HU219485B

HU219485B - Eljárás 1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-származékok, ezek komplexei, valamint antitestekkel képzett konjugátumai, és ilyeneket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására és a komplexeket, illetve konjugátumokat tartalmazó diagnosztikai készítmények

Info

Publication number: HU219485B
Application number: HU432/89A
Authority: HU
Inventors: Sharon Baughman; Roberta C. Cheng; William A. Fordyce; Richard Keith Frank; Joseph R. Garlich; William F. Goeckeler; Garry E. Kiefer; William J. Kruper; Kenneth Mcmillan; Jaime Simon; David A. Wilson
Original assignee: Dow Chemical Co.
Priority date: 1988-06-24
Filing date: 1989-06-23
Publication date: 2001-04-28
Also published as: US5435990A; DE68921941D1; EP0420942A1; WO1989012631A1; NZ229700A; HK60696A; IE67273B1; KR0137930B1; IE892045L; GR900300034T1; EP0353450B1; FI103792B; KR900701765A; NO900869L; JP2831073B2; BR8907507A; HUT70200A; EP0353450A1; ATE120457T1; NO179008C

Abstract

A találmány (IA) általános képletű vegyületek, ezek fémmel alkotottkomplexei, valamint ezen komplexek antitestekkel, vagyantitestfragmensekkel alkotott konjugátumai előállítási eljárásáravonatkozik. Az (IA) általános képletben Q jelentései egymástólfüggetlenül hidrogénatom vagy –(CHR5)pCO2R-csoport, Q1 jelentésehidrogénatom vagy –CO2R-csoport, amely csoportokban R jelentéseihidrogénatom vagy 1–4 szénatomos alkilcsoport, azzal a megkötéssel,hogy Q és Q1 jelentéseiben együttesen legalább kettő hidrogénatomtóleltérő, és ha Q1 jelentése hidrogénatom, R3 jelentése hidrogénatomtóleltérő kell legyen, R5 jelentései hidrogénatom vagy 1–4 szénatomosalkilcsoport, n értéke 0 és 5 közötti szám, p értéke 1 vagy 2, R2jelentése hidrogénatom, nitro-, amino- vagy izotiocianátocsoport R3jelentése 1–4 szénatomos alkoxi- vagy hidroxicsoport, vagyhidrogénatom, R4 jelentése hidrogénatom, nitro-, amino- vagyizotiocianátocsoport, azzal a feltétellel, hogy R2 és R4 egyidejűlegnem lehet hidrogénatom, de R2 és R4 egyike hidrogénatom kell, hogylegyen. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás új 1,4,7,10-tetraaza-ciklodekán-származékok, ezek komplexeinek és antitestekkel képzett konjugátumainak előállítására.

Ismert, hogy a funkciós csoportokat tartalmazó kelátok vagy biíunkcionális koordinátorok képesek kovalens kötéssel kapcsolódni antitestekhez, amelyek rákra, rákossejt-epitópokra vagy antigénekre specifikusak. Az ilyen antitest/kelát konjugátumok radioaktív magot tartalmazó komplexei alkalmasak diagnosztikai és/vagy terápiás felhasználásra, mivel alkalmasak a radioaktív magot a rákos sejthez szállítani [Meares et al., Anal. Biochem. 112, 68-78 (1984); and Krejcarek et al., Biochem and Biophys. Rés. Comm. 77, 581-585 (1977)].

Az aminokarbonsav kelátképző szerek ismertek, és évek óta kutatások tárgyát képezik. Ilyenek például a következők: nitrilo-triecetsav (NTA), etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA), hidroxi-etil-etilén-diamin-triecetsav (HEDTA), dietilén-triamin-epentaecetsav (DTPA), transz-1,2-diamino-ciklohexán-tetraecetsav (CDTA), valamint 1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-tetraecetsav (DOTA). Különböző biíunkcionális kelátképző anyagokat ismertettek és állítottak elő, amelyek aminokarbonsav-alapúak. Ilyenek például: a DTPA ciklusos dianhidridje [Hnatowich et al. Science 220, 613-615 (1983), a 4 479 930 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás], valamint a DTPA kevert karbonsavanhidridjei [4 454 106 és 4 472 509 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás és Krejcarek és munkatársai, Biochem. and Biophys. Rés. Comm., 77, 581-585, (1977)]. Ha az anhidrideket proteinekhez kapcsoljuk, a kapcsolás amidkötésen keresztül megy végbe, és így az eredeti -5-karboxi-metil-csoportokból négy csoport marad a dietilén-triamin- (DETA) vázon [Hnatowich és munkatársai, Int. J. Appl. Isot., 33, 327-332 (1982)]. A 4 432 907 és 4 352 751 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban továbbá bifunkcionális kelátképző szereket ismertetnek, amelyek alkalmasak fémionok „szerves csoportokhoz, így például szerves célmolekulákhoz vagy antitestekhez” való kapcsolására. Mint a fentiekben, a kapcsolás itt is a diamintetraecetsav-dianhidridek amidcsoportján keresztül megy végbe. Az ilyen anhidridekre példa például az EDTA, CDTA, propilén-diamin-tetraecetsav és fenilén-l,2-diamin-tetraecetsav dianhidridjei. A 4 647 447 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban különböző komplex sókat ismertetnek, amelyeket a komplexképző sav anionjából nyertek, és amelyeket különböző diagnosztikai célra alkalmaznak. A kitanítás szerint a kapcsolódás a komplexképző sav karboxilcsoportján keresztül történik, ami amidkötést létesít.

Paik és munkatársai [J. of Radioanalytical Chemistry 57 (12), 553-564 (1980)] p-nitro-benzil-bromid alkalmazását ismertetik egy „blokkolt” dietilén-triaminnal [például bisz(2-ftálimido-etil)-aminnal], majd ezt követően a deblokkolási eljárást és a karboxi-metilezést írják le, amelyhez klór-ecetsavat alkalmaznak, és így N’-p-nitro-benzil-dietilén-triamin-N,N,N”,N”-tetraecetsavat nyernek. Ennél a módszernél is, mivel a kötődés nitrogénen keresztül történik, tetraecetsav-származékot nyernek. Ismertetik továbbá a bisz-funkcionális kelátképző szer kapcsolását és az indiummal való kelátképzést. Ismertetik továbbá a nitrogénatom szubsztitúcióját is [Eckelman és munkatársai, J. of Pharm. Sci. 64 (4), 704- 706 (1975)], amelynél aminokat, így például etilén-diamint vagy dietilén-triamint reagáltatnak a megfelelő alkil-bromiddal a karboxi-metilezés előtt. Az előállított vegyület hatásos radioaktív gyógyászati leképezőszer.

Az aminokarbonsav-alapú bifunkcionális kelátképző szerek további csoportja is ismert. így például Sundberg és munkatársai [J. of Med. Chem. 17 (12), 1304 (1974)] az EDTA bifimkcionális analógjait ismertetik. Ezen vegyületek képviselői például az l-(p-amino-fenil)-etilén-diamin-tetraecetsav és az l-(p-benzol-diazónium)-etilén-diamin-tetraecetsav. Ismertetik továbbá ezen vegyületek proteinekhez való kapcsolását is a parahelyzetű szubsztituensen keresztül, valamint a kelátképző csoporthoz radioaktív fémionok kapcsolását is leírják. Ezen vegyületeket ismertetik még a 3 994 966 és 4 043 998 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban, valamint a következő publikációban is: Biochemical and Biophysical Research Communications 75 (1), 149 (1977). Fontos megjegyezni, hogy az aromás csoportnak az EDTA-hoz való kapcsolása az etilén-diamin-váz szénatomján keresztül történik. Az EDTA, HEDTA és DTPA optikailag aktív bifunkcionális kelátképző vegyületeit ismertetik a 4 622 420 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban. Ezekben a vegyületekben az aromás csoportot (amely a proteinhez való kapcsoláshoz szükséges funkciós csoportot tartalmazza) egy alkiléncsoport kapcsolja a poliamin szénatomjához, amely a kelátképző csoportot tartalmazza. Ilyen vegyületeket ismertetnek még a 4 647 447 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, a WO 86/06 384 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben, valamint a következő publikációban is: Brechbiel és munkatársai, Inorg. Chem. 25, 2772-2781 (1986).

Az utóbbi időben bizonyos makrociklusos bifunkcionális kelátképző szereket, valamint ezek réz-kelátkonjugátumait ismertetik diagnosztikai és terápiás célra a 4 678 667 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, valamint a következő publikációban: Moi és munkatársai, Inorg. Chem., 26, 3458-3463 (1987). Az aminokarbonsav-csoport kapcsolása a bifunkcionális kelátképző molekulához a ciklusos poliamin váz gyűrű-szénatomján keresztül történik. így a kapcsoló molekularész (linker) egyik végén a ciklusos poliamin gyűrű-szénatomjához kapcsolódik, ugyanakkor a másik végén a proteinnel reakcióba lépni képes funkcionális csoporthoz kapcsolódik.

A bifunkcionális kelátképző szerek egy másik említésre méltó csoportját képezik az olyan vegyületek, amelyekben a kelátképző rész, azaz az aminokarbonsav nitrogénatomon keresztül kapcsolódik a molekula funkciós csoportjához, amely molekula a proteinnel reakcióba lépni képes részt is tartalmazza. így például Mikola és munkatársai (WO 84/03698 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés) olyan bifunkciós kelátképző szert ismertetnek, amelyet p-nitrobenzil-bromid és DETA reagálta2

HU 219 485 Β tásával, majd a kapott vegyület bróm-ecetsawal való kezelésével, illetve ily módon aminokarbonsawá való alakításával nyertek. A nitrocsoportot a megfelelő amincsoporttá redukálják, majd ezt tiofoszgénnel való reakcióval izotiocianátcsoporttá alakítják. Ezek a vegyületek bifunkciós kelátképző szerek, amelyek lantanidákkal kelátképzésre képesek, amelyeket ezután diorganikus molekulákkal lehet konjugátumokká alakítani, és diagnosztikai szerként felhasználni. Miután a molekula linkerrésze az aminokarbonsav egyik nitrogénatomján keresztül kapcsolódik, egy potenciális aminokarbonsavcsoport a kelátképzés szempontjából elvész. Ily módon DETA-bázisú bifunkcionális kelátokat nyernek, amelyek négy (nem öt) savcsoportot tartalmaznak. Ily módon a bifunkciós kelátképző szerek ezen csoportja hasonló azokhoz, amelyeknél a proteinekhez való kapcsolódás az amidcsoporton keresztül történik, és így szintén egy karboxil-kelátképző csoport elvész.

Nemrégiben jelent meg Caney, Rogers és Johnson publikációja [3rd. International Conference on Monoclonal Antibodies Fór Cancer; San Diego, Califomia 2/4-6/88, cím: „Absence of Inrinsically Higher Tissue Uptake írom Indium-111 Labeled Antibodies: Co-administration of Indium-111 and Iodine-125 Labeled B72.3 in a Nude Mouse Model” és „Influence of Chelator Denticity on the Biodistribution of Indium-111 Labeled B72.3 Immunoconjugates in Nude Mice”, amelyben az EDTA és DTPA bifunkciós kelátképző szerekkel komplexált indium-111 bioeloszlását ismertetik. Az aromás gyűrű az EDTA/DTPA-részhez acetátmetilén-csoporton keresztül kapcsolódik. D. K. Johnson és munkatársai ugyancsak nemrég ismertettek EDTA és DTPA bifunkciós származékokat [Florida Conf. on Chem. in Biotechnology, April 26-29 (1988), Palm Coast, FL], ahol a p-izotiocianáto-benzil-rész az egyik karboxi-metil-csoport metilén-szénatomján keresztül kapcsolódik. Hunt és munkatársai [4 088 747 és 4 091 088 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások] korábban etilén-diamin-diecetsav (EDDA)-alapú kelátképző szereket ismertettek, ahol az aromás gyűrű az EDDA-részhez egy alkilén- vagy egy acetát-metilén-csoporton keresztül kapcsolódik. Ezek a vegyületek kelétként alkalmasak a hepatobiliáris funkciók tanulmányozására. Előnyös fém a technécium-99m. Az indium-111 és indium-113m szintén előnyösen alkalmazható radioaktív mag a leképezéshez.

A találmány célja olyan komplexek biztosítása, amelyek nem disszociálnak könnyen, amelyek az egész testből gyorsan képesek kiürülni, kivéve a kívánt szöveteket, valamint ezen koplexek antitestekkel képzett konjugátumainak biztosítása, amelyek a kívánt hatást eredményezik.

A találmányi leíráshoz tartozó ábrák a következőkre vonatkoznak:

Az 1-7. és 15-21. ábrák a ¹⁵³Sm bioeloszlását mutatja be, amit ¹⁵³Sm-tartalmú találmány szerinti konjugátum formájában adagoltunk. A konjugátumban CC₄₉-IgG antitestet alkalmaztunk. A bioeloszlást LS 174-T tumort hordozó csupasz egereken határoztuk meg.

A 8-14. és 22-28. ábrákon a ¹⁵³Sm bioeloszlását mutatjuk be, amelyet ¹⁵³Sm-tartalmú, találmány szerinti konjugátum formájában adagoltunk. A konjugátum CC₄₉-F(ab’)₂ antitestfragmenst tartalmaz. A bioeloszlást LS 174-T tumort hordozó csupasz egereken határoztuk meg.

A 29-34. ábrákon a ¹⁷⁷Lu bioeloszlását mutatjuk be ¹⁷⁷Lu(PA-DOTMA)- vagy ¹⁷⁷Lu(PA-DOTA)-tartalmú konjugátumokon. A konjugátumoknál CC₄₉-IgG antitesteket alkalmaztunk. A bioeloszlást LS 1174-T tumort hordozó (balb/C) egereken határoztuk meg.

Meglepetésszerűen azt tapasztaltuk, hogy a találmány szerinti komplexek és/vagy konjugátumok relatíve stabilak (azaz nem disszociálnak könnyen), és némelyik igen gyorsan kiválasztódik a szervezetből és bizonyos nem célszervekből, így például a májból, a veséből és a csontból.

A találmány oltalmi körébe tartozik az új bifunkcionális kelátok előállítása, amelyek mindegyike kelátképző funkciós csoportot és egy kémiailag reakcióképes csoportot tartalmaz, amely révén alkalmas azt kovalens módon egy biomolekulához kötni. Szintén a találmány oltalmi körébe tartozik a különböző bifunkcionális koordinátor (BFC)-fém-komplexek előállítása és ezen komplexek antitestekhez való kapcsolása, amikor is radioaktív (így például szamárium-153, lutécium-177 és ittrium—90) jelzett antitestet és/vagy fragmenst nyerünk, amelyek diagnosztikai és/vagy terápiás célra alkalmasak.

A találmány új bifunkciós kelátképző szerekre vonatkozik, amelyek fémionokkal, különösen ritkaföldfém típusú „radioaktív” fémionokkal, komplexeket képeznek. A találmány szerint alkalmazható ritkaföldfém típusú fémionok közé tartoznak a következők: La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Y és Se, különösen az Sm, Ho, Y és Lu. Előnyös radioaktív ritkaföldfém típusú fémionok a következők: ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, *>Y, ¹⁴⁹Pm, i59Gd, ¹⁴⁰La, ^l77Lu, ^l75Yb, ⁴⁷Sc és ¹⁴²Pr, különösen a ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, 9°Y és ¹⁷⁷Lu. További radioaktív fémionok, amelyek szintén alkalmazhatók, a következők: ⁴⁷Sc, ^99mTc, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ⁹⁷Ru, wíRh, ^lwPd, ¹⁹⁷Pt, «Cu, ¹⁹⁸ Au, 'Au, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, Ίη, Μη, '^Sn és ²¹²Pb/²¹²Bi. Az így kapott komplexeket kovalens kötéssel egy antitesthez vagy annak fragmenséhez kapcsoljuk, és az így nyert konjugátumokat terápiás vagy diagnosztikai célra alkalmazhatjuk. A komplexeket és/vagy konjugátumokat in vivő vagy in vitro egyaránt alkalmazhatjuk. A találmány szerinti konjugátumokat előnyösen emlősök, különösen humán egyedek rákos elváltozásainak kezelésére alkalmazhatjuk. A találmány szerinti olyan komplexek és/vagy konjugátumok, amelyek nem radioaktív fémet tartalmaznak, szintén felhasználhatók diagnosztikai célra és/vagy betegségek, így például rák kezelésére. A nem radioaktív fémek ilyen felhasználásánál rádiófrekvenciával hipertermiát idéznek elő (Jpn. Kokai Tokyo Koho JP 61, 158,931) és fluoreszcenszimmuno-vezérelt terápiát alkalmaznak (FIGVS) [K. Petterson és munkatársai, Clinical Chemistry 29 (1), 60-64 (1983) és C. Meares és munkatársai, Acc. Chem. Rés. 17, 202-209 (1984)].

HU 219 485 Β

Közelebbről a találmány (IA) általános képletű vegyületek előállítására vonatkozik - a képletben Q jelentései egymástól függetlenül hidrogénatom vagy

-(CHR⁵)_pCO₂R-csoport,

Q* jelentése hidrogénatom vagy -CO₂R-csoport, amely csoportokban

R jelentése hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy Q és Q¹ jelentéseiben együttesen legalább kettő hidrogénatomtól eltérő, és ha Q¹ jelentése hidrogénatom, R³ jelentése hidrogénatomtól eltérő kell legyen,

R⁵ jelentése hidrogénatom vagy 1 -4 szénatomos alkilcsoport, n értéke 0 és 5 közötti szám, p értéke 1 vagy 2,

R² jelentése hidrogénatom, nitro-, amino- vagy izotiocianátocsoport,

R³ jelentése 1 -4 szénatomos alkoxi- vagy hidroxicsoport, vagy hidrogénatom,

R⁴ jelentése hidrogénatom, nitro-, amino- vagy izotiocianátocsoport, azzal a feltétellel, hogy R² és R⁴ egyidejűleg nem lehet hidrogénatom, de R² és R⁴ egyike hidrogénatom kell, hogy legyen - .

A találmány oltalmi körébe tartoznak a fenti (IA) általános képletű vegyületek gyógyászatilag elfogadható sói is.

Előnyösek azok az (IA) általános képletű vegyületek, amelyek fenti képletében R jelentése hidrogénatom,

R⁵ jelentése hidrogénatom vagy metilcsoport, n értéke 0-5 közötti egész szám, és

R² jelentése hidrogénatom, nitro-, amino- vagy izotiocianátocsoport,

R³ jelentése 1 -4 szénatomos alkoxi- vagy hidroxicsoport vagy hidrogénatom,

R⁴ jelentése hidrogénatom, nitro-, amino- vagy izotiocianátocsoport, azzal a megkötéssel, hogy R² és R⁴ egy időben nem lehet hidrogénatom, de R² és R⁴ egyikének jelentése hidrogénatom kell hogy legyen.

Ha a találmány szerinti konjugátumot kívánjuk előállítani, akkor R² és R⁴ nitrocsoporttól eltérő kell, hogy legyen.

A találmány vonatkozik továbbá a ritkaföldfém típusú fémekkel képzett komplexekre, különösen a semleges radioaktív vagy töltéssel bíró ritkaföldfém típusú fémiont tartalmazó komplexekre, valamint ezen komplexeknek antitestekkel vagy antitestfragmensekkel képzett konjugátumaira. A találmány oltalmi körébe tartoznak továbbá még azon készítmények is, amelyek ezen konjugátumokat és ezekkel együtt gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagokat tartalmaznak, különösen előnyösen folyékony hordozóanyagot. Ezen konjugátumok, valamint ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények felhasználhatók diagnosztikai célra vagy betegségek, különösen rákos betegségek kezelésére, amely kezelés során az emlősöknek a készítmények hatásos mennyiségét adagoljuk.

A fenti képletekben R² vagy R⁴ jelentésében az elektrofil csoportként előnyös például izotiocianátocsoport, a nukleofil csoportok közül az aminocsoport.

Kívánatos továbbá, hogy az R², R³ és R⁴ csoportok típusa és/vagy helyzete olyan legyen, hogy észrevehető mértékben a kelátképző reakcióban ne vegyen részt.

A fentiekben használt „emlős” kifejezés bármilyen olyan emlősre vonatkozik, amely kicsinyét tejjel táplálja, ezek előnyösen meleg vérű emlősök, még előnyösebben humán egyedek. Az antitest kifejezés magában foglal bármilyen poliklonális, monoklonális vagy kiméraantitestet, vagy heteroantitestet, előnyösen monoklónantitestet jelent. Az antitestffagmens lehet Fab-ffagmens és F(ab’)₂-fragmens, vagy bármilyen antitestrész, amely a kívánt epitóppal vagy epitópokkal szemben specificitással rendelkezik. A fém-kelát/antitest konjugátum vagy antitest rész magában foglalja a teljes antitestet és/vagy antitestffagmenst, beleértve ezek félszintetikus vagy genetikus úton előállított variánsait is.

A találmány értelmében alkalmazott „komplex” kifejezés olyan vegyületre vonatkozik, amely egy találmány szerinti (IA) általános képletű vegyületet ezzel komplexált ritkafém típusú fémiont, különösen radioaktív ritkafém típusú fémiont tartalmaz, amelyben legalább egy fématom van komplexálva. A radioaktív fémion-kelát/antitest konjugátum vagy a radioaktív fémion-konjugátum kifejezés olyan radioaktív fémion-konjugátumra vonatkozik, amely kovalens módon kapcsolódik egy antitesthez vagy egy antitestffagmenshez. A radioaktív kifejezés, ha a fémionnal együttesen alkalmazzuk, olyan ritkaföldfém típusú elemek izotópjaira vonatkozik, amelyek részecskéket és/vagy fotonokat képesek emittálni, ilyenek például a következők: ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, ⁹⁰Y, ¹⁴⁹Pm, ¹⁵⁹Gd, ¹⁴⁰La, ¹⁷⁷Lu, i^Yb, ⁴⁷Sc és ¹⁴²Pr. A bifünkcionális koordinátor, a bifunkcionális kelátképző szer és a funkcionalizált kelát kifejezések egymással egyenértékűek, és olyan vegyületekre vonatkoznak, amelyek egy olyan részt tartalmaznak, amely képes a fémiont kelát formájában megkötni, továbbá tartalmaz a kelátrészhez kovalens módon kapcsolódó linkercsoportot, amely arra szolgál, hogy a molekula kovalens kötéssel az antitesthez vagy az antitestfragmenshez tudjon kapcsolódni.

Az (IA) általános képletű vegyületek gyógyászatilag elfogadható sói olyan sókat jelentenek, amelyek nem toxikusak, és emlősök terápiájában vagy diagnosztikájában felhasználhatók. Az ilyen sókat ismert módon állítjuk elő, például szerves vagy szervetlen vegyületekkel végzett reakcióval, erre a célra például a következő vegyületeket alkalmazhatjuk: kénsav, sósav, foszforsav, ecetsav, borostyánkősav, citromsav, tejsav, maleinsav, fumársav, palmitinsav, kólsav, pálmaolajsav, mukonsav, glutaminsav, d-kámforsav, glutársav, glikolsav, ftálsav, borkősav, hangyasav, laurilsav, sztearinsav, szalicilsav, metánszulfonsav, benzolszulfonsav, szorbinsav, pikrinsav, benzoesav, cinnaminsav, vagy más alkalmas sav. A gyógyászatilag elfogadható sók körébe tartoznak a bázisos vegyületekkel képzett sók, így például bármely szerves vagy szervetlen bázisos vegyülettel képzett só. Erre a célra például a következőket alkalmazhatjuk: ammónia, alkálifémek, alkáliföldfémek

HU 219 485 Β vagy más hasonló ionok. Különösen előnyös sók a kálium-, nátrium-, ammóniumsók vagy ezek keveréke.

Természetesen a (IA) általános képletű vegyületek lehetnek szabad sav formájúak, vagy protonált formájúak, így például ha a karboxilátcsoport protonálva van, és/vagy ha a nitrogénatom protonálva van, azaz például amikor a HCl-sókat állítjuk elő.

Előnyös (LA) általános képletű vegyületek - amelyeket a (II) általános képlettel írunk le - azok, amelyek képletében

Q¹ jelentése hidrogénatom,

Q jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy

-CHR⁵CO₂R képletű csoport, amelyben R jelentése hidrogénatom vagy 1 -4 szénatomos alkilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy Q jelentései közül legalább kettő hidrogénatomtól eltérő, n értéke 0-5 közötti szám,

R² jelentése hidrogénatom, nitro-, amino- vagy izotiocianátocsoport,

R³ jelentése 1-4 szénatomos alkoxi- vagy hidroxicsoport,

R⁴ jelentése hidrogénatom, nitro-, amino- vagy izotiocianátocsoport,

R⁵ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy

1-4 szénatomos alkilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy R² és R⁴ egyidejűleg nem lehet hidrogénatom, de R² és R⁴ közül az egyik hidrogénatom kell, hogy legyen.

Az olyan (II) általános képletű vegyületeket, amelyek képletében R² jelentése hidrogénatom, a (IV) általános képlettel újuk le, amely képletben

Q jelentése hidrogénatom vagy -CHR⁵CO₂R általános képletű csoport,

R jelentése hidrogénatom vagy 1 -4 szénatomos alkilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy a Q csoportok közül legalább kettő hidrogénatomtól eltérő, n értéke O-tól 5-ig terjedő egész szám,

R³ jelentése 1-4 szénatomos alkoxi- vagy hidroxicsoport,

R⁴ jelentése nitro-, amino- vagy izotiocianátocsoport, R⁵ jelentése hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport.

Előnyösek továbbá azok az (IA) általános képletű vegyületek, amelyek képletében Q jelentései közül legalább egy hidrogénatom, a képletben

Q jelentése hidrogénatom vagy -CHR⁵CO₂R általános képletű csoport,

Q¹ jelentése hidrogénatom, vagy -CO₂R általános képletű csoport,

R jelentése hidrogénatom, vagy 1 -4 szénatomos alkilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy a Q és Q¹ csoportokból legalább kettő hidrogénatomtól eltérő kell, hogy legyen, és legalább egy Q csoport hidrogénatom kell, hogy legyen, továbbá Q¹ és R³ egyidejűleg nem lehet hidrogénatom, n értéke O-tól 5-ig terjedő szám,

R² jelentése hidrogénatom, nitro-, amino- vagy izotiocianátocsoport,

R³ jelentése 1 -4 szénatomos alkoxi-, hidroxicsoport, vagy hidrogénatom,

R⁴ jelentése hidrogénatom, nitro-, amino- vagy izotiocianátocsoport,

R⁵ jelentése hidrogénatom, vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy R² és R⁴ jelentése egyidejűleg nem lehet hidrogénatom, de R² és R⁴ jelentései közül az egyik hidrogénatom kell, hogy legyen.

További előnyös vegyületek azok az (IA) általános képletű vegyületek, amelyek képletében Q¹ jelentése -CO₂R, amely vegyületeket a (VI) általános képlettel írunk le, amely képletben

Q jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy

-CHR⁵CO₂R általános képletű csoport,

R jelentése hidrogénatom vagy 1 -4 szénatomos alkilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy a Q csoport jelentései közül legalább egy hidrogénatomtól eltérő, n értéke O-tól 5-ig terjedő szám,

R² jelentése hidrogénatom, nitro-, amino- vagy izotiocianátocsoport,

R³ jelentése 1-4 szénatomos alkoxi- vagy hidroxicsoport vagy hidrogénatom,

R⁴ jelentése hidrogénatom, nitro-, amino- vagy izotiocianátocsoport,

R⁵ jelentése hidrogénatom vagy 1 -4 szénatomos alkilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy R² és R⁴ jelentése egyidejűleg nem lehet hidrogénatom, de R² és R⁴ közül az egyik hidrogénatom kell, hogy legyen.

A (VI) általános képletű vegyületek közül előnyösek azok a vegyületek, amelyeknek képletében R³ és R⁴jelentése egyaránt hidrogénatom, ezeket a vegyületeket a (VII) általános képlettel írjuk le, a képletben Q jelentései egymástól függetlenül hidrogénatom vagy

-CHR⁵CO₂R általános képletű csoport,

R jelentése hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy a Q csoport jelentései közül legalább egy hidrogénatomtól eltérő, n értéke O-tól 5-ig terjedő egész szám,

R² jelentése nitro-, amino- vagy izotiocianátocsoport,

R⁵ jelentése hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport.

A (VI) általános képletű vegyületek közül előnyösek továbbá azok a vegyületek, amelyeknek képletében R²jelentése hidrogénatom, ezeket a vegyületeket a (VIII) általános képlettel újuk le, amely képletben Q jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy

-CHR⁵CO₂R általános képletű csoport,

R³ jelentése 1-4 szénatomos alkoxi- vagy hidroxicsoport,

R⁴ jelentése nitro-, amino- vagy izotiocianátocsoport,

HU 219 485 Β

R⁵ jelentése hidrogénatom vagy 1 -4 szénatomos alkilcsoport.

