CN113416248A - 一种纳米抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纳米抗体及其应用，所述纳米抗体具有如SEQ ID NO.1～3所示的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列。本发明同时提供了编码所述单克隆抗体的核酸分子、含有所述核酸分子的表达载体和宿主细胞。本发明的纳米抗体具有较高的结合活性以及中和活性。

Description

一种纳米抗体及其应用
技术领域
本发明属于细胞免疫学、基因工程领域，涉及一种纳米抗体及其应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是一种革兰阳性细菌，主要起源于环境和食物，可引发多种感染，例如脓疱病、中毒性休克综合症、肺炎、化脓性关节炎、心内膜炎和自身免疫性疾病(如红斑狼疮)(F.D.Lowy.Staphylococcus aureusinfections.N.Engl.J.Med.,1998,339(8):520-532.)。金黄色葡萄球菌特别是耐药菌株在医院感染的高发病率和高死亡率，给全世界的医疗保健造成了巨大负担。尽管引入了针对金黄色葡萄球菌的新抗生素，但耐药性的快速出现表明仍需要开发对细菌的进化适应不施加选择性压力的新型治疗方法来对抗金葡菌感染相关疾病。
金黄色葡萄球菌能够表达广泛的毒力因子，从而逃避宿主免疫反应，并引发多种疾病。金黄色葡萄球菌感染的发病机理取决于生产的表面蛋白能够调节细菌黏附于宿主组织，分泌的一系列细胞外毒素和酶能够破坏宿主细胞和组织，避开宿主的免疫防御，使细菌在宿主细胞中生长和扩散(M.E.Powers,J.Bubeck Wardenburg.Igniting the fire:Staphylococcus aureus virulence factors in the pathogenesis of sepsis.PLoSPathog.,2014,10(2):e1003871.)。外毒素是金黄色葡萄球菌在指数后期和早期静止期分泌到细胞外基质中的蛋白质，它们能参与组织渗透，使细菌入侵宿主，还能溶解细胞作用，从中获取必要的营养物质帮助细菌生长。金黄色葡萄球菌分泌的常见外毒素包括溶血素、白斑毒素、去角质毒素、肠毒素(Staphylococcal enterotoxin,SE)和中毒性休克综合征毒素-1(Toxic shock syndrome toxin-1，TSST-1)(C.Kong,H.Neoh,S.Nathan.TargetingStaphylococcus aureus Toxins:A Potential form of Anti-VirulenceTherapy.Toxins(Basel),2016,8(3).)。
SE可引起呕吐和腹泻，是食源性疾病的最常见原因之一。SE根据抗原异质性进行分型，目前已鉴定的SE有20多种(N.Balaban,A.Rasooly.Staphylococcalenterotoxins.Int.J.Food Microbiol.,2000,61(1):1-10.)。SE是启动T细胞活化和增殖的超抗原，其中葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcal enterotoxin B,SEB)是研究最深多的SE之一，被美国疾病控制和预防中心列为B级生物战剂，使其成为开发抗毒素中和抗体的潜在靶标。SEB直接与抗原呈递细胞表面的主要组织相容性复合物II类分子(MHC II)和T细胞受体(TCR)特定Vβ区结合，导致单核/巨噬细胞和T淋巴细胞均过度活化。活化的宿主细胞会产生大量促炎性细胞因子和趋化因子，从而激活炎症和凝血反应，导致发热、低血压和休克等临床症状。
针对SEB目前没有批准的疫苗或者特定的药物治疗，目前的研究提出了多种治疗方法，包括小分子治疗剂，针对SEB的疫苗，以及SEB靶向单克隆抗体。基于抗体药物为核心的被动免疫治疗MRSA感染具有巨大的发展应用前景，将可成为“非抗生素”治疗MRSA感染和控制耐药性发展新的免疫防治手段。
纳米抗体(nanobody,Nbs)是一种重组抗体片段，大小约为15kDa，发现于骆驼、羊驼等驼科体内，是驼科中的重链抗体的可变区，又称为单域抗体(variable domain ofheavy chain of heavy-chain antibody，VHH)，其仅由两条H链组成，缺失L链。Nbs具有良好的生物和理化性质，其体积小、结构简单、易于表达、耐热、特异性强。随着人们对纳米抗体的不断深入探索，其在生物技术和安全检测、临床治疗等各领域得到广泛应用。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种纳米抗体，所述纳米抗体具有较高的亲和活性与结合活性，能够有效的防治金黄色葡萄球菌的感染，
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种抗肠毒素的纳米抗体，所述纳米抗体的重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、2、3所示。
