FI103792B - Makrosyklisiä bifunktionaalisia kelaatinmuodostajayhdisteitä, niiden metallikomplekseja sekä näiden kompleksien vasta-ainekonjugaatteja - Google Patents

Description

1C2792 f 1

Makrosyklisiä bifunktionaalisia kelaatinmuodostajayhdis-teitä, niiden metallikomplekseja sekä näiden kompleksien vasta-ainekonjugaatteja 5 Tämän keksinnön kohteena ovat kelaatinmuodostajayh- disteet, niiden radionuklidikompleksit ja näiden vasta-ainekonjugaatit, jotka ovat käyttökelpoisia diagnostisina aineina.

Funktionaalisia ryhmiä sisältävien kelaatinmuodos-10 tajien, tai bifunktionaalisten koordinoivien yhdisteiden, tiedetään kykenevän sitoutumaan kovalenttisesti vasta-aineeseen, joka on spesifinen syöpä- tai kasvainsolujen epi-tooppien tai antigeenien suhteen. Sellaisten vasta-aine-kelaatinmuodostajakonjugaattien radionuklidikompleksit 15 ovat käyttökelpoisia diagnostisissa ja/tai terapeuttisissa sovellutuksissa keinona kuljettaa radionuklidi syöpä- tai kasvainsoluun. Tutustukaa esimerkiksi artikkeleihin Meares et ai. . Anal. Biochem. 142 (1984) 68 - 78 ja Krejcarek . et. ai., Biochem. and Biophys. Res. Comm. 77 (1977) 581 - 20 585.

Kelaatteja muodostavia aminokarboksyylihappoja on tunnettu ja tutkittu monta vuotta. Tyypillisiä aminokar-boksyylihappoja ovat nitriilietikkahappo (NTA), etyleeni-diamiinitetraetikkahappo (EDTA), hydroksietyylietyleenidi-25 amiinitrietikkahappo (HEDTA), dietyleenitriamiinipenta- etikkahappo (DTPA), trans-1,2-diaminosykloheksaanitetra-etikkahappo (CDTA) ja 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-tetraetikkahappo (DOTA). Lukuisia aminokarboksyylihappo-pohjaisia bifunktionaalisia kelaatinmuodostajia on esitet-3 0 ty ja valmistettu. On esimerkiksi raportoitu DTPA: n sykli-sestä dianhydridistä [Hnatowich et ai., Science 220 (1983) * 613 - 615; US-patenttijulkaisu 4 479 930] ja DTPA:n kar- boksihiilihapposeka-anhydrideistä [Gansow, US-patenttijul-. kaisut 4 454 106 ja 4 472 509; Krejcarek et ai., Biochem.

35 and Biophys. Res. Comm. 77 (1977) 581 - 585] . Liitettäessä 1C3792 anhydridejä proteiineihin liittyminen tapahtuu amidisidok-sen muodostumisen kautta, jolloin jäljelle jää siis neljä dietyleenitriamiinirungon (DETA-rungon) alkuperäisistä viidestä karboksimetyyliryhmästä [Hnatowich et ai., Int.

5 J. Appi. Isot. 33 (1982) 327 - 332]. US-patenttijulkai- suissa 4 432 907 ja 4 352 751 on lisäksi esitetty bifunk-tionaalisia kelaatinmuodostajia, jotka soveltuvat metalli-ionien sitomiseen "orgaanisiin spesieksiin, kuten esimerkiksi orgaanisiin kohdemolekyyleihin tai vasta-aineisiin". 10 Samoin kuin edellä liittäminen tapahtuu amidiryhmän kautta diaminotetraetikkahappojen dianhydridejä hyväksi käyttäen. Esimerkkejä anhydrideistä ovat EDTA:n, CDTA:n, propyleeni-diamiinitetraetikkahapon ja fenyleeni-1,2-diamiinitetra-etikkahapon dianhydridit. Tuoreessa US-patenttijulkaisussa 15 4 647 447 on esitetty useita kompleksi suoloja, jotka on muodostettu komplekseja muodostavan hapon anionista, erilaisissa diagnosointitekniikoissa käyttäviksi. Konjugaation mainitaan tapahtuvan kompleksin muodostavan hapon karboksyyliryhmän kautta, mikä johtaa sitoutumiseen amidi -20 sidoksen välityksellä.

Paik et ai. ovat julkaisussa J. of Radioanalytical Chemistry 57 (1980), nro 12, 553 - 564 tuoneet esiin p-nitrobentsyylibromidin käytön reaktiossa "suojatun" di-etyleenitriamiinin kanssa, so. bis(2-ftalimidoetyyli)amii-25 nin kanssa, jota reaktiota seuraavat suojauksenpoistotoi-menpiteet ja karboksimetylointi kloorietikkahappoa käyttäen, jolloin saadaan N'-p-nitrobentsyylidietyleenitriamii-ni-Ν,Ν,Ν' ',Ν''-tetraetikkahappoa. Koska sitoutuminen tapahtuu typen kautta, saadaan tässäkin tapauksessa tetra-30 etikkahappojohdannainen. Julkaisussa käsitellään bifunk- .· tionaalisen kelaatinmuodostajan konjugoitumista ja kela- toitumista indiumin kanssa. Typpiatomiin tapahtuvaa substituutiota kuvaavat myös Eckelman et ai. julkaisussa J. of Pharm. Sei. 64 (1975), nro 4, 704 - 706, joka substituutio 35 tapahtuu antamalla amiinien, kuten esimerkiksi "etyleeni- * 1C3792 diamiinin tai dietyleenitriamiinin reagoida asianmukaisen alkyylibromidin kanssa ennen karboksimetylointia". Yhdisteitä on ehdotettu potentiaalisiksi radiofarmaseuttisessa kuvauksessa käytettäviksi aineiksi.

5 Myös eräs toinen aminokarboksyylihappofunktionaali- suuteen perustuva bifunktionaalisten kelaatinmuodostajien ryhmä on kirjallisuudessa hyvin dokumentoitu. Sundberg, Meares et ai. ovat julkaisussa J. of Med. Chem. 17 (1974), nro 12, 1304 esittäneet EDTA:n bifunktionasiisia analoge-10 ja. Tyypillisiä esimerkkejä näistä yhdisteistä ovat 1-(p-aminofenyyli)etyleenidiamiinitetraetikkahappo ja 1-(p-bentseenidiatsonium)etyleenidiamiinitetraetikkahappo. Julkaisussa käsitellään liittymistä proteiineihin para-substituentin kautta ja radioaktiivisten metallien sitou-15 tumista kelaatin muodostavaan ryhmään. Yhdisteitä on esitetty myös julkaisussa Biochemical and Biophysical • Research Communications 75 (1977), nro 1, 149 sekä US-pa-tenttijulkaisuissa 3 994 966 ja 4 043 998. On tärkeätä . huomata, että aromaattisen ryhmän sitoutuminen EDTA-raken- 20 teeseen tapahtuu etyleenidiamiinirungon hiiliatomin kautta. Optisesti aktiivisia bifunktionaalisia kelaatinmuodostaj ia, joiden perustana on EDTA, HEDTA tai DTPA, on esitetty US-patenttijulkaisussa 4 622 420. Näissä yhdisteissä alkyleeniryhmä yhdistää aromaattisen ryhmän (joka sisältää • 25 proteiiniin liittymiseksi tarpeellisen funktionaalisen ryhmän) funktionaalisen kelaatinmuodostusryhmän sisältävän polyamiinin hiileen. Muita lähteitä, joissa sellaisia yhdisteitä käsitellään, ovat Brechbiel et ai., Inorg. Chem. 25 (1986) 2772 - 2781, US-patenttijulkaisu 4 647 447 ja 30 kansainvälinen patenttijulkaisu WO 86/06384.

.· Vielä vähemmän aikaa sitten on US-patenttijulkai- * sussa 4 678 667 ja julkaisussa Moi et ai., Inorg. Chem. 26 (1987) 3458 - 3463 tuotu esiin eräitä makrosyklisiä bi funktionaalisia kelaatinmuodostajia sekä niiden kuparike- 35 laattikonjugaattien käyttö diagnostisissa tai terapeutti- 1C3792 4 sissa sovellutuksissa. Funktionaalisen aminokarboksyyli-happo-osan liittyminen bifunktionaalisen kelaatinmuodosta-jamolekyylin muuhun osaan tapahtuu syklisen polyamiinirun-gon rengashiiliatomin kautta. Yhdistävä ryhmä, joka on 5 toisesta päästään sitoutunut syklisen polyamiinin rengas-hiileen, on myös siten sitoutunut toisesta päästään funktionaaliseen ryhmään, joka kykenee reagoimaan proteiinin kanssa.

Erään toisen, myös huomionarvoisen, bifunktionaa-10 listen kelaatinmuodostajien ryhmän muodostavat yhdisteet, joissa molekyylin kelaatin muodostava osa, so. aminokar-boksyy1ihappo, on liittynyt typen kautta sellaisen molekyylin funktionaaliseen ryhmään, joka sisältää proteiinin kanssa reaktiokykyisen osan. Esimerkiksi Mikola et ai. 15 ovat esittäneet patenttihakemuksessaan (kansainvälinen julkaisunumero WO 84/03698, julkaistu 27. 9. 1984) bifunktionaalisen kelaatinmuodostajan, joka valmistetaan antamalla p-nitrobentsyylibromidin reagoida DETA:n kanssa, jota reaktiota seuraa reaktio bromietikkahapon kanssa ami-20 nokarboksyylihapon aikaansaamiseksi. Nitroryhmä pelkistetään vastaavaksi amiiniryhmäksi ja muunnetaan sitten reaktiolla tiofosgeenin kanssa isotiosyanaattiryhmäksi. Nämä yhdisteet ovat bifunktionaalisia kelaatinmuodostajia, jotka kykenevät muodostamaan lantanidien kanssa kelaatteja, 25 jotka voidaan konjugoida bio-orgaanisiin molekyyleihin diagnostisina aineina käyttöä varten. Koska molekyylin kytkentäosan sitoutuminen tapahtuu jonkin aminokarboksyy-lihapon typen kautta, menetetään yksi potentiaalinen kela-toituva aminokarboksyyliryhmä. Saadaan siis valmistetuksi 30 DETA-pohjainen bifunktionaalinen kelaatinmuodostaja, joka .’ sisältää neljä (eikä viisi) happoryhmää. Tässä suhteessa tähän ryhmään kuuluva kelaatinmuodostaja on samanlainen kuin ne, joiden liittyminen proteiiniin tapahtuu amidiryh-män välityksellä, mistä on seurauksena kelaatin muodosta-35 van karboksyyliryhmän menetys.

s 103792 ♦

Carney, Rogers ja Johnson esittivät hiljattain (3rd International Conference on Monoclonal Antibodies for Cancer, San Diego, Kalifornia, 4. - 6. 2. 1988) tiivistelmät, joiden otsikot olivat "Absence of Intrinsically 5 Higher Tissue Uptake from Indium-111 Labeled Antibodies: Co-administration of Indium-111 and Iodine-125 Labeled B72.3 in a Nude Mouse Model" ja "Influence of Chelator Denticity on the Biodistribution of Indium-111 Labeled B72.3 Immunoconjugates in Nude Mice". Ne paljastavat bi-10 funktionaalisen EDTA- ja DTPA-kelaatinmuodostajan kanssa kompleksoituneen indium-111:n biologisen jakautumisen. Aromaattisen renkaan sitoutuminen EDTA- tai DTPA-osaan tapahtuu asetaattimetyleenin kautta. Eräässä hiljättäisessä kokouksessa (Florida Conf. on Chem. in Biotechnology, 15 26.-29. huhtikuuta 1988) myös D. K. Johnson et ai. esit tivät EDTA:n ja DTPA:n bifunktionaalisia johdannaisia, joissa p-isotiosyanaattibentsyyliryhmä on sitoutunut jonkin karboksimetyyliryhmän metyleenihiileen. Aikaisemmin . Hunt et ai. ovat esittäneet US-patenttijulkaisuissa 20 4 088 747 ja 4 091 088 (1978) etyleenidiamiinidietikkahap- poon (EDDA) pohjautuvia kelaatinmuodostajia, joissa aromaattisen renkaan liittyminen EDDA-osaan tapahtuu alkylee-nin tai asetaattimetyleenin kautta. Yhdisteiden mainitaan olevan käyttökelpoisia kelaatteina haiman ja sapen toimin-25 taa tutkittaessa. Edullinen metalli on teknetium-99m. Myös indium-111 ja indium-113m mainitaan kuvaukseen soveltuvina radionuklideina.

Olisi siis edullista saada aikaan kompleksi, joka ei hajoa helposti, poistuu nopeasti koko elimistöstä ha-30 luttua kudosta lukuunottamatta ja konjugoituu vasta-aineen kanssa, niin että saavutetaan toivotut tulokset.

* ‘ Oheisissa piirroksissa esitettyjä kuvia voidaan kuvata seuraavasti:

Kuvat 1 - 7 ja 15 - 21 esittävät tämän keksinnön 35 mukaisena, 153Sm.-a sisältävänä konjugaattina annetun 153Sm.-n 1C3792 biologista jakautumista. Tämän keksinnön mukaisessa konju-gaatissa käytettiin vasta-ainetta CC49-IgG. Biologinen jakautuminen määritettiin karvattomilla hiirillä, joilla oli LS 174-T -kasvain.

5 Kuvat 8 - 14 ja 22 - 28 esittävät tämän keksinnön mukaisena, 153Sm:a sisältävänä konjugaattina annetun 153Sm:n biologista jakautumista. Tämän keksinnön mukaisessa konju-gaatissa käytettiin vasta-ainefragmenttina CC49-F (ab ' ) 2: ta . Biologinen jakautuminen määritettiin karvattomilla hiiril-10 lä, joilla oli LS 174-T -kasvain.

Kuvat 29 - 34 esittävät 177Lu (PA-DOTMA) :ta tai 177Lu-(PA-DOTA) :ta sisältävänä konjugaattina annetun 177Lu:n biologista jakautumista. Konjugaatissa käytettiin vasta-aineena CC49-IgG:tä. Biologinen jakautuminen määritettiin 15 balb/C-hiirillä, joilla oli LS 174-T -kasvain.

Yllättävää kyllä, tämän keksinnön mukaiset kompleksit ja/tai konjugaatit ovat suhteellisen stabiileja (ts. eivät hajoa helposti) ja jotkut niistä poistuvat nopeasti koko kehosta ja eräistä kohteena olemattomista eli-20 mistä, kuten maksasta, munuaisesta ja luusta.

Keksintö käsittää uudenlaisia bifunktionaalisia kelaatinmuodostajia, jotka kelatoivat aineet sisältävät kukin kelaatin muodostavan funktionaalisen ryhmän sekä kemiallisesti reaktiivisen ryhmän biomolekyyleihin tapah- 25 tuvaa kovalenttista sitoutumista varten. Osan keksintöä muodostavat myös bifunktionaalisten koordinoivien yhdisteiden (BFC) ja metallien kompleksit sekä konjugaatit, joissa kompleksi on liitetty vasta-aineisiin diagnostisiin käyttötarkoituksiin soveltuvien, radionuklidillä (kuten 30 esimerkiksi samarium-153:11a, lutetium-177:llä tai ytt-. rium-90:llä) leimattujen vasta-aineiden ja/tai frag menttien aikaansaamiseksi.

Tämä keksintö koskee uusia bifunktionaalisia ke-laatteja muodostavia aineita, jotka muodostavat komplekse-35 ja metalli-ionien kanssa, erityisesti sellaisten "radioak- ’ 7 103792 tiivisten" metalli-ionien kanssa, jotka ovat kemialtaan harvinaisten maametallien tyyppiä. Edullisia harvinaisten maametallien ioneja ovat La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Y ja Se ja erityisen edullisia 5 Sm, Ho, Y ja Lu. Edullisia radioaktiivisia harvinaisten maametallien ioneja ovat 153Sm, 166Ho, 90Y, 149Pm, 1S9Gd, 140La, 177Lu, 175Yb, 47Sc ja 142Pr ja erityisen edullisia 153Sm, 166Ho, 90Y ja 142Pr. Muita radioaktiivisia metalli-ioneja, jotka saattavat olla kiinnostavia, ovat 47Sc, 99mTc, 186Re, 188Re. 10 97Ru, 10SRh, 109Pd, 197Pt, 67Cu, 198Au, 199Au , 67Ga, 68Ga, mIn, 113mIn, 115mIn, 117Sn ja 212Pb/212Bi. Siten muodostetut komp leksit voidaan liittää (kovalenttisella sidoksella) vasta-aineeseen tai sen fragmenttiin ja käyttää diagnostisiin tarkoituksiin. Kompleksit ja/tai konjugaatit voidaan for-15 muloida in vivo tai in vitro käyttöä varten.

