CN112625132B - 纳米抗体及其编码基因、表达载体、宿主细胞和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明适用于生物基因技术领域，提供了一种纳米抗体及其编码基因、表达载体、宿主细胞和应用，该纳米抗体为针对Siglec‑15胞外特定区域的纳米抗体，其包括至少一种氨基酸序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.23所示的纳米抗体。本发明针对Siglec‑15获得能够与其胞外区域特异性结合的纳米抗体，在研发Siglec‑15治疗性抗体，优选抗肿瘤抗体治疗中具有巨大潜力。该纳米抗体具有强而快的组织穿透能力，可以进入致密的实体瘤组织发挥作用；其分子结构较为简单，可以通过大肠杆菌或酵母表达系统发酵生产，极大的降低生产成本。

Description

纳米抗体及其编码基因、表达载体、宿主细胞和应用
技术领域
本发明属于生物基因技术领域，尤其涉及一种纳米抗体及其编码基因、表达载体、宿主细胞和应用。
背景技术
癌症是世界范围内疾病死亡的主要原因，据国际抗癌联盟统计，全球每年约有960万人死于癌症，远超于艾滋病、结核病、疟疾等疾病死亡病例的总和。而相关专家预估，到2030年，全球每年死于癌症的人数将达到1300万。免疫治疗因其副作用小、抗肿瘤活性高、适应症广已成为继手术、放疗、化疗等常规治疗之后的第四大癌症治疗方式。PD1/PDL1免疫疗法是当前备受瞩目的抗癌免疫疗法，肿瘤细胞表面高表达PDL1分子，其可以与T细胞表面表达到PD1分子结合，从而抑制T细胞活性，导致肿瘤免疫逃逸。通过抗体特异性结合PD1或者PDL1可以有效抑制该信号通路，继而恢复被抑制的T细胞的活性，使癌细胞死亡。然而PD1-PDL1 在实体瘤的治疗中只有不到40%的有效率，因为一些实体瘤不表达PDL1。2019年陈教授发现了在肿瘤细胞表面高表达的分子Siglec-15，其表达水平与PDL1互斥。即肿瘤表面有PDL1的表达，就没有Siglec-15，有Siglec-15就没有PDL1表达，以填补PDL1治疗痛点。因此利用纳米抗体特异性的与Siglec-15结合，封闭Siglec-15信号通路，可以减弱对活化T细胞的抑制作用，增强抗肿瘤的功能。
Siglec-15是一个唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素家族（Siglec family）基因，在大多数正常人体组织和各种免疫细胞亚群中Siglec-15 mRNA的表达很少，但可以在巨噬细胞中表达。然而，在人多种肿瘤中，Siglec-15 mRNA表达量都上调。在241个人非小细胞肺癌样本中，通过免疫组化分析，陈列平研究团队发现Siglec-15可以在肿瘤细胞和肿瘤间质的巨噬/髓系细胞上检测到。Siglec-15是一新的免疫调节靶点，在肿瘤微环境能抑制免疫反应。Siglec-15在肿瘤微环境中的M2型巨噬细胞以及在包括肺癌、卵巢癌和头颈癌等在内多种人体肿瘤细胞中的表达上调，且其表达与B7-H1（PD-L1）是互斥的。Siglec-15 mRNA在大多数正常人体组织和各种免疫细胞亚群中均罕见表达，在肿瘤细胞、肿瘤间质细胞如肿瘤巨噬细胞和髓样细胞中表达上调。因此在肿瘤细胞及肿瘤间质中巨噬细胞和髓样细胞表面表达的Siglec-15均对活化的T细胞有抑制作用，因此要求Siglec-15的抗体不仅可以与癌细胞表面Siglec-15分子结合，抑制它对T细胞的灭活作用，还要求抗体分子可以快速、均匀分散在肿瘤内部组织及肿瘤间质中，从而有效封闭Siglec-15对T细胞的抑制作用。但是在先报道的Siglec-15单克隆抗体是完整的抗体分子，由于分子量大，很难快速、均匀分散在肿瘤内部组织及肿瘤间质中，且结构复杂，适于用细胞表达，生产成本高。
单域抗体最初是从骆驼科动物体内发现的天然缺失抗体轻链和重链恒定区的重链抗体，现在可以由人源化的噬菌体纳米抗体库筛选获得。其分子量大小是完整抗体的1/12，晶体直径2.5nm，长4nm，因此又称为纳米抗体。纳米抗体具有高亲和性和特异性等特点。人源的纳米抗体还具有免疫原性低、溶解性和稳定性较好等特点，因此更适合于治疗应用。
在先虽然L·刘等申请了专利“针对SIGLEC-15的抗体及其使用方法”，对与Siglec-15特异性结合的抗体的三个重链互补决定区（CDR）序列进行保护。而本发明中的Siglec-15纳米抗体包含的重链CDR，其氨基酸及核苷酸序列与专利“针对SIGLEC-15的抗体及其使用方法”权利要求书1-55条中（具体为权利要求1-2和权利要求46-55）中所述重链CDR区序列：SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119， SEQ ID NO:203、206或207， SEQ ID NO:212、213、215或216同一性均小于50%，但仍可以与Siglec-15高度特异性结合。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种纳米抗体，旨在解决背景技术中提出的问题。
本发明实施例是这样实现的，纳米抗体，包括三个重链CDR；三个重链CDR的氨基酸序列选自以下序列中的任三种：SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38及含与上述各序列至少50％序列同一性的变体。
