JP4989638B2 - 足場 - Google Patents
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Description
本発明は、ステフィンA(Stefin A)タンパク質(「シスタチンA」(Cystatin A)とも称されることもある)の分子生物学の詳細な理解に基いている。かかる理解により、野生型SteAタンパク質を、足場タンパク質として用いるために適当な形態にする修飾(modification)を可能とした。ステフィンAに基いている足場タンパク質は、従来技術の足場よりも有利な点を有している。
当該技術分野で周知であるが、「足場(scaffold)」なる用語は、標的ペプチドによりそれ自身の構造が変形(deform)されることなく、溶剤に標的ペプチドを提示できるタンパク質を意味する。
足場タンパク質は標的ペプチドを拘束することが好ましい。足場タンパク質における拘束効果(constraint effect)の存在は、標的ペプチドが足場タンパク質内にある場合に標的ペプチドに結合する実体(entity)の親和性と、ペプチドが足場タンパク質内にない場合の親和性とを比較することにより論証できる。これら2つの親和性の相違は、足場タンパク質が特定の3次元の立体構造を推定させるようにペプチドを拘束していることを示唆している。おそらく足場タンパク質は、ペプチドを拘束し、足場タンパク質の関連で存在する場合に結合親和性の増加を論証する。言い換えれば、好ましくは足場タンパク質は、結合のエントロピー消費を減少させ、遊離ペプチド結合と比較して測定される親和性を増加させる。
足場タンパク質は、以下の特性のうち1又は複数を有することが好ましい:
1)足場は、ペプチド挿入又は置換のための部位のインフォームドチョイスを可能にする公知の構造でなければならない;
2)足場は、広範囲のペプチドの折りたたみを拘束するために十分に安定でなければならない;
3)足場は、その折りたたみが様々なペプチドの挿入により影響を及ぼされることがないように十分にフレキシブルでなければならない;
4)足場は、生物学的に中性でなければならない。すなわち、表現型に貢献することができる細胞内タンパク質の相互作用が欠如していなければならない;及び
5)足場は、同様に折りたたむことができなければならず、1つのシステムにおいて得られたデータを他のシステムで行われた実験に提供できるように、原核及び真核環境の両方において同一であることが好ましい。本発明は、ペプチドアプタマー技術の要求に適応した足場を提供する。STM足場は、上記に定義した5つすべての基準を保持していることが好ましい:母体となっているステフィンAの構造は公知である;設計された足場は安定であり、その生物物理的安定を失うことなく少なくとも1のペプチドの挿入を許容する;機能的相互作用のために広範囲のペプチドを提示することはでき、すべての公知の生物学的相互作用は、設計により取り除かれたばかりでなく、STMと、細胞の細胞質内の母体SteAを明らかにアンカーしている未知の細胞質タンパク質との相互作用も消滅させた。最後にそして重要なことに、STM足場が、うまく発現されており、インビトロからのバクテリア、イースト菌及び哺乳類の細胞への転写/翻訳というシステムの範囲において、生物学的に活性のあるペプチドを提示することができるということである。実施例の項目においては、AU1タグ標的ペプチドがペプチドアプタマーの発明を表現するために用いられている。3つの独立した設定(2つのハイブリッドイースト、プロテインキナーゼとの相互作用及び核移行機構との相互作用)におけるSTMのパフォーマンスの成功は、STMが、機能的相互作用のための広範囲のペプチド配列を提示することができることを示している。
本明細書中で用いられている「標的ペプチド」なる用語は、所望のペプチドを意味する。標的ペプチドは、異種ペプチドであることが好ましい。異種ペプチドとは、通常の状況(context)からは排除され、足場タンパク質が、有し、運搬し、ディスプレイしている配列に通常見い出されない配列を有するペプチドが好ましい。ペプチドが、足場タンパク質の配列内のいずれかに起こる配列を有する場合、配列は文脈を外れるものであり、すなわち足場タンパク質ポリペプチド内の自然発生位置(アドレス)を占めていないということで、異種である。これに関連して、「位置(position)」なる用語は、三次元空間における他のアミノ酸残基との相対的な位置というよりも、アミノ酸直鎖における位置を意味する。標的ペプチドは、例えば、足場タンパク質に取り込まれたペプチドのライブラリーの構築により産生された人工でもよい。かかる実施態様において、人工ペプチドは本発明の目的において「異種」であるとみなされる。
ペプチドアプタマーは、細胞内でタンパク質機能を研究するために用いられる足場タンパク質により拘束され、提示されるペプチドである。いくつかは、タンパク質間相互作用を破壊することができ、いくつかはタンパク質機能の細胞内分析のための分子ツールキットの作出を可能にする認識モジュールの構築をすることができる。
本明細書では、ヒトステフィンA(SteA)に基いている、拘束されるペプチドの提示のため、厳格に試験され、生物学的に安定な足場の開発について述べる。SteAは、システインカテプシンのタンパク質阻害剤のカテプシンファミリーの創立メンバー(founder member)であり、パパインファミリーのリソソームのペプチダーゼである。シスタチンファミリーのステフィンサブグループは、比較的小さい(約100アミノ酸)単一ドメインのタンパク質である。公知の翻訳後修飾は受けず、ジスルフィド結合を欠いており、細胞外及び細胞内の環境の広い範囲において、同一に折りたたむことができることを示している。SteAそれ自身は、単量体で、一本鎖で、98アミノ酸の単一ドメインタンパク質である。SteAの構造は、解明されており(Martin et al. 1995 J Mol Biol. Vol246 pp331-43; Tate et atl 1995 Biochemistry vol 34 pp14637-48;Jenko et al 2003 J Mol Biol vol 326 pp875-85)、SteAのSTM足場への合理的な変異を促進するものである。シスタチンの唯一公知の生物学的活性は、カテプシン活性の阻害であり、本発明者らが設計したタンパク質の未解決の生物学的活性のための徹底的な試験を可能とした。それゆえ、天然SteAのタンパク質設計が、ペプチドアプタマー足場としての有用な変異型を産生することができることを明らかにする。SteAが、インビトロで及び細胞内の関連で、その生物学的活性を失うように設計でき、好ましい実施形態において、いわゆるSTM(ステフィンA三重変異体;Stefin A Triple Mutant)を作出することを示す。生物物理学的方法では、ペプチドが挿入されたSTM足場は、折りたたみと親タンパク質の熱安定性とを保有する。さらにSTMがヒト細胞の細胞質と細胞核の両方にアクセスすることができ、ヒトタンパク質の生物学の追求のための多目的に使用できるツールとなることを示す。設計された足場は、インビトロ及び、バクテリア細胞、イースト菌細胞、ほ乳類細胞の両方におけるペプチドの相互作用を容易に提示する。最終的に、STMが、公知の標的と相互作用を行うことが成功できるデザインされた一連のペプチドを提示することができることを示す。従来のペプチドアプタマーは、細胞に基いているアッセイにおいて生物活性を同定することの困難さによって阻まれていた。それらは、存在する様々な足場の次善のパフォーマンスによって少なくとも部分的にひき起こされていた。インビトロとインビボでタンパク質間相互作用の研究を追求する者にとって非常に有利になるであろう有用な足場を作製した。
ステフィンA「に基いている」足場は、ステフィンAに由来する配列を有する。好ましくは、ステフィンAに由来する配列は、野生型ステフィンA配列を含み、一又は複数の本明細書中に記載の修飾(変異)を含むことが好ましく、STM配列を含むことが好ましく、Leu73部位において挿入された標的ペプチドを有するSTM配列を含むことが好ましい。
好ましいステフィンA変異は以下のとおりである。
「G4W変異」なる用語は、ステフィンA又はステフィンAに由来するポリペプチドのG4部位の周辺の、好ましくは近接の、又は好ましくはその位置での変異を表現するために本明細書中で用いられる。より広範な実施態様では、G4W変異は、SteAのアミノ末端の一又は複数のアミノ末端アミノ酸残基に対する一又は複数の付加、一又は複数の挿入、一又は複数の置換を意味する。好ましくは、かかる変異は、Pro14に近位(proximal)で、好ましくはG4に近位である。かかる変異は、好ましくは、ヒトSteAのPro14の近接、又は好ましくはPro14においてである。特に、G4W変異は、STM配列により論証されるものが好ましい。G4のWとの置換が最も好ましい。
「V48D変異」なる用語は、SteAのVAG部位の周辺、好ましくは近接、又は好ましくはその位置での変異を表現するために本明細書中で用いられる。VAG部位は、QVVAG部位の48〜50残基であって、QVVAG部位はヒトSteAの46〜50残基である。
