JP2002531105A - Dna・蛋白質融合体とその利用 - Google Patents
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Abstract
Description
質およびそれらに対応する核酸配列を選択するための利用を特徴とする。
組合せ法が開発された(ゾスタック(Szostak)ら、米国特許出願第09/007,005
号;ゾスタック(Szostak)ら、国際公開公報第98/31700号;ロバーツおよびゾ
スタック(Roberts & Szostak)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1997)、第94
巻、12297〜12302頁)。この方法では、蛋白質部分は共有化学結合によってそれ
をコードするRNAに結合している。この結合は共有結合であるという特性により
、選択実験は、リボソームディスプレイのような非共有結合的複合体形成を伴う
方法の場合に用いなければならない極端に穏やかな反応条件に限定されることは
ない(ヘインズおよびプリュックサン(Hanes & Pluckthun)、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA(1997)、94巻、4937〜4942頁;へおよびタウシヒ(He & Taussi
g)、Nucl. Acids Res.(1997)、25巻、5132〜5143頁)。しかし、リボ結合が
偶発的に切断されると、コードされる情報が非可逆的に失われることがありうる
ことから、選択プロセスの際にはRNA分解を最小限にするために注意が必要であ
る。この理由から、これらの選択手順は典型的に、リボヌクレアーゼまたは他の
有害な混入物質を含まない反応培地および装置を用いて行われる。
ける方法を提供する。分子進化および認識技術に用いられる可能性があるこれら
のDNA・蛋白質融合体は、RNA・蛋白質融合体より化学的に安定であることから、
多くの長所を提供する(下記により詳細に説明する)。
る。第一の方法は以下の段階を含む:(a)ペプチドアクセプター(例えば、ピ
ューロマイシン)に結合している核酸プライマーを、RNA分子に(好ましくはRNA
の3'末端またはその近傍で)結合させる段階;(b)RNAを翻訳して、プライマー
に共有結合している蛋白質産物を生成する段階;および(c)RNAを逆転写して、
DNA・蛋白質融合体を生成する段階。
b)核酸プライマーを融合体にハイブリダイズさせる段階(好ましくは、RNAの3'
末端またはその近傍で);および(c)RNAを逆転写して、DNA・蛋白質融合体を
生成する段階。
に十分な条件で、段階(c)の産物をRNAアーゼHに接触させることによって)RNA
を除去するために、段階(c)の産物を処理する段階をさらに含む。さらに好ま
しい態様において、核酸プライマーはDNAプライマーであり、翻訳段階はインビ
トロで行われ;および核酸プライマーはヘアピン構造を有する。さらに、プライ
マーは、ソラレンのようなフォトクロスリンク剤をさらに含んでもよく、そのプ
ライマーは、ペプチドアクセプターに結合したオリゴヌクレオチドにクロスリン
クさせてもよく、またはRNA分子とハイブリダイズさせた後、フォトクロスリン
クによって行われる結合段階を行ってもよい。
ロマイシン)を通じて(好ましくは、少なくとも10個のアミノ酸の)蛋白質に共
有結合したDNAを含む分子、ならびにその中で蛋白質が少なくとも10個のアミノ
酸を含む、蛋白質に共有結合したDNAを含む分子を特徴とする。
ノ酸を含み、より好ましくは少なくとも100個のアミノ酸、そしてさらに少なく
とも200個または250個のアミノ酸を含んでもよい。他の好ましい態様において、
蛋白質はDNAによってコードされ、好ましくはDNAによって完全にコードされ;分
子はさらに、DNAに共有結合したリボ核酸を含み;蛋白質はリボ核酸によってコ
ードされ;およびDNAは二本鎖である。
有結合したDNAを含む、少なくとも105個、および好ましくは少なくとも1014個の
本発明のDNA・蛋白質融合体の集団を特徴とする。
法を特徴とする。第一の選択方法は以下の段階を含む:(a)それぞれが候補蛋
白質に共有結合したDNAを含む、DNA・蛋白質融合体の集団を提供する段階;およ
び(b)所望のDNA・蛋白質融合体を選択して、それによって所望の蛋白質または
DNAを選択する段階。
合して、基準蛋白質コード配列とは異なる候補蛋白質コード配列を有するDNAを
含む、候補となるDNA・蛋白質融合体の集団を生成する段階;ならびに(b)機能
が変化したDNA・蛋白質融合体を選択して、それによって機能が変化した蛋白質
またはそれをコードするDNAを選択する段階。
を結合させる段階、または所望の蛋白質の機能的な活性をアッセイする段階のい
ずれかを含む。さらに、方法はさらに段階(a)および(b)を繰り返す段階を含
んでもよい。
白質融合体を含む、固定された分子のアレイを含む固相支持体を特徴とする。好
ましい態様において、固相支持体はマイクロチップである。
分子(例えば、DNA・蛋白質融合体分子)を意味する。本発明の方法によって、
必要に応じて、多数の候補分子から始める選択を容易にすることから、本発明の
「集団」とは、好ましくは107個の分子、より好ましくは109個、1013個、または
1014個より多い分子、および最も好ましくは1015個より多い分子を意味する。
とを意味する。本明細書において用いられるように、「選択する」段階は、選択
段階後の集団における望ましくない分子と比較して、所望の分子の少なくとも2
倍、好ましくは30倍、より好ましくは100倍、および最も好ましくは1000倍濃縮
を提供する。選択段階は、何回繰り返してもよく、異なるタイプの選択段階を所