作为本发明实施例的一个优选方案，纳米抗体还包括3个框架区，3个框架区的氨基酸序列选自以下序列中的任三种：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26及含与上述各序列至少50％序列同一性的变体。
作为本发明实施例的一个优选方案，纳米抗体为针对Siglec-15胞外特定区域的纳米抗体，其包括至少一种氨基酸序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.18、SEQID NO.23所示的纳米抗体。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的纳米抗体的编码基因，其包括三个重链CDR的编码基因；三个重链CDR的编码基因的核苷酸序列选自以下序列中的任三种：SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21及含与上述各序列至少50％序列同一性的变体。
作为本发明实施例的一个优选方案，纳米抗体的编码基因还包括三个框架区的编码基因；3个框架区的编码基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示。
作为本发明实施例的一个优选方案，纳米抗体的编码基因包括以下任一种的编码基因：
氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的纳米抗体的编码基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示；
氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示的纳米抗体的编码基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示；
氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示的纳米抗体的编码基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.17所示；
氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示的纳米抗体的编码基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.22所示。
本发明实施例的另一目的在于提供一种包含上述编码基因的表达载体，其载体是pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P，pBR322，pUC18、pUC19、pUC118和 pUC119。
本发明实施例的另一目的在于提供一种包含上述表达载体的宿主细胞，其受体细胞是细菌细胞、酵母菌细胞、丝状真菌细胞、动物细胞、植物细胞或昆虫细胞。
具体的，上述编码基因的核苷酸序列或至少部分序列可以通过合适的表达系统表达相应的蛋白质或多肽，这些表达系统包括：细菌、酵母菌、丝状真菌、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞或无细胞的表达系统。优选在毕赤酵母中的表达。
上述纳米抗体可用于检测Siglec-15，具体可配合采用免疫荧光法、酶联免疫吸附法、亲和层析法和免疫芯片法等对Siglec-15进行检测。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的纳米抗体在制备Siglec-15治疗性抗体药物中的应用。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的纳米抗体在制备抗肿瘤抗体药物中的应用。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的纳米抗体在制备检测Siglec-15的试剂和/或试剂盒中的应用。所述检测Siglec-15的试剂或检测Siglec-15的试剂盒里含有上述纳米抗体。
本发明实施例以化学合成法合成Siglec-15特定区域，然后将Siglec-15多肽偶联在固相载体上，从人源噬菌体纳米抗体库筛选与Siglec-15特异性结合的纳米抗体，获得表达抗体的特定基因，将此基因连接到毕赤酵母表达载体中，筛选获得能够在毕赤酵母中高效表达Siglec15纳米抗体的毕赤酵母菌株。本发明针对Siglec-15获得能够与其胞外区域特异性结合的纳米抗体，在研发Siglec-15治疗性抗体，优选抗肿瘤抗体治疗中具有巨大潜力。
本发明获得具有全新氨基酸及核苷酸序列的抗Siglec-15的纳米抗体，其氨基酸及核苷酸序列与L·刘等所申请专利“针对SIGLEC-15的抗体及其使用方法”中所保护序列相似性低于50%。其能够与Siglec-15胞外结构域特异性结合，能在大肠杆菌或者酵母菌种稳定表达。
本发明针对Siglec-15分子的特点，制备了抗Siglec-15的纳米抗体，其生产成本低、组织穿透力强，可均匀、快速的分散在肿瘤组织。具体的，纳米抗体通过从人源噬菌体抗体库筛选获得，技术成熟可靠，所获得抗体在疾病的检测和治疗方面具有显著的应用成果。该纳米抗体具有强而快的组织穿透能力，易于进入致密的实体瘤组织发挥作用；其分子结构较为简单，可以通过大肠杆菌或酵母表达系统发酵生产，极大的降低生产成本。
附图说明
图1为ELISA检测筛选克隆分泌抗体与Siglec-15结合情况的结果图。
图2为表达的Siglec-15的纳米抗体，经镍柱树脂凝胶亲和层析纯化后的SDS-PAGE的电泳图。
