CN115925884A - 一种针对EB病毒gB抗原的单克隆抗体及其在病毒标记中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种针对EB病毒gB抗原的单克隆抗体及其应用，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区，包括SEQ ID NO:15所示的重链CDR‑H1；SEQ ID NO:16所示的重链CDR‑H2；和SEQ ID NO:17所示的重链CDR‑H3；所述轻链可变区，包括SEQ ID NO:18所示的轻链CDR‑L1；SEQ IDNO:19所示的轻链CDR‑L2；和SEQ ID NO:20所示的轻链CDR‑L3。本发明中的抗体能够特异性识别EB病毒gB抗原，KD(M)可以达到1.0E‑12，远超现有的一般EB病毒抗体，可以基于该抗体开发各类表达载体和转化体，从而有效用于EB病毒的精确检测。

Description

一种针对EB病毒gB抗原的单克隆抗体及其在病毒标记中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种针对EB病毒gB抗原的单克隆抗体及其在病毒标记中的应用。

背景技术

EB病毒(EBV)又称人类疱疹病毒4型，最早于1964年由Epstein和Barr从Burkitt淋巴瘤细胞通过体外悬浮培养并建株，它是一种γ亚科嗜淋巴细胞病毒属的DNA致瘤病毒。EB病毒颗粒由核心蛋白、衣壳、壳皮、囊膜，共4种结构成分组成，核心为缠绕有DNA的核心蛋白。

EBV以潜伏感染方式最常见，有90％以上的EBV感染者呈终身潜伏感染，病毒在一定条件下被激活启动而致癌。目前研究发现，人EBV与鼻咽癌、传染性单核细胞增多症、霍奇金及非霍奇金淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤及包括胃癌在内的上皮细胞癌等恶性肿瘤的发生有密切的关系。EB病毒最初复制部位是口咽部，其会在B淋巴细胞和口腔上皮细胞内生长繁殖，然后感染B淋巴细胞，这些细胞大量进入血液循环而造成全身性感染。当机体免疫功能低下时，潜伏的EBV活化形成复发感染。

目前针对EBV尚无有效的疫苗，由EBV感染引起的疾病也缺乏特异的治疗手段。传染性单核细胞增多症的治疗大多应用抗病毒药物如阿昔洛韦等，这些药物虽然可一定程度上缓解症状，但并不能消除B淋巴细胞内及咽喉部上皮的EB病毒。EBV相关肿瘤的治疗主要为化疗和放疗，但对于转移或复发患者来说，疗效较差。

单克隆抗体可以大量生产，基于其与抗原结合的高亲和性及高特异性，可以大大减少了临床应用时的不良反应。还可以对这些抗体分子进行改造以增加其抗病毒效力。抗体以其特异性和使用的灵活性成为感染性疾病治疗中非常有前景的手段，但至今仍未有针对EBV囊膜糖蛋白的人源化单克隆抗体上市。因此开发抗EBV的人源单克隆抗体，将为EBV感染相关疾病提供更有效的预防和治疗手段。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种针对EB病毒gB抗原的单克隆抗体及其应用，该单克隆抗体能够高特异性和高亲和性的结合EB病毒gB抗原，且中和效果和亲和性高于常规的EB病毒抗体，具有极高的应用价值。

本发明的第一个方面，提供一种特异性结合EB病毒gB蛋白的抗体，该抗体包括重链可变区和轻链可变区。所述重链可变区，包括SEQ ID NO:15所示的重链CDR-H1；SEQ IDNO:16所示的重链CDR-H2；和SEQ ID NO:17所示的重链CDR-H3。所述轻链可变区，包括SEQID NO:18所示的轻链CDR-L1；SEQ ID NO:19所示的轻链CDR-L2；和SEQ ID NO:20所示的轻链CDR-L3。

其中，CDR-H1为YGIG(SEQ ID NO:15)；CDR-H2为GVIPVTGTRSYPQKFQG(SEQ ID NO:16)；CDR-H3为YMSYLYGMDV(SEQ ID NO:17)。

CDR-L1为RSSQGLVYSDGDTYLN(SEQ ID NO:18)；CDR-L2为KVSNRDS(SEQ ID NO:19)；CDR-L3为MQGAHWPPT(SEQ ID NO:20)。

在本发明的一些实施方式中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示。

在本发明的一些实施方式中，SEQ ID NO：21所示氨基酸序列为：QITLKESGAEMKKPGSSVKVSCKSSDTFKSYGIGWVRQAPGQGLEWMGGVIPVTGTRSYPQKFQGRVTITADESTSTAYMELSRLRSEDTAVYYCGRYMSYLYGMDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:21)。

在本发明的一些实施方式中，所述抗体的重链中除重链可变区外，还包括其他序列，包括但不限于信号肽。

在本发明的一些实施方式中，所述重链的全长序列如SEQ ID NO：11所示。

在本发明的一些实施方式中，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示。

在本发明的一些实施方式中，SEQ ID NO：22所示氨基酸序列为：DIVLTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQGLVYSDGDTYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCMQGAHWPPTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:22)。

在本发明的一些实施方式中，所述抗体的轻链中除轻链可变区外，还包括其他序列，包括但不限于信号肽。

在本发明的一些实施方式中，所述轻链的全长序列如SEQ ID NO：13所示。

本发明的第二个方面，提供编码本发明第一个方面所述抗体的核酸分子。

在本发明的一些实施方式中，编码CDR-H1的核酸分子为TATGGTATCGGC(SEQ IDNO:25)；编码CDR-H2的核酸分子为GGGGTCATCCCTGTCACTGGCACAAGAAGCTACCCACAGAAGTTTCAGGGC(SEQ ID NO:26)；编码CDR-H3的核酸分子为TACATGAGCTACTTATATGGCATGGACGTC(SEQID NO:27)。

