JP2004530411A - 抗菌化合物の同定方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、真正細菌βタンパク質結合特性を有するペプチドおよび上記ペプチドおよび他のタンパク質が相互作用するβタンパク質の表面に関するものである。本発明は、βタンパク質およびそれと相互作用するタンパク質間における相互作用を変調する化合物を同定するためのインビトロおよびインビボ検定法、およびこの相互作用を変調することによる真正細菌外寄生の制御方法を提供する。開示されているペプチドは、前述の相互作用を変調する化合物を設計または選択するためのテンプレートとして使用され得る。

Description

【０００１】
（技術分野）
本明細書に記載されている本発明は、概して細菌複製に関するものである。さらに具体的には、本発明は、細菌複製阻害剤として有用な化合物に関するものである。特に、本発明は、細菌複製阻害剤として有用な化合物の同定方法、その方法で同定された化合物、並びにヒト、動物および植物における病気の処置または予防における抗菌剤としての化合物の使用に関するものである。
【０００２】
（背景技術）
ヒトの細菌感染に起因する病気は、抗菌剤の有効性にもかかわらず、苦しみおよび経済的損失の誘因であり続けている。同様に動物の細菌性疾患も、罹患動物に苦しみをもたらし、病気の動物が農業的価値を有する場合には経済的損失をまねく。数百の異なる抗菌性化合物が知られているが、既存のものに代わる、さらに有効な化合物が要望され続けている。これは、既存の抗菌剤に耐性を示す細菌株が出現したため、特に言えることである。新規抗菌剤の同定に加えて、作用モードが既知種類の化合物とは異なる化合物の種類を同定するのが望ましい。新たな抗菌活性モードを有する化合物の種類を同定することにより、細菌性疾患に対して使用され得る薬剤の選択肢が大きく拡大される。
【０００３】
各生命形態は、増殖するためにはその遺伝物質をコピーしなければならない。したがって、抗菌剤についての潜在的に有用な作用モードは、標的細菌の遺伝物質のコピーまたは複製を妨げることによるものである。細菌の遺伝物質（ＤＮＡ）の複製については、理に適った論証により充分に理解されており、多様なタンパク質が関与していることが知られている。Ａ．Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．による概説、ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版、１６５−１９４頁、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，ニューヨーク（１９９２）参照。複製中、これらのタンパク質のほとんどは「レプリソーム」と称される複雑な多機能機構へ組織される。
【０００４】
真正細菌の場合、レプリソームの中心酵素は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素である。エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ））では、この酵素は１０個の異なるサブユニットを含むが、ほとんどの他の細菌では７個のサブユニットしか同定されていない。エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、およびほとんどの他の真正細菌において、ＤｎａＥオーソログ（αサブユニット）は、主たる複製ポリメラーゼであるが、多くのグラム陽性菌では、区別されるが関連のある酵素、ＰｏｌＣが、複製機構においてＤｎａＥに代わる主たる複製酵素であると提案されている。レプリソームのプロセシビティーは、ＤＮＡ周囲にクランプを形成する、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのβサブユニットにより付与されている。βサブユニットは、δおよびδ’の単一サブユニットおよびτ／γの４個のサブユニットを含むクランプローダー複合体によりＤＮＡへホモ二量体として載せられている。現在までに研究された真正細菌は全て、ＤＮＡ ポリメラーゼＩＩＩのＤｎａＥ、β、δ、δ’およびτ／γサブユニットのオーソログをコード化する遺伝子を含んでおり、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてこれらのサブユニットは、ＤＮＡ複製に不可欠であることが示されている。
【０００５】
β二量体は、ＤＮＡを取り囲んではいるが、それに結合しているわけではなく、ＤＮＡに対しＤｎａＥまたはＰｏｌＣサブユニットを極めて近接した状態に維持することにより、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩにプロセシビティーを付与する。最近、βはまた、内的ＤＮＡ合成速度を増加させるエフェクターとしても作用し得ることが提案されている（Ｋｌｅｍｐｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０００）２７５：２６１３６−２６１４３参照）。ＤｎａＥに加えて、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に存在する３種の他のＤＮＡポリメラーゼ（これらは全てＬｅｘＡリプレッサータンパク質により調節されている）は、βと相互作用すると思われる。ＰｏｌＢ（ＰｏｌＩＩ）はＤＮＡ修復に関与しており、インビトロ検定法においてβおよびクランプローダー複合体の付加は、酵素プロセシビティーの増加をまねく（Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）２６７：１１４３１−１１４３８）。ＤＮＡポリメラーゼＩＶ（ＤｉｎＢ）へβおよびクランプローダー複合体を加えても、ＤＮＡ合成のプロセシビティーは増加せず、むしろそれは合成効率を劇的に増加させる（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０００）４０４：１６１４−１０１８）。βサブユニットは、ＤＮＡポリメラーゼＶ、ＵｍｕＤ’２ＵｍｕＣ複合体の活性において同様の役割を演じると思われる（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
【０００６】
エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのδおよびαサブユニットが結合するβの部位は、ある程度詳細に研究されているが、βと相互作用するδ、αおよび他のタンパク質における部位（複数も可）の性質は知られていない。実験的証拠は、少なくとも多少のβ−結合性タンパク質が、異種に由来するβタンパク質と生産的に相互作用し得ることを示している。例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＰｏｌＣサブユニットは、それらのプロセシビティーサブユニットとしてエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）βを使用し得る（Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７６）２５１：１３１１−１３２５）、Ｂｒｕｃｋおよび Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０００）２７５：２８９７１−２８９８３、Ｋｌｅｍｐｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）。対照的に、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤｎａＥは、他の種に由来するβを使用し得ず（Ｋｌｅｍｐｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）δサブユニットは、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）βには結合せず、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）クランプローディング複合体は、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）βを載せ得ず（Ｋｌｅｍｐｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）クランプローディング複合体は、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）βを載せ得ない（Ｂｒｕｃｋおよび Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ、２０００）。これらの発見は、βと他のレプリソームタンパク質の相互作用にある程度の特異性があることを示している。
【０００７】
有用であるべき抗菌剤の場合、それが感染宿主、ヒトまたは動物に対して有害な影響を与えないように、少なくとも真核生物に対するその活性は制限されたものでなければならない。環境によっては、抗菌剤が限られた範囲の細菌、例えば特定属に対する活性を有することが望ましい場合もある。真正細菌レプリソームタンパク質とβタンパク質の相互作用に特異性があるという発見により、相互作用が、真正細菌の構成員についての選択性をもつ抗菌剤の作用モードとして利用され得る可能性が生じている。
【０００８】
（発明の要約）
本発明の主たる目的は、真正細菌の構成員についての選択性をもつ新規抗菌剤の同定方法を提供することである。本発明の他の目的は、以下の要約および詳細な記載を一読すれば明らかとなるはずである。
【０００９】
第一の態様において、本発明は、βタンパク質と相互作用するタンパク質により接触された真正細菌βタンパク質のドメインの表面に類似した表面を含む分子であって、表面が、残基Ｘ^１７０、Ｘ^１７２、Ｘ^１７５、Ｘ^１７７、Ｘ^２４１、Ｘ^２４２、Ｘ^２４７、Ｘ^３４６、Ｘ^３６０およびＸ^３６２（ここで、上付け数字は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）βタンパク質における残基の位置を示す）、または他の種類の真正細菌からの相同体における均等内容の残基により特定され、
Ｘ^１７０が、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｔ、ＳまたはＥのいずれか一つであり、
Ｘ^１７２が、Ｔ、ＳまたはＩのいずれか一つであり、
Ｘ^１７５が、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｋ、Ｉ、ＱまたはＲのいずれか一つであり、
Ｘ^１７７が、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｆ、ＶまたはＡのいずれか一つであり、
Ｘ^２４１が、Ｆ、ＹまたはＬのいずれか一つであり、
Ｘ^２４２が、Ｐ、ＬまたはＩのいずれか一つであり、
Ｘ^２４７が、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｆ、ＬまたはＭのいずれか一つであり、
Ｘ^３４６が、Ｓ、Ｐ、Ａ、ＹまたはＫのいずれか一つであり、
Ｘ^３６０が、Ｉ、ＬまたはＶのいずれか一つであり、そして
Ｘ^３６２が、Ｍ、Ｌ、Ｖ、Ｓ、ＴまたはＲのいずれか一つである、
分子を提供する。
【００１０】
第二の態様において、本発明は、真正細菌βタンパク質およびそれと相互作用するタンパク質間における相互作用のモジュレーターの同定方法であって、
（ａ）
（ｉ）第一態様に記載のβタンパク質表面の少なくとも一部に結合する真正細菌βタンパク質についてのリガンド、
（ｉｉ）リガンドについての相互作用パートナー、および
（ｉｉｉ）試験化合物
を含む反応混合物を形成させ、
（ｂ）試験化合物の不存在下においてリガンドおよび相互作用パートナー間で相互作用を行わせ得る条件下で反応混合物をインキュベーションし、そして
（ｃ）リガンドおよび相互作用パートナー間の相互作用に対する試験化合物の効果を評価する
工程を含む方法を提供する。
【００１１】
第三の態様において、本発明は、真正細菌βタンパク質およびそれと相互作用するタンパク質間における相互作用のモジュレーターのインビボ同定方法であって、
（ａ）
（ｉ）第一態様に記載のβタンパク質表面の少なくとも一部に結合する真正細菌βタンパク質についてのリガンド、および
（ｉｉ）リガンドについての相互作用パートナー
を発現するかまたは含むように宿主を修飾し、
（ｂ）試験化合物を宿主に投与し、試験化合物の不存在下においてリガンドおよび相互作用パートナー間で相互作用をさせ得る条件下で宿主をインキュベーションし、そして
（ｃ）リガンドおよび相互作用パートナー間の相互作用に対する試験化合物の効果を評価する
工程を含む方法を提供する。
【００１２】
第四の態様において、本発明は、真正細菌βタンパク質およびそれと相互作用するタンパク質間における相互作用のモジュレーターの選択方法であって、
（ａ）第一態様に記載のβタンパク質表面の少なくとも一部に結合するペプチドについての共通配列を確立し、
（ｂ）共通配列の少なくとも一部分の構造をモデル化し、類似構造を有する化合物についての化合物データベースを検索し、ただし、モデル化は、
（ｉ）共通配列またはその一部分の出現についてタンパク質データベースを検索し、共通配列またはその一部分を含むタンパク質の残基の座標を得、そして座標を重ね合わせて薬理作用団モデルを作製するか、または
（ｉｉ）βタンパク質への結合時、共通配列またはその一部分を含むペプチドの構造をモデル化または決定することにより行われるものとし、そして
（ｃ）工程（ｂ）で同定された化合物を相互作用に対するそれらの効果について試験する
工程を含む方法を提供する。
【００１３】
第五の態様において、本発明は、生物系の真正細菌外寄生の作用を低減化させる方法であって、真正細菌種が外寄生した系に真正細菌βタンパク質およびそれと相互作用するタンパク質間の相互作用のモジュレーターを送達することを含む方法を提供する。
【００１４】
第六の態様において、本発明は、第一の態様に記載のβタンパク質表面の少なくとも一部に結合する化合物の設計用テンプレートであって、Ｘ^１Ｘ^２、Ｘ^３Ｘ^１Ｘ^２、Ｘ^３Ｘ^１Ｘ^２Ｘ^４、ＱＸ^５Ｘ^３Ｘ^１Ｘ^２、およびＱＸ^５ｘＸ^６Ｘ^３Ｘ^６（ただし、ｘは任意のアミノ酸残基であり、Ｘ^１は、Ｌ、Ｍ、ＩまたはＦであり、Ｘ^２は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｄ、ＡまたはＧであり、Ｘ^３は、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｄ、ＳまたはＰであり、Ｘ^４は、ＡまたはＧであり、Ｘ^５はＬであり、Ｘ^６は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、ＷまたはＰである）から成る群から選択されるペプチドを含むテンプレートを提供する。
【００１５】
本発明の前述および他の態様は、下記で簡単に説明されている図面と関連させながら詳細に説明されている。
【００１６】
（図面の簡単な記載）
図１は、真正細菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素のＤｎａＥおよびＰｏｌＣサブユニットのドメインの構成の概略図である。
【００１７】
図２は、ＬｅｘＡ−β−結合性モチーフタンパク質融合体による酵母２−ハイブリッド実験の結果を示す。
【００１８】
図３は、真正細菌δタンパク質の例のアミノ酸配列をエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）δ’およびγ／τタンパク質の配列と共に並べた構造配列を示す。配列は、以下のように称される：タウ／ガンマ、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（配列番号６６４）、デルタ’、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（配列番号６６５）、Ｅｃ、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（配列番号６６６）、Ｒｐ、リケッチア・プロワツェキイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）（配列番号６６７）、Ｈｐ、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）（配列番号６６８）、Ｍｔ、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（配列番号６６９）、Ｂ、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（配列番号６７０）、Ｍｐ、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（配列番号６７１）、Ｂｂ、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）（配列番号６７２）、Ｔｐ、トレポネマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）（配列番号６７３）、Ｓ、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）類（配列番号６７４）、Ｃｐ、クラミジオフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（配列番号６７５）、Ｄｒ、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）（配列番号６７６）、Ｔｍ、テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）（配列番号６７７）、およびＡａ、アキフェクス・エオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）（配列番号６７８）。
【００１９】
図４は、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニットのインビトロ発現および相互作用の結果を示す。
【００２０】
図５は、酵母２−ハイブリッド検定法におけるヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニットの相互作用を試験する実験の結果を示す。
【００２１】
図６は、酵母２−ハイブリッド検定法におけるβ−ガラクトシダーゼの発現についての結果を示す。
【００２２】
図７は、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）δタンパク質の構造モデルであり、β−結合性領域を示す。
【００２３】
図８は、天然および突然変異体エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）δサブユニットの相互作用を試験する実験の結果を示す。
【００２４】
図９は、ペンタペプチドβ−結合性モチーフにおけるアミノ酸の分布分析である。タンパク質のＰｏｌＣ（代表的なもの２２が含まれる）、ＰｏｌＢ（代表的なもの１５が含まれる）、ＤｎａＥ１（代表的なもの７２が含まれる）、ＵｍｕＣ（代表的なもの２０が含まれる）、ＤｉｎＢ１（代表的なもの６２が含まれる）およびＭｕｔＳ１（代表的なもの５９が含まれる）ファミリーの各要員からのタンパク質の適切な領域においてモチーフＱｘｓｈｈ（式中、「ｘ」はアミノ酸であり、「ｓ」は小アミノ酸であり、「ｈ」は疎水性アミノ酸である）との３またはそれ以上のマッチを伴う単一ペプチド配列が、分析に包含される。パーセント頻度をペンタペプチドモチーフの各位置における各アミノ酸についてプロットする。
【００２５】
図１０は、トリペプチドＤＬＦによるバシラス・サチラス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の増殖阻害を試験した実験の結果を示す。
【００２６】
図１１は、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）βの三次元構造を示す。第一態様で記載した残基の位置は、黒く塗りつぶした原子により示されている。
【００２７】
（発明の詳細な記載）
タンパク質におけるアミノ酸残基およびＤＮＡにおけるヌクレオチドについての１−および３−文字コードは、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ２１９、３４５−３７３（１９８４）に記載されたＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ標準に従う。
【００２８】
「リガンド」の語は、それが、特異的相互作用部位で非共有結合により別の化合物、例えばタンパク質、または細胞に結合する化合物であるという意味で本明細書では使用されている。この語の意味は、例えば Ｂ．Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ（ガーランド・パブリッシング、インコーポレイテッド、ニューヨークおよびロンドン、１９８３、１２７頁参照）によるその慣用法に従うものとする。
【００２９】
「相互作用」の語は、結合強度または会合の物理的性質に制限を加えることなく、ある分子と別の分子の特異的結合を包含するものとして本明細書では使用されている。
【００３０】
「モジュレーター」の語は、βタンパク質およびそのリガンド間の相互作用を促進または阻害する化合物を示すものとして本明細書では使用されている。すなわち、モジュレーターは、相互作用のアゴニストまたはアンタゴニストである。
