CN114369163B - 与人血小板衍生生长因子受体β结合的羊驼源纳米抗体 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了7种靶向人PDGFRβ的纳米抗体、编码所述纳米抗体的核酸、包含所述核酸的表达载体、包含所述表达载体的宿主细胞、包含所述纳米抗体的药物组合物、以及所述纳米抗体的用途。
Description
技术领域
本发明属于抗体制备技术领域，更具体而言，涉及用噬菌体展示技术制备靶向人血小板衍生生长因子受体β(PDGFRβ)的纳米抗体以及其应用。
背景技术
PDGFRβ是一种位于细胞表面的酪氨酸激酶受体，在成纤维细胞、血管周细胞和神经胶质细胞等间质细胞中表达。它对应的配体是PDGF-BB和PDGF-DD。下游通路包括STAT通路、MAPK通路、PI3K通路以及PLCγ通路，可以促进细胞增殖、分化、存活以及迁移。
然而，PDGFRβ的异常活化与肿瘤的发生发展相关。一方面，它的异常活化可以促进肿瘤血管生长。肿瘤组织通过PDGF-BB/PDGFRβ通路招募血管周细胞。在三阴性乳腺癌中，PDGF-BB/PDGFRβ通路促进间质细胞转变为内皮细胞，形成肿瘤血管生成拟态，另外有研究表明也可促进对抗肿瘤血管生长的VEGF疗法产生抗性。另一方面，这个通路异常活化可以促进肿瘤的生长和转移。PDGFRβ主要在肿瘤的干细胞，间质细胞以及低分化细胞中表达。参与一些具有高复发性，对治疗易产生抗性的肿瘤的形成，比如神经胶质母细胞瘤，另外有研究表明PDGFRβ通路促进乳腺癌细胞向脑部的转移。此外，PDGFRβ的过度活化与肝脏和骨髓等器官的纤维化相关，对PDGFRβ的抑制可能作为抗纤维化的一种策略。
纳米抗体起源于羊驼以及鲨鱼，它们体内可以产生一种只有重链，没有轻链的单链抗体。克隆这类抗体的重链可变区，即获得大小只有13kDa左右的纳米抗体。纳米抗体体积和质量较小，结构灵活度更高，对人的免疫原性弱。并且吸收性好，可以穿透血脑屏障抵达大脑。还具有原核或真核系统中高表达，以及特异性强，亲和力高的优点。
目前靶向PDGFRβ的治疗策略包括靶向PDGF的抗体或适配体，靶向PDGFRβ胞外段的抗体以及非特异性的酪氨酸激酶小分子抑制药物。但是目前还没有靶向PDGFRβ羊驼源纳米抗体的相关报导。
发明内容
本申请的发明人用抗原蛋白PDGFRβ对羊驼进行三次免疫，然后分离出外周血淋巴细胞，提取总RNA，将RNA反转为cDNA，再用引物扩增出纳米抗体VHH序列。之后用噬菌体展示的方法筛选能够和PDGFRβ特异性结合的纳米抗体，并用哺乳细胞表达，纯化获得纳米抗体。最终选定11C、6A、9H、6C、E4、E2和G6这7种纳米抗体进行下一步的实验，其氨基酸序列如下：
11C的氨基酸序列：
QLQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGGTFVTYTMTWFRQTPGKGREFVAGMRRNSGYTTYPNSVKGRFTISGDNAKNTVYLQMNGLKPQDTANYYCAATPSYGLSLSTDDYGIWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1)
VHH序列包含三个变化较高的区域，它们是与抗原作用的区域，称为抗原互补决定区。非CDR区域的序列相对保守，称为框架区。11C纳米抗体的抗原互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为GGTFVTYTM(SEQ ID NO:8)、EFVAGMRRNSGYTT(SEQ ID NO:9)、和TPSYGLSLSTDDYGI(SEQ ID NO:10)，如用下划线标出。11C的编码核酸序列为SEQ ID NO:29。
6A的氨基酸序列：
QLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCEASGRTRSRYGMVWFRQVPGKEREFVAGITWSGGSTIYADSVKGRFNIFRDNFKNAVYLQMNSLKPEDTALYYCAANTRTWAIVRGIGEYDLWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:2)
6A纳米抗体的抗原互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为GRTRSRYGM(SEQ ID NO:11)、EFVAGITWSGGSTI(SEQ ID NO:12)、和NTRTWAIVRGIGEYDL(SEQ ID NO:13)，如用下划线标出。6A的编码核酸序列为SEQ ID NO:30。
9H的氨基酸序列：
QLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYNMGWFRQVPGKERVFVAAITESGGFTVYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGDRPLIRLKTSYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:3)。
9H纳米抗体的抗原互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为GRTFSSYNM(SEQ ID NO:14)、VFVAAITESGGFTV(SEQ ID NO:15)、和GDRPLIRLKTSYDY(SEQ ID NO:16)，如用下划线标出。9H的编码核酸序列为SEQ ID NO:31。
6C的氨基酸序列：
QLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCEASGRTRSRYGMVWFRQVPGKEREFVAGITWSGGSTIYADSVKGRFNIFRDNFKNAVYLQMNSLKPEDTALYYCAANTRTWAIVRGIGEYDLWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:4)。
6C纳米抗体的抗原互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为GRTRSRYGM(SEQ ID NO:17)、EFVAGITWSGGSTI(SEQ ID NO:18)、和NTRTWAIVRGIGEYDL(SEQ ID NO:19)，如用下划线标出。6C的编码核酸序列为SEQ ID NO:32。
E4的氨基酸序列：
QVQLVESGGGLVRPGGSRRLSCAASGSILNINNMGWYRRAPGKQRELVATITPGGITNYADAAKGRFTISGDSANNTVFLEMNSLKPEDTAVYYCNLVGGGPRYYHEYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:5)。
E4纳米抗体的抗原互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为GSILNINNM(SEQ ID NO:20)、ELVATITPGGITN(SEQ ID NO:21)、和VGGGPRYYHEY(SEQ ID NO:22)，如用下划线标出。E4的DNA序列为SEQ ID NO:33。
E2的氨基酸序列：
QLQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSTYPMVWLRQAPGKGVEYVSGISADGDSTTYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNNLQPEDTAVYYCRNRITGTQGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:6)。
E2纳米抗体的抗原互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为GFTLSTYPM(SEQ ID NO:23)、EYVSGISADGDSTT(SEQ ID NO:24)、和NRITGT(SEQ ID NO:25)，如用下划线标出。E2的DNA序列为SEQ ID NO:34。
G6的氨基酸序列：
QLQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGNIVSLNVMGWYRQAPGKQRELVATIISDSDSFTHYADAVKGRFTISRDNAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYCYVDELPPRAGRSWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:7)。
G6纳米抗体的抗原互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为GNIVSLNVM(SEQ ID NO:26)、ELVATIISDSDSFTH(SEQ ID NO:27)、和VDELPPRAGRS(SEQ ID NO:28)，如用下划线标出。G6的DNA序列为SEQ ID NO:35。
这7种纳米抗体具有不同的抗原互补决定区。EC50的数值显示，它们与PDGFRβ结合亲和力较高。能够应用于PDGFRβ的检测，并且具有治疗PDGFRβ过表达相关疾病的潜能。
具体而言，本发明提供了以下技术方案来解决本领域的技术问题。
1.一种靶向人PDGFRβ的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，