与の方法において組みあわせてもよい。
はそれ以上の天然または改変された任意のアミノ酸を意味する。「蛋白質」と「
ペプチド」は、本明細書において互換的に用いられる。
ヌクレオチドの配列を意味する。この用語に含まれる改変されたRNAの一つの例
は、ホスホロチオエートRNAである。
オキシリボヌクレオチドの配列を意味する。
ヌクレオチド類似体もしくは誘導体を意味する。本明細書において用いられるよ
うに、この用語にはDNA、RNA、およびPNAが含まれるが、これらに限定されるこ
とはない。
の触媒活性によって、伸長しつつある蛋白質鎖のC-末端に加えることができる任
意の分子を意味する。典型的にはそのような分子は、(i)ヌクレオチドまたは
ヌクレオチド様部分(例えば、アデノシンまたはアデノシン類似体(N-6アミノ
部位でのジメチル化が許容される))、(ii)アミノ酸またはアミノ酸様部分(
例えば、20D-もしくはL-アミノ酸、またはそれらのアミノ酸類似体(例えば、O-
メチルチロシンまたはエルマン(Ellman)ら、Meth. Enzymol. 202:301、1991
)に記載の任意の類似体)、および(iii)二つの間の結合(例えば、3'部位で
のエステル、アミド、もしくはケトン結合、または次に好ましくは2'部位);好
ましくはこの結合は天然のリボヌクレオチド立体構造の環のパッカーを有意に乱
さない。ペプチドアクセプターはまた、アミノ基、ヒドロキシル基、またはスル
フヒドリル基であってもよいがこれらに限定されない求核基を有してもよい。さ
らに、ペプチドアクセプターは、ヌクレオチド模倣体、アミノ酸模倣体、または
複合ヌクレオチドアミノ酸構造の模倣体で構成されてもよい。
も意味する。
合体のある部分に対する特異的、共有結合、または非共有結合親和性を有する如
何なる分子も意味する。結合パートナーの例には、抗原/抗体対、蛋白質/阻害
剤対、受容体/リガンド対(例えば、ホルモン受容体/ペプチドホルモン対のよ
うな細胞表面受容体/リガンド対)、酵素/基質対(例えば、キナーゼ/基質対
)、レクチン/炭化水素対、オリゴマーまたはヘテロオリゴマー蛋白質凝集体、
DNA結合蛋白質/DNA結合部位、RNA/蛋白質対、および核酸二本鎖、ヘテロ二本
鎖、またはライゲーション鎖のメンバー、並びに、DNA・蛋白質融合体の如何な
る部分とも1つもしくはそれ以上の共有結合または非共有結合を形成することが
できる任意の分子が含まれるが、これらに限定されることはない。
たはプロテインAのような他の結合パートナー中間体を通じて)アフィニティ複
合体が結合してもよい、またはその中にアフィニティ複合体が埋め込まれてもよ
い(例えば、受容体またはチャンネルを通じて)、任意のカラム(もしくはカラ
ム材料)、ビーズ、試験管、マイクロタイター皿、固体粒子(例えば、アガロー
スもしくはセファロース)、マイクロチップ(例えば、シリコン、シリコンガラ
ス、もしくは金チップ)、またはメンブレン(例えば、リポソームもしくは小胞
のメンブレン)を意味するがこれらに限定されることはない。
る。これらの構築物は、第一に融合体のDNA構成要素のために、そして第二にDNA
と蛋白質部分との共有結合のために、大きく増加した化学的安定性を有する。こ
れらの特性によって融合体産物をより容易に取り扱うことができるようになり、
それによって多様な反応条件で選択および認識実験を行うことができるようにな
る。さらに、本発明は、例えばコード融合体が固相支持体に固定されているハイ
ブリダイゼーションアッセイ法において、一本鎖核酸部分が必須である場合の適
用を容易にする。さらに、インキュベーションは、高いpH、多価金属イオンの上
昇した濃度、時間を長くした熱処理、および様々な生物材料への暴露を伴うより
厳しい条件下で行ってもよい。最終的に、一本鎖DNAは二次構造形成に対して比
較的抵抗性であり、核酸ハイブリダイゼーション段階を伴う、または必要とする
技術にとってすばらしい利点となる。
体と共に、複雑度の高い融合体ライブラリーの生成を可能にする。
から明らかとなると思われる。
ついての説明を下記に示す。これらの実施例は、説明する目的のために提供され
るのであって、本発明を制限するためのものではない。
ピューロマイシン改変DNAヘアピン様構造をmRNA分子にライゲーションすること
によって生成される。この手順の第一の段階は、ピューロマイシンをヘアピンに
結合させることであり、これは多くの技術によって行ってもよく、その1つを図
2に示す。この方法によって、DNA分子から枝分かれしたピューロマイシンで終
わる側鎖を有するDNAヘアピンが合成される。この構築物は、ヘアピン構造の任
意の標準的な自動DNA合成(例えば、エクスペダイト核酸合成システムのユーザ
ーガイド、パーセプティブバイオシステムズ社、ファーミンガム、マサチューセ
ッツ州を参照のこと)において、非対称に分岐したホスホロアミダイト(クロン
テック社、パロアルト、カリフォルニア州)を用いて作製し、その後、化学燐酸
化試薬(グレンリサーチ社、スターリング、バージニア州)を用いて5'-ホスフ
ェートを加えてもよい。
の作製プロトコール、クロンテック社、パロアルト、カリフォルニア州)、標準
的な自動DNA合成によってリンカー部分を結合させる。リンカーの末端に達する
前に、少量の5'-ホスホロアミダイト(グレンリサーチ社、スターリング、バー
ジニア州)を加えて鎖の方向を逆転させる。最終的に、好ましくは図3に示す合
成技術を用いて、ピューロマイシン-5'-ホスホロアミダイトの結合によって合成
を終了する。図3において、段階(a)〜(c)は、グリーンおよびワッツ(Gree
ne & Wuts)、「有機合成における保護基(Protective Groups in Organic Syn
thesis)」、第二版(1991)、ジョンウィリー&サンズインク、ニューヨーク、