进一步，所述重链可变区还包括框架区FR，其中所述框架区的FR1、FR2、FR3和FR4序列分别如SEQ ID NO：4、5、6、7所示。
进一步，所述纳米抗体的重链可变区的氨基酸序列具有与SEQ ID NO：8至少90％，优选95％序列同一性的氨基酸序列。
进一步，所述纳米抗体包含抗体重链恒定区的全部或者部分。
本发明的第二方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码本发明第一方面所述的纳米抗体的核苷酸序列。本发明的核酸分子可以例如通过标准化学合成方法和/或重组方法合成，或半合成地产生，例如通过组合化学合成和重组方法。编码序列与转录调控元件和/或与其他氨基酸编码序列的连接可以使用已确立的方法进行，例如限制酶切消化、连接和分子克隆。
在本发明中，编码CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：9、10、11至少90％，优选95％序列的同一性的核苷酸序列。
进一步，编码框架区FR1、FR2、FR3、FR4的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：12、13、14、15至少90％，优选95％序列的同一性的核苷酸序列。
进一步，编码纳米抗体重链可变区的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：16至少90％，优选95％序列的同一性的核苷酸序列。
本发明的第三方面提供了一种载体，所述载体包含本发明第二方面所述的核酸分子。
本发明的第四方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明第二方面所述的核酸分子，或包含本发明第三方面所述的载体。
本发明的第五方面提供了一种产生抗肠毒素纳米抗体的方法，所述方法包括步骤：
在适合产生纳米抗体的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而获得含所述抗肠毒素纳米抗体的培养物；以及
从所述培养物中分离或回收所述的抗肠毒素纳米抗体。
本发明的第六方面提供了一种药物偶联物，所述偶联物含有：
本发明第一方面所述的纳米抗体，以及
选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子或酶。
本发明的第七方面提供了一种组合物，所述组合物包含：
本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的宿主细胞或本发明第六方面所述的药物偶联物。
本发明的第八方面提供了一种纳米抗体噬菌体文库的构建方法，包括
1)从免疫羊驼的外周血淋巴细胞中提取总RNA，并反转录成cDNA；
2)以cDNA为模板扩增纳米抗体基因，将其与载体连接构建噬菌体文库。
进一步，免疫羊驼的方法为：将抗原与CFA等体积混匀后皮下注射；三周后将抗原与IFA等体积混匀后进行第二次皮下注射；接下来每两周将抗原与IFA等体积混匀后进行皮下注射，共两次。
进一步，所述抗原为肠毒素抗原。
进一步，所述载体为pComb3XSS。
进一步，所述方法还包括噬菌体文库的包装。
本发明的第九方面提供了一种本发明第八方面所述的方法构建的纳米抗体噬菌体库。
本发明的第十方面提供了如下任一项所述的应用：
1)本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的宿主细胞在制备检测金黄色葡萄球菌或者金黄色葡萄球菌感染肠毒素的产品中的应用；
2)本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的宿主细胞或本发明第六方面所述的药物偶联物在制备治疗、预防金黄色葡萄球菌感染及相关疾病的药物中的应用；
3)本发明第九方面所述的纳米抗体噬菌体文库在筛选特异性结合肠毒素的纳米抗体中的应用；
4)本发明第九方面所述的纳米抗体噬菌体文库在筛选治疗治疗、预防金黄色葡萄球菌感染及相关疾病的药物中的应用。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供了一种抗肠毒素的纳米抗体，所述抗体体积小、结构简单、易于表达、耐热、特异性强，具有较高的结合活性和中和活性。
附图说明
图1凝胶电泳检测RNA纯度图；
图2不同cDNA浓度电泳图；
图3是VHH一轮扩增电泳图；
图4是VHH二轮扩增电泳图；
图5是插入率检测图。
具体实施方式
本发明通过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，成功获得一组纳米抗体。具体地，本发明利用金黄色葡萄球菌抗原蛋白免疫骆驼，获得高质量的免疫纳米抗体基因文库。然后将抗原分子偶联在酶标板上，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，从而获得了肠毒素特异性的纳米抗体基因。实验结果表明，本发明获得纳米抗体能够有效地与抗原结合。在此基础上完成了本发明。
