CN114057857A

CN114057857A - 基于chagasin的支架组合物、方法和应用

Info

Publication number: CN114057857A
Application number: CN202111344438.8A
Authority: CN
Inventors: 罗伯特·A·拉扎勒斯; 亨利·R·毛恩
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2014-06-20
Filing date: 2015-06-19
Publication date: 2022-02-18
Also published as: US20170174733A1; JP2017526379A; EP3157945A1; US10562946B2; CN106573961A; HK1231496A1; CN106573961B; EP3157945A4; WO2015196070A1; JP6655074B2

Abstract

提供了从chagasin或chagasin‑样蛋白酶抑制剂蛋白来源的新的非天然存在的chagasin支架蛋白。还提供了非天然存在的chagasin支架蛋白的文库和使用这样的文库制备特异性地结合靶配体的非天然存在的chagasin支架蛋白的方法。本发明还提供了使用结合靶配体的非天然存在的chagasin蛋白支架的方法，包括诊断和治疗组合物和方法。本发明还提供了特异性地结合低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)的新的非天然存在的chagasin支架蛋白和特异性地结合血管内皮生长因子(VEGF)的新的非天然存在的chagasin支架蛋白。

Description

基于CHAGASIN的支架组合物、方法和应用

本申请是国际申请号PCT/US2015/036690，国际申请日2015年6月19日，进入中国国家阶段日期为2017年2月9日，中国国家申请号为201580042845.X，发明名称为“基于CHAGASIN的支架组合物、方法和应用”的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年6月20日提交的美国临时申请系列号62/015,296的优先权权益，其内容通过引用整体并入本文。

背景技术

来自替代蛋白支架的新蛋白的设计和工程改造在最近的十年中已经成为一个新出现的领域，其具有从结构生物学和成像工具至目前正在临床试验中的治疗试剂的广泛应用范围(HK Binz等人，Nat Biotechnol 23，1257-1268，2005；HK Binz和A Pluckthun，CurrOpin Biotechnol 16，459-469，2005；SS Sidhu和S Koide，Curr Opin Struct Biol 17，481-487，2007；A Skerra，Curr Opin Biotechnol 18，295-304，2007；C Gronwall和SStahl，J Biotechnol 140，254-269，2009；T Wurch等人，Trends Biotechnol 30，575-582，2012；S Banta等人，Annu Rev BiomedEng 15，93-113，2013)。

潜在替代支架分子的合乎需要的物理性能包括热折叠和解折叠的高热稳定性和可逆性。已经应用几种方法来增加蛋白和酶的表观热稳定性，包括基于与非常类似的热稳定的序列的对比的合理设计、稳定二硫键的设计、突变以增加α-螺旋倾向、盐桥的工程改造、蛋白的表面电荷的改变、定向进化和共有序列的组成(Lehmann和Wyss，Curr OpinBiotechnol 12，371-375，2001)。

Chagasin是来自寄生虫克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)的内源性蛋白，所述克氏锥虫是美洲锥虫病的成因病原体(ACS Monteiro等人，J Cell Sci 114，3933-3942，2001)。Chagasin是半胱氨酸蛋白酶抑制剂的I42家族的标志成员，并且最初在原生动物寄生虫中发现；已经发现与chagasin同源的蛋白同样广泛分布在原核生物和真核生物中(DJ Rigden等人，FEBS Lett 504，41-44，2001；SJ Sanderson等人，FEBS Lett 542，12-16，2003)。Chagasin被分离为结合主要溶酶体半胱氨酸蛋白酶cruzipain的热稳定蛋白，所述cruzipain是寄生虫侵入哺乳动物宿主细胞并在其中繁殖所必需的。除了cruzipain以外，chagasin还抑制其它半胱氨酸蛋白酶诸如Falcipain2、Falcipain 3、组织蛋白酶B、L、K和H(SX Wang等人，Structure 15，535-543，2007)。迄今为止，已经描述了chagasin的几种同系物(D Salmon等人，J Mol Biol 357，1511-1521，2006；BO Smith等人，J Biol Chem 281，5821-5828，2006；G Hansen等人，Structure 19，919-929，2011)。单独的chagasin以及与半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶、组织蛋白酶B、组织蛋白酶L和Falcipain2形成复合物的chagasin的晶体结构已经证实，从β-夹心蛋白支架伸出的三个环(分别命名为L2、L4和L6或BC、DE和FG)是结合这些蛋白酶的活性部位裂缝以便抑制酶活性所必需的(AA Figueiredoda Silva等人，J Struct Biol 157，416-423，2007；A Ljunggren等人，J Mol Biol 371，137-153，2007；SX Wang等人，Structure 15，535-543，2007；I Redzynia等人，J Biol Chem283，22815-22825，2008；I Redzynia等人，FEBS J 276，793-806，2009)。Chagasin具有独特的免疫球蛋白-样折叠，其与人CD8α具有同源性(DJ Rigden等人，FEBS Lett 504，41-44，2001；SX Wang等人，Structure 15，535-543，2007)。

因而，需要开发用于多种治疗和诊断应用的小的、稳定的、人工抗体-样分子。本发明满足了该需要和其它需要。

发明内容

本文提供了非天然存在的chagasin支架蛋白，其包含在环2(L2)、环4(L4)和/或环6(L6)中的至少一个氨基酸改变，参考野生型chagasin-样半胱氨酸蛋白酶抑制剂。在某些实施方案中，所述野生型chagasin-样半胱氨酸蛋白酶抑制剂来自克氏锥虫(T.cruzi)(Dm28c克隆)、克氏锥虫(CL Brenner株，同种型1)、克氏锥虫(CL Brenner株，同种型2)、布氏锥虫(T.brucei)、墨西哥利什曼原虫(L.mexicana)、硕大利什曼原虫(L.major)、溶组织内阿米巴(E.hystolytica)或铜绿假单孢菌(P.aeruginosa)。在某些实施方案中，所述野生型chagasin-样半胱氨酸蛋白酶抑制剂来自人CD8T-细胞表面糖蛋白、人白介素-1受体1型(IL-1R1)或人血管细胞粘附分子-1(Vcam-1)。在某些实施方案中，所述野生型chagasin-样半胱氨酸蛋白酶抑制剂是具有在SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的克氏锥虫(CLBrenner株，同种型1)。在某些实施方案中，L2包含氨基酸序列X_5-8-GF(SEQ ID NO：151)，其中X代表任意氨基酸。在某些实施方案中，L2包含氨基酸序列SNX_3-6-GF(SEQ ID NO：152)，其中X代表任意氨基酸。在某些实施方案中，L4包含氨基酸序列X_7-15-GAGG(SEQ ID NO：153)，其中X代表任意氨基酸。在某些实施方案中，L6包含氨基酸序列X_3-12(SEQ ID NO：154)，其中X代表任意氨基酸。在某些实施方案中，L6包含氨基酸序列X₁₀(SEQ ID NO：106)，其中X代表任意氨基酸。在某些实施方案中，以上任意实施方案的非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白特异性地结合靶配体。在某些实施方案中，所述靶配体是蛋白、核酸、多糖、脂多糖、脂质或磷脂。在某些实施方案中，所述靶配体是蛋白。在某些实施方案中，所述蛋白是细胞表面蛋白、可溶性蛋白、病毒蛋白、细菌蛋白、与眼疾病有关的蛋白、与癌症有关的蛋白、与骨疾病有关的蛋白、与炎症有关的蛋白或治疗性蛋白。在某些实施方案中，所述蛋白是LRP6。在某些实施方案中，所述蛋白是VEGF。

在某些实施方案中，以上实施方案中任一项的非天然存在的chagasin支架蛋白与治疗剂缀合。在某些实施方案中，以上实施方案中任一项的非天然存在的chagasin支架蛋白与标记缀合。在某些实施方案中，所述标记选自由放射性同位素、荧光染料和酶组成的组。

本文还提供了一种分离的核酸，其编码根据以上实施方案中的任一项的非天然存在的chagasin支架蛋白。本文还提供了一种表达载体，其编码根据以上实施方案中的任一项的核酸分子。本文还提供了一种细胞，其包含根据以上实施方案中的任一项的表达载体。

本文提供了一种生产根据以上实施方案中的任一项的非天然存在的chagasin支架蛋白的方法。所述方法可以包括：培养包含根据以上实施方案中的任一项的表达载体的细胞，和从细胞培养物回收非天然存在的chagasin支架蛋白。还提供了一种生产根据以上实施方案中的任一项的非天然存在的chagasin支架蛋白的方法。所述方法可以包括化学合成非天然存在的chagasin支架蛋白。

本文还提供了一种组合物，其含有根据以上实施方案中的任一项的非天然存在的chagasin支架蛋白和药学上可接受的载体。

本文还包括多肽展示文库。所述展示文库可以包括多个根据以上实施方案中的任一项的非天然存在的chagasin支架蛋白。在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白展示在核糖体、噬菌体、病毒、细菌或酵母细胞的表面上。在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白展示在噬菌体上。在某些实施方案中，所述噬菌体是丝状噬菌体。在某些实施方案中，所述丝状噬菌体是M13噬菌体。在某些实施方案中，所述多肽文库具有约10⁸至约10¹⁴的序列多样性。本文还提供了核酸分子，其编码根据以上实施方案中的任一项的多肽展示文库。本文还提供了一种表达载体，其可操作地连接至根据以上实施方案中的任一项的核酸分子。

本文还包括一种得到特异性地结合靶配体的非天然存在的chagasin支架蛋白的方法。所述方法可以包括：(a)在允许形成非天然存在的chagasin支架蛋白：靶配体复合物的条件下，使靶配体与根据以上实施方案中的任一项的文库接触；(b)检测非天然存在的chagasin支架蛋白：靶配体复合物的形成；和(c)从所述复合物得到特异性地结合靶配体的非天然存在的chagasin支架蛋白。在某些实施方案中，所述方法还可以包括，将在步骤(c)中得到的非天然存在的chagasin支架蛋白的L2、L4和/或L6随机化以产生进一步随机化的非天然存在的chagasin支架蛋白，和使用所述进一步随机化的非天然存在的chagasin支架蛋白重复步骤(a)和(b)。

在某些实施方案中，本文提供了一种非天然存在的chagasin支架蛋白，其特异性地结合与结合人低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白相同的表位，其中所述结合人LRP6的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNP-T/S/A/Q-T/C/D(SEQ ID NO：150)或SN-V/A-D(155)的L2，包含氨基酸序列Y/S-N-N/K-I/V-R/K-G-L/V/I-PGF (SEQ ID NO：156)或SN-Y/S-TK-H/R(SEQ ID NO：157)或DSNEIWYC(SEQ ID NO：77)的L4；和包含氨基酸序列R/S/P/G-P/R-W/Y/E/S/V-T/Y/K/T-G-P/S/A-S/T/Y-H/K/L/Q/D-D/V/E-S/E/M/P/V(SEQ ID NO：148)的L6，根据SEQ ID NO：2。本文还提供了一种抗体，其特异性地结合与结合人低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)的非天然存在的chagasin支架蛋白相同的表位，其中所述结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNP-T/S/A/Q-T/C/D(SEQ ID NO：150)或SN-V/A-D(155)的L2，包含氨基酸序列Y/S-N-N/K-I/V-R/K-G-L/V/I-PGF(SEQ ID NO：156)或SN-Y/S-TK-H/R(SEQID NO：157)或DSNEIWYC(SEQ ID NO：77)的L4；和包含氨基酸序列R/S/P/G-P/R-W/Y/E/S/V-T/Y/K/T-G-P/S/A-S/T/Y-H/K/L/Q/D-D/V/E-S/E/M/P/V(SEQ ID NO：148)的L6，根据SEQ IDNO：2。

本发明提供了一种特异性地结合人低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中所述非天然存在的chagasin支架蛋白与结合人LRP6的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白竞争结合，其中所述结合人LRP6的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNP-T/S/A/Q-T/C/D(SEQ ID NO：150)或SN-V/A-D(155)的L2，包含氨基酸序列Y/S-N-N/K-I/V-R/K-G-L/V/I-PGF(SEQ ID NO：156)或SN-Y/S-TK-H/R(SEQ ID NO：157)或DSNEIWYC(SEQ ID NO：77)的L4；和包含氨基酸序列R/S/P/G-P/R-W/Y/E/S/V-T/Y/K/T-G-P/S/A-S/T/Y-H/K/L/Q/D-D/V/E-S/E/M/P/V(SEQ ID NO：148)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在以上任意实施方案的某个实施方案中(或如应用于以上任意实施方案的)，特异性地结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNP-T/S/A/Q-T/C/D(SEQ ID NO：150)或SN-V/A-D(155)的L2，包含氨基酸序列Y/S-N-N/K-I/V-R/K-G-L/V/I-PGF(SEQ ID NO：156)或SN-Y/S-TK-H/R(SEQ ID NO：157)或DSNEIWYC(SEQ ID NO：77)的L4；和包含氨基酸序列R/S/P/G-P/R-W/Y/E/S/V-T/Y/K/T-G-P/S/A-S/T/Y-H/K/L/Q/D-D/V/E-S/E/M/P/V(SEQ ID NO：148)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，本文提供了一种非天然存在的chagasin支架蛋白，其特异性地结合与结合人低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白相同的表位，其中所述结合人LRP6的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列S-N/S-P/N-Q/T/V/S/A-T/D/C-GF(SEQ ID NO：6)的L2，包含氨基酸序列P-S/Y-N-N/K-V/I-K/R-G-V/I/L-PGFGAGG(SEQ ID NO：10)、PSN-S/Y-TK-H/R-GAGG(SEQ ID NO：90)或DSNEIWYC(SEQ ID NO：77)的L4；和包含氨基酸序列G/R/P/S-P/R-W/S/V/Y/E-T/K/Y-G-A/P/S-S/Y/T-Q/D/L/H/K-E/D/V-P/S/M/E(SEQ ID NO：14)的L6，根据SEQ ID NO：2。本文还提供了一种抗体，其特异性地结合与结合人低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)的非天然存在的chagasin支架蛋白相同的表位，其中所述结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列S-N/S-P/N-Q/T/V/S/A-T/D/C-GF(SEQ ID NO：6)的L2，包含氨基酸序列P-S/Y-N-N/K-V/I-K/R-G-V/I/L-PGFGAGG(SEQ ID NO：10)、PSN-S/Y-TK-H/R-GAGG(SEQ ID NO：90)或DSNEIWYC(SEQ ID NO：77)的L4；和包含氨基酸序列G/R/P/S-P/R-W/S/V/Y/E-T/K/Y-G-A/P/S-S/Y/T-Q/D/L/H/K-E/D/V-P/S/M/E(SEQ ID NO：14)的L6，根据SEQ IDNO：2。

本发明提供了一种特异性地结合人低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中所述非天然存在的chagasin支架蛋白与结合人LRP6的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白竞争结合，其中所述结合人LRP6的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列S-N/S-P/N-Q/T/V/S/A-T/D/C-GF(SEQ ID NO：6)的L2，包含氨基酸序列P-S/Y-N-N/K-V/I-K/R-G-V/I/L-PGFGAGG(SEQ ID NO：10)、PSN-S/Y-TK-H/R-GAGG(SEQ ID NO：90)或DSNEIWYC(SEQ ID NO：77)的L4；和包含氨基酸序列G/R/P/S-P/R-W/S/V/Y/E-T/长/Y-G-A/P/S-S/Y/T-Q/D/L/H/K-E/D/V-P/S/M/E(SEQ ID NO：14)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在以上任意实施方案的某个实施方案中(或如应用于以上任意实施方案的)，特异性地结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列S-N/S-P/N-Q/T/V/S/A-T/D/C-GF(SEQ ID NO：6)的L2，包含氨基酸序列P-S/Y-N-N/K-V/I-K/R-G-V/I/L-PGFGAGG(SEQ ID NO：10)、PSN-S/Y-TK-H/R-GAGG(SEQ ID NO：90)或DSNEIWYC(SEQ ID NO：77)的L4；和包含氨基酸序列G/R/P/S-P/R-W/S/V/Y/E-T/K/Y-G-A/P/S-S/Y/T-Q/D/L/H/K-E/D/V-P/S/M/E(SEQ ID NO：14)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，本文提供了特异性地结合人低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)的非天然存在的chagasin支架蛋白且包含：包含在SEQ ID NO：3-5、78-80和146中的任一个中所示的氨基酸序列的L2，包含在SEQ ID NO：7-9、77和81-83中的任一个中所示的氨基酸序列的L4；和包含在SEQ ID NO：11-13、84-86和147中的任一个中所示的氨基酸序列的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，本文提供了特异性地结合人低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)的非天然存在的chagasin支架蛋白且包含：包含在SEQ ID NO：3-5中的任一个中所示的氨基酸序列的L2，包含在SEQ ID NO：7-9中的任一个中所示的氨基酸序列的L4；和包含在SEQ ID NO：11-13中的任一个中所示的氨基酸序列的L6，根据SEQ ID NO：2。在某些实施方案中，L2包含氨基酸序列SNPQT(SEQ ID NO：3)，L4包含氨基酸序列SNKVKGVPGF(SEQ IDNO：7)；且L6包含氨基酸序列GPWTGASQEP(SEQ ID NO：11)。在某些实施方案中，L2包含氨基酸序列SNPTT(SEQ ID NO：4)，L4包含氨基酸序列SNKIKGIPGF(SEQ ID NO：8)；且L6包含氨基酸序列RPSTGPSDDS(SEQ ID NO：12)。在某些实施方案中，L2包含氨基酸序列SNVD(SEQ IDNO：5)，L4包含氨基酸序列SNSTKR(SEQ ID NO：9)；且L6包含氨基酸序列PRVKGAYLVM(SEQ IDNO：13)。

在某些实施方案中，所述特异性地结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNPTT(SEQ ID NO：4)的L2，包含氨基酸序列YNNIRGLPGF(SEQ ID NO：81)的L4；和包含氨基酸序列RPWTGPSHDS(SEQ ID NO：84)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，所述特异性地结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNPSC(SEQ ID NO：79)的L2，包含氨基酸序列DSNEIWYC(SEQ ID NO：82)的L4；和包含氨基酸序列SPYYGPTKVE(SEQ ID NO：85)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，所述特异性地结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNPAD(SEQ ID NO：80)的L2，包含氨基酸序列SNYTKH(SEQ ID NO：83)的L4；和包含氨基酸序列PREKGSSLVM(SEQ ID NO：86)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，所述特异性地结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNAD(SEQ ID NO：146)的L2，包含氨基酸序列SNSTKR(SEQ ID NO：9)的L4；和包含氨基酸序列RREKGSTLVV(SEQ ID NO：147)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQID NO：16中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述特异性地结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：87中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述特异性地结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：88中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述特异性地结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：89中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述特异性地结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：149中所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，根据以上任意实施方案的非天然存在的chagasin支架蛋白以500nM至1pM的Kd结合人LRP6。在某些实施方案中，根据以上任意实施方案的非天然存在的chagasin支架蛋白特异性地结合LRP6并抑制Wnt1信号传递。

在另一个实施方案中，本文提供了一种非天然存在的chagasin支架蛋白，其特异性地结合与结合人血管内皮生长因子(VEGF)的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白相同的表位，其中所述结合人VEGF的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SN-L/Y-R/F/Q-S/Y/N/D-M/D/A/S(SEQ ID NO：23)的L2，包含氨基酸序列A/N/L/S/V-G/D/S/R-P/L/T/A-S/G/Y/T-A/S/G/Q-V/R/S/K/A-P/L/E/S/N-L/S/T/N/E(SEQ ID NO：29)的L4；和包含氨基酸序列A/N/F/S-P/K-W/N/S/V-R/L/W-G-P/L-A/S/D/M/R-N/R/Y/V/F-V/W/P-I/L(SEQ ID NO：35)的L6，根据SEQ ID NO：2。本文还包括一种抗体，其特异性地结合与结合人血管内皮生长因子(VEGF)的非天然存在的chagasin支架蛋白相同的表位，其中所述结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SN-L/Y-R/F/Q-S/Y/N/D-M/D/A/S(SEQ ID NO：23)的L2，包含氨基酸序列A/N/L/S/V-G/D/S/R-P/L/T/A-S/G/Y/T-A/S/G/Q-V/R/S/K/A-P/L/E/S/N-L/S/T/N/E(SEQ ID NO：29)的L4；和包含氨基酸序列A/N/F/S-P/K-W/N/S/V-R/L/W-G-P/L-A/S/D/M/R-N/R/Y/V/F-V/W/P-I/L(SEQ ID NO：35)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在另一个实施方案中，本文提供了一种特异性地结合人血管内皮生长因子(VEGF)的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中所述非天然存在的chagasin支架蛋白与结合人VEGF的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白竞争结合，其中所述结合人VEGF的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SN-L/Y-R/F/Q-S/Y/N/D-M/D/A/S(SEQID NO：23)的L2，包含氨基酸序列A/N/L/S/V-G/D/S/R-P/L/T/A-S/G/Y/T-A/S/G/Q-V/R/S/K/A-P/L/E/S/N-L/S/T/N/E(SEQ ID NO：29)的L4；和包含氨基酸序列A/N/F/S-P/K-W/N/S/V-R/L/W-G-P/L-A/S/D/M/R-N/R/Y/V/F-V/W/P-I/L(SEQ ID NO：35)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在以上任意实施方案的某个实施方案中(或如应用于以上任意实施方案的)，所述结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SN-L/Y-R/F/Q-S/Y/N/D-M/D/A/S(SEQ ID NO：23)的L2，包含氨基酸序列A/N/L/S/V-G/D/S/R-P/L/T/A-S/G/Y/T-A/S/G/Q-V/R/S/K/A-P/L/E/S/N-L/S/T/N/E(SEQ ID NO：29)的L4；和包含氨基酸序列A/N/F/S-P/K-W/N/S/V-R/L/W-G-P/L-A/S/D/M/R-N/R/Y/V/F-V/W/P-I/L(SEQ ID NO：35)的L6。在以上任意实施方案的某个实施方案中(或如应用于以上任意实施方案的)，所述结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含在SEQ ID NO：18-22中的任一个中所示的氨基酸序列的L2，包含在SEQ ID NO：24-28中的任一个中所示的氨基酸序列的L4；和包含在SEQ ID NO：30-34中的任一个中所示的氨基酸序列的L6。在某些实施方案中，L2包含氨基酸序列SNLRSM(SEQ ID NO：18)，L4包含氨基酸序列AGPSAVPL(SEQ ID NO：24)，且L6包含氨基酸序列APWRGPANVI(SEQ ID NO：30)。在某些实施方案中，L2包含氨基酸序列SNYFYD(SEQ IDNO：19)，L4包含氨基酸序列NDPGSRLS(SEQ ID NO：25)，且L6包含氨基酸序列APWLGPSRVL(SEQ ID NO：31)。在某些实施方案中，L2包含氨基酸序列SNLQNA(SEQ ID NO：20)，L4包含氨基酸序列LSLYASET(SEQ ID NO：26)，且L6包含氨基酸序列NPNWGPDYWI(SEQ ID NO：32)。在某些实施方案中，L2包含氨基酸序列SNLQDS(SEQ ID NO：21)，L4包含氨基酸序列SGTTGKSN(SEQ ID NO：27)，且L6包含氨基酸序列FKSRGLMVPL(SEQ ID NO：33)。在某些实施方案中，L2包含氨基酸序列SNYRDS(SEQ ID NO：22)，L4包含氨基酸序列VRAGQANE(SEQ ID NO：28)，且L6包含氨基酸序列SPVLGPRFWL(SEQ ID NO：34)。在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：36中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：38中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：40中所示的氨基酸序列。

本文还提供了一种非天然存在的chagasin支架蛋白，其特异性地结合与结合人血管内皮生长因子(VEGF)的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白相同的表位，其中所述结合人VEGF的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNY-F/Y-Y/C/N/R-D/E(SEQ ID NO：49)的L2，包含氨基酸序列HYYNLGGRYT(SEQ ID NO：57)、D/N/S-D/G/V/Y-P/N/S-G/Y-S/L/M-G/H/S-L/V/A/Y-W/Y/L/S (SEQ ID NO：58)或G/H-S/V-S/Q-Y/W-W/G-G/W(SEQ ID NO：68)的L4，和包含氨基酸序列A/G-PW-S/Q/F/A/L/V-GPSR-Y/E/F/V/D-L(SEQ IDNO：67)的L6，根据SEQ ID NO：2。本文还包括一种抗体，其特异性地结合与结合人血管内皮生长因子(VEGF)的非天然存在的chagasin支架蛋白相同的表位，其中所述结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNY-F/Y-Y/C/N/R-D/E(SEQ ID NO：49)的L2，包含氨基酸序列HYYNLGGRYT(SEQ ID NO：57)、D/N/S-D/G/V/Y-P/N/S-G/Y-S/L/M-G/H/S-L/V/A/Y-W/Y/L/S(SEQ ID NO：58)或G/H-S/V-S/Q-Y/W-W/G-G/W(SEQ ID NO：68)的L4，和包含氨基酸序列A/G-PW-S/Q/F/A/L/V-GPSR-Y/E/F/V/D-L(SEQ ID NO：67)的L6，根据SEQ ID NO：2。

本文还包括一种特异性地结合人血管内皮生长因子(VEGF)的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中所述非天然存在的chagasin支架蛋白与结合人VEGF的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白竞争结合，其中所述结合人VEGF的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNY-F/Y-Y/C/N/R-D/E(SEQ ID NO：49)的L2，包含氨基酸序列HYYNLGGRYT(SEQ ID NO：57)、D/N/S-D/G/V/Y-P/N/S-G/Y-S/L/M-G/H/S-L/V/A/Y-W/Y/L/S(SEQ ID NO：58)或G/H-S/V-S/Q-Y/W-W/G-G/W(SEQ ID NO：68)的L4，和包含氨基酸序列A/G-PW-S/Q/F/A/L/V-GPSR-Y/E/F/V/D-L(SEQ ID NO：67)的L6，根据SEQ ID NO：2。在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNY-F/Y-Y/C/N/R-D/E(SEQ ID NO：49)的L2，包含氨基酸序列HYYNLGGRYT(SEQ ID NO：57)、D/N/S-D/G/V/Y-P/N/S-G/Y-S/L/M-G/H/S-L/V/A/Y-W/Y/L/S(SEQ ID NO：58)或G/H-S/V-S/Q-Y/W-W/G-G/W(SEQ ID NO：68)的L4，和包含氨基酸序列A/G-PW-S/Q/F/A/L/V-GPSR-Y/E/F/V/D-L(SEQ ID NO：67)的L6，根据SEQ ID NO：2。在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含在SEQ ID NO：19和42-48中的任一个中所示的氨基酸序列的L2，包含在SEQ ID NO：50-57中的任一个中所示的氨基酸序列的L4；和包含在SEQ ID NO：59-66中的任一个中所示的氨基酸序列的L6。在某些实施方案中，L2包含氨基酸序列SNYFYD(SEQ ID NO：19)，L4包含氨基酸序列DDPGSGLW(SEQ ID NO：50)，且L6包含氨基酸序列APWSGPSRYL(SEQID NO：59)。在某些实施方案中，L2包含氨基酸序列SNYFYE(SEQ ID NO：42)，L4包含氨基酸序列NGPGLGVY(SEQ ID NO：51)，且L6包含氨基酸序列APWQGPSREL(SEQ ID NO：60)。在某些实施方案中，L2包含氨基酸序列SNYYYD(SEQ ID NO：48)，L4包含氨基酸序列NVNGSHAW(SEQID NO：52)，且L6包含氨基酸序列APWSGPSRFL(SEQ ID NO：61)。在某些实施方案中，L2包含氨基酸序列SNYFCD(SEQ ID NO：44)，L4包含氨基酸序列NYPGSGVL(SEQ ID NO：53)，且L6包含氨基酸序列APWFGPSRVL(SEQ ID NO：62)。在某些实施方案中，L2包含氨基酸序列SNYFND(SEQ ID NO：45)，L4包含氨基酸序列GSSYWG(SEQ ID NO：54)，且L6包含氨基酸序列APWAGPSRVL(SEQ ID NO：63)。在某些实施方案中，L2包含氨基酸序列SNYFYD(SEQ ID NO：19)，L4包含氨基酸序列SGSYMSYS(SEQ ID NO：55)，且L6包含氨基酸序列APWLGPSRDL(SEQID NO：64)。在某些实施方案中，L2包含氨基酸序列SNYFRE(SEQ ID NO：47)，L4包含氨基酸序列HVQWGW(SEQ ID NO：56)，且L6包含氨基酸序列APWVGPSREL(SEQ ID NO：65)。在某些实施方案中，L2包含氨基酸序列SNYYYD(SEQ ID NO：48)，L4包含氨基酸序列HYYNLGGRYT(SEQID NO：57)，且L6包含氨基酸序列GPWLGPSRVL(SEQ ID NO：66)。在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：69中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：70中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：71中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：72中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ IDNO：73中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：74中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：75中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：76中所示的氨基酸序列。

