詳細な説明
アウトライン
A.定義
B.方法の概説
1.抗体ポリペプチド
a.抗体構造および機能
b.抗体配列および特異性
2.抗体を特定する方法
3.抗体最適化の既存方法
C.抗体親和性成熟法
1.構造および活性の比較
a.親和性成熟用の次抗体の選択
i.免疫化およびハイブリドーマ選別
ii.「Hit」の特定のための選別アッセイ
1)ディスプレイライブラリー
2)ファージディスプレイライブラリー
3)アドレス指定可能なライブラリー
b.関連抗体の特定
c.1次抗体および関連抗体のアミノ酸配列の比較
d.特定された領域の変異誘発
2.系統的変異導入によるSAR
3.さらなる最適化
a.相補性決定領域
b.フレームワーク領域
c.生殖系列スワッピング
D.抗体変換方法
1.出発または参照抗体の選択
2.変異誘発
3.変換された抗体の選択
a.結合
b.機能活性
E.アッセイ
1.結合アッセイ
2.機能活性
a.分化
b.遺伝子発現の変化
c.細胞障害性アッセイ
3.インビボアッセイ
F.抗体産生方法
1.ベクター
2.細胞および発現系
a.原核生物発現
b.酵母
c.昆虫
d.哺乳動物細胞
e.植物
3.精製
G.抗DLL4活性化因子/モジュレーター抗体およびその使用
1.DLL4
a.構造
b.発現
c.機能
2.活性化因子/モジュレーター抗DLL4多量体抗体
代表的抗体
3.改変
a.免疫原性を減らす改変
b.グリコシル化
c.Fc改変
d.ペグ化
4.組成物、製剤、投与および製品/キット
a.組成物および製剤
b.製品およびキット
5.治療および使用方法
併用療法
H.実施例
A.定義
特に断らなければ、本明細書で使われる全ての技術および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書の全開示を通して参照される全ての特許、特許出願、公開出願、および出版物、ジェンバンク配列、データベース、ウエブサイト、および他の公表された物質は、特に他に断らない限り、参照によってその全体が組み込まれる。本明細書の用語に対し複数の定義が存在する場合は、本節の定義が優先される。URLまたは他のこのような識別子またはアドレスに対し参照がなされている場合は、このような識別子は、変わる可能性があり、特にインターネット情報は絶えず入れ替わっているが、同等の情報をインターネット上でサーチすることにより見つけることができることは理解されよう。それに対する参照は、このような情報の利用可能性および公開流布の証拠となるものである。
本明細書で使用される抗体は、天然由来の、または一部もしくは全部が合成、例えば、組換えにより産生された、免疫グロブリンおよび免疫グロブリンの一部を指し、抗原結合部位を形成するのに充分な免疫グロブリン分子の可変領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリンのいずれかの部分を含む。従って、抗体またはその一部は、免疫グロブリン抗原結合部位に対し相同または実質的に相同である結合ドメインを有するいずれかのタンパク質を含む。例えば、抗体は、2つの重鎖(HおよびH’と記される)および2つの軽鎖(LおよびL’と記される)を含む抗体を指し、この場合、各重鎖は、完全長免疫グロブリン重鎖または抗原結合部位(例えば、重鎖には、VH、鎖VH−CH1鎖およびVH−CH1−CH2−CH3鎖が含まれるが、これに限定されない)を形成するのに充分なその一部であってもよく、また、各軽鎖は、完全長軽鎖または抗原結合部位(例えば、軽鎖には、VL鎖およびVL−CL鎖が含まれるが、これに限定されない)を形成するのに充分なその一部であってもよい。各重鎖(HおよびH’)は1つの軽鎖(それぞれ、LおよびL’)と対を作る。通常、抗体は、最小限で、可変重鎖(VH)および/または可変軽鎖(VL)の全てまたは少なくとも一部を含む。また、抗体は、定常領域の全てまたは一部を含んでもよい。
本明細書の目的に対して、用語の抗体は、例えば、これに限定されないが、Fab、Fab’、F(ab’)2、単鎖Fv(scFv)、Fv、dsFv、ダイアボディ、FdおよびFd’断片、Fab断片、Fd断片ならびにscFv断片を含む完全長抗体およびその一部を含む。他の既知の断片には、これに限定されないが、scFab断片(Hust et al.、BMC Biotechnology(2007)、7:14)が含まれる。抗体は、免疫グロブリンクラスのいずれかのメンバーを含み、これには、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEがある。
本明細書で使用される、完全長抗体は、2つの完全長重鎖(例えば、VH−CH1−CH2−CH3またはVH−CH1−CH2−CH3−CH4)および2つの完全長軽鎖(VL−CL)およびヒンジ部を有する抗体であり、例えば、抗体分泌B細胞により産生されたヒト抗体、および合成的に産生された同じドメインを有する抗体がこの例である。
本明細書で使用される、抗体の「その一部」または「その断片」として参照される抗体断片または抗体の一部は、完全長抗体のいずれかの一部を指し、完全長の長さより短いが、抗原結合部位(例えば、1つまたは複数のCDR)を形成するのに充分な少なくとも一部の抗体の可変領域を含み、従って、完全長抗体の結合特異性および/または活性を保持する;抗体断片は、完全長抗体の酵素処理により産生された抗体誘導体、ならびに合成的に、例えば、組換えにより産生された誘導体を含む。抗体断片の例には、これに限定されないが、Fab、Fab’、F(ab’)2、単鎖Fv(scFv)、Fv、dsFv、ダイアボディ、FdおよびFd’断片、が含まれる(例えば、分子生物学における方法、Vol207:癌治療方法およびプロトコルのための組換え型抗体、(2003);Chapter1;p3−25、Kipriyanov、を参照)。断片には、例えば、ジスルフィド架橋および/またはペプチドリンカーによって一緒に結合した複数の鎖を含んでもよい。抗体断片は、通常、少なくとも約50アミノ酸、典型的には、少なくとも200アミノ酸を含む。
従って、「抗原結合部位を形成するのに充分な抗体またはその一部」への参照は、抗体またはその一部が、全6CDRを含む対応する完全長抗体の少なくとも一部の結合特異性を保持するのに充分な少なくとも1または2、典型的には3、4、5または全6CDRのVHおよびVLを含むことを意味する。通常、充分な抗原結合部位には、少なくとも重鎖のCDR3(CDRH3)が必要である。典型的には、さらに軽鎖のCDR3(CDRL3)が必要である。本明細書記載のように、当業者は、kabatまたはChothiaナンバリングに基づいてCDRを理解し、特定することができる(例えば、Kabat、E.A.et al.(1991)免疫学的関連タンパク質の配列、第5版、米国保健福祉省、NIH Publication No.91−3242、およびChothia、C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901−917、を参照)。例えば、Kabatナンバリングに基づくと、CDR−LIは、残基L24〜L34に相当する;CDR−L2は、残基L50〜L56に相当する;CDR−L3は、残基L89〜L97に相当する;CDR−H1は、残基H31〜H35、35aまたは35bに相当する(長さに応じて);CDR−H2は、残基H50〜H65に相当する;ならびにCDR−H3は、残基H95〜H102に相当する。
本明細書で使われる「抗原結合部位」は、1つまたは複数の相補性決定領域(CDR;高頻度可変性領域とも呼ばれる)によって形成されるインターフェイスを指す。各抗原結合部位は、重鎖可変領域由来の3つのCDRおよび軽鎖可変領域由来の3つのCDRを含む。抗体分子は、通常、2つの抗原結合部位を有し、それぞれは重鎖可変領域の一部および軽鎖可変領域の一部を含む。抗原結合部位は、CDRに加えて、可変領域ドメインの他の部分を含むことができる。
本明細書で使われるFv抗体断片は、非共有結合の相互作用により結合した1つの可変重鎖ドメイン(VH)および1つの可変軽鎖(VL)ドメインからなる。
本明細書で使われるdsFvは、操作されたVH−VL対を安定化させる分子間ジスルフィド結合を有するFvを指す。
本明細書で使われるFd断片は、抗体重鎖の可変ドメイン(VH)および1つの定常領域ドメイン(CH1)を含む抗体の断片である。
本明細書で使われる「Fab断片」は、完全長免疫グロブリンをパパインで消化して生じた完全長抗体の一部を含む抗体断片、または合成、例えば、組換えにより産生された同じ構造を有する断片である。Fab断片は、軽鎖(VLおよびCL部分を含む)および重鎖の可変ドメイン(VH)および1つの重鎖(CH1)の定常領域ドメイン部分を含む別の鎖を含む;これは、組換えにより産生可能である。
本明細書で使われるF(ab’)2断片は、免疫グロブリンのpH4.0〜4.5でのペプシン消化から生じた抗体断片、または合成的に、例えば、組換えにより、産生された同じ構造を有する抗体である。F(ab’)2断片は、2つのFab断片を含むが、各重鎖部分がシステイン残基を含む、2つの断片を結合するジスルフィド結合を形成する少数の追加のアミノ酸を含む場合には、それは組換えにより産生可能である。
Fab’断片は、F(ab’)2断片の半分(1つの重鎖と1つの軽鎖)を含む断片である。
本明細書で使われる、Fd’断片は、F(ab’)2断片の1つの重鎖部分を含む抗体の断片である。
本明細書で使われる、Fv’断片は、抗体分子のVHおよびVLドメインのみを含む断片である。
本明細書で使われるscFv断片は、ポリペプチドリンカーにより任意の順に共有結合された可変軽鎖(VL)および可変重鎖(VH)を含む抗体断片を指す。リンカーは、2つの可変ドメインが実質的な干渉なしに架橋されるような長さである。代表的リンカーは、一部のGluまたはLys残基を全体に散在させて溶解度を高めた(Gly−Ser)n残基である。
本明細書で使われるディアボディは、二量体scFvである;ディアボディは、典型的には、scFvより短いペプチドリンカーを有し、優先的に二量体化する。
本明細書で使われるhsFvは、Fab断片に通常存在する定常ドメインが、ヘテロ二量体コイルドコイルドメインにより置換されている抗体断片を指す(例えば、Arndt et al.(2001)J Mol Biol.7:312:221−228、参照)。
本明細書で使われる「抗体多量体」は、少なくとも2つ以上の抗原結合部位を含む抗体を指す。抗体多量体には、二量体、三量体、四量体、五量体、およびさらに高い重合度のオリゴマーが含まれる。多量体としての抗体の形成は、当業者の知識に基づいて行うことができる。例えば、多量体型は、少なくとも2つのポリペプチドまたは共有結合の相互反応を調節または促進する多量体化ドメインを介して形成される抗体オリゴマーを含む。
本明細書で使われる多量体化ドメインは、ポリペプチド分子と、1つまたは複数の別のポリペプチド分子との安定な相互作用を促進するアミノ酸配列を指す。この別のポリペプチド分子は相補的な多量体化ドメインをそれぞれ含み、このドメインは最初のドメインと安定な多量体を形成するために、同じ多量体化ドメインであっても、異なるドメインであってもよい。通常、ポリペプチドは、直接または間接的に多量体化ドメインに結合している。代表的多量体化ドメインには、免疫グロブリン配列またはその一部、ロイシンジッパー疎水性の領域、親水性の領域、および適合性タンパク質−タンパク質相互作用ドメインが含まれる。例えば、多量体化ドメインは、免疫グロブリン定常領域またはドメイン、例えば、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4サブタイプを含むIgG、IgA、IgE、IgDおよびIgMならびにその改変型由来の、定常ドメインまたはその一部であってもよい。
本明細書で使われる「単一特異性」は、2つ以上の抗原結合部位を含み、各抗原結合部位が免疫特異的に同じエピトープに結合する抗体である。
本明細書で使われる「多選択性」抗体は、2つ以上の抗原結合部位を含み、少なくとも2つの抗原結合部位が免疫特異的に異なるエピトープに結合する抗体である。
本明細書で使われる「二重特異性」抗体は、2つ以上の抗原結合部位を含み、2つの異なるエピトープに免疫特異的に結合可能な多選択性抗体である。「三重特異性」抗体は、3つ以上の抗原結合部位を含み、3つの異なるエピトープに免疫特異的に結合可能な多選択性抗体であり、「四重特異性」抗体は、4つ以上の抗原結合部位を含み、4つの異なるエピトープに免疫特異的に結合可能な多選択性抗体である、等々。
本明細書で使われる「単量体Ig断片」への参照は、1つの抗原結合部位のみを含む抗体の一部を指す。例えば、単量体Ig断片には、例えば、Fab、FvまたはscFvが含まれる。
本明細書で使われるポリペプチドドメインは、構造的におよび/または機能的に区別可能なまたは限定可能なポリペプチドの一部(3つ以上、通常、5または7または7超のアミノ酸の配列)である。代表的ポリペプチドドメインは、1つまたは複数の構造的モチーフ(例えば、ループ領域で連結されたアルファらせんおよび/またはベータ鎖の組み合わせ)から構成されるポリペプチド内の独立に折り畳まれた構造を形成するポリペプチドおよび/または特定の機能活性、例えば、酵素活性または抗原結合により識別されるポリペプチドの一部である。ポリペプチドは、1つの、典型的には2つ以上の、異なるドメインを持つことができる。例えば、ポリペプチドは、1つまたは複数の構造的ドメインおよび1つまたは複数の機能的ドメインを持つことができる。単一ポリペプチドドメインは、構造および機能に基づいて区別可能である。ドメインは、近接するアミノ酸の直鎖状配列を包含可能である。あるいは、ドメインは、複数の非近接アミノ酸部分を含んでもよく、これはポリペプチドのアミノ酸の直鎖状配列に沿って非近接である。通常、ポリペプチドは、複数のドメインを含む。例えば、抗体分子の各重鎖および各軽鎖は、複数の免疫グロブリン(Ig)ドメインを含み、それぞれ、約110アミノ酸の長さである。
本明細書で使われるIgドメインは、免疫グロブリン(Ig)フォールドと呼ばれる構造により区別できると当業者が認識しているドメインであり、この構造は、2つのベータプリーツシートを含み、それぞれがループで連結された逆平行アミノ酸ベータ鎖を含む。Igフォールド中の2つのベータシートは、疎水性の相互作用により一緒にサンドイッチされ、鎖内ジスルフィド結合により保持されている。抗体鎖内のそれぞれの免疫グロブリンドメインは、機能に基づいてさらに区別できる。例えば、軽鎖は、1つの可変領域ドメイン(VL)および1つの定常領域ドメイン(CL)を含み、他方、重鎖は、1つの可変領域ドメイン(VH)および3つまたは4つの定常領域ドメイン(CH)を含む。各VL、CL、VH、およびCHドメインは、免疫グロブリンドメインの例である。
本明細書で使われる抗体に関連する「可変ドメイン」は、異なる抗体間で変化するアミノ酸配列を含む抗体の重鎖または軽鎖の特異的Igドメインである。各軽鎖および各重鎖は、1つの可変領域ドメイン(VL、および、VH)を有する。可変ドメインは、抗原特異性を提供し、従って、抗原認識に関与する。各可変領域は、CDRを含み、これは抗原結合部位ドメインおよびフレームワーク領域(FR)の一部である。
本明細書で使われる可変重鎖(VH)または可変軽鎖(VL)鎖(VHドメインまたはVLドメインとも呼ばれる)への参照は、抗体の可変ドメインを構成するポリペプチド鎖を指す。
本明細書で使われる抗体の「領域」は、特定の機能または構造に関連する抗体のドメインまたはドメインの一部を指す。抗体では、抗体の領域には、相補性決定領域、フレームワーク領域、および/または定常領域が含まれる。一般的に、本明細書の目的に対して、抗体の領域は、可変軽鎖もしくは可変重鎖の相補性決定領域CDR1、CDR2および/またはCDR3(CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2、もしくはCDRH3)、または可変軽鎖または可変重鎖のフレームワーク領域FR1、FR2もしくはFR3である。
本明細書で使われる「高頻度可変性領域」、「HV」、「相補性決定領域」および「CDR」ならびに「抗体CDR」は、同義に使用され、一緒に抗体の抗原結合部位を形成する各可変領域内の複数の部分の1つを指す。各可変領域ドメインは、3つのCDRを含み、CDR1、CDR2、およびCDR3と名付けられている。この3つのCDRは、直鎖状アミノ酸配列に沿って非近接であるが、折り畳みポリペプチド中では近接している。CDRは、可変ドメインのベータシートの平行鎖を連結するループ内に位置する。
本明細書で使われるフレームワーク領域(FR)は、ベータシート内に位置する抗体可変領域ドメイン内の領域であり;FR領域は、そのアミノ酸配列に関して、高頻度可変性領域に比較して保存的である。
本明細書で使われる定常領域ドメインは、比較的に、可変領域ドメインより抗体中で保存的であるアミノ酸配列を含む、抗体重鎖または軽鎖中のドメインである。各軽鎖は、単一軽鎖定常領域(CL)ドメインを有し、各重鎖は、1つまたは複数の重鎖定常領域(CH)ドメインを含み、これにはCH1、CH2、CH3およびCH4が含まれる。完全長IgA、IgDおよびIgGアイソタイプは、CH1、CH2CH3およびヒンジ部を含み、一方、IgEおよびIgMは、CH1、CH2CH3およびCH4を含む。CH1およびCLドメインは、抗体分子のFabアームを伸張し、これにより、抗原との相互作用および抗体アームの回転に寄与する。抗体定常領域は、エフェクター機能、例えば、これに限定されないが、抗体が、例えば、種々の細胞、生体分子および組織との相互作用を介して、特異的に結合している抗原、病原体および毒素のクリアランス、を提供できる。
本明細書で使われるヒト化抗体は、アミノ酸の「ヒト」配列を含むように改変され、それにより、ヒトへの投与が免疫応答を誘発しない抗体を指す。このような抗体を調製する方法は既知である。例えば、非可変領域のアミノ酸組成がヒト抗体に基づくことが可能な抗体。コンピュータプログラムが、このような領域を特定するように設計されている。
本明細書で使われる「抗体変換」は、標的抗原または基質に対する抗体またはその断片の機能的活性が、通常、1つまたは複数のアミノ酸残基の変異により変えられて、出発または参照抗体の逆の機能活性を有するようにするプロセスを指す。例えば、出発または参照抗体が標的抗原に対しアンタゴニスト活性を示す場合は、抗体変換により抗体がアゴニストまたは活性化因子/モジュレーター活性に変えられる。別の例では、出発または参照抗体が標的抗原に対し活性化因子/モジュレーター活性を示す場合は、抗体変換により、抗体はアンタゴニスト活性に変えられる。
本明細書で使われる「親和性成熟」は、通常、1つまたは複数のアミノ酸残基の変異により、参照抗体(本明細書では、テンプレートまたは親抗体とも呼ばれる)から、対応する型の参照抗体の同じ標的抗原に対する活性より、標的抗原に対する活性増加を示すように抗体を進化させるプロセスを指す。従って、進化した抗体は、参照またはテンプレート抗体に比べて、最適化されている。
本明細書で使われる親和性成熟抗体への参照は、参照抗体に比べて、標的抗原に対する活性増加を有する抗体を指す。例えば、親和性成熟抗体は、参照または親抗体に比べて、標的抗原に対する強化された結合を示す。通常、親和性成熟抗体は、参照抗体と同じエピトープに結合する。
本明細書で使われる最適化抗体は、参照抗体に比べて、標的タンパク質または抗原に対し活性増加、例えば、標的タンパク質に対する結合親和性の改善および/または機能活性の改善、を示す抗体、またはその一部を指す。通常、抗体は、1つまたは複数のアミノ酸改変を含まない親抗体に比較して、1つまたは複数のアミノ酸改変(アミノ酸欠失、置換または挿入)に基づいて最適化される。一般的に、活性、例えば、結合親和性は、親抗体(例えば、改変を含まない生殖系列抗体Hit)の活性に比べて、1.5倍〜1000倍、通常は少なくとも2倍〜100倍、例えば、正確にまたは約1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍または1000倍超、の値だけ増加する。
本明細書で使われる「構造親和性/活性関係性」(SAR)は、構造(例えば、配列)および分子の機能間の関係性を指し、それにより、抗体の活性をその配列に関係づけることができる。従って、SARの知識により、抗体の活性に寄与する特定のアミノ酸残基を含む配列の領域が明らかにされる。SARを測定する方法は、本明細書で記載される。
本明細書で使われる標的タンパク質または標的抗原に対する活性は、結合特異性または結合親和性および/または標的タンパク質の機能活性の調節、または標的タンパク質に対する抗体またはその一部の活性を反映した他の測定値、を指す。抗体の活性は、結合または親和性に基づくアッセイ、例えば、ELISA、電気化学発光測定法(例えば、メソ・スケール・ディスカバリー)、もしくは表面プラズモン共鳴法、または本明細書記載の細胞ベースアッセイを使って測定できる。
本明細書で使われる「機能活性」は、完全長(完全)タンパク質に付随するポリペプチド(例えば、標的タンパク質)またはその一部の活性を指す。機能活性には、これに限定されないが、生物活性、触媒または酵素活性、抗原性(抗ポリペプチド抗体に対し結合する能力、またはポリペプチドと抗ポリペプチド抗体に対する結合に関し競合する能力)、免疫原性、多量体形成能力、ポリペプチドならびにシグナル伝達および下流エフェクター機能のために、受容体またはリガンドに特異的に結合する能力、が挙げられる。本明細書の目的のためには、抗体またはその一部によるポリペプチドの機能活性の調節(すなわち、活性化または抑制)は、本明細書では、ポリペプチドの機能活性が、抗体またはその一部が存在しない場合に比べ、抗体の存在下、変更または部分的に変更されることを意味する。
本明細書で使われる結合活性は、1つまたは複数の結合相手に、それが結合するか否か、およびどのように結合するかに関連した、分子、例えば、ポリペプチド、の特性を指す。結合活性には、結合相手に結合する能力、結合相手に結合する親和性(例えば、高親和性)、結合相手に結合する結合力、結合相手と結合する強度および結合相手と結合するための特異性、が含まれる。
本明細書で使われる「親和性」または「結合親和性」は、標的タンパク質または抗原上のエピトープに抗体分子またはその一部が結合する強度を指す。親和性は、平衡結合定数(KA)または平衡解離定数(KD)で測定されることが多い。低親和性抗体−抗原相互作用は弱く、分子は急速に分離する傾向があり、一方、高親和性抗体−抗原結合は強く、分子は、結合状態で長時間の間残る。一般的に、標的タンパク質に対する抗体の親和性は、平衡結合定数(KA)で、約106M−1以上、約107M−1以上、約108M−1以上、または約109M−1、1010M−1、1011M−1もしくは1012M−1である。また、抗体は、平衡解離定数(KD)10−4M、10−6M〜10−7M、または10−8M、10−10M、10−11Mもしくは10−12Mまたは、さらに低い解離定数が特徴であってもよい。低い解離定数は、抗体がより高い結合親和性を特徴とすることを意味していることは理解されよう。通常、nMまたはnM以下の解離定数を有する抗体は、高親和性抗体と見なされる。このような親和性は、従来技術、例えば、平衡透析;BIAcore2000装置を使い、メーカーにより概説されている一般的手法を使って;放射線標識標的抗原を使ったラジオイムノアッセイ;または当業者には既知の他の方法を使って容易に測定可能である。親和性データを、例えば、Scatchard et al.、Ann N.Y.Acad.ScL、51:660(1949)、の方法を使って解析できる。
本明細書で使われる抗体またはその抗原結合断片に関する「特異的に結合する」または「免疫特異的に結合する」は、本明細書では同意義に使用され、抗体および抗原(例えば、ヒトDLL4)の抗体結合部位間の非共有相互作用により1つまたは複数の同族の抗原と非共有結合を形成する抗体または抗原結合断片の能力を指す。通常、抗原に対し免疫特異的に結合(または特異的に結合する)抗体は、正確にまたは約1×107M−1または1x108M−1もしくはそれ超の親和定数Ka(または1x10−7Mまたは1×10‑8Mもしくはそれ未満の解離定数(Kd))の値で抗原に結合する抗体である。親和定数は、抗体反応の標準的動力学的方法、例えば、イムノアッセイ、表面プラズモン共鳴法(SPR)(Rich and Myszka(2000)Curr.Opin.Biotechnol 11:54;Englebienne(1998)Analyst.123:1599)、等温滴定熱量測定(ITC)または当技術分野で既知の他の動力学的相互作用アッセイで測定可能である(例えば、Paul、ed.、免疫学の基礎、第2版、Raven Press、New York、pages 332−336(1989)を参照;また、代表的SPRおよびITC法による抗RSV抗体の結合親和性を計算法の説明は、米国特許第7、229、619号を参照)。結合速度のリアルタイム検出およびモニタリング用設備と方法は既知で、市販されている(例えば、BiaCore 2000、Biacore AB、Upsala、SwedenおよびGE Healthcare LifeSciences;Malmqvist(2000)Biochem.Soc.Trans.27:335)。
本明細書で提供されるポリペプチドまたは抗体に関連して、本明細書で使われる用語の「選択的に結合する(bind selectively)」または「選択的に結合する(selectively binds)」は、ポリペプチドまたは抗体が、実質的に別のエピトープに結合することなく、選択されたエピトープと結合することを意味する。通常、選択されたエピトープに選択的に結合する抗体またはその断片は、例えば、正確にまたは約1×107M−1または1x108M−1もしくはそれ超の親和定数Kaで特異的にエピトープに結合する。
本明細書で使われる「エピトープ」は、抗体により認識される抗原またはタンパク質の表面上の局部的領域を指す。ペプチドエピトープには、連続的エピトープまたは不連続的エピトープが含まれる。エピトープは、通常、直鎖アミノ酸配列とは対照的に、タンパク質の3次元構造により決定される。
2つ以上の抗体への参照に伴い、本明細書で使われる「同じエピトープに結合する」は、抗体が抗原との結合で競合し、同じか、重なり合う、または包含するアミノ酸の連続または不連続セグメントに結合することを意味する。当業者なら、語句の「同じエピトープに結合する」が、抗体が正確に同じアミノ酸に結合することを必ずしも意味しないことがわかるであろう。抗体が結合する正確なアミノ酸は、異なっていてもよい。例えば、1次抗体は、2次抗体に結合されたアミノ酸のセグメントにより完全に包含されるアミノ酸のセグメントに結合可能である。別の例では、1次抗体は、1つまたは複数の2次抗体により結合されたセグメントと大きくオーバーラップする1つまたは複数のアミノ酸のセグメントと結合する。本明細書の目的に対して、このような抗体は、「同じエピトープに結合する」と見なされる。
抗体競合アッセイを使用して、抗体が、別の抗体と「同じエピトープに結合する」か否かを測定できる。このようなアッセイは、この分野でよく知られている。通常、2次抗体が過剰で、かつ、1次抗体が全部位を飽和させている条件下で、2次抗体によるエピトープとの相互作用が既知である抗体の70%以上、例えば、70%、71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%またはそれ以上の競合は、抗体が「同じエピトープに結合する」指標となる。2つの抗体間の競合レベルを評価するために、例えば、ラジオイムノアッセイまたは他の抗体に対する標識を使ったアッセイを使用可能である。例えば、DLL4抗原を、標識化合物(例えば、3H、125I、ビオチン、またはルビジウム)と結合した飽和量の1次抗DLL4抗体またはその抗原結合断片と共に、同量の非標識2次抗DLL4抗体の存在下、インキュベートしてもよい。次に、非標識ブロッキング抗体の存在下で抗原に結合している標識抗体の量を評価し、非標識ブロッキング抗体の存在しない条件下の結合と比較する。ブロッキング抗体の存在しない条件と比較して、非標識ブロッキング抗体の存在下における結合シグナルのパーセンテージ変化により競合を測定する。従って、ブロッキング抗体の存在しない条件下の結合に比較して、ブロッキング抗体の存在下の標識抗体の70%の結合の抑制がある場合、70%の2つの抗体の間に競合がある。従って、70%以上、例えば、70%、71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%またはそれ以上の1次および2次抗体の間の競合に対する参照は、70%、71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%またはそれ以上(1次抗体の存在しない条件下の2次抗体による抗原の結合に比較して)、抗原に対する2次抗体の結合(または逆も同様)を1次抗体が阻害することを意味する。従って、70%、71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%またはそれ以上の1次抗体の抗原に対する結合の2次抗体による抑制は、2つの抗体が同じエピトープに結合することを示す。
本明細書で使われる用語の「表面プラズモン共鳴」は、例えば、BiaCoreシステム(GE Healthcare Life Sciences)を使って、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによりリアルタイム相互作用の分析を可能とする光学的現象を指す。
本明細書で使われる「二重特異性」抗体は、2つ以上の抗原結合部位を含む多選択性抗体で、2つの異なるエピトープに免疫特異的に結合することができる。「三重特異性」抗体は、3つ以上の抗原結合部位を含む多選択性抗体で、3つの異なるエピトープに免疫特異的に結合することができ、「四重特異性」抗体は、4つ以上の抗原結合部位を含む多選択性抗体で、4つの異なるエピトープに免疫特異的に結合できる、等々。
本明細書で使われる「エピトープマッピング」は、抗体−抗原認識の分子決定要因を特定するプロセスである。
本明細書で使われる「標的タンパク質」または「標的抗原」は、抗体またはその一部により特異的に認識される、および/またはその活性が抗体またはその一部により調節される候補タンパク質またはペプチドを指す。標的タンパク質には、抗体認識のためのエピトープを含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。標的タンパク質には、発現または活性によって疾患または障害の病因に関与するタンパク質が含まれる。代表的標的タンパク質は、本明細書で記載される。
本明細書で使われる「Hit」は、標的抗原に対する活性を有するとして、産生された、特定された、認識された、または選択された抗体またはその一部を指す。例えば、「Hit」は、選別アッセイで特定できる。通常、「Hit」は、標的抗原に対するその結合活性または親和性に基づいて特定される。本明細書の目的に対しては、「Hit」は、通常、少なくとも正確にまたは約10−5M、10−6M、10−7M、10−8M、またはそれ以下である標的抗原に対する結合親和性を有する抗体またはその一部であると認識されている。本明細書の目的としては、Hitは、通常、本明細書の親和性成熟法を使ってさらに最適化される1次抗体または参照もしくは親抗体である。従って、用語の「Hit」、1次抗体、参照抗体または親抗体は、本明細書では、同義で使用される。
本明細書で使われる「改変抗体」は、親または参照抗体に比べ1つまたは複数のアミノ酸改変を含む抗体またはその一部を指す。アミノ酸改変には、アミノ酸欠失、置換(replacement)(もしくは置換(substitution))、または追加、が含まれる。改変抗体は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれを超えるアミノ酸改変を含むことができる。通常、アミノ酸改変は、アミノ酸置換である。一般的には、アミノ酸改変は、抗体の領域または標的領域に存在するが、抗体またはその一部の他の領域に存在してもよい。
本明細書で使われる「関連抗体」は、対応する型の参照抗体(例えば、Hit抗体または1次抗体)に対し、構造的および機能的な類似性を示すが、参照抗体と同じ活性または構造(例えば、配列)を示さない抗体である。例えば、関連抗体は、配列の類似性を示すが、参照抗体と同じではなく、また、標的タンパク質または抗原に対して、参照抗体の活性より活性の低下または少ない活性、例えば、結合親和性の低下、を示す抗体である。本明細書の目的に対しては、1)その抗体が、参照抗体に対する配列の類似性を示し、対応する1次抗体の可変重鎖または可変軽鎖に対し少なくとも75%のアミノ酸配列同一性を示す可変重鎖および/または可変軽鎖を含み、関連抗体(可変重鎖および可変軽鎖)は、参照抗体に対する100%の配列同一性を示さず;さらに2)その抗体が、対応する型の参照抗体に比較して活性の低下を示す場合、抗体は、関連抗体である。配列類似性または配列同一性に関する別の例では、1)その抗体が、参照抗体に対して配列類似性を示し、関連抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の少なくとも1つのVH、DHおよびJH生殖系列セグメントが、1次抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の1つのVH、DHおよびJH生殖系列セグメントと同一であり、および/または少なくとも1つのVκおよびJκまたは少なくとも1つの可変軽鎖をコードする核酸分子のVλおよびJλ生殖系列セグメントが、1次抗体の可変軽鎖をコードする核酸分子の1つのVκおよびJκまたはVλおよびJλ生殖系列セグメントと同一であり;さらに2)その抗体が対応する型の参照抗体に比較して活性低下を示す場合、抗体は関連抗体である。
本明細書で使われる標的抗原に対する「活性低下」または「低い活性」は、抗体、またはその一部が、同じ標的抗原に対する参照抗体ほど高くないか、または同じ程度の標的抗原に対する活性(例えば、結合または他の機能活性)を示すことを意味する。参照抗体に対する活性の比較では、活性は、同じまたは類似の条件下で活性を評価するのと同じアッセイを使って対応する型の抗体と比較されることが理解されよう。従って、2つ以上の抗体の間またはその内の必要な活性レベルは、類似のパラメータまたは条件の下で比較される。本明細書の目的に対しては、標的抗原に対する「活性低下」または「低い活性」を有する抗体は、通常、参照抗体に比べ、標的抗原に対し80%以下の活性、例えば、参照抗体の5%〜80%の活性、例えば、正確にまたは約80%、75%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%もしくはそれ未満の標的抗原に対する活性を示す。
本明細書で使われる「関連可変重鎖」または「関連可変軽鎖」は、対応する参照抗体の可変重鎖および/または可変軽鎖と配列同一性を示すが、対応する参照抗体の可変重鎖および/または可変軽鎖と同じではない(例えば、100%配列同一性を示さない)ものである。通常、関連可変重鎖または可変軽鎖は、対応する参照抗体の鎖と少なくとも60%配列同一性、通常、少なくとも75%配列同一性を示すものである。例えば、関連可変重鎖または可変軽鎖は、対応する参照抗体の鎖と60%〜99%配列同一性、例えば、正確にまたは約60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を示すものである。例えば、関連抗体には、関連抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の少なくとも1つのVH、DHおよびJH生殖系列セグメントが、1次抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の1つのVH、DHおよびJH生殖系列セグメントと同じであり、および/または可変軽鎖をコードする核酸分子の少なくとも1つのVκおよびJκまたは少なくとも1つのVλおよびJλ生殖系列セグメントが、1次抗体の可変軽鎖をコードする核酸分子の1つのVκおよびJκまたはVλおよびJλ生殖系列セグメントと同一である抗体が含まれる。通常、抗体の関連可変重鎖および/または可変軽鎖は、対応する参照抗体の可変重鎖または可変軽鎖と少なくとも75%アミノ酸配列同一性を示す。
本明細書で使われる抗体の型は、抗体の特定の構造を指す。本明細書の抗体には、完全長抗体およびその一部、例えば、Fab断片または他の抗体断片が含まれる。従って、Fabは特定の型の抗体である。
本明細書で使われる抗体の「対応する型」に対する参照は、2つの抗体の特性または活性を比較する場合、特性を同じ型の抗体を使って比較することを意味する。例えば、抗体が、対応する型の1次抗体の活性に比べて低い活性であると述べられている場合、特定の型、例えば、抗体のFab、が1次抗体のFabの型に比べて、低い活性を有することを意味する。
本明細書で使われる「配列多様性」または「配列類似性」は、核酸配列の類似性の表現を指し、配列アラインメント、多様性スコア、および/または配列クラスタリングを使って求められる。いずれかの2つの配列に関し、配列を並べて配置し、配列の長さ方向に沿った全ての位置のヌクレオチド内の差異を分析することにより配列比較可能である。NCBIが開発したツールのBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)を使って、コンピュータにより核酸および/またはタンパク質配列の比較を行い、配列アラインメントを評価することができる。配列アラインメントのためにBLASTを使用することは、当業者にはよく知られている。Blastの探索アルゴリズムは、2つの配列を比較し、各マッチ(Blastスコア)の統計的有意性を計算するものである。相互に最も類似している配列は、高いBlastスコアを有し、一方、最も違いの多い配列は、低いBlastスコアを有することになる。
本明細書で使われるBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)は、Altschul et al.(1990)により開発された探索アルゴリズムで、タンパク質またはDNAデータベースを、例えば、配列同一性に基づいて、別々に探索する。例えば、bastnは、ヌクレオチド配列データベース(例えば、GenBank)に対してヌクレオチド問い合わせ配列を比較するプログラムである。BlastPは、タンパク質配列データベースに対してアミノ酸問い合わせ配列を比較するプログラムである。
本明細書で使われる「標的領域」は、関連抗体または抗体の対応する領域に比べて、少なくとも1つのアミノ酸差異を示す抗体(例えば、Hit抗体)またはその一部の可変重鎖または可変軽鎖の領域を指す。従って、標的領域には、関連抗体の対応する領域に比べて、少なくとも1つのアミノ酸差異を含む抗体の可変重鎖または可変軽鎖の1つまたは複数のCDR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3またはFR4が含まれる。通常、標的領域は、抗体の構造/活性関連性(SAR)に関連する抗体の領域である。従って、本明細書の方法を実施する目的のためには、標的領域は、さらなる変異誘発の標的となる領域である。本明細書に記載のように、このような領域を特定し、アミノ酸の差異が存在するかどうかを判定することは、当業者のレベル内で可能なことである。当業者なら、KabatまたはChothiaナンバリング(例えば、Kabat、E.A.et al.(1991)免疫学的関連タンパク質の配列、第5版、米国保健福祉省、NIH Publication No.91−3242、およびChothia、C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901−917、を参照)に基づいて、抗体中の領域、例えば、CDRまたはFR、を知り、特定できる。
本明細書で使われる「飽和変異誘発」は、タンパク質配列の少なくとも1つのアミノ酸残基を全てのまたはサブセットの使われていないアミノ酸残基に置換することにより、または多くのアミノ酸残基(タンパク質の全長内もしくは全体にわたり、またはタンパク質の領域内もしくは全体にわたり)のそれぞれを全てのまたはサブセットの使われていないアミノ酸残基に置換させることにより、系統的に複数の変異体を生成するプロセスを指す。飽和変異誘発は、全体でも部分的であってもよい。
本明細書で使われる「完全飽和変異誘発(full saturation mutagenesis)」は、タンパク質配列中のアミノ酸残基を他の19天然アミノ酸で置換することにより複数の変異体を系統的に生成するプロセスを指す。タンパク質配列中の単一アミノ酸残基は、変異誘発の対象でありうる。あるいは、タンパク質またはタンパク質配列の領域(例えば、標的領域)の完全長配列全体にわたる全ての、またはサブセットのアミノ酸残基を完全飽和変異誘発に供することができる。
本明細書で使われる「部分的飽和変異誘発」は、タンパク質配列中のアミノ酸残基をサブセットの他の19の天然のアミノ酸に置き換えることにより、複数の変異体配列を系統的に生成するプロセスを指す。タンパク質配列中の単一のアミノ酸残基は、変異誘発の対象になりうる。あるいは、タンパク質またはタンパク質配列の領域(例えば、標的領域)の完全長配列全体にわたる全ての、またはサブセットのアミノ酸残基を部分的飽和変異誘発に供することができる。
本明細書で使われる「系統的変異導入」は、タンパク質またはタンパク質の領域(例えば、標的領域)の全ての、またはサブセットのアミノ酸残基を、各残基が同じ残基で置換可能な間は、選択されたアミノ酸、通常、アラニン、グリシンまたはセリンで、系統的に置換するプロセスを指す。通常は、置換アミノ酸はアラニンである。
本明細書で使われる「Up mutant」である抗体、または「活性保持または活性増加を示す」抗体への参照は、スキャンアミノ酸の変異を含まない親抗体に比較して、スキャンアミノ酸に単一アミノ酸変異を含む場合に、活性が維持されるか、または高められる系統的変異導入をされた抗体を指す。標的抗原に対し活性を保持している抗体は、結合の少しの増加または減少を示しうるが、通常は、スキャン変異を含まない1次抗体と同じ結合を示す。例えば、少なくとも75%の結合活性、例えば、75%〜120%の結合、例えば、75%、80%、85%、90%、95%、100%、105%、110%または115%の結合を示す。標的抗原に対し活性増加を示す抗体は、通常、変異を含まない1次抗体に比べて、115%を超える活性、例えば、115%、120%、130%、140%、150%、200%またはそれを超える活性を示す。
本方法のステップの実行に関して本明細書で使われる「反復性の(iterative)」は、前の繰り返し時に比べ、改変された「Hit」の活性が最適化されている、または改善されていることが特定されるまで、複数回、例えば、2、3、4、5またはそれを超える回数、この方法が繰り返されることを意味している。
本明細書で使われる抗体またはその一部に関連する「中間体」は、参照抗体、テンプレートまたは親抗体から、例えば、親和性成熟のプロセスにより、誘導されたか、または進化した抗体で、しかし、それ自体さらに進化を受ける抗体を指す。例えば、改変Hitが本明細書の親和性成熟法により選択されるとすぐ、それ自体、さらに抗体を進化させる、または最適化するために、テンプレートとして使用できる。従って、改変Hitは、さらなる改変Hitを特定するか、または選択するための中間体抗体である。
本明細書で使われる「抗体ライブラリー」は、例えば、2以上、通常は、5以上、さらに通常は、10以上、例えば、正確にまたは約10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、1000、104 、105、106 、107 、108、109、1010、1011、1012、1013、1014もしくはそれ以上のこのような分子の抗体メンバーまたはその一部の収集を指す。一部の実施例では、収集のメンバーは、収集内のメンバーが、標的またはテンプレート抗体に比較して多様化されているために、相互に類似している。しかし、抗体ライブラリーは、任意の抗体メンバー、またはその一部の収集を包含する。従って、テンプレートメンバーに比較して、収集内の各メンバーが多様化される必要はない。通常、収集は、異なるメンバー(すなわち、配列に基づいて)を含むが、一部の抗体収集では、いくつかの同じメンバーを含むこともありうる。通常は、収集は、少なくとも104または約104 、105または約105、106または約106、少なくとも108または約108、少なくとも109または約109、少なくとも1010または約1010、またはそれ以上異なる抗体メンバーを含む。従って、収集は、通常、少なくとも104または約104 、105または約105、106または約106、少なくとも108または約108、少なくとも109または約109、少なくとも1010または約1010、少なくとも1011または約1011、少なくとも1012または約1012、少なくとも1013または約1013、少なくとも1014または約1014、またはそれ以上の多様性を有する。従って、107の多様性を有する抗体ライブラリーは、107の異なるメンバーを含むことを意味する。
収集またはライブラリーのメンバーに関して本明細書で使われる「多様性」は、収集中のユニークなメンバーの数を指す。従って、多様性は、類似のポリペプチドメンバーの収集の中の異なるアミノ酸配列または核酸配列それぞれの数を指す。例えば、104の多様性を有するポリヌクレオチドの収集は、類似のポリヌクレオチドメンバーの中で、104異なる核酸配列を含む。一例では、提供されるポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドの収集は、少なくとも正確にまたは約102、103、104、105、106、107、108、109、1010もしくはそれ超の多様性を有する。
本明細書で使われる「多様性比率」は、ライブラリー中の、ライブラリーの全体メンバーの数に対する、異なるメンバーの数の比率を指す。従って、別のライブラリーより大きな多様性比率を有するライブラリーは、全体メンバーに対するより多くの異なるメンバーを含み、それにより、全体メンバーに対するより多くの多様性を有する。提供されるライブラリーは、高い多様性比率、例えば、1に近い多様性比率、例えば、正確にまたは約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.90.91、0.92、0.93、0.94、0.95.0.96、0.97、0.98、または0.99の多様性比率を有するライブラリーを含む。
本明細書で使われる「コンビナトリアルライブラリー」は、ビルディングブロック(building block)の組み合わせに基づく、置き替え可能な化学的「ビルディングブロック」の異なる組み合わせを反応させ、化合物の収集を生成することにより形成される化合物の収集を指す。抗体コンビナトリアルライブラリーに対しては、ビルディングブロックは、成分V、DおよびJ領域(またはその改変型)で、これらから抗体が生成される。目的本明細書の目的に対しては、用語「ライブラリー」または「収集」は、同義に使用される。
本明細書で使われるコンビナトリアル抗体ライブラリーは、抗体(またはその一部、例えば、Fab)の収集で、ここでは、抗体は、V、DおよびJ遺伝子セグメント、特にヒトV、DおよびJ生殖系列セグメントの組み合わせにより作られる核酸分子にコードされている。本明細書のコンビナトリアルライブラリーは、通常、少なくとも50の異なる抗体(または抗体の一部もしくは断片)メンバー、通常、少なくともまたは約50〜1010以上の異なるメンバー、一般的には、少なくともまたは約102〜106以上の異なるメンバー、例えば、少なくともまたは約50、100、500、103、1x103、2x103、3x103、4x103、5x103、6x103、7x103、8x103、9x103、1x104、2x104、3x104、4x104、5x104、6x104、7x104、8x104、9x104、1x105、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、106、107、108、109、1010、またはそれ以上の異なるメンバーを含む。得られた抗体またはその一部のライブラリーまたは収集は、標的タンパク質に対する結合または機能活性の調節により選別できる。
本明細書で使われるヒトコンビナトリアル抗体ライブラリーは、抗体またはその一部の収集で、各メンバーは、抗原結合部位を形成するのに充分なVLおよびVH鎖またはその一部を含み、これらは、米国特許仮出願第61/198、764号および61/211、204号に記載のようにして製造されたヒト生殖系列セグメントを含む核酸にコードされている。この特許は、参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書で使われるライブラリー中の座位(locus)は、ライブラリーの1つまたは複数のメンバーを含みうる部位または位置を指す。位置は、物理的な位置である必要はない。例えば、収集が固体支持体上のアレイとして提供される場合は、支持体はアレイのメンバーを提示できる、または提示する座位を含む。
本明細書で使われるアドレスは、収集中の各座位を示すユニークな識別子を指し、それにより、アドレス指定されたメンバー(例えば、抗体)が特定できる。アドレス指定された成分は、その座位または部位により特定可能な成分である。アドレス指定は、表面の位置、例えば、マイクロプレートのウエルの位置にも適用可能である。例えば、マイクロウエルプレート中のタンパク質のアドレス:F9は、タンパク質がマイクロウエルプレートのF行、9列の位置にあることを意味する。また、アドレス指定は、他の識別子、例えば、バーコードもしくは他の記号体系をコードしたタグ、化学的タグ、電子的なRF等のタグ、色分けされたタグまたは他のこのような識別子により行うこともできる。
本明細書で使われるアレイは、3つ以上のメンバーを含む要素、例えば、抗体、の収集を指す。
本明細書で使われる「空間アレイ」は、メンバーがアレイ中の分離された、または別々の空間を占めるアレイである。従って、空間アレイは、アドレス指定できるアレイのタイプである。空間アレイの例には、プレートの各ウエルがアレイ中のアドレスであるマイクロタイタープレートが含まれる。空間アレイには、複数の異なる分子、例えば、ポリペプチド、が保持、提示、配置、位置付け、または支持されている任意の配置が含まれる。アレイには、マイクロタイタープレート、例えば、48ウエル、96ウエル、144ウエル、192ウエル、240ウエル、288ウエル、336ウエル、384ウエル、432ウエル、480ウエル、576ウエル、672ウエル、768ウエル、864ウエル、960ウエル、1056ウエル、1152ウエル、1248ウエル、1344ウエル、1440ウエル、もしくは1536ウエルプレート、チューブ、スライド、チップ、フラスコ、または任意の他の適切な実験器具、が含まれる。さらに、アレイは、複数のサブアレイを含んでもよい。複数のサブアレイは、2つ以上の配列を使用してポリペプチドを配置するアレイを包含する。例えば、複数の96ウエルプレートは、複数のサブアレイおよび単一のアレイを構成することができる。
本明細書で使われる、アドレス指定できるライブラリーは、収集の各メンバーがそのアドレスにより特定可能な分子、例えば、核酸分子または抗体等のタンパク質試薬の収集である。
本明細書で使われる、アドレス指定できるアレイは、アレイのメンバーがそれらのアドレス、マイクロタイタープレートのウエルもしくは固相支持体、等の空間アレイ中の位置、または特定可能なもしくは検出可能な標識、例えば、色、蛍光、電子シグナル(例えば、RF、マイクロ波もしくは対象分子の相互作用を実質的に変えない他の周波数)、バーコードもしくは他の記号体系、化学的もしくは他のこのような標識、により特定可能なアレイである。従って、一般的に、アレイメンバーは、固相の表面上の特定可能な座位に配置され、または直接的もしくは間接的に特定可能な標識に結合させるか、またはそうでなければ会合させて、例えば、マイクロスフェアまたは他の粒子状支持体(本明細書では、ビーズと呼ぶ)に付着させ、溶液中に懸濁または表面上に展開させて、配置される。
本明細書で使われる「アドレス指定できる抗体ライブラリー」または「アドレス指定できるコンビナトリアル抗体ライブラリー」は、メンバー抗体が特定可能であり、空間アレイもしくは固体支持体の位置、または化学的もしくはRFタグ、等の同じ識別子の全抗体が同じ抗原に結合し、さらに、通常、アミノ酸配列が実質的に同じである抗体の収集を指す。本明細書の目的に対しては、「アドレス指定できるコンビナトリアル抗体ライブラリー配列」への参照は、アレイ中で抗体メンバーがアドレス指定されることを意味する。
本明細書で使われる支持体(マトリックス支持体、マトリックス、不溶性の支持体または固体支持体、とも呼ばれる)は、任意の固体または半固体または不溶性支持体を指し、これに、対象分子、通常は、生物学的分子、有機分子または生体分子特異的リガンドが結合または接触する。このような材料には、化学的および生物学的分子合成および分析のための親和性マトリックスまたは支持体として使用される任意の材料が含まれ、例えば、これに限定されないが、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ナイロン、ガラス、デキストラン、キチン、サンド、軽石、アガロース、多糖類、デンドリマー、バッキーボール、ポリアクリルアミド、シリコン、ゴム、および固相合成、親和性分離および精製、ハイブリダイゼーション反応、イムノアッセイならびに他のこのような用途に使われる他の材料、が含まれる。本明細書のマトリックスは、粒子状であっても、連続表面の形、例えば、マイクロタイターディッシュもしくはウエル、ガラススライド、シリコンチップ、ニトロセルロースシート、ナイロンメッシュ、または他のこのような材料であってもよい。微粒子の場合は、通常、粒子は、少なくとも1つの次元は5〜10mmの範囲以下である。このような粒子、本明細書ではまとめて「ビーズ」と呼ぶ、は、必須ではないが、球状であることが多い。しかし、このような参照は、マトリックスの形状を制約するものではなく、ランダムな形状、針状、線維状、および細長い形状を含むどのような形でもよい。液体相中で使用可能な、凡そ球状の「ビーズ」、特に、マイクロスフェアも、また、意図されている。「ビーズ」は、追加の成分、例えば、磁石利用分離のための磁性または常磁性粒子(例えば、Dynabeads(登録商標)(Dynal、Oslo、Norway)を参照)を、その追加の成分が本明細書の方法と分析を妨害しない限り、含んでもよい。
本明細書で使われるマトリックスまたは支持体粒子は、離散性の粒子の形であるマトリックス材料を指す。粒子は、任意の形と次元を有するが、通常、少なくとも1つの次元は、100mm未満、50mm未満、10mm未満、1mm未満、100μm未満、50μm未満であり、また、通常、大きさは、100mm3未満、50mm3未満、10mm3未満、および1mm3未満、100μm3未満、および立方ミクロンのオーダーであってもよい。このような粒子をまとめて「ビーズ」と呼ぶ。
本明細書で使われる生殖系列遺伝子セグメントは、免疫グロブリン重鎖または軽鎖(カッパ鎖およびラムダ鎖)をコードする生殖系列由来の免疫グロブリン(Ig)可変(V)、多様性(D)および連結(J)または定常(C)遺伝子を指す。生殖系列には、複数のV、D、JおよびC遺伝子セグメントがあるが、遺伝子再構成では、再構成された各機能的遺伝子中にそれぞれただ1つのセグメントを生ずる。例えば、機能的に再構成された重鎖は、1つのV、1つのDおよび1つのJを含み、機能的に再構成された軽鎖遺伝子は、1つのVおよび1つのJを含む。従って、これらの遺伝子セグメントは、生殖細胞に運ばれるが、しかしそれらが機能的遺伝子に再構成されるまで、転写もされず、重鎖と軽鎖に翻訳もされ得ない。骨髄中でのB細胞分化の間に、これらの遺伝子セグメントは、1010を超える特異性を生成することが可能なダイナミック遺伝系により、ランダムにシャッフルされる。
本明細書の目的に対しては、重鎖生殖系列セグメントは、VH、DHおよびJHとして設計され、その編集により、VH鎖をコードする核酸を生ずる。軽鎖生殖系列セグメントは、カッパおよびラムダ軽鎖(VκおよびJκ;VλおよびJλ)を含むVLまたはJLとして設計され、その編集により、VL鎖をコードする核酸を生ずる。軽鎖は、カッパまたはラムダ軽鎖であるが、VκおよびJλの編集によるカッパ/ラムダの組み合わせは含まないことは理解されよう。
本明細書の可変生殖系列セグメントへの参照は、V、DおよびJグループ、サブグループ、遺伝子またはその対立遺伝子を指す。遺伝子セグメント配列は、既知のデータベース(例えば、米国・国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)、international ImMunoGeneTics information system(登録商標)(IMGT)、KabatデータベースおよびTomlinson’s VBaseデータベース(Lefranc(2003)Nucleic Acids Res.、31:307−310;Martin et al.、抗体エンジニアリング用バイオインフォマティクスツール(治療抗体ハンドブック中の)、Wiley−VCH(2007)、pp.104−107)からアクセス可能である。
本明細書で使われる、生殖系列セグメントに関連する「グループ」は、免疫グロブリン由来のコアコード領域、すなわち、重鎖または軽鎖をコードする可変(V)遺伝子、多様性(D)遺伝子、連結(J)遺伝子または定常(C)遺伝子、を指す。代表的な生殖系列セグメントグループには、VH、DH、JH、Vκ、Jκ、VλおよびJλが含まれる。
本明細書で使われる生殖系列セグメントに関連する「サブグループ」は、ヌクレオチド配列類似性または同一性により定まる一連の配列を指す。一般的には、サブグループは、所与の種における同じグループ[V、D、JまたはC]に属する一連の遺伝子で、ヌクレオチドレベルで少なくとも75%の同一性を共有する。サブグループは、IMGT命名法(imgt.cines.fr;例えば、Lefranc et al.(2008)バイオインフォマティクス・ブリーフィング、9:263−275、参照)に基づいて分類される。通常、サブグループは、多重遺伝子ファミリーを表す。
本明細書で使われる遺伝子の対立遺伝子は、参照遺伝子配列に比較して、コード領域中の1つまたは複数のヌクレオチドの差異(例えば、置換、挿入または欠失)による配列多型性を有する生殖系列配列を指す。従って、同じサブグループに属するIG配列は、それらのコード配列が高度に類似しているが、それにも関わらず、高い多形性を示しうる。サブグループ対立遺伝子は、IMGT命名法に基づいて分類され、アステリスク(*)とそれに続く2つの図番号が付加される。
本明細書で使われる生殖系列セグメントに関連する「ファミリー」は、アミノ酸配列類似性または同一性により定まる一連の生殖系列セグメント配列を指す。通常、生殖系列ファミリーには、遺伝子の全対立遺伝子が含まれる。
本明細書で使われる生殖系列セグメントのヌクレオチドに関連する反転配列は、遺伝子セグメントが、ヌクレオチドの参照配列の逆相補配列であるヌクレオチドの配列を有することを意味する。
本明細書で使われる「編集(compilation)」、「編集する(compile)」、「組み合わせる(combine)」、「組み合わせ(combination)」、「再構成する(rearrange)」、「再構成(rearrangement)」、または他の類似の用語またはその文法的変化は、生殖系列セグメントが整えられ、または組み立てられて遺伝子を表す核酸配列になるプロセスを指す。例えば、コンビナトリアル法では、可変重鎖生殖系列セグメントは、VHセグメントがDHセグメントに対し5’となり、またDHセグメントがJHセグメントに対し5’となるように組み立てられ、その結果、VH鎖をコードする核酸配列が得られる。可変軽鎖生殖系列セグメントは、VLセグメントがJLセグメントに対し5’となるように組み立てられ、それにより、VL鎖をコードする核酸配列が得られる。1つまたは複数の定常遺伝子セグメントも、また、VHまたはVL鎖をコードする核酸の3’末端上に組み立てることができる。
本明細書で使われる生殖系列セグメントに関連する「結合された(linked)」、または「結合(linkage)」または他のその文法的変化は、生殖系列セグメントの連結を指す。結合は、直接的でも間接的でもよい。生殖系列セグメントは、セグメント間に追加のヌクレオチドなしに直接結合可能であり、または追加のヌクレオチドを加えて、全体セグメントをインフレームにする、もしくはヌクレオチドを欠失させ、生じたセグメントをインフレームにすることが可能である。コンビナトリアル抗体ライブラリーを生成する方法では、生じた核酸分子がインフレームであり、機能的かつ増殖性抗体をコードするように、リンカーヌクレオチドの選択がなされることを理解されたい。
本明細書で使われる、ヒト生殖系列セグメントの結合に関連する「インフレーム」または「結合されたインフレーム」は、生じた核酸分子を5’開始コドン(ATG)を有するインフレームにし、それにより、「増殖性」または機能的完全長ポリペプチドを産生するために、連結された接合部のヌクレオチド生殖系列セグメント内に挿入および/または欠失があることを意味する。生殖系列セグメントに対し挿入する、または欠失させるヌクレオチドの選択、特に、可変VD、DJおよびVJセグメントを連結する接合部での選択は、本明細書の方法で提供されたV(D)J接合部生成のための規則に従っている(詳細は米国特許仮出願第61/198、764号および同61/211、204号に記載されている)。例えば、生殖系列セグメントは、VHセグメントがDHセグメントに対し5’となり、DHセグメントがJHセグメントに対し5’となるように、組み立てられる。VHおよびDHの連結の接合部、ならびにDHおよびJHセグメントの連結の接合部で、生じた連結したVDJセグメントを含む核酸分子が5’開始コドン(ATG)を有するインフレームとなるように、ヌクレオチドを個々のVH、DHまたはJHセグメントに対し挿入する、または欠失させることができる。
本明細書で使われる抗体またはその一部をコードする核酸に関連する「機能的抗体」または「増殖性抗体」は、コンビナトリアル法により産生された核酸分子によりコードされている抗体またはその一部、例えば、Fab、を指す。機能性または増殖性抗体では、V(D)J生殖系列セグメントは、コードされた抗体またはその一部が切断されないように、および/またはアミノ酸配列が読み枠から外れないように、編集される(すなわち、再構成される)。これは、タンパク質翻訳機械にタンパク質構築を時期尚早に停止させる内部停止コドンを核酸分子が含まないことを意味する。
本明細書で使われる、対応する残基に関連する対応、例えば、「に対応するアミノ酸残基」は、関連配列(例えば、対立遺伝子変異体、同じファミリーの遺伝子、種の変異体)の2つのポリペプチドの内または間で比較した、残基を指す。当業者なら、ポリペプチドの間、または内で対応する残基を容易に特定することができる。例えば、2つの配列を比較することにより、当業者なら、保存された、および等価なアミノ酸をガイドとして使用して、対応する残基を特定できる。当業者なら、マニュアルで配列を整列比較することができ、または多数の入手可能なプログラム(例えば、BLAST)のいずれかを使用することができる。従って、相互に対応するアミノ酸残基または位置は、配列および/または特定の参照ポリペプチドとの構造的配列比較に基づき、相互に対応することがわかった残基である。
本明細書で使われる「選別」は、抗体またはその一部の活性または特性の測定に基づき、複数の抗体、例えば、抗体および/またはその一部の収集またはライブラリーからの、抗体またはその一部の特定または選択を指す。選別は、例えば、抗体の標的タンパク質に対する直接結合(例えば、結合親和性)を評価するアッセイ、または標的タンパク質の活性調節を評価する機能的アッセイ、を含む種々の方法のいずれかにより行うことができる。
本明細書で使われる用語の評価(assessing)は、抗体またはその一部の標的タンパク質に対する結合、および/または標的タンパク質の抗体またはその一部による活性の調節、および、また、指数、比率、パーセンテージ、目視のまたは他の結合または活性のレベルを示す値、の取得のために、絶対値取得という意味での定量的および定性的測定を含むことが意図されている。評価は、直接的でも間接的でもよい。例えば、結合は、検出可能な標識による抗体またはその一部の直接標識化により、および/またはそれ自体を標識した二次抗体を使うことにより、測定可能である。さらに、機能的活性は、当業者に既知の種々のアッセイ、例えば、増殖、細胞障害性および本明細書記載の他の方法のいずれかを使って、抗体またはその一部の存在と非存在の対比下で標的タンパク質の活性を比較することにより、測定可能である。