在本发明中，术语“本发明纳米抗体”、“本发明的抗肠毒素抗原纳米抗体”、可互换使用，均指特异性识别和结合于肠毒素SEB抗原的纳米抗体。特别优选的是VHH链的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的纳米抗体。
在本发明中，术语“纳米抗体(single domain antibody，sdAb，或VHH)”、“纳米抗体”(nanobody)具有相同的含义，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体(VHH)。纳米抗体/单域抗体(Nanobody)作为一种新型的小分子抗体片段，由驼类天然的重链抗体重链可变区(VHH)克隆获得。Nanobody(Nb)具有优良的生物学特性，分子量12-15kDa，是完整抗体的十分之一，具有很好的组织穿透性，特异性高，水溶性好。
在本发明中，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明的抗体或其片段结合而形成的偶联物。本发明还包括与所述的纳米抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
在本发明中，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括三个互补决定区CDR1、CDR2、和CDR3。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合抗原的多肽，例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
在本发明中，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有肠毒素抗原结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
所述多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
可利用取代、缺失、插入或其任意组合来实现最终的衍生物或变体。通常，这些变化在几个氨基酸上进行以使分子的改变最小化，特别是抗原结合蛋白的免疫原性和特异性。然而，在某些情况下可以容忍更大的变化。氨基酸取代通常是单个碱基的；插入通常将为大约一个至大约二十个氨基酸残基的数量级，虽然可能容忍显著更大的插入。缺失的范围为大约一个至大约二十个氨基酸残基，虽然在一些情况下，缺失可以大得多。
本发明还提供了其他多肽，如包含纳米抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明纳米抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。
在本发明中，载体包括分子生物学领域的技术人员已知的许多合适的载体，其选择取决于所期望的功能。载体的非限制性实例包括质粒、黏粒、病毒、噬菌体和其他常规用于例如遗传工程的载体。本领域技术人员众所周知的方法可以用于构建各种质粒和载体。
在一个实施方案中，载体是表达载体。根据本发明的表达载体能够指导本发明的核酸分子在宿主中的复制和表达，并因此保证由此编码的本发明的抗肠毒素的可变链结构域在选择的宿主中的表达。在进一步的实施方案中，一种或多种载体包含进一步的序列以确保不仅表达本发明的所述可变链结构域，而且也表达包含本发明的所述可变链结构域的全长抗体。
表达载体可以例如是克隆载体、双元载体或整合型载体。表达包括核酸分子的转录，例如转录成可翻译的mRNA。
载体的非限制性实例包括pQE-12、pUC-系列、pBluescript(Stratagene)、pET-系列表达载体(Novagen)或pCRTOPO(Invitrogen)、λgt11、pJOE、pBBR1-MCS系列、pJB861、pBSMuL、pBC2、pUCPKS、pTACT1、pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CAT、E-027pCAG Kosak-Cherry(L45a)载体系统、pREP(Invitrogen)、pCEP4(Invitrogen)、pMC1neo(Stratagene)、pXT1(Stratagene)、pSG5(Stratagene)、EBO-pSV2neo、pBPV-1、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2-dhfr、pIZD35、Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen)、pcDNA3.1、pSPORT1(GIBCO BRL)、pGEMHE(Promega)、pLXIN、pSIR(Clontech)、pIRES-EGFP(Clontech)、pEAK-10(EdgeBiosystems)pTriEx-Hygro(Novagen)和pCINeo(Promega)。适合于巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)的质粒载体的非限制性实例包括例如质粒pAO815、pPIC9K和pPIC3.5K(全部为Invitrogen)。适合于在爪蟾属(Xenopus)胚胎、斑马鱼胚胎以及各种各样的哺乳动物和禽类细胞中表达蛋白质的另一种载体是多用途表达载体pCS2+。