本文还提供了一种非天然存在的chagasin支架蛋白，其特异性地结合与结合人血管内皮生长因子(VEGF)的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白相同的表位，其中所述结合人VEGF的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNYY-Y/K-D(SEQID NO：114)的L2，包含氨基酸序列HY-Y/Q/S/T-NLGGRYT(SEQ ID NO：115)的L4；和包含氨基酸序列GPWLGPSRVL(SEQ ID NO：66)的L6，根据SEQ ID NO：2。本文还提供了一种特异性地结合人血管内皮生长因子(VEGF)的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中所述非天然存在的chagasin支架蛋白与结合人VEGF的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白竞争结合，其中所述结合人VEGF的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNYY-Y/K-D(SEQ ID NO：114)的L2，包含氨基酸序列HY-Y/Q/S/T-NLGGRYT(SEQ ID NO：115)的L4；和包含氨基酸序列GPWLGPSRVL(SEQ ID NO：66)的L6，根据SEQ ID NO：2。在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNYY-Y/K-D(SEQ ID NO：114)的L2，包含氨基酸序列HY-Y/Q/S/T-NLGGRYT(SEQ ID NO：115)的L4；和包含氨基酸序列GPWLGPSRVL(SEQ ID NO：66)的L6，根据SEQ ID NO：2。在某些实施方案中，L2包含在SEQ IDNO：48和110中的任一个中所示的氨基酸序列，L4包含在SEQ ID NO：57和111-113中的任一个中所示的氨基酸序列；且L6包含在SEQ ID NO：66中所示的氨基酸序列，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，L2包含氨基酸序列SNYYKD(SEQ ID NO：110)，L4包含氨基酸序列HYYNLGGRYT(SEQ ID NO：57)；且L6包含氨基酸序列GPWLGPSRVL(SEQ ID NO：66)，根据SEQID NO：2。在某些实施方案中，L2包含氨基酸序列SNYYYD(SEQ ID NO：48)，L4包含氨基酸序列HYQNLGGRYT(SEQ ID NO：111)；且L6包含氨基酸序列GPWLGPSRVL(SEQ ID NO：66)，根据SEQ ID NO：2。在某些实施方案中，L2包含氨基酸序列SNYYYD(SEQ ID NO：48)，L4包含氨基酸序列HYSNLGGRYT(SEQ ID NO：112)；且L6包含氨基酸序列GPWLGPSRVL(SEQ ID NO：66)，根据SEQ ID NO：2。在某些实施方案中，L2包含氨基酸序列SNYYYD(SEQ ID NO：48)，L4包含氨基酸序列HYTNLGGRYT(SEQ ID NO：113)；且L6包含氨基酸序列GPWLGPSRVL(SEQ ID NO：66)，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：116中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQID NO：117中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：118中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：119中所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，根据以上任意实施方案的非天然存在的chagasin支架蛋白以500nM至1pM的Kd结合人VEGF。在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白形成同源二聚体。

在某些实施方案中，根据以上实施方案中的任一项的结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白和/或根据以上实施方案中的任一项的结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白与治疗剂缀合。在某些实施方案中，根据以上实施方案中的任一项的结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白和/或根据以上实施方案中的任一项的结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白与标记缀合。在某些实施方案中，所述标记选自由放射性同位素、荧光染料和酶组成的组。

本发明还提供了一种分离的核酸分子，其编码根据以上实施方案中的任一项的结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白或根据以上实施方案中的任一项的结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白。本发明还提供了编码根据以上任意实施方案的核酸分子的表达载体。本文还提供了包含根据以上任意实施方案的表达载体的细胞。

本发明提供了一种生产根据以上实施方案中的任一项的结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白和/或根据以上实施方案中的任一项的结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白的方法，所述方法包括：培养根据以上任意实施方案的细胞，和从细胞培养物回收根据以上实施方案中的任一项的结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白或根据以上实施方案中的任一项的结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白。本发明还提供了一种生产根据以上实施方案中的任一项的结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白或根据以上实施方案中的任一项的结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白的方法，所述方法包括：化学合成结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白或结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白。

本发明提供了一种如下检测来自患者的样品中的LRP6蛋白的方法：使根据以上任意实施方案的结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白与样品接触，和检测与LRP6蛋白结合的非天然存在的chagasin支架蛋白。本发明还提供了一种如下检测来自患者的样品中的VEGF蛋白的方法：使根据以上任意实施方案的结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白与样品接触，和检测与VEGF蛋白结合的非天然存在的chagasin支架蛋白。在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白用在免疫组织化学测定(IHC)或ELISA测定中。

本发明提供了一种组合物，其包含根据以上任意实施方案的结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白和药学上可接受的载体。还提供了一种治疗受试者中的癌症、转移性疾病、骨质疏松症、骨代谢疾病、神经元疾病、神经变性疾病、类风湿性关节炎或其它炎性疾病的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的所述组合物。还提供了用于治疗癌症、转移性疾病、骨质疏松症、骨代谢疾病、神经元疾病、神经变性疾病、类风湿性关节炎或其它炎性疾病的组合物，其包含根据以上任意实施方案的结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白。还提供了根据以上任意实施方案的结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白在药物制备中的用途，所述药物用于治疗癌症、转移性疾病、骨质疏松症、骨代谢疾病、神经元疾病、神经变性疾病、类风湿性关节炎或其它炎性疾病。

本发明还提供了一种组合物，其包含根据以上任意实施方案的结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白和药学上可接受的载体。本发明提供了一种抑制受试者中的血管生成(angiogenesis)和/或血管通透性(vascular permeability)或漏出(1eakage)的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的所述组合物。提供了一种治疗受试者中以血管生成和/或血管通透性或漏出为特征的疾病的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的所述组合物。在某些实施方案中，所述疾病是癌症、眼疾病或炎性疾病。本发明提供了一种用于治疗受试者中以血管生成和/或血管通透性或漏出为特征的疾病的组合物，其包含根据以上任意实施方案的结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白。本发明还提供了根据以上任意实施方案的结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白在药物制备中的用途，所述药物用于治疗受试者中以血管生成和/或血管通透性或漏出为特征的疾病。

附图说明

图1显示了来自不同生物的chagasin-样蛋白酶抑制剂的序列比对。

图2A显示了ELISA的结果，所述ELISA为了测量噬菌体展示的chagasin与木瓜蛋白酶的结合而执行。

图2B显示了ELISA的结果，所述ELISA为了测量噬菌体展示的chagasin与抗体的结合而执行，所述抗体对与chagasin的N-端融合的gD表位标签是特异性的。

图3显示了与Dkk1肽Ac-NSNAIKN-NH₂(SEQ ID NO：109)形成复合物的LRP6-E1的晶体结构。

图4A显示了实验的结果，所述实验为了确定LRP6结合剂H(其氨基酸序列显示在SEQ ID NO：87中)的结合动力学而执行。

图4B显示了实验的结果，所述实验为了确定LRP6结合剂P(其氨基酸序列显示在SEQ ID NO：88中)的结合动力学而执行。

图4C显示了实验的结果，所述实验为了确定LRP6结合剂S(其氨基酸序列显示在SEQ ID NO：89中)的结合动力学而执行。

图5A显示了实验的结果，所述实验为了确定LRP6结合剂H2(其氨基酸序列显示在SEQ ID NO：15中)的结合动力学而执行。

图5B显示了实验的结果，所述实验为了确定LRP6结合剂H15(其氨基酸序列显示在SEQ ID NO：16中)的结合动力学而执行。

图5C显示了实验的结果，所述实验为了确定LRP6结合剂S11(其氨基酸序列显示在SEQ ID NO：17中)的结合动力学而执行。

图6显示了实验的结果，所述实验为了确定LRP6结合剂H2、H15和S11是否能够抑制Wnt依赖性的细胞信号传递而执行。

图7显示了chagasin VEGF变体5-44-D8(SEQ ID NO：36)、4-66-F6(SEQ ID NO：37)、2-40-D4(SEQ ID NO：38)、1-90-H6(SEQ ID NO：39)和3-65-F5(SEQ ID NO：40)与包被在ELISA平板上的VEGF(包被在384Maxisorp上的5μg/ml VEGF)的噬菌体结合滴定。

图8显示了实验的结果，所述实验为了确定GST融合的chagasin VEGF变体1-90-H6(SEQ ID NO：39)、2-40-D4(SEQ ID NO：38)、3-65-F5(SEQ ID NO：40)、4-66-F6(SEQ ID NO：37)和5-44-D8(SEQ ID NO：36)在竞争结合ELISA中阻断VEGF与VEGFR1-ECD Fc融合体结合的能力而执行。

图9显示了实验的结果，所述实验为了确定单独的和与GST融合的VEGF变体4-66-F6(SEQ ID NO：37)在竞争结合ELISA中阻断VEGF与VEGFR1-ECD Fc融合体结合的能力而执行。

图10A显示了在基于细胞的测定中的实验的结果，所述实验为了确定GST融合的chagasin VEGF变体对人VEGF的抑制活性而执行。(变体3的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：40中；变体4的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：37中；WT的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：1中。)

图10B显示了在基于细胞的测定中的实验的结果，所述实验为了确定GST融合的chagasin VEGF变体对小鼠VEGF的抑制活性而执行。(变体3的氨基酸序列显示在SEQ IDNO：40中；变体4的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：37中；WT的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：1中。)

图10C显示了在基于细胞的测定中的实验的结果，所述实验为了确定GST融合的chagasin VEGF变体对大鼠VEGF的抑制活性而执行。(变体3的氨基酸序列显示在SEQ IDNO：40中；变体4的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：37中；WT的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：1中。)

图11显示了在基于细胞的测定中的实验的结果，所述实验为了确定GST-chagasinVEGF变体4、变体4(SEQ ID NO：37)和抗-VEGF抗体对人VEGF的抑制活性而执行。

图12显示了通过噬菌体斑点ELISA确定的33个对VEGF具有高靶标亲和力和特异性的噬菌体克隆的部分序列。

图13显示了在基于细胞的测定中的实验的结果，所述实验为了确定亲和力成熟的chagasin VEGF变体对人VEGF的抑制活性而执行。(WT的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：1中；结合剂4的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：37中；E4B-5的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：70中；E4B-7的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：71中；E4B-10的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：69中；L4X6-3的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：73中；L4X6-7的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：75中；和L4X6-9的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：74中。)

图14显示了实验的结果，所述实验为了确定溶液中的单体chagasin VEGF变体L4X6-7(其氨基酸序列显示在SEQ ID NO：75中)对生物素化的VEGF109的结合动力学而执行。

图15显示了chagasin VEGF变体37(即，SEQ ID NO：72)和66(SEQ ID NO：76)的SDS-PAGE分析和结合动力学。

具体实施方式

本发明提供了从chagasin或chagasin-样蛋白酶抑制剂蛋白来源的新的非天然存在的chagasin支架蛋白。本文提供的chagasin支架蛋白是非常热稳定的，这又可以增加得到的重组蛋白的收率，提高纯化的分子的溶解度，提高细胞内支架的活性，降低免疫原性，和使制造中对冷链的需要最小化。

非天然存在的chagasin支架蛋白的总体折叠使得在相对取向上以与抗体CDR类似的方式展示它的环中的三个(L2、L4和L6)成为可能。因为该结构，本发明的支架具有在性质和亲和力上与抗体类似的抗原结合性能。因此，本文提供的非天然存在的chagasin支架蛋白会结合靶配体上的表位(即，决定簇)，更象抗体结合抗原的表位。

本文提供了非天然存在的chagasin支架蛋白的文库和使用这样的文库制备特异性地结合靶配体的非天然存在的chagasin支架蛋白的方法。还提供了使用本文中公开的结合靶配体的非天然存在的chagasin蛋白支架的方法。所述方法可以包括、但不限于诊断和治疗方法。本文还包括诊断和治疗组合物。

在一个有关的方面，本发明提供了特异性地结合低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)的新的非天然存在的chagasin支架蛋白和特异性地结合血管内皮生长因子(VEGF)的新的非天然存在的chagasin支架蛋白。

还提供了包含本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白的嵌合分子和缀合物、编码本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白的核酸、和组合物(诸如药物组合物)。本发明还提供了使用本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白检测样品(诸如体内或离体样品)中的LRP6或VEGF或另一种靶标的方法，用于治疗疾病和病症(其源自异常LRP6活性或表达或源自异常VEGF活性或表达)的包含本文描述的这样的非天然存在的chagasin支架蛋白的组合物，和这样的非天然存在的chagasin支架蛋白在用于治疗癌症的药物的制备中的用途。

除非另有说明，本公开内容的实践采用细胞生物学、毒理学、分子生物学、生物化学、细胞培养、免疫学、肿瘤学、重组DNA的领域和有关领域中的标准方法和常规技术，这些属于本领域的技能。这样的技术描述在文献中且由此可被本领域技术人员得到。参见，例如，Alberts，B.等人，“Molecular Biology of the Cell，”第5版，Garland Science，NewYork，NY，2008；Voet，D.等人.“Fundamentals of Biochemistry：Life at the MolecularLevel，”第3版，John Wiley&Sons，Hoboken，NJ，2008；Sambrook，J.等人，“MolecularCloning：A Laboratory Manual，”第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001；Ausubel，F.等人，“Current Protocols in Molecular Biology，”John Wiley&Sons，NewYork，1987和定期更新；Freshney，R.I.，“Culture of Animal Cells：A Manual of BasicTechnique，”第4版，John Wiley&Sons，Somerset，NJ，2000；和系列“Methods inEnzymology，”Academic Press，San Diego，CA。

定义

本文中使用的“非天然存在的”是指在自然界中不存在的多肽或核酸。通过基因工程方法或通过化学合成方法可以生产非天然存在的chagasin支架蛋白(或编码它们的核酸)。因而，本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白可以是重组的(即，由细胞生产)，或核酸，或载体，所述载体已经通过引入异源核酸或将天然核酸改变成对于该细胞而言非天然的形式而进行修饰，或所述细胞从如此修饰的细胞来源。可替换地，通过化学肽合成可以生产本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白。

本文中使用的“氨基酸改变”表示从天然存在的蛋白序列(诸如天然存在的chagasin蛋白序列或chagasin-样蛋白酶抑制剂蛋白序列)中的对应序列添加、缺失或置换至少一个氨基酸。

“分离的”非天然存在的chagasin支架蛋白或组合物是已经经过鉴定并从它的天然环境的组分分离和/或回收的chagasin支架蛋白或组合物。它的天然环境的污染物组分是干扰非天然存在的chagasin支架蛋白的诊断或治疗用途的物质，且可以包括酶、激素和其它蛋白性的或非蛋白性的溶质。在优选的实施方案中，将非天然存在的chagasin支架蛋白或组合物纯化(1)至大于95重量％的非天然存在的chagasin支架蛋白，如通过Lowry方法所确定的，且最优选地超过99重量％，(2)至足以得到N-端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，通过使用旋转杯序列分析仪，或(3)至同质性，通过在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选银染料的SDS-PAGE。分离的非天然存在的chagasin支架蛋白包括在重组细胞内的原位chagasin支架蛋白，因为chagasin支架蛋白的天然环境的至少一种组分不存在。但是，通常，通过至少一个纯化步骤制备分离的非天然存在的chagasin支架蛋白。

相对于本文中鉴别的多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”或“同源性”被定义为，将任何保守置换视作序列同一性的组成部分来比对序列以后，与正在对比的多肽中的氨基酸残基相同的候选序列中的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域技术中的多种方式实现，例如，使用公众可得到的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括达到正在对比的序列的全长上的最大比对所需的任何算法。但是，为了本文的目的，使用序列对比计算机程序ALIGN-2产生％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列对比计算机程序由Genentech，Inc.创作，且源代码已经与用户文档一起提交在美国版权办公室(U.S.Copyright Office，Washington D.C.，20559)，其中它在美国版权登记号TXU510087下登记。ALIGN-2程序可通过Genentech，Inc.，South San Francisco，California公开得到。ALIGN-2程序应当为了用在UNIX操作系统、优选数字UNIX V4.0D上经过编译。所有序列对比参数由ALIGN-2程序设定并且不改变。

本文中公开的非天然存在的chagasin支架蛋白或组合物的“有效量”是足以实现特别说明的目的的量。可以经验地和通过与所述目的有关的已知方法确定“有效量”。

术语“治疗有效量”表示有效地“治疗”哺乳动物(也称作患者)中的疾病或病症的如在本文中公开的非天然存在的chagasin支架蛋白或组合物的量。在癌症的情况下，治疗有效量的本文中公开的非天然存在的chagasin支架蛋白或组合物可以减少癌细胞的数目；减小肿瘤大小或重量；抑制(即，在某种程度上减慢和优选地停止)癌细胞向周围器官中的浸润；抑制(即，在某种程度上减慢和优选地停止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；和/或在某种程度上解除与癌症有关的一种或多种征状。就本文中公开的非天然存在的chagasin支架蛋白或组合物可以阻止生长和/或杀死现有癌细胞而言，它可以是细胞生长抑制性的和/或细胞毒性的。在一个实施方案中，所述治疗有效量是抑制生长的量。在另一个实施方案中，所述治疗有效量是延长患者的存活的量。在另一个实施方案中，所述治疗有效量是改善患者的无进展存活的量。

本文中使用的“治疗”是得到有益的或期望的结果(包括临床结果)的方案。为了本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括、但不限于以下的一种或多种：减轻由疾病引起的一种或多种征状，减小疾病的范围，使疾病稳定(例如，防止或延缓疾病恶化)，预防或延迟疾病的传播(例如，转移)，预防或延迟疾病的复发，延缓或减慢疾病发展，改善疾病状态，提供疾病的减轻(部分或全部)，减小治疗疾病所需的一种或多种其它药物的剂量，延迟疾病的进展，增加或改善生活质量，增加重量增加，和/或延长存活。“治疗”也包括癌症的病理学后果(例如，肿瘤体积)的减小。本发明的方法预见到治疗的这些方面的任意一种或多种。

“病症”是将受益于使用本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白的治疗的任何病症。例如，遭受异常LRP6表达或活性或异常VEGF表达或活性或需要针对它们的预防的哺乳动物。这包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易感目标病症的那些病理学状况。在本文中要治疗的LRP6相关病症的非限制性例子包括癌症和转移性疾病、骨质疏松症和其它骨代谢和疾病、神经元和神经变性疾病、类风湿性关节炎和其它炎性疾病，如本文别处所述。在本文中要治疗的VEGF相关病症的非限制性例子包括癌症、眼疾病、炎性疾病，如本文别处所述。

本文中使用的“药学上可接受的”或“药理学上相容的”是指不是在生物学上或在其它方面不希望的物质，例如，所述物质可以掺入施用给患者的药物组合物中，而不会造成任何显著的不希望的生物学效应或与它所在的组合物的任何其它组分以有害的方式相互作用。药学上可接受的载体或赋形剂已经优选地满足毒理学和制造试验的要求标准和/或被包括在美国食品和药品管理局(U.S.Food and Drug administration)制备的无活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)上。

术语“检测”意图包括确定物质的存在或不存在，或定量物质(诸如靶配体)的量。该术语因而表示本发明的物质、组合物和方法用于定性和定量测定的用途。一般而言，用于检测的具体技术对于本发明的实践而言不是至关重要的。

例如，根据本发明的“检测”可以包括：观察靶配体(包括，但不限于，人低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)多肽或人血管内皮生长因子(VEGF)多肽)的存在或不存在；靶配体的水平的变化；和/或靶配体的生物学功能/活性的变化。在某些实施方案中，“检测”可以包括检测靶配体的水平(例如，人LRP6或人VEGF的多肽水平)。检测可以包括定量与对照相比在10％至90％之间的任何值或在30％至60％之间的任何值或超过100％的变化(增加或减少)。检测可以包括定量在2倍至10倍(包括端点)之间的任何值或更多(例如，100倍)的变化。

词语“标记”当在本文中使用时表示与非天然存在的chagasin支架蛋白直接地或间接地缀合的可检测的化合物或组合物。所述标记本身可以是自身可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者，在酶标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。

关于非天然存在的chagasin支架蛋白与靶配体的结合，术语“特异性结合特定靶配体”或“与特定靶配体特异性地结合”或“对特定靶配体特异性的”是指所述结合在测量上不同于非特异性的相互作用。可以测量特异性结合，例如，通过相对于对照分子的结合确定分子的结合，所述对照分子通常是不具有结合活性的类似结构的分子。例如，通过与对照分子的竞争可以确定特异性结合，所述对照分子类似于靶标，例如，过量的未标记的靶标。在该情况下，如果标记的靶标与探针的结合被过量的未标记的靶标竞争性地抑制，则指示特异性结合。在某些实施方案中，非天然存在的chagasin支架蛋白与“非靶”配体的结合程度将小于非天然存在的chagasin支架蛋白与它的靶配体的结合的约10％，如通过例如荧光活化细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)所确定的。在某些实施方案中，在约4℃、25℃、37℃或45℃的温度测量，本公开内容的非天然存在的chagasin支架蛋白以以下解离常数(Kd)特异性地结合靶配体(包括，但不限于，人低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)或人血管内皮生长因子(VEGF))：等于或低于100nM，任选地低于10nM，任选地低于1nM，任选地低于0.5nM，任选地低于0.1nM，任选地低于0.01nM，或任选地低于0.005nM。

在本文中对“约”值或参数的提及表示在该技术领域中的技术人员容易知道的各个值的通常误差范围。在本文中对“约”值或参数的提及表示包括(和描述)涉及该值或参数本身的方面。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。

应当理解，本文描述的发明的方面和实施方案包括“包含方面和实施方案”、“由方面和实施方案组成”和”基本上由方面和实施方案组成”。

在本文中引用的所有参考文献(包括专利申请和出版物)特此通过引用整体并入。

非天然存在的Chagasin支架蛋白

Chagasin是Clan CA(即家族C1半胱氨酸肽酶(CP))的天然抑制剂，其在原生动物克氏锥虫中鉴别出，所述克氏锥虫是人美洲锥虫病的致病因子(Monteiro等人(2001)J.Cell Sci.114：3933-3942；Marin-Neto等人(2007)Circulation.115：1101-1108)。它是与其它已知CP抑制剂集合没有序列相似性的单个110-残基多肽链，并通过1∶1紧密结合复合物的形成而有效地灭活木瓜蛋白酶-样酶。在其它原生动物和细菌中存在的Chagasin-样抑制剂已经被命名为ICP(半胱氨酸肽酶的抑制剂)，且一起构成chagasin家族(Clan JL的家族I42)(Rigden等人(2002)Protein Sci.11，1971-1977；Sanderson等人(2003)FEBSLett.542：12-16；MEROPS数据库(环球网at-merops.sanger.ac.uk/)。

Chagasin同系物通常是110-130个氨基酸长，且不含有任何额外结构域。保守的核心结构包括7个预测β-链(图1)，在侧面具有另外1或2个潜在β-链。以前的折叠识别和建模实验有说服力地支持Ig-型结构域超过其它β-夹心结构。此外，chagasin序列与抗体轻链可变结构域共有序列的对比揭示了关键残基的保守，包括提示远进化关系的不变色氨酸和几个邻居。

通过NMR确定的chagasin和墨西哥利什曼原虫(Leishmania mexlcana)ICP的溶液结构表明，所述分子具有Ig-样折叠和3个暴露的环区域(即，环2(L2)、环4(L4)和环6(L6))，它们带有进化上保守的残基，位于所述分子的一端(Salmon D等人(2006)J.Mol.Biol.357：1511-1521；Smith 等人(2006)J.Biol.Chem.281：5821-5828。这3个关键环L2(残基28-34)、L4(残基59-69)和L6(残基91-100)分别含有：(i)NPTTG基序；(ii)保守区，其带有2个疏水残基和随后的GXGG；和(iii)RPW/F基序(Salmon D等人(2006)J.Mol.Biol.357：1511-1521)。chagasin与cruzipain接触后的化学位移扰动的研究将L2、L4和L6中的残基鉴别为候选物以包含chagasin的与靶酶的结合位点(Salmon D等人(2006)J.Mol.Biol.357：1511-1521)。该假设被chagasin的高分辨率晶体结构向cruzain(截短的重组cruzipain)的高分辨率结构入坞而支持(Figueiredo da Silva等人(2006)J.Struct.Biol.157：416-423)。

来自不同病原性细菌和原生动物的chagasin-样蛋白酶抑制剂的序列比对显示在图1中。残基编号表示克氏锥虫chagasin。β-链和3₁₀-螺旋分别用箭头和圆筒显示，如在克氏锥虫chagasin NMR结构中所见，并且与β-链有关的序列带有框。环中最保守的残基的位置以粗体突出显示，且保守的疏水(芳族和脂族)残基用黄色显示。克氏锥虫非保守的残基以蓝色突出显示。指出了在CD8中的互补性决定区(CDR 1-3)。Swiss-Prot登录代码如下：来自克氏锥虫(Dm28c克隆)的chagasin-样ICP，Q966X9；CL Brenner株，同种型1，Q4DH32；CLBrenner株，同种型2，Q4DY71)；布氏锥虫(Q868H0)、墨西哥利什曼原虫(Q868H1)、硕大利什曼原虫(Q868G9)、溶组织内阿米巴(Q6KCA4)、铜绿假单孢菌(Q9I5G0)和人结构同系物蛋白CD8T-细胞表面糖蛋白(P01732)，IL-1R1，白介素-1型1受体(P14778)；Vcam-1，血管细胞粘附分子-1(P19320)。摘自D Salmon等人，J Mol Biol，357，1511-1521，2006)。

这样的序列比对揭示了构成环2的残基的高保守度，而环4和环6(其更多地结合在蛋白酶活性部位裂缝的边缘)仅仅是部分保守的(A Ljunggren等人，JMolBiol 371，137-153，2007；SX Wang等人，Structure 15，535-543，2007；I Redzynia等人，J Biol Chem283，22815-22825，2008；I Redzynia等人，FEBS J 276，793-806，2009)。环4的长度在不同生物之间可以从10至21个残基变化，且已经基于NMR分析而发现是非常柔性的(D Salmon等人，J MolBiol 357，1511-1521，2006；BO Smith等人，J Biol Chem 281，5821-5828，2006)。

在一个方面，本发明提供了一种非天然存在的chagasin支架蛋白，其包含环2(L2)、环4(L4)和/或环6(L6)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考野生型chagasin或野生型chagasin-样半胱氨酸蛋白酶抑制剂。术语“支架”表示在蛋白文库的构建中用作保守的常见序列的最小多肽“框架”或“序列基序”。可变的和高变的位置(例如，L2、L4和/或L6)位于支架的固定的或保守的残基/位置之间。多种氨基酸提供在固定的支架残基之间的可变区中以提供与靶配体的特异性结合。支架通常由在序列相关蛋白的家族的比对中观察到的保守残基来限定。固定残基可能是折叠或结构所必需的，特别是如果比对的蛋白的功能是不同的。

在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环2(L2)、环4(L4)和/或环6(L6)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自克氏锥虫(Dm28c克隆)的野生型chagasin。可替换地或额外地，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环1(L1)、环3(L3)和/或环5(L5)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自克氏锥虫(Dm28c克隆)的野生型chagasin。在某些实施方案中，将氨基酸改变引入L1、L3和/或L5中，例如，以建立双特异性的分子或以添加接头。在某些实施方案中，将L1、L3和/或L5工程改造成结合被L2、L4和/或L6结合的相同靶配体上的不同表位。在某些实施方案中，将L1、L3和/或L5工程改造成结合不同于被L2、L4和/或L6结合的靶配体的靶配体。

在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环2(L2)、环4(L4)和/或环6(L6)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自克氏锥虫(CL Brenner株，同种型1)的野生型chagasin。可替换地或额外地，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环1(L1)、环3(L3)和/或环5(L5)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自克氏锥虫(CL Brenner株，同种型1)的野生型chagasin。在某些实施方案中，将氨基酸改变引入L1、L3和/或L5中，例如，以建立双特异性的分子或以添加接头。在某些实施方案中，将L1、L3和/或L5工程改造成结合被L2、L4和/或L6结合的相同靶配体上的不同表位。在某些实施方案中，将L1、L3和/或L5工程改造成结合不同于被L2、L4和/或L6结合的靶配体的靶配体。

在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环2(L2)、环4(L4)和/或环6(L6)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自克氏锥虫(CL Brenner株，同种型2)的野生型chagasin。可替换地或额外地，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环1(L1)、环3(L3)和/或环5(L5)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自克氏锥虫(CL Brenner株，同种型2)的野生型chagasin。在某些实施方案中，将氨基酸改变引入L1、L3和/或L5中，例如，以建立双特异性的分子或以添加接头。在某些实施方案中，将L1、L3和/或L5工程改造成结合被L2、L4和/或L6结合的相同靶配体上的不同表位。在某些实施方案中，将L1、L3和/或L5工程改造成结合不同于被L2、L4和/或L6结合的靶配体的靶配体。