Leu73部位は、本発明による標的ペプチドの好ましい挿入部位を表す。Leu73部位は、ステフィンAタンパク質の溶剤に露呈したループを表し、溶剤にアクセスできる方法での標的ペプチドのディスプレイに対してそれゆえ影響を受けやすい(amenable)。この特質は、かかる部位の変異によって保存されることが好ましい。
本発明による足場タンパク質は、ステフィンAに基づくものであり、少なくとも一つの上述の変異を含むことが好ましい。足場タンパク質は、Leu73変異を含むことが好ましい。足場タンパク質は、Leu73部位において挿入された標的ペプチドを含むことが好ましい。
上述のとおり、本発明はマイクロアレイにおける適用を見い出すものである。マイクロアレイでの実施態様のような固相での実施態様では、足場タンパク質は、アッセイのための固相基質への会合又は吸着を促進するように設計されるのが好ましい。好ましくは、このことは金メッキへの固着(sticking)又はビオチンとの会合による。金メッキへの固着のための足場を設計するために、一又は複数のCys残基が、足場タンパク質のC又はN末端に導入される。ビオチンの結合による固定化のために足場タンパク質を設計するために、該足場には、8つのアミノ酸ビオチン結合ドメイン(「ストレプトタグ」)が導入されることが好ましい。固定化は、これらの一若しくは複数、又は別のいずれかの適当な手段によってもよい。本発明の足場タンパク質は、固定されることが好ましい。本発明の足場タンパク質は、固定化のために設計されることが好ましい。本発明による相互作用試験は、固定化足場タンパク質を用いて行われることが好ましい。
ステフィンAに基いている足場タンパク質は、インビボで用いることができるので、ペプチドを用いるよりも優れている。さらに、組換えシステムを用いることで、合成ペプチドで実施するよりも安価である。さらに、ライブラリーの構築は、同様の理由で、また核酸操作を用いて合理的にデザインすることができるという理由で、合成ライブラリーを用いるよりも安価である。このことは、ペプチド合成のための複雑な化学への依存を減少させる。
[実施例]
SteAオープンリーディングフレームをpcDNA3SteA由来のプライマーP1とP2(配列表参照)とを用いてPCRで増幅し、SteApcDNA3.1HisAを作出して、pcDNA3.1HisAのEcoRIとEcoRV部位の間でクローンした。RsrII部位が、オリゴヌクレオチドP3を用いて部位特異的突然変異誘発法によりかかるコンストラクトに導入され、RSpcDNA3.1HisAを作出し、ORFのコドン71〜73を変更して、タンパク質配列をKSLからNGPに変化させた。RSORFを、プライマーP4とP5とを用いて、及びRSpJG4−5(下記参照)をテンプレートとして増幅し、pcDNA3.1His/MycBのEcoRIとXbaI部位の間をクローンして、RSpcDNA3.1His/MycBを作出した。DSオープンリーディングフレームを、DSpJG4−5(下記参照)由来のプライマーP6とP7とを用いて、コドン4のコードをグリシンからトリプトファンに変化させて、PCR増幅した。PCR産物は、pcDNA3.1His/MycBにEcoRI−XbaIでクローンして、STMpcDNA3.1His/MycBを作出した。DSオープンリーディングフレームは、DSpJG4−5からプライマーP8とP9とを用いて、別途PCR増殖し、3回目のG4W変異、及びN末端のNLSを導入し、PCR産物は、EcoRI−XbaIでクローンして、NLS STMpcDNA3.1His/MycBを作出した。STMは、STMpJG4−5からEcoRI−EcoRIで、pGFP2-C2にサブクローンされ、STMpGFP2−C2を作出した。これは、STMオープンリーディングフレームのRsrII部位にAvaII制限酵素部位に隣接するSV40TNLS(PKKKRKV)をコードするオリゴヌクレオチドP10とP11をアニールすることにより作出したdsDNAカセットを導入することによりSTM1×NLSpGFP2−C2に変換した(converted)。2つのカセットのRsrII部位への鎖状(Concatameric)ライゲーションにより、STM2×NLSpGFP2−C2を作出した。
RSを、RSpcDNA3.1HisAから、プライマーP12とP13とを用いて、PCR増幅し、EcoRI−EcoRIで、pJG4−5(Gyuris et al, 1993)にB42活性化ドメインのフレーム内にクローンして、RSpJG4−5を作出した。かかるプラスミドにおける比較的弱い転写活性ドメインの使用が、標的タンパク質に対する高親和性を有するペプチドアプタマーの選択を可能にすることが示される。オリゴヌクレオチドP14を用いたRSの部位特異的突然変異誘発法は、V48D変異を導入し、DSpJG4−5を作出した。オリゴヌクレオチドP15は、トリプトファンをコードするコドン4を変更してSTMpJG4−5を作出した。その後STMpJG4−5は、プライマーP26を用いて、部位特異的突然変異誘発法によってRsrII部位を取り囲む配列が、TrxAの配列にマッチするように変更された。本明細書記載の以下の操作はすべて、かかる変更した形態のSTMを用いた。STMは、STMpJG4−5から、pGILDAに隣接するEcoRI部位を用いてサブクローンして、STMpGILDAを作出した。Colas(1996 Nature vol 380 pp548-50)により同定された14すべてのCDK2インタラクターのペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチドを、イーストツーハイブリッド相互作用アッセイのためにSTMpJG4−5にクローンした。Sho1pのSH3ドメインを、プライマーP24とP25とを用いて、pRS306GFP−Sho1pからPCRで増幅した。消化したPCR産物は、EcoRI/NotIで消化したpEG202にクローンされ、PEG202−Sho1−SH3を作製した。
SteAのORFを、プライマーP16とP17を用いて、SteApcDNA3.1 HisAをテンプレートとして増幅し、EcoRI−XhoIを用いてPET30a(+)にクローンして、SteApET30a(+)を作出した。前項に記載のオリゴヌクレオチドによる部位特異的突然変異誘発法は、RSpET30a(+)とSTMpET30a(+)とを作出するために用いられた。AU1エピトープタグDTYRYIをコードするAvaIIのオーバーハングに隣接した二本鎖のオリゴヌクレオチドカセットを、オリゴヌクレオチドP18とP19とをアニールすることにより作製した。dsDNA AU1挿入を、STMpET30a(+)のRsrII部位にライゲートし、STMAU1pET30a(+)を作出した。
イーストツーハイブリッドSH3スクリーニングのための縮合一本鎖ヌクレオチドP21が、P20を用いて反応を開始するためにPCRにより二本鎖とされ、AvaIIで消化したカセットを、Colas(1996 Nature vol 380 pp548-50)とGeyer,C.R. (2000 Current Protocols in Molecular Biology F.M. Ausubel et al, Eds. 24.4.1-24.4.25.)の方法にしたがって、STMpJG4−5のRsrII部位にライゲートした。
イースト菌についての手法のすべてはRose et al(Eds)(1990 Methods in Yeast Genetics: a Lab course manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.)に記載されている。ライブラリーDNAのイースト菌への形質転換は、1μgあたり約5000コロニーをもたらした。形質転換したイーストを回収し、選択培地で4時間30℃にて振盪培養した(250rpm)。細胞は、1000×gにて遠心分離によって回収し、超純水で洗浄し、25%グリセロールに再懸濁して−80℃にてアリコートごとに凍結した。アリコートあたりのコロニー形成単位数は、選択培地上で融解したアリコートを連続希釈することにより決定した。
pJG4−5−STMを有する単一のイースト菌コロニーを一晩培養した細胞を、適当な炭素源(2%v/vのグルコース又はガラクトース)を含む10mLの培地において、タンパク質抑制(repression)とタンパク質発現それぞれのために生育させた。細胞は、前述のとおり遠心分離によって回収し、超純水で洗浄し、1mLのタンパク質抽出バッファー(50mMTrisClpH7.4、2mMEDTA、100mMNaClと完全タンパク質阻害剤(complete protease inhibitors)(ロッシュ社製))に再懸濁した。400/600ミクロンガラスビーズ(シグマ社製)とともに10分間4℃にて激しくボルテックスして溶解した。ビーズと細胞残屑は、エッペンドルフ5415微量遠心管で1分間に13000rpmで遠心分離することによりペレット状にし、10μLの上清がSDS−PAGEと免疫ブロット分析に用いられた。