本明細書で使われる、抗体またはその一部の標的タンパク質機能活性の効果に関連する「調節する」または「調節」および他のそれの種々の文法的変化型は、活性増加、例えば、誘導または活性の増強、ならびに標的タンパク質の1つまたは複数の活性の抑制を指す。従って、調節には、活性の増加(すなわち、上方制御またはアゴニスト活性)、活性の減少(すなわち、下方制御または抑制)またはいずれかの他の活性の変化(例えば、周期性、頻度、持続期間、動力学または他のパラメータの変化)が含まれうる。調節は、状況依存的である可能性があり、通常、調節は設計された状態、例えば、野生型タンパク質、恒常的状態のタンパク質、または設計された細胞型または状態で発現したたんぱく質、と比較される。標的タンパク質の機能活性は、抗体またはその一部が存在しない条件下の標的タンパク質の活性に比較して、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または90%超だけ抗体またはその一部により調節されうる。
本明細書で使われるDelta−like4(DLL4)は、Notch受容体1および4用のリガンドであるタンパク質を指す。DLL4には、下記のいずれかのDLL4ポリペプチドが含まれる(これに限定されない):組換えで産生したポリペプチド、合成で産生したポリペプチド、ネイティブDLL4ポリペプチド、および内皮細胞を含む細胞または組織から抽出したDLL4ポリペプチド。また、DLL4には、ヒトおよび非ヒト起原の動物(これに限定されない)を含む、異なる種由来の関連ポリペプチドが含まれる。ヒトDLL4には、DLL4、対立遺伝子変異体アイソフォーム、核酸由来合成分子、ヒト組織および細胞から単離されたタンパク質、およびその改変型が含まれる。代表的DLL4ヒトには、配列番号2904で設定されるアミノ酸配列を有し、配列番号2905で設定されるヌクレオチドの配列によりコードされたDLL4が含まれる。本明細書の目的のためには、DLL4への参照は、別に定めがなければ、通常は、ヒトDLL4への参照である。
本明細書で使われる「活性化因子」、例えば、「アゴニスト」または「活性化因子/モジュレーター」は、シグナル伝達活性または他の受容体の機能活性を、増強するか、誘導するか、そうでなければ高めることにより調節する抗体またはその一部を指す。活性化因子、例えば、アゴニストまたは活性化因子/モジュレーターは、単独で使用した場合、シグナル伝達または他の機能活性を調節または高めることができるか、またはリガンド単独の場合に比べ、天然の受容体のリガンド、もしくは他の受容体刺激物質の存在下で、シグナル伝達または他の機能活性を変えて、受容体によりシグナル伝達を強化することができる。活性化因子には、アゴニストまたは活性化因子/モジュレーターが含まれる。
本明細書で使われる「アゴニスト」は、内在性リガンドの活性を模倣し、内在性リガンドに置き換わることができる抗体またはその一部を指す。
本明細書で使われる「モジュレーター/活性化因子」は、標的基質のアロステリック部位に結合し、そのリガンドによる受容体の活性化を変える、例えば、高める抗体またはその一部を指す。
本明細書で使われる「アロステリック部位」は、リガンド/受容体相互作用を付与する部位ではないが、抗体またはその一部によって結合された場合、標的基質の活性を変える標的基質上の部位である。
本明細書で使われる「アンタゴニスト」は、シグナル伝達活性または他の受容体の機能活性を遮断または低減することによってシグナル伝達または他の受容体の機能活性を調節する抗体またはその一部を指す。
本明細書で使われるオフレート(koff)は、その抗原から抗体が解離する速度である。
本明細書で使われるオンレート(kon)は、抗体が抗原に結合する速度である。
本明細書で使われる「半減期」(t1/2)または「解離半減期」は、最初に存在するタンパク質−リガンドまたは基質−抗体複合体の半分が解離する時間を指す。これは、Ln(2)/koffとして表される。
本明細書で使われる「抗原結合部位を形成するのに充分な抗体またはその一部」への参照は、抗体またはその一部が全6CDRを含む対応する完全長抗体の少なくとも一部の結合特異性を保持するのに充分な、VHおよびVLの少なくとも1または2、通常は3、4、5または全6のCDRを含むことを意味する。通常、充分な抗原結合部位には、少なくとも重鎖のCDR3(CDRH3)が必要である。通常は、さらに軽鎖のCDR3(CDRL3)が必要である。本明細書記載のように、当業者なら、KabatまたはChothiaナンバリングに基づいてCDRを理解し、特定することができる(例えば、Kabat、E.A.et al.(1991)免疫学的関連タンパク質の配列、第5版、米国保健福祉省、NIH Publication No.91−3242、およびChothia、C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901−917、を参照)。例えば、Kabatナンバリングに基づくと、CDR−LIは、残基L24〜L34に相当する;CDR−L2は、残基L50〜L56に相当する;CDR−L3は、残基L89〜L97に相当する;CDR−H1は、残基H31〜H35、35aまたは35bに相当する(長さに応じて);CDR−H2は、残基H50〜H65に相当する;ならびにCDR−H3は、残基H95〜H102に相当する。
本明細書で使われる標識は、分子に直接的または間接的に付着または結合または会合させることが可能な、検出可能マーカーである。検出方法は、当技術分野で既知のいずれの方法でもよい。
本明細書で使われるヒトタンパク質は、ヒトゲノム中に存在する核酸分子、例えば、DNAによってコードされるたんぱく質で、全対立遺伝子変異体およびその保存された変種を含む。改変がヒトタンパク質の野生型または主要な配列に基づく場合は、タンパク質改変変異体は、ヒトタンパク質である。
本明細書で使われる「天然アミノ酸」は、ポリペプチドで発生する20のL−アミノ酸を指す。残基は、ヒト中で、その同族のmRNAコドンを使った負荷tRNA分子の特異的認識によりタンパク質に組み込まれる天然に存在する20のα−アミノ酸である。
本明細書で使われる非天然アミノ酸は、遺伝的にコードされないアミノ酸を指す。例えば、非天然アミノ酸は、天然アミノ酸に類似の構造を有するが、天然アミノ酸の構造および反応性を模倣するように構造的に改変されている有機化合物である。非天然アミノ酸は、従って、例えば、20天然アミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸の類似体で、アミノ酸のD−イソステレオマーを含む(これに限定されない)。代表的非天然アミノ酸は、当業者に既知である。
本明細書で使われる核酸には、ペプチド核酸(PNA)およびその混合物を含むDNA、RNAおよびその類似体が含まれる。核酸は、単鎖でも二重鎖でもよい。任意選択で検出可能標識、例えば、蛍光または放射標識等で標識付けした、プローブまたはプライマーを参照する場合、単鎖分子が意図されている。このような分子は、通常、ライブラリーの探査または初回刺激に対して、その標的が統計的にユニークであるか、または小コピー数であるような長さ(典型的には、5未満、一般的には、3未満)である。一般的には、プローブまたはプライマーは、対象遺伝子に対し配列相補的なまたは同等な少なくとも14、16または30の近接ヌクレオチドを含む。プローブおよびプライマーは、10、20、30、50、100またはそれ以上の核酸長さであってもよい。
本明細書で使われるペプチドは、2〜40アミノ酸長さのポリペプチドを指す。
本明細書で使われている、本明細書で提供される種々のアミノ酸配列中で現れるアミノ酸は、既知の3文字または1文字省略(表1)に従って特定される。種々の核酸断片中に現れるヌクレオチドは、当技術分野で日常的に使われる標準的な単一文字名称で示される。
本明細書で使われる「アミノ酸」は、アミノ基およびカルボン酸基を含む有機化合物である。ポリペプチドは、2つ以上のアミノ酸を含む。本明細書の目的に対しては、アミノ酸には、20の天然アミノ酸、非天然アミノ酸およびアミノ酸類似体(すなわち、α−炭素が側鎖を有するアミノ酸)が含まれる。
本明細書で使われる「アミノ酸残基」は、そのペプチド結合位置でポリペプチドの化学的消化(加水分解)により形成されたアミノ酸を指す。本明細書記載のアミノ酸残基は、「L」異性体であると想定されている。「D」と指定されている異性体の残基は、ポリペプチドの所望の機能特性が保持されている限り、いずれかのL−アミノ酸残基で置換可能である。NH
2は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。COOHは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシ基を指す。J.Biol.Chem.、243:3557−3559(1968)に記載され、37C.F.R.§§1.821−1.822、で採用された、標準的ポリペプチド命名法に従った、アミノ酸残基の省略を表1に示す。
本明細書で式により表現される全アミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシル末端への通常の方向の、左から右への配列であることに注意しなければならない。さらに、語句の「アミノ酸残基」は、対応表(表1)に挙げられたアミノ酸ならびに改変された、および他とは異なるアミノ酸、例えば、37C.F.R.§§1.821−1.822(参照により本明細書に組み込まれる)で参照されているものを含むように広義に定義されている。さらに、アミノ酸残基配列の先頭または末端にあるダッシュは、アミノ末端基、例えば、NH2への、またはカルボキシル末端基、例えば、COOHへの1つまたは複数のアミノ酸残基の追加配列に対するペプチド結合を示すことに注意すべきである。任意の保護基、アミノ酸および他の化合物に対する省略は、特に指示がなければ、それらの通常の使用法、認められている略号、またはIUPAC−IUB生化学命名法に関する委員会((1972)Biochem.11:1726、参照)に従う。各天然L−アミノ酸は、標準的な3文字コード(もしくは1文字文字コード)または接頭辞「L−」と共に標準的な3文字コード(もしくは1文字コード)によって特定される。接頭辞「D−」は、アミノ酸の立体異性体がDであることを示す。
本明細書で使われる等速性混合物は、アミノ酸のモル比が、報告されている反応速度に基づいて調製されている混合物である(例えば、Ostresh et al.、(1994)Biopolymers 34:1681、参照)。
本明細書で使われる改変は、ポリペプチドのアミノ酸配列の改変への、または核酸分子中のヌクレオチド配列の改変への参照であり、アミノ酸およびヌクレオチドの欠失、挿入、および置換をそれぞれ含む。ポリペプチドの改変方法は、当業者には日常的作業であり、例えば、組換えDNA法を使って行われる。
本明細書で使われる適切なアミノ酸の保存的置換は、当業者には既知で、通常、生成した分子の生物活性を変えることなく実行できる。当業者には、一般的に、ポリペプチドの非必須領域での単一アミノ酸置換は、生物活性を実質的に変えないことがわかっている(例えば、Watson et al.遺伝子の分子生物学、第4版、1987、The Benjamin/Cummings Pub.co.、p.224、参照)。このような置換は、以下の表2で定められている内容に従って行うことができる。
他の置換も許容でき、経験的に、または既知の保存的置換に従って決定できる。
本明細書で使われるDNA構築物は、単鎖または二重鎖の、天然には無い方式で組み合わされ、並置されたDNAのセグメントを含む直鎖または環状DNA分子である。DNA構築物は、ヒト操作の結果として存在し、クローンおよび他の操作された分子のコピーを含む。
本明細書で使われるDNAセグメントは、特定の属性を有するより大きなDNA分子の一部である。例えば、特定のポリペプチドをコードするDNAセグメントは、より長いDNA分子、例えば、プラスミドまたはプラスミド断片の一部であり、これは、5’から3’方向へ読み取られた場合、特定のポリペプチドのアミノ酸配列をコードしている。
本明細書で使われる用語の「核酸」は、単鎖および/または二重鎖ポリヌクレオチド、例えば、デオキシリボ核酸(DNA)、およびリボ核酸(RNA)ならびにRNAまたはDNAの類似体または誘導体を指す。また、用語の「核酸」には、核酸の類似体、例えば、ペプチド核酸(PNA)、ホスホロチオエートDNA、および他のこのような類似体および誘導体またはこれらの組み合わせが含まれる。核酸は、ポリヌクレオチド、例えば、デオキシリボ核酸(DNA)およびリボ核酸(RNA)を指すこともできる。また、この用語は、等価物として、ヌクレオチド類似体、単鎖(センスまたはアンチセンス)および二重鎖ポリヌクレオチドから作られたRNAまたはDNAの誘導体、変異体および類似体を含む。デオキシリボヌクレオチドには、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシンおよびデオキシチミジン、が含まれる。RNAに対しては、ウラシル塩基はウリジンである。
本明細書で使われる「コードする核酸分子」は、特異的タンパク質またはペプチドの発現を指示する核酸分子を指す。核酸配列には、RNA中へ転写されるDNA鎖配列およびタンパク質またはペプチド中へ転写されるRNA配列の両方が含まれる。核酸分子には、完全長成熟ポリペプチド、例えば、前駆体配列の欠けた完全長ポリペプチド由来の完全長核酸配列ならびに非完全長配列の両方が含まれる。本明細書の目的のためには、核酸配列は、また、ネイティブ配列の縮重コドンまたは特異的宿主でのコドン選択を提供するために導入可能な配列も含む。
本明細書で使われる用語の「ポリヌクレオチド」は、少なくとも2つの結合ヌクレオチド、またはヌクレオチド誘導体を含むオリゴマーまたはポリマーを指し、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、およびDNAまたはRNA誘導体を含む。これらには、例えば、ヌクレオチド類似体またはリン酸ジエステル結合以外の「バックボーン」結合、例えば、ホスホトリエステル結合、ホスホルアミダート結合、ホホロチオアート結合、チオエステル結合、またはペプチド結合(ペプチド核酸)が含まれる。また、用語の「オリゴヌクレオチド」は、本明細書では、基本的に「ポリヌクレオチド」の同義語として使用されるが、当業者は、オリゴヌクレオチド、例えば、PCRプライマー、は通常、約50から100ヌクレオチドの長さ未満であることを認識している。
ポリヌクレオチドには、例えば、ポリヌクレオチドの大量分化を可能とする大量改変ヌクレオチド;ポリヌクレオチドの検出を可能とする検出可能標識、例えば、蛍光、放射性、ルミネセンスもしくは化学発光標識を含むヌクレオチド;またはポリヌクレオチドの固体支持体への固定化を促進する反応性基、例えば、ビオチンもしくはチオール基を含むヌクレオチドを含むヌクレオチド類似体が含まれうる。また、ポリヌクレオチドには、選択的に開裂する、例えば、科学的に、酵素的に、または光分解的に開裂する1つまたは複数のバックボーン結合が含まれる。例えば、ポリヌクレオチドは、1つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド、続いて、1つまたは複数のリボヌクレオチド、さらにこれに続く、1つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド、を含むことが可能で、このような配列はリボヌクレオチド配列の位置で塩基加水分解により切断可能である。また、ポリヌクレオチドは、例えば、キメラオリゴヌクレオチドプライマー等の、相対的に開裂に対し耐性のある1つまたは複数の結合を含んでもよく、これはペプチド核酸結合により連結されたヌクレオチドおよび3’末端位置の少なくとも1つのヌクレオチドを含むことが可能で、リン酸ジエステル結合または他の適切な結合により結合されており、ポリメラーゼにより延長できる。ペプチド核酸配列は、よく知られた方法を使って調製可能である(例えば、Weiler et al.Nucleic acids Res.25:2792−2799(1997)、参照)。
本明細書で使われる2つのタンパク質または核酸の間の「類似性」は、タンパク質のアミノ酸配列または核酸のヌクレオチド配列の間の関連性を指す。類似性は、残基の配列およびその中に含まれる残基の同一性および/または相同性の程度に基づいて考えることができる。タンパク質または核酸の間の類似性の程度を評価する方法は、当業者には既知である。例えば、配列類似性を評価する方法の1つの方法では、2つのアミノ酸またはヌクレオチド配列が、配列間で最大レベルの同一性が得られるように整列される。「同一性」は、アミノ酸またはヌクレオチド配列が不変である程度を指す。アミノ酸配列の整列化では(ヌクレオチド配列ではある程度)、アミノ酸(またはヌクレオチド)における保存の差異および/または高頻度置換を考慮に入れることもできる。保存の差異は、関連残基の物理化学的特性の保存の差異である。整列化は全体的(配列の全長にわたる、全残基を含む比較配列の整列化)であっても、局部的(最も類似性の高い領域または複数領域のみを含む配列の一部の整列化)であってもよい。
「同一性」それ自体は、当該分野で承認されている意味を有し、報告された技術を使って計算可能である(例えば、コンピュータによる分子生物学、Lesk、A.M.、ed.、Oxford University Press、New York、1988;Biocomputing:Informatics and Genome Projects、Smith、D.W.、ed.、Academic Press、New York、1993;配列データのコンピュータ分析、パートI、Griffin、A.M.、andGriffin、H.G.、eds.、Humana Press、New Jersey、1994;分子生物学における配列解析、von Heinje、G.、Academic Press、1987;および、配列解析プライマー、Gribskov、M.and Devereux、J.、eds.、M Stockton Press、New York、1991、を参照)。2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の同一性を測定する多くの方法が存在するが、用語の「同一性」は、当業者にはよく知られている(Carillo、H.& Lipton、D.、SIAM J Applied Math 48:1073(1988))。
本明細書で使われる相同(核酸および/またはアミノ酸配列に関して)は、約25%より大きいか、または等しい配列相同性、典型的には、25%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%または95%より大きいか、または等しい配列相同性を意味する。必要に応じ、正確なパーセンテージを特定できる。本明細書の目的のためには、用語の「相同性」および「同一性」は、特に別に指示がなければ、同義に使用されることが多い。一般的には、パーセンテージ相同性または同一性の測定のために、最高順位のマッチが得られるように配列を整列させる(例えば、コンピュータによる分子生物学、Lesk、A.M.、ed.、Oxford University Press、New York、1988;Biocomputing:Informatics and Genome Projects、Smith、D.W.、ed.、Academic Press、New York、1993;配列データのコンピュータ分析、パートI、Griffin、A.M.、and Griffin、H.G.、eds.、Humana Press、New Jersey、1994;分子生物学における配列解析、vonHeinje、G.、Academic Press、1987;および配列解析プライマー、Gribskov、M.and Devereux、J.、eds.、M Stockton Press、New York、1991;Carillo et al.(1988)SIAM J Applied Math4 8:1073、参照)。配列相同性により、保存的アミノ酸の数が標準的整列化アルゴリズムプログラムにより求められ、このプログラムは、それぞれのサプライヤーにより確立された規定値のギャップペナルティを用いて使用可能である。大体の場合、相同核酸分子を対象核酸の全長に沿って、通常、中等度の厳密性または高い厳密性でハイブリダイズする。また、ハイブリダイズする核酸分子中のコドンの代わりに縮重コドンを含む核酸分子も意図されている。
いずれかの2つの分子が、少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の「同一性」または「相同」のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有するかどうかは、既知のコンピュータアルゴリズム、例えば、「FASTA」プログラム、により、例えば、Pearson et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444、の記載にあるように、規定値のパラメータを用いて決定可能である(他のプログラムには、GCGプログラムパッケージ(Devereux、J.、et al.、Nucleic AcidsResearch 12(I):387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul、S.F.、et al.、J Molec Biol 215:403(1990));巨大コンピュータへのガイド、Martin J.Bishop、ed.、Academic Press、San Diego、1994、およびCarillo et al.(1988)SIAM J Applied Math 48:1073、が含まれる)。例えば、全米バイオテクノロジー情報センター・データベースのBLAST関数は、同一性の測定に使用可能である。他の市販または公的に入手可能なプログラムには、DNAStar「MegAlign」プログラム(Madison、WI)およびUniversity of Wisconsin Genetics Computer Group(UWG)「Gap」プログラム(Madison WI)が含まれる。タンパク質および/または核酸分子のパーセント相同性または同一性は、例えば、GAPコンピュータプログラムを使って配列情報を比較することにより測定できる(例えば、Needleman et al.(1970)J.Mol.Biol.48:443、Smith and Watermanによる改訂版((1981)Adv.Appl.Math.2:482、参照)。簡単に述べると、GAPプログラムは、類似の整列化記号(すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸)の数として類似性を求め、2つの配列の短い方の全記号数で除算する。ギャッププログラム用の規定値のパラメータには、次の項目が含まれる:(1)SchwartzとDayhoff(Schwartz and Dayhoff、eds.、ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE、National Biomedical Research Foundation、pp.353‑358(1979))により記載されているように、単項比較マトリックス(同一性に対し1の値、非同一性に対し0の値を持たせる)およびGribskovの加重比較マトリックス(Gribskov et al.(1986)Nucl.Acids Res.14:6745);(2)各ギャップに対し3.0のペナルティ、および、それぞれのギャップ中の各記号に対し0.10の追加のペナルティ;さらに(3)末端ギャップに対してはペナルティ無し。
従って、本明細書で使用される用語の「同一性」または「相同性」は、試験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの間での比較を意味する。本明細書で使われる用語の少なくとも「に対し90%の同一性」は、参照核酸またはポリペプチドのアミノ酸配列に比べて90〜99.99パーセントの同一性を指す。90%以上のレベルの同一性は、例として、100アミノ酸長さの試験および参照ポリペプチドが比較されることを仮定した場合、試験ポリペプチド中のアミノ酸の内の、わずかに10%(すなわち、100の内の10)が、参照ポリペプチドの配列とは異なるという事実を示している。試験および参照ポリヌクレオチドの間で、類似の比較が可能である。このような差異は、ポリペプチド全長にわたりランダムに分布した点変異として表すことができ、または、それらは1つまたは複数の可変長さの部位中で、最大許容可能差異、例えば、10/100アミノ酸差異(約90%同一性)まで、クラスター形成されうる。差異は、核酸またはアミノ酸置換、挿入または欠失として定義される。約85〜90%を超える相同性または同一性のレベルで、結果は、プログラムおよびギャップパラメータセットとは無関係であるべきである;このような高いレベルの同一性は、ソフトウェアに頼ることなく、マニュアル配列比較により、容易に評価可能なことも多い。
本明細書で使われる整列化配列は、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列中で対応する位置を整列させるために、相同性(類似性および/または同一性)を使用することを指す。通常、50%以上同一性により関連付けられている2つ以上の配列が整列化させられる。整列化配列セットは、対応する位置で整列し、RNA、例えば、ゲノムDNA配列と整列させたESTおよび他のcDNA由来の整列化配列を含むことができる2つ以上の配列を指す。
本明細書で使われる「プライマー」は、適切な条件下(例えば4つの異なるヌクレオシド三リン酸塩および重合試薬、例えば、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼまたは逆転写酵素の存在下)、適切な緩衝液中の適切な温度で、テンプレート誘導DNA合成の開始点として作用可能な核酸分子を指す。特定の核酸分子が、「プローブ」および「プライマー」として役立つことは好ましいでことあろう。しかし、プライマーは、延長用の3’ヒドロキシル基を有する。プライマーは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写酵素(RT)−PCR、RNA PCR、LCR、マルチプレックスPCR、パンハンドルPCR、キャプチャーPCR、発現PCR、3’および5’RACE、インサイチューPCR、連結反応仲介PCRおよび他の増幅プロトコルを含む種々の方法で使用可能である。
本明細書で使われる「プライマー対」は、増幅(例えば、PCRにより)される配列の5’末端とハイブリダイズする5’(上流)プライマーおよび増幅される配列の3’末端の相補配列とハイブリダイズする3’(下流)プライマーを含む一連のプライマーを指す。
本明細書で使われる「特異的にハイブリダイズする」は、相補的な塩基対形成による、標的核酸分子に対する核酸分子(例えば、オリゴヌクレオチド)のアニーリングを指す。当業者なら、特異的ハイブリダイゼーションを起こさせるインビトロおよびインビボパラメータ、例えば、特定の分子の長さおよび組成をよく知っている。特に、インビトロハイブリダイゼーションに関するパラメータには、アニーリングおよび洗浄温度、緩衝液組成ならびに塩濃度が、さらに含まれる。非特異的に結合した核酸分子を高い厳密性で除く代表的洗浄条件は、0.1xSSPE、0.1%SDS、65℃であり、中程度の厳密性の場合は、0.2xSSPE、0.1%SDS、50℃である。等価な厳密性条件は、当技術分野で既知である。当業者なら、これらのパラメータを容易に調節し、特定の用途に適した、標的核酸分子に対する核酸分子の特異的ハイブリダイゼーションを成し遂げることができる。
本明細書で使われる、実質的に生成物に対し同じ、は充分に類似しており、対象特性が充分に未変化で、そのため、実質的に同じ生成物が、その生成物の代わりに使用できることを意味する。
本明細書で使われるように、用語「実質的に同じ」または「類似の」は、関連分野の専門家により理解されるように、文脈により変化することもまた、理解されよう。
本明細書で使われる、対立遺伝子変異体または対立遺伝子変異は、同じ染色体座位を占める2つ以上の代替形の遺伝子のいずれかを指す。対立遺伝子変異は、変異により自然に発生し、集団内の表現型多型を生じうる。遺伝子変異は、サイレント(コード化ポリペプチド中の無変化)であっても、変異アミノ酸配列を有するコード化ポリペプチドであってもよい。用語の「対立遺伝子変異体」は、また、本明細書で遺伝子対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を示すためにも使用される。通常、参照型の遺伝子は、種の集団または単一参照メンバー由来の野生型および/または優勢型のポリペプチドをコードする。通常、種の間、または種内の変異体を含む対立遺伝子変異体は、典型的には、同じ種由来の野生型および/または優勢型と少なくとも80%、90%またはそれを超えるアミノ酸同一性を有するが、同一性の程度は、遺伝子、および比較が種内または種間であるかどうかに依存する。通常、種間対立遺伝子変異体は、96%、97%、98%、99%またはそれ以上のポリペプチドの野生型および/または優勢型との同一性を含む、少なくとも約80%、85%、90%または95%またはそれ以上のポリペプチドの野生型および/または優勢型との同一性を有する。本明細書の対立遺伝子変異体への参照は、通常、同じ種のメンバー中のタンパク質の変異を指す。
本明細書で使われるように、本明細書中で「対立遺伝子変異体」と同義に使われる「対立遺伝子」は、遺伝子またはその一部の代替形を指す。対立遺伝子は、相同染色体上の同じ座位または位置を占める。対象が2つの同じ遺伝子の対立遺伝子を有する場合、対象は、その遺伝子または対立遺伝子に対しホモ接合であると呼ばれる。対象が異なる遺伝子の対立遺伝子を有する場合対象は、その遺伝子に対しヘテロ接合であると呼ばれる。特異的遺伝子の対立遺伝子は、単一ヌクレオチドまたはいくつかのヌクレオチド中で相互に異なっていてもよく、ヌクレオチドの置換、欠失および挿入を含むことができる。遺伝子の対立遺伝子は、また、変異を含む遺伝子の形であってもよい。
本明細書で使われる種変異体は、例えば、マウスとヒト、等の異なる哺乳類種を含む、異なる種の中でのポリペプチドの変異体を指す。
本明細書で使われるスプライス変異体は、1つまたは複数のタイプのmRNAを生ずるゲノムDNAの1次転写物のディファレンシャルプロセッシングにより産生された変異体を指す。
本明細書で使われる用語のプロモーターは、RNAポリメラーゼの結合および転写の開始を提供するDNA配列を含む遺伝子の一部を意味する。プロモーター配列は、いつもではないが、通常は、遺伝子の5’非コード領域に存在する。
本明細書で使われる、単離もしくは精製ポリペプチドまたはタンパク質もしくは生物学的に活性なその一部は、細胞性材料または他のそのタンパク質が得られた細胞もしくは組織由来の混入タンパク質が実質的に無い、または化学前駆物質もしくは他の科学的に合成された場合の化学物質が実質的に無いことを意味する。このような純度を評価するのに当業者により使われる標準的な分析方法、例えば、薄層クロマトグラフィー(TLC)、ゲル電気泳動法および高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により測定して、容易に検出可能な不純物がない様に見える場合に、または、それ以上の精製によって物質の物理的および化学的特性、例えば、酵素的および生物活性の変化が検出できない程度に充分純粋な場合に、調製物は実質的に何も含まないと判定できる。実質的に、化学的に純粋な化合物を製造する化合物の精製方法は、当業者には既知である。しかし、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体の混合物であってもよい。このような場合には、さらなる精製を行えば、化合物の特異的活性が高まることになろう。
用語の細胞性物質が実質的に無い、は、タンパク質が、それが単離された、または組換えで産生された細胞の細胞性成分から分離されているタンパク質の調製を含む。一実施形態では、用語の細胞性物質が実質的に無い、には、約30%(乾燥重量で)未満の非プロテアーゼタンパク質(本明細書では、混入タンパク質とも呼ばれている)、通常、約20%未満の非プロテアーゼタンパク質または10%の非プロテアーゼタンパク質または約5%未満の非プロテアーゼタンパク質、を有するプロテアーゼタンパク質の調製が含まれる。プロテアーゼタンパク質または活性なその一部が組換えにより産生される場合、また、それは、実質的に培地が無く、すなわち、培地はプロテアーゼタンパク質調製物の容量の約またはちょうど20%、10%もしくは5%未満である。
本明細書で使われる用語の化学前駆物質または他の化学物質が実質的に無い、は、タンパク質が、タンパク質の合成に関与する化学前駆物質または他の化学物質から分離されているプロテアーゼタンパク質の調製物を含む。この用語は、約30%(乾燥重量で)20%、10%、5%またはそれより少ない値未満の化学前駆物質または非プロテアーゼ化学物質または成分を有するプロテアーゼタンパク質調製物を含む。
本明細書で使われる、例えば、合成核酸分子または合成遺伝子、または合成ペプチド、に関連する「合成」は、組換え法および/または化学合成法により産生される核酸分子またはポリペプチド分子を指す。
本明細書で使われる、組換えDNA法を使った組換え型による産生法、は、クローンDNAによりコードされたタンパク質を発現するためのよく知られた分子生物学の方法の使用を意味する。
本明細書で使われるベクター(またはプラスミド)は、発現またはその複製を目的として、異種の核酸を細胞中に導入するために使われる個別要素を指す。ベクターは、通常、エピソームとして残るが、遺伝子またはその一部をゲノムの染色体へ統合させるように設計可能である。また、人工染色体、例えば、酵母人工染色体および哺乳類人工染色体であるベクターも意図されている。このようなビークルの選択と使用は当業者にはよく知られている。
明細書で使われる発現ベクターには、調節配列、例えば、プロモーター領域、と作動可能なように連結されたDNAを発現することができるベクターを含み、この調節配列は、このようなDNA断片を発現させることが可能である。このような追加のセグメントは、プロモーターおよびターミネーター配列を含むことができ、また任意選択で、1つまたは複数の複製起点、1つまたは複数の選択可能マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、等を含むことができる。発現ベクターは、通常、プラスミドまたはウイルスDNA由来であり、両方の要素を含んでもよい。従って、発現ベクターは、適切な宿主細胞中への導入に際し、クローンDNAの発現がもたらされる組換えDNAまたはRNA構築物、例えば、プラスミド、ファージ、組換え型ウイルスまたは他のベクターを指す。適切な発現ベクターは、当業者にはよく知られており、真核細胞および/または原核細胞中で複製可能な、エピソームとして残るか、または宿主細胞ゲノム中へ統合されるベクターが含まれる。
本明細書で使われるベクターには、また、「ウイルスベクター」または「ウイルス性ベクター」が含まれる。ウイルス性ベクターは外因性の遺伝子を細胞内へ運ぶ(ビークルまたはシャトルとして)ために、作動可能なように外因性の遺伝子に連結された、操作されたウイルスである。
DNAセグメントを参照する場合に本明細書で使われる、作動可能に連結された(operably or operatively linked)は、意図された目的に呼応して機能する、例えば、プロモーター中で転写を開始し、コードセグメントを通してターミネーターまで進める、ようにそのセグメントが配置される、ことを意味する。
本明細書で使われる生物試料は、生きている、またはウイルス性ソースから入手したいずれかの試料を指し、核酸またはタンパク質または他の高分子が得られる任意の対象の細胞型または組織を含む。生物試料には、これに限定されないが、体液、例えば、血液、血漿、血清、脳脊髄液、関節液、尿および汗;動物および植物由来の組織および器官試料が含まれる。また、土壌および水試料ならびに他の環境的試料、ウイルス、細菌、真菌、藻類、原虫類およびその成分、が含まれる。従って、食品および環境の細菌性およびウイルス性およびその他の汚染が評価可能である。本明細書の方法は、生物試料を使って実行され、一部の実施形態では、例えば、プロファイリングを目的としても、任意の試料の試験に使用可能である。
本明細書で使われる高分子は、数百〜数百万の分子量の任意の分子を指す。高分子には、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、核酸、および通常は、生物学的有機体により合成されるが、合成により、または組換え型分子生物的方法を使って調製することができる他の分子、が含まれる。
本明細書で使われる組成物は、任意の混合物を指す。それは、溶液、懸濁液、液体、粉体、ペースト、水性、非水性またはこれらのいずれかの組み合わせ、であってよい。
本明細書で使われる、組み合わせ、は、2つ以上の要素の間、またはその内の任意の結びつきを指す。組み合わせは、2つ以上の離れた要素、例えば、2つの組成物または2つの収集であってもよく、それらの混合物、例えば、2つ以上の要素の単一混合物、またはそれらの任意の変形、であってもよい。
本明細書で使われる、キットは、パッケージ化された組み合わせを指し、任意選択で、インストラクションおよび/または使用する試薬を含む。
本明細書で使われる薬効または治療効果は、疾患または障害の治療またはその症状の改善を意図した試薬の投与に際し、観察される効果を指す。
本明細書で使われる「疾患または障害」は、感染、後天性条件、遺伝的条件(これらに限定されない)を含む原因または条件により生じた生物体の病理学的状態および特定可能な症状を特徴とする状態を指す。本明細書の対象の疾患および障害は、標的タンパク質が病因学または病理学における役割を果たすものを含む特異的標的タンパク質を伴うものである。代表的標的タンパク質および関連疾患と障害は、本明細書の他の場所に記載されている。
本明細書で使われる血管新生疾患(または血管新生関連疾患)は、血管新生のバランスが変えられているか、またはそのタイミングが変えられている疾患である。血管新生疾患には、血管新生の変化、例えば、望ましくない血管新生、が発生している疾患が含まれる。このような疾患には、これに限定されないが、癌を含む細胞増殖性疾患、糖尿病性網膜症および他の糖尿病合併症、炎症性疾患、子宮内膜症、加齢黄斑変性および他の当技術分野で既知の、または本明細書の別のところで述べられている疾患を含む過剰血管新生が疾患プロセスの一部である疾患が含まれる。
本明細書で使われる、何らかの疾患または状態の患者の「治療」は、患者の症状が、部分的にもしくは全く軽減された、または治療後変化しないままであることを意味する。従って、治療は予防、治療および/または治癒を包含する。予防は、潜在的な疾患および/または疾患の症状の悪化または進行の予防を指す。また、治療は、改変インターフェロンおよび本明細書で提供される組成物のいずれかの医薬品の使用を包含する。
本明細書で使われる治療薬、治療法、放射線防護剤、または化学療法剤は、当業者には既知の、ワクチン剤を含む通常の薬剤および薬物療法、を意味する。放射線療法剤は当技術分野でよく知られている。
本明細書で使われる治療は、状態、障害もしくは疾患または他の徴候の症状が、回復するか、またはそうでなければ有益な方向に変化するいずれかの方法を意味する。
本明細書で使われる治療効果は、患者の治療から得られた効果を意味する。この効果は、疾患もしくは状態の症状を、変える、通常は、改善するか、または回復する、または状態を治癒する。治療有効量は、患者に対する投与後、治療効果を生ずる組成物、分子または化合物の量を指す。
本明細書で使われる用語「患者」は、人類等の哺乳動物を含む動物を指す。
本明細書で使われる患者は、ヒトの患者を指す。
本明細書で使われる、治療、例えば、医薬組成物または他の治療薬の投与、による特定の疾患または障害の症状の改善は、永久的であれ一時的であれ、継続的であれ一過性であれ、組成物または治療薬の投与に起因するか、または関連する症状の低減を指す。
本明細書で使われる、予防または予防法は、疾患または状態を進展させるリスクを減少させる方法を指す。
本明細書で使われる、有効量は、疾患または障害の症状の予防、治療、改善、抑止または部分的抑止に必要な治療薬の量である。
本明細書で使われる、投与は、抗体またはその一部を、その標的タンパク質と接触させるいずれかの方法を指す。投与は、インビボまたはエクスビボまたはインビトロで行うことができる。例えば、エクスビボ投与に対しては、体液、例えば、血液、が患者から取り出し、体外で抗体またはその一部と接触させる。インビボ投与に対しては、抗体またはその一部が体内に、例えば、局部的、局所的、全身性および/または他の導入経路により体内に導入可能である。インビトロ投与は、細胞培養法、等の方法を包含する。
本明細書で使われる、単位投与剤形は、ヒトおよび動物に適切な物理的に離散性の単位を指し、当技術分野で既知のように、個別にパッケージされている。
本明細書で使われる、単回投与製剤は、直接投与用の製剤を指す。
本明細書で使われる「製品」は、作られて販売される生成物である。本出願全体を通して使われる用語は、パッケージング製品に含まれる、まとめられた生殖系列抗体またはそれから得られた抗体を包含することが意図されている。
本明細書で使われる、流体は、流れることができる任意の組成物を指す。従って、流体は、半固体、ペースト、溶液、水性の混合物、ゲル、ローション、クリームの形の組成物およびその他のこのような組成物を含む。
本明細書で使われる動物には、任意の動物、例えば、これに限定されないが、ヒト、ゴリラおよびサルを含む霊長類;げっ歯類、例えば、マウスおよびラット;家禽、例えば、ニワトリ;反芻動物、例えば、ヤギ、雄ウシ、シカ、ヒツジ;哺乳動物、例えば、ブタおよび他の動物、が含まれる。非ヒト動物では、ヒトが意図された動物として除外される。本明細書で提供される生殖系列セグメントおよび得られた抗体は、動物、植物、原核生物および真菌、のいずれかのソース由来である。大抵の生殖系列セグメントおよび得られた抗体は、哺乳類由来を含む動物由来である。
本明細書で使われる対照は、試験パラメータで処理されていないことを除き、または、それが血漿試料の場合は、それは対象の疾患に罹患していない正常なボランティア由来でありうることを除き、実質的に試験試料と同等な試料を指す。また、対照は、内部対照であってもよい。
本明細書で使われる単数形「a」、「an」および「the」は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、複数の参照物を含む。従って、例えば、「細胞外のドメイン(an extracellular domain)」を含む化合物への参照は、1つまたは複数の細胞外のドメインを含む化合物を包含する。
本明細書で使われる範囲と量は、「約」特定の値または範囲として表現している。また、約は、正確な量を含む。従って、「about 5 bases」は、「約5塩基(about 5 bases)」および「5塩基(5 bases)」も意味する。
本明細書で使われる「任意選択の(optional)」または「任意選択で(optionally)」は、それに続いて記載されたイベントまたは状況が発生しているか、または発生していないこと、および、その記載は、前記イベントまたは状況が発生する場合、およびそれが発生しない場合を含むことを意味する。例えば、「任意選択で置換される基」では、基は未置換であるか、または置換されていることを意味する。
本明細書で使われる任意の保護基、アミノ酸および他の化合物に対する省略は、別に定めが無ければ、それらの通常の使用法、認められている省略、またはIUPAC−IUB生化学命名法に関する委員会((1972)Biochem.11:1726、参照)に従う。
B.方法の概要
本明細書で、所望の親和性および活性を持つ抗体の選択方法が提供される。この方法には、親和性成熟および抗体変換法が含まれる。この方法は、抗体を操作するために使用し、それにより、アンタゴニスト抗体、部分アンタゴニスト抗体、アゴニスト抗体および/または活性化因子/モジュラー抗体としての抗体を特定または選択することができる。特定の経路を「調節する」能力は、完全にそれを阻害するのとは対照的に、タンパク質治療薬としての利点となると思われる。例えば、薬理学的に、高親和性相互作用による経路を「オン」または「オフ」する能力は、「可変抵抗器」ベースの治療薬による経路の調節よりも、望ましくないであろう。他の例では、高親和性を有する抗体は望ましい。
本方法の実施により生成した親和性に基づくまたは活性に基づく抗体は、1つまたは複数の標的タンパク質に対する特異性を理由に、例えば、種々のインビトロおよびインビボでの適用を含む所望のいずれかの用途または目的のために使用可能である。その多様性、特異性およびエフェクター機能のために、抗体は、タンパク質ベース治療薬に対する魅力的な候補である。従って、本明細書で提供される、所望の親和性、特異性および/または活性を有する抗体を生成する方法は、それらの治療抗体としての使用を可能にする。例えば、抗体は、抗体が調節可能な特定の標的タンパク質の発現または活性化に関連する疾患または障害の治療のための治療方法およびその他の用途に使うことができる。
1.抗体ポリペプチド
本明細書で提供される方法では、変異誘発は、通常、抗体の可変領域上で行われる。従って、本明細書で提供される方法を使って、親和性変換または親和性成熟用に選択された親抗体は、抗体が充分な抗体結合部位を含む限りにおいて、通常は最小限度で、全てのまたは一部の可変重鎖(VH)および/または可変軽鎖(VL)鎖を含む。しかし、本方法の実施により使用される、または得られるいずれかの抗体は、全てのまたは一部の定常重鎖(例えば、1つまたは複数のCHドメイン、例えば、CH1、CH2、CH3およびCH4および/または定常軽鎖(CL))を含むように作製可能であることは、理解されよう。従って、本明細書の親和性変換または親和性成熟に供された抗体は、完全長抗体を含み、また、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、単鎖Fv(scFv)、Fv、dsFv、ダイアボディ、FdおよびFd’断片、Fab断片、scFv断片、ならびにscFab断片を含む断片またはその一部を含む。例えば、本明細書の親和性変換抗体または親和性成熟抗体は、Fabを含む。
当業者なら抗体の構造、配列および機能を理解できる。抗体の構造、配列および機能の一般的説明を以下に提供する。
a.抗体構造および機能
抗体は、膜結合型かつ分泌型としてB細胞により天然に産生される。また、天然に産生される抗体に加えて、抗体には、合成的に、すなわち、組換えで産生された抗体、例えば、抗体断片、も含まれる。抗体は、抗原エピトープを特異的に認識し、同族相互作用により結合する。同族の抗原に対する抗体結合により複数のエフェクター機能を開始でき、これにより、毒素、病原体および他の感染性病原体の中和とクリアランスが起こる。抗体特異性の多様性は、B細胞成長の間の組換えイベントにより自然に生ずる。これらのイベントにより、抗体分子の可変領域をコードする複数の抗体V、DおよびJ遺伝子セグメントの様々な組み合わせが定常領域遺伝子と結合され、多数の多様な抗体を有する天然の抗体レパートリーを生成する。ヒト抗体レパートリーは、1010を超える異なる抗原特異性を含み、従って、理論的には、どのような外部抗原も特異的に認識可能である。
完全長抗体は、4つのポリペプチド鎖、2つの等価な重(H)鎖(通常、それぞれ、約440アミノ酸を含む)および2つの等価な軽(L)鎖(それぞれ、約220アミノ酸を含む)を含む。軽鎖は、カッパ(κ)およびラムダ(λ)と呼ばれる2つの異なる形で存在する。各鎖は、可変(V)および定常(C)領域ドメイを含む免疫グロブリン(Ig)ドメインとして組織化された一連のドメインにまとめられる。軽鎖は、C領域(CL)および可変領域(VL)に対応する2つのドメインを有する。重鎖は、4つのドメインの可変領域(VH)およびC領域中に3つまたは4つのドメイン(CH1、CH2、CH3およびCH4)、および一部のケースではヒンジ部を有する。4つの鎖(2つの重鎖と2つの軽鎖)は、共有結合(ジスルフィド)および非共有結合により一緒に保持されている。
抗体には、完全長抗体、およびその断片、すなわちFab、Fab’、F(ab’)2、単鎖Fv(scFv)、Fv、dsFv、ダイアボディ、FdおよびFd’断片、が含まれる。断片には、単鎖型および二量体型のものが含まれる。VHおよびVLドメインのみを含むFv断片は、全抗原結合部位を持つ最小の免疫グロブリン断片である(例えば、「分子生物学における方法」、Vol 207:「癌治療法およびプロトコルのための組換え型抗体(2003)」;1章;p3−25、Kipriyanov、参照)。Fvの安定化は、VHおよびVL鎖の直接結合、例えば、ペプチド結合(単鎖Fv(scFv)を生成するための)、ジスルフィド架橋またはknob−into−hole変異により成し遂げられている。対照的に、Fab断片は、可変鎖を一緒に保持しているCH1およびCLドメインの存在により安定である。VHドメインのみを含むFd抗体は、完全な抗原結合部位が欠けており、また不溶性でありうる。
折り畳み抗体ポリペプチドでは、結合特異性は、抗原結合部位ドメインにより付与され、これは、一部の重鎖および/または軽鎖可変領域ドメインを含む。抗体分子上の他のドメインは、イベント、例えば、他の細胞、ポリペプチドおよび生体分子とのシグナル伝達および相互作用、に寄与することにより、エフェクター機能の役割を果たす。これらのエフェクター機能は、抗体により認識される感染性病原体の中和および/またはクリアランスを引き起こす。
b.抗体配列および特異性
重鎖および軽鎖の可変領域は、非コード領域またはイントロンで分離された複数の生殖系列遺伝子セグメントによりコードされており、異なる染色体上に存在することが多い。B細胞分化の間に、生殖系列DNAは、再構成され、それにより、重鎖座位の1つのDHおよび1つのJH遺伝子セグメントが組み換えられ、続いて、VH遺伝子セグメントの結合によりVH鎖をコードする再構成VDJ遺伝子が形成される。再構成は、対立遺伝子排除のプロセスにより、単一重鎖対立遺伝子上でのみ起こる。対立遺伝子排除は、インフレームまたはVDJセグメントの「増殖性」組換えにより調節されており、これは、VDJ組換え可変重鎖の約1/3で発生する。このような増殖性組換えイベントが細胞中で最初に起こる場合には、これにより、プレB細胞の表面上に発現したμ重鎖が産生され、さらなる重鎖組換えの停止シグナルを送り、それにより対立遺伝子重鎖座位の発現を防止する。表面に発現したμ重鎖は、また、再構成のためのカッパ(κ)座位を活性化する作用も行う。κ組換えが両座位で非生産的である場合、ラムダ(λ)座位は、再構成のための活性化のみが行われる。軽鎖再構成イベントは、VLおよびJLセグメントのみ組み換えられることを除いて、重鎖に類似である。それぞれの1次転写の前に、対応する定常鎖遺伝子が追加される。その後の転写およびRNAスプライシングによりmRNAが得られ、インタクト軽鎖または重鎖に翻訳される。
抗体の可変領域は、抗原結合およびそれぞれの生殖系列V、DおよびJセグメントの組換えイベントによる特異性を付与し、それにより得られた可変領域ドメインをコードする組換え核酸配列は抗体の中で異なり、特定の抗体に抗原特異性を付与する。しかし、変化は、(H)鎖および(L)鎖可変領域のN末端ドメイン内に存在する3つの相補性決定領域(CDR1、CDR2、およびCDR3)に限られる。CDRは、より保存的な、「フレームワーク領域」(FR)と呼ばれる領域と共に散在する。フレームワーク領域およびCDRの範囲は、正確に定義されている(例えば、Kabat、E.A.et al.(1991)免疫学的関連タンパク質の配列、第5版、米国保健福祉省、NIH Publication No.91−3242、およびChothia、C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901−917、参照)。各VHおよびVLは、通常、アミノ末端からカルボキシ末端へ、次の順に配列された3つのCDRおよび4つのFRから構成される:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4。VLおよびVHドメイン内の配列変異性は、通常、CDRに限定され、これは、抗原結合部位を形成する領域である。例えば、重鎖に関して、通常は、VH遺伝子は、N末端の3つのフレームワーク領域、最初の2つの全CDRおよび3つめのCRDの最初の部分をコードする;DH遺伝子は、3つめのCDRの中央部をコードし、JH遺伝子は、3つめのCDRの最後の部分および4つめのフレームワーク領域をコードする。軽鎖に関しては、VL遺伝子は、最初のCDRおよび2つめのCDRをコードする。3つめのCDR(CDRL3)は、VLおよびJL遺伝子セグメントの結合により形成される。従って、CDR1および2は、生殖系列V遺伝子セグメント配列により独占的にコードされる。VHおよびVL鎖CDR3は、抗原結合部位の中心部を形成し、一方、CDR1および2は、境界の外側を形成する;FRは、HおよびLのCDRの方向を定めることにより足場を支える。概して、抗原結合部位は、通常、少なくとも4つのCDRが抗原のエピトープと接触し、重鎖および軽鎖両方のCDR3が最も可変であり、抗原結合に対する最多数の特異性に寄与することが必要である(例えば、Janis Kuby、免疫学、第3版、New York、W.H.Freeman and Company、1998、pp.115−118、参照)。D遺伝子セグメントの全てを含むCDRH3は、Ab結合部位の最も多様な成分であり、典型的には、Abの特異性を決定する上で重要な役割を果たす。配列変動に加えて、重鎖および軽鎖の間のCDRの長さの変動がある。
他方、定常領域は、抗体中でより保存的な配列によりコードされる。これらのドメインは、機能的特性、例えば、感染性病原体のクリアランスを起こすために免疫系および血清タンパク質の細胞と相互作用する能力、を抗体に付与する。異なるクラスの抗体、例えば、IgM、IgD、IgG、IgEおよびIgA、は異なる定常領域を有し、異なるエフェクター機能を提供させる。
これらのV、D、およびJの天然の組換えイベントは、高親和性および特異性の両方を有する、ほぼ2x107の異なる抗体を提供できる。追加の多様性は、連結セグメント中へのヌクレオチド挿入および欠失により、また、可変領域の体細胞超変異によっても導入される。結果は、個体中に異なる抗原特異性を有する約1010抗体が存在するということになる。
2.抗体を特定する方法
標的タンパク質または抗原に対する結合特異性および/または活性を有する抗体を、当業者に既知の任意の方法により特定可能である。例えば、抗体は、標的抗原に対して従来の免疫化方法により産生され、抗体を分泌するハイブリドーマ細胞が生成しうる(例えば、Kohler et al.(1975) Nature、256:495;Goding、「モノクローナル抗体:原理と実践」、pp.59−103(Macademic Press、1986)、Kozbor、J.Immunol.、(1984)133:3001;Brodeur et al.、「モノクローナル抗体産生技術と応用」、pp.51−63(Marcel Dekker、Inc.、New York、1987、を参照)。別の方法では、標的抗原に特異的な抗体は、抗体ライブラリーの所望の結合および活性による選別により特定される。抗体ライブラリーは、「ワンポット」ライブラリーとして提供可能であり、これには、抗体メンバーの多様な集団が、例えば、ディスプレイライブラリー、例えば、ファージディスプレイライブラリーとして含まれる。このようなライブラリーでは、ライブラリーの各メンバーの特定は、所望の結合活性を有する陽性クローンのシーケンシングの前には、通常は、未知である。
他の例では、抗体ライブラリーは、米国特許仮出願第61/198、764号および同61/211、204号、および国際公開第2010054007号(参照によって本明細書に組み込まれる)、に記載のアドレス指定可能なコンビナトリアル抗体ライブラリーを含む。アドレス指定できるライブラリーでは、各VH鎖および/またはVL鎖をコードする核酸分子は、それぞれ、アドレス指定できるフォーマットで標準的DNA合成技術を使って合成され、それにより、各座位の各VH鎖および/またはVL鎖の核酸配列の同一性を知ることができる。VH鎖およびVL鎖は、次に、同様にアドレス指定できるフォーマットで対形成され、ライブラリー各メンバーの同一性を、その座位または「アドレス」に基づいて知ることができる。アドレス指定できるコンビナトリアル抗体ライブラリーは、標的タンパク質に対する結合または活性で選別され、標的タンパク質に結合する、および/または標的タンパク質の活性を調節する抗体またはその一部を特定できる。これらのライブラリーが配列しているという事実のおかげで、選別の間に、収集内のそれぞれのメンバーの同一性を知ることができ、それにより、「Hit」抗体の手軽な比較を可能とする。
3.既存の抗体最適化方法
通常、上記方法のいずれかで生成された、および/または、特定された抗体は、中等度の親和性(例えば、約106〜107M−1のKd−1)である。本明細書で考察のように、抗体発見およびエンジニアリングの既存の方法は、高親和性アンタゴニスト抗体を要求する。従って、さらなる抗体の最適化に向け、結合親和性を最適化し、改善する親和性成熟方法が採用される。親和性成熟抗体は、一般的に、活性、例えば、抗原結合親和性、の改善を生ずる1つまたは複数のアミノ酸変化を含む抗体である。抗体の親和性成熟の既知の方法には、例えば、前に特定した抗体をテンプレートとして使い、以下の方法を使って変異をインビトロでランダムに導入して、抗体ライブラリーを生成および選別することが含まれる。エラープローンPCR(Zhou et al.、Nucleic Acids Research(1991)19(21):6052;および米国特許公開第2004/0110294号);1つまたは複数のCDRまたはFRをランダム変異導入(例えば、国際公開第96/07754号;Barbas et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.、91:3809−3813;Cumbers et al.(2002)Nat.Biotechnol.、20:1129−1134;Hawkins et al.(1992)J.Mol.Biol.、226:889−896;Jackson et al.、(1995)J.Immunol.、154:3310−3319;Wu et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.、95:6037−6042;McCall et al.(1999)Molecular Immunology、36:433−445、参照);オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発(Rosok et al.、The Journal of Immunology、(1998)160:2353−2359);コドンカセット変異導入(Kegler−Ebo et al.、Nucleic Acids Research、(1994)22(9):1593−1599);2ステップPCRおよびオーバーラップPCRを含む縮重プライマーPCR(米国特許第5、545、142、6、248、516号、および同7、189、841号;Higuchi et al.、Nucleic Acids Research(1988);16(15):7351−7367;およびDubreuil et al.、The Journal of Biological Chemistry(2005)280(26):24880−24887);未免疫ドナーから入手した天然Vドメイン変異体レパートリーを有するファージディスプレイにより選択し、Marks et al.、Biotechnology、10:779−783(1992)に記載のように数ラウンドの鎖の再シャッフルによるより高い親和性で選別した組換えVHまたはVLドメインによるドメインシャッフリング。
抗体を最適化するための利用可能なそれぞれの手法は、制約がある。第1に、これらの手法は、低親和性の抗体が、アゴニスト、部分アゴニスト/アンタゴニストまたは活性化因子/モジュレーターとして作用する候補治療薬であることを認めない。例えば、アンタゴニスト抗体を生成するために、高親和性抗体を生成することが所望の場合、ここでも既存の親和性成熟手法は制約がある。例えば、多くの利用可能な手法は、不要な変異(例えば、望ましくない位置の変異)の導入および/または特定の変異体に対する偏った導入のリスクがある。変異体の全ての可能な組み合わせを生成することができないために、ライブラリーサイズおよび完全性の制約が存在する。さらに、大量の低親和性変異体が、少ない高親和性変異体を排除しないように、競合を避けなくてはならない。さらに、CDRおよび/またはフレームワーク残基のVHおよびVLドメインシャッフリング、またはランダム変異誘発によって多くの親和性成熟抗体が産生される。これらの方法は、しかし、評価される巨大な数のクローンのために、いくつかのタイプのディスプレイ選択が必要である。非常に強い抗体−抗原相互作用を破るための溶出条件が、通常、非常に過酷で(例えば、低pH、高塩)ファージ粒子を変性させて非感染性にしてしまうために、結局のところ、非常に高親和性抗体はパニングによる単離が困難である。
本明細書で、これらの制約の一部または全部を克服する方法が提供される。
C.抗体の親和性成熟方法
本明細書で、標的抗原に対するその活性を親和性成熟される抗体の構造/活性関連性(SAR)に基づいて改善する合理的な抗体の親和性成熟方法が提供される。SARは、抗体の活性(例えば、標的抗原に対する結合)にとって重要な、抗体中の1つまたは複数の領域または特定のアミノ酸残基を特定するために使用できる。例えば、この方法では、親和性成熟する「Hit」または親抗体の構造の知識(例えば、配列)が、標的抗原に対する活性(例えば、結合)と関連付けられる。このような知識は、標的抗原に対する活性に関与する領域および/またはアミノ酸残基を明らかにするために使用することができる。領域またはアミノ酸残基は、さらなる変異誘発のために標的にされる。従って、SAR情報は、変異させるべき抗体ポリペプチドの合理的な領域の特定を提供することにより、さらなる最適化のためのガイダンスを提供する。得られた変異抗体は選別され、出発または参照抗体に比べて、最適化された抗体を特定することができる。
本明細書で提供される方法では、「Hit」または親抗体の親和性成熟は、その構造−親和性/活性−関連性に基づいている。従って、この方法は、SARに誘導されて活性を調節する領域と残基を特定する、遙かに小さなライブラリーを有する合理的な標的変異誘発手法である。
抗体のSARは、様々な手法により決定できる。例えば、標的抗原に対する所望の活性を有する抗体の配列を、同じ標的抗原に対し低下した活性を有する関連抗体と比較して、抗体間で異なるアミノ酸残基を特定することにより、SARを決定することができる。アミノ酸差異を示す抗体の領域は、抗体の活性に重要な構造であることが特定され、さらなる変異誘発の標的とされる。
特に、SARは、米国特許仮出願第61/198、764号および米国特許仮出願第61/211、204号;および国際公開第2010054007号に記載のように、空間的にアドレス指定できるコンビナトリアル抗体ライブラリーを使って素早く解明できる。空間的にアドレス指定可能なフォーマットでは、アドレス指定されたメンバーの配列は、演繹的に既知であるため、活性および結合親和性は、選別アッセイと同時に、構造(例えば、配列)と関連付けることができる。空間的にアドレス指定可能なフォーマットでは、その配列の同一性は演繹的に既知であるため、近くの非「Hit」抗体に対する「Hit」抗体の結合親和性を配列空間で比較可能である。配列比較は、「Hit」および同じアッセイでより低い活性または非活性の関連抗体の間で行うことができる。このような比較により、SARを明らかにし、抗体の活性に関与する重要な領域またはアミノ酸残基を特定することができる。例えば、このような比較は、標的への結合のために重要なCDRおよび潜在的に重要なCDR内の残基のSARを明らかにすることができる。また、SARは、抗体の領域または抗体の活性に寄与するその中のアミノ酸残基を特定する他の方法を使って決定可能である。例えば、変異誘発法、例えば、系統的変異導入法、をSARの決定に使用可能である。
