TWI640537B - ＰＤＧＦ受體β結合多肽 - Google Patents
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Abstract
本發明提供以高親和力特異性結合於目標抗原(例如人類抗原，例如人類PDGFRβ)之結合多肽(例如抗體或其片段)。本發明亦提供結合多肽之文庫、醫藥組合物，以及編碼結合多肽之核酸、重組表現載體及用於製造此等結合多肽之宿主細胞。本發明亦涵蓋使用本發明之結合多肽以診斷及治療疾病的方法。
Description
本發明係關於PDGF受體β結合多肽。
血小板源性生長因子(PDGF)為間葉活動來源之細胞中之強力致裂物質及化學引誘劑且涉及許多疾病之病理學。PDGF係以二硫化物連接之二聚物形式存在，該二聚物係由兩條可組合形成三種獨特PDGF同功異型物AA、BB或AB之同源鏈A或B組成。PDGF之所有同功異型物均藉由結合於細胞表面PDGF受體(PDGFR)來介導其細胞分裂促進作用。
PDGF受體屬於酪胺酸激酶家族且由兩種受體同功異型物α及β組成。α及β同功異型物可藉由其獨特配位體結合特異性加以區分。PDGFβ受體可僅結合於B鏈(同功異型物BB及AB)，而PDGFα受體可結合於PDGF之所有同功異型物。
PDGF與細胞表面PDGFR之結合引起受體二聚化及反式自體磷酸化，進而又引起細胞內信號傳導事件，該等事件尤其會引起細胞增殖及細胞遷移。因此，阻斷PDGF結合及/或受體二聚化之PDGFR拮抗劑可用以治療或預防與PDGFR活化相關之疾病。
因此，在此項技術中需要可用以治療與PDGFR活化相關之疾病的新穎PDGFR拮抗劑。
本發明提供以高親和力特異性結合於目標抗原(例如人類抗原，例如人類PDGF)之結合多肽(例如抗體或其片段)。在一較佳實施例中，本發明提供以高親和力結合於PDGFRβ(例如人類PDGFRβ)且對抗PDGFRβ活化之結合多肽。此等結合多肽尤其適用於治療PDGFRβ相關疾病或病症(例如年齡相關之黃斑部變性(AMD))。本發明亦提供結合多肽之文庫、醫藥組合物，以及編碼結合多肽之核酸、重組表現載體及用於製造此等結合多肽之宿主細胞。本發明亦涵蓋使用本發明之結合多肽來偵測PDGFRβ及調節PDGFRβ活性之方法。
因此，在一態樣中，本發明提供一種經分離結合多肽，其包含VH域，其中作為分離域，VH域以小於100pM之Kd結合於抗原。
在另一態樣中，本發明提供一種特異性結合於PDGFRβ之經分離結合多肽，其包含SEQ ID NO：1中所述之CDR3序列。
在某些實施例中，結合多肽包含VH域，該VH域包含SEQ ID NO：1中所述之HCDR3胺基酸序列。VH域可進一步包括包含選自由SEQ ID NO：2-32組成之群的胺基酸序列之HCDR2及/或包含選自由SEQ ID NO：33-62組成之群的胺基酸序列之HCDR1。
在某些實施例中，多肽包含VH域，該VH域包含與選自由SEQ ID NO：318-368組成之群的VH域胺基酸序列享有至少80%(例如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)胺基酸一致性之胺基酸序列。
在某些實施例中，多肽包含VH域，該VH域包含選自由SEQ ID NO：318-368組成之群的胺基酸序列
在某些實施例中，結合多肽包含VL域。VH域可進一步包括包含選自由SEQ ID NO：63-147組成之群的胺基酸序列之LCDR3、包含選自由SEQ ID NO：148-232組成之群的胺基酸序列之LCDR2及/或包含選自由SEQ ID NO：233-317組成之群的胺基酸序列之LCDR1。
在某些實施例中，多肽包含VL域，該VL域包含與選自由SEQ ID NO：369-453組成之群的VL域胺基酸序列享有至少80%(例如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)胺基酸一致性之胺基酸序列。
在某些實施例中，多肽包含VL域，該VL域包含選自由SEQ ID NO：369-453組成之群的胺基酸序列。
在其他態樣中，本發明提供一種結合多肽，其如包含SEQ ID No：318中所述之VH域胺基酸序列之結合多肽結合於PDGFRβ上之相同抗原決定基。在一較佳實施例中，結合多肽包含與選自由SEQ ID NO：318-368組成之群的VH域胺基酸序列享有至少80%胺基酸一致性(例如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)之VH域胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種結合多肽，其與包含SEQ ID No：318中所述之VH域胺基酸序列之結合多肽競爭結合於PDGFRβ。在一較佳實施例中，結合多肽包含與選自由SEQ ID NO：318-368組成之群的VH域胺基酸序列享有至少80%胺基酸一致性之VH域胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之結合多肽抑制PDGFRβ活性。在一實施例中，PDGFRβ活性係藉由對抗PDGF與PDGFRβ之結合來抑制。在另一實施例中，PDGFRβ活性係藉由對抗PDGFRβ二聚化來抑制。
在某些實施例中，本發明之結合多肽以小於100pM之Kd及/或以小於10-3 s-1之脫附速率結合於PDGFRβ。
在某些實施例中，本發明之結合多肽特異性結合於小鼠及人類PDGFRβ。
在某些實施例中，本發明之結合多肽以小於5nM之IC50對抗PDGF與PDGFRβ之結合、以小於4nM之IC50抑制PDGFRβ之配位體誘導性酪胺酸磷酸化、以小於6nM之IC50抑制視網膜外被細胞遷移，及/或具有至少68℃之熔融溫度(Tm)。
在另一態樣中，本發明提供一種編碼本發明之結合多肽的經分離核酸。
在另一態樣中，本發明提供一種包含編碼本發明之結合多肽之經分離核酸的重組表現載體。
在另一態樣中，本發明提供一種表現本發明之結合多肽的宿主細胞。
在另一態樣中，本發明提供一種製造特異性結合於人類PDGFRβ之結合多肽的方法，其包括將能夠表現本發明之結合多肽的宿主細胞於使得該宿主細胞產生結合多肽之條件下進行培養。
在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本發明之結合多肽及一或多種醫藥學上可接受之載劑。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療疾病或病症PDGFRβ相關疾病或病症(例如年齡相關之黃斑部變性(AMD)或癌症)之方法，該方法包括向有需要之受試者投與本發明之醫藥組合物。
在另一態樣中，本發明提供不成對VH域之多樣文庫，其中文庫各成員結合於人類PDGFRβ。在一較佳實施例中，文庫各成員包含SEQ ID NO：
1中所述之CDR3胺基酸序列及在於FR1-FR3區域之多樣性。在一較佳實施例中，文庫為核酸呈現文庫(例如DNA呈現文庫)。
在另一態樣中，本發明提供穩定VH/VL對之多樣文庫，其中文庫各成員結合於人類PDGFRβ。在一較佳實施例中，文庫各成員包含VH域，該VH域包含SEQ ID NO：1中所述之CDR3胺基酸序列。在一較佳實施例中，VL域為人類VL域。在一較佳實施例中，文庫為核酸呈現文庫(例如DNA呈現文庫)。
第1圖為用於所揭示方法之示範性VH域核酸呈現文庫之構築的示意圖。
第2圖描繪量測XB1511 VH域、未經選擇之XB1511 CDR3/構架改組DNA呈現文庫(R0)及XB1511 CDR3/構架改組DNA呈現文庫池在四輪選擇後(R4)與人類或小鼠PDGFRβ之結合的活體外結合分析結果。
第3圖描繪量測XB1511及構架改組衍生物XB2202及XB2708與人類PDGFRβ之結合動力學的表面電漿子共振結合研究之結果。
第4圖描繪量測XB2202與人類(A)及小鼠(B)PDGFRβ之結合動力學的表面電漿子共振結合分析之結果。
第5圖描繪量測XB2708與人類(A)及小鼠(B)PDGFRβ之結合動力學的表面電漿子共振結合分析之結果。
第6圖為用於所揭示方法之示範性VL域核酸呈現文庫之構築的示意圖。
第7圖描繪量測包含自VH/VL成對DNA呈現篩選之第二輪篩選池分離之VL域的XB1511/VL scFv與人類PDGFRβ之結合的ELISA分析之結
果。
第8圖描繪量測包含自VH/VL成對DNA呈現篩選之第三輪篩選池分離之VL域的XB1511/VL scFv與人類PDGFRβ之結合的ELISA分析之結果。
第9圖描繪量測包含自VH/VL成對DNA呈現篩選之第二輪篩選池分離之VL域的XB2202/VL scFv與人類PDGFRβ之結合的ELISA分析之結果。
第10圖描繪量測來自第9圖中所述之XB1511/VL scFv之不成對VL域與人類PDGFRβ之結合的ELISA分析之結果。
第11圖描繪量測35S Met標記之XB1511 VH域及獲自VH/VL成對DNA呈現篩選之含XB1511之scFV與人類PDGFRβ之結合的溶液結合親和力研究之結果。
第12圖描繪量測35S Met標記之XB2202 VH域及獲自VH/VL成對DNA呈現篩選之含XB2202之scFV與人類PDGFRβ之結合的溶液結合親和力研究之結果。
第13圖描繪量測在各種濃度之XB2202下PDGF-BB與PDGFRβ結合之動力學的表面電漿子共振競爭結合分析之結果。
第14圖描繪量測XB2708對外被細胞遷移之抑制的活體外細胞遷移分析之結果。
第15圖描繪量測含XB1511之IgG1抑制人類包皮纖維母細胞遷移之能力的無標記遷移分析之結果。
第16圖描繪量測XB2202 VH域及XB2202/A4 scFv在各種溫度下培育後與人類PDGFRβ之結合的ELISA分析之結果。
本申請案主張2011年12月5日申請之美國臨時申請案61/566,778及2012年3月14日申請之美國臨時申請案61/610,905的優先權，該等臨時申請案均以全文引用的方式併入本文中。
本發明提供以高親和力特異性結合於目標抗原(例如人類抗原)之結合多肽(例如抗體或其片段)。在一較佳實施例中，本發明之結合多肽以高親和力結合於PDGFRβ(例如人類PDGFRβ)且抑制PDGFRβ活性。此等結合多肽尤其適用於治療PDGFRβ相關疾病或病症(例如年齡相關之黃斑部變性(AMD))。本發明亦提供結合多肽之文庫、醫藥組合物，以及編碼結合多肽之核酸、重組表現載體及用於製造此等結合多肽之宿主細胞。本發明亦涵蓋使用本發明之結合多肽來偵測PDGFRβ及調節PDGFRβ活性之方法。
為使本發明可較容易地理解，首先定義某些術語。
如本文所用，術語「PDGFRβ」係指血小板源性生長因子受體β。此項技術中熟知PDGFRβ核苷酸及多肽序列。示範性人類PDGFRβ胺基序列闡述於GenBank保藏GI：4505683中且示範性小鼠PDGFRβ胺基序列闡述於GenBank保藏GI：226371752中。
如本文所用，術語「PDGF」係指血小板源性生長因子。此項技術中熟知PDGF核苷酸及多肽序列。示範性人類PDGF胺基序列闡述於GenBank保藏GI：4505681中且示範性小鼠PDGF胺基序列闡述於GenBank保藏GI：400744中。
如本文所用，術語「結合多肽」係指含有抗體之抗原結合位點之全部
或一部分(例如重鏈及/或輕鏈可變域之全部或一部分，例如重鏈可變域之至少HCDR3)以使結合多肽特異性識別目標抗原的多肽。結合多肽之非限制性實例包括抗體或其片段，及已變為包含抗體之抗原結合位點之全部或一部分的免疫球蛋白樣域(例如纖維結合蛋白域)。
