CN104105708B - PDGF受体β结合多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明提供以高亲和性特异性结合于靶抗原(例如人类抗原，例如人类PDGFRβ)的结合多肽(例如抗体或其片段)。本发明亦提供结合多肽的文库、药物组合物，以及编码结合多肽的核酸、重组表达载体及用于制造这样的结合多肽的宿主细胞。本发明亦涵盖使用本发明的结合多肽以诊断及治疗疾病的方法。

Description

PDGF受体β结合多肽
本申请主张2011年12月5日申请的美国临时申请61/566,778以及2012年3月14日申请的美国临时申请61/610,905的优先权，所述临时申请均以全文引用的方式并入本文中。
背景技术
本发明涉及PDGF受体β结合多肽。
血小板源性生长因子(PDGF)是间叶活动来源的细胞中的强力分裂原及化学引诱物且涉及许多疾病的病理学。PDGF以二硫化物连接的二聚物存在，所述二聚物是由两条可组合形成三种独特PDGF同种型AA、BB或AB的同源链A或B组成。PDGF的所有同种型均通过结合至细胞表面PDGF受体(PDGFR)来介导其促有丝分裂效果。
PDGF受体属于酪氨酸激酶家族且由两种受体同种型α及β组成。α及β同种型可通过其独特配体结合特异性加以区分。PDGFβ受体可仅结合至B链(同种型BB及AB)，而PDGFα受体可结合至PDGF的所有同种型。
PDGF与细胞表面PDGFR的结合引起受体二聚化及反式自体磷酸化，进而又引起细胞内信号传导事件，所述事件尤其引起细胞增殖及细胞迁移。因此，阻断PDGF结合和/或受体二聚化的PDGFR拮抗剂可用以治疗或预防与PDGFR活化相关的疾病。
发明内容
因此，在本领域中需要可用以治疗与PDGFR活化相关的疾病的新颖PDGFR拮抗剂。
本发明提供以高亲和性特异性结合于靶抗原(例如人类抗原，例如人类PDGF)的结合多肽(例如抗体或其片段)。在一优选实施方案中，本发明提供以高亲和性结合于PDGFRβ(例如人类PDGFRβ)且拮抗PDGFRβ活化的结合多肽。这样的结合多肽尤其适用于治疗PDGFRβ相关疾病或病症(例如年龄相关的黄斑变性(AMD))。本发明亦提供结合多肽的文库、药物组合物，以及编码结合多肽的核酸、重组表达载体及用于制造这样的结合多肽的宿主细胞。本发明亦涵盖使用本发明的结合多肽来检测PDGFRβ及调节PDGFRβ活性的方法。
因此，在一方面，本发明提供经分离结合多肽，其包含VH域，其中作为分离域，VH域以小于100pM的Kd结合于抗原。
在另一方面，本发明提供特异性结合于PDGFRβ的经分离结合多肽，其包含如SEQID NO：1中所示的CDR3序列。
在某些实施方案中，结合多肽包含VH域，所述VH域包含SEQ ID NO:1所示的HCDR3氨基酸序列。VH域可进一步包括包含选自SEQ ID NO:2-32的氨基酸序列的HCDR2和/或包含选自SEQ ID NO:33-62的氨基酸序列的HCDR1。
在某些实施方案中，多肽包含VH域，所述VH域包含与选自SEQ ID NO:318-368的VH域氨基酸序列享有至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)氨基酸同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，多肽包含VH域，所述VH域包含选自SEQ ID NO:318-368的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合多肽包含VL域。VH域可进一步包括包含选自SEQ ID NO:63-147的氨基酸序列的LCDR3、包含选自SEQ ID NO:148-232的氨基酸序列的LCDR2和/或包含选自SEQ ID NO:233-317的氨基酸序列的LCDR1。
在某些实施方案中，多肽包含VL域，所述VL域包含与选自SEQ ID NO:369-453的VL域氨基酸序列享有至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)氨基酸同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，多肽包含VL域，所述VL域包含选自SEQ ID NO:369-453的氨基酸序列。
在其它方面，本发明提供结合多肽，其与包含SEQ ID No:318所示的VH域氨基酸序列的结合多肽结合于PDGFRβ上的相同表位。在一优选实施方案中，结合多肽包含与选自SEQID NO:318-368的VH域氨基酸序列享有至少80％氨基酸同一性(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的VH域氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供结合多肽，其与包含如SEQ ID No:318所示的VH域氨基酸序列的结合多肽竞争结合于PDGFRβ。在一优选实施方案中，结合多肽包含与选自SEQ IDNO:318-368的VH域氨基酸序列享有至少80％氨基酸同一性的VH域氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的结合多肽抑制PDGFRβ活性。在一实施方案中，PDGFRβ活性通过拮抗PDGF与PDGFRβ的结合来抑制。在另一实施方案中，PDGFRβ活性通过拮抗PDGFRβ二聚化来抑制。
在某些实施方案中，本发明的结合多肽以小于100pM的Kd和/或以小于10-3s-1的解离速率结合于PDGFRβ。
在某些实施方案中，本发明的结合多肽特异性结合于小鼠及人类PDGFRβ。
在某些实施方案中，本发明的结合多肽以小于5nM的IC50拮抗PDGF与PDGFRβ的结合、以小于4nM的IC50抑制PDGFRβ的配体诱导性酪氨酸磷酸化、以小于6nM的IC50抑制视网膜周细胞迁移，和/或具有至少68℃的熔融温度(Tm)。
在另一方面，本发明提供编码本发明的结合多肽的经分离核酸。
在另一方面，本发明提供包含编码本发明的结合多肽的经分离核酸的重组表达载体。
在另一方面，本发明提供表达本发明的结合多肽的宿主细胞。
在另一方面，本发明提供制造特异性结合于人类PDGFRβ的结合多肽的方法，其包括将能够表达本发明的结合多肽的宿主细胞在使得所述宿主细胞产生结合多肽的条件下进行培养。
在另一方面，本发明提供药物组合物，其包含本发明的结合多肽及一种或更多种药学上可接受的载体(carrier)。
在另一方面，本发明提供用于治疗疾病或病症PDGFRβ相关疾病或病症(例如年龄相关的黄斑变性(AMD)或癌症)的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本发明的药物组合物。
在另一方面，本发明提供不成对VH域的多样文库，其中文库各成员结合于人类PDGFRβ。在一优选实施方案中，文库各成员包含SEQ ID NO:1所示的CDR3氨基酸序列及在于FR1-FR3区域的多样性。在一优选实施方案中，文库为核酸展示文库(例如DNA展示文库)。
在另一方面，本发明提供稳定VH/VL对的多样文库，其中文库各成员结合于人类PDGFRβ。在一优选实施方案中，文库各成员包含VH域，所述VH域包含SEQ ID NO:1所示的CDR3氨基酸序列。在一优选实施方案中，VL域为人类VL域。在一优选实施方案中，文库为核酸展示文库(例如DNA展示文库)。
附图说明
图1为用于所公开方法的示范性VH域核酸展示文库构建的示意图。
图2描绘量测XB1511VH域、未经选择的XB1511CDR3/构架改组DNA展示文库(R0)及XB1511CDR3/构架改组DNA展示文库池在四轮选择(R4)后与人类或小鼠PDGFRβ的结合的体外结合分析结果。
图3描绘量测XB1511及构架改组衍生物XB2202及XB2708与人类PDGFRβ的结合动力学的表面等离子体共振结合研究的结果。
图4描绘量测XB2202与人类(A)及小鼠(B)PDGFRβ的结合动力学的表面等离子体共振结合分析的结果。
图5描绘量测XB2708与人类(A)及小鼠(B)PDGFRβ的结合动力学的表面等离子体共振结合分析的结果。
图6为用于所公开方法的示范性VL核酸展示文库的构建的示意图。
图7描绘量测包含自VH/VL成对DNA展示筛选的第二轮筛选池分离的VL域的XB1511/VL scFv与人类PDGFRβ的结合的ELISA分析的结果。
图8描绘量测包含自VH/VL成对DNA展示筛选的第三轮筛选池分离的VL 域的XB1511/VL scFv与人类PDGFRβ的结合的ELISA分析的结果。
图9描绘量测包含自VH/VL成对DNA展示筛选的第二轮筛选池分离的VL域的XB2202/VL scFv与人类PDGFRβ的结合的ELISA分析的结果。
图10描绘量测来自图9中所示的XB1511/VL scFv的不成对VL域与人类PDGFRβ的结合的ELISA分析的结果。
图11描绘量测35S Met标记的XB1511VH域及获自VH/VL成对DNA展示筛选的含XB1511的scFV与人类PDGFRβ的结合的溶液结合亲和性研究的结果。
图12描绘量测35S Met标记的XB2202VH域及获自VH/VL成对DNA展示筛选的含XB2202的scFV与人类PDGFRβ的结合的溶液结合亲和性研究的结果。
图13描绘量测在各种浓度的XB2202下PDGF-BB与PDGFRβ结合的动力学的表面等离子体共振竞争结合分析的结果。
图14描绘量测XB2708对周细胞迁移的抑制的体外细胞迁移分析的结果。
图15描绘量测含XB1511的IgG1抑制人类包皮纤维母细胞迁移能力的无标记迁移分析的结果。
图16描绘量测XB2202VH域及XB2202/A4scFv在各种温度下孵育后与人类PDGFRβ的结合的ELISA分析的结果。
具体实施方式
本发明提供以高亲和性特异性结合于靶抗原(例如人类抗原)的结合多肽(例如抗体或其片段)。在一优选实施方案中，本发明的结合多肽以高亲和性结合于PDGFRβ(例如人类PDGFRβ)且抑制PDGFRβ活性。这样的结合多肽尤其适用于治疗PDGFRβ相关疾病或病症(例如年龄相关的黄斑变性(AMD))。本发明亦提供结合多肽的文库、药物组合物、以及编码结合多肽的核酸、重组表达载体及用于制造这样的结合多肽的宿主细胞。本发明亦涵盖使用本发明的结合多肽来检测PDGFRβ及调节PDGFRβ活性的方法。
I：定义
为使本发明可较容易地理解，首先定义某些术语。
如本文所用，术语“PDGFRβ”指血小板源性生长因子受体β。本领域中熟知PDGFRβ核苷酸及多肽序列。示范性人类PDGFRβ氨基序列阐述于GenBank保藏GI:4505683中，且示范性小鼠PDGFRβ氨基序列阐述于GenBank保藏GI:226371752中。
如本文所用，术语“PDGF”指血小板源性生长因子。本领域中熟知PDGF核苷酸及多肽序列。示范性人类PDGF氨基序列阐述于GenBank保藏GI:4505681中，且示范性小鼠PDGF氨基序列阐述于GenBank保藏GI:400744中。
如本文所用，术语“结合多肽”指含有抗体的抗原结合位点的全部或一部分(例如重链和/或轻链可变域的全部或一部分，例如重链可变域的至少HCDR3)以使结 合多肽特异性识别靶抗原的多肽。结合多肽的非限制性实例包括抗体或其片段，及已变为包含抗体的抗原结合位点的全部或一部分的免疫球蛋白样域(例如纤连蛋白域)。