本明細書記載の合理的な手法は、小分子医薬品化学で使われる手法を模倣して、予備的なhitの最適化を支援するSARの特定を促進する。これは、親和性成熟の既存の方法よりも利点がある。現在、VHおよびVLドメインシャッフリングまたはCDRおよび/またはフレームワーク残基のランダム変異誘発により、多くのインビトロ親和性成熟抗体が作られている。多くのこれらの方法は、しかし、評価される巨大な数のクローンのために、いくつかのタイプのディスプレイ選択が必要である。本明細書の方法では、さらに合理的な、標的変異誘発法を採用し、SARに誘導されて遙かに小さいライブラリーを使って系統的変異導入を行い、親和性を調節する領域と残基を特定する。活性なhitをライブラリー中に存在する、より低い活性の、または不活性の関連する抗体と比較することができるため、真のSARを特定できる。さらに、本明細書の方法は、ライブラリーサイズの指数関数的拡大を避けるために、同時発生の変異生成を避けるように行うことができる。例えば、所与のCDRまたは標的領域に対して、1つの最良の置換が変異位置のそれぞれで特定され、活性のさらなる改良を得るために、新規抗体中で変異を組み合わせることができる。一例では、結合親和性が増加する。親和性の増加は、Kdの減少として測定され、結合速度(kon)の増加、解離速度(koff)の減少、または両方により達成できる。
本方法の一態様では、「Hit」抗体中で変異誘発する残基は、「Hit」抗体の可変重鎖または軽鎖のアミノ酸配列と、親和性成熟されるHit抗体に比較して標的抗原に対し低下した活性を示す関連抗体のそれぞれの可変重鎖または軽鎖とを比較することにより特定できる。一部の例では、関連抗体は、Hit抗体に比べ標的抗原に対して顕著に低い活性、例えば、80%未満の活性、通常、50%未満の活性、例えば、5%〜50%の活性、例えば、50%、40%、30%、20%、10%、5%またはそれ以下の活性、を示す非Hit抗体である。例えば、非Hit抗体は、標的抗原に対して検出可能な活性を示さない、または無視できる程度の活性のみを示す抗体でありうる。本方法を実施するに際し、活性の寄与領域の合理的な分析を行うために、「Hit」および関連抗体の間の関連性の一定の要件レベルが要求される。「Hit」抗体および関連抗体の間の、この構造−親和性/活性関連性分析により、活性に重要な抗体ポリペプチドの標的領域が明らかにされる。
本明細書で提供される方法の別の態様では、系統的変異導入法は、抗体の構造/活性関連性に関するより明確な情報を明らかにするために使用可能である。このような方法では、さらなる変異導入のための残基を特定するために、通常、系統的変異導入法が採用される。従って、系統的変異導入法はSARを決定する手段として採用可能である。あるいは、系統的変異導入法は、上述の比較方法と組み合わせて使うことも可能である。このような例では、標的領域活性に関与する標的領域が特定されるとすぐに、系統的変異導入法を使用して、変異誘発のためのアミノ酸残基を合理的に選択するために、それぞれのアミノ酸残基の活性における役割をさらに明らかにする。下記で詳細に考察するように、本明細書の系統的変異導入法では、抗体の活性に悪影響を与えない(例えば、標的抗原に対する活性を保持する、または、高める)スキャン変異体残基のみが、スキャン残基それぞれを他のアミノ酸へさらに変異導入することによりさらに変異誘発を受ける。
SARが決定されるとすぐに、活性に重要な残基含有標的領域が抗体の可変重鎖および/または可変軽鎖中で明らかにされる。可変重鎖または軽鎖に対する標的領域が特定されるとすぐに、領域内のアミノ酸残基の変異誘発法が採用され、標的抗原に対する活性により変異体が選別される。本明細書の方法では、例えば、DNA合成または組換DNA技術により変異誘発された抗体がそれぞれ生成され、発現し、標的抗原に対する活性によりアッセイされる。例えば、カセット変異導入、同時変異を使って、それぞれの抗体に変異導入することにより、ライブラリーの指数関数的拡大を避けることができる。さらに、不必要な変異を避けることができる。他の例では、所望に応じ、他の変異誘発手法、例えば、種々のドーピング方法、および選別およびシーケンシングにより特定された変異体の同一性を使って、変異を起こすことができる。親和性成熟は、参照Hit抗体の可変重鎖および可変軽鎖に対し別々にかつ独立に行うことができる。次に、得られた親和性成熟可変重鎖および軽鎖は、抗体のさらなる最適化のために対形成を行うことができる。
本明細書で提供される親和性成熟方法では、結合親和性のさらなる最適化を繰り返し行うことができる。例えば、さらなる最適化を、変異誘発および抗体ポリペプチドの追加の領域の選別の繰り返しにより行うことができる。方法の各ステップで、親和性成熟抗体の、標的抗原に対する活性(例えば、結合)の試験を行うことができる。親抗体またはいずれかのその中間体抗体に比べて標的抗原に対し改善された活性を有する抗体が特定される。また、標的抗原に対する活性を改善するための抗体領域中の最良置換が特定されるとすぐに、それらは組み合わされて新しい抗体を生成し、さらに改善して、抗体活性を最適化することができる。このような組み合わせ変異体は、追加の改善を提供できる。従って、本明細書の親和性成熟法により、抗体結合親和性の合理的な最適化が可能となる。
1.構造と活性の比較
Hit抗体のSARに基づいた、その構造と活性の関連抗体の比較による親和性成熟の方法が本明細書で提供される。この方法を実行するに際し、「Hit」抗体の重鎖および/または軽鎖のアミノ酸配列が、「Hit」抗体に比べて標的抗原に対する低減した、またはより少ない活性を示す関連抗体の対応する配列と比較される。以下で考察するように、本明細書の方法を実施する目的に対し、比較する場合(例えば、配列アラインメントにより)、「Hit」および関連抗体の間のアミノ酸差異を示す1次配列の領域を制限するために、関連抗体は「Hit」抗体の配列に充分に関連付けられる。従って、この方法は、標的抗原に対する活性に関与する「Hit」抗体の領域の特定を可能にする。例えば、「Hit」の一次配列(例えば、可変重鎖および/または可変軽鎖)および関連抗体の配列比較により、「Hit」および関連抗体の間にアミノ酸差異が存在する1つまたは複数の領域を特定することができる。領域は、1つまたは複数のCDR1、CDR2またはCDR3であっても、および/または抗体(例えば、FR1、FR2、FR3またはFR4)のフレームワーク領域内のアミノ酸残基であってもよい。関連抗体の対応する領域に比べて少なくとも1つのアミノ酸差異を示す抗体の領域は、さらなる変異誘発の標的となる標的領域である。
この方法では、他のいずれかのアミノ酸またはアミノ酸のサブセットへの変異誘発が、特定された標的領域内のアミノ酸残基上で行われる。例えば、「Hit」抗体の重鎖および/または軽鎖中の選択領域の一部のまたは全部のアミノ酸残基が変異している。例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれを超えるアミノ酸残基が変異している。変異誘発目的で選択された各アミノ酸残基は、全19の他のアミノ酸残基、または制限されたそのサブセット、に変異可能である。得られた変異抗体は、出発「Hit」抗体に比べて、標的抗原に対する活性により選別される。以下で考察されるように、一部の例では、それぞれのアミノ酸残基の変異誘発に先立ち、標的領域内の全または選択されたアミノ酸残基の系統的変異導入法を使用して、変異誘発のための特定の残基を特定することができる。特定残基のサブセットは、次に、変異誘発に供されて、標的抗原に対する活性を改善または最適化する。
通常、この方法は、抗体の可変重鎖および/または可変軽鎖に対し行われる。通常、親和性成熟は、「Hit」抗体の重鎖および/または軽鎖の内の1つまたは両方に対し相互に独立に、別々に行われる。重鎖および軽鎖は、独立に、例えば、任意の順で連続して親和性成熟される。あるいは、重鎖および軽鎖は、同時並行で親和性成熟を受ける。可変重鎖および/または可変軽鎖をコードする変異体DNA分子が設計され、変異誘発により産生され、クローン化される。一部の例では、改変可変重鎖および軽鎖が合成により、または他の組換え法により産生されうる。重鎖および軽鎖の様々な組み合わせが対形成され、変異抗体のライブラリーが生成されうる。得られた抗体またはその断片は、標的抗原に対する活性により試験される。出発「Hit」抗体に比較して、最適化されたまたは改善された結合親和性を示す抗体が選択される。
標的抗原に対する活性をさらに最適化するために、繰り返して選別を行うことができる。例えば、可変重鎖または軽鎖内で標的抗原に対する活性を高める変異は、組み合わせることが可能で、それにより、出発「Hit」抗体および/または中間体の単一変異抗体に比べて改善された活性を有する抗体を作り出すことができる。また、親和性成熟軽鎖を有する親和性成熟重鎖の対形成により、本方法の実施により産生された生成抗体の活性をさらに最適化および改善することができる。さらに、1つまたは複数の追加の可変重鎖または軽鎖の領域中のアミノ酸残基の変異誘発、例えば、系統的変異導入または完全もしくは部分飽和変異誘発を行い、標的抗原に対する活性をさらに最適化するさらなる変異を特定することができる。
この方法のいずれのステップにおいても、親和性成熟抗体は、さらに活性に関し評価されうる。いずれの活性も、本明細書のセクションEのいずれかの例で示すように、評価可能である。一例では、結合が評価される。当業者に既知のいずれの方法も、抗体の結合または結合親和性の測定に使用可能である。一例では、結合親和性は、表面プラズモン共鳴法(SPR)を使って測定される。別の例では、結合親和性は、ELISAを使って、用量反応により測定される。得られた抗体は、また、本明細書の別のところで考察されているように、機能活性の試験が可能である。
得られた親和性成熟抗体は、親「Hit」抗体に比較して改善された、および/または最適化された標的抗原に対する活性、を有するように選択される。本方法を実施することにより、標的抗原に対する抗体の活性が、少なくとも1.5倍、通常、少なくとも2倍、例えば、少なくとも2倍〜10000倍、例えば、少なくとも2倍、5倍、10倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、10000倍またはそれ超だけ改善されうる。例えば、本方法の実施により生成された親和性成熟抗体は、例えば、正確にまたは約11x10−9M〜1x10−11M、通常は、5x10−9M〜5x10−10M、例えば、正確にまたは約1x10−9M、2x10−9M、3x10−9M、4x10−9M、5x10−9M、6x10−9M、7x10−9M、8x10−9M、9x10−9M、1x10−10M、2x10−10M、3x10−10M、4x10−10M、5x10−10M、6x10−10M、7x10−10M、8x10−10M、9x10−10Mまたはそれ未満の標的抗原に対する改善された結合親和性を有しうる。
この方法のステップの要約が図1で説明されている。本方法の各ステップの詳細説明は、以下で提供される。本明細書で提供される親和性成熟方法のステップは、抗体の可変重鎖に対しても、または可変軽鎖配列に対しても同様に行えることは理解されよう。従って、本明細書の目的のために、以下の説明は、特に明確な別段の記載が無ければ、重鎖および軽鎖配列の片方または両方に対する本方法の実施に適用できる。本明細書の別のところで考察されているように、通常、親和性成熟は、抗体の重鎖および/または軽鎖の片方または両方に対し、相互に独立に行われる。所望なら、親和性成熟重鎖は、親和性成熟軽鎖と対形成し、抗体の活性をさらに最適化または改善することができる。
a.親和性成熟のための1次抗体の選択
親和性成熟を行うために選択された抗体は、当技術分野で既知の、または標的抗原または抗原に対する活性を有すると特定されたいずれかの抗体である。例えば、抗体は、「Hit」抗体、例えば、選別アッセイで特定された抗体であってもよい。通常、抗体は、標的抗原に対する活性を示すが、親和性が充分高くはないために治療薬としての使用には理想的ではない、または活性の改善が可能もしくは望ましい抗体である。例えば、親和性成熟のために選択される抗体は、典型的には、正確にまたは約10−5M〜10−8M、例えば、正確にまたは約10−5M、10−6M、10−7M、10−8M、またはそれ以下、の標的抗原に対する結合親和性を有する。一般的に、親和性成熟のために選択される抗体は、標的抗原に特異的に結合する。標的抗原に対する抗体の活性を評価するアッセイは、当技術分野で既知である。代表的アッセイは、セクションEで提供される。
従って、1次抗体は、標的抗原に対して活性を有することがわかっている抗体である。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、脂質、核酸または小分子(例えば、神経伝達物質)であってもよい。抗体は、ウイルス、細菌性、腫瘍または他の細胞の表面に発現した抗原に対して活性を示すことも、または、精製抗原に対する活性(例えば、結合)を示すことも可能である。通常、標的抗原は、精製タンパク質またはペプチドで、例えば、組換え型タンパク質を含む。
一般的に、標的抗原は、治療介入の標的であるタンパク質である。代表的標的抗原には、これに限定されないが、細胞増殖および分化、細胞遊走、アポトーシスおよび血管新生に関与する標的が含まれる。このような標的には、これに限定されないが、増殖因子、サイトカイン、リンパ球性抗原、他の細胞性活性化因子およびその受容体が含まれる。このような標的の代表例には、膜結合受容体、例えば、以下を含む細胞表面受容体が挙げられる(これらに限定されない):VEGFR−1、VEGFR−2、VEGFR−3(血管内皮細胞増殖因子受容体1、2、および3)、a上皮増殖因子受容体(EGFR)、ErbB−2、ErbB−b3、IGF−R1、C−Met(肝細胞増殖因子受容体としても知られる;HGFR)、DLL4、DDR1(ジスコイジンドメイン受容体)、KIT(c−kit用受容体)、FGFR1、FGFR2、FGFR4(繊維芽細胞増殖因子受容体1、2、および4)、RON(recepteurd’originenantais;マクロファージ刺激1受容体としても知られる)、TEK(内皮細胞特異的受容体チロシンキナーゼ)、TIE(内皮細胞に存在する受容体型チロシンキナーゼ)、CSF1R(コロニー刺激因子1受容体)、PDGFRB(血小板由来増殖因子受容体B)、EPHA1、EPHA2、EPHB1(エリトロポイエチン産生肝細胞受容体A1、A2およびB1)、TNF−R1、TNF−R2、HVEM、LT−βR、CD20、CD3、CD25、NOTCH、G−CSF−R、GM−CSF−RならびにEPO−R、が含まれる。他の標的には、膜結合型タンパク質、例えば、カドヘリン、インテグリン、CD52またはCD44から選択されるものが含まれる。本明細書の選別方法の標的になりうる代表的リガンドには、これに限定されないが、VEGF−A、VEGF−B、VEGF−C、VEGF−D、PIGF、EGF、HGF、TNF−α、LIGHT、BTLA、リンホトキシン(LT)、IgE、G−CSF、GM−CSFおよびEPOが含まれる。一部の例では、「Hit」抗体は、1つまたは複数の抗原と結合可能である。例えば、実施例1で例示したように、1つの標的抗原のみ、例えば、DLL4に対し結合する、または2つ以上の異なる標的抗原、例えば、P−カドヘリンおよびエリトロポイエチン(EPO)に結合する「Hit」抗体が特定された。
本明細書で提供される方法の実施では、通常、抗体の可変重鎖および/または可変軽鎖のみが親和性成熟される。従って、選択された抗体は、通常、抗原結合部位を形成するのに充分な可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む。しかし、抗体は、また、定常重鎖(例えば、1つまたは複数のCHドメイン、例えば、CH1、CH2、CH3およびCH4)、および/または定常軽鎖(CL)の全てまたは一部を含むことができることは理解されよう。従って、抗体は、完全長抗体、および、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、単鎖Fv(scFv)、Fv、dsFv、ダイアボディ、FdおよびFd’断片、Fab断片、scFv断片、ならびにscFab断片、を含む断片またはその一部も含むことができる。例えば、本明細書の実施例に例示されている親和性成熟抗体はFabである。本明細書で提供されるように、抗体が親和性成熟されるとすぐに、得られた抗体は、完全長抗体またはその断片、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、単鎖Fv(scFv)、Fv、dsFv、ダイアボディ、FdおよびFd’断片、Fab断片、scFv断片、ならびにscFab断片、として産生可能であることは理解されよう。さらに、いずれかのアイソタイプの定常領域は、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgE定常領域を含む完全または部分的抗体断片の生成に使用可能である。このような定常領域は、いずれかのヒトまたは動物種から入手可能である。活性と結合親和性は、抗体の構造に応じて異なりうることは理解されよう。例えば、通常、二価の抗体、例えば、二価のF(ab’)2断片または完全長IgGは、一価のFab抗体よりも良好な結合親和性を有する。結果として、Fabが特定の標的に対し特定の結合親和性を有する場合、結合親和性が二価の完全長IgGに対してはさらに大きいということは除外して考えるべきである。従って、1次抗体および親和性成熟抗体の間の結合親和性の比較は、通常、例えば、FabとFabを比較する、等の、同じ構造を有する抗体の間でなされる。
親和性成熟用の抗体には、当業者に既知の既存抗体を含んでもよい。別の例では、抗体は、所望の標的に応じて経験的に生成、または特定される。例えば、抗体は、従来の免疫化およびハイブリドーマ選別法を使って産生することができる。別の例では、抗体は、当業者に既知の種々の選別方法のいずれかを使って特定される。
i.免疫化およびハイブリドーマ選別
標的抗原に特異的抗体は、最初、Kohler et al.(1975)Nature、256:495、に記載されたハイブリドーマ法を使ってまたは組換えDNA法(米国特許第4、816、567号)により産生可能である。
ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えば、ハムスター、に免疫して免疫化に使われるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生することができるリンパ球を誘発する。標的抗原に対する抗体を、タンパク質抗原およびアジュバントの複数回の皮下(sc)または腹腔内の(ip)注射により動物中に産生することができる。2週間後、動物に追加免疫を行う。7〜14日後、動物から採血し、血清を用いて標的抗原に特異的な抗体力価のアッセイを行う。動物は、力価がプラトーになるまで追加免役される。
あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化できる。次に、リンパ球をポリエチレングリコール等の適切な融合剤を使ってミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding、「モノクローナル抗体:原理と実践」、pp.59−103(Academic Press、1986))。
調製されたハイブリドーマ細胞を播種し、非融合の親ミエローマ細胞の成長または生存を阻害する1つまたは複数の物質を含む適切な培地中で成長させる。例えば、親ミエローマ細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRTまたはHPRT)を欠いている場合には、ハイブリドーマ用の培地は、通常、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン(HAT培地)を含み、この物質は、HGPRT欠乏細胞の成長を防ぐ。
ミエローマ細胞は、効率的に融合するものを含み、選択された抗体産生細胞により抗体の安定な高レベル産生を支援し、また、培地、例えば、HAT培地に敏感である。ミエローマ細胞株の中には、マウス骨髄腫株、例えば、Salk Institute Cell Distribution Center、San Diego、CA、USA、から入手可能なMOPC−21およびMPC−11マウス腫瘍、ならびにアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(ATCC)、Rockville、Md.、USA、から入手可能なSP−2またはX63−Ag8−653細胞、由来のものがある。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記載されている(Kozbor、(1984)J.Immunol.、133:3001;およびBrodeur et al.、「モノクローナル抗体産生技術および応用」、pp.51−63(Marcel Dekker、Inc.、New York、1987))。
ハイブリドーマ細胞が成長している培地を使って、標的抗原に対して誘導されたモノクローナル抗体の産生のアッセイを行う。ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、当業者には既知のいずれかの方法(例えば、セクションE.1に記載のように)、例えば、免疫沈降またはラジオイムノアッセイ(RIA)または酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、等のインビトロ結合アッセイにより、測定可能である。結合親和性は、また、例えば、スキャチャード解析を使って測定可能である。
所望の特異性、親和性、および/または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が特定された後で、クローンを限界希釈法でサブクローニングし、標準的な方法で増殖させることができる(Goding、「モノクローナル抗体:原理と実践」、pp.59−103(Academic Press、1986))。この目的のための適切な培地には、例えば、D−MEMまたはRPMI−1640培地がある。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物中で腹水腫瘍としてインビボで増殖できる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製法、例えば、例えば、タンパク質A−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、透析、または親和性クロマトグラフィーにより、培地、腹水体液、または血清から適切に分離される。
ハイブリドーマ由来モノクローナル抗体をコードするDNAは、容易に分離可能で、従来の方法を使って配列決定できる。例えば、シーケンシングは、重鎖および軽鎖をコードするハイブリドーマ由来対象領域を特異的に増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを使って行うことができる。単離されるとすぐ、DNAは発現ベクター中に挿入することができ、次に、他の方法では免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えば、大腸菌細胞、サルのコス細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、またはミエローマ細胞中に形質移入し、組換え型宿主細胞中で所望のモノクローナル抗体の合成を行う。
ii.「Hit」の特定のための選別アッセイ
方法本明細書の方法により親和性成熟した抗体は、コンビナトリアルライブラリーを使って合成抗体クローンを所望の1つまたは複数の活性により選別することにより特定可能である。所望の活性を有する抗体は、「Hit」として選別できる。このような「Hit」抗体は、親和性成熟してさらに活性を最適化できる。
1)ディスプレイライブラリー
典型的な選別方法は、高スループット選別の抗体ライブラリーである。例えば、抗体ライブラリーは、ライブラリーの個々の分子(表現型)およびそれらをコードする遺伝子情報(遺伝子型)の間の物理的リンクがある様に、ディスプレイ技術を使って選別される。これらの方法には、これに限定されないが、細菌性ディスプレイ、酵母ディスプレイおよび哺乳類ディスプレイを含む細胞ディスプレイ;ファージディスプレイ(Smith、G.P.(1985)Science 228:1315−1317)、mRNAディスプレイ、リボソームディスプレイならびにDNAディスプレイ、が含まれる。ディスプレイ技術を使って、個々の抗体のそれぞれの同一性を選別の前に知ることができるが、表現型−遺伝子型リンクは、選択抗体を容易に特定できるようにする。本明細書の方法を実施する前に、「Hit」抗体の配列が決定される。
通常、ライブラリーでは、抗体遺伝子断片をコードする核酸は、ヒトまたは動物から採取した免疫細胞から入手される。抗原特異的抗体の方に偏ったライブラリーを望む場合は、対象を標的抗原で免疫して、抗体応答を生成させ、脾臓細胞および/または循環B細胞または他の末梢血リンパ球(PBL)をライブラリー構築用に回収する。抗原特異的抗体反応性細胞集団のさらなる濃縮は、抗原特異的膜結合抗体を発現しているB細胞を単離する適切な選別方法、例えば、抗原親和性クロマトグラフィーによる細胞分離、または蛍光色素標識抗原への吸着とそれに続く蛍光標識細胞分取(FACs)を使って行うことができる。
あるいは、脾臓細胞および/またはB細胞または未免疫ドナー由来の他のPBLの使用により、より良好な発現量の可能な抗体レパートリーが提供され、また、標的抗原が非抗原性である任意の動物(ヒトまたは非ヒト)種を使った抗体ライブラリーの構築が可能となる。インビトロ抗体遺伝子構築を組み込んだライブラリーのために、対象から幹細胞を採取し、未再構成抗体遺伝子セグメントをコードする核酸を提供する。対象免疫細胞は、種々の動物種、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ目、オオカミ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、およびトリ種から入手できる。
抗体可変遺伝子セグメント(VHおよびVLセグメントを含む)をコードする核酸は、対象細胞から回収し、増殖可能である。再構成されたVHおよびVL遺伝子ライブラリーの場合には、所望のDNAは、ゲノムDNAまたはmRNAをリンパ球から単離し、次いで、再構成VHVL遺伝子の5’および3’末端に適合するプライマーでポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うことにより得られ(Orlandi et al.、(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)、86:3833−3837)、それにより発現のための多様なV遺伝子レパートリーを作ることができる。V遺伝子は、成熟V−ドメインをコードするエキソンの5’末端の逆方向プライマー(backprimer)、およびJ−セグメント内の順方向プライマーを使って相補DNAおよびゲノムDNAから増幅できる(Orlandi et al.、(1989)およびWard et al.、(1989)Nature、341:544−546)。しかし、相補DNAから増幅するためには、逆方向プライマーは、また、リーダーエキソン中をベースにしてもよく(Jones et al.、(1991)Biotechnology、9:88−89)、また、順方向プライマーは、定常領域内をベースにしてもよい(Sastry et al.、(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)、86:5728−5732)。相補性を最大化するために、縮重をプライマー中に組み込むこともできる(Orlandi et al.(1989)またはSastry et al.(1989))。ライブラリー多様性は、免疫細胞核酸試料中に存在する全ての利用可能なVHおよびVL再構成を増幅するために、例えば、Marks et al.、(1991)J.Mol.Biol.、222:581−597、またはOrum et al.、(1993)Nucleic Acids Res.、21:4491−4498、に記載の方法により、各V−遺伝子ファミリーを標的にしたPCRプライマーを使って最大化可能である。増幅DNAの発現ベクター中へのクローニングのために、PCRプライマー内の1つの末端にタグとして導入する(Orlandi et al.(1989))か、またはタグを付けたプライマーでPCR増幅することにより(Clackson et al.、(1991)Nature、352:624−628)、希な制限酵素部位を導入することができる。
合成的に再構成されたV遺伝子の抗体ライブラリー、レパートリー作製の別の例では、V遺伝子セグメントからインビトロで得ることができる。大抵のヒトVH遺伝子セグメントが、クローン化され、配列決定されており(例えば、Tomlinson et al.、(1992)J.Mol.Biol.、227:776−798、参照)、マップ化されている(例えば、Matsuda et al.、(1993)Nature Genet.、3:988−94、参照)。これらのセグメントは、多様配列および長さのH3ループをコードするPCRプライマーを使って多様なVH遺伝子レパートリーを生成するために使用可能である(Hoogenboom and Winter(1992)J.Mol.Biol.、227:381−388)。また、長い単一長さのH3ループに焦点を絞った全ての配列多様性を有するVHレパートリーも作製可能である(Barbas et al.、(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:4457−4461)。ヒトVκおよびVλセグメントは、クローン化され、配列決定されており(例えば、Williams and Winter(1993)Eur.J.Immunol.、23:1456−1461、参照)、合成軽鎖レパートリーを作るために使用可能である。VHおよびVL群ならびにL3およびH3長さの範囲をベースにした合成V遺伝子レパートリーは、多くの構造的多様性の抗体をコードする。DNAをコードするV−遺伝子の増幅の後で、生殖系列V−遺伝子セグメントが、Hoogenboom and Winter(1992)J.Mol.Biol.、227:381−388、の方法に従って、インビトロで再構成できる。
抗体断片レパートリーは、VHおよびVL遺伝子レパートリーをいくつかの方法で一緒に組み合わせることにより構築可能である。各レパートリーは、異なるベクター中で作製でき、ベクターは、インビトロで(例えば、Hogrefe et al.、(1993)Gene、128:119−126、参照)、またはインビボでコンビナトリアル感染、例えば、lox Pシステムを使って(Waterhouse et al.、(1993)Nucl.Acids Res.、21:2265−2266)、組換え可能である。インビボ組換え手法は、Fab断片の二重鎖の性質を利用して大腸菌形質転換効率から来るライブラリーサイズの制限を克服する。あるいは、レパートリーは、同じベクター中へ順次クローン化でき(例えば、Barbas et al.、(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA、88:7978−7982、参照)、または、PCRにより一緒に構築し、次いで、クローン化できる(例えば、Clackson et al.、(1991)Nature、352:624−628、参照)。また、PCRによる構築により、VHおよびVL DNAを柔軟なペプチドスペーサーをコードするDNAと連結し、単鎖Fv(scFv)レパートリーを形成できる。別の技術では、「細胞中PCR構築」を使って、リンパ球内のVHおよびVL遺伝子をPCRで結合し、次に連結遺伝子のレパートリーをクローン化できる(例えば、Embleton(1992)Nucl.Acids Res.、20:3831−3837、参照)。
通常のディスプレイライブラリーでは、VHおよびVL鎖のレパートリーは、ライブラリーの各メンバーの配列がわからない形でワンポットライブラリーとして構築される。従って、本明細書の方法を実施するために必要な何らかのSAR関連性の知識を得るために、「Hit」抗体の特定後、シーケンシングが必要である。従って上述のように、ハイブリドーマ生成抗体に対し、ディスプレイライブラリーから特定されたDNAコード抗体クローンが容易に単離でき、従来の方法で配列決定できる。例えば、シーケンシングは、重鎖および軽鎖をコードするDNAテンプレート、例えば、ファージDNAテンプレート、由来の対象領域を特異的に増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを使って行うことができる。
選別に使用可能な代表的なこのような抗体ライブラリーは、下記のいずれかに記載されている:欧州特許出願第0368684号および同89311731号;国際公開第92/001047号、同02/38756号、同97/08320号、同2005/023993号、同07/137616号および同2007/054816号;米国特許第6、593、081号および同6、989、250号;米国特許公開第2002/0102613号、同2003/153038号、同2003/0022240号、同2005/0119455号、同2005/0079574号および同2006/0234302号;ならびにOrlandi et al.(1989)Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.、86:3833−3837;Ward et al.(1989)Nature、341:544−546;Huse et al.(1989)Science、246:1275−1281;Burton et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.、U.S.A.、88:10134−10137;Marks et al.(1991)J Mol Biol、222:581−591;Hoogenboom et al.(1991)J Mol Biol、227:381−388;Nissim et al.(1994)EMBO J、13:692−698;Barbas et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.、U.S.A.、89:4457−4461;Akamatsu et al.(1993)J.Immunol.、151:4651−1659;Griffiths et al.(1994)EMBO J、13:3245−3260;Fellouse(2004)PNAS、101:12467−12472;Persson et al.(2006)J.Mol.Biol.357:607−620;Knappik et al.(2000)J.Mol.Biol.296:57−86;Rothe et al.(2008)J.Mol.Biol.376:1182−1200;Mondon et al.(2008)Frontiers in Bioscience、13:1117−1129;およびBehar、I.(2007)Expert Opin.Biol.Ther.、7:763−779。
2)ファージディスプレイライブラリー
例えば、天然、または合成抗体は、ファージコートタンパク質に融合した抗体可変領域(Fv)の様々な断片を提示するファージを含む選別ファージライブラリーによって選択される。可変ドメインは、短い柔軟なペプチドを介してVHおよびVLが共有結合している単鎖Fv(scFv)断片として、または、それぞれ定常ドメインに融合し、非共有結合で相互作用する(Winter et al.、(1994)Ann.Rev.Immunol.、12:433−455)Fab断片として、ファージ上で機能的に提示されうる。このようなファージライブラリーは親和性クロマトグラフィーにより所望の抗原に対して選別される。所望の抗原に対し結合可能なFv断片を発現しているクローンは、抗原に結合し、その結果、ライブラリー中の非結合クローンから分離される。結合クローンは、次に、抗原から溶出され、抗原結合/溶出の追加のサイクルによりさらに濃縮できる。どのような抗体も、対象ファージクローンの選別のための適切な抗原選別方法を設計し、続いて、対象ファージクローンおよび適切な定常領域(Fc)配列由来のFv配列を使って完全長抗体クローンを構築することにより得ることができる(Kabat et al.(1991)免疫学的関連タンパク質の配列、第5版、NIH Publication No.91−3242、Bethesda Md.(1991)、vols.1−3)。
VHおよびVL遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により別々にクローン化でき、ファージライブラリー中でランダムに組換え可能で、その後、抗原結合クローンを対象に検索できる(Winter et al.、Ann.Rev.Immunol.、12:433−455(1994))。免疫化ソース由来のライブラリーは、ハイブリドーマ構築を要せずに、免疫原に対し高親和性抗体を提供する。あるいは、ナイーブレパートリーは、クローン化して、何ら免疫化をせずに、広い範囲の非自己および自己抗原に対しヒト抗体の単一ソースを提供できる(Griffiths et al.、EMBO J.12:725−734(1993))。また、最終的に、ナイーブライブラリーは、幹細胞由来の未再構成V−遺伝子セグメントのクローン化、およびランダム配列を含むPCRプライマーを使って高可変CDR3領域をコードし、インビトロで再構成することにより合成的に作ることができる(Hoogenboom and Winter、J.Mol.Biol.、227:381−388(1992))。
VHおよびVLレパートリーは、別々にクローンされ、1つはファージミド中に、また、もう一方はファージベクター中に挿入される。次に、各細胞が異なる組み合わせを含み、さらに、ライブラリーサイズが存在する細胞の数(約1012クローン)のみにより制限されるように、ファージミド含有細菌のファージ感染により2つのライブラリーを組み合わせる。両ベクターは、インビボ組換えシグナルを含み、これにより、VHおよびVL遺伝子が単一レプリコン上で組み換えられ、ファージヴィリオン中に一緒にパッケージされる。ライブラリーは、良好な親和性(約10−8MのKd−1)を有する大量の多様な抗体を提供できる。
繊維状ファージが、コートタンパク質、例えば、少数のコートタンパク質pIIIに融合することにより抗体断片を提示するために使用される。抗体断片は、VHおよびVLドメインが同じポリペプチド鎖上で柔軟なポリペプチドスペーサーにより連結された、単鎖Fv断片として(例えば、Marks et al.、J.Mol.Biol.、222:581−597(1991))、または、1つの鎖がpIIIに融合し、もう一方の鎖が細菌性宿主細胞ペリプラズム中に分泌され、そこで野性型コートタンパク質の一部を置換することによりファージ表面上に提示されるFabコートタンパク質構造の構築がなされるFab断片として(例えば、Hoogenboom et al.、Nucl.Acids Res.、19:4133−4137(1991))提示される。
3)アドレス指定可能なライブラリー
標的タンパク質に対する所望の特異性および/または活性を有する抗体またはその断片を特定する別の方法には、米国特許仮出願第61/198、764号および同61/211、204号、ならびに国際公開第2010054007号に記載のアドレス指定できるコンビナトリアル抗体ライブラリーが含まれる(これらの特許は、参照によって本明細書に組み込まれる)。これらには、例えば、空間的にアドレス指定されるコンビナトリアル抗体ライブラリーが含まれる。ディスプレイライブラリーに比べて、アドレス指定できるコンビナトリアルライブラリーの利点は、各座位が、アドレスにより同一性がわかっている異なるライブラリーメンバーを表すことである。このようなライブラリーでは、ライブラリーの各個別メンバーは、別々に生成され、次に、各メンバーの配列が知られる。ライブラリーのメンバーの提示は、結合に対してのみではなく、機能に対しても各メンバーの選択を可能にする任意の所望のフォーマットで達成できる。「Hit」は、配列から判断できるものを含め、選別の結果と同時に素早く特定できる。特定された「Hit」の配列は、演繹的に既知であるので、特定された抗体に関する構造的情報を得るのにシーケンシングの必要はない。従って、「Hit」抗体の親和性成熟は、選別および「Hit」抗体の特定後、直ちに行うことができる。
アドレス指定できるコンビナトリアル抗体ライブラリーは、組換えヒト生殖系列セグメントからなる可変重鎖および可変軽鎖を有する抗体を含む。ライブラリー中の抗体組み合わせ多様性は、可変重鎖を構成する個別のV、DおよびJセグメントの組換え、および可変軽鎖を構成する個別V(VκまたはVλ)およびJ(JκまたはJλ)セグメントの組換えから生ずる。さらなる組み合わせ多様性は、異なる可変重鎖および可変軽鎖の対形成から得られる。
各VH鎖および/またはVL鎖をコードする核酸分子は、標準的DNA合成技術を使って、アドレス指定できるフォーマットで別々に合成され、それにより、各VH鎖および/またはVL鎖の座位における核酸配列の同一性は既知である。VH鎖およびVL鎖は、こちらもアドレス指定できるフォーマットで対形成され、それにより、ライブラリー各メンバーの同一性は座位または「アドレス」に基づいて既知である。アドレス指定できるコンビナトリアル抗体ライブラリーは、標的タンパク質に対する結合または活性により選別でき、標的タンパク質に結合する、および/または標的タンパク質の活性を調節する抗体またはその一部を特定できる。これらのライブラリーが配列されているという事実のために、収集中の各個別メンバーの同一性を選別の間に知ることができ、それにより、「Hit」および関連「非Hit」抗体の比較を容易にする。
米国仮出願特許第61/198、764号、および61/211、204号、ならびに国際公開第2010054007号(参照によって本明細書に組み込まれる)には、抗体メンバーの組み合わせ生成の理由により、各抗体の同一性が選別時点で既知であるコンビナトリアル抗体ライブラリーを生成する方法が提供されている。アドレス指定可能なコンビナトリアルライブラリーでは、ライブラリーの可変重鎖(VH)および可変軽(VL)メンバーは、既知の生殖系列抗体配列またはその改変配列から、組換えでまたは合成的にDNA合成により生成される。ライブラリー中の抗体組み合わせ多様性は、可変重鎖を構成する個別のV、DおよびJセグメントの組換え、および可変軽鎖を構成する個別のV(VκまたはVλ)およびJ(JκまたはJλ)セグメントから生成する。さらなる組み合わせ多様性は、異なる可変重鎖および可変軽鎖の対形成から得られる。
ライブラリー中の抗体の各VL鎖は、VκおよびJκヒト生殖系列セグメントもしくはその縮重コドン、またはVλおよびJλヒト生殖系列セグメントもしくはその縮重コドンを含む核酸分子によりコードされ、それにより、セグメントがインフレームで連結される。生殖系列セグメントは、VLセグメントがJLセグメントの5’となるように連結される。ライブラリー中の抗体の各VH鎖は、VH、DHおよびJH生殖系列セグメントを含む核酸分子によりコードされ、それにより、セグメントは、インフレームで連結される。生殖系列セグメントは、VHセグメントがDHセグメントの5’であり、これがJHセグメントの5’となるように、連結される。
各遺伝子セグメントがインフレームとなり、得られた組換え核酸分子が機能的VHまたはVLポリペプチドをコードするように、組換えが行われる。例えば、組換えDセグメントは、組換え完全長核酸がインフレームであり、5’開始コドン(ATG)を有し、それにより、完全長ポリペプチドの発現を可能とするように連結される。V(D)Jのどのような組み合わせも作ることができ、従って、接合部がインフレームの編集されたV(D)J配列を生成するために改変され、一方、各セグメントの読み枠は保存される。接合部改変の選択は、連結されるV(D)Jの組み合わせ、および各遺伝子セグメントの適切な読み枠に依存する。一部の例では、VH鎖および/またはVL鎖をコードする核酸分子は、さらに改変され、停止コドンおよび/または制限酵素部位を除去し、それにより、生じたコード化ポリペプチドはインフレームであり、機能的となる。
可変重鎖または可変軽鎖をコードする核酸が、以下のように産生される。最初のステップで、それぞれの生殖系列セグメント(重鎖に対するVH、DHおよびJHまたは軽鎖に対するVκおよびJκ、またはVλおよびJλ)が組み換えのために選択される。生殖系列セグメントは、ヒト生殖系列セグメントもしくは、その縮重配列でも、あるいは、改変されていてもよい。例えば、可変重鎖のDHセグメントは、任意の読み枠に翻訳されてもよく、あるいは、DHセグメントは、DH生殖系列セグメントの逆相補配列であってもよい。選択されるとすぐ、生殖系列セグメントは、組換え完全長核酸が5’開始コドン(ATG)を有するインフレームとなるように連結され、それにより、完全長ポリペプチドの発現を可能とする。任意のV(D)Jの組み合わせが可能であり、従って、編集されたインフレームのV(D)J配列を生成するために接合部が改変され、一方、各セグメントの読み枠は保存される。Vセグメントは、常に読み枠1である。Jセグメントの読み枠は、適切なアミノ酸がコードされるように選択される。Dセグメントは、どのような読み枠でも可能だが、通常、読み枠は、生じたアミノ酸の疎水性が優るように選択される。必要に応じ、各セグメントが所望の読み枠に入るように、遺伝子セグメントの間の接合部で核酸の改変がなされる。例えば、V−D接合部では、1つまたは複数のヌクレオチドがDの5’末端から欠失、1つまたは複数のヌクレオチドがVの3’末端から欠失、または1つまたは複数のヌクレオチドがVとDに間に挿入されうる(例えば、ヌクレオチドは、Vの3’末端に追加できる)。接合部が形成されるとすぐに、配列は改変され、いずれの停止コドンもヌクレオチドに置換されることにより、例えば、停止コドンTAAがコドンTATにより置換され;停止コドンTAGがコドンTATにより置換され、さらに停止コドンTGAがコドンTCAにより置換されることにより除去される。最終的に、核酸は、さらに改変され、例えば、不必要な制限酵素部位、スプライシングドナーもしくは受容体部位、または効率的翻訳に潜在的に有害な他のヌクレオチド配列を除去できる。核酸配列の改変には、ヌクレオチドの交換もしくは置換、挿入、または欠失、またはそれらのいずれかの組み合わせが含まれる。
各VH鎖および/またはVL鎖をコードする核酸分子を標準的DNA合成技術を使ってアドレス指定できるフォーマットで別々に合成し、それにより、各VH鎖および/またはVL鎖の各座位の核酸配列の同一性を知ることができる。
次に、VH鎖およびVL鎖が同様にアドレス指定できるフォーマットで対形成され、それにより、ライブラリーの各メンバーの同一性を座位または「アドレス]に基づいて知ることができる。例えば、生成するライブラリーのメンバーは、組換え可変領域遺伝子をコードする核酸分子の同時発現により一緒に産生され、それにより、発現する場合、コンビナトリアル抗体メンバーは、VHおよびVL鎖またはその一部を最低限含むように生成される。この方法の一部の例では、VHおよびVL鎖をコードする核酸分子は、単一核酸分子として発現することができ、それにより、重鎖および軽鎖をコードする遺伝子は、リンカーによって連結される。この方法の別の例では、VHおよびVL鎖をコードする核酸分子は、一緒の発現のために、別々に提供できる。従って、組換え核酸分子からの発現に際し、各異なるライブラリーのメンバーは、生殖系列にコードされた抗体を表し、それにより、多様性は、V(D)Jセグメントの組み合わせ多様性および重鎖および軽鎖の対形成多様性により達成される。
アドレス指定できるコンビナトリアル生殖系列抗体ライブラリー内の抗体は、生じた抗体が抗原結合部位を形成するのに充分であるという前提の下、全てまたは一部の可変重鎖(VH)および可変軽鎖(VL)を含む。通常、アドレス指定できるコンビナトリアル生殖系列抗体は、Fabである。可変重鎖および軽鎖をコードする代表的核酸は、下表3で示されている。抗体のライブラリーは、VH鎖をコードする核酸分子およびVL鎖コードする核酸分子の同時発現により産生され、複数の異なるメンバーを含むコンビナトリアルライブラリーを生成することができる。代表的対形成核酸ライブラリーを、下表4に示すが、ここで、各行は、ライブラリーの異なる座位を表す。アドレス指定できるコンビナトリアル抗体ライブラリーは、選別されて任意の標的抗原に対する「Hit」抗体を特定することができる。各「Hit」または「非Hit」の配列構造による同一性は、結合結果と同時に直ちにわかるので、標的抗原に結合しない関連非Hit抗体もまた、容易に特定可能である。
通常、アドレス指定できるコンビナトリアル生殖系列ライブラリーは、マルチウェルプレート、例えば、96ウエルプレート、中で空間的に配列されており、プレートの各ウエルは、他の全てのウエル中の抗体とは異なる1つの抗体に対応する。抗体は、プレートのウエル表面に固定でき、または溶液として存在できる。あるいは、抗体は、固体支持体、例えば、例えば、フィルター、チップ、スライド、ビーズまたはセルロースに付着される。抗体は、また、着色、発色性、発光、化学、蛍光または電子標識で、識別可能なように標識できる。アドレス指定できるコンビナトリアル生殖系列抗体ライブラリーは、標的タンパク質に対する結合または活性により選別し、標的タンパク質に結合する、および/または標的タンパク質の活性を調節する抗体またはその一部を特定できる。これらのライブラリーが配列されているという事実のおかげで、収集中のそれぞれ個別のメンバーの同一性を選別の間に知ることができ、それにより「Hit」抗体の特定が容易にできる。結合または機能活性による選別は、当業者に既知のいずれの方法、例えば、セクションE.1に記載のいずれの方法であってもよい。
例えば、実施例に記載のように、アドレス指定できる抗体ライブラリーから、MSD電気化学発光結合アッセイまたはELISAを使って標的抗原に対して「Hit」抗体を選別できることが実証される。ライブラリーはアドレス指定できるために、特定された「Hit」の配列は、直ちに知ることができる。以下でさらに考察されるように、類似のアッセイにより関連抗体を特定できることが実証される。
b.関連抗体の特定
本明細書で提供される方法では、標的抗原に対し1次抗体より低減したまたは少ない活性を有する関連抗体との比較により、本明細書の親和性成熟に使われるSAR情報が得られる。この方法では、親和性成熟される抗体の変異誘発対象の残基が、1次抗体(例えば、「Hit」)の可変重鎖または軽鎖と、関連抗体の可変重鎖または軽鎖の対応するアミノ酸配列とのアミノ酸配列の比較により特定される。本明細書の方法を実施する目的に対し、関連抗体は、抗体(重鎖および軽鎖)の全体配列にわたって「Hit」抗体に対する配列類似性または同一性を有するが、それ自体、「Hit」抗体に対し配列は全く同じではない。さらに、関連抗体は、標的抗原に対し1次抗体より少ない活性(例えば、結合または結合親和性)を示す。
本明細書の方法では、1次抗体が上述の本明細書の親和性成熟のために選択されるとすぐに、1つまたは複数の関連抗体が選択される。1次抗体および関連抗体が同じライブラリーから特定される必要もなく、または、同じ選別方法を使って特定される必要もない。関連抗体が標的抗原に対し1次抗体より活性が低く、関連抗体が親和性成熟されている抗体に対し配列の類似性を示すことが、必要なことの全てである。便宜上、関連抗体は、通常、1次抗体の特定に使用されたのと同じ選別方法およびアッセイシステムを使って特定される。従って、上述のセクションC.1に記載のいずれかの抗体ライブラリーを含むいずれの抗体生成方法も関連抗体の特定に使用可能である。代表的抗体ライブラリーは、上述および本明細書の実施例のアドレス指定できるコンビナトリアル抗体ライブラリーである。前に記載のように、アドレス指定できるコンビナトリアル抗体ライブラリーは、標的抗原に対する結合に関するライブラリー全メンバーの構造−活性関連性についての即時知識取得の利点を有する。従って、「Hit」抗体の場合と同様に、関連抗体の配列および活性を、直ちに知ることができる。従って、標的抗原に対する選別アッセイの完了時に、「Hit」および関連抗体の間の配列類似性の評価を、ほぼ即座に確定可能である。
通常、関連抗体は、1次抗体に比較して、標的抗原に対し1次抗体の80%未満の活性、通常、5%〜80%の活性、さらに特に5%〜50%の活性、例えば、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%またはそれ未満の活性を示す抗体である。例えば、関連抗体は、「Hit」抗体が結合する標的抗体に対し結合しないか、または無視できる程度にしか結合しない抗体であってもよい(例えば、結合レベルは、アッセイに使われる陰性対照の結合と同じまたは類似の程度である)。従って、関連抗体は、選択された1次抗体が特異的に結合する標的抗原に対し特異的に結合しないために、最初に特定可能である。例えば、関連抗体は、10−4Mまたはそれ超、例えば、10−4M、10−3M、10−2M、またはそれ超の結合親和性を示してもよい。1次抗体の活性(例えば、結合および/または結合親和性)の関連抗体との比較では、同じ標的抗原が使用され、活性は、同じまたは類似のアッセイにより評価される。さらに、抗体の構造も同じである(例えば、完全長抗体またはその断片、例えば、Fab)場合のような、対応する型の抗体が比較される。
その全体配列(重鎖および軽鎖)にわたり、またはその可変重鎖または可変軽鎖の全域で1次抗体に配列類似性または同一性を示すため、本方法実施をするために選択された関連抗体は1次抗体に関連している。例えば、関連抗体の可変重鎖および/または可変軽鎖のアミノ酸配列は、1次抗体のアミノ酸配列に少なくとも50%同一、通常少なくとも75%同等の配列、例えば、1次抗体に対し、正確にまたは約50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列、典型的には、少なくとも正確にまたは約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%配列類似性である。関連抗体は、可変重鎖および軽鎖の両方で1次抗体と同じではないが、1次抗体の可変重鎖または軽鎖の一方と同じで、もう一方の鎖で100%未満の配列類似性であってもよい。従って、本方法の実施のために、本方法で使われる関連抗体の可変部分は、特定された「Hit」抗体に対し同一性が100%未満であることは理解されよう。例えば、多くのケースで、関連抗体は、1次抗体の可変軽鎖配列に対し100%の配列同一性を示すが、1次抗体の可変重鎖配列に対しては、100%未満の配列類似性を示し、それでも必要な配列類似性を示す抗体である可能性がある。このケースでは、関連抗体の可変重鎖配列のみが本明細書記載の方法の実施に使われる。本明細書の他のところで記載されているように、当業者に既知の配列類似性を測定するいずれの方法も使用可能であり、これに限定されないが、マニュアルによる方法または利用可能なプログラム、例えば、BLASTの使用が含まれる。
例えば、関連抗体は、1次抗体の可変重鎖と同じ可変重鎖、および1次抗体に対し配列類似性を示す可変軽鎖を含んでもよい。別の例では、関連抗体の可変重鎖も可変軽鎖も1次抗体のアミノ酸配列と同じではないが、両方とも1次抗体に対する配列類似性を示す。従って、一部の例では、1次抗体の可変重鎖の親和性成熟法で使われる関連抗体は、1次抗体の可変軽鎖の親和性成熟法で使われる関連抗体とは異なる。従って、本明細書の方法の実施のために、1つまたは複数の関連抗体が選択されうる。例えば、実施例で示したように、可変軽鎖の親和性成熟のために3つの関連抗体が選択さる。いずれかの例では、1次抗体の対応する重鎖または軽鎖に対し配列類似性を示す関連抗体の可変鎖(重鎖または軽鎖)が、異なる1次抗体中の1つまたは複数の領域を特定する方法に使用され、従って、1次抗体および関連抗体の異なる結合能力の原因である。このような1つまたは複数の領域は、以下でさらに説明されるように、本明細書の方法における親和性成熟および変異誘発のための標的となる。
通常、1次抗体および関連抗体の可変重鎖および/または軽鎖は、同じまたは関連する抗体可変領域生殖系列セグメント、例えば、同じ遺伝子ファミリー、由来である。例えば、関連抗体は、1つまたは複数の可変重鎖VH、DHおよび/またはJH生殖系列セグメントまたは可変軽鎖VκおよびJκもしくはVλおよびJλ生殖系列セグメントを含む核酸配列によりコードされる。この生殖系列セグメントは、1次抗体をコードする核酸配列に含まれるセグメントと同じではなく、このセグメントと同じ遺伝子ファミリーに属する。通常、関連抗体は、生殖系列セグメントの1、2、3、4、または5つが異なるまたは関連していることを除いて、1次抗体をコードする核酸配列と同じ生殖系列セグメントを含む核酸配列によりコードされる。例えば、関連抗体は、同じ可変重鎖VHおよびDH生殖系列セグメントまたは同じ可変軽鎖VκもしくはVλ生殖系列セグメントを含むが異なるまたは関連するJHおよびJκもしくはJλ生殖系列セグメントを含むVHまたはVL鎖をコードする核酸配列によってコードされる。実施例に例示されるように、選択された「Hit」の可変重鎖配列をコードする核酸配列と比較して、同じ可変重鎖VHおよびJH生殖系列セグメント(すなわちVH5−51およびIGHJ4*01)を含むが、異なるDH生殖系列セグメント(すなわち、IGHD6−25*01対IGHD5−51*01>3)を有する核酸配列によりコードされているので、関連抗体の可変重鎖が、本明細書の方法の実施のために選択された。関連抗体の可変重鎖の配列は、1次抗体に対し98%の配列類似性を示す。別の例では、選択された1次抗体の可変重鎖配列をコードする核酸配列に比べて、同じVH生殖系列セグメント(すなわち、VH1−46)を含むが、異なるJH生殖系列セグメント(すなわち、IGHJ1*01対IGHJ4*01)、および関連DH生殖系列セグメント(すなわち、同じ遺伝子ファミリーIGHD6を共有するIGHD6−6*01対IGHD6−13*01)を含む核酸配列によりコードされているので、関連抗体の可変重鎖が本明細書の方法の実施のために、選択された。関連抗体の可変重鎖の配列は、1次抗体に対し95%配列の類似性を示す。
当業者は、抗体の生殖系列セグメント配列を知っており、精通していて、抗体重鎖または軽鎖をコードする生殖系列セグメント配列を特定することができる。代表的抗体生殖系列ソースには、これに限定されないが、米国・国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のデータベース、international ImMunoGeneTics information system(登録商標)(IMGT)、KabatデータベースおよびTomlinson’s VBaseデータベースが含まれる(Lefranc(2003)Nucleic Acids Res.、31:307−310;Martin et al.、抗体エンジニアリング用バイオインフォマティクスツール(治療抗体ハンドブック)、Wiley−VCH(2007)、pp.104−107)。また、生殖系列セグメントは、非ヒトに関しても既知である。例えば、代表的マウス生殖系列データベースは、ibt.unam.mx/vir/v_mice.htmlで入手可能なABGデータベースである。生殖系列セグメント配列は、種々の命名法により知られ、例えば、IMGT遺伝子名およびヒト遺伝子解析機構(HUGO)命名委員会により承認された定義がある(Lefranc、M.−P.Exp Clin Immunogenet、18:100−116(2001)、Zachau、H.G.Immunologist、4:49−54(1996)、Lefranc、M.−P.Exp Clin Immunogenet、18:161−174(2000)、Kawasaki et al、Genome Res、7:250−261(1997)、Lefranc、M.−P.Exp Clin Immunogenet、18:242−254(2001))。どの所望の命名規則も抗体生殖系列セグメントを特定するのに使用可能である。当業者なら、いずれかの所望の命名規則を用いて核酸配列を特定することができる。例えば、IMGT命名法では、最初の3つの文字は、座位(IGH、IGKまたはIGL)を示し、4番目の文字は、遺伝子を(例えば、V遺伝子をVで、D遺伝子をDで、J遺伝子をJで)表し、5番目の位置は、サブグループの数を示し、ハイフンに続いて、遺伝子分類番号を示す。対立遺伝子に対しては、IMGT名は、アステリスクの後に2つの図番号を入れる。米国特許仮出願第61/198、764号および同61/211、204号には、代表的ヒト重鎖および軽鎖(カッパおよびラムダ)生殖系列セグメント配列が説明されている。
c.1次抗体および関連抗体のアミノ酸配列の比較
1次抗体が選択され、関連抗体または抗体が関連可変重鎖および/または可変軽鎖を有することが特定されるとすぐに、抗体の配列比較が行われる。親または1次抗体の可変重鎖および/または可変軽鎖と関連抗体のアミノ酸配列の比較により、1次抗体および関連抗体の間の異なる領域の特定が可能となる。このような1つまたは複数の領域が、親和性成熟および変異誘発の標的となる。
この方法では、親1次抗体のVH鎖および/またはVL鎖のアミノ酸配列が、少なくとも1つの関連抗体のそれぞれのVH鎖またはVL鎖に整列され、1次抗体および関連抗体間で異なる、または変わっているポリペプチドの領域を特定する。抗体のアミノ酸配列は、当技術分野で通常知られているいずれかの方法で整列させることができる。この方法には、マニュアル配列比較、コンピュータ支援配列アラインメント、およびこれらの組み合わせ、が含まれる。配列アラインメントを行う多くのアルゴリズム(通常、コンピュータで実行される)が広く利用可能である、または専門家により作製可能である。これらの方法には、例えば、SmithとWaterman(Adv.Appl.Math.2:482(1981))の局地的相同性アルゴリズム;NeedlemanとWunsch(J.Mol.Biol.48:443(1970))の相同性配列比較アルゴリズム;PearsonとLipman(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85:2444(1988))の類似性探索方法;および/またはこれらのアルゴリズムの計算機実装による方法(例えば、Wisconsin Genetics Software Package Release7.0、(遺伝学コンピュータグループ、575 Science Dr.、Madison、Wis.)中のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)が含まれる。