图3为分离纯化VH抗体与Siglec-15结合情况的结果图。
图4为纳米抗体VH-4对小鼠肿瘤体积的影响的曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
该实施例提供了一种抗Siglec-15的纳米抗体，为针对Siglec-15胞外特定区域的纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.23所示，编码它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.17、SEQ IDNO.22所示。具体的，编码它们的核苷酸序列由3个框架区和3个CDR组成，其中3个框架区的核苷酸序列分别如 SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，3个CDR的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10和SEQ IDNO.11；SEQ ID NO.14，SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16，SEQ ID NO.19，SEQ ID NO.20和SEQID NO.21 所示；3个框架区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.24（与SEQ ID NO.1对应）、SEQID NO.25（与SEQ ID NO.2对应）和SEQ ID NO.26（与SEQ ID NO.3对应）所示；3个CDR的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.27（与SEQ ID NO.4对应），SEQ ID NO.28（与SEQ ID NO.5对应）和SEQ ID NO.29（与SEQ ID NO.6对应）；SEQ ID NO.30（与SEQ ID NO.9对应），SEQ ID NO.31（与SEQ ID NO.10对应）和SEQ ID NO.32（与SEQ ID NO.11对应）；SEQ ID NO.33（与SEQ IDNO.14对应），SEQ ID NO.34（与SEQ ID NO.15对应）和SEQ ID NO.35（与SEQ ID NO.16对应），SEQ ID NO.36（与SEQ ID NO.19对应）、SEQ ID NO.37（与SEQ ID NO.20对应）和SEQ IDNO.38（与SEQ ID NO.21对应）所示。
具体的，编码上述氨基酸的核酸序列，其核苷酸序列如下：
（1）如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列；
（2）与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.22具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或更高序列同一性的其变体；和选自由以下项组成的多肽的三个重链CDR：SEQ ID NO:4、5、6；SEQ ID NO:9、10、11；SEQ ID NO:14、15、16；SEQID NO:19、20、21或与SEQ ID NO:4、5、6；SEQ ID NO:9、10、11；SEQ ID NO:14、15、16；SEQ IDNO:19、20、21具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或更高序列同一性的其变体。
其中，上述核苷酸和氨基酸序列如下：
SEQ ID NO.1 FR1：ATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCC；
SEQ ID NO.2 FR2：ATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTATCAAGC；
SEQ ID NO.3 FR3：TACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGTGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTATTGC；
SEQ ID NO.4 CDR1：GGATATACGTTTACCAATGAGATT；
SEQ ID NO.5 CDR2：ATTTCGACGCGAAGCGGTAGCACA；
SEQ ID NO.6 CDR3：GCGAGTTTGAAGCGTCGGGGGTGGCCGGTGTATCAGCACCAGTTGTCGTTT；
SEQ ID NO.7：ATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATATACGTTTACCAATGAGATTATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTATCAACCATTTCGACGCGAAGCGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGTGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTATTGCGCGAGTTTGAAGCGTCGGGGGTGGCCGGTGTATCAGCACCAGTTGTCGTTTTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTC；