大腸菌BL21(DE3)細胞に形質転換したpET30a(+)SteA及びSteA変異型は、2×TYブロス内でA600=0.6まで生育し、0.4mMIPTGでタンパク質発現を2時間誘導した。細胞を集菌し、15mMのイミダゾールで補完したBugbusterタンパク質抽出試薬(Novagen社製)に再懸濁した。細胞は、VibraCellソニケーター(Sonics and Materials Inc社製)を用いて3×30秒間80Vにてソニケーションすることにより溶解した。6つのHisタグタンパク質を、Ni−NTAカラム(Qiagen社製)を用いて精製し、500mMのイミダゾールを用いてTBS300(300mMの塩化ナトリウムで補完したトリス緩衝生理食塩水)に溶出した。タンパク質はその後一晩4℃にて1×TBSに透析した。
組換えSteAと変異型を20分間75℃にて又は氷上でインキュベートし、変性タンパク質は、エッペンドルフ5415微量遠心管で、1分間13000rpmで遠心分離することによりペレット状にした。熱処理した及び処理していない溶解性タンパク質が、変性SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動して分離され、クーマシー染色により可視化された。
SteAタンパク質調製物は、1時間4oCにて100ngの組換えSteA又はとSteA変異型と20μLのSephadexタンパク質A/Gビーズ(Amersham Pharmacia社製)とを500μLの1×TBSと1mg/mLのBSAにおいてインキュベートすることで前もって除去した。ビーズは遠心分離で回収され、廃棄され、前もって除去した上清を保存した。免疫沈降のために、0.1、1又は10μgの抗AU1抗体(Babco社製)を20μLのタンパク質A/Gビーズ(Sigma社製)に、1時間4oCにて500μLの1×TBSと1mg/mLのBSAにおいて結合させた。ビーズを3×1分間1mLの1×TBSと1mg/mLのBSAで洗浄し、過剰な抗体を除去するために1.8Krpmで遠心分離によって回収した。前もって除去した上清を抗AU1ビーズに添加し、90分間4oCにてインキュベートした。ビーズは前述のとおり回収し、洗浄した。サンプルバッファー(Laemmli,1970)を添加し、サンプルを3分間沸騰させ、12%SDS−PAGE及び抗steAC5/2モノクローナル抗体(Maryland Biosciences社製)のウェスタンブロッティングにより分析した。
25μLの約2.5mg/mLの精製組換えSteA又はSteA変異型を、スーパーローズ(Superose)12ゲルろ過カラムで、アクタプライム(Akta Prime)(Pharmacia社製)を用いて0.04mL/分の速度で流出させた。SteA変異体を0.5mg/mLの濃度で負荷した溶出体積較正基準と比較した。
組換えSteA、SteA変異型又はSTM含有ペプチドのアリコートは、NiNTAクロマトグラフィーにより精製し、一晩4℃にて25mMカリウムリン酸バッファーで透析した。不溶性の粒子状物質を25μmフィルターで除去した。円偏光二色性分析は、JascoJ8−10システムを用いて0.5mm路長の150μL石英キュベットでA280=0.2にて行った。折りたたみスペクトラは、190nmから250nmで収集し、温度差によるベータシートの存在の有無は、215nmでモニターした。各SteA変異型と条件について10スペクトラが採取され、平均し、最終カーブを作成するためにバッファーのみのスペクトラが差し引かれた。
6ウェルディッシュあたり5×104細胞の密度にてカバースリップ上で生育したヒトU2OS骨肉腫(osteosarcoma)(ATCC HTB-96)細胞を、1μgのプラスミドDNAと3μLのジーンジュース(Genejuice)(Novagen社製)でトランスフェクトした。トランスフェクションした48時間後にカバースリップをPBSで3回洗浄し、1×PBSにおいて新たに調製した4%パラホルムアルデヒド(BDH社製、Poole, Dorset)で、10分間室温にて細胞を固定した。1×PBSによる3回の洗浄後、細胞は、1×PBSと0.1%Triton−X−100において10分間室温にて透過処理され(permeabilized)、ブロッキング溶剤(4.5mLのPBS、500μLのウシ胎仔血清(HyClone社製, Cramlington, Northumberland)、50mgのウシ血清アルブミン、及び0.1%Triton−X−100)内で30分間インキュベートし、その後抗ステフィンA抗体(1:100ブロッキング溶剤)内で一晩4℃にてインキュベートした。細胞をPBSで3×5分間で洗浄し、ブロッキング溶剤内で1:200の抗マウスアレクサ(Alexa)488nm二次抗体(Molecular Probes, Inc社製)に1時間インキュベートし、その後PBSで3×5分間洗浄した。カバースリップは、DAPIを伴うベクタシールド(Vector Laboratories社製)を用いてスライドの上にマウントした。pGFP2C2発現変異型については、細胞を上述の通りトランスフェクトし、24時間後細胞を、1×PBSで3回洗浄し、その後4分間室温にて、PBSで1:250に希釈したPKH26蛍光膜染色(Sigma社製)でインキュベートした。細胞をPBSで3×5分間洗浄し、1×PBSで新たに調製した4%パラホルムアルデヒドで、10分間室温にて固定した。細胞をPBSで3×5分間で洗浄し、最後にカバースリップをDAPIを含むベクタシールド(Vector Laboratories社製)を用いてスライドの上にマウントした。すべてのスライドは、その後ツァイスLSM510メタコンフォーカル(Metaconfocal)とツァイスソフトウェアを用いて共焦点顕微鏡(confocalmicroscopy)により分析された。
縮重(degenerate)オリゴヌクレオチドカセットは、Sho1pのSH3ドメインと相互作用するPbs2pのプロリンに富んだ配列(NKPLPPLPLV)の周辺で設計されたバイアスライブラリーをコードするP20とP21をアニーリングし、増幅することによって作製した。カセットの翻訳によりX(L/V/P/A)N(K/R)PLP(P/S/A)LP(L/V/P/A)Xを得た。DNAレベルでは、かかるオリゴヌクレオチドは、理論上の複雑性として98,304を有するライブラリーを生じる。カセットは、STMpJG4−5にライゲートされ、XL10ゴールドセル(Stratagene社製)内で生育した。ミディプレップ(Qiagen社製)DNAを用いてEGY48内で6×104細胞のイースト菌ライブラリーを作出し、理論上ライブラリーによりコードされる配列の60%をカバーする。かかる細胞は、上述のとおり作出したpEG202−Sho1−SH3を有するEGY42細胞と交配した。インタラクターは、−UHTL/X−Gal/Gal−Raffプレートで4日間選択し、採取して、プラスミドは、大腸菌KC8細胞内でレスキューした。プラスミドは、EGY48に再び形質転換され、相互作用交配マトリックスを用いてEGY42内のSho1pのSH3ドメインとの相互作用を確認した。
カルボキシメチル化されたパパイン(Calbiochem社製)を保有する(carry)アガロースは、EB(平衡バッファー:50mMのリン酸ナトリウム、pH6.5、0.5MNaCl、0.1%非界面活性剤スルホベタイン)で、3回洗浄した。ビーズは、30分間4℃にてEBの1mg/mLBSAでブロックし、EBでさらに3回洗浄した。1×TBSバッファーの300μgの組換えSteA又はSTM AU1をEBに希釈して500μLの総容量を作製し、90分間4℃にてビーズを回転させて培養した。ビーズはその後EBで3回洗浄し、50μLのサンプルバッファーに再懸濁し、12%SDS−PAGEゲルと抗steAモノクローナル抗体(C5/2、Maryland Biosciences社製)を用いたウェスタンブロッティングによって分析した。
組換えカテプシンB(cathepsin B)(Innozyme社製)の活性は、カテプシンB活性アッセイキット(Innozyme社製)を用いて測定した。SteAと変異型との阻害活性は、この反応に滴定することにより測定した。アッセイは、別段の指示がなければ、製造者の指示通りに行われた。同一の条件を用いて、L−アルギニン−7−アミド−4−メチルクマリン塩酸塩(Sigma社製)を基質として、ヒト肝臓カテプシンH(Calbiochem社製)に対するSteAと変異型の阻害活性を測定した。フュージョンアルファプレートリーダー(Perkin Elmer社製)を用いて蛍光発光を測定した。
図1はステフィンAの各部の一次アミノ酸構造とそのホモログを示す。図1bは、ステフィンAの三次元構造を示す。さらに図1bは、足場タンパク質の使用を促進するために変異させたステフィンAにおける3つの部位を示す。図1bには、G4W、V48DとLeu73がペプチド挿入のための部位として示されている。
ステフィンAは二量体を形成することが知られている。足場タンパク質としてのステフィンAの使用は、有利に二量体形成を無効にする。図3よりわかるように、STM足場タンパク質は、二量体形成が消滅し、モノマーであることが示されている。
当該技術では、多数の公知のCDK2結合ペプチドアプタマーがある。これらのペプチドアプタマーのいくつかは、CDK2活性を阻害することが知られている。本発明の有用性を論証するために、これらのペプチドアプタマーのうちのいくつかを、本発明によるステフィンAに基いている足場タンパク質の設定(setting)とチオレドキシンAなどの従来技術の足場タンパク質の設定とを比較した。