Ugyancsak előnyös tulajdonságúak a fentiekben ismertetett (II)—(VIII) általános képletű vegyületek gyógyászatilag elfogadható sói is.

A fentiekben ismertetett, (ΙΑ)—(VIII) általános képletnek megfelelő, bifunkcionális kelátképző vegyületek alkalmasak ritkaföldfém típusú fémionok, különösen radioaktív tulajdonságú ritkaföldfém típusú fémionok kelát formájában való megkötésére, amikor is fémionkelátok (ezeket komplex vegyületként is nevezzük) képződnek. Ezek a komplexek a jelen lévő reakcióképes csoport révén reakcióképes hordozókhoz, így például reakcióképes polimerekhez képesek kapcsolódni, vagy előnyösen, ha az (IA) általános képletű komplexben R²és R⁴ jelentése nitrocsoporttól eltérő, ezek a vegyületek kovalens kötéssel proteinekhez vagy még előnyösebben antitestekhez vagy antitestfragmensekhez képesek kötődni. Ennek megfelelően az (ΙΑ)—(VIII) általános képlettel jellemzett vegyületek ritkaföldfém típusú fémionokat, különösen radioaktív tulajdonságú ritkaföldfém típusú fémionokat képesek komplexálni, és az így nyert komplexek kovalens kötéssel kötődnek az antitestekhez vagy antitestfragmensekhez, amely képződményeket konjugátumoknak nevezünk.

Az ilyen konjugátumok előállításánál felhasználható antitesteket vagy antitestfiragmenseket ismert módon állítjuk elő. így például nagy specificitású monoklonális antitesteket állíthatunk elő hibridizációs technikával, ilyen eljárást ismertetnek például a következő irodalmi helyek: Kohler és Milstein [Natúré 256, 495-497 (1975); és Eur. J. Immunoi. 6, 511-519 (1976)]. Az így nyert antitestek általában nagy specificitású reakcióképességgel rendelkeznek. A radioaktív fémiont tartalmazó konjugátumokban antitestként bármely kívánt antigén vagy haptén elleni antitestet alkalmazhatjuk. Előnyösen olyan monoklonális antitesteket vagy antitestfragmenseket alkalmazunk, amelyek a kívánt epitóppal vagy epitópokkal szemben nagy specificitással rendelkeznek. így például a találmány értelmében a következők elleni antitestek alkalmazhatók: tumorok, baktériumok, gombák, vírusok, paraziták, mikoplazma, differenciális vagy más sejtmembránantigének, patogén felületi antigének, toxinok, enzimek, allergének, drogok és bármilyen, biológiailag aktív molekulák. Példaként említjük a következő antitesteket vagy antitestfragmenseket: CC-11, CC-46, CC-49, CC-49 F(ab’)₂, CC-83, CC-83 F(ab’)₂ és B72.3. [lásd D. Colcher és munkatársai, Cancer Rés. 48, 4597-4603 (1988. augusztus 15.)], a CC-49, CC-83 és B72.3 antitestek. A B72.3 hibridóma-sejtvonal az American Type Culture Collectionnél (ATCC) HB 8108 számon van deponálva. A különböző CC jelű antitestek a 7-073 685 számú, 1987. július 15-én benyújtott amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben vannak ismertetve, és ezek az antitestek az NTIS-nél hozzáférhetők. A többi patkány monoklonális antitestek a TAG-72 jelű, tumorral kapcsolatos antigénepitópokhoz kötődnek. Az antigének teljes listáját például a 4 193 983 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás tartalmazza. A találmány szerinti radioaktív fémion-konjugátumok különösen előnyösen alkalmazhatók különböző rákok kezelésére és diagnosztizálására.

Az előnyös, találmány szerinti ritkaföldfém típusú (lantanidák vagy pszeudolantanidák) komplexeket a következő általános képlettel újuk le:

C[Ln(BFC)] (IX) amely képletben Ln jelentése ritkaföldfém, (lantanida) ion, így például valamely következő ion: Ce³⁺, Pr³⁺, Nd³⁺, Pm³⁺, Sm³⁺, Eu³⁺, Gd³+, Tb³+, Dy³+, Ho³⁺, Er³⁺, Tm³⁺, Yb³⁺ és Lu³⁺, vagy pszeudolantanida-fémion, így például Sc³⁺, Y³⁺ és La³⁺, különösen előnyös fémionok a következők: Y³⁺, Ho³⁺, Lu³⁺ vagy Sm³+; BFC jelentése bifunkcionális kelát; C jelentése gyógyszerészetileg elfogadható ion vagy ionok, amelyek elegendő töltéssel rendelkeznek ahhoz, hogy a komplexet semlegesíteni tudják.

Ha a BFC-csoport négy vagy több negatív töltésű részt tartalmaz, akkor C jelentése valamely következő kation vagy kationcsoport: H+, Li⁺, Na⁺, K+, Rb⁺, Cs⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Sr²+, Ba²+, NH4+, N(CH3)4+, N(C2H5)4+, N(C3H7)4⁺, N(C4H₉)₄+, As(C₆H₅)₄+, [(C₆H₅)₃P=]₂N+ vagy más protonált amincsoport. Ha a BFC-csoport három negatív töltésű részt tartalmaz, akkor C jelenléte nem szükséges. Ha a BFC-csoport két negatív töltésű részt tartalmaz, akkor C jelentése valamely következő anion: F~, CU, Br, I~, C1O₄“, BF₄~, H₂PO₄ , HCO₃ , HCO₂ , ch₃so₃-, H₃C-C₆H₄-SO₃ , pf₆-, ch₃co₂ésB(C₆H₅)₄-.

A találmány szerinti konjugátumokat és bizonyos esetekben a komplexeket is készítmények formájában alkalmazzuk. Ezek a készítmények egy (IA) általános képletű vegyületet, antitestet és/vagy fémiont, valamint fiziológiásán elfogadható hordozót, adalékanyagot tartalmaznak. így például egy találmány szerinti készítmény tartalmazhat egy fiziológiásán elfogadható hordozóanyagot, egy komplexet (fémion+ligandum), konjugátumot (fémion+ligandum+antitest) vagy (ligandum + antitest). Az ilyen készítmények előállítását ismert módon végezzük, a készítmények lehetnek szuszpenziók, injekciózható oldatok vagy más, megfelelő formájú készítmények. A fiziológiásán elfogadható szuszpendálóközeget különböző adalékokkal vagy adalékok nélkül is alkalmazhatjuk.

A találmány szerinti eljárással előállított készítmények szilárd vagy folyékony formájúak, amelyek aktív radioaktív magot tartalmaznak egy ligandummal komplexálva. Ezek a készítmények lehetnek kit formájúak, amelyekben a két komponenst (azaz a ligandumot és a fémet, a komplexet és antitestet vagy ligandum/antitestet és fémet) a megfelelő időben a felhasználás előtt keverjük össze. A készítmény akár előkevert, akár kit formájú, általában gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot is tartalmaz.

A találmány szerinti eljárással nyert injekciózható készítmények lehetnek szuszpenziók vagy oldatok. A különböző készítmények előállításánál általában megállapítható, hogy a só formájú vegyületek vízoldha6

HU 219 485 Β tósága nagyobb mint a sav formájú vegyületeké. Az oldat formájú készítmények esetében a komplexek (vagy a külön komponensek) fiziológiásán elfogadható hordozóanyagban vannak feloldva. Ilyen hordozóanyag lehet például egy megfelelő oldószer, konzerválószer, így például benzil-alkohol vagy szükség esetén egy puffer. Oldószerként általában vizet, vizes alkoholokat, glikolokat, foszfonát- vagy karbonát-észtereket alkalmazunk. A vizes oldatok nem több mint 50 térfogat% szerves oldószert tartalmaznak.

A találmány szerinti injekciózható szuszpenziók általában folyékony szuszpendálóközeget tartalmaznak, amelyekhez adagolhatunk még különböző adalékanyagokat is. A szuszpendálószer lehet például vizes poli(vinil-pirrolidon), inért olajok, így például növényi olajok vagy nagy tisztaságú ásványi olajok, vagy például vizes karboxi-metil-cellulóz. Az alkalmas fiziológiásán elfogadható adalékanyagok például arra szükségesek, hogy a komplexeket szuszpenzióban tartsák. Erre a célra például sűrítőanyagokat, így például karboxi-metilcellulózt, poli(vinil-pirrolidon)-t, zselatint vagy alginátokat alkalmazhatunk. Különböző felületaktív anyagok is alkalmazhatók szuszpendálószerként, így például a következők: lecitin, alkil-fenol, poli(etilén-oxid) adduktumok, naftalinszulfonátok, alkil-benzolszulfonátok vagy poli(etilén-oxi)-szorbitán-észterek.

Különböző anyagokat a hidrofilitás, a sűrűség, a felületi tenzió befolyásolására alkalmazunk, amelyek bizonyos esetben elősegítik az injekciózható szuszpenziók elkészítését. Erre a célra például szilikonos habzásgátlót, szorbitot vagy cukorféléket alkalmazunk.

Terápiás célra a készítmények „hatásos mennyiségét” alkalmazzuk. A szükséges dózis függ általában a kezelendő betegségtől. A készítményeket diagnosztizálásra általában in vitro alkalmazzuk, de in vivő diagnosztizálásra szintén felhasználhatók. A találmány szerinti konjugátumokat vagy készítményeket felhasználhatjuk továbbá radioimmun-vezérelt sebészeti célra is (RIGS), erre a célra még például a következő fémek is felhasználhatók: ^99mTc, ⁱⁿIn, ^n3mIn, ⁶⁷Ga vagy ⁶⁸Ga.

A találmány szerinti kelátok további különböző célokra is felhasználhatók, így például alkalmasak mágneses rezonancia leképezésére, például az (IA) általános képletű vegyületek, különösen a (VI) általános képletű vegyületek Gd+³ ionnal képzett komplexei, továbbá különböző polimer hordozókhoz kötött formában, például diagnosztikai szerként, továbbá lantanida fém- vagy pszeudolantanida fémion eltávolítására szelektív extrakcióval.

A találmány szerinti kelátok, komplexek és antitest konjugátumok közül több sokkal stabilabb és/vagy jobb bioeloszlású és/vagy gyorsabban képes kiürülni a szervezetből, mint más, eddig ismert hasonló készítmények. A találmány oltalmi körébe tartozik ezen kelátok, komplexek és antitest-konjugátumok előállítási eljárása is.

Az (IA) általános képletű 12 tagú makrociklusos bifunkcionális kelátokat előnyösen és általánosságban úgy állítjuk elő, hogy a szabad bázis formájú makrociklusos vegyületet (például 1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán) csak egy nitrogénatomján monofünkcionalizáljuk a megfelelő elektrofil vegyülettel (például bármely, megfelelően szubsztituált a-halogén-karbonsav-észter). Ezen elektrofil vegyület kell, hogy tartalmazzon alkalmas linkerrészt vagy megfelelően védett linkerrészt, amely lehetővé teszi a bifunkcionális ligandum kovalens kapcsolódását a proteinhez, antitesthez vagy antitestffagmenshez.

A szakterületen ismert, hogy a mono-N-funkcionalizált poliaza-makrociklusos vegyületek alkilezésénél különböző, nehezen elkülöníthető termékek keveréke képződik [T. Kaden, Top Curr. Chem. 121, 157-75 (1984)]. Ezt ismertetett módszerek szerint úgy küszöbölték ki, hogy a makrociklusos vegyületet nagy feleslegben alkalmazták (5-10 ekvivalens mennyiségben az elektrofil vegyülethez viszonyítva), amely előnyben részesítette a monoalkilezett adduktum képződését [M. Studer and T. A. Kaden, Helv. Chim. Acta 69, 2081-86 (1986); E. Kimura és munkatársai, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1158-59(1986)].

Más módszerek szerint a mono-N-fünkcionalizált poliaza-makrociklusos vegyületek előállításánál hosszadalmas védő, fünkcionalizáló és védőcsoport-eltávolítási reakciókat alkalmaznak [P. S. Pallavicini és munkatársai, J. Amer. Chem. Soc. 109, 5139-44 (1987); M. F. Tweedle és munkatársai, Eur. Pub. Pat. Appln. No. 0232-751]. Az utóbbi időben a szubsztituált fenil-piruvinsavak és -aminok reduktív aminálását ismertették az Abbott Laboratórium legutóbbi üléséről kiadott kivonatban [D. K. Johnson és munkatársai, Florida Conf. on Chem. in Biotechnology, April 26-29 (1988), Palm Coast, FI], Ismert továbbá egy olyan eljárás, amelynél a mono-N-alkilezett poliaza-makrociklusos vegyületet úgy állítják elő, hogy az elektrofil vegyületet 1-5 ekvivalens mennyiségben a megfelelő makrociklusos vegyületre számolva alkalmazzák olyan oldószerben, amely nem segíti elő a protontranszfert (289 163 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, benyújtás: 1988. december 22).

A találmány szerinti eljárásnál a kiindulási anyagként alkalmazásra kerülő mono-N-szubsztituált poliaza-makrociklusos vegyületet az (IA’) általános képletű vegyülettel íijuk le, a képletben a szubsztituensek jelentése az (IA) általános képieméi megadott, és ezt a vegyületet egy, a -(CHR⁵)_pCO₂R csoport bevitelére alkalmas vegyülettel reagáltatjuk.

Az olyan (IA) általános képletű vegyületek előállítására, amelyek képletében R² vagy R⁴ jelentése aminocsoport, egy R² vagy R⁴ helyén nitrocsoportot tartalmazó vegyületet redukálunk, vagy olyan vegyületek előállítására, amelyek képletében R jelentése hidrogénatom, egy R helyén 1 -4 szénatomos alkilcsoportot tartalmazó (IA) általános képletű vegyületet hidrolizálunk, vagy az olyan (IA) általános képletű vegyületek előállítására, amelyek képletében R² vagy R⁴ jelentése izocianátocsoport, R² vagy R⁴ helyén aminocsoportot tartalmazó vegyületet tiofoszgénnel reagáltatunk.

Az I—III. reakcióvázlatokon általános előállítási eljárást ismertetünk a találmány szerinti kelátokra, amely reakciókban a megfelelő elektrofil és poliaza-makrociklusos vegyületeket alkalmazzuk különböző sztöchio7

HU 219 485 Β metriai arányban, különböző hőmérsékleteken és koncentrációkban, megfelelő szerves oldószerben. Szerves oldószerként bármilyen szénhidrogén-vegyületet alkalmazhatunk, amely a megfelelő oldhatóságot biztosítja, így például a következőket: acetonitril, izopropanol, metilén-klorid, toluol, kloroform, n-butanol, szén-tetraklorid, tetrahidrofurán, 5%-os etanolos kloroform, amelyek közül különösen előnyös a kloroform, a metilénklorid, n-butanol, 1,4-dioxán és acetonitril. A makrociklusos vegyületeket és az elektrofil vegyületeket sztöchiometrikus vagy közel sztöchiometrikus arányban alkalmazzuk, és így a megfelelő mono-N-alkilezett terméket egyetlen lépésben nyeljük. A hőmérséklet általában 0 °C és az oldószer visszafolyatási hőmérséklete közötti érték előnyösen 0-25 °C közötti érték. A reakcióidő általában 1-24 óra.

A II. reakcióvázlatnak megfelelő eljárás kivitelezéséhez szükségesek az α-halogénsav-észterek. Egy megfelelő eljárás az in situ képződött savhalogenidek brómozása vagy klórozása [D. N. Harpp és munkatársai, J. Org. Chem. 40, 3420-27 (1975)]. Ennél a módszernél lehetséges kizárólag α-halogénezett alkánsavakat előállítani, amelyek még reakcióképes benzilcsoportot is tartalmaznak. A szubsztituált savhalogenidek általános előállításánál a szerves savat tionil-kloriddal vagy szulfúril-kloriddal reagáltatjuk [E. Schwenk és munkatársai, J. Amer. Chem. Soc., 70, 3626-27 (1944)]. Mindkét módszernél szabad karbonsavat alkalmazunk kiindulási anyagként, amely kereskedelmi forgalomban beszerezhető.

A poliaza-makrociklusos vegyületeket, így például az 1,4,7,10-tetraaza-ciklododekánt ismert módszerek szerint állíthatjuk elő [például T. J. Atkins és munkatársai, J. Amer. Chem. Soc. 96, 2268-70 (1974) és T. J. Richman és munkatársai, Org. Synthesis 58, 86-98 (1978)].

A mono-N-funkcionalizált makrociklusos vegyület karboxi-metilezését Desreux eljárásával végezhetjük, amelynél bróm-ecetsav-származékot és megfelelő bázist alkalmazunk [J. F. Desreux, Inorg. Chem. 19, 1319-24 (1980)].

Bármely, a találmány szerinti eljárásnál felhasználásra kerülő kiindulási anyag kereskedelmi forgalomban beszerezhető, vagy ismert, irodalomban leírt eljárások szerint előállítható.

Az I. reakcióvázlaton olyan (IA) általános képletű vegyületek előállítását mutatjuk be, amelyek képletében Q¹ jelentése -C02R-csoport, Q jelentése -CH2-COOR-csoport és R³ jelentése hidrogénatom. Bár a reakcióvázlat egy konkrét vegyület előállítására vonatkozik, más olyan (IA) általános képletű vegyületek is előállíthatok, amelyek képletében Q¹ jelentése CO2R, és n=0-5, és a többi szubsztituens jelentése a fenti.

A II. reakcióvázlaton olyan (IA) általános képletű vegyületek előállítását mutatjuk be, amelyek képletében Q jelentése (CHR⁵)_pCO₂R általános képletű csoport, ahol R⁵ jelentése hidrogénatomtól eltérő és R³ jelentése hidrogénatom. Bár a reakcióvázlaton egy konkrét vegyület előállítását mutatjuk be, más olyan (IA) általános képletű vegyületek is előállíthatok az eljárással, amelyek képletében Q jelentése (CHR⁵)_pCO₂R, és n=0-5, és a többi szubsztituens jelentése a fenti.

AII. reakcióvázlaton az A’ csoport jelentése (S képletű vegyület) a reagensben lehet bármilyen a-savak számára előnyös lehasadó csoport, így például A’ jelentése lehet fenil- vagy CF₃-csoport.

Az optikailag aktív alkilezőszerek alkalmazása minimalizálja a diasztereomerek képződését és egyszerűsíti az eljárást. Az egyes diasztereoizomerek elválasztása növeli az egyes, könnyen tisztítható lantanidkomplexek mennyiségét, amely kívánatos a radio-kelátképzéshez, valamint az antitest-konjugáláshoz.

A III. reakcióvázlaton olyan (IA) általános képletű vegyületek előállítását mutatjuk be, amelyek képletében Q¹ jelentése CO2R általános képletű csoport, és R²jelentése hidrogénatom, és R³ jelentése metoxicsoport. Bár a reakcióvázlaton két konkrét vegyület előállítását mutatjuk be, más olyan vegyületek is előállíthatok az eljárással, amelyek képletében Q¹ jelentése hidrogénatom vagy (CHR⁵)pCO₂R általános képletű csoport, Q jelentése hidrogénatom vagy CO₂R, n=0-5, p=l vagy 2, R³ jelentése a fenti, R² és R⁴ jelentése hidrogénatom, amino-, nitro- vagy izotiocianátocsoport.

Az elektrofil vegyületet szintén ismert módon állíthatjuk elő. Ilyen eljárásokat ismertetnek például a következő irodalmi helyen: Acc. Chem. Rés. 17, 202-209 (1984). Az olyan (IA) általános képletű vegyületek előállítását, amelyek képletében R² vagy R⁴ jelentése izotiocianátocsoport, úgy végezzük, hogy egy amino-kelátot R² vagy R⁴ jelentése aminocsoport, tiofoszgénnel reagáltatunk (289 172 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, benyújtva: 1988. december 23-án).

A radiomagot különböző módon nyerhetjük, például úgy, hogy nukleáris reaktorban a magot neutronokkal bombázzuk, például:

Sm-152+neutron ->Sm-153+gamma.

Egy másik módszer szerint a radiomagokat úgy nyerjük, hogy a magot lineáris gyorsítóval vagy ciklotronban bombázzuk. Egy további módszer szerint a radiomagokat fúziós termékek keverékéből választjuk el. A találmány szerinti vegyületek szempontjából a radioaktív magok előállítási módja nem kritikus.

A találmány szerinti konjugátumokat előállíthatjuk úgy, hogy először kialakítjuk a komplexet, majd azután kötjük az antitesthez vagy az antitestfragmenshez. így ennél az eljárásnál először nyerjük a ligandumot, majd kialakítjuk a fémmel a komplexet, és ezután az így nyert komplexet adagoljuk az antitesthez. Más módszer szerint a jelzett antitest-konjugátumok előállításánál először a BFC-t kötjük az antitesthez, majd ezután képezzük a kelátot, amikor is a radioaktív BFC jelzésű antitestet nyeljük. Bármely más eljárás, amellyel a találmány szerinti konjugátumok előállíthatók, szintén a találmány oltalmi körébe tartozik.

A következő példákban, amelyekben a találmányt közelebbről illusztráljuk, a következő kifejezéseket, kísérleti körülményeket alkalmazzuk.

A tömegspektrumméréseket Finnigan TSQ tömegspektrométerrel (Q'MS módozat) vagy VG ZAB-MS

HU 219 485 Β nagy felbontású tömegspektrométerrel (gyors atombombázás xenonnal, 3: l=ditio-treitol:ditiol-eritritol) végezzük.

Az Ή és ¹³C-NMR-spektrumokat Varian VXR-300, Bruker APC 300, IBM/Bruker NR-80 vagy Jeol FX400 típusú spektrométerrel vettük fel. Mindegyik spektrum felvétele 30 °C hőmérsékleten történt, hacsak másképp nem jelöljük. Az ¹ H-NMR-spektrumot 300 MHz, 80 MHz vagy 400 MHz frekvenciánál vettük fel, függően a fentiekben felsorolt készüléktől: a ¹³C-NMR-spektrumot 75 MHz, 20 MHz vagy 100 MHz frekvencián vettük fel szintén a készüléktől függően. A megadott NMR-értékek δ per TMS-(tetrametil-szilán-) értékek, vagy ha oldószerként D₂O-t alkalmaztunk, per DSS-(2,2-dimetil-2-szilapentán-5-szulfonsav-, nátriumsó-) értékek.

Az infravörös spektrumokat (IR) Nicolet 5SL FT/IR berendezés segítségével vettük fel.

A kromatográfiás eljárásoknál a legtöbb oldószer Fisher HPLC minőségű anyag volt. Az ammónium-acetátot az Aldrich cégtől szereztük be. A vizet a „Bamstead NANPOpure™” víztisztító rendszerrel tisztítottuk. A szerves vegyületek preparatív kromatografálását vagy normál gravitációs kromatográfiával, vagy flash-kromatográfíával végeztük [C. W. Still és munkatársai, J. Org. Chem. 43, 2923-24 (1978)]. A kromatografálásnál a következő oldószerrendszereket alkalmaztuk: Oldószerrendszer Komponensek

1. CHC1₃: CH₃OH: konc. NH₄OH 2:2:1

V:V:V

2. CHC1₃: CH₃OH: konc. NH₄OH 12:4:1

V:V:V

3. CHC1₃: CH₃OH: konc. NH₄OH 16:4:1

V:V:V

4. CHC1₃: CH₃OH: konc. NH₄OH 4:2:1

V:V:V

5. CHC1₃: CH₃OH:konc. NH₄OH 3:2:1

V:V:V

6. CHC1₃: CH₃OH: konc. NH₄OH 7:3:1

V:V:V

7. sóoldat (0,85% NaCl desztillált vízben): konc.

NH₄OH

4:1

V:V

8. CHC1₃: CH₃OH: konc. NH₄OH 4:4:1

V:V:V

A példákban megadott R_rértékeket a fenti oldószerrendszerek és kereskedelmi forgalomban kapható normálfázisú szilícium-dioxid TLC-lemezek felhasználásával nyertük (GHLF 250 mikron, Analtech Inc. vagy Merck Kiesel gél 60F₂₅₄). A preparatív oszlopkromatográfíánál Merck 60,60 Á méretű szilikagélt alkalmaztunk.

A példákban megadott százalékok tömeg%-ot jelentenek, hacsak másképp nem jelöljük.

Egyes esetekben a kapott szilárd anyagot forgó bepárlóval (Buchi 461) és/vagy vákuum-szárítószekrényben 55-60 °C hőmérsékleten szárítottuk. Egyes esetekben Virtis 10-010 típusú automatikus fagyasztva szárítót vagy Speed Vác™ típusú koncentrátort alkalmaztunk az oldószer eltávolítására.

A szamárium-153 és lutécium-177 fémeket a következő helyről szereztük be: Research Reactor, University of Missouri (Columbia, MO), az ittrium-90 fémet az Oak Ridge National Laboratorytól szereztük be.

Az 1 -(4-izotiocianáto-benzil)-dietilén-triamin-pentaecetsavat (SCN-Bz-DTPA) M. W. Brechbiel és munkatársai [Inorg. Chem. 25, 2772-2781 (1986)] módszere szerint nyertük, majd a terméket anioncserés HPLC (Q-Sepharose™) kromatográfiával tisztítottuk egyetlen termék kinyerésére. A felhasznált reagenseket a következőkben soroljuk fel, a beszerzési helyeket zárójelben mellette jelöljük: Ν-2-hidroxi-etil-piperazinΝ’-2-etánszulfonsav (HEPES), szabad sav vagy nátriumsó (Bering Diagnostics, La Jolla, CA), nátrium-citrát (bizonylatolt, Fisher Scientefíc), tiofoszgén (Aldrich Chemicals), ammónium-acetát, nátrium-acetát, etilén-diamin-tetraecetsav, foszfátpuffer (Sigma Diagnostics).

HPLC-oszlopként a következőt alkalmaztuk: Handpacked Q-Sepharose™ (Pharmacia) vagy 1,5 cmx25 cm, vagy 2,5 cmx25 cm; Zorbax™ BIO Series GF-250 (9,4 mmx25 cm), gyártó: Du Pont Instruments; Vydac™ (Separation Group, Hesperia, CA márkaneve) protein C-4 (4,6 mmx25 cm) gyártó: Separation Group (Hesperia, CA); és Mono-Q™ a SP-Sephadex™ (Pharmacia Biotechnology Products márkaneve), gyártó: Pharmacia. Sep-Pak™ (Waters Associates márkaneve) C-18 töltet, beszerzési helye: Waters Associates (Milford, MA), Sephadex™ G-25 eldobható oszlop (2,2 ml) beszerzési helye: Isolab Inc. (Akron, OH) és Centricon™-30 (Amicon Division, W. R. Grace & Co., Danvers, MA márkaneve) mikrokoncentrátor, beszerzési helye: Amicon.

Az analízisekhez és a minták elválasztásához öt különböző HPLC-rendszert alkalmaztunk:

I rendszer: LKB 2150 szivattyú, 2152 szabályozó, UV-detektor - LKB 2238 W Cord, a Barthold LB 506 A HPLC Radioactivity Monitor (of the International Berthold Group) és a Gilson Fraction collector 201-202 (Gilson International, Middleton, WI);

II rendszer: automatikus mintaadagoló, WISP 710 B, két szivattyú (model 510) és automatikus gradiens szabályozó (Waters Associates), Perkin-Elmer LC-75 típusú spektrofotometriás detektor, Beckmanmodell 170 radioizotóp-detektor és frakciógyűjtő (Frac-100, Pharmacia);

III rendszer: két Waters M-6000A szivattyú, Waters 660 oldószer-programozó, Waters Model 481 Variable Wawelength Detector, Waters Data Modulé, továbbá ISCO frakciógyűjtő;

HU 219 485 Β

IVrendszer: DionexBioLC™-rendszerváltoztatható hullámhosszú UV-detektorral felszerelve; és

V rendszer: Waters Model 590 típusú szivattyú, ISCO modell 2360 gradiens programozóval és Dionex típusú, változtatható hullámhosszdetektorral.

A centrifugáláshoz és a betöményítéshez Sorvall RT 6000B típusú készüléket alkalmaztunk (hűtött centrifuga, Du Pont gyártmány). Az illékony oldószerek eltávolítására Speed Vác koncentrátort alkalmaztunk (Savant Instruments Inc., Hicksville, Ν. Y.). A radioaktív méréseket Capintec™ radioizotóp kalibrátor CRC-12 készülékkel vagy folyadékszcintillációval (Beckman LS 9800 típusú készülék, Beckman Instruments, Inc., Irvine, CA), vagy Canberra 35+ többcsatornás analizátorral, 3 in. talliumot tartalmazó nátriumjodid üreges kristály belső válaszfallal végeztük.

A komplexek előállítására vonatkozó példákban a komplex százalékos mennyiségét a következő ismert ioncserélési módszerrel határoztuk meg.