在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环2(L2)、环4(L4)和/或环6(L6)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自布氏锥虫的野生型chagasin-样抑制剂。可替换地或额外地，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环1(L1)、环3(L3)和/或环5(L5)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自布氏锥虫的野生型chagasin-样抑制剂。在某些实施方案中，将氨基酸改变引入L1、L3和/或L5中，例如，以建立双特异性的分子或以添加接头。在某些实施方案中，将L1、L3和/或L5工程改造成结合被L2、L4和/或L6结合的相同靶配体上的不同表位。在某些实施方案中，将L1、L3和/或L5工程改造成结合不同于被L2、L4和/或L6结合的靶配体的靶配体。

在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环2(L2)、环4(L4)和/或环6(L6)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自墨西哥利什曼原虫的野生型chagasin-样抑制剂。可替换地或额外地，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环1(L1)、环3(L3)和/或环5(L5)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自墨西哥利什曼原虫的野生型chagasin-样抑制剂。在某些实施方案中，将氨基酸改变引入L1、L3和/或L5中，例如，以建立双特异性的分子或以添加接头。在某些实施方案中，将L1、L3和/或L5工程改造成结合被L2、L4和/或L6结合的相同靶配体上的不同表位。在某些实施方案中，将L1、L3和/或L5工程改造成结合不同于被L2、L4和/或L6结合的靶配体的靶配体。

在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环2(L2)、环4(L4)和/或环6(L6)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自硕大利什曼原虫的野生型chagasin-样抑制剂。可替换地或额外地，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环1(L1)、环3(L3)和/或环5(L5)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自硕大利什曼原虫的野生型chagasin-样抑制剂。在某些实施方案中，将氨基酸改变引入L1、L3和/或L5中，例如，以建立双特异性的分子或以添加接头。在某些实施方案中，将L1、L3和/或L5工程改造成结合被L2、L4和/或L6结合的相同靶标上的不同表位。在某些实施方案中，将L1、L3和/或L5工程改造成结合不同于被L2、L4和/或L6结合的靶标的靶标。

在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环2(L2)、环4(L4)和/或环6(L6)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自溶组织内阿米巴的野生型chagasin-样抑制剂。可替换地或额外地，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环1(L1)、环3(L3)和/或环5(L5)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自溶组织内阿米巴的野生型chagasin-样抑制剂。在某些实施方案中，将氨基酸改变引入L1、L3和/或L5中，例如，以建立双特异性的分子或以添加接头。在某些实施方案中，将L1、L3和/或L5工程改造成结合被L2、L4和/或L6结合的相同靶标上的不同表位。在某些实施方案中，将L1、L3和/或L5工程改造成结合不同于被L2、L4和/或L6结合的靶标的靶标。

在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环2(L2)、环4(L4)和/或环6(L6)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自铜绿假单孢菌的野生型chagasin-样抑制剂。可替换地或额外地，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环1(L1)、环3(L3)和/或环5(L5)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自铜绿假单孢菌的野生型chagasin-样抑制剂。在某些实施方案中，将氨基酸改变引入L1、L3和/或L5中，例如，以建立双特异性的分子或以添加接头。在某些实施方案中，将L1、L3和/或L5工程改造成结合被L2、L4和/或L6结合的相同靶标上的不同表位。在某些实施方案中，将L1、L3和/或L5工程改造成结合不同于被L2、L4和/或L6结合的靶标的靶标。

在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环2(L2)、环4(L4)和/或环6(L6)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考野生型人CD8 T-细胞表面糖蛋白。可替换地或额外地，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环1(L1)、环3(L3)和/或环5(L5)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考野生型人CD8 T-细胞表面糖蛋白。在某些实施方案中，将氨基酸改变引入L1、L3和/或L5中，例如，以建立双特异性的分子或以添加接头。在某些实施方案中，将L1、L3和/或L5工程改造成结合被L2、L4和/或L6结合的相同靶标上的不同表位。在某些实施方案中，将L1、L3和/或L5工程改造成结合不同于被L2、L4和/或L6结合的靶标的靶标。

在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环2(L2)、环4(L4)和/或环6(L6)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自人白介素-1受体1型(IL-1R1)的野生型chagasin-样抑制剂。可替换地或额外地，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环1(L1)、环3(L3)和/或环5(L5)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自人白介素-1受体1型(IL-1R1)的野生型chagasin-样抑制剂。在某些实施方案中，将氨基酸改变引入L1、L3和/或L5中，例如，以建立双特异性的分子或以添加接头。在某些实施方案中，将L1、L3和/或L5工程改造成结合被L2、L4和/或L6结合的相同靶标上的不同表位。在某些实施方案中，将L1、L3和/或L5工程改造成结合不同于被L2、L4和/或L6结合的靶标的靶标。

在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环2(L2)、环4(L4)和/或环6(L6)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自人血管细胞粘附分子-1(Vcam-1)的野生型chagasin-样抑制剂。可替换地或额外地，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环1(L1)、环3(L3)和/或环5(L5)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自人血管细胞粘附分子-1(Vcam-1)的野生型chagasin-样抑制剂。在某些实施方案中，将氨基酸改变引入L1、L3和/或L5中，例如，以建立双特异性的分子或以添加接头。在某些实施方案中，将L1、L3和/或L5工程改造成结合被L2、L4和/或L6结合的相同靶标上的不同表位。在某些实施方案中，将L1、L3和/或L5工程改造成结合不同于被L2、L4和/或L6结合的靶标的靶标。

在某些实施方案中，为了以下目的将氨基酸改变(诸如添加、缺失或置换)引入非天然存在的chagasin支架蛋白的一个或多个β链中：例如，改善与靶配体的结合，结合相同靶配体上的不同表位，或结合不同于被L2、L4和/或L6结合的靶配体的靶配体(参见，例如，Diem等人(2014)Prot Engineer Des&Sel 27，419-429.)。

在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白至少包含环2(L2)、环4(L4)和/或环6(L6)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考具有在SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的来自克氏锥虫(CLBrenner株，同种型1)的野生型chagasin：

可替换地或额外地，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环1(L1)、环3(L3)和/或环5(L5)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考具有在SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的来自克氏锥虫(CLBrenner株，同种型1)的野生型chagasin。在某些实施方案中，将氨基酸改变引入L1、L3和/或L5中，例如，以建立双特异性的分子或以添加接头。在某些实施方案中，将L1、L3和/或L5工程改造成结合被L2、L4和/或L6结合的相同靶标上的不同表位。在某些实施方案中，将L1、L3和/或L5工程改造成结合不同于被L2、L4和/或L6结合的靶标的靶标。

在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的L1对应于SEQ ID NO：1的氨基酸17-20。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的L2对应于SEQ ID NO：1的氨基酸28-34。在某些实施方案中，SEQID NO：1的L3对应于SEQ ID NO：1的氨基酸39-50。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的L4对应于SEQ ID NO：1的氨基酸59-69。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的L5对应于SEQ ID NO：1的氨基酸77-80。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的L6对应于SEQ ID NO：1的氨基酸91-100。

在某些实施方案中，为了以下目的将氨基酸改变(诸如添加、缺失或置换)引入SEQID NO：1的一个或多个β链1-8中：例如，改善与靶配体的结合，结合相同靶配体上的不同表位，或结合不同于被L2、L4和/或L6结合的靶配体的靶配体(参见，例如，Diem等人(2014)Prot Engineer Des&Sel 27，419-429)。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的β链1对应于SEQID NO：1的氨基酸3-6。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的β链2对应于SEQ ID NO：1的氨基酸13-16。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的β链3对应于SEQ ID NO：1的氨基酸21-26。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的β链4对应于SEQ ID NO：1的氨基酸34-38。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的β链5对应于SEQ ID NO：1的氨基酸51-58。在某些实施方案中，SEQ IDNO：1的β链6对应于SEQ ID NO：1的氨基酸70-76。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的β链7对应于SEQ ID NO：1的氨基酸81-90。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的β链8对应于SEQ IDNO：1的氨基酸101-109。

在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的环2(L2)的长度是至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个或至少14个氨基酸。在某些实施方案中，SEQ IDNO：1的L2包含氨基酸序列X_5-8-GF(SEQ ID NO：151)，其中X代表任意氨基酸。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的L2包含氨基酸序列SNX_3-6-GF(SEQ ID NO：152)，其中X代表任意氨基酸。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的环4(L4)的长度是至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个或至少19个氨基酸。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的L4包含氨基酸序列X_7-15-GAGG(SEQ ID NO：153)，其中X代表任意氨基酸。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的环6(L6)的长度是至少8个、至少9个、或至少10个氨基酸。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的环6(L6)包含氨基酸序列X_3-12(SEQ ID NO：154)，其中X代表任意氨基酸。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的环6(L6)包含氨基酸序列X₁₀(SEQ IDNO：106)，其中X代表任意氨基酸。

在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列：

在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白特异性地结合靶配体。在某些实施方案中，所述靶配体是蛋白、核酸、多糖、脂多糖、脂质、磷脂。在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白结合细胞表面蛋白、可溶性蛋白、哺乳动物蛋白、病毒蛋白、细菌蛋白、与眼疾病有关的蛋白、与癌症有关的蛋白、与炎症有关的蛋白、与骨疾病有关的蛋白、与神经变性疾病有关的蛋白或治疗性蛋白。在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白特异性地结合低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)，诸如人LRP6。在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白特异性地结合血管内皮生长因子(VEGF)，诸如人VEGF。在某些实施方案中，所述VEGF是VEGF-A。

如本文别处所述，通过基因工程可以制备非天然存在的chagasin支架蛋白。因此，本发明提供了通过遗传工程改造本文描述的野生型chagasin或野生型chagasin-样半胱氨酸蛋白酶抑制剂中的任一种而得到的非天然存在的chagasin支架蛋白。可替换地，通过化学肽合成可以制备非天然存在的chagasin支架蛋白，如本文别处所述。因而，在某些实施方案中，本发明提供了通过合成(例如，固相肽合成、液相肽合成等)得到的非天然存在的chagasin支架蛋白。

在某些实施方案中，本发明提供了编码非天然存在的chagasin支架蛋白的核酸分子。这样的核酸分子可以呈RNA的形式，诸如mRNA、hnRNA、tRNA或任意其它形式，或呈DNA的形式，包括、但不限于，通过克隆得到的或合成地生产的cDNA和基因组DNA，或它们的任意组合。所述DNA可以是三链的、双链的或单链的，或它们的任意组合。DNA或RNA的至少一个链的任何部分可以是编码链，也被称作有义链，或它可以是非编码链，也被称作反义链。

本发明的分离的核酸分子可以包括、但不限于编码chagasin支架蛋白或其片段的那些。在某些实施方案中，所述分离的核酸包含另外的非编码序列，包括、但不限于，非编码5’和3’序列，诸如在转录、mRNA加工中起作用的转录的非翻译序列，包括剪接和多腺苷酸化信号(例如，mRNA的核糖体结合和稳定性)。在某些实施方案中，所述分离的核酸包含编码额外氨基酸(诸如提供额外功能性的那些)的额外编码序列。因而，可以使编码蛋白支架的序列与标志物序列融合，所述标志物序列是诸如编码促进融合的chagasin支架蛋白的纯化的肽的序列，编码促进向细胞中的进入的肽(即，细胞-通透性肽)的序列，促进非天然存在的chagasin支架蛋白从细胞分泌的肽和/或促进非天然存在的chagasin支架蛋白向例如内质网、高尔基体、核内体等的定位的肽。

在某些实施方案中，在允许非天然存在的chagasin支架蛋白的表达和非天然存在的chagasin支架蛋白向细胞中的靶配体的结合的条件下，将编码本文提供的非天然存在的chagasin支架蛋白的核酸瞬时转染进细胞中。

在某些实施方案中，提供了包含本文描述的分离的核酸的表达载体。在某些实施方案中，提供了宿主细胞，其包含含有本文描述的分离的核酸的表达载体。在某些实施方案中，在允许非天然存在的chagasin支架蛋白的表达的条件下培养宿主细胞。在某些实施方案中，表达非天然存在的chagasin支架蛋白，以便鉴别非天然存在的chagasin支架蛋白所结合的细胞内靶配体。

本文中提供的非天然存在的chagasin支架蛋白可以以单体形式用作单特异性的或者以多聚体形式用作双或多特异性的(对于不同靶配体或相同靶配体上的不同表位)。连接可以是共价的或非共价的。在某些实施方案中，二聚体的双特异性的非天然存在的chagasin支架蛋白具有一个对第一靶配体或表位具有特异性的亚基和第二个对第二靶配体或表位具有特异性的亚基。非天然存在的chagasin支架蛋白亚基可以以多种构象连接，所述构象可以增加效价并从而增加与靶配体的结合的亲合力。

非天然存在的Chagasin支架蛋白文库

本文提供了包含多个本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白的多肽展示文库。可以筛选这样的多肽展示文库以选择和/或进化出用于多种用途的具有期望性能的结合蛋白，所述用途包括、但不限于治疗、预防、兽医、诊断、试剂或材料用途。

在某些实施方案中，在多肽展示文库中的非天然存在的chagasin支架蛋白与本文描述的天然存在的chagasin或chagasin-样蛋白酶抑制剂的序列具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％氨基酸同源性。

在某些实施方案中，所述多肽展示文库包含非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白含有随机化的L2、L4和/或L6环区域序列，所述环区域序列通过从天然存在的chagasin或chagasin-样蛋白酶抑制剂中的对应环序列缺失、置换或添加至少一个氨基酸而不同。

在某些实施方案中，所述多肽展示文库包含非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白各自包含环2(L2)、环4(L4)和/或环6(L6)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考野生型chagasin或野生型chagasin-样半胱氨酸蛋白酶抑制剂。可替换地或额外地，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环1(L1)、环3(L3)和/或环5(L5)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考野生型chagasin或野生型chagasin-样半胱氨酸蛋白酶抑制剂。

在某些实施方案中，所述多肽展示文库包含非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白各自包含环2(L2)、环4(L4)和/或环6(L6)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)，参考来自克氏锥虫(Dm28c克隆)的野生型chagasin。可替换地或额外地，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环1(L1)、环3(L3)和/或环5(L5)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自克氏锥虫(Dm28c克隆)的野生型chagasin。

在某些实施方案中，所述多肽展示文库包含非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白各自包含环2(L2)、环4(L4)和/或环6(L6)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自克氏锥虫(CL Brenner株，同种型1)的野生型chagasin。可替换地或额外地，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环1(L1)、环3(L3)和/或环5(L5)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自克氏锥虫(CL Brenner株，同种型1)的野生型chagasin。

在某些实施方案中，所述多肽展示文库包含非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白各自包含环2(L2)、环4(L4)和/或环6(L6)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自克氏锥虫(CL Brenner株，同种型2)的野生型chagasin。可替换地或额外地，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环1(L1)、环3(L3)和/或环5(L5)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自克氏锥虫(CL Brenner株，同种型2)的野生型chagasin。

在某些实施方案中，所述多肽展示文库包含非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白各自包含环2(L2)、环4(L4)和/或环6(L6)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自布氏锥虫的野生型chagasin-样抑制剂。可替换地或额外地，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环1(L1)、环3(L3)和/或环5(L5)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自布氏锥虫的野生型chagasin-样抑制剂。

在某些实施方案中，所述多肽展示文库包含非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白各自包含环2(L2)、环4(L4)和/或环6(L6)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自墨西哥利什曼原虫的野生型chagasin-样抑制剂。可替换地或额外地，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环1(L1)、环3(L3)和/或环5(L5)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自墨西哥利什曼原虫的野生型chagasin-样抑制剂。

在某些实施方案中，所述多肽展示文库包含非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白各自包含环2(L2)、环4(L4)和/或环6(L6)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自硕大利什曼原虫的野生型chagasin-样抑制剂。可替换地或额外地，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环1(L1)、环3(L3)和/或环5(L5)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自硕大利什曼原虫的野生型chagasin-样抑制剂。

在某些实施方案中，所述多肽展示文库包含非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白各自包含环2(L2)、环4(L4)和/或环6(L6)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自溶组织内阿米巴的野生型chagasin-样抑制剂。可替换地或额外地，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环1(L1)、环3(L3)和/或环5(L5)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自溶组织内阿米巴的野生型chagasin-样抑制剂。

在某些实施方案中，所述多肽展示文库包含非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白各自包含环2(L2)、环4(L4)和/或环6(L6)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自铜绿假单孢菌的野生型chagasin-样抑制剂。可替换地或额外地，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环1(L1)、环3(L3)和/或环5(L5)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自铜绿假单孢菌的野生型chagasin-样抑制剂。

在某些实施方案中，所述多肽展示文库包含非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白各自包含环2(L2)、环4(L4)和/或环6(L6)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考野生型人CD8T-细胞表面糖蛋白。可替换地或额外地，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环1(L1)、环3(L3)和/或环5(L5)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考野生型人CD8 T-细胞表面糖蛋白。

在某些实施方案中，所述多肽展示文库包含非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白各自包含环2(L2)、环4(L4)和/或环6(L6)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自人白介素-1受体1型(IL-1R1)的野生型chagasin-样抑制剂。可替换地或额外地，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环1(L1)、环3(L3)和/或环5(L5)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自人白介素-1受体1型(IL-1R1)的野生型chagasin-样抑制剂。

在某些实施方案中，所述多肽展示文库包含非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白各自包含环2(L2)、环4(L4)和/或环6(L6)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自人血管细胞粘附分子-1(Vcam-1)的野生型chagasin-样抑制剂。可替换地或额外地，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含环1(L1)、环3(L3)和/或环5(L5)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考来自人血管细胞粘附分子-1(Vcam-1)的野生型chagasin-样抑制剂。

在某些实施方案中，为了以下目的将氨基酸改变(诸如添加、缺失或置换)引入非天然存在的chagasin支架蛋白的一个或多个β链：例如，改善与靶配体的结合，结合相同靶配体上的不同表位，或结合不同于被L2、L4和/或L6结合的靶配体的靶配体(参见，例如，Diem等人(2014)Prot Engineer Des&Sel 27，419-429.)。

在某些实施方案中，所述多肽展示文库包含非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白各自至少包含环2(L2)、环4(L4)和/或环6(L6)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个(例如，至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个)氨基酸改变，参考具有在SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的来自克氏锥虫(CL Brenner株，同种型1)的野生型chagasin：

在某些实施方案中，为了以下目的将氨基酸改变(诸如添加、缺失或置换)引入SEQID NO：1的一个或多个β链1-8中：例如，改善与靶配体的结合，结合相同靶配体上的不同表位，或结合不同于被L2、L4和/或L6结合的靶配体的靶配体(参见，例如，Diem等人(2014)Prot Engineer Des&Sel 27，419-429.)。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的β链1对应于SEQ ID NO：1的氨基酸3-6。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的β链2对应于SEQ ID NO：1的氨基酸13-16。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的β链3对应于SEQ ID NO：1的氨基酸21-26。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的β链4对应于SEQ ID NO：1的氨基酸34-38。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的β链5对应于SEQ ID NO：1的氨基酸51-58。在某些实施方案中，SEQ IDNO：1的β链6对应于SEQ ID NO：1的氨基酸70-76。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的β链7对应于SEQ ID NO：1的氨基酸81-90。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的β链8对应于SEQ IDNO：1的氨基酸101-109。

在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的环2(L2)的长度是至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个或至少14个氨基酸。在某些实施方案中，SEQ IDNO：1的L2包含氨基酸序列X_5-8-GF(SEQ ID NO：151)，其中X代表任意氨基酸。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的环4(L4)的长度是至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个或至少19个氨基酸。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的L4包含氨基酸序列X_7-15-GAGG(SEQ ID NO：153)，其中X代表任意氨基酸。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的环6(L6)的长度是至少8个、至少9个或至少10个氨基酸。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的环6(L6)包含氨基酸序列X₁₀(SEQ ID NO：106)，其中X代表任意氨基酸。

在某些实施方案中，所述多肽展示文库包含非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白各自包含在SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列：

在一个实施方案中，本文提供了非天然存在的chagasin支架蛋白文库，其包含至少2个、3个、4个、5个、10个、30个、100个、250个、500个、750个、1000个、2500个、5000个、7500个、10000个、25000个、50000个、75000个、100000个、250000个、500000个、750000个、1000000个、2500000个、5000000个、7500000个、10000000个或超过10000000个具有独特氨基酸序列的chagasin支架蛋白，包括在这些值之间的任意范围。在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架文库具有约2、约5、约10、约50、约100、约250、约500、约750、约10³、约10⁴、约10⁵、约10⁶、约10⁷、约10⁸、约10⁹、约10¹⁰、约10¹¹、约10¹²、约10¹³、约10¹⁴或超过约10¹⁴(诸如约10¹⁵或约10¹⁶)的序列多样性，包括在这些值之间的任意范围。

在某些实施方案中，通过基因工程制备非天然存在的chagasin支架蛋白文库。以前已经描述了多种用于诱变和随后文库构建的方法(与适当的筛选或选择方法一起)。这样的诱变方法包括、但不限于：例如，易出错的PCR、环改组或寡核苷酸-指导的诱变、随机核苷酸插入或在重组之前的其它方法。关于这些方法的其它细节描述在，例如，Abou-Nadler等人(2010)Bioengineered Bugs 1，337-340；Firth等人(2005)Bioinformatics 21，3314-3315；Cirino等人(2003)MethodsMol Biol 231，3-9；Pirakitikulr(2010)Protein Sci19，2336-2346；Steffens等人(2007)J.Biomol Tech 18，147-149；和其它文献中。因此，在某些实施方案中，提供了通过基因工程技术制备的非天然存在的chagasin支架蛋白文库。

在某些实施方案中，通过体外翻译制备非天然存在的chagasin支架蛋白文库。简而言之，体外翻译需要将蛋白-编码序列克隆进含有启动子的载体中，通过用RNA聚合酶转录克隆的序列来生产mRNA，和通过在体外翻译该mRNA来合成蛋白，例如，使用无细胞的提取物。通过改变克隆的蛋白-编码序列，可以简单地制备期望的突变蛋白。可以在麦胚提取物中或在兔网织红细胞裂解物中有效地翻译许多mRNA。关于体外翻译的其它细节描述在，例如，Hope等人(1985)Cell 43，177-188；Hope等人(1986)Cell 46，885-894；Hope等人(1987)EMBO J.6，2781-2784；Hope等人(1988)Nature 333，635-640；和Melton等人(1984)Nucl.Acids Res.12，7057-7070中。

因此，提供了多个编码本文描述的多肽展示文库的核酸分子。本发明还提供了可操作地连接至所述多个核酸分子的表达载体。

在某些实施方案中，通过化学合成来制备非天然存在的chagasin支架蛋白文库。在某些实施方案中，在chagasin框架上化学合成L2、L4和/或L6肽以制备非天然存在的chagasin支架蛋白文库。固相和液相肽合成的方法是本领域众所周知的，且详细描述在，例如，Methods of Molecular Biology，35，Peptide Synthesis Protocols，(M.W.Pennington和B.M.Dunn编)，Springer，1994；Welsch等人(2010)Curr Opin ChemBiol 14，1-15；Methods of Enzymology，289，Solid Phase Peptide Synthesis，(G.B.Fields编)，Academic Press，1997；Chemical Approaches to the Synthesis ofPeptides and Proteins，(P.Lloyd-Williams，F.Albericio，和E.Giralt编)，CRC Press，1997；Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis，A Practical Approach，(W.C.Chan，P.D.White编)，Oxford University Press，2000；Solid Phase Synthesis，A PracticalGuide，(S.F.Kates，F Albericio编)，Marcel Dekker，2000；P.Seneci，Solid-PhaseSynthesis and Combinatorial Technologies，John Wiley&Sons，2000；Synthesis ofPeptides and Peptidomimetics(M.Goodman，Editor-in-chief，A.Felix，L.Moroder，C.Tmiolo编)，Thieme，2002；N.L.Benoiton，Chemistry of Peptide Synthesis，CRCPress，2005；Methods in Molecular Biology，298，Peptide Synthesis andApplications，(J.Howl编)Humana Press，2005；和Amino Acids，Peptides and Proteinsin Organic Chemistry，第3卷，Building Blocks，Catalysts and Coupling Chemistry，(A.B.Hughs，编)Wiley-VCH，2011中。因此，在某些实施方案中，提供了通过化学合成技术制备的非天然存在的chagasin支架蛋白文库。

在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白文库包含展示文库。在某些实施方案中，所述展示文库是噬菌体展示文库、噬粒展示文库、病毒展示文库、细菌展示文库、酵母展示文库、λgt11文库、CIS展示文库和体外隔室文库或核糖体展示文库。制备和筛选这样的展示文库的方法是本领域技术人员众所周知的，且描述在，例如，Molek等人(2011)Molecules 16，857-887；Boder等人，(1997)Nat Biotechnol 15，553-557；Scott等人(1990)Science 249，386-390；Brisette等人(2007)Methods Mol Biol 383，203-213；Kenrick等人(2010)Protein Eng Des Sel 23，9-17；Freudl等人(1986)J Mol Biol 188，491-494；Getz等人(2012)MethodsEnzymol 503，75-97；Smith等人(2014)Curr DrugDiscov Technol11，48-55；Hanes，等人(1997)Proc Natl Acad Sci USA 94，4937-4942；Lipovsek等人，(2004)J Imm Methods 290，51-67；Ullman等人(2011)Brief.Funct.Genomics，10，125-134；Odegrip等人(2004)Proc NatlAcad Sci USA 101，2806-2810；和Miller等人(2006)Nat Methods 3，561-570中。

在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白文库包含通过例如在Szostak等人、US 6258558、US 6261804、US 5643768和US 5658754中描述的技术制备的RNA-蛋白融合物文库。在某些实施方案中，所述非天然存在的chagasin支架蛋白文库包含如在例如US 6416950中所述的DNA-蛋白文库。

非天然存在的Chagasin支架蛋白的定向进化

本文还提供了一种得到特异性地结合靶配体(诸如多肽、核酸、多糖、脂质、磷脂、脂多糖、小分子或可以被抗体结合的任何靶配体)的非天然存在的chagasin支架蛋白的方法。在某些实施方案中，所述方法包括(a)在允许形成非天然存在的chagasin支架蛋白：靶配体复合物的条件下，使靶配体与非天然存在的chagasin支架蛋白文库(诸如本文描述的文库)接触，(b)检测非天然存在的chagasin支架蛋白：靶配体复合物的形成，和(c)从所述复合物得到特异性地结合靶配体的非天然存在的chagasin支架蛋白。

在某些实施方案中，提供了包含非天然存在的chagasin支架蛋白和靶配体的复合物(即，非天然存在的chagasin支架蛋白：靶配体复合物)。在某些实施方案中，提供了能够结合靶配体的非天然存在的chagasin支架蛋白。在某些实施方案中，所述方法还包括(d)确定特异性地结合靶配体的非天然存在的chagasin支架蛋白的核酸序列。

在某些实施方案中，对特异性地结合靶配体的非天然存在的chagasin支架蛋白进行亲和力成熟。在该过程中，对特异性的结合蛋白进行方案，所述方案选择增加的对特定靶标的亲和力(参见Wu等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA.95，6037-42)。在某些实施方案中，在从文库筛选鉴别以后，将特异性地结合靶配体的非天然存在的chagasin支架蛋白进一步随机化。例如，在某些实施方案中，得到特异性地结合靶配体的非天然存在的chagasin支架蛋白的方法还包括(e)将从以前鉴别的非天然存在的chagasin支架蛋白：靶配体复合物得到的非天然存在的chagasin支架蛋白的L2、L4和/或L6随机化以制备进一步随机化的非天然存在的chagasin支架蛋白，(f)使所述靶配体与进一步随机化的非天然存在的chagasin支架蛋白接触，(g)检测进一步随机化的非天然存在的chagasin支架蛋白：靶配体复合物的形成，和(h)从所述复合物得到特异性地结合靶配体的、进一步随机化的非天然存在的chagasin支架蛋白。在某些实施方案中，所述方法还包括(i)确定特异性地结合靶配体的非天然存在的chagasin支架蛋白的核酸序列。

在某些实施方案中，所述进一步随机化的非天然存在的chagasin支架蛋白包含至少1个或至少2个随机化的环，所述环以前没有在第一文库中随机化。可以执行多轮随机化、筛选和选择，直到得到对靶配体具有足够亲和力的非天然存在的chagasin支架蛋白。因而，在某些实施方案中，将步骤(e)-(h)或步骤(e)-(i)重复1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或超过10次，以便鉴别出特异性地结合靶配体的非天然存在的chagasin支架蛋白。

在某些实施方案中，已经经历至少2轮、3轮、4轮、5轮、6轮、7轮、8轮、9轮、10轮或超过10轮随机化、筛选和选择的非天然存在的chagasin支架蛋白以一定亲和力结合靶配体，所述亲和力至少与已经经历一轮随机化、筛选和选择的非天然存在的chagasin支架蛋白的亲和力一样高。在某些实施方案中，已经经历至少2轮、3轮、4轮、5轮、6轮、7轮、8轮、9轮、10轮或超过10轮随机化、筛选和选择的非天然存在的chagasin支架蛋白以一定亲和力结合靶配体，所述亲和力高于已经经历一轮随机化、筛选和选择的非天然存在的chagasin支架蛋白的亲和力。