ここで、新規のペプチドアプタマー足場の設計についての合理的なアプローチについて述べる。理想的な足場は、インビトロとインビボの研究のために広く有用である品質を保持する必要があり、STMの好ましい例示である、新規の足場のデザインについてのかかる基準を適用するために必要な理想的な足場の品質の概要を述べる。
8つの候補タンパク質のパネルが選択された。スルフォロブス・ソルファタリクスTBP(Sulfolobussolfataricus TBP);ジスコソマ類の赤色蛍光タンパク質(Discosoma spp.)、dsRED2及びウミシイタケ(Renilla reniformis)由来のヒト化緑色蛍光タンパク質;サッカロマイセス・セルビシアエGcn4p、及びヒトステフィンA(H. sapiens StefinA)、又はタンパク質ドメイン(ロイシンジッパーとDNA結合領域を含むGcn4pコア;及びヒトのユートロフィン(utrophin)とジストロフィン(dystrophin)に由来する三重らせんコイル状コイルリピート)。これらは、発現ベクターにクローンされ、CMVプロモーターの制御下で、組織培養細胞(tissue culture cells)において発現する。これらの候補のうちヒトステフィンA(SteA)のみが、ウェスタンブロッティングで容易に検出でき、ヒト細胞内で毒性が欠如しており、すぐれた足場を設計することができるかもしれないことを示唆している。SteAは単量体で、98アミノ酸の単一ドメインタンパク質であり、翻訳後修飾を受けることは知られておらず、ジスルフィド結合が欠如している、98アミノ酸の単一ドメインタンパク質である。SteAは、98.8℃にて観察される可逆転移を伴う顕著な熱安定性を示し、折りたたみエンタルピーは490KJ/モルを示し、SteAに基いている足場の重要な特性となっている。
ヒトSteA、SteB、シスタチンC前駆体、シスタチンD前駆体、シスタチンM前駆体と、ラット、ウシ、及びニワトリのシスタチンをGCGスイートのclustalWを用いてアラインし、位相特徴(topological features)を配慮してアラインメントを手入力で調整した(図1A参照)。不十分に(poorly)保存されている領域は、タンパク質の折りたたみに貢献しそうなものではない一方、高度に保存されている領域は、生物相互作用を介するものであってよい。SteA構造(図1B参照)が、どの残基が標的プロテアーゼ結合に関与しており、どの残基がSteAの親水性コアを構成しているかを同定した。73部位のロイシン残基が、SteAとその標的プロテアーゼの間の相互作用の一部を介している。シスタチンファミリーの多様なメンバーが、かかる領域(図1A参照)に近接した挿入を有している。具体的には、挿入は、ファミリーIメンバー(ヒトステフィンAもメンバーである)においては短いか、又は欠如しているが、ニワトリシスタチンA(ファミリーIIメンバー)においては存在し、同様に例えば、シスタチンMは、SteAがかかる部位でペプチドの挿入を受け入れてもよいことを示唆している。ニワトリシスタチンAの構造は、ここに挿入されたペプチドが、うまく拘束を受けやすく、しかしながらαへリックスとβストランドを含む様々な立体構造を採用し、Leu73及びその周囲の残基がSteAの構造的折りたたみに何の役割も果たしていないことを示している。それゆえ、この部位のペプチドの導入は、足場の折りたたみを崩壊させることなく挿入された配列の拘束を可能にすべきことと、溶剤へのペプチドの提示を確実にすることとを結論づけた。RsrIIエンドヌクレアーゼ制限酵素部位が、SteAのオープンリーディングフレームの72、73、及び74残基に対応するコドンにおいて導入され、足場により拘束されるペプチドをコードするオリゴヌクレオチドのオープンリーディングフレーム(ORF)に引き続き挿入が可能となるようにした。変異体ORFによりコードされているタンパク質をRS(RsrII SteA)と称する。また、公知のタンパク質間相互作用を排除しようとした。標的プロテアーゼに対するステフィンAの結合の構造的デターミナントであるグリシン4(図1でハイライトされている)が、トリプトファンに変異させられ、バリン48をアスパラギン酸に変異させられた。後者の変化は、標的プロテアーゼとの相互作用を減少させ、足場の、ドメイン交換(domain swapping)を通じての二量体化への性向を軽減させるものである。これらすべての変異体の設計タンパク質についてSTM(ステフィンA三重変異体;配列表参照)と称する。ヒトステフィンAとアラインするモデル配列での変異タンパク質の配列(AU1ペプチド、以下参照)の説明は図1Cに示されている。
野生型ステフィンAは、大部分が細胞質性であり、新規の足場の有用性を限定しうる。細胞質内局在は、(サイズにより又は能動核外輸送により)核排除(exclusion)、又は細胞質アンカーの結果としてもたらされるものであり、タンパク質は、堅固な相互作用により細胞質内局在に物理的に限定されている。SteA配列の調査は公知の核外輸送配列のいずれのホモロジーを同定することはなかった。タンパク質相互作用の欠如をひきおこすことによる変異が、かかる局在化に影響を及ぼすかが検討された。U20S骨肉腫細胞にトランスフェクトされた場合、RSもまた、以下の表に示されるように大部分は細胞質に局在する:
タンパク質としての安定性に影響を及ぼすことなく、STMにペプチドを挿入することができるかどうかが解明されようとした。設計されたループ内に6残基「AU1」エピトープタグ(DTYRYI)を導入することでペプチドアプタマーをモデル化した。SteAの熱安定性を保有させ、加熱により増進されるドメイン交換による二量体化を消滅させようとした。組換えSteA、STM及びSTMAU1を20分間75℃にて又は氷上でインキュベートし、いずれの変性タンパク質も遠心分離で除去した。基本的に、加熱したSteAと設計されたSTMタンパク質のすべてを回収し、STMがSteAの熱安定性を保有していたことと(図2、パネルA参照)、足場の折りたたみが悪影響を与えることがない少なくとも1ペプチドを提示できるということを示唆し、STMは少なくとも部分的に二番目の基準に当てはまった。野生型SteAの二量体形態は、非加熱サンプルで観察され(図2A、左側のパネルのアスタリスク)、加熱処理をうけて顕著に増加している(図2A、右側のパネル)。予想どおり、かかる二量体形態は、STMとSTMAU1の両方において完全に消滅している(図2A参照)。
設計された足場が正しく折りたたまれたかどうかを検討するために、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて、変性した又は二量体化したSTMのいずれかが、その天然の形態において検出できるかどうかを確認した。組換えSTMAU1は、野生型ステフィンA同様の、その予想されたサイズ近くに移動した(図3、パネルA参照)。タンパク質調製物が、ゲルろ過の前に75℃に加熱された場合は、一部のステフィンAは、二量体として移動する。重要なことは、予想されたように、STM AU1が、二量体として移動しなかったということである。STMとステフィンAが類似の円偏光二色性(CD)による折りたたみパターンを有し、折りたたみポリペプチドのαへリックスとβシートの内容を決定できることも確認した。25℃及び50℃での天然のステフィンAと、25℃及び50℃での天然のSTMAU1のCDスペクトラ(図3参照)は、すべて非常に類似しており、97℃において得られて変性したSTMAU1のコントロールスペクトラとは有意に相違する。216nmにおける共通のより低い変曲点(inflexion point)(βシートに特徴的であり、SteAは、5つの逆平行βストランドを有する)、及び全般的なカーブの類似性は、STM/AU1が正しく折りたたまれている証拠を提供するものであり、STMがペプチドアプタマー足場のように行動する傾向があることを、さらに示すものである。
[プロテアーゼ効果]
野生型ステフィンは、パパインがその創立メンバーであるカテプシンファミリーのプロテアーゼ活性の阻害剤である。設計された変異体が、生物活性を欠いていることを確認するために、STMが、パパインに結合できるか、又はカテプシン活性を阻害することができるかを検討した。固定化されたパパインは、濃度依存的にSteAをアフィニティ精製(affinity purify)することはできたが、STMを精製することはできなかった(図4A参照)。さらにカテプシンB(図4B参照)とカテプシンH(図4C参照)の活性が、SteAの添加により阻害されるのに対して、高濃度であってもSTMは、かかる活性を阻害しなかった(図4参照)。
実験をヒト細胞に拡大し、核内輸送機構との相互作用について検討した。1又は2の連続したNLS配列を足場の設計されたペプチド挿入部位に挿入した(NLSがアミノ末端に配置された実施例5記載の実験とは対照的に)。STM−GFPは、細胞のいたるところに局在したのに対して(実施例5の表及び図5参照)、明確で独占的な核局在が一重及び二重NLS STM変異型の両方に観察することができた。このことは、STMが、ヒト細胞において、核内輸送機構に結合できる6又は14残基長のペプチドを提示できることの明確な証拠となる。