Tämän keksinnön mukaisia komplekseja ja/tai konju-gaatteja, jotka sisältävät jotakin ei-radioaktiivista metallia, on myös mahdollista käyttää tautitilojen, kuten , esimerkiksi syövän, diagnosointiin. Sellainen käyttö on 20 tunnettua ei-radioaktiivisten metallien tapauksessa käytettäessä radiotaajuutta hypertermian indusointiin (JP-patenttijulkaisu Kokai Tokkyo Koho 61/158 931) ja fluoresenssi -immuuniohjatussa hoidossa (FIGS) [K. Pettersson et ai., Clinical Chemistry 29 (1983), nro 1, 60 - 64 ja C.

: 25 Meares et ai., Acc. Chem. Res. 17 (1984) 202 - 209].

Tarkemmin määriteltynä tämä keksintö koskee yhdistettä, jonka kaava on 30 /-/3

/ R2-// \\-(CH2)-c-N N-Q

" H

35 UA) Q

8 103792 jossa kukin Q on itsenäisesti vety tai (CHR5)pC02R, Q1 on vety tai C02R, kukin R on itsenäisesti vety tai C1_4-alkyyli, 5 sillä edellytyksellä, että ainakin kaksi substituenteista Q ja Q1 on muita kuin vetyjä ja että kun Q1 on vety niin R3 on muu kuin vety, kukin R5 on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli, n on kokonaisluku nollasta viiteen, 10 p on 1 tai 2, R2 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatti-, semikar-batsidi-, tiosemikarbatsidi-, maleimidi-, bromiasetamidi-tai karboksyyliryhmä, R3 on Cj.4-alkoksi, -0CH2C02H, hydroksi tai vety, 15 R4 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatti-, semikar-batsidi-, tiosemikarbatsidi-, maleimidi-, bromiasetamidi-tai karboksyyliryhmä, sillä edellytyksellä, että R2 ja R4 eivät molemmat voi olla vetyjä mutta toisen niistä on oltava vety, 20 ja sen farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja.

Kaavassa IA ryhmä -j R3 : 2S \=/ pl]/ (A) on kytkentäryhmä, joka mahdollistaa kovalenttisen sitoutumisen vasta-aineeseen tai sen fragmenttiin. Haluttaessa tämän keksinnön mukainen konjugaatti R2:n ja R4:n on 30 oltava muita kuin nitroryhmiä. Kun R2 tai R4 on nitroryhmä, kyseessä on kytkentäryhmän esiaste. Tämä esiasteryhmä voi olla mikä tahansa sellainen ryhmä, joka muodostetaan R2:ksi tai R4:ksi kaavaa IA vastaavien yhdisteiden valmistusta varten ja joka ei sitoudu vasta-aineeseen tai vasta-aine-35 fragmenttiin.

« 9 103792 Tämä keksintö koskee myös tyypiltään harvinaisia maametalleja olevien metalli-ionien komplekseja, erityisesti radioaktiivisia, neutraaleja tai varautuneita harvinaisten maametalli-ionien komplekseja kaavan IA mukaisten 5 yhdisteiden kanssa, sekä edellä mainittujen kompleksien ja vasta-aineiden tai vasta-ainefragmenttien muodostamia kon-jugaatteja. Lisäksi tämän keksinnön piiriin kuuluvat myös formulaatiot, jotka sisältävät keksinnön mukaisia konju-gaatteja ja farmaseuttisesti hyväksyttävää kantaja-ainet-10 ta, erityisesti formulaatiot, joissa farmaseuttisesti hyväksyttävä kantaja-aine on neste, käytettäviksi nisäkkään tautitilan, erityisesti syövän, diagnosoimiseksi.

Ilmaisu "nisäkäs" tarkoittaa tässä käytettynä eläimiä, jotka ruokkivat poikasiaan maitorauhasten erittämällä 15 maidolla, edullisesti tasalämpöisiä nisäkkäitä, vielä edullisemmin ihmisiä. "Vasta-aineella" tarkoitetaan mitä • tahansa polyklonaalista, monoklonaalista tai kimeeristä vasta-ainetta tai heterovasta-ainetta, edullisesti mono-. klonaalista vasta-ainetta; "vasta-ainefragmentilla" tar- 20 koitetaan Fab-fragmentteja ja (F (ab1) 2-fragmentteja sekä mitä tahansa vasta-aineen osaa, joka on spesifinen halutun epitoopin tai epitooppien suhteen. Käytettäessä ilmaisua "metallikelaatti-vasta-ainekonjugaatti" tai "konjugaatti" osalla "vasta-aine" tarkoitetaan kokonaisia vasta-aineita : 25 ja/tai vasta-ainefragmentteja niiden puolisynteettiset tai geeniteknisesti käsitellyt muunnokset mukaan luettuina.

"Kompleksilla" tarkoitetaan tässä käytettynä keksinnön mukaista, kaavan IA mukaista yhdistettä kompleksoi-tuneena metalli-ionin kanssa, joka on tyypiltään harvinai-30 nen maametalli, erityisesti radioaktiivisen harvinaisen maametallin ionin kanssa, jolloin ainakin yksi metalliato-mi on kelatoitunut tai kompleksoitunut; "radioaktiivisella metalli-ionikelaatti-vasta-ainekonjugaatilla" tai "radioaktiivisella metalli-ionikonjugaatilla" tarkoitetaan ra-35 dioaktiivisen metalli-ionin konjugaattia, jossa metalli- 103792 ioni on sitoutunut kovalenttisesti vasta-aineeseen tai vasta-ainefragmenttiin; "radioaktiivisella" tarkoitetaan sanan "metalli-ioni" yhteydessä käytettynä tyypiltään harvinaisia maametalleja olevien alkuaineiden yhtä tai useam-5 paa sellaista isotooppia, joka emittoi hiukkasia ja/tai fotoneja, kuten esimerkiksi isotooppeja 153Sm, 166Ho, 90Y, 149Pm, 159Gd, 140La, 177Lu, 175Yb, 47Sc ja 142Pr; ilmaisuja "bi- funktionaalinen koordinoiva yhdiste", "bifunktionaalinen kelaatinmuodostaja" ja "funktionaalisia ryhmiä sisältävä 10 kelaatinmuodostaja" käytetään toistensa vaihtoehtoina ja niillä tarkoitetaan yhdisteitä, jotka sisältävän kelaatin muodostavan osan, joka kykenee muodostamaan metalli-ionin kanssa kelaatin, ja kelaatin muodostavaan osaan kovalenttisesti sitoutuneen kytkentäryhmän/väliryhmän, joka pystyy 15 toimimaan vasta-aineeseen tai vasta-ainefragmenttiin tapahtuvan kovalenttisen sitoutumisen välineenä.

"Farmaseuttisesti hyväksyttävä suola" tarkoittaa tässä käytettynä mitä tahansa kaavan I mukaisen yhdisteen suolaa, joka on riittävän myrkytön, jotta se on käyttökel-20 poinen nisäkkäiden diagnosoinnissa. Suoloja voidaan siis käyttää tämän keksinnön mukaisesti. Tyypillisiä sellaisia suoloja, joita muodostetaan tavanomaisilla reaktioilla sekä orgaanisista että epäorgaanisista lähteistä, ovat esimerkiksi rikki-, suola-, fosfori-, etikka-, meripihka-, 25 sitruuna-, maito-, maleiini-, fumaari-, palmitiini-, sappi-, pamoni-, lima-, glutamiini-, D-kamferi-, glutaari-, glykoli-, ftaali-, viini-, muurahais-, lauriini-, steariini-, salisyyli-, metaanisulfoni-, bentseenisulfoni-, sorbiini-, pikriini-, bentsoe- ja kanelihapon sekä muiden 30 sopivien happojen suolat. Suoloihin kuuluvat myös sellai-set suolat, joita muodostetaan tavanomaisilla reaktioilla sekä orgaanisista että epäorgaanisista lähteistä, kuten esimerkiksi ammoniumioneista, alkalimetalli-ioneista, maa-alkalimetalli-ioneista ja muista samankaltaisista ioneis-35 ta. Erityisen edullisia ovat kaavaa I vastaavien yhdistei- 11 103792 den kalium-, natrium- ja ammoniumsuolat sekä niiden sekoitukset .

Luonnollisesti voidaan käyttää kaavaa I vastaavien yhdisteiden vapaata happomuotoa samoin kuin yhdisteiden 5 protonoitua muotoa, jollainen syntyy esimerkiksi protonoi-taessa karboksylaatti ja/tai typpiatomit, ts. muodostettaessa HCl-suola.

Edullisia kaavaa I vastaavia yhdisteitä ovat yhdisteet, joissa Q1 on vety ja joita kuvaa seuraava kaava: 10 R3

*2-^ y-(CHj)-c-N N-Q

15 “ H

(II) Q

jossa , kukin Q on itsenäisesti vety tai CHR5C02R ja 20 kukin R on itsenäisesti vety tai C-^-alkyyli sillä edellytyksellä, että ainakin kaksi substituenteista Q on muita kuin vetyjä, m on kokonaisluku nollasta viiteen, R2 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatti-, semikar-.. 25 batsidi-, tiosemikarbatsidi-, karboksyyli-, bromiasetami- di- tai maleimidiryhmä, R3 on C^-alkoksyyli, -0CH2C02H, hydroksyyli tai vety, R4 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatti-, semikar-batsidi-, tiosemikarbatsidi-, karboksyyli-, bromiasetami-30 di- tai maleimidiryhmä ja kukin R5 on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli sillä edellytyksellä, että R2 ja R4 eivät molemmat voi olla vetyjä mutta toisen niistä on oltava vety; ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.

12 103792

Kun R3 ja R4 ovat molemmat kaavassa II vetyjä, yhdisteet vastaavat seuraavaa kaavaa:

Q

5 _ ^--- /Γ~Λ Hr 7

r2-y-(CHj)-c-N N-Q

10 (III) Q

jossa kukin Q on itsenäisesti vety tai CHR5C02R ja kukin R on itsenäisesti vety tai C1.4-alkyyli, 15 sillä edellytyksellä, että ainakin kaksi substituenteista Q on muita kuin vetyjä, m on kokonaisluku nollasta viiteen, R2 on nitro-, amino-, isotiosyanaatti-, semikarbatsidi-, tiosemikarbatsidi-, karboksyyli-, bromiasetamidi- tai ma-20 leimidiryhmä ja kukin R5 on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli; tai ovat vastaavia farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja.

R2:n ollessa kaavassa II vety yhdisteet vastaavat kaavaa ,25 ? ^ h

// \\-(CH2)-c-N N-Q

30 111 H

CIV) Q

jossa kukin Q on itsenäisesti vety tai CHR5C02R ja 35 kukin R on itsenäisesti vety tai C1_4-alkyyli, ' 13 103792 sillä edellytyksellä, että ainakin kaksi substituenteista Q on muita kuin vetyjä, m on kokonaisluku nollasta viiteen, R3 on C^-alkoksi, -0CH2C02H tai hydroksi, 5 R4 on nitro-, amino-, isotiosyanaatti-, semikarbatsidi-, tiosemikarbatsidi-, karboksyyli-, bromiasetamidi- tai ma-leimidiryhmä ja kukin R5 on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli,-tai ovat vastaavia farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja. 10 Muita edullisia kaavan IA mukaisia yhdisteitä ovat yhdisteet, joissa ainakin yksi Q on vety ja jotka vastaavat kaavaa

Q

/b3 15 /—ς V \ /

“ H

20 Q jossa tT> kukin Q on itsenäisesti vety tai CHR5C02R, Q1 on vety tai C02R ja kukin R on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli, .. 25 sillä edellytyksellä, että ainakin kaksi substituenteista Q ja O1 on muita kuin vetyjä ja yksi Q on vety, m on kokonaisluku nollasta viiteen, R2 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatti-, semikarbatsidi-, tiosemikarbatsidi-, karboksyyli-, maleimidi- tai 30 bromiasetamidiryhmä, R3 on C1.4-alkoksi, -0CH2C02H, hydroksi tai vety, . R4 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatti-, semikar batsidi-, tiosemikarbatsidi-, karboksyyli-, maleimidi- tai bromiasetamidiryhmä ja 35 kukin Rs on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli 14 103792 sillä edellytyksellä, että R2 ja R4 eivät molemmat voi olla vetyjä mutta toisen niistä on oltava vety; ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.

Muita edullisia kaavan I mukaisia yhdisteitä ovat 5 yhdisteet, joissa Q1 on COzR ja jotka vastaavat kaavaa /—Λ ?°2R \ /

10 "2--(C«2>—C-N N-Q

Ri./ ^ H ---^

Q

(VI) jossa 15 kukin Q on itsenäisesti vety tai CHR5C02R ja kukin R on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli sillä edellytyksellä, että ainakin yksi Q on muu kuin vety, m on kokonaisluku nollasta viiteen, 20 R2 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatti-, semikar-batsidi-, tiosemikarbatsidi-, karboksyyli-, maleimidi- tai bromiasetamidiryhmä, R3 on C^-alkoksi, -0CH2C02H, hydroksi tai vety, R4 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatti-, semikar-.. 25 batsidi-, tiosemikarbatsidi-, karboksyyli-, maleimidi- tai bromiasetamidiryhmä ja kukin R5 on itsenäisesti vety tai Cj^-alkyyli, sillä edellytyksellä, että R2 ja R4 eivät molemmat voi olla vetyjä mutta toisen niistä on oltava vety; 30 ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.

: Eräitä edullisia kaavan VI mukaisia yhdisteitä ovat yhdisteet, joissa R3 ja R4 ovat molemmat vetyjä ja jotka vastaavat kaavaa 15 103792

Q

-/

/' M—(CH2)-C-N N”Q

" H

Q

(VII) 10 jossa kukin Q on itsenäisesti vety tai CHR5C02R ja kukin R on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli, sillä edellytyksellä, että ainakin yksi Q on muu kuin vety, 15 m on kokonaisluku nollasta viiteen, R2 on nitro-, amino-, isotiosyanaatti-, semikarbatsidi-, tiosemikarbatsidi-, karboksyyli-, bromiasetamidi- tai ma-leimidiryhmä ja , kukin R5 on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli; 20 ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.

Muita edullisia kaavan VI mukaisia yhdisteitä ovat yhdisteet, joissa R2 on vety ja jotka vastaavat kaavaa jossa r3 25 / /7“\C ?02R \ / r -(ch2)-c-n n-q " h

30 Q

: (VIII) . kukin Q on itsenäisesti vety tai CHR5C02R ja kukin R on itsenäisesti vety tai C1.4-alkyyli, sillä edellytyksellä, että ainakin yksi Q on muu kuin ve- 35 ty, 16 103792 m on kokonaisluku nollasta viiteen, R3 on Cj^-alkoksi, -0CH2C02H tai hydroksi, R4 on nitro-, amino-, isotiosyanaatti-, semikarbatsidi-, tiosemikarbatsidi-, karboksyyli-, maleimidi- tai bromiase-5 tamidiryhmä ja kukin R5 on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli; ja vastaavat farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.

Tässä kuvattuja bifunktionaalisia kelaatinmuodosta-jia (jotka vastaavat jotakin kaavoista IA - VIII) voidaan 10 käyttää kelatoimaan tai kompleksoimaan tyypiltään harvinaisia maametalleja olevia metalli-ioneja, erityisesti radioaktiivisia harvinaisia maametalli-ioneja, metalli-ionikelaattien (joita kutsutaan tässä myös "komplekseiksi") muodostamiseksi. Koska kompleksit sisältävän funktio-15 naalisen osan (jota edustaa substituoitu fenyyli kaavassa IA) , ne voidaan kiinnittää funktionalisoituihin kantajiin, kuten esimerkiksi funktionaalisia ryhmiä sisältäviin polymeerisiin kantajiin, tai edullisesti, kun kysymyksessä on kaavaa IA vastaava kompleksi, jossa R2 ja R4 ovat pakosta 20 muita kuin nitroryhmiä, se voidaan liittää proteiineihin tai vielä tarkemmin vasta-aineisiin tai vasta-ainefrag-mentteihin. Tässä kuvatut kompleksit (joita edustaa harvinaisten maametalli-ionien kanssa, erityisesti radioaktiivisten harvinaisten maametalli-ionien kanssa, komplek- ;· 25 sin muodostanut yhdiste, joka vastaa jotakin kaavoista IA - VIII) voidaan liittää kovalenttisesti vasta-aineeseen tai vasta-ainefragmenttiin, ja niitä kutsutaan tässä "kon-jugaateiksi".