通常，载体可含有一种或多种用于克隆或表达的复制起点(ori)和遗传系统、一种或多种用于在宿主中选择的标记(例如，抗生素抗性)和一种或多种表达盒。另外，可以使用已确立的方法将载体中包含的编码序列与转录调控元件和/或与其他氨基酸编码序列连接。这种调控序列是本领域技术人员众所周知的，并且包括但不限于确保转录起始的调控序列、内部核糖体进入位点(IRES)和任选的确保转录终止和转录物稳定的调控元件。确保转录起始的这种调控元件的非限制性实例包括启动子、翻译起始密码子、增强子、绝缘子和/或确保转录终止的调控元件，其包括在本发明的核酸分子的下游。进一步的例子包括Kozak序列和侧翼为用于RNA剪接的供体和受体位点的间插序列，编码分泌信号的核苷酸序列，或取决于所用的表达系统的信号序列，其能够将表达的蛋白质引导至细胞区室或培养基。载体也可含有编码一种或多种蛋白伴侣的另外的可表达多核苷酸，以促进正确的蛋白质折叠。
可以设计本发明的核酸分子和/或载体以通过例如基于化学的方法(聚乙烯亚胺、磷酸钙、脂质体，DEAE-葡聚糖、核转染、非化学方法(电穿孔、声孔效应、光转染、基因电转移、流体递或细胞与本发明的核酸分子接触时自然发生的转化)、基于粒子的方法(基因枪、磁转染、穿刺转染)、基于噬菌体载体的方法和病毒方法引入细胞。例如，衍生自诸如反转录病毒、牛痘病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、Semliki病毒或牛乳头瘤病毒的表达载体可用于将核酸分子递送至靶向的细胞群体中。另外，杆状病毒系统也可以用作本发明核酸分子的真核表达系统中的载体。
为了促进本发明的核酸分子的纯化，可将标签(tag)序列插入表达载体中。标签的实例包括(但不限于)六个组氨酸标签、myc标签或FLAG标签。可在本发明中使用本领域的技术人员已知的促进纯化的任何标签。
在本发明中，任何适当的宿主细胞/载体系统可用于编码本发明的抗体分子的DNA序列的表达。可使用细菌(例如大肠杆菌)及其它微生物系统，或还可使用真核生物(例如哺乳动物)宿主细胞表达系统。上述细胞包含(但并不限于)哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞或细菌来源的细胞。作为哺乳动物细胞，可优选使用选自(但并不限于)由CHO细胞、F2N细胞、CSO细胞、BHK细胞、Bowes黑色素瘤细胞、HeLa细胞、911细胞、AT1080细胞、A549细胞、HEK293细胞和HEK293T细胞组成的组中的一种作为宿主细胞。在本领域中可使用本领域的技术人员已知的可用作哺乳动物宿主细胞的任何细胞。
本发明公开的抗体和片段从宿主细胞以良好水平表达。因此，抗体和/或结合片段的性质适合用于商业规模的表达。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1噬菌体文库的构建
1.羊驼的免疫
免疫前取血10mL，作为阴性血清对照。将金黄色葡萄球菌B型肠毒素(SEB)抗原0.5mg与CFA等体积混匀后皮下注射进行第一次免疫；三周后，将抗原0.25mg与IFA等体积混匀后皮下注射进行第二次免疫；接下来，每两周将抗原0.25mg与IFA等体积混匀后皮下注射进行第三次次和第四次免疫；分别于每次免疫一周后采集外周血。
2.外周血淋巴细胞分离
采集肠毒素抗原免疫羊驼三次之后的50mL外周血，按照淋巴细胞分离液使用说明分离PBMC。
3.RNA提取
用RNAiso Plus试剂提取分离的PBMC的总RNA。
4.凝胶电泳检测RNA纯度
取1μg RNA电泳，检测RNA纯度。
结果如图1所示，RNA纯度良好。
5.反转录
使用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara，货号：6210A)进行反转录，共转录5μg RNA，具体步骤详见说明书。
6.巢式PCR第一轮cDNA模板浓度的摸索
将反转录得到的cDNA原液稀释5倍进行扩增，分别加入0.5μL、1μL，2.5μL，5μL进行电泳。
结果如图2所示，泳道1为0.5μL，2为1μL，3为2.5μL，4为5μL，5.0μL为最佳扩增浓度。
7.巢式PCR第一轮
构建PCR反应体系进行PCR扩增，PCR扩增产物进行凝胶电泳。
结果如图3所示，扩增产物在约1000bp和750bp处存在条带，割胶回收750b左右的VHH片段。
8.巢式PCR第二轮
将割胶回收产物进行第二轮PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。
结果如图4所示，扩增产物在约500bp处存在条带，割胶回收。使用DNA产物纯化试剂盒纯化VHH片段。