通过本领域已知的用于进化新的或改进的特异性地结合靶配体的结合蛋白的任意技术，可以筛选本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白的文库。在某些实施方案中，将靶配体固定化在固体支持物(诸如柱树脂或微孔滴定板孔)上，并使靶配体与候选非天然存在的chagasin支架蛋白的文库(诸如本文描述的任意文库)接触。选择技术可以是，例如，噬菌体展示(Smith(1985)Science 228，1315-1317)、mRNA展示(Wilson等人(2001)ProcNatl Acad Sci USA 98：3750-3755)、细菌展示(Georgiou，等人(1997)Nat Biotechnol15：29-34.)、酵母展示(Boder和Wittrup(1997)Nat.Biotechnol.15：553-5577)或核糖体展示(Hanes和Pluckthun(1997)Proc Natl Acad Sci U S A 94：4937-4942和WO2008/068637)。

在某些实施方案中，非天然存在的chagasin支架蛋白的文库是噬菌体展示文库。在某些实施方案中，提供了展示本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白的噬菌体颗粒。在某些实施方案中，提供了展示能够结合靶配体的本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白的噬菌体颗粒。

噬菌体展示是这样的技术：其用于使多个非天然存在的chagasin支架蛋白变体作为融合蛋白展示至噬菌体颗粒表面上的外壳蛋白(Smith，G.P.(1985)Science，228：1315-7；Scott，J.K.和Smith，G.P.(1990)Science 249：386；Sergeeva，A.，等人(2006)Adv.DrugDeliv.Rev.58：1622-54)。噬菌体展示的应用在于以下事实：可以针对以高亲和力结合靶配体的那些序列快速地且有效地筛分选择性地随机化的蛋白变体(或随机地克隆的cDNA)的大文库。

肽(Cwirla，S.E.等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6378)或蛋白(Lowman，H.B.等人(1991)Biochemistry，30：10832；Clackson，T.等人(1991)Nature，352：624；Marks，J.D.等人(1991)，J.Mol.Biol.，222：581；Kang，A.S.等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：8363)文库在噬菌体上的展示已经被用于筛选无数多肽或寡肽中具有特异性结合性能的那些(Smith，G.P.(1991)Current Opin.Biotechnol.，2：668；Wu等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA.May 95，6037-42)。多价噬菌体展示方法已经被用于通过与丝状噬菌体的基因III或基因VIII的融合来展示小随机肽和小蛋白(Wells和Lowman，Curr.Opin.Struct.Biol.，3：355-362(1992)，和其中引用的参考文献)。在单价噬菌体展示中，将蛋白或肽文库与基因III或其部分融合，并在有野生型基因III蛋白存在下在低水平表达，使得噬菌体颗粒展示融合蛋白的一个拷贝或不展示融合蛋白。亲合力效应相对于多价噬菌体下降，所以筛分是基于固有的配体亲和力，并使用噬粒载体，其使DNA操作简化(Lowman和Wells，Methods：A compamon to Methods in Enzymology，3：205-0216(1991))。

筛分非天然存在的chagasin支架蛋白的噬菌体文库需要构建和扩增大量变体，使用靶配体的亲和纯化操作，和评价结合富集的结果的方式(参见例如，US 5223409，US5403484，US 5571689，和US 5663143)。

大多数噬菌体展示方法使用丝状噬菌体(诸如M13噬菌体)。λ噬菌体展示系统(参见WO1995/34683，US 5627024)、T4噬菌体展示系统(Ren等人(1998)Gene 215：439；Zhu等人(1998)Cancer Research，58：3209-3214；Jiang等人，(1997)Infection&Immunity，65：4770-4777；Ren等人(1997)Gene，195：303-311；Ren(1996)Protein Sci.，5：1833；Efimov等人(1995)Virus Genes，10：173)和T7噬菌体展示系统(Smith和Scott(1993)Methods inEnzymology，217：228-257；US.5766905)也是已知的。

现在已经开发了基本噬菌体展示概念的许多其它改进和变动。这些改进会增强展示系统的以下能力：针对与选定的靶配体的结合筛选肽文库，和展示功能蛋白，后者具有针对期望性能筛选这些蛋白的潜力。已经开发了用于噬菌体展示反应的组合反应装置(WO1998/14277)，并且噬菌体展示文库已经用于分析和控制双分子相互作用(WO 1998/20169；WO 1998/20159)和受限制的螺旋肽的性能(WO 1998/20036)。WO 1997/35196描述了一种分离亲和配体的方法，其中使噬菌体展示文库与一种溶液(在其中配体将结合靶配体)和第二种溶液(在其中亲和配体不会结合靶配体)接触，以选择性地分离结合配体。WO 1997/46251描述了一种用亲和力纯化的抗体生物淘选随机噬菌体展示文库并然后分离结合噬菌体的方法，继之以使用微量培养板孔分离高亲和力结合噬菌体的微淘选过程。这样的方法可以应用于本文中公开的非天然存在的chagasin支架蛋白。还已经报道了金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A作为亲和标签的应用(Li等人(1998)Mol Biotech.9：187)。WO 1997/47314描述了底物减少文库的使用组合文库(其可以是噬菌体展示文库)区分酶特异性的用途。选择特定结合蛋白的另外方法描述在US 5498538、US 5432018和WO1998/15833中。制备肽文库和筛选这些文库的方法也公开在US 5723286、US 5432018、US5580717、US 5427908、US 5498530、US 5770434、US 5734018、US 5698426、US 5763192和US5723323中。

在某些实施方案中，通过定向进化生产的非天然存在的chagasin支架蛋白可以用于鉴别和/或验证造成疾病的靶标(诸如靶蛋白)或导致治疗候选物。例如，经工程改造成结合目标靶配体的非天然存在的chagasin支架蛋白可以用于在体外(诸如在细胞培养物中)或在体内(诸如在动物模型中)抑制靶标的表达，使得例如靶配体的生理学作用可以被表征或证实，或者，例如，可以研究和/或验证靶配体的疾病关联和治疗潜力。在某些实施方案中，针对与人靶配体的结合筛选经工程改造的非天然存在的chagasin支架蛋白。在某些实施方案中，针对与小鼠靶配体的交叉反应性筛选经工程改造的非天然存在的chagasin支架蛋白。在某些实施方案中，针对对体外功能的影响(例如，配体/受体结合的抑制)筛选经工程改造的非天然存在的chagasin支架蛋白。在某些实施方案中，在基于细胞的测定中研究经工程改造的非天然存在的chagasin支架蛋白的功能和结合。在某些实施方案中，确定经工程改造的非天然存在的chagasin支架蛋白的结合亲和力。在某些实施方案中，将经工程改造的非天然存在的chagasin支架蛋白所结合的靶配体的表位绘图。在某些实施方案中，使用经工程改造的非天然存在的chagasin支架蛋白确定靶配体在体内的分布。在某些实施方案中，使用经工程改造的非天然存在的chagasin支架蛋白确定靶配体的亚细胞定位。在某些实施方案中，使用经工程改造的非天然存在的chagasin支架蛋白描绘靶配体在患病的组织和未患病的组织中的表达和/或证实靶配体在患病的组织中的表达。在某些实施方案中，使用经工程改造的非天然存在的chagasin支架蛋白执行临床前效力研究。在某些实施方案中，使用经工程改造的非天然存在的chagasin支架蛋白执行毒性研究。在某些实施方案中，使用经工程改造的非天然存在的chagasin支架蛋白执行药代动力学和/或药效动力学研究。关于靶标验证的其它细节描述在，例如，Carter等人(2004)Endocr Relat Cancer11，659-687；van BeijBum等人(2002)Int J Cancer 101，118-127；Verheesen等人(2006)Biochim et Biophys Acta1764，1307-1319；Shih(2012)“Development of Antibody-Based Therapeutics”Springer，第9-32页；和Wise等人(2002)Drug Disc Today 7，235-246中。

特异性地结合人低密度脂蛋白受体(LDL)相关蛋白6(LRP6)的非天然存在的Chagasin支架蛋白

LDL受体是在受体介导的脂蛋白和蛋白配体的胞吞作用中涉及的跨膜细胞表面蛋白。人LDL受体相关蛋白6(LRP6)(Accession Nos：NM_002336(mRNA)和NP_002327(蛋白)；UniProtKB：O75581)作为受体起作用，或者，与Frizzled(Wnt的共受体)一起起作用，并由此传递规范的Wnt/β-连环蛋白信号传递级联(Katoh等人(2007)Clin Cancer Res 13：4042-4045)。通过它与Wnt/β-连环蛋白信号传递级联的相互作用，LRP6在细胞分化、增殖和迁移的调节中以及在许多癌症类型的发展中起作用(Li等人(2004)Oncogene 23：9129-9135；Tung等人(2012)PLoS ONE 7(5)：e36565.doi：10.1371/journal.pone.0036565；Liu等人(2010)Proc Natl Acad Sci USA 107：5136-5141)。

Wnt信号传递参与许多生物途径。就疾病而言，它与癌症和转移性疾病、骨质疏松症和其它骨代谢和疾病、神经元和神经变性疾病、类风湿性关节炎和其它炎性疾病有关。LRP6的阻断对Wnt信号传递的这种抑制可能具有宽范围的治疗效用。骨丢失是一个严重的医学问题，不仅在绝经后骨质疏松症过程中，而且在类风湿性关节炎中。在多发性骨髓瘤中和在骨转移灶中，骨发生降解。因此，目的在于强化骨、骨折预防或恢复受损伤的骨的治疗策略具有非常高的重要性(Kawai等人(2011)Nat.Rev.Drug Discov.10，141-156；Mason和Williams(2010)J.Osteoporosis，第2010卷，Article ID 460120，第9页；doi：10.4061/2010/460120)。因为它们在抑制新骨形成中的作用，Wnt途径抑制剂DKK1和SOST被视作非常有前途的治疗靶标；具有中和SOST的功能的抗体表现出显著的临床前活性(Ominsky等人(2010)J.Bone Miner.Res.25，948-959)且现在处于人临床试验中(Padhi等人(2011)J.Bone Miner.Res.26，19-26)。

错误调节的Wnt信号传递涉入从骨质疏松症至癌症的疾病(Clevers(2006)Cell127：469-80；MacDonald等人.2009.Dev Cell 17：9-26；Nusse(2008)Cell Res 18：523-7；Polakis(2007)Curr Opin Genet Dev 17：45-51)。该清单已经被扩展以包括代谢病症(Mani等人(2007)Science 315：1278-82和神经变性(Caricasole等人(2004)JNeurosci24：6021-7；De Ferrari等人(2007)Proc NatlAcadSci USA 104：9434-9)。在蛋白腺瘤性息肉病(APC)的突变(其阻止β-连环蛋白水平的有效调节)和结直肠癌之间存在特别清楚的联系(Polakis(2007)Curr Opin Genet Dev 17：45-51)。还特别指出LRP5和骨体内稳态之间的强遗传关系。LRP5中的功能缺失突变会造成常染色体隐性病症骨质疏松症-假神经胶质瘤综合征(OPPG)，其特征在于低骨量、眼缺陷和骨折倾向(Gong等人(2001)Cell 107：513-23。

本文描述的对人LRP6特异性的非天然存在的chagasin支架蛋白以足够的亲和力和特异性结合人LRP6。优选地，这样的非天然存在的chagasin支架蛋白可以在靶向和干扰其中涉及LRP6活性的疾病或病症中用作治疗剂。特异性地结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白通常不会结合其它LRP蛋白，诸如LRPI、LRPlB、LRP2、LRP3、LRP4、LRP5、LRP8、LRP10、LRP11和LRP12。

提供了特异性地结合人低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中所述非天然存在的chagasin支架蛋白与结合人LRP6的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白竞争结合，其中所述结合人LRP6的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNP-T/S/A/Q-T/C/D(SEQ ID NO：150)或SN-V/A-D(155)的L2，包含氨基酸序列Y/S-N-N/K-I/V-R/K-G-L/V/I-PGF(SEQ ID NO：156)或SN-Y/S-TK-H/R(SEQ ID NO：157)或DSNEIWYC(SEQ ID NO：77)的L4；和包含氨基酸序列R/S/P/G-P/R-W/Y/E/S/V-T/Y/K/T-G-P/S/A-S/T/Y-H/K/L/Q/D-D/V/E-S/E/M/P/V(SEQ ID NO：148)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，特异性地结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白会结合被第二种非天然存在的chagasin支架蛋白结合的人LRP6的相同表位，所述第二种非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列S-N/S-P/N-Q/T/V/S/A-T/D/C-GF(SEQ IDNO：6)的L2，包含氨基酸序列P-S/Y-N-N/K-V/I-K/R-G-V/I/L-PGFGAGG(SEQ ID NO：10)、PSN-S/Y-TK-H/R-GAGG(SEQ ID NO：90)或DSNEIWYC(SEQ ID NO：77)的L4；和包含氨基酸序列G/R/P/S-P/R-W/S/V/Y/E-T/K/Y-G-A/P/S-S/Y/T-Q/D/L/H/K-E/D/V-P/S/M/E(SEQ IDNO：14)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，特异性地结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白竞争性地抑制竞争分子与人LRP6的结合。在某些实施方案中，所述竞争分子是抗-LRP6抗体。在某些实施方案中，所述竞争分子是结合人LRP6的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白。

在某些实施方案中，特异性地结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白竞争性地抑制第二种非天然存在的chagasin支架蛋白与人LRP6的结合，其中所述第二种非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列S-N/S-P/N-Q/T/V/S/A-T/D/C-GF(SEQ IDNO：6)的L2，包含氨基酸序列P-S/Y-N-N/K-V/I-K/R-G-V/I/L-PGFGAGG(SEQ ID NO：10)、PSN-S/Y-TK-H/R-GAGG(SEQ ID NO：90)或DSNEIWYC(SEQ ID NO：77)的L4；和包含氨基酸序列G/R/P/S-P/R-W/S/V/Y/E-T/K/Y-G-A/P/S-S/Y/T-Q/D/L/H/K-E/D/V-P/S/M/E(SEQ IDNO：14)的L6，根据SEQ ID NO：2。在某些实施方案中，特异性地结合人LRP6并竞争性地抑制第二种非天然存在的chagasin支架蛋白与人LRP6的结合的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列S-N/S-P/N-Q/T/V/S/A-T/D/C-GF(SEQ ID NO：6)的L2，包含氨基酸序列P-S/Y-N-N/K-V/I-K/R-G-V/I/L-PGFGAGG(SEQ ID NO：10)、PSN-S/Y-TK-H/R-GAGG(SEQID NO：90)或DSNEIWYC(SEQ ID NO：77)的L4；和包含氨基酸序列G/R/P/S-P/R-W/S/V/Y/E-T/K/Y-G-A/P/S-S/Y/T-Q/D/L/H/K-E/D/V-P/S/M/E(SEQ ID NO：14)的L6，根据SEQ ID NO：2。

通过竞争性抑制/结合测定可以鉴别特征在于结合靶标上的重叠或类似区域的非天然存在的chagasin支架蛋白。这样的测定是本领域众所周知的，且描述在，例如，S.J.Mather(编)1996.Current Directions in Radiopharmaceutical ResearchandDevelopment，169-179，Kluwer Academic Publishers；Zettner(1973)Clin.Chem.19，699-705；Gao(2012)Analytical Methods 4，3718-3723中。

在某些实施方案中，对人LRP6特异性的非天然存在的chagasin支架蛋白包含本文中公开的对人LRP6特异性的任一种非天然存在的chagasin支架蛋白的L2、L4和/或L6。在某些实施方案中，本文提供了特异性地结合人低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)的非天然存在的chagasin支架蛋白且包含：包含在SEQ ID NO：3-5、78-80和146中的任一个中所示的氨基酸序列的L2，包含在SEQ ID NO：7-9、77和81-83中的任一个中所示的氨基酸序列的L4；和包含在SEQ ID NO：11-13、84-86和147中的任一个中所示的氨基酸序列的L6，根据SEQ IDNO：2。上述的L2、L4和L6氨基酸序列提供在下面的表1中：

表1：特异性地结合LRP6的非天然存在的Chagasin支架蛋白的L2、L4和L6氨基酸序列

在某些实施方案中，所述特异性地结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNPQT(SEQ ID NO：3)的L2，包含氨基酸序列SNKVKGVPGF(SEQ ID NO：7)的L4；和包含氨基酸序列GPWTGASQEP(SEQ ID NO：11)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，所述特异性地结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNPTT(SEQ ID NO：4)的L2，包含氨基酸序列SNKIKGIPGF(SEQ ID NO：8)的L4；和包含氨基酸序列RPSTGPSDDS(SEQ ID NO：12)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，所述特异性地结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNVD(SEQ ID NO：5)的L2，包含氨基酸序列SNSTKR(SEQ ID NO：9)的L4；和包含氨基酸序列PRVKGAYLVM(SEQ ID NO：13)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，所述特异性地结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述特异性地结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述特异性地结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述特异性地结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：87中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述特异性地结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：88中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述特异性地结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：89中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述特异性地结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：149中所示的氨基酸序列。在下面提供了SEQ ID NO：15-17、87-89和149。

在某些实施方案中，特异性地结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白是本文描述的特异性地结合人LRP6的任一种非天然存在的chagasin支架蛋白的变体。在某些实施方案中，这样的变体chagasin支架蛋白包含SEQ ID NO：3、4、5、7、8、9、11、12和/或13中的一个或多个中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个氨基酸置换。在某些实施方案中，所述氨基酸置换是保守的氨基酸置换。在某些实施方案中，所述氨基酸置换不会实质上减小非天然存在的chagasin支架蛋白的特异性地结合人LRP6的能力。例如，可以产生不会实质上减小LRP6结合亲和力的保守改变(例如，本文中提供的保守置换)。使用下面实施例中描述的方法，可以评估特异性地结合人LRP6的变体chagasin支架蛋白的结合亲和力。

在表2中在“保守置换”的标题下显示了保守置换。在表2中在“示例性置换”的标题下提供了更实质性的变化，并如下面参考氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸置换引入变体chagasin支架蛋白中并针对期望的活性(例如，保留的/改善的LRP6结合)筛选产物。

表2：保守置换

非保守置换需要将这些分类之一的成员交换为另一个分类的成员。一种示例性的置换变体是特异性地结合LRP6的亲和力成熟的chagasin支架蛋白，其可以方便地制备，例如，使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文描述的那些。简而言之，改变(即，添加、缺失或置换)L2、L4和/或L6中的一个或多个残基，并将变体chagasin支架蛋白展示在噬菌体上和针对LRP6结合亲和力进行筛选。在亲和力成熟的某些实施方案中，通过多种方法(例如，易出错的PCR、环改组或寡核苷酸-指导的诱变)中的任一种将多样性引入为成熟而选择的可变基因中。随后建立次级文库。然后筛选所述文库以鉴别对LRP6具有期望亲和力的任何chagasin支架蛋白变体。在某些实施方案中，引入多样性涉及环-指导的方案，其中将L2、L4和/或L6中的几个残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以特异性地鉴别参与结合靶配体的L2、L4和/或L6残基，例如，使用丙氨酸扫描诱变或建模。

在某些实施方案中，特异性地结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白对LRP6的结合亲和力强于它对LRP蛋白或LRP6同系物(诸如LRP1、LRP1B、LRP2、LRP3、LRP4、LRP5、LRP8、LRP10、LRP11和LRP12)的结合亲和力。

通常，非天然存在的chagasin支架蛋白“特异性地结合”人LRP6(即，具有不超过约1x10^-7M、优选地不超过约1x10^-8和最优选地不超过约1x10^-9M的结合亲和力(Kd)值)，但是对另一种LRP蛋白的结合亲和力比它对LRP6的结合亲和力弱至少约50倍、或至少约500倍、或至少约1000倍。

在某些实施方案中，特异性地结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白与非靶配体(诸如LRP1、LRP1B、LRP2、LRP3、LRP4、LRP5、LRP8、LRP10、LRP11和LRP12)的结合程度小于非天然存在的chagasin支架蛋白与人LRP6的结合的约10％，如通过本领域已知的方法诸如ELISA、荧光活化细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)所确定的。可以测量特异性结合，例如，通过相对于对照分子的结合来确定分子的结合，所述对照分子通常是不具有结合活性的类似结构的分子。例如，通过与对照分子(其类似于靶标，例如，过量的未标记的靶标)的竞争可以确定特异性结合。在该情况下，如果标记的靶标与探针的结合被过量的未标记的靶标竞争性地抑制，则指示特异性结合。本文中使用的术语“特异性结合”或“特异性地结合”特定多肽靶标上的特定多肽或表位或对特定多肽靶标上的特定多肽或表位“具有特异性”可以例如由这样的分子表现出来：所述分子对靶标具有至少约10^-4M、可替换地至少约10^-5M、可替换地至少约10^-6M、可替换地至少约10^-7M、可替换地至少约10^-8M、可替换地至少约10^-9M、可替换地至少约10^-10M、可替换地至少约10^-11M、可替换地至少约10^-12M或更大的Kd。在一个实施方案中，术语“特异性结合”表示这样的结合：其中分子结合特定多肽上的特定多肽或表位，且基本上不结合任意其它多肽或多肽表位。

在某些实施方案中，特异性地结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白以约1pM至约500nM之间的Kd结合人LRP6。在某些实施方案中，特异性地结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白以以下Kd结合人LRP6：约1pM至约50pM，约50pM至约250pM，约250pM至约500pM，约500pM至750pM，约750pM至约1nM，约1nM至约25nM，约25nM至约50nM，50nM至约100nM，约100nM至约250nM，或约250nM至约500nM。

在某些实施方案中，特异性地结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白抑制Wnt1信号传递，例如，如使用在以下实施例中描述的方法所确定的。

也预见到编码本文描述的特异性地结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白的核酸分子，包含编码本文描述的特异性地结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白的核酸分子的表达载体，和包含所述核酸分子的细胞。本文还提供了如下生产本文描述的特异性地结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白的方法：培养这样的细胞，表达非天然存在的chagasin支架蛋白，和从细胞培养物回收非天然存在的chagasin支架蛋白。

在某些实施方案中，通过体外翻译可以生产特异性地结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白，如本文别处所述。

如本文别处所述，还可以通过化学肽合成来制备特异性地结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白，例如，通过将化学合成的L2、L4和/或L6肽移植到chagasin框架上。

特异性地结合人血管内皮生长因子(VEGF)的非天然存在的Chagasin支架蛋白

血管内皮生长因子(VEGF或VEGFA)是血管内皮细胞的高特异性的促分裂原。VEGF的表达响应于低氧而增强，被活化的癌基因增强，和被多种细胞因子增强。VEGF诱导内皮细胞增殖，促进细胞迁移，和抑制细胞凋亡。体内VEGF诱导血管生成以及血管的透化，并在血管发生的调节中起重要作用。VEGF具有多种可以结合不同受体的同种型。例如，VEGF-A可以结合VEGFR1(Flt-1)、VEGFR2(KDR)以及神经纤毛蛋白(NRP-1)(Ferarra等人(2003)NatMedicine 9，669-676；Goel等人.Nat Rev Cancer(2013)12，871-882)。

去调节的VEGF表达会通过促进肿瘤血管生成而为实体瘤的发展做出贡献，并为特征在于异常血管生成的几种另外疾病的病原学做出贡献，所述疾病是诸如由眼新生血管形成造成的疾病，包括、但不限于，例如，糖尿病失明、视网膜病变、原发性糖尿病性视网膜病变或年龄相关的黄斑变性、脉络膜新生血管形成(CNV)、糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、von Rippel-Lindau疾病、眼的组织胞浆菌病、视网膜静脉闭塞(视网膜分支静脉闭塞(BRVO)和视网膜中央静脉闭塞(CRVO)、角膜新生血管形成、视网膜新生血管形成和发红；银屑病、银屑病关节炎、成血管细胞瘤诸如血管瘤；炎症性的肾疾病，诸如肾小球肾炎，特别是系膜增生性肾小球肾炎、溶血性尿毒症综合征、糖尿病肾病或高血压肾硬化。特征在于去调节的VEGF表达的其它疾病包括各种炎性疾病，诸如关节炎(特别是类风湿性关节炎)、炎性肠病、牛皮癣、结节病、动脉硬化和移植以后发生的疾病、子宫内膜异位症或慢性哮喘。当存在促进患病状态的恶化或患病状态的原因的新血管生长时，也会发生过度的、不适当的或失控的血管生成，诸如在癌症中，特别是血管化的实体瘤和转移性肿瘤(包括结肠癌、肺癌(特别是小细胞肺癌)或前列腺癌)。新血管可以供养患病的组织，破坏正常组织，且在癌症的情况下，新血管可以允许肿瘤细胞逃逸进循环中并停留在其它器官(肿瘤转移灶)中。结果，VEGF信号传递的抑制会废除多种肿瘤的发展。

本文描述的对人VEGF特异性的非天然存在的chagasin支架蛋白以足够的亲和力和特异性结合人VEGF。在某些实施方案中，所述VEGF是VEGF-A。优选地，这样的非天然存在的chagasin支架蛋白可以在靶向和干扰其中涉及VEGF活性的疾病或病症中用作治疗剂。特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白通常不会结合其它VEGF同系物诸如VEGF-B或VEGF-C或其它生长因子诸如P1GF、PDGF或bFGF。

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白会结合被第二种非天然存在的chagasin支架蛋白结合的人VEGF的表位，所述第二种非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SN-L/Y-R/F/Q-S/Y/N/D-M/D/A/S(SEQ ID NO：23)的L2，包含氨基酸序列A/N/L/S/V-G/D/S/R-P/L/T/A-S/G/Y/T-A/S/G/Q-V/R/S/K/A-P/L/E/S/N-L/S/T/N/E(SEQ ID NO：29)的L4；和包含氨基酸序列A/N/F/S-P/K-W/N/S/V-R/L/W-G-P/L-A/S/D/M/R-N/R/Y/V/F-V/W/P-I/L(SEQ ID NO：35)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白会结合被第二种非天然存在的chagasin支架蛋白结合的人VEGF的表位，所述第二种非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNY-F/Y-Y/C/N/R-D/E(SEQ ID NO：49)的L2，包含氨基酸序列HYYNLGGRYT(SEQ ID NO：57)、D/N/S-D/G/V/Y-P/N/S-G/Y-S/L/M-G/H/S-L/V/A/Y-W/Y/L/S(SEQ ID NO：58)或G/H-S/V-S/Q-Y/W-W/G-G/W(SEQ ID NO：68)的L4；和包含氨基酸序列A/G-PW-S/Q/F/A/L/V-GPSR-Y/E/F/V/D-L(SEQ ID NO：67)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白竞争性地抑制竞争分子与人VEGF的结合。在某些实施方案中，所述竞争分子是抗-VEGF抗体。在某些实施方案中，所述竞争分子是结合人VEGF的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白。

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白竞争性地抑制第二种非天然存在的chagasin支架蛋白与人VEGF的结合，其中所述第二种非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SN-L/Y-R/F/Q-S/Y/N/D-M/D/A/S(SEQ IDNO：23)的L2，包含氨基酸序列A/N/L/S/V-G/D/S/R-P/L/T/A-S/G/Y/T-A/S/G/Q-V/R/S/K/A-P/L/E/S/N-L/S/T/N/E(SEQ ID NO：29)的L4；和包含氨基酸序列A/N/F/S-P/K-W/N/S/V-R/L/W-G-P/L-A/S/D/M/R-N/R/Y/V/F-V/W/P-I/L(SEQ ID NO：35)的L6，根据SEQ ID NO：2。在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF并竞争性地抑制第二种非天然存在的chagasin支架蛋白与人VEGF的结合的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SN-L/Y-R/F/Q-S/Y/N/D-M/D/A/S(SEQ ID NO：23)的L2，包含氨基酸序列A/N/L/S/V-G/D/S/R-P/L/T/A-S/G/Y/T-A/S/G/Q-V/R/S/K/A-P/L/E/S/N-L/S/T/N/E(SEQ ID NO：29)的L4；和包含氨基酸序列A/N/F/S-P/K-W/N/S/V-R/L/W-G-P/L-A/S/D/M/R-N/R/Y/V/F-V/W/P-I/L(SEQ IDNO：35)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白竞争性地抑制第二种非天然存在的chagasin支架蛋白与人VEGF的结合，其中所述第二种非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNY-F/Y-Y/C/N/R-D/E(SEQ ID NO：49)的L2，包含氨基酸序列HYYNLGGRYT(SEQ ID NO：57)、D/N/S-D/G/V/Y-P/N/S-G/Y-S/L/M-G/H/S-L/V/A/Y-W/Y/L/S(SEQ ID NO：58)或G/H-S/V-S/Q-Y/W-W/G-G/W(SEQ ID NO：68)的L4；和包含氨基酸序列A/G-PW-S/Q/F/A/L/V-GPSR-Y/E/F/V/D-L(SEQ ID NO：67)的L6，根据SEQID NO：2。