例えば、アルゴリズムを使って配列同一性(および配列類似性)分析を行うためのソフトウェアが、Altschul et al.、(1990)J.Mol.Biol.215:403−410、に記載されている。このソフトウェアは、公的に、例えば、国立バイオテクノロジー情報センターのworld wide web:ncbi.nlm.nih.gov経由で、入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させた場合、ある正の値の閾値Tに一致するか、またはこれを満たす問い合わせ配列中の長さWの短いワードを特定することにより、高スコアリング配列対(HSP)を特定することを含む。Tは、近傍ワードスコア閾値(neighborhood word score threshold)と呼ばれる。これらの最初の近傍ワードヒットは、これらを含むさらに長いHSPを見付けるための探索開始用シードとして役立つ。次に、累積的配列比較スコアが増加している間は、ワードヒットを各配列に沿って両方向に延長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列に対しては、パラメータM(マッチ残基対に対するリワードスコア(reward score);常に>0)およびN(ミスマッチの残基に対するペナルティスコア(penalty score);常に<0)を使って計算される。アミノ酸配列に対しては、スコアリング行列を使って、累積スコアを計算する。ワードヒットの各方向への延長は、次の場合に停止される:累積配列比較スコアがその最大到達値から量Xだけ低下する場合;1つまたは複数の負のスコアリング残基配列比較値の蓄積により、累積スコアがゼロ以下になる場合;またはどちらかの配列の末端に至った場合。BLASTアルゴリズムパラメータW、T、およびXは、配列比較の感度と速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列用)は、ワード長(W):11、期待数(E):10、カットオフ値:100、M=5、N=-4、および両鎖の比較、を規定値としてとして使用する。アミノ酸配列に対しては、BLASTP(BLAST Protein)プログラムは、ワード長(W):3、期待数(E):10、およびBLOSUM62スコアリング行列(Henikoff and Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915、参照)を規定値として使用する。
さらに、BLASTアルゴリズムは、2つの配列間の類似性の統計的分析を行う(例えば、Karlin and Altschul(1993)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90:5873−5787、参照)。BLASTアルゴリズムにより得られる1つの類似性の尺度は、最小和確率(P(N))であり、これは2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間にマッチングが偶然に発生する確率の指標を提供する。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較において、最小和確率が約0.1未満、または約0.01未満、または約0.001未満でさえある場合は、核酸は、参照配列に類似である(また、従ってこの文脈では、相同である)と見なされる。
複数のDNA、またはアミノ酸の配列アラインメントに適したアルゴリズムのさらなる例は、CLUSTALWプログラムである(Thompson、J.D.et al.、(1994)Nucl.Acids.Res.22:4673−4680)。CLUSTALWは、配列グループ間の複数の対での比較を行い、それらを集めて相同性に基づく複数の配列比較を構築する。ギャップ開口およびギャップ延長ペナルティは、例えば、それぞれ、10と0.05であってもよい。アミノ酸配列比較に対しては、BLOSUMアルゴリズムがタンパク質重み行列として使用可能である。例えば、Henikoff and Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915−10919、を参照。
抗体のアミノ酸配列を配列比較することにより、当業者なら、1次抗体および関連抗体のアミノ酸配列間の異なる領域を特定することができる。抗体間で異なる領域は、VH鎖および/またはVL鎖のどの部分でも発生する可能性がある。通常、異なるまたは変化している領域は、CDRまたはフレームワーク(FR)領域、例えば、CDR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3および/またはFR4、および特に、CDR、例えば、CDR3で、発生する。当業者は、KabatまたはChothiaナンバリングに基づいてCDRおよびFRを認識し、特定することができる(例えば、Kabat、E.A.et al.(1991)免疫学的関連タンパク質の配列、第5版、米国保健福祉省、NIH Publication No.91−3242、およびChothia、C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901−917、を参照)。例えば、Kabatナンバリングに基づくと、CDR−LIは、残基L24〜L34に相当する;CDR−L2は、残基L50〜L56に相当する;CDR−L3は、残基L89〜L97に相当する;CDR−H1は、残基H31〜H35、35aまたは35bに相当する(長さに応じて);CDR−H2は、残基H50〜H65に相当する;ならびにCDR−H3は、残基H95〜H102に相当する。例えば、Kabatナンバリングに基づくと、FR−L1は、残基L1〜L23に相当する;FR−L2は、残基L35〜L49に相当する;FR−L3は、残基L57〜L88に相当する;FR−L4は、残基L98〜L109に相当する;FR−H1は、残基H1〜H30に相当する;FR−H2は、残基H36〜H49に相当する;FR−H3は、残基H66〜H94に相当する;およびFR−H4は、残基H103〜H113に相当する。
1次抗体と関連抗体の可変重鎖および/または可変軽鎖アミノ酸配列の対応するアミノ酸位置で少なくとも1つの酸の差異または変化を含むため、異なる領域は標的領域として特定される。変異位置には、関連抗体ポリペプチドに比較して、1次抗体ポリペプチドのアミノ酸欠失、追加または置換が含まれる。本明細書の目的のために、特定された領域は、少なくとも1つの1次抗体の可変鎖の領域中に、関連抗体に比較して、1つまたは複数の、通常は2つ以上の、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上の変異アミノ酸位置を含む。一部の例では、1つまたは複数の領域、例えば、1、2、3、4またはそれ以上の領域が、1次抗体と関連抗体の間で、少なくとも1つの変異アミノ酸位置を含むことが特定できる。いずれか1つまたは複数の領域が変異誘発による親和性成熟の標的となりうる。通常、CDRが変異誘発の標的とされる。
d.特定された領域の変異導入
本方法では、特定された標的領域内の標的残基の変異誘発が行われる。例えば、1次抗体の重鎖および/または軽鎖中の選択された標的領域の一部の、または全部のアミノ酸残基が変異導入される。例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25またはそれ以上のアミノ酸残基が変異導入される。変異誘発のために選択された各標的アミノ酸残基が、全19の他のアミノ酸残基に、または制限されたそのサブセットに変異されうる。
一例では、特定された標的領域、例えば、CDR3、中の全アミノ酸残基が変異誘発の対象である。別の例では、選択された標的領域中のアミノ酸残基のサブセットが変異誘発の対象である。例えば、1次抗体と関連抗体の間で異なっている位置のアミノ酸残基のみが変異誘発の対象である。別の例では、1次抗体と関連抗体の間で同じである位置のアミノ酸残基のみが変異誘発の対象である。さらなる例では、系統的変異導入を、任意選択で行い、標的抗原に対する結合を強める残基を特定する。このような例では、以下で考察するように、「UP」変異として特定された残基のみがさらなる飽和変異誘発の対象となる。
例えば、通常、CDRは3〜25のアミノ酸残基を含むことができる。CDR内の全部またはサブセットのアミノ酸が、変異誘発の標的とされうる、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25のアミノ酸残基が変異誘発の標的とされうる。一部の例では、CDR内の全アミノ酸が変異誘発のために選択される。他の例では、CDR内のサブセットのアミノ酸のみが変異誘発のために選択される。一部の例では、CDR内の1つのアミノ酸残基のみが変異誘発のために選択される。別の例では、2つ以上のアミノ酸が変異誘発のために選択される。
さらなる変異誘発のために選択されたアミノ酸残基は、当業者に既知の任意の方法で改変することができる。アミノ酸残基は、合理的に改変でき、またはランダム変異誘発により改変できる。これは、コードしているDNAを改変することによって達成できる。当業者なら変異誘発方法をよく知っている。変異誘発方法には、これに限定されないが、部位媒介変異誘発、PCR変異誘発、カセット変異導入、部位特異的変異誘発、ランダム点変異誘発、ウラシル含有テンプレートを使った変異誘発、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾DNA変異誘発、ギャップ二重鎖DNAを使った変異誘発、ポイントミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使った変異誘発、制限選択と制限精製、欠失変異誘発、全遺伝子合成による変異誘発、二重鎖切断修復、および他の多くの当業者に既知の方法、が含まれる。例えば、Arnold(1993)Current Opinionin Biotechnology 4:450−455;Bass et al.、(1988)Science 242:240−245;Botstein and Shortle(1985)Science 229:1193−1201;Carter et al.、(1985)Nucl.AcidsRes.13:4431−4443;Carter(1986)Biochem.J.237:1−7;Carter(1987)Methods in Enzymol.154:382−403;Dale et al.、(1996)Methods Mol.Biol.57:369−374;Eghtedarzadeh and Henikoff(1986)Nucl.Acids Res.14:5115;Fritz et al.、(1988)Nucl.Acids Res.16:6987−6999;Grundstrom et al.、(1985)Nucl.Acids Res.13:3305−3316;Kunkel(1987)「オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発の効率」(核酸と分子生物学)(Eckstein、F.and Lilley、D.M.J.eds.、Springer Verlag、Berlin);Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488−492;Kunkel et al.、(1987)Methods in Enzymol.154、367−382;Kramer et al.、(1984)Nucl.Acids Res.12:9441−9456;Kramer and Fritz(1987)Methods in Enzymol.154:350−367;Kramer et al.、(1984)Cell38:879−887;Kramer et al.、(1988)Nucl.Acids Res.16:7207;Ling et al.、(1997)Anal Biochem.254(2):157−178;Lorimer and Pastan(1995)Nucl.Acids Res.23、3067−8;Mandecki(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:7177−7181;Nakamaye and Eckstein(1986)Nucl.Acids Res.14:9679−9698;Nambiar et al.、(1984)Science 223:1299−1301;Sakamar and Khorana(1988)Nucl.Acids Res.14:6361−6372;Sayers et al.、(1988)Nucl.Acids Res.16:791−802;Sayers et al.、(1988)Nucl.Acids Res.16:803−814;Sieber et al.、(2001)Nature Biotechnology 19:456−460;Smith(1985)Ann.Rev.Genet.19:423−462;Stemmer(1994)Nature 370、389−91;Taylor et al.、(1985)Nucl.Acids Res.13:8749−8764;Taylor et al.、(1985)Nucl.Acids Res.13:8765−8787;Wells et al.、(1986)Phil.Trans.R.Soc.Lond.A317:415−423;Wells et al.(1985)Gene 34:315−323;Zoller and Smith(1982)Nucleic Acids Res.10:6487−6500;Zoller and Smith(1983)Methods in Enzymol.100:468−500;およびZoller and Smith(1987)Methods in Enzymol.154:329−350、を参照。一部の例では、アミノ酸残基はNNK変異誘発により改変される。別の例では、アミノ酸残基は、カセット変異導入により改変される。
一部の例では、選択標的アミノ酸残基は、各変異誘発が1つの標的位置のみでの単一アミノ酸残基の置換により行われるように、また、生じたそれぞれの個別変異体がそれぞれの単一変異誘発反応の単一の生成物であるように、個々に変異誘発されうる。単一アミノ酸置換変異誘発反応は、選択領域中のそれぞれの標的位置で選択されたアミノ酸のそれぞれに対し繰り返すことができる。従って、複数の変異タンパク質分子が産生され、それにより各変異タンパク質は、1つの標的位置のみに単一アミノ酸置換を含む。変異誘発は、アドレス指定できるアレイ中でも実行でき、それにより、各変異タンパク質の同一性が解る。例えば、部位特異的変異誘発方法は、個別に変異タンパク質を生成するのに使用可能である。
他の例では、可変重鎖または軽鎖中の異的標的位置にランダムアミノ酸を有する変異誘発された抗体を生成できる。通常、選択された標的アミノ酸残基は同時に変異誘発可能で、すなわち、1つまたは複数のアミノ酸残基が一緒に変異誘発される。例えば、標的アミノ酸が、20アミノ酸の全部(またはグループ)により置換されるように、ランダム変異誘発法を使用可能である。異なるアミノ酸位置での単一または複数の置換が同じ分子に、同時に生成される。この手法では、アミノ酸位置もアミノ酸タイプも制約されない;また、あらゆる可能な変異が生成し、試験される。複数の置換が同時に同じ分子上でランダムに発生することもありうる。得られた変異分子の収集は、下記に記載のように、活性により評価可能で、結合を示す分子が特定され、配列決定される。
ランダム変異誘発法では、配列中に無作為化を導入するための任意の既知の方法が利用可能であることが意図されている。例えば、エラープローンPCRによれば、対象ポリペプチドをコードする核酸配列中にランダム変異を導入することができる(例えば、Hawkinsetal.、J.Mol.Biol.、(1992)226(3):889−96、参照)。簡単に述べれば、当業者なら成し遂げることができるように、PCRを複製の正確さを甘くした条件で行い、その結果、配列中にランダム変異を導入する。
1つまたは複数の標的アミノ酸位置に無作為化を導入する代表的な方法は、デオキシリボヌクレオチド「ドーピング戦略(doping strategy)」の使用で、これは、全20アミノ酸の導入をカバーする一方で、コード化停止コドンの数を最小化する。例えば、NNK変異誘発を採用でき、ここでNは、A、C、G、またはT(名目上、等モル)、およびKはGまたはT(名目上、等モル)でありうる。他の例では、NNS変異誘発を採用可能で、ここで、SはGまたはCでありうる。従って、NNKまたはNNSは、(i)全アミノ酸をコード、(ii)1つの停止コドンのみをコード、および(iii)コドンの偏りの範囲を6:1から3:1に減らす。NNKモチーフから生じる32の可能なコドンがある:各12のアミノ酸に対し1つのコドン、各5のアミノ酸に対し2つのコドン、各3のアミノ酸に対し3つのコドン、そして3つの停止コドンの内の1つのコドンのみ。他の選択対象には、これに限定されないが:全ての可能なアミノ酸および全ストップコドンを提供可能なNNN;全ストップコドンを除き、それでも20アミノ酸の内の14をカバーするNNY;さらに20アミノ酸の内の14をカバーするNNR、が挙げられる。コドン中の3番目のヌクレオチド位置は、既知の縮重混合物のいずれかを使ってカスタム設計可能である。しかし、NNK、NNN、NNY、NNR、NNSのグループは、大抵の頻繁に使われるドーピング戦略および本明細書で使われるものをカバーしている。
変異誘発されたタンパク質は、発現し、標的抗原に対する活性により評価される。例えば、さらに本明細書で以下のセクションE.1で記載のような、活性を評価するための当業者に既知のいずれの方法も使用可能である。例えば、代表的結合アッセイには、これに限定されないが、イムノアッセイ、例えば、以下に示す技術を使った競合的および非競合的アッセイシステムが含まれる:ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着測定法)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、メソ・スケール・ディスカバリー電気化学発光測定法(MSD、Gaithersburg、Maryland)、免疫沈降アッセイ、ELISPOT、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定分析、蛍光イムノアッセイ、およびタンパク質Aイムノアッセイ。このようなアッセイは、日常的に使われ、当技術分野でよく知られている(例えば、、Ausubel et al.、eds、1994、「分子生物学における最新プロトコル)、Vol.1、John Wiley & Sons、Inc.、New York、を参照。これらの文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる)。例えば、本明細書で提供された方法では、標的抗原に対する抗体の結合は、ECL結合アッセイを使って測定される。別の例では、結合はELISAにより測定される。
親1次抗体に比べて、標的抗原に対する改善されたまたは強化された結合を示す変異抗体が特定される。特定された変異抗体の可変重鎖または軽鎖中のアミノ酸変異が特定できる。以下で考察するように、特定された変異抗体に対しさらなる変異誘発および繰り返しの選別を行い、標的抗原に対する活性をさらに最適化できる。例えば、標的抗原に対し改善された結合を示すとして特定された親1次抗体の全ての変異抗体の変異を測定可能である。全てのまたはサブセットの特定されたアミノ酸変異を組み合わせて組み合わせ変異抗体を生成できる。
2.系統的変異導入によるSAR
系統的変異導入は、タンパク質残基の機能的役割を測定するための、簡便な、広く使われている技術である。系統的変異導入は、本明細書の親和性成熟の方法に使用し、1次抗体のSARを測定することが可能である。系統的変異導入は、関連抗体と比較しないで1次抗体に対して行うことができる。他の例では、系統的変異導入は、任意選択で、変異導入するアミノ酸残基をさらに合理的に特定するために、上記標的領域の変異誘発の前に行われる。
本明細書の系統的変異導入方法では、抗体の可変重鎖および/または可変軽鎖の完全長全体の全ての残基がスキャンニングアミノ酸により置換される。あるいは、可変重鎖または可変軽鎖の領域の全ての残基がスキャンニングアミノ酸により置換される。例えば、少なくとも1つのCDR(例えば、CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2またはCDRL3)がスキャンニングのために選択される。スキャンニングアミノ酸は、任意のアミノ酸でよいが、通常は、アラニン、トレオニン、プロリンまたはグリシンである。アミノ酸置換は、通常、部位特異的変異誘発により行われる。アラニンは、[ベータ]炭素の先の側鎖を削除し、それでも、主鎖高次構造を変えず(グリシンまたはプロリンと同様に)、また、極度の静電的または立体効果を与えないために、通常、アラニンは好まれる置換残基である。一般的に、変異誘発のために選択された全アミノ酸残基が、スキャンされた(例えば、変異された)同じアミノ酸残基である。他のスキャンニングアミノ酸残基を使う必要が生じることがよくある。例えば、標的アミノ酸残基がすでにアラニンである場合は、別のアミノ酸残基、例えば、トレオニン、プロリンまたはグリシンが使用可能である。
系統的変異導入を行う場合は、完全長ポリペプチド全域または選択領域中の全またはサブセットのアミノ酸が系統的変異導入の標的であり、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれ以上のアミノ酸残基が系統的変異導入を受ける。関連抗体との比較に加えて、系統的変異導入が行われる例では、標的領域中の全アミノ酸残基または標的領域中のサブセットのアミノ酸残基がスキャンされうる。一例では、1次抗体と関連抗体の間で異なるアミノ酸残基のみが、系統的変異導入の標的とされる。一般的に、標的領域中の全アミノ酸残基が系統的変異導入を受ける。上述および以下のセクションEで記載のように、変異誘発されたタンパク質は、発現し、標的抗原に対する活性により評価される。
スキャンニング後、スキャンされた(例えば、変異された)抗体は、活性により選別して、さらなる変異のためにアミノ酸残基を特定する。通常、大抵の先行技術の系統的変異導入方法は、対象タンパク質の活性をノックダウンするか、または低減するスキャン位置の特定を含むか、または位置の特定に限定されている。論拠は、これらの残基は、いずれにしろ活性に対し重大であるということである。しかし、本明細書の方法の実施の目的のために、スキャンニング後のさらなる変異誘発のために、「Up」変異体である残基が選択される。これらは、親抗体に比較してスキャンアミノ酸を含むように変異を受けた場合、活性の保持または増加を示す抗体である。さらに、接触CDR中のスキャン置換による残基のみが選択される。従って、本明細書の代表的実施形態では、接触CDR中のスキャン置換による残基、および活性に影響しない、または改善しない残基のみが選択され、それぞれに、他のアミノ酸への変異をさらに受ける。
この手法の利点は、本明細書の親和性成熟のために選択された抗体は、通常、マイクロモルまたは高ナノモルレベルの親和性を示すことである。このような親和性は、抗体が標的抗原に対し低い相互作用を示すことを意味する。このことは、その機能活性に対しすでに高度に進化している通常の手法で親和性成熟された多くのタンパク質とは対照的である。従って、標的抗原に対し弱い活性を示す、親和性成熟のために選択された抗体に対して、弱い相互作用を改善するか、または最適化するさらなる機会が生ずる。従って、本明細書の方法を実施するに際し、抗体の活性の増加または保持を生ずるスキャン残基が、さらなる変異誘発のために選択される。これは、新しい相互作用を起こさせ、例えば、親和性成熟の前には存在しなかった新しい接触残基をつくりだす。
従って、本明細書の系統的変異導入方法では、選択アミノ酸が系統的変異導入を受け、「Up」変異体(すなわち、活性の保持または増加を示す変異体)であるアミノ酸残基が特定される。さらなる変異誘発が、親抗体に比較して標的抗原に対する活性の保持または増加を示すスキャンアミノ酸位置のみで行われる。標的抗原に対し活性を維持する抗体は、結合の幾分の増加または減少を示しうるが、通常は、スキャン変異を含まない1次抗体と同じ結合を示し、例えば、少なくとも75%の結合活性、例えば、75%〜120%の結合、例えば、75%、80%、85%、90%、95%、100%、105%、110%または115%の結合、を示す。標的抗原に対し活性増加を示す抗体は、通常は、115%を超える活性、例えば、変異を含まない1次抗体よりも115%、120%、130%、140%、150%、200%またはそれ以上超の活性を示す。従って、系統的変異導入は、標的領域中のさらに変異誘発される標的アミノ酸残基のサブセットを制限するために採用可能である。上記セクションC.4で記載のように、特定されるとすぐに、変異誘発が、全またはサブセットのアミノ酸残基上で行われる。上述および以下のセクションEで記載のように、さらに変異誘発された抗体は、発現し、標的抗原に対する活性により評価される。1次抗体に比較して活性の改善または最適化を示す抗体が選択される。
3.さらなる最適化
本明細書で提供される親和性成熟方法は、さらなる抗体の最適化のために繰り返し行うことができる。追加して、または、代わりに、可変重鎖または軽鎖内で標的抗原に対し活性の改善または最適化を生ずる全てのまたはサブセットのアミノ酸改変が選択され、組み合わされ、活性によりさらに評価されうる。これらの中間抗体もまた、本明細書の親和性成熟方法を使った、さらなる変異誘発のためのテンプレートとして使用可能である。一部の例では、1つまたは複数のアミノ酸改変を組み込んだ可変重鎖または軽鎖は、さらなる活性のための変異誘発と最適化用のテンプレートとして使用可能である。さらに、さらなる抗体の領域が変異誘発可能である。
本方法は、1次抗体と関連抗体のアミノ酸配列比較に基づく変異誘発の対象として最初に選択されなかった可変重鎖または軽鎖の領域の最適化を提供する。さらなる変異誘発のために選択される追加の領域は、可変重鎖または軽鎖のいずれの部分でもありうる。例えば、追加の領域には、CDRまたはフレームワーク領域を含むこともできる。通常、CDR、例えば、CDR1、CDR2および/またはCDR3が、選択され、標的とされる。いずれか1つまたは複数の領域が変異誘発による親和性成熟のために標的化可能である。下記の実施例9と12で例示するように、追加の変異誘発のためにCDRH1およびCDRH2が選択される。
可変重鎖または軽鎖の追加の領域は、同時に、さらなる変異誘発を受けることができ、あるいは、繰り返し変異誘発を受けることができる。例えば、抗体の活性を最適化する本明細書のさらなる変異誘発による1つの領域の変異が最初に特定され、第2の領域の最適化がそれに続く。変異誘発するための選択された標的領域内のアミノ酸残基の選択は、この方法を実施する人が決定することができる。一部の例では、その領域中の全てのアミノ酸が変異誘発の標的となる。他の例では、その領域中のアミノ酸のサブセットのみが変異誘発の標的となる。さらなる例では、系統的変異導入を行い、標的抗原に対する活性を高める、または保持する残基が特定される。このような例では、結合親和性を高める、または影響を与えない残基のみがさらに変異誘発され、標的抗原に対する結合親和性を高める変異が特定される。通常、変異誘発は、重鎖および/または軽鎖の片方または両方に対し、他とは独立的に行われる。さらなる変異誘発のために選択されているアミノ酸残基は、当業者には既知のいずれの方法によっても改変可能である。変異誘発されたタンパク質は、発現し、標的抗原に対する結合により評価される。代表的結合アッセイは、下記のセクションE.1で記載される。
上記セクションC.4およびC.5に記載のように、さらなる変異誘発のために選択された領域中のアミノ酸残基は、当業者に既知のいずれかの方法により改変可能である。一部の例では、選択アミノ酸は、さらなる変異誘発のための「Up」変異を特定するために、系統的変異導入を受ける。他の例では、選択アミノ酸は、ランダムに変異誘発され、例えば、アミノ酸残基が飽和変異誘発および/またはカセット変異導入により改変される。セクションFおよびEで記載のように、変異誘発されたタンパク質は発現し、標的抗原に対する活性により評価される。標的抗原に対する活性を増加させるアミノ酸変異を含む抗体が特定される。
また、組み合わせ変異体も産生できる。本明細書で提供される方法では、標的抗原に対する抗体の活性増加を生ずるアミノ酸変異が組み合わされて、複数のアミノ酸改変を有する可変重鎖または軽鎖を生成する。通常、組み合わせ変異体は、可変重鎖および/または軽鎖当たり、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上の変異を有する。一部の例では、組み合わせ変異体は、2つのアミノ酸改変を含む。他の例では、組み合わせ変異体は、3つ以上のアミノ酸改変を含む。下記実施例9で例示するように、4アミノ酸変異を含む可変重鎖が産生される。
さらに、可変重鎖または軽鎖内に複数のアミノ酸改変を含む中間抗体が、この方法のいずれかのステップで生成しうる。中間抗体の可変重鎖および/または軽鎖、すなわち、複数の前に特定されたアミノ酸改変を含むものは、さらなる変異誘発と親和性成熟のための「テンプレート」として使用可能である。
さらに、本明細書の方法は、いずれかの改変軽鎖を有するいずれかの改変重鎖の対形成を提供し、それにより重鎖および軽鎖の両方が変異を含む中間体または親和性成熟抗体を生成する。変異重鎖および軽鎖は、この方法の任意のステップで対形成し、発現し、標的抗原に対する結合により評価されうる。従って、さらなる抗体の最適化が達成できる。
本明細書の方法のさらなる最適化のいずれのステップでも、セクションEに記載のように、親和性成熟抗体は、活性によりさらに評価可能である。
a.相補性決定領域
一部の例では、領域がさらなる変異誘発のために選択される。通常、領域はCDR、例えば、可変重鎖または軽鎖のCDR1、CDR2および/またはCDR3である。可変重鎖または軽鎖CDR内のアミノ酸残基は、当業者により特定可能である。CDRは、次に示すものを含む、いずれの標準的定義によっても特定される:Kabat(例えば、Kabat et al.(1991)免疫学的関連タンパク質の配列、第5版、米国保健福祉省、NIH Publication No.91−3242、参照);Chothia(例えば、Chothia & Lesk、(1987)J Mol Biol.196(4):901−17;Al−Lazikani et al.、(1997)J Mol Biol.273(4):927−48、参照);Abm(例えば、Martin et al.、(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86:9268−9272、参照);または結晶構造データに基づく接触残基(例えば、MacCalllum et al.、(1996)J.Mol.Biol.262、732−745、参照)。Kabatナンバリングに基づき定義された、重鎖および軽鎖CDR内に含有されたアミノ酸は、上記セクションC.3に記載されている。
通常、CDRは3〜25残基を含み、その全てまたは一部は、さらなる変異誘発のために標的化可能である。例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25アミノ酸残基を変異誘発のための標的とすることができる。実施例9に例示したように、選択されたCDRH1残基のみが変異誘発され、一方、実施例10では、CDRL2内の全残基が変異誘発される。
上記セクションC.4および下記セクションE.とF.で記載のように、選択されたアミノ酸は変異誘発を受け、抗体は発現して、標的抗原に対する活性によりアッセイされる。
b.フレームワーク領域
一部の例では、さらなる変異誘発のために選択された領域は、フレームワーク領域の一部、例えば、可変重鎖または軽鎖のFR1、FR2、FR3および/またはFR4、である。CDRの場合のように、フレームワーク領域が、Kabat、Chothia、Abmまたは接触残基のナンバリングに従って、いずれかの標準的な定義により特定される。重鎖および軽鎖可変領域内のフレームワーク領域を構成するアミノ酸は、Kabatナンバリングに基づいて、上記セクションC.3に記載されている。典型的には、フレームワーク領域は、11〜32のアミノ酸を含む。全てのまたは一部のフレームワーク領域は、変異誘発の標的化が可能で、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31または32アミノ酸が完全または部分飽和変異誘発を受けることができる。フレームワーク領域の選択された領域は、1つまたは複数のアミノ酸残基を含みうる。一部の例では、1つのアミノ酸残基のみが変異誘発される。他の例では、2つ以上のアミノ酸残基が変異誘発される。選択されたアミノ酸残基は、別々に変異誘発可能であり、あるいは、選択されたアミノ酸残基は、同時に、すなわち、1つまたは複数のアミノ酸残基が一緒に変異誘発されうる。例えば、二重変異体が生じ、標的抗原に対する結合能力によりアッセイされる。
上記セクションC.4および下記セクションE.とFに記載のように、選択されたアミノ酸は、変異誘発を受け、抗体は発現して、標的抗原に対する活性によりアッセイされる。
c.生殖系列スワッピング
一部の例では、さらなる変異誘発のために選択される領域は、生殖系列セグメント、すなわち、可変重鎖V、DもしくはJセグメント、または可変カッパもしくはラムダ軽鎖VもしくはJセグメント、例えば、VH、DH、JH、Vκ、Vλ、Jκ、およびJλである。可変重鎖では、生殖系列セグメントVHはCDR1およびCDR2内のアミノ酸を含み、一方、生殖系列セグメントDHおよびJHはCDR3内のアミノ酸残基を含む。可変軽鎖では、V生殖系列セグメント(例えば、VκまたはVλ)はCDR1、CDR2内およびCDR3の5’末端のアミノ酸残基を含み、一方、J生殖系列セグメント(例えば、VλおよびJκ)はCDR3の3’末端のアミノ酸残基を含む。生殖系列セグメントが変異誘発の標的とされる場合は、アミノ酸改変は、全体生殖系列セグメントを同じタイプの別の生殖系列セグメントでスワッピング、または置換することにより、可変重鎖または軽鎖中に導入される。例えば、JH生殖系列セグメント、例えば、IGHJ1*01は、異なるJH生殖系列セグメント、例えば、IGHJ2*01で、または任意の他のGHJ生殖系列セグメントで置換される。実施例13Aおよび図4Aで例示されているように、IGHJ1*01のスワッピングにより、重鎖CDR3内の6アミノ酸残基およびフレームワーク領域4内の7番目の残基の同時変異が可能となる。1つの生殖系列セグメント、例えば、JHがスワッピングされ、あるいは、2つの生殖系列セグメント、例えば、DHとJHの両方が、1つの可変重鎖内でスワッピングされうる。
生殖系列セグメントは、重鎖および軽鎖両方のCDR3をコードするために、通常、DまたはJ生殖系列セグメントが変異誘発のために選択される。さらに特異的となるように、生殖系列セグメントDH、JH、Jκ、および/またはJλが選択される。実施例13Bに例示するように、DHおよびJHセグメント両方のスワッピングは、重鎖CDR3のほぼ完全なスキャンをもたらす。図4Bに示すように、生殖系列セグメントJHは、3つの異なるJHセグメントでスワッピングされてCDRH3の3’末端の6アミノ酸を変異させ、また、図4Cに示すように、CDRH3の中央部の5アミノ酸が改変される。
セクションE.とFで記載のように、生殖系列で抗体は、発現し、標的抗原に対する活性によりアッセイされる。本明細書の本セクションで記載のように、標的抗原に対する活性を高めた、スワッピングされた生殖系列セグメントを含む抗体は、さらなる改変のための中間抗体として使用可能である。
D.抗体の変換方法
抗体の変換方法が本明細書で提供される。この方法は、親和性が変動しても、標的抗原に対する特異性を維持している抗体は、同じ標的抗原に対して、アゴニストまたは活性化因子−モジュレーター活性からアンタゴニスト活性までの範囲の活性を示すことが可能であるという解明に基づいている。本明細書で記載のように、抗体の薬理的活性は、それらの親和性に依存し、質的に異なる活性(活性化と抑制)が、同じエピトープであるが本質的に異なる親和性を有するエピトープを認識する抗体で発生する。機能の活性化は、受容体クラスタリングによるシグナル伝達の増強、および低親和性変異体の急速なオン/オフ速度に起因することは、本明細書で意図されている。対照的に、高親和性結合体はそのリガンドにしがみつき、放さず、その結果、シグナル伝達を妨げる。従って、抗体は、同じ標的抗原の低親和性アゴニストもしくは活性化因子−モジュレーターとして、または高親和性アンタゴニストとして、治療効果を示すことが可能である。
複数の作用機序が、通常、いくつかのクラスの小分子薬剤で認められるという事実にも拘わらず、臨床用途におけるほぼ全ての抗体は、高親和性アンタゴニストである。例えば、小分子薬剤は、アンタゴニスト、アゴニスト、部分アゴニストまたはアンタゴニストおよびモジュレーターとしての作用を含め、いくつかの作用機序を有する。対照的に、大抵の抗体治療薬は、アンタゴニストとして作用する。ハイブリドーマおよびディスプレイベースシステムの発見された選択機序は、親和性および優勢エピトープ結合を進行させる。従って、抗体エンジニアリングの大抵の方法は、親和性に基づく偏りを示す。これが、大抵の既存のディスプレイベースライブラリーが、高親和性結合剤を素早く特定する能力に基づいて抗体を選択する理由である。例えば、大抵の方法は、標的親和性に基づく競合的選択に依存する。従って、大抵の既存の方法、例えば、競合的親和性選別に依存する伝統的ディスプレイベースの方法は、それらが高親和性と相容れないといる理由だけで、潜在的治療薬を見逃す可能性がある。
従って、抗体の変換方法が本明細書で提供され、それにより、抗体が、アンタゴニストから部分アゴニスト、アンタゴニストもしくは活性化因子−モジュレーター、またはアゴニストもしくは活性化因子−モジュレーターからアンタゴニスト、もしくは部分アンタゴニストに変換されうる。この方法は、拮抗作用、部分拮抗作用または活性化調節からのある範囲の活性を得るために、同じ標的抗原に対する抗体の結合親和性を調節または変更することにより抗体を変換することに基づいている。この方法は、出発抗体の変異誘発手法と、生じた活性の結合親和性および機能活性の評価に対する評価項目の分析とを組み合わせる。ランダムまたは合理的な変異誘発戦略を採用することにより、広い測定範囲の親和性により選別し、アンタゴニスト、部分アンタゴニストまたは活性化因子/モジュレーター活性を有する抗体を特定することができるライブラリーを生成可能である。一部の例では、ライブラリーは、ライブラリーの各メンバーの同一性がわかるようにアレイフォーマットになっている。別の例では、セクションCに記載の親和性成熟方法と類似の構造/活性関連性(SAR)変異誘発戦略が採用可能である。
1.出発または参照抗体の選定
この方法では、変換されるべき出発または参照抗体、もしくはその一部が選択される。選択される抗体は、1)特定の標的抗原に対して既知の活性を示す(例えば、アンタゴニストまたはアゴニスト)、および2)抗体の活性が逆の場合、または部分的に逆転した場合、潜在的な治療効果が存在すると思われるものである。例えば、アンタゴニストまたは部分アンタゴニスト活性を示す抗体は、選ばれることが可能で、それにより、同じ標的抗原に対し逆アゴニスト、部分アゴニストまたは活性化因子−モジュレーター活性を示す抗体も、望ましい。別の例では、標的抗原に対し、アゴニスト、部分アゴニストまたは活性化因子−モジュレーター活性を示す抗体は、選択され、その結果、同じ標的抗原に対し、逆アンタゴニストまたは部分アンタゴニスト活性を示す抗体も、望ましい。
1次または出発抗体は、標的抗原に対し活性を有していることがわかっている、またはそのように特定された抗体である。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、脂質、核酸または小分子(例えば、神経伝達物質)であってもよい。抗体は、ウイルス、細菌性、腫瘍または他の細胞の表面上に発現している抗原に対し活性を示す、または、精製抗原に対し活性(例えば、結合)を示すことができる。一般的に、標的抗原は、治療介入の標的となるタンパク質である。代表的標的抗原には、これに限定されないが、細胞増殖および分化、細胞遊走、アポトーシスならびに血管新生に関与する標的が含まれる。このような標的には、これに限定されないが、増殖因子、サイトカイン、リンパ球性抗原、他の細胞性活性化因子およびそれらの受容体が含まれる。代表的なこのような標的には、膜結合受容体、例えば、細胞表面受容体が含まれ、これには次のものが挙げられるが、これらに限定されない:VEGFR−1、VEGFR−2、VEGFR−3(血管内皮細胞増殖因子受容体1、2、および3)、上皮増殖因子受容体(EGFR)、ErbB−2、ErbB−b3、IGF−R1、C−Met(肝細胞増殖因子受容体;HGFRとしても知られる)、DLL4、DDR1(ジスコイジンドメイン受容体)、KIT(c−kitの受容体)、FGFR1、FGFR2、FGFR4(繊維芽細胞増殖因子受容体1、2、および4)、RON(recepteur d’origine nantais;マクロファージ刺激1受容体としても知られる)、TEK(内皮細胞特異的受容体チロシンキナーゼ)、TIE(内皮細胞に存在する受容体型チロシンキナーゼ)、CSF1R(コロニー刺激因子1受容体)、PDGFRB(血小板由来増殖因子受容体B)、EPHA1、EPHA2、EPHB1(エリトロポイエチン産生肝細胞受容体A1、A2およびB1)、TNF−R1、TNF−R2、HVEM、LT−βR、CD20、CD3、CD25、NOTCH、G−CSF−R、GM−CSF−RならびにEPO−R。他の標的には、膜結合型のタンパク質、例えば、カドヘリン、インテグリン、CD52またはCD44から選択されるたんぱく質が含まれる。標的となりうる代表的リガンドには、これに限定されないが、VEGF−A、VEGF−B、VEGF−C、VEGF−D、PIGF、EGF、HGF、TNF−α、LIGHT、BTLA、リンホトキシン(LT)、IgE、G−CSF、GM−CSFおよびEPOが含まれる。
標的抗原に対し活性を有する1次または出発抗体は、標的抗原または抗原に対する特定の活性を有することが当技術分野で既知であるか、またはそのように特定されている。例えば、免疫化およびハイブリドーマ選別法、ディスプレイライブラリー選別法(例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー)、またはアドレス指定できるコンビナトリアル抗体ライブラリーを含む(これに限定されない)特定の標的抗原に対し抗体を特定または選択するいずれかの方法が、出発抗体の選択または選出に使用可能である。例えば、特定の活性または親和性を有する抗体を特定する方法が本明細書のセクションB.2に記載されている。さらに、本明細書の親和性成熟方法に関してセクションC.1、特にセクションC.1のiおよびiiに記載されている1次または出発抗体を選択または選出する方法の説明もまた、1次抗体の選択または選出に使用でき、本明細書の抗体変換方法で変換できることは理解されよう。さらに、親和性成熟され、通常、アンタゴニスト活性を示すいずれの抗体も、出発または1次抗体として選択できる。本明細書の別のところで考察したように、親和性成熟法は、当技術分野では既知である(例えば、セクションB.3参照)。また、セクションCで記載された親和性成熟法は、後で本明細書の変換方法に使用可能な抗体、通常、高親和性を有する抗体を特定するのに使用可能である。
1次または出発抗体の活性が未知である場合は、測定することができる。結合親和性および/または機能活性(例えば、アゴニスト、アンタゴニストまたは活性化因子−モジュレーターとして)が測定可能である。代表的アッセイは、本明細書のセクションEおよび実施例に記載されている。特定のアッセイの選定は、標的抗原および/またはその活性に対する要求に依存する。例えば、DLL4は、Notch1受容体を活性化する細胞表面リガンドで、細胞表面上に発現する。従って、通常、細胞ベースアッセイを採用して活性を評価する。代表的細胞ベースアッセイは、本明細書および実施例に記載のレポーターアッセイである。本明細書の記載に基づいて、各抗体に対して特定のアッセイを決め、最適化することは当業者のレベルの範囲内で可能なことである。
2.変異誘発
1次または出発抗体が選択されるとすぐに、可変重鎖および/または可変軽鎖中のアミノ酸残基が変異誘発を受ける。一般的に、1つまたは複数のCDR中のアミノ酸残基が変異を受け、例えば、抗体のCDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2および/またはCDRH3中の残基が変異を受ける。例えば、通常、CDRは3〜25アミノ酸残基を含むことができる。CDR内の全ての、またはサブセットのアミノ酸が変異誘発の標的となり得、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25アミノ酸残基が変異誘発のための標的となりうる。
さらなる変異誘発のために選択されたアミノ酸残基は、当業者に既知のいずれの方法でも改変可能である。アミノ酸残基は、合理的に、またはランダム変異誘発によって改変可能である。これは、コードしているDNAを改変することにより達成可能である。当業者なら変異誘発方法をよく知っている。例えば、セクションC.1.dで記載のいずれかの変異誘発方法が使用可能である。一例では、1次または出発抗体中の結合に関与する残基が既知である場合は、これらの残基は、種々の変異誘発戦略のいずれかにより合理的に標的とされうる。別の例では、ランダム変異誘発法が採用可能である。代表的なこのような変異誘発戦略では、当技術分野で既知の方法を使って配列が無作為化されるが、この方法には、これに限定されないが、エラープローンPCRまたはドーピング戦略が含まれる。変異誘発されたタンパク質は、セクションFに記載のように発現する。本明細書中で以下に記載のように、変換を目的として、変異抗体のライブラリーまたは収集を作成し、選別することができる。一部の例では、ライブラリーはアドレス指定できるライブラリーである。
3.変換抗体に対する選択
変異誘発されたタンパク質は発現し、標的抗原に対する結合親和性および/または標的抗原に対する機能活性の調節に与える効果により評価される。出発または1次抗体に比較して逆転した結合親和性および活性(例えば、より高いまたはより低い;アンタゴニスト対アゴニスト/活性化因子−モジュレーター)を有する変換抗体が選択される。
a.結合
変換抗体の選択の第1ステップでは、結合親和性が評価される。活性を評価する当業者に既知のいずれの方法、例えば、本明細書の以下のセクションE.1でさらに記載されるような方法、でも使用可能である。例えば、代表的結合アッセイには、これに限定されないが、例えば、下記の技術を使った、競合的および非競合的アッセイシステム、等のイムノアッセイが含まれる:ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着測定法)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、メソ・スケール・ディスカバリー電気化学発光測定法(MSD、Gaithersburg、Maryland)、免疫沈降アッセイ、ELISPOT、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定分析、蛍光イムノアッセイ、およびタンパク質Aイムノアッセイ。このようなアッセイは、日常的に使用され、当技術分野でよく知られている(例えば、Ausubel et al.、eds、1994、「分子生物学における最新プロトコル」、Vol.1、John Wiley & Sons、Inc.、NewYorkを参照のこと。本文献は参照によってその全体が本明細書に組み込まれる)。例えば、本明細書で提供される方法では、標的抗原に対する抗体の結合はECL結合アッセイを使って測定される。別の例では、結合はELISAにより測定される。本明細書の別のところで考察されているように、1次抗体と変異抗体の間の結合親和性の比較は、通常、同じ構造を有する抗体間で行われ、例えば、IgGのFabは、IgGのFabと比較される。
例えば、アンタゴニスト抗体が1次または出発抗体として選択される場合は、アゴニスト、部分アゴニストまたは活性化因子−モジュレーターが結合親和性に対する最初の抗体試験により選択される。1次または出発抗体より結合親和性の減少(例えば、より高い結合親和性)を示す抗体が選択される。例えば、2倍〜5000倍、例えば、10倍〜5000倍、例えば、100倍〜1000倍減少した結合親和性を示す抗体が選択される。例えば、1次または出発抗体の結合親和性が10−9Mである場合、10−7Mの結合親和性を示す抗体は、1000倍の結合親和性の減少を示すことになる。
別の例では、アゴニスト、部分アゴニスト、または活性化因子−モジュラー抗体が1次または出発抗体として選択される場合、アンタゴニストまたは部分アンタゴニスト抗体が結合親和性に対する最初の抗体試験により選択される。1次または出発抗体より強化された、または増加した結合親和性(例えば、より低い結合親和性)を示す抗体が選択される。例えば、10倍〜10、000倍、例えば、100倍〜5000倍、例えば、約500倍〜2500倍、強化された、または増加した結合親和性を示す抗体が選択される。例えば、1次または出発抗体が10−7Mである場合、10−9Mの結合親和性を示す抗体は、1000倍増加または強化された結合親和性を示すものとして選択される。
b.機能活性
結合親和性に基づき最初に選択された変異抗体は、次に、機能活性の逆調節により選択される。機能活性を評価するアッセイは当業者にはよく知られ、特定の標的タンパク質に応じて経験的に判断されている。通常、このアッセイは、細胞ベースアッセイである。代表的細胞株を含む代表的アッセイは、本明細書のセクションEに記載されている。アッセイされる細胞は、特定の標的対象タンパク質を発現している。タンパク質を発現していない対照細胞もまた、特異性評価に使用可能である。採用されるアッセイは、容易に判断可能な定量的活性評価を提供する出力を与えることができるものである。例えば、代表的機能アッセイには、レポーターアッセイが含まれ、それにより、例えば、外因的に付加されたリガンドによる細胞表面受容体の活性化時に、測定可能なレポーターシグナルが誘導される。細胞表面受容体またはリガンドに対するアンタゴニストまたは部分アンタゴニスト抗体の存在下では、測定された出力が抗体の阻害効果に呼応して減少する。対照的に、アゴニスト、部分アゴニストまたは活性化因子−モジュレーターの存在下では、測定された出力は、抗体の活性化効果に呼応して増加する。
例えば、出発または1次抗体が標的タンパク質アンタゴニストの場合は、上記a)において、最初に低下した結合親和性(例えば、より高い結合親和性)を有するとして選択された1次抗体の変異抗体が、同じ標的タンパク質に対し、アゴニスト、部分アゴニストおよび/または活性化因子−モジュレーターとしてさらに活性の試験をされる。変換されたとして選択された抗体は、標的タンパク質の機能活性化を示すものである。従って、同じ活性化条件の抗体が存在しない条件下で示される活性に比べて、抗体の存在により標的タンパク質の活性増加、または標的タンパク質の評価項目の活性増加を生ずる。例えば、標的タンパク質がリガンドの存在下で正常に活性化する場合、設定された測定活性が得られ;アゴニスト、部分アゴニストまたは活性化因子−モジュラー抗体が追加されて存在する場合は、測定活性は増加する。別の例では、標的タンパク質が受容体を正常に活性化するリガンドである場合、リガンド−受容体相互作用は設定された測定活性が得られる;リガンドに追加した抗体が存在する場合、測定活性は増加する。例えば、標的タンパク質の活性は、同じ活性化条件と抗体が存在しない条件下での標的タンパク質の活性に比べ、1.2〜2倍、2倍〜1000倍増加し、例えば、5倍〜500倍、例えば、10倍〜200倍増加し、例えば、1.2倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍またはそれ以上増加する。
別の例では、出発または1次抗体が標的タンパク質のアゴニスト、部分アゴニストまたは活性化因子−モジュレーターの場合、上記a)において、最初増加または強化された結合親和性を有する(例えば、より低い結合親和性)として選択された1次抗体の変異抗体が、同じ標的タンパク質に対するアンタゴニストまたは部分アンタゴニストとしての活性によりさらに試験される。変換されているとして選択された抗体は、標的タンパク質に阻害活性を示すものである。従って、抗体の存在が、同じ活性化条件の抗体が存在しない条件下で示される活性に比べ、標的タンパク質の活性の低減、または標的タンパク質の評価項目の活性の低減をもたらす。例えば、標的タンパク質がリガンドの存在下で正常に活性化する場合、設定した測定活性が得られ;アンタゴニストまたは部分アンタゴニスト抗体が追加されて存在する場合、測定活性は減少する。別の例では、標的タンパク質が正常に受容体を活性化するリガンドである場合、リガンド−受容体相互作用により、設定された測定活性が得られ;リガンドに追加されて抗体が存在する場合は、測定活性が増加する。例えば、標的タンパク質の活性は、同じ活性化条件と抗体が存在しない条件下での標的タンパク質の活性化に比べ、1.2〜2倍、2倍〜1000倍減少し、例えば、5倍〜500倍、例えば、10倍〜200倍減少し、例えば、1.2倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍またはそれ以上減少する。
本明細書の抗体変換方法の一部の例では、増加または減少した結合親和性に基づいた最初の抗体選択ステップを行わない。従って、本明細書の抗体変換方法は、本明細書に記載のように、1次または出発抗体を直接選択することにより行い、本明細書記載のように変異誘発して、1次または出発抗体の逆の機能活性により変異抗体の収集を直接試験する。逆の活性を示す変換された抗体が選択される。
本明細書で提供される方法の実施に際し、通常、抗体の可変重鎖および/または可変軽鎖のみが変異誘発を受ける。選択された最終的抗体は、通常、少なくとも抗原結合部位を形成するのに充分な可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む。しかし、抗体は、また、全てまたは一部の定常重鎖(例えば、1つまたは複数のCHドメイン、例えば、CH1、CH2、CH3およびCH4)、および/または定常軽鎖(CL)を含んでもよいことは理解されよう。従って、抗体は、完全長抗体を含むことができ、また、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、単鎖Fv(scFv)、Fv、dsFv、ダイアボディ、FdおよびFd’断片、Fab断片、scFv断片、ならびにscFab断片、を含む断片またはその一部、を含むことができる。また、本明細書で提供されるように、抗体が変換されるとすぐに、生じた抗体は、完全長抗体またはその断片、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、単鎖Fv(scFv)、Fv、dsFv、ダイアボディ、FdおよびFd’断片、Fab断片、scFv断片、ならびにscFab断片、として産生されうることは理解されよう。さらに、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgE定常領域を含む任意のアイソタイプの定常領域は、完全または部分抗体断片の生成に使用可能である。このような定常領域は、いずれかのヒトまたは動物種から入手可能である。例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト、としての活性は実質的に変化するとは予測されないにしても、活性および結合親和性は、抗体の構造によって異なる可能性があることは理解されよう。例えば、一般的に二価の抗体、例えば、二価のF(ab’)2断片または完全長IgGは、一価Fab抗体よりも大きい結合親和性を有する。その結果、Fabが、特定の標的に対し特定の結合親和性を有する場合は、二価の完全長IgGがさらに大きな結合親和性を有するということは除外して考えるべきである。
生成した変換抗体は、治療薬の候補である。代表的実施方法は、本明細書の実施例で記載される。例えば、実施例19では、DLL4に対し低親和性を有する、2つの異なる抗DLL4生殖系列抗体が、アゴニスト活性を示したことが示されている。本明細書記載の親和性成熟法による抗体のそれぞれの変異誘発により、同じ標的抗原に対しより高い親和性を有するアンタゴニスト抗体への変換がもたらされる。
E.アッセイ
本明細書の方法で産生された抗体は、標的抗原に対する活性により評価することができる。改善された結合親和性を有するか、または標的の活性を変更または調節(増加または低減)する抗体が選別され、変異または改変抗体が特定される。通常、本明細書の方法には、標的抗原に対する結合により抗体を選別し試験することが含まれる。また、他の活性は、細胞障害性、細胞分化または増殖、細胞遊走、アポトーシス、血管新生および遺伝子発現変化、を含む評価項目(これらに限定されない)に対してアッセイすることができる。
1.結合アッセイ
本明細書で提供される抗体は、当業者に既知のいずれかの方法により、選択標的に結合する能力によって選別できる。代表的標的抗原は、セクションC.1に記載されている。結合アッセイは、溶液中、懸濁液中または固体支持体上で行うことができる。例えば、標的抗原を、固体支持体(例えば、炭素もしくはプラスチック表面またはチップ)に固定し、抗体を接触させることができる。非結合抗体または標的タンパク質を洗い流し、次に、結合複合体を検出できる。結合アッセイは、非イオン性洗剤(例えば、0.1%トリトンX−100またはツイーン20)および/またはブロッキングタンパク質(例えば、ウシ血清アルブミンまたはゼラチン)と一緒に高イオン強度緩衝液(例えば、0.3〜0.4M NaCl)を使う、等の非特異的結合を減らす条件下で行うことができる。また、陰性対照も、バックグラウンド結合の基準としてこのようなアッセイ中に含めることもできる。結合親和性は、スキャチャード解析(Munson et al.、Anal.Biochem.、107:220(1980))、BIACoreまたは当業者に既知の他の方法を使って測定可能である。
代表的結合アッセイには、これに限定されないが、例えば、次の技術を使った競合的および非競合的アッセイシステム等のイムノアッセイが含まれる:ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着測定法)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、メソ・スケール・ディスカバリー(MSD、Gaithersburg、Maryland)、免疫沈降アッセイ、ELISPOT、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定分析、蛍光イムノアッセイ、およびタンパク質Aイムノアッセイ。このようなアッセイは日常的に使用され、当技術分野ではよく知られている(例えば、Ausubel et al.、eds、1994、「分子生物学における最新プロトコル」、Vol.1、John Wiley & Sons、Inc.、New York、を参照。本文献は参照によってその全体が本明細書に組み込まれる)。他のアッセイ形式には、リポソームイムノアッセイ(LIA)があり、これは、特異的分子(例えば、抗体)に結合し、カプセル化試薬またはマーカーを放出するように設計されたリポソームを使う。放出された化学物質は、次に、標準的な方法により検出される(Monroe et al.、(1986)Amer.Clin.Prod.Rev.5:34−41、参照)。
通常、結合は、標的または必要に応じ直接ライブラリー中の抗体メンバーに結合させた検出可能成分または標識(例えば、酵素、放射性核種、蛍光プローブ、電気化学発光標識、または色染料)を使って検出される。あるいは、結合は、それ自体に標識した、またはそれ自体検出可能である追加の3番目の試薬によって検出可能である。例えば、標的タンパク質に結合した抗体の検出は、サンドイッチ法フォーマットの標識捕獲分子を使って達成できる。免疫グロブリン定常領域に特異的に結合できる他のタンパク質、例えば、タンパク質Aまたはタンパク質Gもまた、標識試薬として使用可能である。これらのタンパク質は、種々の種由来の免疫グロブリン定常領域に対し強力な非免疫原性反応性を示す(例えば、Kronval et al.、(1973)J.Immunol.111:1401−1406;Akerstrom et al.、(1985)J.Immunol.135:2589−2542、参照)。検出試薬は、ストレプトアビジン等の別の分子が特異的に結合可能な検出可能成分、例えば、ビオチン、で修飾可能である。種々の検出可能成分が当業者にはよく知られている。
アッセイに使われる抗体の特異的結合を著しく妨害しない限りは、アッセイに使われる標識または検出可能基の選択は、重大ではない。通常、選択は、必要な感度、化合物との結合の容易さ、安定性要件、利用可能な装置、および廃棄規定に依存する。当業者は、標識をよく知っており、採用されるアッセイに適し、それと相性がよい検出可能標識を選定できる。
検出可能基は、検出可能な物理的または化学的特性を有する任意の材料であってよい。このような検出可能標識はイムノアッセイの分野で充分に開発されてきており、一般的に、このような方法に使われる大抵の標識が本明細書に適用可能である。従って、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能な任意の組成物である。有用な標識には、磁気ビーズ(例えば、DYNABEADS(登録商標))、蛍光染料(例えば、フルオレセインイソチオシアナート、Texasred、ローダミン、等)、放射標識(例えば、3H、125I、35S、14C、または32P)、酵素(例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼおよびELISAでよく使われる他のもの)、化学発光標識(ルシフェリンおよび2、3−ジヒドロフタラジンジオン、例えば、ルミノール)、ならびに比色標識、例えば、コロイド状金または着色ガラスまたはプラスチックビーズ(例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス、等)が挙げられる。使用可能な種々の標識化またはシグナル生成システムの概説に関しては、例えば、米国特許第4、391、904号を参照のこと。
標識を検出する手段は当業者によく知られている。従って、例えば、標識が放射性の標識である場合には、検出手段には、オートラジオグラフィーの場合のようにシンチレーションカウンターまたは写真フィルムが含まれる。標識が蛍光標識である場合には、蛍光色素を適切な波長の光で励起して、生じた蛍光を検出することができる。蛍光は、電荷結合素子(CCD)または光電子増倍管、等の電子的検出器を使って、目視により検出出来る。同様に、酵素標識は、酵素に対する適切な基質を提供し、得られた反応生成物を検出することができる。最後に、単純な比色標識は、単純に標識に関連した色を観察することにより検出出来る。
一部のアッセイ形式では、標識した成分の使用を要しない。例えば、凝集アッセイは、標的抗体の存在を検出するのに使用できる。この場合、抗原コート粒子が標的抗体を含む試料により凝集させられる。この形式では、どの成分も標識する必要がなく、標的抗体の存在が単純な目視検査で検出される。
あるいは、本明細書で提供される抗体は、サブトラクティブパニング(subtractive panning)を行う場合と行わない場合の全細胞パニングを使って、細胞に結合する能力により選別できる。選別は、生きた細胞に対して、またはインタクトの緩く固定した標的細胞に対して行うことができる。全細胞パニングの方法は、以前記載している(例えば、Siegel et al.(1997)J.Immunol.Methods 206:73−85、を参照。本文献は、参照により本明細書に組み込まれる)。他の適用可能選別技術には、蛍光活性化セルソーター(FACs)がある。
高スループット選別のために、アッセイを多重化可能である。従って、多くの異なる標的タンパク質に対する抗体の結合親和性が同時に測定可能である。一例では、異なる標的タンパク質が異なる検出可能成分で別々に標識可能である。例えば、異なる抗原を色分けしたビーズに結合させることができる(Schwenk et al.(2007)Mol.Cell.Prot.、6:125−132)。別の例では、プレートの座位中の100タンパク質までの吸収によりアッセイを多重化するマルチスポットプレートを使うことができる(例えば、メソ・スケール・ディスカバリー;MSD、Gaithersburg、MDから入手したマルチアレイまたはマルチスポットプレートを使って)。このような例では、抗体は、マルチスポットプレートの各ウエルに異なる抗体を添加することにより選別可能である。このアッセイは、多くの標的タンパク質に対して数千の抗体を一度に選別することを容易に可能にする。