9.载体与目的片段连接
使用pComb3XSS载体构建噬菌体文库，pComb3XSS噬菌粒载体通过SfiI单酶切，50℃过夜酶切，然后回收目的片段，连接摩尔比例为Vector：VHH＝1:3。pComb3XSS载体带有His tag与HA tag方便纯化与检测。载体信息如下：
Tag：6×His；HA
Promotor:LacZ
Resistance:Amp+
Vector backbone：pComb3H
Backbone size w/o insert(bp)3300
OmpA：5＇-AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA G-3＇
g-back：5＇-GCC CCC TTATTA GCG TTT GCC ATC-3＇
10.电转化
使用电机转化，共进行了10次，电击之后立即向电击杯中加入1mL 2YT培养基(37℃预热)复苏，吸出电击产物并用2YT培养基洗净电击杯，共计获得100ml复苏产物，37℃，180rpm复苏45min，取100μL梯度稀释至10-3和10-4测定库转化子数目，涂布于90mm的平板上，其余离心，加入8mL 2YT重悬，涂布于8块200mm的平板上，第二天测定库转化子数目。
转化子数目统计显示，在稀释度为10-4的平板上共有368个克隆。
11.菌落PCR验证插入率和库多样性分析
随机从测库转化子数目滴度平板上挑取48个克隆进行鉴定，测序引物pComb3XSS-F，结果如图5所示，表明插入率为100％。
根据转化子数，库插入率和多样性测序分析结果，建库库容为3.68×109(368*1000*104*1*1)，文库库容和多样性良好。
12.噬菌体文库包装
1)将细菌文库接入2×300mL 2YT+A+G(氨苄西林Amp:100μg/ml、Glu:1％)培养基中，至其初始OD600＝0.1-0.2，37℃、230rpm培养至OD600＝0.8以上。
2)根据OD600值加入辅助噬菌体M13KO7，(辅助噬菌体：细菌＝20:1)
3)加入M13KO7后，混匀，37℃静置30min。
4)37℃，180rpm缓摇30min。
5)5000rpm离心10min，弃尽上清，用等体积2YT+A+K(Amp:100μg/ml、卡那霉素Kan:50μg/ml)培养基重悬沉淀，30℃，220rpm过夜。
6)过夜培养物4℃，10000rpm离心20min，收取上清，弃沉淀。更换离心筒，4℃，10000rpm，离心20min，收取上清。
7)按上清体积的1/5加入PEG8000/NaCl，混匀，冰浴沉淀2小时以上。
8)4℃，10000rpm，离心20min，弃上清，空离一次除尽上清。1mL 1×PBS悬起沉淀，加入1/5体积的PEG8000/NaCl二次沉淀1h。
9)4℃，12000rpm，离心10min弃上清，空离一次除尽上清。根据沉淀的量,加入1×PBS重悬沉淀。
10)加100％甘油至终浓度为50％，混匀后分装到1.5mL EP管中，-80℃保存。
11)取10μL库噬菌体用2YT梯度稀释，从10-8和10-9管中取10μL加到90μL的TG1菌液中，轻柔混匀。37℃静置15min，分别涂布Amp抗性平板，过夜培养。
12)第二天，10-9滴度平板上共有218个克隆，噬菌体文库滴度为2.18×1013cfu/mL(218*109*100)。
实施例2单克隆抗体的筛选
1、亲和淘选
1)将靶分子SEB抗原用PH值为9.6的碳酸盐缓冲液稀释至终浓度为5μg/mL，按100μL/孔加入酶标孔中，每个靶分子包被8孔(第二轮筛选包被2孔，)，4℃包被过夜；
2)弃包被液，PBS洗涤3次，每孔加入300μL 3％OVA-PBS封闭液，37℃封闭1h；
3)PBS洗涤3次，加入100μL噬菌体文库，37℃孵育1h；
4)吸出未结合的噬菌体，用PBST洗涤6次，PBS洗涤2次；
5)加入100μL Gly-HCl洗脱液，37℃孵育8min，洗脱特异性结合的噬菌体；
6)将该洗脱液转移至1.5mL无菌离心管中，迅速用10μL Tris-HCl中和缓冲液中和；
7)取10μL进行梯度稀释，测定滴度，计算淘选回收率，其余洗脱物混合后进行扩增和纯化，用于下一轮亲和淘选，每一轮淘选条件如下表。
表1亲和淘选条件
Figure BDA0003127024350000131
2、淘选后文库的构建
1)将淘选洗脱物与处于对数生长前期的E.coli 2738培养物20mL混匀，37℃，静置30min，加入1ml 20％葡萄糖，220r/min振荡培养30min后，按cell：phage＝1：20的比例加入M13K07噬菌体和4μl Amp+，37℃，静置30min后，补加20ml 2YT液体培养基，220r/min振荡培养30min；
2)将培养物分装于离心管中，4℃，5000r/min，10min，细胞沉淀以50mL 2×YT-AK液体培养基重悬，30℃，250r/min振荡培养过夜；
3)将过夜培养物4℃，10000r/min离心20min，将上清转移至新离心管，加入1/5体积的PEG-NaCl，混匀后置于4℃2h以上；
