CN116178526B - 一种识别EB病毒gp42蛋白的单克隆抗体2C1及其应用 - Google Patents

一种识别EB病毒gp42蛋白的单克隆抗体2C1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于抗体技术领域，公开了一种识别EB病毒gp42蛋白的单克隆抗体2C1及其应用。该单克隆抗体或其抗原结合片段对gp42蛋白有较高的亲和力(KD(M)＝1.248E‑09)，可以显著抑制EBV对于上皮细胞以及B细胞的感染，在体内有效保护EBV感染的人源化小鼠，可用于检测gp42蛋白在样品中的存在或水平、检测EB病毒、诊断EB病毒感染所引起的疾病、预防EB病毒感染和/或治疗和/或预防EB病毒感染所引起的疾病。

Description

一种识别EB病毒gp42蛋白的单克隆抗体2C1及其应用
技术领域
本发明属于抗体技术领域，具体涉及一种识别EB病毒gp42蛋白的单克隆抗体2C1及其应用。
背景技术
EB病毒(EBV)又称人类疱疹病毒4型，最早于1964年由Epstein和Barr从Burkitt淋巴瘤细胞通过体外悬浮培养并建株，它是一种γ亚科嗜淋巴细胞病毒属的DNA致瘤病毒。EB病毒颗粒由核心蛋白、衣壳、壳皮、囊膜，共4种结构成分组成，核心为缠绕有DNA的核心蛋白。
EBV以潜伏感染方式最常见，有90％以上的EBV感染者呈终身潜伏感染，病毒在一定条件下被激活启动而致癌。目前研究发现，人EBV与鼻咽癌、传染性单核细胞增多症、霍奇金及非霍奇金淋巴瘤、Bur kitt淋巴瘤及包括胃癌在内的上皮细胞癌等恶性肿瘤的发生有密切的关系。EB病毒最初复制部位是口咽部，其会在B淋巴细胞和口腔上皮细胞内生长繁殖，然后感染B淋巴细胞，这些细胞大量进入血液循环而造成全身性感染。当机体免疫功能低下时，潜伏的EBV活化形成复发感染。
目前针对EBV尚无有效的疫苗，由EBV感染引起的疾病也缺乏特异的治疗手段。传染性单核细胞增多症的治疗大多应用抗病毒药物如阿昔洛韦等，这些药物虽然可一定程度上缓解症状，但并不能消除B淋巴细胞内及咽喉部上皮的EB病毒。EBV相关肿瘤的治疗主要为化疗和放疗，但对于转移或复发患者来说，疗效较差。
单克隆抗体可大量生产，其与抗原结合的高亲和性和高特异性，大大减少了临床应用时的不良反应。还可以对这些抗体分子进行改造以增加其抗病毒效力。抗体以其特异性和使用的灵活性成为感染性疾病治疗中非常有前景的手段，但至今仍未有针对EBV囊膜糖蛋白的单克隆抗体上市。因此开发抗EBV的单克隆抗体，将为EBV感染相关疾病提供更有效的预防和治疗手段。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明第二方面的目的，在于提供一种重组蛋白。
本发明第三方面的目的，在于提供与本发明第一方面的单克隆抗体或其抗原结合片段或第二方面的重组蛋白相关的生物材料。
本发明第四方面的目的，在于提供一种偶联物。
本发明第五方面的目的，在于提供本发明第一方面的单克隆抗体或其抗原结合片段、第二方面的重组蛋白、第三方面的生物材料、和/或第四方面的偶联物在制备产品中的应用。
本发明第六方面的目的，在于提供一种试剂盒。
本发明第七方面的目的，在于提供一种药物。
本发明第八方面的目的，在于提供本发明第一方面的单克隆抗体或其抗原结合片段的制备方法。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种抗EBV gp42的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链：
所述重链包含：
重链可变区，其包含所述重链可变区的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重链可变区具有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列；
所述轻链包含：
轻链可变区，其包含所述轻链可变区的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列。
优选地，所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：30所示，所述CDR是以Kabat定义方案定义的。
优选地，所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L3的氨基酸序列依次如SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30所示，所述CDR-L2的氨基酸序列为：ATS，所述CDR是以IMGT定义方案定义的。
优选地，所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：30所示，所述CDR是以Chothia定义方案定义的。
优选地，所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35所示，所述CDR是以Contact定义方案定义的。
优选地，所述重链可变区的氨基酸序列包含：
a1)SEQ ID NO.14；或
a2)将SEQ ID NO.14经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO.14所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a3)与SEQ ID NO.14具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％或80％的同源性且与SEQ IDNO.14所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述轻链可变区的氨基酸序列包含：
b1)SEQ ID NO.28；或
b2)将SEQ ID NO.28经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO.28所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
b3)与SEQ ID NO.28具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％或80％的同源性且与SEQ IDNO.28所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。
优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、双特异性抗体、多特异性抗体中的至少一种。
优选地，所述重链还包含重链恒定区；和/或
所述轻链还包含轻链恒定区。
优选地，所述重链恒定区的氨基酸序列包含：
c1)SEQ ID NO：13中第148～477位氨基酸组成的氨基酸序列；或
c2)将c1)所述的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与c1)所述的氨基酸序列的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
c3)与c1)所述的氨基酸序列具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与c1)所述的氨基酸序列的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。