如本文所用，術語「抗體」係指包含四條多肽鏈，即兩條重鏈(H)鏈及兩條輕(L)鏈藉由雙硫鍵互連之免疫球蛋白分子，以及其多聚物(例如IgM)。各重鏈包含重鏈可變區(縮寫為VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個域，即CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(縮寫為VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個域(CL1)。VH區及VL區可進一步再分成稱為互補決定區(CDR)之高變區，穿插有稱為構架區(FR)之較保守區。
如本文所用，術語抗體之「抗原結合部分」包括特異性結合抗原以形成複合物之任何天然存在的以酶促方式可獲得之合成或基因工程改造之多肽或醣蛋白。抗體之抗原結合片段可使用任何適合之標準技術例如源於完整抗體分子，該等標準技術諸如為蛋白分解或重組遺傳工程改造技術，其涉及操作及表現DNA編碼抗體可變域及視情況選用之恆定域。抗原結合部分之非限制性實例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；及(vii)由模擬抗體高變區(例如經分離互補決定區(CDR))之胺基酸殘基組成之最小識別單元。表述「抗原結合部分」亦涵蓋其他工程改造分子，諸如雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體及微型抗體。
如本文所用，術語「VH域」及「VL域」分別係指單一抗體可變重鏈域及輕鏈域，其包含FR(構架區)1、2、3及4及CDR(互補決定區)1、2及3(參見Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological
Interest.(NIH出版物第91-3242期，Bethesda)。
如本文所用，術語「FR1-FR3」係涵蓋FR1、CDR2、FR2、CDR2及FR3但排除CDR3及FR4區之VH區。
如本文所用，術語「不成對」係指VH或VL分別未連接(共價或非共價)於互補VL或VH域。
如本文所用，術語「互補VL或VH域」係指分別與VH或VL域締合以形成VH/VL對之VL或VH域。
如本文所用，術語「VH/VL對」係指單一VH與單一VL域之非共價二聚體，其中VL與VH域係以類似於在完整四聚免疫球蛋白分子中所觀察到之方式締合，且該二聚體可特異性結合於至少一種目標抗原。「穩定VH/VL對」為不顯示取代基VH與VL域在生理條件下顯著解離之VH/VL對。
如本文所用，術語「CDR」或「互補決定區」意謂見於重鏈與輕鏈多肽之可變區內之非相連抗原結合位點。Kabat等人，J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977)及Kabat等人，Sequences of protein of immunological interest.(1991)，及Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)及MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996)已描述了此等特定區域，其中該等定義包括當彼此相比較時胺基酸殘基之重疊或子集。闡述涵蓋如上文引用之參考文獻各自所定義之CDR的胺基酸殘基以便比較。較佳地，術語「CDR」為如Kabat依據序列比較所定義之CDR。
如本文所用，術語「構架(FR)胺基酸殘基」係指免疫球蛋白鏈之構架區中之彼等胺基酸。如本文所用，術語「構架區」或「FR區」包括作為可變區之部分而非CDR(例如使用CDR之Kabat定義)之部分的胺基酸殘基。
如本文所用，術語「特異性結合於」係指結合多肽以至少約1×10-6M、
1×10-7M、1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M、1×10-12M或1×10-12M以上之Kd結合於抗原，及/或以比其對非特異性抗原之親和力大至少兩倍的親和力結合於抗原之能力。然而應瞭解，結合多肽能夠特異性結合於兩種或兩種以上在序列中相關之抗原。舉例而言，本發明之結合多肽可特異性結合於人類與非人類(例如小鼠或非人類靈長類動物)PDGFRβ。
如本文所用，術語「抗原」係指由結合多肽所識別之結合位點或抗原決定基。
如本文所用，術語「核酸呈現文庫」係指任何技術上公認之活體外細胞-游離表型-基因型連接呈現，其包括(不限於)例如以下中所述者：美國專利第7,195,880號；第6,951,725號；第7,078,197號；第7,022,479號；第6,518,018號；第7,125,669號；第6,846,655號；第6,281,344號；第6,207,446號；第6,214,553號；第6,258,558號；第6,261,804號；第6,429,300號；第6,489,116號；第6,436,665號；第6,537,749號；第6,602,685號；第6,623,926號；第6,416,950號；第6,660,473號；第6,312,927號；第5,922,545號；及第6,348,315號，及WO2010/011944，該等專利均以全文引用的方式併入本文中。
如本文所用，術語「載體」意欲指能夠輸送其已連接之另一核酸的核酸分子。一種類型之載體為「質體」，其係指內部可接合其他DNA區段之圓形雙股DNA環。另一類型之載體為病毒載體，其中其他DNA區段可接合至病毒基因組。某些載體能夠在引有其之宿主細胞(例如具有細菌複製起點之細菌載體，及遊離型哺乳動物載體)中自體複製。其他載體(例如非遊離型哺乳動物載體)在引入宿主細胞中時可整合至宿主細胞之基因組中，藉此連同宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠引導其可操作地連接之基
因之表現。此等載體在本文中稱作「重組表現載體」(或簡稱「表現載體」)。一般而言，表現載體在重組DNA技術中之效用經常呈質體形式。術語「質體」與「載體」可互換使用。然而，本發明意欲包括表現載體之此等其他形式，諸如病毒載體(例如複製缺陷反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)，其提供等效功能。
如本文所用，術語「宿主細胞」意欲指已引有重組表現載體之細胞。應瞭解，此術語意欲不僅指特定受試者細胞，而且指此細胞之子代。因為後代中可能因突變或環境影響而出現某些修改，所以此子代實務上可能不與親本細胞相同，但仍包括於如本文所用之術語「宿主細胞」之範疇內。
如本文所用，術語「治療」係指本文所述之治療或預防措施。「治療」方法採用向受試者，例如患有PDGFRβ相關疾病或病症(例如AMD)或易患此疾病或病症之受試者投與本發明之抗體或抗原結合部分，以預防、治癒、延遲疾病或病症或復發性疾病或病症、降低其嚴重性，或改善其一或多種症狀，或以延長受試者存活期以超出無此治療時之預期存活期。
如本文所用，術語「PDGFRβ相關疾病或病症」包括與PDGFRβ活性相關之疾病病況及/或症狀。示範性PDGFRβ相關疾病或病症包括(但不限於)年齡相關之黃斑部變性(AMD)及癌症。
如本文所用，術語「有效量」係指當向受試者投與時足以實現如本文所述之PDGFRβ相關疾病或病症之治療、預後或診斷的結合多肽之量。治療有效量將視所治療之受試者及疾病病狀、受試者體重及年齡、疾病病狀之嚴重性、投藥方式及其類似因素而變化，其可由一般技藝人士輕易確定。投與劑量可介於例如約1ng至約10,000mg、約1μg至約5,000mg、約1mg至約1,000mg、約10mg至約100mg本發明之結合多肽的範圍內。可調整
給藥方案以提供最佳治療反應。有效量亦為結合多肽之任何毒性作用或有害作用(亦即副作用)均已減到最小及/或有利效果顯得更重要之量。
如本文所用，術語「受試者」包括任何人類或非人類動物。
如本文所用，術語「表面電漿子共振」係指一種光學現象，其允許藉由例如使用BIAcoreTM系統(Biacore Life Sciences division of GE Healthcare,Piscataway,NJ)來偵測生物感測器基質內之蛋白質濃度變化來分析即時相互作用。
如本文所用，術語「KD」係指特定結合多肽/抗原相互作用之平衡解離常數。
如本文所用，術語「脫附速率」係指特定結合多肽/抗原相互作用之解離速率(Koff)。
如本文所用，術語「抗原決定基」係指在本發明之結合分子中與特異性抗原結合位點相互作用之抗原決定子。單一抗原可具有一個以上抗原決定基。因此，不同抗體可結合於抗原上之不同區域且可具有不同生物作用。抗原決定基可為構形抗原決定基或線性抗原決定基。構形抗原決定基係藉由來自線性多肽鏈之不同區段的空間併接胺基酸產生。線性抗原決定基為藉由多肽鏈中相鄰胺基酸殘基產生之抗原決定基。
在一態樣中，本發明提供包含VH域之結合多肽，其中作為經分離域，VH域以小於約200pM(例如約200、190、180、175、170、160、150、140、130、120、110、100、95、90、80、75、70、65、60、55、50、40、30、20、10、5或1pM或1pM以下)之Kd結合於抗原。
在另一態樣中，本發明提供特異性結合於PDGFRβ且抑制PDGFRβ活
性之結合多肽(例如抗體或其抗原結合片段)。此等結合多肽尤其適用於治療PDGFRβ相關疾病或病症(例如年齡相關之黃斑部變性或AMD)。
一般而言，本發明之PDGFRβ結合多肽包含特異性結合於PDGFRβ之重鏈CDR3(HCDR3)胺基酸序列。一種適用於本發明之結合多肽的非限制性HCDR3序列為SEQ ID NO：1(HGGDRSY)中所述之重鏈CDR3胺基酸序列。在其他實施例中，重鏈CDR3序列為SEQ ID NO：1之變異體，其相對於SEQ ID NO：1包含至少一個(例如一、二或三個)保守胺基酸取代。
可併有特異性結合於PDGFRβ之重鏈CDR3胺基酸序列(例如SEQ ID NO：1(HGGDRSY)中所述之CDR3胺基酸序列)的任何結合多肽均可用於本發明之結合多肽中，包括(不限於)抗體或其片段，及免疫球蛋白樣域。適合之免疫球蛋白樣域包括(不限於)纖維結合蛋白域(參見例如Koide等人，(2007),Methods Mol.Biol.352：95-109，其以全文引用的方式併入本文中)、DARPin(參見例如Stumpp等人，(2008)Drug Discov.Today 13(15-16)：695-701，其以全文引用的方式併入本文中)、蛋白質A之Z域(參見Nygren等人，(2008)FEBS J.275(11)：2668-76，其以全文引用的方式併入本文中)、脂質運載蛋白(Lipocalin)(參見例如Skerra等人，(2008)FEBS J.275(11)：2677-83，其以全文引用的方式併入本文中)、Affilin(參見例如Ebersbach等人，(2007)J.Mol.Biol.372(1)：172-85，其以全文引用的方式併入本文中)、Affitin(參見例如Krehenbrink等人，(2008).J.Mol.Biol.383(5)：1058-68，其以全文引用的方式併入本文中)、Avimer(參見例如Silverman等人，(2005)Nat.Biotechnol.23(12)：1556-61，其以全文引用的方式併入本文中)、Fynomer(參見例如Grabulovski等人，(2007)J Biol Chem 282(5)：3196-3204，其以全文引用的方式併入本文中)及Kunitz域
肽(參見例如Nixon等人，(2006)Curr Opin Drug Discov Devel 9(2)：261-8，其以全文引用的方式併入本文中).