ニューヨーク州)に記載のように実施してもよく、段階(d)は、ビューケージ
(Beaucage)(Methods in Molecular Biology、第20巻、「オリゴヌクレオチド
と類似体のプロトコール(Protocols for Oligonucleotides and Analogs)」、
アガウォール(S. Agarwal)編(1993)、ヒューマナプレス、トトワ、ニュージ
ャージー州、33〜61頁)に記載のように実施してもよい。
よい。この技術によって、合成は、まずリンカー部分を合成することによってピ
ューロマイシンCPG固相支持体(グレンリサーチ社、スターリング、バージニア
州)から開始した後、分岐アミダイト(クロンテック社、パロアルト、カリフォ
ルニア州)を取り込んで、ヘアピンの5'部分を加える。分岐の保護を外した後、
ヌクレオシド-5'-ホスホロアミダイト(グレンリサーチ社、スターリング、バー
ジニア州)を用いることによってヘアピンの3'アームを付加する。
よび鋳型として3'突出末端を用いて、mRNAをヘアピンにライゲーションする(サ
ムブルック、フリッチュおよびマニアティス(Sambrook, Fritsch, & Maniatis
)、「分子のクローニング(Molecular Cloning)」(1989)、コールドスプリ
ングハーバー研究所出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州)。次
に、RNAのリボソーム翻訳によって、蛋白質が合成され、その後融合体が形成さ
れる(例えば、ゾスタック(Szostak)ら、米国特許出願第09/007,005号および
米国特許出願第09/247,190号;ゾスタック(Szostak)ら、国際公開公報第98/31
700号;ロバーツおよびゾスタック(Roberts & Szostak)、Proc. Natl. Acad.
Sci. USA(1997)、第94巻、12297〜12302頁を参照のこと)。一つの特定の態
様において、分岐点はヘアピンのループ領域に存在する。分岐点の他の位置(例
えば、幹構造内で)も同様に用いてもよい。さらに、約10〜60ヌクレオチド、よ
り好ましくは約30ヌクレオチドのdAnリンカーが用いられるが、リンカーの長さ
と化学組成物(例えば、dAnよりむしろPEG(グレリーリサーチ社、スターリン、
バージニア州)との双方を最適化してもよい。
のRNA部分をcDNAに逆転写する(例えば、サムブルック、フリッチュおよびマニ
アティス(Sambrook, Fritsch, & Maniatis)、「分子のクローニング(Molecu
lar Cloning)」(1989)、コールドスプリングハーバー研究所出版、コールド
スプリングハーバー、ニューヨーク州に記載のように)。RNアーゼHによるmRNA
の最適な消化(例えば、サムブルック、フリッチュおよびマニアティス(Sambro
ok, Fritsch, & Maniatis)、「分子のクローニング(Molecular Cloning)」
(1989)、コールドスプリングハーバー研究所出版、コールドスプリングハーバ
ー、ニューヨーク州を参照のこと)によって、一本鎖DNA・蛋白質融合体が得ら
れる。
よって切断型DNA転写物の形成も促進する(例えば、サンガー(Sanger)、Scien
ce(1981)、214巻、1205〜1210頁を参照のこと)。そのような切断型DNA・蛋白
質融合体は、例えば、固定されたオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイ
ゼーションのために、当初のメッセージの3'領域(今のDNA転写物の5'領域)の
みを用いる蛋白質ディスプレイ実験において有用である(クメリス(Kumelis)
ら、1998年4月3日に出願された米国特許出願第60/080,686号)。
ューロマイシンを有する適したリンカーとフォトクロスリンクさせることによっ
て、非常に類似した構造を調製してもよい。一例としてのクロスリンク方法を図
5に示す。この方法において、ピューロマイシンを有するリンカーは、例えば、
ゾスタック(Szostak)ら、米国特許出願第09/007,005号および米国特許出願第0
9/247,190号;ゾスタック(Szostak)ら、国際公開公報第98/31700号;ロバーツ
およびゾスタック(Roberts & Szostak)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1997
)、第94巻、12297〜12302頁に記載されているように構築してもよい。ソラレン
改変プライマーを生成して、例えば、ピーレスおよびイングリッシュ(Pieles
& Englisch、Nucl. Acids Res.(1989)、17巻、285〜299頁)に記載のように
、フォトクロスリンク段階を実施してもよい。残りの段階は上記のように実施し
てもよい。この方法は、非標準ヌクレオシド/ピューロマイシン-5'-ホスホロア
ミダイト(すなわち、ヘアピン・リンカー構造の自動合成の際に用いられる)を
使用する必要がなく、ヘアピン法以上の利点を提供する。この場合も、上記のよ
うに、約10〜60ヌクレオチド、より好ましくは約30ヌクレオチドのdAnリンカー
を利用するが、リンカーの長さと化学組成(例えば、dAnよりむしろPEG(グレン
リサーチ社、スターリング、バージニア州))との双方を最適化してもよい。
A部分とのライゲーション反応は、いくつかの代用技術によって行ってもよい。
例えば、上記のT4 DNAリガーゼとの酵素的ライゲーションの他に、この段階は化
学的方法を用いて行ってもよい。一つの特定の例において、ヘアピンの5'末端は
適当なホスホロアミダイト(クロンテック社、パロアルト、カリフォルニア州)