本明細書の選別方法では、通常、標的抗原に対して特異的に結合し、1次抗体に比べ増加した結合親和性を有する抗体が特定される。Kdの減少として測定される親和性の増加は、会合速度(kon)の増加、もしくは解離速度koffの減少、または両方により達成できる。例えば、抗体の結合親和性は、標的タンパク質に対する高親和性を有する抗体を特定、または選択するために測定される。例えば、本方法の実施により生成した親和性成熟抗体は、1x10−9M未満、通常1x10−9M〜1x10−11M、例えば、正確にまたは約1x10−9M、2x10−9M、3x10−9M、4x10−9M、5x10−9M、6x10−9M、7x10−9M、8x10−9M、9x10−9M、1x10−10M、2x10−10M、3x10−10M、4x10−10M、5x10−10M、6x10−10M、7x10−10M、8x10−10M、9x10−10Mまたはそれ未満の標的抗原に対する結合親和性を有することができる。
当業者に既知のいずれの方法も、抗体の結合親和性を測定するために使用可能である。例えば、抗体の結合特性は、飽和結合アッセイ、例えば、飽和ELISA、を行うことにより評価でき、それにより、抗体量の増加に伴う標的タンパク質に対する結合が評価される。このような実験では、結合が用量依存性および/または飽和性であるかどうかを評価できる。さらに、結合親和性は、50%結合シグナルから外挿できる。通常、見かけの結合親和性は、結合定数(Ka)または解離定数(Kd)として測定され、スキャチャード解析を使って決定される(Munson et al.、Anal.Biochem.、107:220(1980)。例えば、標的タンパク質に対する結合親和性は、ラジオイムノアッセイ(RIA)またはELISA、等により非標識タンパク質を漸増濃度で添加する、競合結合アッセイで評価可能である。結合親和性は、また、BIAcore動態解析を使って分析可能である。これは、表面に固定化した標的タンパク質を含むチップからの抗体メンバーの結合および解離を解析することを含む。Biacore評価ソフトウェアは、相互作用モデルにデータをフィッティングさせることにより、KaとKdの値を生成する。結合親和性の全アッセイは、粗い近似を提供してはくれるが、抗体の結合親和性は、採用アッセイおよび条件によって変化しうることは理解されよう。種々の条件下で種々のアッセイを行うことにより、抗体の結合親和性を推定することが可能となる。
さらに、結合親和性は、抗体の構造により異なる可能性がある。例えば、通常、二価の抗体、例えば、二価のF(ab’)2断片または完全長IgGは、一価Fab抗体よりも良好な結合親和性を有する。従って、Fabが特定の標的に対し、特定の結合親和性を有する場合、結合親和性は二価の完全長IgGに対してはさらに大きいということは除外して考えるべきであることは理解されよう。
2.機能活性
本明細書の方法により生成された抗体は、当業者に既知の任意の方法で、標的の機能活性を調節する能力により選別することができる。アッセイは、細胞表面受容体を結合および/または調節することができる抗体を特定するように設計できる。このような抗体は、受容体結合の正常な効果を模倣するアゴニスト、または受容体結合の正常な効果を阻害するアンタゴニストでありうる。特に関心のあるのは、受容体に結合し、細胞内シグナル伝達を調節する試薬の特定である。
一部の例では、このようなアッセイは、細胞ベースアッセイアッセイである。通常、アッセイは、対象標的を発現することが知られている細胞株を使って行われる。このような細胞は当業者には既知である。例えば、ATCCカタログ(atcc.org)を調べ、細胞株を特定することができる。また、特定の細胞型が必要なら、このような細胞の入手手段、および/またはそれらのすぐ利用可能なソースは、当業者には既知である。科学文献の分析により、任意の所望の標的を発現している細胞の適切な選択を容易に明らかにすることができる。表5は、本明細書で提供された抗体ライブラリーに対し本明細書の機能活性で選別可能な対象標的を発現している代表的細胞株のリストである。
さらに、対象標的を発現している発現ベクターの一時的または安定なトランスフェクションにより対象標的を発現している細胞株を生成できる。トランスフェクションおよび発現の方法は当業者には既知である(例えば、KaufmanR.J.(1990)Methods in Enzymology 185:537−566;Kaufmanetal.(1990)Methods in Enzymology 185:537−566、参照)。さらに、いずれかの1次細胞または細胞株を特定の標的(例えば、細胞表面マーカー)の発現により評価可能である。細胞表面マーカーは蛍光標識抗体およびFACSを使ってアッセイできる。適切な細胞株には、A549(肺)、HeLa、Jurkat、BJAB、Colo205、H1299、MCF7、MDA−MB−231、PC3、HUMEC、HUVEC、およびPrECが挙げられる。
本明細書に記載のように、いずれかの適切な機能的効果が測定可能である。例えば、細胞形態(例えば、細胞容量、核容量、細胞周囲長、および核周囲長)、リガンド結合、基質結合、ヌクレアーゼ活性、アポトーシス、走化性または細胞遊走、細胞表面マーカー発現、細胞増殖、GFP陽性および色素希釈アッセイ(例えば、細胞膜に結合する染料を用いたcell trackerアッセイ)、DNA合成アッセイ(例えば、3H−チミジンおよび蛍光DNA結合染料、例えば、BrdUまたはHoechst染料を使ってFACS分析で)およびnuclear fociアッセイ、は全て、細胞ベースシステムを使って潜在的モジュレーターを特定するために適切なアッセイである。他の測定可能な機能活性には、これに限定されないが、リガンド結合、基質結合、エンドヌクレアーゼおよび/またはエキソヌクレアーゼ活性、既知のおよび性質不明の遺伝子マーカーへの転写変化(例えば、ノーザンブロット)、細胞代謝の変化、細胞増殖関連の変化、細胞表面マーカー発現、DNA合成、マーカーおよび色素希釈アッセイ(例えば、GFPおよびcell trackerアッセイ)、接触阻害、ヌードマウス中の腫瘍増殖、等がある。
例えば、本明細書で提供される方法により生成された抗体は、標的タンパク質を発現することがわかっている細胞の1つまたは複数の表現型の調節により評価可能である。表現型のアッセイ、キットおよび使用される試薬は当業者にはよく知られており、本明細書で抗体ライブラリーを選別するために使用される。いくつかの市販品ベンダーのいずれかから入手可能な代表的な表現型のアッセイには、細胞生存率、細胞障害性、増殖または細胞生存(Molecular Probes、Eugene、Oregon;PerkinElmer、Boston、Mass.)、酵素アッセイ(Panvera、LLC、Madison、Wis.;BD Biosciences、Franklin Lakes、N.J.;Oncogene Research Products、San Diego、Calif.)を含むタンパク質ベースアッセイ、細胞調節、シグナル伝達、炎症、酸化プロセスおよびアポトーシス(Assay Designs Inc.、Ann Arbor、Mich.)、トリグリセリド蓄積(Sigma−Aldrich、St.Louis、Mo.)、血管新生アッセイ、管形成アッセイ、サイトカインおよびホルモンアッセイならびに代謝アッセイ(Chemicon International Inc.、Temecula、Calif.;Amersham Biosciences、Piscataway、N.J.)、を測定するものが含まれる。
特定の表現型のアッセイに適切であると判断された細胞(すなわち、A549、HeLa、Jurkat、BJAB、Colo205、H1299、MCF7、MDA−MB−231、PC3、HUMEC、HUVEC、およびPrECおよび対象標的を発現するとわかっているいずれかの他の細胞)が、抗体ならびに対照化合物と一緒に処理される。必要に応じ、受容体標的に対するリガンドが含まれ、それにより受容体が活性化される。治療期間の終わりに、処理された細胞および未処理細胞が、特異的な1つまたは複数の方法によりアッセイされ、表現型の結果および評価項目が測定される。
表現型評価項目には、時間または治療用量に対する細胞形態の変化、ならびに細胞成分、例えば、タンパク質、脂質、核酸、ホルモン、糖類または金属のレベルの変化が含まれる。pH、細胞周期のステージ、細胞による生物指標の摂取量または排出量、を含む細胞状態の測定値、もまた対象となる評価項目である。
標的タンパク質に対する抗体の直接効果を評価するために、アッセイを行うことができる。例えば、標的タンパク質が細胞表面受容体である場合、標的タンパク質が直接に、例えば、刺激により、受容体の活性または機能を調節するかどうかを評価するために抗体を添加することができる。このような場合には、抗体はアゴニスト抗体と見なされる。別の例では、標的タンパク質が細胞表面受容体の場合には、受容体の活性が、リガンドまたは他の刺激試薬の存在下、かつ抗体の存在下または非存在下、で刺激され、抗体が抗体の作用を調節するかどうか(例えば、阻害するかどうか)を判定する。例えば、抗体は、受容体と相互作用してリガンドの能力をブロックすることにより作用すること、および/または、さもなければ、負の刺激シグナルを誘導することができる。このような場合は、抗体は、受容体のアンタゴニストと見なされる。従って、本明細書の機能活性による選別方法は、アゴニストおよびアンタゴニスト抗体の特定を可能にする。
a.分化
細胞分化は、物理的、化学的または表現型変化の検出を可能とするいずれかのアッセイを使って解析可能である。種々のアッセイが、外部刺激に応答した細胞増殖および活性化を定量的に測定するのに使用される。細胞増殖アッセイは、細胞分化時に新しく合成された細胞のDNA中に試薬を組み込む事により細胞増殖を定量的に測定するために使用される。このような試薬には、これに限定されないが、3H−チミジン、5−ブロモ−2′−デオキシウリジン(BrdU)および蛍光Hoechst染料、が含まれる。細胞生存率アッセイは、生きている細胞は染料を排除するという事実に基づいて、細胞を染料で染色し、どのくらいの細胞が染料を取り込んだかを測定することにより試料中の健康な細胞の数を測定するのに使用される。このような染料には、これに限定されないが、3−(4、5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2、5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)、2、3−ビス(2−メトキシ−4−ニトロ−5−スルホフェニル)−2H−テトラゾリウム−5−カルボキサニリド分子内塩(XTT)、および4−[3−(4−ヨードフェニル)−2−(4−ニトロフェニル)−2H−5−テトラゾリオ]−1、3−ベンゼンジスルホナート(WST−1)、が挙げられる。試薬の取り込みは、分光光度計を使って比色測定で、またはシンチレーションカウンターで照射を測定して求められる。これらの方法の詳細は当業者にはよく知られている。
蛍光染料は、種々の細胞ベースアッセイで、生きている細胞および主要な機能活性の検出によく使用される。細胞代謝に依存しない、いくつかの非放射性、蛍光ベースアッセイがある。蛍光染料が核酸に結合し、その後、蛍光を定量的または定性的に測定できる。このような染料には、これに限定されないが、プロピジウムヨウ化物およびHoechst33342、がある。次いで、蛍光に基づいて細胞数が定量できる。DNA含量も画像処理装置に付属する利用可能なツールを使って定量化可能である。これらの方法の詳細は当業者にはよく知られている。
マトリゲルまたは一部の他の細胞外の基質成分中への侵襲の程度を、異常細胞増殖および腫瘍増殖を阻害することができる抗体を特定するアッセイとして使用できる。腫瘍細胞は、悪性度と、マトリゲルまたは一部の他の細胞外の基質成分中への侵襲性の間の良い相関を示す。このアッセイでは、通常、腫瘍原性細胞が宿主細胞として使用される。従って、抗体は、潜在的モジュレーターの導入前後の宿主細胞間の侵襲性レベルの変化を測定することにより特定可能である。
簡単に述べれば、宿主細胞侵襲レベルは、マトリゲルまたは一部の他の細胞外の基質成分でコートしたフィルターを使って測定することができる。ゲル中、またはフィルターの遠位側への浸透は、細胞の数と移動距離により、または細胞を125Iで前標識し、フィルターの遠位側またはディッシュの底の放射能をカウントすることにより組織学的に分類され、侵襲力としてランク付けされる(例えば、Freshney、「基本技術マニュアル:動物細胞の培養」、第3版、Wiley−Liss、New York(1994)、参照。本文献は、参照によって本明細書に組み込まれる])。
b.遺伝子発現の変化
抗体による標的に対する結合および/または調節の検出は、生物学的応答、例えば、Ca2+イオン流束、cAMP、IP3、PIP3またはレポーター遺伝子の転写を測定することにより検出できる。治療後の細胞の遺伝子型の分析(レポーター遺伝子アッセイを使った1つまたは複数の細胞遺伝子の発現測定)もまた、抗体の有効性または効力の指標として使われる。特徴遺伝子、またはシグナル伝達経路に関連すると疑われる遺伝子が、処理後または未処理の両細胞中で測定される。
レポーター遺伝子の活性化を測定するアッセイを行うことができる。適切なレポーター遺伝子には、例えば、トランスフェクション、電気穿孔、リポフェクションおよびウイルス感染、等の当業者にはよく知られた標準的な方法のいずれかにより細胞中に導入される内在性遺伝子ならびに外因性の遺伝子が含まれる。例えば、組換え型受容体を発現している細胞に、応答配列に機能的に連結されたレポーター遺伝子(例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、細菌性ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアルカリフォスファターゼ)を形質移入できる。次に、細胞を抗体とインキュベートし、レポーター遺伝子の発現が、組換え型受容体を発現しないが他の点では基本的に同じである対照細胞中での発現と比較される。受容体発現細胞中のレポーター遺伝子発現の統計的に有意な変化により、試験化合物が受容体と相互作用していることが示される。さらに、対象タンパク質は、2次レポーター、例えば、赤色または緑色蛍光タンパク質への付着を介した間接的レポーターとして使用可能である(例えば、Mistili & Spector、(1997)Nature Biotechnology 15:961−964、参照)。
レポーター構築物は、通常、細胞中に形質移入される。潜在的モジュレーターで処理後、レポーター遺伝子の転写、翻訳、または活性の量が当業者に既知の標準的な方法により測定される。ルシフェラーゼを使ったレポーター遺伝子アッセイを使用して、直接的、またはサイクリンDプロモーターの誘導によるSTAT5活性の測定に関し、実施例12で例示されている。
c.細胞障害活性
抗体は、アポトーシスまたはプログラム細胞死を直接誘導し、または増殖因子受容体を遮断することにより間接的にアポトーシスを誘導し、それにより増殖を効率的に抑止する能力により選別可能である。また、抗体は補体に結合し、補体依存性細胞障害性(CDC)として知られる、直接的細胞毒性の原因となる。従って、補体依存性細胞障害を評価するアッセイを行うことができる。
アポトーシスを評価する種々のアッセイは当業者には既知である。例えば、アポトーシスアッセイには、アポトーシスに関与する酵素であるカスパーゼの活性の試験をするアッセイが含まれる。カスパーゼアッセイは、酵素前駆体の活性酵素およびタンパク分解活性へのプロセッシングの測定に基づいている。多くの市販キットおよび試薬がカスパーゼ機能に基づくアポトーシス評価に利用可能であり、これに限定されないが、PhiPhiLux(OncoImmunin、Inc.)、Caspase 3 activity assay(Roche Applied science)、ホモジニアスカスパーゼアッセイ(Roche Applied science)、Caspase−Glo Assay(Promega)、Apo−ONE Homogeneous Caspase−3/7 Assay(Promega)、CaspACE Assay System Colorimetric or Fluormetric(Promega)、EnzChek Caspase−3 Assay Kit(Invitrogen)、Imag−iT LIVE green Caspase−3 and 7 Detection Kit(Invitrogen)、Active Caspase−3 Detection Kit(Stratagene)、Caspase−mediated Apoptosis Product(BioVision)およびCasPASE Apoptosis Assay Kit(Genotech)、が含まれる。
アポトーシスのためのアッセイには、ヌクレアーゼの活性化およびその後のDNA開裂による180〜200塩基対増加を測定するTUNELおよびDNA断片化アッセイが含まれる。このようなアッセイおよびキットは、市販品として入手可能であり、これには限定されないが、アポトティックDNAラダーキット(Roche Applied Science)、細胞DNAフラグメンテーションELISA(Roche Applied Science)、Cell Death Detection ELISAPLUS(Roche Applied Science)、In Situ Cell Death Detection Kit(Roche Applied Science)、DeadEnd Fluorometirc or Colorimetric TUNEL System(Promega)、APO−BrdU TUNELアッセイキット(Invitrogen)、およびTUNEL Apoptosis Detection Kit(Upstate)が含まれる。
アポトーシスを評価する他のアッセイには、例えば、膜の完全性の減少を評価する細胞透過性アッセイが含まれる。例えば、抗体が細胞死を誘導することが可能かどうかを判定するために、プロピジウムヨウ化物(PI)、トリパンブルー、または7−アミノアクチノマイシンD(7AAD)の取り込みで評価した膜の完全性の減少を、未処理細胞に比較して評価できる。さらに、市販キット、例えば、APOPercentage Assay(Biocolor Assays)を使ってアポトーシスを測定できる。また、Annexin V assayも採用可能である。Annexin Vは、結合toホスファチジルセリンに結合するが、これは.通常、細胞質膜の内表面上に認められる。アポトーシスの間に、ホスファチジルセリンが外表面に移動し、Annexin Vにより検出できる。例えば、蛍光標識Annexin Vを使った標準的結合アッセイを使うことができる(例えば、InvitrogenのAnnexin V、Alex Fluor350複合体)。アポトーシスは、また、他のアポトーシスマーカーの存在を評価することにより、タンパク質開裂を評価することにより、および/またはミトコンドリアおよびATP/ADPアッセイにより、測定可能である。このようなアッセイは、日常的に使用され、当業者には既知である。
例えば、アポトーシス分析は、細胞株、例えば、RKOもしくはHCT116、または対象標的タンパク質を発現している他の細胞を使って、機能的抗体を特定するアッセイとして使用可能である。この細胞は、マーカー遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質、またはcell tracker染料をコードした遺伝子、を含む構築物を同時形質移入できる。アポトーシス性変化は、当技術分野で既知の方法、例えば、螢光顕微鏡を使ったDAPI染色およびTUNELアッセイ、を使って測定できる。TUNELアッセイに関しては、市販の利用可能なキット(例えば、Fluorescein FragEL DNAFragmentation Detection Kit(Oncogene Research Products、カタログ番号QIA39およびテトラメチル−ローダミン−5−dUTP(Roche、カタログ番号1534378))が使用可能である。抗体と接触した細胞は、例えば、対照に比べアポトーシスの増加を示す。
インビトロの細胞死は、補体および免疫エフェクター細胞の非存在下で、抗体依存性細胞傷害(ADCC)または補体依存細胞障害(CDC)により誘導された細胞死を区別して測定可能である。従って、加熱不活性化した血清(すなわち、補体の非存在の)を使い、免疫エフェクター細胞の非存在下、細胞死のためのアッセイを行うことができる。
3.インビボアッセイ
親和性成熟抗体または変換抗体が本明細書の方法で生成されるとすぐ、標的の異常活性に関連したインビボアッセイにより評価可能である。一般的に、この方法は、対象に、通常は、疾患または状態のために非ヒト動物モデルに、抗体を投与すること、およびモデル動物の疾患または状態に対する抗体の効果を判断することを含む。インビボアッセイには、対照が含まれるが、適切な対照には抗体を含まない試料が含まれる。通常、異なる抗体濃度の複数のアッセイ混合物が同時に行われ、様々な濃度に対する反応の差が得られる。通常は、これらの濃度の1つが陰性対照、すなわち、ゼロ濃度の、または検出レベル以下の対照として使える。
非ヒト動物モデルには、疾患の進行に与える効果をモニターするために、抗体の投与の前に、疾患および/または表現型誘導物質を含む注射により、疾患を有するように誘導されたモデルが含まれる。遺伝的モデルもまた、有用である。過剰発現、過小発現または1つまたは複数の遺伝子のノックアウトにより疾患または状態を模倣する動物、例えば、マウスを生成できる。このような動物は、当技術分野でよく知られた遺伝子導入動物産生技術により、または天然もしくは誘導変異株を使って、生成可能である。当業者なら特定の標的に関連した種々の動物モデルをよく知っている。
このような動物モデル系には、これに限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ならびに非ヒト霊長類、例えば、ヒヒ、チンパンジーおよびサル、が含まれる。当技術分野でよく知られたいずれの動物系も使用可能である。いくつかの手順の態様が変化する可能性がある;前記態様には、これに限定されないが、抗体(例えば、予防薬および/または治療薬)投与の時間的計画、このような抗体を別々に投与するのか、または混合物として投与するのかということ、および抗体の投与頻度が挙げられる。
組換え型(遺伝子導入)動物モデルは、遺伝子導入動物を産生する標準的な方法を使って、本明細書で特定された遺伝子のコード部分を対象動物のゲノム中に導入することにより操作可能である。遺伝子導入操作の標的として使用できる動物には、これに制限されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタならびに非ヒト霊長類、例えば、ヒヒ、チンパンジーおよびサルが含まれる。このような動物中に導入遺伝子を導入する当技術分野で既知の技術には、前核マイクロインジェクション(米国特許第4、873、191号);レトロウイルス媒介遺伝子の生殖細胞系列への移入(例えば、Van der Putten et al.、(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:6148−615);胚性幹細胞標的遺伝子(Thompson et al.、(1989)Cell 56:313−321);胚の電気穿孔(Lo、(1983)Mol.Cel.Biol.3:1803−1814);精子媒介遺伝子移入(Lavitrano et al.、(1989)Cell 57:717−73)、が含まれる。概説としては、例えば、米国特許第4、736、866号を参照のこと。
動物モデルは、本明細書で提供される抗体、組成物、または併用療法の有効性の評価に使用可能である。肺癌の動物モデルの例には、これに限定されないが、肺癌動物モデル(例えば、Zhang et al.、(1994)In Vivo 8(5):755−69)および破壊されたp53機能を有する遺伝子導入マウスモデル(例えば、Morris et al.、(1998)J La State Med Soc 150(4):179−85、参照)、が含まれる。乳癌の動物モデルの例には、これに限定されないが、サイクリンD1を過剰発現している遺伝子導入マウス(例えば、Hosokawa et al.、(2001)Transgenic Res 10(5):471−8)が含まれる。結腸癌の動物モデルの例には、これに限定されないが、TCRbおよびp53ダブルノックアウトマウス(例えば、Kado et al.、(2001)、Cancer Res 61(6):2395−8)が含まれる。膵臓癌の動物モデルの例には、これに限定されないが、Panc02マウス膵臓腺癌の転移性モデル(例えば、Wang et al.、(2001)Int J Pancreatol 29(1):37−46、参照)および皮下膵腫瘍のnu−nuマウス(例えば、Ghaneh et al.、(2001)Gene Ther 8(3):199−208、参照)が含まれる。非ホジキンリンパ腫の動物モデルの例には、これに限定されないが、重症複合免疫不全(「SCID」)マウス(例えば、Bryant et al.、(2000)Lab Invest 80(4):553−73、参照)およびIgHmu−HOX11遺伝子導入マウス(例えば、Hough et al.、(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95(23):13853−8、参照)が含まれる。食道癌の動物モデルの例には、これに限定されないが、ヒトパピローマウイルス型16E7癌遺伝子のための遺伝子導入マウス(例えば、Herber et al.、(1996)J Virol 70(3):1873−81、参照)が含まれる。結腸直腸癌の動物モデルの例には、これに限定されないが、Apcマウスモデル(例えば、Fodde & Smits、(2001)Trends Mol Med 7(8):369−73およびKuraguchi et al.、(2000)Oncogene 19(50):5755−63、参照)が含まれる。
関節炎の動物モデルには、これに限定されないが、関節リウマチラット(例えば、Pearson、(1956)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.、91:95−101、参照)およびマウスおよびラット中のコラーゲン誘導関節炎(例えば、免疫学における最新プロトコル、Eds.J.E.Cologan、A.M.Kruisbeek、D.H.Margulies、E.M.Shevach and W.Strober、John Wiley & Sons、Inc.、1994、参照)が含まれる。喘息の動物モデルの例には、これに限定されないが、肺過敏症のマウスモデル(例えば、Riese et al.(1998)J.Clin.Invest.101:2351−2363 and Shi、et al.(1999)Immunity 10:197−206、参照)が含まれる。同種拒絶反応動物モデルには、これに限定されないが、ラット同種間心臓移植モデル(例えば、Tanabe et al.(1994)Transplantation 58:23−27およびTinubu et al.(1994)J.Immunol.153:4330−4338、参照)およびラット異種心臓同種移植片拒絶(Jae−HyuckSim et al.(2002)Proc Natl Acad Sci U.S.A.99(16):10617−10622)が含まれる。鋼色マウスがヒト再生不良性貧血のモデルとして使用される(例えば、Jones、(1983)Exp.Hematol.、11:571−580、参照)。貧血の動物モデルの例には、これに限定されないが、溶血性貧血モルモット(例えば、Schreiber、et al.(1972)J.Clin.Invest.51:575、参照)が含まれる。好中球減少症の動物モデルの例には、これに限定されないが、好中球減少症中球減少性CDラット(例えば、Nohynek et al.(1997)Cancer Chemother.Pharmacol.39:259−266、参照)が含まれる。
F.抗体の産生方法
本明細書で提供される方法により生成した核酸分子と抗体は、当業者に既知のいずれの方法でも作成可能である。このような方法は、日常的な作業であり、当業者にはよく知られている。これらには、遺伝子合成、PCR、連結反応、クローニング、トランスフェクションおよび精製技術を含む日常的に使われる分子生物学技術が含まれる。このような方法の説明が下記に提供される。
例えば、核酸配列は、本明細書の上記で考察したような遺伝子合成技術を使って構築可能である。遺伝子合成または日常的分子生物学技術は、また、ヌクレオチドの挿入、欠失、追加または置換を行うために使用できる。例えば、追加のヌクレオチド配列を核酸配列に連結可能である。一例では、リンカー配列が付加され、それにより、配列が合成遺伝子をベクター、例えば、タンパク質発現ベクターまたは抗体定常領域をコードするDNA配列の増幅のために設計されたベクター、中に挿入するための制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。さらに、機能性DNA配列を特定する追加のヌクレオチド配列が核酸分子をコードする組換え生殖系列に機能的に連結されうる。このような配列の例には、これに限定されないが、細胞内のタンパク質発現を促進するように設計されたプロモーター配列、およびタンパク質分泌を促進するように設計されたリーダーペプチド配列、が含まれる。さらなるヌクレオチド配列、例えば、タンパク質結合領域を特定する配列も、結合した核酸配列に結合可能である。このような領域には、これに限定されないが、組換え抗体またはその断片を特異的標的細胞中に取り込みを促進するか、またはそうでなければ、合成遺伝子の薬物動態を高める配列、が含まれる。
核酸配列は、本明細書記載のように、例えば、変異誘発により、さらに操作し、変異体抗体を生成することが可能である。変異誘発は、遺伝子合成により全体的に行うことができる。例えば、変異抗体をコードするために、核酸分子をマニュアルで、またはコンピュータシミュレーションにより合成のための設計ができる。遺伝子合成方法を使う利点は、本明細書で前に考察したように、生じた核酸分子がインフレームであり、「増殖性」であるように変異をさせることができることである。他の合成方法は、遺伝子合成の間に無作為化が達成できる場合に登場する。例えば、オリゴヌクレオチドの合成で、ノンネイティブのホスホラミダイトを「ドープ」して、ランダム変異誘発の標的とされる遺伝子部位の無作為化が生じるプロトコルが開発されている(Wang and Hoover(1997)J.Bacteriol.、179:5812−9)。この方法は、位置選択を制御し、一方でランダム置換比率を保持することを可能にする。あるいは、変異誘発を他の分子生物学技術を使って行うことができる。通常、部位特異的変異誘発戦略が採用できる。
変異抗体を作るために使用される他の最新の方法には、これに限定されないが、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応(Caldwell and Joyce(1992);Gram et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.、89:3576−80);最適化されるべき特異的領域が合成的に変異誘発されたオリゴヌクレオチドで置換されるカセット変異導入(Stemmer and Morris(1992)Biotechniques、13:214−20);Arkin and Youvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.、89:7811−7815;Oliphant et al.(1986)Gene、44:177−83;Hermes et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci、87:696−700);変異頻度を増やすための主細胞の変異誘発株の使用(Greener et al.(1997)Mol.Biotechnol.、7:189−95);DNAシャフリング(Crameri et al.(1998)Nature、391:288−291;米国特許第6、177、263号;同5、965、408号;Ostermeier et al.(1999)Nat.Biotechnol.、17:1205−1209);および他のランダム変異誘発方法、が挙げられる。
本明細書で提供される抗体は、完全長抗体、または、Fab、Fabヒンジ断片、scFv断片、scFvタンデム断片ならびにscFvヒンジおよびscFvヒンジ(ΔE)断片を含む(これに限定されない)完全長より短い抗体として生成または発現可能である。様々な技術が抗体断片の産生のために開発されてきた。従来から、これらの断片は、インタクト抗体のタンパク分解性消化経由で生成された(例えば、Morimoto et al.(1992)Journal of Biochemical and Biophysical Methods、24:107−117;Brennance et al.(1985)Science、229:81、参照)。また、断片は、組換え型宿主細胞により直接的に産生することも可能である。Fab、FvおよびscFv抗体断片は全て、大腸菌等の宿主細胞中で発現し、そこから分泌され、その結果、これらの大量の断片を容易に産生することを可能にしている。また、Fab’−SH断片は化学的に結合してF(ab’)2断片を形成できる(Carter et al.(1992)Bio/Technology、10:163−167)。別の手法により、F(ab’)2断片は組換え型宿主細胞培養から直接単離可能である。他の例では、選択抗体は単鎖Fv断片(scFv)である(例えば、国際公開第93/16185号;米国特許第5、571、894号および同5、587、458号参照)。FvおよびsFvは、定常領域を欠いているインタクト結合部位を有する唯一の種である;従って、それらは、インビボでの使用の間の低減した非特異的結合に適している。sFvのアミノまたはカルボキシ末端でエフェクタータンパク質の融合体を得るようにsFv融合タンパク質を構築可能である。抗体断片は、また、直鎖抗体であってもよい(例えば、米国特許第5、641、870号、参照)。このような直鎖抗体断片は、単一特異性でも、または二重特異性でもよい。抗体断片または抗体多量体の産生のための他の技術も当業者に既知である。
例えば、発現時に、抗体重鎖および軽鎖がジスルフィド結合で対形成し、完全長抗体またはその断片を形成する。例えば、完全長Igの発現のために、VH−CH1−ヒンジ−CH2−CH3をコードする配列を第1の発現ベクターに挿入し、VL−CLドメインをコードする配列を第2の発現ベクターに挿入することができる。VL−CLドメインをコードする第2の発現ベクターとの同時発現により、完全長抗体が発現する。別の例では、Fabを生成するために、VH−CH1をコードする配列を第1の発現ベクターに挿入し、VL−CLドメインをコードする配列を第2の発現ベクターに挿入できる。重鎖が軽鎖と対形成し、Fabモノマーが生成する。この例では、本明細書の別のところで記載しているように、代表的ベクターはプラスミドA、C、DおよびEを含む。種々のIgGサブタイプのCH1、ヒンジ、CH2および/またはCH3の配列は、当業者には既知である(例えば、米国特許公開第20080248028号参照;また配列番号2922も参照)。同様に、CL、ラムダまたはカッパ、の配列もまた、既知である(例えば、米国特許公開第20080248028号参照;また、配列番号2923〜2924も参照)。
1.ベクター
可変重鎖または可変軽鎖をコードする核酸の発現のためのベクターが本明細書で提供されている。通常、原核細胞または真核細胞の形質転換の前に、抗体ポリペプチドをコードする核酸が中間体ベクター中に挿入される。ベクターの選択は所望の用途による。例えば、核酸の挿入後、ベクターは、通常は、宿主細胞を形質転換するために、例えば、その複製および/または発現のために抗体遺伝子を増幅するために使われる。このような例では、高レベル発現に適したベクターが使われる。別の例では、細胞表面上に発現したポリペプチドのディスプレイに適合するベクターが選定される。
抗体ポリペプチドをコードする核酸は、通常、原核細胞または真核細胞の形質転換の前にベクター中に挿入される。ベクターの選択は所望の用途に依存する。例えば、核酸の挿入後、ベクターは、通常は、宿主細胞を形質転換するために、例えば、その複製および/または発現のために抗体遺伝子を増幅するために使われる。このような例では、高レベル発現に適したベクターが使われる。発現は、当業者に既知のいずれの細胞発現系でも可能である。代表的発現用細胞には、これに限定されないが、293FS細胞、HEK293−6E細胞またはCHO細胞、が含まれる。他の発現ベクターおよび宿主細胞は、下記に記載する。
一般的に、抗体の重鎖をコードする核酸がベクター中に挿入され、また、抗体の軽鎖をコードする核酸がベクター中に挿入される。遺伝子を、その二重発現のために単一ベクターに、または別々のベクターに、挿入できる。必要に応じ、ベクターはまた、追加の定常領域またはヒンジ部をコードするさらなる配列を含み、他の抗体形態を生成することもできる。
多くの発現ベクターが利用可能で、抗体またはその一部の発現のために、当業者に既知である。発現ベクターの選択は宿主発現系の選択に影響される。このような選択は、当業者の技量の範囲内で充分処理できることである。一般的に、発現ベクターは、転写プロモーターおよび任意選択のエンハンサー、翻訳シグナル、および転写と翻訳の終止シグナル、を含んでもよい。安定な形質転換のために使われる発現ベクターは、通常、形質転換細胞の選択と維持を可能にする選択可能マーカーを有する。一部の例では、複製起点は、細胞中のベクターのコピー数を増幅するために使用可能である。また、ベクターは、通常、連結された核酸分子に機能的に連結された追加のヌクレオチド配列を含むこともできる(例えば、Hisタグ、Flagタグ)。本明細書の目的のために、ベクターは、通常、定常領域をコードする配列を含む。従って、組換え抗体またはその一部もまた、タンパク質融合体として発現可能である。例えば、融合体を生成させ、ポリペプチドに対し追加の機能を加えることも可能である。融合タンパク質の例には、これに限定されないが、シグナル配列の融合体、エピトープタグ、例えば、局在化用の、例えば、his6タグまたはmycタグ、または精製用タグ、例えば、GST融合体、およびタンパク質分泌および/または膜結合指示用配列、が含まれる。
例えば、タンパク質の発現は、当技術分野で既知のいずれかのプロモーター/エンハンサーにより制御可能である。適切な細菌性プロモーターは当技術分野でよく知られ、本明細書で下記に記載されている。他の哺乳動物細胞、酵母細胞および昆虫細胞用の適切なプロモーターは、当技術分野でよく知られており、一部は以下に例示されている。異種の核酸の発現を指示するために使用されるプロモーターの選択は、特定の用途に依存する。使用されるプロモーターには、これに限定されないが、SV40早期プロモーターを含む真核生物発現ベクター(Bernoist and Chambon、Nature 290:304−310(1981))、ラウス肉腫ウイルスの3’末端反復配列中に含まれるプロモーター(Yamamoto et al.Cell 22:787−797(1980))、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1441−1445(1981))、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinster et al.、Nature 296:39−42(1982));原核生物発現ベクター、例えば、β−ラクタマーゼプロモーター(Jay et al.、(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:5543)またはtacプロモーター(DeBoer et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21−25(1983));また、Scientific American 242:79−94(1980)中の「組換え型細菌由来有用なタンパク質」を参照);ノパリン合成酵素プロモーター含有植物発現ベクター(Herrara−Estrella et al.、Nature 303:209−213(1984))またはカリフラワーモザイクウイルス35SRNAプロモーター(Gardner et al.、Nucleic Acids Res.9:2871(1981))、および光合成酵素リブロース二リン酸脱炭酸酵素のプロモーター(Herrera−Estrella et al.、Nature 310:115−120(1984));酵母および他の真菌由来のプロモーター配列、例えば、Gal4プロモーター、アルコール脱水素酵素プロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリフォスファターゼプロモーター、および組織特異性を示し、遺伝子導入動物で使用された次の動物転写制御領域:膵腺房細胞中で活性なエラスターゼI遺伝子制御領域(Swift et al.、Cell 38:639−646(1984);Ornitz et al.、Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399−409(1986);MacDonald、Hepatology 7:425−515(1987));膵臓ベータ細胞中で活性なインスリン遺伝子制御領域(Hanahan et al.、Nature 315:115−122(1985))、リンパ球系細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域(Grosschedl et al.、Cell 38:647−658(1984);Adams et al.、Nature 318:533−538(1985);Alexander et al.、Mol.Cell Biol.7:1436−1444(1987))、精巣、乳房、リンパ球およびマスト細胞中で活性なマウス房腫瘍ウイルス制御領域(Leder et al.、Cell 45:485−495(1986))、肝臓で活性なアルブミン遺伝子制御領域(Pinckert et al.、Genes and Devel.1:268−276(1987))、肝臓中で活性なアルファフェトプロテイン遺伝子制御領域(Krumlauf et al.、Mol.Cell.Biol.5:1639−1648(1985);Hammer et al.、Science 235:53−581987))、肝臓で活性なアルファ1抗トリプシン遺伝子制御領域(Kelsey et al.、Genes and Devel.1:161−171(1987))、骨髄性細胞中有で活性なベータグロビン遺伝子制御領域(Magram et al.、Nature 315:338−340(1985);Kollias et al.、Cell 46:89−94(1986))、脳のオリゴデンドロサイト細胞中で活発なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域(Readhead et al.、Cell 48:703−712(1987))、骨格筋中で活発なミオシン軽鎖2遺伝子制御領域(Shani、Nature 314:283−286(1985))、および視床下部の性腺刺激ホルモン分泌細胞で活性な性腺刺激性放出ホルモン遺伝子制御領域(Mason et al.、Science 234:1372−1378(1986))、が含まれる。
プロモーターに加えて、発現ベクターは、通常、宿主細胞で抗体、またはその一部の発現に必要な全ての追加の配列を含む転写ユニットまたは発現カセットを含む。典型的な発現カセットには、生殖系列抗体鎖および転写物の効率的なポリアデニル化に必要なシグナルをコードする核酸配列に機能的に連結されたプロモーター、リボソーム結合部位ならびに翻訳終結部位が含まれる。カセットの追加の配列には、エンハンサーを含んでもよい。さらに、カセットは、通常、効率的な終結を提供するための構造遺伝子の下流の転写終止領域を含む。終止領域は、同じ遺伝子からプロモーター配列として得るか、または異なる遺伝子から得ることができる。
一部の発現系は、遺伝子増幅を提供するマーカー、例えば、チミジンキナーゼおよびジヒドロ葉酸還元酵素を有する。あるいは、ポリへドロンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指揮下で昆虫細胞のバキュロウイルスベクターを使う、等の遺伝子増幅を伴わない、生殖系列抗体鎖をコードする核酸配列を有する高収率発現系もまた適切である。
代表的発現ベクターには、任意の哺乳類発現ベクター、例えば、pCMVが含まれる。細菌発現に対しては、このようなベクターには、pBR322、pUC、pSKF、pET23D、ならびに融合体ベクター、例えば、MBP、GSTおよびLacZ、が含まれる。代表的なこのようなベクターは細菌発現ベクター、例えば、本明細書記載のプラスミドA、プラスミドC、プラスミドDおよびプラスミドE、である。他の真核生物ベクター、例えば、真核生物ウイルス由来の調節配列を含むいずれかは、真核生物発現ベクターとして使用可能である。これらには、例えば、SV40ベクター、パピローマウイルスベクター、およびEpstein−Barウイルス由来のベクターが含まれる。他の代表的真核生物ベクターには、pMSG、pAV009/A+、pMT010/A+、pMAMneo−5、バキュロウイルスpDSCE、およびCMVプロモーター、SV40早期プロモーター、SV40後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス房腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリへドロンプロモーター、または真核生物の発現に有効であることがわかっている他のプロモーター、の指揮下でタンパク質の発現を可能とするいずれかのベクター、が含まれる。
抗体の可変領域をコードする核酸配列に機能的に連結された抗体の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供可能である。ベクターは、CH1、CH2、CH3またはCH4および/またはCLの1つまたは全てのための配列を含むことができる。通常、Fabの発現等のために、ベクターは、CH1またはCLのための配列を含む。一例では、抗体の重鎖をコードする核酸は、第1の発現ベクター中に連結され、抗体の軽鎖をコードする核酸は、第2の発現ベクター中に連結される。発現ベクターは同じであっても異なっていてもよいが、通常は、それらは、同程度のタンパク質(重鎖および軽鎖)の発現を可能にするのに充分な適合性がある。第1と第2の発現ベクターは、通常、宿主細胞に1:1の比率で同時形質移入される。代表的なベクターには、これに限定されないが、pg1HCおよびpkLC、が含まれる(Tiller et al.(2008)J Immunol.Methods、329:112−24)。他の発現ベクターには、軽鎖発現ベクターpAG4622および重鎖発現ベクターpAH4604、が含まれる(Coloma et al.(1992)J Immunol.Methods、152:89−104)。pAG4622ベクターは、ヒトκ軽鎖のC領域ドメインをコードするゲノム配列およびgpt選択可能マーカーを含む。pAH4604ベクターは、hisD選択可能マーカーおよびヒト重鎖γ1C−領域ドメインをコードする配列を含む。別の例では、重鎖および軽鎖は、重鎖および軽鎖両方用の発現カセットを有する単一ベクターに挿入することができる。他の代表的発現ベクターには、本明細書の別のところで記載のプラスミドA、C、DおよびEが含まれる。
本明細書の目的のために、抗体の組換え可変領域をコードする核酸配列に機能的に連結された抗体の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むベクターが提供される。ベクターは、CH1、CH2、ヒンジ、CH3またはCH4および/またはCLの1つまたは全てのための配列を含むことができる。通常、例えば、Fabの発現のために、ベクターは、CH1(配列番号2922のアミノ酸1〜103)またはCL(カッパ軽鎖に関しては、配列番号2923参照;ラムダ軽鎖に関しては、配列番号2924参照)のための配列を含む。定常領域またはヒンジ部の配列は、当業者には既知である(例えば、米国特許公開第20080248028号、およびCH1(配列番号2922)のアミノ酸1〜103、IgG1ヒンジ部(配列番号2922のアミノ酸104〜119)、IgG1CH2(配列番号2922のアミノ酸120−223)、IgG1CH3(配列番号2922のアミノ酸224〜330)、CLカッパ(配列番号2923)およびCLラムダ(配列番号2924)を含む配列番号2922−2924参照。重鎖定常領域遺伝子(例えば、CH1)を含む代表的なこのようなベクターは、本明細書記載のプラスミドAおよびDである。軽鎖定常領域遺伝子を含む代表的なこのようなベクターは、本明細書記載のプラスミドCおよびEである。
大腸菌細胞の形質転換のための代表的プラスミドベクターには、例えば、本明細書に記載のColE1複製ベクターが含まれる。これら全てのベクターに共通のいくつかの特徴には、(a)pBAD誘導性プロモーター;(b)pBADプロモーターを制御するAraC遺伝子;(c)効率的翻訳のための合成リボソーム結合部位(RBS);(d)多コピー発現を可能とするColE1複製起点;(e)発現したタンパク質をペリプラズムへ移動させるSTIIリーダー配列;(f)f1複製起点;および(g)抗生物質耐性を付与する遺伝子、が含まれる。このようなプラスミドには、プラスミドA(配列番号84)、プラスミドC(配列番号86)、プラスミドD(配列番号85)およびプラスミドE(配列番号87)が含まれる。プラスミドAおよびプラスミドDは、それらが重鎖可変領域のために挿入された遺伝子に機能的に連結された重鎖定常領域(CH1)のための遺伝子を含むので、重鎖抗体遺伝子の発現に利用される。ベクターは、NheIおよびNcoI制限酵素部位を含み、本明細書に記載の組換え抗体遺伝子のクローニングを可能とする。両ベクターは、pUC複製起点、ColE1タイプ複製起点、およびカナマイシン耐性を付与するアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む。プラスミドAは、タンパク質精製用の(His)6タグおよびFlagタグを含む。プラスミドDは、(His)6タグおよびFlagタグの両方を含み、得られたタンパク質のsortaseを使った共有結合を可能とする追加のLPETGタグを含む。プラスミドCおよびプラスミドEは、それらが軽鎖可変領域のために挿入された遺伝子に機能的に連結された軽鎖定常領域(CL)のための遺伝子を含むので、軽鎖抗体遺伝子の発現に利用される。プラスミドCは、カッパ軽鎖に対し特異的であり、BseWIおよびNcoI制限酵素部位を含み、本明細書に記載の組換え抗体遺伝子のクローニングを可能とする。プラスミドEは、ラムダ軽鎖に特異的であり、AcrIIおよびNcoI制限酵素部位を含み、本明細書に記載の組換え抗体遺伝子のクローニングを可能とする。両ベクターは、3.3複製起点、ColE1タイプ複製起点、およびクロラムフェニコール耐性を付与する遺伝子を含む。上述のベクターは、軽鎖ベクターおよび重鎖ベクターが同時形質転換される二重ベクター系で利用されるように設計される。従って、それらは、異なっているが適合性がよい、利用される2つのColE1複製起点、1つは重鎖用、もう一つは軽鎖用、を含む。これにより、ベクターが同時形質転換され、発現する場合に抗体の両鎖の効率的な発現が可能となる。
DNA断片をベクター中へ挿入する当業者に既知のいずれの方法も、抗体鎖をコードする核酸を含む発現ベクターを構築するのに使用可能である。これらの方法には、インビトロ組換えDNAおよび合成技術ならびにインビボ組換え(遺伝的組換え)を含むことができる。クローニングベクターへの挿入は、例えば、DNA断片を相補的な付着末端を有するクローニングベクター中へ連結することにより達成できる。クローニングベクターDNAを分解するのに使われる相補的な制限酵素部位が無ければ、DNA分子の末端は酵素的に修飾されうる。あるいは、いずれかの所望の部位をヌクレオチド配列(リンカー)をDNA末端に連結することにより産生可能である;これらの連結されたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特定の化学合成核酸を含んでもよい。
2.細胞および発現系
また、ベクター含有細胞も提供される。通常、異種のDNAを発現するように操作でき、分泌経路を有するいずれの細胞型も安定である。発現宿主には、原核生物および真核生物、例えば、細菌性細胞(例えば、大腸菌)、酵母細胞、真菌細胞、古細菌、植物細胞、昆虫細胞およびヒト細胞を含む動物細胞が含まれる。発現宿主は、タンパク質産生レベルならびに発現タンパク質上に存在する翻訳後修飾物の型が異なる可能性がある。さらに、発現宿主の選択は、ベクターの選択ならびに使われる転写および翻訳配列に関連することが多い。例えば、発現宿主の選択は、必ずではないが、使用される前駆体配列の選択に依存することが多い。例えば、多くの異種のシグナル配列は、同じ種の宿主細胞中でのみ発現できる(すなわち、昆虫細胞シグナル配列は昆虫細胞中で最適に発現する)。対照的に、他のシグナル配列、例えば、酵母、昆虫、または哺乳類宿主細胞中でうまく作用するヒト血清アルブミン(hHSA)シグナル配列、ならびに昆虫および哺乳動物細胞中で機能的であることが示された組織プラスミノーゲンアクチベータープレプロ配列(Tan et al.、(2002)Protein Eng.15:337)は、異種の宿主中で使用可能である。発現宿主の選択は、これらおよび他の因子、例えば、調節および安全性の考慮、生産コストならびに精製の必要性と方法に基づいて行うことができる。従って、ベクター系は、使われる宿主細胞と適合性がなければならない。
真核生物宿主中での発現には、酵母、例えば、出芽酵母およびピキアパストリス、昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエ細胞および鱗翅目の昆虫の細胞、植物および植物細胞、例えば、タバコ、トウモロコシ、コメ、藻類、およびアオウキクサ属中の発現を含むことができる。また、発現用の真核細胞には、哺乳動物細胞株、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞またはベビーハムスター腎臓(BHK)細胞が含まれる。また、真核生物発現宿主には、例えば、血清、ミルクおよび卵中の産物を含む遺伝子導入動物中の産物が含まれる。
組換え型分子は、例えば、形質転換、トランスフェクション、感染、電気穿孔およびソノポレーションにより宿主細胞中に導入可能であり、それにより、多くの遺伝子配列の複製が生成される。通常、標準的トランスフェクション方法が、大量の抗体鎖を発現する細菌、哺乳類、酵母、または昆虫細胞株を産生するために使用され、次いで、標準的な方法を使って精製される(例えば、Colley et al.(1989)J.Biol.Chem.、264:17619−17622;「酵素学における方法」、vol.182(Deutscher、ed.)、1990中の「タンパク質精製ガイド」、参照)。真核生物および原核細胞の形質転換は、標準的な方法に従って行われる(例えば、Morrison(1977)J.Bact.132:349−351;Clark−Curtiss and Curtiss(1983)「酵素学における方法」、101、347−362、参照)。例えば、外部ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するためのいずれかのよく知られた方法を使用可能である。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、電気穿孔、遺伝子銃、リポソーム、微量注入、血漿ベクター、ウイルスベクターおよびクローン化ゲノムDNA、相補DNA、合成DNAまたは他の外部遺伝物質を宿主細胞中に導入する他のよく知られたいずれかの方法の使用が含まれる。通常、本明細書の目的のために、宿主細胞は、少なくともVH鎖をコードする第1のベクターおよび少なくともVL鎖をコードする第2のベクターを形質移入される。従って、使用される特定の遺伝子工学的手法により、少なくとも両遺伝子が生殖系列、またはその改変型の抗体ポリペプチドを発現可能な宿主細胞中へ成功裏に導入されることのみが必要である。
単離された組換え可変領域遺伝子、相補DNA、または合成DNA配列を組み込んだ宿主細胞の組換えDNA分子による形質転換により、遺伝子の複数の転写物の生成が可能となる。従って、遺伝子は、形質転換体を繁殖させ、形質転換体から組換えDNA分子を単離し、さらに必要に応じ、単離組換えDNAから挿入された遺伝子を回収することにより、大量に得ることができる。通常、発現ベクターが細胞中に導入された後に、生殖系列鎖の発現に適した条件下で形質移入細胞を培養し、下記で示されている標準的精製技術を使って、培養物から回収される。
抗体およびその一部は、当技術分野でタンパク質産生のために既知のいずれかの高スループット手法を使って産生可能である。これらの手法には、インビトロおよびインビボ方法、例えば、抗体またはその一部をコードする核酸分子の宿主細胞または宿主動物中への導入、および抗体をコードする核酸分子からのインビトロ発現を含む。原核生物、特に大腸菌は、大量の抗体またはその一部の産生のためのシステムを提供し、タンパク質の高スループット発現および精製を適用する場合、特に望ましい。大腸菌の形質転換は当業者によく知られた単純かつ迅速な技術である。高スループット発現用大腸菌宿主株には、これに限定されないが、BL21(EMD Biosciences)およびLMG194(ATCC)がある。代表的なこのような大腸菌宿主株は、BL21である。高スループット発現用ベクターには、これに限定されないが、pBR322およびpUCベクターが含まれる。代表的なこのようなベクターは、本明細書に記載のベクターで、プラスミドA、プラスミドC、プラスミドDおよびプラスミドEが含まれる。発現と精製の自動化により、高スループット発現を促進可能である。例えば、細胞培養を自動化採取、溶解および精製ユニットと組み合わせた完全自動化システムであるPiccolo(登録商標)システム(Wollertonetal.(2006)JALA、11:291−303)、または他の類似のロボットシステムが採用できる。
a.原核生物発現
原核生物、特に、大腸菌は、大量の抗体またはその一部を産生するためのシステムを提供する。大腸菌の形質転換は、当業者によく知られた単純かつ迅速な技術である。大腸菌用発現ベクターは、高レベルのタンパク質の発現の誘導および宿主細胞に対し何らかの毒性を示すたんぱく質の発現のために有用な誘導性プロモーターを含むことが可能である。誘導性プロモーターの例には、ラックプロモーター、trpプロモーター、ハイブリッドtacプロモーター、T7およびSP6RNAプロモーターならびに温度調節λPLプロモーター、が含まれる。
抗体またはその一部は、大腸菌の細胞質環境中で発現可能である。細胞質は、還元環境であり、一部の分子にとって、これにより、不溶性の封入体の形成が起こりうる。還元試薬、例えば、ジチオトレイトールおよびβ−メルカプトエタノールおよび変性剤(例えば、グアニジン−HClおよび尿素)をタンパク質の可溶化のために使用できる。代表的代替手法は、細菌細胞周辺腔中での抗体またはその断片の発現であり、これにより、酸化環境、ならびにシャペロニン様およびジスルフィドイソメラーゼが提供され、可溶性タンパク質の産生につながる。通常、リーダー配列が、発現のためにタンパク質に融合され、これがタンパク質をペリプラズムに移動させる。その後、リーダーは、ペリプラズム内のシグナルペプチダーゼにより除去される。発現したタンパク質をペリプラズムに移動させる3つの主要経路がある。すなわち、Sec経路、SRP経路およびTAT経路である。ペリプラズム標的リーダー配列の例には、ペクチン酸リアーゼ遺伝子由来のpelBリーダー、StIIリーダー配列、およびDsbAリーダー配列が含まれる。代表的リーダー配列は、DsbAリーダー配列である。いくつかの例では、ペリプラズム発現は、発現したタンパク質の培地中への漏出を可能とする。タンパク質の分泌は、培養上清からの迅速かつ単純な精製を可能とする。分泌されないタンパク質は、浸透圧溶解によりペリプラズムから得ることができる。細胞質発現と同様に、一部の例では、タンパク質が不溶性になり、変性および還元試薬が可溶化およびリフォールディングを促進するため使用できる。誘導と増殖温度も影響発現レベルおよび溶解度に影響しうる。通常、25℃〜37℃の温度が使われる。変異もまた、発現したタンパク質の溶解度を高めるために使用可能である。通常、細菌は、グリコシル化されたタンパク質を産生する。従って、タンパク質が機能のためにグリコシル化が必要な場合、グリコシル化は、宿主細胞からの精製後、インビトロで追加可能である。
b.酵母
酵母、例えば、出芽酵母、分裂酵母、アルカン資化酵母、クルイベロミセス・ラクチス、およびピキアパストリスが組換え抗体またはその一部のための有用な発現宿主である。酵母は、エピソーム複製ベクターにより、または相同組換えによる安定な染色体の統合により形質転換可能である。通常、遺伝子発現を調節するために、誘導性プロモーターが使用される。このようなプロモーターの例には、AOX1、GAL1、GAL7、およびGAL5ならびにメタロチオネインプロモーター、例えば、CUP1が含まれる。発現ベクターには、選択可能マーカー、例えば、形質転換DNAの選択および維持のためのLEU2、TRP1、HIS3、およびURA3、が含まれることが多い。酵母中で発現したタンパク質は可溶性であることが多い。Bip等のシャペロニンとタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの同時発現により、発現レベルと溶解度が改善する。さらに、酵母中で発現したタンパク質は、分泌シグナルペプチド融合体、例えば、サッカロミセス・セレビジエ由来の酵母接合タイプアルファ因子分泌シグナル、および酵母細胞表面タンパク質との融合体、例えば、接着受容体またはアークスラ・アデニニボランスグルコアミラーゼと結合したAga2p、を使って分泌を誘導されうる。例えば、Kex−2プロテアーゼのためのプロテアーゼ開裂部位を、操作して、それらが分泌経路から出る際に融合配列を発現したポリペプチドから除去できる。酵母は、また、Asn−X−Ser/Thrモチーフの位置でグリコシル化可能である。
c.昆虫
昆虫細胞、特に、バキュロウイルス発現を使う場合の昆虫細胞は、抗体またはその一部の発現に有用である。昆虫細胞は、高レベルのタンパク質を発現し、高等真核生物により使われる大抵の翻訳後修飾が可能である。バキュロウイルスは、宿主範囲が限られており、このために安全性が改善され、真核生物発現に対する制御事項が減る。通常、発現ベクターは高レベル発現用プロモーター、例えば、バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターおよびp10プロモーターを使用する。通常使われるバキュロウイルス系には、バキュロウイルス、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス(AcNPV)、およびカイコ核多角体病ウイルス(BmNPV)および昆虫細胞株、例えば、ヨトウガ由来Sf9およびイラクサギンウワバ由来TN、が含まれる。高レベル発現のために、発現される分子のヌクレオチド配列が、ウイルスのポリへドリン開始コドンのすぐ下流に融合される。ヒト抗体を発現可能なバキュロウイルス組換えを行うために、二重発現導入ベクター、例えば、pAcUW51(PharMingen)が利用される。哺乳類動物の分泌シグナルは、昆虫細胞中で正しく処理され、発現したタンパク質を培地中へ分泌させるのに使用可能である。