4)4℃，10000r/min，20min，去除上清，将沉淀重悬于1mL PBS中，加入1/5体积的PEG/NaCl，混匀后置于4℃1h以上；
5)4℃，12000r/min，2min，去除上清，将沉淀悬浮于200μL PBS中，即为扩增产物，测定滴度，用于下一轮淘选或者分析。
3、特异性噬菌体克隆的鉴定及分析
3.1噬菌粒的救援
1)从淘选洗脱物滴度的平板上，用灭菌牙签从第一轮滴度平板上随机挑选288个克隆接种于1mL 2×YT-A中，37℃，230r/min振荡培养8h。
2)取200μL上述培养物，按cell：phage＝1：20的比例加入M13K07噬菌体，37℃，静置15min，220r/min振荡培养45min。
3)补加800μL体积的2×YT-AK，30℃，剧烈振荡培养过夜。
4)第二天12000rpm离心2min，取上清，用于单克隆ELISA鉴定。
3.2阳性噬菌体克隆的鉴定
1)将靶分子SEB抗原用PH值为9.6的碳酸盐缓冲液稀释至终浓度为2μg/mL，按100μL/孔加入酶标孔中，4℃包被过夜；
2)弃包被液，PBST洗涤3次，每孔加入300μL 5％脱脂牛奶，37℃封闭1h；
3)PBST洗涤3次，每孔加入35μL噬菌体培养菌液上清和65μL 5％脱脂牛奶，37℃，孵育1h；
4)PBST洗涤6次，加入辣根过氧化物酶标记的抗M13抗体(用PBS按1:10000稀释)，100μL/孔，37℃作用1h；
5)PBST洗板6次。加入TMB显色液显色，100μL/孔，37℃，7min，加入终止液终止反应，50μL/孔，于450nm下测光密度。
3.3阳性噬菌体克隆的序列分析
将阳性克隆送成都擎科梓熙生物技术有限公司进行测序。
4、实验结果
4.1SEB抗原固相亲和淘选
采用Gly-HCl酸洗脱方法进行筛选，筛选过程中如表2所示。
表2以SEB抗原为靶分子的酸洗脱筛选回收量
Figure BDA0003127024350000151
4.2单克隆ELISA鉴定
以SEB抗原为靶分子，采用Gly-HCl酸洗脱方法，洗脱特异噬菌体，从第一轮滴度测定平板上随机挑选288个克隆，采用间接ELISA筛选阳性克隆，450nm下检测光密度。
4.3测序
通过上述步骤筛选出了具有较高抗原亲和活力的纳米抗体，经序列比对，获得了该纳米抗体的序列，如表3所示。
表3纳米抗体的序列
Figure BDA0003127024350000152
实施例3纳米抗体的功能性研究
1、纳米抗体的表达和纯化
1)对筛选出的序列进行化学合成，并克隆至真核表达载体中；
2)对质粒扩增提取；
3)将编码抗体的质粒对哺乳动物细胞进行瞬时转染；
4)收集上清，利用亲和层析方法，纯化获得重组蛋白；
5)使用考马斯亮蓝染色法检测抗体的纯度；
6)结果显示，获得的纳米抗体具有较高的纯度。
2、纳米抗体的功能研究
1)纳米抗体的结合活性检测
采用ELISA法检测纳米抗体的结合活性，步骤如下：
在ELISA板中包被抗原，4℃过夜；用脱脂奶粉封闭未结合的位点，然后用含0.1％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；配置不同浓度的纳米抗体，ELISA板条中，37℃孵育1h，用含0.1％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；加入二抗，37℃孵育30min，用含0.1％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；加入TMB显色，1mol/L的硫酸终止后检测OD450的值。
结果显示，纳米抗体能有效地结合抗原，且呈剂量依赖关系。
2)纳米抗体的体外中和效果评价
a.培养人外周血淋巴细胞PBMC，进行稀释，加入到细胞培养板中，用培养基稀释纳米抗体与抗原，将稀释后的纳米抗体与抗原混合，将混合液置于37℃孵育30min，将孵育好的混合液加入到细胞培养板中，阳性对照加入抗原，阴性对照加入培养基，将细胞培养板放入37℃，5％CO2培养箱中培养，待培养结束取出细胞培养板，吸取细胞悬液至EP管中，室温离心，取上清，使用ELISA试剂盒检测上清中的细胞因子。
结果显示，纳米抗体对细胞因子释放浓度具有剂量依赖的抑制作用，其能够抑制抗原刺激的PBMC产生的细胞因子的浓度。
b.培养人外周血淋巴细胞PBMC，进行稀释，加入到96孔细胞培养板中，用培养基稀释纳米抗体与抗原，将稀释后的纳米抗体与抗原混合，将混合液置于37℃孵育30min，将孵育好的混合液加入到96孔细胞培养板中，阳性对照加入抗原，阴性对照加入培养基，将细胞培养板放入37℃，5％CO2培养箱中培养，待培养结束取出细胞培养板，加入celltiter-glo时间，用多功能酶标仪检测化学发光值。
结果显示，纳米抗体对细胞增殖具有剂量依赖的抑制作用，其能够抑制抗原刺激人PBMC的增殖。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种纳米抗体及其应用
<141> 2021-06-22