如本文别处指出的，通过竞争性抑制/结合测定可以鉴别特征在于结合靶标上的重叠或类似区域的非天然存在的chagasin支架蛋白。

在某些实施方案中，对人VEGF特异性的非天然存在的chagasin支架蛋白包含本文中公开的对人VEGF特异性的任一种非天然存在的chagasin支架蛋白的L2、L4和/或L6。因而，在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含在SEQ ID NO：18-22和41-48中的任一个中所示的氨基酸序列的L2，包含在SEQ ID NO：24-28和50-57中的任一个中所示的氨基酸序列的L4；和包含在SEQ ID NO：30-34和59-66中的任一个中所示的氨基酸序列的L6，根据SEQ ID NO：2。

上述的L2、L4和L6氨基酸序列提供在下面的表3中：

表3：特异性地结合VEGF的非天然存在的Chagasin支架蛋白的L2、L4和L6氨基酸序列

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNLRSM(SEQ ID NO：18)的L2，包含氨基酸序列AGPSAVPL(SEQ ID NO：24)的L4，和包含氨基酸序列APWRGPANVI(SEQ ID NO：30)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNYFYD(SEQ ID NO：19)的L2，包含氨基酸序列NDPGSRLS(SEQ ID NO：25)的L4，和包含氨基酸序列APWLGPSRVL(SEQ ID NO：31)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNLQNA(SEQ ID NO：20)的L2，包含氨基酸序列LSLYASET(SEQ ID NO：26)的L4，和包含氨基酸序列NPNWGPDYWI(SEQ ID NO：32)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNLQDS(SEQ ID NO：21)的L2，包含氨基酸序列SGTTGKSN(SEQ ID NO：27)的L4；和包含氨基酸序列FKSRGLMVPL(SEQ ID NO：33)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNYRDS(SEQ ID NO：22)的L2，包含氨基酸序列VRAGQANE(SEQ ID NO：28)的L4；和包含氨基酸序列SPVLGPRFWL(SEQ ID NO：34)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNYFYD(SEQ ID NO：19)的L2，包含氨基酸序列DDPGSGLW(SEQ ID NO：50)的L4，和包含氨基酸序列APWSGPSRYL(SEQ ID NO：59)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNYFYE(SEQ ID NO：42)的L2，包含氨基酸序列NGPGLGVY(SEQ ID NO：51)的L4；和包含氨基酸序列APWQGPSREL(SEQ ID NO：60)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNYYYD(SEQ ID NO：48)的L2，包含氨基酸序列NVNGSHAW(SEQ ID NO：52)的L4；和包含氨基酸序列APWSGPSRFL(SEQ ID NO：61)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNYFCD(SEQ ID NO：44)的L2，包含氨基酸序列NYPGSGVL(SEQ ID NO：53)的L4；和包含氨基酸序列APWFGPSRVL(SEQ ID NO：62)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白形成同源二聚体，所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNYFCD(SEQ IDNO：44)的L2，包含氨基酸序列NYPGSGVL(SEQ ID NO：53)的L4；和包含氨基酸序列APWFGPSRVL(SEQ ID NO：62)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNYFND(SEQ ID NO：45)的L2，包含氨基酸序列GSSYWG(SEQ ID NO：54)的L4，和包含氨基酸序列APWAGPSRVL(SEQ ID NO：63)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNYFYD(SEQ ID NO：19)的L2，包含氨基酸序列SGSYMSYS(SEQ ID NO：55)的L4；和包含氨基酸序列APWLGPSRDL(SEQ ID NO：64)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNYFRE(SEQ ID NO：47)的L2，包含氨基酸序列HVQWGW(SEQ ID NO：56)的L4；和包含氨基酸序列APWVGPSREL(SEQ ID NO：65)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNYYYD(SEQ ID NO：48)的L2，包含氨基酸序列HYYNLGGRYT(SEQ ID NO：57)的L4；和包含氨基酸序列GPWLGPSRVL(SEQ ID NO：66)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：36中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：38中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：40中所示的氨基酸序列。在下面提供了SEQID NO：36-40的序列：

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：69中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：70中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：71中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：72中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：73中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：74中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：75中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：76中所示的氨基酸序列。在下面提供了SEQ ID NO：69-76的序列：

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白竞争性地抑制第二种非天然存在的chagasin支架蛋白与人VEGF的结合，其中所述第二种非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNYY-Y/K-D(SEQ ID NO：114)的L2，包含氨基酸序列HY-Y/Q/S/T-NLGGRYT(SEQ ID NO：115)的L4；和包含氨基酸序列GPWLGPSRVL(SEQID NO：66)的L6，根据SEQ ID NO：2。在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF并竞争性地抑制第二种非天然存在的chagasin支架蛋白与人VEGF的结合的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNYY-Y/K-D(SEQ ID NO：114)的L2，包含氨基酸序列HY-Y/Q/S/T-NLGGRYT(SEQ ID NO：115)的L4；和包含氨基酸序列GPWLGPSRVL(SEQ ID NO：66)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白竞争性地抑制第二种非天然存在的chagasin支架蛋白与人VEGF的结合，其中所述第二种非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNYY-Y/K-D(SEQ ID NO：114)的L2，包含氨基酸序列HY-Y/Q/S/T-NLGGRYT(SEQ ID NO：115)的L4；和包含氨基酸序列GPWLGPSRVL(SEQID NO：66)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，对人VEGF特异性的非天然存在的chagasin支架蛋白包含本文中公开的对人VEGF特异性的任一种非天然存在的chagasin支架蛋白的L2、L4和/或L6。因而，在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含在SEQ ID NO：48和110中的任一个中所示的氨基酸序列的L2，包含在SEQ ID NO：57和111-113中的任一个中所示的氨基酸序列的L4；和包含在SEQ ID NO：66中所示的氨基酸序列的L6，根据SEQ ID NO：2。

上述L2、L4和L6氨基酸序列提供在下面表4中：

表4

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNYYKD(SEQ ID NO：110)的L2，包含氨基酸序列HYYNLGGRYT(SEQ IDNO：57)的L4；和包含氨基酸序列GPWLGPSRVL(SEQ ID NO：66)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNYYYD(SEQ ID NO：48)的L2，包含氨基酸序列HYQNLGGRYT(SEQ ID NO：111)的L4；和包含氨基酸序列GPWLGPSRVL(SEQ ID NO：66)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNYYYD(SEQ ID NO：48)的L2，包含氨基酸序列HYSNLGGRYT(SEQ ID NO：112)的L4；和包含氨基酸序列GPWLGPSRVL(SEQ ID NO：66)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNYYYD(SEQ ID NO：48)的L2，包含氨基酸序列HYTNLGGRYT(SEQ ID NO：113)的L4；和包含氨基酸序列GPWLGPSRVL(SEQ ID NO：66)的L6，根据SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：116中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：117中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：118中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：119中所示的氨基酸序列。在下面提供了SEQ ID NO：116-119的序列：

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白是本文描述的特异性地结合人VEGF的任一种非天然存在的chagasin支架蛋白的变体。在某些实施方案中，这样的变体chagasin支架蛋白包含在SEQ ID NO：3、4、5、7、8、9、11、12、13、19、25、31、48、57和/或66中的一个或多个中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个氨基酸置换。在某些实施方案中，所述氨基酸置换是保守的氨基酸置换。在某些实施方案中，所述氨基酸置换不会实质上减小非天然存在的chagasin支架蛋白的特异性地结合人VEGF的能力。例如，可以制备不会实质上减小VEGF结合亲和力的保守改变(例如，本文中提供的保守置换)。使用下面实施例中描述的方法，可以评估特异性地结合人VEGF的变体chagasin支架蛋白的结合亲和力。

如本文别处指出的，在表2中在“保守置换”的标题下显示了保守置换。在表2中在“示例性置换”的标题下提供了更实质性的变化，并如下面参考氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸置换引入变体chagasin支架蛋白中并针对期望的活性(例如，保留的/改善的VEGF结合)筛选产物。

非保守置换需要将这些分类之一的成员交换为另一个分类的成员。一种示例性的置换变体是特异性地结合VEGF的亲和力成熟的chagasin支架蛋白，其可以方便地制备，例如，使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文描述的那些。简而言之，改变(即，添加、缺失或置换)L2、L4和/或L6中的一个或多个残基，并将变体chagasin支架蛋白展示在噬菌体上和针对VEGF结合亲和力进行筛选。在亲和力成熟的某些实施方案中，通过多种方法(例如，易出错的PCR、环改组或寡核苷酸-指导的诱变)中的任一种将多样性引入为成熟而选择的可变基因中。随后建立次级文库。然后筛选所述文库以鉴别对VEGF具有期望亲和力的任何chagasin支架蛋白变体。在某些实施方案中，引入多样性涉及环-指导的方案，其中将L2、L4和/或L6中的几个残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以特异性地鉴别参与结合靶配体的L2、L4和/或L6残基，例如，使用丙氨酸扫描诱变或建模。在某些实施方案中，特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白(其中为了产生特异性地结合VEGF的亲和力成熟的chagasin支架蛋白的目的改变了L2、L4和/或L6中的一个或多个残基)包含在SEQID NO：37中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白(其中为了产生特异性地结合VEGF的亲和力成熟的chagasin支架蛋白的目的改变了L2、L4和/或L6中的一个或多个残基)包含在SEQ ID NO：76中所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白对VEGF的结合亲和力强于它对该VEGF的同系物(诸如VEGF-B或VEGF-C)或其它生长因子(诸如P1GF、PDGF或bFGF)的结合亲和力。通常，非天然存在的chagasin支架蛋白“特异性地结合”人VEGF，即，具有不超过约1x10^-7M、优选地不超过约1x10^-8和最优选地不超过约1x10^-9M)的结合亲和力(Kd)值，但是对该VEGF的同系物或其它生长因子的结合亲和力比它对VEGF的结合亲和力弱至少约50倍、或至少约500倍、或至少约1000倍。

在某些实施方案中，特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白与非靶配体(诸如诸如VEGF-B或VEGF-C、或其它生长因子诸如P1GF、PDGF或bFGF)的结合程度小于非天然存在的chagasin支架蛋白与人VEGF的结合的约10％，如通过本领域已知的方法诸如ELISA、荧光活化细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)所确定的。可以测量特异性结合，例如，通过相对于对照分子的结合确定分子的结合，所述对照分子通常是不具有结合活性的类似结构的分子。例如，通过与对照分子的竞争可以确定特异性结合，所述对照分子类似于靶标，例如，过量的未标记的靶标。在该情况下，如果标记的靶标与探针的结合被过量的未标记的靶标竞争性地抑制，则指示特异性结合。本文中使用的术语“特异性结合”或“特异性地结合”特定多肽靶标上的特定多肽或表位或对特定多肽靶标上的特定多肽或表位“具有特异性”可以例如由这样的分子表现出来：所述分子对靶标具有至少约10^-4M、可替换地至少约10^-5M、可替换地至少约10^-6M、可替换地至少约10^-7M、可替换地至少约10^-8M、可替换地至少约10^-9M、可替换地至少约10^-10M、可替换地至少约10^-11M、可替换地至少约10^-12M或更大的Kd。在一个实施方案中，术语“特异性结合”表示这样的结合：其中分子结合特定多肽上的特定多肽或表位，且基本上不结合任意其它多肽或多肽表位。

在某些实施方案中，特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白以约1pM至约500nM之间的Kd结合人VEGF。在某些实施方案中，特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白以以下Kd结合人VEGF：约1pM至约50pM，约50pM至约250pM，约250pM至约500pM，约500pM至750pM，约750pM至约1nM，约1nM至约25nM，约25nM至约50nM，50nM至约100nM，约100nM至约250nM，或约250nM至约500nM。

也预见到编码本文描述的特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白的核酸分子，包含编码本文描述的特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白的核酸分子的表达载体，和包含所述核酸分子的细胞。本文还提供了如下生产本文描述的特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白的方法：培养这样的细胞，表达非天然存在的chagasin支架蛋白，和从细胞培养物回收非天然存在的chagasin支架蛋白。

在某些实施方案中，通过体外翻译可以生产特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白，如本文别处所述。

如本文别处所述，通过化学肽合成也可以制备特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白，例如，通过将化学合成的L2、L4和/或L6肽移植到chagasin框架上。

包含非天然存在的Chagasin支架蛋白的嵌合分子

如果有利的话，还可以以形成嵌合分子的方式修饰本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的chagasin支架蛋白和/或特异性地结合VEGF的chagasin支架蛋白)，所述嵌合分子包含与另一种异源多肽或氨基酸序列融合(例如，重组地融合)的chagasin支架蛋白。在某些实施方案中，这样的嵌合分子包含本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白与抗体的融合体以形成例如二价分子或双特异性的分子。在某些实施方案中，这样的嵌合分子包含本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白与蛋白转导结构域的融合体，所述蛋白转导结构域靶向多肽以递送至不同组织和更具体地跨血脑屏障，其中使用例如人免疫缺陷病毒TAT蛋白的蛋白转导结构域(Schwarze等人，1999，Science 285：1569-72)。

在某些实施方案中，嵌合分子包含本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白与细胞通透性肽(CPP)的融合体以促进非天然存在的chagasin支架蛋白向胞质溶胶、细胞核或其它细胞隔室的递送。CPP(也被称作蛋白转导结构域(PTD)、膜易位序列(MTS)或特洛伊肽)是一类能够以相对无毒的方式跨细胞质膜运输各种否则不可渗透的大分子的肽。CPP肽通常具有5至约30个氨基酸(aa)的长度，具有阳离子的、两亲的或疏水的性质。可以与本文提供的非天然存在的chagasin支架蛋白融合的细胞通透性肽的显著例子包括，例如，来自HIV-1的Tat、Penetratin和Transportan(Fawell，S.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.1994，第664-668页；Theodore，L.等人.J.Neurosci.1995，第7158-7167页；Pooga，M.等人.FASEBJ.1998，第67-77页)。CPP的其它例子包括、但不限于：例如，antennapedia、聚阳离子肽等或在例如van den Berg等人，Curr Opin Biotechnol 22，1-6，2011)中所述的这样的肽的衍生物。在某些实施方案中，所述CPP与本文提供的非天然存在的chagasin支架蛋白的N-端重组地融合。在某些实施方案中，所述CPP与本文提供的非天然存在的chagasin支架蛋白的C-端重组地融合。

在某些实施方案中，嵌合分子包含本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白与信号序列的融合体以促进非天然存在的chagasin支架蛋白向例如内质网、高尔基体、核内体等的定位。在某些实施方案中，嵌合分子包含本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白与信号序列的融合体以促进非天然存在的chagasin支架蛋白的分泌。

在某些实施方案中，本文中提供的非天然存在的chagasin支架蛋白可以以多聚体形式用作双或多特异性的(针对不同的靶配体或相同靶配体上的不同表位)。例如，二聚体的双特异性的非天然存在的chagasin支架蛋白具有一个对第一靶配体或表位具有特异性的亚基和第二个对第二靶配体或表位具有特异性的亚基。非天然存在的chagasin支架蛋白亚基可以以多种构象连接，所述构象可以增加效价并从而增加与靶配体的结合的亲合力。

在某些实施方案中，本文中提供的嵌合分子包含2个或更多个(诸如3、4、5、6、7、8、9、10或超过10个)非天然存在的chagasin支架蛋白。在某些实施方案中，可以将核酸工程改造成编码单个非天然存在的chagasin支架蛋白的2个或更多个拷贝，所述拷贝串联地转录和翻译以产生相同支架亚基的共价连接的多聚体。在某些实施方案中，可以将核酸工程改造成编码2个或更多个不同的非天然存在的chagasin支架蛋白，所述拷贝串联地转录和翻译以产生不同支架亚基的共价连接的多聚体，所述不同支架亚基结合例如单个靶配体的不同表位或例如不同靶配体。在另一个实施方案中，这样的嵌合分子包含本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的chagasin支架蛋白和/或特异性地结合VEGF的chagasin支架蛋白)与标签多肽的融合体，所述标签多肽提供抗-标签抗体可以选择性地结合的表位。所述表位标签通常位于chagasin支架蛋白的氨基-或羧基-端。使用针对标签多肽的抗体，可以检测非天然存在的chagasin支架蛋白的这样的表位标记的形式的存在。并且，所述表位标签的提供使得chagasin支架蛋白通过亲和纯化容易地纯化，所述亲和纯化使用抗-标签抗体或另一类结合表位标签的亲和基质。多种标签多肽和它们各自的抗体是本领域已知的。例子包括：聚-组氨酸(聚-His)或聚-组氨酸-甘氨酸(聚-His-Gly)标签；流感HA标签多肽和它的抗体12CA5(Field等人(1988)Mol.Cell.Biol.8，2159-2165)；c-myc标签和针对它们的8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体(Evan等人(1985)Mol.Cell.Biol.5，3610-3616]；和单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签和它的抗体(Paborsky等人(1990)Protein Eng.，3，547-553)。其它标签多肽包括Flag-肽(Hopp等人(1988)BioTechnology，6，1204-1210)；KT3表位肽(Martin等人(1992)Science，255，192-194]；α-微管蛋白表位肽(Skinner等人(1991)J.Biol.Chem.266，15163-15166)；和T7基因10蛋白肽标签(Lutz-Freyermuth等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，6393-6397]。

在某些实施方案中，所述嵌合分子可以包含本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的chagasin支架蛋白和/或特异性地结合VEGF的chagasin支架蛋白)与免疫球蛋白或免疫球蛋白的特定区域的融合体。对二价形式的嵌合分子(例如，“免疫粘附素”)，这样的融合体可以针对IgG分子的Fc区。本文中提供的Ig融合体包括在Ig分子内的至少一个可变区的地方包含人的约或仅残基94-243、残基33-53或残基33-52的多肽。在一个特别优选的实施方案中，所述免疫球蛋白融合体包括IgG1分子的铰链、CH2和CH3、或者铰链、CH1、CH2和CH3区域。关于免疫球蛋白融合体的生产，也参见，1995年6月27日授权的美国专利号5,428,130。在某些实施方案中，本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的chagasin支架蛋白和/或特异性地结合VEGF的chagasin支架蛋白)例如在N或C末端处与IgG的恒定区(Fc)融合。在某些实施方案中，所述chagasin支架蛋白/Fc融合体分子会活化免疫应答的补体组分。在某些实施方案中，所述chagasin支架蛋白/Fc融合蛋白会增加chagasin支架蛋白的治疗价值。在某些实施方案中，本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的chagasin支架蛋白和/或特异性地结合VEGF的chagasin支架蛋白)例如在N或C末端处与补体蛋白(诸如Clq)融合(诸如重组地融合)。多种出版物描述了得到非天然存在的chagasin支架蛋白的方法，其半衰期如下改变：通过将FcRn结合多肽引入所述分子中(WO 1997/43316、US 5869046、US 5747035、WO1996/32478、WO 1991/14438)，或通过使非天然存在的chagasin支架蛋白与抗体融合，所述抗体的FcRn-结合亲合力被保留，但是对其它Fc受体的亲和力已经极大地减小(WO 1999/43713)，或者与抗体的FcRn结合结构域融合(WO 2000/09560，US 4703039)。在US 7083784中也可以找到增加生理学上有活性的分子(例如，非天然存在的chagasin支架蛋白)的半衰期的具体技术和方法。在某些实施方案中，将本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的chagasin支架蛋白和/或特异性地结合VEGF的chagasin支架蛋白)与包含以下氨基酸残基突变(按照Kabat中的EU索引编号)的来自IgG的Fc区融合：M252Y/S254T/T256E或H433KJN434F/Y436H。

在某些实施方案中，使本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的那些和/或特异性地结合VEGF的那些)与增加或延长体内或血清半衰期的分子融合。在某些实施方案中，使本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白和/或特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白)与白蛋白(诸如人血清白蛋白(HSA)、聚乙二醇(PEG)、多糖、免疫球蛋白分子(IgG)、补体、血红蛋白、结合肽、脂蛋白或其它因子)融合以增加它在血流中的半衰期和/或它的组织穿透。

通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(被统称为“DNA改组”)的技术，可以制备包含chagasin支架蛋白的另外嵌合分子。可以采用DNA改组来改变本文中提供的支架(例如，具有较高亲和力和较低解离速率的支架)的活性。通常，参见，US 5605793、US5811238、US 5830721、US 5834252、US 5837458、Patten等人(1997)Curr.OpinionBiotechnol.8，724-33；Harayama(1998)Trends Biotechnol.16，76-82；Hansson，等人，(1999)J.Mol.Biol.287，265-76；和Lorenzo和Blasco，(1998)Biotechniques 24，308-313。

在某些实施方案中，通过易出错的PCR、随机核苷酸插入或在重组之前的其它方法进行随机诱变，改变本文中包括的非天然存在的chagasin支架蛋白。可以使编码结合特定靶标的支架的多核苷酸的一个或多个部分与一种或多种异源分子的一个或多个组分、基序、段、部分、结构域、片段等重组。

通过标准技术，例如，通过从使用公众可得到的基因序列构建的重组融合基因表达融合蛋白，可以制备这些融合体中的任一种。

包含非天然存在的Chagasin支架蛋白的缀合物

本文还提供了免疫缀合物，其包含与细胞毒性剂诸如化学治疗剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素、或其片段)或放射性同位素(即，放射性缀合物)缀合的本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的chagasin支架蛋白和/或特异性地结合VEGF的chagasin支架蛋白)。

可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲毒蛋白、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(Saponaria officinalis)抑制剂、白树毒素、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌毒素。其它毒素包括美坦辛和美坦辛类、卡奇霉素和其它细胞毒性剂。多种放射性核素可用于生产放射性缀合的chagasin支架蛋白。例子包括²¹²Bi、¹³¹I、¹³¹In、⁹⁰y和¹⁸⁶Re。

制备本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的chagasin支架蛋白和/或特异性地结合VEGF的chagasin支架蛋白)和例如细胞毒性剂的缀合物

使用多种双功能的蛋白-偶联剂诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如己二亚氨酸二甲酯HCl)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(诸如戊二醛)、二-叠氮基化合物(诸如二(对-叠氮基苯甲酰基)己烷二胺)、二重氮鎓衍生物(诸如二-(对-重氮鎓苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如2，6-二异氰酸亚甲苯基酯)和二活性的氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，如在Vitetta等人，Science，238：1098(1987)中所述，可以制备蓖麻蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核素缀合至非天然存在的chagasin支架蛋白的示例性螯合剂。参见，WO94/11026。

在另一个实施方案中，可以将本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的chagasin支架蛋白和/或特异性地结合VEGF的chagasin支架蛋白)缀合至用于在肿瘤预靶向中使用的“受体”(诸如抗生蛋白链菌素)，其中将非天然存在的chagasin支架蛋白-受体缀合物施用给患者，随后使用清除剂从循环中除去未结合的缀合物，并然后施用与细胞毒性剂(例如，放射性核素)缀合的“配体”(例如，抗生物素蛋白)。

在某些实施方案中，本文中提供的非天然存在的chagasin支架蛋白可以以多聚体形式用作双或多特异性的(针对不同靶配体或相同靶配体上的不同表位)。连接可以是共价的或非共价的。例如，二聚体的双特异性的非天然存在的chagasin支架蛋白具有一个对第一靶配体或表位具有特异性的亚基和第二个对第二靶配体或表位具有特异性的亚基。非天然存在的chagasin支架蛋白亚基可以以多种构象连接(例如，通过缀合)，所述构象可以增加效价并从而增加与靶配体的结合的亲合力或结合多个靶配体。例如，可以将氨基酸改变(例如，添加、缺失和/或置换)引入非天然存在的chagasin支架蛋白的L1、L3和/或L5，例如，以建立双特异性的分子或以添加接头。在某些实施方案中，将L1、L3和/或L5工程改造成结合被L2、L4和/或L6结合的相同靶标上的不同表位。在某些实施方案中，将L1、L3和/或L5工程改造成结合不同于被L2、L4和/或L6结合的靶配体的靶配体。

在某些实施方案中，将本文提供的非天然存在的chagasin支架蛋白工程改造成提供用于缀合的反应基团。在某些实施方案中，N-末端和/或C-末端也可以用于提供用于缀合的反应基团。在某些实施方案中，将N-末端缀合至一个部分(例如，但不限于PEG)，而将C-端缀合至另一个部分(例如，但不限于生物素)，或反之亦然。

本文提供了与一个或多个部分缀合的本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的chagasin支架蛋白和/或特异性地结合VEGF的chagasin支架蛋白)的用途，所述部分包括、但不限于，肽、多肽、蛋白、融合蛋白、核酸分子、小分子、模拟试剂、合成药物、无机分子和有机分子。本文还提供了与异源蛋白或多肽(或其片段，至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸的多肽)化学缀合(包括共价和非共价缀合)的本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的chagasin支架蛋白和/或特异性地结合VEGF的chagasin支架蛋白)的用途。所述融合不一定需要是直接的，但是可以通过本文描述的接头序列发生。

在某些实施方案中，本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的chagasin支架蛋白和/或特异性地结合VEGF的chagasin支架蛋白)或其类似物或衍生物可以缀合至诊断或可检测试剂。这样的chagasin支架蛋白可以用于监测或预测疾病的发展或进展作为临床试验操作的组成部分，诸如确定特定疗法的效力。这样的诊断和检测可以通过将支架与可检测的物质偶联来完成，所述可检测的物质包括、但不限于各种酶，诸如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，诸如但不限于抗生蛋白链菌素生物素和抗生物素蛋白/生物素；荧光物质，诸如但不限于，伞形酮、荧光素、荧光素异硫代氰酸酯、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，例如，但不限于，鲁米诺；生物发光材料，诸如但不限于，萤光素酶、萤光素和水母荧光素；放射性物质，诸如但不限于碘(¹³¹I、¹²⁵I、¹²³I、¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(¹¹⁵In、¹¹³In、¹¹²In、”¹¹¹In、)和锝(⁹⁹Tc)、铊(²⁰¹Ti)、镓(⁶⁸Ga、⁶⁷Ga)、钯(¹⁰³Pd)、钼(⁹⁹Mo)、氙(¹³³Xe)、氟(¹⁸F)、¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu、¹⁵⁹Gd、¹⁴⁹Pm、¹⁴⁰La、¹⁷⁵Yb、1⁶⁶Ho、⁹⁰y、⁴⁷5c、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁴²Pr、¹⁰⁵Rh、⁹⁷Ru、⁶⁸Ge、⁵⁷Co、⁶⁵Zn、⁸⁵Sr、³²P、¹⁵³Gd、¹⁶⁹Yb、⁵¹Cr、⁵⁴Mn、⁷⁵Se、¹¹³Sn和¹¹⁷Tn；使用各种正电子发射体层摄影术的发射正电子的金属，非放射性的顺磁金属离子，和放射性标记的或缀合至特定放射性同位素的分子。

此外，本文提供了与治疗部分缀合的本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的chagasin支架蛋白和/或特异性地结合VEGF的chagasin支架蛋白)的用途。在某些实施方案中，chagasin支架蛋白可以缀合至治疗部分诸如细胞毒素，例如，细胞生长抑制性的或杀细胞的试剂，治疗剂或放射性的金属离子，例如，α-发射物。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何试剂。

在某些实施方案中，将本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的chagasin支架蛋白和/或特异性地结合VEGF的chagasin支架蛋白)缀合至治疗部分(诸如放射性的金属离子诸如α-发射物诸如²¹³Bi)或大环螯合剂，所述大环螯合剂可用于将射电金属离子(包括、但不限于，¹³¹In、¹³¹Lu、¹³¹y、¹³¹Ho、¹³¹Sm)缀合至多肽。在某些实施方案中，所述大环螯合剂是1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N’，N”，N”‘-四-乙酸(DOTA)，其可以通过接头分子连接至chagasin支架蛋白。这样的接头分子通常是本领域已知的，且描述在，例如，Denardo等人(1998)Clin Cancer Res.4，2483-90；Peterson等人(1999)Bioconjug.Chem.10，553-557；和Zimmerman等人(1999)Nucl.Med.Biol.26，943-50。

用于将治疗部分缀合至抗体的技术是众所周知的，且可以应用于本文中公开的非天然存在的chagasin支架蛋白，参见，例如，Amon等人，“Monoclonal Antibodies ForImmunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy，”见Monoclonal Antibodies AndCancer Therapy，Reisfeld等人(编)，第243-56页.(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等人，“Antibodies For Drug Delivery”，见Controlled Drug Delivery(第2版)，Robinson等人(编)，第623-53页(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“Antibody Carriers OfCytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”，见Monoclonal Antibodies 84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等人(编)，第475-506页(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，见Monoclonal Antibodies For CancerDetection And Therapy，Baldwin等人(编)，第303-16页(Academic Press 1985)，和Thorpe等人，1982，Immunol.Rev.62：119-58。类似的方案可以适合与本发明的chagasin支架蛋白一起使用。

