預防及/或診斷病狀之另一組合物組合之組合物，且可具有無菌出入孔(例如容器可為具有可經皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明免疫結合物。標籤或藥品說明書指示組合物係用於治療所選病狀。此外，製造物品可包含(a)含有組合物之第一容器，其中組合物包含本發明免疫結合物；及(b)含有組合物之第二容器，其中組合物包含另一細胞毒性劑或其他治療劑。本發明之此實施例中之製造物品可另外包含指示組合物可用於治療特定病狀之藥品說明書。或者或另外，製造物品可另外包含含有醫藥學上可接受之緩衝劑的第二(或第三)容器，諸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、林格氏溶液及右旋糖溶液。其可另外包括出於商業及用戶立場所需之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
實例
以下為本發明之方法與組合物之實例。應瞭解，考慮到上文提供之一般說明，可實踐各種其他實施例。
實例1 一般方法 重組DNA技術
如Sambrook等人，Molecular cloning：A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中所述，使用標準方法操作DNA。根據製造商說明書使用分子生物學試劑。關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列之一般資訊在Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH Publication No 91-3242中給出。
DNA定序
藉由雙股定序測定DNA序列。
基因合成
當需要時所要基因區段藉由PCR使用適當模板產生或藉由Geneart AG(Regensburg,Germany)自經由自動基因合成合成的寡核苷酸及PCR產物進行合成。在不可獲得確切基因序列之情形中，基於最近同系物之序列設計寡核苷酸引子，且藉由RT-PCR自源自適當組織之RNA分離基因。側接有單個限制性核酸內切酶裂解位點之基因區段選殖至標準選殖/定序載體中。自轉型細菌純化質體DNA且藉由UV光譜法測定濃度。藉由DNA定序確定次選殖基因片段之DNA序列。以適合限制性位點設計基因區段以允許次選殖至各別表現載體中。所有構築體均以編碼前導肽之5'端DNA序列設計，該前導肽靶向蛋白質在真核細胞中之分泌。SEQ ID NO 8-16給出例示性前導肽及編碼其的聚核苷酸序列。
製備IL-2R βγ次單元-Fc融合物及IL-2R α次單元Fc融合物
為了研究IL-2受體結合親和力，產生允許表現雜二聚合 IL-2受體之工具；IL-2受體之β-次單元使用「杵臼修飾」技術(Merchant等人，Nat Biotech.16,677-681(1998))與經工程改造進行雜二聚合之Fc分子(Fc(臼))(參看SEQ ID NO 17及18)融合。IL-2受體之γ-次單元接著融合於Fc(杵)變異體(參看SEQ ID NO 19及20)，該Fc(杵)變異體與Fc(臼)雜二聚合。此雜二聚合Fc融合蛋白接著用作分析IL-2/IL-2受體相互作用之受質。IL-2R α-次單元表現為具有AcTev裂解位點及Avi His標籤之單體鏈(SEQ ID NO 21及22)。各別IL-2R次單元在具有針對IL-2R βγ次單元構築體之血清及不具有針對α-次單元構築體之血清的HEK EBNA 293中短暫表現。IL-2R βγ次單元構築體在蛋白質A(GE Healthcare)上，隨後尺寸排阻層析(GE Healthcare,Superdex 200)進行純化。IL-2R α-次單元在NiNTA管柱(Qiagen)上經His標籤，隨後尺寸排阻層析(GE Healthcare,Superdex 75)進行純化。多個受體構築體之胺基酸及相應核苷酸序列在SEQ ID NO 17-22及255-268中給出。
製備免疫結合物
關於針對FAP之抗原結合部分的產生及親和力成熟之細節可見於PCT專利申請公開案第WO 2012/020006號隨附之實例中，其全文以引用的方式併入本文中。如其中所述，已藉由噬菌體呈現產生針對FAP之多個抗原結合域，包括以下實例中所用之命名為4G8、28H1及4B9者。純系28H1為基於親本純系4G8之親和力成熟抗體，而純系4B9為基於親本純系3F2之親和力成熟抗體。本文所用的命名為2B1 之抗原結合域係針對肌糖蛋白C之A2結構域(TNC A2)。關於此及其他針對TNC A2之抗原結合部分的細節可見於PCT專利申請公開案第WO 2012/020038號中，其全文以引用的方式併入本文中。命名為L19且針對纖維結合蛋白之額外結構域B(EDB)的抗原結合域源自PCT公開案WO 2007/128563中所述之L19抗體。本文所用的命名為CH1A1A及CH1A1A 98/99 2F1之抗原結合域係針對CEA，且更詳細描述於PCT專利申請案第PCT/EP2012/053390號中，其全文以引用的方式併入本文中。
在以下一些實例中用作效應子部分之IL-2四倍突變體(qm)詳細描述於PCT專利申請案第PCT/EP2012/051991號中，其全文以引用的方式併入本文中。簡言之，IL-2 qm由以下突變表徵：
1. T3A-剔除預測之O-糖基化位點
2. F42A-剔除IL-2/IL-2R α相互作用
3. Y45A-剔除IL-2/IL-2R α相互作用
4. L72G-剔除IL-2/IL-2R α相互作用
5. C125A-突變以避免二硫橋接之IL-2二聚體
當IL-2 qm多肽或包含其之免疫結合物在諸如CHO或HEK293細胞之真核細胞中表現時，選擇T3A突變以消除O-糖基化位點且獲得具有較高均質性及純度之蛋白質產物。選擇三個突變F42A、Y45A及L72G以干擾IL-2受體之α-次單元與CD25之結合。降低或廢除之CD25結合導致活化誘導之細胞死亡(AICD)降低、缺乏調節T細胞之優先活 化以及毒性降低(如EP 11153964.9中所述)。
DNA序列藉由基因合成及/或經典分子生物技術產生，且在MPSV啟動子控制下且在合成聚A位點上游次選殖至哺乳動物表現載體中，各載體均具有EBV OriP序列。藉由使用磷酸鈣轉染共轉染指數式生長之HEK293-EBNA細胞與哺乳動物表現載體產生下文實例中所應用之免疫結合物。或者，由聚伸乙基亞胺(PEI)以各別表現載體轉染在懸浮液中生長之HEK293細胞。或者，穩定轉染之CHO細胞池或CHO細胞純系用於在無血清培養基中製造。隨後，自上清液純化IgG-細胞激素融合蛋白。簡言之，藉由使用在20 mM磷酸鈉、20 mM檸檬酸鈉pH 7.5中平衡之蛋白質A(HiTrap ProtA,GE Healthcare)的一個親和力步驟純化IgG-細胞激素融合蛋白。在裝載上清液後，管柱首先以20 mM磷酸鈉、20 mM檸檬酸鈉(pH 7.5)洗滌，隨後以13.3 mM磷酸鈉、20 mM檸檬酸鈉、500 mM氯化鈉(pH 5.45)洗滌。以20 mM檸檬酸鈉、100 mM氯化鈉、100 mM甘胺酸(pH 3)溶離IgG-細胞激素融合蛋白。中和並彙聚溶離份，且在以下最終調配物緩衝液中藉由尺寸排阻層析法(HiLoad 16/60 Superdex 200，GE Healthcare)進行純化：25 mM磷酸鈉、125 mM氯化鈉、100 mM甘胺酸(pH 6.7)。針對下文之所選構築體給出例示性詳細純化程序及結果。藉由使用基於胺基酸序列計算之莫耳消光係數量測280 nm下之光密度(OD)來測定經純化蛋白質樣品之蛋白質濃度。藉由SDS-PAGE在有或無還原劑(5 mM 1,4-二硫蘇糖醇)存在下分析免疫結 合物之純度及分子量，且以庫馬斯藍(Coomassie blue)(SimpleBlueTM SafeStain，Invitrogen)染色。根據製造商說明書(4-20% Tris-甘胺酸凝膠或3-12% Bis-Tris)使用NuPAGE® Pre-Cast凝膠系統(Invitrogen)。在25℃下，使用Superdex 200 10/300GL分析型尺寸排阻管柱(GE Healthcare)在2 mM MOPS、150 mM NaCl、0.02% NaN3(pH 7.3)電泳緩衝液中分析免疫結合物樣品之聚集體含量。在藉由以肽-N糖苷酶F(Roche Molecular Biochemicals)酶處理移除N-聚糖後，可藉由奈電噴霧Q-TOF質譜法驗證還原抗體輕鏈及重鏈之胺基酸主鏈的完整性。藉由如下文所述之MALDI TOF-MS分析連接於免疫結合物之Fc結構域的寡醣。藉由PNGaseF消化自免疫結合物酶促釋放寡醣。含有所釋放寡醣之所得消化溶液經直接製備以用於MALDI TOF-MS分析或在製備樣品用於MALDI TOF-MS分析之前以EndoH糖苷酶進一步消化。
實例2
基於FAP-抗體4G8、28H1及4B9產生靶向FAP之IgG-IL-2 qm融合蛋白，其中如圖2A中所示，一個單個IL-2四倍突變體(qm)融合於一個雜二聚合重鏈之C端。經二價抗體Fab區靶向選擇性表現FAP之腫瘤基質(親合力作用)。藉由應用杵臼技術實現導致存在單個IL-2四倍突變體之雜二聚合作用。為了使均二聚IgG-細胞激素融合物之產生降至最低，使細胞激素經(G4S)3或G4-(SG4)2連接子融合於含有杵之IgG重鏈的C端(缺失C端Lys殘基)。抗體-細胞激素融合物 具有IgG樣特性。為了降低FcγR結合/效應子功能且防止FcR共活化，向Fc結構域中引入P329G L234A L235A(LALA)突變。此等免疫結合物之序列於SEQ ID NO 193、269及205(具有(G4S)3連接子之28H1)、SEQ ID NO 193、195及205(具有G4-(SG4)2連接子之28H1)、SEQ ID NO 201、203及205(具有G4-(SG4)2連接子之4G8)、SEQ ID NO 207、209及211(具有G4-(SG4)2連接子之4B9)、SEQ ID NO 207、271及211(具有(G4S)3連接子之4B9)中給出。
此外，產生基於抗CEA抗體CH1A1A 98/99 2F1之靶向CEA之IgG-IL-2 qm融合蛋白、IgG未結合於特定目標之對照DP47GS非靶向IgG-IL-2 qm融合蛋白以及靶向肌糖蛋白-C之A2結構域的腫瘤基質特異性基於2B10之IgG-IL-2 qm融合蛋白。此等免疫結合物之序列在SEQ ID NO 275、281及283(具有G4-(SG4)2連接子之CH1A1A 98/99 2F1)、SEQ ID NO 277、281及283(具有(G4S)3連接子之CH1A1A 98/99 2F1)、SEQ ID NO 219、221及225(具有G4-(SG4)2連接子之DP47GS)、SEQ ID NO 219、289及225(具有(G4S)3連接子之DP47GS)、SEQ ID NO 285、287及239(具有(G4S)3連接子之2B10)中給出。藉由在HEK293 EBNA細胞中短暫表現產生構築體且如上文所述進行純化。圖3至圖9顯示純化之例示性層析圖及溶離型態(A、B)以及最終純化構築體之分析型SDS-PAGE及尺寸排阻層析法(C、D)。短暫表現產量對基於4G8之IgG-IL-2 qm免疫結合物為42 mg/L、對基於28H1之IgG-IL-2 qm免疫結合物為20 mg/L、 對基於4B9之IgG-IL-2 qm免疫結合物為10 mg/L、對基於CH1A1A 98/99 2F1之IgG-IL-2 qm免疫結合物為5.3 mg/L、對基於2B10之IgG-IL-2 qm免疫結合物為36.7 mg/L且對於基於DP47GS之IgG-IL-2 qm免疫結合物為13.8 mg/L。