在一較佳實施例中，PDGFRβ結合多肽為抗體或其抗原結合片段，其包含VH域及/或VL域。表1-4中闡述適用於本發明之示範性CDR、VH及VL胺基酸序列。因此，在某些實施例中，結合多肽可包含HCDR3(SEQ ID NO：1)以及HCDR2及/或HCDR1序列，其各自獨立地選自表1中所述之重鏈HCDR2或HCDR1序列中任一者。在某些實施例中，本發明之結合多肽可進一步包含輕鏈CDR，其各自獨立地選自表2中所述之輕鏈CDR1、CDR2或CDR3序列中任一者。舉例而言，本發明之結合多肽可包含表3中所述之重鏈可變(VH)域中任一者，視情況與表4中所述之輕鏈可變(VL)域中任一者成對。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：1之重鏈CDR3序列以及一或多種選自由SEQ ID NO：2-317組成之群的CDR區胺基酸序列。在示範性實施例中，抗體或其抗原結合片段包含分別選自由以下組成之群的HCDR3、HCDR2及HCDR1胺基酸序列：SEQ ID NO：1、2及3；1、2及34；1、3及35；1、4及35；1、5及36；1、6及36；1、3及36；1、7及36；1、8及36；1、9及36；1、10及38；1、2及38；1、11及39；1、12及40；1、13及41；1、13及42；1、13及33；1、14及43；1、14及44；1、15及45；1、16及45；1、17及46；1、18及47；1、19及47；1、20及48；1、2及49；1、21及50；1、2及51；1、2及52；1、2及53；1、22及54；1、23及55；1、24及56；1、25及46；1、26及57；1、27及58；1、28及59；1、29及60；1、30及61；1、31及62；及1、32及62。
在其他實施例中，抗體或其抗原結合片段進一步包含分別選自由以下組成之群的LCDR3、LCDR2及LCDR1胺基酸序列：SEQ ID NO：63、148及233；64、149及234；65、150及235；66、151及236；67、152及237；68、153及238；69、154及239；70、155及240；71、156及241；72、157及242；73、158及243；741、159及244；75、160及245；76、161及246；77、162及247；78、163及248；79、164及249；80、165及250；81、166及251；82、167及252；83、168及253；84、169及254；85、170及255；86、171及256；87、172及257；88、173及258；89、174及259；90、175
及260；91、176及261；92、177及262；93、178及263；94、179及264；95、180及265；96、181及266；97、182及267；98、183及268；99、184及269；100、185及270；101、186及271；102、187及272；103、188及273；104、189及274；105、190及275；106、191及276；107、192及277；108、193及278；109、194及279；110、195及280；111、196及281；112、197及282；113、198及283；114、199及284；115、200及285；116、201及286；117、202及287；118、203及288；119、204及289；120、205及290；121、206及291；122、207及292；123、208及293；124、209及294；125、210及295；126、211及296；127、212及297；128、213及298；129、214及299；130、215及300；131、216及301；132、217及302；133、218及303；134、219及304；135、220及305；136、221及306；137、222及307；138、223及308；139、224及309；140、225及310；141、226及311；142、227及312；143、228及313；144、229及314；145、220及315；146、231及316；及147、232及317。
在其他實施例中，抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：1中所述之HCDR3胺基酸序列，及分別選自由以下組成之群的LCDR3、LCDR2及LCDR1胺基酸序列：SEQ ID NO：63、148及233；64、149及234；65、150及235；66、151及236；67、152及237；68、153及238；69、154及239；70、155及240；71、156及241；72、157及242；73、158及243；741、159及244；75、160及245；76、161及246；77、162及247；78、163及248；79、164及249；80、165及250；81、166及251；82、167及252；83、168及253；84、169及254；85、170及255；86、171及256；87、172及257；88、173及258；89、174及259；90、175及260；91、176
及261；92、177及262；93、178及263；94、179及264；95、180及265；96、181及266；97、182及267；98、183及268；99、184及269；100、185及270；101、186及271；102、187及272；103、188及273；104、189及274；105、190及275；106、191及276；107、192及277；108、193及278；109、194及279；110、195及280；111、196及281；112、197及282；113、198及283；114、199及284；115、200及285；116、201及286；117、202及287；118、203及288；119、204及289；120、205及290；121、206及291；122、207及292；123、208及293；124、209及294；125、210及295；126、211及296；127、212及297；128、213及298；129、214及299；130、215及300；131、216及301；132、217及302；133、218及303；134、219及304；135、220及305；136、221及306；137、222及307；138、223及308；139、224及309；140、225及310；141、226及311；142、227及312；143、228及313；144、229及314；145、220及315；146、231及316；及147、232及317。
在其他實施例中，抗體或其抗原結合片段包含分別選自由以下組成之群的HCDR3、HCDR2及HCDR1胺基酸序列：SEQ ID NO：1、2及3；1、2及34；1、3及35；1、4及35；1、5及36；1、6及36；1、3及36；1、7及36；1、8及36；1、9及36；1、10及38；1、2及38；1、11及39；1、12及40；1、13及41；1、13及42；1、13及33；1、14及43；1、14及44；1、15及45；1、16及45；1、17及46；1、18及47；1、19及47；1、20及48；1、2及49；1、21及50；1、2及51；1、2及52；1、2及53；1、22及54；1、23及55；1、24及56；1、25及46；1、26及57；1、27及58；1、28及59；1、29及60；1、30及61；1、31及62；及1、32及62，及分別選自由以下
組成之群的LCDR3、LCDR2及LCDR1胺基酸序列：SEQ ID NO：63、148及233；64、149及234；65、150及235；66、151及236；67、152及237；68、153及238；69、154及239；70、155及240；71、156及241；72、157及242；73、158及243；741、159及244；75、160及245；76、161及246；77、162及247；78、163及248；79、164及249；80、165及250；81、166及251；82、167及252；83、168及253；84、169及254；85、170及255；86、171及256；87、172及257；88、173及258；89、174及259；90、175及260；91、176及261；92、177及262；93、178及263；94、179及264；95、180及265；96、181及266；97、182及267；98、183及268；99、184及269；100、185及270；101、186及271；102、187及272；103、188及273；104、189及274；105、190及275；106、191及276；107、192及277；108、193及278；109、194及279；110、195及280；111、196及281；112、197及282；113、198及283；114、199及284；115、200及285；116、201及286；117、202及287；118、203及288；119、204及289；120、205及290；121、206及291；122、207及292；123、208及293；124、209及294；125、210及295；126、211及296；127、212及297；128、213及298；129、214及299；130、215及300；131、216及301；132、217及302；133、218及303；134、219及304；135、220及305；136、221及306；137、222及307；138、223及308；139、224及309；140、225及310；141、226及311；142、227及312；143、228及313；144、229及314；145、220及315；146、231及316；及147、232及317。
在其他實施例中，抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：318-368中所述之VH胺基酸序列中至少一者。
在其他實施例中，抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：369-453中所述之VL胺基酸序列中至少一者。
在其他實施例中，抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：318、321或360中所述之VH區胺基酸序列，與選自由SEQ ID NO：369-453組成之群的VL區胺基酸序列成對。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含一或多種選自由SEQ ID NO：1-317組成之群的CDR胺基酸序列，其中該一或多種CDR區胺基酸序列包含至少一個或一個以上保守胺基酸取代(例如1、2、3、4或5個保守胺基酸取代)。保守胺基酸取代包括一類胺基酸經同一類胺基酸取代，其中一類係由以下定義：共同物理化學胺基酸側鏈性質及自然界中所見之同源蛋白質中之高取代頻率，例如藉由標準Dayhoff頻率交換矩陣或BLOSUM矩陣測定。已分類出六大類胺基酸側鏈且其包括：I類(Cys)；II類(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly)；III類(Asn、Asp、Gln、Glu)；IV類(His、Arg、Lys)；V類(Ile、Leu、Val、Met)；及VI類(Phe、Tyr、Trp)。舉例而言，以Asp取代另一III類殘基(諸如Asn、Gln或Glu)為保守取代。因此，抗PDGFRβ抗體中之預測非必需胺基酸殘基較佳經同一類之另一胺基酸殘基置換。此項技術中熟知識別不消除抗原結合之胺基酸保守取代之方法(參見例如Brummell等人，Biochem.32：1180-1187(1993)；Kobayashi等人，Protein Eng.12(10)：879-884(1999)；及Burks等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：412-417(1997))。
在另一實施例中，本發明提供抗PDGFRβ抗體或其抗原結合片段，其包含與SEQ ID NO：318-368中所述之VH區胺基酸序列及/或SEQ ID NO：369-453中所述之VL區胺基酸序列分別具有約80%、85%、86%、87%、
88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH及/或VL區胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供與包含SEQ ID NO：318中所述之VH域胺基酸序列的抗體或其抗原結合片段結合於相同抗原決定基及/或交叉競爭之抗PDGFRβ抗體。此等抗體可使用常規競爭結合分析(包括例如基於表面電漿子共振(SPR)之競爭分析)來識別。
在另一態樣中，本發明提供不成對VH域之多樣文庫，其中文庫各成員特異性結合於人類PDGFRβ且其中多樣性處於FR1-FR3區中。在一較佳實施例中，文庫各成員包含特異性結合於人類PDGFRβ之一致重鏈CDR3(例如SEQ ID NO：1中所述之胺基酸序列)胺基酸序列，且其中多樣性處於FR1-FR3區中。
在另一態樣中，本發明提供穩定VH/VL對之多樣文庫，其中文庫各成員結合於人類PDGFRβ。文庫各成員較佳包含VH域，該VH域包含SEQ ID NO：1中所述之CDR3胺基酸序列。可使用此項技術中已知之任何方法來選擇穩定VH/VL對，該等方法包括(不限於)以全文引用的方式併入本文中之美國臨時專利申請案61/453,106中所述者。
任何類型之VH或VL域表現文庫均可用於本發明之方法中。適合之表現文庫包括(不限於)核酸呈現、噬菌體呈現及細胞表面呈現文庫(例如酵母、哺乳動物及細菌細胞)。在一較佳實施例中，文庫為根據以全文引用的方式併入本文中之WO2010/011944中所述之方法產生的核酸呈現文庫。此項技術中熟知篩選表現文庫之方法。參見例如Antibody Engineering：Methods and Protocols.Methods in Molecular Biology第248卷，(B.K.C.Lo,Ed)Humana Press,2004(ISBN：1-58829-092-1)，其以全文引用的方
式併入本文中。
在某些實施例中，本發明之結合多肽可包含一或多種修飾。修飾形式之本發明之結合多肽可使用此項技術中已知之任何技術製造。
i)降低免疫原性
在某些實施例中，使用技術上公認之技術修飾本發明之結合多肽(例如抗體或其抗原結合片段)以降低其免疫原性。舉例而言，抗體或其片段可經嵌合化、人類化及/或去除免疫化。
在一實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可為嵌合的。嵌合抗體為抗體之不同部分源自不同動物物種之抗體，諸如具有源自鼠類單株抗體之可變區及人類免疫球蛋白恆定區的抗體。此項技術中已知製造嵌合抗體或其片段之方法。參見例如Morrison,Science 229：1202(1985)；Oi等人，BioTechniques 4：214(1986)；Gillies等人，J.Immunol.Methods 125：191-202(1989)；美國專利第5,807,715號；第4,816,567號；及第4,816,397號，其以全文引用的方式併入本文中。為製造「嵌合抗體」所開發之技術(Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.81：851-855(1984)；Neuberger等人，Nature 312：604-608(1984)；Takeda等人，Nature 314：452-454(1985))可用於合成該等分子。舉例而言，編碼小鼠抗PDGFRβ抗體分子之結合特異性的基因序列可與具有適當生物活性之人類抗體分子之序列融合在一起。如本文所用，嵌合抗體為不同部分源自不同動物物種之分子，諸如具有源自鼠類單株抗體之可變區及人類免疫球蛋白恆定區的分子，例如人類化抗體。
在另一實施例中，本發明之抗體或其抗原結合部分經人類化。人類化
抗體具有包含來自非人類抗體之一或多個互補決定區(CDR)及來自人類抗體分子之構架區的結合特異性。人類構架區中之構架殘基經常經CDR供體抗體之相應殘基取代以改變、較佳地改良抗原結合。此等構架取代係藉由此項技術熟知之方法識別，例如藉由模型化CDR與構架殘基之相互作用來識別對於抗原結合重要之構架殘基，及進行序列比較以識別在特定位置之不常見構架殘基。(參見例如Queen等人，美國專利第5,585,089號；Riechmann等人，Nature 332：323(1988)，其係以全文引用的方式併入本文中。)抗體可使用此項技術中已知之多種技術人類化，該等技術包括例如CDR移植(EP 239,400；PCT公開案WO 91/09967；美國專利第5,225,539號；第5,530,101號；及第5,585,089號)、面飾(veneering)或表面重整(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan,Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等人，Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska.等人，PNAS 91：969-973(1994))及鏈改組(美國專利第5,565,332號)。
在一些實施例中，去除免疫化可用以降低PDGFRβ結合多肽(例如抗體或其抗原結合部分)之免疫原性。如本文所用，術語「去除免疫化」包括改變多肽(例如抗體或其抗原結合部分)以修飾T細胞抗原決定基(參見例如WO9852976A1、WO0034317A2)。舉例而言，可分析起始的本發明之PDGFRβ特異性抗體或其抗原結合部分之VH及VL序列，且可自各V區產生展示與序列內互補決定區(CDR)及其他關鍵殘基有關之抗原決定基位置的人類T細胞抗原決定基「圖」。分析來自T細胞抗原決定基圖之個別T細胞抗原決定基以識別改變最終抗體之活性的風險較低的替代性胺基酸取代。設計一系列包含胺基酸取代組合之替代性VH及VL序列，且隨後將此等序
列併入一系列用於本文揭示之診斷及治療方法中之PDGFRβ特異性抗體或其片段中，接著測試其功能。通常產生及測試在12個與24個之間的變異型抗體。接著將包含經修飾V區及人類C區之完整重鏈及輕鏈基因選殖於表現載體中且將後續質體引入細胞株中以便製造全抗體。接著在適當生物化學分析及生物分析中比較抗體，且識別最佳變異體。
ii)效應功能及Fc修飾
本發明之結合多肽可包含介導一或多種效應功能之抗體恆定區(例如IgG恆定區，例如人類IgG恆定區，例如人類IgG1或IgG4恆定區)。舉例而言，補體之C1組件結合於抗體恆定區可活化補體系統。在細胞病原體之調理及溶解中，補體活化為重要的。補體活化亦刺激發炎性反應且亦可涉及自體免疫過敏性。此外，抗體經由Fc區結合於各種細胞上之受體，其中抗體Fc區上之Fc受體結合位點結合於細胞上之Fc受體(FcR)。存在許多對不同類抗體具有特異性之Fc受體，包括IgG(γ受體)、IgE(ε受體)、IgA(α受體)及IgM(μ受體)。抗體結合於細胞表面上之Fc受體引發許多重要且多樣之生物反應，包括由殺手細胞(稱為抗體依賴性細胞介導性細胞毒性或ADCC)吞噬及破壞抗體塗佈粒子、清除免疫複合物、溶解抗體塗佈目標細胞，釋放發炎性介體、胎盤轉移及控制免疫球蛋白產生。在較佳實施例中，本發明之結合多肽(例如抗體或其抗原結合片段)結合於Fc-γ受體。在替代性實施例中，本發明之結合多肽可包含缺乏一或多種效應功能(例如ADCC活性)及/或不能結合Fcγ受體之恆定區。