【００３１】
本発明は、広範囲の真正細菌種において、クランプタンパク質、βへのＤＮＡ複製および修復に関わるタンパク質の結合に関与するペプチドモチーフを同定することから始まる。またこのモチーフを同定することにより、そこへ結合するタンパク質との相互作用に関与するβタンパク質ドメインの解明が可能となる。我々は、本明細書においてβとタンパク質の相互作用を阻害する化合物の設計についてのパラメーターを教示している。我々はまた、阻害または刺激活性についての化合物のスクリーニングを簡易化する簡単な試薬の開発方法を教示している。特に、それは、上記活性についての天然産物または合成化合物の高スループットスクリーニングを目的とする広範囲の簡単でエラーに強い検定システムの開発である。βタンパク質およびそのリガンドを含む様々なタンパク質−タンパク質相互作用の関係物質の構造を理解することから、真正細菌に対して選択活性をもつ新規抗菌剤が設計され、上記化合物の阻害および刺激活性を含む活性が以下詳細に説明されている方法により試験され得る。さらに、結合検定における阻害活性およびインビボ抗菌活性をもつ化合物が報告されている。
【００３２】
本発明者らは、真正細菌βタンパク質結合特性を有するペプチドが、少なくともジペプチドＸ^１Ｘ^２（ここで、Ｘ^１は、Ｌ、Ｍ、ＩまたはＦであり、Ｘ^２は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｄ、ＡまたはＧである）を含むことを確立した。ペプチドは、有利にはトリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチドまたはヘキサペプチドを含む。好ましいジペプチドは、Ｘ^１Ｆ（式中、Ｘ^１は前記の意味である）である。好ましいトリペプチドは、Ｘ^３Ｘ^１Ｘ^２（式中、Ｘ^１およびＸ^２は前記の意味であり、Ｘ^３は、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｄ、ＳまたはＰである）である。好ましいテトラペプチドは、Ｘ^３Ｘ^１Ｘ^２Ｘ^４（式中、Ｘ^１、Ｘ^２およびＸ^３は前記の意味であり、Ｘ^４は、ＡまたはＧである）である。好ましいペンタペプチドは、ＱＸ^５Ｘ^３Ｘ^１Ｘ^２（式中、Ｘ^１、Ｘ^２およびＸ^３は前記の意味であり、Ｘ^５はＬである）である。特に好ましいペンタペプチドはＱＬｘＬｘＬである。好ましいヘキサペプチドは、ＱＸ^５ｘＸ^６Ｘ^３Ｘ^６（式中、ｘ、Ｘ^３およびＸ^５は前記の意味であり、Ｘ^６は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、ＷまたはＰである）である。
【００３３】
特に好ましい特異的ペンタペプチドは、ＱＬＳＬＦ（配列番号６２２）、ＱＬＳＭＦ（配列番号６２３）、ＱＬＤＭＦ（配列番号６２４）およびＱＬＤＬＦ（配列番号６２５）である。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ）の場合、ペンタペプチドＨＬＳＬＦ（配列番号６２６）、ＨＬＳＭＦ（配列番号６２７）、ＨＬＤＭＦ（配列番号６２８）およびＨＬＤＬＦ（配列番号６２９）が有利である。特に好ましいテトラペプチドはＸ^３ＬＦＸ^４（式中、Ｘ^４はＡまたはＧである）である。特に好ましいトリペプチドは、ＳＬＦ、ＳＭＦ、ＤＬＦおよびＤＭＦである。特に好ましいジペプチドはＬＦおよびＭＦである。下記実例により好ましいペプチドについてさらに詳細に説明する。
【００３４】
上記ペプチドは、
（ｉ）βタンパク質およびそのリガンド間の相互作用のモジュレーター検定用試薬、
（ｉｉ）βタンパク質およびそのリガンド間の相互作用の阻害剤そのもの、
（ｉｉｉ）βタンパク質およびそのリガンド間の相互作用をモジュレートする分子設計用テンプレート、および
（ｉｖ）リガンドが相互作用するβタンパク質上の結合ドメインの表面を決定し、その表面から相互作用のモジュレーターをも設計し得る手段
としての有用性を有する。
【００３５】
本発明ペプチドは、当業者に公知の方法のいずれかにより合成および／または修飾され得る（ミメティクスに関する検討については下記参照）。別法として、ペプチドは、所望のペプチド配列を含むさらに大きいポリペプチドから切除され得る。さらに大きなポリペプチドは、ペプチドそれ自体の場合と同様、組換えＤＮＡ手段により製造され得る。
【００３６】
上記の本発明の第一態様に関して述べると、βの結合表面の三次元構造は、Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．により（Ｃｅｌｌ（１９９２）６９：４２５−４３７参照）報告されたところによると、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）βの三次構造において上記で具体的に示した残基の座標により特定される。
【００３７】
第一態様による表面を含む分子は、次の用途を有する：
（ｉ）βタンパク質およびそのリガンド間における相互作用の検定用試薬、
（ｉｉ）βタンパク質およびそのリガンド間における相互作用のモジュレーター自体、
（ｉｉｉ）βタンパク質およびそのリガンド間における相互作用を阻害する分子の設計用テンプレート、
（ｉｖ） βタンパク質における結合ドメインの構造をモデル化するためのテンプレートであって、その構造から相互作用のモジュレーターもまた設計され得るテンプレート、
（ｖ）化合物との共有結合および非共有結合相互作用についての直接標的部位、および
（ｖｉ）部位または部位の一部がβまたはβ結合性タンパク質、ペプチドまたは化合物における他の場所で共有結合的または非共有結合的に結合した化合物により不明確にされている、間接標的部位。
【００３８】
第二態様について述べると、リガンドは、βタンパク質の第一態様で特定された表面または表面の一部またはβタンパク質のこれらのドメインまたは表面のミメティックに結合するあらゆる物質であり得る。すなわち、リガンドは、単純な有機分子から複雑な巨大分子に至る範囲に及び、例えばタンパク質であり得る。典型的なタンパク質リガンドには、δ、ＤｎａＥ１、ＤｎａＥ２、ＰｏｌＣ、ＰｏｌＢ２、ＵｍｕＣ、ＤｉｎＢ１、ＤｉｎＢ２、ＤｉｎＢ３、ＭｕｔＳ１、ＲｅｐＡ、Ｄｕｆ７２およびＤｎａＡ２、およびβタンパク質との相互作用に関与し得るそれらのフラグメントがあるが、限定されるわけではない。リガンドにはまた、上記ペプチドおよび他のタンパク質、例えばＬｅｘＡ、ＧＳＴまたはＧＦＰに全体的または部分的に融合されたβ結合性タンパク質から誘導されたペプチドのミメティック、他のタンパク質、例えばＬｅｘＡ、ＧＳＴまたはＧＦＰに融合されたβ結合性タンパク質から誘導されたペプチド、真正細菌βタンパク質に結合するが、それら自体がβに結合はしないタンパク質から誘導された上記ペプチドがあるが、これらの限定はされない。リガンドにはまた、本発明の第一態様で上述したβタンパク質の表面または付近に全体または一部が結合する抗体および関連分子、例えば一本鎖抗体が含まれる。
【００３９】
本発明の明細書において、ペプチドの「ミメティック」の語は、適切な位置に置換基を提供することにより、上記で示されたペプチドの方法でβタンパク質の結合部位に化合物を全体的または部分的に結合させ得るタンパク質、ペプチドまたは化学的形態のフラグメントを包含する。当業者であれば、ペプチドに関する二次および三次構造情報がほとんどまたは全く無い場合にペプチドミメティックの設計を可能にする方法については熟知しているはずである。これらの方法は、例えば Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．，（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．９：５３０−５３５［１９９９］）による文献で報告されており、出典明示により本明細書の一部とする。採られ得る方法には例えば以下のものが含まれる：
１．ペプチドの特定領域の疎水性を高めるためのアミノ酸側鎖の修飾。例えば、ペンタペプチドの５位にあるフェニルアラニンのメチル基による水素の置換、
２．非アミノ酸による側鎖の置換。例えば、他のアリール基による、ペンタペプチドの５位にあるフェニルアラニンの置換、
３．新規置換基によるアミノ−および／またはカルボキシ−末端の置換。例えば、トリペプチドＤＬＦの疎水性を高めるための脂肪族基、
４．バックボーンの修飾（アミド結合代替）、例えば炭素による窒素の置換、
５．バックボーンの修飾による立体束縛性、例えばメチル基の導入、
６．Ｎ−置換グリシン残基のペプトイド、
７．Ｄアミノ酸による、ペプチド配列における１個またはそれ以上のＬアミノ酸の置換、
８．β−アミノ酸またはγ−アミノ酸による、ペプチド配列における１個またはそれ以上のα−アミノ酸の置換、
９．逆のペプチド結合を伴い、Ｄ−アミノ酸が元の配列に関して逆の順序で会合したレトロ−インベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）ペプチド
１０．非ペプチドフレームワーク、例えばステロイド、サッカリド、ベンズアゼピン１，３，４−トリ置換ピロリジノン、ピリドンおよびピリドピラジンおよび当業界で公知の他の物質の使用、
１１．スペーサーアミノ酸の挿入。例えば、Ｘ^１Ｘ^５Ｘ^２、ＱｘＸ^３Ｘ^１Ｘ^５Ｘ^２、およびＱＬＸ^３Ｘ^１Ｘ^５Ｘ^２（ただし、Ｘ^１は、Ｌ、Ｍ、ＩまたはＦであり、Ｘ^２は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｃ、Ｆ、Ｗ、Ｐ、Ｄ、ＡまたはＧであり、Ｘ^３は、ＤまたはＳであり、そしてＸ^５は、Ａ、Ｓ、Ｇ、Ｔ、ＤまたはＰである）形態のペプチドを生成すること。このモチーフを含む特に好ましいヘキサペプチドは、表１３に示されている。ヘキサペプチドは、事実、単一アミノ酸残基スペーサーを伴うペンタペプチドの「天然」ミメティックである。 １２．１１に記載されたペプチドによる方法１〜１０の使用。
【００４０】
第二態様の相互作用パートナーには、以下の化合物が含まれる：
（ｉ）真正細菌βタンパク質自体、または第一態様で記載されたドメイン表面の少なくとも一機能的部分を含むそのドメインの少なくとも一部分
（ｉｉ）（ｉ）記載の相互作用パートナーのミメティック、
（ｉｉｉ）上記ペプチド、または上記ペプチドの少なくとも一コピーを含むポリペプチド、および
（ｉｖ）（ｉｉｉ）のペプチドに結合する化合物。
【００４１】
前段落の項目（ｉｉ）のミメティックに関して述べると、これは、天然βタンパク質におけるアミノ酸側鎖の配置を模倣すべく折り畳まれている立体配座的に束縛された線状または環状ペプチドまたは表面を含む不連続ペプチドを全部または一部表す連鎖的線状ペプチドを含み得る。立体配座束縛は、ジスルフィド架橋、既知構造的束縛を伴うアミノ酸誘導体、非アミノ酸フレームワークおよび当業者に公知の他の手段を用いて達成され得る（Ｆａｉｒｌｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９８）５：２９−６２、Ｓｔｉｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）３：７１４−７２３）。ミメティックは、上記ペプチド、またはこれらのペプチドのミメティックに全部または一部が結合する、抗体、および関連分子、例えば一本鎖抗体であり得る。ミメティックは、βのこの部位または領域を発現するように遺伝子操作が加えられたタンパク質、または適切な位置に置換基を提供することにより、ペプチドを構成する残基の側鎖を模倣する化学的形態を包含し得る。これらの分子は、上記１〜１２記載の修飾を含み得る。
【００４２】
上記の相互作用性ペプチドおよびβ表面の設計された構造的ミメティックに加えて、他のミメティックもまた設計または選択され得る。これらには、上記ペプチドに結合する化合物、例えばペプチド、それらが存在するタンパク質、または真正細菌δタンパク質の構造的モデル化／測定により設計／同定されたものが含まれる。また、βに結合し、第二態様で同定されたアミノ酸残基のエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）βの３Ｄ構造における公表された座標（Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９２）６９：４２５−４３７）または他種の真正細菌に由来するβのオーソログにおける同等位置のモデル化（モデリング）および／または構造決定により特定された構造的空間を占拠または閉塞（全部または一部）する化合物も含まれる。上記ミメティックは、機能を模倣し得るが、必ずしもペプチドの構造を模倣するとは限らない。上記ミメティックは、天然産物のスクリーニング、ファージ呈示ライブラリーの製造（Ｓｉｄｈｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（２０００）３２８：３３３−３６３）、最小化タンパク質（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍおよび Ｗｅｌｌｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７）７：４５７−４６２）、ＳＥＬＥＸ（アプタマー）選択（Ｄｒｏｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ（１９９９）２：２７１−２７８）、コンビナトリアル・ライブラリーおよび収束コンビナトリアル・ライブラリー、仮想スクリーニング／データベース検索（Ｂｉｓｓａｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２０００）４３：４７５９−４７６７）および当業者に公知の合理的な薬剤設計（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ（２０００）５：２７６−２８５）を包含する方法により同定され得る。上記コンビナトリアル・ライブラリーは、ペプチド配列または上記で示したそれらの好ましい形態に対し当業界における薬化学者に公知の組み合わせ変化を加えたものに基くか、または薬剤設計に使用されるコンピュータープログラムの予測に基き得る（例えば、ＭＳＩからのＩｎｓｉｇｈｔＩＩおよびＣｅｒｉｕｓ２環境およびＴｒｉｐｏｓからのＳＹＢＹＬインターフェースのコンポーネント）。これらのライブラリーは、βに結合し、上記の構造的空間を占拠または閉塞（全部または一部）すると思われる化合物の範囲および性質の適切なサンプリングを含むように設計される。例えば、実施例９に記載されているエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）βのＳｅｒ３４５Ｃｙｓ突然変異体、または他の真正細菌βタンパク質の均等内容の突然変異体を用いることにより、βの結合部位に近接した化合物を繋ぎとめるＥｒｌａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２０００）９７：９３６７−９３７２）の方法は、一例として、フェニルアラニンまたは好ましいジペプチドを用いるＭａｌｙ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２０００）９７：２４１９−２４２４）の組み合わせ標的誘導リガンド構築法と組み合わされることにより、効率的なペプチドのミメティック合成の核となり得る。
【００４３】
第二態様の方法において試験化合物として使用され得る化合物には、以下のものがある：
（ｉ）上記ペプチド、またはペプチドの少なくとも一コピーを含むポリペプチド、
（ｉｉ）（ｉ）のペプチドのミメティック、
（ｉｉｉ）表面全体の結合性機能の少なくとも一部を保持する第二態様に記載された結合性表面の少なくとも一部のミメティック、
（ｉｖ）（ｉ）または（ｉｉ）と結合する天然産物または化学的化合物、
（ｖ）第一態様記載のβタンパク質の結合性表面に全体的または部分的に結合する天然産物または化学的化合物、および
（ｖｉ）検定で使用されるリガンドおよび相互作用パートナーの片方または両方に結合する化合物。
【００４４】
勿論、リガンドまたは相互作用パートナーがβタンパク質またはその結合性表面のミメティックであり、試験化合物もまたいずれかの物質のミメティックであるとき、二番目に挙げたミメティックは、βタンパク質または結合性表面のミメティックとは異なる分子であるものとする。
【００４５】
第二態様の方法は、レセプター‐リガンド相互作用を検定し得るあらゆる技術を用いて実施され得る。例えば、表面プラスモン共鳴、液中または固相を用いる検定法、ただしこの場合、結合は、免疫測定、放射分析、色素原、蛍光原、ルミネセンスまたは他の検出手段により測定されるものとし、クロモグラフィックまたは電気泳動法、ＮＭＲ、低温電子顕微鏡、Ｘ線結晶学および／またはこれらの方法の任意の組み合わせがある。
【００４６】
有利には、第二態様の方法では、構成成分（ｉ）または（ｉｉ）のいずれかを固体支持体に固定する。他の成分については、固定化された他の成分へのその成分の結合が検出され得るように標識され得る。適切な標識は、適切な固体支持体と同様、当業者には公知である。典型的には、標識は、放射性標識、例えば成分（ｉ）または（ｉｉ）を含む化合物へ取込まれた^３５Ｓである。別法として、溶解状態の成分は、成分に特異的な抗体の結合および当業者に公知の適切な展開により検出され得る。
【００４７】
第二態様による典型的な手順は、以下の要領で実施される。この手順では、βタンパク質についてのリガンドはαタンパク質である。精製αサブユニットタンパク質をマイクロタイタープレートのウェルに吸着させる。βサブユニットタンパク質を、試験化合物と共にまたはそれを伴わずに、α吸着ウェルに加え、インキュベーションする。プレートから未結合タンパク質を洗い流し、そしてβサブユニットに特異的な抗体とインキュベーションする。次いで、結合抗体は、種特異的Ｉｇ−西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートおよび適切な基質により検出される。色素原生成物を、プレート読取り装置を用いて関連性のある波長で測定する。
【００４８】
本発明の第三態様について述べると、リガンドおよび相互作用パートナーは、宿主細胞において、一時的発現を含めて発現され得る第二態様と連係的に使用されるリガンドおよび相互作用パートナーのいずれかであり得る。細胞は、必ずしもリガンドまたは相互作用パートナーを発現するように遺伝的に修飾される必要はなく、それらはリポソームなどを用いて細胞へ導入され得る。有利には、リガンドは、上記のものから選択されるペプチド、上記ペプチドの少なくとも一コピーを含むポリペプチド、または前述の化合物のミメティックである。同様に、相互作用パートナーは、真正細菌βタンパク質それ自体、または第一態様に記載されたドメインの表面の少なくとも機能性部分を含むそのドメインの少なくとも一部分である。相互作用パートナーはまた、有利には、前文で具体的に記された化合物のミメティックである。
【００４９】
第三態様の方法の修飾宿主は、動物、植物、真菌または細菌細胞、バクテリオファージまたはウイルスであり得る。上記宿主の修飾方法は、当業界では公知であり、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，編）、第２版（１９８９）（コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス）で報告されており、出典明示により本明細書の一部とする。
【００５０】
βタンパク質およびリガンド間における相互作用の阻害または増強作用が容易に評価され得るように、宿主に対し、有利には指標系を含むように遺伝子操作を加える。上記指標系は当業界では熟知されている。好ましい指標系は、β−ガラクトシダーゼリポーター系である。
【００５１】
第三態様の方法についての好ましい実施手順は、下記実施例２記載の酵母２−ハイブリッド検定法の修飾によるものである。β−ガラクトシダーゼ活性の検定前に適切な濃度の化合物を成長培地に加える。β結合性タンパク質とβとの相互作用を阻害する化合物は、観察されるβ−ガラクトシダーゼ活性の量を低減化させる。
【００５２】
本発明の第四態様について述べると、構造モデル化に適切なペプチド配列の詳細がここに記載されている。当業者であれば、構造を提供し得るモデル化手順については精通しているはずである。
【００５３】
第四態様の方法の工程（ｂ）（ｉ）では、共通配列の部分はトリペプチドであり得る。特に好ましいトリペプチドはＤＬＦである。工程（ｂ）（ｉｉ）方法では、上記ペンタペプチドおよびヘキサペプチド配列が好ましい。しかしながら、本明細書に開示されているペプチドであれば、いずれのものでも使用され得る。工程（ｂ）（ｉｉ）の記載で使用されている「モデル化」の語は、β−タンパク質表面への結合時におけるペプチドの構造の決定を含む。
【００５４】
上記検定手順は、有利には第四態様方法の工程（ｃ）で使用され得る。
【００５５】
本発明の第五態様について述べると、「生物系の真正細菌インフェステーション（外寄生）」の語は、ここではヒトを含む動物の疾患誘発性感染症、植物および植物生産物、例えば種子、果実および花の感染またはインフェステーション、食物のインフェステーションおよび食品製造工程の汚染、発酵工程のインフェステーション、真正細菌種による環境汚染、例えば土壌汚染などを示すものとして使用されている。しかしながら、この方法は、真正細菌種の数の低減化または削除が望まれるいかなる状況にも適用され得るため、この語は、前述の状況に限定されるものと解釈すべきではない。
【００５６】
真正細菌外寄生に対して使用される化合物、すなわち、真正細菌βタンパク質およびそれと相互作用するタンパク質間の相互作用を変調する化合物は、好ましくはその相互作用の阻害剤である。しかしながら、真正細菌βタンパク質およびそれと相互作用するタンパク質間の相互作用を高めるモジュレーター化合物もまた、真正細菌外寄生に対して使用され得る。後者の状況の場合、化合物の効力は、細胞複製の崩壊を伴いながらβに結合したタンパク質の正確なレベルでの放出を阻害する点に存する。ＤＮＡ複製は、βにおけるタンパク質、主としてレプリソームのαおよびδタンパク質の交換を必要とする。