此外，產生基於28H1之靶向FAP之IgG-IL-15免疫結合物，其序列在SEQ ID NO 193、199及205中給出。在IL-15多肽序列中，位置53處之麩胺酸殘基置換為丙胺酸以降低與IL-15受體之α-次單元的結合，且位置79處之天冬醯胺殘基置換為丙胺酸以消除糖基化。藉由短暫表現產生IgG-IL-15融合蛋白且如上文所述進行純化。
FAP結合親和力
藉由表面電漿子共振(SPR)在Biacore機上相較於相應未經修飾之IgG抗體測定基於4G8及28H1抗FAP抗體之IgG-IL-2 qm免疫結合物之FAP結合活性。簡言之，抗His抗體(Penta-His，Qiagen 34660)固定於CM5晶片上以捕捉10 nM His標記之人類FAP(20 s)。溫度為25℃且HBS-EP用作緩衝劑。在50 μl/min流動速率下分析物濃度為50 nM至0.05 nM(締合：300 s，解離：900 s，再生：60 s，使用10 mM甘胺酸(pH 2))。基於1：1結合模型，RI=0，Rmax=局部(因為捕捉型式)進行擬合。下表給出如與1：1結合RI=0，Rmax=局部擬合之SPR所測定之估算表觀二價親和力(pM親合力)。
數據顯示在方法之誤差內，相較於相應未經修飾抗體，基於28H1之免疫結合物保留對人類FAP之親和力，或基於4G8之免疫結合物僅僅略微降低。
類似地，在25℃下，藉由SPR分別測定4B9 IgG-IL-2 qm(16 pM)、CH1A1A 98/99 2F1 IgG-IL-2 qm(400 pM)、CH1A1A 98/99 2F1 IgG-IL-2 wt(參看實例4；470 pM)及2B10 IgG-IL-2 qm(150 pM，對於未結合2B10 IgG為300 pM)對人類FAP、CEA及TNC A2之親和力(KD)。亦分別證實4B9與2B10抗體對人類、鼠類及食蟹獼猴FAP或TNC A2之交叉反應性。
隨後，藉由表面電漿子共振(SPR)測定基於4G8之IgG-IL-2 qm免疫結合物及基於28H1之IgG-IL-2 qm免疫結合物對IL-2R βγ雜二聚體及IL-2R α-次單元之親和力，以與PCT專利申請案第PCT/EP2012/051991號中所述之Fab-IL-2 qm-Fab免疫結合物型式進行直接比較。簡言之，將配位體(人類IL-2R α-次單元或人類IL-2R βγ雜二聚體)固定於CM5晶片上。隨後，在25℃下，向晶片施加用於比較的於HBS-EP緩衝液中濃度在300 nM至1.2 nM(1：3稀釋)範圍內之基於4G8之IgG-IL-2 qm免疫結合物及基於28H1之IgG-IL-2 qm免疫結合物或基於4G8之Fab-IL-2 qm-Fab免疫 結合物及基於28H1之Fab-IL-2 qm-Fab免疫結合物作為分析物。流動速率為30 μl/min且應用以下條件：締合：180 s，解離：300 s，及再生：針對IL-2R βγ雜二聚體使用3 M MgCl2為2×30 s，針對IL-2R α-次單元使用50 mM NaOH為10 s。1：1結合應用於擬合(針對IL-2R βγ 1：1結合RI≠0，Rmax=局部，表觀KD，針對IL-2R α 1：1結合RI=0，Rmax=局部)。下表中給出各別KD值。
資料顯示基於4G8之IgG-IL-2 qm免疫結合物及基於28H1之IgG-IL-2 qm免疫結合物至少以與Fab-IL-2 qm-Fab免疫結合物對IL-2R βγ雜二聚體相同的良好親和力結合，而其不結合於IL-2R α-次單元，這是因為突變之誘導干擾CD25結合。相較於各別Fab-IL-2 qm-Fab免疫結合物，IgG-IL-2 qm融合蛋白之親和力似乎在方法誤差內有略微提高。
類似地，在25℃下，藉由SPR測定包含IL-2 wt(參看實例4)或IL-2 qm之其他構築體(4B9、DP47GS、2B10、CH1A1A 98/99 2F1)對IL-2R βγ雜二聚體及IL-2R α-次單元之親和力。對於所有構築體，人類IL-2R βγ雜二聚體之表觀KD為6至12 nM(與構築體是否包含IL-2 wt抑或IL-2 qm無關)，而根本僅包含IL-2 wt之構築體結合於IL-2R α-次單 元(針對人類IL-2R α之KD為約20 nM)。
使用IgG-細胞激素免疫結合物之生物活性分析法
相較於EP 11153964.9中所述之市售IL-2(阿地介白素(Proleukin),Novartis/Chiron)及/或Fab-IL-2-Fab免疫結合物，在若干細胞分析法中研究靶向FAP之基於4G8之IgG-IL-2 qm融合物的生物活性。
結合於表現FAP之細胞
藉由FACS量測靶向FAP之基於4G8之IgG-IL-2 qm免疫結合物與穩定轉染HEK293細胞上表現之人類FAP的結合。簡言之，每孔250,000個細胞與指定濃度之免疫結合物一起在圓底96孔培養板中培育，在4℃下培育30分鐘，且以PBS/0.1% BSA洗滌一次。結合免疫結合物在4℃下與FITC結合之AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人類F(ab')2特異性抗體(Jackson Immuno Research Lab #109-096-097，使用溶液：在PBS/0.1% BSA中1：20倍稀釋，新鮮製備)一起培育30分鐘後，使用FACS CantoII(Software FACS Diva)偵測。結果顯示於圖10中。資料顯示IgG-IL-2 qm免疫結合物以0.9 nM之EC50值結合於表現FAP之細胞，與相應基於4G8之Fab-IL-2 qm-Fab構築體(0.7 nM)相當。
NK細胞之IFN-γ釋放(溶液中)
隨後，研究靶向FAP之基於4G8之IgG-IL-2 qm免疫結合物對NK92細胞釋放IFN-γ之誘導，如IL-2R βγ信號傳導之活化所誘導。簡言之，IL-2饑餓NK92細胞(96孔U型培養板中每孔100,000個細胞)與不同濃度之包含四倍突變體IL-2 之IL-2免疫結合物一起在NK培養基(來自Invitrogen之MEM α(#22561-021)，補充有10% FCS、10%馬血清、0.1 mM 2-巰基乙醇、0.2 mM肌醇及0.02 mM葉酸)中培育24小時。收集上清液且使用來自Becton Dickinson之抗人類IFN-γ ELISA套組II(#550612)分析IFN-γ釋放。阿地介白素(Novartis)及基於28H1之Fab-IL-2 qm-Fab用作IL-2介導之細胞活化的陽性對照。圖11顯示靶向FAP之基於4G8之IgG-IL-2 qm免疫結合物在誘導IFN-γ釋放中與親和力成熟之基於28H1之Fab-IL-2 qm-Fab免疫結合物同等有效。
STAT5磷酸化分析法
在最後一組實驗中，研究靶向FAP之基於4G8之IgG-IL-2 qm免疫結合物相較於基於28H1之Fab-IL-2-Fab及Fab-IL-2 qm-Fab免疫結合物誘導STAT5磷酸化之作用，以及阿地介白素對來自人類PBMC之人類NK細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞及Treg細胞的作用。簡言之，將來自健康志願者之血液吸入含有肝素之注射器中且分離PBMC。PBMC以指定濃度之指定免疫結合物處理或以作為對照之阿地介白素(Novartis)處理。在37℃下培育20分鐘後，PBMC在37℃下以預升溫之Cytofix緩衝液(Becton Dickinson #554655)固定10分鐘，隨後在4℃下以Phosflow Perm緩衝液III(Becton Dickinson #558050)滲透30分鐘。細胞以含有0.1% BSA之PBS洗滌兩次，隨後使用流動式細胞測量術抗體之混合物進行FACS染色以偵測不同細胞群體及STAT5磷酸化。使用來自Becton Dickinson的具有HTS之 FACSCantoII分析樣品。NK細胞定義為CD3-CD56+，CD8陽性T細胞定義為CD3+CD8+，CD4陽性T細胞定義為CD4+CD25-CD127+且Treg細胞定義為CD4+CD25+FoxP3+。對於顯示無或極低CD25表現(意謂IL-2R信號傳導主要經IL-2R βγ雜二聚體介導)之NK細胞及CD8+ T細胞，結果顯示基於4G8之IgG-IL-2 qm免疫結合物誘導STAT5磷酸化之效力小於阿地介白素的1/10，但比基於28H1之Fab-IL-2-Fab及Fab-IL-2 qm-Fab免疫結合物略微更有效。在刺激後顯示快速上調CD25之CD4+ T細胞上，基於4G8之IgG-IL-2 qm免疫結合物不如28H1 Fab-IL-2-Fab免疫結合物有效，但比28H1 Fab-IL-2 qm-Fab免疫結合物略微有效，且仍顯示在飽和濃度下在誘導IL-2R信號傳導方面與阿地介白素及28H1 Fab-IL-2-Fab相當。此與Treg細胞形成對比，其中由於Treg細胞上之高CD25細胞表現及基於4G8之IgG-IL-2 qm免疫結合物對CD25之低結合親和力，基於4G8之IgG-IL-2 qm免疫結合物之效能相較於Fab-IL-2-Fab免疫結合物顯著降低。由於消除了基於4G8之IgG-IL-2 qm免疫結合物中的CD25結合，所以在IL-2R信號傳導在CD25陰性效應細胞上經IL-2R βγ雜二聚體活化之濃度下，Treg細胞中之IL-2信號傳導僅經IL-2R βγ雜二聚體活化。綜上所述，此處所述的基於4G8之IgG-IL-2 qm免疫結合物能夠經IL-2R βγ雜二聚體活化IL-2R信號傳導，但不會造成相較於其他效應細胞的Treg細胞之優先刺激。此等實驗之結果顯示於圖12中。
2B10 IgG-IL-2 qm與表現TNC A2之細胞的結合
藉由FACS量測靶向TNC A2之基於2B10之IgG-IL-2 qm免疫結合物與U87MG細胞上表現之人類TNC A2的結合。簡言之，每孔200,000個細胞與指定濃度之免疫結合物一起在圓底96孔培養板中培育，在4℃下培育30分鐘，且以PBS/0.1% BSA洗滌兩次。結合免疫結合物在4℃下與FITC結合之AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人類IgG Fcγ特異性抗體(Jackson Immuno Research Lab #109-096-098，使用溶液：在PBS/0.1% BSA中1：20倍稀釋，新鮮製備)一起培育30分鐘後，使用FACS CantoII(Software FACS Diva)進行偵測。結果顯示於圖13中。資料顯示2B10 IgG-IL-2 qm免疫結合物與相應未結合IgG同等良好結合於表現TNC A2之U87MG細胞。