在本发明的一些实施方式中，编码CDR-L1的核酸分子为AGGTCTAGTCAAGGCCTCGTATACAGTGATGGAGACACCTACTTGAAT(SEQ ID NO:28)；编码CDR-L2的核酸分子为AAGGTTTCTAATCGGGACTCT(SEQ ID NO:29)；编码CDR-L3的核酸分子为ATGCAAGGTGCACACTGGCCTCCAACT(SEQ ID NO:30)。

在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子中含有SEQ ID NO：23和/或SEQ IDNO：24所示的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方式中，SEQ ID NO:23为编码所述抗体重链可变区的核苷酸序列，具体为：5’-CAGATCACCTTGAAGGAGTCTGGGGCTGAGATGAAGAAGCCTGGGTCTTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGTCTTCTGACACCTTCAAGAGTTATGGTATCGGCTGGGTCCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGGTCATCCCTGTCACTGGCACAAGAAGCTACCCACAGAAGTTTCAGGGCAGAGTCACTATTACCGCGGACGAGTCCACGAGCACAGCCTACATGGAATTGAGCAGGCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTATTGTGGAAGATACATGAGCTACTTATATGGCATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA-3’(SEQ IDNO:23)。

在本发明的一些实施方式中，SEQ ID NO：24为编码所述抗体轻链可变区的核苷酸序列，具体为：5’-GATATTGTGCTGACTCAGACTCCACTCTCCTCACCTGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAAGGCCTCGTATACAGTGATGGAGACACCTACTTGAATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCAAGGCGCCTAATTTATAAGGTTTCTAATCGGGACTCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCAGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAGAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGGTGCACACTGGCCTCCAACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA-3’(SEQ ID NO:24)。

在本发明的一些实施方式中，所述抗体重链和/或轻链中除可变区外，还包括其他序列，包括但不限于信号肽。

在本发明的一些实施方式中，所述抗体重链全长核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。

在本发明的一些实施方式中，所述抗体轻链全长核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示。

本发明的第三个方面，提供含有本发明第二个方面所述核酸分子的表达载体。

在本发明的一些实施方式中，所述表达载体中还含有标签序列、抗生素序列等辅助用途的序列。当然，本领域技术人员需要理解的是，所述辅助用途的序列包括但不限于上述标签序列、抗生素序列。

本发明的第四个方面，提供含有本发明第二个方面所述核酸分子和/或本发明第三个方面所述表达载体的转化体。

在本发明的一些实施方式中，所述转化体包括病毒、细菌、真菌和细胞。

当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理选择其他转化体用于目的蛋白或目的片段的保存、纯化、表达、分泌或其他必要性用途。

在本发明的一些实施方式中，所述转化体为细胞、细菌和噬菌体。

本发明的第五个方面，提供一种EB病毒检测产品，该EB病毒检测产品中含有如下(1)～(4)中的至少一种：

(1)本发明第一个方面所述抗体；

(2)本发明第二个方面所述核酸分子；

(3)本发明第三个方面所述表达载体；

(4)本发明第四个方面所述的转化体。

在本发明具体实施方式中，发明人通过试验验证，基于上述抗体、核酸分子、表达载体或转化体中的至少一种，均能有效起到EB病毒的检测作用，且检测效果准确，相比常规的一般EB病毒抗体有更好的亲和力，KD(M)可以达到1.122E-09。

本发明的第六个方面，提供本发明第一个方面所述抗体在制备EB病毒检测产品中的应用。

在本发明具体实施方式中，所述EB病毒检测、治疗或预防产品包括：探针、检测试剂、检测试剂盒、检测芯片。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种针对EB病毒gB抗原的单克隆抗体，该抗体能够特异性识别EB病毒gB抗原，从而可以基于该抗体开发各类表达载体和转化体，从而有效用于EB病毒的检测。且该单克隆抗体对EB病毒的亲和力高，KD(M)可以达到1.0E-12，远超现有的一般EB病毒抗体，具有更好的使用效果和技术优势。