应当选择与本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的chagasin支架蛋白和/或特异性地结合VEGF的chagasin支架蛋白)缀合的治疗部分或药物以实现针对受试者中的特定病症的期望的预防性或治疗效果。当决定将哪种治疗部分或药物缀合至支架时，临床医师或其它医护人员应当考虑以下方面：疾病的性质，疾病的严重程度，和受试者的状况。

在某些实施方案中，还可以将本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的chagasin支架蛋白和/或特异性地结合VEGF的chagasin支架蛋白)连接至固体支持物，所述固体支持物对于靶配体的免疫测定或纯化而言是特别有用的。这样的固体支持物包括、但不限于：玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。

共价修饰

在本发明范围内包括本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的chagasin支架蛋白和/或特异性地结合VEGF的chagasin支架蛋白)的共价修饰。一类共价修饰包括使非天然存在的chagasin支架蛋白的靶向氨基酸残基与有机衍生化试剂反应，所述有机衍生化试剂能够与chagasin支架蛋白的选定侧链或N-或C-末端残基反应。使用双功能试剂的衍生化可用于例如将非天然存在的chagasin支架蛋白与在纯化靶配体的方法中使用的不溶于水的支持物基质或表面交联，且反之亦然。常用的交联剂包括，例如，1，1-双(重氮基乙酰基)-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯(例如，与4-叠氮基水杨酸形成的酯)、同双功能的亚氨酸酯(包括二琥珀酰亚胺基酯诸如3，3’-二硫代双(琥珀酰亚胺基-丙酸酯))、双功能的马来酰亚胺诸如二-N-马来酰亚胺基-1，8-辛烷和试剂诸如甲基-3-[(对-叠氮基苯基)-二硫代]丙亚氨酸酯(propioimidate)。

其它修饰包括谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基分别脱酰胺化成为对应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基，脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman&Co.，San Francisco，第79-86页(1983))，N-端胺的乙酰化，和任何C-端羧基的酰胺化。

chagasin支架蛋白的另一类共价修饰包括，以在US 4640835、US 4496689、US4301144、US 4670417、US 4791192或US 4179337中阐述的方式将chagasin支架蛋白连接至多种非蛋白性的聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯)之一。

术语“聚乙二醇”或“PEG”是指聚乙二醇化合物或其衍生物，具有或没有偶联剂、偶联或活化部分(例如，具有硫醇、三氟甲基磺酸酯、三氟乙基磺酸酯、氮丙碇、氧杂环丙烷、N-羟基琥珀酰亚胺或马来酰亚胺部分)。术语“PEG”意图表示，在500-150,000Da之间的分子量的聚乙二醇，包括其类似物，其中例如末端OR-基团已经被甲氧基替代(被称作mPEG)。

在某些实施方案中，本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的那些和/或特异性地结合VEGF的那些)用聚乙二醇(PEG)衍生化。PEG是具有两个末端羟基的环氧乙烷重复单元的直链水溶性聚合物。PEG按照它们的分子量分类，所述分子量通常在约500道尔顿至约40,000道尔顿的范围内。在一个目前优选的实施方案中，采用的PEG具有在从5,000道尔顿至约20,000道尔顿的范围内的分子量。与本文中提供的支架偶联的PEG可以是分支的或未分支的(例如，Monfardini，C.等人.1995Bioconjugate Chem 6：62-69)。PEG可商购得自Nektar Inc.，Sigma Chemical Co.和其它公司。这样的PEG包括、但不限于：单甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG-S)、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、单甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)、单甲氧基聚乙二醇-三氟乙基磺酸酯(MePEG-TRES)和单甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。

在某些实施方案中，采用的亲水聚合物(例如，PEG)在一端用不反应基团(诸如甲氧基或乙氧基)加帽。此后，通过与合适的活化剂诸如氰尿酰氯(例如，氰尿酰氯、氰尿酰溴或氰尿酰氟)、二咪唑(diimadozle)、酸酐试剂(例如，二卤代琥珀酸酐，诸如二溴琥珀酸酐)、酰叠氮、对-重氮鎓苄基醚、3-(对-重氮鎓苯氧基)-2-羟丙基醚)等反应，在另一端将聚合物活化。然后使活化的聚合物与本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的那些和/或特异性地结合VEGF的那些)反应以产生被聚合物衍生化的chagasin支架蛋白。可替换地，可以活化本文中提供的非天然存在的chagasin支架蛋白中的官能团用于与聚合物反应，或可以使用已知的偶联方法在计划的(concerted)偶联反应中连接两个基团。容易理解，使用本领域技术人员已知的和使用的许多其它反应方案，可以用PEG衍生化本文中提供的非天然存在的chagasin支架蛋白。

免疫脂质体

还可以将本文中公开的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的那些或特异性地结合VEGF的那些)配制为免疫脂质体。通过本领域已知的方法，诸如在Epstein等人，Proc Natl Acad Sci USA，82：3688(1985)；Hwang等人，Proc Natl Acad SciUSA，77：4030(1980)；和美国专利号4,485,045和4,544,545中描述的方法，制备含有本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白的脂质体。在美国专利号5,013,556中公开了具有增加的循环时间的脂质体。

通过反相蒸发方法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生化的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物可以制备特别有用的脂质体。将脂质体穿过确定孔径的过滤器挤出以产生具有期望直径的脂质体。在脂质体中还任选地含有抗肿瘤剂、生长抑制剂或化学治疗剂(诸如多柔比星)。参见，Gabizon等人，J.National Cancer Inst.，81(19)：1484(1989)。

治疗方法

与LRP6有关的疾病和病症

可以将特异性地结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白和/或本文中提供的包含这样的chagasin支架蛋白的组合物施用给受试者(例如，哺乳动物诸如人类)以治疗涉及异常LRP6活性的疾病和病症，包括、例如，癌症和转移性疾病、骨质疏松症和其它骨代谢和疾病、神经元和神经变性疾病、类风湿性关节炎和其它炎性疾病，如本文别处所述。在某些实施方案中，提供了用于制备药物的特异性地结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白，所述药物用于治疗受试者中的癌症和转移性疾病、骨质疏松症和其它骨代谢和疾病、神经元和神经变性疾病、类风湿性关节炎和其它炎性疾病。在某些实施方案中，提供了用于治疗受试者中的癌症和转移性疾病、骨质疏松症和其它骨代谢和疾病、神经元和神经变性疾病、类风湿性关节炎和其它炎性疾病的、特异性地结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白。在某些实施方案中，要治疗的受试者是哺乳动物(例如，人、非人灵长类动物、大鼠、小鼠、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫等)。在某些实施方案中，所述受试者是人。在某些实施方案中，所述受试者是临床患者、临床试验志愿者、实验动物等。在某些实施方案中，所述受试者被怀疑患有癌症、转移性疾病、骨质疏松症、骨代谢疾病、神经元疾病、神经变性疾病、类风湿性关节炎或其它炎性疾病或者处于患有所述疾病的风险中，或者被诊断为患有癌症、转移性疾病、骨质疏松症、骨代谢疾病、神经元疾病、神经变性疾病、类风湿性关节炎或其它炎性疾病或具有异常LRP6表达或活性的任意其它疾病。

与VEGF有关的疾病和病症

可以将特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白和/或本文中提供的包含这样的chagasin支架蛋白的组合物施用给受试者(例如，哺乳动物诸如人类)以治疗涉及异常VEGF活性的疾病和病症，包括、例如涉及异常血管生成和/或异常血管通透性的疾病和病症。当存在促进患病状态的恶化或患病状态的成因的新血管生长时，发生过度的、不适当的或失控的血管生成，诸如在以下疾病中：癌症，特别是血管化的实体瘤和转移性肿瘤(包括结肠、肺癌(特别是小细胞肺癌)或前列腺癌)，由眼新生血管形成造成的疾病，特别是糖尿病失明，视网膜病变，原发性糖尿病性视网膜病变或年龄诱导的黄斑变性，脉络膜新生血管形成(CNV)，糖尿病性黄斑水肿，病理性近视，von Rippel-Lindau疾病，眼的组织胞浆菌病，视网膜静脉闭塞(视网膜分支静脉闭塞(BRVO)和视网膜中央静脉闭塞(CRVO))，角膜新生血管形成，视网膜新生血管形成和发红；银屑病，银屑病关节炎，成血管细胞瘤诸如血管瘤；炎症性的肾疾病，诸如肾小球肾炎，特别是系膜增生性肾小球肾炎，溶血性尿毒症综合征，糖尿病肾病或高血压肾硬化；多种炎性疾病，诸如关节炎，特别是类风湿性关节炎，炎性肠病，牛皮癣，结节病，动脉硬化和移植以后发生的疾病，子宫内膜异位症或慢性哮喘。新血管可以供养患病的组织，破坏正常组织，且在癌症的情况下，新血管可以允许肿瘤细胞逃逸进循环中并停留在其它器官(肿瘤转移灶)中。不希望的血管通透性与例如以下病症相关：与脑肿瘤有关的水肿，与恶性肿瘤有关的腹水，梅格斯氏综合征，肺部炎症，肾病综合征，心包积液，胸腔积液，与心血管疾病有关的通透性诸如在心肌梗塞和中风以后的状况等。

在某些实施方案中，提供了用于制备药物的特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白，所述药物用于治疗受试者中以异常血管生成和/或异常血管通透性为特征的疾病或病症。在某些实施方案中，提供了用于治疗受试者中以异常血管生成和/或异常血管通透性为特征的疾病或病症的、特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白。在某些实施方案中，要治疗的受试者是哺乳动物(例如，人、非人灵长类动物、大鼠、小鼠、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫等)。在某些实施方案中，所述受试者是人。在某些实施方案中，所述受试者是临床患者、临床试验志愿者、实验动物等。在某些实施方案中，所述受试者被怀疑患有与异常血管生成和/或异常血管通透性有关的疾病或病症(诸如本文描述的那些)或者处于患有所述疾病或病症的风险中，或者被诊断为患有与异常血管生成和/或异常血管通透性有关的疾病或病症(诸如本文描述的那些)或具有异常VEGF表达或活性的任意其它疾病。

施用和定量给药

本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白和/或特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白)或包含这样的chagasin支架蛋白的组合物的施用可以是通过任意合适的途径，包括、例如，静脉内途径、肌肉内途径或皮下途径。在某些实施方案中，本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白和/或特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白)和/或本文提供的组合物与第二种、第三种或第四种药剂(包括、例如，抗肿瘤剂、生长抑制剂、细胞毒性剂或化学治疗剂)联合施用以治疗涉及例如异常LRP6活性或异常VEGF活性的疾病或病症。对于涉及异常LRP6活性的疾病，这样的药剂包括在例如US 2012/0100562和US 2011/0256127中描述的那些。在某些实施方案中，将特异性地结合LRP6的非天然存在的chagasin支架缀合至另一种药剂。对于涉及异常VEGF活性的疾病，这样的药剂包括例如化学治疗剂或其它抗血管生成的分子。在某些实施方案中，将特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架缀合至另一种药剂。

本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白和/或特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白)和/或本文描述的组合物可以通过任何途径施用给个体，所述途径包括、但不限于，静脉内(例如，通过输液泵)、腹膜内、眼内、动脉内、肺内、口服、吸入、囊泡内、肌肉内、气管内、皮下、眼内、鞘内、透皮、透胸膜、动脉内、局部(topical)、吸入(例如，作为喷雾剂的雾)、粘膜(诸如经由鼻粘膜)、皮下、透皮、胃肠、关节内、脑池内、心室内、直肠(即，经由栓剂)、阴道(即，经由子宫托)、颅内、尿道内、肝内和肿瘤内。在某些实施方案中，全身性地(例如通过静脉内注射)施用本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白和/或特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白)。在某些实施方案中，局部地(例如通过动脉内或眼内注射)施用本文提供的chagasin支架蛋白或组合物。

在某些实施方案中，将本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白和/或特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白)和/或本文描述的组合物直接施用至眼或眼组织。在某些实施方案中，将本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白和/或特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白)和/或本文描述的组合物局部地(topically)施用至眼，例如，在滴眼剂中。在某些实施方案中，通过注射将本文提供的chagasin支架蛋白和/或组合物施用至眼(眼内注射)或与眼有关的组织。例如，通过眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房内注射、subconjectval注射、结膜下注射、眼球筋膜下注射、眼球后注射、眼球周注射或近巩膜后(posterior juxtascleral)递送，可以施用本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白和/或特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白)和/或本文描述的组合物。这些方法是本领域已知的。例如，关于视网膜药物递送的示例性眼周途径的描述，参见Periocularroutes for retinal drug delivery(视网膜药物递送的眼周途径)，Raghava等人(2004)，Expert Opin.Drug Deliv.1(1)：99-114。本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白和/或特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白)和/或本文描述的组合物可以例如施用至玻璃质、房水、巩膜、结膜、巩膜和结膜之间的区域、视网膜脉络膜组织、斑或在个体诱导眼中或附近的其它区域。所述组合物还可以作为植入物施用给个体。优选的植入物是生物相容的和/或可生物降解的持续释放制剂，其在一段时间中逐渐释放化合物。用于药物递送的眼植入物是本领域众所周知的。参见，例如，美国专利号5,501,856、5,476,511和6,331,313。使用离子透入法，包括、但不限于在美国专利号4,454,151和美国专利申请公开号2003/0181531和2004/0058313中描述的ionophoretic方法，也可以将组合物施用给个体。

取决于要治疗的适应症和本领域的技术人员熟悉的与定量给药有关的因素，以一定剂量施用本文中提供的本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白和/或特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白)，所述剂量对于该适应症的治疗而言是有效的，同时使毒性和副作用最小化。典型的剂量可以在例如0.001-1000μg的范围内；但是，在该示例性范围以下或以上的剂量是在本发明范围内。每日剂量可以是约0.1μg/kg至约100mg/kg总体重(例如，约5μg/kg、约10μg/kg、约100μg/kg、约500μg/kg、约1mg/kg、约50mg/kg或由前述值中的任意2个限定的范围)，优选约0.3μg/kg至约10mg/kg总体重(例如，约0.5μg/kg、约1μg/kg、约50μg/kg、约150μg/kg、约300μg/kg、约750μg/kg、约1.5mg/kg、约5mg/kg或由前述值中的任意2个限定的范围)，更优选约1μg/kg至1mg/kg总体重f例如，约3μg/kg、约15μg/kg、约75μg/kg、约300μg/kg、约900μg/kg或由前述值中的任意2个限定的范围)，且甚至更优选约0.5-10mg/kg体重/天(例如，约2mg/kg、约4mg/kg、约7mg/kg、约9mg/kg或由前述值中的任意2个限定的范围)。如上面所指出的，通过定期评估接受治疗的患者，可以监测治疗或预防效力。对于持续若干天或更久的重复给药而言，根据情况，重复所述治疗直至疾病征状得到期望的抑制。但是，其它剂量方案可能是有用的，且在本发明的范围内。通过所述组合物的单次推注施用，通过所述组合物的多次推注施用，或通过所述组合物的连续输注施用，可以递送期望的剂量。

包含本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白和/或特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白)的药物组合物可以每天施用1次、2次、3次或4次。所述组合物还可以以比每天1次更低的频率施用，例如，每周6次，每周5次，每周4次，每周3次，每周2次，每周1次，每2周1次，每3周1次，每个月1次，每2个月1次，每3个月1次，或每6个月1次。所述组合物也可以在持续释放制剂中施用，诸如在植入物中，所述植入物在一段时间中逐渐释放所述组合物用于应用，且其允许所述组合物以更低的频率施用，诸如每个月1次，每2-6个月1次，每年1次，或甚至单次施用。可以通过注射来施用持续释放装置(诸如丸粒、纳米颗粒、微粒、纳米球、微球等)。

可以以单个每日剂量施用本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白和/或特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白)，或者可以以每天2次、3次或4次的分开剂量施用总每日剂量。还可以以低于每天1次的频率施用所述组合物，例如，每周6次，每周5次，每周4次，每周3次，每周2次，每周1次，每2周1次，每3周1次，每个月1次，每2个月1次，每3个月1次，或每6个月1次。所述组合物也可以在持续释放制剂中施用，诸如在植入物中，所述植入物在一段时间中逐渐释放所述组合物用于应用，且其允许所述组合物以更低的频率施用，诸如每个月1次，每2-6个月1次，每年1次，或甚至单次施用。持续释放装置(诸如丸粒、纳米颗粒、微粒、纳米球、微球等)可以通过注射来施用或通过外科手术植入在不同位置。

药物制剂

本文中公开的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的那些或特异性地结合VEGF的那些)可以与合适的载体或赋形剂一起配制，使得它们适合用于施用。通过以低压冻干制剂或水溶液的形式将本文中公开的具有期望纯度的非天然存在的chagasin支架蛋白与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington’sPharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编(1980))混合，得到本文中公开的非天然存在的chagasin支架蛋白的合适制剂。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，且包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物诸如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖类、二糖类和其它碳水化合物类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖类诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成盐的抗衡离子诸如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子型表面活性剂，诸如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。在W098/56418(明确地通过引用并入本文)中描述了可以应用于本文中提供的非天然存在的chagasin支架蛋白的示例性抗体制剂。在W097/04801中描述了适合用于皮下施用的低压冻干制剂。这样的低压冻干制剂可以用合适的稀释剂重构至高蛋白浓度，并且可以将重构的制剂皮下地施用给本文中要治疗的哺乳动物。

本文中的制剂还可以含有超过一种对于正在治疗的特定适应症而言必要的活性化合物，优选具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些。例如，可能合乎需要的是，进一步提供抗肿瘤剂、生长抑制剂、细胞毒性剂或化学治疗剂。这样的分子适当地以对于预期目的而言有效的量存在于组合中。这样的其它药剂的有效量取决于存在于制剂中的非天然存在的chagasin支架蛋白的量、疾病或病症或治疗的类型、和上面讨论的其它因素。这些通常以本文中所述的相同剂量和施用途径、或迄今采用的剂量的约1-99％使用。还可以将活性成分包封在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(分别例如羟基甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中，在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊剂)中或在大乳剂中。这样的技术公开在Remington’sPharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编(1980)中。可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有拮抗剂的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质呈成形物品(例如薄膜或微胶囊)的形式。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙烯基、可降解的乳酸-羟乙酸共聚物诸如LUPRONDEPOT^TM(由乳酸-羟乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。

脂质体转染或脂质体可以用于将本文中公开的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的那些或特异性地结合VEGF的那些)或本文中提供的组合物递送进细胞中。

还可以将活性成分包封在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(分别例如羟基甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中，在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米囊)中或在大乳剂中。这样的技术公开在Remington’s PHARMACEUTICAL SCIENCES，出处同上。

可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有本文中公开的非天然存在的chagasin支架蛋白的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质呈成形物品(例如薄膜或微胶囊)的形式。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙烯基、可降解的乳酸-羟乙酸共聚物诸如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-羟乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管聚合物诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羟乙酸能够释放分子持续超过100天，某些水凝胶会释放蛋白更短的时间段。当包封的chagasin支架蛋白在体内保留长时间时，它们可以由于在37℃暴露于水分而变性或聚集，从而导致生物活性的损失和免疫原性的可能变化。取决于涉及的机制，可以为稳定化设计合理的策略。例如，如果发现聚集机制是通过硫-二硫化物互换而形成分子间S-S键，可以如下实现稳定化：修饰巯基残基，从酸性溶液低压冻干，控制含水量，使用适当的添加剂，和开发特定的聚合物基质组合物。

要用于体内施用的制剂必须是无菌的。这通过例如穿过无菌过滤膜过滤而容易地实现。

使用非天然存在的Chagasin支架蛋白的诊断和成像

本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合LRP6的那些和/或特异性地结合VEGF的那些)可以用于检测例如患者样品中(例如，通过FACS、免疫组织化学(IHC)、ELISA测定)或患者中的LRP6蛋白或VEGF蛋白。标记的非天然存在的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合人LRP6或特异性地结合人VEGF的那些)可以用于诊断目的以检测、诊断或监测与靶配体(诸如LRP6或VEGF)的表达、异常表达和/或活性有关的疾病和/或病症。例如，本文中提供的非天然存在的chagasin支架蛋白可以用在原位、体内、离体和体外诊断测定或成像测定中。

提供了用于检测人LRP6的表达的方法，所述方法包括(a)使用一种或多种特异性地结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白测定个体的细胞(例如，组织)或体液中的多肽表达，和(b)将LRP6表达水平与标准LRP6表达水平进行对比，由此测定的LRP6表达水平相对于标准表达水平的增加或降低指示异常的表达。还提供了用于检测人VEGF的表达的方法，所述方法包括(a)使用一种或多种特异性地结合人VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白测定个体的细胞(例如，组织)或体液中的多肽表达，和(b)将VEGF表达水平与标准VEGF表达水平进行对比，由此测定的VEGF表达水平相对于标准表达水平的增加或降低指示异常的表达。

另外的实施方案包括诊断动物(例如，哺乳动物诸如人)中与LRP6的表达或异常表达有关的疾病或病症的方法。所述方法包括检测哺乳动物中的LRP6分子。在某些实施方案中，诊断包括：(a)给哺乳动物施用有效量的特异性地结合人LRP6的经标记的非天然存在的chagasin支架蛋白，(b)施用以后等待一段时间以允许经标记的chagasin支架蛋白优先聚集在受试者中表达LRP6分子的部位(和使未结合的经标记的分子被清除至背景水平)；(c)确定背景水平；和(d)检测受试者中经标记的分子，使得超过背景水平的经标记的分子的检测指示所述受试者具有与LRP6的表达或异常表达有关的特定疾病或病症。在某些实施方案中，诊断包括：(a)给哺乳动物施用有效量的特异性地结合人VEGF的经标记的非天然存在的chagasin支架蛋白，(b)施用以后等待一段时间以允许经标记的chagasin支架蛋白优先聚集在受试者中表达VEGF分子的部位(和使未结合的经标记的分子被清除至背景水平)；(c)确定背景水平；和(d)检测受试者中经标记的分子，使得超过背景水平的经标记的分子的检测指示所述受试者具有与VEGF的表达或异常表达有关的特定疾病或病症。可以通过多种方法确定背景水平，所述方法包括，将检测的经标记的分子的量与为特定系统在以前确定的标准值进行对比。

使用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法(例如，参见Jalkanen，等人，J.Cell.Biol.101：976-985(1985)；Jalkanen，等人，J.Cell.Biol.105：3087-3096(1987))，本文描述的经标记的chagasin支架蛋白(诸如特异性地结合人LRP6的经标记的chagasin支架蛋白或本文描述的特异性地结合人VEGF的经标记的chagasin支架蛋白)可以用于测定生物样品中的蛋白水平。可用于检测蛋白表达的其它方法包括免疫测定，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。合适的蛋白测定标记是本领域已知的，且包括酶标记，例如，葡萄糖氧化酶；放射性同位素，诸如碘(¹³¹I、¹²⁵I、¹²³I、¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫³⁵S)、氚(³H)、铟(^115mIn、^113mIn、¹¹²In、¹¹¹In)和锝(⁹⁹Tc、^99mTc)、铊²⁰¹Ti)、镓(⁶⁸Ga、⁶⁷Ga)、钯(¹⁰³Pd)、钼(⁹⁹Mo)、氙(¹³³Xe)、氟(¹⁸F)、¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu、¹⁵⁹Gd、¹⁴⁹Pm、¹⁴⁰La、¹⁷⁵Yb、¹⁶⁶Ho、⁹⁰Y、⁴⁷5c、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁴²Pr、¹⁰⁵Rh、⁹⁷Ru；鲁米诺；和荧光标记，诸如荧光素和罗丹明和生物素。

可以将本领域已知的技术应用于本文中提供的经标记的非天然存在的chagasin支架蛋白(例如，诸如特异性地结合人LRP6的经标记的非天然存在的chagasin支架蛋白或特异性地结合人VEGF的经标记的非天然存在的chagasin支架蛋白)。这样的技术包括、但不限于双功能缀合剂(参见例如，美国专利号5,756,065；5,714,631；5,696,239；5,652,361；5,505,931；5,489,425；5,435,990；5,428,139；5,342,604；5,274,119；4,994,560；和5,808,003)的应用。还可以如下研究LRP6或VEGF过表达：测量生物流体诸如血清中脱落的抗原，例如，使用基于经标记的chagasin支架的测定(也参见，例如，1990年6月12日授权的美国专利号4,933,294；1991年4月18日公开的W09I/05264；1995年3月28日授权的美国专利5,401,638；和Sias等人，J.Immunol.Methods 132：73-80(1990))。除了以上测定以外，熟练的从业人员可得到多种体内和离体测定。例如，可以将哺乳动物体内的细胞暴露于chagasin支架蛋白，所述chagasin支架蛋白任选地用可检测标记物(例如，放射性同位素)标记，并可以评价chagasin支架蛋白与靶配体(例如，LRP6或VEGF)的结合，例如，通过针对放射性的外部扫描或通过分析取自以前暴露于chagasin支架蛋白的哺乳动物的样品(例如，活组织检查或其它生物样品)。

制成品和试剂盒

在某些实施方案中，本文提供了制成品，其含有本文描述的特异性地结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白和可用于治疗例如癌症和转移性疾病、骨质疏松症和其它骨代谢和疾病、神经元和神经变性疾病、类风湿性关节炎和其它炎性疾病的材料。在某些实施方案中，本文提供了制成品，其含有本文描述的特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白和可用于治疗以异常血管生成和/或异常血管通透性为特征的疾病或病症或以异常VEGF活性或表达为特征的任意其它疾病(诸如本文别处描述的那些)的材料。

所述制成品可以包括容器和在容器上或伴随容器的标签或包装说明书。合适的容器包括，例如，瓶子、管形瓶、注射器等。容器可以由多种材料制成，例如玻璃或塑料。通常，所述容器容纳可有效地治疗病症的组合物，且可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的瓶子)。组合物内的至少一种活性剂是本文描述的特异性地结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白或本文描述的特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白。所述标签或包装说明书指示，所述组合物用于治疗特定病症。所述标签或包装说明书还包含关于将chagasin支架组合物施用给患者的指令。也预见到包含本文描述的联合疗法的制成品和试剂盒。

包装说明书表示在治疗产品的商业包中通常包括的指令，其含有关于与这样的治疗产品的应用有关的适应症、用法、剂量、施用、禁忌证和/或警告的信息。在某些实施方案中，所述包装说明书指示，包含特异性地结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白的组合物被用于治疗癌症和转移性疾病、骨质疏松症和其它骨代谢和疾病、神经元和神经变性疾病、类风湿性关节炎和其它炎性疾病。在某些实施方案中，所述包装说明书指示，包含特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白的组合物被用于治疗以异常血管生成和/或异常血管通透性为特征的疾病或病症、或以异常VEGF活性或表达为特征的任意其它疾病(诸如本文别处描述的那些)。另外，所述制成品还可以包括第二容器，其包含药学上可接受的缓冲液，诸如抑制细菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。制成品可以进一步包含从商业和用户观点看合乎需要的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。

还提供了试剂盒，其可用于多种目的，例如，用于分离或检测患者中的LRP6或VEGF，所述试剂盒任选地与所述制成品组合。为了分离和纯化LRP6，所述试剂盒可以含有与珠子(例如，sepharose珠子)偶联的、本文描述的特异性地结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白。为了分离和纯化VEGF，所述试剂盒可以含有与珠子偶联的、本文描述的特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白。可以提供含有本文描述的非天然存在的chagasin支架蛋白的试剂盒，所述chagasin支架蛋白用于在体外(例如在ELISA或印迹中)检测和定量LRP6或VEGF。与制成品一样，所述试剂盒包括容器和在容器上或伴随容器的标签或包装说明书。例如，所述容器容纳组合物，所述组合物包含至少一种本文描述的特异性地结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白或至少一种本文描述的特异性地结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白。可以包括另外的容器，其含有例如稀释剂和缓冲剂、对照抗体等。所述标记或包装说明书可以提供组合物的描述以及用于预期体外或诊断用途的指令。

实施例

实施例1：材料和方法

Chagasin克隆和噬粒构建体设计

用优化的密码子选择用下述序列合成了chagasin基因：ATGTCCCACAAGGTGACGAAAGCCCATAACGGTGCGACCTTGACGGTGGCGTCGGCGAGCTGGTGGAGATTCAGCTTCCGAGCAATCCGACCACTGGGTTCGCGTGGTATTTTGAAGGTGGTACCAAAGAAAGTCCGAATGAATCCATGTTCACCGTCGAGAATAAGTACTTTCCGCCGGACAGTAAACTGTTGGGTGCTGGCGGGACGGAGCACTTTCATGTGACAGTGAAGGCGGCGGGTACGCACGCAGTAAATCTCACTTACATGCGCCCGTGGACAGGCCCGTCGCACGATTCCGAGCGTTTCACTGTATATCTCAAGGCAAAC(SEQ ID NO：91)