由IgG-IL-2免疫結合物誘導NK92細胞增殖
測試2B10 IgG-IL-2 qm、CH1A1A 98/99 2F1 IgG-IL-2 qm、CH1A1A 98/99 2F1 IgG-IL-2 wt、4B9 IgG-IL-2 qm及4B9 IgG-IL-2 wt免疫結合物誘導NK92細胞增殖的能力。對於增殖分析法，NK92細胞在無IL-2之培養基中饑餓2小時，將每孔10000個細胞接種至平底96孔培養板中，接著在37℃、5% CO2下在IL-2免疫結合物存在下在濕潤培育箱中培育3天。3天後，使用來自Promega之CellTiter-Glo發光細胞生存力分析法(#G7571/2/3)量測細胞溶胞物之ATP含量。將1.1 mg/ml之阿地介白素(Novartis)濃度設定為100%增殖且不具有IL-2刺激之未處理細胞設為0%增殖，計算生長百分比。結果顯示於圖14及圖15中。資料顯示所有構築 體均能夠誘導NK92細胞增殖，其中基於CH1A1A之構築體比2B10 IgG-IL-2 qm免疫結合物更具活性，且包含IL-2 wt之構築體比具有IL-2 qm之相應構築體更具活性。
實例3
一般而言，引入幾乎完全消除人類IgG1抗體之FcγR相互作用的P329G LALA突變(參看歐洲專利申請案第EP 11160251.2號，其全文以引用的方式併入本文中)以降低FcγR結合/效應子功能，且因此當各別細胞激素受體與FcγR信號傳導共活化時防止過量細胞激素釋放。在特定情形中，例如當抗體靶向高度腫瘤特異性抗原時，Fc效應子功能可藉由使用未經修飾IgG Fc結構域保留或甚至可經IgG Fc結構域之糖基化工程改造進一步提高。
作為其實例，吾人製造靶向CEA之IgG-IL-2 qm免疫結合物，其中一個單個IL-2四倍突變體經(SG4)3-連接子基於抗CEA抗體純系CH1A1A融合於一個雜二聚合重鏈之C端。在此免疫結合物中，不包括P329G LALA突變(參看序列SEQ ID NO 227、229及231)。免疫結合物以如下文所述之人類野生型IgG-或糖基化工程改造之IgG-IL-2 qm融合蛋白形式表現及純化。
製備(糖基化工程改造)IgG-IL-2 qm免疫結合物
藉由共轉染HEK293-EBNA細胞與哺乳動物抗體表現載體產生靶向CEA之基於CH1A1A之IgG-IL-2 qm免疫結合物。藉由磷酸鈣法轉染指數式生長之HEK293-EBNA細胞。或者，在懸浮液中生長之HEK293細胞經聚伸乙基亞 胺轉染。為了製造未經修飾之非糖基化工程改造之IgG-IL-2 qm免疫結合物，細胞僅以1：1比率之抗體重鏈與輕鏈表現載體(其中抗體重鏈載體為兩種載體之1：1混合物：一種用於具有效應子部分之重鏈的載體，及一種用於不具有效應子部分之重鏈的載體)轉染。
為了製造糖基化工程改造之靶向CEA之IgG-IL-2 qm免疫結合物，細胞分別與比率為4：4：1：1之兩種額外質體共轉染，一種用於表現GnTIII融合多肽(GnT-III表現載體)，且一種用於甘露糖苷酶II表現(高基甘露糖苷酶II表現載體)。細胞以附著單層培養物形式在使用補充有10% FCS之DMEM培養基之T燒瓶中生長，且當其為50%至80%匯合時轉染。為了轉染T150燒瓶，15,000,000個細胞接種歷時24小時，隨後在25 ml補充有FCS之DMEM培養基(最終10體積%)中轉染，且細胞在37℃下置於具有5% CO2氛圍之培育器中隔夜。對於各待轉染之T150燒瓶，藉由混合94 μg在輕鏈與重鏈表現載體之間等分的總質體載體DNA、水(至最終體積469 μl)及469 μl 1M CaCl2溶液製備DNA、CaCl2及水之溶液。向此溶液中添加938 μl 50 mM HEPES、280 mM NaCl、1.5 mM Na2HPO4溶液(pH 7.05)，立即混合10秒且在室溫下靜置20秒。懸浮液以10 ml補充有2% FCS之DMEM稀釋，且添加至T150燒瓶中代替現有培養基。接著添加額外13 ml轉染培養基。細胞在37℃，5% CO2下培育約17至20小時，隨後培養基更換為25 ml DMEM，10% FCS。在培養基更換約7天後，藉由在210 x g 下離心15分鐘收集條件培養基。溶液經無菌過濾(0.22 μm過濾器)且添加0.01 w/v%最終濃度之疊氮化鈉，並保持於4℃下。
藉由親和力層析法使用蛋白質A親和力層析法，隨後如上文所述進行HiLoad Superdex 200管柱(GE Healthcare)上之尺寸排阻層析步驟自細胞培養上清液純化分泌之野生型或糖基化工程改造之CEA IgG-IL-2 qm免疫結合物。如上文所述分析蛋白質濃度、純度、分子量、聚集體含量及完整性。
(糖基化工程改造)IgG-IL-2 qm免疫結合物之寡醣結構分析
為了測定含有海藻糖及非海藻糖基化之寡醣結構的相對比率，藉由MALDI TOF質譜法分析經純化免疫結合物材料之釋放的聚糖。免疫結合物樣品(約50 μg)在37℃下與含5 mU N-糖苷酶F(QAbio；PNGaseF：E-PNG01)之2 mM Tris(pH 7.0)一起培育隔夜，以自蛋白質主鏈釋放寡醣。為了使聚糖去胺，添加最終濃度為150 mM之乙酸且在37℃下培育1小時。為了藉由MALDI TOF質譜法進行分析，在MALDI目標上混合2 μL樣品與2 μL DHB基質溶液(溶解於50%乙醇/5 mM NaCl中之2,5-二羥基苯甲酸[Bruker Daltonics #201346]，4 mg/ml)，且以MALDI TOF質譜儀Autoflex II儀器(Bruker Daltonics)分析。常規記錄50-300個射點且構成單個實驗的總數。所獲得之光譜藉由撓曲分析軟體(Bruker Daltonics)評估且測定所偵測之各峰的質量。隨後，藉由比較質量計算值與各別結構預期之質量理 論值(例如分別具有或不具有海藻糖之複合物、雜合物及寡甘露糖或高甘露糖)將峰分為含有海藻糖或非海藻糖基化之碳水化合物結構。
為了測定雜合物結構之比率，抗體樣品以N-糖苷酶F及內-糖苷酶H[QAbio；EndoH：E-EH02]相伴消化。N-糖苷酶F自蛋白質主鏈釋放所有N連接之聚糖結構(複合物、雜合物及寡甘露糖及高甘露糖結構)，且內-糖苷酶H另外裂解聚糖之還原端的兩個N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)殘基之間的所有雜合物型聚糖。此消化隨後以與上文針對N-糖苷酶F消化之樣品所述相同的方式處理且藉由MALDI TOF質譜法分析。藉由比較N-糖苷酶F消化與合併之N-糖苷酶F/內H消化的模式，特定碳水化合物結構之信號的降低程度用於估算雜合物結構之相對含量。自個別結構之峰高度與所偵測所有寡醣之峰高度總和的比率計算各碳水化合物結構之相對量。海藻糖之量為含有海藻糖之結構相對於N-糖苷酶F處理之樣品中所識別的所有碳水化合物結構(例如複合物、雜合物及寡甘露糖及高甘露糖結構)的百分比。非海藻糖基化之程度為缺乏海藻糖之結構相對於N-糖苷酶F處理之樣品中識別的所有碳水化合物(例如複合物、雜合物及寡甘露糖及高甘露糖結構)的百分比。
抗體依賴性細胞介導之細胞毒性分析法
在ADCC分析法中比較野生型與糖基化工程改造之靶向CEA之CH1A1A IgG-IL-2 qm免疫結合物介導抗體介導之細胞毒性的潛力。簡言之，收集過度表現CEA之A549人類腫 瘤細胞作為目標細胞，洗滌且再懸浮於培養基中，在37℃下以新鮮製備之鈣黃綠素AM(Molecular Probes)染色30分鐘，洗滌3次，計數且稀釋至300,000個細胞/毫升。此懸浮液轉移至圓底96孔培養板(每孔30000個細胞)中，添加各別免疫結合物稀釋液且培育10分鐘，以允許測試免疫結合物在與效應細胞接觸之前與細胞結合。新鮮分離之PBMC的效應與目標比率為25比1。進行共培育4小時。使用兩種不同讀出系統：被攻擊細胞崩解後乳酸脫氫酶(LDH)釋放至上清液中，且鈣黃綠素保留於剩餘活細胞中。收集來自共培養物上清液之LDH且以LDH偵測套組(Roche Applied Science)分析。以ELISA吸光率讀取器(SoftMaxPro軟體，參考波長：490 nm相對650 nm)量測LDH酶之受質轉化率。自離心塊化細胞移除剩餘上清液，在溶解之前在PBS中的一個洗滌步驟，及藉由硼酸鹽緩衝液(50 mM硼酸鹽，0.1% Triton)固定細胞後，在螢光讀取器(Wallac VICTOR3 1420 Multilabel COUNTER(Perkin Elmer))中分析活細胞中之殘餘鈣黃綠素。
圖16顯示基於LDH偵測之結果。基於鈣黃綠素滯留(未圖示)獲得類似結果。兩種構築體皆能夠介導ADCC，糖基化工程改造之構築體與相應糖基化工程改造之未結合IgG相比活性類似。正如所料，非糖基化工程改造之構築體相較於糖基化工程改造之構築體顯示降低之活性。
實例4
產生靶向FAP之基於28H1或基於4B9、靶向CEA之基於 CH1A1A 98/99 2F1及非靶向基於DP47GS之IgG-IL-2免疫結合物，其中一個單個野生型IL-2多肽融合於一個雜二聚合重鏈之C端。藉由應用杵臼技術實現產生具有單個IL-2部分之免疫結合物的雜二聚合作用。為了使均二聚IgG-IL-2融合蛋白之產生降至最低，細胞激素經G4-(SG4)2或(G4S)3連接子融合於含有杵之重鏈(缺失C端Lys殘基)。此等免疫結合物之序列在SEQ ID NO 193、197及205(具有G4-(SG4)2連接子之28H1)、SEQ ID NO 207、273及211(具有(G4S)3連接子之4B9)、SEQ ID NO 277、279及283(具有(G4S)3連接子之CH1A1A 98/99 2F1)、SEQ ID NO 219、223及225(具有G4-(SG4)2連接子之DP47GS)、SEQ ID NO 219、293及225(具有(G4S)3連接子之DP47GS)中給出。抗體-細胞激素融合物具有IgG樣特性。為了降低FcγR結合/效應子功能且防止FcR共活化，向Fc結構域中引入P329G LALA突變。兩種構築體皆根據上文所述之方法進行純化。藉由尺寸排阻層析法(HiLoad 26/60 Superdex 200,GE Healthcare)在最終調配物緩衝液(20 mM組胺酸、140 mM氯化鈉，pH 6)中完成最終純化。圖17至圖20顯示純化之各別層析圖及溶離型態(A、B)以及最終純化構築體之分析型SDS-PAGE及尺寸排阻層析法(C、D)。產量對非靶向DP47GS IgG-IL-2免疫結合物為15.6 mg/L、對28H1 IgG-IL-2免疫結合物為26.7 mg/ml、對CH1A1A 98/99 2F1 IgG-IL-2免疫結合物為4.6 mg/L及對4B9 IgG-IL-2免疫結合物為11 mg/L。
隨後，藉由SPR如上文所述(參看實例2)測定其對FAP(分別缺乏結合)之結合特性以及與IL-2R βγ及IL-2R α鏈之結合。亦研究對免疫效應細胞群體之細胞活性及活體內藥效作用。