Tässä kuvatuissa konjugaateissa käyttökelpoisia 30 vasta-aineita tai vasta-ainefragmentteja voidaan valmistaa alalla tunnetuilla tekniikoilla. Erittäin spesifisiä mo-noklonaalisia vasta-aineita voidaan valmistaa hydridisaa-tiotekniikoilla, jotka ovat tällä alalla tunnettuja; tutustukaa esimerkiksi Kohlerin ja Milsteinin julkaisuihin 35 [Nature 256 (1975) 495 - 497 ja Eur. J. Immunol. 6 (1976) 17 103792 511 - 519] . Sellaisilla vasta-aineilla on tavallisesti hyvin spesifinen reaktiokyky. Radioaktiivisissa metalli -ionikonjugaateissa voidaan käyttää minkä tahansa halutun antigeenin tai hapteenin vasta-aineita. Edullisesti radio-5 aktiivisissa metalli-ionikonjugaateissa käytettävät vasta-aineet ovat monoklonaalisia vasta-aineita tai niiden fragmentteja, joilla on suuri spesifisyys halutun epitoopin tai epitooppien suhteen. Tässä keksinnössä käytettävät vasta-aineet voivat olla esimerkiksi kasvainten, bakteeri-10 en, sienien, virusten, loisten, mykoplasmojen, erilaistu-mis- ja muiden solukalvoantigeenien, patogeenien pinta-antigeenien, toksiinien, entsyymien, allergeenien, lääkkeiden ja minkä tahansa biologisesti aktiivisten molekyylien vasta-aineita. Eräitä esimerkkejä vasta-aineista tai 15 vasta-ainefragmenteista ovat C-ll, CC-46, CC-49, CC-49:n F(ab')2, CC-83, CC-83:n F(ab')2 ja B72.3. [Mitä vasta-aineisiin CC-49, CC-83 ja B72.3 tulee, tutustukaa julkaisuun D. Colcher et ai., Cancer Res. 48 (15. elokuuta 1988) 4597 - 4603. Hybridoomasolulinja B72.3 on talletettu koko-20 elmaan American Type Culture Collection (ATCC) numerolla HB 8108. Erilaiset CC-vasta-aineet on esitetty US-patent-tihakemuksessa 7-073685, joka on jätetty 15. heinäkuuta 1987 ja on saatavissa NTIS:n kautta. Muut hiiren monoklonaaliset vasta-aineet sitoutuvat kasvaimiin yhteydessä .. 25 olevan antigeenin TAG-72:n epitooppeihin.] Täydellisempi luettelo antigeeneistä löytyy US-patenttijulkaisusta 4 193 983. Tämän keksinnön mukaiset radioaktiiviset metal-li-ionikonjugaatit ovat erikoisen edullisia erilaisten syöpien diagnosointiin.

3 0 Edullisia tyypiltään harvinaisia maametalleja (lan- tanideja tai pseudolantanideja) olevien metallien komplekseja, jotka ovat tämän keksinnön mukaisia, kuvaa kaava «' 18 103792 C[Ln(BFC)]

(ID

jossa Ln on harvinaisen maametallin ioni, lantanidi-ioni, 5 kuten esimerkiksi Ce3*, Pr3*, Nd3*, Pm3*, Sm3*, Eu3+, Gd3*, Tb3*, Dy3*, Ho3*, Er3*, Tm3*, Yb3* tai Lu3*, tai pseudolantanidi- ioni, kuten esimerkiksi Sc3*, Y3* tai La3*, ja erityisen

edullisia metalli-ioneja ovat Y3*, Ho3*, Lu3* ja Sm3*, BFC

tarkoittaa kaavan IA mukaista bifunktionaalista kelaatin-10 muodostajaa ja C tarkoittaa farmaseuttisesti hyväksyttävää ionia tai ioniryhmää, jolla on riittävä varaus tekemään koko kompleksi sähköisesti neutraaliksi. Mikäli BFC sisältää vähintään 4 negatiivisesti varautunutta ryhmää, C on kationi tai ryhmä kationeja, kuten esimerkiksi H*, Li*, Na*, 15 K*, Rb*, Cs*, Mg2*, Ca2*, Sr2*, Ba2*, NH4*, N(CH3)4*, N(C2H5)4*, N(C3H7)4*, N(C4H9)4*, As (C6H5) 4*, [ (C6H5)3P=]2N* tai muu pro- tonoitu amiini. Jos BFC sisältää 3 negatiivisesti varautunutta ryhmää, C:tä ei tarvita. Mikäli BFC sisältää 2 negatiivisesti varautunutta ryhmää, C on anioni, kuten 20 esimerkiksi F', Cl", Br‘, I‘, C104‘, BF4‘, H2P04', HC03‘, HC02 , CH3S03-, H3C-C6H4-S03-, PF6', CH3C02- tai N(C6H5)4·.

Tämän keksinnön mukaisia konjugaatteja ja joissakin tapauksissa tämän keksinnön mukaisia komplekseja voidaan käyttää formulaatioiden muodossa. Formulaatiot sisältävät .. 25 yhdistettä, joka vastaa kaavaa IA, yhdistettynä vasta-ai neeseen ja/tai metalli-ioniin sekä sille sopivaa fysiologisesti hyväksyttävää kantaja-, täyte- tai väliainetta. Formulaatio voi siis koostua fysiologisesti hyväksyttävästä kantaja-aineesta ja kompleksista (metalli-ioni + ligan-30 di) tai konjugaatista (metalli-ioni + ligandi + vasta-ai-ne. Menetelmät sellaisten formulaatioiden valmistamiseksi ovat tunnettuja. Formulaatioita voidaan käyttää suspension, injektoitavaksi soveltuvan liuoksen tai muun sopivan formulaation muodossa. Voidaan käyttää fysiologisesti hy- •' 103792 väksyttäviä suspendointiaineita mahdollisesti yhdessä apuaineiden kanssa.

Tämän keksinnön mukaiset formulaatiot ovat kiinteässä tai nestemäisessä muodossa, joka sisältää ligandin 5 kanssa kompleksin muodostanutta aktiivista radionuklidia. Nämä formulaatiot voivat olla sellaisen välineistön muodossa, että kyseiset kaksi komponenttia (so. ligandi ja metalli, kompleksi ja vasta-aine tai ligandi/vasta-aine ja metalli) sekoitetaan sopivasti ennen käyttöä. Esisekoitet-10 tuina tai välineistön muodossa formulaatiot vaativat tavallisesti jonkin farmaseuttisesti hyväksyttävän kantaja-aineen .

Tämän keksinnön mukaiset injektoitavat koostumukset voivat olla joko suspension tai liuoksen muodossa. Sopivi-15 en formulaatioiden valmistuksessa on tunnettua, että yleensä suolan vesiliukoisuus on suurempi kuin happomuo-don. Liuosmuodossa kompleksi (tai haluttaessa erilliset aineosat) liuotetaan fysiologisesti hyväksyttävään kantaja-aineeseen. Sellaiset kantaja-aineet koostuvat sopivasta 20 liuottimesta, säilötteistä, kuten esimerkiksi bentsyylial-koholista, ja tarvittaessa puskureista. Käyttökelpoisia liuottimia ovat esimerkiksi vesi, vesi-alkoholiseokset, glykolit sekä fosfonaatti- ja karbonaattiesterit. Sellaiset vesiliuokset sisältävät korkeintaan 50 til-% orgaanis-;· 25 ta liuotinta.

Injektoitavat suspensiot ovat tämän keksinnön mukaisia koostumuksia, jotka edellyttävät kantaja-aineeksi nestemäisen suspendoivan väliaineen mahdollisesti apuaineiden kera. Suspendoiva väliaine voi olla esimerkiksi 30 että sisältävä polyvinyylipyrrolidöni, jokin inertti öljy, ' kuten esimerkiksi kasviöljy tai hyvin puhdas mineraaliöl jy, tai vettä sisältävä karboksimetyyliselluloosa. Sopivia fysiologisesti hyväksyttäviä apuaineita, mikäli sellaisia tarvitaan kompleksin pitämiseksi suspendoituneena, ovat 35 sakeutusaineet, kuten esimerkiksi karboksimetyyliselluloo- 103792 sa, polyvinyylipyrrolidoni, gelatiini ja alginaatit. Myös monet pinta-aktiiviset aineet, esimerkiksi lesitiini, al-kyylifenoli, polyetyleenioksidin additiotuotteet, nafta-leenisulfonaatit, alkyylibentseenisulfonaatit ja polyetee-5 nisorbitaaniesterit, ovat käyttökelpoisia suspendoivina aineina.

Monista aineista, jotka vaikuttavat suspension nestemäisen väliaineen hydrofiilisyyteen, tiheyteen ja pintajännitykseen, voi olla apua injektoitavien suspensioiden 10 valmistuksessa yksittäisissä tapauksissa. Esimerkiksi si-likonivaahdonestoaineet, sorbitoli ja sokerit ovat kaikki käyttökelpoisia suspendointiaineita.

Vaikka tämän keksinnön mukaisia formulaatioita voidaan käyttää in vitro suoritettavassa diagnosoinnissa, 15 myös in vivo diagnosointi on mahdollista tämän keksinnön mukaisia formuloita käyttäen.

Muihin eräiden tämän keksinnön mukaisten kelaatin-muodostajien käyttöihin kuuluvat magneettiseen resonanssiin perustuva kuvaus, esimerkiksi kaavaa IA vastaavien 20 kompleksien, erityisesti kaavaa VI vastaavien yhdisteiden ja Gd3*:n kompleksien, kiinnittäminen polymeerisiin kantajiin erilaisia tarkoituksia varten, esimerkiksi diagnostisina aineina käyttöä varten, ja lantanidimetalli- tai pseudolantanidimetalli-ionin poistaminen selektiivisellä ;< 25 uutolla.

Tämä keksintö tarjoaa kelaatinmuodostajia, komplekseja ja vasta-ainekonjugaatteja, joista eräät ovat stabiilimpia ja/tai biologiselta jakautumiseltaan parempia ja/tai poistuvat nopeammin elimistöstä kuin alalla jo tun-30 netut. Myös menetelmiä tämän keksinnön mukaisten kelaatin-'· muodostajien, kompleksien ja vasta-ainekonjugaattien val mistamiseksi esitetään.

Eräs järkevä ja yleinen tapa tämän keksinnön mukaisen 12 rengasatomia sisältävän, makrosyklisen, bifunktio-35 naalisen kelaatinmuodostajan syntetisoimiseksi, joka vas- 103792 taa kaavaa IA, on monofunktionalisoida vapaana emäksenä oleva makrosyklinen yhdiste (esim. 1,4,7,10-tetra-atsasyk-lododekaani) liittämällä vain yhteen sen typpiatomeista sopiva elektrofiili (esim. jokin asianmukaisella tavalla 5 substituoitu α-halogeenikarboksyylihappoesteri) . Tämän elektrofiilin täytyy sisältää sopiva kytkentäryhmä tai sopivalla tavalla suojattu kytkentäryhmä, joka mahdollistaa bifunktionaalisen ligandin liittämisen proteiiniin, vasta-aineeseen tai vasta-ainefragmenttiin.

10 On alalla tunnettua, että alkylointimenettelytavat mono-N-funktionaalisten makrosyklisten polyatsayhdisteiden valmistamiseksi saattavat johtaa vaikeasti erotettavien tuotteiden seoksiin [T. Käden, Top. Curr. Chem. 121 (1984) 157 - 175] . Tästä ongelmasta on päästy käyttämällä, niin 15 kuin on raportoitu, suuria makrosyklisen yhdisteen ylimää riä (5-10 ekvivalenttia suhteessa elektrofiiliin), mikä edistää monoadditiotuotteen muodostumista [M. Studer ja T. A. Käden, Helv. Chim. Acta 69 (1986) 2081 - 86; E. Kimura et ai., J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1986, 1158 -20 59] .

Muut tiet mono-N-funktionaalisten makrosyklisten polyatsayhdisteiden valmistamiseksi sisältävät pitkähkön suojaus-, funktionalisointi- ja suojauksenpoistosysteemin [P. S. Pallavicini et ai., J. Amer. Chem. Soc. 109 (1987) 25 5139 - 44; M. F. Tweedle et ai., EP-hakemusjulkaisu 0 232 751] . Abbott Laboratories on julkaissut hiljaittain tiivistelmänä äskettäisestä kokouksesta raportin substitu-oitujen fenyylipalorypälehappojen ja amiinien välisestä pelkistysaminaatiosta [D. K. Johnson et ai. . Florida Conf. 30 on Chem. in Biotechnology, April 26-29 (1988), Palm Coast, FL]. W. J. Kruperin US-patenttihakemuksessa 289 163, joka on jätetty 22. joulukuuta 1988, on esitetty menetelmä mono-N-alkyloitujen makrosyklisten polyatsayhdisteiden valmistamiseksi käyttämällä elektrofiiliä yhdessä noin 1 -35 5 ekvivalentin kanssa sopivaa makrosyklistä yhdistettä sellaisessa liuottimessa, joka edistää protonien siirty-mistä.

22 103792

Yleisiä valmistusteitä tämän keksinnön mukaisten kelaatinmuodostajien valmistamiseksi on esitetty jäljempänä synteesikaavioissa I - IV, ja ne sisältävät sopivan elektrofiilin ja makrosyklisen polyatsayhdisteen reaktion 5 sopivassa orgaanisessa liuottimessa eri reagointisuhteil-la, lämpötiloissa ja pitoisuuksilla. Esimerkkejä sopivista orgaanisista liuottimista ovat kaikki liukenemista edistävät hiilivedyt, kuten esimerkiksi asetonitriili, isopropa-noli, metyleenikloridi, tolueeni, kloroformi, n-butanoli, 10 hiilitetrakloridi, tetrahydrofuraani ja 5 % etanolia sisältävä kloroformi, joista edullisimpia ovat kloroformi, metyleenikloridi, n-butanoli, 1,4-dioksaani ja asetonitriili. Makrosyklistä yhdistettä ja elektrofiiliä voidaan käyttää stökiometrisinä tai lähes stökiometrisinä määrinä 15 ja vastaava mono-N-alkylointituote voidaan saada yhdessä vaiheessa. Lämpötila voi vaihdella reaktiossa noin 0 °C:Sta suunnilleen seoksen kiehumislämpötilaan ja on edullisesti 0 - 25 °C. Aika, jossa reaktio menee loppuun, on noin 1-24 tuntia.

20 Yleismenettely substituoitujen a-halogeenihappoes- tereiden valmistamiseksi on toivottava, jotta synteesikaa-viot II ja IV ovat yleisesti käyttökelpoisia. Eräs sopiva tapa on bromata tai kloorata in situ muodostettu happoha-logenidi [esim. D. N. Harpp et ai., J. Org. Chem. 40 25 (1975) 3420 - 27] . Tämä menettelytapa mahdollistaa jopa reaktiivisia bentsyyliryhmiä sisältävien alkaanihappojen yksinomaisen alfa-halogenoinnin. Eräs yleismenetelmä substituoitujen happohalogenidien valmistamiseksi käsittää orgaanisen hapon reaktion tionyylikloridin tai sulfuryyli-30 kloridin kanssa [esim. E. Schwenk et ai., J. Amer. Chem. Soc. 70 (1944) 3626 - 27]. Molemmissa menetelmissä käytetään hyväksi vapaata karboksyylihappoa, joka on usein saatavissa kaupallisista lähteistä.

Makrosyklisiä polyatsayhdisteitä, kuten esimerkiksi 35 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani, voidaan valmistaa mene telmillä, joista on jo raportoitu [esim. T. J. Atkins et 103792 ai. . J. Amer. Chem. Soc. 96 (1974) 2268 - 70 ja T. J.

Richman et ai., Org. Synthesis 58 (1978) 86 - 98].

Mono-N-funktionaalisen makrosyklisen yhdisteen kar-boksimetylointi voidaan toteuttaa Desreux'n menetelmällä 5 käyttämällä bromietikkahappojohdannaisia ja sopivaa emästä [J. F. Desreux, Inorg. Chem. 19 (1980) 1319 - 24].

Kaikki tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden valmistamiseen tarvittavat lähtöaineet ovat joko kaupallisista lähteistä saatavissa tai valmistettavissa tunnetuista 10 kirjallisuuslähteistä löytyvien kuvausten perusteella.

Seuraavassa kaaviossa I valmistetaan yhdisteitä, jotka vastaavat kaavaa IA, jossa Q1 on vety. Vaikka esitetyt termit viittaavat vain yhteen yhdisteeseen, tällä menetelmällä voidaan valmistaa myös muita samankaltaisia 15 kaavan IA piiriin kuuluvia yhdisteitä, joissa Q1 on vety ja n on 0 - 5.