本發明之某些實施例包括抗PDGFRβ抗體，其中一或多個恆定區域中之至少一個胺基酸已缺失或另外改變以便提供所需生物化學特徵，諸如當與具有大約相同免疫原性之未改變之全抗體相比時，效應功能減小或增強、
非共價二聚之能力、在腫瘤部位局部化之能力提高、血清半衰期減少或血清半衰期增加。舉例而言，用於本文所述之診斷及治療方法的某些抗體或其片段為域缺失抗體，其包含類似於免疫球蛋白重鏈之多肽鏈，但缺乏一或多個重鏈域之至少一部分。舉例而言，在某些抗體中，經修飾抗體之恆定區之一個完整域將會缺失，例如CH2域之全部或部分將會缺失。
在某些其他實施例中，結合多肽包含源自不同抗體同型之恆定區(例如來自人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中兩者或兩者以上之恆定區)。在其他實施例中，結合多肽包含嵌合鉸鏈(亦即包含源自不同抗體同型之鉸鏈域(例如IgG4分子之上鉸鏈域及IgG1中間鉸鏈域)之鉸鏈部分的鉸鏈)。在一實施例中，結合多肽包含人類IgG4分子之Fc區或其部分，及分子之核心鉸鏈區中之Ser228Pro突變(EU編號)。
在某些實施例中，可使用此項技術中已知之技術使Fc部分突變以增大或減小效應功能。舉例而言，恆定區域之缺失或不活化(經由點突變或其他手段)可減小循環之經修飾抗體之Fc受體結合，藉此增大腫瘤局部化。在其他情況下，符合本發明之恆定區修飾可能使補體結合緩和，因此減少接合細胞毒素之血清半衰期及非特異性締合。然而，恆定區之其他修飾可用以修飾二硫鍵或寡糖部分，其因抗原特異性或可撓性增大而允許局部化增強。修飾之所得生理學概況、生物可用性及其他生物化學作用(諸如腫瘤局部化、生物分佈及血清半衰期)可使用熟知免疫學技術在無不當實驗之情況下來輕易量測及定量。
在某些實施例中，本發明之抗體中所用之Fc域為Fc變異體。如本文所用，術語「Fc變異體」係指相對於產生該Fc域之野生型Fc域具有至少一個胺基酸取代之Fc域。舉例而言，其中Fc域源自人類IgG1抗體，該人類IgG1
Fc域之Fc變異體相對於該Fc域包含至少一個胺基酸取代。
Fc變異體之胺基酸取代可位於Fc域內任何位置(亦即任何EU慣例胺基酸位置)。在一實施例中，Fc變異體在位於鉸鏈域或其部分之胺基酸位置包含取代。在另一實施例中，Fc變異體在位於CH2域或其部分之胺基酸位置包含取代。在另一實施例中，Fc變異體在位於CH3域或其部分之胺基酸位置包含取代。在另一實施例中，Fc變異體在位於CH4域或其部分之胺基酸位置包含取代。
本發明之結合多肽可採用任何技術上公認之Fc變異體，已知其在效應功能及/或FcR結合方面賦予改良(例如減小或增強)。該等Fc變異體可包括例如以下中揭示之任一胺基酸取代：國際PCT公開案WO88/07089A1、WO96/14339A1、WO98/05787A1、WO98/23289A1、WO99/51642A1、WO99/58572A1、WO00/09560A2、WO00/32767A1、WO00/42072A2、WO02/44215A2、WO02/060919A2、WO03/074569A2、WO04/016750A2、WO04/029207A2、WO04/035752A2、WO04/063351A2、WO04/074455A2、WO04/099249A2、WO05/040217A2、WO05/070963A1、WO05/077981A2、WO05/092925A2、WO05/123780A2、WO06/019447A1、WO06/047350A2及WO06/085967A2或美國專利第5,648,260號；第5,739,277號；第5,834,250號；第5,869,046號；第6,096,871號；第6,121,022號；第6,194,551號；第6,242,195號；第6,277,375號；第6,528,624號；第6,538,124號；第6,737,056號；第6,821,505號；第6,998,253號；及第7,083,784號，其各自以引用的方式併入本文中。在一示範性實施例中，本發明之結合多肽可包含在EU位置268(例如H268D或H268E)包含胺基酸取代之Fc變異體。在另一示範性
實施例中，本發明之結合多肽可在EU位置239(例如S239D或S239E)及/或EU位置332(例如I332D或I332Q)包含胺基酸取代。
在某些實施例中，本發明之結合多肽可包含Fc變異體，該Fc變異體包含改變抗體之抗原獨立性效應功能，特定言之改變結合多肽之循環半衰期的胺基酸取代。當與缺乏此等取代之結合多肽相比時，此等結合多肽顯示對FcRn之結合增大或減小，因此在血清中之半衰期分別增加或減少。預期對FcRn之親和力改良的Fc變異體具有較長血清半衰期，且此等分子在需要所投與之抗體具有長半衰期的治療哺乳動物之方法中具有適用之應用，例如以治療慢性疾病或病症。相反地，預期FcRn結合親和力降低之Fc變異體具有較短半衰期，且此等分子亦適用於例如向哺乳動物投與，其中循環時間縮短可能有利，例如以便活體內診斷成像，或適用於起始抗體當長時期存在於循環中時具有毒性副作用之情況。FcRn結合親和力降低之Fc變異體亦不太可能穿過胎盤，因此亦適用於治療孕婦之疾病或病症。另外，可能需要減小之FcRn結合親和力的其他應用包括需要腦、腎及/或肝局部化之彼等應用。在一示範性實施例中，本發明之經改變結合多肽(例如抗體或其抗原結合片段)顯示自血管結構穿過腎小球上皮之輸送減少。在另一實施例中，本發明之經改變結合多肽(例如抗體或其抗原結合片段)顯示自腦部穿過血腦障壁(BBB)進入血管空間之輸送減少。在一實施例中，FcRn結合改變之抗體包含在Fc域之「FcRn結合環」內具有一或多個胺基酸取代之Fc域。FcRn結合環包含胺基酸殘基280-299(根據EU編號)。以引用的方式併入本文中之國際PCT公開案第WO05/047327號揭示改變FcRn結合活性之示範性胺基酸取代。在某些示範性實施例中，本發明之結合多肽(例如抗體或其抗原結合片段)包含具有一或多個以下取代之Fc域：V284E、H285E、
N286D、K290E及S304D(EU編號)。
在其他實施例中，用於本文所述之診斷及治療方法的結合多肽具有恆定區，例如IgG1或IgG4重鏈恆定區，其經改變以減少或消除糖基化。舉例而言，本發明之結合多肽(例如抗體或其抗原結合片段)亦可包含Fc變異體，該Fc變異體包含改變抗體Fc之糖基化的胺基酸取代。舉例而言，該Fc變異體可具有減少之糖基化(例如N連接或O連接糖基化)。在示範性實施例中，Fc變異體包含N連接聚糖通常見於胺基酸位置297(EU編號)的減少之糖基化。在另一實施例中，抗體在糖基化基元(例如含有胺基酸序列NXT或NXS之N連接糖基化基元)附近或內部具有胺基酸取代。在一特定實施例中，抗體包含在胺基酸位置228或299(EU編號)具有胺基酸取代之Fc變異體。在較特定實施例中，抗體包含IgG1或IgG4恆定區，該恆定區包含S228P及T299A突變(EU編號)。
以引用的方式併入本文中之國際PCT公開案第WO05/018572號揭示賦予減少或改變之糖基化的示範性胺基酸取代。在較佳實施例中，修飾本發明之抗體或其片段以消除糖基化。此等抗體或其片段可稱為「無糖基化(agly)」抗體或其片段(例如「無糖基化」抗體)。儘管不受理論約束，但感信「無糖基化」抗體或其片段可具有改良之活體內安全性及穩定性概況。示範性無糖基化抗體或其片段包含IgG4抗體之無糖基化(aglycosylated)Fc區，其缺乏Fc效應功能，藉此消除對表現PDGFRβ之正常生命器官造成Fc介導性毒性之可能。在其他實施例中，本發明之抗體或其片段包含經改變聚糖。舉例而言，抗體可在N聚糖上在Fc區之Asn297處具有減少數目之海藻糖殘基，亦即經無海藻糖基化(afucosylated)。在另一實施例中，抗體可在N聚糖上在Fc區之Asn297處具有改變數目之唾液酸殘基。
iii)共價連接
可如下修飾本發明之結合多肽：例如使分子共價連接於結合多肽以使共價連接不會阻止結合多肽特異性結合於其同源抗原決定基。舉例而言，但無限制，本發明之抗體或其片段可藉由糖基化、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、醯胺化、藉由已知保護基/阻隔基之衍生、蛋白分解性裂解、連接於細胞配位體或其他蛋白質等來修飾。眾多化學修飾中任一者均可藉由已知技術進行，該等已知技術包括(但不限於)特異性化學裂解、乙醯化、甲醯化等。另外，衍生物可含有一或多個非經典胺基酸。
本發明之結合多肽(例如抗體或其片段)可進一步與異源多肽在N端或C端重組融合或與多肽或其他組成化學接合(包括共價及非共價接合)。舉例而言，抗PDGFRβ抗體可與適用作偵測分析中之標記的分子及效應分子(諸如異源多肽、藥物、放射性核種或毒素)重組融合或接合。參見例如PCT公開案WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美國專利第5,314,995號；及EP 396,387。
可使用此項技術中已知之方法使結合多肽與異源多肽融合以增加活體內半衰期或用於免疫分析。舉例而言，在一實施例中，PEG可與本發明之結合多肽接合以增加其活體內半衰期。Leong,S.R.等人，Cytokine 16：106(2001)；Adv.in Drug Deliv.Rev.54：531(2002)；或Weir等人，Biochem.Soc.Transactions 30：512(2002)。
此外，本發明之結合多肽可與標記序列(諸如肽)融合以有助於其純化或偵測。在較佳實施例中，標記胺基酸序列為六組胺酸肽，尤其諸如為在pQE載體中提供之標籤(QIAGEN公司，9259 Eton Avenue,Chatsworth,Calif.,91311)，其中許多為市售的。如Gentz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 86：821-824(1989)中所述，舉例而言，六組胺酸為融合蛋白提供便利之純化。適用於純化之其他肽標籤包括(但不限於)「HA」標籤，其對應於源自流感血球凝集素蛋白之抗原決定基(Wilson等人，Cell 37：767(1984))，及「flag」標籤。
本發明之結合多肽可以非接合形式使用或可與多種分子中至少一者接合，例如以改良分子之治療性質，以有助於目標偵測，或用於患者之成像或療法。本發明之結合多肽可純化之前或之後、在進行純化時經標記或接合。特定言之，本發明之結合多肽可與治療劑、前藥、肽、蛋白質、酶、病毒、脂質、生物反應修飾藥、醫藥劑或PEG接合。
本發明進一步涵蓋本發明之結合多肽與診斷劑或治療劑接合。結合多肽可以診斷方式用以例如監測免疫細胞病症(例如CLL)之發展或進展(作為臨床測試程序之部分)以例如測定既定治療及/或預防方案之功效。使結合多肽與可偵測物質偶合可有助於偵測。可偵測物質之實例包括各種酶、輔基、螢光物質、發光物質、生物發光物質、放射性物質、正電子發射金屬(使用各種正電子發射斷層攝影術)及非放射性順磁性金屬離子。參見例如美國專利第4,741,900號關於可與根據本發明適用作診斷物之抗體接合的金屬離子。適合酶之實例包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；適合輔基複合物之實例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素及抗生物素蛋白/生物素；適合螢光物質之實例包括繖酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅素；發光物質之實例包括流明諾(luminol)；生物發光物質之實例包括螢光素酶、螢光素及水母發光蛋白(aequorin)；且適合放射性物質之實例包括125I、131I、111In或99Tc。
用於本文揭示之診斷及治療方法之結合多肽可與以下接合：細胞毒素(諸如放射性同位素、細胞毒性藥或毒素)治療劑、細胞生長抑制劑、生物毒素、前藥、肽、蛋白質、酶、病毒、脂質、生物反應修飾藥、醫藥劑、免疫活性配位體(例如淋巴介質或其他抗體，其中所得分子結合於贅生細胞及效應細胞，諸如T細胞)或PEG。
在另一實施例中，用於本文揭示之診斷及治療方法之抗PDGFRβ抗體可與降低腫瘤細胞生長之分子接合。在其他實施例中，所揭示之組合物可包含抗體或其片段與藥物或前藥偶合。本發明之其他實施例包含與特異性生體毒素或其細胞毒素片段(諸如菌麻毒蛋白(ricin)、白樹素(gelonin)、綠膿桿菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)或白喉毒素)接合之抗體或其片段的用途。選擇何種接合或非接合抗體加以使用將視癌症類型及階段、附屬治療(例如化學療法或外部輻射)之使用及患者病狀而定。應瞭解，熟習此項技術者可鑒於本文教示來輕易進行此選擇。
應瞭解，在先前研究中，以同位素標記之抗腫瘤抗體已成功用以破壞動物模型中之腫瘤細胞，且在一些情況下破壞人類中之腫瘤細胞。示範性放射性同位素包括：90Y、125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re及188Re。放射性核種藉由產生電離輻射來起作用，電離輻射引起核DNA中多股斷裂，從而使得細胞死亡。用以產生治療性接合之同位素通常產生具有短路徑長度之高能α或β粒子。此等放射性核種殺死其緊鄰之細胞，例如接合物已連接或已進入之贅生細胞。其對非局部化細胞具有極少影響或無影響。放射性核種為基本上非免疫原性。
在如上所述操作經分離遺傳物質以提供本發明之結合多肽後，通常將基因插入表現載體中以便引入可用以產生所需量之所主張抗體或其片段的宿主細胞中。
術語「載體」或「表現載體」在本文中用於說明書及申請專利範圍之目的，以意謂根據本發明用作將所需基因引入細胞中及在細胞中表現所需基因之媒劑的載體。如熟習此項技術者已知，此等載體可輕易選自由質體、噬菌體、病毒及反轉錄病毒組成之群。一般而言，與本發明相容之載體將包含選擇標記、適當限制位點以有助於選殖所需基因及進入真核或原核細胞及/或在其中複製之能力。
眾多表現載體系統可用於本發明之目的。舉例而言，一個種類之載體利用源自動物病毒之DNA元件，該等動物病毒諸如為牛乳突狀瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘瘡病毒、桿狀病毒、反轉錄病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒。其他涉及使用具有內部核糖體結合位點之多順反子系統。另外，可藉由引入一或多個允許選擇經轉染宿主細胞之標記來選擇已將DNA整合於其染色體中之細胞。標記可提供營養缺陷宿主之原養型、殺生物劑抗性(例如抗生素)或抗重金屬(諸如銅)性。可選標記基因可直接連接至待表現DNA序列，或藉由共轉型引入相同細胞中。亦可能需要其他元件來最佳地合成mRNA。此等元件可包括信號序列、剪接信號、以及轉錄啟動子、強化子及終止信號。在尤其較佳實施例中，將選殖之可變區基因以及如以上所討論的合成之重鏈及輕鏈恆定區基因(較佳為人類)插入表現載體中。
在其他較佳實施例中，本發明之結合多肽或其片段可使用多順反子構築體來表現。在此等表現系統中，諸如抗體之重鏈及輕鏈的相關多基因產
物可自單一多順反子構築體製得。此等系統宜使用內部核糖體入口位點(IRES)以在真核宿主細胞中提供相對較高含量之本發明多肽。併入本文中之美國專利第6,193,980號中揭示相容性IRES序列。熟習此項技術者應瞭解，此等表現系統可用以有效製得本申請案中揭示之整套多肽。
更一般而言，一旦已製備載體或編碼抗體或其片段之DNA序列，表現載體即可引入適當宿主細胞中。亦即，可使宿主細胞轉型。質體引入宿主細胞中可藉由熟習此項技術者熟知之各種技術來實現。其包括(但不限於)轉染(包括電泳及電穿孔)、原生質體融合、磷酸鈣沈澱、與包膜DNA細胞融合、顯微注射及以完整病毒感染。參見Ridgway,A.A.G.「Mammalian Expression Vectors」第24.2章，第470-472頁，Vectors,Rodriguez及Denhardt編，(Butterworths,Boston,Mass.1988)。最佳經由電穿孔將質體引入宿主中。使轉型細胞在適於產生輕鏈及重鏈之條件下生長，且分析重鏈及/或輕鏈蛋白質合成。示範性分析技術包括酶聯結免疫吸附劑分析法(ELISA)、放射免疫分析(RIA)或螢光活化細胞分選器分析(FACS)、免疫組織化學及其類似技術。
如本文所用，術語「轉型」應以廣義使用以指將DNA引入接受者宿主細胞，其改變基因型，因此產生接受者細胞變化。
按照彼等相同思路，「宿主細胞」係指已用使用重組DNA技術構築且編碼至少一種異源基因之載體轉型的細胞。在自重組宿主分離多肽之方法的描述中，除非另外明確規定，否則術語「細胞」與「細胞培養物」可互換使用以表示抗體來源。換言之，自「細胞」回收多肽可意謂自短暫離心之全細胞，或自含有培養基與懸浮細胞之細胞培養物回收。
在一實施例中，用於抗體表現之宿主細胞株具有哺乳動物來源；熟習
此項技術者可確定最適用於待於其中表現之所需基因產物的特定宿主細胞株。示範性宿主細胞株包括(但不限於)DG44及DUXB11(中國倉鼠卵巢細胞株(Chinese Hamster Ovary line)，DHFR-)、HELA(人類子宮頸癌)、CVI(猴腎細胞株)、COS(具有SV40 T抗原之CVI衍生物)、R1610(中國倉鼠纖維母細胞)BALBC/3T3(小鼠纖維母細胞)、HAK(倉鼠腎細胞株)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛內皮細胞)、RAJI(人類淋巴細胞)、293(人類腎)。在一實施例中，細胞株提供由此表現之抗體的經改變糖基化，例如無海藻糖基化(例如PER.C6.RTM.(Crucell)或FUT8基因剔除CHO細胞株(Potelligent.RTM.Cells)(Biowa,Princeton,N.J.))。在一實施例中，可使用NS0細胞。CHO細胞尤其較佳。宿主細胞株通常可獲自商運、美國組織培養物收藏中心(American Tissue Culture Collection)或獲自公開文獻。
活體外製造允許擴大規模以得到大量所需多肽。在組織培養條件下進行哺乳動物細胞培養之技術為此項技術中已知且包括均質懸浮液培養物，例如在空運反應器中或在連續攪拌器反應器中，或固定或裏入之細胞培養物，例如在中空纖維、微膠囊中、在瓊脂糖微珠或陶瓷筒上。必要及/或需要時，多肽溶液可藉由慣用層析方法純化，該等方法例如為凝膠過濾、離子交換層析、DEAE-纖維素層析及/或(免疫)親和力層析。
編碼本發明之結合多肽或其片段之基因亦可為經表現之非哺乳動物細胞，諸如細菌或酵母或植物細胞。就此而言，應瞭解，各種單細胞非哺乳動物微生物(諸如細菌)亦可轉型；亦即能夠在培養物中生長或發酵者。易轉型之細菌包括腸內菌科(enterobacteriaceae)成員，諸如以下之菌株：大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Salmonella)；芽孢桿菌科(Bacillaceae)，諸如枯草桿菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌
(Pneumococcus)；鏈球菌(Streptococcus)及流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)。應進一步瞭解，當在細菌中表現時，多肽可變成內含體之部分。多肽必須係分離、純化及接著組裝入功能分子中。