第一のペプチドアプタマースクリーニングにより、14ペプチド配列を同定し、従来の大腸菌チオレドキシン足場の枠内で、すべてがヒトCDK2に結合した。STMが相互作用のために任意の同一のペプチドを提示することができるかどうかについて検討が試みられた。相互作用マトリックスは、スタンダードコントロールの一式を含み、実験間での比較を可能にするものである。レポーター遺伝子活性とプレートパーフォーマンスをコントロールする天然の転写活性化因子であるアンドロゲン受容体;イースト菌交配とツーハイブリッド相互作用とをコントロールする天然の対相互作用ペアであるCDK4とサイクリンD;及び細胞内で頑強な表現型(phenotype)を産生することができないペプチドアプタマーである弱い相互作用ペアであるCDK4と10T3である。試験された14CDK12相互作用ペプチドのうち、2つのみ(Pep2とPep6、図6参照)が、STMにより提示されている場合にCDK2を認識することができた。
最後に、所望の確定した(defined)構造、本明細書においてはライブラリー形式の標的タンパク質、と結合することができる拘束されるペプチドを提示できることを示すことで、新規足場の検証を完了させようと試みた。SH3ドメインは広く研究されており、パートナータンパク質のPxxPモチーフと結合することが知られている。理論的サイズが38400の異なるペプチド配列である縮重ペプチドアプタマーライブラリーについて、Sho1p SH3ドメインに結合する配列をスクリーニングした。14の異なる縮重ペプチドが、このスクリーニングにおいて同定され、以下の表に参照されるように、そのいくつかについては複数回同定された。
イースト菌Sho1pのSH3ドメインと相互作用するSTM内のペプチドアプタマー
かかるSH3ドメインと天然で相互作用する野生型Pbs2p配列は、「NKPLPPLPLV」であり、ライブラリーペプチドは、「gpX(L/V/P/A)N(K/R)PLP(P/S/A)LP(L/V/P/A)Xgp」として設計され、後者の場合、残基は、ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドをクローンするために用いられるRsrII/AvaII部位により提供され、Xは、任意のアミノ酸である。
01: GPVPNKPLPALPVIGPGVNKPLPALPAHGPIRNKPLPSLPASGP 3
02: GPVLNKPLPSLPVMGPTPNKPLPPLPAAGP 4
03: GPDLNKPLPALPVHGP 1
04: GPYLNRPLPSLPAYGPWVNRPLPSLPLSGP 3
05: GPNLNKPLPALPVLGP 1
06: GPVVNKPLPSLPVKGPDVNKPLPSLPAVGP 1
07: GPPNVKPLPALPLMGPLLNKPLPALPLDGP 1
08: GPDPNRPLPSLPVTGPYLNKPLPALPVSGP 1
09: GPMLNKPLPSLPVGGPGLNKPLPSLPAAGP 3
10: GPILNKPLPALPLRGPDPNRPLPALPVTGP 2
11: GPFPNKPLPALPLTGPVLNRPLPPLPRNGP 3
13: GPYLNKPLPSLPLCGPSVNRPLPALPDVGP 2
17: GPEPNKPLPALPLTGPVLNRPLPPLPRNGP 2
20: GPRMNKPLPSLPLGGPAMNKPLPALPLQGP 1
ペプチドアプタマーがSH3ドメイン相互作用のマッピングに使用されるように試みた。図7に示されるように、第一のモデルとして、推定イースト菌浸透圧センサー(osmo‐sensor)Sho1p(黄色)のSH3ドメインが選択された。例えば、SH3ドメインに結合するペプチドアプタマーは、イースト菌細胞内のシグナル伝達を干渉すると期待してもよい。例えば、イースト菌内のSH3ドメインとのペプチドアプタマー(赤)の相互作用は、それ自身MAPKKKSte11からMAPKHog1への特異性足場指向シグナルとしての役目を果たすMAPキナーゼキナーゼPbs2Pとの会合を阻害してもよい。
Hog1経路を通じたシグナルは、1MNaCl又は1Mソルビトールを含む高浸透圧培地でイースト菌細胞が生育することが要求される。PepA、32、34、124及び201は、Sho1pのSH3ドメインに結合するようなペプチドアプタマーのためのイーストツーハイブリッドスクリーニングからすべて単離された。これらのうちPepAのみが、その発現がガラクトースで補完された培地で誘導されている場合、イースト菌細胞に対する浸透圧感受性を付与することができる。グルコースで生育した細胞は、ペプチドアプタマーを発現せず、浸透圧耐性である(図7B参照のこと)。
PepAがイースト菌の浸透圧感受性を付与されるための最も可能性のあるメカニズムは、Hog1へのPbs2経由のSho1pからのシグナルを遮断することによるものである。このメカニズムが生じるか否かを検討するにあたり、抗ホスホチロシン抗体が、Hog1p活性をモニターするために用いられた。細胞が高浸透圧培地で生育している場合、Hog1pはリン酸化されている(コントロール、−及び+ガラクトース)。浸透圧感受性を付与しないペプチドアプタマーの発現は、Hog1のリン酸化(Pep32)に影響を及ぼさないが、一方でガラクトースによるPepAの誘導は、細胞内でHog1のリン酸化と活性化をほとんど完全に消滅させ、ハイパー浸透圧に対する感受性を説明するものとなっている。図7Cを参照のこと。
PepAは、Las17(Sho1との相互作用に関係するアクチン細胞骨格の形成体(organiser))と、MAPKKと足場タンパク質であって、Hoglpをリン酸化、活性化するPbs2との両方と顕著な同一性を示す。原則として、それゆえ示されているモデルスキーマのいずれかのアーム経由のシグナルを妨害することができる。しかしながら、Sho1SH3を用いるGSTプルダウンは、PepAが存在していない場合に、Sho1とHog1の間の相互作用を示し、PepAがSho1とPbs2との間の相互作用を実際に遮断することを示している。図7Dを参照のこと。
本発明の足場の機能の追加試験として、本発明による足場がプロテインキナーゼによりリン酸化されることができる形態で、ペプチドを溶剤に提示できるかどうかを検討が行われた。本実施例において、足場はSTMである。
本実施例は、人工シグナルモジュールとしての本発明によるペプチドアプタマーの使用を示すものである。
ゲノム規模の遺伝子発現マイクロアレイは、その変化した発現が疾病と関連があるが、その遺伝子産物が候補薬剤標的ではない遺伝子を同定する。RNAiにより、それらのサブセットの検証を可能にできる一方、「ノックアウト」技術により、特異的タンパク質間相互作用の貢献を見渡すものである。細胞内のタンパク質間相互作用と直接競争できるペプチドアプタマーなどの設計されたタンパク質の入手しやすさは、薬剤標的検証を一段と促進するものであろう。本明細書では、どのようにペプチドアプタマーを細胞内のタンパク質間相互作用の精査に用いられることができることを示すため、堅固で高度な独自技術について論ずる。非必須な経路における必須タンパク質についてのこれまで確認されていなかった役割が明らかにされ、かかる技術が薬剤標的検証の取組みにおいて、RNAiを有用に補完してもよいことを示唆するものである。
ヒトゲノム配列決定と、その後のゲノム規模のスクリーニング(RNAi又はマイクロアレイのいずれかを用いる)の使用は、多様な疾病との多数の遺伝子産物の関連を導いてきた。大きな課題は、かかる遺伝子産物のいずれが、有効な薬剤標的であるかを決定することである。細胞内で機能するタンパク質の場合は、病的な状態と健全な状態との両方におけるタンパク質の行動を理解することが必要である。この問題に対する一つの解決策は、細胞状況における各タンパク質の研究に適合できる分子ツールキットを考案することであろう。ペプチドアプタマーを特有な認識ドメインとして用いる、設計されたタンパク質のツールキットを作出できることを提案する。ペプチドアプタマーは、所望のタンパク質に結合するためのイーストツーハイブリッドスクリーニングにおいて選択された。一定の割合のバインダーは、タンパク質相互作用のためにインビボで競合してもよく、量的表現型(measurable phenotypes)を導くものである。表現型が疾病表現型の裏返しである場合、ペプチドアプタマーは、共結晶構造から構造に基いている薬剤送達、又は薬剤置換スクリーニングのいずれかにより、薬剤標的を検証し、薬剤同定の根拠を提供してきた。さらに、各ペプチドアプタマーは、設計されたタンパク質の認識ドメインとなりうるものであり、このことは、細胞内で発現している場合ペプチドアプタマーそれ自身が表現型を導かない場合に、最も有用なものとなろう。各認識ドメインは、GFP、又はプロテアーゼ若しくはユビキチンリガーゼ等の酵素の触媒部分などのエフェクター部分のいくつかのうち一つと遺伝子的に融合するであろう。後者は、設計されたF−ボックスタンパク質で論証されてきたように、標的タンパク質全体を除去してもよいが、GFPへの融合は、FRETによる細胞内の特異的タンパク質相互作用をモニターするための潜在性が追加されると共に、タンパク質の細胞内の取引(trafficking)をモニターすることを可能にする。細胞生物学の域を超えて、GSTへのペプチドアプタマーの融合は、任意の与えられたタンパク質の生物化学的又は構造的分析による細胞生物学を用いて獲得される情報の統合を可能とするものとなろう。ペプチドアプタマーは、認識部分の有用なソースを表すものであるが、代替テクノロジー(ブドウ球菌ヌクレアーゼ又はGFP、あるいはいわゆるアフィボディ、モノボディ(monobodies)、アンチカリン、アンキリン反復タンパク質に基いているもの)が有用であることも証明できる。