附图说明

图1为BLI法测定得到的不同浓度4F10抗体的亲和力曲线。

图2为基于4F10抗体的gB蛋白Western Bloting电泳图。

图3为基于4F10抗体的瞬时转染gB重组质粒的293T细胞Western Bloting电泳图。

图4为基于4F10抗体的流式细胞图。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

EBV gB重组蛋白的制备

gB蛋白在EBV入侵上皮细胞和B细胞的过程中发挥重要的作用，在本发明实施例中，发明人选择gB作为诱饵蛋白来筛选特异性抗体。

其中，所选择的gB原始序列(包括KOZAK序列和CD5信号肽)为：

5’-GCCACCATGCCCATGGGGTCTCTGCAACCGCTGGCCACCTTGTACCTGCTGGGGATGCTGGTCGCTTCCTGCCTCGGACAGACCCCAGAGCAGCCCGCGCCCCCCGCCACCACGGTGCAGCCTACCGCCACGCGTCAGCAAACCAGCTTTCCTTTCCGAGTCTGCGAGCTCTCCAGCCACGGCGACCTGTTCCGCTTCTCCTCGGACATCCAGTGTCCCTCGTTTGGCACGCGGGAGAATCACACGGAGGGCCTGTTGATGGTGTTTAAAGACAACATTATTCCCTACTCGTTTAAGGTCCGCTCCTACACCAAGATAGTGACCAACATTCTCATCTACAATGGCTGGTACGCGGACTCCGTGACCAACCGGCACGAGGAGAAGTTCTCCGTTGAGAGCTACGAAACTGACCAGATGGATACCATCTACCAGTGCTACAACGCGGTAAAGATGACAAAAGATGGGCTGACGCGCGTGTATGTAGACCGCGACGGAGTTAACATCACCGTCAACCTAAAGCCCACCGGGGGCCTGGCCAACGGGGTGCGCCGCTACGCCAGCCAGACGGAGCTCTATGACGCCCCCGGGTGGTTGATATGGACTTACAGAACAAGAACTACCGTCAACTGCCTGATAACTGACATGATGGCCAAGTCCAACAGCCCCTTCGACTTCTTTGTGACCACCACCGGGCAGACTGTGGAAATGTCCCCTTTCTATGACGGGAAAAATACGGAAACCTTCCATGAGCGGGCAGACTCCTTCCACGTGAGAACTAACTACAAGATAGTGGACTACGACAACCGAGGGACGAACCCGCAAGGCGAACGCCGAGCCTTCCTGGACAAGGGCACTTACACGCTATCTTGGAAGCTCGAGAACAGGACAGCCTACTGCCCGCTTCAACACTGGCAAACCTTTGACTCGACCATCGCCACAGAAACAGGGAAGTCAATACATTTTGTGACTGACGAGGGCACCTCTAGCTTCGTGACCAACACAACCGTGGGCATAGAGCTCCCGGACGCCTTCAAGTGCATCGAAGAGCAGGTGAACAAGACCATGCATGAAAAGTACGAGGCCGTCCAGGATCGTTACACGAAGGGCCAGGAAGCCATTACATATTTTATAACGAGCGGAGGATTGTTATTAGCTTGGCTACCTCTGACCCCGCGCTCGTTGGCCACCGTCAAGAACCTGACGGAGCTTACCACTCCGACTTCCTCACCCCCCAGCAGTCCATCGCCCCCCGCCCCACCCGCGGCCCGCGGGAGCACCTCCGCCGCCGTTCTGAGGCGCCGGAGGCGGAATGCGGGGAATGCCACCACACCGGTGCCCCCCGCGGCCCCCGGGAAGTCCCTGGGCACCCTCAACAATCCCGCCACCGTCCAGATCCAATTTGCCTACGACTCCCTGCGCCGCCAGATCAACCGCATGCTGGGAGACCTTGCGCGGGCCTGGTGCCTGGAGCAGAAGAGGCAGAACATGGTGCTGAGAGAACTAACCAAGATTAATCCCACCACCGTCATGTCCAGCATCTACGGTAAGGCGGTGGCGGCCAAGCGCCTGGGGGATGTCATCTCAGTCTCCCAGTGCGTGCCCGTTAACCAGGCCACCGTCACCCTGCGCAAGAGCATGAGGGTCCCCGGCTCCGAGACCATGTGCTACTCGCGCCCCCTGGTGTCCTTCAGCTTTATCAACGACACCAAGACCTACGAGGGACAGCTGGGCACCGACAACGAGATCTTCCTTACAAAAAAGATGACGGAGGTGTGCCAGGCGACCAGCCAGTACTACTTCCAGTCCGGCAACGAGATCCACGTCTACAACGACTACCACCACTTTAAAACCATCGAGCTGGACGGCATTGCCACCCTGCAGACCTTCATCTCACTAAACACCTCCCTCATCGAGAACATTGACTTTGCCTCCCTGGAGCTGTACTCACGGGACGAACAGCGTGCCTCCAACGTCTTTGACCTGGAGGGCATCTTCCGGGAGTACAACTTCCAGGCGCAAAACATCGCCGGCCTGCGGAAGGATTTGGACAATGCAGTGTCA-3’(SEQ ID NO：1)。

将上述gB基因片段连接在哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1+(Invitrogen)中，具体方法如下：

(1)gB蛋白基因的扩增：

选用50μL的NEB

PCR扩增反应体系(表1)对上述gB蛋白基因进行扩增。

表1 gB蛋白基因PCR扩增反应体系

组分	含量
		5×Reaction Buffer	10μL
dNTPs	1μL
		上游引物	2.5μL
下游引物	2.5μL
		DNA模板	1μL
DNA聚合酶	0.5μL
		High GC Enhancer(来自NEB的Q5试剂盒)	10μL
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	补至50μL

其中，上游引物为：5’-TGGTGGAATTCGCCACCATGCCCATGGGGTCTCTGCAACCGCTGGCCACCTTGTACCTGCTGGGGATGCTGGTCGCTTCCTGCCTCGGACAGACCCCAGAGCAGCCC-3’(SEQ ID NO：2)；下游引物为5’-TCGAGCGGCCGCTTAGTGGTGATGGTGATGATGTGACACTGCATTGTCCAAATCC-3’(SEQ IDNO：3)。

扩增完成的目的片段通过琼脂糖凝胶电泳分析，在紫外灯下切割正确分子量的条带，按照市售试剂盒说明书操作回收PCR产物。

(2)目的片段和载体的酶切与连接：

载体使用真核表达质粒pcDNA3.1+。目的片段和载体都采用EcoRⅠ和NotⅠ进行酶切(选用50μL的酶切反应体系(表2)进行酶切)。

表2酶切反应体系

组分	含量
		10×CutSmart Buffer	5μL
EcoRⅠ-HF	1μL
		NotⅠ-HF	1μL
目的片段或载体	5μg
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	补至50μL