如本文所用，术语“抗体”指包含四条多肽链，即通过双硫键互连的两条重链(H)链及两条轻(L)链的免疫球蛋白分子，以及其多聚体(例如IgM)。各重链包含重链可变区(缩写为VH)及重链恒定区。重链恒定区包含三个域，即CH1、CH2及CH3。各轻链包含轻链可变区(缩写为VL)及轻链恒定区。轻链恒定区包含一个域(CL1)。VH及VL区可进一步细分成称为互补决定区(CDR)的高变区，穿插有称为构架区(FR)的更保守区。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在的以酶促方式可获得的合成或基因工程化的多肽或醣蛋白。抗体的抗原结合片段可使用任何适合的标准技术例如源于完整抗体分子，所述标准技术诸如为蛋白水解消化或重组遗传工程化技术，其涉及操作及表达DNA编码抗体可变及任选的恒定域。抗原结合部分的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；及(vii)由模拟抗体高变区(例如经分离互补决定区(CDR))的氨基酸残基组成的最小识别单元。表述“抗原结合部分”亦涵盖其它工程化的分子，诸如双抗体(diabody)、三抗体(triabody)、四抗体(tetrabody)及微型抗体。
如本文所用，术语“VH域”及“VL域”分别指单一抗体可变重链及轻链域，其包含FR(构架区)1、2、3及4及CDR(互补决定区)1、2及3(参见Kabat等人,(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest.(NIH出版第91-3242期,Bethesda)。
如本文所用，术语“FR1-FR3”指涵盖FR1、CDR2、FR2、CDR2及FR3但排除CDR3及FR4区的VH区。
如本文所用，术语“不成对”指VH或VL分别未连接(共价或非共价)于互补VL或VH域。
如本文所用，术语“互补VL或VH域”指分别与VH或VL域相联以形成VH/VL对的VL或VH域。
如本文所用，术语“VH/VL对”指单一VH与单一VL域的非共价二聚体，其中VL与VH域以类似于在完整四聚免疫球蛋白分子中所观察到的方式相联，且所述二聚体可特异性结合于至少一种靶抗原。“稳定VH/VL对”为不显示取代基VH与VL域在生理条件下显著解离的VH/VL对。
如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”意思是见于重链与轻链多肽两者的可变区内的非连续的抗原结合位点。Kabat等人,J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977)及Kabat等人,Sequences of protein of immunological interest.(1991)，及Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)及MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)已描述了这些特定区域，其中所述定义包括当彼此相比较时氨基酸残基的重 迭或子集。阐述涵盖如上文引用的参考文献各自所定义的CDR的氨基酸残基以便比较。优选地，术语“CDR”为如Kabat基于序列比较所定义的CDR。
如本文所用，术语“构架(FR)氨基酸残基”指免疫球蛋白链的构架区中的那些氨基酸。如本文所用，术语“构架区”或“FR区”包括作为可变区的部分而非CDR(例如，使用Kabat定义的CDR)的部分的氨基酸残基。
如本文所用，术语“特异性结合于”指结合多肽以至少约1×10-6M、1×10-7M、1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M、1×10-12M或更多的Kd结合于抗原，和/或以比其对非特异性抗原的亲和性至少两倍大的亲和性结合于抗原的能力。然而应了解，结合多肽能够特异性结合于两种或更多在序列中相关的抗原。举例而言，本发明的结合多肽可特异性结合于人类与非人类(例如小鼠或非人类灵长动物)两者的PDGFRβ。
如本文所用，术语“抗原”指由结合多肽所识别的结合位点或表位。
如本文所用，术语“核酸展示文库”指任何技术上公认的体外无细胞表型-基因型连接的展示，其包括(不限于)例如以下所示：美国专利第7,195,880号；第6,951,725号；第7,078,197号；第7,022,479号；第6,518,018号；第7,125,669号；第6,846,655号；第6,281,344号；第6,207,446号；第6,214,553号；第6,258,558号；第6,261,804号；第6,429,300号；第6,489,116号；第6,436,665号；第6,537,749号；第6,602,685号；第6,623,926号；第6,416,950号；第6,660,473号；第6,312,927号；第5,922,545号；及第6,348,315号，及WO2010/011944，所述专利均以全文引用的方式并入本文中。
如本文所用，术语“载体”意欲指能够输送其已连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体为“质粒”，其指可连接其它DNA区段的圆形双链DNA环。另一类型的载体为病毒载体，其中其它DNA区段可连接至病毒基因组。某些载体能够在其被引入的宿主细胞(例如，具有细菌复制起点的细菌载体，及游离型哺乳动物载体)中自体复制。其它载体(例如非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞中时可整合至宿主细胞的基因组中，由此连同宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导其可操作地连接到的基因的表达。这样的载体在本文中称作“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。一般而言，表达载体在重组DNA技术中的效用经常呈质粒形式。术语“质粒”与“载体”可互换使用。然而，本发明意欲包括这样的表达载体的其它形式，诸如病毒载体(例如，复制缺陷反转录病毒、腺病毒及腺相关病毒)，其提供等效功能。
如本文所用，术语“宿主细胞”意欲指已引入重组表达载体的细胞。应了解，此术语不仅意欲指特定受试细胞，而且指这样细胞的子代。因为后代中可能因突变或环境影响而出现某些修改，所以此子代实际可能不与亲本细胞相同，但仍包括于如本文所用的术语“宿主细胞”的范畴内。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗的(treating)”、“治疗(treatment)” 指本文所述的治疗或预防措施。“治疗”方法采用向受试者，例如患有PDGFRβ相关疾病或病症(例如AMD)或易患此疾病或病症的受试者施用本发明的抗体或抗原结合部分，以预防、治愈、延迟疾病或病症或复发性疾病或病症、降低其严重性，或改善其一种或更多种症状，或以延长受试者存活期以超出无此治疗时的预期存活期。
如本文所用，术语“PDGFRβ相关疾病或病症”包括与PDGFRβ活性相关的疾病病况和/或症状。示范性PDGFRβ相关疾病或病症包括(但不限于)年龄相关的黄斑变性(AMD)及癌症。
如本文所用，术语“有效量”指当向受试者施用时足以实现如本文所述的PDGFRβ相关疾病或病症的治疗、预后或诊断的结合多肽的量。治疗有效量将视所治疗的受试者及疾病病状、受试者体重及年龄、疾病病状的严重性、施用方式等而变化，其可由本领域普通技术人员轻易确定。施用剂量可介于例如本发明的结合多肽的约1ng至约10,000mg、约1μg至约5,000mg、约1mg至约1,000mg、约10mg至约100mg范围内。可调整给药方案以提供最佳治疗反应。有效量亦为结合多肽的任何毒性或有害作用(亦即副作用)均已减到最小和/或有利效果更重要的量。
如本文所用，术语“受试者”包括任何人类或非人类动物。
如本文所用，术语“表面等离子体共振”指光学现象，其允许通过例如使用BIAcoreTM系统(Biacore Life Sciences division of GE Healthcare,Piscataway,NJ)来检测生物传感器基质内的蛋白质浓度变化来分析实时相互作用。
如本文所用，术语“KD”指特定结合多肽/抗原相互作用的平衡解离常数。
如本文所用，术语“解离速率”指特定结合多肽/抗原相互作用的解离速率(Koff)。
如本文所用，术语“表位”指在本发明的结合分子中与特异性抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单一抗原可具有一个以上表位。因此，不同抗体可结合于抗原上的不同区域且可具有不同生物作用。表位可为构象的或线性的。构象表位通过来自线性多肽链的不同区段的空间并列氨基酸产生。线性表位为通过多肽链中相邻氨基酸残基产生的表位。
II.结合多肽
在一方面，本发明提供包含VH域的结合多肽，其中作为经分离域，VH域以小于约200pM(例如约200、190、180、175、170、160、150、140、130、120、110、100、95、90、80、75、70、65、60、55、50、40、30、20、10、5或1pM或更少)的Kd结合于抗原。
在另一方面，本发明提供特异性结合于PDGFRβ且抑制PDGFRβ活性的结合多肽(例如，抗体或其抗原结合片段)。这样的结合多肽尤其适用于治疗PDGFRβ相关疾病或病症(例如年龄相关的黄斑变性或AMD)。
一般而言，本发明的PDGFRβ结合多肽包含特异性结合于PDGFRβ的重链 CDR3(HCDR3)氨基酸序列。一种适用于本发明的结合多肽的非限制性HCDR3序列为如SEQ ID NO:1(HGGDRSY)所示的重链CDR3氨基酸序列。在其它实施方案中，重链CDR3序列为SEQ ID NO:1的变体，其相对于SEQ ID NO:1包含至少一个(例如一、二或三个)保守氨基酸取代。
可合并特异性结合于PDGFRβ的重链CDR3氨基酸序列(例如SEQ ID NO:1(HGGDRSY)所示的CDR3氨基酸序列)的任何结合多肽均可用于本发明的结合多肽中，包括(不限于)抗体或其片段，及免疫球蛋白样域。适合的免疫球蛋白样域包括(不限于)纤连蛋白域(参见例如Koide等人,(2007),Methods Mol.Biol.352:95-109，其以全文引用的方式并入本文中)、DARPin(参见例如Stumpp等人,(2008)Drug Discov.Today 13(15-16):695-701，其以全文引用的方式并入本文中)、蛋白质A的Z域(参见Nygren等人,(2008)FEBS J.275(11):2668-76，其以全文引用的方式并入本文中)、脂质运载蛋白(Lipocalin)(参见，例如Skerra等人,(2008)FEBS J.275(11):2677-83，其以全文引用的方式并入本文中)、Affilin(无对应中译文)(参见例如Ebersbach等人,(2007)J.Mol.Biol.372(1):172-85，其以全文引用的方式并入本文中)、Affitin(参见例如Krehenbrink等人,(2008).J.Mol.Biol.383(5):1058-68，其以全文引用的方式并入本文中)、Avimer(无对应中译文)(参见例如Silverman等人,(2005)Nat.Biotechnol.23(12):1556-61，其以全文引用的方式并入本文中)、Fynomer(无对应中译文)(参见例如Grabulovski等人,(2007)J Biol Chem 282(5):3196-3204，其以全文引用的方式并入本文中)及库尼兹(Kunitz)域肽(参见,例如Nixon等人,(2006)Curr Opin DrugDiscov Devel 9(2):261-8，其以全文引用的方式并入本文中).