を用いて、1つ(または多数)のアミノ基を改変してもよい。RNAの3'末端を過
ヨウ素酸塩によって酸化した後、2つの基質を還元的アミノ化反応によって結合
してもよい。これは、図6においてスキーム「A」として示され、例えばレマイ
ター(Lemaitre)ら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1987)、第84巻、648〜652
頁)に記載されている。または、この化学的ライゲーション段階は、ヒドラゾン
形成のためのカルボヒドラジドもしくはヒドラジン改変構造、または還元的アミ
ノ化を含んでもよい。これらの方法をそれぞれ、図6にスキーム「B」および「C
」として説明し、それぞれ、ゴッシュ(Gosh)ら(Anal. Biochem.(1989)、第
178巻、43〜51頁)、プロウドニコフおよびミルザベコフ(Proudnikov & Mirza
bekov)(Nucl. Acids Res.(1996)、第24巻、4535〜4542頁)に記載されてい
る。ヒドラジドホスホロアミダイト合成を、図7に示されるように行ってもよく
、ヒドラジンホスホロアミダイト合成は、図8に示されるように、ならびにグリ
ーンおよびワッツ(Greene & Wuts、「有機合成における保護基(Protective G
roups in Organic Synthesis)」、第二版(1991)、ジョンウィリー&サンズイ
ンク、ニューヨーク、ニューヨーク州)(段階(a)および(c))、プロウドニ
コフおよびミルザベコフ(Proudnikov & Mirzabekov)(Nucl. Acids Res.(19
96)、第24巻、4535〜4542頁(段階(b)))、およびビューケージ(Beaucage
)、(Methods in Molecular Biology、第20巻、「オリゴヌクレオチドと類似体
のプロトコール(Protocols for Oligonucleotides and Analogs)」、S.アガウ
ォール(S. Agarwal)編(1993)、ヒューマナプレス、トトワ、ニュージャージ
ー州、33〜61頁)(段階(e))に記載されるように行ってもよい。
ピューロマイシン改変リンカーを化学的にクロスリンクさせる段階を含む。その
ようなクロスリンクは、多くの方法によって行ってもよい。
ーとリンカー領域の間に存在する反応基(例えば、上記のアミノ誘導体、ヒドラ
ジド、またはヒドラジンの一つ)を有するオリゴヌクレオチドを合成する。RNA
とプライマー部位との二本鎖形成がこの反応基に隣接して直ちに起こり、次にこ
れによって、RNAの過ヨウ素酸塩酸化3'末端との反応が起こってクロスリンクが
誘導される(図6に示すように、および上記のように)。この反応は、還元的ア
ミノ化(図6、スキーム「A」または「C」;レマイター(Lemaitre)ら、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA(1987)、第84巻、648〜652頁;プロウドニコフおよびミ
ルザベコフ(Proudnikov & Mirzabekov)、Nucl. Acids Res.(1996)、第24巻
、4535〜4542頁)、またはヒドラゾン形成(図6、スキーム「B」;ゴッシュ(G
osh)ら、Anal. Biochem.(1989)、第178巻、43〜51頁)によって起こってもよ
い。翻訳および融合体形成の後(ゾスタック(Szostak)ら、米国特許出願第09/
007,005号および米国特許出願第09/247,190号;ゾスタック(Szostak)ら、国際
公開公報第98/31700号;ロバーツおよびゾスタック(Roberts & Szostak)、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA(1997)、第94巻、12297〜12302頁)、RNA鋳型上で
の逆転写によってプライマーを伸長させ、最適なRNアーゼH消化段階を実施して
、DNA・蛋白質融合体を生成する(図9)。
逆転させるが、これは、合成の際に5'-ホスホロアミダイト(グレンリサーチ社
、スターリング、バージニア州)を用いることによって行うことができる。
性ソラレン部分を反応基としてリンカーに含める(図10)。そのような構築物は
、ソラレン改変デスオキシヌクレオチドホスホロアミダイトを用いて(ピーレス
(Pieles)ら、Nucleic Acids Res.(1989)、第17巻、8967〜8978頁)、または
標準的なソラレンホスホロアミダイト(グレンリサーチ社、スターリング、バー
ジニア州)が結合している分岐ホスホロアミダイト(クロンテック社、パロアル
ト、カリフォルニア州)を組み入れることによって合成してもよい。リンカーと
標的RNAとのハイブリダイゼーション後、クロスリンク形成は、例えば、ピーレ
スおよびイングリッシュ(Pieles & Englisch、Nucl. Acids Res.(1989)、第
17巻、285〜299頁)に記載のように、UV光による照射によって行う。次に、得ら
れた構築物に翻訳および融合体形成を行う(ゾスタック(Szostak)ら、米国特
許出願第09/007,005号および米国特許出願第09/247,190号;ゾスタック(Szosta
k)ら、国際公開公報第98/31700号;ロバーツおよびゾスタック(Roberts & Sz
ostak)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1997)、第94巻、12297〜12302頁)。
逆転写およびRNアーゼH消化によって最終的なDNA・蛋白質融合体が得られる。
酵素プライマー構築物を用いて行ってもよい。上記の方法の変法において、ソラ