Kaavio I

24 103792

Br °2n h s (^-ΓΊ- iaJkH, ^—N^/ 16 h \—N'v7 N02

/ H

10 / / BrCH2C02CH3, / K2C03, CH3CN, / 25eC, 17 h O,N COOCH, 15 loi ' /COOCH, F N—' 3

Pd/C, H2, / ^ COOCH3 20 CH3OH, 25°C, / 2,5 h / H2Nv^. COOCH, : 25 Yq] väk*Hcl_ /COOCH, 80°C, 2 5 h 7 L» /

Yooch, / 30 / h2n ^cooh 35 nHCl

;· ' COOH

25 103792

Seuraavassa kaaviossa II valmistetaan yhdisteitä, jotka vastaavat kaavaa IA, jossa Q1 on vety. Vaikka esitetyt termit viittaavat vain yhteen yhdisteeseen, tällä menetelmällä voidaan valmistaa myös muita samankaltaisia 5 kaavan IA piiriin kuuluvia yhdisteitä, joissa Q1 on vety ja n on 0 - 5.

Kaavio II

103792

H

5 ¢-(3'—&C3'

N02 H 2 H

l)Pd/C, H2, CH3OH / 2)HC1(g)/ c2h5oh / 10 / H / 15 h2N H inHC1

BrCH2C02CH3, / K2C03, CH3CK / 20 * ^,cooch3 f / COOCH-,

j§fV

*: 25 H2N ^ / cooch3 Väk. / HCl / 30 / ^003

^ COOH

ioruj" h2n k

3 5 COOH

27 103792

Seuraavassa kaaviossa III valmistetaan yhdisteitä, jotka vastaavat kaavaa IA, jossa Q1 on C02R. Vaikka esitetyt termit viittaavat vain yhteen yhdisteeseen, tällä menetelmällä voidaan valmistaa myös muita samankaltaisia 5 kaavan IA piiriin kuuluvia yhdisteitä, joissa Q1 on C02R ja n on 0 - 5.

103792

Kaavio III B r j—COOH \ J /—c°OCH-j 5 ύ

T CH3OH

°2N NO-

Br V-COOCH^ Φ · O* —XrS.„

»0j a H3C00C

15 a

BrCH2C02CH3, , K2C03, CH3CN, \ 25°C, 17 h 1 t 20 0,N COOCH-,

Pd/C' H2 { CH30H /COOCH3

_ h3cooc C J

'= 25 ^«3 ΙΟ -'N cooch3

Nn^'w/\_n J /c°och3 Väk. HC1 ^C00c O-axO *0

30 k H2N , — \ .COOH

' Ίο] Uc.

NO^C00ii HOOC ( \ \-N-^x^ »3HC1 k

COOH

• * 29 103792

Seuraavassa kaaviossa IV valmistetaan yhdisteitä, jotka vastaavat kaavaa IA, jossa Q1 on C02R. Vaikka esitetyt termit viittaavat vain yhteen yhdisteeseen, tällä menetelmällä voidaan valmistaa myös muita samankaltaisia 5 kaavan IA piiriin kuuluvia yhdisteitä, joissa Q1 on C02R ja n on 0 - 5.

Kaaviossa IV esitetty A':n sisältävä reagenssi voi olla mikä tahansa o-hapon aikaansaantiin soveltuva irtoava ryhmä, ts. A' on fenyyli tai CF3.

10 Optisesti aktiivisen alkylointiaineen käyttö on minimoinut diastereomeerien muodostumisen ja tekee synteesistä yksinkertaisemman. Yhden ainoan diastereomeerin saaminen eristetyksi, mikä tuottaisi yhden helposti puhdistettavan lantanidikompleksin, olisi toivottavaa sekä ra-15 dioaktiivisen kelaatin että vasta-ainekonjugaatin muodostuksen kannalta.

103792

Kaavio IV

H Br ^^ycoocmcn2)2 5 H7 *-H + foi __ °2Nv^ · ^ V s; IQL r-·^

H N02 V / N N-H

(h3o2chooc

10 H

K2C03, H

CH3CN(50-95%) + h3c ^--- 3 v COOCH,

X

15 H3C<d COOCH-i O H

0’nV"N h ,V

To] B °t°

(H3C)2CHOOC T „ \ \ A

COOCH-,

20 J

H IIlL

/>ch3 cooch3

Pd/C, H2

·* 25 CH-.OH

3 T

E30 COOCH3 H3C cooh

Txfx 7 (H3C)2CH00C \ HOOC T 3 \ · cooch3 'cooh H "/V H "fv / ^η3 - Väk. HC1 „ />ch3 35 cooch3 cooh • · 31 103792

Seuraavassa kaaviossa V valmistetaan yhdisteitä, jotka vastaavat kaavaa IA, jossa Q1 on C02R ja R2 on vety. Vaikka esitetyt termit viittaavat vain kahteen yhdisteeseen, tällä menetelmällä voidaan valmistaa myös muita sa-5 mankaltäisiä kaavan IA piiriin kuuluvia yhdisteitä, joissa Q1 on C02R, n on 0 - 5, R3 on edellä esitetyn määritelmän mukainen ja R2:na sekä R4:nä tulevat kysymykseen vety ja amino-, nitro-, isotiosyanaatti-, semikarbatsidi-, tiose-mikarbatsidi-, maleimidi-, bromiasetamidi- ja karboksyyli-1o ryhmä.

103792

Kaavio V

H

OR H OR ’

Jr1 ' r R' ^

5 f^Vi Br R CHV CHCl,t N v-H

Ιλ—jJ + H_f R - H, dioksaani D-DJ D'Nn/ Y D^NnD X|/

02n h 02N

R' M H, y/ R » CH3, 10 / R' * C07ch, R1 * E, COOCH3 R* H ν' 1 -3 s' BrCH2COOH BrCH2COOCH3

T

* CH2COOCH3 CH2COOH CH30 j

15 ?H I

sSs^r-v »-CHjCooa (fW-? γ™2^«2 ©rv v v CH2COOH ' CH2COOCH3

0,N

20 °2N 2

(1) HC1, 90-100°C

(2) Pt02/H 2

Pt02/H2

T

' 25 CH2COOH

CH2COOH

OH I CH3O I

ffV-ϊ H-CHjCOOH Ali_'N N-CBtCOOH

DJ Dj

·; 30 CH2CCXDH CH2COOH

H2N E2H

• « 33 103792

Elektrofiilinen osa (kaavassa IA substituoitu fe-nyyliryhmä voidaan valmistaa alalla tunnetuin menetelmin. Sellaisia menetelmiä on esitetty julkaisussa Acc. Chem. Res. 17 (1984) 202 - 209. Eräs menetelmä, jolla voidaan 5 valmistaa kaavaa IA vastaavia yhdisteitä, joissa elektro-fiili voisi olla isotiosyanaattiryhmä (läsnä oleva R2 tai R4 on isosyanaattiryhmä) käsittää aminokelaatin (R2 tai R4 on aminoryhmä) reaktion tiofosgeenin kanssa ja on esitetty M. J. Fazion et ai. US-patenttihakemuksessa 289 712, joka 10 on jätetty 23. joulukuuta 1988.

Radionuklideja voidaan tuottaa monin tavoin. Nukli-dia pommitetaan ydinreaktorissa neutroneilla, jolloin saadaan radionuklidi, esimerkiksi 15 Sm-152 + neutroni - Sm-153 + gamma

Toinen menetelmä saada aikaan radionuklideja on pommittaa nuklideja hiukkasilla lineaarikiihdyttimessä tai syklotronissa. Eräs tapa on vielä eristää radionuklidi 20 fissiotuotteiden seoksesta. Tässä keksinnössä käytettävä menetelmä radionuklidien aikaansaamiseksi ei ole keksinnön kannalta ratkaiseva.

Tämän keksinnön mukaisia konjugaatteja voidaan valmistaa muodostamalla ensin kompleksi ja liittämällä siihen : 25 sitten vasta-aine tai vasta-ainefragmentti. Menetelmä kä sittää siis ligandin valmistamisen, sen ja metallin kompleksin muodostamisen ja vasta-aineen liittämisen sen jälkeen. Vaihtoehtoisesti menetelmä leimattujen vasta-aine-konjugaattien valmistamiseksi voi käsittää BFC:n konjugoi-30 misen ensin vasta-aineeseen ja sen kelatoimisen sen jälkeen, jolloin saadaan radionuklidi-BFC-leimattu vasta-aine. Mikä tahansa sopiva menetelmä, jonka tuloksena muodostuu tämän keksinnön mukaisia konjugaatteja, kuuluu tämän keksinnön piiriin.

34 103792

Seuraavissa esimerkeissä käytetään seuraavia termejä ja käytettiin seuraavia olosuhteita, ellei toisin ole erikseen mainittu.

Massaspektrit saatiin joko Finnigan TSQ -massa-5 spektrometrillä (Q^S-malli) tai hyvän erotuskyvyn omaavalla VG ZAB-MS -massaspektrometrillä (pommitus nopeilla kse-nonatomeilla käyttäen ditiotreitolin ja ditioerytritolin seosta suhteessa 3:1).

1H- ja 13C-NMR-spektrit saatiin käyttämällä Varian 10 VXR-300, Bruker APC 300, IBM/Bruker Nr-80 tai Jeol FX400 -spektrometriä. Kaikki spektrit saatiin 30 °C:ssa, ellei toisin ole mainittu. ^-NMR-spektrit ajettiin taajuudella 300 MHz, 80 MHz tai 400 MHz edellä lueteltuja laitteita vastaavasti ja 13C-NMR-spektrit taajuudella 75 MHz, 20 MHz 15 tai 100 MHz edellä lueteltuja laitteita vastaavasti. NMR-arvot ovat delta-arvoja suhteessa TMS:ään (tetrametyy-lisilaaniin) tai D20:n ollessa liuottimena suhteessa DSS:ään (2,2-dimetyyli-2-silapentaani-5-sulfonihapon nat-riumsuolaan).

20 Infrapunaspektrit (IR-spektrit) rekisteröitiin

Nicolet 5SX FT/IR -laitteella.

Mitä kromatografisiin menettelytapoihin tulee, useimmat liuottimet olivat Fischer HPLC -laatua olevia aineita. Ammoniumasetaatti ostettiin Aldrichilta. Vesi .* 25 puhdistettiin Barnstead NANOpure™ -vedensuodatus j ärj estel - mää käyttäen. Orgaanisten yhdisteiden preparatiivinen kromatografinen käsittely toteutettiin joko normaalilla painovoimaan perustuvalla kromatografiällä tavanomaista tekniikkaa käyttäen tai flash-kromatografiällä, jota kuvaavat 30 C. W. Still et ai., J. Org. Chem. 43 (1978) 2923 - 24.

Käytettiin seuraavia liuotinseoksia: • · 35 103792

Liuotinseos Aineosat 1 CHCl^tCH^OH: väk. NH^OK til.suhde 2 · 2 · 1

V:V;V

5 2 CHClotCHoOH: väk. ΝΗ^ΟΗ til.suhde 12:Mf1 5

V i V: V

3 CHCloiCHoOH: väk. ΝΗυΟΗ til. suhde 16:4?1 J *

V: Vi V

10 4 CHCl?:CHiOH: väk. NHhOH til. suhde 4:2:1 3

V:V’V

5 CHClo:CH-sOK: väk. NHnOH til.suhde 3:2:1 0 V:V:V 1 15 6 CHCl^CHoÖH: väk. NHhOHtil.suhde

7:3:1 V: V: V

γ Fysiologinen suolaliuos (0,85 %

NaClsa tislatussa vedessä)väk.NH4OH, til.suhde 4:1

20 V: V

8 CHC1?:CH-sOH: väk. NHyOK til.suhde 4:4:1 3

V:V:V

Ilmoitetut Rf-arvot on saatu näitä liuotinseoksia ja : 25 kaupan olevia, faasiltaan normaaleja silikageeli-TLC-levy- jä (GHLF 250 mieron, Analtech Inc. tai Kieselgel 60F254 / Merck) käyttäen. Preparatiivinen pylväskromatografiakäsit-tely tehtiin Merck grade 60 -silikageeliä (600 nm:n sili-kageeliä) käyttäen.

30 Kaikki prosenttiluvut perustuvat massaan, ellei . toisin ole mainittu.

Eräitä kiinteitä aineita kuivattiin pyöröhaihdutinta (Buchi 461) tai vakuumiuunia käyttäen noin 55 -60 °C:ssa muutaman tunnin ajan. Liuottimien poistoon käy- 36 103792 tettiin lisäksi automaattista Virtis-kylmäkuivauslaitetta (malli 10-010) tai Speed Vac™ -väkevöintilaitetta.

Samarium-153 ja lutetium-177 tuotettiin Missourin yliopiston (Columbia, MO) tutkimusreaktorilla. Yttrium-90 5 ostettiin Oak Ridge National Laboratoriesilta.

1 - (4 - isotiosyanaattibentsyyli)dietyleenitriami i-nipentaetikkahappo (SCN-Bz-DTPA) valmistettiin muunnelmalla menetelmästä, jonka ovat esittäneet M. W. Brechbiel et ai. , Inorg. Chem. 25 (1986) 2772 - 2781, ja 10 puhdistettiin yhden ainoan lajin saamiseksi anioninvaihto- HPLCrllä (Q-Sepharose™). Jotkut käytetyistä kemikaaleista hankittiin alla mainituista lähteistä: N-2-hydroksietyyli-piperatsiini-N'-2-etaanisulfonihappo (HEPES), vapaa happo ja natriumsuola, ostettiin Behring Diagnosticsilta (La 15 Jolla, CA) ; natriumsitraatti (takuulaatu) oli peräisin Fisher Scientificilta; tiofosgeeni oli peräisin Aldrich Chemicalsilta; ammoniumasetaatti, natriumasetaatti, ety-leenidiamiinitetraetikkahappo (EDTA) ja fosfaattipuskuroi-tu fysiologinen suolaliuos (PBS) olivat peräisin Sigma 20 Diagnosticsilta.

HPLC-kolonnit, joita käytettiin, olivat seuraavia: Käsin pakattu Q-Sepharose™ (Pharmacia), jonka koko oli joko 1,5 cm x 25 cm tai 2,5 cm x 25 cm; Zorbax™ BIO Series GF-250 (DuPont Instruments,· 9,4 mm x 25 cm); Vydac™ pro- .* 25 tein C-4 (Separations Groupin, Hesperia, CA, tavaramerkki; 4,6 mm x 25 cm); sekä Mono-Q™ ja Sp-Sephadex™ (Pharmacia Biotechnology Productsin tavaramerkki) . Sep-Pak™ (Waters Associatesin tavaramerkki) C-18 -patruunat ostettiin Waters Associatesilta (Milford, MA), Sephadex™ G-25 -ker-30 takäyttökolonnit (2,2 ml) Isolab Inc:Itä (Akron, OH) ja

Centricon™-30 (Amicon Divisionin, W. R. Grace & Co., • «

Danvers, MA, tavaramerkki) -pienväkevöintilaitteet Amico-nilta.

Analyyseissä ja näyte-erotuksissa käytettiin viittä 35 HPLC-systeemiä: • * 103792

Systeemi I koostui LKB 2150 -pumpusta ja 4152 -säätölaitteesta, UV-detektorista (LKB 2238 UV Cord) Berthold LB 506 A HPLC -radioaktiivisuusseurantalaitteesta (International Berthold Group) ja Gilson 201-202 -frakti-5 onkeräyslaitteesta (Gilson International, Middleton, WI).

Systeemi II varustettiin automaattisella näytteen-ottolaitteella (WISP 710 B) , kahdella pumpulla (malli 510) ja automaattisella gradientinsäätölaitteella (Waters Associates) , Perkin-Elmer LC-75 -spektrofotomeridetektorilla, 10 Beckman Model 170 -radioisotooppidetektorilla ja fraktion-keräyslaitteella (Pharmacian Frac-100).

Systeemi III koostui kahdesta Waters M-6000A -pumpusta ja Waters 660 -liuotinohjelmointilaiteesta, Waters Model 481 -detektorista, jossa aallonpituus on vaihdelta-15 vissa, ja Waters Data Module -yksiköstä; preparatiivisesti käytettiin myös ISCO-fraktiokeräyslaitetta.

Systeemi IV oli Dionex BioLC™ -systeemi, joka oli varustettu UV-detektorilla, jossa aallonpituus oli vaihdeltavissa.