SEQ IDNO.8：MAQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNEIMGWVRQAPGKGLEWVSTISTRSGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLKRRGWPVYQHQLSF；
SEQ ID NO.9 CDR1：GGAGATAGGTTTAGCAATAACATT；
SEQ ID NO.10 CDR2：ATTAGGAAGGGTAGCGGTAGCACA；
SEQ ID NO.11 CDR3：GCGGGTTCGGTGTTTGGTTCGGGGATTTTGAGTGTGACTCCCACGGCGGTGTCGTTT；
SEQ ID NO.12：ATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGAGATAGGTTTAGCAATAACATTATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTATCAAGCATTAGGAAGGGTAGCGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGTGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTATTGCGCGGGTTCGGTGTTTGGTTCGGGGATTTTGAGTGTGACTCCCACGGCGGTGTCGTTTTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTC；
SEQ IDNO.13：MAQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGDRFSNNIMGWVRQAPGKGLEWVSSIRKGSGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGSVFGSGILSVTPTAVSF；
SEQ ID NO.14：GGATTTAGGGTTAGCGATAACACT；
SEQ ID NO.15：ATTCATACGAATGGCGGTAGCACA；
SEQ ID NO.16：GCGGGTACGGATTCGCTGGATATTCATCGTTTTTTGTCGTGGAATGCGCCGGAGCACCTCGCGTTT；
SEQ ID NO.17：ATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTTAGGGTTAGCGATAACACTATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTATCAAGCATTCATACGAATGGCGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGTGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTATTGCGCGGGTACGGATTCGCTGGATATTCATCGTTTTTTGTCGTGGAATGCGCCGGAGCACCTCGCGTTTTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTC；
SEQ ID NO.18：MAQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFRVSDNTMGWVRQAPGKGLEWVSSIHTNGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGTDSLDIHRFLSWNAPEHLAF；
SEQ ID NO.19：GGATTTAAGTTTATCAATGAGACT；
SEQ ID NO.20：ATTATGGACGCAAACGGTAGCACA；
SEQ ID NO.21：GCGACTGATATGGATCGTTTTGAGCTTGTGATGAGTCAGTCGGCGGCGTTCGACTCT；
SEQ ID NO.22：ATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTTAAGTTTATCAATGAGACTATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTATCAACCATTATGGACGCAAACGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGTGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTATTGCGCGACTGATATGGATCGTTTTGAGCTTGTGATGAGTCAGTCGGCGGCGTTCGACTCTTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTC；
SEQ ID NO.23：MAQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKFINETMGWVRQAPGKGLEWVSTIMDANGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATDMDRFELVMSQSAAFDS；
SEQ ID NO.24：FR1：MAQVQLLESGGGLVQPGGS；
SEQ ID NO.25：FR2：MGWVRQAPGKGLEWVSS；
SEQ ID NO.26：FR3：YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC；
SEQ ID NO.27：CDR1：GYTFTNEI；
SEQ ID NO.28：CDR2：ISTRSGST；
SEQ ID NO.29：CDR3：ASLKRRGWPVYQHQLSF；
SEQ ID NO.30：CDR1：GDRFSNNI；
SEQ ID NO.31：CDR2：IRKGSGST；
SEQ ID NO.32：CDR3：AGSVFGSGILSVTPTAVSF；
SEQ ID NO.33：GFRVSDNT；
SEQ ID NO.34：IHTNGGST；
SEQ ID NO.35：AGTDSLDIHRFLSWNAPEHLAF；
SEQ ID NO.36：GFKFINET；
SEQ ID NO.37：IMDANGST；
SEQ ID NO.38：ATDMDRFELVMSQSAAFDS。
该纳米抗体纳米具有以下优点：
1、抗体分子量小、结构简单，抗原结合特异性好、稳定性高。
2、纳米抗体具有强而快的组织穿透能力，可以进入致密的实体瘤组织发挥作用，可以结合到常规抗体不易结合的狭小裂隙中，可以快速、均匀的分散在肿瘤组织及间质中，提高抗体抗肿瘤效果。
3、纳米抗体可用原核细胞或酵母菌表达，降低生产成本。
实施例2
该实施例提供了一种针对Siglec-15纳米抗体的筛选方法，其包括：
利用人源噬菌体纳米抗体库，以Siglec-15为抗原，从抗体库进行3轮筛选，每轮筛选按照吸附-洗脱-扩增的步骤进行。
（1）VH纳米抗体库的扩增：将冻存的噬菌体抗体库置于冰上融化，吸取400 μL加入到预热的200 mL的2×TY中，加入1% Glu和1% Amp。在 37℃、250 rpm的条件下培养至OD600=0.4。取50 mL的菌液加入2×1011 KM13辅助噬菌体，水浴37℃孵育30 min。3000 g离心10min弃上清，用100 mL 2×TY重悬沉淀，添加100 μg/mL Amp和50 μg/mL Kan，30℃、250 rpm培养过夜。第二天将过夜的菌液3300 g离心30 min，弃沉淀，将上清中加入体积比例为1/4的PEG/NaCl，冰上静置1 h。3300 g离心30 min，弃上清；用4 mLPBS重悬沉淀，11600 g离心10 min，去沉淀。
（2）抗Siglec-15纳米抗体的筛选：抗体库为噬菌体表面呈现的人源纳米抗体库，扩增后库容为1×1013 。化学合成Siglec-15作为抗原，以100 μg/mL包被至抗原免疫管，按“吸附-洗脱-扩增”程序进行特异性抗体的筛选。噬菌体纳米抗体库第一轮筛选具体过程如下：将4 mL浓度为100 μg/mL的抗原包被在免疫管中，置于 4℃过夜。将免疫管用PBS洗3次，加入2% MPBS室温封闭2 h。PBS洗3次，加入4 mL含有10 12个噬菌体文库的2% MPBS，室温孵育2 h。用PBST洗10次，加入500 μL Trypsin溶液（1 mg/mL），室温放置于摇床上洗脱10min。取出250 μL噬菌体洗脱液，加入到1.75 mL的OD600=0.4的TG1菌液中，37℃水浴30min。将菌液按系列梯度进行稀释（10 2 、10 3 ··· 10 6），取10 μL稀释的菌液点在TYE平板上（含有1% Glu和1% Amp），每组3个平行。将剩余的TG1菌液11600 g离心5 min。弃上清，沉淀用50 μL 2×TY重悬，涂在TYE平板上，37℃培养过夜，作为第二轮筛选的噬菌体文库。将涂在TYE平板上的菌液用含有15%甘油的2 mL 2×TY 刮下来，取出50 μL加入到50 mL2×TY中，含有100 μg/mL Amp和1%Glu。37℃摇床上培养1-2 h至菌液OD600=0.4。取出10 mL菌液，加入5×1010个KM13辅助噬菌体，37℃水浴孵育30 min。将菌液3000 g离心10 min，用50 mL 2×TY 重悬沉淀，加入100 μg/mL Amp、50 μg/mL Kan和0.1% Glu，30℃，250 rpm过夜培养。第二天将噬菌体文库进行PEG沉淀。第2、3轮过程与第1轮过程相同。
（3）ELISA法检测筛选抗体与Siglec-15的结合：筛选3轮后，在第3轮的TYE平板上随机挑取单菌落进行培养，37℃过夜培养后离心收集上清检测抗体活性，具体过程如下：将圆底96孔板中加入含有100 μg/mL Amp和1% Glu的2 × TY培养基，挑取第3轮的单菌落于96孔板中，37℃，250 rpm过夜培养。取新的96孔板，加入200 μL 2×TY 培养基，含有100 μg/mL Amp和0.1% Glu。吸出过夜培养的菌液5 μL接种于新的96孔板中（每孔3个平行），37℃、250 rpm培养3 h。加入25 μL含有9 mM IPTG、100 μg/mL Amp的2×TY培养基，30℃、250rpm培养过夜。将100 μL浓度为50 μg/mL的抗原包被在96孔板中，以50 μg/mL的BSA作为空白对照，置于4℃过夜。将96孔板用PBS洗3次，加入2% MPBS室温封闭2 h。用PBS洗3次96孔板，将过夜的菌液离心10 min，吸取上清25 μL加入75 μL含有3% BSA的PBS，将100 μL混合液加入到96孔板中，室温孵育1 h。用PBST洗5次，每次振荡10 s。加入抗myc单克隆抗体（1:5000用2% MPBS稀释），室温轻轻摇动孵育1 h。用PBST洗5次，每次振荡10 s。加入100 μL辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体（1:10000用2% MPBS稀释），室温轻轻摇动孵育1 h。用PBST洗3次，用PBS洗1次。加入50 μL TMB溶液显色，用等体积的1 M H2SO4 终止反应。波长450 nm和650 nm测定吸光度，数值=OD450 nm-OD650 nm，BSA作为空白对照。
