ES2280131T3 - Fusiones de adn-proteina y utilizaciones de las mismas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para generar una fusión de ADN-proteína, comprendiendo dicho procedimiento: (a) entrecruzar un cebador de ácidos nucleicos con una molécula de ARN, encontrándose dicho cebador unido a un péptido aceptor; (b) traducir dicho ARN para producir un producto proteína, encontrándose dicho producto proteína unido covalentemente a dicho cebador de ácidos nucleicos, y (c) transcribir inversamente dicho ARN a partir de dicho cebador de ácidos nucleicos para producir una fusión de ADN-proteína.
Description
Fusiones de ADN-proteína y
utilizaciones de las mismas.
En general, la invención se refiere a fusiones
de ADN-proteína y a sus utilizaciones,
particularmente para la selección de proteínas deseadas y sus
secuencias de ácidos nucleicos correspondientes.
Recientemente se ha desarrollado un
procedimiento combinatorio para aislar proteínas con propiedades
deseadas a partir de grupos grandes de proteínas (Szostak et
al., patente U.S.S.N. 09/007.005; Szostak et al.,
documento WO nº 98/31700; Roberts y Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 94:12297-12302, 1997). Mediante este
procedimiento, se une la parte proteica a su ARN codificante a
través de un enlace covalente químico. Debido a la naturaleza
covalente de este enlace, los experimentos de selección no se
encuentran limitados a las condiciones de reacción extremadamente
suaves que deben utilizarse en los enfoques que implican la
formación de complejos no covalentes, tales como la expresión
ribosómica (Hanes y Plückthun, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
94:4937-4942, 1997; He y Taussig, Nucl. Acids Res.
25:5132-5143, 1997). Sin embargo, deben adoptarse
precauciones durante el procedimiento de selección para minimizar
la degradación del ARN, debido a que el corte accidental de los
enlaces ribonucleótidos pueden resultar en la pérdida irreversible
de la información codificada. Por ello, estos procedimientos de
selección se llevan a cabo típicamente utilizando medios de reacción
y equipos libres de ribonucleasas y otros contaminantes
deletéreos.
La presente invención proporciona procedimientos
para etiquetar proteínas covalentemente con sus secuencias de ADN
codificante. Estas fusiones de ADN-proteína, que
pueden utilizarse en técnicas de evolución y reconocimiento
moleculares, son químicamente más estables que las fusiones de
ARN-proteína y por lo tanto proporcionan varias
ventajas (tal como se comenta con mayor detalle a continuación).
De acuerdo con lo expuesto anteriormente, en
general, la invención proporciona procedimientos para generar
fusiones de ADN-proteína. Un primer procedimiento
implica: (a) entrecruzar un cebador de ácidos nucleicos a una
molécula de ARN (preferentemente en el extremo 3'del ARN o próximo
al mismo), estando unido el cebador a un péptido aceptor (por
ejemplo puromicina); (b) traducir el ARN para producir un producto
proteína, encontrándose el producto proteína unido covalentemente
al cebador de ácidos nucleicos; y (c) transcribir inversamente el
ARN a partir de dicho cebador de ácidos nucleicos para producir una
fusión de ADN-proteína.
Un segundo procedimiento implica: (a) generar
una fusión de ARN-proteína; (b) hibridar un cebador
de ácidos nucleicos a la fusión (preferentemente en el extremo 3'del
ARN o próximo al mismo); y (c) entrecruzar dicho cebador de ácidos
nucleicos con dicha fusión; y (d) transcribir inversamente el ARN de
dicha fusión de ARN-proteína a partir de dicho
cebador de ácidos nucleicos para producir una fusión de
ADN-proteína.
En una forma de realización preferida de los
procedimientos indicados anteriormente, el procedimiento puede
implicar además tratar el producto de la etapa (c) y de la etapa
(d), respectivamente, para eliminar el ARN (por ejemplo poniendo en
contacto el producto de la etapa (c) y de la etapa (d),
respectivamente, con ARNasa H bajo condiciones suficientes para
digerir el ARN). En otras formas de realización preferidas, el
cebador de ácidos nucleicos es un cebador de ADN; la etapa de
traducción se lleva a cabo in vitro; y el cebador de ácidos
nucleicos presenta una estructura de horquilla. Además, el cebador
puede incluir además un agente fotoentrecruzante, tal como el
soralén, y el cebador puede entrecruzarse con un oligonucleótido que
se encuentre unido a un péptido aceptor o, alternativamente, puede
hibridarse con la molécula de ARN, seguido de una etapa de unión que
se lleva a cabo mediante fotoentre-
cruzamiento.
cruzamiento.
En aspectos relacionados, la invención también
se refiere a una molécula que incluye un ADN unido covalentemente a
una proteína (preferentemente de por lo menos 10 aminoácidos) a
través de un péptido aceptor (por ejemplo puromicina), así como una
molécula que incluye un ADN unido covalentemente a una proteína, en
la que la proteína incluye por lo menos 10 aminoácidos.
En formas de realización preferidas de ambos
aspectos, la proteína incluye por lo menos 30 aminoácidos, más
preferentemente por lo menos 100 aminoácidos y puede incluir incluso
por lo menos 200 ó 250 aminoácidos. En otras formas de realización
preferidas, la proteína se encuentra codificada por el ADN y
preferentemente se encuentra codificada completamente por el ADN;
la molécula incluye además un ácido ribonucleico unido
covalentemente al ADN; la proteína se encuentra codificada por el
ácido ribonucleico; y el ADN es de doble cadena.
En otro aspecto relacionado, la invención se
refiere a una población de por lo menos 10^{5}, y preferentemente
de por lo menos 10^{14}, fusiones de ADN-proteína
de la invención, incluyendo cada fusión un ADN unido covalentemente
a una proteína.
Además, la invención se refiere a procedimientos
de selección que utilizan las fusiones de
ADN-proteína indicadas en la presente memoria. Un
primer procedimiento de selección implica las etapas de: (a)
proporcionar una población de fusiones de
ADN-proteína, incluyendo cada una un ADN unido
covalentemente a una proteína candidata, en la que dicha proteína
se encuentra codificada por dicho ADN unido covalentemente, y (b)
seleccionar una fusión deseada de ADN-proteína,
seleccionando de esta manera la proteína o ADN deseados.
Un segundo procedimiento de selección implica
las etapas de: (a) producir una población de fusiones candidatas de
ADN-proteína, incluyendo cada una un ADN unido
covalentemente a una proteína candidata y que presentan una
secuencia codificante de proteína candidata que difiere de una
secuencia codificante de proteína de referencia; y (b) seleccionar
una fusión de ADN-proteína que presenta una función
alterada, seleccionando de esta manera la proteína que presenta la
función alterada o su ADN codificante.
En las formas de realización preferidas, la
etapa de selección implica la unión de la proteína deseada a una
pareja de unión inmovilizada o realizar un ensayo para una actividad
funcional de la proteína deseada. Además, el procedimiento puede
implicar además repetir las etapas (a) y (b).