20 Systeemi V oli Waters Model 590 -pumppu yhdistet tynä ISCO Model 2360 -gradientinohjelmointilaitteeseen ja Dionex-detektoriin, jossa aallonpituus on vaihdeltavissa.

Sentrifugointiin ja väkevöitiin käytettiin Sorvali RT 6000B -laitetta (DuPontin jäähdytettävää sentrifugia).

: 25 Haihtuvien liuottimien poistamiseen käytettiinm Speed Vac -haihdutinta (Savant Instruments Inc., Hicksville, N.Y.). Radioaktiivisuusmittaukset tehtiin Capintec™ Radioisotope Calibrator (Capintec Inc:n tavaramerkki) CRC-12 -laitteella, Beckman LS 9800 -nestetuikelaskurilla (beckman Instru-30 ments, Inc., Irvine, CA) tai Canberra 35* -monikanava-analysaattorilla, jossa jakopintana oli talliumissa uiva 7,6 cm natriumjodidikolokide.

Kompleksin muodostusta koskevissa esimerkeissä kompleksinmuodostumisprosentti määritettiin seuraavalla 38 103792 yleisellä vaihtomenetelmällä, silloin kun se on ilmoitettu .

10 ml:n muovikolonni täytettiin 1 - 2 ml :11a SP-Sephadex™ C-25 -hartsia, joka turvotettiin vedessä.

5 Ylimääräinen vesi poistettiin kolonnin yläpäähän kohdistetulla paineella. Hartsin päälle lisättiin tutkittava liuos (15 /il) , ja sen jälkeen käytettiin eluenttina 2 ml isotonisen suolaliuoksen ja väk. NH<OH:n seosta tilavuussuhteessa 4:1, Eluentti kerättiin laskentaputkiin. Sen jälkeen 10 käytettiin 2 ml lisää eluenttia. Sen jälkeen kun eluentti oli kerätty toiseen laskentaputkeen, hartsin yläosaan puhallettiin paineilmaa sen saamiseksi kuivaksi. Kuivattu hartsi siirrettiin kolmanteen laskentaputkeen. Aktiivisuus kussakin laskentaputkessa mitattiin Canberra-monikanava-15 analysaattoriin kytketyllä Nai-kolokidelaskurilla. Komp leksina esiintyvän metallin määrä on ilmoitettu sinä koko-naisaktiivisuuden osana (prosentteina) , joka todettiin eluentista. Vapaassa kompleksoitumattomassa tilassa olevan metallin määrä on ilmoitettu sinä prosenttiosuutena koko-20 naismetallimäärästä, joka jää hartsiin.

Kompleksoitumattoman metallin poisto ioninvaihdolla 10 ml: n muovikolonni täytettiin 0,5 ml :11a SP-Sephadex™ C-25 -hartsia, joka oli turvotettu vedessä. Ylimääräinen vesi poistettiin sentrifugoimalla kolonnia 25 4 minuuttia kierrosnopeudella 3000 min1. Hartsin päälle laitettiin 200 - 500 μΐ kompleksiliuosta, ja putkea sentrifugoitiin jälleen 4 minuuttia kierrosnopeudella 3000 min'1. Kompleksoitumaton metalli jäi kolonniin ja kompleksoitunut eluoitui liuottimen mukana.

30 Yttriumkompleksin valmistus

Kompleksit valmistettiin valmistamalla yttriumin 3 x 10'4 M vesiliuos [YC13 -6H20, 303,26 g/mol, tai Y(0Ac)3, 12,1 % H20:ta]. Halutun radioaktiivisuustason saavuttamiseksi lisättiin radioaktiivista Y3*-liuosta (Oak Ridge 35 National Laboratories). 990 μΐ-.aan Y3+-liuosta lisättiin 39 103792 10 μΐ ligandiliuosta (0,03 M), jolloin ligandin ja metallin moolisuhteeksi tuli 1:1. Ligandi-metallisuhteen 10:1 muodostamiseen käytettiin 10-kertainen määrä ligandiliuosta. pH säädettiin arvoon 7,4 mikrolitraluokkaa olevilla 5 määrillä HCl:a tai NaOHra. Liuoksesta tutkittiin sitten kompleksoituneen yttriumin määrä edellä esitettyä katio-ninvaihtomenetelmää käyttäen.

Samariumkompleksin valmistus

Samariumkompleksit muodostettiin edellä yttrium-10 komplekseille esitetyllä tavalla, paitsi että 3 x 10 4 M samariumliuos valmistettiin liuottamalla Sm203 (348,7 g/mol) 0,1 M HCl:oon. Radioaktiivinen Sm-153 saatiin Missourin yliopiston (Columbia, Missouri) tutkimus-reaktorista noin 3 x 10'4 M liuoksena 0,1 M HCl:ssa.

15 Eräät läpi koko tämän tekstin käytettävät termit määäritellään seuraavasti.

Sanasto: Väk. tarkoittaa väkevää; "OAc tarkoittaa asetaattiryhmää, OCOCH3; 20 TLC tarkoittaa ohutkerroskromatografiaa; DI H20 tarkoittaa deionisoitua NANOpure™-vettä; NANOpure™-vesi on puhdasta vettä, jota saadaan Barnstead NÄNOpure™-vedensuodatusjärjestelmästä; ympäristön lämpötila tarkoittaa huoneen lämpötilaa '·· 25 eli noin 20 - 25 °C:n lämpötilaa; yön yli tarkoittaa noin 9-18 tuntia; LC tarkoittaa nestekromatograf iaa ,· NBS tarkoittaa N-bromisukkinimidiä; MES tarkoittaa 2-(N-morfolino)etaanisulfonihappoa; 30 HPLC tarkoittaa suuren erotuskyvyn nestekromatogra- . f iaa; PBS tarkoittaa Sigmalta peräisin olevaa fosfaatti -puskuroitua fysiologista suolaliuosta, joka sisältää 120 mmol NaCl:a/l, 2,7 mmol KCl:a/l ja 10 mmol fosfaatti-35 puskuria (pH 7,4)/1.

103792 SP-Sephadex™ C-25 -hartsi on kationinvaihtohartsi, joka sisältää funktionaalisia sulfonihapporyhmiä ja jota myy Pharmacia, Inc.; min1 = kierroksia minuutissa; 5 pD tarkoittaa pH:ta vedyn ollessa korvattu deute riumilla; DOTA = 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahappo; HEPES = N-2-hydroksietyylipiperatsiini-N1-2-etaani- 10 sulfonihappo; BFC = bifunktionaalinen kelaatinmuodostaja;

Sykleeni = 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani; PA-DOTA = a-[2 -(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10 -tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahappo; 15 PA-DOTMA = a -[2 -(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10 - tetra-atsasyklododekaani-l-etikka-4,7,10-tris(metyylietik-ka)happo; BA-DOTA = a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani- 1,4,7,10-tetraetikkahappo; 20 OMe-BA-DOTA = a-(5-amino-2-metoksifenyyli)- 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahappo ; EA-D03A = 1-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10- tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahappo; 25 DTPA = dietyleenitriamiinipentaetikkahappo; SCN-Bz-DTPA = 1-(4-isotiosyanaattibentsyyli)diety-leenitriamiinipentaetikkahappo; EDTA = etyleenidiamiinitetraetikkahappo; kelaatinmuodostaja on ekvivalenttinen ligandin 30 kanssa; *: kompleksi on ekvivalenttinen kelaatin kanssa, konjugaatti tarkoittaa kovalenttisesti vasta-aineeseen tai vasta-ainefragmenttiin sitoutunutta kelaatinmuo-dostajaa tai kompleksia; 41 103792 vasta-aineet tarkoittavat CC-49:ää, CC-83:a ja B72.3:a ja niiden fragmentteja, kuten esimerkiksi Fabrtä ja F(ab')2:ta. Muita mahdollisia vasta-aineita on esitetty edellä. Hybridoomasolulinja B72.3 on talletettu kokoelmaan 5 American Type Culture Collection numerolla ATCC HB 8108, ja muut nimetyt hiiren monoklonaaliset vasta-aineet sitoutuvat TAG-72:n, kasvaimiin yhteydessä olevaan antigeenin, epitooppeihin.

Keksintöä valaistaan yksityiskohtaisemmin seuraa-10 villa esimerkeillä.

Lähtöaineiden valaistus

Esimerkki A

DL-2-bromi-4-(4-nitrofenyyli)butaanihapon metyyli-esterin valmistus 15 Liuokseen, joka sisälsi 5 ml hiilitetrakloridia ja 15 ml (0,2 mol) tionyylikloridia, lisättiin 10,46 g (0,05 mol) 4-(4-nitrofenyyli)butaanihappoa typpikaasukehän alla. Liuosta refluksoitiin 1 tunti, jolloin aluksi vapautui vetykloridikaasua ja rikkidioksidikaasua. Lämpimään 20 liuokseen lisättiin 11,0 g (0,06 mol) N-bromisukkinimidiä 25 ml:ssa hiilitetrakloridia ja katalysaattoriksi kolme pisaraa 48-%:ista vetybromidin vesiliuosta. Bromikaasua havaittiin vapautuvan. Tummanpunaista liuosta refluksoitiin 35 minuuttia. Liuos jäähdytettiin ja kaadettiin 25 100 ml:aan metanolia samalla sekoittaen. TLC-analyysi (etyyliasetaatti-heksaaniseos tilavuussuhteessa 60:40) osoitti uuden tuotteen (Rf = 0,69, silikageelilevyt) syntyneen. Ylimääräinen liuotin poistettiin pyöröhaihduttantalla, ja tummanpunainen öljy suodatettiin flash-kromato-30 grafiasilikageelikerroksen (2,5 cm x 12,7 cm) läpi : käyttäen eluenttina metyleenikloridia. Haihdutettaessa liuotin saatiin kirkas öljy (saanto 15,43 g), joka oli otsikon mukaisen yhdisteen ja lähtöaineena käytetyn butaa-nihappojohdannaisen metyyliesterin seos suhteessa 85:15.

103792

Otsikon mukaisen tuotteen karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: "H-NMR (CDC13) : 8,16 (d) , 7,38 (d) , 4,20 (dd) , 3,79 (s) , 2,88 (m), 2,38 (m): 5 13C-NMR (CDCI3, 75 MHz): 169,6, 147,5, 129,3, 123,7, 53,0, 44,4, 35,5, 33,0.

Esimerkki B

a-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10 -tetra-atsa-syklododekaani-l-etikkahapon 1-metyyliesterin valmistus 10 Liuokseen, joka sisälsi 1,72 g (10,0 mmol) 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaania 17 ml:ssa penteenillä stabiloitua kloroformia ja jota sekoitettiin, lisättiin 5 minuutin aikana 2,07 g (5,82 mmol) DL-2-bromi-4-(4-nitrofenyyli) butaanihapon metyyliesteriä typpikaasukehän alla 15 ja samalla sekoittaen. Reaktioseosta sekoitettiin noin 25 °C:ssa 48 tuntia. TLC (Analtechin silikageelilevyillä käyttäen liuotinseosta 2) osoitti otsikon mukaisen tuotteen (Rf = 0,73) muodostuneen. Keltainen kloroformiliuos laitettiin kooltaan 2,5 cm x 40 cm olevaan flash-kromato-20 grafiasilikageelipylvääseen (esieluoitu 5 % metanolia sisältävällä kloroformilla), joka eluoitiin 250 ml :11a kloroformia, joka sisälsi 5 % metanolia ja sen jälkeen liuo-tinseoksella 2. Puhdasta otsikon mukaista tuotetta sisältävät jakeet yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saa-” 25 tiin 2,15 g (5,46 mmol, 94 %) otsikon mukaista tuotetta vaaleankeltaisena lasimaisena aineena. Tämän lasimaisen aineen kloroformiliuoksen triturointi dietyylieetterin kanssa johti analyysipuhtaan valkean jauheen (sp = 156 -159 °C) saostumiseen, joka jauhe karakterisoitiin seuraa-30 vien tietojen perusteella: 1H-NMR (CDCI3) : 8,14 (d) , 7,39 (d) , 3,71 (s), 3,39 (dd) , 2,5 - 3,0 (m), 2,08 (m), 2,01 (m); 13C-NMR (CDCI3, 75 MHz): 172,7, 149,3, 146,4, 129,2, 123,6, 62,3, 51,2, 48,9, 47,2, 45,8, 45,4, 32,8,30,9.

103792

Esimerkki C

2-bromi-2-(4-nitrofenyyli)etaanihapon metyyllieste-rin valmistus

Seosta, joka sisälsi p-nitrofenyylietikkahappoa 5 (25,0 g, 0,14 mol) ja tionyylikloridia (15,1 ml, 0,21 mol) kuivassa bentseenissä (100 ml), sekoitettiin ja refluksoi-tiin N2-vaipan alla 3 tuntia. Sen jälkeen seos haihdutettiin kuiviin alipaineessa, Jäännös liuotettiin hiilitetra-kloridiin, ja liuosta sekoitettiin ja refluksoitiin typpi-10 vaipan alla. Palautusjäähdyttimen alla kiehuvaan seokseen lisättiin bromi (7,2 ml, 0,14 mol) pienissä erissä 3 vuorokauden aikana. Reaktioseoksen annettiin jäähtyä, ja hap-pokloridiin lisättiin hitaasti metanolia (50 ml) . Tulokseksi saatu bromiesteri (27 g, 71 %) saatiin talteen kel-15 täisenä alennetussa paineessa 6 tuuman lasikierukkakolon-nin läpi tislaamalla (kp = 168 °C 1,1 mm:n paineessa).

Otsikon mukaisen tuotteen rakenteen vahvistivat seuraavat spektritiedot: 1H-NMR (CDClj) : 8,25 (d) , 7,81 (d) , 5,51 (s), 3,86 (s).

2 0 Esimerkki D

a- (4-nitrofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-l-etikkahapon 1-metyyliesterin valmistus 529 mg:aan (2,068 mmol) 2-bromi-2-(4-nitrofenyyli)-etaanihapon metyyliesteriä (valmistettu esimerkin C mukai-' 25 sella menetelmällä), joka oli liuotettu 20 ml:aan aseto- nitriiliä, lisättiin kerralla liuos, joka sisälsi 354 mg (2,068 mmol) 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaania 20 ml:ssa asetonitriiliä, joka sisälsi juuri ja juuri riittävästi metanolia täydellisen liukenemisen aikaansaamiseksi. Tu-30 lokseksi saatua vaaleanpunaista liuosta sekoitettiin 1,5 :* tuntia, jonka jälkeen se väkevöitiin alipaineessa 35 °C:ssa pieneen tilavuuteen. Tämä epäpuhdas monoesteri-tetra-amiini puhdistettiin silikageelikromatografiällä käyttäen eluenttina 20 % (m/V) NH4OAc:a sisältävää CH3OH:a.

3 5 Näin triasetaattisuolana eristetty puhdistettu monoesteri- 44 103792 tetra-amiini muunnettiin sitten vapaaksi amiiniksi. 270 mgraan suolaa, joka oli liuotettu 3 ml:aan vettä, lisättiin 0 °C:ssa K2C03:n vesiliuosta (10-painoprosenttista) niin, että liuoksen pH:ksi tuli 11. Emäksinen liuos uutet-5 tiin sitten 10 ml:lla kloroformia (viidesti), ja klorofor-mikerrokset yhdistettiin, kuivattiin natriumsulfaatilla ja haihdutettiin, jolloin saatiin 160 mg (saanto 42 %) haluttua monoesteritetra-amiinia, joka karakterisoitiin NMR-spektrometrian ja FAB-massaspektrometrian (FAB = nopeilla 10 atomeilla pommitus; [M + H] * = 366) avulla sekä seuraavien tietojen perusteella: 'H-NMR (CDC13) : 8,12 (d) , 7,44 (d) , 4,75 (s) , 3,76 (s) , 2,67 -2,44 (m); 13C-NMR (CDCI3) : 171,5, 147,6, 144,0, 130,0, 124,0, 67,0, 15 49,8, 47,9, 46,9, 46,0.

Esimerkki E

N- (2-metoksi-5-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaanin valmistus

Kloroformiliuokseen (20 ml), joka sisälsi 2,9 g 20 (16,8 mmol) 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaania ja jota sekoitettiin, lisättiin yhdessä eräss kloroformiliuos (20 ml), joka sisälsi 2,1 g (8,5 mmol) 2-metoksi-5-nitro-bentsyylibromidia. Sen jälkeen kun reaktioseosta oli sekoitettu huoneen lämpötilassa 3 tuntia, se suodatettiin ja ·· 25 suodos väkevöitiin (alipaineessa), jolloin saatiin jään nös, joka käsiteltiin kromatografisesti silikageeli, liuo-tinsseos 3) . Monoalkyloitu tuote saatiin eristetyksi 79 %:n saannolla (sp = 154 - 156 °C) ja karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 30 13C-NMR (CDClj) : 162,47, 140,63, 127,92, 125,49, 124,53, 109,91, 55,88, 53,25, 50,90, 47,17, 45,45, 45,29.