优选地，所述轻链恒定区的氨基酸序列包含：
d1)SEQ ID NO：27中第127～232位氨基酸组成的氨基酸序列；或
d2)将d1)所述的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与d1)所述的氨基酸序列的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
d3)与d1)所述的氨基酸序列具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与d1)所述的氨基酸序列的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。
优选地，所述重链还包含重链信号肽；和/或
所述轻链还包含轻链信号肽。
优选地，所述重链信号肽的氨基酸序列包含：
e1)SEQ ID NO：13中第1～19位氨基酸组成的氨基酸序列；或
e2)将e1)所述的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与e1)所述的氨基酸序列的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
e3)与e1)所述的氨基酸序列具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与e1)所述的氨基酸序列的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。
优选地，所述轻链信号肽的氨基酸序列包含：
f1)SEQ ID NO：27中第1～19位氨基酸组成的氨基酸序列；或
f2)将f1)所述的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与f1)所述的氨基酸序列的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
f3)与f1)所述的氨基酸序列具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与f1)所述的氨基酸序列的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。
优选地，所述EBV gp42的氨基酸序列包含：
g1)SEQ ID NO：4中第1～190位氨基酸组成的氨基酸序列；或
g2)将g1)所述的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与g1)所述的氨基酸序列的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
g3)与g1)所述的氨基酸序列具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与g1)所述的氨基酸序列的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。
本发明的第二个方面，提供一种重组蛋白，包含：本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段；和
任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
优选地，所述的标签序列选自下组中的至少一种：His标签、GGGS序列、FLAG标签；进一步为Hi s标签；更进一步为6×His标签。
本发明的第三个方面，提供与本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段、或本发明第二个方面的重组蛋白相关的生物材料，所述生物材料包含h1)～h16)中至少一种：
h1)编码本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段、或第二个方面的重组蛋白的核酸分子；
h2)包含h1)所述核酸分子的表达盒；
h3)包含h1)所述核酸分子的载体；
h4)包含h2)所述表达盒的载体；
h5)包含h1)所述核酸分子的转基因细胞系；
h6)包含h2)所述表达盒的转基因细胞系；
h7)包含h3)所述载体的转基因细胞系；
h8)包含h4)所述载体的转基因细胞系；
h9)包含h1)所述核酸分子的微生物；
h10)包含h2)所述表达盒的微生物；
h11)包含h3)所述载体的微生物；
h12)包含h4)所述载体的微生物；
h13)包含h1)所述核酸分子的病毒；
h14)包含h2)所述表达盒的病毒；
h15)包含h3)所述载体的病毒；
h16)包含h4)所述载体的病毒。
优选地，所述转基因细胞系不包含繁殖材料。
优选地，所述编码如本发明第一个方面的所述单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子包含编码本发明第一个方面的所述单克隆抗体或其抗原结合片段的重链的核酸分子和编码本发明第一个方面的所述单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链的核酸分子。
优选地，所述编码本发明第一个方面的所述单克隆抗体或其抗原结合片段的重链的核酸分子的核苷酸序列包含：
a211)如SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列；或
a212)将SEQ ID NO：26经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID NO：26所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；或
a213)与SEQ ID NO：26具有80％、85％或90％以上的同源性，且与SEQ ID NO：26所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；
所述编码编码本发明第一个方面的所述单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链的核酸分子的核苷酸序列包含：
a221)如SEQ ID NO：36所示的核苷酸序列；或
a222)将SEQ ID NO：36经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID NO：36所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；或
a223)与SEQ ID NO：36具有80％、85％或90％以上的同源性，且与SEQ ID NO：36所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列。
本发明的第四个方面，提供一种偶联物，包含：本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段和本发明第二个方面的重组蛋白中的至少一种；
以及偶联部分，所述偶联部分包含可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶中的至少一种。
优选地，所述可检测标记物选自放射性同位素，荧光物质，化学发光物质，有色物质，或其任意组合。
优选地，所述偶联物选自：荧光物质、化学发光标记物、有色物质、放射性同位素、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