En un aspecto final, la invención se refiere a
un soporte sólido que incluye una matriz de moléculas inmovilizadas,
incluyendo cada una fusión covalentemente unida de
ADN-proteína de la invención. En una forma de
realización preferida, el soporte sólido es un microchip.
Tal como se utiliza en la presente invención,
"población" se refiere a 10^{5} o más moléculas (por ejemplo
moléculas de fusión de ADN-proteína). Debido a que
los procedimientos de la invención facilitan las selecciones que
parten, si se desea, de un gran número de moléculas candidatas, una
"población" según la invención se refiere preferentemente a un
número superior a 10^{7} moléculas, más preferentemente a más de
10^{9}, 10^{13}, o 10^{14} moléculas, y todavía más
preferentemente, a más de 10^{15} moléculas.
El término "selección" se refiere a la
separación sustancial de una molécula de entre otras moléculas en
una población. Tal como se utiliza en la presente memoria, una
etapa de "selección" proporciona un enriquecimiento de por lo
menos 2 veces, preferentemente de 30 veces, más preferentemente de
100 veces, y todavía más preferentemente, de 1.000 veces, de una
molécula deseada respecto a moléculas no deseadas en una población
tras la etapa de selección. Puede repetirse una etapa de selección
cualquier número de veces, y pueden combinarse diferentes tipos de
etapas de selección en un enfoque dado.
El término "proteína" se refiere a dos o
más cualesquiera aminoácidos naturales o modificados unidos por uno
o más enlaces peptídicos. Los términos "proteína" y
"péptido" se utilizan intercambiablemente en la presente
memoria.
El término "ARN" se refiere a una secuencia
de dos o más ribonucleótidos naturales o modificados unidos
covalentemente. Un ejemplo de un ARN modificado comprendido dentro
de este término es el ARN fosforotioato.
El término "ADN" se refiere a una secuencia
de dos o más desoxirribonucleótidos naturales o modificados unidos
covalentemente.
La expresión "ácido nucleico" se refiere a
dos o más nucleótidos o análogos o derivados de nucleótidos unidos
covalentemente. Tal como se utiliza en la presente memoria, este
término incluye, sin limitación, ADN, ARN y PNA.
La expresión "péptido aceptor" se refiere a
cualquier molécula capaz de añadirse al extremo
C-terminal de una cadena de proteína en crecimiento
mediante la actividad catalítica de la función peptidil transferasa
ribosómica. Típicamente estas moléculas contienen: (i) un nucleótido
o grupo similar a nucleótido (por ejemplo adenosina o un análogo de
adenosina (la dimetilación en la posición amino N-6
resulta aceptable)), (ii) un aminoácido o grupo similar a
aminoácido (por ejemplo cualquiera de los 20
D-aminoácidos o L-aminoácidos o
cualquier análogo aminoácido de los mismos (por ejemplo la
O-metil-tirosina o cualquiera de los
análogos indicados por Ellman et al., Enzymol. 202:301,
1991), y (iii) un enlace entre los dos (por ejemplo un enlace éster,
amida o cetona en la posición 3'o, menos preferentemente, en la
posición 2'); preferentemente este enlace no altera
significativamente el plegamiento del anillo respecto a la
conformación natural del ribonucleótido. Los péptidos aceptores
también pueden poseer un nucleófilo, que puede ser, sin limitación,
un grupo amino, un grupo hidroxilo, o un grupo sulfhidrilo. Además,
los aceptores péptidos pueden estar compuestos de miméticos de
nucleótidos, miméticos de aminoácidos, o miméticos de la estructura
combinada nucleótido-aminoácido.
La expresión "función alterada" se refiere
a cualquier cambio cualitativo o cuantitativo en la función de una
molécula.
La expresión "pareja de unión", tal como se
utiliza en la presente memoria, se refiere a cualquier molécula que
presenta una afinidad específica, covalente o no covalente, por una
parte de una fusión ADN-proteína deseada. Entre los
ejemplos de parejas de unión se incluyen, sin limitación, miembros
de las parejas de antígeno/anticuerpo, las parejas de
proteína/inhibidor, las parejas de receptor/ligando (por ejemplo los
pares de receptor de superficie celular/ligando, tales como los
pares de receptor de hormona/hormona péptido), pares de
enzima/sustrato (por ejemplo pares de quinasa/sustrato), pares de
lectina/carbohidrato, agregados de proteínas oligoméricas o
heterooligoméricas, pares de proteína de unión a ADN/sitio de unión
a ADN, pares de ARN/proteína, y dúplex de ácidos nucleicos,
heterodúplex o cadenas ligadas, así como cualquier molécula capaz de
formar uno o más enlaces covalentes (por ejemplo enlaces disulfuro)
con cualquier parte de una fusión de
ADN-proteína.
La expresión "soporte sólido" se refiere,
sin limitación, a cualquier columna (o material de columna), perla,
probeta, placa de microtitulación, partícula sólida (por ejemplo de
agarosa o de sefarosa), microchip (por ejemplo de silicio, de
vidrio silicio, o chip de oro), o membrana (por ejemplo, la membrana
de un liposoma o vesícula) al que puede unirse un complejo de
afinidad, directa o indirectamente (por ejemplo a través de otros
intermediarios parejas de unión, tales como otros anticuerpos o
proteína A), o en los que puede insertarse un complejo de afinidad
(por ejemplo mediante un receptor o canal).
La presente invención proporciona procedimientos
para la creación de fusiones entre proteínas y sus ADNc
codificantes. Estos constructos poseen una estabilidad química muy
incrementada, en primer debido al componente ADN de la fusión y, en
segundo lugar, debido a la unión mediante enlace covalente de los
grupos de ADN y de proteína. Estas proteínas permiten una
manipulación más sencilla de los productos de fusión y de esta
manera permiten llevar a cabo experimentos de selección y de
reconocimiento bajo un intervalo de condiciones de reacción.
Además, la presente invención facilita las aplicaciones en las que
resulta necesaria una parte de ácido nucleico monocatenario, por
ejemplo en ensayos de hibridación en los que las fusiones
codificantes se inmovilizan en un soporte sólido. Además, las
incubaciones pueden llevarse a cabo bajo condiciones más rigurosas,
implicando un pH elevado, concentraciones elevadas de iones
metálicos multivalentes, tratamiento de calor prolongado, y
exposición a diversos materiales biológicos. Finalmente, el ADN
monocatenario es relativamente resistente a la formación de
estructura secundaria, proporcionando una gran ventaja para las
técnicas que implican o requieren etapas de hibridación de
ácidos
nucleico.
nucleico.
Además, los procedimientos de la presente
invención permiten producir fusiones que implican componentes ADN y
proteína de cualquier longitud, así como bibliotecas de fusión de
elevada complejidad.
Se pondrán de manifiesto otras características y
ventajas de la invención a partir de la descripción detallada
siguiente, y de las reivindicaciones.
La figura 1 es una ilustración esquemática de un
procedimiento para la generación de fusiones de
ADN-proteína (tipo A1) que implican la ligación de
una estructura similar a una horquilla de ADN modificada con
puromicina, a una molécula de ARNm.