在一优选实施方案中，PDGFRβ结合多肽为抗体或其抗原结合片段，其包含VH域和/或VL域。表1-4中阐述适用于本发明的示范性CDR、VH及VL氨基酸序列。因此，在某些实施方案中，结合多肽可包含HCDR3(SEQ ID NO:1)以及HCDR2和/或HCDR1序列，其独立地选自表1中所示的重链HCDR2或HCDR1序列中任一者。在某些实施方案中，本发明的结合多肽可进一步包含轻链CDR，其独立地选自表2中所示的轻链CDR1、CDR2或CDR3序列中任一者。举例而言，本发明的结合多肽可包含表3中所示的重链可变(VH)域中任一者，任选地与表4中所示的轻链可变(VL)域中任一者配对。
表1：示范性抗PDGFRβ抗体的重链CDR氨基酸序列
表2：示范性抗PDGFRβ抗体的轻链CDR氨基酸序列
表3：示范性抗PDGFRβ抗体的重链可变域(VH)氨基酸序列
表4：示范性抗PDGFRβ抗体的轻链可变域(VL)氨基酸序列
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链CDR3序列以及一种或更多选自SEQ ID NO:2-317的CDR区氨基酸序列。在示范性实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含分别选自以下的HCDR3、HCDR2及HCDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:1、2及3；1、2及34；1、3及35；1、4及35；1、5及36；1、6及36；1、3及36；1、7及36；1、8及36；1、9及36；1、10及38；1、2及38；1、11及39；1、12及40；1、13及41；1、13及42；1、13及33；1、14及43；1、14及44；1、15及45；1、16及45；1、17及46；1、18及47；1、19及47；1、20及48；1、2及49；1、21及50；1、2及51；1、2及52；1、2及53；1、22及54；1、23及55；1、24及56；1、25及46；1、26及57；1、27及58；1、28及59；1、29及60；1、30及61；1、31及62；及1、32及62。
在其它实施方案中，抗体或其抗原结合片段进一步包含分别选自以下的LCDR3、LCDR2及LCDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:63、148及233；64、149及234；65、150及235；66、151及236；67、152及237；68、153及238；69、154及239；70、155及240；71、156及241；72、157及242；73、158及243；741、159及244；75、160及245；76、161及246；77、162及247；78、163及248；79、164及249；80、165及250；81、166及251；82、167及252；83、168及253；84、169及254；85、170及255；86、171及256；87、172及257；88、173及258；89、174及259；90、175及260；91、176及261；92、177及262；93、178及263；94、179及264；95、180及265；96、181及266；97、182及267；98、183及268；99、184及269；100、185及270；101、186及271；102、187及272；103、188及273；104、189及274；105、190及275；106、191及276；107、192及277；108、193及278；109、194及279；110、195及280；111、196及281；112、197及282；113、198及283；114、199及284；115、200及285；116、201及286；117、202及287；118、203及288；119、204及289；120、205及290；121、206及291；122、207及292；123、208及293；124、209及294；125、210及295；126、211及296；127、212及297；128、213及298；129、214及299；130、215及300；131、216及301；132、217及302；133、218及303；134、219及304；135、220及305；136、221及306；137、222及307；138、223及308；139、224及309；140、225及310；141、226及311；142、227及312；143、228及313；144、229及314；145、220及315；146、231及316；及147、232及317。
在其它实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1中所示的的HCDR3氨基酸序列，及分别选自以下的LCDR3、LCDR2及LCDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:63、148及233；64、149及234；65、150及235；66、151及236；67、152及237；68、153及238；69、154及239；70、155及240；71、156及241；72、157及242；73、158及243；741、159及244；75、160及245；76、 161及246；77、162及247；78、163及248；79、164及249；80、165及250；81、166及251；82、167及252；83、168及253；84、169及254；85、170及255；86、171及256；87、172及257；88、173及258；89、174及259；90、175及260；91、176及261；92、177及262；93、178及263；94、179及264；95、180及265；96、181及266；97、182及267；98、183及268；99、184及269；100、185及270；101、186及271；102、187及272；103、188及273；104、189及274；105、190及275；106、191及276；107、192及277；108、193及278；109、194及279；110、195及280；111、196及281；112、197及282；113、198及283；114、199及284；115、200及285；116、201及286；117、202及287；118、203及288；119、204及289；120、205及290；121、206及291；122、207及292；123、208及293；124、209及294；125、210及295；126、211及296；127、212及297；128、213及298；129、214及299；130、215及300；131、216及301；132、217及302；133、218及303；134、219及304；135、220及305；136、221及306；137、222及307；138、223及308；139、224及309；140、225及310；141、226及311；142、227及312；143、228及313；144、229及314；145、220及315；146、231及316；及147、232及317。
在其它实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含分别选自以下的HCDR3、HCDR2及HCDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:1、2及3；1、2及34；1、3及35；1、4及35；1、5及36；1、6及36；1、3及36；1、7及36；1、8及36；1、9及36；1、10及38；1、2及38；1、11及39；1、12及40；1、13及41；1、13及42；1、13及33；1、14及43；1、14及44；1、15及45；1、16及45；1、17及46；1、18及47；1、19及47；1、20及48；1、2及49；1、21及50；1、2及51；1、2及52；1、2及53；1、22及54；1、23及55；1、24及56；1、25及46；1、26及57；1、27及58；1、28及59；1、29及60；1、30及61；1、31及62；及1、32及62，及分别选自以下的LCDR3、LCDR2及LCDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:63、148及233；64、149及234；65、150及235；66、151及236；67、152及237；68、153及238；69、154及239；70、155及240；71、156及241；72、157及242；73、158及243；741、159及244；75、160及245；76、161及246；77、162及247；78、163及248；79、164及249；80、165及250；81、166及251；82、167及252；83、168及253；84、169及254；85、170及255；86、171及256；87、172及257；88、173及258；89、174及259；90、175及260；91、176及261；92、177及262；93、178及263；94、179及264；95、180及265；96、181及266；97、182及267；98、183及268；99、184及269；100、185及270；101、186及271；102、187及272；103、188及273；104、189及274；105、190及275；106、191及276；107、192及277；108、193及278；109、194及279；110、195及280；111、196及281；112、197及282；113、198 及283；114、199及284；115、200及285；116、201及286；117、202及287；118、203及288；119、204及289；120、205及290；121、206及291；122、207及292；123、208及293；124、209及294；125、210及295；126、211及296；127、212及297；128、213及298；129、214及299；130、215及300；131、216及301；132、217及302；133、218及303；134、219及304；135、220及305；136、221及306；137、222及307；138、223及308；139、224及309；140、225及310；141、226及311；142、227及312；143、228及313；144、229及314；145、220及315；146、231及316；及147、232及317。
在其它实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:318-368所示的VH氨基酸序列中至少一个。
在其它实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:369-453所示的VL氨基酸序列中至少一个。
在其它实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:318、321或360中所示的VH区氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO:369-453的VL区氨基酸序列成对。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含一种或更多选自SEQ ID NO:1-317的CDR氨基酸序列，其中所述一个或更多个CDR区氨基酸序列包含至少一个或更多保守氨基酸取代(例如1、2、3、4或5个保守氨基酸取代)。保守氨基酸取代包括一类氨基酸经同一类氨基酸取代，其中一类是由以下定义：共同物理化学氨基酸侧链性质及自然界中所见的同源蛋白质中的高取代频率，例如通过标准Dayhoff频率交换矩阵或BLOSUM矩阵确定。已分类出六大类氨基酸侧链且其包括：I类(Cys)；II类(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly)；III类(Asn、Asp、Gln、Glu)；IV类(His、Arg、Lys)；V类(Ile、Leu、Val、Met)；及VI类(Phe、Tyr、Trp)。举例而言，以Asp取代另一III类残基，诸如Asn、Gln或Glu为保守取代。因此，抗PDGFRβ抗体中的预测非必需氨基酸残基优选经同一类的另一氨基酸残基置换。本领域中熟知鉴定不消除抗原结合的氨基酸保守取代的方法(参见例如Brummell等人,Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人,Protein Eng.12(10):879-884(1999)；及Burks等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417(1997))。