Egy 10 ml-es műanyag oszlopot megtöltöttünk 1-2 ml SP-Sephadex™ C-25 jelű, vízben előzőleg duzzasztott gyantával, majd a fölösleges vizet az oszlop tetején alkalmazott nyomással eltávolítottuk. A 15 μΐ mennyiségű vizsgálandó oldatot az oszlop tetején a gyantára adagoltuk, majd 2 ml, 4:1 (térfogatarány) izotóniás sóoldat: koncentrált ammóniumhidroxid eluenst vittünk fel. Az eluenst egy beosztással ellátott csőedényben gyűjtöttük össze. Ezután még 2 ml eluenst adagoltunk. Miután az eluenst egy második kémcsőben összegyűjtöttük, az oszlop tetején nyomás alkalmazásával a gyantát megszárítottuk. A szárított gyantát ezután egy harmadik mérőcsőbe vittük át. A mérőcsövek aktivitását NaI-számlálóval határoztuk meg, amely egy Canberra többcsatornás analizátorhoz volt kapcsolva. A komplexben kötött fém mennyiségét az eluensben meghatározott összes aktivitás százalékában fejeztük ki. A nem komplexált, szabad állapotú fém mennyiségét a gyantán visszamaradó összfém mennyiségének százalékában adtuk meg.

A nem komplexált fém eltávolítása ioncserével

Egy 10 ml térfogatú műanyag oszlopot megtöltöttünk vízben duzzasztott 0,5 ml SP-Sephadex™ C-25 típusú gyantával. A vízfelesleget centrifugálással távolítottuk el 3000 fordulat/perc sebességgel, 4 percen át. 200-500 μΐ komplex vegyület oldatát adagoltuk ezután a gyanta tetejére, majd ismételt centrifugálást végeztünk 4 percen át 3000 fordulat/perc mellett. A nem komplexált fémet, amely az oszlopon maradt, valamint a komplex formában megkötött fémet oldószenei végzett eluálással távolítottuk el.

Ittriumkomplex előállítása

Komplex vegyületet állítottunk elő 3xl0~⁴ mólos vizes ittriumoldat készítésével [YC1₃-6H₂O, 303,26 g/mol; vagy Y(OAc)₃, 12,1% H₂O]. Az így kapott oldathoz radioaktív Y³+ oldatot adagoltunk (Oakridge National Laboratories) a kívánt radioaktivitás biztosítása érdekében. Ezután 10 μΐ ligandumoldatot adagoltunk (0,03 mól) 990 μΐ Y³⁺-oldathoz, amikor is 1:1 mólarányú ligandum:fém koncentrációt biztosítottunk. A ligandumoldatot tízszeres mennyiségben alkalmaztuk 10:1 ligandum:fém arány biztosítására. A pH értékét 7,4 értékre állítottuk be sósav vagy nátriumhidroxid mikroliteres mennyiségének alkalmazásával. A kapott oldatban ezután meghatároztuk a komplexált ittrium mennyiségét a fentiekben ismertetett kationcserélési módszer segítségével.

Szamáriumkomplex előállítása

A szamáriumkomplexet a fentiekben az ittriumkomplex előállításánál ismertetett módszer segítségével állítottuk elő, azzal az eltéréssel, hogy 3 χ 10^-4 mól koncentrációjú szamáriumoldatot állítottunk elő 348,7 g/mol Sm₂O₃ 0,1 mólos sósavban való feloldásával. A radioaktív Sm-153-at 3 χ IO^-4 mol/0,1 mól sósavas oldat formájában a University of Missouri Research Reactor, Columbia, Missouri helyről szereztük be.

A következőkben ismertetjük a példákban esetenként alkalmazott rövidítések jelentését:

-OAc jelentése acetát-csoport, -OCOCH₃;

TLC jelentése vékonyréteg-kromatográfia;

Dl H₂O jelentése ionmentesített NANOpure™ víz;

NANOpure™ víz jelentése a Barnstead NANOpure™ cég által előállított, szűréssel tisztított víz; a környezeti hőmérséklet értéke általában 20-25 °C;

az egy éjszakán át jelentése 9-18 óra;

LC jelentése folyadékkromatográfia;

NBS jelentése N-bróm-szukcinimid;

MES jelentése 2-(N-morfolino)-etánszulfonsav;

HPLC jelentése nagynyomású folyadékkromatográfia;

PBS jelentése foszfáttal pufferolt sóoldat, Sigma cég gyártmánya, összetétele: 120 mmol NaCl, 2,7 mmol KC1 és 10 mmol foszfátpuffer, pH=7,4;

SP-Sephadex™ C-25 gyanta jelentése: kationcserélő gyanta, szulfonsav funkciós csoportokkal, forgalomba hozza a Pharmacia Inc. cég;

pD jelentése pH-érték, ahol a hidrogén deuterizált;

DOTA jelentése 1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán1.4.7.10- tetraecetsav;

HEPES jelentése N-2-hidroxi-etil-piperazin-N’2-etánszulfonsav;

BFC jelentése bifunkcionális kelát;

ciklén jelentése 1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán;

PA-DOTA jelentése a-[2-(4-amino-fenil)-etil)1.4.7.10- tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav;

PA-DOTMA jelentése a-[2-(4-amino-fenil)-etil]1.4.7.10- tetraaza-ciklododekán-1 -ecetsav-4,7,10-trisz(metil-acetát);

BA-DOTA jelentése a-(4-amino-fenil)-1,4,7,10tetraaza-ciklododekán- 1,4,7,10-tetraecetsav;

OMe-BA-DOTA jelentése a-(5-amino-2-metoxifenil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav;

EA-DO₃A jelentése l-[2-(4-amino-fenil)-etil)1.4.7.10- tetraaza-ciklododekán-4,7,10-triecetsav;

DTPA jelentése dietilén-triamin-pentaecetsav;

SCN-Bz-DTPA jelentése l-(4-izotiocianáto-benzil)-dietilén-triamin-pentaecetsav;

EDTA jelentése etilén-diamin-tetracetsav; a kelát azonos a ligandummal; a komplex azonos a keláttal;

HU 219 485 Β a konjugátum olyan kelátot vagy komplexet jelent, amely kovalens kötéssel kapcsolódik egy antitesthez vagy antitestfragmenshez; és az antitest lehet CC-49, CC-83 és B-72.3, valamint ezek ffagmensei, így például Fab és F(ab’)₂. 5 Egyéb, szintén felhasználható antitesteket a fentiekben már említettünk. A B-72.3 hibridóma-sejtvonal az American Type Culture Collectionnél van letétbe helyezve ATCC HB 8108 számon, a többi említett patkány monoklón antitestek a TAG- 72, tumorral kapcso- 10 latos antigénepitópokhoz kötődnek.

A következőkben ismertetésre kerülő példák semmiképpen sem jelentenek korlátozást, csupán a találmány illusztrálására szolgálnak.

Kiindulási vegyületek előállítása

A) példa d,l-2-Bróm-4-(4-nitro-fenil)-butánsav-metil-észter ml szén-tetrakloridot elkeverünk 15 ml (0,2 mól) 20 tionil-kloriddal, és nitrogénatmoszférában hozzáadagolunk 10,46 g (0,05 mól) 4-(4-nitro-fenil)-butánsavat.

A kapott oldatot 1 órán keresztül visszafolyatás közben melegítjük, amikor is hidrogén-klorid, valamint kéndioxid-gáz fejlődik. A meleg oldathoz ezután 11 g 25 (0,06 mól), 25 ml szén-tetrakloridban oldott N-brómszukcinimidet és 3 csepp, 48%-os vizes hidrogén-bromid katalizátort adagolunk. Ekkor brómgázfejlődést észlelünk. A sötétvörös oldatot ezután 35 percen át visszafolyatás közben melegítjük, majd lehűtjük, 30 100 ml metanolba öntjük keverés közben. A TLC-analízis (60/40=etil-acetát/hexán, v/v) új terméket jelez (Rf=0,69, szilikagéllemezek). A felesleges oldószert forgó bepárlóban távolítjuk el, és a kapott sötétvörös olajat flash-kromatográfiával szilikagélen átszűrjük, 35 eluensként metilén-kloridot alkalmazva. Az oldószert ezután elpárologtatjuk, a visszamaradó tiszta olaj mennyisége 15,43 g, amely 45:15 arányú keveréke a cím szerinti vegyületnek, valamint a kiindulási butánsav metil-észterének. A cím szerinti vegyület jellemzői 40 a következők:

•H-NMR (CDC1₃):

8,16 (d), 7,38 (d), 4,20 (dd), 3,79 (s), 2,88 (m),

2,38 (m);

•³C-NMR (CDC1₃, 75 MHz): 45

169,6,147,5,129,3,123,7, 53,0,44,4, 35,5, 33,0.

B) példa a-[2-(4-Nitro-fenil)-etil]-l, 4,7,10-tetraaza-ciklododekán-l-ecetsav-metil-észter 50

1,72 g (10 mmol) 1,4,7,10-tetraaza-ciklododekánt és 17 ml penténnel stabilizált kloroformot keverés közben 2,07 g (5,82 mmol) d,l-2-bróm-4-(4-nitro-fenil)butánsav-metil-észterhez adagolunk [az A) példa szerint előállítva], 5 perc leforgása alatt nitrogénatmoszfé- 55 rában, keverés közben. A reakciókeveréket ezután még 48 órán keresztül körülbelül 25 °C hőmérsékleten keverjük. A TLC-analízis (2 oldószerrendszer, Analtech szilikagéllemezek) a cím szerinti vegyület képződését mutatja ki (R_f=0,73). A kapott sárga színű kloro- 60 formos oldatot ezután szilikagéloszlopra adagoljuk, amelyet előzőleg 5%-os metanolos kloroformmal preeluáltunk, majd a terméket 250 ml 5%-os metanolos kloroformmal, majd 2 oldószerrendszerrel eluáljuk. A tiszta, cím szerinti terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, betöményítjük, amikor is 2,15 g (5,46 mmol, 94%) cím szerinti vegyületet nyerünk sárga üveg formájában. A termék kloroformos oldatát ezután elkeverjük dietil-éterrel, amikor is fehér por formájában analitikailag tiszta termék válik ki (olvadáspont: 156-159 °C).

Ή-NMR (CDC1₃):

8,14 (d), 7,39 (d), 3,71 (s), 3,39 (dd), 2,5-3,0 (m), 2,08 (m), 2,01 (m);

•³C-NMR (CDC1₃, 75 MHz):

127,7, 149,3, 146,4, 129,2, 123,6, 62,3, 51,2, 48,9,

47,2,45,8,45,4, 32,8, 30,9

C) példa

2-Bróm-2-(4-nitro-fenil)-etánsav-metil-észter g p-nitro-fenil-ecetsavat (0,14 mól) és 15,1 ml (0,21 mól) tionil-kloridot 100 ml vízmentes benzolban visszafolyatás közben nitrogénatmoszférában keverünk 3 órán át. A kapott keveréket ezután vákuumban szárazra pároljuk, a visszamaradó anyagot szén-tetrakloridban oldjuk, és nitrogénatmoszférában visszafolyatás közben keverjük. Ezután 7,2 ml (0,14 mól) brómot adagolunk hozzá kis részletekben, 3 nap leforgása alatt visszafolyatás közben, majd a keveréket hagyjuk lehűlni, és 50 ml metanolt adagolunk hozzá lassan. A kapott bróm-észtert (27 g, 71%) desztillációval elválasztjuk (forráspont=168 °C/1,1 mm).

•H-NMR (CDClj):

8,25 (d), 7,81 (d), 5,51 (s), 3,86 (s).

D) példa a-(4-Nitro-fenil)-l ,4,7,10-tetraaza-ciklododekán1 -ecetsav-metil-észter

529 mg (2,068 mmol) 2-bróm-2-(4-nitro-fenil)etánsav-metilésztert [C) példa szerint előállítva] elkeverünk 20 ml acetonitrillel, és hozzáadunk egy részletben 354 mg (2,068 mmol) 1,4,7,10-tetraaza-ciklododekánt 20 ml acetonitrilben, amely még elegendő metanolt tartalmaz az oldat képzéséhez. A kapott rózsaszínű oldatot ezután 1,5 órán át keverjük, majd vákuumban, 35 °C hőmérsékleten kis térfogatra betöményítjük. A kapott nyers monoészter-tetraamint szilikagélen kromatografáljuk (20 tömeg/térfogat% NH₄OAc/ /CHjOH). A tisztított monoészter-tetraamint triacetát sója formájában nyerjük ki, amelyet azután szabad aminná alakítunk. Az igy kapott anyagból 270 mg-ot 3 ml vízben elkeverünk 0 °C hőmérsékleten 10 tömeg%-os vizes kálium-karbonáttal, így pH-értékét 11-re beállítjuk, a kapott lúgos oldatot ezután 10 ml kloroformmal ötször extraháljuk, a kloroformos fázisokat egyesítjük, nátrium-szulfáton szárítjuk és betöményítjük, amikor is 160 mg (42%) kívánt monoésztertetraamint nyerünk.

•H-NMR (CDC1₃):

8,12 (d), 7,44 (d), 4,75 (s), 3,76 (s), 2,67-2,44 (m);

HU 219 485 Β ¹³C-NMR (CDC1₃):

171,5, 147,6, 144,0, 130,0, 124,0, 67,0, 49,8, 47,9, 46,9,46,0.

FAB MS=[M+H]⁺=366.

E) példa

N-(2-Metoxi-5-nitro-benzil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán ml kloroformot elkeverünk 2,9 g (16,8 mmol)

1.4.7.10- tetraaza-ciklododekánnal, majd hozzáadagolunk 20 ml kloroformban oldott 2,1 g (8,5 mmol) 2metoxi-5-nitro-benzil-bromidot egy adagban. A kapott keveréket ezután szobahőmérsékleten 3 órán át keverjük, majd szüljük, a szűrletet vákuumban betöményítjük, a visszamaradó anyagot kromatografáljuk (szilikagél, három oldószerrendszer), a kapott monoalkilezett termék olvadáspontja 154-156 °C, a hozam 79%.

¹³C-NMR (CDCI3):

162,47, 140,63, 127,92, 125,49, 124,53, 109,91, 55,88, 53,25, 50,90,47,18,45,45,45,29.

F) példa

N-(2-Hidroxi-5-nitro-benzil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán ml 1,4-dioxánban feloldunk 2,3 g (14 mmol)

1.4.7.10- tetraaza-ciklododekánt, majd hozzáadunk 15 ml dioxánban oldott 1,2 g (7 mmol) 2-hidroxi-5-nitro-benzil-bromidot állandó keverés közben egy részletben. Ezután néhány perc elteltével 12 g kálium-karbonátot adagolunk, majd a keverést szobahőmérsékleten még 1 órán át folytatjuk. A reakciókeveréket ezután szüljük, a szűrletet vákuumban betöményítjük, a kapott félszilárd, sárga színű anyagot szilikagélen kromatografáljuk (oldószerrendszer 5). A kívánt monoalkilezett terméket az utolsó 1/3 sárga színű eluensből nyerjük ki, amely még reagálatlan amint is tartalmaz. Ezt a frakciót betöményítjük, a visszamaradó sárga olajat 100 ml CHCl₃-mal elkeverjük, majd szűréssel eltávolítjuk a CHCl₃-ban oldódó amin kiindulási vegyületet. A végső terméket ezután sárga színű, szilárd anyag formájában nyeljük, mennyisége 1,2 g (55%), olvadáspont: 142-145 °C.

¹³C-NMR (D₂O);

25,04, 25,28, 26,83, 31,80, 36,54, 101,88, 107,22, 110,92,111,80,115,26,159,99.

K) példa

2-Metoxi-5-nitro-benzil-nitril 6 g (121,9 mmol) nátrium-cianidot feloldunk 5,3 ml vízben, és 70 °C hőmérsékleten kis részletekben keverés közben hozzáadunk 15 ml etanolban oldott 25 g (101,6 mmol) 2-metoxi-5-nitro-benzil-bromidot forrón. A reakciókeveréket ezután 1,5 órán át visszafolyatás közben még melegítjük, majd lehűtjük, szüljük, a szűrőlepényt acetonitrillel átmossuk, majd a szűrletet vákuumban betöményítjük, amikor is 19,5 g (100%) 2metoxi-5-nitro-benzilnitrilt nyerünk drapp színű, szilárd anyag formájában.

13C-NMR (CDClj):

161,4, 141,0, 125,7, 124,6, 119,8, 116,5, 110,2,

56,3,18,8.

L) példa

2-Metoxi-5-nitro-fenil-ecetsav

19,5 g előző, G) példa szerinti terméket elkeverünk 20 ml koncentrált sósavval, és visszafolyatás közben 3 órán át melegítjük, majd lehűtjük, a kapott nyersterméket szűréssel elválasztjuk és vízzel mossuk. A szilárd anyagot ezután forró vizes nátrium-hidroxidban oldjuk, és forrón szűrjük. A narancsszínű oldatot lehűtjük, sósavval megsavanyítjuk, a kiváló csapadékot szűrjük, vízzel mossuk és szárítjuk, amikor is 15 g (70%) cím szerinti vegyületet nyerünk fehér, szilárd anyag formájában.

13C-NMR (CDC1₃-CD₃OD):

127,8, 162,5, 140,7, 126,2, 124,7, 124,1, 109,7,

55,8, 35,0.

M) példa d-Bróm-(2-metoxi-5-nitro-fenil)-ecetsav, metil-észter

2,266 g (10,74 mmol) 2-metoxi-5-nitro-fenil-ecetsavat [H) példa szerint előállítva] elkeverünk 50 ml benzollal, és hozzáadagolunk 4 ml (54,8 mmol) tionil-kloridot. Ezután egy szárítócsövet és egy kondenzort helyezünk a lombikra, és a keveréket 2 órán át visszafolyatás közben melegítjük. A kapott sárga színű oldatot vákuumban betöményítjük, a kis térfogatú visszamaradó anyagot vízmentes szén-tetrakloridban oldjuk, hozzáadunk 0,6 ml (11,6 mmol) brómot, és atmoszferikus nedvesség kizárása mellett 2 napon át visszafolyatás közben forraljuk. A keveréket ezután kis térfogatra betöményítjük, hozzáadunk 50 ml metanolt, majd a felesleges metanolt vákuumban eltávolítjuk, és a visszamaradó anyagot kromatografáljuk (szilikagél, metilén-klorid/hexán=4:1). A cím szerinti vegyületet sárga olaj formájában nyeljük, mennyisége 2,399 g, 74%.

Ή-NMR (CDC1₃):

8,45 (dd), 8,15 (dd), 6,95 (d), 5,75 (s), 3,99 (s), 3,78 (s).

N) példa a-(2-Metoxi-5-nitro-fenil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1 -ecetsav-metil-észter

2,399 g 7,89 mmol) a-bróm-(2-metoxi-5-nitrofenil)-ecetsavat (I) példa szerint előállítva) feloldunk 10 ml kloroformban, és keverés közben hozzáadagolunk 50 ml kloroformban oldott 2,72 g (15,79 mmol)

1,4,7,10-tetraaza-ciklododekánt. A kapott keveréket szobahőmérsékleten 2 órán át keveijük, majd a zavaros keveréket vákuumban kis térfogatra szobahőmérsékleten betöményítjük. A nyersterméket kromatografálással tisztítjuk (szilikagél, oldószerrendszer 3), a cím szerinti vegyület sárga, szilárd anyag, mennyisége 2,6 g (83 g).

'³C-NMR (CDC1₃)

170,7, 161,6, 1339,9, 125,0, 1124,5, 124,2, 110,2, 59,5, 55,5, 50,5,48,0,47,3, 45,6, 44,3,43,5.

O) példa d,l-2-Bróm-4-(4-nitro-fenil)-butánsav-izopropilészter g (0,1 mól) 4-(4-nitro-fenil)-vajsavat 10 ml széntetrakloridban oldott 30 ml (0,4 mól) tionil-kloridot nit12

HU 219 485 Β rogénatmoszférában Harpp és munkatársai módszere szerint [J. Org. Chem. 40, 3420-27 (1975)]. A kapott oldatot ezután 1 órán át visszafolyatás közben melegítjük, miközben kezdetben hirtelen sósavgáz és kén-dioxid-gáz szabadul fel. Ekkor 20 g (0,12 mól) N-brómszukcinimidet adagolunk hozzá 50 ml szén-tetrakloridban oldva, valamint 8 csepp 48%-os vizes hidrogénbromid-katalizátort csepegtetünk az oldathoz még, amikor is bróm szabadul fel. A sötétvörös színű oldatot ezután további 35 percen át melegítjük, majd lehűtjük, 400 ml izopropanolba öntjük keverés közben. A TLCanalízis szerint (metilén-klorid, szilikagéllemezek) új termék képződött (R_f=0,73). Az oldószerfelesleget ezután eltávolítjuk, a sötétvörös színű olajat flash-kromatografáljuk (szilikagél, metilén-klorid), az oldószert vákuumban eltávolítjuk, és a kapott világossárga olajat flash-kromatografálással tisztítjuk (szilikagél, metilénklorid). Ily módon 25 g (,076 mól) cím szerinti brómésztert nyerünk tiszta olaj formájában (75%), amely izopropanol-szolvát és amely kevesebb mint 5% nem brómozott észtert tartalmaz.

Ή-NMR (CDClj):

8,16 (d, 2H), 7,38 (d, 2H), 5,05 (szeptet, 1H),

4,14 (dd, 1H), 2,88 (m, 4H), 2,39 (m, 4H), 1,29 (d, 6H);

'3C-NMR (CDClj):

168,7, 147,7, 129,3, 123,8, 69,9, 45,1, 35,6, 33,0,

21,5,21,2.

P) példa

a.-[3-(4-Nitro-fenil)-propil]-l, 4,7,10-tetraaza-ciklododekán-l-ecetsav-metil-észter

3,137 g (18,2 mmol) ciklén szabad bázist elkeverünk 30 ml penténnel stabilizált kloroformmal, és hozzáadunk 4,81 g (14,6 mmol) d,l-2-bróm-4-(4-nitro-fenil)-vajsav-izopropil-észtert [K) példa szerint előállítva] 5 perc leforgása alatt, nitrogénatmoszférában keverés közben. A kapott reakciókeveréket ezután szobahőmérsékleten 24 órán át keveijük. A TLC-analízis szerint (oldószerrendszer 2) a cím szerinti monoalkilezett termék képződött (R_f=0,78, detektálás: ninhidrin, jód, UV-aktivitás). A kapott sárga kloroformos oldatot flash-kromatografálással tisztítjuk (szilikagéloszlop, amely előzőleg 5%-os metanolos kloroformmal eluálva volt), az eluálást 300 ml ilyen oldószerrel, majd oldószerrendszer 2-vel végezzük, a tiszta, cím szerinti terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és betöményítjük, amikor is 4,85 g (5,46 mmol) cím szerinti vegyületet nyerünk szabad bázis formájában.

Hozam: 79%.

Ή-NMR (CDClj):

8,15 (d, 2H), 7,40 (d, 2H), 5,07 (ρ, 1H), 3,35 (dd, 1H), 2,65-3,0 (m, 13H), 2,5-2,64 (m, 4H), 2,14 (m, 1H), 2,00 (m, 1H), 1,28 (dd, 6H);

'3C-NMR (CDClj):

171,6, 149,5, 146,5, 129,2, 123,6, 68,1, 62,7, 49,2,

47,5,45,9,45,7, 32,9,31,0,22,1,22,0;

IR (CDClj) cm-':

3231 (N-H), 2978, 2933, 1721 (észter-karbonil), 1601,1512,1458,1345,1107;

FAB MS m/e 422 [M+H]+, 408, 392.

A végtermékligandumok előállítása

1. példa

a.-(4-Nitro-fenil)-l, 4,7,10-tetraaza-ciklododekán1.4.7.10- tetraecetsav-l-monometil-4,7,10-trietilészter ml acetonitrilt elkeverünk 4,6 g (33,3 mmol) frissen porított vízmentes kálium-karbonáttal, majd feloldunk benne 700 mg (1,91 mmol) a-(4-nitro-fenil)1.4.7.10- tetraaza-ciklododekán-1 -ecetsav-1 -metil-észtert [D) példa szerint előállítva], majd a szuszpenzióhoz egy adagban hozzáadunk 1,022 g (6,12 mmol) etilbróm-acetátot. A keveréket 4 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd a szuszpenziót vákuumban szűqük, a szűrőlepényt 15 ml acetonitrillel kétszer átmossuk, majd a szűrletet vákuumban 38 °C hőmérsékleten betöményítjük, amikor is a cím szerinti tetraésztert nyerjük bíborszínű, szilárd anyag formájában. A kapott tetraésztert ezután kromatografálással tisztítjuk (szilikagél, 5% C₂H₅OH/CHC1j, majd oldószerrendszer 3), amikor is 620 mg (0,988 mmol, 52%) kívánt terméket nyerünk.

FABMS [M+H]+=624.

Ή-NMR (CDClj):

8,24 (d), 7,45 (d), 4,94 (s), 4,35-4,10 (m), 3,79 (s), 3,75-1,84 (m), 1,34-1,22 (m);

C-NMR (CDClj):

174,3, 173,8, 173,6, 171,5, 147,6, 138,9, 131,5,

123,4, 64,8, 61,5, 61,4, 60,2, 55,4, 55,0, 53,1, 52,9,

52.7, 52,4, 51,9, 51,7,48,8,48,3,44,9,19,1,14,1.

2. példa

a.-(4-Nitro-fenil)-l, 4,7,10-tetraaza-ciklododekán1.4.7.10- tetraecetsav ml 6 n sósavban feloldunk 300 mg (0,478 mmol) a-(4-nitro-fenil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán1.4.7.10- tetraecetsav-monometil-trietil-észtert (1. példa szerint előállítva), majd a kapott keveréket visszafolyatás közben egy éjszakán át forraljuk. A visszafolyatás végén az oldatot vákuumban 70 °C hőmérsékleten betöményítjük, a kapott szilárd anyagot 3 ml vízben feloldjuk, szűqük, és a szűrletet betöményítjük. Ily módon 253 mg (0,378 mmol, 79%) nyersterméket nyerünk, amelyet preparatív TLC-kromatográfíával tisztítunk (szilikagél, kifejlesztés 20% NH_4OAc/CH₃OH, tömeg/térfogat%).

Ή-NMR (D₂O):

8,21 (d), 7,42 (d), 4,83 (s), 3,83-2,19 (m), 1,92 (s);

FAB MS=[M+H]⁺=526.

'3C-NMR (D₂O):

175,0, 173,6, 171,8, 167,0, 166,3, 146,9, 138,3,

130,1, 123,0, 62,2, 54,0, 53,0, 52,2, 50,4, 97,3, 46,8,

44.8, 42,8, 20,0.

3. példa

v.-(4-Amino-fenil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán1.4.7.10- tetraecetsav; (BA-DOTA)

A) módszer

A tetraecetsav nitrocsoportját (2. példa szerint előállított vegyület) katalitikusán hidrogénezzük Adams-katalizátor (PtO₂) és hidrogén felhasználásával, amikor is

HU 219 485 Β lényegében kvantitatív kihozatallal nyerjük a cím szerinti terméket.

Ή-NMR (D₂0):

8,12 (d), 7,86 (d), 5,66 (s), 4,73-4,57 (m), 4,27-3,78 (m), 3,39-2,91 (m);

¹³C-NRM (D₂O):

176,54, 176,52, 176,46, 141,1, 128,9, 120,9, 112,5, 65,0, 555,9, 55,7, 53,6, 49,7, 49,5, 49,3, 45,7, 45,4,

44,9,44,6,41,4.

A terméket még FAB-analízissel ([M+H]⁺=496), valamint anioncserés HPLC-kromatográfiával (Q-Sepharose™) is jellemeztük.

B) Módszer

Egy másik módszer szerint a cím szerinti vegyületet úgy állítjuk elő, hogy a D) példa szerinti monoésztertetraamin-vegyületet monosav-tetraamin-vegyületté alakítjuk (6 n sósav, egy éjszakán át való visszafolyatás), majd a kapott terméket vizes közegben alkilezzük brómecetsav alkalmazásával, majd a nitrocsoportot amincsoporttá redukáljuk (PtO₂-katalizátor), amikor is a fenti fizikai állandókkal rendelkező vegyületet nyerjük.

4. példa

a.-(4-Nitro-fenil)-l ,4,7,10-tetraaza-ciklododekán1,4,7-triecetsav ml 6 n sósavban feloldunk 2,0 g (5,48 mmol) monoészter-tetraamin-vegyületet [D) példa szerint előállítva], a keveréket ezután 95 °C hőmérsékleten körülbelül 10 órán át melegítjük, majd vákuumban 75 °C hőmérsékleten betöményítjük, amikor is 2,53 g (5,11 mól, 96%) monosav-tetraamin-tetrahidrokloridot nyerünk sárga, szilárd anyag formájában.