La figura 2 es una ilustración esquemática de un
procedimiento para la generación de estructuras de horquilla
ramificadas.
La figura 3 es una ilustración esquemática de un
procedimiento para la síntesis de
puromicín-5'-fosforamidita.
La figura 4 es una ilustración esquemática de un
procedimiento para la generación de estructuras de horquilla
ramificadas.
La figura 5 es una ilustración esquemática de un
procedimiento para la generación de fusiones de
ADN-proteína que implican el fotoentrecruzamiento de
un cebador de ADN modificado con 5'-soralén a un
ligador adecuado que porta una 3'-puromicina.
La figura 6 es una ilustración esquemática de
procedimientos ejemplares para la ligación química de moléculas de
ARNm y ADN.
La figura 7 es una ilustración esquemática de un
procedimiento para la síntesis de hidrazida fosforamidita.
La figura 8 es una ilustración esquemática de un
procedimiento para la síntesis de hidrazina fosforamidita.
La figura 9 es una ilustración esquemática de un
procedimiento para la generación de fusiones de
ADN-proteína que implica el entrecruzamiento químico
de un ligador modificado con puromicina al extremo 3'de una molécula
de ARNm.
La figura 10 es una ilustración esquemática de
un procedimiento para la generación de fusiones de
ADN-proteína que implica el fotoentrecruzamiento
mediado por soralén de un constructo combinado de ligador/cebador de
transcripción inversa con el extremo 3'de una molécula de ARNm.
La figura 11 es una ilustración esquemática de
un procedimiento alternativo para la generación de fusiones de
ADN-proteína que implican el fotoentrecruzamiento
con soralén de un constructo combinado de ligador/cebador de
transcripción inversa.
La figura 12 es una ilustración esquemática de
un procedimiento para la generación de fusiones de
ADN-proteína que implica el entrecruzamiento de un
cebador de transcripción inversa con un constructo preexistente de
ARNm-ligador.
\newpage
La figura 13 es una ilustración esquemática de
un procedimiento para la generación de fusiones de
ADN-proteína que implica el entrecruzamiento de un
cebador de transcripción inversa con una fusión preexistente de
ARNm-proteína.
La figura 14 es una ilustración esquemática de
los constructos oligonucleótidos (SEC ID nº 1 a 6) utilizados para
la preparación de las fusiones ejemplares de
ADN-proteína indicadas en la presente memoria.
La figura 15 es una ilustración esquemática de
la preparación de fusiones de ADN-proteína de tipo
C2.
La figura 16 es una fotografía que ilustra un
análisis de producto de las fusiones de ADN-proteína
de tipo C2.
La figura 17 es una ilustración esquemática de
la preparación de fusiones de ADN-proteína de tipo
B3.
La figura 18 es una ilustración esquemática de
la preparación de fusiones de ADN-proteína de tipo
B2
La figura 19 es una fotografía que ilustra el
análisis de resistencia de las fusiones de
ADN-proteína de tipo B3 contra el tratamiento con
nucleasa y con base.
La figura 20 es un gráfico que ilustra las
semividas determinadas experimentalmente de los productos de fusión
de ARN-proteína y ADN-proteína en
presencia de preparaciones de membrana celular.
A continuación, se proporcionan varias técnicas
ejemplares para la producción de fusiones de
ADN-proteína, y descripciones para su utilización.
Estos ejemplos se proporcionan a título ilustrativo no limitativo de
la invención.
Tipo
A1
Según un primer enfoque ejemplificativo, las
fusiones de ADN-proteína se generan ligando una
estructura similar a horquilla de ADN modificada con puromicina a
una molécula de ARNm, tal como se ilustra en la figura 1. La
primera etapa de este procedimiento es la unión de la puromicina a
la horquilla, y esto puede conseguirse mediante varias técnicas,
una de las cuales se muestra en la figura 2. Mediante este enfoque,
se sintetiza una horquilla de ADN con una cadena lateral terminada
en puromicina que se ramifica desde la molécula de ADN. Este
constructo puede generarse utilizando una fosforamidita ramificada
asimétrica (Clontech, Palo Alto, CA) en cualquier síntesis
automatizada estándar de ADN de la estructura de horquilla (ver, por
ejemplo, User Guide to Expedite Nucleic Acid Synthesis System,
Perseptive Biosystems, Framingham, MA), seguido de la adición de un
5'-fosfato utilizando un reactivo de fosforilación
química (Glen Research, Sterling VA).
Posteriormente, se elimina selectivamente el
grupo protector de la rama (Product Protocol for Asymmetric
Branching Phosphoramidite, Clontech, Palo Alto, CA), seguido de la
unión de la parte ligador mediante la síntesis automatizada
estándar de ADN. Antes de alcanzar el final del ligador, se invierte
la orientación de la cadena mediante la adición de varias
5'-fosforamiditas (Glen Research, Sterling, VA).
Finalmente, la síntesis se termina mediante la unión de
puromicín-5'-fosforamidita,
preferentemente utilizando la técnica de síntesis mostrada en la
figura 3. En la figura 3, pueden llevarse a cabo las etapas (a)-(c)
tal como se describe en Greene & Wuts (Protective Groups in
Organic Synthetic, 2a edición, John Wiley & Sons, Inc., New
York, New York, 1991), y la etapa (d) puede llevarse a cabo tal
como se describe en Beaucage (Methods in Molecular Biology, vol. 20,
Protocols for Oligonucleotides and Analogs, editor S. Agarwal,
Humana Press, Totowa, N.J. páginas 33 a 61, 1993).
Alternativamente, la horquilla ramificada
modificada con puromicina puede sintetizarse tal como se muestra en
la figura 4. Mediante esta técnica, se inicia la síntesis a partir
de un soporte sólido de puromicina-CPG (Glen
Research, Sterling, VA) sintetizando en primer lugar la parte
ligador, seguido de la incorporación de la amidita ramificada
(Clontech, Palo Alto, CA) y la adición de la parte 5'de la
horquilla. Tras la desprotección de la rama, se añade el brazo 3'de
la horquilla mediante la utilización de
nucleósido-5'-fosforamiditas (Glen
Research, STerling, VA).
Mediante cualquiera de los enfoques anteriores,
en la etapa siguiente el ARNm se liga a la horquilla, por ejemplo
utilizando ADN ligasa de T4 y el extremo protuberante 3'como molde
(Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989). A
continuación, la traducción ribosómica del ARN conduce a la
síntesis de proteína con la posterior formación de fusión (ver, por
ejemplo, Szostak et al., patente U.S.S.N. 09/007.005 y nº
09/247.190; Szostak et al., documento WO nº 98/31700;
Roberts y Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
94:12297-12302, 1997). En una forma de realización
particular, el punto de ramificación se encuentra situado en la
región de bucle de la horquilla. También pueden utilizarse otras
posiciones para el punto de ramificación (por ejemplo dentro de la
estructura de la cadena principal). Además, aunque se utiliza un
ligador dAn de entre aproximadamente 10 y 60 nucleótidos, y más
preferentemente de aproximadamente 30 nucleótidos, pueden
optimizarse tanto la longitud como la composición química (por
ejemplo PEG (Glen Research, Sterling, VA) en lugar de dAn) del
ligador.