除原核生物外，亦可使用真核微生物。啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)或常見焙用酵母(baker's yeast)在真核微生物中為最常用，但通常可用許多其他菌株。為在酵母菌中表現，常用質體YRp7，例如(Stinchcomb等人，Nature,282：39(1979)；Kingsman等人，Gene,7：141(1979)；Tschemper等人，Gene,10：157(1980))。此質體已含有TRP1基因，其為缺乏在色胺酸中生長之能力的酵母突變株(ATCC編號44076或PEP4-1)提供選擇標記(Jones,Genetics,85：12(1977))。作為酵母宿主細胞基因組之特徵的trpl病變之存在接著藉由在不存在色胺酸下生長為偵測轉型提供有效環境。
在另一態樣中，本發明提供包含抗PDGFRβ抗體或其片段之醫藥組合物。
製備本發明之抗體或其片段及將其投與受試者之方法為熟習此項技術者所熟知或由熟習此項技術者輕易確定。本發明之抗體或其片段的投藥途徑可為經口、非經腸、吸入或表面。如本文所用，術語非經腸包括靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、經直腸或經陰道投與。非經腸投與之靜脈內、動脈內、皮下及肌肉內形式一般為較佳。儘管所有此等投藥形式均明確涵蓋於本發明之範疇內，但投藥形式將為注射用溶液，特定言之用於靜脈內或動脈內注射或點滴。適用於注射之醫藥組合物通常可包含緩衝劑(例如乙酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝劑)、界面活性劑(例如聚山梨醇
酯)、視情況選用之穩定劑(例如人類白蛋白)等。然而，在與本文教示相容之其他方法中，多肽可直接傳遞至不利細胞群體之位點，藉此增加疾病組織對治療劑之暴露。
用於非經腸投與之製劑包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液及乳液。非水性溶劑之實例為丙二醇、聚乙二醇、植物油(諸如橄欖油)及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。水性載劑包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水及緩衝介質。在主題發明中，醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)0.01-0.1M及較佳0.05M磷酸鹽緩衝液或0.8%鹽水。其他常見非經腸媒劑包括磷酸鈉溶液、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)、右旋糖及氯化鈉、乳酸化林格氏液，或不揮發性油。靜脈內媒劑包括流體及營養素補充劑、電解液補充劑，諸如基於林格氏右旋糖之物，及其類似物。亦可存在防腐劑及其他添加劑，諸如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑及惰性氣體及其類似物。更特定言之，適用於可注射用途之醫藥組合物包括無菌水溶液(其中水溶性)或分散液及無菌散劑以便臨時製備無菌可注射溶液或分散液。在此等情況下，組合物必須無菌且應為流體(至存在輕易可注射性之程度)。其應在製造及儲存條件下穩定且較佳將免受諸如細菌及真菌之微生物的污染作用而保藏。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇，及其類似物)及其適合混合物之溶劑或分散介質。適當流動性可例如藉由使用塗料(諸如卵磷脂)、在分散液情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持。防止微生物作用可藉由各種抗細菌劑及抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、乙汞硫柳酸鈉及其類似物)來達成。在許多情況下，組合物中較佳包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉。可注射組合物之長久吸收可藉由在
組合物中包括延遲吸收之試劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來達成。
在任何情況下，無菌可注射溶液均可如下製備：將活性化合物(例如單獨之抗體或抗體與其他活性劑組合)根據需要以所需量併入含一種本文所列舉之成分或其組合的適當溶劑中，接著進行過濾滅菌。一般而言，分散液係藉由將活性化合物併入無菌媒劑中來製備，該無菌媒劑含有鹼性分散介質及來自上文列舉成分之所需其他成分。在用於製備無菌可注射溶液之無菌散劑之情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥，其得到活性成分加上來自其先前無菌過濾之溶液之任何其他所需成分的散劑。根據此項技術中已知之方法處理注射用製劑、填充至諸如安瓿、袋子、瓶子、注射器或小瓶之容器中，及在無菌條件下密封。此外，製劑可以諸如同在申請中之美國專利序號第09/259,337號及美國專利序號第09/259,338號(其各自以引用的方式併入本文中)中所述者之套組形式包裝及出售。此等製品將較佳具有標記或藥品說明書來指示相關組合物適用於治療罹患或易患自體免疫病症或贅生性病症之受試者。
治療上述病狀的本發明之穩定化抗體或其片段之有效劑量視許多不同因素而變化，該等因素包括投藥手段、目標部位、患者生理狀態、患者為人類或動物、所投與之其他醫藥及治療為預防性的或治療性的。通常，患者為人類，但亦可治療包括轉殖基因哺乳動物之非人類哺乳動物。治療劑量可使用熟習此項技術者已知之常規方法滴定以使安全性及功效最佳化。
為用本發明之抗體進行被動免疫，劑量可介於例如約0.0001毫克/公斤至100毫克/公斤且更通常介於0.01毫克/公斤至5毫克/公斤(例如0.02毫克/公斤、0.25毫克/公斤、0.5毫克/公斤、0.75毫克/公斤、1毫克/公斤、2毫克
/公斤等)宿主體重之範圍內。舉例而言，劑量可為1毫克/公斤體重或10毫克/公斤體重或在1-10毫克/公斤之範圍內，較佳為至少1毫克/公斤。上述範圍中間之劑量亦意欲在本發明之範疇內。
可每日、隔日、每週或根據經驗分析確定之任何其他時程向受試者投與此等劑量。示範性治療需要歷經長時期(例如至少六個月)投與多次劑量。其他示範性治療方案需要每兩週投與一次或一月投與一次或每3至6個月投與一次。示範性給藥時程包括1-10mg/kg或15mg/kg連續日、30mg/kg隔日或60mg/kg每週。在一些方法中，同時投與兩種或兩種以上具有不同結合特異性之單株抗體，在該情況下，各抗體之投與劑量可屬於指定範圍內。
本發明之抗體或其片段可在多個場合下投與。單次劑量之間的間隔可為例如每日、每週、每月或每年。間隔亦可不規則，如藉由量測患者體內多肽或目標分子之血液含量來指定。在一些方法中，調整劑量以達成某一血漿抗體或毒素濃度，例如1-1000μg/ml或25-300μg/ml。或者，抗體或其片段可以持續釋放調配物形式投與，在該情況下需要以較小頻率投藥。劑量及頻率視患者體內抗體半衰期而變化。一般而言，人類化抗體顯示最長半衰期，接著為嵌合抗體及非人類抗體。在一實施例中，本發明之抗體或其片段可以非接合形式投與。在另一實施例中，本發明之抗體可以接合形式多次投與。在又一實施例中，本發明之抗體或其片段可以非接合形式投與，接著以接合形式投與，或反之亦然。
投藥劑量及頻率可視治療為預防性的或治療性的而變化。在預防性應用中，向尚未處於疾病狀態之患者投與含有本發明之抗體或其混合物之組合物以增強患者抵抗力。此量係定義為「預防性有效劑量」。在此用途中，精確量又視患者健康狀況及全身免疫性而定，但一般介於每劑0.1mg至25
mg，特定言之每劑0.5mg至2.5mg之範圍內。以相對不頻繁之間隔投與相對較低劑量歷經一長段時間。一些患者在其餘生繼續接受治療。
在治療性應用中，有時需要相對較短間隔下之相對較高劑量(例如每劑約1mg/kg至400mg/kg抗體，其中5mg至25mg之劑量較常用於輻射免疫接合物及細胞毒素-藥物接合分子之較高劑量)直至疾病進展減小或終止為止，且較佳直至患者顯示病徵部分或完全改善為止。此後，可向患者投與預防性方案。
在一實施例中，可用編碼本發明之多肽的核酸分子(例如在載體中)治療受試者。編碼多肽之核酸的劑量介於每個患者約10ng至1g、100ng至100mg、1μg至10mg或30-300μg DNA之範圍內。感染性病毒載體之劑量自每劑10-100個或100個以上病毒粒子變化。
治療劑可藉由非經腸、表面、靜脈內、經口、皮下、動脈內、顱內、腹膜內、鼻內或肌肉內手段來投與以便預防性及/或治療性治療。對於投與本發明之抗體，肌肉內注射或靜脈內輸注為較佳。在一些方法中，將治療性抗體或其片段直接注射至顱腔中。在一些方法中，以持續釋放組合物或裝置(諸如MedipadTM裝置)形式投與抗體或其片段。
本發明之藥劑可視情況與有效治療需要治療(例如預防性或治療性)之病症或病狀之其他藥劑組合投與。較佳其他藥劑為技術上公認且標準式投與以用於特定病症之藥劑。
90Y標記之本發明抗體的有效單次治療劑量(亦即治療有效量)介於約5mCi與約75mCi之間、更佳介於約10mCi與約40mCi之間的範圍內。131I標記之抗體的有效單次治療非骨髓去除性劑量介於約5mCi與約70mCi之間、更佳介於約5mCi與約40mCi之間的範圍內。131I標記之抗體的有效
單次治療去除性劑量(亦即可能需要自體骨髓移植)介於約30mCi與約600mCi之間、更佳介於約50mCi與小於約500mCi之間的範圍內。結合嵌合修飾抗體，由於相對於鼠類抗體之較長循環半衰期，因此碘-131標記之嵌合抗體的有效單次治療非骨髓去除性劑量介於約5mCi與約40mCi之間、更佳在小於約30mCi之範圍內。例如111In標記之成像準則通常小於約5mCi。
儘管用131I及90Y已獲得了許多臨床經驗，但其他放射性標記為此項技術中已知且已用於類似目的。將其他放射性同位素用於成像。舉例而言，與本發明範疇相容之其他放射性同位素包括(但不限於)123I、125I、32P、57Co、64Cu、67Cu、77Br、81Rb、81Kr、87Sr、113In、127Cs、129Cs、132I、197Hg、203Pb、206Bi、177Lu、186Re、212Pb、212Bi、47Sc、105Rh、109Pd、153Sm、188Re、199Au、225Ac、211A 213Bi。就此而言，α、γ及β發射體均與本發明相容。此外，鑒於本揭示案，熟習此項技術者認為可在無不當實驗之情況下輕易確定何種放射性核種與所選療程相容。為此目的，已用於臨床診斷中之其他放射性核種包括125I、123I、99Tc、43K、52Fe、67Ga、68Ga，以及111In。亦用多種放射性核種標記抗體以便可能用於目標免疫療法中(Peirersz等人，Immunol.Cell Biol.65：111-125(1987))。此等放射性核種以較少程度包括188Re及186Re以及199Au及67Cu。美國專利第5,460,785號提供關於此等放射性同位素之其他資料且以引用的方式併入本文中。
如先前討論，本發明之抗體或其片段可以醫藥學上有效量投與以便活體內治療哺乳動物病症。就此而言，應瞭解，所揭示之抗體或其片段將經調配以便有助於投與活性劑及促進活性劑穩定性。本發明之醫藥組合物較
佳包含醫藥學上可接受之無毒性無菌載劑，諸如生理食鹽水、無毒緩衝劑、防腐劑及其類似物。出於本申請案之目的，與治療劑接合或未接合之本發明抗體之醫藥學上有效量應被認為意謂足以達成有效結合於目標及達成益處(例如改善疾病或病症之症狀或偵測物質或細胞)之量。在腫瘤細胞之情況下，多肽較佳將能夠與贅生細胞或免疫活性細胞上之所選免疫活性抗原相互作用且提供彼等細胞死亡之增加。當然，本發明之醫藥組合物可以單次或多次劑量投與以提供醫藥學上有效量之多肽。
與本揭示案之範疇相一致，可根據上述治療方法以足以產生治療性或預防性作用之量向人類或其他動物投與本發明之抗體。本發明之多肽可以藉由根據已知技術組合本發明之抗體與醫藥學上可接受之習知載劑或稀釋劑製備之習知劑型向此人類或其他動物投與。熟習此項技術者應認識到，醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑的形式及特徵係藉由與其組合之活性成分之量、投藥途徑及其他熟知變數規定。熟習此項技術者應進一步瞭解，可證明包含一或多種本發明多肽物質之混合物尤其有效。
本發明之結合多肽或其片段適用於對抗PDGFRβ活性。因此，在另一態樣中，本發明提供藉由向有需要之受試者投與包含一或多種本發明之抗PDGFRβ抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物來治療PDGFRβ相關疾病或病症的方法。
接受治療之PDGFRβ相關疾病或病症包括(不限於)：年齡相關之黃斑部變性(AMD)；再狹窄，包括動脈血管手術、粥樣斑切除術(atherectomy)或其他斑塊移除侵入法後冠脈再狹窄，及相同程序後腎或周邊動脈再狹窄；與其他急性損傷形式相關之血管增生現象及纖維化，諸如：與成人呼吸窘
迫症候群相關之肺纖維化、與腎炎相關之腎纖維化、與川崎病(Kawasake's disease)相關之冠脈狹窄，及與其他動脈炎(諸如高安病(Takayasha's disease))相關之血管變窄；纖維變性過程，諸如硬皮病、肌纖維變性；及癌症(例如腫瘤細胞增殖及新血管生成)
熟習此項技術者應能夠藉由常規實驗來確定用於治療PDGFRβ相關疾病或病症之目的之抗體(或其他治療劑)的有效、無毒量。舉例而言，多肽之治療活性劑量可根據諸如以下之因素而變化：受試者之疾病階段(例如I階段相對於IV階段)、年齡、性別、醫學併發症(例如免疫抑制之病狀或疾病)及體重，及抗體在受試者體內引發所需反應之能力。可調整給藥方案以提供最佳治療反應。舉例而言，可每日投與若干分次劑量，或該劑量可如由治療情況之急迫性所指定按比例減少。然而，一般而言，預期有效劑量係在每公斤體重每日約0.05毫克至100毫克且更佳在每公斤體重每日約0.5毫克至10毫克之範圍內。
本發明係由以下實例進一步說明，不應將該等以下實例視為作進一步限制。序列表、圖式及在整個本申請案中引用之所有參考文獻、專利及公開專利申請案之內容均以引用的方式明確併入本文中。
實例1. 分離特異性結合於人類PDGFRβ之VH域
使用如WO2010/011944(以全文引用的方式併入本文中)中所述之DNA呈現來選擇特異性結合於人類PDGFRβ之VH域。特定言之，針對人類PDGFRβ，對源自十個骨髓供體之原生人類VH域DNA呈現文庫進行六輪選擇。選殖所選結合子且對其定序。自此篩選選擇VH域純系A4、B4及G2，其胺基酸序列闡述於表3中。
實例2. HCDR3改組
A. VH文庫構築
為篩選結合特徵改良之VH域，將純系A4(指定為XB1511)之HCDR3序列改組至原生人類VH文庫中，針對結合於人類及小鼠PDGFRβ對其進行進一步選擇。特定言之，合成編碼純系A4之HCDR3(SEQ ID NO：1)的DNA序列且使用構架特異性寡核苷酸將其組裝至包含自骨髓B細胞及PBMC擴增之原生人類VH域之構架區1-3的文庫中。使用5' VH家族特異性及3'通用FR3反向引子來擴增人類VH構架區1-3以產生VH家族構架區之個別文庫。藉由使用5' T7TMV及3' XB1511 FR3CDR3FR4寡核苷酸進行進一步PCR擴增來改組VH家族構架文庫及XB1511 HCDR3。此亦在5'末端添加T7TMV啟動子序列以便活體外轉錄/轉譯。亦藉由分別使用FR4 Cu3反向及Y109引子以及5' T7TMV引子進行PCR來添加C端Cμ3序列及FLAG標籤(用於轉譯後純化)。表5中闡述用於製備HCDR3改組VH文庫之寡核苷酸的核酸序列。第1圖中闡述VH文庫構築之示意圖。
B. 文庫篩選
接著將HCDR3改組VH域文庫轉錄至mRNA文庫中且用如WO2010/011944中所述之dsDNA呈現技術進行選擇。以交替之輪用人類及小鼠PDGFRβ進行選擇持續4輪。在連續輪應用動力學控制之吸附及脫附速率選擇以提高選擇嚴格度，因此選擇對PDGFRβ具有高親和力之VH域。特定言之，如下選進行擇：第1輪(R1)用10nM固定之人類PDGFRβ；R2用固定之100nM小鼠PDGFRβ；R3用10nM可溶人類PDGFRβ且與200nM固定之人類PDGFRβ競爭24小時及120小時；且R4用10nM小鼠PDGFRβ。次選殖R4結合池以便DNA定序。R4結合池之序列分析顯示XB1511之HCDR3存在於多種不同構架內容中。未自所分析之序列組獲得野生型親本序列。本文表3中闡述所選VH域之胺基酸序列。
C. 所選HCDR3改組VH域之結合特異性
使用35S Met標記之活體外轉譯文庫評估上文所選之R4結合池對人類PDGFRβ與小鼠PDGFRβ之結合。特定言之，評估該池對環氧樹脂珠粒、100nM人類IgG、人類PDGFRβ及小鼠PDGFRβ之結合。如第2圖中所示，
親本XB1511 VH域顯示特異性結合於人類PDGFRβ，且不可偵測地結合於小鼠PDGFRβ。構架改組預選文庫顯示對人類PDGFRβ之弱結合。然而，相反地，R4構架改組文庫顯示顯著結合於人類PDGFRβ與小鼠PDGFRβ。
實例3. 識別穩定VL/VH對
A. 構築VL DNA文庫
藉由RT-PCR自年輕健康供體(Allcells)之B細胞構築人類VL文庫(Vκ及Vλ)。為確保文庫多樣性，自十個供體獲得3億個骨髓單核細胞及1億個周邊血液單核細胞且用於原生VH及VL文庫構築。第3圖中闡述文庫產生方法之示意圖。
如表4中所述來設計用於Vκ及Vλ序列之cDNA合成及後續PCR擴增之寡核苷酸引子。特定言之，自具有上游UTR序列之各家族之Vκ及Vλ FR1區設計多種正義引子。自巢套於Cκ1(Cκ2)或具有相同Cκ2下游之Jλ(JλCκ2)之恆定區設計用於κ及λ基因擴增之反義引子。Vκ與Vλ文庫攜帶相同C端序列以便在選擇週期期間PCR擴增。
使用FastTrack mRNA製備套組(Invitrogen)按照套組所提供之方案自個別供體製備mRNA。使用對輕鏈κ及λ恆定區(Cκ1及Cλ1)具有特異性之引子自經分離mRNA合成第一股cDNA。
用Cκ2及Vκ家族特異性或JλCκ2混合物及Vλ家族特異性引子使用cDNA作為模板進行Vκ及Vλ序列之PCR擴增。對個別Vκ及Vλ家族及個別供體進行PCR持續18-20個週期。在凝膠純化後，彙集來自各不同來源之Vκ及Vλ文庫以產生最終Vκ及Vλ文庫。
B. 藉由dsDNA呈現產生VL融合文庫
使用T7 Megascript套組(Invitrogen，目錄號AM1334)將使用本實例中所述之方法產生之Vκ及Vλ DNA文庫轉錄至mRNA文庫中。用RNeasy MinElute Cleanup套組(Qiagen，目錄號74204)按照套組所提供之方案來純化mRNA。如WO2010/011944中所述，總共600 pmol RNA(300 pmol Vκ及Vλ文庫)係與dsDNA呈現連接子及組件接合及組裝。對組裝之VL文庫進行活體外轉譯以產生融合文庫，其中各VL域(表型)係與其編碼序列(基因型)穩定融合。將35S Met併入轉譯方法中以對融合物進行放射性標記。該文庫接著用寡聚dT纖維素純化、使用反轉錄之標準分子生物學技術轉化為dsDNA呈現文庫、RNaseH分解、第2股DNA合成，接著進行flag標籤純化。
C. 識別XB1511及XB2202 VH域之VL對