A fentiek szerinti monosav-tetraamin-tetrahidrokloridot (0,5 g, 1 mmol) feloldunk 15 ml vízben, és a pH-t nátrium-hidroxiddal 9-re beállítjuk. Ezután brómecetsav-oldatot készítünk külön (0,71 g, 5,13 mmol), majd a fenti vizes oldathoz adagoljuk. A pH értékét ismételten 9-re beállítjuk, és ezen az értéken tartjuk a reakció ideje alatt kis mennyiségű 1 n nátrium-hidroxid adagolásával. A reakciókeveréket keveqük, és különböző időpontokban aliquot részeket veszünk ki, hogy az alkilezési reakció lefolyását anioncserés HPLC segítségével kimutassuk. Amikor a dialkilezett termék (mindhárom acetátcsoport jelen van) mennyisége a maximumot elérte, a reakcióterméket liofilizáljuk, és ily módon sötét színű, szilárd anyagot nyerünk. Az alkilezett termékek ezen nyerskeverékét ezután szilikagélen kromatografáljuk (oldószerrendszer 1), majd ezt követően preparatív anioncserés kromatográfiával (0-100% 1 mól NH₄OAc), majd preparatív TLC-kromatográfiával (kifejlesztés, oldószerrendszer 4), végül szilikagélen végzett kromatografálással (oldószerrendszer 4) tisztítjuk. E hatásos tisztítási folyamat után sárga, szilárd anyag formájában 30 mg (0,06 mmol, 6%) cím szerinti vegyületet nyerünk.

FABMS: [M+H]+=468.

•H-NMR (D₂O):

8,12 (széles s), 7,35 (széles s), 4,76 (s), 3,57-3,44 (m), 2,97-1,83 (m), 1,80 (s);

¹³C-NMR (D₂O):

181,75, 180,68, 179,00, 175,37, 147,70, 141,22, 133,08,123,53, 68,44, 59,72, 56,00, 52,80,49,96,49,29, 47,86,45,36,44,26,42,78,42,25, 23,72.

5. példa

a.-(4-Amino-fenil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán1,4,7-triecetsav-pentahidroklorid és a.-(4-amino-fenil)-l,4,7,l 0-tetraaza-ciklododekán-l, 4,10-triecetsav-pentahidroklorid

A 4. példa szerinti eljárással az alkilezett termékek nyerskeverékét állítjuk elő, majd a kapott keveréket szilikagélen kromatografáljuk (20 tömeg/térfogat% NH₄OAc/CH₃OH), majd a megfelelő frakciókat egyesítjük és szárazra pároljuk. A nyersterméket, amely jelentős mennyiségű NH₄OAc-t tartalmaz, 80 ml NANOpure™-vízben oldjuk, majd liofilizáljuk, amikor is világosbarna, szilárd anyagot nyerünk. Ezt az anyagot 20 ml NANOpure™-vízben oldjuk, elkeverjük PtO₂-katalizátorral, és hidrogénatmoszférában a hidrogénfelvétel megszűntéig hidrogénezzük. A katalizátort ezután vákuumban szűréssel eltávolítjuk, a szűrletet liofilizáljuk, a kapott sárga színű, szilárd anyagot 3 ml 4-es számú oldószerrendszerben feloldjuk, majd szilikagélen kromatografáljuk, az eluálást szintén 4-es számú oldószerrendszerrel végezve. Az egyesített frakciókat ezután vákuumban ledesztilláljuk, majd a kapott terméket liofilizáljuk, amikor is 779,6 mg világossárga színű, szilárd anyagot nyerünk. Az elvégzett ¹³C-NMR, valamint protonNMR-vizsgálat szerint a kapott termék 50/50 arányú keveréke a két lehetséges geometriai izomernek. Ezt az izomerkeveréket feleslegben alkalmazott sósavval elkeverjük, majd liofilizáljuk, amikor is 548,4 mg (61%) cím* szerinti vegyületet nyerünk, olvadáspont : >270 °C. Az elvégzett anioncserés kromatográfiás vizsgálat szerint (HPLC, oldószerrendszer III) egy fő csúcs van (>94% tisztaság), FAB MS: [M+H]+=438.

6. példa

a.-[2-(4-Nitro-fenil)-etil]-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav, 1,4,7,10- tetrametil-észter 1,43 g (3,63 mól) a-[2-(4-nitro-fenil)-etil]-l,4,7,10tetraaza-ciklododekán-1-ecetsav-1-metil-észtert [B) példa szerint előállítva] feloldunk 40 ml argongázzal öblített acetonitriiben, hozzáadunk 1,71 g (12,34 mmol) vízmentes kálium-karbonátot erőteljes keverés közben, majd 1,78 g (11,61 mmol) metil-bróm-acetátot adagolunk, és a kapott keveréket 25 °C hőmérsékleten 48 órán át keverjük. Az elvégzett TLC-analízis szerinti új terméket nyertünk (R_f=0,62, oldószerrendszer 2), amelyhez 6 g flash-szilikagélt adagolunk, majd az acetonitrilt forgó bepárlóban eltávolítjuk. A visszamaradó anyagot 1x16 inch méretű szilikagéloszlopra viszszük fel, amelyet előzőleg 5%-os metanolos kloroformmal eluáltunk. A kapott oldat körülbelül 400 ml-ét eluáljuk több ízben, hogy különböző, nem poláros szennyezést, valamint a nem reagált alkilezőszert eltávolítsuk. Az oldószerrendszer 2 felvitele után a terméket tartalmazó frakciókat (R_f=0,62) összegyűjtjük, betöményítjük, amikor is 2,1 g (3,44 mmol, 95%) cím szerinti vegyületet nyerünk sárga, üveges anyag formájá14

HU 219 485 Β bán. Az elvégzett ¹ H-NMR-vizsgálat szerint a kapott tennék a geometriai izomerek 2:1 arányú keveréke.

•H-NMR (CDClj, 50 °C):

8,137 (d), 8,128 (d), 7,398 (d), 7,385 (d), 3,82 (s), 3,76 (s), 3,75 (s), 3,74 (s), 3,68 (s), 1,5-3,52 (m);

•3C-NMR (CDClj, 50 °C, 75 MHz) :

175,8, 174,2, 174,1, 174,0, 149,0, 129,5, 129,3, 123,6, 60,1, 555,1, 52,8, 52,7, 52,6, 52,4, 52,2, 52,1, 52,0, 51,2, 51,1, 51,0,49,1,48,8,47,5,45,2, 34,2, 32,6.

7. példa

а. -[2-(4-Amino-feml)-etil]-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,1O-tetraecetsav-1,4,7,10-tetrametilészter

400 mg 10% szénhordozós palládiumkatalizátort tartalmazó 25 ml metanolban feloldunk nitrogénatmoszférában 1,41 g (2,31 mól) a-[2-(4-nitro-fenil)-etil]1.4.7.10- tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav1.4.7.10- tetrametil-észtert (6. példa szerint előállítva), majd feleslegben hidrogéngázt áramoltatunk keresztül az oldaton 10⁵ Pa nyomáson 3 órán át. A TLC-vizsgálat ninhidrinre erősen pozitív anyag képződését mutatja ki (R_f=0,62, oldószerrendszer 2). A metanolos katalizátorszuszpenziót ezután Celiten leszűijük, a szűrletet bepároljuk, amikor is 1,21 g (2,08 mmol, 91%) cim szerinti vegyületet nyerünk fehér, üvegszerű szilárd anyag formájában (a konformációs izomerek 2:1 arányú keveréke). A kis mennyiségű konformációs vagy geometriai izomereket a fő izomerektől flash-kromatográfiával választjuk el (10%-os metanolos kloroform), amikor is a cím szerinti vegyületet nyerjük szürkésfehér por formájában, olvadáspont: 89-95 °C.

•H-NMR (CDClj, 50 °C):

б, 94 (d), 6,89 (d), 6,69 (d), 6,66 (d), 3,91 (s), 3,80 (s), 3,78 (s), 3,74 (s), 3,73 (s), 3,72 (s), 3,71 (s), 1,5-3,5 (m), •3C-NMR (CDClj, 50 °C, 75 MHz):

176,1, 174,0, 173,9, 172,2, 170,4, 169,6, 144,2,

144,1, 130,6, 130,5, 129,5, 129,1, 115,9, 115,8, 62,6,

58.7, 55,1, 54,3, 52,7, 52,5, 52,3, 52,2,52,1, 52,0, 51,9,

51.8, 51,7, 50,2, 50,0,47,3,44,7,32,8,31,8, 30,0,25,2;

FAB MS: m/e 602 [M+Na+], 618 [M + K+J+, [624 M+2Na+-H+]⁺.

8. példa a-[2-(4-Amino-fenil)-etilJ-l, 4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav; (PA-DOTA) ml koncentrált sósavban feloldunk 1,5 g (2,59 mmol) a-[2-(4-amino-fenil)-etil]-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav-1,4,7,10-tetrametil-észtert (a 7. példa szerint előállított 2:1 arányú nyerskeverék), majd a reakciókeveréket visszafolyatás közben körülbelül 105 °C hőmérsékleten 6 órán át melegítjük. Az elvégzett TLC-vizsgálat (oldószerrendszer

1) az észter átalakulását jelzi a cím szerinti vegyületté (R_f=0,88), hidrokloridsó formájában (R_f=0,43). A fölösleges oldószert forgó bepárlóban eltávolítjuk, és a visszamaradó fehér, szilárd anyagot szárítjuk. A cím szerinti vegyületet hidroklorid sója formájában nyerjük, mennyisége 1,6 g.

•H-NMR (D₂O, pD=l,0, 90 °C):

7,48 (d), 7,42 (d), 28-4,3 (m), 2,23 (m), 2,03 (m);

•3C-NMR (D₂O, pD=l,0, 90 °C, 75 MHz):

176,4, 174,9, 171,6, 144,7, 132,9, 132,8, 130,4,

125,7, 61,7, 56,8, 56,0, 53,7, 53,1, 51,6,47,9, 34,3, 37,6.

FAB MS: m/e [MH]+, 546 [M+Na+]+, 568 [M+2Na⁺-H⁺]⁺.

Flash-kromatográfiával és oldószerrendszer 1 alkalmazásával az észter minden szennyező nyomát eltávolíthatjuk, ehhez a flash-kromatografáló oszlopra 1,1 g cím szerinti terméket adagolunk hidroklorid sója formájában. A cím szerinti vegyületet tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, kevert ammónium-kálium-só formájában, mennyisége 580 mg.

Az elvégzett HPLC-analízis szerint az anyag tisztasága nagyobb, mint 98% 230 és 254 nm-nél meghatározva.

FAB MS: m/e 562 (M+K)⁺, 584 [M+K⁺+Na⁺-H+], 600 [M+2K+-H+J+.

9. példa

a.-[2-(4-Amino-fenil)-etil]-l,4,7,10-tetraazaciklododekán-l,4,10-triecetsav, kevert kálium- és ammóniumsók izolálása

2,05 g tetra- és trisavból álló keveréket (mindkettő a

8. példa szerinti eljárással előállítva) minimális mennyiségű 1. számú oldószerrendszerben feloldunk, majd -38x7 cm méretű flash-kromatografáló szilikagéloszlopra adagoljuk, amelyet előzőleg az oldószerrel eluáltunk. A cím szerinti vegyületet tartalmazó frakciókat (R_f=0,63, 1. oldószerrendszer) összegyűjtjük, ezek 200 mg cím szerinti vegyületkeveréket tartalmaznak. Az elvégzett *H- és ^{8 * * * * 13}C-NMR-vizsgálatok szerint a trisav szimmetrikus izomer (1,4,10-trisav-helyzetű izomer).

•H-NMR (D₂O, pD=0,5 DCl-lel, T=90 °C):

7,52 (d), 7,46 (d), 3,60 (m), 3,54 (m), 3,19 (m);

•³C-NMR (D₂O, pD=0,5, T=90 °C):

176,1, 170,2, 140,0,132,7,131,1, 126,1, 57,6, 57,2,

56,1,54,9, 53,2,51,5,51,2,31,2.

FAB MS: m/e 466 [M+H+]\ 488 [M+Na⁺]+, 504 [M+K+J+, 526 [M+K-+Na+,-H⁺]+, 542 [M+ +2K-H)]+.

10. példa

a.-(2-Metoxi-5-nitro-fenil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav-tetrametil-észter 565 μΐ (5,97 mmol) metil-bróm-acetátot elkeverünk

580 mg (1,47 mmol) a-(2-metoxi-5-nitro-fenil)1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1 -ecetsav-metil-észterrel (N példa szerint előállítva) és 1,15 g (8,32 mmol) porított kálium-karbonáttal 20 ml acetonitrilben. A kapott keveréket szobahőmérsékleten 2 órán át keveijük, majd szűrjük, a szűrletet vákuumban betöményítjük, a visszamaradó olajos terméket kromatografáljuk (szilikagél, 8%-os metanolos metilén-klorid). A cím szerinti vegyületet sárga, szilárd anyag formájában nyerjük, mennyisége 469 mg (52%), TLC, R_f=0,4 (szilikagél, 10% CH₃OH CHClj-ban).

•3C-NMR (CDClj):

HU 219 485 Β

173,2, 172,6, 161,2, 139,1, 125,1, 124,6, 120,5,

110,7, 57,0, 55,6, 53,5, 52,6, 51,3, 50,8, 46,8,46,0,44,0.

11. példa

a.-(2-Metoxi-5-nitro-fenil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav A 10. példa szerinti vegyületet feloldjuk koncentrált sósavban (5 ml, J. T. Baker ULTREX), majd a kapott oldatot nitrogénatmoszférában 5 órán át visszafolyatás közben melegítjük. Az oldatot ezután vákuumban szárazra pároljuk, a visszamaradó szilárd anyagot kromatografáljuk (szilikagél, oldószerrendszer 6), amikor is 209 mg cím szerinti vegyületet nyerünk szürkésfehér, szilárd anyag formájában. A kapott anyagot tetrahidrokloridsóvá alakítjuk.

•³C-NMR (D₂O-DC1, 80 °C):

171,0, 166,9, 161,2, 139,0, 125,5, 119,3, 110,7,

56,8, 54,5, 52,7, 51,0,49,2,49,0,46,3,42,9.

12. példa ct.-(2-Metoxi-5-amino-fenil)-l, 4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav, tetraammóniumsó 157 mg 11. példa szerint nyert vegyületet feloldunk ml vízben, hozzáadunk 20 mg platina-oxidot, és a kapott keveréket 10⁵ Pa nyomáson 1 órán át szobahőmérsékleten hidrogénezzük. A keveréket ezután szüljük, a szűrletet kromatografáljuk (szilikagél, 5 oldószerrendszer, amikor is 141 mg cím szerinti vegyületet nyerünk szürkésfehér, szilárd anyag formájában.

•³C-NMR (D₂O-DC1):

175,5,172,6,172,3,159,9,128,8,127,5,124,6,123,8,

115,5, 61,2, 58,1, 57,3, 55,7, 53,4,51,6,49,6,47,4.

14. példa l-(2-Metoxi-5-nitro-benzil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-4,7,10-triecetsav,-4,7,10-trimetil-észter 20 ml acetonitrilt elkeverünk 1 g l-(2-metoxi-5nitro-benzil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekánnal [E) példa szerint előállítva], majd hozzáadunk keverés közben 1,6 g (11 mmol) metil-bróm-acetátot egy részletben. 1 óra elteltével 0,3 g kálium-karbonátot keverünk folyamatosan szobahőmérsékleten a keverékhez 12 óra leforgása alatt, majd a keveréket szüljük, a szűrletet vákuumban betöményítjük, a visszamaradó anyagot oszlopkromatografáljuk (szilikagél, CH₃CN/CH₃OH=9:1, térfogat/térfogat), amikor is a cím szerinti triésztert nyerjük fehér, szilárd anyag formájában, 68%-os kitermeléssel.

•H-NMR (CDClj):

8,19 (d), 8,14 (s), 7,18 (d), 2,58-3,99 (m);

•³C-NMR (CDC1₃):

173,53, 172,83, 164,59, 142,28, 128,51, 127,69, 126,49, 112,30, 57,25, 56,90, 55,03, 54,21, 53,06, 52,09, 52,0, 51,54, 50,68, 50,30, 49,85, 49,63, 49,31, 49,00,48,68,48,37,48,05,47,70,47,39.

75. példa

-(2-Metoxi-5-nitro-benzil)-l, 4,7,10-tetraaza-ciklododekán-4,7,10-triecetsav ml 6 mólos sósavban feloldunk 0,25 g (0,45 mmol) 14. példa szerint előállított vegyületet, és 100 °C hőmérsékleten 24 órán át keverjük. A reakciókeveréket ezután szobahőmérséklete hűtjük, 5 ml vizet adunk hozzá, és a kapott vizes oldatot fagyasztva szárítjuk. Az ily módon nyert drapp színű, szilárd anyagot oszlopkromatografáljuk (szilikagél, oldószerrendszer 5), a kívánt trisavat 60%-os kihozatallal szürkésfehér, szilárd anyag formájában nyerjük, olvadáspont: 228-230 °C (bomlik).

•H-NMR (D₂O):

8,18 (d), 8,09 (s), 7,12 (d), 3,87 (s), 2,10-3,60 (m);

³C-NMR(D₂O):

180,45, 179,80, 163,66, 140,22, 128,60, 126,24, 122,66, 111,50, 59,91, 59,06, 56,44, 52,75, 50,92,48,84.

16. példa

-(2-Metoxi-5-amino-benzil)-l ,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-4,7,10-triecetsav ml vizes oldatot, amely 50 mg PtO₂-t és 50 mg előző, 15. példa szerinti eljárással nyert terméket tartalmaz, nitrogéngázzal átöblítünk, majd Parr-hidrogénezőberendezésben 1 órán át hidrogénezzük, a kapott oldatot szűrjük, a vizes szűrletet fagyasztva szárítjuk, amikor is a kívánt anilinszármazékot nyeqük barnás, szilárd anyag formájában (95%), olvadáspont: >240 °C (bomlik).

•H-NMR (D₂O):

7,54 (széles s), 7,21 (d), 7,09 (d), 7,05 (s), 6,88 (s), 3,84 (s), 3,78 (s), 2,85-3,56 (m);

•³C-NMR (D₂O):

180,59, 179,77, 153,38, 124,16, 124,03, 122,82, 120,18, 113,68, 112,43, 59,06, 57,02, 55,96, 53,67,. 50,52, 50,08, 49,70, 49,04,48,32.

17. példa l-(2-Hidroxi-5-nitro-benzil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-4,7,10-triecetsav

200 mg (0,62 mmol) l-(2-hidroxi-5-nitro-benzil1,4,7,10-tetraaza-ciklododekánt [F) példa szerint előállítva] feloldunk 1 ml vízben, hozzáadunk 309 mg (2,2 mmol) bróm-ecetsavat és 3,5 ml (körülbelül 1 mól) nátrium-hidroxidot keverés közben szobahőmérsékleten. A reakció lefutását LC-kromatográfíával követjük (anioncsere, Q-Sepharose™), miközben a pH értékét nátrium-hidroxid szükség szerinti adagolásával 8 körüli értéken tartjuk. 12 óra elteltével a kapott oldatot fagyasztva szárítjuk, a szilárd anyagot oszlopkromatografáljuk (szilikagél, oldószerrendszer 5). A fő, sárga színű frakciót betöményítjük, vízben oldjuk, fagyasztva szárítjuk, amikor is a kívánt terméket világossárga poranyag formájában nyeqük, mennyisége 150 mg (49%), olvadáspont: 230-235 °C (bomlik).

•³C-NMR (D₂O):

166,41, 165,60, 160,00, 119,91, 116,02, 113,85, 111,71,104,59,45,20,44,50,43,96, 36,43.

18. példa l-(2-Hidroxi-5-amino-benzil)-l, 4,7,10-tetraaza-ciklododekán-4,7,10-triecetsav ml vízben feloldunk 200 mg (0,4 mmol) 17. példa szerinti eljárással nyert vegyületet, argonnal átöblít16

HU 219 485 Β jük, majd hozzáadunk 30 mg PtO₂-t, és Parr-berendezésben a keveréket hidrogénezzük. A sárga szín teljes eltűnése után az oldatot argonnal átöblítjük, majd szűrjük, a vizes oldatot fagyasztva szárítjuk, amikor is barnás, szilárd anyag formájában 146 mg (78%) cím szerinti vegyületet nyerünk.

19. példa l-a.-[2-(4-Nitro-fenil)-etil/-1,4,7,1O-tetraaza-ciklododekán-l-(R,S-ecetsav)-4,7,1O-trisz[(R)-v.-metilecetsav]-l-izopropil-4,7,1O-trimetil-észter; (PN-DOTMA trimetil-izopropil-észter)

100 g (2,37 mmol) a-[3-(4-nitro-fenil)-propil]1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1 -ecetsav-1 -metil-észtert (P példa szerint előállítva) feloldunk 35 ml vízmentes acetonitrilben, hozzáadunk 1,15 g (8,32 mmol) vízmentes kálium-karbonátot erőteljes keverés közben, nitrogénatmoszférában, majd tejsav-metil-észter optikailag aktív α-benzolszulfonát származékát adagoljuk hozzá (1,79 g, 7,39 mmol, S:R=98,2), és a kapott keveréket szobahőmérsékleten 60 percen át keverjük. Az elvégzett TLC-analízis új termék képződését mutatja ki (R_f=0,71, oldószerrendszer 2, a cím szerinti tetraészterre, és R_f=0,89 a triészterre). A kapott oldatot a szuszpendált karbonátsóval 40 ml kloroformmal elkeverjük, és a kiváló szervetlen sót szűrjük. Az oldószert a szűrletből eltávolítjuk, és a kapott nyers, narancsszínű olajos anyagot kétszer kromatografáljuk 1x16 inch méretű flash-szilikagéloszlopon, oldószerrendszer 2 eluens alkalmazásával. Ily módon a cím szerinti vegyületet kapjuk mint a tetraészter-diasztereomerek nem rezolvált keverékét (1,00 g, 1,47 mmol, 62%), a termék alulalkilezett terméket nem tartalmaz.

Az Ή-NMR-analízis szerint ez az anyag körülbelül 0,5 ekvivalens nemreagált benzolszulfonát-származékot tartalmaz. Az anyag NMR-spektruma 60 °C hőmérsékleten kloroformban nem összefolyó.

‘H-NMR (CDClj, 60 °C):

7,9-8,1 (m, 2H), 7,2-7,4 (m, 2H), 5,06 (m, 1H), 3,4-4,0 (m, 9H), 1,7-3,4 (m, 20H), 1,0-1,7 (m, 15H);

IR (CDClj) cm-‘:

2980, 2840, 1725, 1710 (észter-karbonil), 1590, 1510,1440,1340;

FAB MS m/e 702 (M+Na+]⁺, 687.

20. példa l-a-[2-(4-amino-fenil)-etil]-l,4,7,10-[tetraaza-ciklododekán-l-(R,S-ecetsav)-4,7,10-trisz-[(R)-d-metilecetsav]-l-izopropil-4,7,10-trimetil-észter;

(PA -DOTMA trimetil-izopropil-észter)

950 mg (1,4 mmol, nem korrigált) 19. példa szerint előállított vegyületet, amely reagálatlan a-[3-(4-nitro-fenil)-propil]-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1 -ecetsav-1-metil-észtert tartalmaz, feloldunk 10 ml 30%-os vizes metanolban, amely 1 g 10%-os szénhordozós palládiumkatalizátort is tartalmaz, nitrogénatmoszférában, majd feleslegben hidrogéngázt vezetünk rajta keresztül 7 órán át. Ezután TLC-vizsgálatot végzünk, amely ninhidrinre erősen pozitív anyag képződését mutatja ki (R_f=0,62, oldószerrendszer 2, R_f=0,71 a kiindulási anyagra). A metanolos katalizátorszuszpenziót ezután szűréssel Celiten elválasztjuk, majd az oldószert elpárologtatjuk, amikor is 800 mg nyers, cím szerinti vegyületet nyerünk tiszta olaj formájában, amely benzolszulfonsavat tartalmaz (R_f=0,09, oldószerrendszer 2), a benzolszulfonát-észter hidrogenolíziséből eredendően. A nyersolajat ezután 1x8 inch méretű flash-szilikagéloszlopon kromatografáljuk, amely a halványsárga sávokat eluálja. A cím szerinti terméket oldószerrendszer 2vel eluáljuk, ennek mennyisége 480 mg (52%), és a nem rezolvált diasztereomerek és geometriai izomerek keveréke. Az ‘H-NMR-spektrumban három különböző ab kvartettet figyeltünk meg az aromás régióban:

‘H-NMR (CDClj, 30 °C):

6,63-8,0 (m (kvartettek, 4H), 5,07 (m, 1H, izopropil-metin H), 3,53-3,9 (m, 13 H 33 szingulettel: 3,85, 3,73, 3,69 és 3,56. 3,46 (m, 1H), 3,25 (széles t, 3H), 2-3,1 (m, 14H), 1,0-2,0 (m, 15H);

¹³C-NMR (CDClj, 30 °C) :

177,3, 177, 176,4, 176,2, 175,9, 173,4, 172,9,

170,6, 145,3, 144,9, 130,8, 129,7, 129,3, 129,1, 128,8,

128,4, 127,5, 126,3, 115,2, 115,1, 114,9, 69,0, 68,4,

67,3,61,6,57,8,57,4,56,7, 56,5, 56,4,52,9, 52,7, 52,1,

50.8, 50,7, 50,6, 47,3, 47,1 47,0, 46,9,46,5, 46,3, 46,1,

44.8, 44,5,44,3, 34,1, 32,9, 32,5, 32,2, 31,8, 24,8, 22,2,

22,1, 22,21,8,21,6,15,8,14,9, 7,7, 7,5, 7,4, 7,1;

IR (CDClj) cm-‘:

2960,2840, 1720, 1510,1450,1375;

FAB MS: m/e 672 [M+Na⁺]+, 686.

21. példa l-a.-[2-(4-amino-fenil)-etil]-l, 4,7,10-tetraaza-ciklododekán-l-(R,S-ecetsav)-4,7,10-trisz-[(R)-a.-metilecetsav];

(PA-DOTMA)

400 mg (0,59 mmol) 20. példa szerint előállított diasztereomerkeveréket feloldunk 50 ml 6 n sósavban, és 30 órán át visszafolyatás közben melegítjük. Az elvégzett TLC-analízis szerint (oldószerrendszer 1) az észter (R_f=0,98, oldószerrendszer 1) új termékké való konverziója mutatható ki két új folttal (R_f=0,6, magasabb diasztereomer, R_f=0,54, alacsony diasztereomer, oldószerrendszer 1, mindkettő folt UV, ninhidrin és jód-pozitív). A felesleges oldószert forgó bepárlóban eltávolítjuk, majd szárítjuk, amikor is a cím szerinti vegyületek nyers diasztereomerkeverékét nyerjük (403 mg), sósavas só formájában. A két diasztereomer preparatív elválasztását úgy végezzük, hogy 290 mg (0,51 mmol) nyers sót 1 χ 13 cm méretű szilikagél flashkromatografálóoszlopra adagoljuk, és oldószerrendszer 8-cal eluáljuk. A magasabb R_rértékű diasztereomert (119 mg, 0,21 mmol) tisztább formában nyeljük, mint az alacsonyabb R_rértékű diasztereomert (90 mg, 0,16 mmol), mivel a magasabb R_rértékű diasztereomert eluál tűk először az oszlopról.

Ή-NMR a magasabb R_rértékű diasztereomerekre:

‘H-NMR (D₂O, 90 °C. pp=7,5):

7,12 (d 2H), 6,80 (d, 2H), 3,66 (m, 1H), 3,57 (széles t, 3H), 2-3,4 (m, 19H), 1,89 (m, 1H), 1,37 (m, 1H),

1,15 (d, 3H), 1,10 (d, 3H), 1,06 (d, 3H);

HU 219 485 Β •3C-NMR (D₂0, 90 °C, pp=7,5):

184,4, 184,2, 184,0, 183,3, 135,9, 132,6, 131,7,

119,1, 78,2, 69,0, 61,7, 61,5, 61,1, 57,4, 54,1, 49,7, 49,6,48,2,47,7,47,2, 34,8, 33,8, 9,6, 9,1, 9,0;

FAB MS: m/e 566 [M+H+J+, 588 (M+Na⁺]+, 604 (M+K+]⁺, 626 [M+K++Na+-H+]+, 642 (M+2K+-H+J+.

Végtermékek - komplexek előállítása

A fém-ligandum komplexeket különböző módszerek szerint állítottuk elő. Ezen módszerek során a fémet és a ligandumot vizes oldatban elkevertük, miközben a pH-t a kívánt értékre állítottuk be. A komplexálást sókat és/vagy puffereket, valamint vizet tartalmazó oldatban végeztük. Esetenként az oldatokat melegítettük, és ekkor magasabb komplexkitermelést értünk el, mint mikor a komplexálást környezeti hőmérsékleten végeztük. Megállapítható volt az is, hogy a BFC-vegyületek szintézisénél végzett feldolgozási művelet szintén befolyásolja a komplexálást.