En una etapa final, la parte ARN del constructo
se transcribe inversamente formando ADNc (por ejemplo tal como se
describe en Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)
utilizando el extremo 3'de la horquilla como cebador. La digestión
opcional del ARNm con ARNasa H (ver, por ejemplo, Sambrook, Fritsch
y Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, New York, 1989) proporciona una fusión de ADN
monocatenario-proteína.
Este procedimiento facilita asimismo la
formación de transcritos de ADN truncado mediante la adición de
didesoxinucleósido trifosfato durante la transcripción (ver, por
ejemplo, Sanger, Science 214:1205-1210, 1981). Estas
fusiones de ADN truncado-proteína resultan útiles
en experimentos de expresión de proteínas (Kumelis et al.,
patente U.S.S.N. 60/080.686, presentado el 3 de abril de 1998), por
ejemplo, en los que sólo la región 3'del mensaje original (ahora la
región 5'del transcrito del ADN) se utiliza para la hibridación con
sondas oligonucleótidas inmovilizadas.
Tipo
A2
Como alternativa al constructo similar a
horquilla descrito anteriormente, también puede prepararse una
estructura estrechamente relacionada mediante fotoentrecruzamiento
de un cebador de ADN modificado con soralén en el extremo 5'con un
ligador adecuado que porta una puromicina en el extremo 3'. Se
ilustra un procedimiento ejemplar de entrecruzamiento en la figura
5. En este procedimiento, puede construirse el ligador que porta
puromicina tal como se describe, por ejemplo, en Szostak et
al., patentes U.S.S.N. nº 09/007.005 y nº 09/247.190; Szostak
et al., patente WO nº 98/31700; Roberts
y Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
94:12297-12302, 1997). Puede generarse el cebador
modificado con soralén y la etapa de fotoentrecruzamiento llevarse a
cabo tal como se describe, por ejemplo, en Pieles & Englisch,
Nucl. Acids Res. 17:285-299, 1989. Las etapas
restantes pueden llevarse a cabo tal como se ha descrito
anteriormente. Este enfoque no requiere la utilización de
nucleósido/puromicín-5'-fosforamiditas
no estándares (es decir, que se utilizaron durante la síntesis
automatizada de la estructura de ligador en forma de horquilla),
proporcionando una ventaja respecto al procedimiento con horquilla.
Nuevamente, tal como anteriormente, aunque se utiliza un ligador dAn
de entre aproximadamente 10 y 60 nucleótidos, y más preferentemente
de aproximadamente 30 nucleótidos, puede optimizarse tanto la
longitud como la composición química (por ejemplo PEG (Glen
Research, Sterling, VA) y no dAn) del ligador.
Además, para cada uno de los procedimientos de
tipo A1 y de tipo A2, la reacción de ligación entre la parte ARNm y
la parte ADN del constructo puede llevarse a cabo mediante varias
técnicas alternativas. Por ejemplo, además de la ligación
enzimática con ADN ligasa de T4 descrita anteriormente, esta etapa
puede realizarse utilizando procedimientos químicos. En un ejemplo
particular, el extremo 5'de la horquilla puede modificarse con uno
(o múltiples) grupos amino utilizando la fosforamidita apropiada
(Clontech, Palo Alto, CA). Tras la oxidación con peryodato del
extremo 3'del ARN, los dos sustratos pueden unirse a través de una
reacción de aminación reductiva. Esto se ilustra en el esquema
"A" en la figura 6 y se describe, por ejemplo, en Lemaitre
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84:648-652, 1987. Alternativamente, esta etapa de
ligación química puede implicar estructuras modificadas con
carbohidrazida o con hidrazina para la formación de hidrazona o la
aminación reductiva. Estos enfoques se ilustran en la figura 6,
respectivamente, en los esquemas "B" y "C", y se
describen, respectivamente, en Gosh et al. (Anal. Biochem.
178:43-51, 1989) Proudnikov y Mirzabekov (Nucl.
Acids Res. 24:4535-4542, 1996). La síntesis de
hidrazina fosforamidita puede llevarse a cabo tal como se muestra en
la figura 7, y la síntesis de hidrazina fosforamidita, tal como se
muestra en la figura 8, y tal como se describe en Greene y Wuts
(Protective Groups in Organic Synthesis, 2a edición, John Wiley
& Sons, Inc., New York, New York, 1991 (etapas (a) y (c)),
Proudnikov y Mirzabekov (Methods in Molecular Biology, vol. 20,
Protocols for Oligonucleotides and Analogs, editor S. Agarwal,
Humana Press, Totowa, NJ, páginas 33-61, 1993, etapa
(e)).
Tipos
B1-B3
Todavía otro enfoque a la generación de fusiones
de ADN-proteína implica el entrecruzamiento químico
de un ligador modificado con puromicina con el extremo 3'de una
molécula de ARNm. Este entrecruzamiento puede conseguirse a través
de varios enfoques.
Se muestra esquemáticamente en la figura 9 un
enfoque ejemplar. En este enfoque ("B1"), se sintetiza un
oligonucleótido que porta un grupo reactivo (por ejemplo uno de los
derivados amino, hidrazidas o hidrazinas indicados anteriormente)
situadas entre las regiones de cebador y de ligador. La formación de
dúplex de ARN y sitio de cebador tiene lugar en posición
inmediatamente contigua a este grupo reactivo, que después se deja
reaccionar con el extremo 3'del ARN, que ha sido oxidado con
peryodato, conduciendo a un entrecruzamiento (tal como se muestra en
la figura 6 y tal como se ha descrito anteriormente). Esta reacción
puede producirse mediante aminación reductiva (figura 6, esquema
"A" o "C"; Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 84:648-652, 1987; Proudnikov y Mirzabekov,
Nucl. Acids Res. 24:4535-4542, 1996) o formación de
hidrazona (figura 6, esquema "B"; Gosh et al., Anal.
Biochem. 178:43-51, 1989). Tras la traducción y la
formación de fusión (Szostak et al., patentes U.S.S.N. nº
09/007.005 y nº 09/247.190; Szostak et al., patente WO nº
98/31700; Roberts y Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
94:12297-12302, 1997), el cebador se extiende con
transcriptasa inversa en el molde de ARN y se lleva a cabo una etapa
opcional de digestión con ARNasa H, generando la fusión de
ADN-proteína (figura 9).
Tal como en los procedimientos A1 y A2
anteriormente, se invierte la dirección de cadena de los nucleótidos
terminales de la parte ligador, que puede conseguirse mediante la
utilización de 5'-fosforamiditas (Glen Research,
Sterling, VA) durante la síntesis.