本发明的第五个方面，提供发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段、第二个方面的重组蛋白、第三个方面的生物材料、和/或第四个方面的偶联物在制备产品中的应用；
所述产品包含药物、试剂、检测板、试剂盒、检测芯片中的至少一种。
优选地，所述药物具有i1)～i2)中至少一种功能：
i1)预防EB病毒感染；
i2)治疗和/或预防EB病毒感染所引起的疾病。
优选地，所述试剂、检测板、检测芯片或试剂盒具有j1)～j3)中至少一种功能：
j1)检测gp42蛋白在样品中的存在或水平；
j2)检测EB病毒；
j3)诊断EB病毒感染所引起的疾病。
优选地，所述疾病包括：鼻咽癌、胃癌、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤、淋巴组织增生性疾病、传染性单核细胞增多症中的至少一种。
优选地，所述药物包含疫苗。
本发明的第六个方面，提供一种产品，所述产品包含k1)～k3)中至少一种：
k1)本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段；
k2)本发明第二个方面的重组蛋白；
k3)本发明第四个方面的偶联物；
所述产品包含试剂、检测板、试剂盒、检测芯片中的至少一种。
优选地，所述产品具有j1)～j3)中至少一种功能：
j1)检测gp42蛋白在样品中的存在或水平；
j2)检测EB病毒；
j3)诊断EB病毒感染所引起的疾病。
优选地，所述疾病包括：鼻咽癌、胃癌、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤、淋巴组织增生性疾病、传染性单核细胞增多症中的至少一种。
本发明的第七个方面，提供一种药物，所述药物包含l1)～l4)中至少一种：
l1)本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段；
l2)本发明第二个方面的重组蛋白；
l3)苯发明第三个方面的生物材料；
l4)本发明第四个方面的偶联物。
优选地，所述药物还包含药学上可接受的载体。
优选地，所述药物具有i1)～i2)中至少一种功能：
i1)预防EB病毒感染；
i2)治疗和/或预防EB病毒感染所引起的疾病。
优选地，所述疾病包括：鼻咽癌、胃癌、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤、淋巴组织增生性疾病、传染性单核细胞增多症中的至少一种。
优选地，所述药物包含疫苗。
优选地，一种疫苗，包含l1)～l4)中至少一种和佐剂：
l1)本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段；
l2)本发明第二个方面的重组蛋白；
l3)苯发明第三个方面的生物材料；
l4)本发明第四个方面的偶联物。
本发明第八个方面，在于提供本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段或第二方面的重组蛋白的制备方法，通过培养本发明第三个方面中的转基因细胞系、微生物或病毒得到。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种抗EBV gp42的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段对gp42蛋白有较高的亲和力(KD(M)＝1.248E-09)，可以显著抑制EBV对于上皮细胞以及B细胞的感染，在体内有效保护EBV感染的人源化小鼠，可用于检测gp42蛋白在样品中的存在或水平、检测EB病毒、诊断EB病毒感染所引起的疾病、预防EB病毒感染和/或治疗和/或预防EB病毒感染所引起的疾病。
附图说明
图1是单克隆抗体2C1与gp42蛋白的亲和力检测结果图。
图2是单克隆抗体2C1阻断EBV感染上皮细胞的结果图。
图3是单克隆抗体2C1阻断EBV感染B细胞的结果图。
图4是单克隆抗体2C1处理EBV感染的人源化小鼠后的生存曲线图。
图5是单克隆抗体2C1处理EBV感染的人源化小鼠后的体重变化图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1抗EB病毒gp42蛋白(EBV gp42)的单克隆抗体(单抗)的制备
1.1EBV gp42重组蛋白的制备
gp42蛋白在EBV入侵上皮细胞和B细胞的过程中发挥重要的作用，在本发明实施例中，发明人选择gp42作为诱饵蛋白来筛选特异性抗体。
其中，所选择的gp42原始序列包括KOZAK序列、CD5信号肽、gp42蛋白(34-223aa)、His标签、终止密码子；具体如下：5’-GCCACCATGCCCATGGGGTCTCTGCAACCGCTGGCCACCTTGTACCTGCTGG GGATGCTGGTCGCTTCCTGCCTCGGAGGAGGGCGGGTGGCAGCCGCGGCCATCACCTGGGTTCCCAAACCAAATGTAGAGGTCTGGCCGGTGGATCCTCCACCGCCGGTTAACTTTAACAAGACAGCCGAGCAGGAGTATGGGGACAAAGAGGTAAAACTGCCACATTGGACACCCACCCTGCACACATTTCAGGTACCCCAAAACTATACCAAAGCTAACTGTACATACTGCAACACCAGAGAATACACATTTTCATATAAAGGATGCTGTTTTTATTTCACCAAAAAGAAGCACACCTGGAATGGGTGTTTCCAAGCCTGTGCAGAGCTATATCCATGCACTTATTTTTATGGGCCAACGCCCGATATTCTACCTGTGGTAACTAGAAATCTGAATGCCATTGAGTCCCTTTGGGTCGGGGTGTACAGGGTGGGAGAAGGGAACTGGACATCATTAGATGGGGGGACTTTTAAGGTTTATCAAATTTTTGGCTCTCATTGTACATATGTCAGCAAATTTAGTACAGTTCCAGTCTCACACCATGAGTGTTCATTCCTTAAACCATGTTTATGTGTCAGTCAAAGATCAAATAGCCATCATCACCATCACCACTAA-3’(SEQ ID NO：1)；其中，SEQ ID NO：1中第1～6位核苷酸组成的序列为KOZAK序列，SE Q ID NO：1中第7～78位核苷酸组成的序列为CD5信号肽序列；SEQ ID NO：1中第79～648位核苷酸组成的序列为gp42蛋白(34-223aa)序列，SEQ ID NO：1中第649～666位核苷酸组成的序列为His标签序列，SEQ ID NO：1中第667～669位核苷酸组成的序列是终止密码子。
将上述gp42原始序列连接在哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1+(Invitrogen)中，具体方法如下：
(1)gp42蛋白基因的扩增：
选用50μL的NEBPCR扩增反应体系(表1)对上述gp42原始序列进行扩增，其中，上游引物为：5’-GTGTGATCAGATATCGCGGCCGCATGCCCATGGGGTCTCTGCAACCGCTGGCCACCTTGTACCTGCTGGGGATGCTGGTCGCTTCCTGCCTCGGAGGAGGGCGGGTGGCAGCC-3’(SEQ ID NO：2)；下游引物为：5’-ACTAGAAGGCACAGCAGATCTTTAGTGGTGATGGTGATGATGGCTATTTGATCTTTGACTGACACATAAA-3’(SEQ ID NO：3)。