實例5
藉由融合兩種不同IL-10細胞激素型式至包含臼修飾之雜二聚合IgG之重鏈的C端建構靶向FAP之基於4G8-以及靶向TNC A2之基於2B10之IgG-IL-10免疫結合物：(G4S)4 20-聚體連接子插入兩個IL-10分子之間的單鏈IL-10或經工程改造之單體IL-10(Josephson等人，J Biol Chem 275,13552-7(2000))。兩分子皆經(G4S)3 15-聚體連接子融合於包含臼修飾且缺失C端Lys殘基之重鏈的C端。藉由應用杵臼技術實現僅產生一個具有IL-10部分之重鏈的雜二聚合作用。IgG-細胞激素融合物具有IgG樣特性。為了降低FcγR結合/效應子功能且防止FcR共活化，向免疫結合物之Fc結構域中引入P329G LALA突變。各別構築體之序列在SEQ ID NO 233、235及239(具有scIL-10之2B10)、SEQ ID NO 233、237及239(具有單體IL-10「IL-10M1」之2B10)、SEQ ID NO 241、243及205(具有scIL-10之4G8)、SEQ ID NO 241、245及205(具有IL-10M1之4G8)中給出。所有此等免疫結合物均根據上文所述之方法純化。隨後，藉由SPR使用ProteOn XPR36生物感測器測定其分別與FAP或TNC A2之結合特性以及其對人類IL-10R1之親和力。簡言之，目標FAP或TNC A2以及人類IL-10R1以垂直方向固定 於感測晶片表面上(FAP藉由標準胺偶聯，TNC A2及人類IL-10R1(皆經C端avi標籤進行生物素標記)藉由親和素捕捉)。隨後，IgG-IL-10免疫結合物以6種不同濃度(包括0濃度)作為分析物在水平方向上注射。雙重參考後，感測器圖譜擬合於1：1相互作用模型上以測定動力學速率常數及親和力。目標抗原以及IL-10受體之分析型SDS PAGE分析及基於SPR之親和力測定的結果顯示於圖21及圖22中。資料顯示免疫結合物分別以52 pM或26 pM之KD值結合於TNC A2或FAP，而IL-10受體之KD值為520 pM及815 pM。
實例6
根據上文所述之方法，產生及表現IgG-細胞激素融合蛋白，其由一個單個基於28H1或基於4B9之Fab區組成，該Fab區針對融合於包含臼修飾之Fc結構域次單元的N端的FAP，而具有杵修飾之IgG重鏈之第二Fab區經(G4S)n連接子(n=1)由細胞激素部分置換。此免疫結合物型式(亦稱為「1+1」型式)之圖示參看圖2C。所用細胞激素部分為上文及PCT專利申請案第PCT/EP2012/051991號中所述之IL-2四倍變異體(參看SEQ ID NO：3)、IL-7及IFN-α。包含細胞激素部分且經連接子肽融合於包含杵修飾之Fc結構域次單元之N端的融合多肽之相應序列在SEQ ID NO 247(包含四倍突變體IL-2)、249(包含IL-7)及251(包含IFN-α)中給出。在此等構築體中，經高親和力單價Fab區實現免疫結合物之靶向。在使用單價結合子可降低抗原內化之情形中可推薦此型式。如上文所述製造、純化及分析免疫結合物。對 於包含IL-2 qm或IL-7之構築體，在單次操作中組合蛋白質A親和力層析法與尺寸排阻層析法。20 mM組胺酸、140 mM NaCl(pH 6.0)用作尺寸排阻層析法及最終調配物緩衝液。圖23至圖26顯示純化之溶離型態及層析圖以及最終純化構築體之分析型SDS-PAGE及尺寸排阻層析圖。產量對4B9「1+1」IgG-IL-2 qm為11 mg/L，對28H1「1+1」IgG-IL-2 qm為43 mg/L，對4B9「1+1」IgG-IL-7為20.5 mg/L且對4B9「1+1」IgG-IFN-α構築體為10.5 mg/L。
測試包含IL-2 qm之「1+1」構築體相較於IgG-IL-2 qm免疫結合物誘導NK細胞增殖之能力。使NK-92細胞饑餓2小時，隨後以每孔10000個細胞接種至96孔黑色平底透明培養板中。免疫結合物滴定至經接種NK-92細胞上。72小時後，根據製造商說明書使用「CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay」套組(Promega)量測ATP含量以測定活細胞數。圖27顯示「1+1」構築體能夠誘導NK-92細胞增殖，活性略微低於相應IgG-IL-2 qm構築體。
測試包含IL-2 qm或IL-7的基於4B9之「1+1」構築體相較於IgG-IL-2免疫結合物誘導T細胞增殖之能力。使用Histopaque-1077(Sigma Diagnostics Inc.,St.Louis,MO,USA)製備周邊血液單核細胞(PBMC)。簡言之，來自白血球層之血液用無鈣及無鎂PBS以5：1倍稀釋，且在Histopaque-1077上分層。梯度在450 x g下在室溫(RT)下離心30分鐘而不破裂。收集含有PBMC之相界且以PBS(在室溫下350 x g繼之以300 x g持續10分鐘)洗滌3次。PBMC以1 μg/ml PHA-M(Sigma Aldrich #L8902)預刺激隔夜，隨後在37℃下以100 nM CFSE(羧基螢光素丁二醯亞胺基酯)標記15分鐘。細胞以20 ml培養基洗滌，隨後在37℃下回收經標記PBMC持續30分鐘。洗滌細胞，計數且將100000個細胞接種於96孔U型底培養板中。免疫結合物滴定至經接種細胞上持續6天培育時間。此後，洗滌細胞，針對適當細胞表面標記物染色，且使用BD FACSCantoII藉由FACS分析。CD4 T細胞定義為CD3+/CD8-，且CD8 T細胞定義為CD3+/CD8+。
圖28顯示包含IL-2 qm或IL-7之「1+1」構築體能夠誘導PHA活化之CD4 T細胞(A)及CD8 T細胞(B)之增殖。對於NK細胞而言，包含IL-2 qm之「1+1」構築體的活性略微低於IgG-IL-2 qm構築體。
測試包含IFN-α的基於4B9之「1+1」構築體相較於Roferon A(Roche)抑制Daudi細胞增殖的能力。簡言之，Daudi細胞以100 nM CFSE標記且接種至96孔U型底培養板(每孔50,000個細胞)上。在指定濃度下添加分子，隨後在37℃下培育3天。藉由分析CFSE稀釋，藉由使用活菌株/死亡菌株自分析中排除死亡細胞來量測增殖。
圖29顯示該構築體能夠抑制Daudi細胞之增殖，至少與Roferon A一樣有效。
實例7
在無腫瘤之免疫潛能129小鼠中針對包含野生型或四倍突變體IL-2之靶向FAP之IgG-IL2免疫結合物及包含野生型 或四倍突變體IL-2之非靶向IgG-IL-2免疫結合物進行單次給藥藥物動力學(PK)研究。
8-9週齡之雌性129小鼠(Harlan,United Kingdom)在實驗開始時根據約定方針(GV-Solas；Felasa；TierschG)保持於12小時明/12小時暗之每日循環的無特定病原體之條件下。由地方政府評審及批准實驗研究方案(P 2008016)。到達後，動物保持1週以適應新環境及用於觀測。在常規基礎上進行連續健康監測。
小鼠以靶向FAP之28H1 IgG-IL2 wt(2.5 mg/kg)或28H1 IgG-IL2 qm(5 mg/kg)或非靶向DP47GS IgG-IL2 wt(5 mg/kg)或DP47GS IgG-IL2 qm(5 mg/kg)靜脈內注射一次。所有小鼠均以200 μl適當溶液靜脈內注射。為了獲得每200 μl適當量之免疫結合物，儲備溶液在必要時以PBS稀釋。
在第1、8、24、48、72、96小時為小鼠放血；且此後每兩天放血持續3週。提取血清且在-20℃下儲存直至ELISA分析。使用定量IL-2-免疫結合物抗體(Roche-Penzberg)之ELISA測定血清中之免疫結合物濃度。使用405 nm之量測波長及492 nm之參考波長量測吸收(VersaMax tunable微板讀取器，Molecular Devices)。
圖30顯示此等IL-2免疫結合物之藥物動力學。靶向FAP(A)及非靶向(B)IgG-IL2 qm構築體的血清半衰期(約30小時)皆比相應IgG-IL-2 wt構築體(約15小時)長。應注意，儘管實驗條件並不完全相當，但本發明之IL-2免疫結合物的血清半衰期看似比例如Gillies等人，Clin Cancer Res 8, 210-216(2002)中所報導之此項技術中已知之「2+2」IgG-IL-2免疫結合物(參看圖1)的血清半衰期長。
實例8
進行生物分佈研究以評定本發明免疫結合物之腫瘤靶向。靶向FAP之基於28H1之IgG-IL-2 qm與靶向FAP之未結合28H1 IgG及4B9 IgG，及非靶向DP47GS IgG比較。此外，使用4B9 IgG-IL-2 qm進行SPECT/CT成像研究，與DP47GS IgG-IL-2 qm、4B9 IgG及DP47GS IgG比較。
DTPA結合及 111 In標記
針對磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS，15 mM)透析28H1 IgG-IL-2 qm、28H1 IgG1、4B9 IgG-IL-2 qm、4B9 IgG1及DP47 IgG1之溶液。在嚴格無金屬條件下，藉由與5倍莫耳過量之ITC-DTPA一起在室溫(RT)下培育1小時，使2 mg構 築體(5 mg/ml)與含異硫氰基苯甲基-二伸乙基三胺五乙酸(ITC-DTPA,Macrocyclis,Dallas,TX)之0.1 M NaHCO3(pH 8.2)結合。藉由針對0.1 M 2-(N-嗎啉基)乙烷磺酸(MES)緩衝液(pH 5.5)透析移除未結合ITC-DTPA。
藉由與含111In(Covidien BV,Petten,The Netherlands)之0.1 M MES緩衝液(pH 5.5，含有0.05%牛血清白蛋白(BSA)及0.05% Tween-80)一起在室溫下在嚴格無金屬條件下培育30分鐘，對純化結合物進行放射性標記。放射性標記後，添加乙二胺四乙酸(EDTA)直至5 mM之最終濃度以螯合未結合之111In。藉由在拋棄式G25M管柱(PD10,Amersham Biosciences,Uppsala,Sweden)上膠凝來純化111In標記之產物。在TEC對照層析條帶(Biodex,Shirley,NY)上使用0.1 M檸檬酸鹽緩衝液(pH 6.0)作為移動相藉由瞬間薄層層析法(ITLC)測定經純化111In標記之構築體的放射化學純度。 111In標記之製劑的比活性為0.6-4.6 MBq/μg。
Lindmo分析法
如先前所述(Lindmo等人，(1984)J Immunol Methods 72,77-89)測定111In標記之抗體製劑的免疫反應性部分。簡言之，以纖維母細胞活化蛋白(FAP)cDNA(HEK-FAP細胞)轉染之人類胚腎(HEK)細胞的連續稀釋液系列與200 Bq 111In標記之構築體一起在37℃下培育1小時。在過量未經標記構築體存在下培育最低細胞濃度之複本來校正非特異性結合。培育後，洗滌細胞，短暫離心且在伽馬計數器(Wallac Wizzard 3" 1480自動γ計數器，Pharmacia LKB)中 測定細胞離心塊中細胞相關之放射活性。製劑之免疫反應性部分在75%-94%範圍內。