En todavía otro enfoque ejemplar de
entrecruzamiento ("B2"), se incluye un grupo soralén
fotorreactivo en el ligador como grupo reactivo (figura 10). Este
constructo puede sintetizarse utilizando una desoxinucleótido
fosforamidita modificada con soralén (Pieles et al., Nucleic
Acids Res. 17:8967-8978, 1989) o incorporando una
fosforamidita ramificada (Clontech, Palo Alto, CA) a la que se une
una fosforamidita soralén estándar (Glen Research, Sterling, VA).
Tras la hibridación del ligador con el ARN diana, se consigue la
formación de enlace cruzado mediante irradiación con luz UV, por
ejemplo tal como se describe en Pieles y Englisch (Nucl. Acids Res.
17:285-299, 1989). A continuación, el constructo
resultante se somete a traducción y formación de fusión (Szostak
et al., patentes U.S.S.N. nº 09/007.005 y nº 09/247.190;
Szostak et al., documento WO nº 98/31700; Roberts y Szostak,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302, 1997). La
transcripción inversa y digestión con ARNasa H producen las fusiones
de ADN-proteína finales.
Alternativamente, el entrecruzamiento puede
conseguirse utilizando un constructo combinado de ligador/cebador
de transcriptasa inversa, tal como se ilustra en la figura 11
("B3"). En una variante del enfoque anterior, el grupo soralén
no se une directamente entre el ligador y la región del cebador,
sino que se conecta a una rama corta de ADN. Esta parte de ADN
también se hibrida con el ARN diana y de esta manera proporciona un
ambiente de doble cadena optimizado para que reaccione el soralén
(Pieles y Englisch, Nucl. Acids Res. 17:285-299,
1989). La preparación de fusiones de ADN-proteína
utilizando este constructo de soralén pueden llevarse a cabo tal
como se ha descrito anteriormente.
Tipos C1 y
C2
En la figura 12 se muestra esquemáticamente otro
procedimiento para generar fusiones de ADN-proteína.
En este enfoque, se liga inicialmente ARN a una molécula de ligador,
tal como se ha descrito anteriormente (Szostak et al.,
patentes U.S.S.N nº 09/007.005 y nº 09/247.190; Szostak et
al., patente WO nº 98/31700; Roberts y Szostak, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 94:12297-12302, 1997). En una etapa
posterior, se hibrida un cebador adecuado que porta un reactivo de
fotoentrecruzamiento 5'(por ejemplo el soralén, Glen Research,
Sterling, VA) al producto de ARN-ligador. La
irradiación con luz proporciona un enlace covalente cruzado entre
las dos cadenas oligonucleótidas (tal como se describe, por ejemplo,
en Pieles y Englisch, Nucl. Acids Res. 17:285-299,
1989). Tal como en los procedimientos Tipo A1, A2 y
B1-B3 anteriores, puede llevarse a cabo la
traducción y la formación de fusión, seguido de una etapa de
transcripción inversa y una etapa opcional de digestión con ARNasa
H, proporcionando fusiones de ADN-proteína (figura
12).
Alternativamente, tal como se muestra en la
figura 13, las etapas iniciales del procedimiento anterior pueden
llevarse a cabo en el orden contrario. Este enfoque permite llevar a
cabo la traducción y formación de fusión previamente al
entrecruzamiento y a la transcripción inversa. De acuerdo con ello,
este procedimiento permite utilizar condiciones de reacción y
componentes previamente descritos y bien establecidos para la
traducción y la formación de fusión de
ARN-proteína.
Se llevaron a cabo técnicas ejemplares descritas
anteriormente para demostrar la formación de fusión de
ADN-proteína. Estos experimentos utilizaron los
oligonucleótidos ilustrados en la figura 14.
Los sustrato ARN modelos nº 1: GGG ACA AUU ACU
AUU UAC AAU UAC AAU GGA CUA CAA GGA CGA UGA CGA UAA GGG CGG CUG GUC
CCA CCC CCA GUU CGA GAA GGC AUC CGC U (SEC ID nº 7); nº 2: GGG ACA
AUU ACU AUU UAC AAU UAC AAU GGA CUA CAA GGA CGA UGA CGA UAA GGG CGG
CUG GUC CCA CCC CCA GUU CGA GAA GGC AUC CGC UCU UUC ACU AUA (SEC ID
nº 8); y nº 3: GGG ACA AUU ACU AUU UAC AAU UAC AAU GGA CUA CAA GGA
CGA UGA CGA UAA GGG CGG CUG GUC CCA CCC CCA GUU CGA GAA GGC AUC CGC
UAU UUA AAA AAA AAA AAA AAA AAA A (SEC ID nº 9) se sintetizaron
mediante transcripción de T7 (kit de transcripción MEGAshortscript,
Ambion, Austin, TX) utilizando moldes de ADNdc apropiados. Tras la
transcripción, los ARNs se purificaron mediante electroforesis en
gel de poliacrilamida desnaturalizante.
Los oligonucleótidos modificados nº 4:
5'pd(AAA AAA AAA ACG GCT ATA TAA AAA AAA
CC)-Pu (SEC ID nº 10); nº 5: 5'soralén
C2-TAG CCG TTT TTT TTT TAG CGG ATG C (SEC ID nº 11);
nº 6: 5'd(cgt agg cga gaa agt
gat)-ramificación[soralén
C6]-d(AAA AAA AAA AAA AA AAA AAA AAA AAA
CC)-Pu (SEC ID nº 12) y nº 7: 5'ggt caa gct
ctt-ramificación[5'-soralén
C6-TAG CGG ATG C 3']espaciador_{6}
CC-Pu (SEC ID nº 13) [[mayúsculas=ADN fosforamiditas
3'; minúsculas=ADN fosforamiditas 5';
espaciador=espaciador-9 fosforamidita;
Pu=puromicina-CPG (todos de Glen Research, Sterling,
VA); ramificación=amidita de ramificación asimétrica (Clontech,
Palo Alto, CA)] se sintetizaron en un aparato Expedite Synthesizer
Model 8909 (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) según los
protocolos recomendados para las fosforamiditas correspondientes.
Para los constructos ramificados 6 y 7, en primer lugar se sintetizó
la cadena principal y se concluyó con una etapa final de adición de
caperuza. A continuación, se eliminó el grupo protector levulinilo
de la unidad ramificada mediante tratamiento con hidrazina
monohidrato 0,5 M en piridina-ácido acético durante 15 minutos a
temperatura ambiente. A continuación, se reinició la síntesis
automatizada y se unieron las secuencias de cadena principal
(indicadas entre corchetes). Los oligos se desprotegieron
completamente en hidróxido amónico concentrado durante 8 horas a
55ºC y se purificaron mediante electroforesis en gel
desnaturalizante.
Las secuencias de ADN nº 8: d(TTT TTT TTT
TAG CGG ATG C) (SEC ID nº 14) y nº 9: d(TAA TAC GAC TCA CTA
TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT) (SEC ID nº 15) se obtuvieron de
Oligos etc (Wilsonville, OR) y se utilizaron sin purificación
adicional.