別の昆虫細胞発現系は、安定に形質転換された細胞を使うことである。細胞株、例えば、ヨトウガの細胞由来のSf9およびイラクサギンウワバの細胞由来のTNが発現に使用可能である。バキュロウイルス最初期の遺伝子プロモーターIE1が安定したレベルの発現を誘導するために使用可能である。典型的発現ベクターには、pIE1−3およびpI31−4導入ベクター(Novagen)が含まれる。発現ベクターは、通常、選択可能マーカー、例えば、ネオマイシンおよびヒグロマイシンを使って維持される。
d.哺乳動物細胞
哺乳類発現系は、抗体またはその一部を発現するのに使用可能である。発現構築物は、アデノウイルス等のウイルス感染により、または、リポソーム、リン酸カルシウム、DEAEデキストラン、等の直接移入により、ならびに電気穿孔および微量注入等の物理的手段により、哺乳動物細胞中に移入可能である。哺乳動物細胞用の発現ベクターは、通常、mRNAキャップ部位、TATAボックス、翻訳開始配列(Kozakコンセンサス配列)およびポリアデニル化配列、を含む。このようなベクターは、高レベル発現用転写プロモーター−エンハンサー、例えば、SV40プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウィルス(CMV)プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス(RSV)の末端反復配列、を含むことが多い。これらのプロモーター−エンハンサーは、多くの細胞型中で活性である。組織および細胞型プロモーターおよびエンハンサー領域もまた、発現のために使用できる。代表的プロモーター/エンハンサー領域には、これに限定されないが、エラスターゼI、インスリン、免疫グロブリン、マウス房腫瘍ウイルス、アルブミン、アルファフェトプロテイン、アルファ1抗トリプシン、ベータグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖2、および性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御、等の遺伝子由来の領域が含まれる。選択可能マーカーが発現構築物を含む細胞の選択と維持に使用可能である。選択可能マーカー遺伝子の例には、これに限定されないが、ヒグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素およびチミジンキナーゼ、が含まれる。抗体は、通常、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)系またはグルタミンシンテターゼ(GS)系、を使って産生される。GS系は、共発現ベクター、例えば、pEE12/pEE6、を使って重鎖と軽鎖の両方を発現する。細胞表面シグナル伝達分子、例えば、TCR−ζおよびFcεRI−γを有する融合体は、細胞表面にある活性状態のタンパク質の発現を指示することができる。
多くの細胞株が、マウス、ラット、ヒト、サル、ニワトリおよびハムスター細胞を含む哺乳類発現のために利用可能である。代表的細胞株には、これに限定されないが、CHO、Balb/3T3、HeLa、MT2、マウスNS0(非分泌性)および他のミエローマ細胞株、ハイブリドーマおよびヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、2B8、およびHKB細胞、が含まれる。また、細胞培地からの分泌タンパク質の精製を促進する無血清培地に適合された細胞株も利用可能である。このような例の1つに、無血清EBNA−1細胞株がある(Pham et al.、(2003)Biotechnol.Bioeng.84:332−42)。
e.植物
遺伝子導入植物細胞および植物は、タンパク質、例えば、本明細書に記載のいずれかの抗体またはその一部を発現するのに使用可能である。発現構築物は、通常、直接DNA移入、例えば、微粒子銃およびPEG媒介プロトプラストへの移入、およびアグロバクテリウム媒介形質転換によって植物に導入される。発現ベクターには、プロモーターおよびエンハンサー配列、転写終止配列および翻訳調節配列を含むことができる。発現ベクターおよび形質転換技術は、通常、双子葉植物宿主、例えば、シロイヌナズナおよびタバコ、と単子葉植物宿主、例えば、トウモロコシおよびコメ、の間で異なる。発現に使用される植物プロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルスCaMV35Sプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、リボース二リン酸カルボキシラーゼプロモーターおよびトウモロコシユビキチン−1(ubi−1)プロモーターが含まれる。選択可能マーカー、例えば、ヒグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼが、形質転換細胞の選択と維持を促進するために使用されることが多い。形質転換細胞は、細胞、凝集物(カルス組織)として培養物中で維持でき、または全植物に再生することができる。遺伝子導入植物細胞には、また、ロテアーゼまたは改変ロテアーゼを産生するように操作された藻類を含むこともできる(例えば、Mayfield et al.(2003)PNAS 100:438−442、参照)。植物は哺乳動物細胞とは異なるグリコシル化パターンを有するため、これは、これらの宿主中で産生されたタンパク質の選択に影響する可能性がある。
3.精製
抗体およびその一部は、当業者に既知のいずれかの方法により精製される。本明細書の方法で精製される、または使われる抗体は、当技術分野で既知の標準的タンパク質精製技術を使って実質的な純度に精製できる。これらの技術には、これに限定されないが、SDS−PAGE、サイズ分画およびサイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿法、キレートクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたはカラムクロマトグラフィー、が含まれる。例えば、抗体は、カラムクロマトグラフィーで精製できる。抗体を精製する代表的な方法は、カラムクロマトグラフィーを使うことによる方法で、固体支持体カラム材料が連鎖球菌由来の細胞表面結合タンパク質であるタンパク質Gに連結され、これが結合免疫グロブリンと高親和性で結合する。抗体は、60%、70%、80%の純度に精製可能で、典型的には、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の純度に精製できる。純度は標準的な方法、例えば、SDS−PAGEおよびクーマシー染色により評価可能である。
抗体またはその一部の宿主細胞からの精製方法は、選択された宿主細胞および発現系に依存する。分泌分子に対しては、タンパク質は、通常、細胞除去後、培地から精製される。細胞内の発現に対しては、細胞を溶解し、タンパク質は抽出物から精製される。遺伝子導入生物、例えば、遺伝子導入植物および動物が発現に使用される場合には、組織または器官は、溶解細胞抽出物を作る出発材料として使用することができる。さらに、遺伝子導入動物産生には、ミルクまたは卵中でのポリペプチドの産生を含むことができ、集めて、さらなる必要に応じ、タンパク質を抽出し、当技術分野で標準的な方法を使ってさらに精製できる。
抗体が形質転換細菌により大量に発現する場合、発現は恒常的でありうるが、通常、プロモーター誘導後、ポリペプチドが不溶性凝集物を形成する可能性がある。当業者に既知のポリペプチド封入体の精製に適したいくつかのプロトコルが存在する。多くの変形が当業者には明らかであろう。
例えば、1つの方法では、細胞懸濁液が、通常、遠心分離され、封入体含有ペレットが緩衝液中で再懸濁される。この緩衝液は、封入体を溶解しないで洗浄するもので、例えば、20mMトリス塩酸(pH7.2)、1mM EDTA、150mM NaClおよび2%トリトン−X100、の非イオン性洗剤である。洗浄ステップを繰り返し、細胞性壊死組織片を可能な限り除去することが必要となろう。残りの封入体ペレットは適切な緩衝液(例えば、20mM ナトリウムリン酸塩、pH6.8、150mM NaCl)中で再懸濁できる。他の適切な緩衝液は当業者には自明である。
あるいは、抗体は、細菌ペリプラズムから生成できる。ポリペプチドが細菌のペリプラズムへ搬出される場合は、細菌のペリプラズム画分は当業者に既知の他の方法に加えて冷浸透圧ショックで単離できる。例えば、ペリプラズムから組換え型ポリペプチドを単離する1つの方法では、細菌性細胞を遠心分離し、ペレットを形成する。このペレットを20%ショ糖含有緩衝液に再懸濁する。細胞を溶解するために、細菌を遠心分離し、ペレットを氷冷した5mM MgSO4に再懸濁し、氷浴中で約10分間保持する。細胞懸濁液を遠心分離し、上清をデカンテーションし、保存する。上清中に存在する組換え型ポリペプチドを当業者よく知られた標準的分離技術により宿主タンパク質から分離できる。これらの方法には、これに限定されないが、次の工程を含む:溶解度分画、サイズ差次的濾過、およびカラムクロマトグラフィー。
G.抗DLL4活性化因子/モジュラー抗体およびその使用
ヒトデルタ様リガンド4(DLL4)に特異的に結合し、DLL4活性の活性化因子/モジュレーターである抗DLL4多量体抗体が、本明細書で提供される。従って、多量体抗体は、血管新生阻害治療薬として使用し、過剰または異常血管新生を特徴とする疾患または障害、例えば、癌または黄斑変性を治療することができる。
1.DLL4
a.構造
DLL4(配列番号2904に設定;また、ヌクレオチド配列(配列番号2905に設定)によりコードされる)は、Notch膜貫通受容体に対する膜貫通タンパク質リガンドである。細胞外の領域は、8EGF様反復、ならびに全Notchリガンドの間で保存され、受容体結合に必要なDSLドメインを含む。また、タンパク質は、膜貫通領域、およびどのような触媒的モチーフも存在しない細胞質側末端を含む。ヒトDLL4は685アミノ酸タンパク質で、配列番号2904に設定のアミノ酸に対応する次のドメインを含む:シグナルペプチド(アミノ酸1〜25);MNNL(アミノ酸26〜92);DSL(アミノ酸155〜217);EGF様1(EGF1;アミノ酸221〜251);EGF様2(EGF2;アミノ酸252〜282);EGF様3(EGF3;アミノ酸284〜322);EGF様4(EGF4;アミノ酸324〜360);EGF様5(EGF5;アミノ酸366〜400);EGF様6(EGF6;アミノ酸402〜438);EGF様7(EGF7;アミノ酸440〜476);EGF様8(EGF8;アミノ酸480〜518);膜貫通(アミノ酸529〜551);および細胞質ドメイン(アミノ酸553〜685)。
b.発現
DLL4は種々の組織で広範に発現しているが、その発現は、主に脈管構造に局在化している。それは正常な血管成長に必要であり、腫瘍血管上に発現する。それは腫瘍血管新生中の血管中で発現上昇しており、発現はVEGFシグナル伝達に依存している。また、DLL4は、炎症促進性刺激、例えば、リポ多糖類、インターロイキン−1β、Toll様受容体4リガンドおよび他の炎症促進性の刺激に曝された活性化マクロファージ上に発現し、Notch経路を介したそのシグナル伝達はマクロファージ活性化を特徴とする炎症性状態である種の役割を果たす(Fung et al.(2007)Circulation、115:2948−2956)。
c.機能
DLL4はNotch受容体に結合する。進化的に保存されたNotch経路は、多くの発生過程ならびに出生後の自己更新器官系の主要な制御因子である。無脊椎動物から哺乳動物まで、Notchシグナル伝達は、無数の細胞の運命の決定を通して細胞を誘導し、増殖、分化およびアポトーシスに影響を与える(Miele and Osborne(1999)J Cell Physiol.、181:393−409)。Notchファミリーは、DSL遺伝子ファミリーのリガンドに結合した膜により活性化される、構造的に保存された細胞表面受容体で構成されている(ショウジョウバエ由来のDeltaとSerrateおよび線虫由来のLag−2から名付けられた)。哺乳動物は、4つの受容体(Notch1、Notch2、Notch3およびNotch4)および5つのリガンド(Jag1、Jag2、DLL1、DLL3、およびDLL4)を有する。隣接細胞上のリガンドにより活性化されると、Notch受容体は、連続的タンパク分解性切断;すなわち、ADAMプロテアーゼに媒介された細胞外開裂およびガンマセクレターゼにより媒介された膜貫通ドメイン内開裂、を受ける。これはNotch細胞内ドメイン(NICD)の放出につながり、これが核内に移動し、DNA結合タンパク質、RBP−Jk(CSLforCBF1/Su(H)/Lag−1由来名称のCSLとしても知られる)および他の転写補助因子と転写複合体を形成する。Notch活性化の主要標的遺伝子には、HES(Hairy/Enhance of Split)遺伝子ファミリーおよびHES関連遺伝子(Hey、CHF、HRT、HESR)が含まれ、組織および細胞タイプ特異的な方式で、下流の転写エフェクターを順々に調節する(Iso et al.(2003)J Cell Physiol.、194:237−255;Li and Harris(2005)Cancer Cell、8:1−3)。
Notch受容体によるシグナル伝達は、これに限定されないが、以下に示す造血幹細胞通常の保守および白血病性形質転換を含む様々な細胞プロセスに関係する(HSCs;Kopper & Hajdu(2004)Pathol.Oncol.Res.、10:69−73):通常の保守ならびに脳癌の場合を含む神経幹細胞の維持(Kopper & Hajdu(2004)Pathol.Oncol.Res.、10:69−73;Purow et al.(2005)Cancer Res.65:2353−63;Hallahan et al.、(2004)Cancer Res.64:7794−800);リンパ芽球白血病/リンパ腫の場合を含む多くのヒト癌の発生(Ellisen et al.(1991)Cell、66:649−61;Robey et al.(1996)Cell、87:483−92;Pear et al.(1996)J.Exp.Med.183:2283−91;Yan et al.(2001)Blood 98:3793−9;Bellavia et al.(2000)EMBO J.19:3337−48;Pear & Aster(2004)Curr.Opin.Hematol.、11:416−33);乳癌(Gallahan & Callahan(1987)J.Virol.、61:66−74;Brennan & Brown(2003)Breast Cancer Res.、5:69;Politi et al.(2004)Semin.Cancer Biol.、14:341−7;Weijzenetal.(2002)Nat.Med.、8:979−86;Parr et al.(2004)Int.J.Mol.Med.、14:779−86);子宮頸癌(Zagouras et al.(1995)PNAS、92:6414−8);腎細胞癌(Rae et al(2000)Int.J.Cancer、88:726−32);頭頸部扁平上皮癌(Leethanakul et al(2000)Oncogene、19:3220−4);子宮内膜癌(Suzuki et al.(2000)Int.J.Oncol.、17:1131−9);および神経芽細胞腫(vanLimpt et al.(2000)Med.Pediatr.Oncol.、35:554−8)。また、Notch経路は、増殖、遊走、平滑筋分化、血管新生および動静脈分化を含む血管成長の多くの局面に関与する(Iso et al.(2003)Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.23:543)。
NotchリガンドDLL4は、Notch−1(Uniprot受入番号P46531;配列番号2906)およびNotch−4受容体(Uniprot受入番号Q99466;配列番号2907)と相互作用し、主に脈管構造中に発現する。DLL4の過剰発現の効果を評価する調査により、DLL4が、血管新生、内皮細胞増殖、遊走および血管分岐の負の制御因子であることが明らかにされた(例えば、Trindade et al.(2008)Blood 1:112、参照)。DLL4の抗血管新生活性に対する1つの説明は、これがVEGF応答性遺伝子であり、血管新生促進因子であるVEGFシグナル伝達の負の制御因子として作用するということである。従って、DLL4活性化をターゲティングすることにより、DLL4の抗血管新生活性が促進される。
対照的に、DLL4の遮断は、非生産的血管新生に関連している。DLL4は、血管の新芽形成と分岐を特徴とする血管新生を増加させるが、また、血管機能の低下にも関連し、それにより、腫瘍成長の低下も生ずる(Ridgway et al.(2006)Nature、444:1083;Noguera−Troise et al.(2006)Nature、444:1032)。従って、DLL4の機能は、腫瘍血管密集状態とは切り離された腫瘍成長に起因する無秩序な血管新生と関連している。従って、DLL4シグナル伝達の遮断は、増殖性血管新生を混乱させ、腫瘍成長を効率的に低下させる。従って、また、DLL4抑制のターゲッティングは、血管新生が進行している腫瘍を治療するために使用できる(例えば、国際公開第2009/085209号、参照)。
2.活性化因子/モジュレーター抗DLL4多量体抗体
本明細書で、DLL4活性の活性化因子/モジュレーターである抗体またはその抗体断片が提供される。この抗体は、DLL4の活性を活性化するか、または増加させ、それにより、抗血管新生剤として作用する。例えば、本明細書で提供される抗体多量体は、抗体多量体のない場合の活性化に比べ、DLL4媒介受容体活性化、例えば、DLL4−媒介Notch−1またはNotch−4シグナル伝達の活性化の活性を増加させる。DLL4媒介活性は、抗体多量体が存在しない場合の活性化に比べ、抗体多量体の存在下で、少なくとも1.1倍、例えば、正確にまたは約1.2倍〜5倍の間、例えば、1.1倍、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5倍またはそれ超増加する。従って、抗体は、血管新生疾患または障害を治療するために使用可能である。一部の例では、本明細書で提供される抗体はアゴニストである。他の例では、本明細書で提供される抗体は、Notchシグナル伝達を活性化することによるDLL4の活性化因子/モジュレーターである。
本明細書で提供される抗体多量体は、DLL4との結合に対し、速いオン/オフ速度を示す。特に、抗体は高koffを示す。例えば、単量体Ig断片として評価される場合、本明細書で提供される抗体は、正確にまたは約1s−1〜5x10−2s−1、例えば、0.5s−1〜0.01s−1、例えば、正確にまたは約0.1s−1のkoffを有する。例えば、抗体多量体が特異的にDLL4に結合している限り、本明細書で提供される抗体のkoffは、Fab型で評価した場合、正確にまたは約5x10−2s−1、4x10−2s−1、3x10−2s−1、2x10−2s−1、1x10−2s−1、0.02s−1、0.03s−1、0.04s−1、0.05s−1、0.06s−1、0.07s−1、0.08s−1、0.09s−1、0.1s−1、0.2s−1、0.3s−1、0.4s−1、0.5s−1、0.6s−1、0.7s−1、0.8s−1、0.9s−1、1s−1またはそれより大きい。一部の例では、本明細書で提供される抗体は、単量体Ig断片として評価した場合、0.5s〜150s、例えば、1s〜100s、5s〜50sまたは5s〜10sの解離半減期(t1/2)を示す。例えば、本明細書で提供される抗体のt1/2は、単量体Ig断片として評価した場合、正確にまたは約1s、2s、3s、4s、5s、6s、7s、8s、9s、10s、20s、30s、40s、50s、60s、70s、80s、90s、100s、110s、120s、130s、140sまたは150sである。抗体の動力学的速度定数を測定する方法は当業者には既知である。例えば、Biacore(登録商標)装置を使った表面プラズモン共鳴法を使うことができる(BiaCore Life Science;GE Healthcare)。Biacoreの機器使用および他の機器使用提供サービスが利用可能である(Biosensor Tools;Salt Lake City、UT;biosensortools.com/index.php)。
通常、本明細書で提供される抗体多量体は、一般的に低い結合親和性に示す。例えば、単量体Ig断片として評価した場合、本明細書で提供される抗体は、10−8Mまたはそれ未満の結合親和性を示す。例えば、結合親和性は、10−6M〜10−8M、例えば、4x10−6M〜10−8M、例えば、1x10−7M〜10−8Mである。例えば、本明細書で提供される抗体の結合親和性は、単量体Ig断片として、正確にまたは約1x10−6M、2x10−6M、3x10−6M、4x10−6M、5x10−6M、6x10−6M、7x10−6M、8x10−6M、9x10−6M、1x10−7M、2x10−7M、3x10−7M、4x10−7M、5x10−7M、6x10−7M、7x10−7M、8x10−7M、9x10−7Mまたは1x10−8Mである。結合親和性の評価方法は当業者に既知であり、本明細書のセクションEで記載されている。
本明細書で提供される抗体は、多量体であり、それにより、少なくとも2つの抗原結合部位を含む。通常、本明細書で提供される抗体は、少なくとも2つの可変重鎖、または抗原に結合するのに充分なその一部;および2つの可変軽鎖、または多量体化ドメインにより結合される抗原に結合するのに充分なその一部、を含む。多量体は、単量体免疫グロブリン分子の二量体、三量体、またはさらに高い次数の多量体であってもよい。多量体には、二価の、三価の、四価の、五価、六価、七価、またはさらに大きな結合価(すなわち、2、3、4、5、6、7またはそれ超の抗原結合部位を含む)のものが含まれる。例えば、全免疫グロブリン分子またはF(ab’)2断片の二量体は四価であり、一方、Fab断片またはscFv分子の二量体は二価である。
多量体中の個別の抗体は、同じまたは異なる結合特異性を持つことができる。通常、多量体は、単一特異性であり、DLL4上の同じエピトープに免疫特異的に結合する2つ以上の抗原結合ドメインを含む。一部の例では、2つ以上の異なるエピトープに免疫特異的に結合する2つ以上の抗原結合ドメインを含む多選択性の抗体多量体を生成することができる。エピトープはDLL4エピトープであってもよい。一部の例では、抗体多量体は、DLL4中のエピトープに結合し、また、別の異なる標的抗原中のエピトープにも結合する。
抗体多量体を操作する技術は当技術分野で既知であり、これには、例えば、共有結合、非共有結合、または化学結合を介して2つ以上の可変重鎖および可変軽鎖の結合が含まれる。抗体の多量体化は、抗体の自然凝集または当技術分野で既知の化学的または組換え連結技術により行うことができる。従って、2つの抗体ポリペプチド鎖または抗原結合断片間の多量体化は、自発的であるか、または2つ以上のポリペプチドの強制的結合により生成させることができる。一例では、抗体多量体は、異なるポリペプチド鎖上のシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合により生成させることができる。別の例では、抗体多量体は、共有結合または非共有結合的相互作用を介してポリペプチドを連結することにより生成させることができる。一部の例では、多量体は、ペプチド、例えば、多量体化を促進する特性を有するペプチドリンカー(スペーサー)、またはペプチドから生成することができる。一部の例では、抗体多量体は、例えば、ヘテロ二機能性リンカーを使って、化学結合により形成できる。
例えば、抗体多量体には、VL−CL含有軽鎖およびVH−CH1−ヒンジおよび重鎖の結合が可能とするのに充分なCH2−CH3(または、IgEもしくはIgMクラスの場合CH4)の一部を含有する重鎖を含む抗体が含まれる。精製時には、このような抗体(例えば、完全長IgG1)自然に抗体ホモダイマー含有凝集物、および他のより高次の抗体多量体を形成する。代表的な定常領域は、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgM、およびIgE由来の免疫グロブリン分子の定常領域部分、を含むことができる。抗体領域の配列は既知で、組換えによる抗体多量体を生成するために使用可能である(例えば、米国特許公開第20080248028号、参照)。例えば、軽鎖アミノ酸配列は、CLドメイン、カッパ(配列番号2923に設定)またはラムダ(配列番号2924)を含むことができる。重鎖アミノ酸配列は、IgG1(配列番号2922)、IgG2(配列番号2937)、IgG3(配列番号2925)、IgA(配列番号2926もしくは2927)またはIgM(配列番号2928もしくは2929)サブクラス由来の1つまたは複数のCH1、ヒンジ、CH2、CH3またはCH4を含むことができる。特に、本明細書で提供される抗体多量体は、VL−CL含有軽鎖、およびVH−CH1−ヒンジ−CH2−CH3含有重鎖を含む完全長抗体である。例えば、このような抗体多量体では、生じる抗体分子は、重鎖が軽鎖にジスルフィド結合により結合し、2つの重鎖がジスルフィド結合により相互に結合した少なくとも4つの鎖の分子である。また、重鎖の結合は、重鎖の、ヒンジ部として知られる柔軟な領域により媒介される。
あるいは、抗体ホモダイマーは、当技術分野で既知の化学結合技術により形成可能である。例えば、SMCC[スクシンイミジル4−(マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシラート]およびSATA[N−スクシンイミジルS−アセチルチオ−アセタート](例えば、Pierce Biotechnology、Inc.(Rockford、Ill.)から入手可能)を含むヘテロ二機能性架橋剤(これに限定されない)が、抗体多量体形成のために使用可能である。抗体ホモダイマー形成用の代表的プロトコルが、Ghetie et al.、Proceedings of the National Academy of Sciences USA(1997)94:7509−7514、に記載されている。抗体ホモダイマーは、ペプシン消化によりFab’2ホモダイマーに変換可能である。抗体ホモダイマー形成の別の手法は、Zhao and Kohler、The Journal of Immunology(2002)25:396−404、に記載の自己親和性(autophilic)T15ペプチドの使用によるものである。
また、ScFv二量体は、当技術分野で既知の組換え型技術により形成可能である。例えば、このような抗体多量体は、2つのドメイン間で同じ鎖上で対形成を可能とするには短すぎるペプチドリンカーにより連結された同じポリペプチド鎖(VH−VL)上の可変軽鎖に連結された可変重鎖を含む。このことが、別の鎖の相補的なドメインとの対形成を起こさせ、2つの機能性抗原結合部位を有する二量体分子の構築を促進する。scFv二量体の構成の例が、Goeletal.、(2000)Cancer Research 60:6964−6971、に記載されている。
あるいは、抗体は、組換DNA技術により多量体化することができる。IgMおよびIgAは、成熟J鎖ポリペプチド(例えば、配列番号2930)との相互作用により自然に抗体多量体を形成する。非IgAまたは非IgM分子、例えば、IgG分子は、IgAまたはIgMのJ鎖相互作用ドメインを含むように操作でき、それにより、非IgAまたは非IgM分子のさらに高次の多量体を形成する能力が付与される。(例えば、Chintalacharuvu et al.、(2001)Clinical Immunology 101:21−31.およびFrigerio et al.、(2000)Plant Physiology123:1483−94、参照)。IgA二量体は、粘膜裏打ち器官の管腔中に自然に分泌される。この分泌は、J鎖と上皮細胞上の重合体IgA受容体(pIgR)との相互作用により媒介される。IgA型の抗体(またはJ鎖相互作用ドメインを含むように操作された抗体のIgA型)の分泌が望ましくない場合は、pIgRとうまく相互作用しない変異J鎖と結合した抗体分子を発現することにより、この分泌を大きく減らすことができる(例えば、配列番号2931〜2933;Johansen et al.、The Journal of Immunology(2001)167:5185−5192)。配列番号2931は、成熟型のヒトJ鎖(配列番号2930)に比べ、C134S変異を有する変異型のヒト成熟J鎖である。配列番号2932は、成熟型のヒトJ鎖(配列番号2930)に比べて、アミノ酸113〜137が欠失した変異型のヒト成熟J鎖である。配列番号2933は、成熟型のヒトJ鎖(配列番号2930)に比べて、C109SおよびC134S変異を有する変異型のヒト成熟J鎖を示す。これらの変異J鎖の1つを有する抗体の発現は、上皮細胞上の高分子IgA受容体に結合する能力を低下させ、それにより、上皮細胞を通過する抗体、およびその生成分泌物の粘膜裏打ち器官の管腔中への輸送を減らすことになる。
抗体多量体は、当技術分野で既知のいずれかの適切な方法を使って精製可能であり、これには、サイズ排除クロマトグラフィーが含まれる(これに限定されない)。抗体精製の代表的方法は、本明細書の別のところに記載されている。
代表的抗体
本明細書で提供される代表的抗体多量体は、SYYMH(配列番号2920)のアミノ酸配列、例えば、GYTFTSYYMH(配列番号2908)を有するCDRH1(kabatナンバリングよるアミノ酸位置26〜35に対応)、IINPSGGSTSYAQKFQG(配列番号2909)のアミノ酸配列を有するCDRH2(kabatナンバリングによるアミノ酸位置50〜65に対応)およびEEYSSSSAEYFQH(配列番号2910)のアミノ酸配列を有するCDRH3(アミノ酸位置95〜102に対応)を含有する可変重鎖を含み;さらにRASQSVSSYLA(配列番号2911)のアミノ酸配列を有するCDRL1(kabatナンバリングによるアミノ酸位置24〜33または34に対応)、DASNRAT(配列番号2912)のアミノ酸配列を有するCDRL2(kabatナンバリングによるアミノ酸位置50〜56に対応)、およびQQRSNWPPWT(配列番号2913)のアミノ酸配列を有するCDRL3(kabatナンバリングによるアミノ酸位置89〜97に対応)を含有する可変軽鎖を含む。また、それぞれ配列番号2908〜2910のいずれかに少なくとも70%同じであるCDRH1、CDRH2およびCDRH3を含む可変重鎖、ならびにそれぞれ、配列番号2911〜2913のいずれかに少なくとも70%同じであるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む可変軽鎖を有し、それにより抗体多量体がDLL4に結合し、DLL4の活性化因子である抗体多量体が提供される。例えば、配列同一性は、正確にまたは約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、またはそれ超であってもよい。例えば、抗体多量体は、少なくとも配列番号88に設定された可変重鎖および配列番号107に設定された可変軽鎖、または、それぞれ、配列番号88および/または107に少なくとも60%同じである可変重鎖または可変軽鎖を含む抗体である。抗体は、本明細書の上記に記載のように多量体化可能である。例えば、配列番号88で設定された可変重鎖領域、および配列番号2922で設定されたCH1−ヒンジ−CH2−CH3を含む重鎖、ならびに配列番号107で設定された可変軽鎖および配列番号2923または2924で設定されたカッパまたはラムダCL鎖を含む軽鎖を有する抗体多量体が本明細書で提供される。
別の例では、本明細書で提供される代表的抗体多量体は、SYWIG(配列番号2921)のアミノ酸配列、例えば、GYSFTSYWIG(配列番号2914)を有するCDRH1(kabatナンバリングによるアミノ酸位置26〜35に対応)、IIYPGDSDTRYSPSFQG(配列番号2915)のアミノ酸配列を有するCDRH2(kabatナンバリングによるアミノ酸位置50〜65に対応)、およびRGYSYGYDYFDY(配列番号2916)のアミノ酸配列を有するCDRH3(アミノ酸位置95〜102に対応)を含有する可変重鎖;GLSSGSVSTSYYPS(配列番号2917)のアミノ酸配列を有するCDRL1(kabatナンバリングによるアミノ酸位置24〜33または34に対応)、STNTRSS(配列番号2918)のアミノ酸配列を有するCDRL2(kabatナンバリングによるアミノ酸位置50〜56)、およびVLYMGSGISYV(配列番号2919)のアミノ酸配列を有するCDRL3(kabatナンバリングによるアミノ酸位置89〜97に対応)を含有する軽鎖、を含む。また、それぞれ配列番号2914〜2916のいずれかに少なくとも70%同じであるCDRH1、CDRH2およびCDRH3を含む可変重鎖、ならびにそれぞれ配列番号2917〜2919のいずれかに少なくとも70%同じであるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む可変軽鎖を有し、それにより、抗体多量体がDLL4に系都合し、DLL4の活性化因子である抗体多量体が提供される。例えば、配列同一性は、正確にまたは約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、またはそれ超であってもよい。例えば、抗体多量体は、少なくとも配列番号89で設定された可変重鎖および配列番号108で設定された可変軽鎖、または配列番号89および/または108にそれぞれ少なくとも60%同じである可変重鎖もしくは可変軽鎖を含む抗体である。抗体は、本明細書の上記に記載のように、多量体化可能である。例えば、配列番号89で設定された可変重鎖領域、および配列番号2922で設定されたCH1−ヒンジ−CH2−CH3を含む重鎖、ならびに、配列番号108で設定された可変軽鎖および配列番号2923または2924で設定されたカッパまたはラムダCL鎖を含む軽鎖を有する抗体多量体が本明細書で提供される。
一部の例では、抗体が配列番号88で設定された可変重を含む重鎖および配列番号107で設定された可変軽鎖を含む軽鎖を有する抗体ではない;または配列番号89で設定された可変重鎖を含む重鎖および配列番号108で設定された可変軽鎖を含む軽鎖を有する抗体ではない、という条件で、本明細書で提供される抗DLL4抗体多量体は、DLL4活性の活性化因子/モジュレーターを含む。
3.改変
本明細書で提供される抗DLL4抗体多量体は、抗体がDLL4に対する結合を維持し、DLL4活性の活性化因子である限り、さらに改変可能である。本明細書で提供される抗DLL4抗体多量体の改変により、1つまたは複数の抗体の特性を改善することができる。改善できる特性には、これに限定されないが、抗体の免疫原性の低減;抗体の半減期の改善、例えば、蛋白質分解に対する感受性の低減および/または酸化に対する感受性の低減;抗体の結合特性の変更または改善;および/または抗体のエフェクター機能の調節、が含まれる。代表的改変には、抗体の一次配列の改変、および/または抗体の翻訳後修飾の変更がある。代表的翻訳後修飾には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、保護基/遮断基による誘導体化、タンパク分解性開裂、および細胞性リガンドまたは他のタンパク質への結合が含まれる。他の代表的改変には、1つまたは複数の抗体特性の変更または改善のための抗体への1つまたは複数の異種のペプチドの連結が含まれる。
通常、改変は、抗体またはその抗原結合断片の免疫原性の増加を生じない、または抗体のDLL4に対する結合または活性化因子としての活性に顕著な負の影響を与えない。改変抗体のDLL4に対する結合を評価する方法は、本明細書で提供され、また、当技術分野で既知である。例えば、改変抗体のDLL4に対する結合を、例えば、ELISAまたはFACS結合アッセイにより試験できる(これに限定されない)。また、抗体活性の活性化を評価する方法は、当業者には既知であり、また、本明細書の別のところで、例えば、実施例中で、記載されている。例えば、活性は、Notch受容体の活性をレポーターアッセイを使って測定可能である。
本明細書で産生された抗DLL4抗体の改変には、その抗体が由来している親抗体に比べて、1つまたは複数のアミノ酸置換、欠失または追加を含むことができる。ポリペプチド、例えば、抗体、の改変の方法は、当技術分野で既知であり、本明細書で提供されるいずれの抗体または抗原結合断片の改変にも採用可能である。当業者に既知の標準的な方法が、本明細書で提供される抗体または抗原結合断片をコードするヌクレオチド分子中に変異を導入し、1つまたは複数のアミノ酸置換を有するポリペプチドを産生するために使用可能である。変異導入のための代表的技術には、これに限定されないが、部位特異的変異誘発およびPCR媒介変異誘発がある。
抗体は、N末端またはC末端で異種のポリペプチドに組換操作による融合、または異種のポリペプチドまたは他の組成物への共有結合および非有結合を含む化学的結合が可能である。融合は、必ずしも直接的である必要はなく、リンカーペプチド経由で行ってもよい。一部の例では、リンカーペプチドは、精製後、プロテアーゼ開裂部位を特異的に認識するプロテアーゼによる開裂によって精製ペプチドの取り出しを可能にするプロテアーゼ開裂部位を含む。
例えば、本明細書で提供される抗DLL4抗体は、精製を促進するための異種ペプチドの連結により改変できる。通常、このようなペプチドは、抗体のC末端またはN末端でペプチドに融合した抗体を含む融合タンパク質として発現する。精製によく使われる代表的ペプチドには、これに限定されないが、ヘキサヒスチジンペプチド、赤血球凝集素(HA)ペプチド、およびflagタグペプチド、が含まれる(例えば、Wilson et al.(1984)Cell 37:767;Witzgall et al.(1994)Anal Biochem 223:2、291−8、参照)。
別の例では、本明細書で提供される抗DLL4抗体は、共有結合の任意のタイプの分子、例えば、診断または治療分子、により改変されうる。代表的診断および治療成分には、これに限定されないが、薬剤、放射性ヌクレオチド、毒素、蛍光分子、が含まれる(例えば、国際公開第92/08495号;同91/14438号;同89/12624号;米国特許第5、314、995号;および欧州特許第396、387号、参照)。診断ポリペプチドまたは診断成分は、例えば、インビボまたはインビトロ検出のための標識として、使用可能である。さらなる例では、本明細書で提供される抗DLL4抗体多量体は、他の分子または成分、例えば、半減期、安定性、免疫原性を増加させるか、またはインビボで抗体のターゲッティングに影響を与えるか、もしくは変えるもののいずれかに連結することにより改変できる。
代表的改変は、本明細書で下記に記載される。特定の抗体の用途に応じて、本明細書で提供される抗体のいずれかを改変することは、当業者のレベルの範囲内で対処できることである。
a.免疫原性を減らすための改変
一部の例では、本明細書で提供される抗体は、患者、例えば、ヒト患者の免疫原性を減らすために改変可能である。例えば、患者の免疫系に曝した場合、抗体中の1つまたは複数のアミノ酸が改変されて、ヒトT細胞に対する潜在的エピトープを変え、抗体の免疫原性を除去するか、または減らすことができる。代表的改変は、1つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失および挿入を含み、これにより、抗体の免疫原性を除去または低減する。通常、このような改変は、それぞれの抗原に対する結合特異性を変えない。抗体の免疫原性の減少により、1つまたは複数の抗体特性、例えば、抗体治療の効力の改善および/またはインビボ抗体半減期を増加させることができる。
b.グリコシル化
本明細書で提供される抗DLL4抗体は、N結合型またはO結合型グリコシル化により改変可能である。N結合型グリコシル化には、トリペプチド配列のアスパラギン−X−セリンおよびアスパラギン−X−トレオニン内のアスパラギン残基の側鎖への炭水化物成分の連結が含まれる。ここで、Xはプロリンを除く任意のアミノ酸である。O結合型グリコシル化には、糖類の1つ、N−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのヒドロキシルアミノ酸への結合が含まれ、最もよく使われるのはセリンまたはトレオニンであるが、5−ヒドロキシプロリンまたは5−ヒドロキシリシンも使用可能である。抗DLL4抗体は、さらに改変により、1つまたは複数の上記のトリペプチド配列を含むようにアミノ酸配列を変えることにより追加のグリコシル化部位を組み込むことができる(N結合型グリコシル化部位に対し)。また、元の抗体の配列に対し、1つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基を追加または置換することにより改変を行うことができる(O結合型グリコシル化部位に対し)。抗体がFc領域を含む場合は、それに連結された炭水化物は変えることができる(例えば、米国特許公開第2003/0157108号、同2005/0123546号および同2004/0093621号;国際公開第2003/011878号、同1997/30087号、同1998/58964号、同1999/22764号;および米国特許第6、602、684号、参照)。
例えば、Fc領域に結合した炭水化物構造でフコースが欠けているようなグリコシル化の変化が抗体のFc領域で起こる。このような変異体は、ADCC機能を改善する。任意選択で、Fc領域は、1つまたは複数のアミノ酸置換、例えば、Fc領域の位置298、333、および/または334(Eu残基ナンバリング)での置換をさらに含み、それにより、ADCCをさらに改善する(例えば、米国特許公開第2003/0157108号;国際公開第2000/61739号;国際公開第2001/29246号;米国特許公開第2003/0115614号;米国特許公開第2002/0164328号;米国特許公開第2004/0093621号;米国特許公開第2004/0132140号;米国特許公開第2004/0110704号;米国特許公開第2004/0110282号;米国特許公開第2004/0109865号;国際公開第2003/085119号;国際公開第2003/084570;国際公開第2005/035586号;国際公開第2005/035778号;国際公開第/053742;Okazaki et al.J.Mol.Biol.336:1239−1249(2004);Yamane−Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87:614(2004)、参照)。脱フコシル化抗体を産生する細胞株の例には、タンパク質フコシル化欠損Lec13 CHO細胞(Ripka et al.Arch.Biochem.Biophys.249:533−545(1986);米国特許公開第2003/0157108A1号、Presta、L;および国際公開第2004/056312A1号、Adams et al.(特に、実施例11))、ならびにノックアウト細胞株、例えば、アルファ−1、6−フコシル基転移酵素遺伝子、FUT8、ノックアウトCHO細胞(Yamane−Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87:614(2004))が含まれる。
c.Fc改変
本明細書で提供される抗DLL4抗体多量体は、野性型または改変Fc領域を含むことができる。本明細書で提供される抗体は、改変Fc領域を含むよう操作できる。一部の例では、Fc領域は、Fcポリペプチドの1つまたは複数の特性を変えるように改変可能である。例えば、Fc領域は、野性型免疫グロブリン重鎖のFc領域のエフェクター機能に比べて、エフェクター機能を変える(すなわち、高めるまたは低下させる)ように改変可能である。従って、改変Fcドメインは、Fc受容体に対する親和性を高める、または低下させる、または無くする(これに限定されない)ことを含めて、変えられた親和性を持たせることができる。受容体に対するFc領域の親和性を変えることにより、Fcドメインにより誘導されるエフェクター機能を調節することができる。
一例では、特定のFcγRsに対する結合を最適化し、エフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害活性(ADCC)をよりうまく媒介するために改変されているFc領域が使用される。このような改変Fc領域は、1つまたは複数のアミノ酸残基(Kabatナンバリング体系による:Kabat、etal.(1991)免疫学的関連タンパク質の配列、米国保健福祉省)での改変を含むことができる。これらの残基には、これに限定されないが、アミノ酸の位置249、252、259、262、268、271、273、277、280、281、285、287、296、300、317、323、343、345、346、349、351、352、353、および424、が含まれる。例えば、配列番号2922に設定された代表的Fc配列のいずれか1つまたは複数のG119S、G119A、S122D、S122E、S122N、S122Q、S122T、K129H、K129Y、D132Y、R138Y、E141Y、T143H、V147I、S150E、H151D、E155Y、E155I、E155H、K157E、G164D、E166L、E166H、S181A、S181D、S187T、S207G、S207I、K209T、K209E、K209D、A210D、A213Y、A213L、A213I、I215D、I215E、I215N、I215Q、E216Y、E216A、K217T、K217F、K217A、およびP279L、またはその組み合わせに対応するFc領域の改変を行うことができる。これらの変異を含む改変Fcは、FcRに対する強化された結合、例えば、受容体FcγIIIaを活性化する結合、および/または阻害性受容体FcγRIIbに対する低下した結合を有しうる(例えば、米国特許公開第2006/0024298号参照)。FcRに対する結合を強化するように改変されたFc領域は、患者中の真菌細胞の破壊を促進するのにさらに有効になりうる。
一部の例では、本明細書で提供される抗体または抗原結合断片がさらに改変され、抗体とFcRn受容体の相互作用を改善し、インビボ半減期および抗体の薬物動態を増加させることができる(例えば、米国特許第7、217、797号;ならびに米国特許公開第2006/0198840号および同2008/0287657号、参照)。FcRnは、新生児のFcRで、これとの結合により、エンドサイトーシスによって取り込まれた抗体がエンドソームからリサイクルにより血流に戻される。大きなサイズの完全長分子による腎臓濾過の妨害と相まって、このプロセスにより、1〜3週間の範囲の好ましい抗体血清半減期が生ずる。また、FcRnへのFcの結合は、抗体輸送でも一定の役割を果たす。
Fc領域の代表的改変には、これに限定されないが、米国特許第7、217、797号;米国特許公開第2006/0198840号、同2006/0024298号および同2008/0287657号;ならびに国際公開第2005/063816号、に記載のFcの変異、例えば、1つまたは複数のFc重鎖定常領域のCH2ドメイン中のアミノ酸残基(Kabatナンバリング、Kabat et al.(1991))251〜256、285〜90、308〜314、および/またはCH3ドメイン中のアミノ酸残基385〜389、および428〜436の変異が含まれ、これらの改変により、未改変抗体に比べ、Fc受容体結合親和性および/または血清半減期が変化する。一部の例では、Fc領域が、1つまたは複数のFc重鎖定常領域のCH2ドメイン中のアミノ酸位置250、251、252、254、255、256、263、308、309、311、312および314および/またはCH3ドメイン中のアミノ酸位置385、386、387、389、428、433、434、436、および459で改変される。このような改変は、配列番号2922に設定された代表的Fc配列中のCH2ドメイン中のアミノ酸Gly120、Pro121、Ser122、Phe124Leu125、Phe126、Thr133、Pro174、Arg175、Glu177、Gln178、およびAsn180ならびにCH3ドメイン中のアミノ酸Gln245、Val246、Ser247、Thr249、Ser283、Gly285、Ser286、Phe288、およびMet311に対応する。一部の例では、改変は、1つまたは複数の表面露出残基で行われ、改変は、置換される残基に類似の電荷、極性または疎水性を有する残基による置換である。
特定の例では、Fc重鎖定常領域が1つまたは複数のアミノ酸位置251、252、254、255、および256(Kabatナンバリング)で改変される。この場合、位置251がLeuまたはArgで置換され、位置252がTyr、Phe、Ser、TrpまたはThrで置換され、位置254がThrまたはSerで置換され、位置255がLeu、Gly、IleまたはArgで置換され、および/または位置256がSer、Arg、Gln、Glu、Asp、Ala、AspまたはThrで置換される。一部の例では、Fc重鎖定常領域が1つまたは複数のアミノ酸位置308、309、311、312、および314(Kabatナンバリング)で改変される。この場合、位置308がThrまたはIleで置換され、位置309がProで置換され、位置311がセリンまたはGluで置換され、位置312がAspで置換され、および/または位置314がLeuで置換される。一部の例では、Fc重鎖定常領域が1つまたは複数のアミノ酸位置428、433、434、および436(Kabatナンバリング)で改変される。この場合、位置428がMet、Thr、Leu、Phe、またはSerで置換され、位置433がLys、Arg、Ser、Ile、Pro、Gln、またはHisで置換され、位置434がPhe、Tyr、またはHisで置換され、および/または位置436がHis、Asn、Asp、Thr、Lys、Met、またはThrで置換される。一部の例では、Fc重鎖定常領域が1つまたは複数のアミノ酸位置263および459(Kabatナンバリング)で改変される。この場合、位置263がGlnまたはGluで置換され、および/または位置459がLeuまたはPheで置換される。
一部の例では、Fc重鎖定常領域を補体タンパク質C1qに対する結合を強化するために改変することができる。FcRとの相互作用に加えて、Fcはまた、補体タンパク質C1qと相互作用し、補体依存細胞障害性(CDC)を媒介する。C1qはセリンプロテアーゼC1rおよびC1sと複合体を形成しC1複合体を作る。C1qは、6つの抗体と結合可能であるが、2つのIgGとの結合で、補体カスケードを活性化するのに充分である。FcのFcRとの相互作用と同様に、異なるIgGサブクラスは、C1qに対し異なる親和性を有し、通常、IgG1およびIgG3が、実質的にIgG2およびIgG4よりも良好な結合を行う。従って、C1qに対する増加した結合を有する改変Fcは、強化されたCDCを媒介し、真菌性細胞の破壊を強化することができる。C1qへの結合を高めるFc領域の代表的改変には、これに限定されないが、位置345および253(Kabatナンバリング)でのアミノ酸改変がある。代表的改変には、配列番号2922に設定された代表的Fc配列中のK209W、K209Y、およびE216Sに対応するものが含まれる。
別の例では、FcγRとの結合を低減する、または切断するための置換を有する種々のFc変異体も知られている。このような変異タンパク質は、Fcに媒介されるエフェクター機能の低下または除去が必要な場合に有用である。これは、拮抗作用を望むが、標的抗原を有する細胞の死滅は望まない場合によくあることである。代表的なこのようなFcは、米国特許第5、457、035号に記載のFc変異タンパク質で、これは、アミノ酸位置248、249および251(Kabatナンバリング)で改変されている。配列番号2922のアミノ酸100〜330の代表的Fc配列中で、アミノ酸118がLeuからAlaに改変され、アミノ酸119がLeuからGluに改変され、およびアミノ酸121がGlyからAlaに改変される。同様の変異を、いずれのFc配列でも、例えば、代表的Fc配列で作ることができる。この変異タンパク質は、Fc受容体に対する親和性の低下を示す。
d.ペグ化
本明細書で提供される抗DLL4抗体多量体は、ポリマー分子、または水溶性ポリマー、例えば、高分子量ポリエチレングリコール(PEG)と結合させ、半減期を増加し、および/または薬物動態学的プロファイルを改善することができる。水溶性ポリマーには、これに限定されないが、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコール共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1、3−ジオキソラン、ポリ−1、3、6−トリオキサン、エチレン/マレイン酸無水物共重合体、ポリアミノ酸(ホモポリマーまたはランダム共重合体)、およびデキストランまたはポリ(n−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレン酸化物/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセリン)、ポリビニルアルコール、およびその混合物、が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中で安定性があるため、製造上の利点がある可能性がある。ポリマーは、どの分子量でもよく、分岐でも非分岐でもよい。抗体に結合したポリマーの数は、変えることができ、2つ以上のポリマーが結合している場合は、それらが同じ分子であっても、異なっている分子であってもよい。一般的に、誘導体化に使われるポリマーの数および/またはタイプは、改良されるべき抗体の特定の特性または機能、および抗体誘導体が一定の条件下で治療に使われることになるのかどうかを含む(これに限定されない)考察に基づいて判断できる。
当業者に既知の技術により結合を行うことができる。治療の抗体のPEGとの結合は、機能を妨害することなく薬力学を高めることが示されている(例えば、Deckert et al.、Int.J.Cancer 87:382−390、2000;Knight et al.、Platelets 15:409−418、2004;Leong et al.、Cytokine 16:106−119、2001;およびYang et al.、Protein Eng.16:761−770、2003、参照)。PEGは、抗体または抗原結合断片のNまたはC末端へのPEGの部位特異的結合により、またはリジン残基上に存在するε−アミノ基経由で、多機能リンカーを用い、または用いないで、抗体または抗原結合断片に結合することができる。生物活性の最小限の損失で済む直鎖または分枝高分子誘導体化を使用することができる。結合度は、SDS−PAGEおよび質量分析でモニターして、PEG分子の抗体への適正な結合を確認することができる。未反応PEGは、抗体−PEG複合体から、例えば、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーにより分離することができる。PEG誘導体化した抗体は、DLL4に対する結合活性、ならびにインビボ有効性に関し、当業者に既知の方法、例えば、本明細書に記載の機能的アッセイを使って試験できる。
4.組成物、製剤、投与および製品/キット
a.組成物および製剤
本明細書で提供される抗体多量体は、投与用製剤として提供可能である。有効成分を単独で投与することも可能であるが、通常、それは調合薬として存在する。組成物または製剤は、1つまたは複数の受容可能なそのキャリアと一緒に、少なくとも1つの有効成分を含む。各キャリアは、他の成分と適合するという意味で、薬学的および生理学的の両方から受容可能であり、患者に対し非障害性でなければならない。製剤には、経口、直腸、鼻、または非経口(皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む)投与に適切なものが含まれる。製剤は、便利なように単位剤形で存在してもよく、当技術分野でよく知られた薬学の方法で調製されてもよい。例えば、Gilman、et al.(eds.1990)Goodman and Gilman’s:「治療薬の薬理学的基礎」、第8版.、Pergamon Press;および「レミントンの薬学」、第17版.(1990)、Mack Publishing Co.、Easton、Pa.;Avis、et al.(eds.1993)製剤剤形:Parenteral Medications Dekker、NY;Lieberman、et al.(eds.1990)製剤剤形:Tablets Dekker、NY;およびLieberman、et al.(eds.1990)製剤剤形:Disperse Systems Dekker、NY、参照のこと。
抗体投与経路は、既知の方法と同じで、例えば、静脈内、腹腔内、大脳内、筋肉内、皮下、眼内、動脈内、鞘内、吸入または病巣内経路による注射または注入、局所的または下記に示すように徐放製剤による方法である。抗体は、通常、注入またはボーラス注入により連続的に投与される。抗体は、局地的の、または全身性の方法で投与できる。
本明細書で提供される抗体多量体は、薬学的に許容可能なキャリアを含む混合物として調製できる。化合物の製剤処方および投与のための技術は、当業者には既知である(例えば、「レミントンの薬学」、Mack Publishing Co.、Easton、Pa.参照)。この治療組成物は、静脈内にまたは鼻または肺経由で、好ましくは、液体または粉末エアロゾル(凍結乾燥した)として、投与可能である。また、組成物は、必要に応じ、非経口的にまたは皮下に投与可能である。全身性投与の場合は、治療組成物は、無菌の、発熱性物質のない、pH、等張性、および安定性に対し当然の配慮を有する非経口的に受容可能な溶液でなければならない。これらの条件は当業者には既知である。
治療製剤は、多くの従来の剤形で投与可能である。簡単に述べれば、抗体本明細書で提供される製剤は、貯蔵または投与のために、所望の純度の生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤を混合することにより調製される。このような材料は、採用される容量と濃度でレシピエントに対し無毒性であり、緩衝液、例えば、トリスHCl、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩および他の有機酸塩;抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸;低分子量(約10残基未満)ペプチド、例えば、ポリアルギニン、タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性高分子、例えば、ポリビニルピロリジノン;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン;単糖類、二糖類、およびセルロースまたはその誘導体を含む他の炭水化物、グルコース、マンノース、またはデキストリン;キレート化剤、例えば、EDTA;糖アルコール、例えば、マンニトールまたはソルビトール;対イオン、例えば、ナトリウムおよび/または非イオン性界面活性剤、例えば、ツイーン、PLURONICSまたはポリエチレングリコール、を含むことができる。
インビボ投与に使用する場合は、抗体多量体製剤は、無菌でなければならず、従来の薬務に従って処方可能である。これは、凍結乾燥および再構成の前または後で、無菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成可能である。抗体は、通常、凍結乾燥した形態でまたは溶液で貯蔵可能である。他の賦形剤、例えば、ゴマ、ピーナッツ、もしくは綿実オイル、等の天然植物油、またはエチルオレアート等の合成脂肪賦形剤、等が望ましい。緩衝液、防腐剤、抗酸化剤、等は、受け入れられている薬務に従って、組み込むことができる。
使用に適した医薬組成物には、1つまたは複数の抗体多量体が、その意図された目的を達成するのに有効な量で含まれている組成物が含まれる。治療有効量の決定は、特に、本明細書で提供される詳細開示を考慮すると、当業者の能力の範囲内で充分に処理できる。治療有効投薬量はインビトロおよびインビボの方法を使って決定可能である。
治療に採用される抗体の有効量は、例えば、治療目的、投与経路、および患者の状態に依存する。さらに、主治医は、重症度および疾患の型、体重、性別、食事、時間および投与経路、他の投薬およびその他の関連する臨床的因子を含む薬剤の作用を変えることがわかっている種々の因子を考慮に入れる。従って、治療専門家は、投与量の力価を評価し、最適治療効果を得られるように投与経路を変更する必要が生じるであろう。通常、臨床医は所望の効果が達成される投与量になるまで抗体を投与する。この治療の進行は、従来のアッセイにより容易にモニターされる。
ペプチドを含むいずれの抗体に対しても、治療有効量は、最初に、細胞培養アッセイから推定可能である。例えば、用量は、細胞培養で求めたEC50を含む循環濃度範囲を達成するように動物モデル中で処方することができる(例えば、細胞増殖または分化を促進または阻害する試験分子の濃度)。このような情報は、ヒトでの有用な用量を、より正確に決定するために使用できる。
本明細書記載の抗体多量体の毒性および治療有効性は、例えば、LD50(集団の50%の致死用量)およびED50(集団の50%の治療的有効用量)の測定のための、細胞培養または実験動物での標準的医薬品手法により測定可能である。有毒性および治療効果の間の用量比率は、治療指数であり、それは、LD50とED50の間の比率として表現できる。高治療指数を示す分子は、使用可能である。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータは、ヒトでの使用の投与量の範囲を公式化するのに使用可能である。このような分子の投与量は、ほんのわずかの毒性、または無毒性で、ED50を含む循環濃度範囲内に入ることが望ましい。投与量は、採用された剤形および使われた投与経路に依存するこの範囲内で変動してもよい。正確な製剤処方、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して、個別の医師により選択されうる(例えば、Fingl et al.、1975、「治療薬の薬理学的基本」中の1章、p.1、参照)。
投与量および間隔は、細胞増殖もしくは分化を促進もしくは阻害するのに充分な抗体の血漿レベルまたは最小有効濃度(MEC)を提供するようにそれぞれ調節できる。MECは、各抗体に対し変化すると思われるが、記載のアッセイを使ってインビトロデータから推測可能である。MECを達成するのに必要な投与量は、個々の特性と投与経路に依存するであろう。しかし、HPLCアッセイまたはバイオアッセイを使って血漿中濃度を測定することができる。
また、投与間隔も、MEC値を使って決めることができる。抗体分子は、MECを超える血漿レベルを10〜90%、好ましくは30〜90%、最も好ましくは50〜90%の時間の間維持する投与計画により投与しなければならない。
局所投与または選択的取り込みの場合には、抗体の有効局所濃度は、血漿中濃度に関連しない可能性がある。
本明細書で提供される抗体多量体の典型的な毎日投与量の範囲は、約1μ/kg〜1000mg/kgまたはそれ超であり、上述の因子に依存する。通常、臨床医は、所望の効果が得られる投与量に達するまで分子の投与を行うであろう。この治療の進行は、従来のアッセイにより容易にモニターされる。
例えば、1つまたは複数の別々の投与による場合でも、または連続注入による場合であっても、疾患の型および重症度に応じて、約0.001mg/kg〜約1000mg/kg、例えば、約0.01mg〜100mg/kg、例えば、約0.010〜20mg/kgの抗体多量体が、最初の患者への投与の候補投与量である。数日、またはさらに長期にわたる反復投与に対しては、状態に応じ、疾患症状の所望の抑制が起こるまで、または患者の状態の所望の改善が得られるまで、治療が繰り返される。しかし、他の投与計画もまた、意図されている。
b.製品とキット
選択抗体もしくは選択抗体をコードする核酸、または誘導体もしくは生物学的に活性なその一部の医薬品化合物は、パッケージング材料、疾患または障害の治療に有効な医薬組成物、および選択抗体または核酸分子が疾患または障害の治療に使用できることを示すラベルを含む製品としてパッケージされうる。