扩增完成的目的片段通过琼脂糖凝胶电泳分析，在紫外灯下切割正确分子量的条带，按照市售试剂盒说明书操作回收PCR产物。
表1 gp42原始序列PCR扩增反应体系
组分 含量
5×Reaction Buffer 10μL
dNTPs 1μL
上游引物(10uM) 2.5μL
下游引物(10uM) 2.5μL
EBV基因组DNA模板 1μL
DNA聚合酶 0.5μL
High GC Enhancer(来自NEB的Q5试剂盒) 10μL
ddH2O 补至50μL
(2)目的片段和载体的酶切与连接：
载体使用真核表达质粒pcDNA3.1+。目的片段和载体都采用NotⅠ和BglII进行酶切(选用50μL的酶切反应体系(表2)进行酶切)。
表2酶切反应体系
组分 含量
10×CutSmart Buffer 5μL
BglII-HF 1μL
NotⅠ-HF 1μL
目的片段或载体 5μg
ddH2O 补至50μL
酶切在37℃进行，酶切时间为2～3h。酶切载体跑琼脂糖凝胶后使用胶回收试剂盒回收，得到线性化载体。插入片段直接使用DNA纯化试剂盒回收。回收后使用10μL连接反应体系(表3)进行连接。反应条件为37℃进行30min。得到连接产物。
表3连接反应体系
组分 含量
5×CEⅡ Buffer 2μL
CEⅡ 1μL
线性化载体 100ng
插入片段 100ng
ddH2O 补至10μL
(3)连接产物的转化和阳性克隆的筛选：
将连接产物加入刚刚融化的DH5α感受态细胞悬液中，冰上放置30min，42℃热激90s，放回冰上5min。加入200μL LB培养基，于30℃慢摇复苏40min。吸取培养液涂布在氨苄抗性的LB平板上，37℃培养过夜。
挑取单个克隆菌落测序验证，待测序结果正确后，得到目标重组质粒。大量提取质粒。
(4)重组蛋白的表达和提取：
取人肾上皮细胞293F细胞进行培养，得到1L的细胞密度为1.5×106的细胞悬液。使用PEI转染试剂转染步骤(3)得到的重组质粒。具体操作为：用25mL Union-293培养基稀释2mg重组质粒；向25mL Union-293培养基中加入6mL 1mg/mL PEI。将质粒和PEI充分震荡混匀，室温放置20min后加入至293F细胞悬液中。培养5天后收集细胞上清，在4℃条件下6000rpm离心1h，弃去细胞沉淀，即得含有目的蛋白的上清。
目的蛋白的纯化采用亲和层析。
由于得到的gp42重组蛋白C端带有6×His tag，因此可以使用镍柱对其进行亲和纯化。具体操作为：使用0.65μm滤纸过滤上述得到的含有目的蛋白的上清，过镍柱beads结合3次，用30mM咪唑淋洗beads3次，用500mM咪唑洗脱目的蛋白。然后使用凝胶过滤层析进一步纯化，具体操作为：使用3kD浓缩管对镍柱洗脱的蛋白进行浓缩，至体积小于1mL。然后使用Superdex 200Increase 10/300GL纯化。
最终得到的目的蛋白的氨基酸序列为：GGRVAAAAITWVPKPNVEVWPVDPPPPVNFNKTAEQEYGDKEVKLPHWTPTLHTFQVPQNYTKANCTYCNTREYTFSYKGCCFYFTKKKHTWNGCFQACAELYPCTYFYGPTPDILPVVTRNLNAIESLWVGVYRVGEGNWTSLDGGTFKVYQIFGSHCTYVSKFSTVPVSHHECSFLKPCLCVSQRSNSHHHHHH(SEQ ID NO：4)；其中，SEQ ID NO：4中第1～190位氨基酸残基组成的序列为gp42蛋白(34-223aa)序列，第191～196位氨基酸残基组成的序列为His标签序列。
1.2噬菌体抗体库的构建
(1)总RNA提取：
将鼻咽癌(NPC)病人血液用PBS 1:1稀释(10mL血+10mL PBS)，然后取20mL稀释液小心覆盖于15mL淋巴细胞分离液上，保持分层界面，2000rpm常温离心20min，缓慢降速，吸取中间单核细胞层到新的15mL离心管中，加PBS定容至15mL，300g常温离心20min，将上清转移到新的50mL离心管中，300g常温离心20min，去上清，将15mL和50mL离心管内的细胞沉淀各用1mL Trizol重悬(即每10mL血液用2mL Trizol重悬)。
取20mL Trizol-细胞沉淀重悬液加入4mL氯仿，在震荡器上震荡15s后，室温放置静置5min。在4℃4000g离心30min，离心后出现分层，将最上层的透明层用移液枪小心转移到新的无RNase和DNase的50mL离心管中，每管加入1:1体积的异丙醇，上下颠倒多次混匀后室温放置静置10min。4000g离心30min去除上清保留沉淀。向沉淀中加入1mL 75％乙醇，转移到1.5mL离心管中，将沉淀多次弹起与液体充分接触。7500g离心5min，去除上清保留沉淀。保持离心管口打开，室温放置干燥10min，加入400uL无酶水，55℃孵育10min以确保RNA完全溶解，即得总RNA。
取1μL用核酸浓度测量仪检测RNA的浓度和A260/A280并记录。
(2)RNA逆转录：
使用反转录试剂盒(Promega公司GoScriptTM反转录试剂盒)对上述步骤(1)得到的总RNA进行反转录。
具体操作为：
将上述总RNA样品分为两份，一份使用试剂盒内的Oligo dT Primer作为引物，另一份用试剂盒内的Random 6-mers作为引物，在1.5mL离心管中按表4所示体系配置反应液，根据RNA量同比例扩大反应体系进行扩增。
将上述反应后的反应液分装到PCR八联管中放入PCR仪，短暂离心，70℃反应5min使RNA变性，反应结束后置于冰上迅速冷却。然后按照表5中的比例向上述PCR八联管中配置其余反应液。将表5中反应液混匀后短暂离心，将离心管放入PCR仪中，45℃反应60min，再75℃反应15min，冰上冷却，即得总RNA反转录后的cDNA，4℃保存。
表4 5μL反转录反应体系
组分 含量
Oligo dT Primer(50μM)/Random 6-mers(50μM) 1μL
总RNA 2μg
ddH2O 补至5μL
表5其他反应液配比
组分 含量
表4反应后的体系 5μL
5×Reaction Buffer 4μL
MgCl2 2uL
dNTP mix 1uL
RNase抑制剂 0.4μL
RTase 1μL
ddH2O 补至20μL
(3)PCR扩增：
以步骤(2)中得到cDNA为模板，使用NEB Q5高保真DNA聚合酶通过两轮PCR扩增出单链抗体片段(ScFv)，其构建的结构为VL-linker-VH(轻链-连接子-重链)。
第一轮PCR是以cDNA为模板进行的，第一轮PCR反应体系如表6所示。PCR反应采用三温度点法：每个循环95℃变性10秒，60℃退火30秒，升温至72℃延伸1分钟，循环35次。第一轮PCR中的引物包括：
Vλ正向引物：5’-CCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCgagctcCAGTCTGTSBTGACGCAGCCGCC-3’(SEQ ID NO：5)；
Vλ-linker反向引物：5’-GGAAGATCTAGAGGAACCACCTAGGACGGTSASCTTGGTCC-3’(SEQID NO：6)；
Vκ正向引物：5’-CCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCgagctcGACATCCRGDTGACCCAGTCTCC-3’(SEQ ID NO：7)；