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Arg Thr Asp Ser Tyr Ala Met
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ser Trp Ser Gly Gln Ser Thr
1 5
<210> 3
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Cys Ala Met Gly Arg Ala Pro Phe Tyr Ile Gly Leu Thr Ser Glu Pro
1 5 10 15
Glu Ala Tyr Glu Ser Trp
20
<210> 4
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Val Val Ser
20 25
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Val Ile Ala Gly
1 5 10 15
Val
<210> 6
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Arg Ala Val Tyr Leu Gln Met Gly Asn Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr
35
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Leu
1 5 10
<210> 8
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Val Val Ser Val Arg Thr Asp Ser Tyr Ala
20 25 30
Met Gly Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Val Ile Ala
35 40 45
Gly Val Ser Trp Ser Gly Gln Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Ala Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Gly Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Met Gly Arg Ala Pro Phe Tyr Ile Gly Leu Thr Ser Glu Pro Glu Ala
100 105 110
Tyr Glu Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Leu
115 120 125
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gttcgcaccg acagctatgc catg 24
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agctggagtg gtcaaagtac a 21
<210> 11
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgtgcgatgg gccgagcccc attctacatc ggtcttacat ccgagcccga agcgtatgaa 60
tcgtgg 66
<210> 12
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caggtgcagc tcgtggagtc cggaggaggc tcggtgcagg ctggtgcctc cctgacactc 60
tcctgtgtag tctct 75
<210> 13
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggctggatgc gccaggctcc agggaaggag cgggaagtga tagccggtgt c 51
<210> 14
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acctatgcag actccgtgaa gggccgattc accatctcca gagataacgc caagcgcgcg 60
gtgtatctgc aaatgggcaa cctgaaacct gaggacacgg ccgtctacta c 111
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggccagggga cccaggtcac cgtctcctta 30
<210> 16
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
caggtgcagc tcgtggagtc cggaggaggc tcggtgcagg ctggtgcctc cctgacactc 60