(1)CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:8，CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:9，CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:10，或者
(2)CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:11，CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:12，CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:13，或者
(3)CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:14，CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:15，CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:16，或者
(4)CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:17，CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:18，CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:19，或者
(5)CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:20，CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:21，CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:22，或者
(6)CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:23，CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:24，CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:25，或者
(7)CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:26，CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:27，CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:28。
2.根据实施方案1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体具有如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:7任一项所示的氨基酸序列。
3.编码实施方案1-2任一项所述纳米抗体的核酸，其具有SEQ ID NO:29至SEQ IDNO:35任一项所示的核苷酸序列。
4.一种融合蛋白，其由实施方案1-2任一项所述纳米抗体在C端连接到IgG的Fc结构域，优选人源IgG1 Fc结构域构成。
5.实施方案4所述的融合蛋白，其中所述人源IgG1 Fc结构域的氨基酸序列为SEQID NO:37。
6.一种核酸，其编码实施方案4-5任一项所述的融合蛋白。
7.实施方案7所述的核酸，其中编码所述人源IgG1 Fc结构域的核苷酸序列包含SEQ ID NO:36或由其组成。
8.—种包含实施方案3、6或7所述核酸的真核表达载体。
9.—种包含实施方案8所述表达载体的宿主细胞，优选哺乳动物细胞HEK293 F。
10.实施方案1-2任一所述的纳米抗体、实施方案4或5所述的融合蛋白在制备治疗和PDGFRβ过度活化相关的疾病如肿瘤和器官纤维化的药物中的用途。
11.一种药物组合物，其包含实施方案1-2任一项的纳米抗体或实施方案4或5所述的融合蛋白和药学上可接受的载体。
本发明具有以下有益效果：
本发明制备的抗体为纳米抗体，具有一系列优势。其体积和质量较小，结构灵活度更高，对人的免疫原性弱。并且纳米抗体吸收性好，可以穿透血脑屏障抵达大脑，特异性强，亲和力高。还具有原核或真核系统中高表达，易于改造，生产成本低且性质稳定的优点。
本发明制备的7种纳米抗体6A-Fc，6C-Fc，9H-Fc，11C-Fc，E2-Fc，E4-Fc和G6-Fc的EC50分别为：0.6331nM，0.06891nM，0.05767nM，0.1008nM，0.2444nM，0.04438nM和0.4098nM，亲和力较好。经分子筛验证，除6A外，其余六种纳米抗体在与受体PDGFRβ形成抗原抗体复合物后分子筛鉴定有前移。SPR实验结果显示6A-Fc和6C-Fc与PDGFRβ结合的解离常数分别为5.30×10-10nM，1.728×10-10nM，表明亲和力良好。