將XB1511 VH轉譯為游離蛋白質(將35S Met併入轉譯反應中)且經由c端flag標籤進行親和力純化。接著以等莫耳比混合XB1511 VH域與純化之VL域融合物文庫(如上製備)，且在25℃下培育隔夜以使VH與VL融合域經由其疏水片來活體外締合。接著使混合物與預固定於Epoxy450珠粒上或溶液中之PDGFRβ目標接觸，且由蛋白質A珠粒捕獲，洗滌結合於固定之PDGFRβ目標的複合物且用0.1N KOH溶離。用VL特異性引子組進行PCR以回收結合於PDGFRβ目標之VL，兩者均呈VH-VL對形式且呈不成對VL域形式。進行3輪VL成對，前2輪嚴格度較低(100nM PDGFRβ)且第三輪嚴格度較高(10nM PDGFRβ)。兩輪類似地，XB2202 VH域亦與VL文庫成
對。對於各輪XB2202/VL成對及選擇，如下提高嚴格度：藉由動力學的控制之吸附及脫附速率策略，以識別與XB2202 VH域穩定成對之VL域且增強VH結合。
接著將上文識別之VL域池選殖至Blunt Zero TOPO載體(Invitrogen)中，且藉由使用M13正向引子及反向引子進行PCR自所得菌落擴增VL編碼DNA序列。接著對個別之經擴增之VL編碼DNA序列進行定序。自VL池獲得之序列資料顯示VL之多樣譜系經由該方法得到增濃。多個家族及構架存在於池中。若干VL係以複本或家族形式存在。可識別獨特VL家族且若干VL存在不止一次。本文表4中闡述使用本發明方法識別之與PDGFRβ結合VH域XB1511及XB2202成對的示範性VL序列。
D. 評估經識別VH與VL對
為評估經識別VH-VL對之特徵，藉由活體外轉譯或藉由大腸桿菌(E.coli)表現來構築及產生10-12個來自各池之scFV，接著進行親和力純化。
進行PDGFRβ結合ELISA分析以評估scFv對固定PDGFRβ之結合且測定EC50。特定言之，在4℃下將PBS中之2μg/mL人類PDGFRβ及人類Fc或IgG固定於Maxisorp板上隔夜。接著洗滌該板且用superblock阻斷。將活體外轉譯之粗scFv溶胞產物1：3稀釋於1×PBST中。將100μl稀釋scFv溶胞產物加載至Maxisorp板之各孔中且在室溫下培育1小時。藉由抗flag抗體-HRP(在1：5000稀釋度下)及TMB受質來偵測結合於固定PDGFRβ之scFv。在OD 450nm下進行終點分析之Molecular Device板讀取器上讀取該板。如第4、5及6圖中所示，在ELISA結合分析中，大於50%對於XB1511及XB2202產生之scFv顯示特異性結合於PDGFRβ。相反地，單獨之不成對VL不顯示結合於PDGFRβ(參見第7圖)。
藉由基於溶液之平衡結合分析測定若干scFv之親和力。特定言之，將120 pmol scFv RNA轉譯至併有35S Met之游離蛋白質中。在含有1×PBS與0.025%氚核(triton)、1mg/mL BSA及0.1mg/mL sssDNA之結合緩衝液中稀釋經轉譯反應混合物3倍。將人類PDGFRβ在同一結合緩衝液中稀釋至100nM至0nM之最終濃度。將稀釋之scFv混合物與hPDGFRβ一起以100μl之最終體積在Kingfisher板(Thermofisher Scientific,97002084)上培育。在培育之後，使用25μl蛋白質A磁性珠粒(Invitrogen)以自溶液捕獲PDGFRβ。洗滌捕獲之PDGFRβ且在kingfisher Reader(Thermofisher Scientific)中溶離。使用閃爍計數器對結合於磁性珠粒-固定hPDGFRβ之scFv(以35S Met標記)之量進行計數，且用Graph Pad Prism 5計算Kd。對於所測試之XB1511源性scFv，當與單獨之XB1511 VH相比時，2個scFv顯示高8-10倍之Kd，1個顯示高2.5倍之Kd，且4個顯示類似Kd(第8圖)。僅1個scFv顯示低於單獨之XB1511 VH的KD。如第9圖中所示，當與單獨之XB2202 VH相比時，所測試之XB2202源性scFv均顯示好約8-10倍之Kd。
實例4. 抗PDGFRβVH域對人類及小鼠PDGFRβ之結合親和力
將實例2中所選之R4構架改組之人類及小鼠PDGFRβ增濃之VH域池選殖至大腸桿菌表現載體中、產生及純化。在Biacore T100上使用表面電漿子共振測定VH域對人類及小鼠PDFGR之結合動力學。簡言之，使用與抗hIgG1 Fc單株抗體偶合之Series CM5感測晶片(CM5)分別固定人類及小鼠PDGFR-hIgG1-Fc嵌合融合蛋白。對於各週期，首先捕獲PDGFR融合蛋白，接著以100μL/min之流動速率注射VH 115秒(締合)。在締合階段之後立即為600秒之解離階段。在各週期單次注射3M MgCl2(10μL/min，60秒)使表面再生。注射多種濃度之VH域(0.55nM-40nM)且用T100評估軟
體來分析所得感測圖。使用1：1結合曲線擬合來測定結合動力學。第10、11及12圖中分別展示VH域純系XB2202及XB2708對人類及小鼠PDGFRβ之結合動力學。此等結果顯示XB2202及XB2708與親本XB1511相比親和力改良50-150倍。特定言之，XB2202及XB2708之Kd分別為249pM及93pM，且脫附速率(Koff)分別為1.86×10-3及9.267×10-4。XB2202與XB2708均結合於人類及小鼠PDGFRβ。尤其請注意，儘管其共用相同HCDR3，但XB2202源自VH1家族生殖系序列且XB2708源自VH3家族生殖系序列。
實例5. 抑制PDGFBB結合於PDGFRβ
使用表面電漿子共振在Biacore T100上評估本文揭示之XB2202 VH域對抗PDGFBB配位體結合於人類PDFGRb之能力。簡言之，使用與抗hIgG1 Fc單株抗體偶合之Series CM5感測晶片固定人類PDGFR-hIgG1-Fc嵌合融合蛋白。將10nM人類PDGFBB注射於預捕獲之人類PDGFRβ，獲得100%在不存在VH下對PDGFRβ之結合反應單元。對於各連續週期，首先捕獲PDGFR融合蛋白，接著注射VH域120秒。在沖掉未結合之VH域後，接著注射10nM PDGFBB持續120秒。在各週期單次注射3M MgCl2(10μL/min，60秒)使表面再生。注射多種濃度之VH(0.46nM-60nM)，用T100評估軟體來分析所得感測圖，且計算PDGFBB結合抑制。如第13圖中所示，XB2202以小於5nM之IC50抑制PDGFBB結合於人類PDFGRb。
實例6. 抑制外被細胞細胞遷移
測定本文揭示之XB2708 VH域對抗PDGF-BB誘導性活體外外被細胞遷移之能力。自Cell Systems Corporation(Kirkland,WA)獲得初級人類視網膜外被細胞且根據製造商建議使用CSC完整生長培養基來培養。將約125個細胞(2-5繼代)接種於塗有人類血漿纖維結合蛋白(5μg/ml於PBS中)之
384孔BIND©生物感測板之各孔中，且用含BSA(1%於PBS中)之含有0.1% BSA之無血清培養基阻斷。時細胞黏著，接著血清挨餓隔夜。在血清挨餓之後，將細胞與各種濃度之針對人類PDGFRβ受體之VH在組織培養恆溫箱中一起培育1小時。在抗體預培育結束時藉由將PDGF-BB以5ng/ml之最終濃度添加至無血清培養基中來刺激遷移。在組織培養恆溫箱中在37℃與5% CO2及>75%濕度下使用BIND©掃描儀每18分鐘獲得孔影像持續20小時。使用基於Matlab之質心識別及追蹤演算法以計算10小時與16小時之間的細胞速度來分析所收集之資料。第14圖中所述之結果顯示XB2708可以0.54nM之IC50對抗PDGF-BB誘導性外被細胞遷移。
實例7. VH-VL對轉化為異源四聚IgG及生物活性之證明
XB1511 VH與D8 VL係在293T細胞中之異源四聚IgG中一起表現。在48小時及96小時後收集細胞培養物上清液，且用蛋白質A瓊脂糖珠粒純化表現之IgG。IgG係以8mg/L製造而無任何最佳化。為評估XB1511/D8 IgG之生物活性，將HFF-1人類包皮纖維母細胞接種於384孔BIND生物感測器中且使其在無血清培養基中附著隔夜。接著用5ng/mL或10ng/mL PDGFBB配位體刺激成纖維細胞，且使其在100nM XB1511/D8 IgG存在或不存在下遷移18小時。每15分鐘捕獲BIND掃描儀影像且使用軟體分析工具以量測個別細胞遷移反應之軌跡長度。軌跡長度係由自藍色(無遷移)至紅色(最大遷移)之「熱圖(heat map)」表示。如第15圖中所示，XB1511/D8 IgG能夠完全阻斷人類纖維母細胞之PDGFBB誘導性遷移。
實例8. scFv熱穩定性
測定XB2202 VH及XB2202/A4 scFv之熱穩定性。特定言之，在4℃、37℃、60℃及70℃下培育1mg/mL XB2202及XB2202-A4持續12小時，且
進行PDGFRβ結合ELISA以測試蛋白質在培育後之結合活性。如第16圖中所示，XB2202 VH域在60℃下培育之後失去顯著PDGFRβ結合活性，且在70℃下培育之後完全失去結合活性。XB2202之Tm量測為約62℃。相反地，XB2202/A4 scFv在70℃下培育12小時之後完全具有活性，表明XB2202 scFv之Tm大於70℃。
實例9. IgG1抗體之表現、純化及濃縮
XB1511/D8及XB2202/A4 VH/VL對分別以全長異源四聚IgG1抗體形式在293T細胞中表現，且加以純化。本文表7中闡述XB1511/D8及XB2202/A4 IgG1抗體之重鏈及輕鏈的胺基酸序列。
細胞培養物上清液係藉由過濾獲得且使用兩步純化流程純化所表現之抗體。特定言之，進行蛋白質A親和力純化，結合抗體在pH 3.5下溶離。使用1M Tris將蛋白質A洗出液之pH值調節至pH 7，且藉由使用HiTrap Q XL管柱(GE Healthcare)之離子交換層析進一步純化。純化之抗體儲存於pH 7 PBS中。
藉由量測抗體溶液之A280來測定在各純化步驟後之抗體表現量及抗體濃度。純化之抗體的純度及品質係藉由尺寸排除高效液相層析(SEC-HPLC)來測定。本文表8中闡述此等實驗之結果。此等資料顯示當XB1511/D8及XB2202/A4 VH/VL對設計為全長異源四聚IgG1抗體形式時，所得抗體為高度可製造的，因為其表現量高、輕易純化至高純度且顯示極少聚集。
進一步分析純化之XB1511/D8及XB2202/A4 IgG1抗體之濃縮能力。特定言之，使用具有10kDa及30kDa截斷限制之centricon超濾旋轉管柱將各抗體溶液濃縮至50mg/ml。藉由SEC-HPLC分析濃縮溶液之完整性。自
此分析確定50mg/ml XB1511/D8 IgG1溶液之純度為約96%且含有約2.4%抗體聚集體，而50mg/ml XB2202/A4 IgG1溶液之純度為約97.8%且含有約2.2%抗體聚集體。此等資料證明XB1511/D8及XB2202/A4 IgG1抗體在濃縮溶液中高度穩定。
實例10. XB1511/D8及XB2202/A4 IgG1抗體之熱穩定性
使用基於螢光之分析測定XB1511/D8及XB2202/A4 IgG1抗體之熱穩定性。特定言之，使5mg/ml純化之XB1511/D8 IgG1、XB2202/A4 IgG1或人類IgG1對照物與Sypro橙色染料(Sigma)混合，且將混合物溫度以1度增量自25℃提高至95℃。當溫度提高且IgG展開時將Sypro橙色染料併入IgG中。使用BioRad CFX96儀器來監測Sypro橙色染料與IgG締合所產生之螢光信號。在此分析中，將Sypro橙色信號之負回歸(negative regression)用以識別各蛋白質之峰值熔融(亦即Tm)點。
自此分析確定XB1511/D8及XB2202/A4之熔融溫度(Tm)分別為67℃至70℃。將此與Tm為72℃之人類IgG1對照抗體充分比較。此資料證明本發明之VH及VH/VL對能夠設計成高度熱穩定性全長IgG分子之形式。
實例11. XB2202 VH、scFv及IgG1抗體對人類之結合親和力
使用表面電漿子共振在Biacore T100上測定XB2202 VH域、XB2202/A4 scFv及XB2202/A4 IgG1對人類PDFGR之結合動力學。簡言之，將重組人類PDGFR-hIgG1-Fc嵌合融合蛋白(R&D,#385-PR-100/CF)固定於與抗hIgG1 Fc單株抗體(對於VH及ScFv分析)或抗6His抗體(對於IgG分析)偶合之Series CM5感測晶片上。使XB2202 VH域、XB2202/A4 scFv及XB2202/A4 IgG1在50μl/min或100μl/min下以不同濃度(75nM、50nM、25nM、10nM、5nM及1nM)在表面上方流動3分鐘且允許解離
10分鐘。使用Biacore T100分析軟體使用1：1模型來分析資料。檢查質量輸送且使其避免以允許精確量測。所有資料均根據Biacore標準協定加以雙重參考。
本文表9中展示XB2202 VH域、XB2202/A4 scFv及XB2202/A4 IgG1抗體對人類PDGFRβ之結合動力學。此等資料顯示XB2202 VH域、XB2202/A4 scFv及XB2202/A4 IgG1各自對PDGFRβ具有高結合親和力。尤其請注意，與單獨之不成對XB2202 VH域之脫附速率(2.95×10-3 s-1)相比，XB2202/A4 scFv及XB2202/A4 IgG1顯示改良之脫附速率(分別為1.54×10-3 s-1及1.56×10-3 s-1)。
實例12. 使用活體內小鼠模型進行抗PDGFRβ抗體之功能分析
使用Nobuo等人，Am.J.Path,(2006)168(6),2036-2052(以全文引用的方式併入本文中)中所述的在發展中之視網膜血管結構模型、角膜新血管生成模型及/或脈絡膜新血管生成模型來評估本文揭示之抗PDGFRβ抗體活體內抑制PDGF誘導性血管化之能力。在此等分析中，以VH域、scFv及/或全長IgG之形式向小鼠投與抗體。
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：F7
<400> 168
<210> 169
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：B7
<400> 169
<210> 170
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：G9
<400> 170
<210> 171
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：A9
<400> 171
<210> 172
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：A11
<400> 172
<210> 173
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：E12
<400> 173
<210> 174
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：H7
<400> 174
<210> 175
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：A10
<400> 175
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：C11
<400> 176
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：D10
<400> 177
<210> 178
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：D12
<400> 178
<210> 179
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：C7
<400> 179
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：D7
<400> 180
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：C9
<400> 181
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：C12
<400> 182
<210> 183
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：D8
<400> 183
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：D9
<400> 184
<210> 185
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：G7
<400> 185
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：G11
<400> 186
<210> 187
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：F9
<400> 187
<210> 188
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：E9
<400> 188
<210> 189
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：B1
<400> 189
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：E6
<400> 190
<210> 191
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：F3
<400> 191
<210> 192
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：H4
<400> 192
<210> 193
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：H5
<400> 193
<210> 194
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：B5
<400> 194
<210> 195
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：G6
<400> 195
<210> 196
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：C1
<400> 196
<210> 197
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：F1
<400> 197
<210> 198
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：A3
<400> 198
<210> 199
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：B4
<400> 199
<210> 200
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：B6
<400> 200
<210> 201
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：P2
<400> 201
<210> 202
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：D3