45 103792

Esimerkki F

N- (2-hydroksi-5-nitrobentsyyli) -1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaanin valmistus 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaanin (2,3 g, 14 mmol) 5 1,4-dioksaaniliuokseen (20 ml) lisättiin yhdessä erässä ja tasaisesti sekoittaen 2-hydroksi-5-nitrobentsyylibromidin (1,2 g, 7 mmol) dioksaaniliuos (15 ml). Muutaman minuutin kuluttua lisättiin K2C03:a (1 g), ja sekoitusta jatkettiin 1 tunti huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen reaktioseos suo-10 datettiin ja suodos haihdutettiin alipaineessa, jolloin saatiin keltaista puolikiinteätä ainetta, joka käsiteltiin kromatografisesti (pylväässä) silkageelillä käyttäen elu-enttina liuotinseosta 5. Haluttu monoalkyloitu tuote eristettiin viimeistä kolmasosasta kirkkaankeltaista eluent-15 tia, joka sisälsi myös reagoimatonta amiinia. Haihdutuksen jälkeen keltaista öljyä trituroitiin CHCl3:n (100 ml) kanssa, ja seos suodatettiin CHC13-liukoisen amiinilähtöaineen poistamiseksi. Lopputuote eristettiin sitten puhtaana keltaisen kiinteän aineen muodossa (1,2 g, 55 %; sp = 142 -20 145 °C) ja karakterisoitiin tarkemmin seuraavien tietojen perusteella: 13C-NMR (D20) : 25,04. 25,28, 26,83, 31,80, 36,54, 101,88, 107,22, 110,92, 111,80, 115,26, 159,99.

Esimerkki G

25 1-[2 -(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa syklododekaanin valmistus

Liuokseen, joka sisälsi 3,50 g (20,3 mmol) 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaania 50 mlrssa penteenillä stabiloitua kloroformia ja jota sekoitettiin, lisättiin 30 pisaroittain 5 minuutin aikana 4,00 g (17,4 mmol) l-(2-bromietyyli)-4-nitrobentseeniä typpikaasukehän alla ja samalla voimakkaasti sekoittaen.

Sekoitusta jatkettiin noin 18 tuntia huoneen lämpötilassa (noin 25 °C:ssa), jolloin liuoksesta saostui amii-35 nihydrobromidikiteitä. Koko reaktioseo siirrettiin flash- 103792 kromatografiapylvääseen (2,5 cm x 46 cm) , joka oli esielu-oitu 5 % metanolia sisältävällä kloroformilla; 200 ml tätä liuosta käytettiin eluenttina ja eluointia jatkettiin sen jälkeen liuotinseoksella 3. Halutusta tuotteesta erotet-5 tiin 1,45 g (9,7 mmol) p-nitrostyreeniä (Rf = 0,98, liuo-tinseos 1) . Haluttu monofunktionaalinen otsikon mukainen yhdiste saatiin eristetyksi keltaisena öljynä (2,27 g, 7,06 mmol, 40,6 %), joka jähmettyi seisoessaan (Rf = 0,73, liuotinseos 1) .

10 Otsikon mukaisesta yhdisteestä otettu näyte kitey tettiin uudelleen CHCl3-sykloheksaaniseoksesta, ja sen ka-rakterisistiset tiedot olivat seuraavat: sp = 146,5 - 148.5 °C; ^-NMR (CDClj): 8,135 (d, m), 7,395 (d, m), 2,91 (t) , 2,77 15 (t), 2,72 (t), 2,50 (t), 2,60 (s); 13C-NMR (CDClj, 75 MHz): 148,5, 146,7, 129,6, 123,4, 55,5, 51,4, 46,9, 45,9, 45,1, 33,7.

Esimerkki H

1-(4-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklodode-20 kaanin valmistus 50 ml:aan kloroformia lisättiin lisättiin 3,5 g (20,3 mmol) 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaania ja 1,7 g (7,87 mmol) p-nitrobentsyylibromidia, ja seosta sekoitettiin typen alla 25 °C:ssa 24 tuntia. Hydrobromidisuolan *· 25 kloroformiliete siirrettiin sitten flash-silikageelikroma- tografiapylvääseen (liuotinseos 3) , jonka koko oli 2.5 cm x 43 cm. Saatiin 2,13 g (6,93 mmol) otsikon mukaista tuotetta analyysipuhtaana, vaaleankeltaisena, kiinteänä aineena 88 %:n saannolla (Rf = 0,58, liuotinseos 3), sp = 30 128 - 129 °C, joka aine karakterisoitiin tarkemmin seuraa- *1 vien tietojen perusteella: 1H-NMR (CDClj): 8,19 (d) , 7,49 (d) , 3,69 (s), 2,82 (t) , 2,70 (t), 2,59 (m); 13C-NMR (CDClj, 75 MHz): 147,2, 128,4, 123,8, 58,8, 51,7, 35 47,1, 46,3, 45,1.

« 4 103792 (Esimerkkiä I ei ole lainkaan, jotta vältetään sekaantuminen myöhempien biologisten esimerkkien numeroinnin kanssa. )

Esimerkki J

5 1-(4-aminobentsyyli)1,4,7,10-tetra-atsasyklodode- kaanin valmistus 10 ml:aan metanolia liuotettiin 690 mg (2,25 mmol) 1-(4-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaania (valmistettu esimerkin H mukaisella menetelmällä). Liuok-10 seen lisättiin 350 mg katalysaattoria, joka sisälsi 10 % palladiumia hiilikantoaineella. Liuoksen läpi johdettiin ylimäärin vetyä 25 °C:n lämpötilassa. TLC osoitti 45 minuutin kuluttua otsikon mukaisen tuotteen syntyneen (Rf = 0,33, liuotinseos 3). Muodostunut otsikon mukainen tuote 15 puhdistettiin kromatografisesti flash-silikageelipylväässä (liuotinseos 3), jonka koko oli 2,5 cm x 41 cm, ja saatiin 480 mg (77 %) otsikon mukaista tuotetta vaaleankeltaisena kirkkaana öljynä.

Vapaan emäksen muodossa oleva otsikon mukainen tuo-20 te (103 mg, 0,37 mmol) muunnettiin hydrokloridisuolaksi puhaltamalla vapaan emäksen etanoliliuosten läpi vedetöntä vetykloridia. Syntyneen otsikon mukaisen yhdisteen tetra-hydrokloridisuolan saanto oli kylmällä etanolilla pesun ja alipainekuivauksen jälkeen 147 mg (0,347 mmol), sp = 255 -·· 25 260 °C (hajoaa), ja se karakterisoitiin tarkemmin seuraa- vien tietojen perusteella: ^-NMR (DaO, pD = 1,9): 7,56 (d) , 7,47 (d) , 3,95 (s), 3,28 (t), 3,23 (t), 3,09 (t), 2,96 (t); 13C-NMR (D20, pD = 1,9, 75 MHz): 138,3, 134,2, 132,2, 126,0, 30 58,5, 50,3, 46,7, 44,6, 44,3.

.* Esimerkki K

2-metoksi-5-nitrobentsyylinitriilin valmistus

Liuokseen, joka sisälsi natriumsyanidia (6 g, 121,9 mmol) vedessä (5,3 ml) jajonka lämpötila oli 70 °C, 35 lisättiin pienissä erissä ja samalla sekoittaen kuuma liu- • 103792 os, joka sisälsi 2-metoksi-5-nitrobentsyylibromidia (25 g, 101,6 mmol) etanolissa (15 ml). Reaktioseosta refluksoi-tiin sitten 1,5 tuntia, ja se jäähdytettiin ja suodatettiin. Suodatuskakku pestiin asetonitriilillä ja suodos 5 haihdutettiin alipaineessa, jolloin saatiin 2-metoksi-5-nitrobentsyylinitriiliä (19,5 g, 100 %) kellertävänruskeana kiinteänä aineena. Tuote karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 13C-NMR (CDCIj) : 161,4, 141,0, 125,7, 124,6, 119,8, 116,5, 10 110,2, 56,3, 18,8.

Esimerkki L

2-metoksi-5-nitrofenyylietikkahapon valmistus

Lietettä, joka sisälsi 2-metoksi-5-nitrobentsyyli-nitriiliä (19,5 g) (valmistettu esimerkin K mukaisella 15 menettelytavalla) väk. HC1:ssa (20 ml) refluksoitiin 3 tuntia. Jäähdytyksen jälkeen raakatuote saatiin talteen suodattamalla ja pestiin vedellä. Kiinteä aine sekoitettiin natriumhydroksidin kuumaan vesiliuokseen ja seos suodatettiin kuumana. Oranssi liuos jäähdytettiin ja tehtiin 20 happamaksi HCl:lla. Sakka suodatettiin erilleen, pestiin vedellä ja kuivattiin, jolloin saatiin 2-metoksi-5-nitro-fenyylietikkahappoa valkeana kiinteänä aineena (15 g, 70 %) . Tuote karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella : ;; 25 13c-nmr (cdci3-cd3od) : 172,8, 162,5, 140,7, 126,2, 124,7, 124,1, 109,7, 55,8, 35,0.

Esimerkki M

o-bromi-(2-metoksi-5-nitrofenyyli)etikkahapon me-tyyliesterin valmistus 30 Lietteeseen, joka sisälsi 2-metoksi-5-nitrofenyyli- etikkahappoa (2,266 g, 10,74 mmol) (valmistettu esimerkin L mukaisella menettelytavalla) kuivassa bentseenissä (50 ml), lisättiin tionyylikloridia (4,0 ml, 54,8 mmol). Pulloon asetettiin kuivausputki ja jäähdytin, ja seosta 35 refluksoitiin 2 tuntia. Tulokseksi saatu keltainen liuos • · 49 1 0 3 7 9 2 väkevöitiin alipaineessa pieneen tilavuuteen ja sekoitettiin kuivaan hiilitetrakloridiin. Lisättiin bromia (0,6 ml, 11,6 mmol), ja liuosta refluksoitiin 2 vuorokautta ilmakehän kosteudelta suojattuna. Reaktioseos väkevöi-5 tiin pieneen tilavuuteen, ja siihen lisättiin metanolia (50 ml) . Sen jälkeen kun ylimääräinen metanoli oli haihdutettu alipaineessa, tulokseksi saatu öljy puhdistettiin kromatografisesti (silikageeli, metyleenikloridi-heksaani-seos suhteessa 4:1). Otsikon mukainen tuote (2,399 g, 10 74 %) saatiin keltaisena öljynä. Tuote karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: XH-NMR (CDC13) : 8,45 (dd) , 8,15 (dd) , 6,95 (d) , 5,75 (s), 3,99 (s), 3,78 (S).

Esimerkki N

15 a-(2-metoksi-5-nitrofenyyli)-1,4,7,10 -tetra-atsa- syklododekaani-l-etikkahapon metyyliesterin valmistus

Liuokseen, joka sisälsi 1,4,7,10-tetra-atsasyklodo-dekaania (2,72 g, 15,79 mmol) kloroformissa (50 ml) ja jota sekoitettiin, lisättiin liuos, joka sisälsi a-bromi-20 (2-metoksi - 5-nitrofenyyli)etikkahappoa (2,399 g, 7,89 mmol) (valmistettu esimerkin M mukaisella menettelytavalla) kloroformissa (10 ml). Seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 2 tuntia. Samea seos väkevöitiin sitten pieneen tilavuuteen alipaineessa ja huoneen lämpötilassa.

·. 25 saakatuote puhdistettiin kromatografisesti (silikageeli, liuotinseos 3) . Otsikon mukainen yhdiste saatiin talteen keltaisena kiinteänä aineena (2,60 g, 83 %) ja karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 13C-NMR (CDCI3) : 170,7, 161,6, 139,9, 125,0, 124,5, 124,2, 30 110,2, 59,5, 55,5, 50,5, 48,0, 47,3, 45,6, 44,3, 43,5.

Esimerkki O

DL-2-bromi-4-(4-nitrofenyyli)butaanihapon isopro-pyyliesterin valmistus

Liuokseen, joka sisälsi hiilitetrakloridia (10 ml) 35 ja tionyylikloridia (30 ml, 0,4 mol), lisättiin typpikaa- • · 103792 sukehän alla 4-(4-nitrofenyyli)butaanihappoa (21,0 g, 0,10 mol) Harppin et ai. [J. Org. Chem. 40 (1975) 3420 - 27] menettelytapaa käyttäen. Liuosta refluksoitiin l tunti, jolloin aluksi vapautui nopeasti vetykloridia ja rik-5 kidioksidia. Tässä vaiheessa lämpimään liuokseen lisättiin N-bromisukkinimidiä (22,0 g, 0,12 mol) hiilitetrakloridiin (50 ml) liuotettuna ja katalysaattoriksi 8 pisaraa 48-%:ista vetybromidin vesiliuosta, jolloin havaittiin vapautuvan bromia. Tummanpunaista liuosta refluksoitiin 10 35 minuuttia lisää. Liuos jäähdytettiin ja kaadettiin iso- propanoliin(400 ml) samalla sekoittaen. TLC-analyysi (me-tyleenikloridi, silikageelilevyt) paljasti uuden tuotteen (R£ = 0,73). Ylimääräinen liuotin poistettiin, ja tummanpunainen öljy suodatettiin flash-kromatografiasilikageeli-15 kerroksen läpi (7,6 cm x 15 cm) käyttäen eluenttina mety-leenikloridia. Liuotin poistettiin alipaineessa, ja vaaleankeltainen öljy siirrettiin flash-kromatografiapylvääseen (7,6 cm x 46 cm) ja elueoitiin metyleenikloridilla, jolloin saatiin 25,0 g (0,076 mol) otsikon mukaista bromies-20 terituotetta 75 %-.n saannolla kirkkaana öljynä isopropano-lilla solvatoituneena, joka tuote sisälsi alle 5 % bromau-tumatonta esteriä ja joka karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: ^-NMR (CDC13) : 8,16 (d, 2 H), 7,38 (d, 2 H), 5,05 (sept., ; 25 1 H), 4,14 (dd, 1 H), 2,88 (m, 4 H), 2,39 (m, 4 H), 1,29 (d, 6 H) ; 13C-NMR (CDCI3) : 168,7, 147,7, 129,3, 123,8, 69,9, 45,1, 35,6, 33,0, 21,5, 21,2.