附图说明
图1PDGFRβ纯化的蛋白峰图。
图2.PDGFRβ的SDS-PAGE图。
图3.单克隆噬菌体ELISA筛选PDGFRβ纳米抗体阳性克隆。
图4.PDGFRβ纳米抗体的SDS-PAGE图。
图5.PDGFRβ与纳米抗体EC50的检测。
图6.PDGFRβ与抗体过分子筛。
图7.PDGFRβ与抗体的SPR结果。
图8.羊驼纳米抗体结构与传统抗体结构示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
实施例1 PDGFRβ蛋白的表达和纯化
本实例提供了抗原蛋白的表达和纯化方法。具体步骤如下：
抗原的分子克隆:设计引物，在人源的cDNA文库中，扩增出PDGFRβN端三个免疫球蛋白样结构域的基因片段(NP_002600.1：33-314aa)。将PDGFRβ基因序列插入到PTT5载体(SalI-XbaI-TEV-Fc-stop)的SalI和XbaI位点之间。
抗原的真核表达和纯化：利用转染试剂PEI(BIOHUB，49553-93-7)将质粒转染到悬浮培养的哺乳动物细胞HEK293 F(ATCC，CBP60437)中。转染体系(300mL HEK293 F)如下：
| PEI | 1.2mL |
| 质粒 | 0.3mg |
| DMEM | 30mL |
转染前，将DMEM(购买自biosharp)放置到37℃水浴锅中。转染时，先用两根50mL离心管分别装15mL的DMEM，一管加入PEI，另一管加入质粒，混匀。将两管混合到一起，静置20分钟后，转移到300mL的细胞中，再次静置20分钟。
转染后的细胞培养3天后，5000rpm，15分钟离心，收集上清。上清需要过0.22μm的滤膜，防止没有完全离心下来的细胞堵塞纯化柱。在蠕动泵上上样，利用Protein A柱子(Thermo Scientific，蛋白A亲和填料)纯化蛋白。Protein A能够特异性地和蛋白上连接的Fc(其氨基酸序列为SEQ ID NO:37所示)结合，从而将上清中的目的蛋白富集到柱子上。上样结束后，在AKTA Prime Plus纯化系统上洗脱蛋白，蛋白收集管中加入约0.2M的Tris-HCl7.5，从0％B液到100％B液梯度洗脱蛋白。其中洗脱所用的A液是PBS，B液是0.1M乙酸溶液，PBS的配方见下表。蛋白纯化的峰图见附图1，收集峰对应的蛋白。
采用TEV酶，过夜切掉Fc。随后将酶切产物分别流过Protein A柱子和镍柱(ThermoScientific的Ni-NTA Resin填料，88222)，从而分别除去未酶切完全的蛋白、Fc和TEV酶。收集流穿，浓缩后进行SDS-PAGE电泳，结果如图2所示。从流穿中，我们获得了高纯度的PDGFRβ蛋白。
实施例2噬菌体展示纳米抗体文库的构建
1)取0.2mg抗原(实施例1制备的PDGFRβ蛋白)与弗氏佐剂混合后，对羊驼进行皮下注射，之后每隔两周免疫一次，共免疫三次。
2)第三次免疫后，静脉抽取羊驼血，分离血液中的白细胞，采用omegabiotek公司的RNA抽提试剂盒提取总R N A，同时采用DNA酶除去基因组DNA。采用TARKARA公司的PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，根据试剂盒中的使用说明书对RNA进行反转录，将RNA反转录为cDNA。
3)在VHH的框架区设计VHH特异性引物，，用以上cDNA为模板扩增获得VHH的编码基因片段，将扩增的VHH序列克隆至噬菌粒pR2(实验室自备)的NcoI和NotI位点中，得到的连接产物即为初始纳米抗体噬菌粒文库。
VHH引物序列：
上游引物：
GCTGCACAGCCTGCTATGGCACAGKTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGG(SEQ ID NO:38)
下游引物：
1：GAGTTTTTGTTCGGCTGCTGCGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG(SEQ ID NO:39)
2：GAGTTTTTGTTCGGCTGCTGCTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG(SEQ ID NO:40)。
4)电转化：10％甘油洗涤法制备大肠杆菌TG1感受态细胞，将连接产物和500μL的感受态细胞混匀，用电穿孔转染(2500V，5ms)的方法将连接产物转到大肠杆菌TG1菌株感受态细胞(自备)中，加入20mL 2TY培养基(包含蛋白胨和酵母粉，均购买自OXOID)，复苏一小时。分别取0.2μL和0.02μL涂布100mm LB/100μg/mL氨苄青霉素(购买自Jason Biotech)/2％G(葡萄糖，购买自国药)平板。剩余菌液涂布150mm LB/Amp/2％G平板
2 TY培养基(1L)的组分如下表：