以Siglec-15为抗原，ELISA检测从人源噬菌体纳米抗体库筛选获得的纳米抗体与Siglec-15的结合情况如附图1所示，其中，30个克隆进行ELISA检测，共有4个阳性克隆可以与Siglec-15特异性结合。
实施例3
该实施例提供了一种抗Siglec-15的纳米抗体的酵母表达和纯化方法，其包括以下步骤：
S1、将3个阳性克隆进行测序分析，并克隆至pPICzα A酵母表达质粒，并转化到毕赤酵母GS115进行可溶性表达。核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID：NO.7 和SEQ ID：NO.8；SEQ ID NO.12 和SEQ ID：NO.13；SEQ ID：NO.17 和SEQ ID：NO.18；NO.22 和SEQ ID：NO.23。
S2、分别提取PIT2-Siglec-15-VH重组质粒和pPICZα A质粒，以PIT2-Siglec-15-VH为模板PCR，进行目的片段VH的扩增，使用限制性内切酶进行双酶切，胶回收目的片段和酶切载体后，使用T4 DNA连接酶连接目的基因片段和载体。乙醇沉淀DNA；将5-20 µg的DNA线性化电转化至毕赤酵母GS115。选择转化子进行基因测序，挑取阳性克隆培养，每24 h向培养基中加入甲醇诱导蛋白分泌表达。将诱导后的菌液12000 g离心取上清，使用镍柱亲和层析纯化VH-myc-6×HIS重组蛋白；其中，核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID：NO.7和SEQID：NO.8表达的纳米抗体（重组蛋白）记为抗Siglec-15的纳米抗体VH-1；核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID：NO.12和SEQ ID：NO.13表达的纳米抗体（重组蛋白）记为抗Siglec-15的纳米抗体VH-2；核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID：NO.17和SEQ ID：NO.18表达的纳米抗体（重组蛋白）记为抗Siglec-15的纳米抗体VH-3；核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID：NO.22和SEQ ID：NO.23表达的纳米抗体（重组蛋白）记为抗Siglec-15的纳米抗体VH-4。
其中，表达的Siglec-15的纳米抗体，经镍柱树脂凝胶亲和层析纯化后的SDS-PAGE的电泳图如图2所示。图2所示从左到右的条带分别是：第一泳道（即M泳道）为标准蛋白分子，第2-5泳道（即1，2，3, 4泳道）为250mmol 咪唑的洗脱液洗脱的蛋白样品；结果显示，纳米抗体经过该纯化后，其纯度可达到95％以上。得到的纳米抗体产品真空冷冻干燥后，可以分装保存。
实施例4
该实施例提供了一种上述抗Siglec-15的纳米抗体检测特异性分析方法，其包以下步骤：
S1、将Siglec-15包被在酶标板上，同时做空白孔对照，和BSA阴性对照孔，各包被三个孔，将上述抗Siglec-15的纳米抗体VH-1、VH-2、VH-3、VH-4及阴性对照抗体分别转移到Siglec-15抗原包被的ELISA板中，在室温孵育1小时。
S2、用PBST洗涤，加入一抗mouse anti-myc tag antibody，在室温孵育1小时。
S3、用PBST洗涤，加入抗小鼠二抗anti-mouse alkaline phosphataseconjugate，在室温下放置1小时。
S4、用PBST洗涤，加入碱性磷酸酶显色液，于ELISA仪上，在405nm波长，读取吸收值。结果如图3所示，其中，上述抗Siglec-15的纳米抗体VH-1、VH-2、VH-3、VH-4均能特异性的识别Siglec-15蛋白。
实施例5
该实施例提供了一种上述纳米抗体的抗肿瘤活性分析方法，其包括：
淋巴瘤肿瘤模型
取20只C57BL/6N小鼠随机分成两组，每组10只。用无血清培养基吹打表达鸡蛋卵清蛋白(OVA)的EL4淋巴瘤肿瘤细胞EG7，沉淀至3×106个细胞/mL，接种体积为0.1ml，即每只小鼠接种量为3×105个肿瘤细胞。种植部位选择小鼠右腹侧。接种第8天开始给予对照组小鼠250μg纯化的无内毒素的纳米抗体对照物（阴性对照组），抗体治疗组小鼠给予250μg纯化的无内毒素的抗Siglec-15的纳米抗体VH-4，每四天一次，总共给予四次，肿瘤大小测量为5天1次，游标卡尺测量肿瘤最长和最短部位。V=0.5×长度×宽度2。结果如图4所示，抗Siglec-15的纳米抗体VH-4可以有效抑制肿瘤生长。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 沈阳荣欣生物制药科技有限公司