<400> 202
<210> 203
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：G2
<400> 203
<210> 204
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：A4
<400> 204
<210> 205
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：G4
<400> 205
<210> 206
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：D5
<400> 206
<210> 207
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：A1
<400> 207
<210> 208
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：H2
<400> 208
<210> 209
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：E2
<400> 209
<210> 210
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：F4
<400> 210
<210> 211
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：C5
<400> 211
<210> 212
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：E5
<400> 212
<210> 213
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：F6
<400> 213
<210> 214
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：G5
<400> 214
<210> 215
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：A5
<400> 215
<210> 216
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：D6
<400> 216
<210> 217
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：E4
<400> 217
<210> 218
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：F5
<400> 218
<210> 219
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：G1
<400> 219
<210> 220
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：E3
<400> 220
<210> 221
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：A2
<400> 221
<210> 222
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：D1
<400> 222
<210> 223
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：C4
<400> 223
<210> 224
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：E1
<400> 224
<210> 225
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：A6
<400> 225
<210> 226
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：H1
<400> 226
<210> 227
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：B2
<400> 227
<210> 228
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：C2
<400> 228
<210> 229
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：G3
<400> 229
<210> 230
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：H3
<400> 230
<210> 231
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：D4
<400> 231
<210> 232
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：C6
<400> 232
<210> 233
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：B10
<400> 233
<210> 234
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：H10
<400> 234
<210> 235
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：F10
<400> 235
<210> 236
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：B12
<400> 236
<210> 237
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：B11
<400> 237
<210> 238
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：E7
<400> 238
<210> 239
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：E8
<400> 239
<210> 240
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：H8
<400> 240
<210> 241
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：H12
<400> 241
<210> 242
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：F8
<400> 242
<210> 243
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：D11
<400> 243
<210> 244
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：G8
<400> 244
<210> 245
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：H9
<400> 245
<210> 246
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：H11
<400> 246
<210> 247
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：G12
<400> 247
<210> 248
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：E11
<400> 248
<210> 249
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：F12
<400> 249
<210> 250
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：C8
<400> 250
<210> 251
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：A8
<400> 251
<210> 252
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：B8
<400> 252
<210> 253
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：F7
<220>
<221> 其它特徵
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<400> 253
<210> 254
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：B7
<400> 254
<210> 255
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：G9
<400> 255
<210> 256
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：A9
<400> 256
<210> 257
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：A11
<400> 257
<210> 258
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：E12
<400> 258
<210> 259
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：H7
<400> 259
<210> 260
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：A10
<400> 260
<210> 261
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：C11
<400> 261
<210> 262
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：D10
<400> 262
<210> 263
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：D12
<400> 263
<210> 264
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：C7
<400> 264
<210> 265
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：D7
<400> 265
<210> 266
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：C9
<400> 266
<210> 267
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：C12
<400> 267
<210> 268
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：D8
<400> 268
<210> 269
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：D9
<400> 269
<210> 270
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：G7
<400> 270
<210> 271
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：G11
<400> 271
<210> 272
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：F9
<400> 272
<210> 273
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：E9
<400> 273
<210> 274
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：B1
<400> 274
<210> 275
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：E6
<400> 275
<210> 276
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈CDR，純系：F3
<400> 276
<210> 277
<211> 11
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：F12
<400> 385
<210> 386
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：C8
<400> 386
<210> 387
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：A8
<400> 387
<210> 388
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：B8
<400> 388
<210> 389
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：F7
<220>
<221> 其它特徵
<222> (27)..(27)
<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<400> 389
<210> 390
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：B7
<400> 390
<210> 391
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：G9
<400> 391
<210> 392
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：A9
<400> 392
<210> 393
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：A11
<400> 393
<210> 394
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：E12
<400> 394
<210> 395
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：H7
<400> 395
<210> 396
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：A10
<400> 396
<210> 397
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：C11
<400> 397
<210> 398
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：D10
<400> 398
<210> 399
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：D12
<400> 399
<210> 400
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：C7
<400> 400
<210> 401
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：D7
<400> 401
<210> 402
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：C9
<220>
<221> 其它特徵
<222> (75)..(75)
<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<400> 402
<210> 403
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：C12
<400> 403
<210> 404
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：D8
<400> 404
<210> 405
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：D9
<400> 405
<210> 406
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：G7
<400> 406
<210> 407
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：G11
<400> 407
<210> 408
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：F9
<400> 408
<210> 409
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：E9
<400> 409
<210> 410
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：B1
<400> 410
<210> 411
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：E6
<400> 411
<210> 412
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：F3
<400> 412
<210> 413
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：H4
<400> 413
<210> 414
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：H5
<400> 414
<210> 415
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：B5
<400> 415
<210> 416
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：G6
<220>
<221> 其它特徵