動物
雌性BALB/c裸小鼠(8-9週，+/- 20 g)購自Janvier且在內梅亨大學醫學中心之中央動物設施(Central Animal Facility of the Radboud University Nijmegen Medical Centre)中在標準條件下圈養，其中5隻動物在個別通風籠中，自由獲取食物及水。氣候馴化一週後，動物在左肋腹以含10×106個HEK-FAP細胞之基質膠(matrigel)(1：3)皮下接種，且視情況在右肋腹以含5×106個HEK-293細胞之基質膠(1：3)皮下接種。藉由測徑規量測監測異種移植物生長(體積=(4/3．π)．(1/2．長度)．(1/2．寬度)．(1/2．高度)。當異種移植物達到100 mm3之體積時，小鼠以111In標記之構築體靜脈內注射。
生物分佈(28H1 IgG-IL-2 qm、28H1 IgG 1 、4B9 IgG 1 及DP47GS IgG 1 )
111In標記之構築體(5 MBq，150 μg，200 μl)經尾靜脈靜脈內注射。注射24小時後，藉由在CO2/O2氛圍中窒息對動物施以安樂死。收集血液、肌肉、異種移植物、肺臟、脾臟、胰臟、腎臟、胃(空)、十二指腸(空)及肝臟，稱重且在伽馬計數器(Wallac Wizard)中測定放射性。同時計數注射劑量標準(1%)且以每公克組織之注射劑量%(%ID/g)形式計算組織攝取。
SPECT-CT分析(4B9 IgG-IL-2 qm、4B9 IgG 1 、DP47GS IgG-IL-2 qm及DP47GS IgG 1 )
靜脈內注射111In標記之4B9-IgG-IL-2 qm、4B9-IgG1、DP47GS-IgG-IL-2 qm及DP47GS-IgG1(20 MBq、50、150、300 μg、200 μl)。注射後第4、24、72及144小時，動物以異氟醚/O2麻醉，且在裝備有1.0 mm小鼠視準儀之U-SPECT II microSPECT/CT相機(MILabs,Utrecht,The Netherlands)中掃描30至60分鐘。在SPECT後直接進行電腦斷層攝影術(CT)。SPECT(0.4 mm之立體尺寸)及CT掃描皆以MILabs軟體重建且SPECT及CT掃描共登記以測定無線電信號的確切位置。使用Siemens Inveon Research Workplace軟體形成3D影像。
圖31顯示28H1及4B9 IgG1及28H1 IgG-IL-2 qm在第24小時的組織分佈與腫瘤靶向之間無顯著差異(因此細胞激素不會顯著改變免疫結合物之組織分佈及腫瘤靶向特性)，且靶向FAP之構築體之腫瘤與血液比顯著大於非靶向DP47GS對照IgG。
4B9 IgG-IL-2 qm免疫結合物之此等結果在SPECT/CT成像中確認(資料未顯示)。4B9 IgG-IL-2 qm定位於FAP陽性HEK-FAP中，但不定位於FAP陰性HEK-293對照腫瘤中，而非靶向DP47GS免疫結合物不在任何腫瘤中定位。與未結合IgG不同，亦在脾臟中觀測到4B9 IgG-IL-2 qm之弱攝取。
實例9
比較基於28H1之IgG-IL-2 qm及基於28H1之IgG-(IL-2 qm)2(亦即如圖1描繪之「2+2」型式免疫結合物；序列顯示於SEQ ID NO 253及205中)與NK 92細胞之結合。每孔200000個NK92細胞接種於96孔培養板中。免疫結合物滴定至NK92細胞上且在4℃下培育30分鐘以允許結合。細胞以含有0.1% BSA之PBS洗滌兩次以移除未結合之構築體。為了偵測免疫結合物，在4℃下添加FITC標記之抗人類Fc特異性抗體持續30分鐘。細胞以含有0.1% BSA之PBS再洗滌兩次且藉由FACS使用BD FACSCantoII進行分析。
如圖32中所說明，「2+2」免疫結合物相較於相應「2+1」構築體顯示與NK 92細胞之較佳結合。
實例10 藉由IL-2免疫結合物誘導人類PBMC增殖
使用Histopaque-1077(Sigma Diagnostics Inc.,St.Louis,MO,USA)製備周邊血液單核細胞(PBMC)。簡言之，將來自健康志願者之靜脈血抽至肝素化注射器中。血液以無鈣及無鎂之PBS 2：1倍稀釋，且在Histopaque-1077上分層。梯度在450 x g下在室溫(RT)下離心30分鐘而不破裂。收集含有PBMC之相界且以PBS(在室溫下350 x g繼之以300 x g持續10分鐘)洗滌3次。
隨後，PBMC在37℃下以40 nM CFSE(羧基螢光素丁二醯亞胺基酯)標記15分鐘。細胞以20 ml培養基洗滌，隨後在37℃下回收經標記PBMC持續30分鐘。洗滌細胞，計數且將100000個細胞接種於96孔U型底培養板中。預稀釋之阿地介白素(市售野生型IL-2)或IL2-免疫結合物滴定至接 種細胞上，將其培育指定時間點。4-6天後，洗滌細胞，針對適當細胞表面標記物染色，且使用BD FACSCantoII藉由FACS分析。NK細胞定義為CD3-/CD56+，CD4 T細胞定義為CD3+/CD8-，且CD8 T細胞定義為CD3+/CD8+。
圖33顯示在與不同靶向FAP之28H1 IL-2免疫結合物一起培育4天(A)、5天(B)或6天(C)後，NK細胞增殖。所有測試構築體均以濃度依賴性方式誘導NK細胞增殖。在較低濃度下，阿地介白素比免疫結合物更有效，然而此差異在較高濃度下不復不存。在較早時間點(第4天)，IgG-IL2構築體看似比Fab-IL2-Fab構築體略微更有效。在隨後時間點(第6天)，所有構築體均具有相當功效，其中Fab-IL2 qm-Fab構築體在低濃度下效力最低。
圖34顯示在與不同靶向FAP之28H1 IL-2免疫結合物一起培育4天(A)、5天(B)或6天(C)後，CD4 T細胞增殖。所有測試構築體均以濃度依賴性方式誘導CD4 T細胞增殖。阿地介白素活性高於免疫結合物，且包含野生型IL-2之免疫結合物比包含四倍突變IL-2者略微更有效。對於NK細胞而言，Fab-IL2 qm-Fab構築體活性最低。增殖CD4 T細胞最可能至少為野生型IL-2構築體的部分調節T細胞。
圖35顯示在與不同靶向FAP之28H1 IL-2免疫結合物一起培育4天(A)、5天(B)或6天(C)後，CD8 T細胞增殖。所有測試構築體均以濃度依賴性方式誘導CD8 T細胞增殖。阿地介白素活性高於免疫結合物，且包含野生型IL-2之免疫結合物比包含四倍突變IL-2者略微更有效。對於NK及CD4 T細胞而言，Fab-IL2 qm-Fab構築體活性最低。
實例11 增殖及活化誘導之IL-2活化之PBMC細胞死亡
來自健康供體的新鮮分離之PBMC以含1 μg/ml PHA-M之RPMI1640(具有10% FCS及1%麩醯胺酸)預活化隔夜。預活化後，採集PBMC，以含40 nM CFSE之PBS標記，且以每孔100,000個細胞接種於96孔培養板中。預活化之PBMC以不同濃度之IL-2免疫結合物(4B9 IgG-IL-2 wt、4B9 IgG-IL-2 qm、4B9 Fab-IL-2 wt-Fab及4B9 Fab-IL-2 qm-Fab)刺激。IL-2處理6天後，PBMC以0.5 μg/ml活化抗Fas抗體處理隔夜。CFSE稀釋6天後，分析CD4(CD3+CD8-)及CD8(CD3+CD8+)T細胞之增殖。藉由在CD3+ Annexin V陰性活細胞上閘控測定抗Fas處理後活T細胞之百分比。
如圖36所示，所有構築體均誘導預活化T細胞增殖。在低濃度下，包含野生型IL-2 wt之構築體比包含IL-2 qm之構築體更具活性。IgG-IL-2 wt、Fab-IL-2 wt-Fab及阿地介白素具有類似活性。Fab-IL-2 qm-Fab活性略低於IgG-IL-2 qm。包含野生型IL-2之構築體對CD4 T細胞之活性高於對CD8 T細胞之活性，此最可能歸因於調節T細胞之活化。包含四倍突變IL-2之構築體對CD8及CD4 T細胞之活性類似。
如圖37所示，以高濃度野生型IL-2刺激之T細胞對抗Fas誘導之細胞凋亡比對四倍突變IL-2處理之T細胞更敏感。
儘管本發明已出於清楚理解之目的藉助於說明及實例在 一定程度上詳細描述，但說明及實例不應被視為對本發明範疇之限制。本文引用之所有專利及科學文獻的揭示內容以引用的方式全部明確併入本文中。
圖1. 此項技術中已知之典型免疫球蛋白-細胞激素免疫結合物之圖示，其中細胞激素(打點)融合於兩個免疫球蛋白重鏈之每一者的C端。
圖2. 本發明之新穎免疫結合物之圖示，其包含不超過一個效應子部分(打點)。效應子部分視情況經連接子肽(灰盒)融合於Fc結構域之羧基端(型式A及B)或胺基端胺基酸(型式C)。免疫結合物包含一(型式B及C)或多個(通常兩個，型式A)抗原結合部分，其可為包含抗體重鏈及輕鏈可變域之Fab片段(陰影線)。Fc結構域可包含促進兩個不相同多肽鏈雜二聚合之修飾(黑點)及/或改變Fc受體結合及/或效應子功能的修飾(黑星)。
圖3. 靶向FAP之基於4G8之IgG-IL-2四倍突變體(qm)免疫結合物之純化。A)蛋白質A親和力層析步驟之溶離型態。B)尺寸排阻層析步驟之溶離型態。C)最終產物之分析型SDS-PAGE(NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel,Invitrogen,MOPS電泳緩衝液)。D)最終產物在Superdex 200管柱(97%單體含量)上的分析型尺寸排阻層析法。
圖4. 靶向FAP之基於28H1之IgG-IL-2 qm免疫結合物的純化。A)蛋白質A親和力層析步驟之溶離型態。B)尺寸排阻層析步驟之溶離型態。C)最終產物之分析型SDS-PAGE (還原：NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel,Invitrogen,MOPS電泳緩衝液；非還原：NuPAGE Tris-乙酸鹽，Invitrogen,Tris-乙酸鹽電泳緩衝液)。D)最終產物在Superdex 200管柱(100%單體含量)上的分析型尺寸排阻層析法。
圖5. 靶向FAP之基於28H1之IgG-IL-2 qm免疫結合物自CHO細胞的純化。A)蛋白質A親和力層析步驟之溶離型態。B)尺寸排阻層析步驟之溶離型態。C)最終產物之分析型SDS-PAGE(NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel,Invitrogen,MOPS電泳緩衝液)。D)最終產物在Superdex 200管柱(100%單體含量)上的分析型尺寸排阻層析法。
圖6. 靶向FAP之基於4B9之IgG-IL-2 qm免疫結合物的純化。A)蛋白質A親和力層析步驟之溶離型態。B)尺寸排阻層析步驟之溶離型態。C)最終產物之分析型SDS-PAGE(NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel,Invitrogen,MOPS電泳緩衝液)。D)最終產物在Superdex 200管柱(100%單體含量)上的分析型尺寸排阻層析法。