【００５７】
第五態様および本記載全体を通して使用されている「外寄生された」の語は、真正細菌種による真核生物体、例えば動物、植物、真菌および海綿動物の全身感染またはその表面感染を包含する。この語はまた、真核生物体の体の一部の感染、例えば肉および植物製品の感染を包含する。さらにこの語は、微生物培養物の感染も包含する。さらにこの語は、加工処理工程または物理的環境での表面における真正細菌種の存在を含む。
【００５８】
第五態様および本記載全体を通して使用されている「送達する」の語は、真正細菌種により感染した対象動物、植物または微生物により取込まれる形で阻害剤化合物を投与することを含む。この明細書において、真正細菌外寄生がその表面に限られている場合、阻害剤化合物は必ずしも生物体に取込まれる必要はないが、この語は、感染表面または動物もしくは植物への阻害剤化合物の適用を包含する。またこの語は、動物、植物または微生物の遺伝的修飾を含むため、阻害剤化合物は修飾された生物体により内的に発現される。遺伝的修飾は、阻害剤化合物の調節された発現についての機構を含み得る。例えば、植物へ導入された阻害剤化合物の発現に関する一または複数遺伝子は、植物の真正細菌外寄生に反応するプロモーターの制御下に置かれ得る。動物、植物または微生物の遺伝的修飾により所望の阻害剤化合物を発現させる方法は、阻害剤化合物の発現制御方法と同様、当業者には公知である。さらに「送達する」の語は、例えば噴霧、すり込みなどによる表面または物理的環境への阻害剤化合物含有組成物の物理的送達を包含する。
【００５９】
投与されるモジュレーター化合物の量は、特定化合物、外寄生系の性質および関与する真正細菌種により異なる。抗菌剤適用技術分野の当業者であれば、特定阻害剤の量については認識しているはずである。
【００６０】
モジュレーター化合物は、典型的には化合物および適切な担体物質を含む組成物として投与される。組成物はまた、賦形剤、アジュバントおよび増量剤、または医薬、獣医学および農業組成物、または環境的に使用される組成物の製造で使用される他の化合物を含み得る。組成物はまた、追加的活性剤、例えば他の抗菌剤または治療剤を含み得る。
【００６１】
組成物は、シロップ、ローション、スプレー、錠剤、カプセル、ゲル、クリームまたは単なる溶液として製造され得る。使用される組成物の性質、および投与経路は、外寄生に対する生物系対象、および外寄生の性質により異なる。例えば、ヒトの真正細菌感染は、通常モジュレーター化合物の組成物を含む錠剤またはカプセルの投与により、またはさらに極端な場合にはモジュレーター化合物含有溶液の注射により処置される。
【００６２】
組成物は、当業者には公知である手順のいずれかにより製造され得る。本発明はまた、真正細菌βタンパク質および生物系の真正細菌外寄生の作用を低減化させる医薬製造用の他のタンパク質間における相互作用のモジュレーターの使用をその範囲内に包含する。
【００６３】
上記で示したところによると、本発明ペプチドは、リガンドとβタンパク質の相互作用のモジュレーターを設計するためのテンプレートとして使用され得る。ペプチドまたはポリペプチドは標的真正細菌または感染宿主によりタンパク質分解的に分解される傾向があり得るため、上記モジュレーター化合物は、有利にはペプチドのミメティックである。それにもかかわらず、環境によってはポリペプチドおよびペプチドが使用に供され得る場合もある。
【００６４】
ペプチドおよびβタンパク質表面のミメティックに関して述べると、これらは上記の化学的形態をとり得る。
【００６５】
設計されたモジュレーター化合物の効力は、第二または第三態様の方法を用いて試験され得るものとする。また、第五態様で使用されるモジュレーター化合物は、設計されたモジュレーター化合物、または第二および第三態様の方法の使用を通じて有効なモジュレーターとして同定された任意の化合物、または化合物の混合物であり得るものとする。
【００６６】
（実施例）
以下、本発明の非限定的実施例を記載する。
実施例１
この実施例では、プロセシビティークランプ、βとタンパク質の相互作用に関与するレプリソームタンパク質のペプチドモチーフの同定について記載する。
【００６７】
Ａ．方法
アミノ酸配列の分析
若干の供給源からの配列を採ることにより、タンパク質ファミリーのアミノ酸配列のアラインメントを構築した。ＮＣＢＩでのタンパク質の非重複データベースのＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索、以下のサーバーでの未完了および完了ゲノムのＢＬＡＳＴ検索：
ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｍｉｃｒｏｂ＿ｂｌａｓｔ／ｕｎｆｉｎｉｓｈｅｄｇｅｎｏｍｅ．ｈｔｍｌ）、
ＴＩＧＲ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ／ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？）、
サンガー・センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ＤａｔａＳｅａｒｃｈ／ｏｍｎｉｂｌａｓｔ．ｓｈｔｍｌ）、および
ＤＯＥ ジョイント・ゲノム・インスティテュート（ｈｔｔｐ：／／ｓｐｉｄｅｒ．ｊｇｉ−ｐｓｆ．ｏｒｇ／ＪＧＩ＿ｍｉｃｒｏｂｉａｌ／ｈｔｍｌ／）。
【００６８】
非重複ＧｅｎＰｅｐｔおよびバシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）読み枠の検索は、Ｐａｔｔｉｎｐｒｏｔサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ＿ｐａｔｔｉｎｐｒｏｔ．ｈｔｍｌ）を用いて着手された。予測される二次構造は、以下のサーバーを用いて決定された：
ＰＳＩＰＲＥＤ（ｈｔｔｐ：／／ｉｎｓｕｌｉｎ．ｂｒｕｎｅｌ．ａｃ．ｕｋ／ｐｓｉｐｒｅｄ）、および
Ｊｐｒｅｄ（ｈｔｔｐ：／／ｊｕｒａ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ：８８８８／ｓｕｂｍｉｔ．ｈｔｍｌ）。
【００６９】
タンパク質フォールド認識は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｍｍ．ｉｃｎｅｔ．ｕｋ／〜３ｄｐｓｓｍでの３Ｄ−ＰＳＳＭサーバーを用いて実施された。モデル化は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｓｗｉｓｓｍｏｄ／ＳＭ＿ＦＩＲＳＴ．ｈｔｍｌでのＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬサーバーを用いて実施された。ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬおよびＳｗｉｓｓ−ＰｄｂＶｉｅｗｅｒを用いてモデルを操作した。
【００７０】
Ｂ．結果
真正細菌ポリメラーゼＤｎａＥ、ＰｏｌＢおよびＰｏｌＣは、それらのポリメラーゼドメインのカルボキシ末端に保存ペプチドモチーフを含む。
主要な真正細菌複製ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのαサブユニット（ＤｎａＥおよびＰｏｌＣ）である。ＰｏｌＢは修復ポリメラーゼであり、真正細菌ＰｏｌＢタンパク質のカルボキシ末端は、短い保存ペプチドＱＬｓＬＦを含む。また、ＤＮＡポリメラーゼの真正細菌ＰｏｌＣファミリーの構成員のカルボキシ末端を調べると、これまでに同定されたファミリーの全構成員のカルボキシ末端またはその非常に近位に共通配列ＱＬＳＬＦ（配列番号６２２）を伴う短いペプチドが同定された。この分析結果は、ＰｏｌＣ１ファミリーについては表１およびＰｏｌＢ２ファミリーについては表２に示されている。これらの表、および以下の配列データ表では、モチーフを含む残基（最後の縦列の２列目）が、モチーフのＮ−末端側の１０残基、および上記残基が現れるモチーフのＣ末端側の１０番目までの残基と共に提示されている。両ファミリーとも、ペプチドは、ヘリックスまたはシートの一部であるとは予測されておらず、ヘリックスがそれに先行すると予測されている。すなわち、このモチーフは、真正細菌酵素におけるβ結合部位についての優れた候補である。
【００７１】
ＰｏｌＣは、多くのグラム陽性菌におけるＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのαサブユニットである。しかしながら、ほとんどの細菌においてＤｎａＥがαサブユニットである。ペプチドＱＬｓＬＦが現実にβ結合部位の一部である場合、それもまた当然ＤｎａＥサブユニットに存在する。ＤｎａＥおよびＰｏｌＣファミリーの構成員は関連しており、類似ドメインを含むが、僅かに異なる方法で組織化されている（図１）。ＤｎａＥファミリーは、それらのドメイン構成（図１）および配列類似性に基いてさらにＤｎａＥ１およびＤｎａＥ２サブファミリーに分けられ得る。ＤｎａＥ１およびＤｎａＥ２サブファミリーの構成員のカルボキシ末端を調べても、ＱＬｓＬＦに類似した保存ペプチドモチーフは全く認められなかった。提案されたヘリックス‐ヘアピン‐ヘリックスドメイン（ＰｏｌＣ酵素におけるＱＬｓＬＦモチーフの位置に等しい）の直後に続く領域を詳細に分析したところ、ＰｏｌＢおよびＰｏｌＣで同定されたモチーフと同等に共通配列ＱｘｓＬＦを伴う短いペプチドが同定された。この分析用に使用したデータを表３および４に示す。示された構造は３Ｄ−ｐｓｓｍを用いて予測されたものであり、配列決定されたエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤｎａＥ１を用いて配列のアラインメントを開始させた。エルシニア・ペスティス（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）、ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ）、パスツレラ・マルトサイダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、アクチノバシラス・アクチノマイセテムコミタンス（Ａ．ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、シェワネラ・プトレファシエンス（Ｓ．ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・ピュチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、ティー・フェロキシダンズ（Ｔ．ｆｅｒｒｏｘｉｄａｎｓ）、ナイセリア・ゴノロエエ（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ボルデテラ・ブロ（ン）キセプチカ（Ｂ．ｂｒｏｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ボルデテラ・パータッシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ロドバクター・スファエロイデス（Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、カウロバクター・クレセンタス（Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、ジアトーマ・ブルガリス（Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ジオバクター・スルフレンデュセンス（Ｇ．ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ）、マイコバクテリウム・レプレ（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）、マイコバクテリウム・アビアム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、コリネバクテリウム・ジフセリエ（Ｃ．ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ）、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ディー・エソゲネス（Ｄ．ｅｔｈｏｇｅｎｅｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、バシラス・アンスラシス（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、トレポネマ・デンチコーラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、クロロビウム・テピデュム（Ｃ．ｔｅｐｉｄｕｍ）およびポルフィロモナス・ギンギバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の種について示された配列データは、以下のＮＣＢＩサイトでの未完了ゲノムサーバーから得られた予備データである：
ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｍｉｃｒｏｂ＿ｂｌａｓｔ／ｕｎｆｉｎｉｓｈｅｄｇｅｎｏｍｅ．ｈｔｍｌ）。
【００７２】
ニトロソモナス・エウロペア（Ｎ．ｅｕｒｏｐａｅａ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒ．ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、プロクロロコッカス・マリナス（Ｐ．ｍａｒｉｎｕｓ）およびノストック・パンクチフォルメ（Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）種について示された配列データは、予備データであり、ＤＯＥジョイント・ゲノム・インスティテュート（ｈｔｔｐ：／／ｓｐｉｄｅｒ．ｊｇｉ−ｐｓｆ．ｏｒｇ／ＪＧＩ＿ｍｉｃｒｏｂｉａｌ／ｈｔｍｌ／）での関連のある未完了ゲノムサーバーから得られた。
【００７３】
さらに、小アミノ酸は、中央モチーフの直前および直後に有利である。ペプチドは、ヘリックスまたはβ−シートの一部であるとは予測されず、ヘリックスがそれに先行すると予測されている。
【００７４】
修復ポリメラーゼのＵｍｕＣ／ＤｉｎＢファミリーの構成員における共通ＱＬｓＬＦを伴うペプチドの同定
エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩＶおよびＶは、βの存在下では高いＤＮＡ合成効率を有する。ＵｍｃＣ／ＤｉｎＢファミリーは、配列類似性に基いてさらに４つのサブファミリーに分割され得る。４つのサブファミリーは、ＤｉｎＢ１、ＤｉｎＢ２、ＤｉｎＢ３およびＵｍｕＣと称される。ＤｉｎＢ１サブファミリー（ポリメラーゼＩＶ）の構成員の配列を分析すると、多少の保存ペプチドモチーフが同定され（表５）、タンパク質のカルボキシ末端またはその近位に非常に弱い共通ＱｘｓＬＦを伴う。ポリメラーゼＶは、ＵｍｕＤ’と称されるＵｍｕＤの開裂バージョンおよびＵｍｕＣなるポリメラーゼサブユニットの２分子を含むマルチ‐サブユニット酵素である。ＵｍｕＣサブファミリーの構成員は、保存ペプチドモチーフ、ＱＬＮＬＦ（配列番号６３０）、タンパク質のカルボキシ末端から約６０アミノ酸を含んでいた（表７）。ＵｍｕＣサブファミリーは、染色体コード化ＵｍｕＣタンパク質およびプラスミドコード化ＳａｍＢ、ＲｕｌＢ、ＭｕｃＢ、ＩｍｐＢおよびＲｕｍＢタンパク質を包含する。また、グラム陽性菌のプラスミドおよびバクテリオファージに存在する、第三のサブファミリー、ＤｉｎＢ２の構成員は、ＤｉｎＢおよびＵｍｕＣサブファミリーにおけるモチーフに対し均等な位置に配列ＱＬＳＬＦ（配列番号６２２）を伴う保存モチーフを含んでいた（表６）。
【００７５】
ミスマッチ修復に関与するタンパク質における推定的β−結合部位の同定
ＭｕｔＳスーパーファミリーは、進化全景にわたるミスマッチＤＮＡ修復系と共通している。ＭｕｔＳタンパク質は、ミスマッチの初回認識に関与している。ＭｕｔＳスーパーファミリーは、２つのファミリーＭｕｔＳ１およびＭｕｔＳ２に分割されている。真正細菌では、ＭｕｔＳ１およびＭｕｔＳ２ファミリーの単一サブファミリーが同定された。ＭｕｔＳ１ファミリーでは、β結合モチーフとマッチする保存ペプチドが、ファミリーのほとんどの構成員で同定された（表８）。このモチーフは、長さが多型性のアミノ酸配列および保存ＭｕｔＳドメインおよびタンパク質のカルボキシ末端にある真正細菌に特異的な短い保存ドメイン間に存する配列の領域に存する（表８）。このペプチドはヘリックスまたはシートの一部であるとは予測されず、ヘリックスがそれに先行すると予測される。類似モチーフは、ＭｕｔＳ２スーパーファミリーの構成員からは同定されなかった。
【００７６】
β結合ペプチド共通配列の決定
提案されたβ結合ペプチドを整列させ、各位置における各アミノ酸の頻度をプロットした（図９）。このプロットから、ペンタペプチドの共通配列は、ＱＬ［ＳＤ］ＬＦ（ここで、［ＳＤ］はＳまたはＤ（それぞれ配列番号５８２および５８４）を意味する）であると決定された。
【００７７】
可能なβ結合部位を伴う他の真正細菌タンパク質
提案されたβ結合部位は、若干の共通した特徴を有する。すなわち、それらはタンパク質ファミリーの一群の構成員全体で保存されているドメインにあるのではなく、それらは通常タンパク質のカルボキシ末端にあり、それらは可変アミノ酸配列およびアミノ酸長の領域にあって、それらはヘリックスまたはシートであるとは予測されない領域に存し、それらはヘリックスが先行していることが多く、これらのタンパク質の三次構造は知られていないが、ペプチドはタンパク質の外部表面上にあると思われる。非重複ＧｅｎＰｅｐｔタンパク質配列データベースを、配列ＱＬＳＬＦ（配列番号６２２）を含むタンパク質について検索し、バシラス・サチラス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）タンパク質配列データベースをＱＬＳＬＦに関連したペプチド配列について検索した。ＤＮＡ複製および修復に関与していることが知られているタンパク質におけるヒットをさらに詳細に調べた。
【００７８】
ペプチドモチーフおよびフランキング配列および予測される二次構造の位置およびアミノ酸保存性を上記特徴に対して評価した。例外は一つあるが、これらの基準を満たすタンパク質のさらなるファミリーはそれ以上同定されなかった。一つの例外とは、プラスミドのエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＡ１、アシドチオバシラス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｏｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）ｐＴＦ５およびブフネラ・アフィジコラ（Ｂｕｃｈｎｅｒａ ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ）ｐＢＰＳ２によりコード化されるＲｅｐＡタンパク質のファミリーにおける若干のタンパク質であった（表９）。
【００７９】
ＵｍｕＣ／ＤｉｎＢスーパーファミリーの第四ファミリー、ＤｉｎＢ３の構成員は、かなり低レベルのモチーフ保存性を呈していたが、僅かな例外はモチーフのＱまたはＬＦ部分が保存されていることであった（表１０）。
【００８０】
さらに、推定β結合部位は、機能が未知のタンパク質のＤｕｆ７２ファミリーの全部ではないがかなりの構成員におけるカルボキシ末端で同定された（表１１）。Ｄｕｆ７２ファミリー（ＰｆａｍＰＦ０１９０４）は以下のサイト：
Ｐｆａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｐｆａｍ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）
に報告されており、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＹｅｃＥタンパク質（ＮＣＢＩ ｇｉ：１７８８１７５）およびバシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＹｕｎＦタンパク質（ＮＣＢＩ ｇｉ：２６３５７３６）を含む。このファミリーのさらなる構成員は、方法の項で記載したデータベースのＢＬＡＳＴ検索により同定された。
【００８１】
ＤｎａＡに関連した、ここではＤｎａＡ２ファミリーと称され、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＹｆｇＥタンパク質（ＮＣＢＩ ｇｉ：１７８８８４２）により例証されたタンパク質の一ファミリーの分析により、アミノ末端にある推定β結合部位が同定された（表１２）。また、このファミリーのさらなる構成員が、上記方法の項で記載したデータベースのＢＬＡＳＴ検索により同定された。
【００８２】
第二ヘキサペプチド、推定β−結合モチーフの同定
提案されたＤｎａＡ２ β結合モチーフの配列分析は、共通配列ＱＬｘＬｘｈ（ただし、ｘはアミノ酸であり、ｈは疎水性アミノ酸である）を伴うヘキサペプチドが第２の共通性の劣るβ結合モチーフを構成し得ることを示唆していた。類似モチーフの例はまた、表１３のデータから明らかなように、低頻度で他のファミリーのタンパク質の幾つかにおいても現れ得る。全体的にみて、これらの配列は、弱い共通配列ＱｘｘＬｘｈを有すると思われる。
【００８３】
【表１】