22. példa

a.-(4-Amino-fenil)-l, 4,7,10-tetraaza-ciklododekán1,4,7,1O-tetraecetsav-ammóniumsó-szamárium (III) komplex;

Sm(BA-DOTA) mg (0,094 mmol) a-(4-amino-fenil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-l,4,7,10-tetraecetsavat (3. példa szerint előállítva) feloldunk 10 pl vízben, és elkeverjük 3 ml 0,043 mólos Sm(OAc)₃-oldattal (48,8 mg, 0,128 mmol) pH=6-7 körüli értéken. A kapott oldatot ezután 100 °C hőmérsékletre melegítjük, és a komplexálás mértékét anioncserés HPLC segítségével határozzuk meg. Ilyenkor az anioncserés kromatográfiával (HPLC System III) követett komplexálás befejeződött, a komplex oldatát szobahőmérsékletre lehűtjük, és fagyasztva szárítjuk. A szamáriumkomplexet szilikagél kromatográfiával tisztítjuk (oldószerrendszer 1), amikor is a cím szerinti vegyületet 82%-os kihozatallal nyeljük. A kapott komplexet TLC-vel, FAB MS-módszerrel, anioncserés HPLC-vel azonosítjuk.

•H(D₂O):

8,94, 7,81, 7,21, 6,97,6,80, 5,63, 5,01,4,58,4,01, 3,56, 1,78,1,53,1,24,1,10,0,77, -2,80, -2,95, -3,21, -3,91;

¹³C-NMR (D₂O):

190,3, 184,9, 181,4, 146,8, 143,3, 122,7, 116,4,

80,8, 72,6, 64,2, 57,2, 55,8, 54,7, 53,4, 51,5,49,7,45,5,

43,5,23,6.

FABMS: [M+H⁺]⁺=645 (Sm-izotópjel).

23. példa

a.-(4-Amino-fenil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán1,4,7, lO-tetraecetsav-szamárium(III) komplex

150 pl Sm-153-oldatot (3xl0~⁴ mól, 0,1 n sósavban) és 600 μΐ SmCl₃-at (3xl0~⁴ mól) elkeverünk 0,1 n sósavval, majd hozzáadunk 5 μΐ 2 mólos NaOAct, majd 45 μΐ 50 mmol-os ligandumot (3. példa szerint előállítva) HEPES-pufferban. Az oldat pH-értékét 7-re állítjuk be 275 μΐ 0,5 mólos HEPES-puffer alkalmazásával. Ezt az oldatot két, 500-500 μΐ-es frakcióra választjuk szét, és az egyik frakciót 1 órán át 100 °C hőmérsékleten melegítjük.

Az oldatokat ezután SP-Sephadex™ kationcserés gyantán engedjük át, a komplex formában lévő fém százalékos mennyiségét az előzőekben leirt módszer szerint határozzuk meg. A kapott eredmény szerint 99,6%-a a fémnek van komplexálva a melegített mintában, és 96,6% a nem melegített mintában.

A kelátok stabilitása a pHfüggvényében

A fém-ligandum komplexek stabilitását különböző pH-értékeknél vizsgáltuk, meghatározva a komplexek mennyiségét az oldatban. Alacsony pH-értéknél a ligandum protonálódása következtében fémfelszabadulás következhet be. Magas pH-értéknél a fém-hidroxidok is részt vesznek a kelátképződésben. Ezért inért kelátok kutatása esetén szükséges, hogy az inért kelát magas és alacsony pH-értéknél egyaránt stabil maradjon.

A találmány szerinti kelátok pH-függvényében való stabilitását a következő példákban ismertetett módszerek szerint vizsgáltuk. Egyes esetekben a nem komplexálódott fémet az oldat kationcserélő gyantán való áteresztésével eltávolítottuk. A komplex oldatok 1-14 közötti pH-értékének beállításához híg nátrium-hidroxidot és sósavoldatot alkalmaztunk. A komplex fémtartalmának meghatározását az előzőekben ismertetett módszerek szerint végeztük.

Hasonlóképpen bifunkcionális kelátkonjugátumokat állítottunk elő, és pH=2,8,4 és 6,0 értéknél vizsgáltuk. Az oldatban maradó konjugátum mennyiségét HPLC-módszerrel határoztuk meg radiometrikus detektor alkalmazásával. A kapott eredményeket a következő biológiai rész XX példájában foglaljuk össze.

24. példa

a.-(4-Amino-fenil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán1,4,7,10-tetraecetsav-szamárium(III) komplex stabilitása a pH függvényében

A 22. példa szerinti melegített és nem melegített mintákat 2x250 μΐ mennyiségű aliquot részekre választottuk szét. Az egyik 250 μΐ mennyiségű mintának a pH-ját a következő táblázatban összefoglalt értékekre állítottuk be sósav alkalmazásával. A második 250 μΐ mennyiségű mintát nátrium-hidroxid segítségével állítottuk be a kívánt pH-értékre. Amikor a minta a kívánt pH-értéket elérte, 25 μΐ mennyiségű aliquot részt vettünk ki belőle, és meghatároztuk a komplex fémtartalmát az előzőekben ismertetett módon. A kapott eredményeket a következő táblázatban foglaljuk össze:

PH	Komplex%
Hőkezelt	Nem hókezelt
1	98,9	92,7
3	99,6	93,3
5	99,6	92,9
7	99,6	95,7
9	99,9	95,8
11	99,6	95,7
13	99,6	94,5

HU 219 485 Β

A táblázat adataiból kitűnik, hogy a találmány szerinti komplexek stabilak, függetlenül a melegítéstől, illetve a pH-értéktől.

25. példa

u. -(4-Amino-fenil)-l ,4,7,10-tetraaza-ciklododekán1.4.7.10- tetraecetsav-ittrium(III) komplex μΐ 1,4 mg/100 μΐ koncentrációjú a-(4-aminofenil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav-oldatot (3. példa szerint előállítva) adagoltunk 100 μΐ 0,03 mólos Y(OAc)₃-oldathoz, amely Υ-90-et tartalmaz. Az így kapott oldathoz ezután 500 μΐ vizet, majd 125 μΐ 0,5 mólos NaOAc-t adagoltunk, majd 265 μΐ vizet, hogy az oldat össztérfogatát 1 ml-re egészítsük ki. Az így kapott oldatot ezután két részre osztottuk. Az egyik részt 100 °C hőmérsékleten 1 órán át melegítettük, majd mind a melegített, majd a nem melegített mintában meghatároztuk a komplex fémtartalmát az előzőekben ismertetett kationcserés eljárással. A kapott eredmények szerint 84% fémtartalma volt a melegített, illetve a nem melegített mintának.

26. példa a-(4-Amino-fenil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán1.4.7.10- tetraecetsav-lutécium(III) komplex

A 3. példa szerint előállított a-(4-amino-fenil)1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsavból desztillált vízzel 1,63 mg/ml koncentrációjú oldatot készítettünk.

Lutécium-klorid-oldatot állítottunk elő 0,1 n sósavval 3,9 mg/ml (0,01 mól) koncentrációban. Jelzőként lutécium-177-et (0,3 mmol) alkalmaztunk.

μΐ 0,01 mólos lutéciumoldatot adagoltunk 2 μΐ Lu-177-oldathoz. A fentiek szerint készített ligandumot adagoltuk ezután hozzá, majd HEPES-pufferrel (0,1 mól, pH=7,6) a térfogatot 1 ml-re egészítettük ki. Az így nyert oldat ligandumra és lutéciumra nézve 0,03 mmólos volt. A kapott oldatot ezután 100 °C hőmérsékleten 1 órán át melegítettük, majd meghatároztuk a Lu mennyiségét, az előzőekben leírt kationcserés módszer segítségével, ez 86% volt.

27. példa

v. -(4-Izotiocianáto-fenil)-l, 4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav-szamárium(III) komplex mg (10,8 pmol) 22. példa szerinti előállított a-(4amino-fenil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10tetraecetsav-szamárium(III) komplexet feloldunk 400 pl vízben, hozzáadunk 50 pl tiofoszgént, majd 400 pl CHCl₃-at, és a kapott kétfázisú keveréket erőteljesen 30 percen át keverjük. Ezután a vizes fázist 500 pl CHCl₃-mal négyszer extraháljuk, a vizes fázist liofilizáljuk, amikor is a cím szerinti vegyületet nyerjük kvantitatív kitermeléssel.

A fentiek szerint előállított vegyület UV-spektrumában 272 és 282 nm-nél vannak sávok. Az elvégzett TLC-vizsgálat alapján (szilikagél, 75:25=CH₃CN:H₂O, térfogat/térfogat) az R_rérték 0,38, a kiindulási vegyület Rpértéke 0,19.

IR: (-SCN)=-2100cm->;

FABMS: [M+H+]+=687.

28. példa

а. -(4-Amino-fenil)-l ,4,7,10-tetraaza-ciklododekán1,4,7,10-tetraecetsav-ammóniumsó-ittrium(llI) komplex mg (160 mmol) 3. példa szerint előállított a-(4amino-fenil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10tetraecetsavat feloldunk 1 ml vízben, hozzáadunk 3 ml, 51 mg (192 mmol) Y(OAc)₃-at tartalmazó vizes oldatot. A kapott keveréket ezután pH=6-7-re beállítjuk, majd 100 °C hőmérsékleten 7 órán át melegítjük. Az így nyert oldatot ezután üveggyapoton átszűqük, liofilizáljuk, amikor is 126 mg sárga, szilárd anyagot nyerünk. Ezt az anyagot szilikagélen kromatografáljuk (1. oldószerrendszer), ily módon 71 mg (76%) kívánt komplex terméket nyerünk. Az elvégzett anioncserés analízis szerint a kapott termék retenciós ideje azonos az Sm-komplex retenciós idejével.

13C-NMR (D₂O):

180,8, 180,5, 179.9, 146,1, 133,4, 122,0, 116,1,

74,9, 66,3, 56,3, 55,8, 55,4, 55,1, 54,8, 52,2,46,0,44,0, 23,6;

•H-NMR (D₂O):

б, 90 (d), 6,70 (d), 4,40 (s), 3,45-3,06 (m), 2,71-2,10 (m), 1,75 (s).

FABMS: [M+H+]+=582.

29. példa a-(4-Izotiocianáto-fenil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-l, 4,7,10-tetraecetsav-nátriumsó-ittrium (III) komplex mg (17 pmol) 28. példa szerint nyert vegyületet feloldunk 400 pl vízben, majd hozzáadunk 64 pl tiofoszgént (felesleg), és 400 pl CHCl₃-at, majd a kapott keveréket erőteljesen 40 percen át keveqük. Ezen idő alatt többször kis mennyiségű szilárd nátrium-hidrogén-karbonátot adagolunk, hogy a pH-értéket 8 körüli értéken tartsuk. A reakció lejátszódása után a vizes réteget elválasztjuk, 1 ml CHCl₃-mal négyszer extraháljuk, majd liofilizáljuk. A cím szerinti vegyületet TLC-vel és UV-spektroszkópiával azonosítjuk.

30. példa

a.-[2-(4-Amino-fenil)-etil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav-ittrium(IIl) komplex-ammön iumsó;

NH₄[Y(PA-DOTA)J

A 8. példa szerint élőállított a-[2-(4-amino-fenil)etilj-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav-ligandumot kevert protonált ammóniumsóvá alakítjuk erősen kationos ioncserélő gyanta segítségével (SP-Sephadex™ C-25, Pharmacia). Az oszlopot ezután a protonált formát tartalmazó anyaggal desztillált vízzel átmossuk, majd a ligandum koncentrált vizes oszlopát feladjuk, majd desztillált vízzel átmossuk. A ligandumot az oszlopról 0,5 mólos ammónium-hidroxiddal eluáljuk. Az eluenst vízmentes formában alkalmazzuk.

HU 219 485 Β

0,0728 g (0,215 mmol) Y(OAc)₃-4H₂O-t feloldunk 5 ml desztillált vízben és 0,120 g (0,215 mmol) kevert protonált ammóniumsóhoz adagoljuk, amelyet 5 ml vízben oldottunk. Az így kapott oldatot ezután visszafolyatás közben melegítjük, és a pH értékét 7-re beállítjuk 0,1 mólos ammónium-hidroxiddal. 1 órás visszafolyatás közbeni melegítés után az oldatot lehűtjük és szárazra pároljuk. Az NH₄OAc-felesleget melegítéssel eltávolítjuk, a visszamaradó fehér, szilárd anyagot olajfürdón vákuumban 105 °C hőmérsékleten melegítjük. Ily módon 0,142 g (94%) cím szerinti vegyületet nyerünk, amely 1 ekvivalens ammónium-acetátot tartalmaz.

¹³C-NMR (D₂O, 88 °C, 75 MHz):

23,8, 27,6, 35,4, 49,6, 55,0, 56,2, 56,9, 57,1, 65,7, 68,0,121,7,132,6,138,8,180,7,181,4,182,0,183,1;

FAB MS: m/e 610 (pozitív ion, [M~+2H⁺]⁺), 608 (negatív ion, M~).

31. példa

v.-[2-(4-Amino-fenil)-etil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav-szamórium (III) komplex ammóniumsó;

NH₄[Sm(PA-DOTA)J

A 30. példa szerinti eljárást ismételtük meg azzal az eltéréssel, hogy az Y(OAc)₃-4H₂O helyett Sm(OAc)₃-3H₂O-t (0,082, 0,215 mmol) alkalmaztunk. Ily módon nyertük a cím szerinti vegyületet, 0,155 g (94%), amely 1 ekvivalens ammónium-acetátot tartalmaz.

¹³C-NMR (D₂O, 88 °C, 75 MHz):

23,5, 27,2, 35,6, 50,5, 54,5, 56,0, 57,2, 57,9, 69,5, 71,5, 122,3, 133,0, 139,7, 181,2, 188,4, 189,3, 190,9.

FAB MS: m/e 673 (pozitív ion, [M~+2H⁺]⁺, Smizotópjel), m/e 671 (negatív ion, M~, Sm-izotópjel).

32. példa

a.-[2-(4-Izotiocianóto-fenil)-etil)-1,4,7,10-tetraazaciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav-szamárium(III) komplex ammóniumsó;

NH₄[Sm(SCN-PA-DOTA)]

27,9 mg (381,56 g/mol, 73,1 pmol) Sm(OAc)₃-3H₂Ot feloldunk 10 ml desztillált vízben, elkeveqük 10 ml desztillált vízben oldott 42 mg PA-DOTA-val, kevert ammónium-káliumsó (632,97 g/mol, 66,4 pmol), majd a kapott keveréket gőzfürdőn melegítjük. 30 perc elteltével a reakció végbemegy [Sm(PA-DOTA) képződik HPLCanalízis szerint kimutatva]. Az oldatot ezután elkeveqük 45,4 mg (114,98 g/mol, 395 pmol) 10 ml kloroformban oldott CSCl₂-vel és választótölcsérben kirázzuk. A reakció körülbelül 1 perc alatt végbemegy (HPLC-analízis), pozitív ninhidrinreakció (0,2 t etanolban) hiánya, szilikagél TLC-lemezen, a kiinduló [SM(PA-DOTA)] kelát pozitív ninhidrinreakciót mutat). A kloroformos réteget eltávolítjuk, a vizes réteget 2x20-20 ml kloroformmal mossuk, a vizes fázist szárazra pároljuk, 100 ml acetonitril adagolásával, majd környezeti hőmérsékleten és nitrogénáramban végzett bepárlásával, amikor is 56 mg cím szerinti vegyületet nyerünk.

FAB MS : m/e 715 (pozitív ion, [M~+2H⁺]⁺, Smizotópjel), m/e 713 (negatív ion, M , Sm-izotópjel).

33. példa y^J+ pA-DOTA-val való kelátképzésének sebessége

HPLC-analizissel meghatározva

A PA-DOTA Y³+-ionnal való kelátképzésének sebességét vizsgáltuk a PA-DOTA-termék előállítása során alkalmazott feldolgozás függvényében. A kelátképzés kimenetelét HPLC segítségével követtük Alltech Econosphere™ Cl8 100 mm-es oszlop alkalmazásával. A következő gradienseket alkalmaztuk: A) 95:5 pH 6,0, 0,05 m NaOAc, puffer: CH₃CN, B) 30:70, pH 6,0, 0,05 m NaOAc, puffer: CH₃CN, A-B, 15 perc. A PA-DOTA hidrokloridsót (retenciós idő 1,31 perc) és a PA-DOTA kevert ammónium-káliumsót (retenciós idő=4,55 perc), amelyeket a 8. példa szerint állítottunk elő, 1,6 mólos oldat formájában alkalmazzuk, pH=6, 0,5 mól NaOAc-puffer. Mindkét oldatból 1 ml-t (1,6 pmol) 0,2 ml (8 pmol) A(OAc)₃ -4H₂O-oldattal (40 mmol, pH=6,0, 0,5 mól NaOAc-puffer) reagáltatunk. A kelátképződést a 3,96 perces R_rértéknél megjelenő csúccsal határozzuk meg (összehasonlítás a 30. példa szerinti mintával). A kelátképződés eredményeit a következő táblázatban foglaljuk össze.

PA-DOTA-só	Komplex%	Idő (perc/hőmérséklet)
PA-DOTA,	>90	< 1/szobahőmérséklet
HCl-só
PA-DOTA kevert	<10	15/szobahőmérséklet
ammónium-
káliumsó	>85	10/90 °C

A táblázat adataiból kitűnik, hogy a BFC tisztítási módszere hatással van a kelátképződés mértékére.

34. példa l-a-[2-(4-Amino-fenil)-etil]-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekón-l-(R,S)-ecetsav-4,7,10-trisz(metil-ecetsav)-szamórium(III) komplex, ammóniumsó; NH₄[Sm(PA-DOTMA)] mg Sm(OAc)₃-3H₂O-t feloldunk 2 ml desztillált vízben és 2 ml desztillált vízben oldott 30 mg a-[2-(4amino-fenil)-etil]-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1 (R,S)-4,7,10-trisz(metil-acetát)-ecetsavhoz (21. példa szerint előállított nagyobb Rf-értékű diasztereomer) adagoljuk. A pH=6,5-es oldatot ezután gőzfürdőn melegítjük, és a reakció lefutását HPLC-vel követjük. 30 perces melegítés után az oldatot forgó párologtatóban vákuumban szárazra pároljuk.

FAB MS: m/e 715 (pozitív ion, [M+2H⁺]⁺, Smizotópjel), 737 (pozitív ion, [M+H⁺+Na⁺]⁺, Sm-izotópjel), 713 (negatív ion, [M~], Sm-izotópjel).

A következő példákban a komplex oldatokat ioncserélő oszlopon bocsátottuk át a felesleges szabad fém eltávolítása érdekében. A labilis rendszerek ismételten egyensúlyba kerülnének, és hasonló mennyiségű szabad fém lenne jelen az oldatban. Az inért rendszerek nem kerülnek egyensúlyba, és a nem kelát formában jelen lévő fém mennyiségének csökkenni kell. Ily módon még ha a komplex alacsony kitermeléssel képződött is,

HU 219 485 Β a tisztítás, azaz az ioncserélő oszlopon való átengedés megfelelően stabil komplexet eredményez nem komplexált fém jelenléte nélkül.

35. példa a-(2-Metoxi-5-amino-fenil)-l,4,7,1O-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav-szamárium(HI) komplex

5,8 mg 12. példa szerint előállított a-(2-metoxi-5amino-fenil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10tetraecetsavat feloldunk 325 μΐ NANOpure™ vízben (3xl0“² mólos oldat), a kapott oldatból 10 μΐ-t kiveszünk, és elkeverünk 990 μΐ 3χ10~⁴ mólos SmCl₃-oldattal, amely SM-153-at tartalmaz (0,1 n sósav). A pH értékét ezután nátrium-hidroxiddal 7-re beállítjuk, majd az oldatot kétszer 500 μΐ-es frakciókra osztjuk, és az egyik frakciót 1 órán át 100 °C hőmérsékleten melegítjük. Mind a hőkezelt, mind a nem hőkezelt mintákban ezután meghatározzuk a fém százalékát komplex formájában a fentiekben leírt kationcserélő módszerrel. Az oldatot ezután SP-Sephadex™ gyantán átbocsátjuk, majd a komplexképzést ismételten meghatározzuk a tisztított mintákon. A kapott eredményeket a következő táblázatban foglaljuk össze.

37. példa a-(2-Metoxi-5-nitro-fenil)-l, 4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav-szamárium (III) komplex 7,9 mg 11. példa szerint előállított a-(2-metoxi-5nitro-fenil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10tetraecetsavat feloldunk 464 μΐ NANOpure™ vízben (3 χ 10~² mólos oldat), a kapott oldatból 10 μΐ-t elkeverünk 950 μΐ 0,1 n sósavval készült, 3x10 ⁴ mólos SmCl₃-oldattal (Sm-153-izotópot tartalmaz), majd a pH értékét nátrium-hidroxiddal 7-re beállítjuk. Az így kapott oldatot 2 χ 500 μΐ mennyiségű frakcióra bontjuk, az egyik részt 1 órán át 100 °C hőmérsékleten melegítjük. Ezután mind a hőkezelt, mind a nem hőkezelt mintákban meghatározzuk a komplex formájában lévő fémet az előzőekben ismertetett kationcserélési módszerrel. Az oldatokat ezután SpSephadex™ gyantán átengedjük, majd a komplexek mennyiségét a tisztított mintákon is az előzőek szerint meghatározzuk. A kapott eredményeket a következő táblázatban foglaljuk össze.

Hőkezelt Nem hőkezelt

Tisztított Nem Tisztított Nem tisztított tisztított

Hőkezelt Nem hőkezelt

Komplex⁰/» 100 72 100 46

Tisztított Nem Tisztított Nem tisztított tisztított

Komplex⁰/» 96 95 97 89

36. példa

a.-(2-Metoxi-5-amino-fenil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav-szamárium(III) komplex stabilitása a pH függvényében A 35. példa szerinti hőkezelt és nem hőkezelt minták mindegyikét 2 χ 250 μΐ-es részre osztjuk. Az egyik aliquot rész pH-ját sósavval, a másikét nátrium-hidroxiddal a következő táblázatban megadott értékekre állítjuk be. Miután a minták a kívánt pH-értéket elérték, 10 percen át állni hagyjuk, és meghatározzuk a komplex formájában jelen lévő fém mennyiségét a fentiekben már ismertetett kationcserélő módszerrel. A kapott eredményeket a következő táblázatban foglaljuk össze.

Komplex⁰/»

pH	Hőkezelt	Nem hőkczclt
2	95	94
3	97	95
5	98	97
7	96	97
9	98	96
11	97	98
13	100	99

38. példa

a.-(2-Metoxi-5-nitro-fenil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-l,4,7,10-tetraecetsav-Sm(III) komplex stabilitása a pH függvényében

A 37. példa szerinti hőkezelt és nem hőkezelt tisztított minták mindegyikét 2 aliquot részre osztjuk. Az egyik aliquot rész pH-ját hígított sósavval, a másikét nátrium-hidroxiddal a következő táblázatban megadott értékekre beállítjuk. Miután a minták a kívánt pH-értéket elérték, 10 percen át állni hagyjuk, majd meghatározzuk az előzőekben leírt kationcserélési módszerrel a komplexek fémtartalmát. A kapott eredményeket a következő táblázatban foglaljuk össze.

Tisztított

pH	Hőkezelt	Nem hőkezclt
2	99	99
4	100	100
5	100	100
7	100	100
9	100	100
11	100	100
13	100	100

39. példa

a.-(4-Nitro-fenil)-l, 4,7,10-tetraaza-ciklododekán1,4,7-triecetsav-szamárium(III) komplex 0,0219 mólos (100 μΐ, 2,195 mmol) 4. példa szerint előállított a-(4-nitro-fenil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklodo21

HU 219 485 Β dekán-l,4,7-triecetsavból nyert oldatot elkeverünk 0,043 mólos (25 μΐ, 1,05 mmol) Sm(OAc)₃-oldattal. Az így kapott keveréket anioncserés HPLC-nek vetjük alá (Q-Sepharose™ oszlop, 1x25 cm, folyási sebesség 2 ml/perc, eluálás 0-1 mólos NH₄OAc-gradienssel 30 percen át). 1 óra elteltével komplex alakul ki (R_f=ll,l perc) 77%-os kitermeléssel, és a komplex teljes mértékben elválik a ligandumcsúcstól (retenciós idő= 15,5 perc). További bizonyítéka, hogy a cím szerinti komplex kialakult, a szilikagéllemezen végzett TLC-analízis (oldószerrendszer 4), amelynél a ligandum R_f=0,59 és a komplex R_f=0,00 értéket mutat.

40. példa a-(4-Amino-fenil)-l, 4,7,10-tetraaza-ciklododekán1.4.7- triecetsav-szamárium(IIl) komplex és a.-(4-amino-fenil)-l, 4,7,10-tetraaza-ciklododekán-l, 4,10-triecetsav-szamárium(III) komplex

Az 5. példa szerint előállított izomerek 0,022 mólos oldatát (100 μΐ, 2,2 pmol) 0,043 mólos (6,4 μΐ, 0,275 pmol) Sm(OAc)₃-oldattal érintkeztetjük. A kapott reakciókeveréket ezután HPLC-anioncserés vizsgálatnak vetjük alá (Q-Sepharose™ oszlop, 1x25 cm, átfolyási sebesség 2 ml/perc, eluálás 0-0,25 mól gradiensű NH₄OAC-oldattal, 300 percen át). 40 perc elteltével a komplex kialakul (retenciós idő=9 perc) 66%-os kitermeléssel, és teljes mértékben elválik a ligandumcsúcstól (retenciós idő 18,5 perc).

41. példa (t-(4-Amino-fenil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán1.4.7- triecetsav-szamárium-153 komplex és a.-(4amino-fenil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekém-1,4,10triecetsav-szamárium-153 komplex

Az 5. példa szerint előállított a-(4-amino-fenil)1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7-triecetsav-pentahidrokloridból és a-(4-amino-fenil)-1,4,7,10-tetraazaciklododekán-l,4,10-triecetsav-pentakloridból 3 χ 10~² mólos oldatot készítünk 4,2 mg anyag 300 μΐ NANOpure™ vízben való oldásával. Az oldatból 10 μΐ-es aliquot részt 15 pl 0,1 n sósavval készült, 2 x 10 ² mólos SmCl₃- (Sm-153-tartalommal) oldathoz adagolunk, majd a térfogatot vízzel 1 ml-re kiegészítjük. A pH értékét ezután nátrium-hidroxiddal 7-re beállítjuk, az oldatot 500-500 μΐ-es frakciókra osztjuk, és az egyik frakciót 1 órán át 100 °C hőmérsékleten melegítjük.

Mind a hőkezelt, mind a nem hőkezelt mintákban meghatározzuk a fentiekben leírt kationcserélési módszenei a komplexek fémtartalmát. A kapott eredmények szerint 89%, illetve 96% fémtartalmat mutatnak a hőkezelt, illetve nem hőkezelt minták. ⁴²

42. példa a-(4-Amino-fenil)-l, 4,7,10-tetraaza-ciklododekán1.4.7- triecetsav-szamárium(III) komplex, és a.-(4-amino-fenil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,10triecetsav-szamárium(III) komplex stabilitása a pH függvényében

A 41. példa szerinti hőkezelt és nem hőkezelt minták mindegyikét 2 aliquot részre osztjuk, az egyik aliquot rész pH-ját sósavval, a másik rész pH-ját nátrium-hidroxiddal a következő táblázatban megadott pH-értékekre állítjuk be. Miután a minták a kívánt pHértéket elérték, még 10 percen át állni hagyjuk, majd meghatározzuk a komplexek fémtartalmát a fentiekben már ismertetett kationcserélési módszerrel. A kapott eredményeket a következő táblázatban foglaljuk össze.

Komplex%

PH	Hőkczelt	Nem hőkezelt
1	86	83
3	99	99
5	99	99
7	89	96
11	96	89
13	97	97

43. példa l-(2-Hidroxi-5-nitro-benzil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-4,7,10-triecetsav-szamárium(III) komplex A 17. példa szerint előállított vegyületből 3 χ 10 ² mólos oldatot készítünk 3,9 mg vegyület 260 μΐ NANOpure™ vízben való feloldásával. Az így nyert oldatból 10 μΐ-t elkeverünk 15 pl vizes 2x10 ² mólos SmCl3oldattal, amely 10 pl 0,1 n sósavas Sm-153-oldatot tartalmaz (3 x 10~⁴ mól). A térfogatot ezután 965 pl Dl H2O vízzel 1 ml-re kiegészítjük. A pH értékét ezután nátriumhidroxiddal 7-re beállítjuk, az oldatot két 500 μΐ-es frakcióra bontjuk, és az egyik frakciót 1 órán át 100 °C hőmérsékleten melegítjük. Mind a hőkezelt, mind a nem hőkezelt mintákban meghatározzuk a komplexek fémtartalmát. A kapott eredmények szerint 71%, illetve 74% a fémtartalom a hőkezelt, illetve nem hőkezelt mintákban.