5)扩增纳米抗体噬菌体文库：每个150mm LB/Amp/2％G平板中加入4mL 2 TY培养基(加入了20％甘油)，用涂布棒刮板，收集到离心管中，涡旋混匀，液氮速冻后放置到-80℃保存。在250mL的2 TY培养基中(含2％葡萄糖，100μg/mL氨苄青霉素)，加入100μL文库菌液和1012pfu的辅助噬菌体KM13(购自MRC Laboratory of Molecular Biology)。37℃下振荡培养至菌液生长的对数期，静置侵染45分钟。之后取出50mL进行离心，去除上清，用100mL的2 TY重悬加入0.1％葡萄糖，100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素(购买自JasonBiotech)，25℃下180rpm培养约16h。用PEG沉淀的方法浓缩噬菌体，然后用PBS重悬，冰上保存。
实施例3淘选
1.第一轮
包被抗原：用0.1mg/mL的浓度包被PDGFRβ至免疫板(Nunc maxsorp plate)，每个孔加100μL，空白对照只加PBS，放置4℃过夜。
封闭：免疫板用PBS洗三次，每孔加入260μL的MPBS(含5％脱脂牛奶的PBS)，室温封闭2h。
孵育抗体噬菌体：用PBST(PBS+0.1％Tween 20)洗三次，每孔加入1×1011pfu的文库噬菌体，溶于5％的脱脂牛奶中，每个孔加100μL，振荡孵育1h。
消化：用PBST洗10次后，每孔加入100μL浓度为0.5mg/mL的胰蛋白酶，在摇床上室温消化1h，结合在孔中的噬菌体被洗脱。
侵染：取10μL上一步获得的噬菌体侵染1mL对数生长期TG1细菌，37℃水浴45min。分别取100μL、10μL和1μL涂布100mm LB/2％G/Amp平板计数。剩余噬菌体溶液全部侵染3mL对数生长期TG1细菌，37℃水浴45min，涂布1块150mm LB/2％G/Amp平板，37℃过夜培养。
刮板：加入4mL 2 TY(含20％甘油)至上一步涂布的150mm LB/2％G/Amp平板中，将菌落刮下，获得第一轮淘选出的菌液。
2.第二轮
(1)扩增第一轮淘选获得的噬菌体
步骤和扩增纳米抗体噬菌体文库基本一致。
(2)第二轮淘选
步骤和第一轮基本相同，但是加入的文库噬菌体的量为1×108pfu，加入文库噬菌体后，洗板子的次数改为20-30次。
包被抗原：用0.1mg/mL的浓度包被PDGFRβ至免疫板，每个孔加100μL，空白对照只加PBS，放置4℃过夜。
封闭：免疫板用PBS洗三次，每孔加入260μL的MPBS(含5％脱脂牛奶的PBS)，室温封闭2h。
孵育抗体噬菌体：用PBST(PBS+0.1％Tween 20)洗三次，每孔加入1×108pfu(1)中制备的噬菌体，溶于5％的脱脂牛奶中，振荡孵育1h。
消化：用PBST洗20-30次后，每孔加入100μL浓度为0.5mg/mL的胰蛋白酶，在摇床上室温消化1h，结合在孔中的噬菌体被洗脱。
侵染：取10μL胰酶消化获得的噬菌体侵染1mL对数生长期TG1细菌，37℃水浴45min。分别取100μL、10μL和1μL涂布100mm LB/2％G/Amp平板计数，37℃过夜培养。
实施例4单克隆噬菌体ELISA筛选阳性克隆
1.制备单克隆噬菌体
(1)在第二轮淘选后涂布的100mm LB/2％G/Amp平板上挑单克隆至96孔细胞培养板(含100μL 2 TY/2％G/Amp)，37℃、250rpm培养4-5h。
(2)另取一块96孔细胞培养板(含200μL 2 TY/2％G/Amp/KM13)，取5μL上一步菌液接种到对应的孔中，37℃、250rpm培养1.5h后，静置侵染45min。采用排枪混匀并吸走150μL菌液，剩余菌液3000rpm离心30min，甩掉上清。每孔加入200μL 2 TY/0.1％G/Amp/Kan重悬，25℃、250rpm培养16h后，3000rpm离心30min，4℃储存备用。
2.包被抗原
取抗原0.2μg/孔(总体积为100μL，溶于PBS中)，另外设一组空白对照(只加PBS)，分别加入96孔免疫板中。放置4℃过夜(16h)包被。
3.封闭
PBS洗3次，每孔加入260μL 5％牛奶室温放置2h，完成封闭。
4.孵育一抗
PBST洗3次，取以上1(2)的制备的60μL上清加入200μL 5％脱脂奶粉混匀后作为一抗孵育。
5.孵育二抗
PBST洗四次，采用MPBS适度稀释HRP-抗M13抗体(北京义翘神州)，分别加100μL至以上免疫板的各孔中，室温孵育1h。
6.显色
在避光条件下，每孔各加入100μL TMB显色底物(碧云天)，室温孵育8min至阳性孔蓝色较深。每孔各加入50μL 1M H2SO4终止反应，此时阳性孔呈现黄色。用酶标仪读取OD450值，结果如图2，选择OD450值大于1的克隆送通用生物公司测序。
7.测序分析
比对阳性单克隆序列，选择CDR区域序列明显不同的抗体做下一步实验，最终确定7个抗体进行下一步的实验，分别命名为6A，6C，9H，11C，E2，E4和G6。