レン部分は、リンカーとプライマー領域とのあいだに直接結合するのではなく、
短いDNA分岐に結合している。このDNA部分はまた、標的RNAに対してもハイブリ
ダイズして、このようにソラレンが反応するために最適な二本鎖環境を提供する
(ピーレスおよびイングリッシュ(Pieles & Englisch)、Nucl. Acids Res.(
1989)、第17巻、285〜299頁)。このソラレン構築物を用いたDNA蛋白質融合体
の調製は、上記のように実施してもよい。
は、これまでに記述されているように(ゾスタック(Szostak)ら、米国特許出
願第09/007,005号および米国特許出願第09/247,190号;ゾスタック(Szostak)
ら、国際公開公報第98/31700号;ロバーツおよびゾスタック(Roberts & Szost
ak)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1997)、第94巻、12297〜12302頁)、RNA
をまずリンカー分子にライゲーションする。次の段階において、5'-フォトクロ
スリンク試薬(例えば、ソラレン、グレンリサーチ社、スターリング、バージニ
ア州)を有する適したプライマーをRNA・リンカー産物にアニーリングさせる。
光を照射すると、2つのオリゴヌクレオチド鎖のあいだに共有的クロスリンクが
起こる(例えば、ピーレスおよびイングリッシュ(Pieles & Englisch)、Nucl
. Acids Res.(1989)、第17巻、285〜299頁で記述されている)。上記のタイプ
A1、A2、およびB1〜B3の方法のように、翻訳および融合体形成を行って、その後
、逆転写段階および選択的RNアーゼH消化段階を行って、DNA・蛋白質融合体を生
成する(図12)。
てもよい。この方法によって、クロスリンクおよび逆転写の前に翻訳および融合
体形成を行うことができる。したがって、この方法によって、翻訳およびRNA・
蛋白質融合体形成に関してこれまでに記述されて十分に確立された反応条件およ
び構成要素を利用することができる。
た。これらの実験は図14に記載のオリゴヌクレオチドを利用した。
ョンキット(Megashort script transkiption kit)、アンビオン社、オースチ
ン、テキサス州)によって合成した。転写の後、変性ポリアクリルアミドゲル電
気泳動によってRNAを精製した。
C)-Pu(配列番号:10);5:5'ソラレンC2-TAG CCG TTT TTT TTT TAG CGG ATG
C(配列番号:11);6:5'd(cgt agg cga gaa agt gat)-分岐[ソラレンC6]-
d(AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA CC)-Pu(配列番号:12);および7
:5' ggt caa gct ctt-分岐[5ソラレンC6-TAG CGG ATG C 3']スペーサー 6CC-Pu
(配列番号:13)[大文字=標準的なDNA-3'-ホスホロアミダイト;小文字=DNA-
5'-ホスホロアミダイト;スペーサー=スペーサー-9ホスホロアミダイト;Pu=
ピューロマイシン-CPG(全て、グレンリサーチ社、スターリング、バージニア州
);分岐=非対称分岐アミダイト(クロンテック社、パロアルト、カリフォルニ
ア州)]は、対応するホスホロアミダイトに関して推奨されるプロトコールに従
って、エクスペダイトシンセサイザーモデル8909(パーセプティブバイオシステ
ムズ社、フラミンガム、マサチューセッツ州)によって合成した。分岐構築物6
および7に関しては、主鎖をまず合成して、最終的なキャッピング段階で終了し
た。次に、ピリジン酢酸溶液中の0.5 Mヒドラジン一水和物によって室温で15分
処理することによって、レブリニル保護基を分岐単位から外した。次に自動合成
を再開して、側鎖配列(四角の枠内で示す)を結合させた。オリゴは、濃水酸化
アンモニウム溶液中で55℃で8時間の処理によって完全に脱保護して、変性ゲル
電気泳動によって精製した。
TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT)(配列番号:15)は
、オリゴス社(ウィルソンビル、オレゴン州)等から購入して、さらに精製を行
わずに使用した。
述されているように(ゾスタック(Szostak)ら、米国特許出願第09/007,005号
および米国特許出願第09/247,190号;ゾスタック(Szostak)ら、国際公開公報
第98/31700号;ロバーツおよびゾスタック(Roberts & Szostak)、Proc. Natl
. Acad. Sci. USA(1997)、第94巻、12297〜12302頁)、RNA1とリンカー4を
鋳型DNA8にハイブリダイズさせて、T4 DNAリガーゼによって酵素的にライゲー
ションした。変性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動による精製後、得られた
mRNA・リンカー構築物を、アンビオン社のウサギ網状赤血球溶解物キットを用い
たインビトロ翻訳の鋳型として用いた。反応混合物は、50 pmoleのライゲーショ
ンしたmRNA 10、10 mM燐酸クレアチニン、150 mM酢酸カリウム、0.5 mM塩化マグ
ネシウム、メチオニンを除く各アミノ酸0.1 mM、150 μCi [35S]メチオニン(ア
マシャム社、アーリントンハイツ、イリノイ州)、および67%(v/v)溶解物を
全量300 μl中に含み、反応を30℃で30分間行った。その後の融合体形成を促進
するために、KClおよびMgCl2をそれぞれ、全量500 μl中に最終濃度590 mMおよ
び50 mMとなるように加えた。インキュベーションは20℃で60分継続した。溶解