Esimerkki P

30 a- [3-(4-nitrofenyy1i)propyy1i]-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-l-etikkahapon 1-metyyliesterin valmistus

Liuokseen, joka sisälsi 3,137 g (18,2 mmol) sykleenistä vapaata emästä 30 mlrssa penteenillä stabiloitua kloroformia ja jota sekoitettiin, lisättiin 5 minuutin 35 aikana 4,81 g (14,6 mmol) DL-2-bromi-4-(4-nitrofenyyli)bu- 103792 taanihapon isopropyyliesteriä typpikaasukehän alla ja samalla sekoittaen. Reaktioliuosta sekoitettiin 24 tuntia huoneen lämpötilassa. TLC-analyysi (liuotinseos 2) paljasti muuttumisen otsikon mukaiseksi monoalkyloitumistuot-5 teeksi (Rf = 0,78, detektointi ninhydriinin, jodin ja UV-valon avulla). Keltainen kloroformiliuos siirrettiin kooltaan 2,5 cm x 43 cm olevaan flash-kromatografiasilikagee-lipylvääseen, joka oli esieluoitu 5 % metanolia sisältävällä kloroformilla. Eluointi 300 ml :11a tätä liuotinseos-10 ta ja sen jälkeen liuotinseoksella 2 antoi tuotteeksi puhdasta otsikon mukaista yhdistettä sisältäviä jakeita, jotka yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin 4,85 g (5,46 mmol) vapaan emäksen muodossa olevaa otsikon mukaista tuotetta vaaleana öljynä (saanto 79 %), joka karakteri-15 soitiin tarkemmin seuraavien tietojen perusteella: lH-NMR (CDClj) : 8,15 (d, 2 H), 7,40 (d, 2 H), 5,07 (p, 1 H), 3,35 (dd, 1 H), 2,65 - 3,0 (m, 13 H), 2,5 - 2,64 (m, 4 H), 2,14 (m, 1 H), 2,00 (m, 1 H), 1,28 (dd, 6 H); 13C-NMR (CDC13) : 171,6, 149,5, 146,5, 129,2, 123,6, 68,1, 20 62,7, 49,2, 47,5, 45,9, 45,7, 32,9, 31,0, 22,1, 22,0; IR (CDC13, cm'1): 3231 (N-H) , 2978, 2933, 1721 (esterikar-bonyyli), 1601, 1512, 1458, 1345, 1107; FAB-massaspektri (m/e): 422 ([M + H]+), 408, 392. Lopputuotteiden, ligandien, valmistus : 25 Esimerkki 1 a-(4-nitrofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7,10-tetraetikkahapon monometyylitrietyyliesterin valmistus 46 ml:aan asetonitriiliä, joka sisälsi 4,6 g 30 (33,3 mmol) vastajauhettua vedetöntä kaliumkarbonaat tia, liuotettiin 700 mg (1,91 mmol) a-(4-nitrofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l-etikkahapon 1-metyyli-esteriä (valmistettu esimerkin D mukaisella menettelytavalla) . Tähän suspensioon lisättiin kerralla 1,022 g 35 (6,12 mmol) etyylibromiasetaattia. Sen jälkeen kun suspen- • · > 103792 siota oli sekoitettu huoneen lämpötilassa 4 tuntia, se suodatettiin alipaineessa, suodatuskakku pestiin 15 ml :11a asetonitriiliä (kahdesti) ja suodos haihdutettiin alipaineessa 38 °C:ssa, jolloin saatiin puhdistamatonta otsikon 5 mukaista tetraesteriä purppuranpunaisena kiinteänä aineena. Tetraesteri puhdistettiin sitten silikageelikromato-grafian avulla käyttäen eluenttina 5 % C2H5OH:a sisältävää CHCl3:a ja sen jälkeen liuotinseosta 3, jolloin saatiin 620 mg (0,988 mmol, 52 %) haluttua tuotetta. Tämä tuote 10 karakterisoitiin FAB-massaspektrometrian avulla ([M + H]+ = 624) ja lisäksi seuraavien tietojen perusteella: "H-NMR (CDClj) : 8,24 (d) , 7,45 (d) , 4,94 (s), 4,35 - 4,10 (m), 3,79 (s), 3,75 - 1,84 (m), 1,34 - 1,22 (m); 13C-NMR (CDClj) : 174,3, 173,8, 173,6, 171,5, 147,6, 138,9, 15 131,5, 123,4, 64,8, 61,5, 61,4, 60,2, 55,4, 55,0, 53,1, 52,9, 52,7, 52,4, 51,9, 51,7, 48,8, 48,3, 44,9, 19,1, 14,1.

Esimerkki 2 a- (4-nitrofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-20 ni-1,4,7,10-tetraetikkahapon valmistus 30 ml:aan 6 N HCl:a liuotettiin 300 mg (0,478 mmol) a- (4-nitrofenyyli-1,4,7,10 - tetra - atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon monometyylitrietyyliesteriä (valmistettu esimerkin 1 mukaisella menettelytavalla), ja : 25 seosta refluksoitiin yön yli. Tämän refluksointijakson päätyttyä liuos haihdutettiin alipaineessa 70 °C:ssa, jolloin saatiin keltaista kiinteätä ainetta. Tämä kiintoaine liuotettiin 3 ml:aan vettä, liuos suodatettiin ja suodos haihdutettiin, jolloin saatiin 253 mg (0,378 mmol, 79 %) 30 raakatuotetta. Tämä tuote puhdistettiin preparatiivisen TLC:n avulla [silikageeli, kehitys 20 % (m/V) NH4OAc:a sisältävällä CH3OH: 11a] ja karakterisoitiin FAB-massaspektrometrian avulla ( [M + H] 1 = 526) ja lisäksi seuraavien tietojen perusteella: • « 103792 ^-NMR (D20) : 8,21 (d) , 7,42 (d) , 483 (s) , 3,83 - 2,19 (m) , 1,92 (s); 13C-NMR (D20) : 175,0, 173,6, 171,8, 167,0, 166,3, 146,9, 138,3, 130,1, 123,0, 62,2, 54,0, 53,0, 52,2, 50,4, 97,3, 5 46,8, 44,8, 42,8, 20,0.

Esimerkki 3 a- (4-aminofenyyli) -1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7,10-tetraetikkahapon (BA-DOTA) valmistus Menetelmä A: 10 Tetrahapon (valmistettu esimerkin 2 mukaisella me nettelytavalla) nitroryhmän katalyyttinen hydraus toteutettiin Adams-katalysaattoria (Pt02) ja vetyä käyttäen suurin piirtein kvantitatiivisella saannolla, jolloin saatiin otsikon mukainen tuote. Tämä tuote karakterisoitiin 15 FAB-massaspektrometrian ([M + H]+ = 496) ja anioninvaihto-HPLC:n (Q-Sepharose™-geelillä) avulla sekä lisäksi seuraa-vien tietojen perusteella: 1H-NMR (DaO) : 8,12 (d) , 7,86 (d) , 5,66 (s), 4,73 - 4,57 (m), 4,27 - 3,78 (m), 3,39 - 2,91 (m); 20 13C-NMR (DaO) : 176,54, 176,52, 176,46, 141,1, 128,9, 120,9, 112,5, 65,0, 55,9, 55,7, 53,6, 49,7, 49,5, 49,3, 45,7, 45,4, 44,9, 44,6, 41,4.

Menetelmä B:

Toinen menetelmä tämän yhdisteen valmistamiseksi .' 25 oli esimerkissä D saadun monoesteritetra-amiiniyhdisteen muuntaminen monohappotetra-amiiniyhdisteeksi (6 N HC1, refluksointi yön yli), mitä seurasi alkylointi vesiliuoksessa bromietikkahappoa käyttäen ja sitten nitroryhmän pelkistys amiiniryhmäksi (Pt02-katalysaattori), jolloin 30 saatiin edellä kuvatun tuotteen kanssa identtinen tuote. Esimerkki 4 a- (4-nitrofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7-trietikkahapon valmistus 60 ml:aan 6 N HCl:a liuotettiin 2,0 g (5,48 mmol) 35 monoesteritetra-amiiniyhdistettä (valmistettu esimerkin D 1 • · 103792 mukaisella menettelytavalla). Seosta kuumennettiin 95 °C:ssa yön yli (noin 10 tuntia), jonka jälkeen se haihdutettiin alipaineessa 75 °C:ssa, jolloin saatiin 2,53 g (5,11 mmol, 96 %) monohappotetra-amiinitetrahydrokloridia 5 keltaisena kiinteänä aineena.

Edellä saatu monohappotetra-amiinitetrahydrokloridi (0,5 g, 1,0 mmol) liuotettiin 15 ml:aan vettä, ja pH säädettiin NaOH-.lla arvoon 9. Valmistettiin erillinen bromi -etikkahapon (0,71 g, 5,13 mmol) liuos, ja se lisättiin mo-10 nohappotetra-amiinin vesiliuokseen. Liuoksen pH säädettiin taas arvoon 9 ja pidettiin reaktion aikana tässä arvossa pienillä 1,0 N NaOH -lisäyksillä. Samalla kun reaktiota sekoitettiin, siitä otettiin eri vaiheissa näyte-eriä ja alkyloitumisen etenemistä seurattiin anioninvaihto-HPLC:n 15 avulla. Kun dialkyloitumistuotteen (kaikkiaan 3 asetaatti- ryhmää läsnä) määrä oli saavuttanut maksiminsa, koko reak-tioseos kylmäkuivattuin, jolloin saatiin tummaa kiinteätä ainetta. Tämä alkylointituotteiden raakaseos puhdistettiin sitten silikageelikromatografiällä (eluointi liuotinseok-20 seilal), jota seurasivat preparatiivinen anioninvaihtokro- matografia (eluointi liuotingradienttia 0 %:sta 100 %:iin 1 M NH4OAc:a käyttäen), sen jälkeen käsittely preparatiivi-silla TLC-levyillä (kehitys liuotinseoksessa 4) ja lopuksi silikageelikromatografia (eluointi liuotinseoksella 4) . 25 Tällä laajamittaisella puhdistusmenettelyllä saatiin 30 mg (0,06 mmol, 6,0 %) otsikon mukaista tuotetta keltaisena kiinteänä aineena. Tämä tuote karakterisoitiin FAB-massa-spektrometrian ([M + H]* = 468) ja anioninvaihto-HPLC:n avulla sekä lisäksi seuraavien tietojen perusteella: 30 1H-NMR (DjO) : 8,12 (bs) , 7,35 (bs) , 4,76 (s), 3,57 - 3,44 (m) , 2,97 - 1,83 (m) , 1,80 (s) ; • 13C-NMR (Da0) : 181,75, 180,68, 179,00, 175,37, 147,70, 141,22, 133,08, 123,53, 68,44, 59,72, 56,00, 52,80, 49,96, 49,29, 47,86, 45,36, 44,26, 42,78, 42,25, 23,72.

• · 103792

Esimerkki 5 a- (4-aminofenyyli) -1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7-trietikkahappopentahydrokloridin ja a-(4-aminofenyyli) -1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l,4,10-tetraetik-5 kahappopentahydrokloridin valmistus

Alkuloitumistuotteiden raakaseos valmistettiin esimerkissä 4 kuvatulla menettelytavalla. Tämä raakaseos käsiteltiin kromatografisesti silikageelipylväässä käyttäen eluenttina 20 % (m/V) NH4OAc:a sisältävää CH3OH:a. Asianmu-10 kaiset tästä pylväästä saadut jakeet yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin. Raakatuote, joka sisälsi huomattavia määriä NH„OAc:a, liuotettiin 80 ml:aan NANOpure™-vettä ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin vaaleanruskeata kiinteätä ainetta. Tämä kiintoaine liuotettiin 20 ml:aan NANOpure™-15 vettä, ja liuosta ravistettiin Pt02-katalysaattorin kanssa H2-atmosfäärissä, kunnes vedyn kulutus lakkasi. Katalysaattori erotettiin alipainesuodattamalla ja suodos kylmäkuivattiin, jolloin saatiin keltaista kiinteätä ainetta.

. Kiintoaine liuotettiin 3 ml:aan liuotinseosta 4 ja käsi- 20 teltiin kromatografisesti silikageelillä liuotinseosta 4 käyttäen. Yhdistetyistä jakeista poistettiin sitten liuotin alipaineessa ja ne kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 779,6 mg vaaleankeltaista kiinteätä ainetta. nC-NMR- ja protoni-NMR-spektri viittasivat siihen, että tämä tuote on : 25 kahden mahdollisen geometrisen isomeerin seos suhteessa 50:50. Isomeeriseos käsiteltiin HCl:lla (ylimäärin) ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 548,4 mg (saanto 61 %) otsikon mukaisia tuotteita, sp. >270 °C. Anionvaihto-kromatografiässä (HPLC-systeemi III) esiintyi vain yksi 30 suuri huippu (puhtaus >94 %); FAB-massaspektri paljasti geometristen isomeerien esiintymisen ([M + H]+ = 438).

• « 56 103792

Esimerkki 6 α-[2 -(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon 1,4,7,10-tetrame-tyyliesterin valmistus 5 Liuokseen, joka sisälsi 1,43 g (3,63 mol) a-[2-(4- nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l-etikkahapon 1-metyyliesteriä (valmistettu esimerkin B mukaisella menettelytavalla) 40 ml:ssa argonilla huuhdottua asetonitriiliä, lisättiin 1,71 g (12,34 mmol) vedetöntä 10 kaliumkarbonaattia samalla voimakkaasti sekoittaen. Reak-tioseokseen lisättiin 1,78 g (11,61 mmol) metyylibromiase-taattia, ja reaktioseosta sekoitettiin noin 25 °C:ssa 48 tuntia. TLC-analyysi osoitti uuden tuotteen muodostuneen (Rf = 0,62, liuotinseos 2). Lietteeseen lisättiin 6,0 g 15 flash-kromatografiasilikageeliä ja asetonitriili poistet tiin pyöröhaihduttimella. Tulokseksi saatu aine siirrettiin silikageelipylvääseen, jonka koko oli 2,5 cm x 41 cm ja joka oli esieluoitu 5 % metanolia sisältävällä kloroformilla. Noin 400 ml valmistetusta liuoksesta käytettiin 20 useiden poolittomien epäpuhtauksien ja reagoimattoman al-kylointiaineen eluointiin. Sen jälkeen eluoitiin liuotin-seoksella 2, ja tuotetta (Rf = 0,62) sisältävät jakeet kerättiin talteen, yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin 2,1 g (3,44 mmol, 95 %) otsikon mukaista tuotetta : 25 vaaleankeltaisena lasimaisena aineena. 1H-NMR osoitti tämän tuotteen olevan konformaatioisomeerien eli geometristen isomeerien seos suhteessa 2:1.

'H-NMR (CDC13, 50 °C) : 8,137 (d) , 8,128 (d) , 7,398 (d) , 7,385 (d) , 3,82 (s), 3,76 (s), 3,75 (s), 3,74 (s), 3,68 30 (s), 1,5-3,52 (m); “C-NMR (CDCI3, 50 °C, 75 MHz): 175,8, 174,2, 174,1, 174,0, 149,0, 129,5, 129,3, 123,6, 60,1, 55,1, 52,8, 52,7, 52,6, 52.4, 52,2, 52,1, 52,0, 51,2, 51,1, 51,0, 49,1, 48,8, 47.5, 45,2, 34,2, 32,6.

• 1 103792

Esimerkki 7 a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon 1,4,7,10-tetrame-tyyliesterin valmistus 5 25 ml:aan metanolia, joka sisälsi 400 mg kataly saattoria, joka sisälsi 10 % palladiumia hiilikantoaineel-la, liuotettiin typpikaasukehän alla 1,41 g (2,31 mol) a-[2 -(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklodode-kaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon 1,4,7,10-tetrametyylieste-10 riä (valmistettu esimerkin 6 mukaisella menettelytavalla). Liuoksen läpi johdettiin ylimäärin vetyä 1 baarin paineessa 3 tunnin ajan. TLC osoitti voimakkaasti ninhydriinipo-sivisen aineen (Rf = 0,62, liuotinseos 2) muodostuneen. Metanolia sisältävä katalysaattoriliete suodatettiin pii-15 maan läpi ja liuotin haihdutettiin, jolloin saatiin otsikon mukainen tuote (1,21 g, 2,08 mmol, 91 %) valkeana la-simaisena kiintoaineena (konformaatioisomeerien seoksena suhteessa 2:1). Vähemmistönä oleva konformaatioisomeeri eli geometrinen isomeeri erotettiin pääisomeerista flash-20 kromatografiän avulla käyttäen eluenttina 10 % metanolia sisältävää kloroformia, jolloin saatiin otsikon mukainen tuote likaisenvalkoisena jauheena (sp =89-95 °C), joka karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: ^-NMR (CDC13, 50 °C) : 6,94 (d) , 6,89 (d) , 6,69 (d) , 6,66 . 25 (d) , 3,91 (s), 3,80 (s), 3,78 (s), 3,74 (s), 3,73 (s), 3,72 (s), 3,71 (s), 1,5 - 3,5 (m); 13C-NMR (CDClj, 50 °C, 75 MHz): 176,1, 174,0, 173,9, 172,2, 170,4, 169,6, 144,2, 144,1, 130,6, 130,5, 129,5, 129,1, 115,9, 115,8, 62,6, 58,7, 55,1, 54,3, 52,7, 52,5, 52,3, 30 52,2, 52,1, 52,0, 51,9, 51,8, 51,7, 50,2, 50,0, 47,3, 44,7, 32,8, 31,8, 30,0, 25,2; FAB-massaspektri (m/e) : 602 ([M + Na+]+), 618 ([M + K*]"), 624 ( [M + 2Na+ - H+] ♦) .

58 103792

Esimerkki 8 α-[2 -(4-aminofenyyli) etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon (PA-DOTA) valmistus 5 50 ml:aan väk. suolahappoa liuotettiin 1,5 g (2,59 mmol) a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon 1,4,7,10-tet-rametyyliesteriä (esimerkin 7 mukaisella menettelytavalla valmistettuna raakaseoksena suhteessa 2:1). Reaktioseosta 10 refluksoitiin noin 105 °C:ssa 6 tuntia. TLC (liuotinseos 1) osoitti esterin (Rf = 0,88) muuttuneen hydrokloridisuo-lan muodossa olevaksi otsikon mukaiseksi tuotteeksi (Rf = 0,43) . Ylimääräinen liuotin poistettiin pyöröhaihduttimel-la, ja tulokseksi saatu valkea kiinteä aine kuivattiin. 15 Otsikon mukaista tuotetta saatiin hydrokloridisuolana 1,6 g, ja se karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella : ^-NMR (D20, pD = 1,0, 90 °C) : 7,48 (d) , 7,42 (d) , 2,8 - 4,3 (m), 2,23 (m), 2,03 (m); 20 13C-NMR (D20, pD = 1,0, 90 °C, 75 MHz): 176,4, 174,9, 171,6, 144.7, 132,9, ,132,8, 130,4, 125,7, 61,7, 56,8, 56,0, 53.7, 53,1, 51,6, 47,9, 34,3, 37,6; FAB-massaspektri (m/e) : 524 ([M + H]+), 546 ([M + Na*]*), 624 ( [M + 2Na+ - H+] *) .