Vκ-linker反向引物：5’-GGAAGATCTAGAGGAACCACCTTTGATTTCCACCTTGGTCC-3’(SEQID NO：8)；
linker-VH正向引物：5’-GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCTCCTCTGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCSG-3’(SEQ ID NO：9)；
linker-VH反向引物：5’-CAGTCATTCTCGACTTactagtTGAGGAGACRGTGACCAGGGTG-3’(SEQ ID NO：10)；
其中，各引物中的小写部分为酶切位点；Vλ正向引物与Vλ-linker反向引物配对使用，Vκ正向引物和Vκ-linker反向引物配对使用，linker-VH正向引物和linker-VH反向引物配对使用。
表6第一轮PCR反应体系
组分 含量
cDNA 5μL
正向引物(10uM) 2.5μL
反向引物(10uM) 2.5μL
dNTP Mix 1μL
5×Reaction Buffer 10μL
High GC Enhancer 10μL
聚合酶 0.5μL
ddH2O 补至50μL
反应结束后，将所有PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收目的片段大小在320bp(对应VL)和350bp(对应VH)左右的条带。使用NEB DNA GEL purification kit根据试剂盒说明书进行DNA回收。收集DNA溶液即为第一轮PCR扩增产物，测浓度后4℃保存。
第二轮PCR是以第一轮PCR扩增产物作为模板进行的，第二轮PCR反应体系如表7所示。第二轮PCR的反应条件与第一轮PCR的反应条件相同。第二轮PCR中的引物包括：OF：5’-CCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCgagctc-3’(SEQ ID NO:11)；OR：5’-CAGTCATTCTCGACTTactagt-3’(SEQ ID NO:12)。
表7第二轮PCR反应体系
组分 含量
VH/VL胶回收产物 80ng VH+80ng VL
dNTP Mix 1μL
5×Reaction Buffer 10μL
High GC Enhancer 10μL
正向引物OF(10uM) 2.5μL
反向引物OR(10uM) 2.5μL
聚合酶 0.5μL
ddH2O 补至50μL
反应结束后，将PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，160V，20min，最终选取电泳结果中目的条带片段大小为750bp的条带，使用NEB DNA GEL purification kit根据试剂盒说明书进行DNA回收，收集DNA溶液即为第二轮PCR扩增产物，测浓度后4℃保存。
(4)载体与PCR扩增产物的酶切连接：
将第二轮PCR产物(ScFv片段)通过酶切连接到噬菌体质粒pComb3XSS中，从而构建含有扩增目标片段(ScFv片段)的噬菌体质粒库。其中，酶切使用限制性内切酶SpeI和SacI。
pComb3XSS载体和第二轮PCR扩增产物(扩增目标片段(ScFv片段))的酶切体系分别如表8和表9所示。
表8载体酶切体系
表9目标片段(ScFv片段)酶切体系
组分 含量
scFv 5μg
SpeI 5μL
SacI 5μL
CutSmart 10×buffer 25μL
ddH2O 补至250μL
酶切反应条件：37℃孵育2h，80℃3min。酶切结束后，载体酶切产物跑胶后切胶使用NEB DNA纯化回收试剂盒回收(不要照射紫外)；ScFv片段酶切产物无需跑胶，可直接回收。
酶切反应纯化后，测量回收产物的浓度，然后按照表10所示连接反应体系连接酶切后的载体和ScFv酶切产物。上述连接体系37℃反应过夜(16～24h)。连接结束后，使用NEBDNA纯化回收试剂盒回收连接产物。检测回收连接产物的浓度并记录，4℃保存。
表10连接反应体系
组分 含量
10×T4 reaction Buffer 2μL
ScFv片段(酶切后) 68ng
载体(酶切后) 100ng
T4连接酶 1μL
ddH2O 补至20μL
1.3细菌文库的构建：
(1)TG1大肠杆菌感受态细胞的制备：
取TG1菌株在2×YT固体培养基进行单菌落划线，37℃过夜培养，从单菌落板上挑取一个单菌落到10mL 2×YT培养基，37℃过夜，220rpm培养。按照1:100的稀释比例将菌接种至100mL2×YT培养基中，37℃250rpm培养40min后测OD值，此后每间隔20min测一次，直到OD600＝0.3～0.35。收集菌液，3200g，0～4℃离心10min，弃上清，置于冰上，加入40mL预冷ddH2O重悬，3200g，0～4℃离心10min，弃上清，置于冰上，加入1mL预冷ddH2O重悬，转移到1.5mL预冷EP管内，10000g，4℃离心30s，重复一次。弃上清，置于冰上，加入400μL预冷ddH2O重悬，得到TG1大肠杆菌感受态细胞悬液。
取上述实施例中得到的含有ScFv片段的Comb3XSS重组质粒，采用电击转化法构建大肠杆菌文库。具体方法为：使用提前预冷的枪头向50μL上述TG1大肠杆菌感受态细胞悬液中加入100ng含有ScFv片段的Comb3XSS重组质粒，轻轻吹匀，转移到已经预冷的1mm电转杯中，确认混合物在电转杯底部且无气泡后，设定1800V，1mm间距，进行电转。完成后立即加入1000μL 37℃的SOC培养基，将混合液从电转杯中取出，37℃，180rpm震荡复苏90min。使用2×YT液体培养基进行10倍梯度稀释，共稀释6个梯度(分别稀释101、102、103、104、105、106倍)。每个梯度取5μL均匀滴加到2×YT-GA固体培养基，晾干后37℃静置培养过夜。对梯度稀释平板上的菌落数目进行计数，并计算连接效率。连接效率公式为：
E(pfu/ug)＝N×D×10；
其中，E为感受态效率(单位pfu/ug)，D为稀释倍数，N为相应稀释倍数平板上的单克隆数目。
按照上述方法重复进行100个电击转化反应，将复苏菌液均匀涂布到100个2×YT-GA245mm方形培养基平板中，晾干后37℃倒置过夜培养。取过夜培养的方形板，在每个培养板表面加6mL 2×YT液体培养基，用涂布棒轻轻将100个方形板菌落刮下并将菌液收集至50mL离心管中，加入终浓度为20％的甘油，即为细菌文库。
取10μL细菌液到990μL 2×YT液体培养基中并使用NanoDrop测量OD600，计算并记录细菌文库总OD600。
TOD600＝MOD600×100；
其中，TOD600为细菌总OD600，MOD600为测量出的OD600。
1.4噬箘体文库构建：
从上述细菌文库中取适量到1.5mL EP管，菌液量的计算公式为：
其中，V为转接菌液的体积(单位μL)，OD600为构建的细菌文库总OD600。
将其转接到100mL 2×YT-GA液体培养基中，以使初始OD600为0.1。在恒温摇床中37℃，250rpm培养直至菌液OD600达到0.5～0.55。按照下面公式计算并加入辅助噬菌体M13K07以使细菌：噬菌体的数量比为1：20。噬菌体加入量计算公式为：
其中，V为加入辅助噬菌体的体积(单位mL)，Thelper-phage为使用的辅助噬菌体效价，OD600为菌液的OD600值。
在恒温摇床中37℃，220rpm继续培养30min。3200g离心5min收集TG1细菌，去上清，将沉淀重悬转移到100mL 2×YT-AK液体培养基中，恒温摇床中30℃，250rpm过夜培养。