酶切在37℃进行，酶切时间为2～3h。酶切载体跑琼脂糖凝胶后使用胶回收试剂盒回收，得到线性化载体。插入片段直接使用DNA纯化试剂盒回收。回收后使用10μL连接反应体系(表3)进行连接。

表3连接反应体系

组分	含量
		5×CEⅡBuffer	2μL
CEⅡ	1μL
		线性化载体	100ng
插入片段	100ng
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	补至10μL

反应条件为37℃进行30min。得到连接产物

(3)连接产物的转化和阳性克隆的筛选：

将连接产物加入刚刚融化的DH5α感受态细胞悬液中，冰上放置30min，42℃热激90s，放回冰上5min。加入200μL LB培养基，于30℃慢摇复苏40min。吸取培养液涂布在氨苄抗性的LB平板上，37℃培养过夜。

挑取单个克隆菌落测序验证，但测序结果正确后，得到目标重组质粒。大量提取质粒。

(4)重组蛋白的表达和提取：

取人肾上皮细胞293F细胞进行培养，得到1L的细胞密度为1.5×10⁶的细胞悬液。使用PEI转染试剂转染步骤(3)得到的重组质粒。具体操作为：用25mL Union-293培养基稀释2mg重组质粒；向25mL Union-293培养基中加入6mL 1mg/mL PEI。将质粒和PEI充分震荡混匀，室温放置20min后加入至293F细胞悬液中。培养5天后收集细胞上清，在4℃条件下6000rpm离心1h，弃去细胞沉淀，即得含有目的蛋白的上清。

目的蛋白的纯化采用亲和层析。

由于得到的gB重组蛋白C端带有6×His tag，因此可以使用镍柱对其进行亲和纯化。

具体操作为：使用0.65μm滤纸过滤上述实施例中得到的含有目的蛋白的上清，过镍柱beads结合3次，用30mM咪唑淋洗beads 3次，用500mM咪唑洗脱目的蛋白。然后使用凝胶过滤层析进一步纯化，具体操作为：使用30kD浓缩管对镍柱洗脱的蛋白进行浓缩，至体积小于1mL。然后使用Superdex 200Increase10/300GL纯化。

最终得到的目的蛋白的氨基酸序列为：

QTPEQPAPPATTVQPTATRQQTSFPFRVCELSSHGDLFRFSSDIQCPSFGTRENHTEGLLMVFKDNIIPYSFKVRSYTKIVTNILIYNGWYADSVTNRHEEKFSVESYETDQMDTIYQCYNAVKMTKDGLTRVYVDRDGVNITVNLKPTGGLANGVRRYASQTELYDAPGWLIWTYRTRTTVNCLITDMMAKSNSPFDFFVTTTGQTVEMSPFYDGKNTETFHERADSFHVRTNYKIVDYDNRGTNPQGERRAFLDKGTYTLSWKLENRTAYCPLQHWQTFDSTIATETGKSIHFVTDEGTSSFVTNTTVGIELPDAFKCIEEQVNKTMHEKYEAVQDRYTKGQEAITYFITSGGLLLAWLPLTPRSLATVKNLTELTTPTSSPPSSPSPPAPPAARGSTSAAVLRRRRRNAGNATTPVPPAAPGKSLGTLNNPATVQIQFAYDSLRRQINRMLGDLARAWCLEQKRQNMVLRELTKINPTTVMSSIYGKAVAAKRLGDVISVSQCVPVNQATVTLRKSMRVPGSETMCYSRPLVSFSFINDTKTYEGQLGTDNEIFLTKKMTEVCQATSQYYFQSGNEIHVYNDYHHFKTIELDGIATLQTFISLNTSLIENIDFASLELYSRDEQRASNVFDLEGIFREYNFQAQNIAGLRKDLDNAVSHHHHHH*(SEQ IDNO：4)。

噬菌体抗体库的构建

(1)总RNA提取：

将鼻咽癌(NPC)病人血液用PBS 1:1稀释(10mL血+10mL PBS)，然后每20mL稀释液小心覆盖于15mL淋巴细胞分离液上，保持分层界面，2000rpm常温离心20min，缓慢降速，吸取中间单核细胞层到新的15mL离心管中，加PBS定容至15mL。300g常温离心20min，将上清转移到新的50mL离心管中，300g常温离心20min。去上清。将15mL和50mL离心管内的细胞沉淀各用1mL Trizol重悬。(即每10mL血液用2mL Trizol重悬)。

取每20mL Trizol-细胞沉淀重悬液加入4mL氯仿，在震荡器上震荡15s后，室温放置静置5min。在4℃4000g离心30min，离心后出现分层，将最上层的透明层用移液枪小心转移到新的无RNase和DNase的50mL离心管中，每管加入1:1体积的异丙醇，上下颠倒多次混匀后室温放置静置10min。4000g离心30min去除上清保留沉淀。向沉淀中加入1mL 75％乙醇，转移到1.5mL离心管中，将沉淀多次弹起与液体充分接触。7500g离心5min，去除上清保留沉淀。保持离心管口打开，室温放置干燥10min，加入400uL无酶水，55℃孵育10min以确保RNA完全溶解，即得总RNA。

取1μL用核酸浓度测量仪检测RNA的浓度和A260/A280并记录。

(2)RNA逆转录：

使用反转录试剂盒(Promega公司GoScript^TM反转录试剂盒)对上述步骤(1)得到的总RNA进行反转录。

具体操作为：

将上述总RNA样品分为两份，一份使用试剂盒内的Oligo dT Primer作为引物，另一份用试剂盒内的Random 6-mers作为引物，在1.5ml离心管中按表4所示体系配置反应液，根据RNA量同比例扩大反应体系进行扩增。