tcctgtgtag tctctgttcg caccgacagc tatgccatgg gctggatgcg ccaggctcca 120
gggaaggagc gggaagtgat agccggtgtc agctggagtg gtcaaagtac aacctatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagataacg ccaagcgcgc ggtgtatctg 240
caaatgggca acctgaaacc tgaggacacg gccgtctact actgtgcgat gggccgagcc 300
ccattctaca tcggtcttac atccgagccc gaagcgtatg aatcgtgggg ccaggggacc 360
caggtcaccg tctcctta 378

Claims (10)

1.一种抗肠毒素的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、2、3所示；
优选地，所述重链可变区还包括框架区FR，所述框架区的FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、5、6、7所示；
优选地，所述纳米抗体的重链可变区的氨基酸序列具有与SEQ ID NO：8至少90％，优选95％序列同一性的氨基酸序列；
优选地，所述纳米抗体包含抗体重链恒定区的全部或者部分。
2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码权利要求1所述的纳米抗体的核苷酸序列；
优选地，编码CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：9、10、11至少90％，优选95％序列的同一性的核苷酸序列；
优选地，编码框架区FR1、FR2、FR3、FR4的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：12、13、14、15至少90％，优选95％序列的同一性的核苷酸序列；
优选地，编码纳米抗体重链可变区的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：16至少90％，优选95％序列的同一性的核苷酸序列。
3.一种载体，其特征在于，包含权利要求2所述的核酸分子。
4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求2所述的核酸分子，或包含权利要求3所述的载体。
5.一种产生抗肠毒素纳米抗体的方法，其特征在于，包括步骤：
在适合产生纳米抗体的条件下，培养权利要求4所述的宿主细胞，从而获得含所述抗肠毒素纳米抗体的培养物；以及
从所述培养物中分离或回收所述的抗肠毒素纳米抗体。
6.一种药物偶联物，其特征在于，所述偶联物含有：
权利要求1所述的纳米抗体，以及
选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子或酶。
7.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含：
权利要求1所述的纳米抗体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的载体、权利要求4所述的宿主细胞或权利要求6所述的药物偶联物。
8.一种纳米抗体噬菌体文库的构建方法，其特征在于，包括
1)从免疫羊驼的外周血淋巴细胞中提取总RNA，并反转录成cDNA；
2)以cDNA为模板扩增纳米抗体基因，将其与载体连接构建噬菌体文库；优选地，免疫羊驼的方法为：将抗原与CFA等体积混匀后皮下注射；三周后将抗原与IFA等体积混匀后进行第二次皮下注射；接下来每两周将抗原与IFA等体积混匀后进行皮下注射，共两次；
优选地，所述抗原为肠毒素抗原；
优选地，所述载体为pComb3XSS；
优选地，所述方法还包括噬菌体文库的包装。
9.一种权利要求8所述的方法构建的纳米抗体噬菌体文库。
10.如下任一项所述的应用：
1)权利要求1任一项所述的抗体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的载体、权利要求4所述的宿主细胞在制备检测金黄色葡萄球菌或者金黄色葡萄球菌感染肠毒素的产品中的应用；
2)权利要求1所述的抗体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的载体、权利要求4所述的宿主细胞或权利要求6所述的药物偶联物在制备治疗、预防金黄色葡萄球菌感染及相关疾病的药物中的应用；
优选地，所述肠毒素为SEB；
3)权利要求9所述的纳米抗体噬菌体文库在筛选特异性结合肠毒素的纳米抗体中的应用；
4)权利要求9所述的纳米抗体噬菌体文库在筛选治疗治疗、预防金黄色葡萄球菌感染及相关疾病的药物中的应用。
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