液を結合緩衝液(100 mMトリス、pH 8.0、10 mM EDTA、1M NaCl、0.25%(v/v
)トライトンX-100)10 mlに希釈して、10 mgオリゴdTセルロースタイプ7(フ
ァルマシア社、ピスキャタウェイ、ニュージャージー州)を加えることによって
産物を単離した。試料を4℃で60分回転させた後、EDTAを含まない氷冷結合緩衝
液5 mlによって固相支持体を洗浄して、水100 μlアリコートによって溶出した
。融合体産物が分画2および3に認められ、これらの分画を合わせた。融合体11
の全収量を、1.6 pmole(加えたRNAの3.2%)となるように組み入れられた[35S]
メチオニンのシンチレーション計数によって決定した。
施した(図15)。まず、上記の20 μlのオリゴ-dT精製材料11を0.5 μlのプライ
マー5(50 μM)および6 μlの第一の鎖緩衝液(ギブコBRL社のスーパースクリ
プトIIキット(Superscript II kit);250 mMトリス塩酸、pH 8.3、375 KCl、1
5 mM MgCl2)と混合して、80℃にて2分間という短い時間で加熱して、その後徐
々に0℃に冷却した。ソラレンフォトクロスリンク形成は、試料にλ>310 nm[
石英の液浸ウェル中にパイレックス(登録商標)吸光スリーブを備えた450 W中 圧液浸灯(ACEグラス、バインランド、ニュージャージー州)]を0℃で15分照射 することによって誘導した。次に、0.6 μlのdNTPミックス(各25 mM)、3 μl の0.1 M DTT、および0.4 μlのスーパースクリプトII逆転写酵素(80単位)を加 えて、cDNA合成を42℃で60分実施した。次に、0.5 μlのRNアーゼH(1単位)( プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州)を加えた後に37℃で60分インキュ ベーションを継続することによってRNA部分を除去した。最終的に、50 pmolsの プライマー9を加えて、42℃でさらに60分インキュベートすることによって二本 鎖DNA 14を生成した。非クロスリンク試料の対照反応は図15に示すように実施し た。産物分析は、変性6%TBE-尿素ゲル(ノベックス社、サンジエゴ、カリフォ ルニア州)で電気泳動を行った後に、[35S]標識産物のバンドを燐造影装置のス クリーンに暴露して可視化することによって行った(図16)。
、フォトクロスリンクした、およびフォトクロスリンクしていない反応経路の順
にゲルに載せた。図16に示すように、ゲルの移動度は、予測された挙動と十分に
一致し、DNA・蛋白質融合体13の構成を明らかに確証する。
ー構築物7(5 μM)を、100 mM NaClを含む25 mMトリス緩衝液pH 7.0中で標的R
NA3(2.5 μM)にアニーリングして、ホウケイ酸ガラスバイアル(カインブル/
コンテス社、バインランド、ニュージャージー州)中で、長波長側に設定した携
帯型の多波長UV灯モデルUVGL-25(UVP社、アップランド、カリフォルニア州)を
用いて室温で15分照射することによってクロスリンクした。産物分析は、6%TB
E-尿素ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動の後、UVシャドウイングによる可視
化によって行った。これらの結果は、開始材料(図17のゲル「A」)のほぼ定量
的変換が示された。フォトライゲーションした産物RNAは、残りのライゲーショ
ンしていないRNAおよび過剰量のリンカーからさらに分離することなくインビト
ロ翻訳に用いた。インビトロ翻訳および融合体形成反応は、全量300 μl中にRNA
100 pmoleを加えて、上記のタイプC2に記載のように実施した。オリゴdTセルロ
ースで精製した後、5.5 pmoleのRNA・融合体15を得た。一本鎖DNA・蛋白質融合
体16および二本鎖DNA・蛋白質融合体17への変換は、それぞれタイプC2融合体(
図17のゲル「B」)に関して記述したように、逆転写(スーパースクリプトIIキ
ット、ギブコBRL社、グランドアイランド、ニューヨーク州)およびRNアーゼH(
プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州)処理によって行われた。
べると、上記のタイプB3融合体に関して概説した手順の後にRNA2をリンカー6
にクロスリンクした。変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の後、ライゲーショ
ンした産物18が収率12%で単離された。インビトロ翻訳、融合体形成、およびDN
A・蛋白質融合体19の調製は、上記のタイプB3融合体に関して記述したように実
施して、同様の効率で融合体が形成された。
較して評価するために、以下の実験を実施した。逆転写緩衝溶液中のDNA融合体1
6(タイプB3)またはRNA融合体15、10 μlに、0.2 μlのRNアーゼH(0.4単位)
、0.2 μlのRNアーゼI(2単位)、0.2 μlのT4 DNAポリメラーゼ(3'-5'エキソ
ヌクレアーゼ活性)(0.6単位)、または2.5 μlの2.0 M NaOHのいずれかを加え
た。試料を37℃で30分インキュベートした後、4〜12% NuPageゲル(ノベックス
社、サンジエゴ、カリフォルニア州)において分析して、オートラジオグラフィ
ーを行った。結果を図19に示し、リボヌクレアーゼ処理および塩基処理に対する
DNA融合体の安定性の増加を確認した。
11もしくは12、またはDNA融合体13もしくは14(タイプC2)のいずれか5 nMを、
3 μg/μl CHO-K1細胞膜とともに、50 mMトリス塩酸pH 8.3、75 mM KCl、3mM M