在另一实施方案中，本发明提供抗PDGFRβ抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQID NO:318-368中所示的VH区氨基酸序列和/或SEQ ID NO:369-453所示的VL区氨基酸序列分别具有约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH和/或VL区氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供与包含SEQ ID NO:318所示的VH域氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段结合于相同表位和/或交叉竞争的抗PDGFRβ抗体。这样的抗体可使用常规竞争结合分析，包括例如基于表面等离子体共振(SPR)的竞争分析 来识别。
在另一方面，本发明提供不成对VH域的多样文库，其中文库各成员特异性结合于人类PDGFRβ且其中多样性处于FR1-FR3区中。在一优选实施方案中，文库各成员包含特异性结合于人类PDGFRβ的一致重链CDR3(例如，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列)氨基酸序列，且其中多样性处于FR1-FR3区中。
在另一方面，本发明提供稳定VH/VL对的多样文库，其中文库各成员结合于人类PDGFRβ。文库各成员优选包含VH域，所述VH域包含SEQ ID NO:1所示的CDR3氨基酸序列。可使用本领域中已知的任何方法来选择稳定VH/VL对，所述方法包括(不限于)以全文引用的方式并入本文中的美国临时专利申请案61/453,106中所示的那些。
任何类型的VH或VL域表达文库均可用于本发明的方法中。适合的表达文库包括(不限于)核酸展示、噬菌体展示及细胞表面展示文库(例如酵母、哺乳动物及细菌细胞)。在一优选实施方案中，文库为根据以全文引用的方式并入本文中的WO2010/011944所示的方法产生的核酸展示文库。本领域中熟知筛选表达文库的方法。参见例如AntibodyEngineering:Methods and Protocols.Methods in Molecular Biology第248卷,(B.K.C.Lo,Ed)Humana Press,2004(ISBN:1-58829-092-1)，其以全文引用的方式并入本文中。
III.经修饰的结合多肽
在某些实施方案中，本发明的结合多肽可包含一种或更多种修饰。修饰形式的本发明的结合多肽可使用本领域中已知的任何技术制造。
i)降低免疫原性
在某些实施方案中，使用本领域认可的技术修饰本发明的结合多肽(例如抗体或其抗原结合片段)以降低其免疫原性。举例而言，抗体或其片段可经嵌合化、人化和/或去除免疫化。
在一实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段可为嵌合的。嵌合抗体为抗体的不同部分源自不同动物物种的抗体，诸如具有源自鼠单克隆抗体的可变区及人类免疫球蛋白恒定区的抗体。本领域中已知制造嵌合抗体或其片段的方法。参见例如Morrison,Science 229:1202(1985)；Oi等人,BioTechniques 4:214(1986)；Gillies等人,J.Immunol.Methods 125:191-202(1989)；美国专利第5,807,715号；第4,816,567号；及第4,816,397号，其以全文引用的方式并入本文中。为制造“嵌合抗体”所开发的技术(Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.81:851-855(1984)；Neuberger等人,Nature 312:604-608(1984)；Takeda等人,Nature 314:452-454(1985))可用于合成所述分子。举例而言，编码结合特异性的小鼠抗PDGFRβ抗体分子的遗传序列可与具有适当生物活性的人类抗体分子的序列融合在一起。如本文所用，嵌合抗体为不同部分源自不同动物物种的分子，诸如具有源自鼠单克隆抗体的可变区及人类免疫球蛋白恒定区的分子，例如人化抗体。
在另一实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分经人化。人化抗体具有包含来自非人类抗体的一或多个互补决定区(CDR)及来自人类抗体分子的构架区的结合特异性。人类构架区中的构架残基经常经CDR供体抗体的相应残基取代以改变，优选地改进抗原结合。这样的构架取代通过本领域熟知的方法鉴定，例如通过模型化CDR与构架残基的相互作用来鉴定对于抗原结合重要的构架残基，及进行序列比较以鉴定在特定位置的不常见构架残基。(参见例如Queen等人,美国专利第5,585,089号；Riechmann等人,Nature 332:323(1988)，其以全文引用的方式并入本文中。)抗体可使用本领域中已知的各种技术人类化，所述技术包括例如CDR移植(EP 239,400；PCT公开号WO 91/09967；美国专利第5,225,539号；第5,530,101号；及第5,585,089号)、面饰(veneering)或表面重整(resurfacing)(EP592,106；EP 519,596；Padlan,Molecular Immunology 28(4/5):489-498(1991)；Studnicka等人,Protein Engineering 7(6):805-814(1994)；Roguska.等人,PNAS91:969-973(1994))及链改组(美国专利第5,565,332号)。
在一些实施方案中，去除免疫化可用以降低PDGFRβ结合多肽(例如抗体或其抗原结合部分)的免疫原性。如本文所用，术语“去除免疫化”包括改变多肽(例如抗体或其抗原结合部分)以修饰T细胞表位(参见例如WO9852976A1、WO0034317A2)。举例而言，可分析本发明起始的PDGFRβ特异性抗体或其抗原结合部分的VH及VL序列，且可自各V区产生显示与序列内互补决定区(CDR)及其它关键残基有关的表位位置的人类T细胞表位“图”。分析来自T细胞表位图的个别T细胞表位以鉴定具有低风险的改变最终抗体活性的替代性氨基酸取代。设计一系列包含氨基酸取代组合的替代性VH及VL序列，且随后将这些序列并入一系列用于本文公开的诊断及治疗方法中的PDGFRβ特异性抗体或其片段中，接着测试其功能。通常产生及测试在12个与24个之间的变异型抗体。接着将包含经修饰V及人类C区的完整重及轻链基因克隆到表达载体中且将后续质粒引入细胞系中以便制造全抗体(wholeantibody)。接着在适当生物化学及生物分析中比较抗体，且鉴定最佳变异体。
ii)效应功能及Fc修饰
本发明的结合多肽可包含介导一种或更多种效应功能的抗体恒定区(例如IgG恒定区，例如人类IgG恒定区，例如人类IgG1或IgG4恒定区)。举例而言，补体的C1组分结合于抗体恒定区可活化补体系统。在细胞病原体的调理及溶解中，补体活化为重要的。补体活化亦刺激炎性反应且亦可涉及自身免疫过敏。此外，抗体经由Fc区结合于各种细胞上的受体，其中抗体Fc区上的Fc受体结合位点结合于细胞上的Fc受体(FcR)。存在许多对不同类抗体具有特异性的Fc受体，包括IgG(γ受体)、IgE(ε受体)、IgA(α受体)及IgM(μ受体)。抗体结合于细胞表面上的Fc受体引发许多重要且多样的生物反应，包括由杀伤细胞(称为抗体依赖性细胞介导性细胞毒性或ADCC)吞噬及破坏抗体包被粒子、清除免疫复合物、溶解抗体包被靶细胞，释放炎性介质、胎盘转移及控制免疫球蛋白产生。在优选实施方案中，本发明的结合多肽(例如抗体或其抗原结合片段)结合于Fc-γ受体。在替代性实施方案中，本发明的结合多肽可包含缺乏一种或更多种效应功能(例如ADCC活性)和/或不能结合Fcγ受体的恒定区。
本发明的某些实施方案包括抗PDGFRβ抗体，其中一或多个恒定区域中的至少一个氨基酸已缺失或另外改变以便提供所需生物化学特征，诸如当与大约相同免疫原性的未改变的全抗体相比时，减小或增强的效应功能、非共价二聚的能力、定位在肿瘤位点的能力提高、血清半衰期减少或血清半衰期增加。举例而言，用于本文所述的诊断及治疗方法的某些抗体或其片段为域缺失抗体，其包含类似于免疫球蛋白重链的多肽链，但缺乏一或多个重链域的至少一部分。举例而言，在某些抗体中，经修饰抗体的恒定区的一个完整域将会缺失，例如CH2域的全部或部分将会缺失。
在某些其它实施方案中，结合多肽包含源自不同抗体同型的恒定区(例如来自人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中两个或更多的恒定区)。在其它实施方案中，结合多肽包含嵌合铰链(亦即包含源自不同抗体同型的铰链域(例如IgG4分子的上铰链域及IgG1中间铰链域)的铰链部分的铰链)。在一实施方案中，结合多肽包含人类IgG4分子的Fc区或其部分，及分子的核心铰链区中的Ser228Pro突变(EU编号)。
在某些实施方案中，可使用本领域中已知的技术使Fc部分突变以增大或减小效应功能。举例而言，恒定区域的缺失或不活化(经由点突变或其它手段)可减小循环(circulating)的经修饰抗体的Fc受体结合，由此增大肿瘤定位。在其它情况下，符合本发明的恒定区修饰可能使补体结合缓和，因此减少接合细胞毒素的血清半衰期及非特异性相联。然而，恒定区的其它修饰可用以修饰二硫键或寡糖部分，其因抗原特异性或柔性增大而允许定位增强。修饰的所得生理学概况、生物可用性及其它生物化学作用(诸如肿瘤定位、生物分布及血清半衰期)可使用熟知免疫学技术在无不当实验的情况下来轻易量测及定量。
在某些实施方案中，本发明的抗体中所用的Fc域为Fc变异体。如本文所用，术语“Fc变异体”指相对于产生所述Fc域的野生型Fc域具有至少一个氨基酸取代的Fc域。举例而言，其中Fc域源自人类IgG1抗体，所述人类IgG1Fc域的Fc变异体相对于所述Fc域包含至少一个氨基酸取代。
Fc变异体的氨基酸取代可位于Fc域内任何位置(亦即任何EU常规氨基酸位置)。在一实施方案中，Fc变异体在位于铰链域或其部分的氨基酸位置包含取代。在另一实施方案中，Fc变异体在位于CH2域或其部分的氨基酸位置包含取代。在另一实施方案中，Fc变异体在位于CH3域或其部分的氨基酸位置包含取代。在另一实施方案中，Fc变异体在位于CH4域或其部分的氨基酸位置包含取代。
本发明的结合多肽可采用任何本领域认可的Fc变异体，已知其在效应功能和/或FcR结合方面赋予改进(例如减小或增强)。所述Fc变异体可包括例如以下中公 开的任一氨基酸取代：国际PCT公布WO88/07089A1、WO96/14339A1、WO98/05787A1、WO98/23289A1、WO99/51642A1、WO99/58572A1、WO00/09560A2、WO00/32767A1、WO00/42072A2、WO02/44215A2、WO02/060919A2、WO03/074569A2、WO04/016750A2、WO04/029207A2、WO04/035752A2、WO04/063351A2、WO04/074455A2、WO04/099249A2、WO05/040217A2、WO05/070963A1、WO05/077981A2、WO05/092925A2、WO05/123780A2、WO06/019447A1、WO06/047350A2及WO06/085967A2或美国专利第5,648,260号；第5,739,277号；第5,834,250号；第5,869,046号；第6,096,871号；第6,121,022号；第6,194,551号；第6,242,195号；第6,277,375号；第6,528,624号；第6,538,124号；第6,737,056号；第6,821,505号；第6,998,253号；及第7,083,784号，其各自以引用的方式并入本文中。在一示范性实施方案中，本发明的结合多肽可包含在EU位置268(例如H268D或H268E)上含有氨基酸取代的Fc变异体。在另一示范性实施方案中，本发明的结合多肽可在EU位置239(例如S239D或S239E)和/或EU位置332(例如I332D或I332Q)上含有氨基酸取代。