圖7. 靶向CEA之基於CH1A1A 98/99 2F1之IgG-IL-2 qm免疫結合物的純化。A)蛋白質A親和力層析步驟之溶離型態。B)尺寸排阻層析步驟之溶離型態。C)最終產物之分析型毛細管電泳SDS(Caliper)。D)最終產物在TSKgel G3000 SW XL管柱(98.8%單體含量)上之分析型尺寸排阻層析。
圖8. 靶向TNC A2之基於2B10之IgG-IL-2 qm免疫結合物的純化。A)蛋白質A親和力層析步驟之溶離型態。B)尺寸 排阻層析步驟之溶離型態。C)最終產物之分析型毛細管電泳SDS(Caliper)。D)最終產物在TSKgel G3000 SW XL管柱(100%單體含量)上之分析型尺寸排阻層析。
圖9. 非靶向之基於DP47GS之IgG-IL-2 qm免疫結合物的純化。A)蛋白質A親和力層析步驟之溶離型態。B)尺寸排阻層析步驟之溶離型態。C)最終產物之分析型SDS-PAGE(NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel,Invitrogen,MOPS電泳緩衝液)。D)最終產物在Superdex 200管柱(100%單體含量)上的分析型尺寸排阻層析法。
圖10. 如FACS所量測，靶向FAP之基於4G8之IgG-IL-2 qm免疫結合物相較於相應Fab-IL-2 qm-Fab構築體與穩定轉染HEK 293細胞上表現之人類FAP的結合。
圖11. 含靶向FAP之基於4G8之IgG-IL-2 qm免疫結合物的溶液相較於基於28H1之Fab-IL-2 qm-Fab構築體誘導之NK92細胞上的干擾素(IFN)-γ釋放。
圖12. 相較於基於28H1之Fab-IL-2-Fab及Fab-IL-2 qm-Fab構築體以及阿地介白素，以含靶向FAP之基於4G8之IgG-IL-2 qm免疫結合物的溶液刺激20分鐘後，藉由FACS的在不同細胞類型中磷酸化STAT5之偵測。A)NK細胞(CD3-CD56+)；B)CD8+ T細胞(CD3+CD8+)；C)CD4+ T細胞(CD3+CD4+CD25-CD127+)；D)調節T細胞(CD4+CD25+ FOXP3+)。
圖13. 如FACS所量測，靶向TNC A2之2B10 IgG-IL-2 qm及相應未結合IgG與表現TNC A2之U87MG細胞的結 合。
圖14. 靶向TNC A2之2B10 IgG-IL-2 qm、靶向CEA之CH1A1A 98/99 2F1 IgG-IL-2 qm及CH1A1A 98/99 2F1 IgG-IL-2 wt免疫結合物對NK92細胞增殖之誘導。
圖15. 靶向FAP之4B9 IgG-IL-2 qm及4B9 IgG-IL-2 wt免疫結合物對NK92細胞增殖之誘導。
圖16. 相較於未結合糖基化工程改造之CH1A1A IgG，經由糖基化工程改造(ge)及野生型(wt)CH1A1A IgG-IL-2 qm免疫結合物介導之ADCC由PBMC對共表現CEA之A549腫瘤細胞的殺傷(如LDH釋放所量測)。
圖17. 非靶向DP47GS IgG-IL-2 wt免疫結合物的純化。A)蛋白質A親和力層析步驟之溶離型態。B)尺寸排阻層析步驟之溶離型態。C)最終產物之分析型SDS-PAGE(NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel,Invitrogen,MOPS電泳緩衝液)。D)最終產物在Superdex 200管柱(99.6%單體含量)上的分析型尺寸排阻層析法。
圖18. 基於28H1之靶向FAP之28H1 IgG-IL-2 wt免疫結合物之純化。A)蛋白質A親和力層析步驟之溶離型態。B)尺寸排阻層析步驟之溶離型態。C)最終產物之分析型SDS-PAGE(NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel,Invitrogen,MOPS電泳緩衝液)。D)最終產物在Superdex 200管柱(99.6%單體含量)上的分析型尺寸排阻層析法。
圖19. 靶向CEA之基於CH1A1A 98/99 2F1之IgG-IL-2 wt免疫結合物的純化。A)蛋白質A親和力層析步驟之溶離型 態。B)尺寸排阻層析步驟之溶離型態。C)最終產物之分析型毛細管電泳SDS(Caliper)。D)最終產物在TSKgel G3000 SW XL管柱(100%單體含量)上之分析型尺寸排阻層析。
圖20. 靶向FAP之基於4B9之IgG-IL-2 wt免疫結合物的純化。A)組合蛋白質A親和力及尺寸排阻層析之溶離型態。B)A中尺寸排阻層析步驟之溶離型態的放大圖像。C)最終產物之分析型SDS-PAGE(NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel,Invitrogen,MOPS電泳緩衝液)。D)最終產物在TSKgel G3000 SW XL管柱(98.5%單體含量)上之分析型尺寸排阻層析。
圖21. A)還原(1)及非還原(2)2B10 IgG-IL-10M1之分析型SDS-PAGE(NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel(Invitrogen),NuPAGE LDS樣品緩衝液(4×)，在70℃下加熱10分鐘，MOPS緩衝液，160 V，60 min，MW marker Mark 12，未染色標準物(Invitrogen,M))。B)與1：1相互作用模型全局擬合之2B10 IgG-IL-10M1與人類TNC A2的基於SPR之親和力測定(ProteOn XPR36)。
(晶片：NLC；配位體：TNCA2(250 RU)；分析物：TNCA2 2B10 IgG-IL-10M1 164 kDa；分析物濃度範圍：50、10、2、0.4、0.08、0 nM；締合時間：180 s；解離時間：600 s；流動速率：50 μl/min；kon 1.80×106 1/Ms；koff：9.35×10-5 1/s；KD：52 pM)。C)與1：1相互作用模型全局擬合之2B10 IgG-IL-10M1與人類IL-10R1的基於SPR之親和力測定(ProteOn XPR36)(晶片：NLC；配位體： IL-10R1(1600RU)；分析物：TNCA2 2B10 IgG-IL-10M1 164 kDa；分析物濃度範圍：50、10、2、0.4、0.08、0 nM；締合時間：180 s；解離時間：600 s；流動速率：50 μl/min；kon 5.56×105 1/Ms；koff：2.89×10-4 1/s；KD：520 pM)。
圖22. A)還原(1)及非還原(2)4G8 IgG-IL-10M1之分析型SDS-PAGE(NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel(Invitrogen),NuPAGE LDS樣品緩衝液(4×)，在70℃下加熱10分鐘，MOPS緩衝液，160 V，60 min，MW marker Mark 12，未染色標準物(Invitrogen,M))。B)與1：1相互作用模型全局擬合之4G8 IgG-IL-10M1與人類FAP的基於SPR之親和力測定(ProteOn XPR36)(晶片：GLM；配位體：huFAP(500RU)；分析物：FAP 4G8 IgG-IL-10M1 164 kDa；分析物濃度範圍：10、2、0.4、0.08、0 nM；締合時間：180 s；解離時間：600 s；流動速率：50 μl/min；kon 6.68×105 1/Ms；koff：1.75×10-5 1/s；KD：26 pM)。C)與1：1相互作用模型全局擬合之4G8 IgG-IL-10M1與人類IL-10R1的基於SPR之親和力測定(ProteOn XPR36)(晶片：NLC；配位體：IL 10R1(1600RU)；分析物：FAP 4G8 IgG-IL-10M1 164 kDa；分析物濃度範圍：50、10、2、0.4、0.08、0 nM；締合時間：180 s；解離時間：600 s；流動速率：50 μl/min；kon：3.64×105 1/Ms；koff：2.96×10-4 1/s；KD：815 pM)。
圖23. 靶向FAP之基於4B9之「1+1」IgG-IL-2 qm免疫 結合物的純化。A)組合蛋白質A親和力及尺寸排阻層析之溶離型態。B)最終產物之分析型SDS-PAGE(NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel,Invitrogen,MOPS電泳緩衝液)。C)最終產物在TSKgel G3000 SW XL管柱(99.2%單體含量)上之分析型尺寸排阻層析。
圖24. 靶向FAP之基於28H1之「1+1」IgG-IL-2 qm免疫結合物的純化。A)組合蛋白質A親和力及尺寸排阻層析之溶離型態。B)最終產物之分析型SDS-PAGE(NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel,Invitrogen,MOPS電泳緩衝液)。C)最終產物在TSKgel G3000 SW XL管柱(100%單體含量)上之分析型尺寸排阻層析。
圖25. 靶向FAP之基於4B9之「1+1」IgG-IL-7免疫結合物的純化。A)組合蛋白質A親和力及尺寸排阻層析之溶離型態。B)最終產物之分析型毛細管電泳SDS(Caliper)。C)最終產物在TSKgel G3000 SW XL管柱(98.6%單體含量)上之分析型尺寸排阻層析。
圖26. 靶向FAP之基於4B9之「1+1」IgG-IFN-α免疫結合物的純化。A)蛋白質A親和力層析步驟之溶離型態。B)尺寸排阻層析步驟之溶離型態。C)最終產物之分析型毛細管電泳SDS(Caliper)。D)最終產物在TSKgel G3000 SW XL管柱(92.8%單體含量)上之分析型尺寸排阻層析。
圖27. 靶向FAP之4B9「1+1」IgG-IL-2 qm及28H1「1+1」IgG-IL-2 wt免疫結合物相較於相應IgG-IL-2構築體對NK92細胞增殖之誘導。
圖28. 4B9「1+1」IgG-IL-7及4B9「1+1」IgG-IL-2 qm免疫結合物相較於IgG-IL-2 qm及IgG-IL-2 wt構築體對PHA活化(A)CD4及(B)CD8 T細胞之增殖的誘導。
圖29. 4B9「1+1」IgG-IFN-α相較於Roferon A對Daudi細胞增殖之誘導。
圖30. 單次靜脈內投與包含野生型(wt)或四倍突變體(qm)IL-2之靶向FAP之(A)及非靶向(B)IgG-IL-2構築體後的IL-2免疫結合物之血清濃度。
圖31. 靶向FAP之28H1 IgG-IL qm相較於未結合靶向FAP之28H1 IgG及4B9 IgG以及非靶向DP47GS IgG在靜脈內注射24小時後的組織分佈。
圖32. 如FACS所測定之28H1 IgG-IL-2 qm及28H1 IgG-(IL-2 qm)2免疫結合物與NK92細胞之結合。
圖33. 在與不同靶向FAP之28H1 IL-2免疫結合物或阿地介白素一起培育4天(A)、5天(B)或6天(C)後，NK細胞之增殖。