将过夜培养的菌液转移至新的50mL离心管中4000g，4℃离心30min。取上清液，加入1/4体积的4℃预冷的20％PEG/2.5M NaCl，充分混匀后冰上放置30min。4000rpm，4℃离心30min，弃上清，并在纸上倒置2min。加入1mL PBS重悬沉淀，12000rpm，4℃离心20min。取上清液，加入1/4体积预冷的20％PEG/2.5M NaCl溶液，混匀后冰上放置10min。12000rpm，4℃离心10min，弃上清，加入1ml PBS重悬沉淀。12000rpm，4℃离心2min，取上清，即为噬菌体文库，加入最终浓度为20％的甘油，-80℃保存。
对噬菌体文库效价进行检测，具体操作为：取噬菌体文库加入至10mL2×YT液体培养基中，37℃，250rpm培养约45min～60min，直至OD600为0.5～0.55。取10μL培养好的噬菌体文库，10倍梯度稀释(共稀释13个梯度)。每个稀释梯度加入90μL无处理TG1菌液，混匀后37℃孵育20min。然后每个稀释梯度中取5μL滴加到2×YT-GA固体培养基中，晾干后37℃过夜培养，计数，并按照噬菌体文库效价公式计算每毫升噬菌体溶液中噬菌粒的数量。
T(pfu/ml)＝N×D×400；
其中，T为噬菌体效价(单位pfu/mL)，D为稀释倍数，N为相应稀释倍数上单菌落个数。
1.5gp42蛋白特异性抗体的筛选
使用抗原固相化吸附筛选法，筛选与gp42蛋白特异性结合的抗体。
具体操作如下：
将50μg上述得到的gp42蛋白溶解于2mL PBS中，4℃包被免疫管过夜(阳性管)。同时包被阴性对照蛋白(50μg BSA)作为阴性对照。弃包被蛋白，用2mL PBS涮洗3遍，然后用2mL 3％BSA(PBST溶解)室温封闭2h。弃封闭液，取100μL得到的噬菌体文库，用2mL PBS稀释，在免疫管中孵育1h。弃去液体，用2mL PBST洗涤5遍，每次5min。然后再用2mL PBS洗涤5遍，每次5min。洗涤的同时，取1mL过夜TG1饱和菌液至100mL 2×YT液体培养基中，37℃150rpm培养至OD600＝0.5(大约1.5h)。弃洗涤液，用1mL 0.1mg/mL Trypsin室温洗脱30min。将1mL洗脱物加入10mL至培养好的TG1菌液(OD＝0.5)中，37℃150rpm感染30min；4℃，3000g离心10min。然后使用1mL 2×YT液体培养基重悬沉淀。将阳性免疫管洗脱的1mL重悬产物均匀涂布在245mm×245mm的2×YT固体培养皿中，37℃培养过夜(16～20h)。分别测定阳性管与阴性对照管的噬菌体效价，测定方法同上述实施例。
根据噬菌体效价对比结果向过夜培养后噬菌体效价高的培养皿中加入5mL 2×YT液体培养基，用涂布棒刮下全部菌落，按照上述实施例中的方法制备子噬菌体文库。重复上述操作，直至筛选出与gp42具有最高亲和力的抗体(相比阴性对照)。
其中，抗原包被、封闭、孵育、洗涤和洗脱过程，如不作特别说明，转速均为15rpm。
使用ELISA检测最高亲和力的抗体。
取10μL与gp42具有最高亲和力的抗体的培养菌液，用1ml 2×YT液体培养基稀释菌液。在2×YT-GA固体培养板上进行克隆划线，37℃过夜培养16～20h。挑取192个单克隆至96孔板(每孔含200μL 2×YT-GA液体)，37℃静置培养至饱和。取2μL饱和菌液至新96孔板(每孔含200μL 2×YT-A液体)，使初始OD约为0.03，37℃静置2.5h～3h至OD约为0.5。每孔加入0.1μL上述辅助噬菌体，37℃感染30min。每孔加入0.2μL Kana(卡那霉素)，30℃培养过夜。蛋白(-/+)包被酶标板过夜。将过夜培养的96孔板4℃、3400g离心5min。弃酶标板内液体，350μL PBS洗1遍。350μL 3％BSA(PBST)37℃封闭1h。弃封闭液，350μL PBST洗1遍，拍板除去液体。每孔加入140μL 3％BSA(PBST)，再分别加入60μL上述噬菌体文库表达抗体(最高亲和力的抗体，作为一抗)，37℃孵育1h。弃液体(一抗)，350μL PBST洗5遍，拍板。加入100μLM13 Antibody(HRP)作为二抗(1:8000加入比例，相对于封闭液)，37℃孵育1h，弃液体(二抗)，350μL PBST洗5遍，拍板。100μL TMB避光2-3min，100μL稀盐酸(浓盐酸：水＝1:12)终止反应。读取酶标板的OD450、OD630。在本实施例中，发明人最终得到的效果最佳的抗体命名为2C1。
1.6单克隆抗体的表达和纯化
将抗体重链可变区上游与CMV片段、下游与人IgG1的恒定区以及ployA片段进行连接后可以表达完整重链的片段；而将抗体轻链可变区上游与CMV片段、下游与轻链κ/λ的恒定区以及ploy A片段进行连接后可以表达完整轻链的片段。将带有上述抗体重链和轻链全长序列的质粒共转染293T细胞中即可实现抗体的表达，用protein A beads可以实现抗体的纯化。
2C1全长重链共477氨基酸残基(不计*)，具体为：
13)；
其中，序列中下划线部分为重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)。下划线且加粗部分依次为重链可变区中3个互补区CDR-H1(SEQ ID NO：15)、CDR-H2(SEQ ID NO：16)和CDR-H3(SEQ ID NO：17)的氨基酸序列(IMGT定义方案)。斜体部分为信号肽。SEQ ID NO：13中第148～477位氨基酸为重链恒定区。*表示终止密码子。
该重链可变区中以其他定义CDR方案的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3如表11所示。
表11重链可变区中以其他定义CDR方案的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3
2C1全长重链的编码基因共1434个碱基，具体为：
其中，序列中下划线部分为重链可变区的核苷酸序列。下划线且加粗部分依次为重链可变区中3个互补区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的核苷酸序列(IMGT定义方案)。5’端最初始和3’端最末端的3个碱基分别为起始密码子和终止密码子。斜体部分为信号肽。
2C1全长轻链共232个氨基酸残基(不计*)，具体为：
其中，序列中下划线部分为轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：28)。下划线且加粗部分依次为轻链可变区中3个互补决定区CDR-L1(SEQ ID NO：29)、CDR-L2(ATS)和CDR-L3(SEQ ID NO：30)的氨基酸序列(IMGT定义方案)。斜体部分为信号肽。SEQ ID NO：27中第127～232位氨基酸为轻链恒定区。*表示终止密码子。
该轻链可变区中以其他定义CDR方案的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3如表12所示。
表12轻链可变区中以其他定义CDR方案的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3
2C1全长轻链的编码基因共699个碱基，具体为：
其中，序列中下划线部分为轻链可变区的核苷酸序列。下划线且加粗部分依次为轻链可变区中3个互补区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的核苷酸序列。5’端最初始和3’端最末端的3个碱基分别为起始密码子和终止密码子。斜体部分为信号肽。