在某些实施方案中，本发明的结合多肽可包含Fc变异体，该Fc变异体包含改变抗体的抗原独立性效应功能，特别是改变结合多肽的循环半衰期的氨基酸取代。当与缺乏这些取代的结合多肽相比时，这样的结合多肽显示对FcRn的结合增大或减小，因此在血清中的半衰期分别增加或减少。预期具有对FcRn改进亲和性的Fc变异体具有更长血清半衰期，且这样的分子在需要所施用抗体具有长半衰期的治疗哺乳动物的方法中具有适用的应用，例如以治疗慢性疾病或病症。相反地，预期FcRn结合亲和性降低的Fc变异体具有更短半衰期，且这样的分子亦适用于例如向哺乳动物施用，其中循环时间缩短可能有利，例如以便活体内诊断成像，或起始抗体当长时期存在于循环中时具有毒性副作用的情况。FcRn结合亲和性降低的Fc变异体亦不太可能穿过胎盘，因此亦适用于治疗孕妇的疾病或病症。另外，可能需要减小的FcRn结合亲和性的其它应用包括需要脑、肾和/或肝定位的那些应用。在一示范性实施方案中，本发明的经改变结合多肽(例如抗体或其抗原结合片段)显示自脉管系统穿过肾小球上皮的输送减少。在另一实施方案中，本发明的经改变结合多肽(例如抗体或其抗原结合片段)显示自脑部穿过血脑障壁(BBB)进入血管空间的输送减少。在一实施方案中，具有改变的FcRn结合的抗体包含在Fc域的“FcRn结合环”内具有一或多个氨基酸取代的Fc域。FcRn结合环包含氨基酸残基280-299(根据EU编号)。以引用的方式并入本文中的国际PCT公布第WO05/047327号公开改变FcRn结合活性的示范性氨基酸取代。在某些示范性实施方案中，本发明的结合多肽(例如抗体或其抗原结合片段)包含具有一或多个以下取代的Fc域：V284E、H285E、N286D、K290E及S304D(EU编号)。
在其它实施方案中，用于本文所述的诊断及治疗方法的结合多肽具有恒定区，例如IgG1或IgG4重链恒定区，其经改变以减少或消除糖基化。举例而言，本发 明的结合多肽(例如抗体或其抗原结合片段)亦可包含Fc变异体，该Fc变异体包含改变抗体Fc的糖基化的氨基酸取代。举例而言，所述Fc变异体可具有减少的糖基化(例如N连接或O连接糖基化)。在示范性实施方案中，Fc变异体包含减少糖基化的N连接聚糖，其通常见于氨基酸位置297(EU编号)。在另一实施方案中，抗体在糖基化基序(例如含有氨基酸序列NXT或NXS的N连接糖基化基序)附近或内部具有氨基酸取代。在一具体实施方案中，抗体包含在氨基酸位置228或299(EU编号)具有氨基酸取代的Fc变异体。在更具体的实施方案中，抗体包含IgG1或IgG4恒定区，该恒定区包含S228P及T299A突变(EU编号)。
以引用的方式并入本文中的国际PCT公布第WO05/018572号公开赋予减少或改变的糖基化的示范性氨基酸取代。在优选实施方案中，修饰本发明的抗体或其片段以消除糖基化。这样的抗体或其片段可称为“无糖基化(agly)”抗体或其片段(例如“无糖基化”抗体)。尽管不受理论约束，但认为“无糖基化”抗体或其片段可具有改进的活体内安全性及稳定性概况。示范性无糖基化抗体或其片段包含IgG4抗体的无糖基化(aglycosylated)Fc区，其缺乏Fc效应功能，由此消除对表达PDGFRβ的正常重要器官造成Fc介导性毒性的可能。在其它实施方案中，本发明的抗体或其片段包含经改变的聚糖。举例而言，抗体可在N聚糖上在Fc区的Asn297处具有减少数目的海藻糖残基，亦即经无海藻糖基化(afucosylated)。在另一实施方案中，抗体可在N聚糖上在Fc区的Asn297处具有改变数目的唾液酸残基。
iii)共价连接
可如下修饰本发明的结合多肽：例如使分子共价连接于结合多肽以使共价连接不会阻止结合多肽特异性结合于其同源表位。举例而言，但无限制，本发明的抗体或其片段可通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻隔基的衍生、蛋白水解切割、连接于细胞配体或其它蛋白质等来修饰。众多化学修饰中任一个均可通过已知技术进行，所述已知技术包括(但不限于)特异性化学切割、乙酰化、甲酰化等。另外，衍生物可含有一或多个非经典氨基酸。
本发明的结合多肽(例如抗体或其片段)可进一步与异源多肽在N端或C端重组融合或与多肽或其它组分化学接合(包括共价及非共价接合)。举例而言，抗PDGFRβ抗体可与适用作检测分析中标记的分子及效应分子(诸如异源多肽、药物、放射性核素或毒素)重组融合或接合。参见例如PCT公布WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美国专利第5,314,995号；及EP 396,387。
可使用本领域中已知的方法使结合多肽与异源多肽融合以增加活体内半衰期或用于免疫分析。举例而言，在一实施方案中，PEG可与本发明的结合多肽接合以增加其活体内半衰期。Leong,S.R.等人,Cytokine 16:106(2001)；Adv.in Drug Deliv.Rev.54:531(2002)；或Weir等人,Biochem.Soc.Transactions30:512(2002)。
此外，本发明的结合多肽可与标记序列(诸如肽)融合以有助于其纯化或检测。在优选实施方案中，标记氨基酸序列为六组氨酸肽，诸如为在pQE载体中提供的 标签(QIAGEN公司,9259Eton Avenue,Chatsworth,Calif.,91311)，其中许多为商业上可获得的。如Gentz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821-824(1989)中所述，举例而言，六组氨酸为融合蛋白提供便利的纯化。适用于纯化的其它肽标签包括(但不限于)“HA”标签，其对应于源自流感血球凝集素蛋白的表位(Wilson等人,Cell37:767(1984))，及“flag”标签。
本发明的结合多肽可以非接合形式使用或可与各种分子中至少一个接合，例如以改进分子的治疗性质以有助于靶检测，或用于患者的成像或疗法。本发明的结合多肽可纯化之前或之后、在进行纯化时经标记或接合。具体地，本发明的结合多肽可与治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物应答调节剂、医药剂或PEG接合。
本发明进一步涵盖接合至诊断剂或治疗剂的本发明的结合多肽。结合多肽可以诊断方式用以例如监测免疫细胞病症(例如CLL)的发展或进展(作为临床测试程序的部分)以例如确定既定治疗和/或预防方案的功效。使结合多肽与可检测物质偶联可有助于检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属(使用各种正电子发射断层摄影术)及非放射性顺磁性金属离子。参见例如美国专利第4,741,900号关于可与根据本发明的适用作诊断物的抗体相接合的金属离子。适合酶的实例包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合辅基复合物的实例包括抗生蛋白链菌素/生物素及抗生物素蛋白/生物素；适合荧光材料的实例包括伞酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺(dichlorotriazinylamine)荧光素、丹磺酰氯或藻红素；发光材料的实例包括流明诺(luminol)；生物发光材料的实例包括荧光素酶、荧光素及水母发光蛋白(aequorin)；且适合放射性材料的实例包括125I、131I、111In或99Tc。
用于本文公开的诊断及治疗方法的结合多肽可与以下接合：细胞毒素(诸如放射性同位素、细胞毒性药或毒素)治疗剂、细胞生长抑制剂、生物毒素、前药、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物应答调节剂、医药剂、免疫活性配体(例如淋巴介质或其它抗体，其中所得分子结合于赘生细胞及效应细胞，诸如T细胞)或PEG。
在另一实施方案中，用于本文公开的诊断及治疗方法的抗PDGFRβ抗体可与降低肿瘤细胞生长的分子接合。在其它实施方案中，所公开的组合物可包含与药物或前药偶合的抗体或其片段。本发明的其它实施方案包含与特异性生物体毒素或其细胞毒素片段(诸如蓖麻毒蛋白(ricin)、白树素(gelonin)、绿脓杆菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)或白喉毒素)接合的抗体或其片段的用途。选择何种接合或非接合抗体加以使用将视癌症类型及阶段、辅助治疗(例如化学疗法或外部辐射)的使用及患者病状而定。应了解，本领域技术人员可鉴于本文启示来轻易进行此选择。
应了解，在先前研究中，以同位素标记的抗肿瘤抗体已成功用以破坏动物模 型中以及在一些情况下在人类中的肿瘤细胞。示范性放射性同位素包括：90Y、125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re及188Re。放射性核素通过产生电离辐射来起作用，电离辐射引起核DNA中多链断裂，从而使得细胞死亡。用以产生治疗性接合的同位素通常产生具有短路径长度的高能α或β粒子。这样的放射性核素杀死其紧邻的细胞，例如接合物已连接或已进入的赘生细胞。其对非局部化细胞具有极少影响或无影响。放射性核素为基本上非免疫原性。
IV.结合多肽的表达
在如上所述操作经分离遗传物质以提供本发明的结合多肽后，通常将基因插入表达载体中以便引入可用以产生所需量的所要求的抗体或其片段的宿主细胞中。
术语“载体”或“表达载体”在本文中用于说明书及权利要求的目的，意思是根据本发明所用的载体，其用作将所需基因引入细胞中及在细胞中表达的运载体。如本领域技术人员已知，这样的载体可轻易选自质粒、噬菌体、病毒及反转录病毒。一般而言，与本发明相容的载体将包含选择标记、适当限制位点以有助于克隆所需基因及进入真核或原核细胞和/或在其中复制的能力。
众多表达载体系统可用于本发明的目的。举例而言，一类的载体利用源自动物病毒的DNA元件，所述动物病毒诸如为牛乳突状瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘疮病毒、杆状病毒、反转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒。其它涉及使用具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统。另外，可通过引入一或多个允许选择经转染宿主细胞的标记来选择已将DNA整合于其染色体中的细胞。标记可提供营养缺陷宿主的原养型、杀生物剂抗性(例如抗生素)或抗重金属(诸如铜)性。可选标记基因可直接连接至待表达的DNA序列，或通过共转化引入相同细胞中。亦可能需要其它元件来最佳地合成mRNA。这样的元件可包括信号序列、剪接信号、以及转录启动子、强化子及终止信号。在尤其优选的实施方案中，将克隆的可变区基因以及如上所述合成的重链及轻链恒定区基因(优选为人类)插入表达载体中。
在其它优选实施方案中，本发明的结合多肽或其片段可使用多顺反子构建体来表达。在这样的表达系统中，诸如抗体的重链及轻链的目标多基因产物可自单一多顺反子构建体制得。这样的系统有利地使用内部核糖体进入位点(IRES)以在真核宿主细胞中提供相对高水平的本发明多肽。并入本文中的美国专利第6,193,980号中公开相容性IRES序列。本领域技术人员应了解，这样的表达系统可用以有效制得本申请案中公开的整套多肽。
更一般而言，一旦已制备载体或编码抗体或其片段的DNA序列，表达载体即可引入适当宿主细胞中。亦即，可转化宿主细胞。可通过本领域技术人员熟知的各种技术来实现将质粒引入宿主细胞中。其包括(但不限于)转染(包括电泳及电穿 孔)、原生质体融合、磷酸钙沈淀、与包膜DNA细胞融合、显微注射及以完整病毒感染。参见Ridgway,A.A.G.“Mammalian Expression Vectors”第24.2章,第470-472页,Vectors,Rodriguez及Denhardt编,(Butterworths,Boston,Mass.1988)。最优选地，经由电穿孔将质粒引入宿主中。使转化细胞在适于产生轻链及重链的条件下生长，且分析重链和/或轻链蛋白质合成。示范性分析技术包括酶联免疫吸附剂分析法(ELISA)、放射免疫分析(RIA)或荧光活化细胞分选器分析(FACS)、免疫组织化学等。
如本文所用，术语“转化”应以广义使用以指将DNA引入受体宿主细胞，其改变基因型，因此产生在受体细胞中的变化。
按照这样相同思路，“宿主细胞”指已用使用重组DNA技术构建且编码至少一种异源基因的载体已经转化的细胞。在自重组宿主分离多肽的方法的描述中，除非另外明确规定，否则术语“细胞”与“细胞培养物”可互换使用以表示抗体来源。换言之，自“细胞”回收多肽可意谓自短暂离心的全细胞，或自含有培养基与悬浮细胞的细胞培养物回收。
在一实施方案中，用于抗体表达的宿主细胞系具有哺乳动物来源；本领域技术人员可确定具体宿主细胞系，其最适于所需基因产物表达于其中。示范性宿主细胞系包括(但不限于)DG44及DUXB11(中国仓鼠卵巢细胞系(Chinese Hamster Ovary line)，DHFR-)、HELA(人类子宫颈癌)、CVI(猴肾细胞系)、COS(具有SV40T抗原的CVI衍生物)、R1610(中国仓鼠纤维母细胞)BALBC/3T3(小鼠纤维母细胞)、HAK(仓鼠肾细胞系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人类淋巴细胞)、293(人类肾)。在一实施方案中，细胞系提供由此表达的抗体的经改变糖基化，例如无海藻糖基化(例如PER.C6.RTM.(Crucell)或FUT8基因敲除CHO细胞系(Potelligent.RTM.Cells)(Biowa,Princeton,N.J.))。在一实施方案中，可使用NS0细胞。CHO细胞尤其优选。宿主细胞系通常可获自商业服务、美国组织培养物收藏中心(American Tissue Culture Collection)或获自公开文献。