<120> 纳米抗体及其编码基因、表达载体、宿主细胞和应用
<141> 2021-01-15
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3150
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
ncstngrtca ncatggccca ggtgcagctg ttggagtctg ggggaggctt ggtacagcct 60
ggggggtccr tcancatggg ctgggtccgc caggctccag ggaagggtct agagtgggta 120
tcaagcrtca nctactacgc agactccgtg aagggccggt tcaccatctc ccgtgacaat 180
tccaagaaca cgctgtatct gcaaatgaac agcctgcgtg ccgaggacac cgcggtatat 240
tattgcrtca ncggatatac gtttaccaat gagattrtca ncatttcgac gcgaagcggt 300
agcacartca ncgcgagttt gaagcgtcgg gggtggccgg tgtatcagca ccagttgtcg 360
tttrtcanca tggcccaggt gcagctgttg gagtctgggg gaggcttggt acagcctggg 420
gggtccctgc gtctctcctg tgcagcctcc ggatatacgt ttaccaatga gattatgggc 480
tgggtccgcc aggctccagg gaagggtcta gagtgggtat caaccatttc gacgcgaagc 540
ggtagcacat actacgcaga ctccgtgaag ggccggttca ccatctcccg tgacaattcc 600
aagaacacgc tgtatctgca aatgaacagc ctgcgtgccg aggacaccgc ggtatattat 660
tgcgcgagtt tgaagcgtcg ggggtggccg gtgtatcagc accagttgtc gttttggggt 720
cagggaaccc tggtcaccgt crtcanctan anryyyanry yrrgrysaar yyrhrhhrsn 780
tyrargnary ysyrarhrrh rrgryrhryr yrasraysyr ghhrrrgssn ryssnhryrn 840
tsnrrgashr aayryrysar ysrgrgyrra yrnsnrhrtc ancggagata ggtttagcaa 900
taacattrtc ancattagga agggtagcgg tagcacartc ancgcgggtt cggtgtttgg 960
ttcggggatt ttgagtgtga ctcccacggc ggtgtcgttt rtcancatgg cccaggtgca 1020
gctgttggag tctgggggag gcttggtaca gcctgggggg tccctgcgtc tctcctgtgc 1080
agcctccgga gataggttta gcaataacat tatgggctgg gtccgccagg ctccagggaa 1140
gggtctagag tgggtatcaa gcattaggaa gggtagcggt agcacatact acgcagactc 1200
cgtgaagggc cggttcacca tctcccgtga caattccaag aacacgctgt atctgcaaat 1260
gaacagcctg cgtgccgagg acaccgcggt atattattgc gcgggttcgg tgtttggttc 1320
ggggattttg agtgtgactc ccacggcggt gtcgttttgg ggtcagggaa ccctggtcac 1380
cgtcrtcanc tananryyya nryyrrgrys aarysrghrs nsntyrargn aryysyrarr 1440
rgysyryrhr yryrasrays yrghhrrrgs snryssnhry rntsnrrgas hraayryrys 1500
ayrahyryra hrrhraarhr tcancggatt tagggttagc gataacactr tcancattca 1560
tacgaatggc ggtagcacar tcancgcggg tacggattcg ctggatattc atcgtttttt 1620
gtcgtggaat gcgccggagc acctcgcgtt trtcancatg gcccaggtgc agctgttgga 1680
gtctggggga ggcttggtac agcctggggg gtccctgcgt ctctcctgtg cagcctccgg 1740
atttagggtt agcgataaca ctatgggctg ggtccgccag gctccaggga agggtctaga 1800
gtgggtatca agcattcata cgaatggcgg tagcacatac tacgcagact ccgtgaaggg 1860