表4 5μL反转录反应体系

组分	含量
		Oligo dT Primer(50μM)/Random 6-mers(50μM)	1μL
总RNA	2μg
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	补至5μL

将上述反应液分装到PCR八联管中放入PCR仪，短暂离心，70℃反应5min使RNA变性，反应结束后置于冰上迅速冷却。然后按照表5中的比例向上述PCR八联管中配置其余反应液。

表5其他反应液配比

组分	含量
		表4反应后的体系	5μL
5×Reaction Buffer	4μL
		<![CDATA[MgCl<sub>2</sub>]]>	2uL
dNTP mix	1uL
		RNase抑制剂	0.4μL
RTase	1μL
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	补至20μL

将表5中反应液混匀后短暂离心，将离心管放入PCR仪中，45℃反应60min，再75℃反应15min，冰上冷却，即得总RNA反转录后的cDNA，4℃保存。

(3)PCR扩增：

以步骤(2)中得到cDNA为模板，使用NEB Q5高保真DNA聚合酶通过两轮PCR扩增出单链抗体片段(ScFv)，其构建的结构为VL-linker-VH(轻链-连接子-重链)。

第一轮PCR是以cDNA为模板进行的，第一轮PCR反应体系如表6所示。

表6第一轮PCR反应体系

PCR反应采用三温度点法：每个循环95℃变性10秒，60℃退火30秒，升温至72℃延伸1分钟，循环35次。

第一次PCR中的引物包括：

Vλ正向引物：5’-CCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCgagctcCAGTCTGTSBTGACGCAGCCGCC-3’(SEQ ID NO：5)。

Vλ-linker反向引物：5’-GGAAGATCTAGAGGAACCACCTAGGACGGTSASCTTGGTCC-3’(SEQID NO：6)。

Vκ正向引物：5’-CCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCgagctcGACATCCRGDTGACCCAGTCTCC-3’(SEQ ID NO：7)。

Vκ-linker反向引物：5’-GGAAGATCTAGAGGAACCACCTTTGATTTCCACCTTGGTCC-3’(SEQID NO：8)。

linker-VH正向引物：5’-GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCTCCTCTGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCSG-3’(SEQ ID NO：9)。

linker-VH反向引物：5’-CAGTCATTCTCGACTTactagtTGAGGAGACRGTGACCAGGGTG-3’(SEQ ID NO：10)。

其中，各引物中的小写部分为酶切位点。

其中，Vλ正向引物与Vλ-linker反向引物配对使用，Vκ正向引物和Vκ-linker反向引物配对使用，lin ker-VH正向引物和linker-VH反向引物配对使用。

反应结束后，将所有PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收目的片段大小在320bp(对应VL)和350bp(对应VH)左右的条带。使用NEB DNA GEL purification kit根据试剂盒说明书进行DNA回收。收集DNA溶液即为第一轮PCR扩增产物，测浓度后4℃保存。

第二轮PCR是以第一轮PCR扩增产物作为模板进行的，第二轮PCR反应体系如表7所示。

表7第二轮PCR反应体系

组分	含量
		VH/VL胶回收产物	80ng VH+80ng VL
dNTP Mix	1μL
		5×Reaction Buffer	10μL
High GC Enhancer	10μL
		正向引物OF	2.5μL
反向引物OR	2.5μL
		聚合酶	0.5μL
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	补至50μL

OF：5’-CCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCgagctc-3’(SEQ ID NO:31)。

OR：5’-CAGTCATTCTCGACTTactagt-3’(SEQ ID NO:32)。

反应条件同上。反应结束后，将PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，160V，20min，最终选取电泳结果中目的条带片段大小为750bp的条带，使用NEB DNA GEL purificationkit根据试剂盒说明书进行DNA回收，收集DNA溶液即为第二轮PCR扩增产物，测浓度后4℃保存。

(4)载体与PCR扩增产物的酶切连接：

将第二轮PCR产物通过酶切连接到噬菌体质粒pComb3XSS中，从而构建含有扩增目标片段(ScFv片段)的噬菌体质粒库。其中，酶切使用限制性内切酶SpeI和SacI。

pComb3XSS载体和第二轮PCR扩增产物的酶切体系分别如表8和表9所示。

表8载体酶切体系

表9目标片段(ScFv片段)酶切体系：

组分	含量
		scFv	5μg
SpeI	5μL
		SacI	5μL
CutSmart 10×buffer	25μL
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	补至250μL

酶切反应条件：37℃孵育2h，80℃3min。酶切结束后，载体酶切产物跑胶后切胶使用NEB DNA纯化回收试剂盒回收(不要照射紫外)；ScFv酶切产物无需跑胶，可直接回收。

酶切反应纯化后，测量回收产物的浓度，然后按照表10所示连接反应体系连接酶切后的载体和ScFv酶切产物。

表10连接反应体系

组分	含量
		10×T4 reaction Buffer	2μL
ScFv片段(酶切后)	68ng
		载体(酶切后)	100ng
T4连接酶	1μL
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	补至20μL