体外制造允许扩大规模以得到大量所需多肽。在组织培养条件下进行哺乳动物细胞培养的技术为本领域中已知且包括均质悬浮液培养物，例如在气升式反应器中或在连续搅拌反应器中，或固定或里入(entrap)的细胞培养物，例如在中空纤维、微胶囊中、在琼脂糖微珠或陶瓷筒上。必要和/或需要时，多肽溶液可通过惯用层析方法纯化，所述方法例如为凝胶过滤、离子交换层析、DEAE-纤维素层析和/或(免疫)亲和性层析。
编码本发明的结合多肽或其片段的基因亦可为表达的非哺乳动物细胞，诸如细菌或酵母或植物细胞。就此而言，应了解各种单细胞非哺乳动物微生物(诸如细菌)亦可被转化；亦即那些能够在培养物中生长或发酵的。易转化的细菌包括肠内菌科(enterobacteriaceae)成员，诸如以下的菌株：大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)；芽孢杆菌科(Bacillaceae)，诸如枯草杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎 球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)及流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)。应进一步了解，当在细菌中表达时，多肽可变成包涵体的部分。多肽必须经分离、纯化及接着组装入功能分子中。
除原核生物外，亦可使用真核微生物。啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)或常见烘焙酵母(baker's yeast)在真核微生物中为最常用，但通常可用许多其它菌株。为在酵母菌中表达，常用质粒YRp7，例如(Stinchcomb等人,Nature,282:39(1979)；Kingsman等人,Gene,7:141(1979)；Tschemper等人,Gene,10:157(1980))。此质粒已含有TRP1基因，其为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株(ATCC编号44076或PEP4-1)提供选择标记(Jones,Genetics,85:12(1977))。作为酵母宿主细胞基因组表征的trpl病变存在接着通过在不存在色氨酸下生长为检测转化提供有效环境。
V.结合多肽的药物制剂及施用方法
在另一方面，本发明提供包含抗PDGFRβ抗体或其片段的药物组合物。
制备本发明的抗体或其片段及将其施用至受试者的方法为本领域技术人员所熟知或由本领域技术人员轻易确定。本发明的抗体或其片段的施用途径可以是口服、肠胃外、通过吸入或局部。如本文所用，术语非经肠包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、经直肠或经阴道施用。非经肠施用的静脉内、动脉内、皮下及肌肉内形式一般为优选。尽管所有这些施用形式均明确涵盖于本发明的范畴内，但施用形式将为注射用溶液，特别用于静脉内或动脉内注射或点滴。适用于注射的药物组合物通常可包含缓冲剂(例如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)、界面活性剂(例如聚山梨醇酯)、任选地稳定剂(例如人类白蛋白)等。然而，在与本文启示相容的其它方法中，多肽可直接传递至不利细胞群体的位点，由此增加疾病组织对治疗剂的暴露。
用于非经肠施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液及乳液。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油)及可注射有机酯(诸如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水及缓冲介质。在主题发明中，药学上可接受的载体包括(但不限于)0.01-0.1M及优选0.05M磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。其它常见非经肠媒剂包括磷酸钠溶液、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)、右旋糖及氯化钠、乳酸化林格氏液，或不挥发性油。静脉内媒剂包括流体及营养素补充剂、电解液补充剂，诸如基于林格氏右旋糖的物等。亦可存在防腐剂及其它添加剂，诸如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂及惰性气体等。更具体地，适用于可注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(其中水溶性)或分散液及无菌散剂以便临时制备无菌可注射溶液或分散液。在这样的情况下，组合物必须无菌且应为流体(至存在易可注射性的程度)。其应在制造及储存条件下稳定且优选将免受诸如细菌及真菌的微生物的污染作用而保藏。载体可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液体聚乙二醇等)及其适合混合物的溶剂或分散介质。适 当流动性可例如通过使用包衣(诸如卵磷脂)、在分散液情况下通过维持所需粒度及通过使用界面活性剂来维持。防止微生物作用可通过各种抗细菌剂及抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、乙汞硫柳酸钠等)来达成。在许多情况下，组合物中优选包括等张剂，例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。可注射组合物的长久吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝及明胶)来达成。
在任何情况下，无菌可注射溶液均可如下制备：将活性化合物(例如单独的抗体或抗体与其它活性剂组合)根据需要以所需量并入具有一种本文所列举的成分或其组合的适当溶剂中，接着进行过滤灭菌。一般而言，分散液通过将活性化合物并入无菌媒剂中来制备，该无菌媒剂含有碱性分散介质及来自上文列举那些的所需其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌散剂的情况下，优选制备方法为真空干燥及冷冻干燥，其得到活性成分加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何其它所需成分的散剂。根据本领域中已知的方法处理注射用制剂、填充至诸如安瓿、袋子、瓶子、注射器或小瓶的容器中，及在无菌条件下密封。此外，制剂可以诸如同在申请中的美国专利序号第09/259,337号及美国专利序号第09/259,338号(其各自以引用的方式并入本文中)中所述的试剂盒形式包装及出售。这样的制品将优选具有标记或包装说明书来指示相关组合物适用于治疗罹患或易患自体免疫病症或赘生性病症的受试者。
治疗上述病状的本发明的稳定化抗体或其片段的有效剂量视许多不同因素而变化，所述因素包括施用手段、靶部位、患者生理状态、患者为人类或动物、所施用的其它医药及治疗为预防性的或治疗性的。通常，患者为人类，但亦可治疗包含转基因哺乳动物的非人类哺乳动物。治疗剂量可使用本领域技术人员已知的常规方法滴定以使安全性及功效最佳化。
为用本发明的抗体进行被动免疫，剂量可介于例如约0.0001至100mg/kg且更通常介于0.01至5mg/kg(例如0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg等)宿主体重的范围内。举例而言，剂量可为1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内，优选为至少1mg/kg。上述范围中间的剂量亦意欲在本发明的范畴内。
可每日、隔日、每周或根据经验分析确定的任何其它时程向受试者施用这样的剂量。示范性治疗需要历经长时期(例如至少六个月)施用多次剂量。其它示范性治疗方案需要每两周施用一次或一月施用一次或每3至6个月施用一次。示范性剂量时程包括在连续日1-10mg/kg或15mg/kg、隔日30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中，同时施用两种或更多具有不同结合特异性的单克隆抗体，在该情况下，各抗体的施用剂量可属于指定范围内。
本发明的抗体或其片段可在多个场合下施用。单次剂量之间的间隔可为例如每日、每周、每月或每年。间隔亦可不规则，如通过量测患者体内多肽或靶分子 的血液水平所示。在一些方法中，调整剂量以达成某一血浆抗体或毒素浓度，例如1-1000μg/ml或25-300μg/ml。或者，抗体或其片段可以作为持续释放制剂来施用，在该情况下需要以更小频率施用。剂量及频率视患者体内抗体半衰期而变化。一般而言，人化抗体显示最长半衰期，接着为嵌合抗体及非人类抗体。在一实施方案中，本发明的抗体或其片段可以以非接合形式施用。在另一实施方案中，本发明的抗体可以以接合形式多次施用。在又一实施方案中，本发明的抗体或其片段可以以非接合形式施用，接着以接合形式施用，或反之亦然。
施用剂量及频率可视治疗为预防性的或治疗性的而变化。在预防性应用中，向尚未处于疾病状态的患者施用含有本发明的抗体或其混合物的组合物以增强患者抵抗力。此量定义为“预防性有效剂量”。在此用途中，精确量又视患者健康状况及全身免疫性而定，但一般介于每剂0.1至25mg，特别每剂0.5至2.5mg的范围内。以相对不频繁的间隔施用相对较低剂量历经一长段时间。一些患者在其余生继续接受治疗。
在治疗性应用中，有时需要相对较短间隔下的相对较高剂量(例如每剂约1至400mg/kg抗体，其中5至25mg的剂量更常用于辐射免疫接合物及更高剂量用于细胞毒素-药物接合分子)直至疾病进展减小或终止为止，且优选直至患者显示疾病症状部分或完全改善为止。此后，可向患者施用预防性方案。
在一实施方案中，可用编码本发明的多肽的核酸分子(例如在载体中)治疗受试者。编码多肽的核酸的剂量介于每个患者约10ng至1g、100ng至100mg、1μg至10mg或30-300μg DNA的范围内。感染性病毒载体的剂量自每剂10-100个或更多病毒粒子变化。
治疗剂可通过非经肠、表面、静脉内、经口、皮下、动脉内、颅内、腹膜内、鼻内或肌肉内手段来施用以便预防性和/或治疗性治疗。对于施用本发明的抗体，肌肉内注射或静脉内输注为优选。在一些方法中，将治疗性抗体或其片段直接注射至颅腔中。在一些方法中，以持续释放组合物或装置(诸如MedipadTM装置)形式施用抗体或其片段。
本发明的试剂可任选地与有效治疗需要治疗(例如预防性或治疗性)的病症或病状的其它试剂组合施用。优选其它试剂为本领域认可的且标准式施用以用于特定病症的试剂。
90Y标记的本发明抗体的有效单次治疗剂量(亦即治疗有效量)介于约5与约75mCi之间、更优选地介于约10与约40mCi之间的范围内。131I标记的抗体的有效单次治疗非骨髓去除性剂量介于约5与约70mCi之间、更优选地介于约5mCi与约40mCi之间的范围内。131I标记的抗体的有效单次治疗去除性剂量(亦即可能需要自体骨髓移植)介于约30与约600mCi之间、更优选地介于约50与小于约500mCi之间的范围内。结合嵌合修饰抗体，由于相对于鼠类抗体的更长循环半衰期，因此碘-131标记的嵌合抗体的有效单次治疗非骨髓去除性剂量介于约5与约40 mCi之间、更优选地在小于约30mCi的范围内。例如111In标记的成像准则通常小于约5mCi。
尽管用131I及90Y已获得了许多临床经验，但其它放射性标记为本领域中已知且已用于类似目的。将其它放射性同位素用于成像。举例而言，与本发明范畴相容的其它放射性同位素包括(但不限于)123I、125I、32P、57Co、64Cu、67Cu、77Br、81Rb、81Kr、87Sr、113In、127Cs、129Cs、132I、197Hg、203Pb、206Bi、177Lu、186Re、212Pb、212Bi、47Sc、105Rh、109Pd、153Sm、188Re、199Au、225Ac、211A、213Bi。就此而言，α、γ及β发射体均与本发明相容。此外，鉴于本公开，本领域技术人员认为可在无不当实验的情况下轻易确定何种放射性核素与所选疗程相容。为此目的，已用于临床诊断中的其它放射性核素包括125I、123I、99Tc、43K、52Fe、67Ga、68Ga，以及111In。亦用多种放射性核素标记抗体以便可能用于靶向免疫疗法中(Peirersz等人,Immunol.Cell Biol.65:111-125(1987))。这样的放射性核素以较少程度包括188Re及186Re以及199Au及67Cu。美国专利第5,460,785号提供关于这样的放射性同位素的其它资料且以引用的方式并入本文中。