イースト膜貫通タンパク質Sho1は、MAPKKPbs2とのSH3ドメイン介在相互作用を通じた浸透圧ストレスシグナル伝達の制御において重要であることが示されてきた。Sho1−Sho3ドメインに結合するペプチドアプタマーは、浸透圧ストレス反応を阻害するかもしれないことを予測された。遊離(free)ペプチドを用いたインビトロでの研究では、SH3リガンドは、SH3ドメインの範囲への結合が不規則な(promiscuous)左巻きのポリプロリンタイプIIへリックスを含むことを示してきた。かかる研究は、それゆえ高い特異性のあるペプチドを提示する新規にデザインされた足場(本実施例ではSTM)の能力を試験するためにデザインされたものであった。
Sho1と相互作用するペプチドアプタマーが、浸透圧感受性機構(Posas F, Saito H. 1997. Osmotic activation of the HOG MAPK pathway via Ste11p MAPKKK: 足場 role of Pbs2p MAPKK.Science. 276: 1702-5)のSho1ブランチに依存しているイースト菌細胞内の浸透圧耐性をブロックすることができるかについて試験がされた。28のSHO1−SH3バインダーのうち1つのみが、AptAと指摘されたペプチドであり、細胞が1MのNaClを含む培地で平板培養された場合に浸透圧感受性をひきおこした(図9、パネルA参照)。AptAは、高浸透圧培地でHog1のチロシンリン酸化の活性化を妨害したが、Apt32などのコントロールペプチドアプタマーはしなかった(図9、パネルB参照)。Apt32を含む他のペプチドアプタマーも同様に、浸透圧耐性を阻害しない(図9、パネルA参照)。かかるペプチドアプタマーはどれも通常の浸透圧の培地でのイースト菌の生育には影響を与えなかった。かかる観察により、ペプチドアプタマーが、真核細胞におけるタンパク質相互作用を阻害することができるということを確認するものである。
特異性は、インビボにおいて維持されているようにみえるが、インビトロにおいては、複数のSH3ドメインと多数のPxxPリガンドが交差反応しているので、Sho1SH3レベルでAptAが作用していることを示すことが重要であった。
例えば、イースト菌プロテオームの28のSH3ドメインのうち、Pbs2は、Sho1にのみ相互作用する。さらに、Pbs2のコアPLPPLP配列がPLPALP又はPLPSLPに変化した場合、不規則性が増加することが観察された。AptAはコアPLPSLPを含んでいるので、かかるデータは、AptAが、イースト菌内の複数のSH3ドメインと結合しているかもしれないことを示すものであった。AptAとイースト菌の28すべてのSH3ドメインとの間の系統的なY2H相互作用マトリックスを行った。プロテオームのSH3マトリックスによると、AptAは、Sho1SH3に対して特異性が高く、一方最初のスクリーニングで単離された他のペプチドアプタマーは、幾分かの交差反応性を示した(図10参照)。例えば、ポジション−5にロイシンを含むAptAとPep05の両方が、Sho1SH3に対する特異性が高い。対照的に、ポジション−5にロイシンの代わりにプロリンを有するPep32は、他の2つのイースト菌SH3ドメイン(Lsb1とCdc25)に弱い親和性を示す。Sho1SH3ドメインに対するAptAの特異性の高さは、AptA依存性浸透圧感受性表現型が、Sho1依存性及び特異的であることを示唆するものである。
AptAとApt32は、可変ループ内でポジション−6、−5、及び+4の3残基のみ相違する(表2参照)。コアプロリンに富んだモチーフの外側の残基は、プロリンに富んだペプチドのSH3ドメインへ結合する特異性及び/又は強度を決定する重要な役割を果たしていることが示されてきた。Apt32の3つの特有な残基がAptAの対応する残基に変異した(表3参照)。6つの可能な変異の組合せの分析により、AptA内のポジション−5のロイシン残基が、浸透圧感受性アッセイにおいて、阻害活性の唯一の決定因子であることが明らかになった。Apt32内のポジション−5がロイシンに置換された場合、ペプチドアプタマーは、阻害性になる(表3、変異番号2参照)。Apt32の他の残基へのかかるロイシン付加は、AptAによるSho1シグナル伝達の阻害を妨害するものではなく、ポジション−6と+4の残基は、活性にそれほど重要ではないことを示唆した。Schreiberとその同僚は、PPII/SH3ドメイン相互作用の親和性と特異性を決定する側鎖残基の役割の構造的基礎をすでに確立してきた。データによると、−6における残基の同一性が他のポリプロリンIIへリックス/SH3ドメイン相互作用における特異性に貢献している一方、Pbs2/Sho1SH3相互作用の場合は、鍵となる役割を果たしているのはおそらくポジション−5であることを示唆している。このことは、Feng et al(Feng S, Kasahara C, RicklesRJ, Schreiber SL. 1995. Specific interactions outside the proline-rich core of two classes of Src homology 3 ligands. Proc Natl Acad SciU S A. 92: 12408-15)により研究された局面(situation)とは逆であり、高度な配列保存性にもかかわらず、PPII/SH3ドメイン相互作用の機構の詳細は相違してもよいことを示すものである。このことは、SrcのSH3ドメインがポジション−7及び−6の特異的残基を選択し、一方でFynのSH3は、ポジション−6及び−5を選択するという観察と一致する。実際、Sho1SH3は、ポジション−5及び−6において以下のジペプチドを容認したので、ポジション−6では選択を観察しなかった:RL(AptA);LP(Pep32);SV(Apt34);VE(Apt40);PA(Apt94);RG(Apt124);DL(Apt03)及びNL(Apt05)、の3ペプチド(AptA、Apt03及びApt05)において同じポジションのロイシン残基と、別の2ペプチド(AptAとApt124)においてアルギニン残基の出現が保存されているだけである。
細胞シグナル伝達経路は、シグナル伝達構成要素を配線又は接続するドメインモジュールによりリレーされる。例えば、Sho1により感知される浸透圧ストレスシグナルは、PxxPモチーフを経由したSH3ドメインへのPbs2の動員(recruitment)によりリレーされる。PBS2は、MAPKKKSte11からSho1へ動員する足場としてと、及びHog1MAPKを活性化するMAPKKというシグナルの伝達物質(transmitter)としての両方に供する。Pbs2が足場として機能する証拠は、Pbs2AxxAを作出するPbs2のPxxPモチーフの変異が、細胞を高浸透圧培地で、接合MAPK経路(Ste11と浸透圧感受性経路を共有する)を活性化するように導くということである。モデルは、Ste11の活性化が、浸透圧ストレスによるものであろうが、又は接合フェロモンによるものであろうが、HOG又は接合経路を活性する潜在性を有し、シグナル伝達特異性は、適当な足場であるHOG経路におけるPbs2及び接合経路におけるSte5により付与される。AptAの効果についての一番簡単な説明は、Pbs2からSho1への動員について競合し、Pbs2を含むPxxPの結合と活性化を妨害するということであった。もしこれが本当であったならば、そして簡単な足場モデルが正しいならば、1)AptAを発現している細胞は、浸透圧ショックに反応して接合カスケードを活性してもよい、及び2)Ste11とPbs2がお互いに恒常的に結合しているのであれば、Ste11は直接Sho1を拘束することによりSho1へのPbs2の動員を迂回することが可能であってもよい。しかしながら、AptAを発現する細胞内で、接合MAPキナーゼであるFus3又はKss1のいずれの活性化を論証することはできなかった。さらに、Ste11へのAptAの融合を用いてSho1に対してSte11を標的にすることは、AxxA変異体pbs2を発現している細胞内でHog1活性化を回復することができなかった:pbsAxxAを発現しているΔssk2/Δssk2/Δpbs22イースト菌とSte11−AptA融合は、高浸透圧プレートでは生存できず(図14A参照)、Hog1は、これらの細胞内では活性化されなかった(図14C参照)。このことは、Ste11−AptAキメラは、NaCl処理により活性化されることができないか、かかる融合がPbs2MAPKKとの機能的な複合体を形成することができないかのいずれかであることを示すものである。経路におけるLas17についての推測により明らかとなった別の説明としては、Ste11−AptA融合は、Pbs2/Sho1複合体を回復するが、Las17との相互作用と置換できるものではないということである。次に、AptAがSho1から、pbs2AxxAへのSho1結合については不備のあるシグナル伝達を回復することができたかどうかが検討された。実際、AptAのPbs2の二重AxxA変異体への融合は、シグナル伝達を回復させ、イースト菌細胞は、浸透圧ストレスから救出された(図11参照)。この結果は、AptAがAxxA変異体Pbs2とSho1−SH3との間の相互作用を解することができることと一致する。逆に、AptAにAxxA変異を導入することは、Sho1−SH3とのその相互作用を無効にしたものであり(図10A*参照)、AptAがこの実験においてSho1 SH3ドメインに結合することを強く示唆するものである。これらのデータにより、Las17により果たされる任意の役割が、AptA−pbs2AxxA融合がシグナル変換経路の細胞質セクションを保存するのに十分であるので、Pbs2/Sho1相互作用の形成の上流、概して原形質膜においてでなければならないことをさらに論証する。