上述连接体系37℃反应过夜(16～24h)。连接结束后，使用NEB DNA纯化回收试剂盒回收连接产物。检测回收连接产物的浓度并记录，4℃保存。

细菌文库的构建

(1)TG1大肠杆菌感受态细胞的制备：

取TG1菌株在2×YT固体培养基进行单菌落划线，37℃过夜培养，从单菌落板上挑取一个单菌落到10ml 2×YT培养基，37℃过夜，220rpm培养。按照1:100的稀释比例将菌接种至100mL2×YT培养基中，37℃250rpm培养40min后测OD值，此后每间隔20min测一次，直到OD600＝0.3～0.35。收集菌液，3200g，0～4℃离心10min，弃上清，置于冰上，加入40mL预冷ddH₂O重悬，3200g，0～4℃离心10min，弃上清，置于冰上，加入1mL预冷ddH₂O重悬，转移到1.5mL预冷EP管内，10000g，4℃离心30s，重复一次。弃上清，置于冰上，加入400μL预冷ddH₂O重悬，得到TG1大肠杆菌感受态细胞悬液。

取上述实施例中得到的ScFv片段，采用电击转化法构建大肠杆菌文库。具体方法为：使用提前预冷的枪头向50μL上述TG1大肠杆菌感受态细胞悬液中加入100ng ScFv片段，轻轻吹匀，转移到已经预冷的1mm电转杯中，确认混合物在电转杯底部且无气泡后，设定1800V，1mm间距，进行电转。完成后立即加入1000μL 37℃的SOC培养基，将混合液从电转杯中取出，37℃，180rpm震荡复苏90min。使用2×YT液体培养基进行10倍梯度稀释，共稀释6个梯度(分别稀释10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶倍)。每个梯度取5μL均匀滴加到2×YT-GA固体培养基，晾干后37℃静置培养过夜。对梯度稀释平板上的菌落数目进行计数，并计算连接效率。连接效率公式为：

E(pfu/ug)＝N×D×10

其中，E为感受态效率(单位pfu/ug)，D为稀释倍数，N为相应稀释倍数平板上的单克隆数目。

按照上述方法重复进行100个电击转化反应，将复苏菌液均匀涂布到100个2×YT-GA245mm方形培养基平板中，晾干后37℃倒置过夜培养。取过夜培养的方形板，在每个培养板表面加6mL 2×YT液体培养基，用涂布棒轻轻将100个方形板菌落刮下并将菌液收集至50mL离心管中，加入终浓度为20％的甘油，即为细菌文库。

取10μL细菌液到990μL 2×YT液体培养基中并使用NanoDrop测量OD600，计算并记录细菌文库总OD600。

T_OD600＝M_OD600×100

其中，T_OD600为细菌总OD600，M_OD600为测量出的OD600。

噬箘体文库构建

从上述细菌文库中取适量到1.5ml EP管，菌液量的计算公式为：

其中，V为转接菌液的体积(单位μL)，OD600为构建的细菌文库总OD600。

将其转接到100mL 2×YT-GA液体培养基中，以使初始OD600为0.1。在恒温摇床中37℃，250rpm培养直至菌液OD600达到0.5～0.55。按照下面公式计算并加入辅助噬菌体M13K07以使细菌：噬菌体的数量弄为1：20。噬菌体加入量计算公式为：

其中，V为加入辅助噬菌体的体积(单位mL)，T_helper-phage为使用的辅助噬菌体效价，OD600为菌液的OD600值。

在恒温摇床中37℃，220rpm继续培养30min。3200g离心5min收集TG1细菌，去上清，将沉淀重悬转移到100mL 2×YT-AK液体培养基中，恒温摇床中30℃，250rpm过夜培养。

将过夜培养的菌液转移至新的50mL离心管中4000g，4℃离心30min。取上清液，加入1/4体积的4℃预冷的20％PEG/2.5M NaCl，充分混匀后冰上放置30min。4000rpm，4℃离心30min，弃上清，并在纸上倒置2min。加入1mL PBS重悬沉淀，12000rpm，4℃离心20min。取上清液，加入1/4体积预冷的20％PEG/2.5M NaCl溶液，混匀后冰上放置10min。12000rpm，4℃离心10min，弃上清，加入1ml PBS重悬沉淀。12000rpm，4℃离心2min，取上清，即为噬菌体文库，加入最终浓度为20％的甘油，-80℃保存。

对噬菌体文库效价进行检测，具体操作为：取噬菌体文库加入至10mL2×YT液体培养基中，37℃，250rpm培养约45min-60min，直至OD600为0.5～0.55。取10μL培养好的噬菌体文库，10倍梯度稀释(共稀释13个梯度)。每个稀释梯度加入90μL无处理TG1菌液，混匀后37℃孵育20min。然后每个稀释梯度中取5μL滴加到2×YT-GA固体培养基中，晾干后37℃过夜培养，计数，并按照噬菌体文库效价公式计算每毫升噬菌体溶液中噬菌粒的数量

T(pfu/ml)＝N×D×400

其中，T为噬菌体效价(单位pfu/mL)，D为稀释倍数，N为相应稀释倍数上单菌落个数。

gB蛋白特异性抗体的筛选

使用抗原固相化吸附筛选法，筛选与gB蛋白特异性结合的抗体。

具体操作如下：

将50μg上述实施例中得到的gB蛋白溶解于2mL PBS中，4℃包被免疫管过夜。同时包被阴性对照蛋白(50μg BSA)作为阴性对照。弃包被蛋白，用2mL PBS涮洗3遍，然后用2mL3％BSA(PBST溶解)室温封闭2h。弃封闭液，取100μL上述实施例中的噬菌体文库，用2mL PBS稀释，在免疫管中孵育1h。弃去液体，用2mL PBST洗涤5遍，每次5min。然后再用2mL PBS洗涤5遍，每次5min。洗涤的同时，取1mL过夜TG1饱和菌液至100mL 2×YT液体培养基中，37℃150rpm培养至OD600＝0.5(大约1.5h)。弃洗涤液，用1mL 0.1mg/mL Trypsin室温洗脱30min。将1mL洗脱物加入10mL至培养好的TG1菌液(OD＝0.5)中，37℃150rpm感染30min；4℃，3000g离心10min。然后使用1mL 2×YT液体培养基重悬沉淀。将阳性免疫管洗脱的1mL重悬产物均匀涂布在245mm×245mm的2×YT固体培养皿中，37℃培养过夜(16～20h)。分别测定阳性管与阴性对照管的噬菌体效价，测定方法同上述实施例。