如先前讨论，本发明的抗体或其片段可以药学上有效量施用以便活体内治疗哺乳动物病症。就此而言，应了解，所公开的抗体或其片段将经调配以便有助于施用活性剂及促进活性剂稳定性。根据本发明的药物组合物优选包含药学上可接受的无毒性无菌载体，诸如生理盐水、无毒缓冲剂、防腐剂等。出于本申请的目的，与治疗剂接合或未接合的本发明抗体的药学上有效量应被认为意思是足以达成有效结合于靶及达成益处(例如改善疾病或病症的症状或检测物质或细胞)的量。在肿瘤细胞的情况下，多肽优选将能够与赘生细胞或免疫活性细胞上的所选免疫活性抗原相互作用且提供那些细胞死亡的增加。当然，本发明的药物组合物可以单次或多次剂量施用以提供药学上有效量的多肽。
与本公开的范畴相一致，可根据上述治疗方法以足以产生治疗性或预防性作用的量向人类或其它动物施用本发明的抗体。本发明的多肽可以通过根据已知技术组合本发明的抗体与药学上可接受的常规载体或稀释剂制备的常规剂型向此人类或其它动物施用。本领域技术人员应认识到，药学上可接受的载体或稀释剂的形式及特征通过与其组合的活性成分的量、施用途径及其它熟知变数来规定。本领域技术人员应进一步了解，可证明包含一种或更多种本发明多肽物质的混合物尤其有效。
VI.治疗PDGFRβ相关疾病或病症的方法
本发明的结合多肽或其片段适用于拮抗PDGFRβ活性。因此，在另一方面，本发明提供通过向有需要的受试者施用包含一种或更多种本发明的抗PDGFRβ抗体或其抗原结合片段的药物组合物来治疗PDGFRβ相关疾病或病症的方法。
接受治疗的PDGFRβ相关疾病或病症包括(不限于)：年龄相关的黄斑变性 (AMD)；再狭窄，包括动脉血管手术、粥样斑切除术(atherectomy)或其它斑块移除侵入法后冠脉再狭窄，及相同程序后肾或周边动脉再狭窄；与其它急性损伤形式相关的血管增生现象及纤维化，诸如：与成人呼吸窘迫症候群相关的肺纤维化、与肾炎相关的肾纤维化、与川崎病(Kawasake's disease)相关的冠脉狭窄，及与其它动脉炎(诸如高安病(Takayasha'sdisease))相关的血管变窄；纤维变性过程，诸如硬皮病、肌纤维变性；及癌症(例如肿瘤细胞增殖及新血管生成)
本领域技术人员应能够通过常规实验来确定用于治疗PDGFRβ相关疾病或病症的目的的抗体(或其它治疗剂)的有效、无毒量。举例而言，多肽的治疗活性量可根据诸如以下的因素而变化：受试者的疾病阶段(例如I阶段相对于IV阶段)、年龄、性别、医学并发症(例如免疫抑制的病状或疾病)及体重，及抗体在受试者体内引发所需反应的能力。可调整给药方案以提供最佳治疗反应。举例而言，可每日施用若干分次剂量，或剂量可如由治疗情况的急迫性所指定按比例减少。然而，一般而言，预期有效剂量在每公斤体重每日约0.05至100毫克且更优选地在每公斤体重每日约0.5至10毫克的范围内。
实施例
本发明是由以下实例进一步说明，不应将所述以下实例视为作进一步限制。序列表、附图及在整个本申请案中引用的所有参考文献、专利及公开专利申请的内容均以引用的方式明确并入本文中。
实施例1：分离特异性结合于人类PDGFRβ的VH域
使用如WO2010/011944(以全文引用的方式并入本文中)中所示的DNA展示来选择特异性结合于人类PDGFRβ的VH域。特别地，针对人类PDGFRβ，对源自十个骨髓供体的原生人类VH域DNA展示文库进行六轮选择。克隆所选结合物且对其测序。自此筛选选择VH域克隆A4、B4及G2，其氨基酸序列阐述于表3中。
实施例2：HCDR3改组
A.VH文库构建
为筛选具有结合特征改进的VH域，将克隆A4(指定为XB1511)的HCDR3序列改组至原生人类VH文库中，针对结合于人类及小鼠PDGFRβ对其进行进一步选择。特别地，合成编码克隆A4的HCDR3(SEQ ID NO:1)的DNA序列且使用构架特异性寡核苷酸将其组装至包含自骨髓B细胞及PBMC扩增的原生人类VH域的构架区1-3的文库中。使用5'VH家族特异性及3'通用FR3反向引物来扩增人类VH构架区1-3以产生VH家族构架区的个别文库。通过使用5'T7TMV及3'XB1511FR3CDR3FR4寡核苷酸进行进一步PCR扩增来改组VH家族构架文库及XB1511HCDR3。此亦在5'末端添加T7TMV启动子序列以便体外转录/翻译。亦通过分别 使用FR4Cu3反向及Y109引物以及5'T7TMV引物进行PCR来添加C端Cμ3序列及FLAG标签(用于翻译后纯化)。表5中阐述用于制备HCDR3改组VH文库的寡核苷酸的核酸序列。图1中阐述VH文库构建的示意图。
表5：用于构建HCDR3改组VH文库的寡核苷酸
B.文库筛选
接着将HCDR3改组VH域文库转录至mRNA文库中且用如WO2010/011944中所述的dsDNA展示技术进行选择。以交替的轮用人类及小鼠PDGFRβ进行选择4轮。在连续轮应用动力学控制的吸附及解离速率筛选以提高选择严谨性，因此选择对PDGFRβ具有高亲和性的VH域。具体地，如下进行选择：第1轮(R1)用10nM固定的人类PDGFRβ；R2用固定的100nM小鼠PDGFRβ；R3用10nM可溶人类PDGFRβ且与200nM固定的人类PDGFRβ竞争24小时及120小时；且R4用10nM小鼠PDGFRβ。亚克隆R4结合池以便DNA测序。R4结合池的序列分析显示XB1511的HCDR3存在于多种不同构架内容中。自所分析的序列组未获得野生型亲本序列。本文表3中阐述所选VH域的氨基酸序列。
C.所选HCDR3改组VH域的结合特异性
使用35S Met标记的体外翻译文库评估上文所选的R4结合池对人类与小鼠PDGFRβ的结合。具体地，评估所述池对环氧树脂珠粒、100nM人类IgG、人类PDGFRβ及小鼠PDGFRβ的结合。如图2中所示，亲本XB1511VH域显示特异性结合于人类PDGFRβ，且不可检测地结合于小鼠PDGFRβ。构架改组预选文库显 示对人类PDGFRβ的弱结合。然而，相反地，R4构架改组文库显示显著结合于人类与小鼠PDGFRβ。
实施例3：鉴定稳定VL/VH对
A.构建VL DNA文库
通过RT-PCR自年轻健康供体(Allcells)的B细胞构建人类VL文库(Vκ及Vλ)。为确保文库多样性，自十个供体获得3亿个骨髓单核细胞及1亿个周边血液单核细胞且用于原生VH及VL文库构建。图3中阐述文库产生方法的示意图。
如表4中所述来设计用于Vκ及Vλ序列的cDNA合成及后续PCR扩增的寡核苷酸引物。具体地，自具有上游UTR序列的各家族的Vκ及VλFR1区设计多种正义引物。自嵌套于Cκ1(Cκ2)或具有相同Cκ2下游的Jλ(JλCκ2)的恒定区设计用于κ及λ基因扩增的反义引物。Vκ与Vλ文库携带相同C端序列以便在选择周期期间进行PCR扩增。
使用FastTrack mRNA制备试剂盒(Invitrogen)按照试剂盒所提供的方案自个别供体制备mRNA。使用对轻链κ及λ恒定区(Cκ1及Cλ1)具有特异性的引物自经分离mRNA合成第一链cDNA。
用Cκ2及Vκ家族特异性或JλCκ2混合物及Vλ家族特异性引物使用cDNA作为模板进行Vκ及Vλ序列的PCR扩增。对个别Vκ及Vλ家族及个别供体进行PCR持续18-20个周期。在凝胶纯化后，汇集来自各不同来源的Vκ及Vλ文库以产生最终Vκ及Vλ文库。
表6：用于构建人类Vλ及VκDNA展示文库的寡核苷酸
B.通过dsDNA展示产生VL融合文库
使用T7Megascript试剂盒(Invitrogen,目录号AM1334)将使用本实施例中所述的方法产生的Vκ及VλDNA文库转录至mRNA文库中。用RNeasy MinElute Cleanup试剂盒(Qiagen,目录号74204)按照试剂盒所提供的方案来纯化mRNA。如WO2010/011944中所述，总共600pmol RNA(300pmol Vκ及Vλ文库)与dsDNA展示连接子及组分接合及组装。对组装的VL文库进行体外翻译以产生融合文库，其中各VL域(表型)与其编码序列(基因型)稳定融合。将35S Met并入翻译过程中以对融合物进行放射性标记。该文库接着用寡聚dT纤维素纯化、使用反转录的标准分子生物学技术转化为dsDNA展示文库、RNaseH分解、第2链DNA合成，接着进行flag标签纯化。
C.识别XB1511及XB2202VH域的VL对
将XB1511VH域翻译为游离蛋白质(将35S Met并入翻译反应中)且经由c端flag标签进行亲和性纯化。接着以等摩尔比混合XB1511VH域与纯化的VL域融合物文库(如上制备)，且在25℃下孵育过夜以使VH与VL融合域经由其疏水片来体外相联。接着使混合物与预固定于Epoxy450珠粒上或溶液中的PDGFRβ靶接触，且由蛋白质A珠粒捕获，洗涤结合于固定的PDGFRβ靶的复合物且用0.1N KOH洗脱。用VL特异性引物组进行PCR以回收结合于PDGFRβ靶的VL，两者均呈VH-VL对且呈不成对VL域。进行3轮VL成对，前2轮具有低严谨性(100nMPDGFRβ)以及第三轮具有高严谨性(10nM PDGFRβ)。两轮类似地，XB2202VH域亦与VL文库成对。对于各轮XB2202/VL成对及选择，如下提高严谨性：通过动力学的控制的吸附及解离速率策略，以鉴定与XB2202VH域稳定成对的VL域且增强VH结合。
接着将上文鉴定的VL域池克隆至Blunt Zero TOPO载体(Invitrogen)中，且通过使用M13正向及反向引物进行PCR自所得菌落扩增编码VL DNA序列。接着对个别的经扩增的编码VL DNA序列进行测序。自VL池获得的序列数据显示VL的多样谱经由该方法得到增浓。多个家族及构架存在于池中。若干VL以复本或家族形式存在。可鉴定独特VL家族且若干VL存在不止一次。本文表4中阐述使用本发明方法鉴定的与PDGFRβ结合VH域XB1511及XB2202成对的示范性VL序列。
D.评估经鉴定的VH与VL对
为评估经鉴定VH-VL对的特征，通过体外翻译或通过大肠杆菌(E.coli)表达来构建及产生10-12个来自各池的scFV，接着进行亲和性纯化。
进行PDGFRβ结合ELISA分析以评估scFv对固定PDGFRβ的结合且确定EC50。具体地，在4℃下将PBS中的2μg/mL人类PDGFRβ及人类Fc或IgG固定于Maxisorp板上过夜。接着洗涤该板且用superblock封闭。将体外翻译的粗scFv溶解产物1:3稀释于1×PBST中。将100μl稀释scFv溶解产物上样至Maxisorp板 的各孔中且在室温下孵育1小时。通过抗flag抗体-HRP(在1:5000稀释度下)及TMB底物来检测结合于固定PDGFRβ的scFv。在OD 450nm下进行终点分析的Molecular Device板读取器上读取该板。如第4、5及6图中所示，在ELISA结合分析中，对于XB1511及XB2202产生的scFv中大于50％显示特异性结合于PDGFRβ。相反地，单独的不成对VL不显示结合于PDGFRβ(参见图7)。
通过基于溶液的平衡结合分析确定若干scFv的亲和性。具体地将120pmol的scFvRNA翻译至并有35S Met的游离蛋白质中。在含有1×PBS与0.025％氚核(triton)、1mg/mLBSA及0.1mg/mL sssDNA的结合缓冲液中将经翻译反应混合物稀释至3倍。将人类PDGFRβ在同一结合缓冲液中稀释至100nM至0nM的最终浓度。将稀释的scFv混合物与hPDGFRβ一起以100μl的最终体积在Kingfisher板(Thermofisher Scientific,97002084)上孵育。在孵育之后，使用25μl蛋白质A磁性珠粒(Invitrogen)以自溶液中捕获PDGFRβ。洗涤捕获的PDGFRβ且在kingfisher Reader(Thermofisher Scientific)中洗脱。使用闪烁计数器对结合于磁性珠粒-固定hPDGFRβ的scFv(以35S Met标记)的量进行计数，且用Graph Pad Prism 5计算Kd。对于所测试的XB1511源性scFv，当与单独的XB1511VH相比时，2个scFv显示高8-10倍的Kd，1个显示高2.5倍的Kd，且4个显示类似Kd(图8)。仅1个scFv显示低于单独的XB1511VH的KD。如图9中所示，当与单独的XB2202VH相比时，所测试的XB2202源性scFv均显示约8-10倍更好的Kd。
实施例4：抗PDGFRβVH域对人类及小鼠PDGFRβ的结合亲和性
将实施例2中所选的R4构架改组的人类及小鼠PDGFRβ增浓的VH域池克隆至大肠杆菌表达载体中、产生及纯化。在Biacore T100上使用表面等离子体共振确定VH域对人类及小鼠PDFGR的结合动力学。简言之，使用与抗hIgG1Fc单克隆抗体偶合的Series CM5感测晶片(CM5)分别固定人类及小鼠PDGFR-hIgG1-Fc嵌合融合蛋白。对于各周期，首先捕获PDGFR融合蛋白，接着以100μL/min的流动速率注射VH115秒(相联)。在相联阶段之后立即为600秒的解离阶段。在各周期单次注射3M MgCl2(10μL/min，60秒)使表面再生。注射多种浓度的VH域(0.55nM-40nM)且用T100Evaluation软件来分析所得感测图。使用1:1结合曲线拟合来确定结合动力学。第10、11及12图中分别展示VH域克隆XB2202及XB2708对人类及小鼠PDGFRβ的结合动力学。这样的结果显示XB2202及XB2708与亲本XB1511相比亲和性改进50-150倍。具体地，XB2202及XB2708的Kd分别为249pM及93pM，且解离速率(Koff)分别为1.86×10-3及9.267×10-4。XB2202与XB2708均结合于人类及小鼠PDGFRβ。尤其请注意，尽管其共用相同HCDR3，但XB2202源自VH1家族生殖系序列且XB2708源自VH3家族生殖系序列。