Se demostró la formación de fusión de
ADN-proteína tipo C2 de la manera siguiente (figura
15). Se hibridaron ARN 1 y ligador 4 con ADN molde 8 y se ligaron
enzimáticamente con ADN ligasa de T4, tal como se ha descrito
anteriormente (Szostak et al., patentes U.S.S.N. nº
09/007.005 y nº 09/247.190; Szostak et al., patente WO nº
98/31700; Roberts y Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
94:12297-12302, 1997). Tras la purificación mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante, el
constructo resultante de ARNm-ligador se utilizó
como molde para la traducción in vitro utilizando kits de
lisado de reticulocitos de conejo de Ambion. Las mezclas de reacción
contenían 50 pmoles de ARNm ligado 10, creatina fosfato 10 mM,
acetato de potasio 150 mM, cloruro de magnesio 0,5 mM, 0,1 mM de
cada aminoácido excepto metionina, 150 \muCi de
[^{35}S]-metionina (Amersham, Arlington Heights,
IL) y 67% v/v de lisado en un volumen total de 300 \mul y se
llevaron a cabo durante 30 minutos a 30ºC. Para estimular la
formación posterior de fusión, se añadieron KCl y MgCl_{2} hasta
concentraciones finales de 590 mM y 50 mM, respectivamente, en un
volumen de 500 \mul. Se continuó con la incubación durante 60
minutos a 20ºC. Los productos se aislaron diluyendo el lisado en 10
ml de tampón de unión (Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 10 mM, NaCl 1 M,
Triton-X-100 al 0,25% v/v) y
añadiendo 10 mg de oligo-dT celulosa tip7
(Pharmacia, Piscataway, NJ). Las muestras se centrifugaron durante
60 minutos a 4ºC, y seguidamente el soporte sólido se lavó a
continuación con 5 ml de tampón de unión helado carente de EDTA,
seguido de elución con alícuotas de 100 \mul de agua. Se encontró
producto de fusión en las fracciones 2 y 3, y estas fracciones se
agruparon. Se determinó el rendimiento total de fusión 11 mediante
contaje de centelleo de la [^{35}S]-metionina
incorporada en 1,6 pmoles (3,2% del ARN de entrada).
Para la conversión de las fusiones de
ARN-proteína 11 en fusiones de
ADN-proteína 13, se llevaron a cabo las reacciones
siguientes (figura 15). En primer lugar, se mezclaron 20 \mul del
material purificado en oligo-dT anterior 11 con 0,5
\mul de cebadores 5 (50 \muM) y 6 \mul de tampón de primera
cadena (kit Superscript II de GibcoBRL; Tris-HCl 250
mM, pH 8,3, KCl 375, MgCl_{2} 15 mM) y se calentó brevemente a
80ºC durante 2 minutos, seguido de enfriamiento lento a 0ºC. Se
indujo la formación de fotoentrecruzamiento con soralén irradiando
la muestra durante 15 minutos a 0ºC con \lambda>310 nm [lámpara
de inmersión de presión intermedia de 450 W (ACE Glass, Vineland,
NJ) provista de una manga de absorción de Pyrex en un pocillo de
inmersión Quartz]. A continuación, se añadieron 0,6 \mul de una
mezcla de dNTP (25 mM cada uno), 3 \mul de DTT 0,1 M y 0,4 \mul
(80 unidades) de transcriptasa inversa Superscript II, y se llevó a
cabo la síntesis de ADNc durante 60 minutos a 42ºC. A continuación,
se eliminó la parte ARN continuando la incubación durante 60 minutos
a 37ºC tras la adición de 0,5 \mul (1 unidad) de ARNasa H
(Promega, Madison, WI). Finalmente, se generó ADN de doble cadena
14 mediante la adición de 50 pmoles de cebador 9 e incubando durante
60 minutos más a 42ºC. Se llevaron a cabo reacciones de control con
muestras no entrecruzadas tal como se indica en la figura 15. Se
llevó a cabo análisis de producto mediante electroforesis en geles
desnaturalizantes de TBE al 6%-urea (Novex, San Diego, CA), seguido
de la visualización de las bandas de producto marcadas con
[^{35}S] mediante exposición en una pantalla de phosphorimager
(figura 16).
Se aplicaron muestras al gel en el mismo orden
en que aparecieron en la figura 15, partiendo de la fusión de
ARN-proteína 11 y siguiendo la ruta de reacción con
y sin fotoentrecruzamiento. Tal como se indica en la figura 16, las
movilidades en gel se corresponden bien con el comportamiento
esperado y confirman claramente la constitución de la fusión de
ADN-proteína 13.
Se demostró la formación de fusión de
ADN-proteína tipo B3 de la manera siguiente (figura
17). Se hibridó el constructo de ligador ramificado 7 (5 \muM)
con el ARN diana 3 (2,5 \muM) en tampón Tris 25 mM, pH 7,0, que
contenía NaCl 100 mM y se entrecruzó mediante irradiación durante 15
minutos a temperatura ambiente en un vial de vidrio borosilicato
(Kimble/Kontes, Vineland, NJ) utilizando una lámpara de UV
multilongitud de onda manual UVGL-25 (UVP, Upland,
CA) prefijada a longitudes de onda largas. Se llevó a cabo el
análisis de producto mediante electroforesis en un gel de
poliacrilamida TBE al 6%-urea seguido de visualización mediante
sombreado de UV. Estos resultados indican una conversión
prácticamente cuantitativa del material de partida (gel "A" en
la fig. 17). El producto ARN fotoligado se utilizó para la
traducción in vitro sin separación adicional del ARN no
ligado restante y ligador en exceso. Se llevaron a cabo reacciones
de traducción in vitro y de formación de fusión tal como se
ha descrito para el tipo C2 anteriormente, con 100 pmoles de ARN de
entrada en un volumen total de 300 \mul. Tras la purificación en
oligo-dT-celulosa, se obtuvieron 5,5
pmoles de fusión de ARN 15. Su conversión en fusiones de ADN de
cadena única y de doble cadena y proteína 16 y 17, respectivamente,
se llevó a cabo mediante transcripción inversa (kit Superscript II,
GibcoBRL, Gran Island, NY) y tratamiento con ARNasa H (Promega,
Madison, WI) tal como se ha descrito para las fusiones de tipo C2
(gel "B" en la fig. 17).
Se demostró la formación de fusión de
ADN-proteína tipo B2 tal como se describe de manera
general en la figura 18. Específicamente, siguiendo el
procedimiento descrito de manera general para las fusiones de tipo
B3 anteriormente, se entrecruzó ARN con ligador 6. Tras la
electroforesis de poliacrilamida desnaturalizante, se aisló el
producto ligado 18 con un rendimiento del 12%. Se llevaron a cabo
la traducción in vitro, la formación de fusión y la
preparación de fusiones de ADN-proteína 19 tal como
se ha descrito para las fusiones de tipo B3 anteriormente, con
eficacia similar de formación de fusión.