【００８４】
【表２】

【００８５】
【表３】

【００８６】
【表４】

【００８７】
【表５】

【００８８】
【表６】

【００８９】
【表７】

【００９０】
【表８】

【００９１】
【表９】

【００９２】
【表１０】

【００９３】
【表１１】

【００９４】
【表１２】

【００９５】
【表１３】

【００９６】
【表１４】

【００９７】
【表１５】

【００９８】
【表１６】

【００９９】
【表１７】

【０１００】
実施例２
この実施例では、我々は、実施例１で同定されたペプチドモチーフが、βへのタンパク質の結合を可能にするのに必要であり、充分であることを立証する。
【０１０１】
Ａ．方法
材料
エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ−１Ｂｌｕｅを、全プラスミド構築用宿主として使用した。ｐＬｅｘＡ、ｐＢ４２ＡＤ、ｐ８ｏｐ−ｌａｃＺベクターおよび酵母ＥＧＹ４８細胞は、マッチメーカー２−ハイブリッドシステム（クロンテク）から入手された。２％グルコース含有最少合成ドロップアウトベース培地（ＳＤ）または２％ガラクトースおよび１％ラフィノース含有誘導培地（ＳＧ）、および種々のドロップアウトアミノ酸混合物（ＣＳＭ）は、ＢＩＯ１０１から入手された。クローニングおよびＰＣＲに使用される酵素は全てプロメガから入手された。
【０１０２】
酵母２−ハイブリッドプラスミド構築
我々は、ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインおよび細菌タンパク質Ｂ４２からのトランスアクチベーションドメインに基く酵母２−ハイブリッドシステムを使用した。エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）βのコーディング領域を、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いるＸＬ−１ ＢｌｕｅゲノムＤＮＡからのＰＣＲにより増幅した。β遺伝子を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー、フォワードおよび逆プライマー、
５’−ＴＧＧＣＴＧＧＡＡＴＴＣＡＡＡＴＴＴＡＣＣＧＴＡＧＡＡＣＧＴ−３’ （配列番号５８２）および
５’−ＡＧＴＣＣＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＧＴＣＴＣＡＴＴＧＧＣＡＴ−３’ （配列番号５８３）
には各々、ＥｃｏＲＩ部位（下線部）が両端に隣接しており、ｐＢ４２ＡＤのＥｃｏＲＩ部位でβ遺伝子をクローニングさせることにより、Ｂ４２転写活性化ドメインとの翻訳融合体を作製した。ｐＬｅｘＡにおけるＤｎａＥ遺伝子の様々な欠失を構築するため、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲによりＤｎａＥ遺伝子の適切な部分を増幅した。ＤｎａＥ（５４２−９９１）およびＤｎａＥ（７３６−９９１）フラグメントを生成するのに使用されるＰＣＲプライマーは、以下の通りであった：
５’−ＴＴＴＧＡＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＧＣＧＡＣＧＴＴＧＡＡＴＡＣＧＣ−３’ （アミノ酸５４２から始まる５’プライマー、配列番号５８４）、
５’−ＧＣＴＴＴＧＧＡＡＴＴＣＧＴＧＴＣＡＴＡＴＣＡＡＡＣＧＴＴＡＴＧ−３’ （アミノ酸７３６から始まる５’プライマー、配列番号５８５）、および
５’−ＧＡＣＴＴＴＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＣＣＡＣＧＴＴＣＴＧＴＣＧＧＧＴＧＣＡ−３’（３’プライマー、配列番号５８６）。
【０１０３】
ＤｎａＥ（５４２−７３５）を構築するため、プライマー
５’−ＴＴＴＧＡＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＧＣＧＡＣＧＴＴＧＡＡＴＡＣＧＣ−３’ （配列番号５８７）および
５’−ＧＡＣＴＴＴＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＧＴＴＴＧＡＴＡＡＧＴＣＡＣ−３’ （配列番号５８８）
を使用した。フォワードプライマーは全てＥｃｏＲＩ部位（下線部）を含んでおり、逆プライマーの両端にはＸｈｏＩ部位（下線部）が隣接しているため、各ＤｎａＥ ＰＣＲ生成物がｐＬｅｘＡのＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングされ得ることにより、ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインとのインフレーム融合体が作製された。部位特異的突然変異誘発を行うため、ＤｎａＥ（７３６−９９１）フラグメントをｐＱＥ１１（キアゲン）へクローン化した。
【０１０４】
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅプロトコル（ストラタジーン）を用いて、ＭＦ〜ＫＫ突然変異については突然変異誘発性プライマー２ＨｙＫＫ１および２ＨｙＫＫ２、およびＱＦ〜ＰＰ突然変異については同２ＨｙＰＰ１および２ＨｙＰＰ２を用いることにより、突然変異をこのプラスミドに導入した。これらのプライマーは、以下の配列を有していた：
５’−ＧＴＣＡＧＧＣＣＧＡＴＡＡＡＡＡＧＧＧＣＧＴＧＣＴＧＧＣＣ−３’ （２ＨｙＫＫ１、配列番号５８９）、
５’−ＧＣＣＡＧＣＡＣＧＣＣＣＴＴＴＴＴＡＴＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣ−３’ （２ＨｙＫＫ２、配列番号５９０）、
５’−ＧＡＡＧＣＴＡＴＣＧＧＴＣＣＴＧＣＣＧＡＴＡＴＧＣＣＡＧＧＣＧＴＧＣＴＧＧＣＣ−３’ （２ＨｙＰＰ１、配列番号５９１）、および
５’−ＧＧＣＣＡＧＣＡＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＡＴＣＧＧＣＡＣＣＡＣＣＧＡＴＡＧＣＴＴＣ−３’ （２ＨｙＰＰ２、配列番号５９２）。
【０１０５】
次いで、突然変異を含むＰＣＲフラグメントをｐＬｅｘＡにサブクローニングすることにより、ｐＬｅｘＡＤｎａＥ（７３６−９９１ＫＫ）およびｐＬｅｘＡＤｎａＥ（７３６−９９１ＰＰ）プラスミドを作製した。β結合領域を含むペプチドをサブクローニングするため、我々は、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲによりＤｎａＥ、ＵｍｕＣ、ＤｉｎＢおよびＭｕｔＳの適切な領域を増幅した。これらの増幅用プライマーは以下の通りであった：
ＤｎａＥ（９０８−９３１）
５’−ＧＧＡＡＡＧＡＡＴＴＣＧＧＴＣＣＧＧＣＧＧＣＡＧＡＴＣＡＡＣＡＣＧＣＧ−３’（フォワード、配列番号５９３）、および
５’−ＧＡＴＣＡＡＣＴＣＧＡＧＡＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＣＴＣＣＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＣＡＣ−３’ （逆、配列番号５９４）；
ＤｎａＥ（８９６−９１９）
５’−ＴＣＴＣＡＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＡＧＣＧＧＧＴＧＣＧＡＧＴＣＡＧＧＧＡＧＴＣＧＣＧＣＡＧ−３’ （フォワード、配列番号５９５）、および
５’−ＡＡＴＣＣＡＣＴＣＧＡＧＧＣＣＴＣＣＡＣＣＧＡＴＡＧＣＴＴＣＣＧＣＴＴＴ−３’ （逆、配列番号５９６）；
ＵｍｕＣ
５’−ＴＣＴＣＡＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＧＴＧＣＧＡＧＴＣＡＧＧＧＡＧＴＣＧＣＧＣＡＧ−３’ （フォワード、配列番号５９７）、および
５’−ＡＡＴＣＣＡＣＴＣＧＡＧＴＣＣＣＧＧＴＧＣＧＴＴＧＴＣＡＴＣＧＡＡ−３’ （逆、配列番号５９８）；
ＤｉｎＢ
５’−ＴＣＴＣＡＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＧＴＧＣＧＣＣＧＣＡＡＡＴＧＧＡＡＡＧＡＣＡＡ−３’ （フォワード、配列番号５９９）、および
５’−ＡＡＴＣＣＡＣＴＣＧＡＧＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＴＴＧ−３’ （逆、配列番号６００）；
ＭｕｔＳ
５’−ＴＣＴＣＡＡＡＧＣＣＧＣＣＧＣＴＡＣＧＣＡＡＧＴＧＧ−３’ （フォワード、配列番号６０１）、および
５’−ＡＡＴＣＣＡＣＴＣＧＡＧＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＴＡＣＴＧＡＣＡＧＣＡＡＡＧＡＣ−３’ （逆、配列番号６０２）。
【０１０６】
これらのＰＣＲフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ（下線部）で消化し、ＧＡＧまたはＡＧＡリンカーを通してＬｅｘＡ結合ドメインにインフレーム融合した。ｐＬｅｘＡｐｏｌＢを構築するため、リンカーＧＡＧおよびフランキングＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ部位を伴う配列ＱＬＧＬＦ（配列番号６３６）をコード化する二本鎖ＤＮＡをｐＬｅｘＡにサブクローニングした。
【０１０７】
全プラスミドにおけるＤＮＡ挿入体およびクローニング連結点を配列決定により確認した。
【０１０８】
２−ハイブリッド検定法
βおよび様々なＬｅｘＡ融合タンパク質間における相互作用を、酢酸リチウム方法を用いてｐＬｅｘＡ融合プラスミドおよびｐＢ４２ＡＤβプラスミドの同時形質転換によりｌａｃＺリポーター遺伝子を含む酵母ＥＧＹ４８（ＥＧＹ４８ｐ８０ｐ−ｌａｃＺ）で試験した。適切な補足物質を欠く合成完全培地において同時形質転換体を平板培養することにより、プラスミド選択を維持した。
【０１０９】
β−ガラクトシダーゼ
３〜６個の形質転換体を指標培地（ＳＧ／Ｇａｌ／Ｒａｆ／−Ｈｉｓ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐ／−ＵｒａおよびＸ−ｇａｌ含有）へパッチし、３０℃で成長させ、９６時間まで１２時間間隔で青色発色についてチェックした。結果を、並行して行った陽性（ｐＬｅｘＡ−５３とｐＢ４２ＡＤ−Ｔ）および陰性対照（ｐＬｅｘＡ−ＬａｍとｐＢ４２ＡＤ−Ｔ）の場合と比較した。また、細胞を接種し、グルコースまたはガラクトース含有選択培地で中間対数期まで成長させた。酵母β−ガラクトシダーゼキット（ピアス）を用いてβ−ガラクトシダーゼ活性を評価し、酵素活性をミラー単位で表した。結果は全て、少なくとも２つの独立した検定法において再現性を示した。
【０１１０】
Ｂ．結果
エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤｎａＥにおけるβ−結合部位の分析
前述の実施例１におけるバイオインフォマティクス（バイオ情報）分析により、真正細菌タンパク質におけるβ結合部位の一部であることについての基準をある程度満たすエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤｎａＥにおける２つの短い保存ペプチドモチーフが同定され得た。提案されたペプチドモチーフの役割の実験的確証を得るため、そのモチーフに隣接するエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤｎａＥをコード化する遺伝子の領域を、酵母２−ハイブリッドベクターｐＬｅｘＡへクローン化することにより、プラスミドｐＬｅｘＡＤｎａＥ（５４２−９９１）を作製した（図２）。プラスミドｐＬｅｘＡＤｎａＥ（５４２−９９１）および転写アクチベータードメインＢ４２に融合したエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）βを発現するｐＢ４２ＡＤβにより形質転換されたサッカロマイシス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＧＹ４８ではβ−ガラクトシダーゼの顕著な発現が観察された（図２）。提案されたペプチドを含まないアミノ末端領域を除去することにより、酵母２−ハイブリッドシステムにおけるβ−ガラクトシダーゼの発現が高められた。提案された結合性ペプチドを含まないフラグメントからは、β−ガラクトシダーゼの顕著な発現は観察されなかった。提案されたβ結合部位をさらに特性確認するため、ペプチドモチーフにおけるアミノ酸の部位特異的突然変異誘発を企てることにより、ＱＡＤＭＦ（配列番号６３１）モチーフを、共に非結合性配列であると予測される、ＱＡＤＫＫ（配列番号６３２）（プラスミドｐＬｅｘＡＤｎａＥ（７３６−９９１ＫＫ））およびＰＡＤＭＰ（配列番号６３３）（プラスミドｐＬｅｘＡＤｎａＥ（７３６−９９１ＰＰ））に変換した。プラスミドｐＬｅｘＡＤｎａＥ（７３６−９９１ ＫＫ）またはｐＬｅｘＡＤｎａＥ（７３６−９９ ＰＰ１）およびｐＢ４２ＡＤβにより形質転換されたサッカロマイシス・セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）では、β−ガラクトシダーゼの顕著な発現は観察されなかった（図２）。ＱＡＤＭＦ（配列番号６３１）ペプチドの役割をさらに調べるため、この配列を含む２４アミノ酸ペプチドをコード化するＤＮＡフラグメントを、酵母２−ハイブリッドベクターｐＬｅｘＡへ挿入することにより、ペプチドとＬｅｘＡのインフレーム融合体を含むプラスミドｐＬｅｘＡＤｎａＥ（９０８−９３１）を作製したところ、再び、β−ガラクトシダーゼの強い発現が、隣接ペプチドを含むＬｅｘＡを発現するｐＬｅｘＡＤｎａＥ（８９６−９１９）を含む細胞からではなく上記ペプチドを含むタンパク質から観察された。
【０１１１】
エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＵｍｕＣにおけるβ−結合部位の分析
前述の実施例１におけるバイオインフォマティクス分析により、真正細菌タンパク質におけるβ結合部位の一部であることについての基準を全て満たすと思われるエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＵｍｕＣにおける短い保存ペプチドモチーフが同定され得た。提案されたペプチドモチーフの役割の実験的確証を得るため、モチーフ（ＳＱＧＶＡＱＬＮＬＦＤＤＮＡＰ、配列番号６３７）を含む短いペプチドを、プラスミドｐＬｅｘＡＵｍｕＣ（３５１−３６５）においてＬｅｘＡ融合体として発現させた。ｐＬｅｘＡＵｍｕＣ（３５１−３６５）プラスミドを、Ｂ４２−β融合体を発現するプラスミドと同時形質転換すると、サッカロマイシス・セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＧＹ４８においてβ−ガラクトシダーゼの顕著な発現が観察された（図２）。
【０１１２】
エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤｉｎＢにおけるβ−結合部位の分析
また、実施例１分析により、真正細菌タンパク質におけるヘキサペプチドβ結合性ペプチドモチーフを表す、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤｉｎＢにおける短い保存ペプチドモチーフが同定され得た。提案された変異型ペプチドモチーフＰＱＭＥＲＱＬＶＬＧＬ（配列番号６３９）の役割の実験的確証を得るため、モチーフを含む短いペプチドを、酵母２−ハイブリッドベクターｐＬｅｘＡＤｉｎＢにおいてＬｅｘＡ融合体として発現させた（図２）。ｐＬｅｘＡＤｉｎＢ（３０７−３１７）プラスミドおよびＢ４２−β融合体を発現するプラスミドにより同時形質転換したとき、サッカロマイシス・セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＧＹ４８においてβ−ガラクトシダーゼの顕著な発現が観察された（図２）。
【０１１３】
エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭｕｔＳにおけるβ−結合部位の分析
さらに実施例１分析により、真正細菌タンパク質におけるβ結合部位の一部であることについての基準を全て満たすエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭｕｔＳにおける短い保存ペプチドモチーフが同定され得た。提案されたペプチドモチーフの役割の実験的確証を得るため、モチーフ（ＡＡＡＴＱＶＤＧＴＱＭＳＬＬＳＶＰ、配列番号６３８）をコード化する短いペプチドを、酵母２−ハイブリッドベクターｐＬｅｘＡＭｕｔＳ（８０２−８１８）においてＬｅｘＡ融合体として発現させた（図２）。ｐＬｅｘＡＭｕｔＳ（８０２−８１８）プラスミドおよびｐＢ４２ＡＤβプラスミドにより同時形質転換すると、サッカロマイシス・セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＧＹ４８においてβ−ガラクトシダーゼの顕著な発現が観察された（図２）。上記ペプチド結果と一致して、ＬｅｘＡと融合した完全長エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭｕｔＳタンパク質はまた、酵母２ハイブリッド検定法でエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）βと相互作用した。このペプチドモチーフにおけるＬＬ（モチーフＱＭＳＬＬにおける：配列番号６３８参照）からＡＡへの突然変異により、ＭｕｔＳによるβ結合が排除された。
【０１１４】
エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰｏｌＢにおけるβ結合部位の分析
実施例１分析から、真正細菌タンパク質におけるβ結合部位の一部であることについての基準を全て満たすエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰｏｌＢにおける短い保存ペプチドモチーフが同定された。提案されたペプチドモチーフの役割の実験的確証を得るため、モチーフ「ＱＬＧＬＦ」（配列番号６３６）をコード化する短いペプチドを、酵母２−ハイブリッドベクターｐＬｅｘＡＰｏｌＢ（７７９−７８３）においてＬｅｘＡ融合体として発現させた（図２）。ｐＬｅｘＡＰｏｌＢ（７７９−７８３）プラスミドおよびｐＢ４２ＡＤβプラスミドにより同時形質転換すると、サッカロマイシス・セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においてβ−ガラクトシダーゼの顕著な発現が観察された（図２）。
【０１１５】
実施例３
この実施例では、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）における新規δタンパク質オーソログの同定について記載する。
【０１１６】
ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）δオーソログについての検索
同定されたエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびヘモフィラス・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）δオーソログの完全アミノ酸配列を用いて、以下の検索を開始した：ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）完全ゲノム配列のＢＬＡＳＴ検索、ＮＣＢＩでのタンパク質の非重複データベースのＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索および未完了および完了ゲノムのＢＬＡＳＴ検索：
ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｍｉｃｒｏｂ＿ｂｌａｓｔ／ｕｎｆｉｎｉｓｈｅｄｇｅｎｏｍｅ．ｈｔｍｌ）、
ＴＩＧＲ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ／ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？）、
サンガー・センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ＤａｔａＳｅａｒｃｈ／ｏｍｎｉｂｌａｓｔ．ｓｈｔｍｌ）、および
ＤＯＥ ジョイント・ゲノム・インスティテュート（ｈｔｔｐ：／／ｓｐｉｄｅｒ．ｊｇｉ−ｐｓｆ．ｏｒｇ／ＪＧＩ＿ｍｉｃｒｏｂｉａｌ／ｈｔｍｌ／）。
【０１１７】
有意性の限界におけるヒットを用いて新たな検索を開始する反復法で検索を実施した。δタンパク質の場合、以下の基準を用いることにより、次の検索ラウンドで特定配列を含むか否かを決定した：既知ｈｏｌＡタンパク質に類似した長さの生成物、タンパク質における類似相対位置での同一性、現時点で機能を割当てられていないタンパク質。δタンパク質の候補推定オーソログが、完了または実質的に完了したゲノム配列が入手できる全細菌において同定されるまで、この過程を続行した。また、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｓｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｃｏｍｐｂｉｏ／ＨＭＭ−ａｐｐｓ／Ｔ９８−ｑｕｅｒｙ．ｈｔｍｌでのＳＡＭ−Ｔ９８サーバーを用いて追加的検索を行った。
【０１１８】
細菌および酵母株
エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ−１Ｂｌｕｅを、全プラスミド構築用の宿主として使用した。ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ノヴァゲン）を、Ｈｉｓ_６標識タンパク質の細菌発現に使用した。サッカロマイシス・セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＥＧＹ４８（ＭＡＴａ、ｈｉｓ３、ｔｒｐ１、ｕｒａ３、ＬｅｘＡ _{ｏｐ （ Ｘ６ ）}−Ｌｅｕ）（クロンテク）を、２ハイブリッド分析用に使用した。ベクターｐＥＴ２０ｂをノヴァゲンから、ｐＬｅｘＡおよびｐＢＤ４２ＡＤをクロンテクから、そしてｐＥＳＣ−ＬＥＵをストラタジーンから入手した。
【０１１９】
タンパク質のクローニングおよび発現
インビトロタンパク質相互作用で使用される様々な発現プラスミドを作製するため、忠実度の高いポリメラーゼのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ）を用いるＰＣＲにより完全長遺伝子を増幅した。プライマーＨｕＰＣＮＡ１およびＨｕＰＣＮＡ２によりラムダＺＡＰ結腸癌ｃＤＮＡライブラリー（ストラタジーン）からヒトＰＣＮＡを増幅した。前述のプライマーおよび他のプライマーの配列を表１４に示す。表では、制限部位（ＮｄｅＩ、ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ）には下線をそして停止コドンには二重下線を付している。
【０１２０】
【表１８】