实施例5：抑制PDGFBB结合至PDGFRβ
使用表面等离子体共振在Biacore T100上评估本文公开的XB2202VH域拮抗PDGFBB配体结合于人类PDFGRb的能力。简言之，使用与抗hIgG1Fc单克隆抗体偶联的SeriesCM5感测晶片固定人类PDGFR-hIgG1-Fc嵌合融合蛋白。将10nM人类PDGFBB注射于预捕获的人类PDGFRβ，获得在不存在VH下对PDGFRβ的100％结合反应单元。对于各连续周期，首先捕获PDGFR融合蛋白，接着注射VH域120秒。在冲掉未结合的VH域后，接着注射10nM的PDGFBB持续120秒。在各周期单次注射3M MgCl2(10μL/min，60秒)使表面再生。注射多种浓度的VH(0.46nM-60nM)，用T100Evaluation软件来分析所得感测图，且计算PDGFBB结合抑制。如图13中所示，XB2202以小于5nM的IC50抑制PDGFBB结合于人类PDFGRb。
实施例6：抑制周细胞迁移
确定本文公开的XB2708VH域拮抗PDGF-BB诱导性体外周细胞迁移的能力。自CellSystems Corporation(Kirkland,WA)获得初级人类视网膜周细胞且根据制造商建议使用CSC完整生长介质来培养。将约125个细胞(2-5继代)接种于涂有人类血浆纤连蛋白(5μg/ml于PBS中)的384孔生物感测板的各孔中，且在含有0.1％BSA的无血清介质中用含BSA(1％于PBS中)封闭。允许细胞粘着，接着血清挨饿过夜。在血清挨饿之后，将细胞与各种浓度的针对人类PDGFRβ受体的VH在组织培养恒温箱中一起孵育1小时。在抗体预孵育结束时通过将PDGF-BB以5ng/ml的最终浓度添加至无血清培养基中来刺激迁移。在组织培养恒温箱中在37℃与5％CO2及>75％湿度下使用扫描仪每18分钟获得孔影像持续20小时。使用基于Matlab的质心鉴定及追踪演算法以计算10小时与16小时之间的细胞速度来分析所收集的数据。图14中所述的结果显示XB2708可以0.54nM的IC50拮抗PDGF-BB诱导性周细胞迁移。
实施例7：VH-VL对转化为异源四聚IgG及生物活性的证明
XB1511VH与D8VL在293T细胞中的异源四聚IgG中一起表达。在48小时及96小时后收集细胞培养物上清液，且用蛋白质A琼脂糖珠粒纯化表达的IgG。IgG以8mg/L制造而无任何最佳化。为评估XB1511/D8IgG的生物活性，将HFF-1人类包皮纤维母细胞接种于384孔BIND生物传感器中且使其在无血清培养基中附着隔夜。接着用5ng/mL或10ng/mL PDGFBB配体刺激成纤维细胞，且使其在100nM XB1511/D8IgG存在或不存在下迁移18小时。每15分钟捕获BIND扫描仪影像且使用软件分析工具以量测个别细胞迁移反应的轨迹长度。轨迹长度是由自蓝色(无迁移)至红色(最大迁移)的“热图(heat map)”表示。如图15中所示，XB1511/D8IgG能够完全阻断人类纤维母细胞的PDGFBB诱导性迁移。
实施例8：scFv热稳定性
确定XB2202VH及XB2202/A4scFv的热稳定性。具体地，在4℃、37℃、60℃及70℃下孵育1mg/mL XB2202及XB2202-A4持续12小时，且进行PDGFRβ结合ELISA以测试蛋白质在孵育后的结合活性。如图16中所示，XB2202VH域在60℃下孵育之后失去显著PDGFRβ结合活性，且在70℃下孵育之后完全失去结合活性。XB2202的Tm量测为约62℃。相反地，XB2202/A4scFv在70℃下孵育12小时之后完全具有活性，表明XB2202scFv的Tm大于70℃。
实施例9：IgG1抗体的表达、纯化及浓缩
XB1511/D8及XB2202/A4VH/VL对分别以全长异源四聚IgG1抗体形式在293T细胞中表达，且加以纯化。本文表7中阐述XB1511/D8及XB2202/A4IgG1抗体的重链及轻链的氨基酸序列。
细胞培养物上清液通过过滤获得且使用两步纯化流程纯化所表达的抗体。具体地，进行蛋白质A亲和性纯化，结合抗体在pH 3.5下洗脱。使用1M Tris将蛋白质A洗出液的pH值调节至pH 7，且通过使用HiTrap Q XL管柱(GE Healthcare)的离子交换层析进一步纯化。纯化的抗体储存于pH 7PBS中。
表7：格式为全长异源四聚IgG1抗体形式的XB1511/D8及XB2202/A4VH/VL对的氨基酸序列。
通过量测抗体溶液的A280来确定在各纯化步骤后的抗体表达水平及抗体浓度。纯化的抗体的纯度及品质通过尺寸排除高效液相层析(SEC-HPLC)来确定。本文表8中阐述这样的实验的结果。这样的数据显示当XB1511/D8及XB2202/A4VH/VL对格式为全长异源四聚IgG1抗体形式时，所得抗体为高度可制造的，因为其表达水平高、容易纯化至高纯度且显示极少聚集。
表8：XB1511/D8及XB2202/A4IgG1抗体的表达及纯化的分析。
进一步分析纯化的XB1511/D8及XB2202/A4IgG1抗体的浓缩能力。具体地，使用具有10kDa及30kDa截断限制的centricon超滤旋转管柱将各抗体溶液浓缩至50mg/ml。通过SEC-HPLC分析浓缩溶液的完整性。自此分析确定50mg/ml XB1511/D8IgG1溶液的纯度为约96％且含有约2.4％抗体聚集体，而50mg/ml XB2202/A4IgG1溶液的纯度为约97.8％且含有约2.2％抗体聚集体。这样的数据证明XB1511/D8及XB2202/A4IgG1抗体在浓缩溶液中高度稳定。
实施例10：XB1511/D8及XB2202/A4IgG1抗体的热稳定性
使用基于荧光的分析确定XB1511/D8及XB2202/A4IgG1抗体的热稳定性。具体地，使5mg/ml纯化的XB1511/D8IgG1、XB2202/A4IgG1或人类IgG1对照物与Sypro橙色染料(Sigma)混合，且将混合物温度以1度增量自25℃提高至95℃。当温度提高且IgG展开时将Sypro橙色染料并入IgG中。使用BioRad CFX96仪器来监测Sypro橙色染料与IgG相联所产生的荧光信号。在此分析中，将Sypro橙色信号的负回归(negative regression)用以鉴定各蛋白质的峰值熔融(亦即Tm)点。
自此分析确定XB1511/D8及XB2202/A4的熔融温度(Tm)分别为67℃至70℃。将此与Tm为72℃的人类IgG1对照抗体充分比较。此数据证明本发明的VH及VH/VL对能够设计成高度热稳定性全长IgG分子的形式。
实施例11：XB2202VH、scFv及IgG1抗体对人类的结合亲和性
使用表面等离子体共振在Biacore T100上确定XB2202VH域、XB2202/A4scFv及XB2202/A4IgG1对人类PDFGR的结合动力学。简言之，将重组人类PDGFR-hIgG1-Fc嵌合融合蛋白(R&D,#385-PR-100/CF)固定于与抗hIgG1Fc单克隆抗体(对于VH及ScFv分析)或抗6His抗体(对于IgG分析)偶联的Series CM5感测晶片上。使XB2202VH域、XB2202/A4scFv及XB2202/A4IgG1在50μl/min或100μl/min下以不同浓度(75nM、50nM、25nM、10nM、5nM及1nM)在表面上方流动3分钟且允许解离10分钟。使用Biacore T100分析软件使用1:1模型来分析数据。检查质量输送且使其避免以允许精确量测。所有数据均根据Biacore标准协定加以双重参考。
本文表9中展示XB2202VH域、XB2202/A4scFv及XB2202/A4IgG1抗体对人类PDGFRβ的结合动力学。这样的数据显示XB2202VH域、XB2202/A4scFv及XB2202/A4IgG1各自对PDGFRβ具有高结合亲和性。尤其请注意，与单独的不成对XB2202VH域的解离速率(2.95×10-3s-1)相比，XB2202/A4scFv及XB2202/A4IgG1显示改进的解离速率(分别为1.54×10-3s-1及1.56×10-3s-1)。
表9：XB2202VH域、XB2202/A4scFv及XB2202/A4IgG1对人类PDGFRβ的结合动力学
抗体 吸附速率(M-1s-1) 解离速率(s-1) Kd(M)
XB2202VH 1.30×107 2.95×10-3 2.27×10-10
XB2202/A4ScFv 7.06×105 1.54×10-3 2.18×10-9
XB2202/A4IgG1 9.80×105 1.56×10-3 1.59×10-9
实施例12：使用活体内小鼠模型进行抗PDGFRβ抗体的功能分析
使用Nobuo等人,Am.J.Path,(2006)168(6),2036-2052(以全文引用的方式并入本文中)中所述的在发展中的视网膜血管结构模型、角膜新血管生成模型和/或脉络膜新血管生成模型来评估本文公开的抗PDGFRβ抗体活体内抑制PDGF诱导性血管化的能力。在这样的分析中，以VH域、scFv和/或全长IgG的形式向小鼠施用抗体。

Claims (23)

1.一种包含特异性结合于PDGFRβ的可变重链(VH)域的经分离结合多肽，其中所述VH域包含CDR3,CDR2和CDR1氨基酸序列，
其中所述CDR3由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成，所述CDR2由SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列组成，以及所述CDR1由SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的结合多肽，其中所述VH域包含与选自SEQ ID NO:345和SEQ IDNO:360的氨基酸序列享有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，或者所述VH域包含选自SEQ ID NO:345和SEQ ID NO:360的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的结合多肽，其中所述结合多肽与SEQ ID NO:345或SEQ ID NO:360所示的VH域氨基酸序列结合于PDGFRβ上的相同表位或与SEQ ID NO:345或SEQ ID NO:360所示的VH域氨基酸序列竞争结合于PDGFRβ。
4.根据权利要求2所述的结合多肽，其中所述结合多肽与SEQ ID NO:345或SEQ ID NO:360所示的VH域氨基酸序列结合于PDGFRβ上的相同表位或与SEQ ID NO:345或SEQ ID NO:360所示的VH域氨基酸序列竞争结合于PDGFRβ。
5.根据权利要求2所述的结合多肽，其中所述结合多肽抑制PDGFRβ的活性。
6.根据权利要求5所述的结合多肽，其中PDGFRβ的活性通过拮抗PDGF与PDGFRβ的结合来抑制。
7.根据权利要求5所述的结合多肽，其中PDGFRβ的活性通过拮抗PDGFRβ二聚化来抑制。
8.根据前述权利要求2所述的结合多肽，其以小于250pM的Kd结合于PDGFRβ。
9.根据前述权利要求2所述的结合多肽，其以小于100pM的Kd结合于PDGFRβ。
10.根据权利要求2所述的结合多肽，其特异性结合于小鼠及人类PDGFRβ。
11.根据权利要求2所述的结合多肽，其以小于5nM的IC50拮抗PDGF与所述PDGFRβ的结合。
12.根据权利要求2所述的结合多肽，其以小于4nM的IC50抑制PDGFRβ的配体诱导性酪氨酸磷酸化。
13.根据权利要求2所述的结合多肽，其为抗体。
14.根据权利要求2所述的结合多肽，其为scFv。
15.一种经分离核酸，其编码根据前述权利要求中任一项所述的结合多肽。
16.一种重组表达载体，其包含根据权利要求15所述的核酸。
17.一种宿主细胞，其包含根据权利要求16所述的重组表达载体。
18.一种产生特异性结合于人类PDGFRβ的结合多肽的方法，其包括将根据权利要求17所述的宿主细胞在使得所述宿主细胞产生特异性结合于人类PDGFRβ的结合多肽的条件下进行培养。
19.结合多肽，其包含分离的权利要求1或2中所述的VH域和可变轻链(VL)域，所述VL域包含具有选自SEQ ID NOs:63-147的氨基酸序列的CDR3。
20.根据权利要求19所述的结合多肽，其中所述VL域还包含具有选自SEQ ID NOs:148-232的氨基酸序列的CDR2。
21.根据权利要求20所述的结合多肽，其中所述VL域还包含具有选自SEQ ID NOs:233-317的氨基酸序列的CDR1。
22.根据权利要求19所述的结合多肽，其中所述VL域包含与选自SEQ ID NOs:369-453的氨基酸序列享有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
23.根据权利要求19所述的结合多肽，其中所述VL域包含选自SEQ ID NOs:369-453的氨基酸序列。
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