Con el fin de evaluar la resistencia a nucleasa
y a bases de las fusiones de ADN en comparación con las fusiones de
ARN correspondientes, se llevaron a cabo los experimentos
siguientes. A 10 \mul de fusión de ADN 16 (tipo B3) o de fusión
de ARN 15 en tampón de transcripción inversa se les añadieron 0,2
\mul (0,4 unidades) de ARNasa H, 0,2 \mul (2 unidades) de
ARNasa I, 0,2 \mul (0,6 unidades) de ADN polimerasa de T4
(actividad de 3'-5'-exonucleasa) o
2,5 \mul de NaOH 2,0 M. Las muestras se incubaron durante 30
minutos a 37ºC y después se analizaron en un gel NuPage al
4-12% (Novex, San Diego, CA), seguido de
autorradiografía. Se muestran los resultados en la figura 19 y
confirman la estabilidad incrementada de las fusiones de ADN frente
al tratamiento con ribonucleasas y con bases.
Con el fin de someter a ensayo la estabilidad de
los constructos de fusión de ADN en medios biológicos, se incubaron
5 nM de fusiones de ARN 11 ó 12, o fusiones de ADN 13 ó 14 (tipo C2)
con 3 \mug/\mul de membranas de células CHO-K1
(Receptor Biology, Beltsville, MD) en Tris-HCl 50
mM, pH 8,3, KCl 75 mM, MgCl_{2} 3 mM y DTT 10 mM a temperatura
ambiente. Se prepararon muestras adicionales de fusiones de ARN 11 y
12 que contenían complejo de vanadil ribonucleósido ("VRC")
para inhibir la actividad de ribonucleasa. Se extrajeron alícuotas
tras 0, 5, 15, 30, 60, 120 minutos y 24 horas y se analizaron
mediante electroforesis en geles NuPage al 4-12%
(Novex), seguido de la exposición en una pantalla phosphorimager. Se
prepararon gráficos de las cantidades relativas de fusión restante
contra el tiempo de incubación y se extrajeron las semividas
gráficamente a partir de las curvas resultantes. Tal como se indica
en la figura 20, todos los constructos mostraron una degradación no
superior al 50% durante el periodo inicial de dos horas, excepto la
fusión de ADNdc 14, que aparentemente era completamente estable
bajo las condiciones ensayadas. Tras una incubación de 24 horas,
todos los constructos de fusión se habían degradado completamente
debido a la actividad de nucleasa o de proteasa.
Las fusiones de ADN-proteína
descritas en la presente memoria pueden utilizarse en cualquier
procedimiento de selección para proteínas deseadas, incluyendo los
enfoques de evolución y reconocimiento molecular. Se describen
procedimientos de selección ejemplares, por ejemplo en Szostak et
al., patente WO nº 98/31700; Roberts y Szostak, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 94:12297-12302, 1997.
Las fusiones de ADN-proteína
descritas en la presente memoria pueden utilizarse para cualquier
aplicación descrita o contemplada anteriormente para las fusiones
de ARN-proteína. Entre los usos comerciales se
incluyen el aislamiento de polipéptidos con propiedades deseadas a
través de técnicas de evolución in vitro (ver, por ejemplo,
Szostak et al., patentes U.S.S.N. nº 09/007.005 y nº
09/247.190; Szostak et al., documento WO nº 98/31700;
Roberts y Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
94:12297-12302, 1997), cribado de bibliotecas de
ADNc que se derivan de ARNm celular (ver, por ejemplo, Lipovsek
et al., patente U.S.S.N. nº 60/096.818, presentada el 17 de
agosto de 1998), y la clonación de nuevos genes basada en
interacciones proteína-proteína (Szostak et
al., patentes U.S.S.N. nº 09/007.005 y nº 09.247.190; Szostak
et al., documento WO nº 98/31700), así como la
utilización de estas fusiones en experimentos de expresión proteica
(Kuimelis et al., patentes U.S.S.N. nº 60/080.687 y nº
09/282.734). Además, las fusiones de ADN-proteína
descritas en la presente memoria pueden utilizarse en ensayos de
unión y reconocimiento molecular que implican materiales biológicos
que probablemente contienen ribonucleasas, tales como células
completas, lisados o líquidos biológicos. Estas fusiones de
ADN-proteína pueden utilizarse con cualquier
propósito terapéutico, diagnóstico o de investigación,
particularmente en las áreas farmacéutica y agronómica.
Claims (55)
-
\global\parskip0.940000\baselineskip
1. Procedimiento para generar una fusión de ADN-proteína, comprendiendo dicho procedimiento:- (a)
- entrecruzar un cebador de ácidos nucleicos con una molécula de ARN, encontrándose dicho cebador unido a un péptido aceptor;
- (b)
- traducir dicho ARN para producir un producto proteína, encontrándose dicho producto proteína unido covalentemente a dicho cebador de ácidos nucleicos, y
- (c)
- transcribir inversamente dicho ARN a partir de dicho cebador de ácidos nucleicos para producir una fusión de ADN-proteína.
- 2. Procedimiento para generar una fusión de ADN-proteína, comprendiendo dicho procedimiento:
- (a)
- generar una fusión de ARN-proteína;
- (b)
- hibridar un cebador de ácidos nucleicos con dicha fusión;
- (c)
- entrecruzar dicho cebador de ácidos nucleicos con dicha fusión; y
- (d)
- transcribir inversamente el ARN de dicha fusión de ARN-proteína a partir de dicho cebador de ácidos nucleicos para producir una fusión de ADN-proteína.
- 3. Procedimiento para generar una fusión de ADN-proteína, comprendiendo dicho procedimiento:
- (a)
- ligar un cebador de ácidos nucleicos a una molécula de ARN, encontrándose dicho cebador unido a un péptido aceptor y presentando una estructura de horquilla;
- (b)
- traducir dicho ARN para producir un producto proteína, encontrándose dicho producto proteína unido covalentemente a dicho cebador de ácidos nucleicos; y
- (c)
- transcribir inversamente dicho ARN a partir de dicho cebador de ácidos nucleicos para producir una fusión de ADN-proteína.
- 4. Procedimiento según la reivindicación 1, 2 ó 3, comprendiendo además dicho procedimiento el tratamiento del producto de la etapa (c) según las reivindicaciones 1 ó 3, o la etapa (d) según la reivindicación 2 para eliminar dicho ARN.
- 5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicho tratamiento comprende poner en contacto el producto de la etapa (c) según las reivindicaciones 1 ó 3, o la etapa (d) según la reivindicación 2 con ARNasa H bajo condiciones suficientes para digerir el ARN.
- 6. Procedimiento según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que dicho cebador de ácidos nucleicos es un cebador de ADN.
- 7. Procedimiento según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que dicha etapa de traducción se lleva a cabo in vitro.
- 8. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho cebador de ácidos nucleicos presenta una estructura de horquilla.
- 9. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho cebador comprende además un agente de fotoentrecruzamiento.
- 10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicho agente de fotoentrecruzamiento es el soralén.
- 11. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicho cebador se entrecruza con un oligonucleótido que se encuentra unido a un péptido aceptor.
- 12. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicho cebador se hibrida con dicha molécula de ARN y dicha etapa de entrecruzamiento se lleva a cabo mediante fotoentrecruzamiento.