8.制备纳米抗体
表达纯化这7个纳米抗体与Fc融合的融合蛋白，方法同实施例1，切掉Fc的纳米抗体的SDS-PAGE电泳结果如图3，其中，E4可能有部分被糖基化修饰，因此有两条带。
实施例5纳米抗体的EC50鉴定
1.包被抗原
0.2μg/孔，每孔100μL(用PBS稀释)，4℃过夜。
2.封闭
用PBS洗三次，每孔加入260μL的MPBS，室温封闭2-3h。
3.孵育一抗
用PBST洗三次，起始孔加入200nM带有Fc标签的抗体(溶于MPBS)，之后每一横排依次四倍稀释，每孔100μL，室温，振荡孵育一个小时。
4.孵育二抗
用PBST洗4次，加入HRP偶联的抗IgG1 Fc的抗体(北京义翘神州)检测与抗原结合的纳米抗体-Fc融合蛋白，室温，振荡孵育1小时。
5.显色
PBST洗四次，每孔加入100μL TMB，室温避光孵育8min后，每孔加入50μL 1M H2SO4，终止反应。
6.处理数据
利用GraphPad Prism作图软件处理数据，结果显示，6A-Fc，6C-Fc，9H-Fc，11C-Fc，E2-Fc，E4-Fc和G6-Fc的EC50分别为：0.6331nM，0.06891nM，0.05767nM，0.1008nM，0.2444nM，0.04438nM和0.4098nM。
实施例6纳米抗体与受体PDGFRβ复合物过分子筛
用PBS作为过分子筛的缓冲液。先后用水和PBS平衡24mL分子筛(Superdex75)。首先取0.1mg左右的没有Fc的纳米抗体和受体PDGFRβ各自单独过分子筛。将抗体的量固定在0.1mg左右，以抗原：抗体＝1：1.1的摩尔比将PDGFRβ分别与不带Fc的6A，6C，9H和11C四种纳米抗体孵育30分钟以上。如果纳米抗体和受体PDGFRβ形成了复合物，那么分子筛的第一个峰对应的是复合物，第二个峰对应剩余的抗体。并且和受体单独过分子筛的结果相比，第一个峰会出现轻微的前移。第二个峰的峰高明显降低或者消失。结果显示：这四种纳米抗体中，6C，9H和11C能够和PDGFRβ在溶液状态下形成抗原抗体复合物。
实施例7纳米抗体与受体PDGFRβ的亲和力验证-SPR实验
抗体9H，11C，E4，G6和E2与PDGFRβ结合的表位对再生液不耐受，不能通过SPR的方法验证亲和力。而6A与6C与PDGFRβ结合的表位对再生液耐受，因此选择带着Fc标签的6A与6C抗体进行亲和力检测，实验仪器为Biacore T200。将PDGFRβ偶联到芯片上，纳米抗体为流动相，检测纳米抗体与PDGFRβ结合和解离的动态过程。实验条件如下：
实验结果显示6A-Fc和PDGFRβ的解离常数为0.53nM，6C-Fc和PDGFRβ的解离常数为0.1728nM。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (14)
1.一种靶向人PDGFRβ的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，
CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:8，CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:9，CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:10。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
3.编码权利要求1-2任一项所述纳米抗体的核酸，其具有SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列。
4.一种融合蛋白，其由权利要求1-2任一项所述纳米抗体在C端连接到IgG的Fc结构域构成。
5.权利要求4所述的融合蛋白，其中所述Fc结构域为人源IgG1 Fc结构域。
6.权利要求5所述的融合蛋白，其中所述人源IgG1 Fc结构域的氨基酸序列为SEQ IDNO:37。
7.一种核酸，其编码权利要求4-6任一项所述的融合蛋白。
8.权利要求7所述的核酸，其中编码所述人源IgG1 Fc结构域的核苷酸序列包含SEQ IDNO:36或由其组成。
9.一种包含权利要求3、7或6所述核酸的真核表达载体。
10.一种包含权利要求9所述表达载体的宿主细胞。
11.权利要求10所述的宿主细胞，其为哺乳动物细胞HEK293 F。
12.权利要求1-2任一所述的纳米抗体、权利要求4-6任一项所述的融合蛋白在制备治疗和PDGFRβ过度活化相关的疾病的药物中的用途。
13.权利要求12所述的用途，其中所述疾病为肿瘤或器官纤维化。
14.一种药物组合物，其包含权利要求1-2任一项的纳米抗体或权利要求4-6任一项所述的融合蛋白和药学上可接受的载体。
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