圖34. 在與不同靶向FAP之28H1 IL-2免疫結合物或阿地介白素一起培育4天(A)、5天(B)或6天(C)後，CD4 T細胞之增殖。
圖35. 在與不同靶向FAP之28H1 IL-2免疫結合物或阿地介白素一起培育4天(A)、5天(B)或6天(C)後，CD8 T細胞之增殖。
圖36. 與不同IL-2免疫結合物一起培育6天後，預活化CD8(A)及CD4(B)T細胞之增殖。
圖37. 與不同IL-2免疫結合物一起培育6天後及以抗Fas抗體處理隔夜後，CD3+ T細胞之活化誘導之細胞死亡。
<110> 瑞士商羅齊克雷雅公司
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<223> 人類IL-10單體(IL-10M1)
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<223> 突變人類IL-15(E53A,N79A)
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<223> 人類IL-2Rα次單元+Avi-標籤+His-標籤
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47GS Fab HC-Fc杵(LALA P329G)-IL-2 wt
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> CH1A1A Fab HC-Fc杵(wt)-IL-2 qm
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2F1 Fab LC
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2B10 Fab HC-Fc杵(LALA P329G)
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2B10 Fab HC-Fc臼(LALA P329G)-scIL-10
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2B10 Fab HC-Fc臼(LALA P329G)-IL-10M1
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
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<212> PRT
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<212> DNA
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<223> 4G8 Fab HC-Fc臼(LALA P329G)-IL-10M1
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-2 qm-Fc杵(LALA P329G)(IL-2 N-端)
<400> 247
<210> 248
<211> 1098
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-2 qm-Fc杵(LALA P329G)(IL-2 N-端)
<400> 248
<210> 249
<211> 384
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-7-Fc杵(LALA P329G)(IL-7 N-端)
<400> 249
<210> 250
<211> 1152
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-7-Fc杵(LALA P329G)(IL-7 N-端)
<400> 250
<210> 251
<211> 398
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IFN-a-Fc杵(LALA P329G)(IFN-a N-端)
<400> 251
<210> 252
<211> 1194
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IFN-a-Fc杵(LALA P329G)(IFN-a N-端)
<400> 252
<210> 253
<211> 593
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 28H1 Fab HC-Fc(LALA P329G)-IL-2 qm
<400> 253
<210> 254
<211> 1779
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 28H1 Fab HC-Fc(LALA P329G)-IL-2 qm
<400> 254
<210> 255
<211> 473
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠類IL-2R-β-Fc(臼)融合蛋白
<400> 255
<210> 256
<211> 1422
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠類IL-2R-β-Fc(臼)融合蛋白
<400> 256
<210> 257
<211> 500
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠類IL-2R-γ-Fc(臼)融合蛋白
<400> 257
<210> 258
<211> 1503
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠類IL-2R-γ-Fc(臼)融合蛋白
<400> 258
<210> 259
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠類IL-2Rα次單元+Avi-標籤+His-標籤
<400> 259
<210> 260
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠類IL-2Rα次單元+Avi-標籤+His-標籤
<400> 260
<210> 261
<211> 480
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹獮猴IL-2R-β-Fc(臼)融合蛋白+Avi-標籤
<400> 261
<210> 262
<211> 1443
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹獮猴IL-2R-β-Fc(臼)融合蛋白+Avi-標籤
<400> 262
<210> 263
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹獮猴IL-2R-γ-Fc(臼)融合蛋白
<400> 263
<210> 264
<211> 1470
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹獮猴IL-2R-γ-Fc(臼)融合蛋白
<400> 264
<210> 265
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹獮猴IL-2R次單元+Avi-標籤+His-標籤
<400> 265
<210> 266
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹獮猴IL-2R次單元+Avi-標籤+His-標籤
<400> 266
<210> 267
<211> 474
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IL-10R1-Fc融合+Avi-標籤
<400> 267
<210> 268
<211> 1422
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IL-10R1-Fc融合+Avi-標籤
<400> 268
<210> 269
<211> 593
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 28H1 Fab HC-Fc杵(LALA P329G)-IL-2 qm(2)
<400> 269
<210> 270
<211> 1779
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 28H1 Fab HC-Fc杵(LALA P329G)-IL-2 qm(2)
<400> 270
<210> 271
<211> 594
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4B9 Fab HC-Fc杵(LALA P329G)-IL-2 qm(2)
<400> 271
<210> 272
<211> 1782
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 4B9 Fab HC-Fc杵(LALA P329G)-IL-2 qm(2)
<400> 272
<210> 273
<211> 594
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4B9 Fab HC-Fc杵(LALA P329G)-IL-2 wt
<400> 273
<210> 274
<211> 1782
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 4B9 Fab HC-Fc杵(LALA P329G)-IL-2 wt
<400> 274
<210> 275
<211> 599
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A 98/99 2F1 Fab HC-Fc杵(LALA P329G)-IL-2 qm
<400> 275
<210> 276
<211> 1797
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A 98/99 2F1 Fab HC-Fc杵(LALA P329G)-IL-2 qm
<400> 276
<210> 277
<211> 598
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A 98/99 2F1 Fab HC-Fc杵(LALA P329G)-IL-2 qm(2)
<400> 277