44. példa l-(2-Hidroxi-5-nitro-benzil)-l, 4,7,10-tetraaza-ciklododekán-4,7,10-triecetsav-szamárium(IIl) komplex stabilizálása a pH függvényében

A 43. példa szerinti hőkezelt és nem hőkezelt mintákat két 250 μΐ-es aliquot részre bontjuk. Az egyik aliquot rész pH-ját sósavval, a másikét nátrium-hidroxiddal a következő táblázatban megadott értékekre beállítjuk. A mintákat, miután a kívánt pH-értéket elérték, még 10 percen át állni hagyjuk, majd meghatározzuk a komplexek fémtartalmát a fentiekben ismertetett módszer szerint. A kapott eredményeket a következő táblázatban foglaljuk össze.

Táblázat

PH	Komplex%
Hőkezelt	Nem hőkezelt
1	65	51
3	98	93
5	99	99
7	100	100

HU 219 485 Β

Táblázat (folytatás)

pH	Komplex%
Hőkezelt	Nem hőkezelt
9	100	99
11	100	96
13	100	98

45. példa l-(2-Hidroxi-5-amino-benzil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-4,7,10-triecetsav-szamárium(III) komplex A 18. példa szerinti eljárással nyert l-(2-hidroxi-5amino-benzil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-4,7,10triecetsavból 3x10 ² mólos oldatot készítünk 3,2 mg anyag 100 μΐ NANOpure™ vízben való feloldásával. Az így nyert oldatból 10 pl aliquot részt 20 μΐ-re hígítunk, majd elkeveqük 15 μΐ vizes 2x 10~² mól koncentrációjú SmClj-oldattal, amely Sm-153-at tartalmaz. A térfogatot ezután 1 ml-re kiegészítjük 250 μΐ DU H₂O és 20 μΐ 0,1 n nátrium-hidroxid adagolásával. A kapott oldatot ezután két 500 μΐ-es frakcióra bontjuk, az egyik frakciót 1 órán át 100 °C hőmérsékleten melegítjük. Ezután mind a hőkezelt, mind a nem hőkezelt mintákban meghatározzuk a komplexekben lévő fémtartalmat az ismertetett kationcserélési módszerrel. Amennyiben a fémtartalom 95%-nál kevesebb, az oldatot SP-Sephadex™ gyantán átengedjük, majd ismételten meghatározzuk a komplexek fémtartalmát. A kapott eredményeket a következő táblázatban foglaljuk össze.

Hőkczclt	Nem hőkezelt
Tisztított	Nem tisztított	Tisztított Nem tisztított
Komplex% 99	68	99 21

46. példa l-(2-Hidroxi-5-amino-benzil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-4,7,10-triecetsav-szamárium(III) komplex stabilizálása a pH függvényében

A 45. példa szerint előállított hőkezelt és nem hőkezelt, kromatográfiásan tisztított mintákat két 250 μΐes aliquot részre osztjuk. Az egyik aliquot rész pH-ját sósavval, a másikét nátrium-hidroxiddal a következő táblázatban megadott pH-értékekre beállítjuk. A mintákat, miután a kívánt pH-értéket elérték, még 10 percen át állni hagyjuk, majd meghatározzuk a komplexek fémtartalmát kationcserélési módszerrel. A kapott eredményeket a következő táblázatban foglaljuk össze.

pH	Komplex%
Hőkezelt	Nem hőkezelt
1	60	56
2	74	76

PH	Komplex%
Hőkezelt	Nem hőkczclt
3	84	87
5	97	98
7	99	99
9	99	98
11	99	99
13	99	99

Biológiai példák

Ismert, hogy az egy molekulán belül egy fém kelátképző csoportot, így például DTPA-t és egy reakcióképes linkért (aril-amint) tartalmazó bifunkcionális kelátok képesek kovalens kötéssel kapcsolódni különböző irányított cél-biomolekulákhoz, amelyek rák- vagy tumor-sejtepitópokra vagy antigénekre specifikusak. Az ilyen konjugátumok radioaktív magot tartalmazó komplexei felhasználhatók diagnosztikai és/vagy terápiás célra is, mivel radioaktív magot képesek a rákos vagy daganatos sejthez közvetíteni [Meares és munkatársai, Anal. Biochem. 142, 68-78 (1984); lásd még 215-216. oldal J. Protein Chem., 3 (2), (1984), Meares és Goodwin, továbbá 4 678 677 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, 1987. július 7., Warshawsky és munkatársai, 4 652 519 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, 1987. március 24, Brechbiel és munkatársai, Inorg Chem., 25, 2772-2781 (1986)]. Feltehető, hogy a radioaktív vagy luminescens fémet tartalmazó termék in vitro immunovizsgálatokban is alkalmazható.

A technika állása szerinti információk

A jelzett antitestek alkalmazhatósága több különböző tényezőtől függ. így például: 1. az antitest specificitásától, 2. a komplex inért voltától vagy stabilitásától, az alkalmazási körülmények között (azaz szérumstabilitás), és 3. az antitest integritásától, azaz, hogy az antitest specificitását és immunoreaktivitását a jelzési eljárás ne befolyásolja.

A komplexek stabilitása vagy inért volta különlegesen nagy fontosságú a radioaktív magot tartalmazó antitest-konjugátum diagnosztikai és/vagy terápiás szerként való felhasználásakor. A kinetikus labilitás instabilitáshoz vezethet például a szérumban, valamint a radioaktív magnak a komplexről való disszociációját okozza. Ily módon ez diagnosztikai és terápiás célra hatásosan nem alkalmazható. Ráadásul, ilyen esetben nagyobb a normál sejtek sugárzás útján való károsodása [Colé és munkatársai,/. Nucl. Med., 28, 83-90 (1987)].

A radioaktív mag antitesthez való kötése

A radioaktív magot az antitesthez úgy kötjük, hogy vagy a BFC-t kötjük az antitesthez valamely ismert módon, majd a radioaktív magot keláttá alakítjuk olyan körülmények között, amely az antitesttel kompatibilis, vagy más módon az antitesthez a fém-BFC-komplexet kötjük környezeti vagy emelt hőmérsékleten. [Meares és munkatársai, Acc. Chem. Rés., 17, 202-209 (1984)]. Erre a következő példákat mutatjuk be.

HU 219 485 Β

ZA-példa (összehasonlító példa) l-(4-Izotiocianáto-benzil)-dietilén-triamin-pentaecetsav-szamárium-153 komplex kötése IgG-hez vagy CC-49 F(ab ’)₂fragmenséhez;

[^!53Sm(SCN-Bz-DTPA)]-lgG és [¹⁵³Sm(SCN-Bz-DTPA)]-F(ab ) 2-fragmens l-(4-izotiocianáto-benzil)-dietilén-triamin-pentaecetsav-szamárium-153 komplexet [¹⁵³Sm(SCNBz-DTPA)] állítunk elő oly módon, hogy 150 μΐ ¹⁵³Sm-ot 0,1 n sósavban elkeverünk 9 μΐ l-(4-izotiocianáto-benzil)-dietilén-triamin-pentaecetsavval, amelyhez HEPES-puffert adagolunk (0,5 mól, pH 8,9, körülbelül 30 μΐ), amikor is a pH értékét 6-ra állítjuk be. Az így kapott ¹⁵³Sm-komplexet ezután elkeverjük 22,5 χ 10~⁹ mól IgG-vel, vagy CC-49 F(ab’)2-fragmenssel (1 χ 10~⁴ mól protein 50 mól HEPES-pufferban, pH=8,5), és a pH értékét nátrium-karbonát oldattal (1 mól, 12-15 μΐ) 8,9 értékre állítjuk be. A konjugálási reakciót szobahőmérsékleten (körülbelül 25 °C) körülbelül 3 órán át végezzük. A kapott ¹⁵³Smkomplexszel jelzett IgG- vagy F(ab’)₂-konjugátumot elválasztjuk, és a XII. példában leírt módon vizsgáljuk, illetve jellemezzük.

Biológiai kísérletek ismertetése

I. és 11. példa, A-D összehasonlító példák, a bifunkcionális kelátok IN VIVŐ vizsgálata Bizonyos ritkafémkelátok stabilitását vizsgáltuk in vivő állatkísérletekben. Rosoff és munkatársai [International Journal of Applied Radiation and Isotopes, 14, 129-135 (1963)] például ismertetik radioaktív ritkafémkelátok eloszlását egerekben bizonyos aminokarbonsavaknál. Megállapították, hogy in vivő a kelátképző szerek és a test különböző alkotóelemei (szerves és szervetlen) közötti, a ritkaföldfémionokért való versengése meghatározza azok lerakódását és kiválasztódását. A találmány szerinti erős ritkafoldfémkelátok igen kis mértékben disszociálnak, és ily módon kismértékben választódnak ki; míg a gyönge és átmeneti erősségű kelátok, amelyek a technika állása szerint ismertek, sokkal könnyebben képesek dísszociálni, és így lerakódnak a különböző szervekben, így például a májban. A májban kimutatott radioaktív anyagok koncentrációja azonban nem minden esetben köszönhető a gyenge komplexképződésnek, hanem sok esetben a fémkelát és a máj közötti affinitás miatt következik be. A kelátokat ténylegesen a máj működésének kiértékelése céljából állították elő, és erre alkalmazták [Fritzberg Alán R., Radiopharmaceuticals: Progress and Clinical Perspectives, 1. kötet, 1986; 4 088 747 és 4 091 088 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások.

A 3. példa szerinti vegyület ittrium és szamárium kelátjának, amely jellemző példa az erős ritkaföldfémkelátokra, bioeloszlását vizsgáltuk, és megállapítottuk a májban kimutatható százalékos mennyiségét, amely alkalmas in vivő a kelátok stabilitásának kvalitatív jellemzésére. Összehasonlításként NTA- és EDTAkelátokat alkalmaztunk, valamint kontrollként szamárium-kloridot nem kelatizált formában is alkalmaztunk.

150-200 g tömegű Sprague-Dawley-patkányokat (Charles River Laboratories) ketrecekbe helyeztünk, és nem korlátozott mennyiségben ivóvizet és táplálékot adagoltunk nekik. Az állatokat a vizsgálatok előtt legalább 5 napon át akklimatizáltuk. A komplexek beinjekciózása előtt az állatokat melegítőlámpa alá helyeztük (15-30 perc) a farokvéna kitágítása érdekében. Az állatokat ezután a vizsgálóketrecbe helyeztük, a farkukat alkoholos vattával megtisztítottuk, és a farokvénán keresztül beinjekcióztuk őket (50-200 μΐ). Az injekciózás után az állatokat 2 órára egy másik ketrecbe tettük át, majd a nyaknál végzett metszéssel megöltük őket. Az állatokat ezután felboncoltuk, a megfelelő részeket ionmentesített vízzel leöblítettük, szárítottuk, mértük és számlálócsőbe helyeztük őket. Minden anyagból legalább három párhuzamost készítettünk, és injekcióztunk be. A százalékos dózis a szervben kimutatott szám osztva a standardban kimutatható számmal, és szorozva 100-zal (lásd a következő táblázatot).

Táblázat

Bioeloszlási adatok

A példa száma	Ligandum (példa)*	Fém	Beinjekciózott dózis %-os mennyisége a májban
I.	3	Y	0,17
II.	3	Sm	0,29
(A)	EDTA	Sm	8,4
(B)	EDTA	Sm	4,4
(C)	NTA	Sm	8,6
(D)	SmCl₃	Sm	39

* A komplexeket ligandum/fém 1:1 aránnyal állítottuk elő az I. és II. példánál, 5:1 aránnyal az (A) példánál és 300:1 aránnyal a (B) és (C) példánál

111. és E) példák

Ittriumból (amely nyomnyi mennyiségű Y-t tartalmaz) és a 3. példa szerinti ligandumból, amely BA-DOTA, és EDTA-ból (E összehasonlító példa) 1:1 arányú komplexeket állítottunk elő az előzőekben ismertetett módon. Az így kapott komplexekből 100 μΐ aliquot részeket vittünk át külön centrifugálócsövekbe. Ezután feleslegben Y-t (III) adagoltunk úgy, hogy a térfogati változás minimális legyen, és feljegyeztük az időpontokat. 1,5 órával a fém adagolása után meghatároztuk a komplexek százalékos mennyiségét a fentiekben ismertetett kationcserés módszerrel, majd összehasonlítottuk a komplexek eredeti mennyiségével. A komplexek százalékos mennyisége az adagolt fém mennyiségének függvényében jellemző a ligandum-fém komplex labilitására. A kapott eredményeket a következő táblázatban foglaljuk össze.

HU 219 485 Β

Táblázat

Komplexek vizsgálata

Fém/ligandum mólarány	Komplex%
BA-DOTA	EDTA
1	80	98
10	-	86
100	-	78
250	88	48
500	80	16

V. példa

a.-[2-(4-Amino-fenil)-etil]-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,1O-tetraecetsav-szamárium -153 komplex;

[^I53Sm(PA-DOTA)] komplex

150 μΐ ¹⁵³Sm/0,l n HCl-oldathoz (körülbelül

4,6 mCi) 1 μΐ nátrium-acetátot (2 mólos) és 9 μΐ α-[2(4-amino-fenil)-etil]-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán1.4.7.10- tetraecetsav kevert ammónium-kálium-sót (5 mmol 50 mmol HEPES-pufferban, pH 8,5, előállítása a 9. példa szerint) adagolunk. A kapott keveréket mechanikusan rázzuk, majd fokozatosan HEPES-pufferral titráljuk (0,5 mól, pH=8,9, körülbelül 31 μΐ), ily módon a pH értékét 7-re állítjuk be. A kapott keveréket ezután homokfurdőn 98 °C hőmérsékleten 1 órán át melegítjük, majd 5 μΐ-t alkalmazunk a vizsgálathoz. A vizsgálatot Mono-Q™, HPLC System II segítségével végezzük, az eluálás gradiens oldószerrendszerrel történik (0-15 perc, 0-100% B; A=víz és B=1 mól ammónium-acetát és 0,1 mmol EDTA). A kihozatal a ¹⁵³Sm-ra számítva 85-95%. Az ily módon nyert a-[2(4-amino-fenil)-etil]-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán1.4.7.10- tetraecetsav, szamárium-153 komplexet öszszehasonlítottuk az azonos, nem radioaktív mintával, a megfelelő kromatográfiás tulajdonságok segítségével, Mono-Q™ és GF-250 oszlopok segítségével. A radioaktív komplex jelenlétének további bizonyítéka, hogy izotiocianátoszármazékká alakítottuk, majd ezt antitesthez kötöttük. Komplexet állítottunk elő melegítés nélkül is, környezeti hőmérsékleten, 6-18 órán való inkubálással. A kitermelés ebben az esetben 70-80% volt.

VI. példa

a.-[2-(4-Izotiocianáto-fenil)-etil]-l ,4,7,10-tetraazaciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav, szamárium -153 komplex;

[^,53Sm(SCN-PA-DOTA)] komplex

Az előző, V. példa szerint nyert reakciókeverékhez μΐ HEPES-puffert (0,5 mól, pH=8,9), 2 μΐ tiofoszgént és 0,2 ml kloroformot adagolunk. A kapott keveréket mechanikusan erőteljesen összerázzuk két vagy három alkalommal néhány másodpercen át minden rázásnál. A kloroformos réteget eldobjuk, és a vizes réteget, amely túlnyomórészt a kívánt terméket tartalmazza, tovább tisztítjuk. Ily módon 85-90%-os kihozatallal nyeljük az a-[2(4-izotiocianáto-fenil)-etil]-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav-szamárium-153 komplexet. A ¹⁵³Sm-aktivitást HPLC segítségével GF-250 oszlop, HPLC System I alkalmazásával határoztuk meg. A tisztítás érdekében a vizes réteget Sep-Pak™ C-18 töltetű oszlopon eluáltuk 90% acetonitriles vízzel. Az első 300 μΐ-t eldobtuk, majd a következő 900 μΐ-t, amely az SCN-származék, alkalmaztuk a HPLC-analízishez. A ^1S3Sm-aktivitás nagyobb volt, mint 90 %. Az oldószert ezután 1,5-2 órán át elpárologtattuk, és a visszamaradó anyagot alkalmaztuk az antitestkonjugátum-készítéshez.

VII. példa

a.-(4-Amino-fenil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán1,4,7,10-tetraecetsav-szamárium-153 komplex;

[^,53Sm (BA-DOTA)] komplex

200 μΐ ¹⁵³Sm/0,l n sósavoldathoz nátrium-acetátot (2 mólos) és 12 μΐ a-(4-amino-fenil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-l,4,7,10-tetraecetsavat (5 mmol 50 mmol HEPES-ben, pH 8,5, a vegyület előállítása a 3. példa szerinti) adagoltunk. A kapott keveréket mechanikusan kevertük, majd fokozatosan HEPES-puffert adagoltunk hozzá (0,5 mól, pH=8,9, körülbelül 38 μΐ), ily módon a pH értékét 7-re állítottuk be. A kapott keveréket ezután homokfürdőn 98 °C hőmérsékleten 1 órán át melegítettük. Ezután a kapott keverékből 50 μΐ-es mennyiséget alkalmaztunk az analízishez, amelyet mono-Q™ oszlopon végeztünk (HPLC System II, gradiens oldószerrendszerrel végzett eluálás: 0-15 perc, 0-100% B; A=víz, és B=1 mólos ammónium-acetát és 0,1 mmol EDTA). Általánosságban a ¹⁵³Sm-ra számolva a kihozatal 85-95%. Komplexet állítottunk elő szobahőmérsékleten 12-18 órán át végzett inkubálással is, amikor is a cím szerinti vegyületet 80-90%-os kihozatallal nyertük. Az így kapott, cím szerinti vegyületet a megfelelő mintával összehasonlítva is vizsgáltuk a kromatográfiás tulajdonságaik alapján Mono-Q™ oszlopon, átalakítottuk izotiocianátoszármazékká, majd antitestkonjugátumot is készítettünk.

Vili. példa

a.-(4-Izotiocianáto-fenil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav-szamárium-153 komplex;

[¹³³Sm(SCN-BA-DOTA)J komplex

A VII. példa szerinti reakciókeverékhez 2 μΐ HEPES-puffert (0,5 mól, pH=8,9), 2 μΐ tiofoszgént és 0,2 ml kloroformot adagoltunk. A kapott keveréket mechanikusan két-három ízben összeráztuk, mindegyiknél néhány perces ideig. A kloroformos réteget ezután eldobtuk, a vizes réteget, amely túlnyomórészt a kívánt terméket tartalmazza, tovább tisztítottuk. A cím szerinti vegyületet 90% feletti kihozatallal nyertük HPLC-analízissel GF-250 oszlopon meghatározva, HPLC System I felhasználásával. A tisztítás érdekében a vizes réteget Sep-Pak™ C-18 töltetű oszlopon 90% acetonitrilt tartalmazó vizes oldattal eluáltuk. Az első 0,3 ml frakciót eldobtuk, majd a kívánt frakcióból 86-93%-os kihozatallal nyertük a cím szerinti vegyületet (a következő 1,2 ml-es frakció). Az oldószer elpárologtatása után (kö25

HU 219 485 Β rülbelül 2 óra) a visszamaradó anyagot alkalmaztuk az antitestkonjugátum előállításához.

IX. példa l-[2-(4-Izotiocianáto-fenil)-etil]-l,4,7,10-tetraazaciklododekán-4,7,10-triecetsav-szamárium-153 komplex-antitest konjugátum [^,53Sm(SCN-EA-DO3A)]-IgG-konjugátum

Antitestként CC-49-et (patkány monoklón IgG) alkalmaztunk, amely a TAG-72 epitóphoz (tumorral kapcsolatos antigén) kapcsolódik. A konjugátum előállításához 187 μΐ antitestoldatot (1,2 xlO^-4 mól 50 ml HEPES-pufferban, pH=8,5) elkevertünk 4,5 χ 10⁸ mól ¹⁵³Sm(SCN-EA-DO3A) komplexszel, amelyet a IV. példa szerint állítottunk elő, majd hozzáadagoltunk mólos nátrium-karbonát-oldatot, hogy a pH értékét 8,9-re állítsuk be. A reakciót szobahőmérsékleten órán át végeztük, majd a ¹⁵³Sm-jelzésű IgG-t centrifugális gélszűréssel Sephadex G-25 (2,2 ml) eldobható oszlopon elválasztottuk, majd HPLC segítségével GF-250 oszlopon tovább tisztítottuk, az eluálást citrátpufferral (0,25 mól, pH=7,4) végezve. A jelzett IgG-t tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük, betöményítettük, háromszor PBS-sé átalakítottuk, Centricon™ koncentrátor segítségével. Az így kapott ¹⁵³Sm-jelzett IgG specifikus aktivitása körülbelül 0,16 pCi/pg protein volt. A [^,53Sm(EA-DO3A)]-IgG-készítmény intenzitását HPLC segítségével [Sivakoff, S. I., BioChrom. 1 (1), 42-48 (1986)], valamint standard biokémiai eljárásokkal, így például nátrium-dodecil-szulfát :poliakrilamid-gélelektroforézis és autoradiográfia, valamint szilárd fázisú radioimmunovizsgálat (RIA) segítségével határoztuk meg [lásd Dávid Colcheer és társai., Cancer Rés., 43, 736-742 (1983)].

X. példa l-[2-(4-Izotiocianáto-fenil)-etil]-l,4,7,10-tetraazaciklododekán-4,7,10-triecetsav-szamárium-153 komplex CC-49-F(ab’)₂-fragmens konjugátuma; [^I53Sm(SCN-EA-DO3A)]-CC-49 F(ab‘)₂ fragmense

CC-49 F(ab’)₂-ffagmenst [előállítása Lamoyi és Nisonoff A. módszere szerint enzimatikus emésztéssel, E. Lamoyi és A. Nisonoff, J. Immunoi. Methods, 56, 235-243 (1983)] (225 μΐ lxlO-⁴ mólos oldat 50 ml HEPES-pufferban, pH=8,5) elkeverünk 2,9xlO⁸ mól ¹⁵³Sm(SCN-EA-DO3A) komplexszel, amelyet a IV. példa szerint állítottunk elő. A kapott keverékhez ezután körülbelül 5 pmol-os nátrium-karbonátot adagolunk, hogy a pH-t 8,9-re beállítsuk, majd a reakciót 2,5 órán át folytatjuk. Az így kapott ¹⁵³Sm-jelzésű fragmenst elválasztjuk, és a IX. példában leírtak szerint jellemezzük.

XI. (A és H) példa [^,53Sm(EA-DO3A)-IgG és [³³³Sm(EA-DO3A)]F(ab )₂ in vivő lokalizálása

A ¹⁵³Sm(EA-DO3A)-jelzésű IgG (IX. példa) és -CC-49 F(ab’)₂-fragmens-konjugátum (X. példa) felhasználását a jelzett anyagok humán tumorral fertőzött athémyás egereknél mutatkozó felvételével jellemeztük. A nőstény athémyás egereket (Nu/Nu, CDl-háttér) szubkután (S. C.) inokuláltuk (0,1 ml/forrás) a humán colon karcinóma-sejtvonallal, LS-174 T (körülbelül 1 χ 10⁶ sejt/állat). Körülbelül 2 héttel az inokulálás után mindegyik állatot a farokvénán keresztül beinjekcióztunk körülbelül 2 pCi (15-30 pg) ¹⁵³Sm-jelzésű antitesttel PBS-ben. Az egereket ezután különböző időintervallumokban leöltük, transzfuziót végeztünk, és a tumort, valamint a kiválasztott szöveteket kimetszettük és mértük, és gamma-számláló segítségével meghatároztuk a radioaktivitás értékét. A percenkénti beütések számát (CPM) a ¹⁵³Sm esetében minden szövetnél meghatároztuk, és CPM per gramm, szövet per injektált dózis x 100 (injektált dózis/g százalékos mennyisége) értékben fejeztük ki. A kapott eredményeket az 1-14. ábrákon, valamint az IA. és IB. táblázatokban foglaljuk össze. Összehasonlításul ¹⁵³Sm(SCN-BzDTPA)-jelzésű IgG-t és -CC-49 F(ab’)₂-fragmenskonjugátumokat (ZA-példa) alkalmaztunk. Ezek eredményeit az IC és ID táblázatok tartalmazzák.

XII. példa

a.-[2-(4-Izotiocianáto-fenil)-etil]-l,4,7,10-tetraazaciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav-szamárium -153 komplex [¹⁵³Sm(SCN-PA-DOTA)]-IgG-konjugátum

Antitestként CC-49 patkány monoklón IgG-t alkalmaztunk, amely a TAG-72 (tumorral kapcsolatos antigén) epitópjához kötődik. A konjugátum előállításához 178 μί antitestoldatot (1,26x10 ⁴ mól 50 mmol HEPES-pufferban, pH=8,5) elkevertünk 3,4 χ 10^-8 mmol a-[2-(4-izotiocianáto-fenil)-etil]-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav-szamárium-153 komplexszel (VI. példa szerint előállítva), majd hozzáadtunk 17 μί 1 mólos nátrium-karbonát-oldatot, így a pH-t 8,9re állítottuk be. A reakciót 2 órán át szobahőmérsékleten végeztük, majd elválasztottuk a ¹⁵³Sm-jelzett IgG-t centrifugális gélszűréssel Sephadex™ G-25 (2,2 ml) eldobható oszlop segítségével, majd a kapott anyagot GF-250 töltetű HPLC-oszlopon tisztítottuk, az eluálást citrátpufferral végezve (0,25 mól, pH=7,4). A jelzett IgG-t tartalmazó frakciókat egyesítettük, betöményítettük, háromszor PBS-be cseréltük, Centricum™ koncentrátor felhasználásával. Az így kapott ¹⁵³Sm-jelzett IgG specifikus aktivitása 0,16 pCi/pg protein volt. A kapott cím szerinti konjugátum homogenitását és integritását HPLC, valamint standard biokémiai folyamatok segítségével (lásd IX. példa) igazoltuk.

A következő példákban különböző antitest-konjugátum-előállítási módszereket ismertetünk, amelyekben először végezzük a BFC konjugálását az antitesthez, majd ezután képezünk kelátot a radioaktív magot tartalmazó, BFC-jelzetű AB-konjugátum előállítására.

XII A. példa

a.-[2-(4-Amino-fenil)-etil]-l, 4,7,10-tetraaza-cíklododekán-l,4,7,10-tetraecetsav - Ab CC₄₉ konjugátum (IgG CC₄₉-PA-DOTA) előállítása, majd ezt kö26

HU 219 485 Β vetően kelátképzés ¹⁵³Sm-mel, ¹⁵³Sm-jelzésű antitestkonjugátum (IgG CC₄₉-PA-DOTA-^!S3Sm előállítására) ¹⁵³Sm(PA-DOTA)-jelzésű antitestet állítunk elő oly módon, hogy először BFC-t, például a-[2-(4-izotiocianáto-fenil)-etil]-1,4,7,1O-tetraaza-ciklododekán1,4,7,10-tetraecetsavat (SCN-PA-DOTA) kapcsolunk az antitesthez pH=8-9 körüli értéken, majd ezután kelátot képzünk ¹⁵³Sm segítségével pH=6 értéknél szobahőmérsékleten, több órán át.

Egy jellemző előállítási módszernél IgG-CC-49-et betöményítünk, és háromszor karbonát-pufferban cseréljük (50 mmol, pH=9,l) Centricon™ koncentrátor (30 K molekulatömeg cut off-érték) felhasználásával, amikor is olyan oldatot nyerünk, amelynek antitestkoncentrációja >1,5χ10⁴ mól. A konjugátum előállításához 161 μΐ antitestoldatot, amely 25xl0^-9 mól IgG CC-49-et tartalmaz, elkeverünk 5 μΐ SCN-PADOTA-val (5 mmol koncentráció ugyanebben a karbonátpufferban, 18. példa szerint előállítva). A kapott keveréket szobahőmérsékleten 5 órán át állni hagyjuk, majd szűrjük, 30 K membránon, Centricon™ koncentrátorban, 5000 fordulat/perc értéknél Sorvad Rt. centrifuga alkalmazásával. A kapott antitestkonjugátumot ezután 2 ml 0,25 mólos DTPA/PBS-oldattal mossuk pH=7,4 értéknél, majd ötször (2-2 ml) MES-pufferral mossuk (20 mmol, pH=5,8), majd 30 percen át mindegyik frakciót centrifugáljuk. Ezután a PA-DOTA-IgG konjugátumot minimális térfogatra betöményítjük (körülbelül 100 μΐ), majd az integritását HPLCanalízissel GF-250 oszlopon ellenőrizzük. A konjugátumot ezután tisztítjuk oly módon, hogy 50 μΐ ¹⁵³Sm/0,l n sósavoldatot és 20 μΐ MES-puffert (1 mól, pH=6) Vortex-keverőben elkeverünk, majd egy éjszakán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A kapott anyagot ezután centrifugális gélszűréssel tisztítjuk, az anyagban lévő ¹⁵³Sm mennyiségét HPLC-analízissel meghatározzuk, ez az érték 0,22 BFC-Sm/antitest. Azt, hogy a ^I53Sm az antitesttel a BFC-vel képzett keláton keresztül kapcsolódik, és hogy ez az antitest ez valódi kötődéskovalens, és nem egy nem specifikus kötés, a kontrollkísérlettel való összehasonlítás alapján mutattuk ki. A kontrollkísérletben IgG-CC-49-oldatot kevertünk el ¹⁵³Sm-keverékkel azonos körülmények között. A fentiekhez hasonlóképpen elválasztott antitest kimutatható mennyiségű, vele összekötött ¹⁵³Sm-et nem tartalmazott. Ezt bizonyítja, hogy az Sm-153 és az antitest között ilyen körülmények között nem specifikus kötés nem alakul ki.