本明細書で提供される製品は、パッケージング材料を含む。医薬品のパッケージングに使われるパッケージング材料は当業者にはよく知られている。例えば、米国特許第5、323、907号、同5、052、558号および同5、033、252号を参照。これらの特許は、その全体が本明細書に組み込まれる。医薬品パッケージング材料の例には、これに限定されないが、ブリスター包装、ビン、チューブ、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、コンテナ、注射器、ボトル、および選択製剤および意図したモードの投与と治療に適したいずれかのパッケージング材料、が挙げられる。本明細書で提供される化合物および組成物の多様な製剤は、いずれかのEPO媒介疾患または障害または治療ポリペプチド媒介疾患または障害に対する種々の治療薬として意図されている。
抗体およびその抗体をコードする核酸分子は、また、キットとして提供可能である。キットは、本明細書記載の医薬組成物および投与のための品目を含むことができる。例えば、選択抗体は、投与用装置、例えば、シリンジ、吸入器、用量カップ、ドロッパー、または塗布具と一緒に提供可能である。キットには、任意選択で、投与量、投与計画および投与方法のインストラクションを含む適用のためのインストラクションが含まれる。また、キットには、本明細書記載の医薬組成物および診断用品目を含めてもよい。例えば、このようなキットには、患者中の抗体の濃度、量または活性を測定する品目を含めてもよい。
5.治療および使用方法
本明細書で、異常血管新生または血管新生を顕在化させる疾患を治療するために、抗DLL4抗体多量体による治療の方法、またはその使用の方法が提供される。血管新生は、新血管が形成されるプロセスである。それは、例えば、傷害または侵襲後、創傷の治療のために、および血流を組織に戻すために健常体で発生する。女性では、また、血管新生が、子宮粘膜を形成するために、排卵中に卵を成熟させるために、および妊娠中に胎盤を形成するために、毎月の生殖周期の間に発生する。一部の状況では、「あまりにも多い」血管新生、例えば、炎症反応および他の異常血管新生関連状態における、腫瘍病巣に血液を提供する血管新生、が有害になる可能性がある。慢性炎症中の腫瘍の増殖、または増殖部位は、通常、それらの代謝要求を支援するために、近くの血管および血管内皮細胞の動員を要求する。これが、組織中で、酸素の拡散が制限される理由である。血管新生に関連する代表的状態には、これに限定されないが、固形腫瘍および血液系腫瘍、例えば、リンパ腫、急性白血病、および多発性骨髄腫が含まれ、これらは、病的骨髄中で血管の数の増加が観察される。
従って、血管新生は、種々の障害の発病に関与する。これらには、固形腫瘍および転移、アテローム性動脈硬化、後水晶体線維増殖症、血管腫、慢性炎症、眼内の新生血管疾患、例えば、増殖網膜症、例えば、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性(AMD)、血管新生緑内障、移植角膜組織および他の組織の免疫拒絶、関節リウマチ、および乾癬、が含まれる。Folkman et al.、J.Biol.Chem.267:10931−34(1992);Klagsbrun et al.、Annu.Rev.Physiol.53:217−39(1991);およびGarner A.、「眼疾患の病理生物学」中の「血管疾患」。「動的アプローチ」、GarnerA.、Klintworth GK、eds.、2nd Edition(Marcel Dekker、NY、1994)、pp1625−1710。
腫瘍増殖の場合には、血管新生は、腫瘍への過形成から移行し、腫瘍の増殖と転移用栄養物を提供するために重大であると思われる。Folkman et al.、Nature 339:58(1989)。血管新生は、正常細胞に比べて、腫瘍細胞に増殖の利点と増殖の自立性を獲得させる。腫瘍は、通常、利用可能な毛細管床からの距離に起因して、わずか数立方ミリメーターのサイズに増殖することが可能な単一の異常細胞として始まり、さらなる増殖も内転移もなく長期間「休眠中」状態でのまま留まることができる。次に、一部の腫瘍細胞は、血管新生表現型に切り替わり、内皮細胞を活性化し、新毛細血管へと増殖および成熟する。これらの新しく形成された血管は、原発性腫瘍の増殖を継続させるのみでなく、転移性の腫瘍細胞の内転移および再コロニー化を起こさせる。従って、乳癌ならびにいくつかの他の腫瘍中の腫瘍断面中の微小血管の密度と患者生存の間の相関が観察されている。Weidner et al.、N.Engl.J.Med.324:1−6(1991);Horak et al.、Lancet 340:1120−24(1992);Macchiarini et al.、Lancet 340:145−46(1992)。血管新生切り替えを制御する詳細な機序は、はっきりとは解っていないが、腫瘍塊の血管新生は、血管新生刺激剤および阻害剤の数の正味バランスに起因すると考えられている(Folkman、Nat.Med.1(1):27−31(1995))。
また、血管新生は、炎症性疾患においても一定の役割を果たす。これらの疾患は、腫瘍病巣に類似の増殖成分を有する。関節リウマチでは、1つのこの成分は、滑膜線維芽細胞の異常増殖を特徴とし、パンヌス形成が起こる。パンヌスは、形質転換細胞と同じ表現型特性を有する滑膜線維芽細胞から構成されている。パンヌスが関節内で成長するにつれ、多くの血管新生促進シグナルを発し、多くの腫瘍と同じ新血管新生要求を行う。追加の血液供給の要求、すなわち、血管新生、は重要な意味を持つ。同様に、慢性炎症性状態は、また、増殖性成分を有し、それを含む一部の細胞が、通常、形質転換細胞が原因とされる特性を持つ可能性がある。
過剰血管新生を伴う状態の別の例は、糖尿病性網膜症である(Lipetal.Br J Ophthalmology 88:1543、2004))。糖尿病性網膜症は、血管新生、炎症性および増殖性成分;VEGF過剰発現を有し、アンジオポエチン−2がよく見られる。この過剰発現は、同様に、疾患関連リモデリングおよび血管分岐に必要であり、これはその後、疾患の増殖性成分を支援する。
従って、本明細書では、血管新生疾患および状態のための抗DLL4抗体多量体による治療方法が提供される。このような疾患または状態には、これに限定されないが、炎症性疾患、免疫疾患、癌、および異常の血管新生および異常な血管新生を顕在化させる他の疾患が含まれる。癌には、乳癌、肺癌、結腸癌、胃癌、膵臓癌、その他が含まれる。炎症性疾患には、例えば、糖尿病性網膜症および/または神経障害および他の糖尿病の炎症性血管合併症、自己免疫性糖尿病を含む自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化、クローン病、糖尿病性腎臓疾患、嚢胞性繊維症、子宮内膜症、糖尿病誘導血管傷害、炎症性腸疾患、アルツハイマー病および他の神経変性疾患が含まれる。治療は、ポリペプチドとして組成物中に提供される抗体多量体を適切に経路設定して投与するとこにより行うことができる。一部の例では、抗体多量体は、標的送達のためにターゲッティング試薬に結合する、またはリポソーム等の送達賦形剤中でカプセル化することができる。
例えば、本明細書で提供される抗DLL4多量体を使った治療には、これに限定されないが、糖尿病関連疾患および歯周部、自己免疫性、血管、および尿細管間質性疾患、を含む状態の治療が含まれる。抗DLL4抗体多量体を使った治療には、また、黄斑変性を含む眼疾患、循環器疾患、アルツハイマー病を含む神経変性疾患、炎症性疾患およびリウマチ性関節炎を含む状態、ならびに癌を含む細胞増殖に関連する疾患および状態の治療が含まれる。当業者は、治療される疾患の型、重症度および疾患の経過、分子が予防または治療目的で投与されるのかどうか、前治療、患者の臨床的病歴および治療に対する反応、ならびに主治医の裁量による投与する分子の適切な投与量、に基づいて評価できる。
併用療法
本明細書で提供される抗DLL4抗体多量体は、別の治療薬と組み合わせて投与できる。例えば、抗DLL4抗体多量体は、抗癌治療薬または抗血管新生治療薬と組み合わせて、種々の腫瘍性または非腫瘍性状態を治療するために使われる。一実施形態では、腫瘍性または非腫瘍性状態は、異常のまたは望ましくない血管新生に関連する病理学的障害を特徴とする。また、代表的併用療法には、米国特許公開第20090246199号に述べられた内のいずれかが含まれる。抗DLL4抗体多量体は、連続的に、またはこれらの目的に効果的な別の薬剤と、同じ組成物または別々の組成物として組み合わせて投与可能である。抗DLL4抗体多量体は、順次、同時にまたは間をおいて、治療薬と投与可能である。代わりに、または、追加して、複数のDLL4阻害剤を投与可能である。
抗DLL4抗体多量体の投与は、例えば、単一の組成物として、または2つ以上の異なる組成物として、同じまたは異なる投与経路を使って、同時に行うことができる。代わりに、または、追加して、順番はどうであれ、順に投与を行うことができる。特定の実施形態では、間隔は分から日、週、月にわたる間隔を、2つ以上の組成物の投与の間におくことができる。例えば、抗癌剤を最初に投与し、次いで、DLL4抗体多量体を投与してもよい。同時投与または抗DLL4抗体多量体の最初の投与も、また、意図されている。
抗DLL4抗体多量体と組み合わせて投与される治療薬の有効量は、医師または獣医師の裁量に任される。服用量の投与および調整は、治療される状態の最高の処置が得られるように行われる。用量はさらに、使用される治療薬の型および治療される特定の患者、等の因子に依存するであろう。適切な抗癌剤投与量は、現在使われている量であり、また、抗癌剤と抗DLL4抗体多量体の組み合わせ作用(相乗作用)により低減することが可能である。
通常、抗DLL4抗体多量体および抗癌剤は、同じまたは類似の疾患の病理学的障害、例えば、腫瘍増殖または癌細胞の増殖を遮断または低減するのに適している。一実施形態では、抗癌剤は、抗血管新生剤である。癌に関連した抗血管新生治療は、腫瘍増殖を支える栄養素を提供するのに必要な腫瘍血管の成長を阻害することを狙った癌治療戦略である。血管新生は、原発性腫瘍増殖および転移の両方に関与するので、抗血管新生治療は、一般的に、1次部位での腫瘍の新生物形成増殖、ならびに2次部位での腫瘍の転移を阻害することができ、それにより、他の治療薬による腫瘍の攻撃が可能となる。
多くの抗血管新生剤が特定され、当技術分野で既知であり、本明細書で、例えば、定義の下に挙げられたもの、また、例えば、Carmeliet and Jain、Nature 407:249−257(2000);Ferrara et al.、Nature Reviews.Drug Discovery、3:391−400(2004);およびSato Int.J.Clin.Oncol.、8:200−206(2003)により挙げられたものが含まれる。また、米国特許公開第20030055006号を参照。一実施形態では、抗DLL4抗体多量体は、抗VEGF中和抗体(または断片)および/または別のVEGFアンタゴニストまたはVEGF受容体アンタゴニストと組み合わせて使用される。これらには、例えば、可溶性VEGF受容体(例えば、VEGFR−1、VEGFR−2、VEGFR−3、ニューロピリン(例えば、NRP1、NRP2))断片、VEGFまたはVEGFRを遮断できるアプタマー、中和抗VEGFR抗体、VEGFRチロシンキナーゼの低分子量阻害剤(RTK)、VEGFに対するアンチセンス戦略、VEGFまたはVEGF受容体に対するリボザイム、VEGFのアンタゴニスト変異体;およびこれらのいずれかの組み合わせが含まれる(これに限定されない)。代わりに、または、追加で2つ以上の血管新生阻害剤を、任意選択で、VEGFアンタゴニストおよび他の薬剤に追加して、患者に同時投与できる。特定の実施形態では、1つまたは複数の追加の治療薬、例えば、抗癌剤を、抗DLL4抗体多量体、VEGFアンタゴニスト、および抗血管新生剤と組み合わせて投与可能である。
特定の態様では、抗DLL4抗体多量体との組み合わせ血管新生または腫瘍治療に有用な他の治療には、他の癌治療、(例えば、手術、放射線治療(例えば、放射性活性物質の照射または投与を伴う)、化学療法、本明細書で挙げられ、当技術分野で既知の抗癌剤による治療、またはこれらの組み合わせ)が含まれる。代わりに、または、本明細書で開示の、同じまたは2つ以上の異なる抗原に結合した2つ以上の抗体を患者に同時投与可能である。ときには、1つまたは複数のサイトカインを患者に投与することも有用である。
H.実施例
下記の実施例は、説明の目的のみのために提示されており、本発明の範囲を限定する意図はない。
実施例1
変異Fab抗体の生成
この実施例では、変異Fab抗体を、アラニンスキャニング、NNK変異誘発、およびオリゴ対の、いずれかの改変CDR領域のクローニングを可能とするBsaI改変プラスミド中への、高スループット方式による連結反応により生成した。
A.アラニン置換変異導入(alanine scanning mutagenesis)
親重鎖または軽鎖DNAをテンプレートとして使って、アラニン変異体をオーバーラッピングPCR(overlapping PCR)により生成した。標的コドンに所望の変異を特異的に生成する順方向および逆方向プライマーを適切なプラスミド中の親DNAを増幅するのに使用した。
PCRの最初のラウンドで、異なるプライマー対を用いた2つの別々のPCR反応を使って、2つの遺伝子セグメントを増幅した。最初の反応では、EcoRI順方向プライマーを有する特異的逆方向プライマーを使い、遺伝子の最初の半分を増幅した。第2の反応では、FLXhoI逆方向プライマーを有する特異的順方向プライマーを使い、遺伝子の残りの半分を増幅した。次の条件の20サイクルのPCRを使って遺伝子セグメントを生成した:94℃で30秒間;50℃で30秒間;および72℃で90秒間。PCR産物を単離し、1%アガロースゲルから精製し、一緒に混合して、第2ラウンドのPCR用テンプレートとした。PCR第2ラウンドでは、EcoRI順方向およびFLXhoI逆方向プライマーを使って、完全長遺伝子産物を増幅した。次の条件の20サイクルのPCRを使って遺伝子産物を得た:94℃で30秒間;55℃で30秒間;および72℃で90秒間。
PCR産物を単離し、その後、EcoRIおよびXhoI(New England Biolabs)で消化させて、同様に消化させたプラスミド中に連結した。大腸菌DH5α中で連結反応生成物の形質転換および平板培養後、個々のコロニーを選択し、50μg/mlカナマイシン、および0.4%グルコースを補充した1.5mlのTerrific Broth培地(EMD、San Diego、CA)を含む96ウエルブロック中、37℃で、一晩成長させた。ミニプレップキット(Qiagen)を使ってDNAを単離し、アラニン変異をDNAシーケンシングにより確認した。
一例として、表6に、変異体VH5−51_IGHD5−18*01>3_IGHJ4*01 R99AおよびVH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01 E100Aを生成するために使用したプライマー対を示す。プライマーR99A_FおよびR99A_Rは、R99を特異的に増幅しアラニン変異を導入するために利用した。プライマーE100A_FおよびE100A_Rは、E100を特異的に増幅しアラニン変異を導入するために利用した。プライマーEcoRI_FおよびFLXhoI_Rは、遺伝子の残りのセグメントを増幅するために利用した。
B.オーバーラッピングPCRによるNNK変異誘発
アラニン置換変異導入に関し上述したように、所望のNNK変異を生成する初期プライマーを使って、オーバーラッピングPCRによるNNK変異誘発を行った。従って、最初のPCRのラウンドでは、標的コドンがNNK(順方向)およびMNN(逆方向)で置換された特異的プライマー対を使った。例えば、下の表7に、H5−51_IGHD5−18*01>3_IGHJ4*01 G100 NNK変異体およびVH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01 S102 NNK変異体を生成するのに使用した順方向および逆方向プライマーを示す。
それぞれのクローンをDNAシーケンシング(BATJ、Inc.、SanDiego、CAで実施)を行い、アミノ酸置換を特定した。NNK変異反応毎の採取したコロニーの数に応じて、変異割合は変化し、変異毎に、4〜5アミノ酸変化のように低いものから18〜19アミノ酸変化のように高いものまで観察された。
C.タイプII制限酵素ベースオリゴ対の消化と連結反応を使ったカセット変異導入
この実施例では、高スループット方式で、事前にBsaIクローニング部位を含むように改変されたプラスミド中へ特異的合成CDR1、CDR2および/またはCDR3配列をクローニングしてFab変異体を生成した。重鎖または軽鎖のそれぞれに対し、特異的にそれぞれ3つのベクターを生成し、それにより、BsaI制限酵素部位を各CDR領域の5’と3’の両末端に組み込んだ。Fab変異体を生成するために、特異的変異および追加のBsaIオーバーラッピング末端を有するCDRをコードする順方向および逆方向プライマーを合成し、アニールした。これらのカセット、または変異CDR領域は、次に、対応するBsaI消化ベクターに連結され、それにより、特異的に改変されたCDR領域を含むプラスミドを生成する。
例えば、特異的プライマーを合成し(IDT、下記表8参照)、重鎖VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01およびVH5−51_IGHD5−18*01>3_IGHJ4*01ならびに軽鎖L6_IGKJ1*01およびV3−4_IGLJ1*01用のそれぞれ3つのベクターを生成するために使用し、CDR1、CDR2およびCDR3の先頭と末端にBsaI部位を組み込んだ。最初のラウンドのPCRで、特異的順方向および逆方向プライマーを使い、また、親重鎖または軽鎖DNAをテンプレートとして使って、上述のように、ベクターが生成された。それぞれのクローンのDNAシーケンシング(BATJ、Inc.、SanDiego、CAで実施)を行い、各CDRの2つのBsaI部位の組み込みを確認した。
引き続いて、各BsaI含有プラスミドをBsaIで消化し(New England Biolabs)、DNAをゲル精製した。特異的プライマー(IDT)を合成し、所望の変異体を生成した。簡単に述べれば、各1μlの順方向および逆方向プライマーを95℃の加熱下、TE中で2分間アニールし、続いて、室温までゆっくり冷却した。次に、1μlのアニールしたプライマーを2ngのBsaI消化ベクターに連結し、大腸菌DH5a細胞中で形質転換した。変異をDNAシーケンシングにより確認した。連結反応を、96ウエルプレート中で行い、高スループット変異誘発を可能とする。
例えば、下表8〜9は、VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01_APFFCDR2変異体を生成するプライマーを示す。
実施例2
Fabライブラリーのクローニングおよび高スループット増殖および精製
この実施例では、重鎖または軽鎖可変領域DNAをそれぞれのプラスミド中にクローニングし、続いて同時形質転換し、高スループットタンパクの質増殖/精製を行うことによりFab抗体を生成した。
A.可変重鎖および軽鎖のクローニングおよび同時形質転換
必要に応じてコンビナトリアルFabの同時形質転換および発現を行うための定常重鎖または軽鎖を含むプラスミドに、重鎖または軽鎖可変領域をコードするDNAを挿入した。プラスミドA(配列番号84)およびプラスミドD(配列番号85)は、重鎖定常領域配列を含む。プラスミドC(配列番号86)は、カッパ軽鎖定常領域配列を、また、プラスミドE(配列番号87)は、ラムダ軽鎖定常領域配列を含む。
可変重鎖をコードするDNAをNheIおよびNcoIで消化し、StIIリーダー配列を有するプラスミドAに連結した。DNAa可変カッパ軽鎖をコードするDNAをNcoIおよびBsiWIで消化し、可変ラムダ鎖をコードするDNAをNcoIおよびAvrIIで消化し、それぞれ、標準的分子技術を使って、StIIリーダー配列を有するプラスミドCまたはプラスミドEに連結した。
プラスミドAおよびそれぞれ種々の組み合わせの可変重鎖および軽鎖を含むプラスミドCまたはプラスミドEの内の1つを大腸菌中で同時形質転換した。このプロセスを、全ての重鎖および軽鎖の組み合わせに対し繰り返した。簡単に述べれば、プラスミドA(Fab重鎖をコード)およびプラスミドCまたはプラスミドE(Fab軽鎖をコード)をTE緩衝液中で1ng/μLの最終濃度で別々に再懸濁した。1μLの重鎖プラスミドおよび1μLの軽鎖プラスミドをPCRチューブまたはPCRプレート中で混ぜ合わせ、20μLの氷冷LMG194コンピテント細胞と混合した。形質転換反応系を氷上で10分間インキュベートし、続いて、予熱PCRブロック中、42℃で45秒間、熱ショックを加えた。次に、チューブをさらに2分間氷上に置き、その後、200μLのSOC培地を追加した。細胞を37℃で1.5時間回収した。100μLの形質転換培養液を使って0.4%(w/v)グルコース、17μg/mLカナマイシン(Sigma Aldrich)および34μg/mLクロラムフェニコール(Sigma Aldrich)を含む0.9mLLB(Luria−Bertani Broth)培地に播種した。培養物を激しく振盪を加えながら30℃で20時間成長させた。下記に記載のように、Piccolo(登録商標)システムを使って、形質転換培養物を成長させ、精製した。
B.Fab抗体の高スループット増殖および精製
形質転換後、細胞を、通気性のあるテープでカバーした2mlのディープウエル96ウエルプレート(VWR)ブロック中で一晩成長させた。一晩の培養物を使ってPiccolo(登録商標)に直接播種した(Wollerton et al.(2006)JALA、11:291−303)。
タンパク質発現および精製を自動化するPiccolo(登録商標)(The Automation Partnership(TAP))を使ってFab抗体の高スループット、並列発現および精製を行った。Piccolo(登録商標)用の発現および精製パラメータをRun Composerソフトウェア(TAP)を使って作成した。種培養プレート中の各クローンの位置をマッピングした「株ファイル(Strain File)」を生成した。これはRun Composerソフトウェアで処理され、基本的に装置設定を下記のように設定した:前誘発インキュベーターは30℃に設定;発現インキュベーター1を16℃に設定;遠心分離を6℃と5000xgに設定;TB(Terrific Broth;1L中に、12gトリプトン、24g酵母抽出物、9.4g二塩基性カリウムリン酸塩、および2.2g一塩基性カリウムリン酸塩、を含有)(EMD Biosciences;カタログNo.71754)を満たした培地ポンプ(Media Pump)1、50μg/mLカナマイシン(Sigma Aldrich)、35μg/mLクロラムフェニコール(Sigma Aldrich)、0.4%(w/v)グルコース(Sigma Aldrich)および0.015%(v/v)Antifoam 204(Sigma Aldrich);0.2%(w/v)アラビノース(EMD Biosciences)を満たしたインデューサーポンプ(Inducer Pump)1;インキュベーターガス処理速度を51%酸素で2秒に設定、0.1mL播種容量;帰納統計平均を外れ値除外に設定(すなわち、3つの最高値および3つの最低値を除いた後に求められるブロック平均OD600);culture vessel block(CVB)前誘発遅延を1時間20分に設定、および発現インキュベーター順化(Expression Incubator Acclimatization)を30分に設定。
種培養を行い、メーカー指定のように、必要な実験器具:24ウエルculture vessel block(CVB;The Automation Partnership)、24ウエルフィルタープレート(Filter Plate)(The Automation Partnership)、24ウエルアウトプットプレート(output plate)(Seahorse Bioscience)およびPipette Tip Boxe(MBP)を備えたPiccolo(登録商標)中に入れた。上述のようにアラビノース誘導因子および関連ポンプを補充したTB培地を無菌条件下で調製し、装置に添加した。遠心分離の釣合い錘の重量を設定し、遠心分離器の内側に設置した。最後に、精製試薬(下記のように、溶解緩衝液、樹脂、洗浄緩衝液および溶出緩衝液)を調製し、システムポンプに添加した。これが終わるとすぐ装置をスタートさせ、処理を開始した。
播種の前に、播種材料を24ウエルCVBの特定のウエルにマッピングし、発現および誘導条件を下記のように設定した。種プレートからの播種の前に、CVBの各ウエルに上述のように補充した10mLのTB培地を満たした。各CVBの各ウエルに0.1mLの種培養物を播種し、次に、前誘導インキュベーションに入るまでの間、CVBを貯蔵用カルーセルに戻した。CVBが前誘導インキュベーション開始待ちになるとすぐに、貯蔵カルーセルから取り出し、通気機構(aeration assembly)(これは撹拌、ウエルシーリングおよび酸素/空気の制御管理の手段を提供する)に連結し、30℃に設定した前誘導インキュベーター中に設置した。インキュベーションの開始時とその後、約30分毎にOD600を読み取った。Piccoloの運転制御ソフトウェアが、OD600測定値をモニターし、各CVBが1.0OD600の設定ポイントに到達する時間を予測する。CVBがOD600設定ポイントに到達する約30分前に、機構を発現インキュベーターに移し、発現温度の20℃に平衡化した後、0.032%アラビノース誘導因子の添加によりCVB中の培養を誘導し、続けて45時間発現させた。
培養物の播種と培養物の増殖誘導後、Fabの精製のために細胞を採取し、溶解した。Piccolo(登録商標)を、全培養精製の自動化発現と精製「ライフサイクル(Lifecycle)」を使って、発現Fabタンパク質の精製のために使用した。制御発現後、溶解の前に貯蔵カルーセル中で6℃、30分の条件下、CVBを冷却した。CVBを液体ハンドリングベッドに移し、溶解緩衝液(1:1000 Lysonase(EMD Biosciences)を含む2.5mLのPopculture)を入念に混合しながら各ウエルに添加した。溶解を10分間行った後、CVBを5000xgで10分遠心分離し、細胞壊死組織片ペレットを形成した。遠心分離の間、フィルタープレートをフィルターベッド中に置き、樹脂(2mLのNi−charged His−Bind resin(EMD Biosciences)の50%スラリー)を各ウエルに添加した。可溶性ライセートを樹脂含有フィルタープレートの対応するウエルに添加し、廃棄物中に排液する前に10分間結合させた。洗浄緩衝液(12mLの洗浄緩衝液(50mMナトリウムリン酸塩、300mM NaCl、30mMイミダゾール、pH8.0))を2段に分け各ウエルに添加し、廃棄物中に排液した。最後に、アウトプットプレートをフィルターベッドのフィルタープレートの下に置き、IMAC溶出緩衝液(50mMナトリウムリン酸塩、300mM NaCl、500mMイミダゾール)を2段階で添加して、アウトプットプレート中に排液した。他の全実験器具と同様に、アウトプットプレートを貯蔵用カルーセルに戻した。計画した運転の各CVBに対しこのプロセスが終わると、すぐに装置を解放した。
実施例3
Fab抗体の直交2次精製
Piccolo(登録商標)プロセスにより生成された部分的に純粋なFabのさらなる精製を素早く行うために、精製直交法を開発した。上述の実施例2のようにPiccolo(登録商標)装置を使って、Fabを発現させ、精製した。
軽鎖クラスに応じて、2つの異なる親和性樹脂を使った。カッパ軽鎖を有するFabは、タンパク質Gカラム(GE Healthcare)でさらに精製され、ラムダ軽鎖を有するFabは、Capture Select Fab Lambda affinity column(BAC、Netherlands)でさらに精製された。最初に、タンパク質試料を深いウエルの96ウエルブロック(VWR)に移した。Fab試料毎に約1.8mLのIMAC溶出液を、メーカーのプロトコルに従って、4℃、1mLのHi−Trapタンパク質Gカラムまたは0.5mLのCapture Select Fab Lambda affinity columnと、Akta purifier(GE Healthcare)およびA−905オートサンプラー(GE Healthcare)を使って精製した。タンパク質濃度をMolecular Dynamicプレートリーダー上でA280の吸光度を測定し、対応するFabの消衰係数から計算して求めた。消衰係数は、Fab重鎖および軽鎖中のチロシン+トリプトファン+フェニルアラニン合計数に基づいて計算される。Piccolo(登録商標)システムを使って精製後、発現したタンパク質は、一般的に、20%未満の純度であった。タンパク質Gを使った直交精製後、Fab純度は、SDS−PAGEによると、95%を超える純度であった。
実施例4
電気化学発光結合アッセイ
この実施例では、電気化学発光(ECL)結合アッセイを使用して、Fabライブラリー(例えば、表4参照)から、9つの異なる抗原の内の1つと結合可能な抗体を選別する。これらの抗原には、ヒト上皮増殖因子2受容体(ErbB2)、上皮増殖因子受容体(EGFR)、肝細胞増殖因子受容体(HGFR/c−Met)、Notch−1、CD44、インスリン様増殖因子−1可溶性受容体(IGF−1sR)、P−カドヘリン、エリトロポイエチン受容体(EpoR)およびデルタ様タンパク質4(DLL4)、が含まれる。ECLアッセイでは、抗原−抗体相互作用が、ルテニウムトリビスピリジン(4−メチスルホン)(Ru(bpy)2 2+)標識検出抗体の添加により検出される。電流の印加時に、Ru(bpy)2 2+−標識が、共反応剤の存在下で、酸化−還元サイクルを受け、光が放出される。シグナルは、Ru(bpy)2 2+−標識が電極に接近している場合にのみ発生し、洗浄の必要がない。検出光強度は、捕捉されたタンパク質の量に比例する。
組換え型ヒトタンパク質をR&D Systemsから入手した。これには、rHuman ErbB2/Fcキメラ、CF(Cat#1129−ER);rHuman EGF R/Fcキメラ、CF(Cat#344−ER);rHuman HGF R/c−MET/Fcキメラ、CF(Cat#358−MT/CF);rHuman Notch−1/Fcキメラ、CF(Cat#3647−TK);rHuman CD44/Fcキメラ、CF(Cat#3660−CD);rHuman IGF−1sR、(IGF−1sR)、CF(Cat#391−GR);rHuman P−カドヘリン/Fcキメラ、CF(Cat#861−PC);rHumanエリトロポイエチンR/Fcキメラ、CF(Cat#963−ER);および組換え型ヒトDLL4(Cat#1506−D4/CF)が含まれる。
A.複数抗原に対する結合のためのマルチスポット(Multispot)ECLアッセイ
上記に挙げた各抗原を、96ウエルマルチスポット10Highbindプレート(メソ・スケール・ディスカバリー;Gaithersburg MD)の表面上に50ナノリッター(nl)の各タンパク質(60μg抗原/mL)の量でスポット状に配置することにより10プレートの各ウエル上に固定化した。スポット10は、対照にするため、ブランクで残した。
150μlの分量の1%ウシ血清アルブミン(BSA)のトリス緩衝食塩水ツイーン(TBST)中溶液を各ウエルに添加し、20℃で30分間、インキュベートし、続いて、洗浄およびタップ乾燥して残っている溶液を完全に除去した。その後、12.5μlの分量の1%BSA−TBSTを各ウエルに添加し、続いて、12.5μlの分量の精製Fabを添加した。プレートをシールして、振盪を加えながら、20℃で1時間インキュベートした。
メーカーのインストラクションに従って、検出抗体を、それぞれヤギ抗ヒトカッパ軽鎖ポリクローナル抗体(K3502−1MG、Sigma−Aldrich)およびヤギ抗ヒトラムダ軽鎖ポリクローナル抗体(L1645−1ML、Sigma−Aldrich)の両方をルテニウム(II)トリス−ビピリジン−(4−メチルスルホン)−N−ヒドロキシスクシンイミド(スルフォ−タグNHS−エステル、メソ・スケール・ディスカバリー)に結合させることにより調製した。25μlのTAG検出抗体を各ウエルに添加し、振盪を加えながら、20℃で1時間インキュベートした。最後に、15μlの読み取り緩衝液(Read Buffer)Pを界面活性剤(Cat#R92PC−1、メソ・スケール・ディスカバリー)と一緒に各ウエルに添加した。電気化学発光をSector Imager 2400(メソ・スケール・ディスカバリー)を使って測定した。各ウエルのブランクに対する抗原のECLシグナルを比較することによりデータを解析した。4以上のブランクに対するシグナルの比率の場合に、「Hit」Fabと見なした。
マルチスポットECLアッセイを使って、選択抗原と結合する抗体が特定された。下表10、は、マルチスポットECLアッセイを使って「hit」として特定されたFab(重鎖および軽鎖を含む)および特定されたFab「hit」の標的を示す。いくつかのFabが複数の標的と結合することが特定された。例えば、VH1−46_IGHD6−13*01_IGH41*01&B3_IGKJ1*01は、ヒトErbB2/FcおよびヒトエリトロポイエチンR/Fcキメラの両方に親和性を示す。Fab VH1−46_IGHD2−15*01_IGHJ2*01&L12_IGKJ1*01は、EGFR、EpoRおよびDLL4に結合し、Fab VH1−46_IGHD3−10*01_IGHJ4*01&L12_IGKJ1*01は、Notch−1、P−カドヘリンおよびDLL4に結合する。
最初のマルチスポットECL選別から「Hit」を確認するために、Fab濃度依存性滴定を行いFab−抗原結合親和性を測定した。下表に示すように、Fab抗体の濃度が、各試験Fabに応じて、ウエル間で0.1nM〜2.4μM変動することを除いて、マルチスポットECLアッセイ法の結果は上記と同じであった。データを下表11〜33に示す。
B.DLL4に対する結合に対する96ウエルプレートECLアッセイ
試験ウエルプレート毎にただ1つの抗原を単一スポットに固定したこと以外は、同様にECLアッセイを行った。5μL(PBS+0.03%トリトン−X−100中の10μg/ml DLL4溶液の)を各ウエルに添加し、20℃で一晩インキュベートすることにより、組換え型ヒトDLL4(Cat#1506−D4/CF)を96ウエルプレート上に固定した。1つのウエルは、対照としてブランクのまま残した。タンパク質を取りだし、150μ;lの分量のTBST中1%BSA溶液を各ウエルに添加し、20℃で1時間インキュベートし、続いて、150μlのTBSTで2回洗浄後、タップ乾燥して、完全に残っている溶液を除去した。その後、25μlの分量の各Fab(TBST中1%BSAを含む)を各ウエルに添加した。プレートをシールし、振盪を加えながら20℃で1時間インキュベートした。実施例7と12で記載のように、2つの異なる抗原とFab濃度の組み合わせを使用した。1つの実験では、5μLの30μg/mL抗原を使って、プレートをコートし、各Fabを0.02μMの濃度で試験した。他の実験では、5μLの15μg/mL抗原を使って、プレートをコートし、各Fabを0.004μMの濃度で試験した。
その後、Fabを取りだし、25μlの抗ヒトカッパルテニウム抗体または抗ヒトラムダルテニウム抗体(TBST中1%BSA溶液中の1μg/ml)を各ウエルに添加し、振盪を加えながら20℃で1時間インキュベートした。最後に、15μlの読み取り緩衝液Pと界面活性剤(Cat#R92PC−1、メソ・スケール・ディスカバリー)を各ウエルに添加した。Sector Imager 2400(メソ・スケール・ディスカバリー)を使って電気化学発光を測定した。各ウエルのブランクに対する抗原のECLシグナルを比較することによりデータを解析した。4以上のブランクに対するシグナルの比率を、「Hit」Fabと見なした。結果を下記の実施例7〜15に示す。
実施例5
表面プラズモン共鳴法
この実施例では、選択Fabの組換え型ヒトDLL4(R&D Systems)に対する結合親和性を表面プラズモン共鳴法(SPR)(Biosensor Tools、Salt Lake City、UT)を使って解析した。Fabには、最初のECL選別でDLL4に結合すると特定された生殖系列抗体が含まれる(実施例4に示されるように)。
結果を下表34に示す。表34は、Fab、k
a(M
−1s
−1)、k
d(s
−1)、およびK
D(nM)ならびに標準偏差(括弧で)を示す。生殖系列Fab VH5−51_IGHD5−18*01>3_IGHJ4*01&V3−4_IGLJ1*01は、4.8μMの平均K
Dを有する。生殖系列Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01&L6_IGKJ1*01は、DLL4に730nMの平均K
Dで結合する。生殖系列Fab VH6−1_IGHD3−3*01_IGHJ4*01&V4−3_IGLJ4*01は、38μMの平均結合親和性を有し、一方、生殖系列Fab VH1−46_IGHD3−10*01_IGHJ4*01&L12_IGKJ1*01は、500nMの平均K
Dを有する。
実施例6
ELISA結合アッセイ
この実施例では、ELISA結合アッセイを使って、DLL4に対するFab抗体の結合を測定した。
A.96ウエルプレート
簡単に述べれば、0.5μg/mlのDLL4の100mM NaHCO3中溶液(pH9)50μlを96ウエルCostarプレート(Cat#3370、Corning Inc.)の各ウエルに添加し、室温で1時間インキュベートした。プレートをトリス緩衝食塩水ツイーン(TBST)中の1%BSAを添加してブロッキングして、室温で1時間インキュベートし、続いて、150μlTBSTで2回洗浄した。TBST中の1%BSAを用い、Fab抗体を1000nMの濃度から出発して系列希釈した。50μlの分量の各系列希釈物を3回に分けて各ウエルに添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした後、2回TBSTで洗浄した。1%BSA含有TBST(Cat#AB1238−200、Abcam)で1:1000に希釈した50μlのヤギ抗DDDDKタグHRP結合ポリクローナル抗体を各ウエルに添加し、プレートを室温で30分インキュベート後、200μl TBSTで3回洗浄した。最後に、100μlのTMB一液型試薬(Cat#TMBW−1000−01、BioFax)を添加し、室温で2分間発色させた。100μlの0.5M H2S04を添加して反応を直ちに停止し、ELISAプレートリーダーを使って、450nmの吸光度を測定した。このアッセイを使った結果を実施例9と10で示す。
B.384ウエルプレート
簡単に述べれば、0.5μg/mlの100mM NaHCO3中DLL4溶液(pH9)10μlを384ウエルNunc Maxisorpプレート(Cat#464718、Nalgene Nunc International)の各ウエルに添加し、室温で90分間インキュベートした。プレートをトリス緩衝食塩水ツイーン(TBST)中1%BSAを添加してブロッキングを行い、室温で1時間インキュベートした後、100μlTBSTで2回洗浄した。TBST中1%BSAを用いて1000nMの濃度から出発して、Fab抗体を系列希釈した。20μlの分量の各系列希釈液を3回に分けて各ウエルに添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした後、100μlのTBSTで2回洗浄した。軽鎖に依存して、1%BSA含有TBST(Cat#A7164−1mL、Sigma−Aldrich)を用いて1:1000に希釈したヤギ抗カッパHRP結合ポリクローナル抗体の20μl、または、1%BSA含有TBST(Cat#L1645−1ml、Sigma−Aldrich)を用いて1:1000に希釈したヤギ抗ラムダHRP結合ポリクローナル抗体の20μlを各ウエルに添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした後、100μlのTBSTで4回洗浄した。最後に、25μlのTMB一液型試薬(Cat#TMBW−1000−01、BioFax)を添加し、室温で1〜5分間発色させた。25μlの0.5M H2S04を添加して直ちに反応を停止し、ELISAプレートリーダーを使って450nmでの吸光度を測定した。このアッセイを使った結果を、実施例9と10で示す。
実施例7
抗DLL4「Hit」VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01&L6_IGKJ1*01の重鎖の親和性成熟
a.要約
マルチスポットECL結合アッセイを使って実施例4で特定された、DLL4に対するFab「Hit」VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01&L6_IGKJ1*01の重鎖および軽鎖アミノ酸配列(配列番号88および107)を、関連重鎖または軽鎖を有するがDLL4に結合しない関連「non−Hit」Fab抗体の重鎖および軽鎖アミノ酸配列と配列比較した。配列比較に基づいて、各重鎖および軽鎖中で、その後の親和性成熟に関与する潜在的アミノ酸として、「Hit」と「non−Hit」抗体間で差異があるアミノ酸残基を特定した。重鎖の親和性成熟については、実施例7〜9で記載されている。軽鎖の親和性成熟については、実施例10で記載されている。
簡単に述べれば、特定されたアミノ酸残基に対し、アラニン置換変異導入を行い、生成した変異体Fabを試験し、DLL4と抗体の結合に与える影響を評価した。DLL4と抗体の結合に影響しない変異残基を特定し、NNK変異誘発を伴うオーバーラッピングPCRを使って、さらなる変異誘発を行った。DLL4との結合に関し変異体抗体を評価し、DLL4との結合が改善された変異を特定した。それぞれ特定された単一変異体を含む組み合わせ変異体が生成し、組み合わせ変異体をDLL4との結合に関し、さらにアッセイした。抗体の他の領域を変異させることによりさらなる最適化を行った。この方法により、親「Hit」VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01&L6_IGKJ1*01 Fab抗体に比べて、DLL4に対し大きな結合親和性を有する抗DLL4抗体が生成した。
b.重鎖の親和性成熟
i.CDRの潜在的結合部位の特定
親「Hit」VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01&L6_IGKJ1*01の重鎖のアミノ酸配列(配列番号88)を、DLL4に結合しないと特定されたnon−Hit抗体、すなわち、VH1−46_IGHD6−13*01_IGHJ4*01&L6_IGKJ1*01の関連重鎖のアミノ酸配列(配列番号93)と配列比較した。「Hit」Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01&L6_IGKJ1*01は、23.1のECLシグナル/ブランク比率を有し、一方、non−Hit Fab VH1−46_IGHD6−13*01_IGHJ4*01&L6_IGKJ1*01のその比率は、2.4にすぎなかった。これらの2つのFabは、同じVH生殖系列セグメントを共有しているため、関連がある。さらに、DH生殖系列セグメントは、同じ遺伝子ファミリー(すなわち、IGHD6)に属する。配列アラインメントについては、図1に説明されている。配列比較に基づいて、「Hit」および「non−Hit」間で異なり、それにより、「Hit」および「non−Hit」の抗DLL4抗体の結合の差異が説明できるアミノ酸残基が特定された。特定されたアミノ酸残基は、結合親和性にとって重要な重鎖の領域であると特定されたCDR3に位置していた。
ii.CDR3のアラニンスキャンニング
親Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01&L6_IGKJ1*01の重鎖配列のCDR3中のアミノ酸残基に対しアラニン置換変異導入を行い、DLL4結合に関与しそうにないアミノ酸残基を特定した。親Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01&L6_IGKJ1*01の重鎖配列のCDR3領域のアラニンスキャニングを、アミノ酸残基A106、Y108、およびF109を除く、CDR3領域の全残基のアラニンへの変異を行うことにより実行した。上記実施例2に記載のように、変異Fab抗体を発現し、精製した。
実施例4Bに記載のように、ECL96ウエルプレートアッセイを使って、精製Fabアラニン変異体をDLL4との結合に関し試験した。5μLの10μg/mL組換え型ヒトDLL4抗原を96ウエルプレートにコートし、を0.04μMの濃度で添加した。対照として、96ウエルプレートのブランクウエルへのFabのバックグラウンド結合も測定した。データをECLシグナルのシグナル/ノイズ比率として示したが、これは、DLL4との結合のECLシグナルを、プレートに対する残りの結合のECLシグナルで除算した比率である。表35で、試験変異体FabおよびDLL4との結合に対し観察されたシグナル/ノイズ比率を示す。結果は、E100、Y101、S105、E107またはQ110のアラニンによる変異が、ECLシグナルの減少を引き起こし、従って、DLL4に対する結合親和性を低減させたことを示している。従って、これらの残基は、DLL4結合に関与していると思われ、これ以上は変異誘発しなかった。対照的に、S102、S103、S104またはH111のアラニンによる変異により、親に比較してECLシグナルが増加したか、またはECLシグナルが変化せず、従って、DLL4に対する結合親和性を改善したか、または結合親和性に影響を与えなかった。これにより、これらの残基は、さらなる変異誘発用の残基として特定された。
変異体FabおよびDLL4タンパク質の濃度を変えて、上記のECL結合実験を繰り返した。表36は、2つの異なる濃度のDLL4抗原および変異体Fabに対する変異体Fab、ECLシグナル、およびシグナル/ノイズ比率を示す。結果は、両アッセイで一致し、上述の最初の結果が確認できた。E100、Y101、S105、E107またはQ110のアラニンによる置換で、DLL4との結合に対するECLシグナルの減少が起こり、一方、S102、S103、S104またはH111のアラニンによる置換で、DLL4との結合に対するECLシグナルの改善が起こるか、またはECLシグナルに影響を与えなかった。
iii.重鎖アミノ酸残基S102、S103、S104のNNK変異誘発
CDR3のアラニン置換変異導入の後で、実施例1に記載のように、重鎖アミノ酸残基S102、S103およびS104を選択し、親Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01&L6_IGKJ1*01をテンプレートとして使って、NNK変異誘発を伴うオーバーラッピングPCR法によりさらに変異導入した。
実施例4に記載のように、96ウエルプレートECLアッセイを使って、FabおよびDLL4タンパク質の濃度を変えて、生成したFab変異体のDLL4に対する結合親和性を測定した。表37に、S102、S103およびS104NNK変異体のそれぞれのシグナル/ノイズ比率を示す。シーケンシングの前に、Fab NNK変異体をランダムに選択し、従って、いくつかの変異体、例えば、S103Lは、複数回、精製と試験が行われ、結果は一致した。Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01&L6_IGKJ1*01中のシグナル/ノイズ比率の増加と、従ってDLL4に対する結合親和性の改善を伴うFabを生ずる3つの変異が特定された。2つのFab変異体、S102AおよびS103Pは、それぞれ親Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01&L6_IGKJ1*01より約3倍大きいDLL4に対するシグナル/ノイズ比率を有していた。3番目の変異体の重鎖Fab変異体S104Fは、親Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01&L6_IGKJ1*01よりも少なくとも4倍大きなDLL4に対するシグナル/ノイズ比率を有していた。2つの別の変異、すなわち、Fab重鎖変異体S103AおよびS104HがDLL4との結合に対するシグナル/ノイズ比率のわずかな増加を生じることが特定された。
重鎖親Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01&L6_IGKJ1*01中にS102A、S103A、S103P、S104HおよびS104F変異をそれぞれ含むFab重鎖変異体を、次に、実施例4Aで記載のECLマルチスポットアッセイを使って再アッセイを行い、DLL4に対する結合親和性の増加を確認した。各Fab変異体を2つの異なるFab濃度で一群の抗原に対し試験した。結果を下表38〜39に示す。表29は、DLL4に対する結合に関する各変異体のECLシグナルおよびシグナル/ノイズ比率の結果を示す。表38は、全試験抗原に対する結合に関するシグナル/ノイズ比率を示す。結果は、重鎖変異体S102A、S103P、S104HおよびS104Fは、全て、親Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01&L6_IGKJ1*01に比べて、DLL4に対する結合のシグナルが増加し、さらに、これらの変異体は、用量依存性ならびに抗原特異的様式で結合することを示す。さらに、結果は、重鎖変異体S103AのDLL4に対する結合のシグナルは、親Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01&L6_IGKJ1*01と大略同じであることも示している。
iv.NNK変異誘発結果に基づく組み合わせ変異体
DLL4との結合を増加させるのに寄与すると特定されたFab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01&L6_IGKJ1*01の重鎖変異体S102A、S103PおよびS104Fを組み合わせて、三重変異体を生成した。三重変異体は、Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01S102A/S103P/S104F&L6_IGKJ1*01(H:APF&L:wt)として設計されている。Fab APF三重変異体の結合親和性および特異性を、ECLマルチスポットアッセイとELISAの両方を使って測定した。
実施例4Aで記載のECLマルチスポットアッセイを使って、APF三重変異体および親抗体のDLL4および他の抗原に対する結合に関する特異性と結合親和性を種々の抗体濃度で比較した。表40は、試験抗原に対する親およびAPF三重変異体の結合のシグナル/ノイズ比率を示す。結果は、重鎖APF三重変異体が、親抗体よりも10倍大きい結合親和性でDLL4に結合することを示す。さらに、他のいずれの抗原に対する結合の検出可能なシグナルも認められなかったので、APF三重変異体は、特異的にDLL4に結合する。
実施例6で記載のように、125nm〜1000nm抗体のFab濃度で、APF三重変異体のDLL4に対する結合をELISAによりさらに解析した。結果を、下表41に示す。試験濃度では、親Fab抗体は、DLL4との結合に関し検出可能なシグナルを示さなかった。対照的に、APF三重変異体は、検出可能なシグナルを示し、濃度依存性様式によるDLL4との結合の証拠を示した。これらの結果から、ECLアッセイがELISAアッセイより感受性が高いことが確認される。
実施例8
抗DLL4APF三重変異体重鎖のDLL4に対する結合のさらなる最適化
この実施例では、実施例7で記載ならびに生成したAPF三重変異体重鎖を、さらに最適化し、DLL4に対する結合親和性を改善する。APF三重変異体Fabを、抗体重鎖の残っているCDR領域中の重鎖アミノ酸残基のさらなる変異誘発のためのテンプレートとして使用した。上述の実施例1のように、CDR2のアミノ酸残基G55およびCDR3のアミノ酸残基E100、A106、Y108、F109、およびH111に対し、NNK変異誘発を伴うオーバーラッピングPCRを使って変異誘発を行った。
アミノ酸残基E100、A106、Y108、F109、およびH111の位置にさらなる変異を含むFab APF三重変異体を10nMFabの濃度で、ECLマルチスポットアッセイを使って、DLL4および他の抗原との結合試験を行った。結果を、下表42〜43に示す。DLL4との結合に関し試験した各変異体Fabのシグナル/ノイズ比率を表42に示す。表43は、各変異体Fabの種々の試験抗原に対する結合関するECLシグナルおよびブランク(抗原不含の対照ウエルに対するバックグラウンド結合)を示す。X(どのアミノ酸でもよい)と指定されたアミノ酸変異は、明確な結合を示さず、従って、正確な変異を特定するための配列決定を行わなかった。結果は、アミノ酸残基G55、E100、A106、Y108、またはF109の他のいずれかの他のアミノ酸による変異は、ECLシグナルの減少からも明らかなように、一般的に、DLL4対する結合親和性を減少させたことを示す。一方、H111の置換は、ECLシグナルの増加またはECLシグナルの無変化からも明らかなように、DLL4に対する結合親和性を改善するか、または結合親和性に影響を与えなかった。特に、Fab重鎖変異体VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01S102A/S103P/S104F/H111F&L6_IGKJ1*01(H:APFF&L:wt)は、Fab APF三重変異体より2〜4倍優れたDLL4との結合に関するシグナル/ノイズ比率であった。さらに、どの変異体も、他の試験抗原のいずれに対しても何ら明らかな結合を示さなかった(下表43参照)。
ECLマルチスポットアッセイを使って、APF三重変異体およびAPFF変異体のDLL4との結合に関し、さらに比較した。Fab抗体を種々の濃度でアッセイして、DLL4に対する結合の用量依存性を評価した。また、Fab抗体を、種々の抗原に対しアッセイし特異性を評価した。APFF変異体を二通りに試験した。表44は、DLL4に対する結合のシグナル/ノイズ比率を示す。結果は、H:APF&L:wt変異体(122nM)に比べて、H:APFF&L:wt変異体がDLL4に対しわずかに親和性が増加する(70nM)ことを示す。さらに、表45のアッセイで観察されたECLシグナルの結果から、他の試験抗原に比べて、両Fab変異体が特異的にDLL4結合することが確認される。
実施例9
DLL4との結合に対する抗DLL4 APFF変異体重鎖のさらなる最適化
この実施例では、実施例7と8に記載のようにDLL4との結合に対し親和性成熟したAPFF変異体の重鎖アミノ酸配列を、抗体ポリペプチドの他のCDR領域のさらなる変異のためのテンプレートとして使用した。変異体Fabを発現させ、DLL4に対する結合に関しアッセイした。
i.CDR1のアラニンスキャンニング
重鎖APFF変異体をCDR1(アミノ酸26〜35)中のアミノ酸残基のアラニン置換変異導入のためのテンプレートとして使用し、DLL4に結合する抗体に関与する残基を特定した。アラニンスキャンニングをCDR1の残基T28、F29、T30、S31およびY33のみをアラニンに変異させることにより行った。上記実施例2に記載のように、変異体Fab抗体を発現し、精製した。
DLL4および他の抗原に対する結合に関して、ECLマルチスポット結合アッセイを使って、精製Fabアラニン変異体を10nMの濃度で試験した。ECLアッセイの結果を、表46と47に示す。表46は、変異体FabおよびDLL4に対する結合のシグナル/ノイズ比率を示す。結果は、アミノ酸残基F29およびY33のアラニンでの変異により、DLL4に対する結合のシグナル/ノイズ比率の減少を生じることを示す。従って、これらの残基は、さらなる変異誘発の対象としては選択しなかった。アミノ酸残基T28、T30またはS31のアラニンへの変異により、親重鎖APFF変異体に比べて、DLL4に対する結合のシグナル/ノイズ比率のわずかの増加を生じた。種々の抗原および抗原不含ブランクウエルに対する結合のECLシグナルを示している表47から、全試験抗体がDLL4に対し特異性を示すことが解る。また、表46は、実施例6に記載のように、100nMのFab変異体を使って行ったELISAアッセイの結果を示す。ELISAの結果もまた、アミノ酸残基Y33がDLL4結合に関与することを示す。ELISAに比べECLアッセイの観察結果が異なるのは、おそらく、ELISAアッセイが大きいオフ速度を選択し、一方、ECLアッセイは平衡結合を検出しているという事実によると思われる。従って、小さいオン速度を有するが、改善されたオフ速度も有する変異体に対しては、ELISAは強力な結合を示す可能性があるが、それは必ずしも強力なECLシグナルと相関しないと思われる。対照的に、改善されたオン速度を有するが、小さいオフ速度も有する変異体に対しては、ELISAは弱い結合を示す可能性がある。
アラニン変異体のDLL4に対する結合を確認するために、ECLアッセイを使って、さらなる実験を行った。表48は、DLL4抗原およびブランクに対するECLシグナルおよび各変異体FabのDLL4に対する結合のシグナル/ノイズ比率を示す。表40は、各変異体Fabの全試験抗原に対する結合のECLシグナルを示す。表48と49の結果により、表46と47で認められたECL結果がそれぞれ確認できる。
ii.CDR2のアラニンスキャンニング
重鎖APFF変異体をCDR2(アミノ酸50〜66)中のアミノ酸残基のアラニン置換変異導入のためのテンプレートとして使用し、DLL4に結合する抗体に関与する残基を決定した。アミノ酸残基Y60〜G66は変異させなかった。上記実施例2に記載のように変異体Fab抗体を発現し、精製した。
精製Fabアラニン変異体を、ECLマルチスポット結合アッセイを使って、DLL4に対する結合に関し10nMの濃度で試験した。ECLアッセイの結果を表50と51に示した。表50は、変異体FabおよびDLL4に対する結合のシグナル/ノイズ比率を示す。結果は、アミノ酸残基I50、G55、S57、T58、またはS59のアラニンへの変異でDLL4に対する結合のシグナル/ノイズ比率が減少することを示し、従って、これらの残基は、さらなる変異誘発の対照とはしなかった。対照的に、アミノ酸残基I51、N52、P53、S54またはG56のアラニンへの変異で、親重鎖APFF変異体よりもDLL4に対する結合のシグナル/ノイズ比率を2〜4倍改善し、従って、これらの残基を、さらなる変異誘発用の残基として特定した。種々の抗原および抗原不含のブランクウエルに対する結合のECLシグナルを表す表51から、全試験抗体がDLL4に対する特異性を示すことが解る。また、表50は、実施例6で記載のように、100nMのFab変異体を使って行ったELISAアッセイの結果を示す。ELISAの結果により、ECLアッセイにより観察された結果をおおむね確認できた。ELISAによる観察によると、アミノ酸残基I50、G55、S57、T58およびS59の変異は、親APFF変異体に比べて、DLL4に対する結合を低下させた。
iii.CDR2残基N52、S54およびG56のNNK変異誘発
次に、Fab重鎖APFF変異体をテンプレートとして使って、上述のように、アミノ酸残基N52、S54、G56のさらなる変異誘発を行った。
親APFF変異体テンプレートH:APFF&L:wt中にアミノ酸残基N52、S65およびG56の変異を含むFab重鎖変異体のDLL4に対する結合に関し、実施例4Bに記載の96ウエルプレートDLL4 ECL結合アッセイおよび実施例6に記載のELISAアッセイを使って試験した。表52は、種々の試験変異体のDLL4に対する結合のECLおよびELISAシグナルを示す。二重変異体、例えば、I51T/N52Vが、PCR反応中に偶然に生成した。特定のアミノ酸位置に2つの変異の組み合わせを含むようにいくつかのFab変異体が設計されている。例えば、G56E/Dは、試験抗体が、1つは変異G56Eを含み、他の1つは、変異G56Dを含む、2つのFabの混合物であったことを示す。ECLとELISAの両方の結果はFabAPFF変異体中に、N52L、N52W、S54T、G56HおよびG56W等の変異を含むいくつかのFab重鎖変異体は、全て、親Fab APFF変異体より大きい親和性でDLL4に結合することを示す。
iv.CDR2アミノ酸残基I51のさらなる変異誘発
N52L、S54TおよびG56Hを含むFab変異体を生成した。従って、生成したFab変異体は、抗体の重鎖:S102A/S103P/S104F/H111FN52L/S54T/G56H中に7つの変異を含み、Fab変異体VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01S102A/S103P/S104F/H111FN52L/S54T/G56H&L6_IGKJ1*01(H:APFF LTH&L:wt)と呼ばれる。H:APFF LTH変異体をCDR2アミノ酸残基I51のさらなるNNK変異誘発のためのテンプレートとして使用した。実施例4Bで記載の96ウエルプレートECL結合アッセイおよび実施例6に記載のELISAを使って、I51変異体をDLL4に対する結合の試験を行った。ECLおよびELISAシグナルの結果を表53に示す。結果は、H:APFF LTH親バックボーン中のアミノ酸残基I51のバリン(I51V)への変異により、H:APFF LTH親に比べて、DLL4に対する結合親和性のさらなる増加を生じたことを示す。
v.CDR2アミノ酸残基P53のNNK変異誘発
Fab変異体VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01S102A/S103P/S104F/H111FI51T/N52L/S54T/G56H&L6_IGKJ1*01(H:APFF TLTH)をCDR2アミノ酸残基P53のNNK変異誘発のためのテンプレートとして使用した。実施例4Bで記載の96ウエルプレートECL結合アッセイおよび実施例6に記載のELISAを使って、P53変異体のDLL4に対する結合の試験を行った。表54は、ECLおよびELISAシグナルを示す。結果は、Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01S102A/S103P/S104F/H111FI51T/N52L/S54T/G56H(H:APFF TLTH)&L6_IGKJ1*01重鎖残基P53のアラニン(P53A)への変異により、H:APFF TLTH変異体に比べて、DLL4に対する結合親和性の増加を生ずることを示す。
重鎖変異体APFF LTH(配列番号203)、APFF ELTH(配列番号208)、APPF VLTH(配列番号209)、APFF NLTH(配列番号214)、APFF TLATH(配列番号221)およびAPFFI51T/N52V(配列番号171)をそれぞれ、親軽鎖L6_IGKJ1*01(配列番号107)と対形成させ、20nMの濃度から開始されるFabの2倍系列希釈を使ってELISAによりDLL4に対する結合をさらに解析した。結果を下表55に示す。結果は、重鎖変異体APFF LTH(配列番号206)、APFF ELTH(配列番号208)、APPF VLTH(配列番号209)およびAPFF NLTH(配列番号214)を含むFabは、約1nM〜10nMの間のKdでDLL4と結合することを示す。重鎖変異体APFF TLATH(配列番号221)およびAPFF I51T/N52V(配列番号171)を含むFabは、他の試験Fabに比べて、DLL4に対する低い親和性を有する。重鎖変異体APFFTLATHは、約100nMを超えるKdを有し、重鎖変異体APFF I51T/N52Vは、10〜100nMの間のKdを有する。
vi.フレームワークアミノ酸残基S84のNNK変異誘発