【０１２１】
【表１９】

【０１２２】
ｐＥＴ−Ｈｐδ、ｐＥＴ−Ｈｐδ’およびｐＥＴ−Ｈｐβを構築するため、我々は、各々Ｈｐδ１およびＨｐδ２、Ｈｐδ’１およびＨｐδ’２、並びにＨｐβ１およびＨｐβ２のプライマー対（表１４）によりテンプレートとしてヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）Ｊ９９ゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲ反応を実施した。プライマーＥｃβ１およびＥｃβ２（表１）により株ＸＬ−１ ＢｌｕｅのゲノムＤＮＡからエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）βを増幅した。生成したＰＣＲフラグメントをＮｄｅＩおよびＮｏｔＩで消化し、Ｔ７プロモーターに基くエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＥＴ２０ｂにおいてクローン化した。ヒトＰＣＮＡ、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）δおよびδ’のオープンリーディングフレームは停止コドンを全く含んでおらず、それらをｐＥＴ２０ｂベクターにおけるＣ−末端Ｈｉｓ_６標識の前に挿入した。プラスミドｐＥＴ−ＨｐβおよびｐＥＴ−Ｅｃβでは、停止コドンをＮｏｔＩ部位の前に挿入したため、天然（非標識）タンパク質が発現された。アプライド・バイオシステムズのシーケンサーを用いて全ての挿入体およびクローニング連結点の配列決定をした。
【０１２３】
インビトロ結合検定法
放射性標識（^３５Ｓ−標識）タンパク質を、製造会社の推奨にしたがいエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔ７ Ｓ３０抽出物（プロメガ）および［^３５Ｓ］メチオニン（アマーシャム・ファーマシア・バイオテク）を用いてインビトロ転写および翻訳により様々なｐＥＴプラスミドから生産した。放射性標識したＨｉｓ_６標識タンパク質（１０〜２０μｌのＳ３０抽出反応物）を、結合緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８）中総量１００μｌでＮｉ−ＮＴＡ樹脂の５０％スラリー５０μｌと４℃で１時間インキュベーションした。Ｎｉ−ＮＴＡビーズを、洗浄緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８）中で２回洗浄し、次いで結合緩衝液ＢＢ１４（２０ｍＭのトリスｐＨ７．５、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、２５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２）に再懸濁し、次いで、［^３５Ｓ］メチオニン標識βとインキュベーションした。ＲＴで１時間インキュベーション後、ビーズをＷＢ３緩衝液（２０ｍＭのトリスｐＨ７．５、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のトウィーン２０）で３回洗浄し、ラエムリ試料緩衝液を加えて１００℃で５分間インキュベーションすることにより、Ｎｉ−ＮＴＡビーズに結合したタンパク質を溶離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動にかけた。バイオマックストランススクリーンおよびバイオマックスＭＳフィルム（コダック）によるオートラジオグラフィーにより放射性標識タンパク質を可視化した。
【０１２４】
酵母２−ハイブリッドシステム
フランキングＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩを伴う遺伝子特異的プライマー（表１４）を用いるＰＣＲにより、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）δ、τおよびδ’遺伝子の完全長ＯＲＦを得た。ＰＣＲフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、ｐＬｅｘＡおよびｐＢ４２ＡＤの両ベクターへクローン化した。ｐＬｅｘＡへのクローニングにより、ＡＤＨプロモーターの下流にある、ＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメインをインフレームで伴うヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）δおよびδ’ＯＲＦが入れられた。ｐＢ４２ＡＤへのクローニングにより、Ｂ４２転写アクチベータードメインおよびＣ−末端血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグをインフレームで伴うヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）δおよびδ’ＯＲＦが入れられた。ＬｅｘＡ−δおよび非融合τタンパク質を同時発現させるため、修飾２−ハイブリッドベクターｐＥＳＣＬｅｘＨｐδ／τを以下の要領で構築した。ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）δＯＲＦに融合したＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインを含むＤＮＡフラグメントを、プライマーＨｙＬｅｘＡおよびＮｏｔＩ部位を含むＨｙδ２を用いてプラスミドｐＬｅｘＡＨｐδからＰＣＲ増幅し、ＮｏｔＩで消化し、酵母二重発現ベクターｐＥＳＣ−ＬＥＵ（ストラタジーン）へ挿入することにより、ｐＥＳＣＬｅｘＡδを得た。最後に、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）τＯＲＦを、プライマーＨｙτ１およびＨｙτ２（表１４）を用いるＰＣＲにより増幅し、ＸｈｏＩで消化し、ＸｈｏＩで消化したｐＥＳＣＬｅｘＡδへクローン化した。生成したプラスミド、ｐＥＳＣＬｅｘＡδ／τは、酵母ＧＡＬ１０プロモーターからのＬｅｘＡδ融合タンパク質およびＧＡＬ１プロモーターからのｃ−ｍｙｃエピトープ標識τを共発現した。
【０１２５】
β−ガラクトシダーゼ
３〜６個の形質転換体を選択培地にパッチし、３０℃で１日間成長させた時点で、それらを接種し、指示通りグルコースまたはガラクトース含有選択培地で中間対数期まで成長させた。酵母β−ガラクトシダーゼキット（ピアス）を用いてβ−ガラクトシダーゼ活性を検定し、ミラー単位で表した。
【０１２６】
共免疫沈降およびウエスタンブロッティング
酵母細胞を、２％Ｄ（＋）ラフィノース含有最少培地５０ｍｌ中で０．７未満のＯＤ_６００に成長させた時点で、２％Ｄ（＋）ガラクトース含有培地に移すことにより、Ｇａｌ１／１０プロモーターを誘導した。タンパク質抽出するため、酵母細胞を１．０のＯＤ_６００（約１×１０^７細胞／ｍｌ）で採取し、遠心分離により集め、２ｍＭのフェニルメチルスルホニル（ｓｕｌｏｎｙｌ）フルオリドおよび完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（ベーリンガー・マンハイム）を含む氷冷溶解緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２５％のグリセリン、１ｍＭのＤＴＴ）に再懸濁した。氷冷ガラスビーズの約１／３体積を加え、細胞を４℃で数回渦巻き状に振り混ぜることにより破壊した。溶解細胞を遠心分離し、ライゼートを新たな管に移した。共免疫沈降させるため、ライゼートを４℃で特異的抗体（抗ＨＡ、ベーリンガー・マンハイムからの１２Ａ５）とインキュベーションした。２時間後、プロテインＡ‐セファロース（アマーシャム・ファーマシア・バイオテク）を加え、混合物を４℃でさらに２時間インキュベーションした。免疫沈降物を、１０ｍＭトリス‐ＨＣｌ、ｐＨ７．０、５０ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのＮａＰＰ、５０ｍＭのＮａＦ、２ｍＭのＥＤＴＡおよび１％のトリトンＸ−１００を含む氷冷洗浄液中で洗浄した。タンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ニトロセルロース膜（バイオ‐ラド）へ移した。膜をＰＢＳＴ（リン酸緩衝食塩水＋０．１％トウィーン２０）中３％のブロットにより１時間遮断し、それに続いて抗ＬｅｘＡポリクローナル抗体または抗ｍｙｃモノクローナル抗体（インビトロゲン）と１時間インキュベーションし、ＰＢＳＴ中で洗浄し、ペルオキシダーゼ‐コンジュゲート二次抗体と１時間インキュベーションした。膜をＰＢＤＴ中で洗浄し、増強した化学発光手段（ピアス）で展開させた後、ハイパーフィルムＥＣＬ（アマーシャム・ファーマシア・バイオテク）に暴露した。
【０１２７】
Ｂ．結果
ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）からのδの推定オーソログをコード化する遺伝子の同定
エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびヘモフィラス・インフルエンゼ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）δアミノ酸配列によるヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）Ｊ９９の翻訳された完全ゲノム配列の初回ＢＬＡＳＴ検索では、顕著なマッチは同定され得なかった。しかしながら、一連のさらに徹底した反復検索後、δの推定オーソログをコード化するタンパク質のファミリーが同定された。完了または実質的完了ゲノム配列をもつ細菌は全て、ファミリーの一員をコード化する単一遺伝子を含んでいたが、このファミリーの構成員の大部分は現時点ではそれら自体認識されていない。完全に配列決定されたゲノムをもつ細菌の範囲に存在するδの提案されたオーソログのアラインメントを図３に示している。図３では、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｅｃ）、リケッチア・プロワツェキイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）（Ｒｐ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）Ｊ９９（Ｈｐ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（Ｍｔ）、バシラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｂｓ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｍｐ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）（Ｂｂ）、トレポネマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）（Ｔｐ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）類（Ｓ）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｃｐ）、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）（Ｄｒ）、テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）（Ｔｍ）およびアキフェクス・エオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）（Ａａ）からのδオーソログの提案された縮重ＡＡＡ＋ドメインのアミノ酸配列が示されている。カッコ内の数は、アラインメントから欠けているアミノ酸の数である。エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）δ’の実験的に決定された二次構造（Ｇｕｅｎｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９７）９１：３３５−３４５）が、ＰＳＩＰＲＥＤ、ｓ−シートおよびｈ−ヘリックスを用いて決定されたエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）δの推定二次構造と一緒に示されている。このファミリーの構成員はアミノ酸配列の保存性が非常に乏しく、１００％保存されているアミノ酸は皆無である。高度保存位置は、タンパク質のアミノ末端の近位に位置するグリシンおよびフェニルアラニンおよびカルボキシ末端の近位に位置するアスパラギンまたはグルタミン酸およびリシンである（図３）。δ’およびγ／τファミリーとは異なり、同類置換を伴う部位は、タンパク質全長にわたってかなり良好に分布している。クランプローダーのかかる重要成分における全体的に低レベルの保存性は、明らかに酵素活性が存在しないためと思われ、δサブユニットは主としてタンパク質‐タンパク質相互作用に関与する。
【０１２８】
提案されたヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）δオーソログは、遺伝子ｊｈｐ１１６８によりコード化される。予測されるタンパク質は、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）δとの低いアミノ酸同一性を呈した。
【０１２９】
Ｈｉｓ_６標識ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）δはβに結合し得る
ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）における推定δオーソログの同定を確認するため、我々は、まずインビトロ生化学検定法を用いてヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）δおよび提案されたβ間の相互作用を調べた。様々なヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）タンパク質δ、δ’、βおよびヒトＰＣＮＡ（ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのβサブユニットの真核生物に相当するもの）、およびエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのβを、ｐＥＴプラスミドを用いてエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させた。δ‐β相互作用を立証するため、我々は、Ｎｉ−ＮＴＡビーズに固定されたタンパク質の一つとのタンパク質相互作用検定法を使用した。エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔ７ Ｓ３０抽出物を用いてｐＥＴプラスミドからタンパク質をインビトロで合成し、^３５Ｓ−メチオニンで標識した（図４）。図４Ａでは、様々なｐＥＴプラスミドからエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔ７ Ｓ３０抽出物を用いるインビトロ転写−翻訳によりタンパク質を合成した。［^３５Ｓ］Ｍｅｔの存在下での並行反応により翻訳効率を評価した。反応混合物のアリコート（５μｌ）を１０％ＳＤＳ／ＰＡＧＥでサイズ分画した。ホスファーイメージャーを用いることにより、合成されたタンパク質の量を定量し、等量を結合実験で使用した。図４Ｂでは、^３５Ｓ−標識Ｈｉｓ_６標識ヒトＰＣＮＡ（レーン３および４）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）δ（レーン５および６）、およびδ’（レーン７および８）（５〜１５μｌの反応混合物）を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズに固定した。ビーズを洗浄し、^３５Ｓ−標識ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）βまたはエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）βタンパク質を含むＳ３０抽出反応混合物１０μｌとインキュベーションした。樹脂に会合したタンパク質を１０％ゲルでのＳＤＳ／ＰＡＧＥ、次いでオートラジオグラフィーにより検出した。レーン１および２は、プラスミドテンプレートを欠く反応混合物を用いてＮｉ−ＮＴＡ樹脂と結合させた対照である。ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）βの位置は矢印で示されている。^３５Ｓ標識およびＨｉｓ_６標識タンパク質を各々別々に、それらのＨｉｓ_６タグを介してＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズに固定した。固定されたＳ３０抽出物または各Ｈｉｓ_６融合タンパク質を担うＮｉ−ＮＴＡビーズを洗浄し、^３５Ｓ−標識βタンパク質とインキュベーションした。洗浄後、ビーズに結合した^３５Ｓ−標識タンパク質を溶離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いでオートラジオグラフィーを用いて分析した。典型的な結果は、図４に示されており、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）βのみＨｉｓ_６δに結合したことを示している。結合は特異的であり、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）βはδ’またはヒトＰＣＮＡに結合しなかった。さらに、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）βはヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）Ｈｉｓ_６−δに結合しなかったため相互作用は種特異的である。
【０１３０】
δおよびδ’はτの存在下で相互作用する
次に、我々は、酵母２−ハイブリッドシステムを用いて複合体形成におけるヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）クランプローディングタンパク質間における会合を試験した。３種のヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）クランプローディングタンパク質（δ、δ’およびτ）の各々は、ＤＮＡ結合タンパク質、ＬｅｘＡ、またはＢ４２の転写活性化ドメインとの融合体として発現された。β‐ガラクトシダーゼ活性は、２タイプの融合タンパク質を発現する二重形質転換酵母細胞において相互作用を全く示さないかまたは弱い相互作用しか示さなかった（図５）。図５では、ＥＧＹ４０［ｐ８ｏｐ−ｌａｃＺ］を、ＬｅＸＡ−δおよびＢ４２−δ’およびτを発現するプラスミドにより形質転換した。２％ガラクトース中で成長させた細胞からタンパク質抽出物を調製することにより、遺伝子発現を誘導した。免疫沈降は、抗ＨＡ（１２Ａ５）抗体により行なわれた。細胞ライゼートおよび免疫沈降物（ＩＰ）を、ポリクローナル抗ＬｅｘＡ抗体により免疫ブロットしたもの（Ａ）；抗ｍｙｃ抗体により免疫ブロットしたもの（Ｂ）で分析した。ＬｅｘＡ−δ（予測される分子量６５ｋＤａ）およびτ（予測される分子量７０ｋＤａ）の位置を矢印で示す。２−ハイブリッドシステムは２種の充分に特定されたタンパク質間における相互作用を検出し得るが、この方法はさらに大型のタンパク質複合体、例えば本明細書で試験されているクランプローダーの一部であるタンパク質間の相互作用については検出し得ないものと我々は推論した。これは、多タンパク質複合体の２構成員間に存する相互作用が弱いことに起因し得る。したがって、我々は、τの存在がδおよびδ’相互作用を高めるか否かという問いを発した。これを酵母細胞で試験するため、我々は、τを発現する第三のプラスミドをシステムへ導入した。ＬｅｘＡ−δ、Ｂ４２−δ’および非融合τを同時発現する形質転換体は、ＬｅｘＡ−δおよびＢ４２−δ’を生産するものより顕著に高いβ‐ガラクトシダーゼ活性を呈した（図６）。図６では、プラスミドを様々な組み合わせでＥＧＹ［ｐ８ｏｐ−ｌａｃＺ］へ形質転換し、β‐ガラクトシダーゼ活性について検定し、ミラー単位で表した。ＬｅｘＡ−δ、非融合Ｂ４２およびτを生産する陰性対照形質転換体は、β‐ガラクトシダーゼ活性を示さなかった（結果は示さず）。２種のタンパク質ＬｅｘＡ−δおよびτが同じベクター（ｐＥＳＣＬｅｘＡＨｐδ／τ）から発現されるときも同様の結果が得られた。また我々は、抗ＨＡおよび抗ＬｅｘＡ抗血清を用いるウエスタンブロットにより評価したところ、蓄積されたＬｅｘＡ−δおよびＢ４２−δ’ハイブリッドタンパク質の量が、δδ’τ‐発現性酵母細胞およびδδ’−発現性酵母細胞の両方で変化していないことを確認した（結果は示さず）。すなわち、τの存在は、ＬｅｘＡ−δおよびＢ４２−δ’タンパク質の安定性の発現レベルに影響しないと思われる。結果は、δおよびδ’がτの存在下で相互作用し得ることを示す。
【０１３１】
クランプローダー（δδ’τ）複合体の形成
これらを考え合わせると、我々の結果は、再構成されたアクチベーターＬｅｘＡ／Ｂ４２によるリポーター遺伝子転写の活性化により、ＬｅｘＡ−δ‐Ｂ４２−δ’タンパク質複合体が形成され、これがクランプローダー複合体における第三のパートナー、τにより促進されることを立証している。上記タンパク質複合体は、Ｂ４２−δ’ハイブリッドタンパク質のＨＡエピトープに指向した抗体を用いた全二重形質転換酵母細胞抽出物からの免疫沈降により可視化され得る。抗ＨＡ抗体（１２Ａ５）を用いることにより、我々は、酵母全細胞抽出物からＬｅｘＡ−δだけでなくτも免疫沈降させることができた（図５）。
【０１３２】
実施例４
この実施例において、我々は、δタンパク質とβの相互作用に関与するδペプチドモチーフを同定する。
【０１３３】
Ａ．方法
δファミリーのアミノ酸配列の分析
予測される二次構造を、ＰＳＩＰＲＥＤおよびＧｅｎＴｈｒＥＡＤＥＲサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｉｎｓｕｌｉｎ．ｂｒｕｎｅｌ．ａｃ．ｕｋ／ｐｓｉｐｒｅｄ）およびＪｐｒｅｄサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｊｕｒａ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ：８８８８／ｓｕｂｍｉｔ．ｈｔｍｌ）を用いて決定した。３Ｄ ＰＳＳＭサーバーｖ２．５．１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｍｍ．ｉｃｎｅｔ．ｕｋ／〜３ｄｐｓｓｍ）を用いてタンパク質フォールド予測を実施した。β’構造に基くδタンパク質構造のモデル化を、ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｓｗｓｓｍｏｄ／ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ．ｈｔｍｌ）を用いて実施し、ＳｗｉｓｓＰｄｂＶｉｅｗｅｒを用いて考察した。
【０１３４】
プラスミドの発現の構築および突然変異誘発
Ｎ−末端Ｈｉｓ_６−標識を伴うエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）δを発現するプラスミドを、ｐＥＴ２０ｂ（ノヴァゲン）で構築した。製造会社の使用説明書にしたがい部位特異的突然変異誘発法（Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発キット、ストラタジーン）を用いてＨｉｓ_６−δのＬＦ〜ＡＡ突然変異を導入した。使用した突然変異誘発性プライマーは、次の通りであった：
５’−ＧＣＣＡＧＧＣＴＡＴＧＡＧＴＧＣＧＧＣＴＧＣＣＡＧＴＣＧＡＣＡＡＡＣ−３’ （配列番号６２０）、および
５’−ＧＴＴＴＧＴＣＧＡＣＴＧＧＣＡＧＣＣＧＣＡＣＴＣＡＴＡＧＣＣＴＧＧＣ−３’ （配列番号６２１）。
【０１３５】
Ｎｉ−ＮＴＡ共固定化検定法
インビトロＨｉｓ_６標識δタンパク質を、４℃で１時間結合緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８）２００μｌ中のＮｉ−ＮＴＡ樹脂に結合させた。次いで、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を、洗浄緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾールｐＨ８）により３回洗浄した。インビトロ転写‐翻訳［^３５Ｓ］標識βタンパク質を、ＢＢ１４相互作用緩衝液（２０ｍＭのトリスｐＨ７．５、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、２５ｍＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭのＭｇＣｌ_２）中のＮｉ−ＮＴＡ樹脂に加え、１時間室温で結合させた。次いで、樹脂をＷＢ３緩衝液（２０ｍＭのトリスｐＨ７．５、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のトウィーン２０）により３回洗浄した。結合タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元性試料緩衝液中５分間１００℃で樹脂を加熱することにより溶離させた。［^３５Ｓ］標識タンパク質をオートラジオグラフィーにより可視化した。
【０１３６】
Ｂ．結果
δファミリータンパク質のドメイン構成
データベースのＰＳＩ ＢＬＡＳＴ検索中、細菌性γ／τおよび古細菌および真核生物クランプローダータンパク質（ＲＦＣサブユニット）および細菌性ＤｎａＡタンパク質によるかなりの数の境界有意ヒットが、ＡＡＡ＋ドメインを含むこれらのタンパク質の領域において記録された。ＡＡＡ＋ドメインは、ＡＴＰ−結合に関与しており、またそれを含むタンパク質の非常に大きなファミリーの多くの構成員のサブユニットオリゴマー化に関与することが提案されている（Ｎｅｕｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９９）９：２７−４３）。これらのタンパク質の多くは、タンパク質複合体の組立、作用および分解と関連している（Ｎｅｕｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。クランプローダーにおけるδの役割を仮定して、これらの類似性をさらに詳細に調べた。ＰＳＩ ＢＬＡＳＴおよびＨＭＭ検索から作製されたアラインメントおよび残基の保存性の性質に基き、代表的δ配列をエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）δ’およびγ／τのＡＡＡ＋ドメイン領域と整列させた（図３）。２つの異なる方法により予測されるエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）δの二次構造は、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）δ’の実験的に決定された二次構造特性と充分に一致している（図３）。さらに、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびアキフェクス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）δ配列による３Ｄ−ｐｓｓｍフォールド予測サーバーを用いるフォールド予測検索により、それぞれ０．１３、８．０１ｅ〜０７、５．１５ｅ〜０６の確率でエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）δ’構造フォールドとのマッチが同定され、δのアミノ末端領域がＡＡＡ＋ドメインへ折りたたまれているという提案がさらに裏付けられた。ＡＡＡ＋ファミリードメインにおいて最も保存されている残基は、アデノシントリホスファターゼ活性に関与するものである。δ’と同様δはアデノシントリホスファターゼ活性をもたないため、これらの残基が保存されるとは予測されない。むしろ、ドメインの二次および三次構造に寄与する残基の保存が予測される。良好な保存はδ’構造のコア残基について見られる。
【０１３７】
徹底的な検索にもかかわらず、δオーソログおよび真正細菌からの他のクランプローディングタンパク質のカルボキシ‐末端領域間において、または真核生物、古細菌およびバクテリオファージからのクランプローディングタンパク質と、またはジェンバンクでの非重複タンパク質データベースにおける他のタンパク質との顕著な関係は認められなかった。
【０１３８】
δにおけるβ結合部位の同定
δにおいて最も保存された残基の位置をδの我々の構造モデルでマップ化したとき、他の場所ではなく、ウォーカーＢボックスに先行するボックスＩＶ’の後半に位置する（図３）、δファミリーで保存されたフェニルアラニンが同定された。それは、おそらくサブユニット間相互作用とは独立して、δの領域にある表面ループで暴露される形で位置していた（図７）。他の保存アミノ酸は、δ、γ／τまたは別のクランプローダーで保存された領域にあった（図３）。保存フェニルアラニンは、緩い共通配列ｓＬＦ［ＡＧ］（ここで、ｓは小アミノ酸である）（表１５）を伴う領域の一部であって、ＤＮＡへのβのローディング中におけるβへのδの結合におけるある役割についての優れた候補である。
【０１３９】
【表２０】