gCl2、および10 mM DTTを含む溶液中で室温でインキュベートした。リボヌクレ
アーゼ活性を阻害するための20 mMバナジルリボヌクレオシド複合体(「VRC」)
を含む、RNA融合体11および12の追加的な試料を調製した。0分、5分、15分、3
0分、60分、120分、および24時間後にアリコートを採取して、4〜12% NuPageゲ
ル(ノベックス社)で電気泳動を行った後、燐造影装置スクリーンへ暴露するこ
とによって分析した。残った融合体の相対量をインキュベーション時間に対して
プロットすると、得られた曲線から図示されて半減期が得られた。図20に示すよ
うに、全ての構築物は、調べた条件下で全く安定であるように思われたdsDNA融
合体14を除き、最初の2時間のあいだに50%以上の分解を示した。24時間のイン
キュベーション後、全ての融合体構築物をヌクレアーゼまたはプロテアーゼ活性
のいずれかにより完全に分解した。
および認識方法を含む如何なる選択方法において用いてもよい。一例としての選
択方法は、例えば、全てが参照として本明細書に組み入れられる、ゾスタック(
Szostak)ら、米国特許出願第09/007,005号および米国特許出願第09/247,190号
;ゾスタック(Szostak)ら、国際公開公報第98/31700号;ロバーツおよびゾス
タック(Roberts & Szostak)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1997)、第94巻
、12297〜12302頁;リポフセク(Lipovsek)ら、米国特許出願第60/096,818号お
よび米国特許出願第09/374,962号;ならびにクイメリス(Kuimelis)ら、米国特
許出願第60/080,686号および米国特許出願第09/282,734号に記載されている。
白質融合体に関して想像される如何なる応用に用いてもよい。商業的用途には、
インビトロ進化技術による所望の特性を有するポリペプチドの単離(例えば、ゾ
スタック(Szostak)ら、米国特許出願第09/007,005号および米国特許出願第09/
247,190号;ゾスタック(Szostak)ら、国際公開公報第98/31700号;ロバーツお
よびゾスタック(Roberts & Szostak)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1997)
、第94巻、12297〜12302頁を参照のこと)、細胞mRNAに由来するcDNAライブラリ
ーのスクリーニング(例えば、リポフセク(Lipovsek)ら、1998年8月17日に出
願された米国特許出願第60/096,818号を参照のこと)、および蛋白質・蛋白質相
互作用に基づく新規遺伝子のクローニング(ゾスタック(Szostak)ら、米国特
許出願第09/007,005号および米国特許出願第09,247,190号;ゾスタック(Szosta
k)ら、国際公開公報第98/31700号)、ならびに蛋白質ディスプレイ実験におけ
るこれらの融合体の使用(クイメリス(Kuimelis)ら、米国特許出願第60/080,6
86号および米国特許出願第09/282,734号)が含まれる。さらに、本明細書に記載
のDNA・蛋白質融合体は、細胞全体、溶解物、または生体液のような、リボヌク
レアーゼをおそらく含む生物材料を含む、結合および分子認識アッセイ法に用い
てもよい。これらのDNA・蛋白質融合体は、特に製薬および農業分野における如
何なる適当な治療目的、診断目的、または研究目的のために用いてもよい。
ーションを伴う、DNA・蛋白質融合体(タイプA1)を生成する方法の概略図であ
る。
ある。
る適したリンカーとのフォトクロスリンクを伴う、DNA・蛋白質融合体を作製す
る方法の概略図である。
法の概略図である。
ロスリンクを伴う、DNA・蛋白質融合体の生成方法の概略図である。
とのソラレン媒介フォトクロスリンクを伴う、DNA・蛋白質融合体の作製方法の
略図である。
ロスリンクを伴うDNA・蛋白質融合体のもう一つの生成方法の概略図である。
クを伴う、DNA・蛋白質融合体の生成方法の概略図である。
クを伴う、DNA・蛋白質融合体の生成方法の概略図である。
いられるオリゴヌクレオチド構築物(配列番号:1〜6)の概略図である。
合体の抵抗性分析を示す写真である。
蛋白質融合体産物の実験的に決定された半減期を示すグラフである。
Claims (54)
- 【請求項1】 以下の段階を含む、DNA・蛋白質融合体を生成する方法: (a)ペプチドアクセプターに結合している核酸プライマーを、RNA分子に結合さ
せる段階; (b)該RNAを翻訳して、該プライマーに共有結合している蛋白質産物を生成する
段階;および (c)該RNAを逆転写して、DNA蛋白質融合体を生成する段階。 - 【請求項2】 以下の段階を含む、DNA・蛋白質融合体を生成する方法: (a)RNA・蛋白質融合体を生成する段階: (b)核酸プライマーを該融合体にハイブリダイズさせる段階;および (c)該RNAを逆転写してDNA・蛋白質融合体を生成する段階。
- 【請求項3】 RNAを除去するために段階(c)の産物を処理する段階をさら
に含む、請求項1または2記載の方法。 - 【請求項4】 処理段階が、RNAを消化するために十分な条件下で段階(c)
の産物をRNアーゼHに接触させる段階を含む、請求項3記載の方法。 - 【請求項5】 核酸プライマーがDNAプライマーである、請求項1または2
記載の方法。 - 【請求項6】 翻訳段階がインビトロで行われる、請求項1または2記載の
方法。 - 【請求項7】 ペプチドアクセプターがピューロマイシンである、請求項1
記載の方法。 - 【請求項8】 核酸プライマーがヘアピン構造を有する、請求項1記載の方
法。 - 【請求項9】 プライマーがフォトクロスリンク剤をさらに含む、請求項1