根据噬菌体效价对比结果向过夜培养后噬菌体效价高的培养皿中加入5mL 2×YT液体培养基，用涂布棒刮下全部菌落，按照上述实施例中的方法制备子噬菌体文库。重复上述操作，直至筛选出与gB具有最高亲和力的抗体(相比阴性对照)。

其中，抗原包被、封闭、孵育、洗涤和洗脱过程，如不作特别说明，转速均为15rpm。

使用ELISA检测最高亲和力的抗体。

取10μL与gB具有最高亲和力的抗体的培养菌液，用1ml 2×YT液体培养基稀释菌液。在2×YT-GA固体培养板上进行克隆划线，37℃过夜培养16～20h。挑取192个单克隆至96孔板(每孔含200μL 2×YT-GA液体)，37℃静置培养至饱和。取2μL饱和菌液至新96孔板(每孔含200μL 2×YT-A液体)，使初始OD约为0.03，37℃静置2.5h～3h至OD约为0.5。每孔加入0.1μL上述辅助噬菌体，37℃感染30min。每孔加入0.2μL Kana(卡那霉素)，30℃培养过夜。蛋白(-/+)包被酶标板过夜。将过夜培养的96孔板4℃、3400g离心5min。弃酶标板内液体，350μL PBS洗1遍。350μL 3％BSA(PBST)37℃封闭1h。弃封闭液，350μL PBST洗1遍，拍板除去液体。每孔加入140μL 3％BSA(PBST)，再分别加入60μL上述噬菌体文库表达抗体(最高亲和力的抗体，作为一抗)，37℃孵育1h。弃液体(一抗)，350μL PBST洗5遍，拍板。加入100μL M13Antibody(HRP)作为二抗(1:8000加入比例，相对于封闭液)，37℃孵育1h，弃液体(二抗)，350μL PBST洗5遍，拍板。100μL TMB避光2-3min，100μL稀盐酸(浓盐酸：水＝1:12)终止反应。读取酶标板的OD450、OD630。

单克隆抗体的表达和纯化

将抗体重链可变区上游与CMV片段、下游与人IgG1的恒定区以及ployA片段进行连接后可以表达完整重链的片段；而将抗体轻链可变区上游与CMV片段、下游与轻链κ/λ的恒定区以及ploy A片段进行连接后可以表达完整轻链的片段。将带有上述抗体重链和轻链全长序列的质粒共转染293T细胞中即可实现抗体的表达，用protein A beads可以实现抗体的纯化。

在本实施例中，发明人最终得到的效果最佳的抗体命名为4F10。

4F10全长重链共467个氨基酸残基(不计*)，具体为：

其中，序列中下划线部分为重链可变区的氨基酸序列。下划线且加粗部分依次为重链可变区中3个互补区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列。斜体部分为信号肽。*表示终止密码子。

4F10全长重链的编码基因共1404碱基，具体为：

其中，序列中下划线部分为重链可变区的核苷酸序列。下划线且加粗部分依次为重链可变区中3个互补区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的核苷酸序列。5’端最初始和3’端最末端的3个碱基分别为起始密码子和终止密码子。斜体部分为信号肽。

4F10全长轻链共237个氨基酸残基(不计*)，具体为：

其中，序列中下划线部分为轻链可变区的氨基酸序列。下划线且加粗部分依次为轻链可变区中3个互补决定区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列。*表示终止密码子。

4F10全长轻链的编码基因共714个碱基，具体为：

其中，序列中下划线部分为轻链可变区的核苷酸序列。下划线且加粗部分依次为轻链可变区中3个互补区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的核苷酸序列。5’端最初始和3’端最末端的3个碱基分别为起始密码子和终止密码子。斜体部分为信号肽。

4F10抗体亲和力测定

利用生物膜干涉技术(BLI)测定抗体4F10的亲和力。

BLI可按照本领域常规进行，在本实施例中，具体操作为：将生物传感器(德国赛多利斯Sartorius 

SA探针)浸入缓冲液(KB buffer、0.1％BSA和0.02％Tween 20的混合液)中进行平衡。然后将其取出浸入含有5μg/mL gB-Biotin(生物素标记的gB蛋白)的溶液中，溶液中的gB抗原会结合到SA(链霉亲和素)生物探针表面，使其表面膜层厚度增加。然后以固化的已知浓度抗原的生物传感器浸入缓冲液中作为基线。通过将固化好的已知浓度抗原的生物传感器浸入含有0～200nM 4F10抗体的样品溶液中，由于抗原-抗体间特异性结合会导致膜层厚度的增加，将已结合4F10抗体的生物传感器浸入缓冲液中进行解离，待测抗体(4F10抗体)会从生物传感器表面脱落导致膜层厚度的减少。通过对实验过程中生物传感器生物膜层厚度的实时监控，可以得到待测样品(4F10抗体)的动力学常数。以对照抗体AMMO5(参考https://www.creativebiolabs.net/anti-ebv-gb-recombinant-antibody-clone-ammo5-140472.htm)为对照。