【０１４０】
【表２１】

【０１４１】
【表２２】

【０１４２】
【表２３】

【０１４３】
提案されたＬＦペプチドモチーフがβ結合部位の一部を構成するか否かを測定するため、ＬＦをＡＡ（２アラニン）と置換することにより突然変異体δを作製した。ＡＡ突然変異体タンパク質をＮｉ−ＮＴＡ共固定化検定法で使用したとき、それはβには結合しなかった（図８）。図８では、インビトロ転写および翻訳βタンパク質の５〜１５μｌのアリコートを、固定化Ｈｉｓ_６−標識野生型δまたは突然変異体δ（δＡＡ）に結合させた。結合したタンパク質を溶離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに適用した。５μｌの投入タンパク質が図に示されている。エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、δ‐β相互作用は、ＬＦからＡＡへの改変により明らかに破壊されたことから、βとの相互作用に関するこのモチーフの重要性をさらに立証していた（図８）。
【０１４４】
実施例５
この実施例において、我々は真正細菌βタンパク質への上記実施例で同定および特性検定されたペプチドモチーフの結合についてのモデルを示す。
【０１４５】
Ａ．方法
ＲＣＳＢタンパク質データバンク（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）からのＰＤＢ座標ファイル１ＡＸＣからのＰＣＮＡのサブユニットおよびＰＤＢ座標ファイル２ＰＯＬからのβのサブユニットの３Ｄ構造を、ディープ・ヴィユー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｓｐｄｂｖ／ｍａｉｎｐａｇｅ．ｈｔ．）を用いて重ね合わせた。次いで、ＰＣＮＡの選択されたサブユニットへ結合するｐ２１ペプチドの座標を、βの座標と合併させることにより、βのサブユニットおよびｐ２１ペプチドの座標を含む座標ファイルを作製した。ｐ２１ペプチドのアミノ酸１４４〜１４８の座標は保持されており、残りは除去されていた。残存している５個のアミノ酸を突然変異させることにより、ペプチドＱＬＳＬＦ（配列番号６２２）を得、座標をリセーブした。これらの座標は、インサイトＩＩパッケージ（アクセルリス）においてフレキシブルドッキングモードを用いる６０のエネルギー最小化ランについての出発点であった。最終最小化構造を比較し、出発構造と類似した場所にアミノ末端グルタミンの位置を有する５つの最低エネルギー構造をさらなる分析用に選択した。
【０１４６】
Ｂ．結果
βへのＱＬＳＬＦペプチドの結合モデル化
エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）βのカルボキシ末端における突然変異は、βへのδの結合を低減化させることが示された（Ｎａｋｔｉｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９６）８４：１３７−１４５）。保存されたβ結合モチーフの性質は、β結合性ペプチドおよびβ間の主たる相互作用が本質的に疎水性であることを立証していた。βの構造を決定し、コード２ＰＯＬによりタンパク質データベースに寄託した（Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９２）６９：４２５−４３７）。カルボキシ末端付近におけるβの表面領域を疎水性域について分析した。かかるポケットが２つ同定された。真正細菌βタンパク質の利用可能配列の全てにおいて２つのポケットに寄与しているアミノ酸を表１６に列挙する。
【０１４７】
【表２４】

【０１４８】
【表２５】

【０１４９】
この領域へのＱＬＳＬＦ（配列番号６２２）共通ペプチドのモデル化は、これらのアミノ酸が、βへのβ結合性ペプチドの結合性に寄与していると思われることを示した。したがって、これらのアミノ酸は、β結合性ペプチドと相互作用するβの表面のその部分を構成する。
【０１５０】
実施例６
βタンパク質結合性モチーフの若干のペプチド類似体を、βへのレプリソームタンパク質αおよびδの結合に対するそれらの阻害能力について試験した。これらの実験結果を以下に示す。
【０１５１】
Ａ．方法
プレート阻害検定法
組換え手法により発現された野生型エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）αサブユニットを精製し、１００ｍＭのＮａ_２ＣＯ_３、ｐＨ９．５中２０μｇ／ｍｌで９６ウェルマイクロタイタープレート（ファルコン可撓性プレート、ベクトン・ディッキンソン）へコーティングした（５０μｌ／ウェル、４℃、一晩または２時間、ＲＴ（ＲＴ））。プレートをＷＢ３（２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖトウィーン２０含有）で洗浄した。この緩衝液を、検定全体を通じ全洗浄工程で使用した。次いで、プレートを必要時まで「ブロット」（ＷＢ３中５％の脱脂粉乳、１００μｌ／ウェル、ＲＴ）で遮断した。使用直前プレートを洗浄した。
【０１５２】
精製合成ペプチドおよびβサブユニットを、ＢＢ１４（２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）で希釈した。９．３〜３００および１０００μｇ／ｍｌの濃度を有する精製合成ペプチドを、「ブロット（ｂｌｏｔｔｏ）」で前処理しておいた９６ウェルマイクロタイタープレート（サーステッド、アデレード、オーストラリア）において精製野生型βサブユニット（５μｇ／ｍｌ）と複合体を形成させた（３０分、ＲＴ）。反応量は１２０μｌであった。またβサブユニットを、ＢＢ１４中ペプチドの不存在下または７６．５μｇ／ｍｌのαサブユニットの存在下でインキュベーションした。全試料を１時間インキュベーション（ＲＴ）した。２つの５０μｌ試料を、各ウェルから洗浄および「阻止」αサブユニットコーティングプレートの対応するウェルに移し、さらに３０分間インキュベーションした（ＲＴ）。
【０１５３】
プレートを洗浄し、βサブユニットに対して産生したウサギ血清により処理した。抗血清を、１０％「ブロット」含有ＷＢ３中で１：１０００に希釈し、５０μｌ／ウェルで分配し、１２分間インキュベーションした（ＲＴ）。プレートを再び洗浄し、１０％「ブロット」含有ＷＢ中で１：１０００希釈したヒツジ抗ウサギＩｇ−ＨＲＰコンジュゲート（サイレナス、メルボルン、オーストラリア）で処理した（５０μｌ／ウェル）。プレートを１２分間インキュベーションした（ＲＴ）。最終洗浄工程後、１ｍＭの２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）を加えた（１１０μｌ／ウェル）。色の展開を、プレート読取り装置（マルチスカン・アセント、ラブシステムズ、スウェーデン）を用いて４０５ｎｍで評価した。
【０１５４】
δ‐βプレート結合検定も同様の方法にしたがうが、以下の変化を伴った。すなわち、精製野生型エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）δサブユニットを、５μｇ／ｍｌでプレートにコーティングした。同濃度の合成ペプチドを１μｇ／ｍｌでのβサブユニットとプレインキュベーションした。そして前形成ペプチド複合体をδサブユニットコーティングプレートに移し、１０分間だけインキュベーションした。
【０１５５】
Ｂ．結果
ＤｎａＥにおけるＱｘＳＬＦモチーフを含むアミノ酸配列に基いた配列を有する幾つかの９アミノ酸ペプチドを合成し、精製した。ペプチドおよびそれらの配列を表１７に列挙する。
【０１５６】
【表２６】