效果实施例
1.利用生物膜干涉技术(BLI)测定抗体2C1的亲和力。
BLI可按照本领域常规方法进行，在本实施例中，具体操作为：将生物传感器(德国赛多利斯Sartorius SA探针)浸入缓冲液(KB buffer、0.1％BSA和0.02％ Tween 20的混合液)中进行平衡。然后将其取出浸入含有5μg/mL gp42-Biotin(生物素标记的gp42蛋白)的溶液中，溶液中的gp42抗原会结合到SA(链霉亲和素)生物探针表面，使其表面膜层厚度增加。然后以固化的已知浓度抗原的生物传感器浸入缓冲液中作为基线。通过将固化好的已知浓度抗原的生物传感器浸入含有7.8～500nM 2C1抗体的样品溶液中约120秒，由于抗原-抗体间特异性结合会导致膜层厚度的增加，将已结合2C1抗体的生物传感器浸入缓冲液中进行解离约180秒，待测抗体(2C1抗体)会从生物传感器表面脱落导致膜层厚度的减少。通过对实验过程中生物传感器生物膜层厚度的实时监控，可以得到待测样品(2C1抗体)的动力学常数。结果如图1所示：2C1抗体的KD(M)＝1.248E-09；说明2C1抗体与gp42抗原之间具有极高的亲和力。
2 2C1抗体的中和活性
(1)EBV病毒的制备：
1)用RPMI1640+5％ FBS培养基于37度培养箱(5％CO2)培养感染EBV-GFP的CNE2细胞(病毒已在文献：An Antibody Targeting the Fusion Machinery Neutralizes Dual-Tropic Infection and Defines a Si te of Vulnerability on Epstein-Barr Virus中公开)，当细胞长至90％密度(10cm皿)时加入终浓度为20ng/mL的TPA和终浓度为2.5mM的NaB(丁酸钠)诱导，12个小时后换液。
2)换液后48～72h收集培养上清分离纯化病毒，直接吸取上清，上清离心后用0.45um小滤器过滤。浓缩后用无血清的RPMI1640进行重悬，重悬后立即用于感染或于-80度保存。
(2)2C1单克隆抗体的上皮细胞中和活性检测
1)在96孔板中每孔铺1x106个NOK上皮细胞，每孔加100uL含10％FBS的DMEM培养基。
2)第二天取上述实施例中的2C1单克隆抗体，调整浓度为2mg/mL。在新的96孔板中每孔加入60uL DMEM培养基，首孔加入120uL 12.5ug/mL用DMEM稀释后的2C1抗体(首孔中不包含RPMI1640培养基)。
3)2倍梯度稀释后(梯度稀释会从首孔吸出60uL加入第二孔，以此类推，最后一孔吸出60uL后丢弃，最终每孔体积为60uL)；每孔加60uL病毒稀释液(病毒用DMEM培养基稀释，滴度约4*106/mL)，37度孵育2个小时后加入前一天铺板的NOK细胞中。放置于37度培养箱培养48个小时后检测。
4)用胰酶消化NOK细胞后制备细胞悬液，通过流式检测感染率，通过检测与感染对照组(加入等体积的DMEM)相比抗体处理组的GFP阳性细胞数量减少比例，计算抗体在NOK上皮细胞感染模型的抑制率(中和效率，％)。利用Prism计算绘制得2C1单克隆抗体的IC50。以2G4抗体作为阴性对照抗体。其中，2G4抗体为抗埃博拉病毒的对照抗体。
结果如图2所示：单克隆抗体2C1在上皮细胞感染模型的IC50为0.0157ug/mL，对照抗体没有中和活性；单克隆抗体2C1可以显著抑制EBV对于上皮细胞的感染。
(3)2C1单克隆抗体的B细胞中和活性检测
1)取上述实施例中的2C1单克隆抗体，调整浓度为2mg/mL。在新的96孔板中每孔加入60uL RP MI1640培养基，首孔加入90uL 100ug/mL用RPMI1640稀释后的2C1抗体(首孔中不包含RPMI1640培养基)。
2)3倍梯度稀释后(梯度稀释会从首孔吸出30uL加入第二孔，以此类推，最后一孔吸出30uL后丢弃，最终每孔体积为60uL)；每孔加60uL病毒稀释液(病毒用DMEM培养基稀释，滴度约4*106/mL)，37度孵育2个小时后每孔加入1*106个Raji细胞。放置于37度培养箱培养48个小时后检测。
3)吸出Raji细胞制备细胞悬液，通过流式检测感染率，通过检测与感染对照组(加入等体积的RPM I1640)相比抗体处理组的GFP阳性细胞数量减少比例，计算抗体在Raji B细胞感染模型的抑制率(中和效率，％)。利用Prism计算绘制得2C1单克隆抗体的IC50。以2G4抗体作为阴性对照抗体。
结果如图3所示：单克隆抗体2C1在B细胞感染模型的IC50为0.212ug/mL，对照抗体没有中和活性；单克隆抗体2C1可以显著抑制EBV对于B细胞的感染。
3.2C1单克隆抗体的人源化小鼠保护实验
基于NSG小鼠(NOD-Prkdcnull IL2Rγnull)构建人源化小鼠，它们被保存在无特定病原体设施中并从北京维通达公司获得。动物培养是在标准湿度(50％)、温度(25±2℃)条件下保持12小时光照和12小时黑暗循环。为了产生人源化免疫系统，将白消安以20mg/kg的剂量腹腔注射小鼠。注射后48h后，从小鼠尾部静脉注射人CD34+细胞。在移植后4周和8周通过流式细胞术检测每只人源化小鼠外周血中的人CD45+细胞。
在CD34+干细胞转移后8周，腹腔注射200μg 2C1单克隆抗体或对照抗体或等体积PBS(每组数量6只)。24小时后，小鼠通过静脉注射相当于2.5*105感染单位的CNE2-EBV病毒稀释液(第0天)。在第2、7、14、21天，分别给每组小鼠腹腔注射200ug的2C1单克隆抗体或200ug的对照抗体或等体积PBS，并每周进行采血和记录体重和健康状况。小鼠在EBV感染后6周或更早(如果它们出现较严重临床疾病例如，体重减轻30％))被安乐死。对照抗体为在前期筛选中对EBV体外中和能力较2C1差的抗体。结果如图4、5所示：2C1单克隆抗体可以在体内有效保护EBV感染的人源化小鼠，因此能够有效用于病毒的预防或治疗。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种抗EBV gp42的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链：
所述重链包含：
重链可变区，其包含所述重链可变区的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
所述轻链包含：
轻链可变区，其包含所述轻链可变区的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：30所示，所述CDR是以Kabat定义方案定义的；或
所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：15、SEQID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30所示，所述CDR-L2的氨基酸序列为：ATS，所述CDR是以IMGT定义方案定义的；或
所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：30所示，所述CDR是以Chothia定义方案定义的；或
所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35所示，所述CDR是以Contact定义方案定义的。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于：