用N-端表位标签(gD-标签)MADPNRFRGKDLGSLE(SEQ ID NO：92)(NJ Skelton等人，J Biol Chem 278，7645-7654，2003)通过PCR扩增chagasin基因并克隆进噬粒载体(SSSidhu等人，Methods Enzymol 328，333-363，2000；R Tonikian等人，Nat Protoc 2，1368-1386，2007)中在MalE信号肽和噬菌体外壳蛋白g3或g8之间，包括在外壳蛋白前面的(GGS)₃接头。使用Kunkel诱变(R Tonikian等人，Nat Protoc 2，1368-1386，2007)，通过用2个终止密码子替代chagasin的3个环区域，修饰含有噬粒载体的Chagasin。可替换地，对于一些文库在chagasin基因后面引入TAG琥珀终止密码子以降低展示水平。将这些构建体用作Kunkel模板用于文库生产，其中使用用NNK密码子合成的或来自在为随机化选择的位置处的三核苷酸的寡核苷酸(R Tonikian等人，Nat Protoc 2，1368-1386，2007)。

在噬菌体上的chagasin展示的确定

如所述的(SS Sidhu等人，Methods Enzymol 328，333-363，2000；R Tonikian等人，Nat Protoc 2，1368-1386，2007)，生产展示与外壳蛋白p3或p8融合的gD-标记的chagasin的噬菌体。通过噬菌体ELISA(其用从2.5×10¹²噬菌体/ml开始的噬菌体溶液的系列2倍稀释物)测量纯化的噬菌体与抗-gD抗体(Genentech，Inc.)或木瓜蛋白酶的结合，并使用抗-M13HRP-缀合抗体(NEB)检测。

chagasin环的丙氨酸扫描

制备三个丙氨酸扫描文库用于分析，每个文库同时含有两个随机化的环(L2和L4、L2和L6、L4和L6)。使用丙氨酸鸟枪扫描密码子(GA Weiss等人，Proc Natl Acad Sci USA97，8950-8954，2000)将环2、4和6中的下述位置(分别是Ser28至Phe34、Pro59至Gly69、和Arg91至Ser100)随机化。使用抗-gD抗体包被的Maxisorp免疫平板(Nunc)执行两轮亲和力选择，并使用以前描述的方法(R Tonikian等人，Nat Protoc 2，1368-1386，2007)通过噬菌体斑点ELISA和DNA测序来分析选择的噬菌体克隆。

原初chagasin噬菌体文库设计

使用基本上如所述的方法(R Tonikian等人，Nat Protoc 2，1368-1386，2007)制备Chagasin文库。Chagasin噬粒构建体充当Kunkel模板，其中用两个终止密码子替代编码在L2、L4和L6处的残基位置(分别是28-34、59-69和91-100)的DNA。

表5：为随机化选择的残基位置

L2：	SNPX<sub>2</sub>GF	SEQ ID NO：93
			L2：	SNX<sub>4</sub>GF	SEQ ID NO：94
L4：	<u>P</u>X<sub>6-14</sub>GAGG	SEQ ID NO：95
			L6：	R<u>P</u>WT<u>GP</u>SHDS	SEQ ID NO：84

基于丙氨酸扫描结果(实施例2)和L2中的额外残基插入(实施例3)，将在chagasin环L2、L4和L6中的粗体显示的氨基酸残基位置选择用于随机化。加下划线的位置在保守文库中是固定的。使用NNK密码子，基于上面表5中所示的为随机化选择的位置(X)设计了7种寡核苷酸：

L2-X2：GGA GAT TCA GCT TCC GAG CAA TCC GNN KNN KGG GTT CGC GTG GTATTTTGA AGG(SEQ ID NO：96)

L2-X4：GGA GAT TCA GCT TCC GAG CAA TNN KNN KNN KNN KGG GTT CGC GTG GTATTTTGA AGG(SEQ ID NO：97)

L4-X6：GTC GAG AAT AAG TAC TTT CCG NNK NNK NNK NNK NNK NNK GGT GCT GGCGGG ACG GAG CAC TTT CAT GTG(SEQ ID NO：98)

L4-X8：GTC GAG AAT AAG TAC TTT CCG NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK GGTGCT GGC GGG ACG GAG CAC TTT CAT GTG(SEQ ID NO：99)

L4-X10：GTC GAG AAT AAG TAC TTT CCG NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNKNNK NNK GGT GCT GGC GGG ACG GAG CAC TTT CAT GTG(SEQ ID NO：100)

L6-X4GX5：GTA AAT CTC ACT TAC ATG NNK NNK NNK NNK GGT NNK NNK NNK NNKNNK GAG CGT TTC ACT GTA TAT C(SEQ ID NO：101)

L6-XPX2GPX4：GTA AAT CTC ACTTAC ATG NNK CCA NNK NNK GGT CCG NNK NNKNNK NNK GAG CGT TTC ACT GTA TAT C(SEQ ID NO：102)

用这些寡核苷酸制备了共8种原初个体文库，其中单独的L4、L4和L2、或所有3个环含有随机化的位置(参见下面的表6)。在8和21残基之间同时随机化。

表6：原初Chagasin文库

噬菌体淘选

基本上如所述的(R Tonikian等人，Nat Protoc 2，1368-1386，2007；Y Zhang等人，J Biol Chem 289，942-955，2014)，在溶液中或在包被的平板上进行噬菌体淘选。执行四轮噬菌体淘选以富集靶标特异性的结合剂。关于LRP6的文库淘选总是在溶液中进行，而针对VEGF109的初始原初文库淘选在平板上进行，并然后在亲和力成熟过程中转换至溶液筛分。第四轮淘选以后，将来自每个文库或文库集合的96个克隆单个地生产并通过噬菌体ELISA和DNA测序进行分析。在溶液噬菌体淘选过程中，在轮之间调节靶蛋白浓度(范围从500nM至0.5nM)。

靶标特异性的chagasin结合剂的亲和力成熟

通过环中选择的新序列的软随机化，使针对LRP6或VEGF109的靶标特异性的chagasin结合剂进行亲和力成熟。使用简并寡核苷酸(其用核苷酸碱基的70-10-10-10混合物合成，其中野生型碱基是过量的)构建软随机化文库。这导致以大约50％的频率出现在靶位置的野生型氨基酸和大约50％的所有其它氨基酸。如上所述进行这些新文库的噬菌体淘选，并使用在线软件WebLogo 3.3产生WebLogo图。

LRP6的表达和纯化

如前面所述(E Bourhis等人，J Biol Chem 285，9172-9179，2010)生产具有C-端Avi-标签和His₆-标签的LRP6 E1E2。使用试剂盒(GeneCopoeia)根据生产商的方案进行生物素化。

chagasin变体的表达和纯化

将Chagasin变体克隆进具有N-端His₆-GST-标签的pET52b载体主链中，用TEV切割位点分离chagasin变体。将构建体转化进BL21Star大肠杆菌细胞(Invitrogen)中并在TB自动培养基中在16℃在200rpm表达72小时。将细胞沉淀物通过离心进行收获并在PBS缓冲液中用微流态化仪裂解。在50,000g离心以后，对细胞裂解物根据生产商的方案进行Ni-NTA超流(superflow)亲和纯化(Qiagen)，继之以在S200柱(GE Healthcare Life Sciences)上在20mM Tris pH 8和150mM NaCl中在30cm/h流速的尺寸排阻色谱法。将含有GST融合的chagasin变体的级分浓缩，并用补充了1mM DTT的TEV蛋白酶(25μg TEV/mg GST-chagasin)在室温切割过夜。使用S75尺寸排阻色谱法(GE Healthcare Life Sciences)在20mM TrispH 8和150mM NaCl中在30cm/h流速分离切割的chagasin变体并浓缩。

具有Strep-标签II(IBA GmbH)的chagasin变体的小规模表达.我们在含有chagasin变体的噬粒中在chagasin的C-端处引入了编码Strep-标签II(SAWSHPQFEK)的DNA序列。掺入的Ser-Ala残基提高了对StrepMAB-Immo的亲和力。将含有这些噬粒变体的转化的大肠杆菌菌株33D3(Genentech，Inc.)培养至对数期，并用0.5mM IPTG诱导和在30℃培养过夜。通过在10,000g离心除去细胞，上清液培养基含有分泌的具有Strep-标签II的chagasin变体，然后将其用于在OctetRED384上的结合研究。

使用ExiProgen^TM系统的chagasin变体的小规模表达

使用ExiProgen^TMProXpress模板试剂盒根据生产商的方案(Bioneer)用C-端His₆-标签和Avi-标签扩增编码chagasin变体的DNA。使用EC1蛋白合成试剂盒(Bioneer)在ExiProgen^TM仪器(Bioneer)上通过加入BirA和d-生物素(Avidity，LLC)生产蛋白，以从Ni-亲和色谱法得到20-40μg纯化的生物素化的蛋白。

基于Wntl细胞的测定

如所述的(Y Zhang等人，Nat Chem Biol 5，217-219，2009；Y Gong等人，PLoS One5，e12682，2010)执行在WNT1转染的HEK293S细胞中的萤光素酶报告物测定。将纯化的chagasin LRP6变体和抑制剂系列稀释2倍并按指示加入。

VEGFR1-VEGF竞争结合ELISA

如以前所述(J Bostrom等人，Science 323，1610-1614，2009)进行该测定。将Maxisorp免疫平板用在PBS中的VEGFR1-Fc(5μg/ml)包被过夜。将0.4nM生物素化的VEGF165(用来自Pierce的NHS-PEG4-生物素根据它们的方案执行标记)与VEGF结合剂的系列滴定液1∶1混合2小时，然后将它与VEGFR1-Fc包被的平板一起温育15min。用含有0.05％吐温20的PBS洗涤以后，用分光光度计在450nm用NeutrAvidin-HRP和TMB底物(Pierce)检测结合。VEGF109、165和VEGFR1-Fc由Germaine Fuh(Genentech，Inc.)慷慨提供。

细胞的VEGF受体抑制测定

基本上如所述的(MD Sadick等人，J Pharm Biomed Anal 19，883-891，1999；HGille等人，JBiol Chem 276，3222-3230，2001)，测量通过受体KDR对细胞上的VEGF信号传递的抑制。将恒定量的25或50ng/mL人、小鼠或大鼠VEGF与不同浓度的chagasin变体或抑制剂混合，然后刺激表达表达KDR的CHO细胞。

在OctetRED384上的动力学结合测量

使用OctetRED384(ForteBio)测量chagasin变体对靶标LRP6和VEGF109的结合亲合力。在基于PBS的动力学缓冲液(ForteBio)中在1000rpm板摇动下执行所有洗涤、稀释和测量。将抗生蛋白链菌素生物传感器(SA尖，ForteBio)在动力学缓冲液中平衡5min，然后加载生物素化的LRP6-E1E2或生物素化的VEGF109(20μg/ml)至2nm信号差异的密度，随后是3min洗涤步骤。对于结合阶段(association phase)，配体包被的SA-尖处于含有chagasin变体的溶液(7个系列2倍稀释液，从1000或250nM开始)中。在含有单独动力学缓冲液的孔中测量chagasin变体-靶标复合物的解离多达30min。在结合和解离测量中穿过仅含有缓冲液的孔的装载配体的SA尖的传感图用作参照用于背景减去。使用Octet评价软件v7.0.1.3使用具有总体拟合的1∶1结合模型确定Kd、k_a和k_d。可替换地，给AMC-生物传感器(Fortebio)加载StrepMAB-Immo(IBA GmbH)至饱和并随后用于捕获含有Strep-标签II的chagasin变体至饱和。在动力学缓冲液中洗涤5min以后，基本上如上所述确定针对未标记的LRP6-E1E2片段的结合动力学。

实施例2：chagasin环中用于随机化的氨基酸位置的确定

为了验证chagasin与噬菌体的相容性，将chagasin野生型(wt)基因与N-端表位-标签(gD-标签)(NJ Skelton等人，J BiolChem 278，7645-7654，2003)一起融合至噬粒载体中的g3或g8的N-端(SS Sidhu等人，Methods Enzymol 328，333-363，2000；R Tonikian等人，Nat Protoc 2，1368-1386，2007)，并针对它的展示和与木瓜蛋白酶或抗-gD抗体的结合进行试验。在p3-和p8-融合体展示模式中，chagasin在噬菌体滴定ELISA中表现出与木瓜蛋白酶的特异性结合，且不具有可检测的与BSA的结合(参见图2)。通过在268nM的OD确定噬菌体浓度，并相对于抗-gD抗体或木瓜蛋白酶进行滴定。当对比与作为对照的BSA的结合时，两个结合事件都是特异性的。

然后确定在环2、4和6中可以为了产生原初chagasin蛋白文库而随机化的位置。目前不可得到针对chagasin的构象特异性抗体以捕获展示的chagasin变体。因而，为了确定给定的位置的耐受性，执行丙氨酸扫描以鉴别允许存在野生型残基或丙氨酸的氨基酸位置。在某种情况下，由于遗传密码的变性，替代野生型或丙氨酸的2个其它氨基酸也是可能的(GA Weiss等人，Proc Natl Acad Sci USA 97，8950-8954，2000)。通过在用抗-gD抗体包被的Maxisorb免疫平板上的N-端gD-标签捕获展示chagasin变体的噬菌体文库，其中仅适当折叠的chagasin变体被较好地展示用于捕获。如果野生型残基是稳定性所必需的，预期它在该位置超过丙氨酸而占优势，而具有丙氨酸和野生型残基的相等发生的位置将指示对丙氨酸和可能的其它残基的耐受性。因而具有丙氨酸和野生型残基的相等发生的位置被选择为用于随机化的位置。

制备了3个含有2个同时成对扫描的环(L2+L4、L2+L6、L4+L6)的丙氨酸扫描文库，并使用标准操作(R Tonikian等人，Nat Protoc 2，1368-1386，2007)进行2轮淘选。得到来自每个文库的96个单独挑取的克隆的DNA序列，并使用WebLogo 3.3使用logo图分析在每个随机化位置出现的残基的频率/概率。环2含有序列SNPTT(SEQ ID NO：4)并允许对2个苏氨酸(位置31和32)的丙氨酸置换，具有Thr32与L4中的变异的某种共同依赖性。Asn或Asp在位置29是优选的，但是所有其它位置表现出对野生型残基的高偏爱。环4含有野生型序列PPDSKLLGAGG(SEQ ID NO：149)并表现出对Pro59和Ser62的某种偏爱，但是没有显著至从随机化排除这些位置。Gly66和Gly69是在环4中非常优选的残基。环6含有序列RPWTGPSHDS(SEQ ID NO：84)且没有在任何位置表现出对野生型残基的强烈偏爱。

实施例3：用于文库设计的L2环延伸的研究

接着，执行试验来确定是否可以延伸环2而不显著影响蛋白稳定性。构建了5个在L2中在Asn30和Gly33之间含有1、2、3、5或7个额外随机残基的文库，并对它们进行两轮抗-gD抗体分选以选择展示的chagasin变体。通过噬菌体斑点ELISA，针对chagasin展示水平分析了来自每个文库的共96个噬菌体克隆。L2中多达3个残基的插入产生这样的克隆：其具有非常均匀的展示水平的与抗-gD抗体的结合和非常低水平的与BSA的结合。超过3个残基的插入表现出降低的展示水平的chagasin变体，具有增加的非特异性结合，如通过与BSA的结合所测量的。

实施例4：Chagasin文库设计

基于每个环的位置丙氨酸扫描以及L2的环长度选择，为随机化选择上面表4中所示的具体位置。设计了8个原初chagasin蛋白文库并在噬菌体上展示，即，6个在g3上的文库和2个在g8上的文库(上面表6)。由于在chagasin同系物中L4的长度可以在10-21个残基之间变化(D Salmon等人，J Mol Biol 357，1511-1521，2006)，没有通过相对于抗-gD抗体淘选文库关于它们的稳定性和序列组成试验在该环中的不同长度变异。

实施例5：结合靶蛋白的chagasin变体的制备

为了验证chagasin作为支架的实用性和它的产生以高亲和力、特异性和活性结合除了半胱氨酸蛋白酶以外的其它蛋白的变体的能力，将Wnt信号传递共受体LRP6(KIPinson等人，Nature 407，535-538，2000；K Tamai等人，Nature 407，530-535，2000)和生长因子VEGF(DW Leung等人，Science 246，1306-1309，1989)选择为靶蛋白用于噬菌体淘选。在结构上和在功能上充分表征了LRP6(VE Ahn等人，Dev Cell 21，862-873，2011；EBourhis等人，Structure 19，1433-1442，2011；Z Cheng等人，Nat Struct Mol Biol 18，1204-1210，2011)和VEGF(YA Muller等人，Proc Natl Acad Sci USA 94，7192-7197，1997；CWiesmann等人，Cell 91，695-704，1997)。在本文中使用的VEGF是指VEGF-A，其具有多种形式(BA Keyt等人，J Biol Chem 271，7788-7795，1996)。VEGF109表示含有残基8-109的蛋白(也被称作VEGF109；VEGF8-109；VEGF_8-109)，且VEGF165表示含有残基1-165的蛋白(也被称作VEGF165；VEGF1-165；VEGF_1-165；VEGF₁₆₅。

结合LRP6的chagasin变体的制备

首先对8个原初chagasin文库分别相对于C-端Avi-标记的LRP6受体片段E1E2(EBourhis等人，Structure 19，1433-1442，2011)进行4轮溶液噬菌体淘选(Y Zhang等人，JBiol Chem 289，942-955，2014)。所有文库产生了特异性地结合LRP6-E1E2的chagasin变体，如通过噬菌体斑点ELISA所确定的，其中在最后一轮淘选中用于靶标结合的噬菌体滴度富集范围为0-100倍。

已经描述了选择性地结合直链NXIK肽基序的LRP6的第一个β-螺旋桨结构域(E1)中的功能性蛋白-蛋白相互作用位点(E Bourhis等人，Structure 19，1433-1442，2011)。与抗-LRP6抑制性抗体(YW210.09)或来自天然抑制剂Dkk1、SOST的肽或从噬菌体展示来源的肽形成复合物的LRP6-E1的晶体结构揭示这些结合配偶体(以Dkk1肽Ac-NSNAIKN-NH₂(SEQID NO：109)为例)与受体片段的一致相互作用(图3)。

chagasin LRP6变体(特异性地结合LRP6的chagasin变体)的序列分析表现出对NXIK序列基序的强烈偏好，主要是在随机化的环L4中。21个在噬菌体斑点ELISA中表现出强烈靶标结合和特异性的变体选自在仅L4、L2和L4或在所有3个环中随机化的文库。所述变体以小规模从大肠杆菌表达为具有C-端Strep-标签II的分泌蛋白(TG Schmidt和A Skerra，Nat Protoc 2，1528-1535，2007)。将它们的结合动力学绘图并按照在OctetRED384上的生物层干扰量度法(BLI)测量排序，其中给AMC尖加载StrepMAB-Inmo捕获抗体以固定化chagasin LRP6变体，且LRP6-E1E2受体片段是在溶液中。3种LRP6结合剂(变体H、P和S)具有在纳摩尔范围内的缓慢解离速率动力学和结合亲合力(分别Kd＝6、150、70nM)(图4)。变体S含有2个可以形成分子内二硫键的半胱氨酸，但是也与它自身形成同源二聚体，如通过在非还原条件下的SDS-PAGE检测的。通过制备文库使变体H和变体S进行亲和力成熟，其中所有3个环同时软随机化。在最后一步中用3种不同的靶浓度(0.5、0.1、0.05nM)对得到的文库进行3轮严谨溶液噬菌体淘选。将384个噬菌体克隆分别表达并通过噬菌体斑点ELISA分析特异性和提高的亲和力。从许多良好的结合剂中，将具有最高靶标结合特异性的来自文库H和来自文库S的前16个克隆(即，共计32个克隆)选择用于使用Bioneer Exiprogen^TM系统用C-端Avi-标签的小规模表达，并通过BLI测量来表征它们与LRP6-E1E2的动力学结合特性。将具有最佳结合动力学特性(快速结合速率、缓慢解离速率)的前4个克隆选择用于大规模表达为GST-融合蛋白(参见下面表7)。

表7：基于它们的结合动力学在OctetRED384上筛选高亲和力的32个变体中的前4个

克隆H2、H15和S11都较好地表达并产生单体chagasin LRP6变体。克隆H2和H15对LRP6-E1E2分别具有400pM和250pM的结合亲合力(Kd)，而变体S11具有74nM的结合亲和力(图5)。

高亲和力chagasin LRP6变体抑制Wnt依赖性的细胞信号传递

在基于细胞的测定中针对它们的阻断Wnt信号传递的能力进一步表征所有三种chagasin LRP6变体(Y Zhang等人，Nat Chem Biol 5，217-219，2009；Y Gong等人，PLoSOne 5，e12682，2010)。不同的Wnt配体结合LRP6受体的不同部分(EBourhis等人，J BiolChem 285，9172-9179，2010)。Wnt3a与LRP6的E3结构域相互作用，而Wnt1与E1结构域相互作用，据推测是在抑制性抗体YW210.09和Dkk1所结合的重叠部位(Y Gong等人，PLoS One 5，e12682，2010)。单体chagasin LRP6变体H2、H15和S11在该基于细胞的测定中表现出Wnt1信号传递的剂量依赖性抑制，分别具有31、26和400nM的IC₅₀值(图6)。与此相比，二价抑制性抗体YW210.09具有28nM的IC₅₀，从而证实单体变体H2和H15是同样有效的试剂。所有chagasinLRP6变体在该测定中导致在饱和浓度的完全抑制。野生型chagasin在该测定中没有抑制Wnt1信号传递，它也没有干扰正常细胞生长。高亲和力chagasin LRP6变体与YW210.09结合表位重叠并利用LRP6的E1上的相同NXIK肽结合位点。

结合VEGF的chagasin变体的制备

为了制备chagasin VEGF变体(即，特异性地结合VEGF的chagasin变体)，将8个单个的原初chagasin噬菌体文库合并成3组(A、B、C)，其中集合A仅含有具有不同长度的随机化环L4的文库，集合B含有具有随机化L2和L4环的文库，且集合C由其中所有3个环被同时随机化的文库组成(表6)。对这3个文库集合进行4轮常规板分选，其中将VEGF固定化在MaxiSorp免疫平板上(Y Chen等人，J Mol Biol 293，865-881，1999；R Tonikian等人，NatProtoc 2，1368-1386，2007)。培养共96个来自每个文库集合的单个噬菌体克隆，并针对特异性的靶标结合通过噬菌体斑点ELISA进行分析。仅文库集合C产生具有高靶标结合和特异性的单个变体，其在ELISA中通过针对VEGF和BSA的噬菌体滴定进行证实(图7)。将所有5种变体生产为GST-融合蛋白，并在竞争结合ELISA中针对它们的阻断VEGF与VEGFR1-ECD Fc融合体的结合的能力进行试验(图8)(J Bostrom等人，Science 323，1610-1614，2009)。仅变体4(作为GST-融合蛋白，与G6抗-VEGF抗体一起)(G Fuh等人，J Biol Chem281，6625-6631，2006；WC Liang等人，J Biol Chem 281，951-961，2006)能够阻断VEGF与VEGFR1-ECD的结合，分别具有13nM至0.25nM的IC₅₀值。变体3在较高浓度表现出相当弱的抑制，但是其它结合剂都不具有抑制活性。单体chagasin VEGF变体4在相同测定中没有阻断VEGF结合(图9)。不受理论的约束，这可能是由于以下事实：在该测定中GST形成二聚体并且可以导致增加的chagasin变体与VEGF的结合亲合力从而增强效能。在该测定中，同源二聚体VEGF的结合位点需要在该测定中阻断以有效地废除信号。

Chagasin VEGF变体抑制VEGF依赖性的细胞信号传递

我们在基于细胞的测定中试验了变体4作为GST-融合体以及单体chagasin VEGF变体4，以观察它们是否能够通过它的受体KDR阻断VEGF依赖性的细胞信号传递，其中细胞内的受体磷酸化是读出(图10A-10C和11和下面的表7和8)(H Gille等人，JBiol Chem 276，3222-3230，2001)。在该测定中，GST融合的和单体的变体4具有抑制活性，IC₅₀值分别为72和908nM；其它GST融合的chagasin VEGF变体没有抑制活性。令人感兴趣的是，变体4是对人VEGF特异性的，因为它没有抑制鼠或大鼠VEGF依赖性的信号传递。

表8：在基于细胞的测定中结合VEGF的GST-chagasin变体对VEGF的抑制活性(IC₅₀，nM)

表9：在基于细胞的测定中结合VEGF的GST-变体4、变体4和抗-VEGF抗体对VEGF的抑制活性(IC₅₀，nM)

chagasin VEGF变体4的亲和力成熟

为了提高单体VEGF变体4的亲和力和效能，我们设计了4个新文库，其中将该变体的L2和L6的序列软随机化，且L4含有6、8或10个具有YSGX组成(不包括半胱氨酸)的随机化位置(FA Fellouse等人，J Mol Biol 373，924-940，2007)或软随机化的亲本序列。对所有文库进行4轮严谨溶液噬菌体淘选(Y Zhang等人，J Biol Chem 289，942-955，2014)。将共96个来自每个文库的克隆表达为单个克隆并通过噬菌体ELISA进行分析。从分析的384个噬菌体克隆中，鉴别出34个具有高靶标特异性的单个克隆(图12)，并使用来自Bioneer的ExiProgen^TM小规模表达23个克隆。图12显示了通过噬菌体斑点ELISA确定的、对VEGF具有高靶标亲和力和特异性的33个噬菌体克隆的部分序列。在环2、4、6中的随机化位置以粗体显示。23个在ExiProgen^TM上小规模生产的变体用星号标记。在基于细胞的测定中为试验生产的6种变体是E4B-10、E4B-5、E4B-7、37、L4X6-3、L4X8-9和L4X6-7，如图12的右侧上所示。半胱氨酸标有下划线。

在OctetRED384上通过BLI描绘这23种变体的结合动力学，并将这些中的最佳6种以较大规模表达为GST-融合体，并在TEV蛋白酶切割以后纯化为单体chagasin VEGF变体。针对它们通过细胞上的KDR受体抑制VEGF依赖性的信号传递的能力试验这6种变体(HGille等人，J Biol Chem 276，3222-3230，2001)。所述变体中的大多数表现出相对微小的抑制提高，但是变体L4X6-7和L4X8-9分别具有65和301nM的IC₅₀值，其代表相对于亲本chagasin变体4的13和2倍提高(图13和下面的表9)。基于动力学结合测量，L4X6-7与VEGF的结合亲和力是Kd＝150nM(图14)，其为相对于亲本变体4的2.5倍提高。

表10：在基于细胞的测定中从变体4来源的亲和力成熟的结合VEGF的变体针对hVEGF的抑制活性(IC₅₀，nM)

以较高亲和力结合VEGF的chagasin同源二聚体变体的鉴别.