^ａ−阻害無し、^ｂ−行なわれず
【０１５７】
５つのノナペプチドである、ＤｎａＥ、およびペプチド１、２、１３および１４は、βへのαの結合の顕著な阻害をもたらした（表１７）。配列関連ノナペプチド３〜１２は、α：β結合の阻害を全く誘発しなかった。ペプチド１、１３、１４およびＤｎａＥはまた、βへのδの結合を阻害した（表１７）。他のノナペプチドはどれもβ結合をあまり阻害しなかった。
【０１５８】
ペプチド検定法
我々は、９アミノ酸の特異的ペプチドがβに結合し、βへのαおよびδ両方の結合を阻止し得ることを立証することにより、βとの相互作用に必要とされる残基の範囲が限られていることを確認した。これらの結果はまた、検定されている相互作用が細胞での相互作用と同一ではないにしても類似していると思われるさらなる証拠を提供することにより、βへのαおよび／またはδの結合に干渉する化合物についてのスクリーニングで使用される検定法を実証している。
【０１５９】
実施例７
α：βおよびδ：βタンパク質−タンパク質相互作用のトリペプチド阻害剤の設計
β結合性ペプチドおよびβを含むタンパク質間における相互作用のさらに小型の阻害剤を設計するため、β結合性ペプチドの配列における変異および結合阻害検定データを詳細に調べた。観察された最高レベルの保存性は、１、４および５位におけるアミノ酸についてのものであった（図９）。
【０１６０】
７０％を越えるペプチド配列（δを除く）が、４位にロイシンおよび５位にフェニルアラニンを含んでいた。ＬＦモチーフの高レベルの保存は、これらのアミノ酸が、β結合性タンパク質およびβ間の相互作用の主たる決定因子であることを示していた。突然変異誘発およびペプチド阻害実験により、ＬＦモチーフの重要性が確認され、そのコンセンサス、位置５＝４＞１＞３＞２を確認する次の重要性を伴う。しかしながら、２および３位は、βとペプチドの相互作用を変調する。２位のアラニンをロイシンにより置換してペプチド２を生成すると、競合性が実質的に改善され、３位のアスパラギン酸をセリンにより置換してペプチド２を生成すると、ペプチドの競合性が実質的に減少した。これらの結果は、トリペプチドＤＬＦが、βへのαおよびδの結合を阻害するが、トリペプチドＱＬＤは、有利なアミノ酸を含むにもかかわらず、結合を阻害しないと思われることを予測するものであった。２つのポリペプチドＱＬＤおよびＤＬＦを合成および精製した。予測通り、ＤＬＦは、α：β結合を阻害し（表１７）、約１３５μｇ／ｍｌで５０％阻害を示し、同じくδ：β結合阻害については、約１２００μｇ／ｍｌで５０％阻害を示した。
【０１６１】
これらの観察結果は、バックボーン領域に追加的置換を伴うジペプチドＬＦおよび／またはその変異体（例えば、ＭＦおよびＤＬＦ）が、β結合性タンパク質およびβ間の相互作用を破壊し得る他の化合物の設計に用いられるリード化合物であることを示している。
【０１６２】
実施例８
この実施例では、我々は、トリペプチドＤＬＦという、α：βおよびδ：β相互作用のインビトロ阻害剤がバシラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の成長を阻害することを立証する。
【０１６３】
Ａ．方法
バシラス・ズブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＩＨ６１４０を、新しいプレートから５ｍｌのオキソイド・ミュラー‐ヒントンブロス（オキソイドコードＣＭ４０５オキソイド・マニュアル第７版１９９５、２−１６１頁）を含む１０ｍｌ管へ継代培養した。この培養物を３７℃で２１時間、１２０ｒｐｍで振とうし、次いで規定食塩水中で０．５マクファーランド標準に希釈した（希釈抗菌剤感受性試験についてのＮＣＣＬＳパフォーマンス標準Ｍ７−Ａ４、９７年１月）。この懸濁液をさらに規定食塩水中で１：５に希釈することにより細菌スターター培養物を生成した。ペプチドを、平底９６ウェルプレート（ヌンクロン表面、滅菌、ナルジェ・ヌンク・インターナショナル）において１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で試験した。１００μｇの二倍強度ミュラー‐ヒントンブロス、適量のペプチドを用い、１９０μｌの最終容量にすることにより、ウェルを調製した。次いで、ウェルに１０μｌのスターター培養物を接種した。
【０１６４】
プレートを透明なプレート粘着性シール（アブジーン・ハウス）により密閉した。次いで、それをラブシステムズ・マルチスカン・アセント分光光度計に置いた。プレートを、１０秒おきに１２０ｒｐｍで振とうしながら３７℃でインキュベーションした。６２０ｎｍでの吸光度を、１６時間３０分ごとに測定した。
【０１６５】
Ｂ．結果
トリペプチドＤＬＦは、主として直線的増殖期を増やすことにより、そしてそれに続く対数期中における成長速度を減らすことにより、バシラス・ズブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の成長を顕著に阻害する（図１０）。図１０では、バシラス・サチラス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の成長に対するトリペプチドの効果を、インキュベーション時間に対するＯＤ_６２０としてグラフ化している。対照的に、トリペプチドＱＬＤは、βとαおよびδの相互作用を阻害せず、直線的増殖期を増加させなかったが、対数期中における成長速度を低減化させた（図１０および表１８参照）。
【０１６６】
【表２７】

【０１６７】
実施例９
この実施例では、我々は、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）により、βタンパク質へのペプチドの結合性を直接立証する。
【０１６８】
Ａ．方法
表面プラスモン共鳴
逆相ＨＰＬＣ精製ペプチド（１０μｇ）を、回転させながら一晩（ＲＴ）７５ｍＭのホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５）中の１ｍｇのビオチンリンカー（６−（６−（（ビオチニル）アミノ）（ヘキサノイル）アミノ）ヘキサン酸）スルホスクシンイミジルエステル（モレキュラー・プローブス、ユージーン、オレゴン）（２０ｍｇ／ｍｌ、ＤＭＳＯ中）と反応させた。ブラウンリーＣ１８カートリッジ（アプライド・バイオシステムズ・インコーポレイテッド、フォスターシティー、カリフォルニア）およびＨＰＬＣにより４０分間にわたって０．５ｍｌ／分で送達させる０．１％ＴＦＡ中６〜６５％アセトニトリルの勾配（島津、日本）を用いて、反応混合物を分離させた。ビオチンリンカーおよび遊離ペプチドより後に溶離したビオチニル化ペプチドを集め、真空乾燥し、次いで水に溶かした。ストレプトアビジン誘導体化フローセル表面を用いるビアコア２０００（ビアコア）においてＳＰＲを行った。全βサブユニットおよび遊離ペプチド溶液を、１５０ｍＭのＮａＣｌと共にＢＢ１４中で調製した。
【０１６９】
ＫＤ試験のため、０．５μＭのβサブユニットとの相互作用により５０〜１００ＲＵの応答が発生するように、ビオチニル化ペプチドをフローセル表面へローディングした。注入完了時、ＲＵ値は、１０および５０μｌ／分の流速で急速にベースラインへ戻ったため、再生緩衝液は必要とされなかった。フローセル表面に結合した各ビオチニル化ペプチドについて１０ｎＭ〜５ｎＭ（二反復で）にわたる１５の異なる濃度のβサブユニットについての定常状態で得られたＲＵ値を用いて、解離速度（ＫＤ）を測定した。データを、バイオエヴァルエーションソフトウェア（ビアコア）により１：１ラングミュアーモデルに当てはめた。
【０１７０】
液中親和力分析のため、フローセル表面における高いローディングのビオチニル化ペプチド、従って高いＲＵ（７００〜１０００）を確立した。ペプチド４でのローディングにより、陰性対照表面を生成した。このペプチドはβサブユニットと相互作用せず、βサブユニットの溶液との相互作用に関するＲＵ値が得られないため、フローセル表面には、他のビオチニル化ペプチドについて必要とされる最大値として同モル量のビオチニル化ペプチド４をローディングした。全データ操作において、この表面のＲＵ値を試験表面のＲＵ値から控除した。１０〜１００ｎＭにわたるβサブユニットの異なる濃度で得られたＲＵ値の標準曲線を、フローセル表面に結合した各ビオチニル化ペプチドについて展開させた。遊離ペプチドの阻害効果を測定するため、１００ｎＭのβサブユニットを、５分間異なる濃度の遊離ペプチド（１０ｎＭ〜４．５μＭ、二反復で）とプレインキュベーションすることによりβサブユニットおよびペプチドの複合体を形成させ、次いでこれをフローセル表面へ通した。残存する遊離非複合体形成βの量を標準曲線から測定した。非複合体形成（遊離）βサブユニットの濃度の対数を、阻害ペプチドの濃度対数に対してプロットした。これらのプロットから、この場合は５０ｎＭのβサブユニットを複合体にするのに要求されるペプチドの濃度である、ＩＣ_５０値を測定した。
【０１７１】
Ｂ．結果
結合曲線は急速なオフおよびオン速度を呈し、後者は速すぎてＳＰＲにより測定できなかった。データを１：１ラングミュアーモデルに当てはめることにより、ＫＤを測定した（表１９）。先の結合実験から予測される通り、ＤｎａＥペプチドは最高ＫＤ、２．７μＭに戻り、ペプチド１は最低ＫＤ、５００ｎＭに戻った。ペプチド１３および１４は、非常に類似した値、それぞれ７７８および８００ｎＭを与えた。
【０１７２】
ペプチドをさらに区別するため、ペプチド１、４、１３および１４のＩＣ_５０値を、液中親和力分析によりフローセル表面に結合したビオチニル化ペプチド１、４および１４と競合させて測定した。ペプチド４表面を陰性対照として使用した。フローセル表面に結合したビオチニル化ペプチド１および１４に対して競合する各ペプチドについてのＩＣ_５０値を表１９に列挙する。
【０１７３】
【表２８】

【０１７４】
表１９に示された結果は、ペプチド１３および１４が、ペプチド１よりも液中のβサブユニットについて優れた競合相手であること、およびペプチド１４はペプチド１３より僅かに優れていることを示している。
【０１７５】
実施例１０
この実施例では、我々は、ペプチドの構造を改変し、βへのαの結合阻害について検定することにより、ペプチドの修飾により活性が改変されない場合もあることを立証する。
【０１７６】
Ａ．方法
修飾アミノおよびカルボキシ末端をもつペプチドを合成し、βとαの相互作用を阻害するその能力について検定した。実施例６の記載と同様にペプチドを合成し、検定した。
【０１７７】
Ｂ．結果
表２０に示された結果は、ＤＬＦのアミノ末端のアセチル化およびカルボキシ末端のアミド化が、βへのαの結合阻害能力にあまり影響を及ぼさなかったことを示している（ペプチド１６および１８についての結果を比較）。
【０１７８】
【表２９】

【０１７９】
実施例１１
この実施例では、我々は、実施例５で誘導された、βに結合したＱＬＳＬＦ（配列番号６２２）のモデル化された構造、および化学物質ライブラリーの仮想スクリーニングについての基礎として実施例６からの実験結果を使用する。本実施例は、バイオインフォマティックスおよび実験分析から誘導された配列情報に基づいたβ結合性ペプチドの構成要素のミメティックの同定方法を立証している。
【０１８０】
Ａ．方法
ＱＬＳＬＦ（配列番号６２２）の構造およびモデル化の結果から引き出された下部構造ＳＬＦおよびＬＦを用い、「単純スクリーン試験」および類似性検索の様々なレベルの「タニモトインデックス」オプションを用いてＮＣＩ（ナショナル・キャンサー・インスティテュート）化合物データベース（ｈｔｔｐ：／／１２９．４３．２７．１４０／ｎｃｉｄｂ２／）を検索した。さらに、次のサイト：
ディープ・ヴィユー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｓｐｄｂｖ／ｍａｉｎｐａｇｅ．ｈｔｍ）。
を用いてＱＬＳＬＦ（配列番号６２２）におけるＳからＤへの突然変異誘発により生成されたＤＬＦも使用した。
【０１８１】
Ｂ．結果
若干の化合物がこれらのスクリーンの各々から同定された。代表的化合物は、下記実施例１３および１４で示された表に含まれている。
【０１８２】
実施例１２
この実施例では、我々は、実施例１で誘導された、β結合性ペプチドの共通配列、および化学物質ライブラリーの仮想スクリーニングについての基礎として実施例６からの実験結果を使用した。本実施例は、バイオインフォマティックスおよび実験分析から誘導された配列情報に基づいたβ結合性ペプチドの構成要素のミメティックの第二同定方法を立証している。
【０１８３】
Ａ．方法
配列ＳＬＦおよびＤＬＦを用いることにより、測定された３Ｄ構造をもつタンパク質におけるこれらの配列の出現についてＰＤＢデータベースを検索した。下部構造をファイルから除去し、重ね合わせることにより、ケミインフォマティックスプログラム（トリポス・インコーポレイテッド）のトリポス総合ソフトウェアのコンポーネントを用いてＳＬＦおよびＤＬＦの薬理作用団モデルを作製した。次いで、薬理作用団モデルを用いて、化合物のＮＣＩおよびＣＭＳ（ＣＳＩＲＯモレキュラー・サイエンス）ライブラリーを検索した。
【０１８４】
Ｂ．結果
先行実施例の場合と同様、若干の化合物がこれらのスクリーンの各々から同定された。代表的化合物は、下記実施例１３および１４で示された表に含まれている。
【０１８５】
実施例１３
この実施例では、我々は、βとαおよびδの相互作用の阻害能力について実施例１１および１２で同定された若干の化学的化合物の試験結果を示し、β結合性ペプチドの構成成分の化学的ミメティックの中には相互作用を阻害するものもあることを立証する。
【０１８６】
Ａ．方法
高い類似性スコアを有するか、若干の異なる方法を用いた検索の結果の共通部分にあり、ＮＣＩまたはＣＭＳライブラリーから入手できる化合物を得、実施例６と同様にスクリーニングにかけた。α：β検定法におけるＣＭＳ化合物については、緩衝液ＢＢ３７を緩衝液ＢＢ１４の代わりに使用した。緩衝液ＢＢ３７は、ＢＢ１４で使用されている１０ｍＭのＭｇＣｌ_２の代わりに１０ｍＭのＭｎＣｌ_２を含む。緩衝液の条件を変えることにより、α：β結合検定法の再現性および感受性が改善された。
【０１８７】
Ｂ．結果
１１のＮＣＩ化合物および２０のＣＭＳ化合物を、βとαおよびδの相互作用の阻害能力についてスクリーニングにかけた。２結合検定法のいずれかの顕著な阻害性をもつ３種の化合物が同定された。それらの化合物の一つ、１３１１２３は、βとαの相互作用を顕著に阻害し、そして後の二つ、３３８５０およびＡＯＣ−０７８７７はβとδの相互作用を顕著に阻害した（下記表２１参照）。すなわち、β結合性ペプチドの構成成分の化学的ミメティックは、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）βへのエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）αおよびδの結合を阻害し得る。これらの化合物は以下の特徴を有する：
１３１１２３ ３３８５００ ＡＯＣ−０７８７７
【０１８８】
【表３０】

【０１８９】
【表３１】

【０１９０】
実施例１４
この実施例では、我々は、細菌増殖を阻害する能力に関するβ結合性ペプチドの構成成分の実施例１１および１２で同定された若干の化学的ミメティックのスクリーニングを説明する。
【０１９１】
Ａ．方法
高い類似性スコアを有するか、若干の異なる方法を用いた検索の結果の共通部分にあり、ＮＣＩまたはモレキュラー・サイエンスライブラリーから入手できる化合物を得、以下の要領にしたがいエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ３５２１８、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＡＴＣＣ１３８８５、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＡＴＣＣ２７８５３、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ２５９２３およびエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）ＡＴＣＣ３３１８６の増殖阻害についてスクリーニングした。化合物を９６ウェルトレイフォーマットにおいて１ｍｇ／ｍｌのＤＭＳＯに溶かして準備した。８５μｌの滅菌水、および１００μｌの２ｘミュラー・ヒントンブロスを加えることにより、６つの対応するスレーブプレートを調製した。マスタープレートからの溶解化合物（５μｌ）を、スレーブプレートの対応するウェルに加え、５０μｇ／ｍｌの最終濃度とした。
【０１９２】
次いで、プレートを、選択された細菌株を接種するためＰＣ２ラボラトリーに移した。株を新たに成長させ、規定食塩水中で０．５マクファーランド標準（希釈抗菌感受性試験についてのＮＣＣＬＳパフォーマンス標準Ｍ７−Ａ４、９７年１月）に希釈した。この溶液をさらに規定食塩水中で１：１０に希釈して、細菌接種培養物を形成させた。１０μｌを用いて各ウェルに接種した。プレートを被覆し、一晩３５℃インキュベーター中に入れた後、Ａ_６２０を測定した。テトラサイクリンを標準抗菌化合物として使用した。
【０１９３】
ＣＭＳライブラリーからの６３の化合物をスクリーニングにかけたところ、細菌増殖を顕著に阻害する２つの化合物が同定された。具体的には、化合物ＡＯＣ−０７８７７およびＡＯＣ−０８９４４は両方とも、５０％を越える率でスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）およびエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）の増殖を阻害した（下表２２参照、示された値は増殖阻害パーセントである）。前者の化合物はまた、δおよびβの相互作用に対して顕著な阻害活性を呈した。これらの結果は、ペプチド配列データを用いてペプチドのミメティックについての化学的多様性を検索することによる化学的リードの同定について報告された方法の有用性を立証している。
【０１９４】
【表３２】

【０１９５】
【表３３】

化合物ＡＯＣ−０８９４４の構造は以下の通りである：
【０１９６】
実施例１５
この実施例では、我々は、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）βへのエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）αの結合を阻害する能力に関する化合物ライブラリーの代表的なもののスクリーニングについて説明する。
【０１９７】
Ａ．方法
ＣＭＳライブラリーからの化合物を、９６ウェルトレイフォーマットにおいて１ｍｇ／ｍｌでＤＭＳＯに溶かした。１１５μｌのＢＢ３７を加えることにより、対応するスレーブプレートを調製した。マスタープレートからの溶解した化合物（５μｌ）を、スレーブプレートの対応するウェルに加え、４１．７μｇ／ｍｌの最終濃度にした。
【０１９８】
実施例１３の記載と同様にしてエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）βへのエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）αの結合の阻害について化合物を検定した。
【０１９９】
Ｂ．結果
ＣＭＳライブラリーからの６０の化合物をスクリーニングした。エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）βへのエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）αの結合を顕著に阻害する一化合物（ＡＯＬ−０６４５４：下記構造参照）が同定された。
【０２００】
【表３４】