XIII. példa a-[2-(4-Izotiocianáto-fenil)-etil]-l ,4,7,10-tetraazaciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav-szamárium—153 komplex - CC-49-F(ab’)₂ -fragmens-konjugátum; [^,53Sm(SCN-PA-DOTA)]-F(ab j₂ -fragmens 225 μΐ CC-49 F(ab’)₂-fragmenst (lxlO^-4 mól mmol HEPES-pufferban, pH=8,5, előállítása E. Lamoyi és munkatársai szerint, [J. Immunoi. Methods, 56, 235-243 (1983)] elkeverünk 2,9xlO ⁸ mól a-[2(4-izotiocianáto-fenil)-etil]-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-l,4,7,10-tetraecetsav-szamárium-153 komplexszel (VI. példa szerint előállítva), hozzáadunk körülbelül 9 μΐ 1 mólos nátrium-karbonátot, így a pH-t 8,9-re állítjuk be. A reakciót körülbelül 2,5 órán át végezzük, majd a ⁱ⁵³Sm-jelzésű fragmenst elválasztjuk, és a IX. példa szerint jellemezzük. A specifikus aktivitás értéke körülbelül 0,4 pCi/pg.

XIV. (A és B) példa

Az a-[2-(4-izotiocianáto-fenil)-etilJ-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav-szamárium-153 komplex jelzésű IgG és F(ab ’)₂; [^1S3Sm(SCN-PA-DOTA]-IgG és [^I53Sm(SCN-PADOTA)]-F(ab’)₂-konjugátum in vivő lokalizálása A cím szerinti konjugátumok, amelyeket a XII. és

XIII. példák szerint állítottunk elő, felhasználását a humán tumorral fertőzött athémiás egerekben való felvétellel mutatjuk ki. A biolokalizálást a XI. példában leírtak szerint végeztük. A kapott eredményeket az 1-7. ábrákon mutatjuk be az IgG esetében, és a 8-14. ábrákon az F(ab’)₂-fragmens esetében, valamint a IIA és IIB táblázatok is ezen eredményekre vonatkoznak.

Összehasonlításképpen ^I53Sm(SCN-Bz-DTPA)IgG- és F(ab’)₂-fragmens-konjugátumokat (ZA példa szerint előállítva) alkalmaztunk. A kapott eredményeket a IC és ID táblázat tartalmazza.

XV. példa

a.-(4-lzotiocianáto-fenil)-l,4,7,10-tetraaza-cikloáodekán-1,4,7,10-tetraecetsav-szamárium-153 komplex antitestkonjugátum;

[^l53Sm(SCN-BA-DOTA)]-IgG

CC-49 IgG-t (174 μΐ, 1,2xlO^-4 mól 0,25 mól HEPES-pufferban, pH=8,7) elkeverünk 2,0 χ 10^-8 mól a-(4-izotiocianáto-fenil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-l,4,7,10-tetraecetsav, szamárium-153 komplexszel (2,8 mCi) (VIII. példa szerint előállítva), majd hozzáadunk körülbelül 2 μΐ 1 mólos nátrium-karbonátoldatot, hogy a pH-értéket 8,7 értéken tartsuk. A reakciót ezután 2,5 órán át szobahőmérsékleten végezzük, majd a kapott ’⁵³Sm-jelzett IgG-t centrifugális gélszűréssel elválasztjuk Sephadex™ G-25 (2,2 ml) eldobható oszlop alkalmazásával, majd a kapott anyagot HPLC-vel GF-250 oszlopon még tisztítjuk, az eluálást citrátpufferral végezve (0,025 mól, pH=7,4). A kívánt terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, betöményítjük, majd háromszor PBS-be cseréljük Centricon™ koncentrátor felhasználásával. A szamárium-153-jelzett IgG-készítmény homogenitását és integritását HPLC segítségével és standard biokémai eljárások (lásd IX. példa) segítségével igazoljuk.

XVI. példa a-(4-lzotiocianáto-fenil)-l, 4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav-szamárium -153 komplex-CC-49-F(ab ’)₂ -fragmens-konjugátum; [^I53Sm(SCN-BA-DOTA)]-fragmens CC-49-F(ab ’)₂CC-49 F(ab’)₂-fragmenst (84 μΐ 2,4xl0^-4 mól

0,25 mólos HEPES-pufferban, pH=8,7), előállítása Lamoyi és munkatársai módszere szerinti enzimatikus

HU 219 485 Β emésztéssel elkeverünk 2,1 xlO~⁸ mól a-(4-izotiocianáto-fenil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10tetraecetsav-szamárium-153 komplexszel (előállítása a Vili. példa szerint), majd körülbelül 2 μΐ 1 mólos nátrium-karbonát-oldatot adunk hozzá, hogy a pH értékét 8,7-re beállítsuk. A reakciót 2,5 órán át végezzük, majd a kapott ¹⁵³Sm-jelzett fragmenst elválasztjuk, és a IX. példában leírtak szerint jellemezzük.

XVII. (A és B) példa a-(4-Izotiocianáto-fenil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,1O-tetraecetsav-szamárium -153 komplex jelzett IgG (XV. példa) és F(ab’)₂-fragmens (XVI. példa);

[¹³³Sm(BA-DOTA)]-IgG és [^l33Sm(BA-DOTA)jF(ab)₂ in vivő lokalizálása

Az in vivő vizsgálatot a XI. példában leírtak szerint végeztük, és a kapott eredményeket az 1-14. ábrákon, valamint a IIIA. és IIIB. táblázatokban foglaljuk össze.

XVIII. (A és B) példa a-[2-(4-Izotiocianáto-fenil)-etilJ-l,4,7,10-tetraazaciklododekán-1, 4,7,10-tetraecetsav ¹⁷⁷Lu-komplexjelzett IgG és F(ab )₂-fragmens;

[¹⁷⁷Lu(PA-DOTA)]-IgG és j^I77Lu(PA-DOTA)jF(ab’)₂ in vivő lokalizálása

A cím szerinti vegyületek előállítását és in vivő tanulmányozását a V., VI., XI., XII. és XVII. példákban leírtak szerint végeztük, és a kapott eredményeket a 1VA. és IVB. táblázatokban foglaljuk össze.

XIX. (A és B) példák a-[2-(4-Izotiocianáto-fenil)-etilJ-l,4,7,10-tetraazaciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav, ittrium - 90 komplex-jelzett IgG és F(ab )^fragmens;

P°Y(PA-DOTA)]-IgG és [^9,>Y(PA-DOTA)]-F(ab)₂in vivő lokalizálása

A cím szerinti vegyületek in vivő vizsgálatát a XI. példában leírtak szerint végeztük, kivéve, hogy a szöveteket emésztettük, és a számlálást folyadékszcintillációval végeztük. A kapott eredményeket az VA. és VB. táblázatokban foglaljuk össze.

XX. példa [^,33Sm(BFC)-CC-49-IgG és [^I77Lu(BFC)jCC-49-IgG in vitropH-stabilitása

A [¹⁵³Sm(BFC)]-CC-49-IgG vagy [¹⁷⁷Lu(BFC)JCC-49-IgG-t 0,2 mólos nátrium-acetát-pufferben PH =6, 4,0 és 2,8 értékeknél, szobahőmérsékleten állni hagytuk, körülbelül 5x10 ⁶ proteinkoncentrációnál és 0,5 komplex/antitest koncentrációnál. A mintákat bizonyos időintervallumokként vettük, majd HPLC-vel analizáltuk (GF-250 oszlop), a ¹⁵³Sm- vagy ¹⁷⁷Lu-aktivitás proteinről való ledisszociálásának meghatározására. Általában a vizsgálatokat 5 napon át végeztük, vagy addig, amíg a radioizotópok 90%-a disszociálódott. A kapott eredményeket a radioizotóp kiindulási értékéhez viszonyítva, vagy a naponkénti veszteség értékében fejeztük ki. A kapott eredmények szerint különlegesen stabilak a ¹⁵³Sm(PA-DOTA), a i⁷⁷Lu(PA-DOTA), a ¹⁵³Sm(BA-DOTA), a i5JSm(PA-DOTMA) és a ¹⁵³Sm(MeO-BA-DOTA) viszonyítva a standard [¹⁵³Sm(Bz-DTPA)]-komplexhez savas pH-értéknél.

A kapott eredményeket a következő táblázatban foglaljuk össze.

A komplexek ezen in vitro nagyobb stabilitása összhangban van a ^I53Sm- és ¹⁷⁷Lu-nak a szervezetből, valamint a nem célszövetekből való gyorsabb kiürülésével (például a veséből, májból); lásd 1-34. ábrák.

BFC	Izotóp	Izotóp %-os veszteség/nap PH
6.0	4,0	2,8
Bz-DTPA	¹⁵³Sm	<2	35	35
PA-DOTA	¹⁵³Sm	<2	<2	<2
BA-DOTA	¹⁵³Sm	<2	<2	<2
PA-DOTA	¹⁷⁷Lu	<2	<2	<2
MeOBA-DOTA	¹⁵³Sm	<2	<2	<2
EA-DO3A	¹⁵³Sm	<2	90	95
PA-DOTMA	¹⁵³Sm	<2	<2	-

XXI. (A és B) példák a-(2-Metoxi-5-amino-fenil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav-szamárium-153 komplex-jelzett IgG és F(ab’)₂-fragmens-konjugátumok; [^I53Sm(MeO-HA-DOTA)]-IgG és [^lS3Sm(MeO-BA-DOTA)]-F(ab )₂ in vivő lokalizálása

A cím szerinti vegyületek előállítását az V., VI., XII. és XIII. példák szerint végeztük, és az in vivő v'vzsgálatoknál a XI. példában leírtak szerint jártunk el. A kapott eredményeket a VIA. és VIB. táblázatokban foglaljuk össze.

XXII. példa ¹³³Sm(PA -DOTMA)-komplex előállítása

100 mikroliter ¹⁵³Sm-oldatot (0,3 xl0~³ mól 0,01 n HCl-ben, 5 mCi) elkeverünk 6 μΐ PA-DOTMA-val (29. példa szerinti, nagyobb Rj-értékű diasztereomer, 5 mmol Milli-Q™ vízben) és 20 μΐ MES-puffert (1 mól, pH=6) és 1 μΐ HEPES-puffert (0,5 mól, pH=8,7) adagolunk hozzá. A kapott oldatot Vortex-keverőben keverjük, a kapott keverék végső pH-értéke 6. Ezt a keveréket ezután 90 °C hőmérsékleten 30 percen át melegítjük, majd HPLC-vel (GF-250 oszlop) vizsgáljuk a komplexálás mértékének meghatározására. A kapott eredmény szerint ez 90% vagy még nagyobb. A kapott ¹⁵³Sm-PA- DOTMA komplexet a megfelelő, nem radioaktív Sm-komplexszel összehasonlítottuk, amely nem radioaktív komplexet a 42. példában leírtak szerint állítottunk elő, és vizsgáltunk.

XXIII. példa ^,53Sm(SCN-PA-DOTMA) előállítása

A XXII. példa szerint előállított ¹⁵³SmPA-DOTMA komplexet 20 percen át szobahőmérsékleten tartjuk, majd hozzáadunk 10 μΐ 1% tiofoszgént és 90%

HU 219 485 Β acetonitril-víz elegyet tartalmazó keveréket. A kapott keveréket Vortex-keverőben erőteljesen keverjük, majd szobahőmérsékleten 5-10 percen át állni hagyjuk. A reakció az elvégzett HPLC-analízis szerint önmagától végbemegy. Az aktivált, tisztított ¹⁵³Sm-komp- 5 lexet 3 χ 200-200 μΐ kloroformmal extraháljuk, majd a vizes réteget PRP-töltetű oszlopon (PRP-töltet: Miniclean™-töltet, Alltech Associates, Deerfield, IL-gyártmány) előkezeljük 5 ml metanollal és 5 ml MES-pufferral (20 mmol, pH=5,8). Miután az oszlopot az 5 ml 10 mennyiségű MES-pufferral átmostuk, 5 ml Milli-Q™ vizet is átengedünk, és 900 μΐ 90%-os acetonitrillel extraháljuk a kapott anyagot, amikor is 90%-os ¹⁵³Smaktivitást nyerünk, az első 100 μΐ-es frakciót eldobtuk.

Az ily módon nyert keveréket szárazra pároljuk, majd csökkentett nyomáson, 40 °C hőmérséklet alatti értéken betöményítjük, a visszamaradó anyagot, amely túlnyomórészt a cím szerinti terméket tartalmazza, antitesttel konjugáljuk.

XXIV. példa (A és B) ^,53Sm(SCN-PA-DOTMA)-lgG-hez és CC-49 F(ab’)₂-jragmenshez való konjugálása Általában úgy járunk el, hogy az antitestet betöményítjük, és karbonátpufferral ioncseréljük (pH=9,1 vagy 9,5, 5 mmol) Centricon™ koncentrátorban (30 K molekulatömeg cut off-érték), amikor is 1,5 χ IO^-4 mól vagy még nagyobb proteinkoncentrációt érünk el.

A konjugátum előállításához kis mennyiségű karbonátpuffert, amellyel az 1,5 χ 10~⁴ mólos végső protein- 30 koncentrációt biztosítjuk, elkeverjük a ¹⁵³Sm-(PADOTMA) izotiocianátoszármazékával (előállítása a XXIII. példa szerint), majd a kapott keverékkoncentrált antitestet adagolunk a BFC-¹⁵³Sm-komplexszel ekvimoláris mennyiségben. A keveréket Vortex-ke ve- 35 rőben keverjük, majd szobahőmérsékleten 1 órán át állni hagyjuk. Ezen idő alatt 40-50% mennyiségű ¹⁵³Sm kötődik az antitesthez, ezt HPLC-analízissel GF-250 oszlopon mutattuk ki. A jelzett antitestet ezután izoláltuk két egymást követő centrifugális gélszűréssel, Sephadex™ G-250 oszlopokon (2,2 ml). A jelzett antitest homogenitását, integritását és immunoreaktivitását HPLC-analízissel és standard biokémiai módszerekkel, mint ahogy azt az előzőekben leírtuk, vizsgáltuk.

XXV. példa (A és B) ^I53Sm(PA-DOTMA)-jelzett IgG és CC-49 F(ab)₂bioeloszlásának vizsgálata A vizsgálatokat a XIX. példában leírtak szerint végeztük. A kapott eredményeket a VIIA. és VIIB. táblázatokban, valamint a 15-28. ábrákon foglaljuk össze.

Táblázat

Konjugátumok	Jel	Táblázat	Ábrák	Biológiai példa
[¹⁵³Sm(EA-DO3A)]-IgG-CC-49	Δ	IA.	1-7.	IX.
[¹⁵³Sm(EA-DO3A)]-F(ab’)₂-CC-49	Δ	IB.	8-14.	X.

XXVI. példa ^,77Lu (PA-DOTMA)-komplex előállítása μΐ ¹⁷⁷Lu-ot (6xl0-³ mól 1,1 n HCl-benzodiazepin, 4 mCi) elkeverünk 36 μΐ PA-DOTMA-val (előállítása a 29. példa szerint), és milli-Q™ vízzel 5 mmol-os oldatot készítünk. Ezt az oldatot Vortex-ke verőben keverjük, majd 115 μΐ MES-puffert adagolunk hozzá (1 mól, pH=6,0), amikor is az oldat pH-ját 5,5-6 értékre állítjuk be. Az így nyert oldatot 90 °C hőmérsékleten 30 percen át keveijük, amikor is nagyobb, mint 90%-os kelátképzést mutathatunk ki. A keveréket ezután PRPtöltetű 5 ml metanollal és 5 ml MES-pufferral (20 mmol, pH=5,8) előkezelt oszlopon engedjük át, 5 ml milli-Q™ vízzel mossuk, a komplexet 1000 μΐ 90%-os acetonit15 rillel extraháljuk, és meghatározzuk a ¹⁷⁷Lu-aktivitást, amely a kiindulási értékre számolva 78%-os (nem számítva az első 100 μΐ-es extraktumot, amelyet eldobtunk).

XXVU. példa ^I77Lu(SCN-PA-DOTMA) előállítása

A XXVI. példa szerint előállított 90%-os acetonitriles ¹⁷⁷Lu(PA-DOTMA) komplex oldatot elkeverünk 6 μΐ 10% tiofoszgént tartalmazó 90%-os acetonitril-oldattal. A kapott oldatot Vortex-keverőben keverjük, 25 majd 20 perc eltelte után meghatározzuk HPLC segítségével az izotiocianátszármazék mennyiségét. A reakció általában kvantitatív mértékben végbemegy. A reakciókeverékből ezután az oldatot és a tiofoszgénfelesleget eltávolítjuk, csökkentett nyomáson, 40 °C alatt 1-2 órán át végzett bepárlással. A visszamaradó anyagot alkalmazzuk antitesttel való konjugálásra.

XXVIII. példa ¹⁷⁷Lu(PA-DOTMA) IgG-CC-49-cel való konjugálása

Az IgG-CC-49 antitestet karbonátpufferban (50 mmol, pH=9,l) elkeveijük ekvimoláris mennyiségű, XXVII. példa szerint előállított izotiocianátoszármazékkal. A reakciót 70 percen át végezzük 1,5 χ IO^-4 mól antitestkoncentráció mellett, és a jelzett antitestet elválasztjuk, majd a IX. példában leírtak szerint jellemezzük.

XXIX. példa ^I77Lu(PA-DOTMA) és ⁷⁷⁷Lu(PA-DOTA)-jelzett IgG 45 CC-49 bioeloszlásának hosszú idejű vizsgálata

A hosszan tartó vizsgálatot állatokon ¹⁷⁷Lu-jelzett antitesttel végeztük, figyelembe véve ezen anyag hoszszú felezési idejét (161 óra). A vizsgálatot Balb/c-egereken végeztük 33 hetes perióduson át, a XI. példában 50 leírtak szerint. A kapott eredményeket a VIIIA. táblázatban, valamint a 29-34. ábrákon foglaljuk össze.

Az ábrákon, valamint a következő táblázatokban a következő jelöléseket alkalmaztuk.

HU 219 485 Β

Táblázat (folytatás)

Konjugátumok	Jel	Táblázat	Ábrák	Biológiai példa
[¹⁵³Sm(Bz-DTPA)]-IgG-CC-49	0	IC.	1-7.	ZA
[¹⁵³Sm(Bz-DTPA)]-F(ab’)₂-CC-49	o	ID.	8-14.	ZA
[¹⁵³Sm(PA-DOTA)]-IgG-CC-49	□	HA.	1-7.	XII.
[¹⁵³Sm(PA-DOTA)]-F(ab’)₂-CC-49	□	IIB.	8-14.	XIII.
[¹⁵³Sm(BA-DOTA)]-IgG-CC-49		IIIA.	1-7.	XV.
[¹⁵³Sm(BA-DOTA)]-F(ab’)₂-CC-49		IIIB.	8-14.	XVI.
[^l53Sm(PA-DOTMA)]-IgG-CC49	V	VIIA.	15-21.	XXIV.
[¹⁵³Sm(PA-DOTMA)]-F(ab’)₂-CC-49	V	VIIB.	22-28.	XXV.
[¹⁷⁷Lu(PA-DOTMA)]-IgG-CC49	•	VIIIA.	29-34.	XXIX.
[^l77Lu(PADOTA)]-IgG-CC-49	►	VIIIA.	29-34.	XXIX.

A leíráshoz mellékelt ábrákon az adatok a következőket jelentik:

Ábra	Szerv	Cím	25
1.	Vér	¹⁵³Sm-BFC* bioeloszlása
2.	Máj	¹⁵³Sm-BFC* bioeloszlása
3.	Lép	¹⁵³Sm-BFC* bioeloszlása
4.	Vese	¹⁵³Sm-BFC* bioeloszlása	30
5.	Tumor	^l53Sm-BFC* bioeloszlása
6.	Combcsont	¹⁵³Sm-BFC* bioeloszlása
7.	Összes testretenció	¹⁵³Sm-BFC* bioeloszlása
8.	Vér	¹⁵³Sm-BFC** bioeloszlása	35
9.	Máj	¹⁵³Sm-BFC** bioeloszlása
10.	Lép	¹⁵³Sm-BFC** bioeloszlása
11.	Vese	¹⁵³Sm-BFC** bioeloszlása
12.	Tumor	¹⁵³Sm-BFC** bioeloszlása
13.	Combcsont	¹⁵³Sm-BFC** bioeloszlása	40
14.	Összes testretenció	¹⁵³Sm-BFC** bioeloszlása

15.	Vér	¹⁵³Sm-BFC* bioeloszlása
16.	Máj	^l53Sm-BFC* bioeloszlása	45
17.	Lép	¹⁵³Sm-BFC* bioeloszlása
18.	Vese	¹⁵³Sm-BFC* bioeloszlása
19.	Tumor	¹⁵³Sm-BFC* bioeloszlása
20.	Combcsont	¹⁵³Sm-BFC* bioeloszlása
21.	Összes testretenció	¹⁵³Sm-BFC* bioeloszlása	50

Ábra	Szerv	Cím
22.	Vér	^I53Sm-BFC** bioeloszlása
23.	Máj	¹⁵³Sm-BFC** bioeloszlása
24.	Lép	¹⁵³Sm-BFC** bioeloszlása
25.	Vese	^I53Sm-BFC** bioeloszlása
26.	Tumor	¹⁵³Sm-BFC** bioeloszlása
27.	Combcsont	¹⁵³Sm-BFC** bioeloszlása
28.	Összes testretenció	¹⁵³Sm-BFC** bioeloszlása
29.	Vér	¹⁵³Sm-BFC*** bioeloszlása
30.	Máj	¹⁵³Sm-BFC*** bioeloszlása
31.	Lép	¹⁵³Sm-BFC*** bioeloszlása
32.	Vese	¹⁵³Sm-BFC*** bioeloszlása
33.	Tumor	¹⁵³Sm-BFC*** bioeloszlása
34.	Combcsont Összes	¹⁵³Sm-BFC*** bioeloszlása
	testretenció	¹⁵³Sm-BFC*** bioeloszlása

* CC₄₉-IgG LS174-T tumorral bíró meztelen egérben.

** CC₄₀-F(ab’)₂ LS174-T tumorral bíró meztelen egérben. *** CC₄₉-lgG balb/c-egérben.

HU 219 485 Β

IA. táblázat [¹⁵³Sm(EA-DO3A)]-IgG-CC-49 formában beinjekciózott ¹⁵³Sm bioeloszlása, injekciódózis/gramm% (n=5)

Szerv	5 óra	24 óra	48 óra	120 óra
AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD
Vér	23,08	2,36	17,25	2,40	11,32	*1,06	5,78	*1,69
Máj	6,95	1,28	6,58	0,56	6,58	0,62	7,62	0,98
Lép	5,17	0,59	5,06	0,96	4,62	0,72	4,92	1,72
Vese	4,59	0,68	4,01	0,53	3,74	0,76	3,20	0,59
Tumor	11,44	4,13	27,19	2,12	53,01	9,10	59,01	13,23
Combcsont	-	-	2,58	0,52	2,78	0,20	4,22	0,17
Tumortömege/g	0,16	0,09	0,20	0,09	0,30	0,17	0,52	0,34

* n=4.

IB. táblázat [¹⁵³Sm(EA-DO3A)]-F(ab’)₂-CC-49 formában beinjekciózott ¹⁵³Sm bioeloszlása, injekciódózis/gramm% (n=5)

Szerv	5 óra	24 óra	48 óra	120 óra
AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD
Vér	13,36	0,97	1,52	0,42	0,20	0,06	0,05	0,01
Máj	7,13	0,65	8,59	1,3	8,08	0,8	8,11	0,92
Lép	5,94	1,24	4,96	1,27	4,81	0,99	5,08	1,43
Vese	41,60	5,60	64,32	7,88	64,12	*12,59	37,63	6,57
Tumor	12,95	1,73	16,84	3,71	11,50	4,56	5,53	1,46
Combcsont	2,74	0,65	2,45	0,26	3,41	0,75	4,99	0,29
Tumortömege/g	0,25	0,20	0,34	0,25	0,28	0,14	0,44	0,27

* n=4.

IC. táblázat [¹⁵³Sm(Bz-DTPA)]-IgG-CC-49 formában beinjekciózott ^I53Sm bioeloszlása, injekciódózis/gramm% (n=10)

Szerv óra óra óra

120 óra

	AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD
Vér	24,97	3,07	16,05	2,45	12,81	2,69	5,84	1,76
Máj	7,74	1,35	6,01	0,95	5,68	1,07	5,43	1,45
Lép	5,69	1,04	4,86	1,36	4,72	0,81	3,78	0,63
Vese	4,52	1,04	3,96	0,88	3,81	0,61	3,76	0,31
Tumor	13,90	3,18	42,86	14,03	46,33	8,30	61,32	19,80
Combcsont	2,36	0,12	1,95	0,38	1,97	0,75	2,25	0,50
Összes testretenció	85,45	4,74	80,16	3,58	77,36	5,32	70,60	3,32

ID. táblázat [¹⁵³Sm(Bz-DTPA)]-F(ab’)₂-CC-49 formában beinjekciózott ^I53Sm bioeloszlása, injekciódózis/gramm% (n =10)

Szerv	5 óra	24 óra	48 óra	120 óra
AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD
Vér	15,03	1,84	2,13	0,48	0,29	0,08	0,04	0,02
Máj	7,07	0,88	7,03	1,24	6,14	0,67	5,80	1,00
Lép	4,50	0,97	4,22	1,15	3,65	0,62	3,24	0,42
Vese	46,74	8,69	80,	12,76	61,42	9,85	30,17	5,17

HU 219 485 Β

ID. Táblázat (folytatás)

Szerv	5 óra	24 óra	48 óra	120 óra
AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD
Tumor	15,95	3,88	18,66	5,10	15,55	2,80	6,54	1,14
Combcsont	2,48	0,24	1,77	0,28	2,48	0,40	2,85	0,35
Összes testretenció	83,23	4,64	72,17	6,20	58,89	4,40	40,53	2,48

IIA. táblázat [¹⁵³Sm(PA-DOTA)]-IgG-CC-49 formában beinjekciózott ¹⁵³Sm bioeloszlása, injekciódózis/gramm% (n=5)

Szerv	5,5 óra	25 óra	49 óra	121 óra
AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD
Vér	24,65	2,89	16,18	2,10	13,22	1,08	7,34	4,23
Máj	8,25	1,14	5,92	0,41	5,59	0,52	4,16	1,03
Lép	6,98	1,70	5,05	0,20	4,27	0,52	4,31	L95
Vese	4,01	0,86	3,16	0,55	3,44	0,39	3,26	0,57
Tumor	14,31	*2,00	42,81	8,83	72,59	21,53	78,36	33,29
Combcsont	2,69	0,41	2,02	0,32	1,69	0,37	1,44	0,69
Tumor tömege/g	0,27	0,29	0,34	0,26	0,16	0,13	0,28	0,15

*n=4.

IIB. táblázat [¹⁵³Sm(PA-DOTA)]-F(ab’)₂-CC-49 formában beinjekciózott ¹⁵³Sm bioeloszlása, injekciódózis/gramm% (n=5)

Szerv	5 óra	24 óra	48 óra	120 óra
AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD
Vér	14,74	0,76	2,25	0,45	0,33	0,08	0,02	*0,01
Máj	7,83	0,82	5,04	*0,32	4,48	0,41	1,61	0,26
Lép	4,80	0,84	3,27	0,45	3,33	0,82	1,41	0,10
Vese	51,28	5,83	78,78	8,40	61,91	8,17	19,79	5,75
Tumor	17,99	6,53	22,09	6,07	14,93	1,91	5,81	1,21
Combcsont	2,43	0,17	1,34	0,25	1,17	0,22	0,51	0,18
Tumor tömege/g	0,20	0,08	0,19	0,13	0,29	0,10	0,45	0,23

*n=4.