ペプチドアプタマーは、健康であるか病気であるかといった、細胞間の状況においてタンパク質を研究するためのツールとしての適用ができる。かかる可能性を満たすために、堅固で、生物学的に中性な足場を必要とし、標的タンパク質への効果によりひき起こされるペプチドアプタマーを発現する細胞内で観察される任意の表現型を疑いの余地なく論証することができる能力を必要とする。かかる研究のゴールは、細胞内のタンパク質機能との相互作用をする特異性の高いペプチドアプタマーの提示のために、好ましい足場であるSTMの有用性を論証することであった。まず、SH3ドメインに結合するファージディスプレイにより同定されていたポリプロリンIIへリックスペプチドを含むペプチドアプタマーの機能的ライブラリーを作出することができるかどうかが検討された。密接な関係のあるSH3ドメイン間で区別できる必要な特異性をペプチドに提示できる足場の能力を検証するため、および完全長タンパク質の関連においてSH3ドメイン/PxxP相互作用の特異性と親和性の決定因子を追求することができるようにデザインした。二番目に、どの程度ペプチドアプタマーが細胞内の状況におけるタンパク質の生物学を追求することが可能となるかが検討された。
SH3ドメインの従前の研究で、左巻きのタイプIIポリプロリンへリックスを形成することができるPxxPモチーフ(xは任意の残基)を含むリガンドペプチドが認識されることが示された。かかる研究は、10〜12残基長の遊離ペプチドのライブラリーのファージディスプレイを典型的に使用したものであるが、結合特異性と結合親和性を決定するために重要なリガンドコンセンサスモチーフと残基の両方を定義するものである。Yu et al(Yu H, Chen JK, Feng S, Dalgarno DC, Brauer AW, Schreiber SL. 1994. Structural basis for the binding of proline-rich peptides to SH3 domains. Cell. 76: 933-45)のナンバリングシステムを用いて、PxxPモチーフの最初のプロリンに番号「0」を与え、先行する残基を「−1」とし、次に来る残基を「+1」とすると、ポジション−2のアルギニン又はリジン残基が重要であったことと、親和性と特異性を決定するためにはポジション−5の残基の同定が重要であることとが示された。構造分析により、ポジション−1と0の残基は、SH3ドメインの1つのポケットに適合し、+2と+3の残基は、別のポケットに適合することが示された。3番目のポケットは、SH3ドメインの間によく保存されておらず、結合の特異性と親和性を決定しやすく、−6、−5、−4、及び−3の残基と接触する。好ましい足場タンパク質STMが提示し、理論上拘束しているプロリンがアンカーしているペプチドの12残基長のライブラリーを用いて、拘束ペプチドに対する強い淘汰圧が見い出された。バインダーは、成熟する前に切断された足場タンパク質のC末端において存在するペプチド、又は、オリジナルの12merよりも少なく拘束していると合理的に推測することができる24残基長よりも大きいペプチドのいずれかを含む。ペプチドの両方のクラスがもたらされることはめったにない。多量体(multimeric)ペプチドは、宿主プラスミドへのライゲーション前に、コードしているオリゴヌクレオチドのセルフライゲーションからもたらされる。切断されたペプチドは、コードしているオリゴヌクレオチドにおけるストップコドンの存在、又はペプチドライブラリーをコードするための用いられるオリゴヌクレオチドの合成の誤りのいずれかの結果である。ライブラリーのオリゴヌクレオチドは、「NNK」コドンを用いて構築され、Nは、任意のヌクレオチドであり、Kは、G又はTである。このライブラリーは、30のコードしているコドンを用いてすべての可能なアミノ酸をコードする(F、I、M、Y、H、Q、N、K、D、E及びCについては各1、V、S、P、T、Aについては各2、並びにLとRについては各3)、そしてストップコドンは、一つのみである。言い換えれば、任意に与えられた部位のフレーム内のストップコドンの見込みは、1/31であり、ペプチドのコード領域の末端のストップコドンを得る確率は、0.0312= 5×10−8である。データは、足場がポリプロリンIIへリックスの形成を妨害するか、又は、側鎖残基のすべてを標的SH3ドメインと適当に接触させることを可能にする拡張した立体配置のかかるヘリックスにより採用を妨害するための12merペプチドを立体配置的に拘束することができる場合に、一致する。このことは、なぜApt32などのペプチドアプタマーがSho1SH3に結合できるが、結合を阻害するほど十分に強いものではないのかを説明するものとなろう。それゆえデータによって、プロリンに富んだリガンドのSH3ドメインとの相互作用は、リガンドが比較的非拘束であることを必要とするという仮説についての強い支持が提供される。
細胞内シグナル伝達(Cellular signaling)は、タンパク質相互作用によって制御されている。各シグナル伝達経路の忠実性を維持するために、シグナル伝達タンパク質間の相互作用は、高度に制御される必要がある。各線形経路の「コアメンバー」に加え、足場タンパク質又は細胞間トランスポータータンパク質などの他の多数のタンパク質がシグナル変換の特異性を確実するために、空間的にそして動的に関連するものである。それゆえ、タンパク質相互作用ネットワークを詳細に精査することは、どの様に細胞のふるまいが制御されているかを理解することの助けになるであろう。
発現マイクロアレイは、疾病において差動的に発現される多数の遺伝子産物を明らかにしてきた。疾病の設定において、ユニークに発現し、また時には単に過剰発現するタンパク質は、潜在的な治療標的である。RNAiは、現時点で、かかる候補薬剤標的の検証のために選択される技術である。しかしながら、タンパク質は、細胞内の多重相互作用のセットに参加するものである。実際このことは、RNAiなどの「ノックダウン」技術が複数の経路に影響を与えるかもしれず、誤解を招くような結果を導く可能性を提起する。このことは、多数の有効な治療標的が、RNAi表現型が予測とマッチしない場合に、誤って退けられるかもしれないことを意味する。従来技術において明らかに欠如していたものは、生細胞との関連でタンパク質のパートナーシップを精査する能力である。
(Sho1 SH3ドメインスクリーニング)
本スクリーニングは、公知である(Woodman R, YehJT-H, Laurenson S, Ko Ferrigno P. 2005. Design and validation of a neutral protein 足場 for the presentation of peptide aptamers J Mol Biol. 352: 1118-33)。手短にいえば、Pbs2に基いているミニライブラリーを、縮重オリゴヌクレオチド「NNK SYG AAT AAG CCC CTA CCC BCT CTA CCC SYG NNK」(N=A、T、C又はG;K=G又はT;S=C又はG;Y=C又はT;B=C、G又はT)をRsrIIで消化したpJG4.5STMベクターにライゲートして構築した。部分的に任意抽出したかかるオリゴヌクレオチドカセットは、ペプチド配列X(L/V/P/A)N(K/R)PLP(P/s/A)LP(L/V/P/A)Xをコードし、Xは、任意のアミノ酸である。タンパク質レベルでの理論上のライブラリーの複雑性は、38400である。ライブラリースクリーニングとヒットの確認は、Woodman et al(同上)に記載がある。
イースト菌細胞を、多様なSho1−SH3ペプチドアプタマー構築物で形質転換した。スポットアッセイとして、形質転換体ごとに10000細胞が、1MのNaClが添加又は無添加の、グルコース又はガラクトース/ラフィノーズにより補完されている選択プレートにスポットされた。イースト菌細胞は、1Mの塩化ナトリウムが添加又は無添加のプレートに直接播種もされた。細胞の生育は、3〜5日後に記録された。
イースト菌細胞は、1×SDSサンプルバッファーで溶解し、80μLのガラスビーズとともに1分間ボルテックスした。サンプルは、95℃の加熱ブロック内で5分間インキュベートし、その後氷上で急冷した。サンプルは、簡単に遠心器で沈降させ、上清を無菌の1.5mL遠心分離管に集め、4℃にて保存した。ウェスタンブロットを標準プロトコールにより行い、ウサギポリクローナルパン(pan)Hog1抗体Y−118(Santa Cruz社製)、又はNEB抗リン(anti-phospho)p38(クローン28B10)をプローブとして行わった。リン酸化を検出するためには、活性Hog1を用いた。