または2記載の方法。 - 【請求項10】 フォトクロスリンク剤がソラレンである、請求項9記載の
方法。 - 【請求項11】 プライマーがペプチドアクセプターに結合したオリゴヌク
レオチドにクロスリンクしている、請求項9記載の方法。 - 【請求項12】 プライマーがRNA分子にハイブリダイズして、結合段階が
フォトクロスリンクによって行われる、請求項9記載の方法。 - 【請求項13】 ペプチドアクセプターを通じて蛋白質に共有結合したDNA
を含む分子。 - 【請求項14】 ペプチドアクセプターがピューロマイシンである、請求項
13記載の分子。 - 【請求項15】 蛋白質が少なくとも10個のアミノ酸を含む、請求項13記載
の分子。 - 【請求項16】 蛋白質が少なくとも10個のアミノ酸を含む、蛋白質に共有
結合したDNAを含む分子。 - 【請求項17】 蛋白質が少なくとも30個のアミノ酸を含む、請求項13また
は16記載の分子。 - 【請求項18】 蛋白質が少なくとも100個のアミノ酸を含む、請求項17記
載の分子。 - 【請求項19】 蛋白質がDNAによってコードされる、請求項13または16記
載の分子。 - 【請求項20】 蛋白質がDNAによって完全にコードされる、請求項13また
は16記載の分子。 - 【請求項21】 分子が、DNAに共有結合したリボ核酸をさらに含む、請求
項13または16記載の分子。 - 【請求項22】 蛋白質がリボ核酸によってコードされる、請求項21記載の
分子。 - 【請求項23】 DNAが二本鎖である、請求項13または16記載の分子。
- 【請求項24】 各融合体が蛋白質に共有結合したDNAを含む、少なくとも1
05個のDNA・蛋白質融合体の集団。 - 【請求項25】 集団が少なくとも1014個の融合体を含む、請求項24記載の
集団。 - 【請求項26】 蛋白質が少なくとも10個のアミノ酸を含む、請求項24記載
の集団。 - 【請求項27】 蛋白質が少なくとも30個のアミノ酸を含む、請求項26記載
の集団。 - 【請求項28】 蛋白質が少なくとも100個のアミノ酸を含む、請求項27記
載の集団。 - 【請求項29】 蛋白質が共有結合したDNAによってコードされる、請求項2
4記載の集団。 - 【請求項30】 蛋白質が共有結合したDNAによって完全にコードされる、
請求項24記載の集団。 - 【請求項31】 融合体が、DNAに共有結合したリボ核酸をさらに含む、請
求項24記載の集団。 - 【請求項32】 蛋白質がリボ核酸によってコードされる、請求項31記載の
集団。 - 【請求項33】 DNAがペプチドアクセプターを通じて蛋白質に共有結合す
る、請求項24記載の集団。 - 【請求項34】 ペプチドアクセプターがピューロマイシンである、請求項
33記載の集団。 - 【請求項35】 DNAが二本鎖である、請求項24記載の集団。
- 【請求項36】 以下の段階を含む、所望の蛋白質またはそれをコードする
DNAを選択する方法: a) それぞれが候補蛋白質に共有結合したDNAを含む、DNA蛋白質融合体の集
団を提供する段階;および b) 所望のDNA・蛋白質融合体を選択して、それによって該所望の蛋白質また
はDNAを選択する段階。 - 【請求項37】 以下の段階を含む、基準蛋白質と比較して機能が変化して
いる蛋白質またはそれをコードするDNAを選択する方法: a) それぞれが、候補蛋白質に共有結合して、該基準蛋白質コード配列とは
異なる候補蛋白質コード配列を有するDNAを含む、候補DNA・蛋白質融合体の集団
を形成する段階;および b) 機能が変化したDNA・蛋白質融合体を選択して、それによって機能が変化
した蛋白質またはそれをコードするDNAを選択する段階。 - 【請求項38】 蛋白質がDNAによってコードされる、請求項36または37記
載の方法。 - 【請求項39】 DNA・蛋白質融合体が、DNAに共有結合したリボ核酸をさら
に含む、請求項36または37記載の方法。 - 【請求項40】 蛋白質がリボ核酸によってコードされる、請求項39記載の
方法。 - 【請求項41】 蛋白質が少なくとも10個のアミノ酸を含む、請求項36また
は37記載の方法。 - 【請求項42】 蛋白質が少なくとも30個のアミノ酸を含む、請求項41記載
の方法。 - 【請求項43】 蛋白質が少なくとも100個のアミノ酸を含む、請求項42記
載の方法。 - 【請求項44】 DNAがペプチドアクセプターを通じて蛋白質に共有結合す
る、請求項36または37記載の方法。 - 【請求項45】 ペプチドアクセプターがピューロマイシンである、請項44
記載の方法。 - 【請求項46】 候補DNA・蛋白質融合体の集団が、少なくとも105個の異な
るDNA分子を含む、請求項36または37記載の方法。 - 【請求項47】 候補DNA・蛋白質融合体の集団が、少なくとも1014個の異
なるDNA分子含む、請求項46記載の方法。 - 【請求項48】 選択段階が、固定された結合パートナーに所望の蛋白質を
結合させる段階を含む、請求項36または37記載の方法。 - 【請求項49】 選択段階が、所望の蛋白質の機能的な活性をアッセイする
段階を含む、請求項36または37記載の方法。 - 【請求項50】 段階(a)および(b)を繰り返す段階をさらに含む、請求
項36または37記載の方法。 - 【請求項51】 DNAが二本鎖である、請求項36または37記載の方法。
- 【請求項52】 それぞれが蛋白質に共有結合したDNAを含む、固定された
分子のアレイを含む固相支持体。 - 【請求項53】 蛋白質がDNAによってコードされる、請求項52記載の固相
支持体。 - 【請求項54】 固相支持体がマイクロチップである、請求項52記載の固相
支持体。
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