IIIA. táblázat [¹⁵³Sm(BA-DOTA)]-IgG-CC-49 formában beinjekciózott ¹⁵³Sm bioeloszlása, injekciódózis/gramm% (n=5)

Szerv	5,5 óra	24 óra	48 óra	120 óra
AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD
Vér	24,89	1,29	17,58	1,79	13,61	0,53	8,68	2,94
Máj	7,53	0,79	5,46	*0,62	5,35	*0,40	4,26	*0,58
Lép	5,52	0,61	5,83	1,07	4,78	0,35	3,76	1,28
Vese	3,84	0,50	3,96	*0,36	3,17	*0,57	3,49	*0,43
Tumor	14,41	2,96	38,65	6,45	55,84	11,43	85,26	25,70
Combcsont	2,54	0,34	1,81	0,35	2,08	0,30	L17	0,48
Tumor tömege/g	0,34	0,22	0,13	0,04	0,20	0,06	0,20	0,15

*n=4.

HU 219 485 Β

ΙΠΒ. táblázat [¹⁵³Sm(BA-DOTA)]-F(ab’)₂-CC-49 formában beinjekciózott ^,53Sm bioeloszlása, injekciódózis/gramm% (n=5)

Szerv	5 óra	24 óra	48 óra	120 óra
AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD
Vér	15,62	*0,86	2,42	0,42	0,28	0,08	0,03	0,01
Máj	7,69	0,71	6,18	0,82	4,22	0,88	1,56	0,25
Lép	4,93	0,63	3,94	0,52	2,88	*0,36	1,43	*0,30
Vese	50,29	4,99	77,19	*3,22	60,44	7,71	24,98	2,67
Tumor	14,58	2,24	24,28	1,81	17,65	3,25	7,39	2,54
Combcsont	2,13	0,18	1,36	0,15	1,03	0,28	0,68	0,35
Tumor tömege/g	0,17	0,02	0,12	0,07	0,17	0,06	0,12	0,10

*n=4.

IVA. táblázat [¹⁷⁷Lu(PA-DOTA)]-IgG-CC-49 formában beinjekciózott ¹⁷⁷Lu bioeloszlása, injekciódózis/gramm% (n=5)

Szerv	5 óra	24 óra	48 óra	121 óra
AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD
Vér	26,50	4,32	*19,43	*1,59	14,89	1,72	11,73	3,14
Máj	7,47	1,34	*6,74	*0,31	5,11	0,41	4,71	0,63
Lép	6,29	1,56	*5,47	*1,24	4,43	0,31	5,35	1,82
Vese	3,86	*0,80	*4,13	*0,45	3,13	*0,30	3,57	1,15
Tumor	11,94	3,39	*49,03	*3,21	56,36	*4,24	92,05	*15,32
Combcsont	2,79	1,08	*2,15	*0,30	2,11	0,39	1,32	*0,19
Tumor tömege/g	0,13	0,09	*0,09	*0,02	0,08	*0,02	0,10	*0,04

*n=4.

IVB. táblázat [¹⁷⁷Lu(PA-DOTA)]-F(ab’)₂-CC-49 formában beinjekciózott ¹⁷⁷Lu bioeloszlása, injekciódózis/gramm% (n=5)

Szerv	5 óra	24 óra	48 óra	121 óra
AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD
Vér	12,65	*0,87	*2,40	*0,18	0,47	0,08	0,04	*0,02
Máj	5,39	*0,27	*5,54	*0,31	3,25	0,45	1,30	*0,24
Lép	4,21	0,95	*3,00	*0,55	2,60	0,74	1,33	0,27
Vese	38,82	6,42	*74,40	*6,13	48,45	6,47	15,88	2,13
Tumor	10,79	2,69	*19,10	*2,08	15,44	2,35	4,69	0,78
Combcsont	2,13	0,83	*1,45	*0,33	0,95	0,43	0,41	*0,25
Tumor tőmege/g	0,10	0,03	*0,10	*0,03	0,07	0,06	0,19	0,13

*n=4.

VA. táblázat [9°Y(PA-DOTA)]-IgG-CC-49 formában beinjekciózott *>Υ bioeloszlása, injekciódózis/gramm%

Szerv	n=3 5 óra	n=5 24 óra	n=5 48 óra	n=5 120 óra
AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD
Vér	25,15	1,96	18,22	2,69	15,85	*0,81	6,62	2,94
Máj	8,25	0,42	7,61	0,77	6,52	0,96	5,68	1,26
Lép	5,13	0,26	5,50	0,72	5,66	*0,38	4,19	0,88

HU 219 485 Β

VA. táblázat (folytatás)

Szerv	n=3 5 óra	n=5 24 óra	n=5 48 óra	n=5 120 óra
AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD
Vese	3,04	0,58	4,35	1,06	3,66	0,60	2,47	0,33
Tumor	12,45	0,79	44,73	**1,43	68,41	*5,48	70,32	21,34
Combcsont	2,05	0,15	1,81	0,54	1,79	*0,11	1,04	0,45

*n=4.

**n=3.

VB. táblázat [⁹⁰Y(PA-DOTA)]F(ab’)₂-CC-49 formában beinjekciózott ⁹⁰Y bioeloszlása, injekciódózis/gramm% (n=5)

Szerv	5 óra	24 óra	48 óra	120 óra
AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD
Vér	13,87	1,19	2,22	0,46	0,31	*0,03	0,04	0,02
Máj	6,98	0,84	4,13	*0,42	3,01	0,33	1,56	0,32
Lép	4,27	0,35	3,44	*0,49	2,54	0,71	1,33	0,54
Vese	44,60	5,52	65,40	5,92	42,31	4,67	12,36	2,60
Tumor	13,08	*0,88	22,44	4,77	17,84	5,09	5,83	2,09
Combcsont	1,42	0,22	1,12	0,14	0,39	0,18	0,38	0,12

*n=4.

VIA. táblázat [¹⁵³Sm(MeO-BA-DOTA)]-IgG-CC-49 formában beinjekciózott ¹⁵³Sm bioeloszlása, injekciódózis/gramm%

Szerv	n=5 5 óra	n=5 24 óra	n=5 48 óra	n-4 120 óra
AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD
Vér	21,06	*0,75	14,57	1,18	13,98	0,78	9,49	1,06
Máj	9,00	1,93	6,22	0,68	6,32	0,41	4,34	0,27
Lép	5,39	1,40	4,00	0,64	4,69	0,93	4,53	0,41
Vese	3,48	*0,24	3,23	0,41	3,47	0,45	3,47	0,19
Tumor	18,00	8,91	41,64	3,37	58,34	5,78	69,26	21,92
Combcsont	2,54	0,27	1,94	0,32	2,05	0,29	1,29	0,16

*n=4.

VIB. táblázat [¹⁵³Sm(MeO-BA-DOTA)]-IgG-CC-49 formában beinjekciózott ¹⁵³Sm bioeloszlása, injekciódózis/gramm%

Szerv	n=5 5 óra	n=5 24 óra	n=4 48 óra	n=4 120 óra
AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD
Vér	12,98	**0,36	2,13	0,37	0,31	*0,03	0,05	0,03
Máj	6,58	**0,16	6,77	1,13	4,62	0,27	2,46	0,55
Lép	3,95	0,57	3,53	0,76	2,59	0,40	2,18	0,68
Vese	47,07	5,85	74,16	8,03	47,68	6,29	24,25	2,74
Tumor	12,59	3,96	17,30	1,68	12,33	*0,80	5,21	*0,63
Combcsont	2,61	0,30	1,61	0,31	0,90	0,03	0,68	**0,10

*n=3.

**n=4.

HU 219 485 Β

VUA. táblázat [¹⁵³Sm(PA-DOTMA)]-IgG-CC-49 formában beinjekciózott ¹⁵³Sm bioeloszlása, injekciódózis/gramm% (n=5)

Szerv	5 óra	24 óra	48 óra	120 óra
AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD
Vér	23,00	1,11	15,58	1,37	11,78	0,36	8,98	0,91
Máj	7,71	0,51	6,68	1,16	4,98	0,32	4,72	0,69
Lép	6,05	1,03	5,28	0,45	3,66	0,35	3,72	0,53
Vese	3,68	*0,23	4,03	0,41	3,95	*0,15	3,17	0,86
Tumor	10,40	2,10	31,85	*2,52	44,70	10,03	66,45	13,60
Combcsont	1,94	0,20	1,66	0,11	1,49	0,10	1,22	0,08

*n=4.

V11B. táblázat [¹⁵³Sm(PA-DOTMA)]-F(ab’)₂-CC-49 formában beinjekciózott ¹⁵³Sm bioeloszlása, injekciódózis/gramm% (n=5)

Szerv	5 óra	24 óra	48 óra	120 óra
AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD
Vér	12,85	1,06	1,	0,13	0,38	0,09	0,07	0,02
Máj	6,12	0,52	5,36	0,49	3,65	0,65	1,93	0,32
Lép	4,08	0,37	2,88	0,31	2,09	0,62	0,92	*0,13
Vese	50,28	5,26	58,59	5,63	45,29	7,04	14,85	*0,66
Tumor	11,85	2,23	14,27	1,02	15,26	2,83	4,90	2,01
Combcsont	1,77	0,06	1,06	0,13	0,96	0,28	0,79	0,24

*n=4.

VIIIA. táblázat [¹⁷⁷Lu(PA-DOTMA)]-IgG-CC-49 formában beinjekciózott ¹⁷⁷Lu bioeloszlása, injekciódózis/gramm% (n=5)

Szerv	24 óra	48 óra	7 nap	14 nap	21 nap
	AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD
Vér	31,35	2,66	30,25	*0,93	22,47	0,71	14,13	1,05	9,88	0,83
Máj	10,01	0,46	11,22	1,47	8,61	0,79	6,76	0,67	5,41	1,39
Lép	10,13	1,16	10,91	*0,67	10,79	*0,36	8,09	0,98	6,03	0,55
Vese	6,52	2,06	6,14	0,67	5,21	0,97	3,44	0,43	2,17	0,22
Combcsont	3,97	0,45	4,53	0,38	2,84	0,16	2,36	0,23	1,67	0,30

*n=4.

VII1B. táblázat [¹⁷⁷Lu(PA-DOTA)]-IgG-CC-49 formában beinjekciózott ¹⁷⁷Lu bioeloszlása, injekciódózis/gramm% (n=5)

Szerv	24 óra	48 óra	7 nap	14 nap	21 nap
AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD	AVG	STD
Vér	30,23	*0,57	28,42	2,02	21,96	1,03	14,73	0,48	8,85	1,03
Máj	11,54	1,34	10,84	1,27	9,20	1,04	6,69	0,48	6,07	1,41
Lép	10,86	1,47	11,55	1,64	10,62	1,25	9,25	1,10	6,64	1,43
Vese	7,67	1,83	5,80	0,59	4,98	0,50	3,27	*0,19	2,60	0,64
Combcsont	3,65	0,62	3,64	0,51	2,98	0,41	2,50	0,20	1,17	*0,17

*n=4.

HU 219 485 Β

Az előző példáktól eltérő megvalósítási formák, amelyek a szakember számára nyilvánvalóak, szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak. A közölt példák csupán a találmány lényegének bemutatására szolgálnak, és semmiképpen sem célozzák az igénypontok korlátozását.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás (IA) általános képletű vegyületek és gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására - a képletben Q jelentései egymástól függetlenül hidrogénatom vagy (CHR⁵)_pCO₂R-csoport,

Q¹ jelentése hidrogénatom vagy -C0₂R-csoport, amely csoportokban

R jelentései hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy Q és Q¹ jelentéseiben együttesen legalább kettő hidrogénatomtól eltérő, és ha Q¹ jelentése hidrogénatom, R³ jelentése hidrogénatomtól eltérő kell legyen,

R⁵ jelentései hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport, n értéke 0 és 5 közötti szám, p értéke 1 vagy 2,

R² jelentése hidrogénatom, nitro-, amino- vagy izotiocianátocsoport,

R³ jelentése 1-4 szénatomos alkoxi- vagy hidroxicsoport, vagy hidrogénatom,

R⁴ jelentése hidrogénatom, nitro-, amino- vagy izotiocianátocsoport, azzal a feltétellel, hogy R² és R⁴ egyidejűleg nem lehet hidrogénatom, de R² és R⁴ egyike hidrogénatom kell, hogy legyen, azzal jellemezve, hogy

a) egy (IA’) általános képletű vegyületet - a képletben Ql, R², R³, R⁴ és n jelentése a fenti - egy, a -(CHR⁵)_pCO₂R-csoport bevitelére alkalmas vegyülettel reagáltatjuk, vagy

b) olyan (IA) általános képletű vegyületek előállítására, amelyek képletében R² vagy R⁴ jelentése aminocsoport és a többi szubsztituens jelentése a tárgyi kör szerinti, egy R² vagy R⁴ helyén nitrocsoportot tartalmazó (LA) képletű vegyületet redukálunk, vagy

c) olyan (IA) általános képletű vegyületek előállítására, amelyek képletében R jelentése hidrogénatom és a többi szubsztituens jelentése a tárgyi kör szerinti, egy R helyén 1-4 szénatomos alkilcsoportot tartalmazó (IA) általános képletű vegyületet hidrolizálunk, vagy

d) olyan (IA) általános képletű vegyületek előállítására, amelyek képletében R² vagy R⁴ izocianátocsoport és a többi szubsztituens jelentése a tárgyi kör szerinti, egy R² vagy R⁴ helyén aminocsoportot tartalmazó (LA) általános képletű vegyületet tiofoszgénnel reagáltatunk, és bármely kapott vegyületet kívánt esetben gyógyászatilag elfogadható sóvá alakítunk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás az (IA) általános képletű vegyületek gyógyászatilag elfogadható sóiként kálium-, nátrium-, lítium-, ammónium-, kalcium-, magnézium- vagy hidrogénklorid-sóinak előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket reagáltatjuk, és a kapott (IA) általános képletű vegyületeket sóvá alakítjuk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (IA) általános képletű vegyületek előállítására, amelyek képletében R és R⁵ mindegyikének jelentése hidrogénatom, az egyéb szubsztituensek jelentése az 1. igénypont szerinti, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (IA) általános képletű vegyületek előállítására, amelyek képletében R jelentése hidrogénatom, R⁵ jelentése metilcsoport, az egyéb szubsztituensek jelentése az 1. igénypont szerinti, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (IA) általános képletű vegyületek előállítására, amelyek képletében R³ és R² jelentése hidrogénatom, az egyéb szubsztituensek jelentése az 1. igénypont szerinti, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás az (IA) általános képletű vegyületek körébe tartozó (II) általános képletű vegyületek és gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására - a képletben

Q jelentése hidrogénatom vagy -CHR⁵CO₂R-csoport, R jelentése hidrogénatom vagy 1 -4 szénatomos alkilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy Q jelentései közül legalább kettő jelentése hidrogénatomtól eltérő, és R³ jelentése hidrogénatomtól eltérő, n jelentése 0-5 közötti szám, és

R², R⁴ és R⁵ jelentése az 1. igénypont szerinti azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás az (IA) általános képletű vegyületek körébe tartozó (IV) általános képletű vegyületek és gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására - a képletben

Q és n jelentése az 1. igénypont szerinti, azzal a megkötéssel, hogy Q jelentései közül legalább kettő hidrogénatomtól eltérő,

R³ jelentése 1-4 szénatomos alkoxi- vagy hidroxicsoport,

R⁴ jelentése nitro-, amino- vagy izotiocianátocsoport-, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás l-(2-metoxi-5-amino-benzil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-4,7,10-triecetsav előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
9. A 7. igénypont szerinti eljárás l-(2-hidroxi-5-amino-benzil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-4,7,10-triecetsav előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
10. Az 1. igénypont szerinti eljárás az (IA) általános képletű vegyületek körébe tartozó (VI) általános képletű vegyületek és gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására, amelyek képletében

HU 219 485 Β

Q jelentése hidrogénatom vagy CHR⁵CO₂R-csoport, R jelentése hidrogénatom vagy 1 -4 szénatomos alkilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy Q jelentései közül legalább egy hidrogénatomtól eltérő, n értéke 0 és 5 közötti szám,

R², R³, R⁴ és R⁵ jelentése az 1. igénypont szerinti, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás (VII) általános képletű vegyületek és gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására - a képletben R, Q és n jelentése a 10. igénypont szerinti, R² jelentése nitro-, amino- vagy izotiocianátocsoport -, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
12. All. igénypont szerinti eljárás az l-a-[2-(4-amino-fenil)-etil]-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-l-(R,S)ecetsav-4,7,10-trisz-[(R)-a-metil-ecetsav] -1 -izopropil4,7,10-trimetil-észter-vegyület előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
13. A 11. igénypont szerinti eljárás az l-a-[2-(4amino-fenil)-etil]-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1 (R,S)-ecetsav-4,7,10-trisz-[(R)-a-metil-ecetsav] előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
14. A 11. igénypont szerinti eljárás az l-a-[2-(4izotiocianáto-fenil)-etil]-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1 -(R,S)-ecetsav-4,7,10-trisz-[(R)-a-metil-ecetsav] előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
15. A 11. igénypont szerinti eljárás az a-[2-(4-amino-fenil)-etil]-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7triecetsav, kevert ammónium-nátrium-só előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk, és elvégezzük a sóvá alakítás műveletét.
16. A 11. igénypont szerinti eljárás az a-(4-aminofeníl)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7-triecetsav előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
17. A 11. igénypont szerinti eljárás az a-(4-aminofenil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,10-triecetsav előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
18. A 11. igénypont szerinti eljárás az a-(4-aminofenil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10-tetraecetsav előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
19. A 11. igénypont szerinti eljárás az a-(4-izotiocianáto-fenil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10tetraecetsav előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
20. A 11. igénypont szerinti eljárás az a-[2-(4-nitro-feníl)etil ] -1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10tetraecetsav-l,4,7,10-tetrametil-észter előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
21. A 11. igénypont szerinti eljárás az a-[2-(4-amino-fenil)-etil]-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10tetraecetsav-l,4,7,10-tetrametil-észter előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
22. A 11. igénypont szerinti eljárás az a-[2-(4-nitro-fenil)etil]-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10tetraecetsav előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
23. A 11. igénypont szerinti eljárás az a-[2-(4-izotiocianáto-fenil)-etil]-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán1.4.7.10- tetraecetsav előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
24. Az 1. igénypont szerinti eljárás az (IA) általános képletű vegyületek körébe tartozó (VIII) általános képletű vegyületek és gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására - a képletben

Q jelentése hidrogénatom vagy -CHR⁵CO₂R általános képletű csoport,

R és R⁵ jelentése hidrogénatom vagy 1 -4 szénatomos alkilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy Q jelentései közül legalább egy hidrogénatomtól eltérő, n értéke 0-5 közötti szám.

R³ jelentése az 1. igénypont szerinti, és R⁴ jelentése nitro-, amino- vagy izotiocianátocsoport -, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
25. A 24. igénypont szerinti eljárás a-(2-metoxi-5nitro-fenil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10tetraecetsav előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
26. A 24. igénypont szerinti eljárás a-(2-metoxi-5nitro-fenil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10tetraecetsav-tetraammóniumsó előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk, és elvégezzük a sóvá alakítás műveletét.
27. A 24. igénypont szerinti eljárás a-(2-metoxi-5izotiocianáto-fenil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán1.4.7.10- tetraecetsav-tetraammóniumsó előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk, és elvégezzük a sóvá alakítás műveletét.
28. Eljárás ligandumként (IA) általános képletű vegyületet vagy gyógyszerészetileg elfogadható sóját - a képletben

Q jelentései egymástól függetlenül hidrogénatom vagy -(CHR⁵)_pCO₂R-csoport,

Q¹ jelentése hidrogénatom vagy -CO₂R-csoport, amely csoportokban

R jelentései hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy Q és Q¹ jelentéseiben együttesen legalább kettő hidrogénatomtól eltérő, és ha Q¹ jelentése hidrogénatom, R³ jelentése hidrogénatomtól eltérő kell legyen,

R⁵ jelentései hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport, n értéke 0 és 5 közötti szám, p értéke 1 vagy 2,

R² jelentése hidrogénatom, nitro-, amino- vagy izotiocianátocsoport,

HU 219 485 Β

R³ jelentése 1 -4 szénatomos alkoxi- vagy hidroxicsoport vagy hidrogénatom,

R⁴ jelentése hidrogénatom, nitro-, amino- vagy izotiocianátocsoport, azzal a feltétellel, hogy R² és R⁴ egyidejűleg nem lehet hidrogénatom, de R² és R⁴ egyike hidrogénatom kell, hogy legyen - és valamely következő fémiont tartalmazó komplexek előállítására: La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Y vagy Se, azzal jellemezve, hogy az említett (IA) általános képletű vegyületet vagy gyógyszerészetileg elfogadható sóját az említett valamely fémionnal komplexáljuk.
29. A 28. igénypont szerinti eljárás olyan komplexek előállítására, amelyek fémionként a következőket tartalmazzák: Sm, Lu vagy Y, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
30. A 28. igénypont szerinti eljárás olyan komplexek előállítására, amelyek fémionként a következőket tartalmazzák: ^l53Sm, >«HO, ⁹θΥ, i⁴⁹Pm, i⁵⁹Gd, >⁴°La, ¹⁷⁷Lu, ¹⁷⁵Yb, ⁴⁷SC vagy ¹⁴²Pr, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
31. A 28. igénypont szerinti eljárás olyan komplexek előállítására, amelyek a következő fémionokat tartalmazzák: ¹⁵³Sm, ¹⁷⁷Lu vagy ⁹⁰Y, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
32. A 30. vagy 31. igénypontok szerinti eljárás olyan komplexek előállítására, amelyek ligandumként a 7., 10., 12., 13. vagy 26. igénypontok bármelyike szerint előállított (IA) általános képletű vegyületet tartalmazzák, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
33. A 28. igénypont szerinti eljárás olyan komplexek előállítására, amelyekben a fémion a 20. igénypont szerint előállított ligandummal van komplexálva, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
34. A 28. igénypont szerinti eljárás olyan komplexek előállítására, amelyek fémionként a következőket tartalmazzák: ^1S3Sm vagy Y, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
35. A 28. igénypont szerinti eljárás olyan komplexek előállítására, amelyekben a fémion a 21. igénypont szerint előállított ligandummal van komplexálva, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
36. A 35. igénypont szerinti eljárás olyan komplexek előállítására, amelyek fémionként ¹⁵³Sm-et tartalmaznak, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
37. A 28. igénypont szerinti eljárás olyan komplexek előállítására, amelyekben a fémion egy, a 24. vagy 25. igénypont szerint előállított ligandummal van komplexálva, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
38. A 28. igénypont szerinti eljárás olyan komplexek előállítására, amelyek fémionként valamely következő fémet tartalmazzák: ¹⁵³Sm, ⁹⁰Y vagy ¹⁷⁷Lu, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
39. A 28. igénypont szerinti eljárás olyan komplexek előállítására, amelyekben a fémion a 24. igénypont szerint előállított ligandummal van komplexálva, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
40. A 39. igénypont szerinti eljárás olyan komplexek előállítására, amelyek fémionként a következők valamelyikét tartalmazzák: ¹⁵³Sm, ⁹⁰Y vagy ¹⁷⁷Lu, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
41. A 28. igénypont szerinti eljárás olyan komplexek előállítására, amelyekben a fémion a 26. igénypont szerint előállított ligandummal van komplexálva, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
42. A 41. igénypont szerinti eljárás, amelyben a fémion ¹⁵³Sm, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
43. A 28. igénypont szerinti eljárás olyan komplexek előállítására, amelyekben a fémion 27. igénypont szerinti eljárással előállított ligandummal van komplexálva, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
44. A 43. igénypont szerinti eljárás olyan komplex előállítására, amelyben a fémion ¹⁵³Sm, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
45. A 28. igénypont szerinti eljárás olyan komplexek előállítására, amelyekben a fémion a 15. igénypont szerinti eljárással előállított ligandummal van komplexálva, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
46. A 45. igénypont szerinti eljárás olyan komplexek előállítására, amelyekben a fémion ^l53Sm, Y vagy ¹⁷⁷Lu, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
47. A 28. igénypont szerinti eljárás olyan komplexek előállítására, amelyekben a fémion a 16. igénypont szerinti eljárással előállított ligandummal van komplexálva, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
48. Eljárás ligandumként (IA) általános képletű vegyületet - a képletben

Q jelentései egymástól függetlenül hidrogénatom vagy (CHR⁵)_pCO₂R-csoport,

Q¹ jelentése hidrogénatom vagy -C0₂R-csoport, amely csoportokban

R jelentései hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy Q és Q¹ jelentéseiben együttesen legalább kettő hidrogénatomtól eltérő, és ha Q* jelentése hidrogénatom, R³ jelentése hidrogénatomtól eltérő kell legyen,

R⁵ jelentései hidrogénatom vagy 1 -4 szénatomos alkilcsoport, n értéke 0 és 5 közötti szám, p értéke 1 vagy 2,

R² jelentése hidrogénatom, amino- vagy izotiocianátocsoport,

R³ jelentése 1-4 szénatomos alkoxi- vagy hidroxicsoport vagy hidrogénatom,

HU 219 485 Β

R⁴ jelentése hidrogénatom, amino- vagy izotiocianátocsoport, azzal a feltétellel, hogy R² és R⁴ egyidejűleg nem lehet hidrogénatom, de R² és R⁴ egyike hidrogénatom kell hogy legyen -, fémionként valamely következő fémiont: La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Y vagy Se, és antitestet vagy antitestfragmentumot tartalmazó konjugátumok előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) egy (IA) általános képletű vegyületet vagy gyógyászatilag elfogadható sóját valamely említett fémionnal, komplexált formában, kovalens kötéssel egy antitesthez vagy antitestíragmenshez kapcsoljuk, vagy

b) valamely (IA) általános képletű vegyületet vagy gyógyászatilag elfogadható sóját egy antitesttel vagy antitestfragmenssel kovalens kötéssel konjugáljuk, és valamely fentiek szerinti fémionnal komplexáljuk.
49. A 48. igénypont szerinti eljárás olyan konjugátumok előállítására, amelyek a következő fémiont tartalmazzák: ¹⁵³Sm, ^l66Ho, Y, ¹⁴’Pm, ‘«Gd, >⁴<>La, ^l77Lu, ^l75Yb, ⁴⁷Sc vagy ¹⁴²Pr, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
50. A 49. igénypont szerinti eljárás olyan konjugátumok előállítására, amelyek fémionként a következőket tartalmazzák: ¹⁵³Sm, ⁹⁰Y vagy ¹⁷⁷Lu, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
51. A 48-50. igénypontok bármelyike szerinti eljárás olyan konjugátumok előállítására, amelyek antitestként vagy antitestfragmensként monoklonális antitestet vagy annak fragmensét tartalmazzák, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
52. Az 51. igénypont szerinti eljárás olyan konjugátumok előállítására, amelyek antitestként vagy antitestfragmensként a következőket tartalmazzák: CC-49 (ATCC HB 9459), CC-49 F(ab’)₂, CC-83 (ATCC HB 9453), CC-83 F(ab’)₂ vagy B72.3 (ATCC HB 8108), azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
53. A 48-50. igénypontok bármelyike szerinti eljárás olyan konjugátumok előállítására, amelyek ligandumként a 7., 10., 12., 13. vagy 26. igénypontok bármelyike szerint előállított ligandumot tartalmazzák, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
54. A 49-52. igénypontok bármelyike szerinti eljárás olyan konjugátumok előállítására, amelyek a 19. igénypont szerint előállított ligandumot tartalmazzák ¹⁵³Sm fémionnal komplexál va, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
55. A 49-52. igénypont szerinti eljárás olyan konjugátumok előállítására, amelyekben a 24. igénypont szerint előállított vegyület valamely következő fémionnal van komplexálva: ¹⁵³Sm, Y vagy ¹⁷⁷Lu, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
56. A 49-52. igénypontok bármelyike szerinti eljárás olyan konjugátum előállítására, amelyben a 27. igénypont szerint előállított ligandum ¹⁵³Sm fémionnal van komplexálva, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
57. A 49-52. igénypontok bármelyike szerinti eljárás olyan konjugátumok előállítására, amelyekben a 14. igénypont szerint előállított vegyület valamely következő fémionnal van komplexálva: ¹⁵³Sm, Y vagy ¹⁷⁷Lu, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
58. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, a 28-47. igénypontok bármelyike szerint előállított komplexet gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyaggal elkeverünk, és adagolásra alkalmas gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.
59. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, a 48-57. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított konjugátumot gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyaggal elkeverünk, és adagolásra alkalmas gyógyszerkészitménynyé alakítjuk.
60. Diagnosztikai készítmény, azzaljellemezve, hogy valamely, a 28-47. igénypontok bármelyike szerint előállított komplexet tartalmaz gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyaggal elkeverve.
61. Diagnosztikai készítmény, azzal jellemezve, hogy valamely, a 48-57. igénypontok bármelyike szerint előállított konjugátumot tartalmaz gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyaggal elkeverve.