<222> (75)..(75)
<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<220>
<221> 其它特徵
<222> (78)..(78)
<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<220>
<221> 其它特徵
<222> (104)..(104)
<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<400> 416
<210> 417
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：C1
<400> 417
<210> 418
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：F1
<220>
<221> 其它特徵
<222> (38)..(38)
<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<220>
<221> 其它特徵
<222> (45)..(45)
<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<220>
<221> 其它特徵
<222> (61)..(61)
<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<220>
<221> 其它特徵
<222> (65)..(65)
<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<220>
<221> 其它特徵
<222> (82)..(82)
<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<400> 418
<210> 419
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：A3
<400> 419
<210> 420
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：B4
<400> 420
<210> 421
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：B6
<400> 421
<210> 422
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：F2
<400> 422
<210> 423
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：D3
<400> 423
<210> 424
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：G2
<400> 424
<210> 425
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：A4
<400> 425
<210> 426
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：G4
<220>
<221> 其它特徵
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<220>
<221> 其它特徵
<222> (79)..(79)
<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<400> 426
<210> 427
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：D5
<400> 427
<210> 428
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：A1
<400> 428
<210> 429
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：H2
<400> 429
<210> 430
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：E2
<220>
<221> 其它特徵
<222> (11)..(11)
<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<400> 430
<210> 431
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：F4
<400> 431
<210> 432
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：C5
<400> 432
<210> 433
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：E5
<400> 433
<210> 434
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：F6
<400> 434
<210> 435
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：G5
<400> 435
<210> 436
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：A5
<400> 436
<210> 437
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：D6
<400> 437
<210> 438
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：E4
<400> 438
<210> 439
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：F5
<400> 439
<210> 440
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：G1
<400> 440
<210> 441
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：E3
<400> 441
<210> 442
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：A2
<400> 442
<210> 443
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：D1
<400> 443
<210> 444
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：C4
<400> 444
<210> 445
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：E1
<400> 445
<210> 446
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：A6
<400> 446
<210> 447
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：H1
<400> 447
<210> 448
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：B2
<400> 448
<210> 449
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：C2
<400> 449
<210> 450
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：G3
<400> 450
<210> 451
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：H3
<400> 451
<210> 452
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：D4
<400> 452
<210> 453
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成輕鏈，純系：C6
<400> 453
<210> 454
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：FR3反義
<400> 454
<210> 455
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：VH1a
<400> 455
<210> 456
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：VH1b
<400> 456
<210> 457
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：VH1c
<400> 457
<210> 458
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：VH1d
<400> 458
<210> 459
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：VH2
<400> 459
<210> 460
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：VH3a
<400> 460
<210> 461
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：VH3b
<400> 461
<210> 462
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：VH3c
<400> 462
<210> 463
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：VH4a
<400> 463
<210> 464
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：VH4b
<400> 464
<210> 465
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：VH5
<400> 465
<210> 466
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：VH6
<400> 466
<210> 467
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：VH7
<400> 467
<210> 468
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：T7TMVUTR
<400> 468
<210> 469
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：XB1511 FR3CDR3FR4反義
<400> 469
<210> 470
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：FR4 Cu3反義
<400> 470
<210> 471
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：Y109
<400> 471
<210> 472
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：Ck1
<400> 472
<210> 473
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：C11
<400> 473
<210> 474
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：Ck2
<400> 474
<210> 475
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：J11-3Ck2
<400> 475
<210> 476
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：J17Ck2
<400> 476
<210> 477
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：T7TMVUTR
<400> 477
<210> 478
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：UTRVk1a
<400> 478
<210> 479
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：UTRVk1b
<400> 479
<210> 480
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：UTRVk1c
<400> 480
<210> 481
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：UTRVk1d
<400> 481
<210> 482
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：UTRVk2a
<400> 482
<210> 483
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：UTRVk2b
<400> 483
<210> 484
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：UTRVk3a
<400> 484
<210> 485
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：UTRVk3b
<400> 485
<210> 486
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：UTRVk3c
<400> 486
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<220>
<223> 合成寡核苷酸：UTRVk4a
<400> 487
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<220>
<223> 合成寡核苷酸：UTRVk6a
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<220>
<223> 合成寡核苷酸：UTRVL1a
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<223> 合成寡核苷酸：UTRVL1b
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
<223> 合成寡核苷酸：UTRVL3a
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<220>
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<220>
<223> 合成寡核苷酸：UTRVL3c
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<220>
<223> 合成寡核苷酸：UTRVL3d
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
<223> 合成寡核苷酸：UTRVL5
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸：UTRVL6
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：UTRVL7
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<220>
<223> 合成寡核苷酸：UTRVL8
<400> 502
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：UTRVL4/9
<400> 503
<210> 504
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸：UTRVL10
<400> 504
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<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗體鏈：XB1511 IgG1
<400> 505
<210> 506
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗體鏈：D8 Ckappa
<400> 506
<210> 507
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗體鏈：XB2202 IgG1
<400> 507
<210> 508
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗體鏈：A4 Ckappa
<400> 508
Claims (5)
- 一種不成對VH域之多樣庫，其中該多樣庫之各成員結合於人類PDGFRβ，且包含含有CDR3、CDR2及CDR1的VH域，且其中：該CDR3包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列；該CDR2包含選自由SEQ ID NO：2-32組成之群的胺基酸序列；及該CDR1包含選自由SEQ ID NO：33-62組成之群的胺基酸序列。
- 一種穩定VH/VL對之多樣庫，其中該多樣庫之各成員結合於人類PDGFRβ，且包含VH域及VL域，各VH域包含CDR3、CDR2及CDR1，且其中：該CDR3包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列；該CDR2包含選自由SEQ ID NO：2-32組成之群的胺基酸序列；及該CDR1包含選自由SEQ ID NO：33-62組成之群的胺基酸序列。
- 如請求項2之多樣庫，其中該等VL域為人類VL域。
- 如請求項1至3中任一項之多樣庫，其中該多樣庫為核酸呈現多樣庫。
- 如請求項4之多樣庫，其中該核酸呈現多樣庫為DNA呈現多樣庫。
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