ＡＯＣ−０６４５４
【０２０１】
前述の結果は、上記検定法が、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）αおよびβの相互作用を阻害する化合物についての化学的化合物の大型ライブラリーのスクリーニングに適切であることを証明している。
【０２０２】
実施例１６
この実施例では、我々は、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）βへのエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）αおよびδの相互作用を阻害する能力についてのエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）β結合性タンパク質からの追加的ペプチドのスクリーニングについて記載する。
【０２０３】
Ａ．方法
アルファ：ベータ結合検定法における緩衝液ＢＢ１４の代わりに緩衝液ＢＢ３７を使用したこと以外は実施例６と同様に、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）βへのエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）αの結合の阻害についてペプチドを検定した。上記で示した通り、緩衝液ＢＢ３７は、ＢＢ１４で使用されている１０ｍＭのＭｇＣｌ_２の代わりに１０ｍＭのＭｎＣｌ_２を含む。また、緩衝液の条件を変えることにより、α：β結合検定法の再現性および感受性が改善された。
【０２０４】
Ｂ．結果
推定β結合部位を含むエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質からの若干のペプチドを、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）βとエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）αおよびδの相互作用を阻害する能力について検定した。ペンタ‐およびヘキサ‐ペプチドモチーフの中には、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）αからのフランキング配列（ペプチド１１０ａ−ｆ、１１２ａおよびペプチド１３）が両側に隣接しているものもあれば、それらの天然フランキング配列（ペプチド１１２ｃおよびｄ）が両側に隣接しているものあった。
【０２０５】
【表３５】

【０２０６】
これらの結果は、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＵｍｕＣ１、ＵｍｕＣ２、ＭｕｔＳ１およびＰｏｌＢ２からのペンタペプチドモチーフおよびエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤｉｎＢ１およびＤｎａＡ２からのヘキサペプチドモチーフが、共通９量体（ペプチド１３）について観察されたのと類似したレベルでエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）α：βおよびδ：βの相互作用を顕著に阻害することを証明している。さらに、共通５量体（１１２ｆ）は、共通９量体（ペプチド１３）と類似したレベルの阻害性を呈する。興味深いことに、２種の最も阻害性の高いペプチドＤｎａＡ２およびＵｍｕＣ１には、両側にそれらの天然フランキングジペプチドが隣接することから、フランキングアミノ酸は、たとえ僅かにせよ、ペプチドの結合能力に寄与し得ることが示唆される。
【０２０７】
ペンタペプチドおよびヘキサペプチドの阻害活性レベルが同等であることは、少なくとも２種の、そしてバイオインフォマティックス分析により、恐らく幾つかのさらに異なるβ結合性ペプチドのファミリーが存在することを示唆している。ヘキサペプチドについての共通配列の分析は、５位におけるアミノ酸同一性が、小アミノ酸が有利であるにせよ、厳密なものではないこと、そして６位の疎水性アミノ酸がペンタペプチドモチーフにおける５位のアミノ酸と均等内容であると思われることを示唆している。
【０２０８】
「請求の範囲」に記載されている本発明の広い領域および範囲から逸脱することなく、上記で例証した本発明の態様に多くの変化が加えられ得ることは当業者には明らかなことである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、真正細菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素のＤｎａＥおよびＰｏｌＣサブユニットのドメインの構成の概略図である。
【図２】図２は、ＬｅｘＡ−β−結合性モチーフタンパク質融合体による酵母２−ハイブリッド実験の結果を示す。
【図３】図３は、真正細菌δタンパク質の例のアミノ酸配列をエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）δ’およびγ／τタンパク質の配列と共に並べた構造配列を示す。
【図４】図４は、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニットのインビトロ発現および相互作用の結果を示す。
【図５】図５は、酵母２−ハイブリッド検定法におけるヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニットの相互作用を試験する実験の結果を示す。
【図６】図６は、酵母２−ハイブリッド検定法におけるβ−ガラクトシダーゼの発現についての結果を示す。
【図７】図７は、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）δタンパク質の構造モデルであり、β−結合性領域を示す。
【図８】図８は、天然および突然変異体エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）δサブユニットの相互作用を試験する実験の結果を示す。
【図９】図９は、ペンタペプチドβ−結合性モチーフにおけるアミノ酸の分布分析である。
【図１０】図１０は、トリペプチドＤＬＦによるバシラス・サチラス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の増殖阻害を試験した実験の結果を示す。
【図１１】図１１は、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）βの三次元構造を示す。

Claims (27)

1. βタンパク質と相互作用するタンパク質により接触された真正細菌βタンパク質のドメインの表面に類似した表面を含む分子であって、表面が、残基Ｘ^１７０、Ｘ^１７２、Ｘ^１７５、Ｘ^１７７、Ｘ^２４１、Ｘ^２４２、Ｘ^２４７、Ｘ^３４６、Ｘ^３６０およびＸ^３６２（ここで、上付け数字は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）βタンパク質における残基の位置を示す）、または他の種類の真正細菌からの相同体における均等内容の残基により特定され、
   Ｘ^１７０が、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｔ、ＳまたはＥのいずれか一つであり、
   Ｘ^１７２が、Ｔ、ＳまたはＩのいずれか一つであり、
   Ｘ^１７５が、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｋ、Ｉ、ＱまたはＲのいずれか一つであり、
   Ｘ^１７７が、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｆ、ＶまたはＡのいずれか一つであり、
   Ｘ^２４１が、Ｆ、ＹまたはＬのいずれか一つであり、
   Ｘ^２４２が、Ｐ、ＬまたはＩのいずれか一つであり、
   Ｘ^２４７が、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｆ、ＬまたはＭのいずれか一つであり、
   Ｘ^３４６が、Ｓ、Ｐ、Ａ、ＹまたはＫのいずれか一つであり、
   Ｘ^３６０が、Ｉ、ＬまたはＶのいずれか一つであり、そして
   Ｘ^３６２が、Ｍ、Ｌ、Ｖ、Ｓ、ＴまたはＲのいずれか一つである、
   分子。
2. 真正細菌βタンパク質およびそれと相互作用するタンパク質間における相互作用のモジュレーターの同定方法であって、
   （ａ）
   （ｉ）請求項１記載のβタンパク質表面の少なくとも一部に結合する真正細菌βタンパク質についてのリガンド、
   （ｉｉ）リガンドについての相互作用パートナー、および
   （ｉｉｉ）試験化合物
   を含む反応混合物を形成させ、
   （ｂ）試験化合物の不存在下においてリガンドおよび相互作用パートナー間で相互作用を行わせ得る条件下で反応混合物をインキュベーションし、そして
   （ｃ）リガンドおよび相互作用パートナー間の相互作用に対する試験化合物の効果を評価する
   工程を含む方法。
3. リガンドが、タンパク質、ペプチド、抗体およびペプチドのミメティックから成る群から選択される、請求項２記載の方法。
4. タンパク質が、δ、ＤｎａＥ１、ＤｎａＥ２、ＰｏｌＣ、ＰｏｌＢ２、ＵｍｕＣ、ＤｉｎＢ１、ＤｉｎＢ２、ＤｉｎＢ３、ＭｕｔＳ１、ＲｅｐＡ、Ｄｕｆ７２およびＤｎａＡ２、およびβタンパク質と相互作用し得るそれらのフラグメントから成る群から選択される、請求項３記載の方法。
5. タンパク質が、βタンパク質と相互作用し得るδ、ＤｎａＥ１、ＤｎａＥ２、ＰｏｌＣ、ＰｏｌＢ２、ＵｍｕＣ、ＤｉｎＢ１、ＤｉｎＢ２、ＤｉｎＢ３、ＭｕｔＳ１、ＲｅｐＡ、Ｄｕｆ７２およびＤｎａＡ２のフラグメントから選択され、フラグメントが別のタンパク質に融合されている、請求項３記載の方法。
6. リガンドが、Ｘ^１Ｘ^２、Ｘ^３Ｘ^１Ｘ^２、Ｘ^３Ｘ^１Ｘ^２Ｘ^４、ＱＸ^５Ｘ^３Ｘ^１Ｘ^２、およびＱＸ^５ｘＸ^６Ｘ^３Ｘ^６（ただし、ｘはアミノ酸残基であり、Ｘ^１は、Ｌ、Ｍ、ＩまたはＦであり、Ｘ^２は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｄ、ＡまたはＧであり、Ｘ^３は、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｄ、ＳまたはＰであり、Ｘ^４は、ＡまたはＧであり、Ｘ^５はＬであり、Ｘ^６は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、ＷまたはＰである）から成る群から選択されるペプチドである、請求項３記載の方法。
7. リガンドが、Ｘ^１Ｘ^２、Ｘ^３Ｘ^１Ｘ^２、Ｘ^３Ｘ^１Ｘ^２Ｘ^４、ＱＸ^５Ｘ^３Ｘ^１Ｘ^２、およびＱＸ^５ｘＸ^６Ｘ^３Ｘ^６（ただし、ｘはアミノ酸残基であり、Ｘ^１は、Ｌ、Ｍ、ＩまたはＦであり、Ｘ^２は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｄ、ＡまたはＧであり、Ｘ^３は、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｄ、ＳまたはＰであり、Ｘ^４は、ＡまたはＧであり、Ｘ^５はＬであり、およびＸ^６は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、ＷまたはＰである）から成る群から選択される配列を含むポリペプチドまたはペプチドである、請求項３記載の方法。
8. リガンドが、表１〜１３および１５のモチーフのいずれか一つを含むポリペプチドまたはペプチドであるか、または表１〜１３および１５のモチーフのいずれか一つを含むペプチドである、請求項３記載の方法。
9. 相互作用パートナーが、真正細菌βタンパク質、請求項１記載の表面の少なくとも一機能性部分を含む真正細菌βタンパク質のフラグメント、請求項１記載の表面のミメティック、請求項３記載のペプチド、および請求項３記載のペプチドの少なくとも一コピーを含むポリペプチドから成る群から選択される、請求項３記載の方法。
10. 相互作用パートナーが、表１〜１３および１５のモチーフのいずれか一つを含むポリペプチドまたはペプチドであるかまたは、表１〜１３および１５のモチーフのいずれか一つを含むペプチドである、請求項３記載の方法。
11. 真正細菌βタンパク質およびそれと相互作用するタンパク質間における相互作用のモジュレーターのインビボ同定方法であって、
    （ａ）
    （ｉ）請求項１記載のβタンパク質表面の少なくとも一部に結合する真正細菌βタンパク質についてのリガンド、および
    （ｉｉ）リガンドについての相互作用パートナー
    を発現するかまたは含むように宿主を修飾し、
    （ｂ）試験化合物を宿主に投与し、試験化合物の不存在下においてリガンドおよび相互作用パートナー間で相互作用をさせ得る条件下で宿主をインキュベーションし、そして
    （ｃ）リガンドおよび相互作用パートナー間の相互作用に対する試験化合物の効果を評価する
    工程を含む方法。
12. 宿主が、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、バクテリオファージおよびウイルスから成る群から選択される、請求項１１記載の方法。
13. リガンドが、δ、ＤｎａＥ１、ＤｎａＥ２、ＰｏｌＣ、ＰｏｌＢ２、ＵｍｕＣ、ＤｉｎＢ１、ＤｉｎＢ２、ＤｉｎＢ３、ＭｕｔＳ１、ＲｅｐＡ、Ｄｕｆ７２およびＤｎａＡ２、およびβタンパク質と相互作用し得るそれらのフラグメントから成る群から選択されるタンパク質である、請求項１１記載の方法。
14. リガンドが、Ｘ^１Ｘ^２、Ｘ^３Ｘ^１Ｘ^２、Ｘ^３Ｘ^１Ｘ^２Ｘ^４、ＱＸ^５Ｘ^３Ｘ^１Ｘ^２、およびＱＸ^５ｘＸ^６Ｘ^３Ｘ^６（ただし、ｘはアミノ酸残基であり、Ｘ^１は、Ｌ、Ｍ、ＩまたはＦであり、Ｘ^２は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｄ、ＡまたはＧであり、Ｘ^３は、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｄ、ＳまたはＰであり、Ｘ^４は、ＡまたはＧであり、Ｘ^５はＬであり、Ｘ^６は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、ＷまたはＰである）から成る群から選択されるペプチドである、請求項１１記載の方法。
15. リガンドが、Ｘ^１Ｘ^２、Ｘ^３Ｘ^１Ｘ^２、Ｘ^３Ｘ^１Ｘ^２Ｘ^４、ＱＸ^５Ｘ^３Ｘ^１Ｘ^２、およびＱＸ^５ｘＸ^６Ｘ^３Ｘ^６（ただし、ｘはアミノ酸残基であり、Ｘ^１は、Ｌ、Ｍ、ＩまたはＦであり、Ｘ^２は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｄ、ＡまたはＧであり、Ｘ^３は、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｄ、ＳまたはＰであり、Ｘ^４は、ＡまたはＧであり、Ｘ^５はＬであり、Ｘ^６は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、ＷまたはＰである）から成る群から選択される配列を含むポリペプチドまたはペプチドである、請求項１１記載の方法。
16. リガンドが、表１〜１３および１５のモチーフのいずれか一つを含むポリペプチドまたはペプチドであるかまたは、表１〜１３および１５のモチーフのいずれか一つを含むペプチドである、請求項１１記載の方法。
17. 相互作用パートナーが、真正細菌βタンパク質、請求項１記載の表面の少なくとも一機能性部分を含む真正細菌βタンパク質のフラグメント、請求項３記載のペプチド、および請求項３記載のペプチドの少なくとも一コピーを含むポリペプチドから成る群から選択される、請求項１１記載の方法。
18. 相互作用パートナーが、表１〜１３および１５のモチーフのいずれか一つを含むポリペプチドまたはペプチドであるかまたは、表１〜１３および１５のモチーフのいずれか一つを含むペプチドである、請求項１１記載の方法。
19. 真正細菌βタンパク質およびそれと相互作用するタンパク質間における相互作用の潜在的モジュレーターの選択方法であって、
    （ａ）請求項１記載のβタンパク質表面の少なくとも一部に結合するペプチドについての共通配列を確立し、
    （ｂ）共通配列の少なくとも一部分の構造をモデル化し、類似構造を有する化合物についての化合物データベースを検索し、ただし、モデル化は、
    （ｉ）共通配列またはその一部分の出現についてタンパク質データベースを検索し、共通配列またはその一部分を含むタンパク質の残基の座標を得、そして座標を重ね合わせて薬理作用団モデルを作製するか、または
    （ｉｉ）βタンパク質への結合時に共通配列またはその一部分を含むペプチドの構造をモデル化または決定することにより行われるものとし、そして
    （ｃ）工程（ｂ）で同定された化合物を相互作用に対するそれらの効果について試験する
    工程を含む方法。
20. 共通配列が、表１〜１３および１５のいずれか一つの配列データから選択される、請求項１３記載の方法。
21. 生物系の真正細菌外寄生の作用を低減化させる方法であって、真正細菌種が外寄生した系に真正細菌βタンパク質およびそれと相互作用するタンパク質間の相互作用のモジュレーターを送達することを含む方法。
22. モジュレーターが、Ｘ^１Ｘ^２、Ｘ^３Ｘ^１Ｘ^２、Ｘ^３Ｘ^１Ｘ^２Ｘ^４、ＱＸ^５Ｘ^３Ｘ^１Ｘ^２、およびＱＸ^５ｘＸ^６Ｘ^３Ｘ^６（ただし、ｘはアミノ酸残基であり、Ｘ^１は、Ｌ、Ｍ、ＩまたはＦであり、Ｘ^２は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｄ、ＡまたはＧであり、Ｘ^３は、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｄ、ＳまたはＰであり、Ｘ^４は、ＡまたはＧであり、Ｘ^５はＬであり、Ｘ^６は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、ＷまたはＰである）から成る群から選択されるペプチドである、請求項２１記載の方法。
23. モジュレーターが、請求項２２記載のペプチドのいずれか一つのミメティックである、請求項２１記載の方法。
24. モジュレーターが、真正細菌βタンパク質およびそれと相互作用するタンパク質間における相互作用の阻害剤である、請求項２１記載の方法。
25. 請求項１記載のβタンパク質表面の少なくとも一部に結合する化合物の設計用テンプレートであって、Ｘ^１Ｘ^２、Ｘ^３Ｘ^１Ｘ^２、Ｘ^３Ｘ^１Ｘ^２Ｘ^４、ＱＸ^５Ｘ^３Ｘ^１Ｘ^２、およびＱＸ^５ｘＸ^６Ｘ^３Ｘ^６（ただし、ｘはアミノ酸残基であり、Ｘ^１は、Ｌ、Ｍ、ＩまたはＦであり、Ｘ^２は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｄ、ＡまたはＧであり、Ｘ^３は、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｄ、ＳまたはＰであり、Ｘ^４は、ＡまたはＧであり、Ｘ^５はＬであり、Ｘ^６は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、ＷまたはＰである）から成る群から選択されるペプチドを含むテンプレート。
26. ペプチドが、ＱＬＳＬＦ（配列番号６２２）、ＱＬＳＭＦ（配列番号６２３）、ＱＬＤＭＦ（配列番号６２４）、ＱＬＤＬＦ（配列番号６２５）、ＨＬＳＬＦ（配列番号６２６）、ＨＬＳＭＦ（配列番号６２７）、ＨＬＤＭＦ（配列番号６２８）、ＨＬＤＬＦ（配列番号６２９）、Ｘ^３ＬＦＸ^４、ＳＬＦ、ＳＭＦ、ＤＬＦ、ＤＭＦ、ＬＦおよびＭＦから成る群から選択される、請求項２５記載のテンプレート。
27. ペプチドが、表１〜１３および１５のモチーフのいずれか一つである、請求項２５記載のテンプレート。

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