通过噬菌体ELISA检测出的表现出高度靶标特异性的34个单个克隆中的9个含有在L2中的相同位置处的单个半胱氨酸(YFCD)。由于L4环在亲本序列的亲和力成熟以后仍然携带大量序列变异性且环L2和L6仅表现出非常微小的变化且最优选亲本序列，所以L4可能不显著参与VEGF结合。选择在g3上展示的克隆37(其具有含有在L2中的单个半胱氨酸的琥珀终止密码子(amber stop)(YFCD))并表达为GST-融合体。通过TEV切割除去GST和S75尺寸排阻色谱法以后，变体37开始在氧化条件下自发地形成同源二聚体(图15)。图15显示了chagasin VEGF变体37和66的SDS-PAGE分析和结合动力学。Chagasin变体37在氧化条件下形成二聚体，其可以在还原条件下分离成单体。在OctetRED384上用加载在SA传感器尖上的生物素化的VEGF109测量两种结合剂的结合动力学。两种结合剂表现出缓慢的解离速率，其中二聚体的chagasin变体37是二相性的。

发现在g3上展示的仅单个克隆(克隆66)(其具有琥珀终止密码子)在任何随机化的环中不含有任何半胱氨酸。使用Exiprogen^TM以小规模生产Chagasin变体66，并通过BLI评价与VEGF的结合。该克隆表现出指示两位数纳摩尔结合剂的结合动力学曲线(图15)。

大规模蛋白表达和纯化以后，注意到chagasin变体66具有有限的溶解度且在基于细胞的实验和亲和力测量所需的浓度会沉淀。设计了2个基于克隆66的序列的新噬菌体文库，其中每个变体在环L2和L4中在此时仅含有单个随机化的位置，从而允许掺入20种氨基酸中的任一种(“NNK行走”)。如前面所述在亲和力成熟操作中将文库淘选2轮，并将200个来自最后一次分选的随机克隆选择用于DNA测序和分析。基于序列分析，将L2和L4中的2个酪氨酸残基分别用其它残基替代，所述其它残基基于它们在测序的克隆中的丰度而选择为第二层。将4个新克隆(66-L2-K、66-L4-Q、66-L4-T、66-L4-S)表达并纯化为GST-融合体，并如上所述通过TEV切割得到各个chagasin变体。通过Octet测量它们对VEGF109的亲和力，并在基于细胞的测定中试验它们的抑制活性，如上所述。测量的这些变体的数据列出在下面的表11中：

表11

以上实施例仅仅为了例证目的而提供，且无意以任何方式限制本发明的范围。除了本文显示和描述的那些内容以外，本领域技术人员从前述描述会明白本发明的不同改变，并且所述改变落入所附的权利要求的范围内。

实施方案的列表

1.一种非天然存在的chagasin支架蛋白，其包含在环2(L2)、环4(L4)和/或环6(L6)中的至少一个氨基酸改变，参考野生型chagasin-样半胱氨酸蛋白酶抑制剂。

2.实施方案1的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中所述野生型chagasin-样半胱氨酸蛋白酶抑制剂来自克氏锥虫(T.cruzi)(Dm28c克隆)、克氏锥虫(CL Brenner株，同种型1)、克氏锥虫(CL Brenner株，同种型2)、布氏锥虫(T.brucei)、墨西哥利什曼原虫(L.mexicana)、硕大利什曼原虫(L.major)、溶组织内阿米巴(E.hystolytica)或铜绿假单孢菌(P.aeruginosa)。

3.实施方案1的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中所述野生型chagasin-样半胱氨酸蛋白酶抑制剂来自人CD8 T-细胞表面糖蛋白、人白介素-1受体1型(IL-1R1)或人血管细胞粘附分子-1(Vcam-1)。

4.实施方案2或3的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中所述野生型chagasin-样半胱氨酸蛋白酶抑制剂是具有在SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的克氏锥虫(CLBrenner株，同种型1)。

5.实施方案4的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L2包含氨基酸序列X_5-8-GF(SEQ ID NO：151)，其中X代表任意氨基酸。

6.实施方案5的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L2包含氨基酸序列SNX_3-6-GF(SEQ ID NO：152)，其中X代表任意氨基酸。

7.实施方案4-6中任一项的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L4包含氨基酸序列X_7-15-GAGG(SEQ ID NO：153)，其中X代表任意氨基酸。

8.实施方案4-7中任一项的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L6包含氨基酸序列X_3-12(SEQ ID NO：154)，其中X代表任意氨基酸。

9.实施方案8的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L6包含氨基酸序列X₁₀(SEQID NO：106)，其中X代表任意氨基酸。

10.实施方案4-9中任一项的非天然存在的chagasin支架蛋白，其包含在SEQ IDNO：2中所示的氨基酸序列。

11.实施方案1-10中任一项的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中所述非天然存在的chagasin支架蛋白特异性地结合靶配体。

12.实施方案11的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中所述靶配体是蛋白、核酸、多糖、脂多糖、脂质或磷脂。

13.实施方案12的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中所述靶配体是蛋白。

14.实施方案13的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中所述蛋白是细胞表面蛋白、可溶性蛋白、病毒蛋白、细菌蛋白、与眼疾病有关的蛋白、与癌症有关的蛋白、与骨疾病有关的蛋白、与炎症有关的蛋白或治疗性蛋白。

15.实施方案13的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中所述蛋白是LRP6。

16.实施方案13的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中所述蛋白是VEGF。

17.与治疗剂缀合的实施方案1-16中任一项的非天然存在的chagasin支架蛋白。

18.与标记缀合的实施方案1-16中任一项的非天然存在的chagasin支架蛋白。

19.根据实施方案18的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中所述标记选自由放射性同位素、荧光染料和酶组成的组。

20.一种分离的核酸，其编码根据实施方案1-16中的任一项的非天然存在的chagasin支架蛋白。

21.一种表达载体，其编码实施方案20的核酸分子。

22.一种细胞，其包含实施方案21的表达载体。

23.一种生产实施方案1-16中任一项的非天然存在的chagasin支架蛋白的方法，所述方法包括，培养实施方案22的细胞，和从细胞培养物回收非天然存在的chagasin支架蛋白。

24.一种生产实施方案1-16中任一项的非天然存在的chagasin支架蛋白的方法，所述方法包括，化学合成非天然存在的chagasin支架蛋白。

25.一种组合物，其包含实施方案1-16中任一项的非天然存在的chagasin支架蛋白和药学上可接受的载体。

26.一种多肽展示文库，其包含多个实施方案1-16中任一项的非天然存在的chagasin支架蛋白。

27.实施方案26的多肽展示文库，其中所述非天然存在的chagasin支架蛋白展示在核糖体、噬菌体、病毒、细菌或酵母细胞的表面上。

28.实施方案27的多肽展示文库，其中所述非天然存在的chagasin支架蛋白展示在噬菌体上。

29.实施方案28的多肽展示文库，其中所述噬菌体是丝状噬菌体。

30.实施方案29的多肽展示文库，其中所述丝状噬菌体是M13噬菌体。

31.实施方案26-30中任一项的多肽展示文库，其中所述多肽文库具有约10⁸至约10¹⁴之间的序列多样性。

32.编码实施方案26-31中任一项的多肽展示文库的核酸分子。

33.一种表达载体，其可操作地连接至实施方案32的核酸分子。

34.一种得到特异性地结合靶配体的非天然存在的chagasin支架蛋白的方法，所述方法包括：

(a)在允许形成非天然存在的chagasin支架蛋白：靶配体复合物的条件下使靶配体与实施方案26-31中任一项的文库接触；

(b)检测非天然存在的chagasin支架蛋白：靶配体复合物的形成；和，

(c)从所述复合物得到特异性地结合靶配体的非天然存在的chagasin支架蛋白。

35.实施方案34的方法，所述方法还包括，将在步骤(c)中得到的非天然存在的chagasin支架蛋白的L2、L4和/或L6随机化以产生进一步随机化的非天然存在的chagasin支架蛋白，和使用所述进一步随机化的非天然存在的chagasin支架蛋白重复步骤(a)和(b)。

36.一种非天然存在的chagasin支架蛋白，其特异性地结合与结合人低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白相同的表位，其中所述结合人LRP6的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNP-T/S/A/Q-T/C/D(SEQ ID NO：150)或SN-V/A-D(155)的L2，包含氨基酸序列Y/S-N-N/K-I/V-R/K-G-L/V/I-PGF(SEQ ID NO：156)或SN-Y/S-TK-H/R(SEQ ID NO：157)或DSNEIWYC(SEQ ID NO：77)的L4；和包含氨基酸序列R/S/P/G-P/R-W/Y/E/S/V-T/Y/K/T-G-P/S/A-S/T/Y-H/K/L/Q/D-D/V/E-S/E/M/P/V(SEQ ID NO：148)的L6，根据SEQ ID NO：2。

37.特异性地结合人低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中所述非天然存在的chagasin支架蛋白与结合人LRP6的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白竞争结合，其中所述结合人LRP6的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNP-T/S/A/Q-T/C/D(SEQ ID NO：150)或SN-V/A-D(155)的L2，包含氨基酸序列Y/S-N-N/K-I/V-R/K-G-L/V/I-PGF(SEQ ID NO：156)或SN-Y/S-TK-H/R(SEQ ID NO：157)或DSNEIWYC(SEQ ID NO：77)的L4；和包含氨基酸序列R/S/P/G-P/R-W/Y/E/S/V-T/Y/K/T-G-P/S/A-S/T/Y-H/K/L/Q/D-D/V/E-S/E/M/P/V(SEQ ID NO：148)的L6，根据SEQ ID NO：2。

38.实施方案36或37中任一项的特异性地结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中所述特异性地结合人LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNP-T/S/A/Q-T/C/D(SEQ ID NO：150)或SN-V/A-D(155)的L2，包含氨基酸序列Y/S-N-N/K-I/V-R/K-G-L/V/I-PGF(SEQ ID NO：156)或SN-Y/S-TK-H/R(SEQ ID NO：157)或DSNEIWYC(SEQ ID NO：77)的L4；和包含氨基酸序列R/S/P/G-P/R-W/Y/E/S/V-T/Y/K/T-G-P/S/A-S/T/Y-H/K/L/Q/D-D/V/E-S/E/M/P/V(SEQ ID NO：148)的L6，根据SEQ ID NO：2。

39.实施方案38的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L2包含在SEQ ID NO：3-5、78-80和146中的任一个中所示的氨基酸序列，L4包含在SEQ ID NO：7-9、77和81-83中的任一个中所示的氨基酸序列；且L6包含在SEQ ID NO：11-13、84-86和147中的任一个中所示的氨基酸序列，根据SEQ ID NO：2。

40.实施方案39的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L2包含氨基酸序列SNPQT(SEQ ID NO：3)，其中L4包含氨基酸序列SNKVKGVPGF(SEQ ID NO：7)；且其中L6包含氨基酸序列GPWTGASQEP(SEQ ID NO：11)。

41.实施方案39的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L2包含氨基酸序列SNPTT(SEQ ID NO：4)，其中L4包含氨基酸序列SNKIKGIPGF(SEQ ID NO：8)；且其中L6包含氨基酸序列RPSTGPSDDS(SEQ ID NO：12)。

42.实施方案39的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L2包含氨基酸序列SNVD(SEQ ID NO：5)，其中L4包含氨基酸序列SNSTKR(SEQ ID NO：9)；且其中L6包含氨基酸序列PRVKGAYLVM(SEQ ID NO：13)。

43.实施方案39的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L2包含氨基酸序列SNPTT(SEQ ID NO：4)，L4包含氨基酸序列YNNIRGLPGF(SEQ ID NO：81)；且L6包含氨基酸序列RPWTGPSHDS(SEQ ID NO：84)，根据SEQ ID NO：2。

44.实施方案39的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L2包含氨基酸序列SNPSC(SEQ ID NO：79)，L4包含氨基酸序列DSNEIWYC(SEQ ID NO：82)；且L6包含氨基酸序列SPYYGPTKVE(SEQ ID NO：85)，根据SEQ ID NO：2。

45.实施方案39的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L2包含氨基酸序列SNPAD(SEQ ID NO：80)，L4包含氨基酸序列SNYTKH(SEQ ID NO：83)；且L6包含氨基酸序列PREKGSSLVM(SEQ ID NO：86)，根据SEQ ID NO：2。

46.实施方案39的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L2包含氨基酸序列SNAD(SEQ ID NO：146)，L4包含氨基酸序列SNSTKR(SEQ ID NO：9)；和L6包含氨基酸序列RREKGSTLVV(SEQ ID NO：147)，根据SEQ ID NO：2。

47.实施方案39的非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白包含在SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列。

48.实施方案39的非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白包含在SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列。

49.实施方案39的非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白包含在SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列。

50.实施方案39的非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白包含在SEQ ID NO：87中所示的氨基酸序列。

51.实施方案39的非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白包含在SEQ ID NO：88中所示的氨基酸序列。

52.实施方案39的非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白包含在SEQ ID NO：89中所示的氨基酸序列。

53.实施方案39的非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白包含在SEQ ID NO：149中所示的氨基酸序列。

54.实施方案36-53中任一项的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中所述非天然存在的chagasin支架蛋白以500nM至1pM之间的Kd结合人LRP6。

55.实施方案36-54中任一项的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中所述特异性地结合LRP6的chagasin-来源的蛋白抑制Wnt1信号传递。

56.一种非天然存在的chagasin支架蛋白，其特异性地结合与结合人血管内皮生长因子(VEGF)的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白相同的表位，其中所述结合人VEGF的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SN-L/Y-R/F/Q-S/Y/N/D-M/D/A/S(SEQ ID NO：23)的L2，包含氨基酸序列A/N/L/S/V-G/D/S/R-P/L/T/A-S/G/Y/T-A/S/G/Q-V/R/S/K/A-P/L/E/S/N-L/S/T/N/E(SEQ ID NO：29)的L4；和包含氨基酸序列A/N/F/S-P/K-W/N/S/V-R/L/W-G-P/L-A/S/D/M/R-N/R/Y/V/F-V/W/P-I/L(SEQ ID NO：35)的L6，根据SEQ ID NO：2。

57.特异性地结合人血管内皮生长因子(VEGF)的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中所述非天然存在的chagasin支架蛋白与结合人VEGF的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白竞争结合，其中所述结合人VEGF的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SN-L/Y-R/F/Q-S/Y/N/D-M/D/A/S(SEQ ID NO：23)的L2，包含氨基酸序列A/N/L/S/V-G/D/S/R-P/L/T/A-S/G/Y/T-A/S/G/Q-V/R/S/K/A-P/L/E/S/N-L/S/T/N/E(SEQ ID NO：29)的L4；和包含氨基酸序列A/N/F/S-P/K-W/N/S/V-R/L/W-G-P/L-A/S/D/M/R-N/R/Y/V/F-V/W/P-I/L(SEQ ID NO：35)的L6，根据SEQ ID NO：2。

58.实施方案56或57的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SN-L/Y-R/F/Q-S/Y/N/D-M/D/A/S(SEQ ID NO：23)的L2，包含氨基酸序列A/N/L/S/V-G/D/S/R-P/L/T/A-S/G/Y/T-MS/G/Q-V/R/S/K/A-P/L/E/S/N-L/S/T/N/E(SEQ ID NO：29)的L4；和包含氨基酸序列A/N/F/S-P/K-W/N/S/V-R/L/W-G-P/L-A/S/D/M/R-N/R/Y/V/F-V/W/P-I/L(SEQ ID NO：35)的L6。

59.实施方案58的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L2包含在SEQ ID NO：18-22中的任一个中所示的氨基酸序列，其中L4包含在SEQ ID NO：24-28中的任一个中所示的氨基酸序列；且其中L6包含在SEQ ID NO：30-34中的任一个中所示的氨基酸序列。

60.实施方案58的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L2包含氨基酸序列SNLRSM(SEQ ID NO：18)，其中L4包含氨基酸序列AGPSAVPL(SEQ ID NO：24)且其中L6包含氨基酸序列APWRGPANVI(SEQ ID NO：30)。

61.实施方案58的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L2包含氨基酸序列SNYFYD(SEQ ID NO：19)，其中L4包含氨基酸序列NDPGSRLS(SEQ ID NO：25)且其中L6包含氨基酸序列APWLGPSRVL(SEQ ID NO：31)。

62.实施方案58的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L2包含氨基酸序列SNLQNA(SEQ ID NO：20)，其中L4包含氨基酸序列LSLYASET(SEQ ID NO：26)且其中L6包含氨基酸序列NPNWGPDYWI(SEQ ID NO：32)。

63.实施方案58的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L2包含氨基酸序列SNLQDS(SEQ ID NO：21)，其中L4包含氨基酸序列SGTTGKSN(SEQ ID NO：27)且其中L6包含氨基酸序列FKSRGLMVPL(SEQ ID NO：33)。

64.实施方案58的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L2包含氨基酸序列SNYRDS(SEQ ID NO：22)，其中L4包含氨基酸序列VRAGQANE(SEQ ID NO：28)且其中L6包含氨基酸序列SPVLGPRFWL(SEQ ID NO：34)。

65.实施方案58的非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白包含在SEQ ID NO：36中所示的氨基酸序列。

66.实施方案58的非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白包含在SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列。

67.实施方案58的非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白包含在SEQ ID NO：38中所示的氨基酸序列。

68.实施方案58的非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白包含在SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列。

69.实施方案58的非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白包含在SEQ ID NO：40中所示的氨基酸序列。

70.一种非天然存在的chagasin支架蛋白，其特异性地结合与结合人血管内皮生长因子(VEGF)的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白相同的表位，其中所述结合人VEGF的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNY-F/Y-Y/C/N/R-D/E(SEQ ID NO：49)的L2，包含氨基酸序列HYYNLGGRYT(SEQ ID NO：57)、D/N/S-D/G/V/Y-P/N/S-G/Y-S/L/M-G/H/S-L/V/A/Y-W/Y/L/S(SEQ ID NO：58)或G/H-S/V-S/Q-Y/W-W/G-G/W(SEQID NO：68)的L4，和包含氨基酸序列A/G-PW-S/Q/F/A/L/V-GPSR-Y/E/F/V/D-L(SEQ ID NO：67)的L6，根据SEQ ID NO：2。

71.特异性地结合人血管内皮生长因子(VEGF)的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中所述非天然存在的chagasin支架蛋白与结合人VEGF的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白竞争结合，其中所述结合人VEGF的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNY-F/Y-Y/C/N/R-D/E(SEQ ID NO：49)的L2，包含氨基酸序列HYYNLGGRYT(SEQ ID NO：57)、D/N/S-D/G/V/Y-P/N/S-G/Y-S/L/M-G/H/S-L/V/A/Y-W/Y/L/S(SEQ ID NO：58)或G/H-S/V-S/Q-Y/W-W/G-G/W(SEQ ID NO：68)的L4，和包含氨基酸序列A/G-PW-S/Q/F/A/L/V-GPSR-Y/E/F/V/D-L(SEQ ID NO：67)的L6，根据SEQ ID NO：2。

72.实施方案70或71的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNY-F/Y-Y/C/N/R-D/E(SEQ ID NO：49)的L2，包含氨基酸序列HYYNLGGRYT(SEQ ID NO：57)、D/N/S-D/G/V/Y-P/N/S-G/Y-S/L/M-G/H/S-L/V/A/Y-W/Y/L/S (SEQ ID NO：58)或G/H-S/V-S/Q-Y/W-W/G-G/W(SEQ ID NO：68)的L4，和包含氨基酸序列A/G-PW-S/Q/F/A/L/V-GPSR-Y/E/F/V/D-L(SEQ ID NO：67)的L6，根据SEQ ID NO：2。

73.实施方案72的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L2包含在SEQ ID NO：19和42-48中的任一个中所示的氨基酸序列，其中L4包含在SEQ ID NO：50-57中的任一个中所示的氨基酸序列；且其中L6包含在SEQ ID NO：59-66中的任一个中所示的氨基酸序列。

74.实施方案72的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L2包含氨基酸序列SNYFYD(SEQ ID NO：19)，其中L4包含氨基酸序列DDPGSGLW(SEQ ID NO：50)且其中L6包含氨基酸序列APWSGPSRYL(SEQ ID NO：59)。

75.实施方案72的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L2包含氨基酸序列SNYFYE(SEQ ID NO：42)，其中L4包含氨基酸序列NGPGLGVY(SEQ ID NO：51)且其中L6包含氨基酸序列APWQGPSREL(SEQ ID NO：60)。

76.实施方案72的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L2包含氨基酸序列SNYYYD(SEQ ID NO：48)，其中L4包含氨基酸序列NVNGSHAW(SEQ ID NO：52)且其中L6包含氨基酸序列APWSGPSRFL(SEQ ID NO：61)。

77.实施方案72的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L2包含氨基酸序列SNYFCD(SEQ ID NO：44)，其中L4包含氨基酸序列NYPGSGVL(SEQ ID NO：53)且其中L6包含氨基酸序列APWFGPSRVL(SEQ ID NO：62)。

78.实施方案72的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L2包含氨基酸序列SNYFND(SEQ ID NO：45)，其中L4包含氨基酸序列GSSYWG(SEQ ID NO：54)且其中L6包含氨基酸序列APWAGPSRVL(SEQ ID NO：63)。

79.实施方案72的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L2包含氨基酸序列SNYFYD(SEQ ID NO：19)，其中L4包含氨基酸序列SGSYMSYS(SEQ ID NO：55)且其中L6包含氨基酸序列APWLGPSRDL(SEQ ID NO：64)。

80.实施方案72的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L2包含氨基酸序列SNYFRE(SEQ ID NO：47)，其中L4包含氨基酸序列HVQWGW(SEQ ID NO：56)且其中L6包含氨基酸序列APWVGPSREL(SEQ ID NO：65)。

81.实施方案72的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L2包含氨基酸序列SNYYYD(SEQ ID NO：48)，其中L4包含氨基酸序列HYYNLGGRYT(SEQ ID NO：57)且其中L6包含氨基酸序列GPWLGPSRVL(SEQ ID NO：66)。

82.实施方案72的非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白包含在SEQ ID NO：69中所示的氨基酸序列。

83.实施方案72的非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白包含在SEQ ID NO：70中所示的氨基酸序列。

84.实施方案72的非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白包含在SEQ ID NO：71中所示的氨基酸序列。

85.实施方案72的非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白包含在SEQ ID NO：72中所示的氨基酸序列。

86.实施方案72的非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白包含在SEQ ID NO：73中所示的氨基酸序列。

87.实施方案72的非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白包含在SEQ ID NO：74中所示的氨基酸序列。

88.实施方案72的非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白包含在SEQ ID NO：75中所示的氨基酸序列。

89.实施方案72的非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白包含在SEQ ID NO：76中所示的氨基酸序列。

90.一种非天然存在的chagasin支架蛋白，其特异性地结合与结合人血管内皮生长因子(VEGF)的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白相同的表位，其中所述结合人VEGF的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNYY-Y/K-D(SEQ ID NO：114)的L2，包含氨基酸序列HY-Y/Q/S/T-NLGGRYT(SEQ ID NO：115)的L4；和包含氨基酸序列GPWLGPSRVL(SEQ ID NO：66)的L6，根据SEQ ID NO：2。

91.一种特异性地结合人血管内皮生长因子(VEGF)的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中所述非天然存在的chagasin支架蛋白与结合人VEGF的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白竞争结合，其中所述结合人VEGF的第二种非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNYY-Y/K-D(SEQ ID NO：114)的L2，包含氨基酸序列HY-Y/Q/S/T-NLGGRYT(SEQ ID NO：115)的L4；和包含氨基酸序列GPWLGPSRVL(SEQ ID NO：66)的L6，根据SEQ ID NO：2。

92.实施方案90或91的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中所述非天然存在的chagasin支架蛋白包含：包含氨基酸序列SNYY-Y/K-D(SEQ ID NO：114)的L2，包含氨基酸序列HY-Y/Q/S/T-NLGGRYT(SEQ ID NO：115)的L4；和包含氨基酸序列GPWLGPSRVL(SEQ ID NO：66)的L6，根据SEQ ID NO：2。

93.实施方案92的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L2包含在SEQ ID NO：48和110中的任一个中所示的氨基酸序列，L4包含在SEQ ID NO：57和111-113中的任一个中所示的氨基酸序列；且L6包含在SEQ ID NO：66中所示的氨基酸序列，根据SEQ ID NO：2。

94.实施方案92的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L2包含氨基酸序列SNYYKD(SEQ ID NO：110)，L4包含氨基酸序列HYYNLGGRYT(SEQ ID NO：57)；且L6包含氨基酸序列GPWLGPSRVL(SEQ ID NO：66)，根据SEQ ID NO：2。

95.实施方案92的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L2包含氨基酸序列SNYYYD(SEQ ID NO：48)，L4包含氨基酸序列HYQNLGGRYT(SEQ ID NO：111)；且L6包含氨基酸序列GPWLGPSRVL(SEQ ID NO：66)，根据SEQ ID NO：2。

96.实施方案92的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L2包含氨基酸序列SNYYYD(SEQ ID NO：48)，L4包含氨基酸序列HYSNLGGRYT(SEQ ID NO：112)；且L6包含氨基酸序列GPWLGPSRVL(SEQ ID NO：66)，根据SEQ ID NO：2。

97.实施方案92的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中L2包含氨基酸序列SNYYYD(SEQ ID NO：48)，L4包含氨基酸序列HYTNLGGRYT(SEQ ID NO：113)；且L6包含氨基酸序列GPWLGPSRVL(SEQ ID NO：66)，根据SEQ ID NO：2。

98.实施方案92的非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白包含在SEQ ID NO：116中所示的氨基酸序列。

99.实施方案92的非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白包含在SEQ ID NO：117中所示的氨基酸序列。

100.实施方案92的非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白包含在SEQ ID NO：118中所示的氨基酸序列。

101.实施方案92的非天然存在的chagasin支架蛋白，所述蛋白包含在SEQ ID NO：119中所示的氨基酸序列。

102.实施方案56-101中任一项的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中所述非天然存在的chagasin支架蛋白以500nM至1pM之间的Kd结合人VEGF。

103.实施方案77或85的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中所述非天然存在的chagasin支架蛋白形成同源二聚体。

104.与治疗剂缀合的实施方案36-55中任一项的结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白或实施方案56-103中任一项的结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白。

105.与标记缀合的实施方案36-55中任一项的结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白或实施方案56-103中任一项的结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白。

106.实施方案105的结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白或结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白，其中所述标记选自由放射性同位素、荧光染料和酶组成的组。

107.一种分离的核酸分子，其编码实施方案36-55中任一项的结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白或实施方案56-103中任一项的结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白。

108.一种表达载体，其编码实施方案107的核酸分子。

109.一种细胞，其包含实施方案108的表达载体。

110.一种生产实施方案36-55中任一项的结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白或实施方案56-103中任一项的结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白的方法，所述方法包括：培养实施方案109的细胞和从细胞培养物回收非天然存在的chagasin支架蛋白。

111.一种生产实施方案36-55中任一项的结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白或实施方案56-103中任一项的结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白的方法，所述方法包括化学合成结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白或结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白。

112.一种如下检测来自患者的样品中的LRP6蛋白的方法：使实施方案36-55、105和106中任一项的结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白与样品接触，和检测与LRP6蛋白结合的非天然存在的chagasin支架蛋白。

113.一种如下检测来自患者的样品中的VEGF蛋白的方法：使实施方案56-95、105和105中任一项的结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白与样品接触，和检测与VEGF蛋白结合的非天然存在的chagasin支架蛋白。

114.根据实施方案112或113的方法，其中所述非天然存在的chagasin支架蛋白用在免疫组织化学测定(IHC)或ELISA测定中。

115.一种组合物，其包含实施方案36-55和104中任一项的结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白和药学上可接受的载体。

116.一种组合物，其包含根据实施方案56-95和104中任一项的结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白和药学上可接受的载体。

117.一种治疗受试者中的癌症、转移性疾病、骨质疏松症、骨代谢疾病、神经元疾病、神经变性疾病、类风湿性关节炎或其它炎性疾病的方法，所述方法包括：给所述受试者施用有效量的实施方案36-55和104中任一项的结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白或实施方案115的组合物。

118.一种用于治疗癌症、转移性疾病、骨质疏松症、骨代谢疾病、神经元疾病、神经变性疾病、类风湿性关节炎或其它炎性疾病的组合物，其包含实施方案36-55和104中任一项的结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白。

119.用于治疗癌症、转移性疾病、骨质疏松症、骨代谢疾病、神经元疾病、神经变性疾病、类风湿性关节炎或其它炎性疾病的实施方案115的组合物。

120.实施方案36-55和104中任一项的结合LRP6的非天然存在的chagasin支架蛋白或实施方案115的组合物在药物制备中的用途，所述药物用于治疗癌症、转移性疾病、骨质疏松症、骨代谢疾病、神经元疾病、神经变性疾病、类风湿性关节炎或其它炎性疾病。

121.一种抑制受试者中的血管生成和/或血管通透性或漏出的方法，所述方法包括：给所述受试者施用有效量的根据实施方案56-95和116中任一项的结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白或实施方案108的组合物。

122.一种治疗受试者中以血管生成和/或血管通透性或漏出为特征的疾病的方法，所述方法包括：给所述受试者施用有效量的根据实施方案56-95和104中任一项的结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白或实施方案116的组合物。

123.实施方案122的方法，其中所述疾病是癌症、眼疾病或炎性疾病。

124.一种用于治疗受试者中以血管生成和/或血管通透性或漏出为特征的疾病的组合物，其包含根据实施方案56-95和104中任一项的结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白。

125.用于治疗受试者中以血管生成和/或血管通透性或漏出为特征的疾病的实施方案116的组合物。

126.根据实施方案56-95和104中任一项的结合VEGF的非天然存在的chagasin支架蛋白或实施方案116的组合物在药物制备中的用途，所述药物用于治疗受试者中以血管生成和/或血管通透性或漏出为特征的疾病。

Claims

1.一种多肽展示文库，其包含多个非天然存在的chagasin支架蛋白，其中所述非天然存在的chagasin支架蛋白展示在核糖体、噬菌体、病毒、细菌或酵母细胞的表面上,

所述非天然存在的chagasin支架蛋白，其特异性结合于

i)LRP6并且由SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列组成；或

ii)VEGF并且由SEQ ID NO:116，SEQ ID NO:117，SEQ ID NO:118或SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列组成。

2.权利要求1的多肽展示文库，其中所述非天然存在的chagasin支架蛋白与治疗剂和/或标记缀合。

3.权利要求2的多肽展示文库，其中所述标记选自由放射性同位素、荧光染料和酶组成的组。

4.权利要求1-3任一项的多肽展示文库，其中所述多肽文库具有约10⁸至约10¹⁴之间的序列多样性。

5.编码权利要求1-3任一项的多肽展示文库的核酸分子。

6.一种表达载体，其可操作地连接至权利要求5的核酸分子。