<210> 278
<211> 1794
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A 98/99 2F1 Fab HC-Fc杵(LALA P329G)-IL-2 qm(2)
<400> 278
<210> 279
<211> 598
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A 98/99 2F1 Fab HC-Fc杵(LALA P329G)-IL-2 wt
<400> 279
<210> 280
<211> 1794
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A 98/99 2F1 Fab HC-Fc杵(LALA P329G)-IL-2 wt
<400> 280
<210> 281
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A 98/99 2F1 Fab HC-Fc臼(LALA P329G)
<400> 281
<210> 282
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A 98/99 2F1 Fab HC-Fc臼(LALA P329G)
<400> 282
<210> 283
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A 98/99 2F1 Fab LC
<400> 283
<210> 284
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A 98/99 2F1 Fab LC
<400> 284
<210> 285
<211> 598
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2B10 Fab HC-Fc杵(LALA P329G)-IL-2 qm
<400> 285
<210> 286
<211> 1794
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2B10 Fab HC-Fc杵(LALA P329G)-IL-2 qm
<400> 286
<210> 287
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2B10 Fab HC-Fc臼(LALA P329G)
<400> 287
<210> 288
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2B10 Fab HC-Fc臼(LALA P329G)
<400> 288
<210> 289
<211> 592
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47GS Fab HC-Fc杵(LALA P329G)-IL-2 qm
<400> 289
<210> 290
<211> 1776
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47GS Fab HC-Fc杵(LALA P329G)-IL-2 qm
<400> 290
<210> 291
<211> 592
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47GS Fab HC-Fc杵(LALA P329G)-IL-2 wt(2)
<400> 291
<210> 292
<211> 1776
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47GS Fab HC-Fc杵(LALA P329G)-IL-2 wt(2)
<400> 292
<210> 293
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A 98/99 2F1；VL
<400> 293
<210> 294
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A 98/99 2F1；VL
<400> 294
<210> 295
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A 98/99 2F1；VH
<400> 295
<210> 296
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A 98/99 2F1；VH
<400> 296

Claims (39)

  1. 一種免疫結合物，其包含(i)免疫球蛋白分子，其包含第一及第二抗原結合Fab分子及由兩個次單元組成之Fc結構域及(ii)效應子部分，其中存在不超過一個效應子部分；且其中該第一及該第二Fab分子係關於癌胚抗原(CEA)且包含重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列，該重鏈可變區序列係至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%與SEQ ID NO：191之序列相同，且該輕鏈可變區序列係至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%與SEQ ID NO：189之序列相同；且該效應子部分係突變之人類介白素-2(IL-2)多肽，其包含F42A、Y45A及L72G(相對於SEQ ID NO：2中人類IL-2序列編號)之胺基酸取代。
  2. 如請求項1之免疫結合物，其中該Fc結構域包含促進兩個不相同多肽鏈之雜二聚合的修飾。
  3. 如請求項2之免疫結合物，其中該修飾為杵臼修飾(knob-into-hole modification)，其包含該Fc結構域之一個次單元中的杵修飾及該Fc結構域之兩個次單元之另一者中的臼修飾。
  4. 如請求項3之免疫結合物，其中該杵修飾包含胺基酸取代T366W，且該臼修飾包含胺基酸取代T366S、L368A及Y407V(EU編碼)。
  5. 如請求項4之免疫結合物，其中包含杵修飾之Fc結構域 的次單元另外包含胺基酸取代S354C，且包含臼修飾之Fc結構域的次單元另外包含胺基酸取代Y349C。
  6. 如請求項3之免疫結合物，其中該效應子部分融合於包含該杵修飾之該Fc結構域之該次單元的羧基端胺基酸。
  7. 如請求項1之免疫結合物，其中該Fc結構域經工程改造，以具有改變之與Fc受體結合性及/或改變之效應子功能。
  8. 如請求項7之免疫結合物，其中該Fc受體為Fcγ受體。
  9. 如請求項7之免疫結合物，其中該效應子功能為抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
  10. 如請求項7之免疫結合物，其中該經改變之結合性及/或效應子功能為降低之結合性及/或效應子功能。
  11. 如請求項1之免疫結合物，其中該Fc結構域包含一或多個降低Fc結構域與Fc受體結合性的胺基酸突變。
  12. 如請求項11之免疫結合物，其中該Fc受體係Fcγ受體。
  13. 如請求項11之免疫結合物，其中該胺基酸突變為位置P329處(EU編號)之胺基酸取代。
  14. 如請求項11之免疫結合物，其中該Fc結構域在其每一個次單元中包含胺基酸取代L234A、L235A及P329G(EU編號)。
  15. 如請求項7之免疫結合物，其中該經改變之結合性及/或效應子功能為提高之結合性及/或效應子功能。
  16. 如請求項1之免疫結合物，其中該Fc結構域為IgG Fc結構域。
  17. 如請求項1至16中任一項之免疫結合物，其中該Fc結構域為人類IgG1 Fc結構域。
  18. 如請求項1之免疫結合物，其中該免疫球蛋白分子為IgG類之免疫球蛋白。
  19. 如請求項1至16及18中任一項之免疫結合物，其中該免疫球蛋白分子為IgG1類之免疫球蛋白。
  20. 如請求項1之免疫結合物，其中該效應子部分融合於該等免疫球蛋白重鏈中之一者的羧基端胺基酸。
  21. 如請求項20之免疫結合物，其中該效應子部分經連接子服融合於該等免疫球蛋白重鏈中之一者的羧基端胺基酸。
  22. 如請求項1之免疫結合物，其中該突變之人類介白素-2(IL-2)多肽進一步包含胺基酸取代T3A。
  23. 如請求項1之免疫結合物，其中該突變之人類介白素-2(IL-2)多肽進一步包含胺基酸取代C125A。
  24. 如請求項1之免疫結合物，其中該突變之人類介白素-2(IL-2)多肽進一步包含SEQ ID NO：3之多肽序列。
  25. 如請求項1之免疫結合物，其包含SEQ ID NO：277、SEQ ID NO：281及SEQ ID NO：283之多肽序列；或其維持功能性之變異體。
  26. 一種經分離聚核苷酸，其編碼如請求項1至25中任一項之免疫結合物。
  27. 一種表現載體，其包含如請求項26之經分離聚核苷酸。
  28. 一種宿主細胞，其包含如請求項26之經分離聚核苷酸或 如請求項27之表現載體。
  29. 如請求項28之宿主細胞，其中該宿主細胞經過操作，以表現增加含量之一或多種具有β(1,4)-N-乙醯基葡糖胺基轉移酶III(GnTIII)活性的多肽。
  30. 一種製造免疫結合物的方法，該免疫結合物包含(i)免疫球蛋白分子，其包含第一及第二抗原結合Fab分子及由兩個次單元組成之Fc結構域及(ii)效應子部分，其中存在不超過一個效應子部分，其包含在適於表現該免疫結合物的條件下培養如請求項28或29之宿主細胞。
  31. 如請求項30之製造免疫結合物的方法，進一步包含回收該免疫結合物。
  32. 一種免疫結合物，其包含(i)免疫球蛋白分子，其包含第一及第二抗原結合Fab分子及由兩個次單元組成之Fc結構域及(ii)效應子部分，其中存在不超過一個效應子部分，其中該免疫結合物藉由如請求項30或31之方法製造。
  33. 如請求項1至16、18、20至25及32中任一項之免疫結合物，其用於為有此需要之個體治療疾病。
  34. 如請求項33之免疫結合物，其中該疾病為癌症。
  35. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至25及32中任一項之免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑。
  36. 如請求項35之醫藥組合物，其用於為有此需要之個體治療疾病。
  37. 如請求項35之醫藥組合物，其中該疾病為癌症。
  38. 一種如請求項1至25及32中任一項之免疫結合物的用途，其用於製造為個體治療疾病的藥物。
  39. 如請求項38之用途，其中該疾病為癌症。
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