27推定イースト菌SH3ドメインは、イースト菌ゲノムDNAからPCRで増幅し、イースト菌pEG202ベクターのEcoRIとXhoI部位にクローンした。PCRのためのオリゴヌクレオチドプライマー配列は、要請に応じてPKFより入手できる。各SH3ドメインは、NCBIデータベース(www.ncbi.nlm.nih.gov)内で与えられている定義により選択される。
STM三重変異体アミノ酸配列
MIPWGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVDAGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPPGQNEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF
SEQ ID NO:2
野生型ステフィンA配列(ヒトCysA)
MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVVAGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLPGQNEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF
SEQ ID NO: 3
STM up to Leu73, without Leu73/NGP
MIPWGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVDAGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVF
SEQ ID NO: 4
STM from Leu73 to end, without Leu 73/NGP
PGQNEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF
SEQ ID NO: 4
標的ペプチドAU1エピトープを含むSTM
MIPWGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVDAGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPDTYRYIGPPGQNEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF
PCR:
P1 EcoRI 5’-ccggaattcccatgatacctggaggc-3’
P2 EcoRV 5’-atctcaaaagcccgtcagctcg-3’
P4 EcoRI 5’-ggaattccaccatgatacctggaggcttatct-3’
P5 XbaI 5’-gctctagagcaaagcccgtcagctcgtcat-3’
P6 EcoRI 5’-ggaattccaccatgataccttggcttatctgaggcca-
aacc-3’
P7 XbaI 5’-gctctagagcaaagcccgtcagctcgtcat-3’
P8 EcoRI 5’-ggaattcaccatgccaaaaaagaagaaaggtagata-
taccttggggc-3’
P9 XbaI 5’-gctctagagcaaagcccgtcagctcgtcat-3’
P12 EcoRI 5’-ccggaattcatgatacctggaggcttatc-3’
P13 EcoRI 5’-ccggaattcctaaaagcccgtcagctcgtc-3’
P16 EcoRI 5’-ccggaattcatgatacctggaggcttatc-3’
P17 XhoI 5’-ccgctcgagctaaaagcccgtcagctcg-3’
部位特異的突然変異誘発法:
P3 KSL/NGP 5’-cttgaaagtattcaacggaccgcccggacaaaatga-
gg-3’
P14 V48D 5’-cagtataaaactcaagttgatgctggaacaaattac-3’
P15 G4W 5’-ggcctcagataagccccaaggtatcat-3’
挿入:
P10 NLS For 5’-gactgactggtccgccaaagaagaagagaaaggtag-
gtcctcagtcagtcag-3’
P11 NLS Rev 5’-ctgactgactgaggacc-3’
P18 AU1 Forward 5’-gtccggacacctaccgctacatcg-3’
P19 AU1 Reverse 5’-gtccgatgtagcggtaggtgtccg-3’
SH3ドメインスクリーニング;
P20 Amplifier; 5’-ctgactgactgaggacc-3’
P21 ライブラリー挿入 5’-gactgactggtccgnnksygaatargcccctacccbc-
tctacccsygnnkggtcctcagtcagtcag-3’ (Nは、任意のヌクレオチドK = G or T, R = A or G, S = C or G, Y = C or T and B = C, G or T)
P22 SH3 bait for 5’ CGAATTCCCGGGTGATATCGGTGATGATAATTTCATT-
TAC-3’
P23 SH3 bait rev 5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTAACGATGCATTTCTTCTGG-
ACCATC-3’
P24 Unifier 5’-gaaagtattcaacggtccgcccggacaaaatg-3’.
ペプチドA:
RLNKPLPSLPV
Claims (14)
- 足場タンパク質としてのステフィンAの使用であって、該ステフィンAが、ヒトステフィンAであり、前記ステフィンAの71〜73残基のアミノ酸部位において異種ペプチド挿入を含むことを特徴とする、前記ステフィンAの使用。
- 足場タンパク質が、V48D変異を含むことを特徴とする請求項1記載の使用。
- 足場タンパク質が、G4W変異を含むことを特徴とする請求項1又は2記載の使用。
- 足場タンパク質が、V48D及びG4W変異をさらに含むことを特徴とする請求項1記載の使用。
- 足場タンパク質が、配列番号3に示されるアミノ酸配列と配列番号4に示されるアミノ酸配列とを含むことを特徴とする請求項1〜4いずれか記載の使用。
- 足場タンパク質が、配列番号1に示される配列を含むことを特徴とする請求項1〜5いずれか記載の使用。
- 足場タンパク質としてのステフィンAポリペプチドであって、該ステフィンAポリペプチドが、ヒトステフィンAポリペプチドであり、前記ステフィンAポリペプチドの71〜73残基のアミノ酸部位において異種ペプチド挿入を含むことを特徴とする、前記ステフィンAポリペプチド。
- ステフィンAポリペプチドが、配列番号3に示されるアミノ酸配列と配列番号4に示される配列とを含むことを特徴とする、請求項7記載のステフィンAポリペプチド。
- ステフィンAポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項7又は8記載のステフィンAポリペプチド。
- 異種ペプチドが、20以下のアミノ酸を含むことを特徴とする請求項7〜9いずれか記載のステフィンAポリペプチド。
- 足場タンパク質としてのステフィンAポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸であって、該ステフィンAポリペプチドが、ヒトステフィンAポリペプチドであり、前記ステフィンAポリペプチドの71〜73残基のアミノ酸部位において異種ペプチド挿入を含むことを特徴とする、前記単離核酸。
- 単離核酸が、配列番号3のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と配列番号4のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列とを含むことを特徴とする、請求項11記載の単離核酸。
- 配列番号1のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸であって、ヌクレオチド配列がRsrII制限酵素部位を含むことを特徴とする、請求項11又は12記載の単離核酸。
- (i)ヒトステフィンAの71〜73残基のアミノ酸部位において標的ペプチド挿入を含む、ステフィンA足場タンパク質を提供するステップ;
(ii)前記ステフィンA足場タンパク質を所望の構造に接触させるステップ;及び
(iii)前記ステフィンA足場タンパク質と前記所望の構造との間の会合をモニターするステップ;
を含む、前記所望の構造に結合することのできる標的ペプチドを同定する方法であって、前記所望の構造と前記足場タンパク質との会合により、前記標的ペプチドを前記構造に結合することができる候補標的ペプチドとして同定する方法。
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