Fab重鎖APFF変異体を、上述のNNK変異誘発を伴うオーバーラッピングPCRを使った、重鎖フレームワーク領域中のアミノ酸残基S84のさらなる変異誘発のためのテンプレートとして使用した。実施例4Aに記載のECLマルチスポット結合アッセイおよび実施例6に記載のELISAを使って、生成した変異体のDLL4および他の抗原に対する結合の試験を行った。ECLおよびELISAの結果を表56に示す。表56は、変異体FabおよびECL法またはELISAアッセイによるDLL4に対する結合のシグナル/ノイズ比率を示す。表57は、各変異体Fabの全試験抗原に対する結合のECLシグナルを示す。一般的に、結果から、Fab重鎖VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01S102A/S103P/S104F/H111F S84変異体は、ECLまたはELISAでは、DLL4に対する結合の強化を示さなかったことが認められる。1つの変異体のFab重鎖VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01S102A/S103P/S104F/H111F S84T(配列番号233)が、ECL MSDアッセイでは、より大きなDLL4に対する結合を示したが、ELISAでは、同じ結合であった。
実施例10
DLL4に対し特定された「Hit」Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01&L6_IGKJ1*01軽鎖の親和性成熟
この実施例では、親のDLL4に対する「Hit」Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01&L6_IGKJ1*01の軽鎖に、上記実施例7〜9に記載の重鎖の親和性成熟と同様に親和性成熟を行った。
i.CDR潜在的結合部位の特定
「Hit」VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01&L6_IGKJ1*01の軽鎖のアミノ酸配列(配列番号107)を、DLL4に対し結合しないと特定された3つの「non−Hit」関連軽鎖(下表58参照)のアミノ酸配列と配列比較した。これら4つのFabは、同じJ
L生殖系列セグメントを共有するため、関連している。さらに、V
L生殖系列セグメントは同じサブグループ(すなわち、IGKV3)に属する。配列アラインメントを図2に示す。配列比較に基づいて、「Hit」および「non−Hit」の間で異なっており、それにより、「Hit」および「non−Hit」間の結合親和性の差異を説明できるアミノ酸残基が特定された。特定されたアミノ酸残基は、CDR3中に位置し、これは結合親和性に重要な軽鎖の領域として特定された。
CDR3のNNK変異誘発
オーバーラッピングPCRを使ってNNK変異誘発により軽鎖L6_IGKJ1*01のCDR3のアミノ酸残基R91、S92、N93、およびW94に変異導入し、DLL4に結合するアミノ酸残基をさらに特定した。CDR3アミノ酸残基Q89、Q90、P95、P96、W97およびT98は、4つの整列させた軽鎖の内で保存されていた(図2参照)ので、NNK変異誘発は行わなかった。重鎖三重変異体APF(例えば、実施例7;Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01S102A/S103P/S104F(H:APF)&L6_IGKJ1*01を参照)をアミノ酸残基R91およびS92のNNK変異誘発のための親テンプレートとして使用した。重鎖士重変異体APFF(例えば、実施例9;Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01S102A/S103P/S104F/H111F(H:APFF)&L6_IGKJ1*01を参照)をアミノ酸残基S92、N93およびW94のNNK変異誘発のための親テンプレートとして使用した。X(任意のアミノ酸)で指定されたアミノ酸変異は、明確な結合を示さなかったので、正確な変異を特定するための配列決定を行わなかった。生成した変異体を実施例4Aに記載のようにECLマルチスポットアッセイを使ってアッセイした。結果を下表59と60に示す。結果は、アミノ酸残基R91、S92、N93およびW94の変異誘発により、APFまたはAPFF親テンプレート抗体に比較して、DLL4に対する結合のECLシグナルの減少が起こることを示しており、従って、これらの残基は、これ以上変異誘発しなかった。
iii.CDR1のNNK変異誘発
オーバーラッピングPCRを使ってNNK変異誘発により軽鎖L6_IGKJ1*01のCDR1のアミノ酸残基S28、S30、S31、およびY32に変異導入し、DLL4に対する結合に重要なアミノ酸残基をさらに特定した。APF三重変異体(例えば、実施例7;Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01S102A/S103P/S104F(H:APF)&L6_IGKJ1*01を参照)をS30およびY32のNNK変異誘発用テンプレートとして使用した。APFF重鎖四重変異体(例えば、実施例9;Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01S102A/S103P/S104F/H111F(H:APFF)&L6_IGKJ1*01を参照)をS28、S30およびS31のNNK変異誘発用のテンプレートとして使用した。生成した変異体を、上記実施例4Aに記載のようにECLマルチスポットアッセイを使って試験した。結果を下表61と62に示す。二重変異体、例えば、R24G/Q27LがPCR反応中に偶然に生成した。X(任意のアミノ酸)で指定されたアミノ酸変異は、明確な結合を示さなかったので、正確な変異を特定するための配列決定を行わなかった。結果は、アミノ酸残基Y32の変異誘発により、APF親テンプレートに比べてDLL4に対する結合親和性の減少が起こることを示しており、従って、この残基のこれ以上の変異誘発は行わなかった。アミノ酸残基S28、S30およびS31の変異誘発は、APFまたはAPFF親テンプレートに比べて、DLL4に対する結合親和性を改善するか、または結合親和性に影響を与えなかったので、これらの残基を、さらなる変異誘発用の残基として特定した。3つの軽鎖変異体、すなわち、L6_IGKJ1*01 S28D、S30N、およびS31Hは、DLL4に対する抗体の結合親和性をわずかに増加させた。
次に、Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01S102A/S103P/S104F/H111F(H:APFF)&L6_IGKJ1*01軽鎖変異体S28D、S28H、S30NおよびS31HをELISAによりDLL4に対する結合の再アッセイを行った。結果を下表63に示す。結果は、Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01S102A/S103P/S104F/H111F(H:APFF)&L6_IGKJ1*01軽鎖変異体S28N、およびS31Hが、H:APFF親テンプレート抗体に比べて、DLL4に対する結合親和性をわずかに増加させることを示している。試験濃度でのELISAでは、Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01S102A/S103P/S104F/H111F(H:APFF)&L6_IGKJ1*01軽鎖変異体S28HおよびS30Dは、APFF親テンプレート抗体に比べて、DLL4に対する結合親和性を増加させなかった。
iv.CDR1のNNK変異誘発に基づく組み合わせ変異体
Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01S102A/S103P/S104F/H111F(H:APFF)&L6_IGKJ1*01軽鎖変異体S28D、S30NおよびS31Hを1つの三重変異体に組み合わせて、Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01S102A/S103P/S104F/H111F(H:APFF)&L6_IGKJ1*01S28D/S30N/S31H(L:NDH)(H:APFF&L:NDH)と呼んだ。H:APFF&L:NDH変異体のDLL4に対する結合親和性を、ELISAおよび96ウエルプレートECLアッセイの両方で試験した。さらに、軽鎖三重変異体L6_IGKJ1*01S28D/S30N/S31H(L:NDH)を重鎖変異体VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01S102A/S103P/S104F/H111F/G56A(H:APFFG56A)およびVH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01S102A/S103P/S104F/H111F/S54A(H:APFFS54A)と組み合わせてアッセイした。
結果を下表64と65に示す。結果は、抗体変異体APFF−NDHは、親抗体APFF変異体に比べて、4倍増加した親和性でDLL4に結合することを示している。抗体Fab H:APFFG56A&L:NDHは、H:APFF&L:wt親抗体変異体に比べて、8倍大きいDLL4に対する結合親和性を生じ、また、他の試験抗体に比べ、増加した結合親和性を示した。抗体Fab H:APFFS54A&L:NDHは、H:APFF&L:NDH抗体変異体に比べて、結合親和性のわずかな増加を生じた。表65は、三重軽鎖変異体および種々の重鎖変異体を含む抗体の結合親和性の比較である。表64および65の結果から、重鎖中に5変異および軽鎖中に3変異を含むH:APFFG56A&L:NDHが、試験した抗体中で最高の結合親和性を示すことが解る。
v.CDR2のアラニンスキャンニング
軽鎖L6_IGKJ1*01のCDR2のアミノ酸残基D50、A51、S52、N53、R54、A55およびT56をアラニン置換変異導入により変異させ、DLL4に対する結合に重要なアミノ酸残基をさらに特定した。アミノ酸残基A51およびA55は、トレオニンに変異させた。APFF重鎖四重変異体(例えば、実施例9;Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01S102A/S103P/S104F/H111F(H:APFF)&L6_IGKJ1*01を参照)をテンプレートとして使用した。
結果を下表66に示す。結果は、アミノ酸残基D50、R54およびT56のアラニンへの変異、およびアミノ酸残基A51のトレオニンによる置換により、DLL4に対する結合のECLシグナルの減少が生じることを示し、従って、これらの残基をこれ以上変異誘発しなかった。アミノ酸残基S52およびN53のアラニンへの変異、およびアミノ酸残基A55のトレオニンへの変異は、DLL4に対する結合のECLシグナルを改善したか、またはECLシグナルに影響を与えなかったので、これらの残基をさらなる変異誘発用のアミノ酸残基として特定した。
vi.CDR2残基S52、N53、およびA55のNNK変異誘発
Fab変異体H:APFF&L:NDH(上記実施例10;VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01S102A/S103P/S104F/H111F(H:APFF)&L6_IGKJ1*01S28D/S30N/S31H(L:NDH)を参照)をCDR2アミノ酸残基S52、N53およびA55のNNK変異誘発用テンプレートとして使用した。Fab変異体を96ウエルプレートECL結合アッセイおよびELISAを使って、DLL4に対する結合の試験を行った。表67は、ECLおよびELISAシグナルを示す。X(任意のアミノ酸)で指定されたアミノ酸変異は、明確な結合を示さなかったので、正確な変異を特定するための配列決定を行わなかった。結果は、軽鎖中にさらなる変異S52T、S52L、N53H、A55SおよびA55Gを有するものを含む、H:APFF&L:NDHの種々の変異体が、親H:APFF&L:NDHに比べて、より大きなDLL4に対する結合のECLおよびELISAシグナルを呈することを示している。
軽鎖変異体H:APFF&L:NDH S52T、H:APFF&L:NDH S52L、H:APFF&L:NDHS 52T/S、H:APFF&L:NDH S52X、H:APFF&L:NDH N53H、H:APFF&L:NDH A55SおよびH:APFF&L:NDH A55Gを、100nMの濃度から始まるFabの2倍系列希釈を使って、ELISAによりDLL4に対する結合をさらに解析した。結果を下表68に示す。抗体変異体H:APFF&L:NDHS52L、H:APFF&L:NDHA55SおよびH:APFF&L:NDHA55Gは、親H:APFF&L:NDH変異体に比較して、DLL4に対する結合の親和性をわずかに増加させた。全てのFab軽鎖変異体は、親H:APFF&L:NDH変異体と同じ親和性の範囲内でDLL4と結合する。
vii.フレームワーク3残基S76およびF62のNNK変異誘発
Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01S102A/S103P/S104F/H111F(H:APFF)およびL6_IGKJ1*01を軽鎖フレームワーク3領域のアミノ酸残基S76およびF62のさらなる変異誘発用のテンプレートとして使用した。これらの残基を、上述のNNK変異誘発を伴うオーバーラッピングPCRを使って、変異導入した。DLL4に対する結合を、実施例4Aに記載のようにECLマルチスポットアッセイまたは実施例6に記載のようにELISAアッセイを使って試験した。結果を下表69〜71に示す。結果は、アミノ酸残基の変異S76およびF62は、DLL4に対する結合のECLおよびELISAシグナルの減少を起こすことを示している。
実施例11
重鎖および軽鎖Fab組み合わせ変異体
実施例7〜10でDLL4に対する結合に寄与するとして特定された重鎖および軽鎖変異体を対形成させ、様々な組み合わせ変異体を得た。重鎖変異体には、VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01 S102A/S103P/S104F/H111FN52L/S54T/G56H(H:APFFLTH)、VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01 S102A/S103P/S104F/H111FI51A/N52L/S54T/G56H(H:APFFALTH)、およびVH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01 S102A/S103P/S104F/H111FI51V/N52L/S54T/G56H(H:APFFVLTH)を含めた。軽鎖変異体には、L6_IGKJ1*01 S28D/S30N/S31HS52L/A55S(L:NDHLS)およびL6_IGKJ1*01S28D/S30N/S31HS52L/A55G(L:NDHLG)を含めた。
下表72にFabおよびDLL4に対する結合のECLシグナルを示す。通常、H:APFFLTHおよびH:APFFVLTH重鎖を有するFabは、重鎖H:APFFALTHを有するFabに比べて、DLL4に対する結合のECLシグナルを増加させた。試験抗体に応じて、特定の軽鎖変異体もまた、DLL4に対する結合にさらに影響を及ぼした。類似の結果がELISAによっても得られた(表73)。変異体を20nMの濃度から始まるFabの3倍系列希釈を使って、ELISAによりDLL4に対する結合をさらに解析した。結果を下表73に示す。H:APFFLTHおよびAPFFH:VLTH重鎖変異を含む抗体は、重鎖変異体H:APFFALTHを含む抗体変異体に比べ、約10倍増加したDLL4に対する結合親和性を有していた。
要約
親和性成熟の結果として、親Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01&L6_IGKJ1*01のDLL4に対する結合親和性が430倍増加した。下表75に、SPR(実施例5参照)により測定した種々の親和性成熟抗体のDLL4に対する結合親和性を示す。親Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01&L6_IGKJ1*01は、730nMのK
DでDLL4に結合する。4つの重鎖アミノ酸、すなわち、S102A/S103P/S104F/H111F(H:APFF)の変異により、10倍増加したDLL4に対する親和性を有するFabを生成した(K
D=70.6nM)。親和性成熟重鎖および軽鎖変異体FabH:APFFVLTH&L:NDHLSは、1.7nMのK
Dを有し、DLL4に対する結合親和性の430倍の増加に相当する。
実施例12
特定された親「Hit」Fab VH5−51_IGHD5−18*01>3_IGHJ4*01&V3−4_IGLJ1*01のDLL4に対する親和性成熟
エレクトロルミネセンス・メソ・スケール・ディスカバリー(MSD)マルチスポット結合アッセイを使って実施例4で特定された、DLL4に対する親「Hit」Fab VH5−51_IGHD5−18*01>3_IGHJ4*01&V3−4_IGLJ1*01(配列番号89および108)に対し、上述の実施例7〜11のように親和性成熟を行った。この方法により、親「Hit」VH5−51_IGHD5−18*01>3_IGHJ4*01&V3−4_IGLJ1*01 Fab抗体に比べて、顕著に改善されたDLL4に対する結合親和性を有する抗DLL4抗体が生成された。
A.重鎖
1.CDR潜在的結合部位の特定
親「Hit」VH5−51_IGHD5−18*01>3_IGHJ4*01&V3−4_IGLJ1*01の重鎖のアミノ酸配列(配列番号89)をDLL4に対し結合しないとして特定されたnon−Hit、すなわち、VH5−51_IGHD6−25*01_IGHJ4*01の関連重鎖のアミノ酸配列(配列番号106)と配列比較した。これらの2つのFabは、同じVHおよびJH生殖系列セグメントを共有するため、関連している。配列アラインメントを図3に示す。配列比較に基づいて、「Hit」と「non−Hit」の間で異なり、それにより、「Hit」と「non−Hit」抗体のDLL4に対する結合の差異を説明できるアミノ酸残基が特定された。特定されたアミノ酸残基は、CDR3に位置しており、結合親和性に重要な重鎖の領域であるとして特定された。
2.CDR3のアラニンスキャンニング
親FabVH5−51_IGHD5−18*01>3_IGHJ4*01&V3−4_IGLJ1*01の重鎖配列のCDR3中のアミノ酸残基に対しアラニン置換変異導入を行い、DLL4との結合に関与しないと思われるアミノ酸残基を特定した。重鎖のCDR3領域のアラニンスキャニングを、CDR3領域のアミノ酸残基Y107、F108、D109、およびY110を除く、全残基をアラニンに変異させることにより行った。精製Fabアラニン変異体をDLL4に対する結合の試験を行った。結果を表76に示す。R99、Y101、S102、Y103、Y105、またはD106のアラニンへの変異により、DLL4に対する結合のECLシグナルの減少が生じたので、これらの残基に対し、これ以上の変異誘発は行わなかった。対照的に、G100またはG104のアラニンへの変異では、DLL4に対する結合のECLシグナルの増加を生じたか、またはECLシグナルに対し影響を与えなかった。従って、これらの残基をさらなる変異誘発用の残基として特定した。結果は、種々の濃度の変異体FabおよびDLL4タンパク質を使って反復実験により確認した(表77参照)。
3.重鎖アミノ酸残基G100およびG104のNNK変異誘発
CDR3のアラニン置換変異導入後、上記実施例7.b.iiiに記載の実験と同様の、野生型Fab VH5−51_IGHD5−18*01>3_IGHJ4*01&V3−4_IGLJ1*01をテンプレートとして使い、また、NNK変異誘発を伴うオーバーラッピングPCRを使ったさらなる変異用として、重鎖アミノ酸残基G100およびG104を選択した。結果を下表78に示す。X(どのアミノ酸でもよい)と指定されたアミノ酸変異は、明確な結合を示さず、従って、正確な変異を特定するための配列決定を行わなかった。重鎖中の2つの変異、G100KおよびG104T、を改善されたDLL4に対する結合のECLシグナルを有するFabを生成する変異として特定した。各変異体は、親Fab VH5−51_IGHD5−18*01>3_IGHJ4*01&V3−4_IGLJ1*01に比べて、約2倍大きいDLL4に対する結合のECLシグナルを示した。
4.CDR3のNNK変異誘発に基づく組み合わせ変異体
DLL4に対する増加した結合親和性を有するとして特定されたFab VH5−51_IGHD5−18*01>3_IGHJ4*01&V3−4_IGLJ1*01重鎖変異体G100KおよびG104Tを組み合わせて、二重変異体を生成し、Fab VH5−51_IGHD5−18*01>3_IGHJ4*01G100K/G104T&V3−4_IGLJ1*01(H:KT)と命名した。種々の濃度の各抗体をアッセイすることにより、KT二重変異体のDLL4に対する結合を、親Fab VH5−51_IGHD5−18*01>3_IGHJ4*01&V3−4_IGLJ1*01のDLL4に対する結合と比較した。結果を下表79〜80に示す。結果から、KT二重変異体は、親Fab VH5−51_IGHD5−18*01>3_IGHJ4*01&V3−4_IGLJ1*01に比べて、DLL4に対する結合のECLシグナルの増加を示すことが解る。両Fabは、種々の他の試験抗原に比べて、DLL4に対し特異的結合を示す(表80参照)。
B.重鎖のさらなる最適化
1.要約
前に記載し生成したKT二重変異体の重鎖をさらに最適化しDLL4に対する結合を改善した。重鎖変異体KT二重変異体を、重鎖のCDR1(アミノ酸26〜35)、CDR2(アミノ酸残基50〜66)およびフレームワーク領域中の重鎖アミノ酸残基のアラニン置換変異導入によるさらなる変異誘発のためのテンプレートとして使用した。
2.CDR1中の残基のアラニンスキャンニング
G26を除くCDR1の全アミノ酸残基を変異させることによりアラニンスキャンニングを行った。また、3つの追加の隣接アミノ酸残基、すなわち、G24、I34、およびG35をアラニンに変異させた。精製Fabアラニン変異体を、ECLマルチスポット結合アッセイを使ってDLL4に対する結合に関し試験を行った。結果を下表81〜83に示す。アミノ酸残基Y27、F29、T30、S31、Y32、W33、またはI34のアラニンへの変異により、DLL4に対する結合のECLおよびELISAシグナルの減少が生じ、従って、これらの残基は、これ以上変異誘発を行わなかった。アミノ酸残基G24、S28、またはG35のアラニンへの変異は、DLL4に対する結合のECLシグナルを改善したか、またはECLシグナルに影響を与えなかった。従って、これらの残基をさらなる変異誘発用の残基として特定した。また、ELISA実験も行ったが、ELISA実験では、検出可能なシグナルがほんのわずしか、または全く観察されなかった(表81)。表83から、試験抗体は、他の試験抗原に比べ、DLL4に対し特異性を示すことが解る。
3.アミノ酸残基G24、S28およびG35のNNK変異誘発
CDR1のアラニン置換変異導入後、重鎖KT二重変異体をテンプレートとし、NNK変異誘発を伴うオーバーラッピングPCRを使ったさらなる変異のために、重鎖アミノ酸残基G24、S28およびG35を選択した。結果を下表84に示す。X(どのアミノ酸でもよい)と指定されたアミノ酸変異は、明確な結合を示さず、従って、正確な変異を特定するための配列決定を行わなかった。特異的アミノ酸位置に2つの変異の組み合わせを含むようにいくつかのFab変異体が設計された。例えば、G24S/Tの場合、試験抗体は、1つが変異G24Sを含み、もう一つが変異G24Tを含む、2つのFabの混合物であったことを示す。結果は、KT二重変異体の重鎖の追加のアミノ酸変異(G24L、S28R、S28KおよびG35V)により、親KT二重変異体テンプレートに比べて、DLL4に対する結合のECLシグナルの増加が生じることを示している。
4.G24、S28およびG35の組み合わせ変異体
Fab VH5−51_IGHD5−18*01>3_IGHJ4*01G100K/G104T(KT)&V3−4_IGLJ1*01重鎖変異体G24L、G24T、G24A、S28RおよびG35Vを組み合わせて、重鎖中に3つから5つの変異を含む抗体を生成した。生成した変異体を表85に示す。ECLアッセイを使って、変異体のDLL4に対する結合を評価した。全組み合わせ変異体が、KT二重変異体に比べて、より大きなDLL4に対する結合のECLシグナルを示した。結果は、変異体Fab H:KT TRV&L:wtがDLL4に対する結合に関し最大の親和性を持ったことを示している。
5.CDR2のアラニンスキャンニング
KT二重変異体をCDR2(アミノ酸50〜58)のアラニン置換変異導入用のテンプレートとして使用し、抗体DLL4に対する結合に重要な残基を決定した。ECLマルチスポット結合アッセイを使って精製Fabアラニン変異体のDLL4に対する結合試験を行った。結果を下表86〜88に示す。アミノ酸残基I50、I51、Y52、P53、G54、D55、またはD57のアラニンへの変異により、DLL4に対する結合のECLシグナルの減少が生じ、従って、これらの残基をこれ以上の変異誘発用の標的とはしなかった。アミノ酸残基S56またはT58のアラニンへの置換により、DLL4に対する結合のECLシグナルが改善されたか、またはECLシグナルに影響を与えなかった。従って、これらの残基に対し、さらなる変異誘発を行った。また、ELISAによる類似の実験を行ったが、検出可能なシグナルがほんのわずかしか、または全く検出されなかった。表88から、全抗体がDLL4に対し特異性を示すことが明らかである。
6.アミノ酸残基T58およびS56のNNK変異誘発
CDR2のアラニン置換変異導入後、H:KT&L:wt二重変異体をテンプレートとし、NNK変異誘発を伴うオーバーラッピングPCRを使ったさらなる変異のために、重鎖アミノ酸残基T58およびS56を選択した。結果を下表89に示す。X(どのアミノ酸でもよい)と指定されたアミノ酸変異は、明確な結合を示さず、従って、正確な変異を特定するための配列決定を行わなかった。重鎖KTアミノ酸残基T58のアラニン(T58A)およびアスパラギン酸(T58D)への変異により、DLL4に対する結合のECLシグナルの増加が生じた。
7.アミノ酸残基S84およびD109の変異誘発
重鎖KT二重変異体を、アミノ酸残基S84およびD109の変異誘発用テンプレートとして使用した。これらのアミノ酸残基を、NNK変異誘発を伴うオーバーラッピングPCRを使って、またはアラニンスキャンニングによって、変異導入した。結果を下表90〜92に示すが、これらの図はDLL4または種々の抗原に対する結合のECLおよびELISA結果を示す。重鎖残基S84およびD109の変異により、重鎖変異体Fab KT&V3−4_IGLJ*01に比較して、DLL4に対する結合のECLシグナルの減少を生じた。
C.軽鎖
1.CDR3のアラニンスキャンニング
親Fab VH5−51_IGHD5−18*01>3_IGHJ4*01G100K/G104T(H:KT)&V3−4_IGLJ*01の軽鎖のCDR3中のアミノ酸残基に対しアラニン置換変異導入を行い、DLL4結合に関与しないと思われるアミノ酸残基を特定した。CDR3の全ての残基を変異させるアラニン置換変異導入を行った。精製Fabアラニン変異体に対し、ECLマルチスポットアッセイを使って、0.04μMの濃度でDLL4に対する結合の試験を行った。した。結果を下表93〜94に示す。結果は、アミノ酸残基L92、Y93、G95、G97、I98、またはS99のアラニンへの変異により、DLL4に対する結合が低減することを示したので、これらの残基に対しては、これ以上の変異誘発を行わなかった。V91、M94、またはS96のアラニンによる置換は、DLL4に対する結合を改善したか、またはDLL4に対する結合に影響を与えなかった。従って、これらの残基を、さらなる変異誘発のための残基として特定した。
2.CDR3アミノ酸残基V91、M94およびS96のNNK変異誘発
CDR3のアラニン置換変異導入後、FabVH5−51_IGHD5−18*01>3_IGHJ4*01G100K/G104T&V3−4_IGLJ*01をテンプレートとして使い、NNK変異誘発を伴うオーバーラッピングPCRを使ってさらに変異を行うために、軽鎖アミノ酸残基V91、M94およびS96を選択した。生成した変異体を、実施例4に記載のようにECLマルチスポットアッセイを使って、または実施例6に記載のようにELISAによって、アッセイした。結果を表95に示す。ECL結果は、V3−4_IGLJ*01アミノ酸変異体M94R、S96MおよびS96EがDLL4に対する結合を増加させたことを示した。ELISAでは、いずれの試験変異体にも、検出可能なシグナルが観察されなかった。
3.M94およびS96の組み合わせ変異体
DLL4に対する結合の強化に貢献すると特定されたV3−4_IGLJ1*01軽鎖変異体M94RおよびS96Mを組み合わせて、二重変異体を生成した。二重変異体は、V3−4_IGLJ1*01M94R/S96M(L:RM)と命名された。H:KT、H:KT S28R、H:KT LRV、H:KT TRV、およびH:KT ARVを含む種々の重鎖変異体と対を形成した、L:RM二重変異体の結合親和性を実施例4に記載のようにECLアッセイにより測定した。結果を下表96に示す。Fab H:KT TRV&L:RMは、他の試験Fab抗体に比べて、最大のDLL4に対する結合のECLシグナルを示した。
実施例6に記載のように20nMの濃度から始まるFabの3倍系列希釈を使い、ELISAにより、上記変異体FabのDLL4に対する結合に関しさらに解析した。結果を下表97に示す。ECLの結果と同様に、他の試験変異体Fab抗体に比べて、Fab H:KT TRV&L:RMが最大のDLL4に対する結合のELISAシグナルを示した。
4.軽鎖CDR1のアラニンスキャンニング
重鎖KT二重変異体(FabVH5−51_IGHD5−18*01>3_IGHJ4*01G100K/G104T&V3−4_IGLJ*01)を、軽鎖CDR1(アミノ酸23〜33)のアラニン置換変異導入用のテンプレートとして使用し、抗体DLL4に対する結合に重要な残基を特定した。
実施例4Aに記載のようにECLマルチスポット結合アッセイを使って、精製Fabアラニン変異体のDLL4に対する結合の試験を100nMの濃度で行った。結果を下表98に示す。アミノ酸残基Y33、Y34およびP35のアラニンへの変異は、ECLシグナルの減少からも明らかなように、DLL4に対する結合を低減させた。アミノ酸残基G23、L24、S25、S26、G27、S28、V29、S30、T31、およびS32のアラニンへの変異により、軽鎖に変異を持たない親KT二重変異体に比較して、ECLシグナルが増加した、またはECLシグナルが変化しなかったことからも明らかなように、DLL4に対する結合が改善されたか、またはDLL4に対する結合が影響を受けなかったかのどちらかであった。
5.アミノ酸残基G23のNNK変異誘発
CDR1のアラニン置換変異導入後、Fab H:KT&L:wt二重変異体をテンプレートとして使用するさらなる変異誘発のために、軽鎖アミノ酸残基G23を選択した。ECLおよびELISAシグナルを下表99に示す。X(どのアミノ酸でもよい)と指定されたアミノ酸変異は、明確な結合を示さず、従って、正確な変異を特定するための配列決定を行わなかった。
6.CDR2のアラニンスキャンニング
重鎖KT二重変異体(FabVH5−51_IGHD5−18*01>3_IGHJ4*01G100K/G104T&V3−4_IGLJ*01)をCDR2(アミノ酸52〜58)のアラニン置換変異導入用のテンプレートとして使用し、DLL4に対する結合抗体として重要な残基を特定した。
実施例4に記載のように、ECLマルチスポット結合アッセイを使って、精製Fabアラニン変異体のDLL4に対する結合の試験を行った。結果を下表100に示す。アミノ酸残基S52、T53、N54、T55、R56、S57およびS58のアラニンへの変異は、軽鎖中に変異を持たない親KT二重変に比べて、ECLシグナルの増加、またはECLシグナルの無変化からも明らかなように、DLL4に対する結合を改善したか、またはDLL4に対する結合に何ら影響を与えなかったかのどちらかであった。
7.アミノ酸残基S52およびR56のNNK変異誘発
CDR2のアラニン置換変異導入後、重鎖KT二重変異体をテンプレートとして使用するさらなるNNK変異誘発のために、軽鎖アミノ酸残基S52およびR56を選択した。ECLおよびELISAシグナルを下表101に示す。X(どのアミノ酸でもよい)と指定されたアミノ酸変異は、明確な結合を示さず、従って、正確な変異を特定するための配列決定を行わなかった。軽鎖変異体S52G、R56Y/S、R56AおよびR56Gは、ECLおよびELISAの両方で評価して、DLL4に対する結合の強化を示した。
重鎖および軽鎖の変異の種々の組み合わせを含む種々のFabを、100nMの濃度から始まるFabの2倍系列希釈を使って、DLL4に対する結合に関しさらに解析した。結果を下記表102に示す。他の試験Fab変異体に比べた、ELISAシグナルからも明らかなように、FabH:KTS28R&L:wtは、最大のDLL4に対する結合を示した。
8.フレームワーク3アミノ酸残基T78の変異誘発
KT重鎖に重鎖変異体(Fab VH5−51_IGHD5−18*01>3_IGHJ4*01G100K/G104T(H:KT)&V3−4_IGLJ*01)を、軽鎖フレームワーク3領域内のアミノ酸残基T78のさらなる変異誘発のためのテンプレートとして使用した。この残基をNNK変異誘発を伴うオーバーラッピングPCRを使って変異させた。表103は、DLL4に対する結合のECLシグナルを示す。アミノ酸残基T78の変異は、軽鎖に変異を持たない親KT二重変異体に比較して、ECLシグナルが増加した、またはECLシグナルが変化しなかったことからも明らかなように、DLL4に対する結合が改善されたか、またはDLL4に対する結合が影響を受けなかったかのどちらかであった。2つの追加の軽鎖二重変異体G23A/N175K(定常領域内)およびS52A/A116T(フレームワーク4領域内)も生成し、ECLシグナルの増加からも明らかなように、KT二重変異体テンプレート抗体に比べて、これらはDLL4との結合の改善を示した。
9.重鎖KT TRVの対形成変異体
FabH:KT TRV&V3−4_IGLJ1*01およびH:KT TRV&L:RMに対するSPRデータ(実施例5および表108参照)は、これらのFabが小さいオフ速度を有することを示している。従って、これらの抗体の結合親和性を増やすために、重鎖H:KT TRVを種々のV3−4_IGLJ1*01軽鎖変異体と対形成させた。ELISAアッセイが、大きいオフ速度を選択し、一方、ECLアッセイは平衡結合を検出するために、DLL4に対する結合親和性をELISAによりアッセイした。
実施例6に記載のように、100nM Fabの濃度でELISAを使って、精製Fab変異体のDLL4に対する結合の試験を行った。ELISAアッセイの結果を表104に示す。軽鎖変異体V91A、T31A、S52A、T53A、S57A、V91L、S96GおよびS96P含有Fabは、より大きなELISAシグナル−ブランクからも明らかなように、親軽鎖V3−4_IGLJ1*01を有するFabに比べて、DLL4に対する結合の強化を示した。
10.アミノ酸残基S52、T53およびS57のII型制限酵素連結を使ったカセット変異導入
重鎖H:KT TRVの対形成Fab変異体の分析に続いて、軽鎖二重変異体V3−4_IGLJ1*01 V91L/S96P(L:LP)を生成した。Fab H:KT TRV&L:LPをテンプレートとして、タイプII制限酵素連結反応をつかって行うさらなる変異誘発用残基として、ELISAによりDLL4に対する結合の強化が認められた3つの追加の軽鎖アミノ酸残基(S52、T53およびS57)(上記表103参照)を選択した。ELISAシグナルを下表105に示す。軽鎖変異体L:LP S52G、L:LP S52M、L:LP S52NおよびL:LP S52Hは、ELISAで評価して、DLL4に対する結合の強化を示した。
100nMの濃度から始まるFabの3倍系列希釈を使って、ELISAにより重鎖および軽鎖の種々の組み合わせの変異を含む4つのFabのDLL4に対する結合のさらなる解析を行った。結果を下表106に示す。他の試験Fab変異体に比べたELISAシグナルからも明らかなように、Fab H:KT TRV&L:LPS52Gが、最大のDLL4に対する結合を示した。
11.対形成Fab変異体
100nMの濃度から始まるFabの2倍系列希釈を使って、ELISAにより、重鎖および軽鎖の種々の組み合わせの変異を含む24変異体FabのDLL4に対する結合のさらなる解析を行った。結果を下表107に示す。FabH:KT TRV&L:LP S52KおよびH:KT TRV&L:LP S52Gは、他の試験Fab変異体とのELISAシグナルの比較からも明らかなように、最大のDLL4に対する結合親和性を示した。Fab H:KT TRV&L:LP S52HおよびH:KT TRV&L:LP S52Nは、Fab H:KT TRV&L:LP S52KおよびH:KT TRV&L:LP S52Gに比べて、DLL4に対する結合親和性がわずかに低下した。
要約
親和性成熟の結果として、親Hit Fab VH5−51_IGHD5−18*01>3_IGHJ4*01&V3−4_IGLJ1*01のDLL4に対する結合親和性が130倍増加した(下表108のSPRデータ参照)。親Fab VH5−51_IGHD5−18*01>3_IGHJ4*01&V3−4_IGLJ1*01は、4.8μMのK
DでDLL4に結合する。重鎖変異体Fab H:KT&L:wtは、DLL4に対する親和性が13倍増加する(K
D=355nM)。親和性成熟重鎖および軽鎖変異体Fab H:KTTRV&L:wtは、36.2nMのK
Dを有し、DLL4に対する結合親和性の130倍の増加になる。親和性成熟重鎖および軽鎖変異体Fab H:KT TRV&L:LPおよびH:KT TRV&L:LP S52Gは、それぞれ、3.3および5.0nMのK
Dを有し、DLL4に対する結合親和性の1000倍の増加になる。
実施例13
生殖系列セグメントスワッピング
この実施例では、マルチスポットECL結合アッセイを使って実施例4で特定されたDLL4に対する2つの抗体「Hit」Fabに対し、それぞれJHまたはDH生殖系列セグメントのJ−スワッピングまたはD−スワッピングによる変異誘発を行った。J−スワッピングは、親「Hit」Fab JH生殖系列セグメントの異なるJH生殖系列セグメントによる置換を伴う。D−スワッピングは、親「Hit」DH生殖系列セグメントの異なるDH生殖系列セグメントによる置換を伴う。DH生殖系列セグメントが、重鎖CDR3の5’末端を構成し、JHセグメントが、重鎖CDR3の3’末端を構成するために、D−スワッピングおよびJ−スワッピングは、この重要な抗体結合領域の変異誘発を容易にする。
A.Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01&L6_IGKJ1*01
Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01&L6_IGKJ1*01に対して、IGHJ1*01のIGHJ2*01、IGHJ4*01、およびIGHJ5*01によるJ−スワッピングにより、CDR3の3’末端のアミノ酸残基A106からH111までの解析が可能となる(図4A参照)。実施例4に記載のようにECLアッセイを使って、精製Fab J−スワップ変異体のDLL4に対する結合の試験を行った。結果を下表109〜110に示す。結果は、ECLシグナルの減少により評価して、IGHJ1*01のIGHJ2*01、IGHJ4*01、またはIGHJ5*01によるスワッピングによって、IGHJ1*01J
H生殖系列セグメント含有親テンプレート抗体と比較して、DLL4に対する抗体の結合が低下したこと示す。
B.Fab VH5−51_IGHD5−18*01>3_IGHJ4*01&V3−4_IGLJ*01
Fab VH5−51_IGHD5−18*01>3_IGHJ4*01&V3−4_IGLJ*01に対して、IGHJ4*01のIGHJ1*01、IGHJ3*01、およびIGHJ5*01によるJ−スワッピングにより、CDR3の3’末端のアミノ酸残基106〜110の解析が可能となる(図4B参照)。IGHD5−18*01のIGHD5−12*01およびIGHD5−24*01のD−スワッピングにより、CDR3の5’末端のアミノ酸残基100〜104の解析が可能となる(図4C参照)。精製J−スワップおよびD−スワップ変異体のDLL4に対する結合の解析を、実施例4に記載のようにECLアッセイを使って行った。DLL4に対する結合のECL結果を下表111〜112に示す。結果は、ECLシグナルの減少により評価して、IGHJ4*01のIGHJ1*01、IGHJ3*01、またはIGHJ5*01によるスワッピングにより、IGHJ4*01J
H生殖系列セグメント含有親テンプレート抗体に比較して、DLL4に対する抗体の結合が低下したことを示す。さらに、ECLシグナルで評価して、IGHD5−18*01のIGHD5−12*01またはIGHD5−24*01によるスワッピングにより、IGHD5−18*01D
H生殖系列セグメント含有親テンプレート抗体に比較して、DLL4に対する抗体の結合が低下した。
実施例14
肝細胞増殖因子受容体に対するFab VH3−23_IGHD2−21*01>3_IGHJ6*01&V2−13_IGLJ2*01の親和性成熟
エレクトロルミネセンス・メソ・スケール・ディスカバリー(MSD)マルチスポット結合アッセイを使って、肝細胞増殖因子受容体(HGFR;C−Met)に対して特定されたFab VH3−23_IGHD2−21*01>3_IGHJ6*01&V2−13_IGLJ2*01(配列番号2803および594)に、上述の実施例7〜9に示すように親和性成熟を行った。実施例1Cに記載の方法を使って、オリゴ対の連結によりアミノ酸残基の変位導入を行った。
i.CDRの潜在的結合部位の特定
親「Hit」VH3−23_IGHD2−21*01>3_IGHJ6*01&V2−13_IGLJ2*01の重鎖アミノ酸配列(配列番号2803)を、わずかに低い親和性であるがHGFRにも結合する3つの関連「Hit」の3つの重鎖アミノ酸配列(配列番号2797、2799および2801)と配列比較した。これらの4つのFabは同じVHおよびJH生殖系列セグメントを共有する。配列アラインメントを図5に示す。配列比較に基づいて、親「Hit」と関連「Hit」の間で違いがあり、それにより、親「Hit」と関連「Hit」の間のHGFRに対する結合の差異を説明できるアミノ酸残基を特定した。特定されたアミノ酸残基は、CDR3中に位置しており、この位置は、結合親和性にとって重要な重鎖の領域であるとして特定された。
ii.重鎖CDR3のアラニンスキャンニング
親Fab VH3−23_IGHD2−21*01>3_IGHJ6*01&V2−13_IGLJ2*01(配列番号2803および594)の重鎖配列のCDR3に対しアラニン置換変異導入を行い、100nM Fab濃度でECLマルチスポットアッセイを使って解析した。結果を下表113に示す。ECLシグナルの減少で評価して、アミノ酸残基E99、V102、V103、V104、およびI105のアラニン置換およびA106のトレオニン置換により、HGFRに対する結合の顕著な低下が生じた。ECLシグナルの減少で評価して、H100、I101、I107、およびS108のアラニンによる置換により、HGFRに対する結合のわずかな低下が生じた。
iii.Y113のNNK変異誘発
Fab VH3−23_IGHD2−21*01>3_IGHJ6*01H100E/S108P(H:EP)&V2−13_IGLJ2*01(配列番号593および594)の重鎖配列のアミノ酸残基Y113に対し、NNK変異誘発を行い、20nM Fab濃度でECLマルチスポットアッセイを使って解析した。結果を下表114に示す。ECLシグナルの増加からも明らかなように、EP変異体Y113G、Y113I、Y113S、Y113T、Y113N、Y113NおよびY113Wは、重鎖EPに比べて、HGFRに対する結合が強化された。
iv.Y109、Y110、Y111、Y112およびY114のNNK変異誘発
Fab VH3−23_IGHD2−21*01>3_IGHJ6*01 H100E/S108P/Y113G(EPG)&V2−13_IGLJ2*01(配列番号605および594)の重鎖配列のアミノ酸残基Y109、Y110、Y111、Y112およびY114のNNK変異誘発を行い、20nMFabの濃度でECLマルチスポットアッセイを使って解析した。結果を下表115に示す。ECLシグナルの増加からも明らかなように、EPG重鎖残基Y110のイソロイシンへの置換により、重鎖EPGに比較して、HGFRに対する結合が強化された。また、ECLシグナルのわずかな増加からも明らかなように、EPG変異体Y109W、Y112、Y112TおよびY112Wでは、重鎖EPGに比べて、HGFRに対する結合がわずかに強化された。
v.重鎖CDR1のアラニンスキャンニング
Fab VH3−23_IGHD2−21*01>3_IGHJ6*01 H100E/S108P/Y113G(H:EPG)&V2−13_IGLJ2*01(配列番号605および594)の重鎖配列のCDR1のアラニン置換変異導入を行い、20nM Fabの濃度でECLマルチスポットアッセイを使って解析した。結果を下表116に示す。ECLシグナルの減少からも明らかなように、アミノ酸残基F27およびA33のアラニン置換により、HGFRに対する結合の低下が起こった。ECLシグナルの増加、またはECLシグナルの無変化からも明らかなように、アミノ酸残基G26、T28、F29、S30、S31、Y32、M34、およびS35のアラニンへの置換により、軽鎖中に変位を持たないEPG三重変異体に比べて、HGFRに対する結合の改善が認められたか、またはHGFRに対する結合への影響がなかったかのいずれかであった。
vi.重鎖CDR2のアラニンスキャンニング
Fab VH3−23_IGHD2−21*01>3_IGHJ6*01 H100E/S108P/Y113G(H:EPG)&V2−13_IGLJ2*01(配列番号605および594)の重鎖配列のCDR2のアラニン置換変異導入を行い、20nM Fabの濃度でECLマルチスポットアッセイを使って解析した。結果を下表117に示す。減少したECLシグナルからも明らかなように、アミノ酸残基I51、G56、Y59、およびA61のアラニンによる置換により、HGFRに対する結合が低下した。また、ECLシグナルの減少からも明らかなように、二重変異体S46A/G47Aは、HGFRに対する結合が低下した。ECLシグナルの増加、またはECLシグナルの無変化からも明らかなように、アミノ酸残基G53、S54、G55、S57、T58、Y60、D62、V64およびK65のアラニンによる置換により、軽鎖中に変位を含まないH:EPG三重変異体に比べて、HGFRに対する結合を改善したか、またはHGFRに対する結合に影響を与えなかったかのいずれかであった。
実施例15
P−カドヘリンおよびEpoに対するFab VH3−23_IGHD3−10*01>3_IGHJ6*01&O12_IGKJ1*01の親和性成熟
実施例4に記載のようにエレクトロルミネセンス・メソ・スケール・ディスカバリー(MSD)マルチスポット結合アッセイを使って、P−カドヘリンおよびEPOに対して特定されたFab VH3−23_IGHD3−10*01>3_IGHJ6*01&V2−13_IGLJ2*01(配列番号688および594)の親和性成熟を、上述の実施例7〜9に記載のように、行った。
vii.CDR3アミノ酸残基R104、Y110、Y112、Y113、およびY114のNNK変異誘発
CDR3アミノ酸残基R104、Y110、Y112、Y113、およびY114に対し、NNK変異誘発を使って変位導入し、P−カドヘリンとEPOに結合する能力をECLマルチスポットアッセイにより試験した。結果を下表118に示す。変異体−3Yは欠失変異体であり、チロシン110、111および112が欠失している。ECL結合シグナルの増加からも明らかなように、アミノ酸残基Y115のプロリン(Y115P)への変異およびY110のバリン(Y110V)への変異により、野生型テンプレート抗体に比べて、P−カドヘリンおよびEPOの両方に対する結合が強化された。ECL結合シグナルの増加からも明らかなように、アミノ酸残基Y111のアルギニン(Y111R)への変異により、野生型に比べて、P−カドヘリンに対する結合が強化された。さらに、下表118に示されるように、変異体Y115P、Y110VおよびY111Rは、全てP−カドヘリンに結合する。このことは、ELISA結合結果からも明らかである。
実施例16
CHO細胞表面上に発現したDLL4に対する結合
この実施例では、Fab H:APFF VLTH&L:NDH LS(配列番号209および350;表75に示されるように、約1.7nMの親和性を示すと特定された)およびH:KT TRV&L:LP S52G(配列番号430および543;表108に示されるように、約5nMの親和性を示すと特定された)に対し、フローサイトメトリーで検出されたCHO細胞の表面上で発現したDLL4に結合する能力の試験を行った。DLL4発現構築物を生成するために、pCR−BluntII−TOPO(配列番号2934)中のヒトDLL4相補DNA(配列番号2905、受入番号BC106950;および配列番号2904で設定されたアミノ酸をコードするもの、受入番号AAI06951)をグリセロールストックとして、Open Biosystems(クローンID#40034887)から入手した。このストックをカナマイシン寒天プレート上に線状に塗布し、DNAの精製のため、コロニーを採取した。Purelink(登録商標)Quick Plasmid Miniprepキット(Invitrogen、Catalog#K210010)を使ってDNAを得た。
完全長DLL4をOpenBiosystemsベクターから消化物として取りだし、pCDNA5/FRT(配列番号2935;InvitrogenCatalog#K601001)中のNheIとNotIの間に挿入した。連結反応をRapid DNA Ligationキット(Roche、Catalog#11635379001)で行い、細胞を熱ショックを使って、One Shot(登録商標)Max Efficiency(登録商標)DH5αTM−T1Rコンピテント細胞(Invitrogen、Catalog#12297016)に形質転換した。細胞をカルベニシリンプレート上に選択した。コロニーを採取し、1:1000の100mg/mLカルベニシリン含有luria broth(LB)培地中で一晩播種した。miniprep(Invitrogen;Catalog#K210011)によりプラスミドDNAを抽出した。
Invitrogenのリポフェクタミン(登録商標)トランスフェクション試薬を使って、完全長DLL4およびpOG44リコンビナーゼベクター(配列番号2936;Invitrogen Catalog#K601001)を含むpcDNA5/FRTを、Flp−InTMSystemプロトコルに従ってInvitrogenのFlp−InTM−CHO細胞株(Cat.No.R75807)に形質移入した。細胞を12ウエルプレート中で約90%集密とした。2日後、形質移入した細胞を400μg/mlヒグロマイシンで選択した。5日後、コロニーを採取し、10cm2組織培養皿に移した。これらの細胞株をヒグロマイシン選択により維持した。
Accutase(登録商標)Enzyme Cell Detachment Medium(Cat#00−4555−56、eBioscience)を使って、完全長DLL4および対照CHO細胞を発現しているCHO細胞を組織培養プレート(BD Falcon 10cm2)から取り出した。燐酸塩緩衝食塩水(2%BSA/PBS)中の2%ウシ血清アルブミンで細胞を洗浄後、2%BSA/PBS中の10nM〜50nM Fabを添加し、氷上で30分間、インキュベートした。細胞を2%BSA/PBSで1回洗浄し、マウス抗ヒトカッパPE抗体(1:100に希釈、Cat#MH10514、Invitrogen)またはマウス抗ヒトラムダPE抗体(1:100に希釈、Cat#MH10614、Invitrogen)を添加し、氷上で10分間、インキュベートした。二次抗体マウス抗ヒトカッパPE単独(Fabなしの)をDLL4発現CHO細胞用の対照として使用した。次に、細胞を2%BSA/PBSで2回洗浄し、BD FACSAriaを使ってフローサイトメトリーにより解析した。結果は、試験Fabは、CHO細胞の表面上に発現したDLL4に結合することを示す。いずれのFabもDLL4の高発現が無ければCHO細胞に顕著な結合を示さなかった。
実施例17
フローサイトメトリーによるDLL4−Notch相互作用の抑制
この実施例では、DLL4に対するNotch−Fcの結合を遮断する能力により3つのDLL4結合Fabを機能的に選別した。このアッセイでは、Fabおよびビオチン化Notch−Fcの両方の存在下、DLL4発現CHO細胞をインキュベートした。ストレプトアビジン−PEを検出分子として使用した。Notch−FcがDLL4発現CHO細胞に結合する場合、これらの細胞は、578nmのPEシグナルにより検出可能である。あるいは、FabがNotch−FcのDLL4に対する結合を遮断する場合、DLL4発現CHO細胞は、標識されないか、または検出されない。試験Fabには、H:APFF VLTH&L:NDHLS(配列番号209および350)、H:KT TRV&V3−4_IGLJ1*01(配列番号430および108)ならびにH:KT TRV&L:LP S52G(配列番号430および543)が含まれる。
簡単に述べれば、完全長DLL4(CHO−DLL4)を発現しているCHO細胞を、実施例16に記載のように、Accutase(登録商標)Enzyme Cell Detachment Medium(Cat#00−4555−56、eBioscience)を使って組織培養プレートから採取した。Fabを50nMの出発濃度から開始する2%BSA/PBSの5倍系列により希釈した。メーカーのインストラクションに従って、EZ−Link NHS−Biotin試薬(cat#20217.Pierce)を使って、Notch−FC(cat#3647−TK−050、R&D Systems)をビオチン化した。採取した細胞を2%BSA/PBS中の250nMビオチン化Notch−FCおよび30μL Fabで30分間、氷上で処理した。次に、PE−標識ストレプトアビジン(Cat#21627、Pierce−Thermo Scientific)を添加して1:5の最終希釈度にし、続けて、室温で10分間インキュベーションを行った。次に、細胞を2%BSA/PBSで2回洗浄し、BD FACSAriaを使ってフローサイトメトリーにより分析した。
結果を下表119に示す。全3つのFabは、CHO−DLL4に対するNotch−Fcの結合を効果的に遮断する。Fab H:APFF VLTH&L:NDH LSは、2nMのFab濃度で、NotchのDLL4に対する結合を80%遮断する。Fab H:KT TRV&V3−4_IGLJ1*01は、50nMのFab濃度で、NotchのDLL4に対する結合を50%遮断する。Fab H:KT TRV&L:LP S52Gは、50nMのFab濃度で、NotchのDLL4に対する結合を80%遮断する。
実施例18
IgGクローニングおよび発現
この実施例では、DLL4に結合するFab抗体をpFUSEベクター中にクローン化することによりIgGに変換した。簡単に述べれば、重鎖および軽鎖をコードする配列を別々にpFUSEファミリーベクター(pFUSE−hIgG2−Fc2、Cat#pfuse−hfc2、InvivoGen;配列番号2938)の含有IL−2シグナル配列の後ろに挿入した。次に、これら2つのベクターを293F細胞に同時形質転換し、タンパク質を発現させ、精製した。
軽鎖:Fab軽鎖をコードする配列(N末端大腸菌選別シグナルMet Alaを除く)をEcoRIおよびNheI末端を含むプライマーでPCR増幅した。増幅Fab軽鎖を、予めEcoRIおよびNheIで消化したpFUSE−hIgG2−Fc2中にサブクローニングした。Fab軽鎖は、直ちにIL−2シグナル配列に従い、完全にpFUSE−hIgG2−Fc2中のFc配列を置き換える。
重鎖:VHとCH1−CH2−CH3の間にNheI部位を含む完全長IgG1重鎖配列(配列番号2922)をGenscript社で合成し、EcoRIおよびXbaI末端含有プライマーでPCR増幅し、予めEcoRIとNheIで消化したpFUSE−hIgG2−Fc2にサブクローニングした。XbaIおよびNheI適合性付着末端の連結反応により、この位置での両部位を除去し、IgG1重鎖配列のVHとCH1−CH2−CH3の間のNheI部位を特有のものにする。Fab重鎖(N−末端大腸菌選別シグナルMet Alaを除く)をコードする配列をEcoRIおよびNheI末端を含むプライマーでPCR増幅した。次に、完全長さIgG1重鎖を含むベクターをEcoRIおよびNheIで消化させ、これにより、VH配列を除去し、増幅したFab重鎖を消化ベクターにサブクローニングした。従って、Fab重鎖は、IL−2およびIgGI重鎖の間にサブクローニングされた。
タンパク質発現および精製:IgGを産生するために、メーカーのインストラクションに従い、293fectin(Cat#12347、Invitrogen)を使って、重鎖および軽鎖プラスミドを293F細胞(Cat#R790−07、Invitrogen)に同時形質移入した。無血清293Freestyle培地(Cat#12338026、Invitrogen)中で増殖させた細胞を、50mlスピナーフラスコ中、1×106細胞/mlで、形質移入した。トランスフェクションの3日後および6日後、細胞培地を採取し、タンパク質−Gセファロース(GE Healthcare)を使ったカラムクロマトグラフィーによる精製用として、一緒にプールした。IgG溶出画分をプールし、PBS中に透析した。
実施例19
DLL4−Notch相互作用による抗体のレポーターアッセイによる活性
この実施例では、ルシフェラーゼレポーターアッセイを使って、2つのDLL4結合抗体のDLL4依存性Notch1シグナル伝達阻害能力を試験した。細胞表面上にNotch1の存在が既知のヒトグリオーマT98G細胞(Purow et al.(2005)Cancer Res.、65:2353−63、参照)に、6つのCプロモーター結合因子−1(CBF−1)応答配列(配列番号2939に設定;Nefedova et al.(2004)、Blood.103(9):3503−10、参照)を含むNotchレポータープラスミド(p6xCBF)に安定に形質移入することにより、レポーター細胞を生成した。続いて、DLL4−CHO細胞(上記実施例16参照)のレポーターT98G細胞への添加により、Notch1−DLL4相互作用によるホタルルシフェラーゼの発現を起こさせる。従って、DLL4結合抗体に起因するNotch1−DLL4の分断により、ルシフェラーゼ発現が減少する。
A.Notchレポータープラスミド
6つのCプロモーター結合因子−1(CBF−1)応答配列(配列番号2939に設定;CBFNotch応答配列を太字で示す;ggtacctgagctcgctagcgatctggtgtaaacacgccgtgggaaaaaatttatggatctggtgtaaacacgccgtgggaaaaaatttatggagctcgctagcgatctggtgtaaacacgccgtgggaaaaaatttatggatctggtgtaaacacgccgtgggaaaaaatttatgctcgaggatctggtgtaaacacgccgtgggaaaaaatttatggatctggtgtaaacacgccgtgggaaaaaatttatgaagctt;)を含むレポーター構築物をKpnIおよびHindIIIで消化させた。次に、消化産物をKpnIおよびHindIII部位で、ルシフェラーゼレポーターベクターpGL4.26(配列番号2940;Promega、Catalog#E8441)に挿入した。pGL4.26ベクターをヒグロマイシン選択し、これにより、安定に取り込まれたレポーターのコピーを有する細胞株の産生を促進する。また、pGL4.26の使用により、一時的なレポーターの形質移入および可変トランスフェクション効率の正規化の必要性がなくなる。
B.アッセイ
ATCC(No.CRL−1690(登録商標))由来のT98G細胞を、ウエル当たり、10%胎仔ウシ血清(BSA、Invitrogen)および1Xペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミン(P/S/G、Invitrogen)を補充したイーグルの最小必須培地(EMEM、Invitrogen)中の20、000細胞の量で96ウエル組織培養プレートに播種した。
次の日、ホタルルシフェラーゼ(p6xCBF)を発現しているNotchレポーター構築物をT98G細胞に形質移入し、安定組み込み体を200ug/mlヒグロマイシンB(Invitrogen)で選択した。DLL4または対照CHO細胞を発現しているCHO細胞を10%FBSとP/S/Gを補充したF12培地(Invitrogen)中で増殖した。10%FBSとP/S/G補充EMEM中のT98G Notchレポーター細胞(2×105細胞/ウエル)を、96ウエル組織培養プレートに別々に播種した。Notch発現T98G細胞をCHO−DLL4または対照CHO細胞(1×105細胞/ウエル)により刺激した。T98G細胞の培地を100μlのP/S/G補充無血清F12培地で置換した。Fab H:APFF VLTH&L:NDH LS(配列番号209および350)およびH:KT TRV&L:LP S52G(配列番号430および543)ならびにそれらに対応するIgG、ならびに対照Fab(DLL4に結合しない;VH6−1_IGHD6−13*01_IGHJ4*01およびV2−17_IGLJ2*01(それぞれ、配列番号2152と2941に設定))を100、20、4および0.8nM濃度で添加した。さらに、非親和性成熟生殖系列親Fabも試験し、Notchレポーター応答を測定した。このため、対応するIgGのVH5−51_IGHD5−18*01>3_IGHJ4*01&V3−4_IGLJ1*01(配列番号89と108に設定;H:KT TRV&L:LP S52Gの親生殖系列Fab)ならびにVH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01&L6_IGKJ1*01(配列番号88と107に設定;H:APFF VLTH&L:NDH LS親生殖系列Fab)を対照IgGとして、200、100および20nMの濃度で添加した。
24時間後、ルシフェラーゼレポーター発現をBright−Gloルシフェラーゼアッセイ試薬(Cat#E2620、Promega)を使って測定した。発光をWallac Victor II model 1420プレートリーダーを使って読み取った。各条件を4回行った。
結果を下表120に示す。表120の結果は、CHO−DLL4を有するT98Gレポーター細胞のインキュベーションにより、CHO細胞単独でインキュベートしたものに比べて、Notch1レポーターレベルが8〜9倍増加したことを示す。Notch1活性化は、DLL4に結合しない対照Fabの存在下でも、一定のままであった。抗DLL4抗体Fab H:APFF VLTH&L:NDH LSおよびH:KT TRV&L:LP S52Gの濃度増大条件下で、その活性化は減少した。減少はIgGバージョンのH:APFF VLTH&L:NDH LS(IC
50は約6nM)では、さらに顕著であり、対応するFabよりも10倍以上も効率的であった。IgGバージョンのH:KT TRV&L:LP S52Gはまた、対応するFabよりも効率的であり、0.8nMでNotch1活性化の約30%の減少を示した。さらに高濃度(>100nM)でも、どのFabまたはIgG型のH:KT TRV&L:LP S52Gも、Notch1活性化の完全な阻害を示さなかった。結果は、IgGH:APFF VLTH&L:NDH LSは、DLL4−Notch活性化の完全な阻害剤であり、一方、IgGH:KT TRV&L:LP S52Gは、DLL4−Notch活性化の部分アンタゴニストであることを示している。
変更は、当業者には明らかであるので、本発明は、添付の請求項の範囲によってのみ限定されることが意図されている。