ccggttcacc atctcccgtg acaattccaa gaacacgctg tatctgcaaa tgaacagcct 1920
gcgtgccgag gacaccgcgg tatattattg cgcgggtacg gattcgctgg atattcatcg 1980
ttttttgtcg tggaatgcgc cggagcacct cgcgttttgg ggtcagggaa ccctggtcac 2040
cgtcrtcanc tananryyya nryyrrgrys aaryhrgars snhrtyrarg naryysyrar 2100
rshrsnyyrh ryryrasray syrghhrrrg ssnryssnhr yrntsnrrga shraayryry 2160
sayhrsrssr ghrrsnarsa hrtcancgga tttaagttta tcaatgagac trtcancatt 2220
atggacgcaa acggtagcac artcancgcg actgatatgg atcgttttga gcttgtgatg 2280
agtcagtcgg cggcgttcga ctctrtcanc atggcccagg tgcagctgtt ggagtctggg 2340
ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg cgtctctcct gtgcagcctc cggatttaag 2400
tttatcaatg agactatggg ctgggtccgc caggctccag ggaagggtct agagtgggta 2460
tcaaccatta tggacgcaaa cggtagcaca tactacgcag actccgtgaa gggccggttc 2520
accatctccc gtgacaattc caagaacacg ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgcc 2580
gaggacaccg cggtatatta ttgcgcgact gatatggatc gttttgagct tgtgatgagt 2640
cagtcggcgg cgttcgactc ttggggtcag ggaaccctgg tcaccgtcrt canctananr 2700
yyyanryyrr grysaaryhy shsnhrtyra rgnaryysyr arhrtsasny rhryryrasr 2760
aysyrghhrr rgssnryssn hryrntsnrr gashraayry rysahrstsr ghatrnraah 2820
srrtcancta nanryyyanr yyrrtcanct yrargnaryy syrarrrtca ncyryrasra 2880
ysyrghhrrr gssnryssnh ryrntsnrrg ashraayryr ysrtcancyy rhrhhrsnrt 2940
cancrhrrgr yrhrrtcanc arysrgrgyr rayrnsnrhr tcancysrgh rsnsnrtcan 3000
crgysyryrh rrtcancayr ahyryrahrr hraarhrtca ncyhrgarss nhrrtcancs 3060
hrsnyyrhrr tcancayhrs rssrghrrsn arsahrtcan cyhyshsnhr rtcanctsas 3120
nyrhrrtcan cahrstsrgh atrnraahsr 3150

Claims (6)

1.纳米抗体，包括三个重链CDR，其特征在于，为针对Siglec-15胞外特定区域的纳米抗体，其包括至少一种氨基酸序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.23所示的纳米抗体。
2.如权利要求1所述的纳米抗体的编码基因，其特征在于，包括以下任一种的编码基因：
氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的纳米抗体的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示的纳米抗体的编码基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示；
氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示的纳米抗体的编码基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.17所示；
氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示的纳米抗体的编码基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.22所示。
3.包含如权利要求2所述编码基因的表达载体。
4.包含如权利要求3所述表达载体的宿主细胞。
5.如权利要求1所述的纳米抗体在制备Siglec-15治疗性抗体药物，或检测Siglec-15的试剂和/或试剂盒中的应用。
6.如权利要求1所述的纳米抗体在制备抗肿瘤抗体药物中的应用。
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