所述重链可变区的氨基酸序列包含：
a1)SEQ ID NO.14；或
a2)将SEQ ID NO.14经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ IDNO.14所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a3)与SEQ ID NO.14具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％或80％的同源性且与SEQ ID NO.14所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述轻链可变区的氨基酸序列包含：
b1)SEQ ID NO.28；或
b2)将SEQ ID NO.28经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ IDNO.28所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
b3)与SEQ ID NO.28具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％或80％的同源性且与SEQ ID NO.28所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于：
所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、双特异性抗体、多特异性抗体中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于：
所述重链还包含重链恒定区；和/或
所述轻链还包含轻链恒定区。
5.根据权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于：
所述重链恒定区的氨基酸序列包含：
c1)SEQ ID NO：13中第148～477位氨基酸组成的氨基酸序列；或
c2)将c1)所述的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与c1)所述的氨基酸序列的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
c3)与c1)所述的氨基酸序列具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与
c1)所述的氨基酸序列的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
所述轻链恒定区的氨基酸序列包含：
d1)SEQ ID NO：27中第127～232位氨基酸组成的氨基酸序列；或
d2)将d1)所述的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与d1)所述的氨基酸序列的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
d3)与d1)所述的氨基酸序列具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与
d1)所述的氨基酸序列的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。
6.一种重组蛋白，包含：权利要求1～5中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；和
任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
7.与权利要求1～5中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、或权利要求6所述的重组蛋白相关的生物材料，所述生物材料包含h1)～h16)中至少一种：
h1)编码权利要求1～5中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段、或权利要求6所述的重组蛋白的核酸分子；
h2)包含h1)所述核酸分子的表达盒；
h3)包含h1)所述核酸分子的载体；
h4)包含h2)所述表达盒的载体；
h5)包含h1)所述核酸分子的转基因细胞系；
h6)包含h2)所述表达盒的转基因细胞系；
h7)包含h3)所述载体的转基因细胞系；
h8)包含h4)所述载体的转基因细胞系；
h9)包含h1)所述核酸分子的微生物；
h10)包含h2)所述表达盒的微生物；
h11)包含h3)所述载体的微生物；
h12)包含h4)所述载体的微生物；
h13)包含h1)所述核酸分子的病毒；
h14)包含h2)所述表达盒的病毒；
h15)包含h3)所述载体的病毒；
h16)包含h4)所述载体的病毒；
所述转基因细胞系不包含繁殖材料。
8.一种偶联物，包含：权利要求1～5中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段和权利要求6所述的重组蛋白中的至少一种；
以及偶联部分，所述偶联部分包含可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶中的至少一种。
9.(1)～(4)中至少一种在制备产品中的应用；
(1)权利要求1～5中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；
(2)权利要求6所述的重组蛋白；
(3)权利要求7所述的生物材料；
(4)权利要求8所述的偶联物；
所述产品包含药物、试剂、检测板、试剂盒、检测芯片中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：
所述药物具有i1)～i2)中至少一种功能：
i1)预防EB病毒感染；
i2)治疗和/或预防EB病毒感染所引起的疾病；或
所述试剂、检测板、检测芯片或试剂盒具有j1)～j3)中至少一种功能：
j1)检测gp42蛋白在样品中的存在或水平；
j2)检测EB病毒；
j3)诊断EB病毒感染所引起的疾病。
11.一种产品，所述产品包含k1)～k3)中至少一种：
k1)权利要求1～5中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；
k2)权利要求6所述的重组蛋白；
k3)权利要求8所述的偶联物；
所述产品包含试剂、检测板、试剂盒、检测芯片中的至少一种。
12.一种药物，所述药物包含(l1)～(l4)中至少一种：
(l1)权利要求1～5中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；(l2)权利要求6所述的重组蛋白；
(l3)权利要求7所述的生物材料；
(l4)权利要求8所述的偶联物。
13.根据权利要求12所述的药物，其特征在于：
所述药物还包含药学上可接受的载体。
14.一种疫苗，所述疫苗包含(l1)～(l4)中至少一种和佐剂：
(l1)权利要求1～5中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；(l2)权利要求6所述的重组蛋白；
(l3)权利要求7所述的生物材料；
(l4)权利要求8所述的偶联物。
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