结果如图1所示。

经检测，对照抗体AMMO5的KD(M)＝3.018E-10，而本发明中的4F10抗体的KD(M)＝1.0E-12。说明4F10抗体相较于一般的EB病毒抗体，其与gB抗原之间具有更高的亲和力。

4F10抗体的相关应用

基于4F10抗体的高亲和力，其可以有效用于gB抗原的相关检测，如用在WesternBlot等定性或定量检测中。

(1)4F10抗体在Western Blot中的应用：

在本实施例中，发明人以Western Blot为示例，以验证其实际应用效果。其中，所用的Western Blot相关试剂的组成情况如表11～13所示。

表11 Western Blot相关试剂的组成情况

表12 Western Blot相关试剂的组成情况

表13 Western Blot相关试剂的组成情况

操作步骤为：

按照上表配制10％分离胶，混匀后迅速加7mL至胶板模具中，加入2mL无水乙醇液封。待下层分离胶凝固后，弃无水乙醇，静置挥发。配制浓缩胶，加2mL至分离胶上层，迅速插入梳子。使用BCA蛋白定量分析试剂盒进行蛋白定量。向gB蛋白样品(在本实施例中，样品为EBV gB重组蛋白)加入5×SDS上样缓冲液，95℃金属浴10min。待胶干后，将模具放入电泳槽，加入电泳液，拔掉梳子。将处理好的蛋白样品加入样品孔中，并加入marker。先使用80V低压进行蛋白浓缩，再更换电压至120V进行蛋白分离。电泳时间根据marker位置确定。电泳完成后，小心打开胶板，割去浓缩胶。使用甲醇活化0.22μm PVDF膜。将2层滤纸、PVDF膜、分离胶、2层滤纸按从下至上的顺序依次摆放，固定于转膜夹板中。将夹板放入转膜仪，加入转膜液，100mA恒流转膜2h。将PVDF膜转移至5％牛奶封闭液中，室温摇床上孵育1h。将PVDF膜转移至上述4F10抗体溶液(1μg/mL)中，4℃振荡孵育过夜。TBST漂洗3次，每次5min。将PVDF膜转移至Rabbit Anti-Human IgG H&L(HRP)抗体(abcam，1:10000稀释)中，室温振荡孵育1h。TBST漂洗3次，每次5min。将化学发光液均匀滴至PVDF膜表面，避光反应数分钟。使用化学发光成像仪对PVDF膜进行成像。设置空白对照。

结果如图2所示。

使用4F10抗体作为一抗进行Western Bloting，gB蛋白样品会在35kD～40kD处呈现黑色条带。

将gB蛋白样品替换为瞬时转染gB重组质粒的293T细胞(转染方法同上述实施例)，按照上述Western Bloting方法进行检测(设置空白对照，并以β-actin作为内参)。结果如图3所示。

可以发现，使用4F10抗体作为一抗进行Western Bloting，可以有效检测出瞬时转染gB重组质粒的293T细胞的gB蛋白表达。

(2)4F10抗体在流式细胞术中的应用：

在本实施例中，以瞬时转染gB重组质粒的293T细胞为测试对象，以测试4F10抗体在流式细胞术中的实际应用效果。

具体步骤为：使用12孔板培养293T细胞，细胞密度约为40％。待细胞贴壁后，瞬时转染gB-Flag重组质粒(制备方法同上述gB重组质粒)，同时设置阴性对照，继续培养24h。更换培养基，使用标记了403荧光的4F10抗体4℃条件下孵育30min。使用Anti-Flag-488在4℃条件下孵育30min。以标记了403荧光的2G4抗体作为阴性对照抗体。其中，2G4抗体为上述实施例中淘汰的非最高亲和力的一般gB抗体。使用1mL胰蛋白酶消化细胞3min，200g离心5min，PBS重悬洗涤3次。500μL PBS重悬细胞，使用40μm细胞筛网过滤细胞。使用流式细胞仪检测细胞荧光。以不经任何处理的293T细胞作为空白对照。

结果如图4所示。

可以发现，使用4F10抗体的分筛效果明显优于一般gB抗体，说明4F10抗体对于一般gB抗体具有更好的特异结合性和检测效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种特异性结合EB病毒gB蛋白的抗体，其特征在于，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区；

所述重链可变区，包括SEQ ID NO:15所示的重链CDR-H1；SEQ ID NO:16所示的重链CDR-H2；和

SEQ ID NO:17所示的重链CDR-H3；

所述轻链可变区，包括SEQ ID NO:18所示的轻链CDR-L1；SEQ ID NO:19所示的轻链CDR-L2；和

SEQ ID NO:20所示的轻链CDR-L3。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：21所示。

3.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示。

4.编码权利要求1～3任一项所述抗体的核酸分子。

5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子中含有SEQ ID NO：23和/或SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列。

6.含有权利要求4或5所述核酸分子的表达载体。

7.含有权利要求4或5所述核酸分子和/或权利要求6所述表达载体的转化体。

8.根据权利要求7所述的转化体，其特征在于，所述转化体包括病毒、细菌、真菌和细胞。

9.一种EB病毒检测产品，其特征在于，所述EB病毒检测产品中含有如下(1)～(4)中的至少一种：

(1)权利要求1～3任一项所述抗体；

(2)权利要求4或5所述核酸分子；

(3)权利要求6所述表达载体；

(4)权利要求7～8任一项所述的转化体。

10.权利要求1～3任一项所述抗体在制备EB病毒检测产品中的应用；所述EB病毒检测产品优选包括：探针、检测试剂、检测试剂盒、检测芯片。

Images