- 13. Procedimiento para la selección de una proteína deseada o su ADN codificante, que comprende las etapas siguientes:
- a)
- proporcionar una población de fusiones de ADN-proteína, comprendiendo cada una un ADN unido covalentemente a una proteína candidata, en la que dicha proteína se encuentra codificada por dicho ADN unido covalentemente; y
- b)
- seleccionar una fusión deseada de ADN-proteína, seleccionando de esta manera dicha proteína deseada o ADN.
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- 14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que dicha proteína deseada presenta una función alterada respecto a una proteína de referencia.
- 15. Procedimiento según la reivindicación 13 ó 14, en el que dicha molécula o dicha fusión de ADN-proteína comprende además un ácido ribonucleico unido covalentemente a dicho ADN.
- 16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que dicha proteína se encuentra codificada por dicho ácido ribonucleico.
- 17. Procedimiento según la reivindicación 13 ó 14, en el que dicha proteína comprende por lo menos 10 aminoácidos, preferentemente 30 aminoácidos, o más preferentemente 100 aminoácidos.
- 18. Procedimiento según la reivindicación 13 ó 14, en el que dicho ADN se encuentra unido covalentemente a dicha proteína mediante un péptido aceptor.
- 19. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que dicho péptido aceptor es la puromicina.
- 20. Procedimiento según la reivindicación 13 ó 14, en el que dicha población de fusiones de ADN-proteína candidatas comprenden por lo menos 10^{5} moléculas de ADN diferentes, preferentemente por lo menos 10^{4} moléculas de ADN diferentes.
- 21. Procedimiento según la reivindicación 13 ó 14, en el que dicha etapa de selección comprende la unión de dicha proteína deseada con una pareja de unión inmovilizada.
- 22. Procedimiento según la reivindicación 13 ó 14, en el que dicho procedimiento comprende además repetir las etapas (a) y (b).
- 23. Procedimiento según la reivindicación 13 ó 14, en el que dicho ADN es de doble cadena.
- 24. Procedimiento para generar una fusión de ADN-proteína, comprendiendo dicho procedimiento:
- (a)
- proporcionar un ARN unido covalentemente a un péptido aceptor;
- (b)
- entrecruzar un cebador de ácidos nucleicos a la molécula de la etapa (a);
- (c)
- traducir dicha molécula de ARN para producir una proteína, en la que dicha proteína se une covalentemente a dicho péptido aceptor; y
- (d)
- transcribir inversamente dicho ARN mediante la extensión de dicho cebador para producir una fusión de ADN-proteína.
- 25. Procedimiento según la reivindicación 2 ó 24, en el que la proteína de dicha fusión de ADN-proteína se une covalentemente al ARN mediante un ligador que comprende un ADN y dicho cebador de ácidos nucleicos se une covalentemente a dicho ligador.
- 26. Procedimiento según la reivindicación 24, comprendiendo además dicho procedimiento el tratamiento del producto de la etapa (d) para eliminar dicho ARN.
- 27. Procedimiento según la reivindicación 26, en el que dicho tratamiento comprende poner en contacto el producto de la etapa (d) con ARNasa H bajo condiciones suficientes para digerir dicho ARN.
- 28. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que dicho cebador de ácidos nucleicos es un cebador de ADN.
- 29. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que dicha etapa de traducción se lleva a cabo in vitro.
- 30. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que dicho péptido aceptor es la puromicina.
- 31. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que dicho cebador de ácidos nucleicos comprende además un agente de fotoentrecruzamiento.
- 32. Procedimiento según la reivindicación 31, en el que dicho agente de fotoentrecruzamiento es el soralén.
- 33. Procedimiento según la reivindicación 31, en el que dicho cebador de ácidos nucleicos se encuentra entrecruzado con un oligonucleótido que se encuentra unido a un péptido aceptor.
- 34. Procedimiento según la reivindicación 31, en el que dicho cebador de ácidos nucleicos se hibrida a dicha molécula de ARN y dicha etapa de unión se lleva a cabo mediante fotoentrecruzamiento.
- 35. Procedimiento según la reivindicación 25, en el que el ligador comprende además un polímero.
- 36. Molécula que comprende un ADN unido covalentemente a una proteína a través de un péptido aceptor, en la que dicha proteína se encuentra codificada por dicho ADN unido covalentemente.
- 37. Molécula según la reivindicación 36, en la que dicha proteína comprende por lo menos 10 aminoácidos.
- 38. Molécula que comprende un ADN unido covalentemente a una proteína, comprendiendo dicha proteína por lo menos 10 aminoácidos, en la que dicha proteína se encuentra codificada por dicho ADN unido covalentemente.
- 39. Molécula según la reivindicación 36 ó 38, en la que la proteína se encuentra completamente codificada por dicho ADN unido covalentemente.
- 40. Molécula según la reivindicación 36 ó 38,en la que dicha proteína comprende por lo menos 30 aminoácidos o preferentemente por lo menos 100 aminoácidos.
- 41. Molécula según la reivindicación 36 ó 38, en la que dicha molécula comprende además un ácido ribonucleico unido covalentemente a dicho ADN.
- 42. Molécula según la reivindicación 41, en la que dicha proteína se encuentra codificada por dicho ácido ribonucleico.
- 43. Molécula según la reivindicación 36 ó 38, en la que dicho péptido aceptor es la puromicina.
- 44. Molécula según la reivindicación 36 ó 38, en la que el ADN es de doble cadena.
- 45. Población de por lo menos 10^{5} fusiones de ADN-proteína, comprendiendo cada fusión un ADN unido covalentemente a una proteína, en la que dicha proteína se encuentra codificada por dicho ADN unido covalentemente.
- 46. Población según la reivindicación 45, en la que dicha población comprende por lo menos 10^{14} fusiones.
- 47. Población según la reivindicación 45, en la que dicha proteína se encuentra completamente codificada por dicho ADN unido covalentemente.
- 48. Población según la reivindicación 45, en la que dicha molécula o dicha fusión de ADN-proteína comprende además un ácido ribonucleico unido covalentemente a dicho ADN.
- 49. Población según la reivindicación 48, en la que dicha proteína se encuentra codificada por dicho ácido ribonucleico.
- 50. Población según la reivindicación 45, en la que dicha proteína comprende por lo menos 10 aminoácidos, preferentemente 30 aminoácidos, o más preferentemente 100 aminoácidos.
- 51. Población según la reivindicación 45, en la que dicho ADN se encuentra unido covalentemente a dicha proteína a través de un péptido aceptor.
- 52. Población según la reivindicación 51, en la que dicho péptido aceptor es la puromicina.
- 53. Población según la reivindicación 45, en la que el ADN es de doble cadena.
- 54. Soporte sólido que comprende una matriz de molécula inmovilizadas, comprendiendo cada una un ADN unido covalentemente a una proteína, en el que dicha proteína se encuentra codificada por dicho ADN.
- 55. Soporte sólido según la reivindicación 54, en el que dicho soporte sólido es un microchip.
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