25 Mahdolliset pienet esteriepäpuhtaudet poistettiin flash-kromatografiaa ja liuotinseosta 1 käyttäen hydroklo-ridisuolan muodossa olevasta otsikon mukaisesta yhdisteestä. 1,0 g otsikon mukaisen yhdisteen hydrokloridisuolaa siirrettiin flash-silikageelikromatografiakolonniin, jonka 30 koko oli 2,5 cm x 58 cm. Jakeet, jotka sisälsivät pelkästään otsikon mukaista tuotetta ammoniumkaliumsekasuolan • < muodossa, yhdistettiin, jolloin saatiin 580 mg tuotetta.

HPLC-analyysi osoitti aineen pinta-alaan perustuvan puhtauden olevan yli 98 % aallonpituudella 230 ja 254 nm.

• I

59 103792 FAB-massaspektri (m/e) : 562 ( [M + K+] *) , 584 ( [M + K+ + Na+ - H+] *) , 624 ( [M + 2Na+ - H+] +) .

Esimerkki 9 a-[2 -(4 -aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-5 syklododekaani-1,4,10-trietikkahapon ammoniumkaliumseka- suolan eristys

Seka tetra- että trihappoja (2,05 g) sisältävä raa-kaliuos (valmistettu esimerkin 8 mukaisella menettelytavalla) liuotettiin mahdollisimman pieneen määrään liuotin-10 seosta 1 ja siirrettiin flash-silikageelikromatografiapyl-vääseen, jonka koko oli 30 cm x 7,6 cm ja joka oli esi-eluoitu tällä liuottimena. Eluoituneet otsikon mukaista tuotetta (Rf = 0,63 liuotinseoksessa 1) sisältävät jakeet kerättiin ja saatiin 200 mg o-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-15 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,10-trietikkahapon ammoniumkaliumsekasuolaa. ^-NMR- ja 13C-NMR-analyysi viit-tasivat siihen, että tämä trihappo oli symmetrinen isomeeri (1,4,10-trihappopaikkaisomeeri): 1H-NMR (D20, pD = 0,5 DClrlla säädettynä, T = 90 °C): 7,52 20 (d), 7,46 (d), 3,60 (m), 3,54 (m), 3,19 (m); 13C-NMR (D20, pD = 0,5, T = 90 °C) : 176,1, 170,2, 140,0, 132,7, 131,1, 126,1, 57,6, 57,2, 56,1, 54,9, 53,2, 51,5, 51,2, 31,2.

FAB-massaspektri (m/e): 466 ([M + H*]*), 488 ([M + .· 25 Na+] +) , 504 ( [M + ΚΊ +) , 526 ( [M + K+ + Na* - H*] *) , 542 ( [M + 2K+ - ΗΊΊ .

Esimerkki 10 a-(2-metoksi-5-nitrofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon tetrametyylieste-30 rin valmistus

Seokseen, joka sisälsi a-(2-metoksi-5-nitrofenyy-li)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l-etikkahapon 1-me-tyyliesteriä (580 mg, 1,47 mmol) (valmistettu esimerkin N mukaisella menettelytavalla) ja jauhettua kaliumkarbonaat-35 tia (1,15 g, 8,32 mmol) asetonitriilissä (20 ml) ja jota « 60 103792 sekoitettiin, lisättiin metyylibromiasetaattia (565 μΐ, 5,97 mmol). Reaktioseosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 2 tuntia. Sen jälkeen seos suodatettiin ja seos väke-vöitiin öljyksi alipaineessa. Raakatuote puhdistettiin 5 kromatografisesti (silikageeli, 8 % metanolia sisältävä metyleenikloridi). Otsikon mukainen tuote saatiin keltaisena kiinteänä aineena (469 mg, 52 %; TLC Rf = 0,4, silikageeli, 10 % CHjOH: a CHCl3: ssa) ja karakterisoitiin tarkemmin seuraavien tietojen perusteella: 10 13C-NMR (CDClj) : 173,2, 172,6, 161,2, 139,1, 125,1, 124,6, 120,5, 110,7, 57,0, 55,6, 53,5, 52,6, 51,3, 50,8, 46,8, 46,0, 44,0.

Esimerkki 11 a-(2-metoksi-5-nitrofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-15 syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon valmistus

Liuosta, joka sisälsi a-(2-metoksi-5-nitrofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l,4,7,10-tetraetikkaha-pon metyyliesteriä (valmistettu esimerkin 10 mukaisella menettelytavalla) väkevässä HCl:ssa (5 ml, J. T. Baker 20 ULTREX), refluksoitiin typpikaasukehän alla 5 tuntia. Liuos haihdutettiin sitten kuiviin alipaineessa, jolloin jäi kiinteä jäännös. Tämä jäännös puhdistettiin kromatografi-sesti (silikageeli, liuotinseos 6), jolloin saatiin otsikon mukaista tuotetta likaisenvalkoisena kiinteänä aineena : 25 (209 mg) . Tämä aine muunnettiin tetrahydrokloridisuolaksi ja karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 13C-NMR (D20-DC1, 80 °C) : 171,0, 166,9, 161,2, 139,0, 125,5, 119,3, 110,7, 56,8, 54,5, 52,7, 51,0, 49,2, 49,0, 46,3, 42,9.

30 Esimerkki 12 . a-(2-metoksi-5-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa syklododekaani-l , 4,7,10-tetraetikkahapon tetra-ammonium-suolan valmistus

Liuokseen, joka sisälsi a-(2-metoksi-5-nitrofenyy-35 li)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l,4,7,10-tetraetik- 61 103792 kahappoa (157 mg; valmistettu esimerkin 11 mukaisella menettelytavalla) vedessä (20 ml), lisättiin platinaoksidia (20 mg) . Tätä seosta hydrattiin (vedyn paine 1 bar) huoneen lämpötilassa 1 tunti. Suodatuksen jälkeen aine puh-5 distettiin edelleen kromatografisesti (silikageeli, liuo-tinseos 5) , jolloin saatiin otsikon mukaista yhdistettä (141 mg) likaisenvalkoisena kiinteänä aineena, joka karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 13C-NMR (D20-DC1) : 175,5, 172,6, 172,3, 159,9, 128,8, 127,5, 10 124,6, 123,8, 115,5, 61,2, 58,1, 57,3, 55,7, 53,4, 51,6, 49,6, 47,4.

Esimerkki 13 1-(4-aminobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklodode-kaani-4,7,10-trietikkahapon 4,7,10-trimetyyliesterin val-15 mistus 4 mlraan argonilla huuhdottua asetonitriiliä lisättiin samalla sekoittaen 100 mg (0,236 mmol) 1-(4-aminobentsyyli) -1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaanin tetrahydro-. kloridisuolaa (valmistettu esimerkin J mukaisella menette- 20 lytavalla), 260 mg (1,88 mmol) kaliumkarbonaattia ja 108 mg (0,708 mmol) metyylibromiasetaattia. Seosta sekoitettiin 25 °C:ssa 48 tuntia. Suolaa sisältävä liuos siirrettiin flash-silikageelikromatografiapylvääseen, jonka koko oli 2,5 cm x 10 cm, ja eluoitiin asetonitriilillä.

* 25 Haluttua tuotetta sisältävät jakeet yhdistettiin ja liuo tin poistettiin pyöröhaihduttamalla, jolloin saatiin 65 mg (0,132 mmol, 56 %) otsikon mukaista tuotetta, joka karakterisoitiin tarkemmin seuraavien tietojen perusteella: Ή-NMR (CDClj) : 7,29 (d) , 6,75 (d) , 4,62 (s), 4,20 (leveä 30 s), 3,70 (s), 3,69 (s), 3,64 (s), 3,62 (t), 3,27 (s), 3,06 (t) , 2,82 (leveä t) , 2,79 (leveä t) ; 13C-NMR (CDClj, 75 MHz): 171,4, 171,0, 148,4, 132,8, 117,5, 115,0, 55,9, 55,3, 54,7, 53,1, 51,7, 51,4, 50,6, 50,5, 47,4.

62 103792

Esimerkki 14 1-(4-aminobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklodode-kaani-4,7,10-trietikkahapon hydrokloridisuolan valmistus

Liuos, joka sisälsi 42 mg (0,085 mmol) l-(4-amino-5 bentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-tri-etikkahapon 4,7,10-trimetyyliesteriä (valmistettu esimerkin 13 mukaisella menettelytavalla) 2 mlrssa 6 N suolahappoa, kuumennettiin 80 °C:seen 2 tunniksi. TLC paljasti useita tuotteita (halutun otsikon mukaisen tuotteen Rf = 10 0,60, liuotinseos 1). Poistettaessa liuotin saatiin 41 mg puhdistamatonta otsikon mukaista tuotetta.

Esimerkki 15 1-[2 -(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon 4,7,10-1rimetyylies-15 terin valmistus

Liuokseen, joka sisälsi 2,24 g (6,97 mmol) 1- [2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaania (valmistettu esimerkin G mukaisella menettelytavalla) 75 ml:ssa argonilla huuhdottua asetonitriiliä, lisättiin 20 samalla voimakaasti sekoittaen 3,17 g vedetöntä kaliumkar bonaattia. Tähän reaktioseokseen lisättiin pisaroittain 5 minuutin aikana 3,20 g (20,9 mmol) metyylibromiasetaattia. Reaktioseosta sekoitettiin 17 tuntia argonkaasukehän alla. TLC-analyysi osoitti lähtöaineen (Rf = 0,73, liuotinseos 1) 25 muuttuneen uudeksi tuotteeksi (Rf = 0,46, liuotinseos 1). Liuokseen lisättiin 70 ml kloroformia, ja suspendoitunutta suolaa sisältävä liuos siirrettiin flash-silikageelikroma-tografiapylvääseen, jonka koko oli 2,5 cm x 18 cm. Tuote eluoitiin 10 % metanolia sisältävällä kloroformilla, jol-30 loin saatiin 2,95 g otsikon mukaista tuotetta meripihkan-värisenä öljynä, josta muodostui haurasta lasimaista ainetta alipaineessa kuivattaessa (78 %). Otsikon mukainen tuote karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 63 103792 Ή-NMR (CDC13) : 8,17 (m,m), 7,4 - 7,66 (m), 2,38 - 3,95 (m) ; 13C-NMR (CDCIj, 75 MHz): 171,5, 171,2, 146,7, 144,5, 130,3, 123,9, 56,0, 55,2, 53,5, 53,4, 52,6, 51,9, 51,8, 50,6, 5 48,1, 29,5.

Esimerkki 16 1-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10 -tetra-atsa-syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon 4,7,10-metyyliesterin valmistus 10 50 ml:aan metanoiia liuotettiin 2,8 g (5,18 mmol) puhdistamatonta 1-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon 4,7,10-tri-metyyliesteriä (valmistettu esimerkin 15 mukaisella menettelytavalla) . Liuokseen, jota sekoitettiin ja josta pois-15 tettiin ilma typellä, lisättiin katalysaattoria (600 mg), joka sisälsi 10 % palladiumia hiilikantoaineella. Liuos pidettiin typpikaasukehän alla, ja liuoksen läpi johdettiin sitten sitä samalla sekoittaen vetyä (1 bar, 20 -25 °C) 2,5 tuntia. Liuoksen läpi johdettiin sitten typpeä 20 usean minuutin ajan, ja katalysaattori poistettiin suodattamalla liuos ohuen piimakerroksen läpi. TLC-analyysi (10 % metanolia kloroformissa) osoitti otsikon mukaisen tuotteen läsnäolon (Rf = 0,14). Otsikon mukainen tuote elu-oitiin silikageelistä kloroformilla, jolloin saatiin 2,2 g 25 (4,33 mmol, 83 %) keltaista lasimaista ainetta, joka ka rakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 1H-NMR (CDCIj) : 7,03 (d, m), 6,63 (d) , 3,4 - 3,6 (m), 2,7 -3,2 (m); 13C-NMR (CDC13, 75 MHz): 171,4, 171,2, 145,6, 129,7, 125,6, 30 115,5, 55,9, 54,4, 54,3, 53,0, 52,8, 51,8, 51,6, 50,3, 47,8, 28,6; FAB-massaspektri (m/e) : 508 ([M + H*]*).

64 103792

Esimerkki 17 1-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon (EA-D03A) hydroklori-disuolan valmistus 5 30 ml:aan väk. HCl:a liuotettiin 850 mg (1,69 mmol) 1-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklodode-kaani-4,7,10-trietikkahapon 4,7,10-trimetyyliesteriä (valmistettu esimerkin 16 mukaisella menettelytavalla). Liuosta sekoitettiin 70 - 80 °C:ssa 2,5 tuntia, sen annettiin 10 jäähtyä 25 °C:seen sitä samalla sekoittaen ja sekoitusta jatkettiin noin 18 tuntia. Liuotin poistettiin pyöröhaih-duttimella alipaineessa (10 mm, 75 °C) . Liuotin ja ylimääräinen vetykloridi poistettiin tulokseksi saadusta kirkkaasta öljystä alipainekuivauksella (0,1 mm, 45 °C). Otsi-15 kon mukaista tuotetta saatiin 820 mg valkeana kiinteänä aineena (Rf = 0,46, liuotinseos 2), joka karakterisoitiin tarkemmin seuraavien tietojen perusteella: ^-NMR (D20, pD = 1,9, T = 90 °C) : 7,50 (d) , 7,41 (d) , 4,26 (s), 3,43 - 3,68 (m), 3,0 - 3,3 (m); 20 13C-NMR D20, pD = 1,9, T = 90 °C) : 176,7, 170,9, 139,8, 133,0, 131,2, 125,9, 57,5, 57,1, 55,4, 54,4, 52,7, 51,0, 50,6, 31,3; FAB-massaspektri (m/e) : 466 ([M + H*]*), 488 ([M + Na+]+), 510 (M + 2Na* - H*]4) .

25 HPLC-analyysi osoitti pinta-alaan perustuvan puh tauden olevan yli 92 % (254 nm) 10 cm Partisil-5 OD53 RAC II -käänteisfaasikolonnia. Eluenttina oli 10 % asetonit-riiliä sisältävä 0,05 M kaliumfosfaattiliuos, pH 7,0.

Esimerkki 18 3 0 1 - [2 - (4 - isotiosyanaattifenyyli)etyyli]-1,4,7,10- : tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon (SCN-EA- D03A) valmistus 1 - [2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani -4 ,7,10-trietikkahapon hydrokloridisuola 35 (valmistettu esimerkin 17 mukaisella menettelytavalla; 65 103792 106 mg, 0,21 mmol) liuotettiin 2 ml:aan vettä typpikaasu-kehän alla ja samalla sekoittaen. Lisättiin hitaasti nat-riumvetykarbonaattia (105,6 mg, 1,26 mmol) hiilidioksidin kehittymisestä aiheutuvan vaahtoamisen estämiseksi (tulok-5 sena pH-arvo 8,0). Lisättiin tiofosgeenia (16,8 μΐ, 0,22 mmol), ja 1 tunnin voimakkaan sekoituksen jälkeen TLC-analyysi (20 % vettä asetonitriilissä) osoitti lähtöaineen (Rf = 0,12) muuttuneen otsikon mukaiseksi tuotteeksi (Rf = 0,26) . Liuotin poistettiin raakatuotteesta pyöröhaih-10 duttamalla, jolloin saatiin 130 mg otsikon mukaista tuotetta, joka sisälsi natriumkloridia. Tämän aineen infra-puna-analyysi (KBr-tabletti) vahvisti isotiosyanaattiryh-män läsnäolon (SCN = 2150 cm'1) .

Esimerkki 19 15 1-[2 -(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon trietyyliesterin valmistus 5 ml:aan asetonitriililiuosta, joka sisälsi 395 mg (1,12 mmol) 1- [2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-20 atsasyklododekaania (valmistettu esimerkin G mukaisella menettelytavalla) 1,5 g (11 mmol) K2C03:a ja jota sekoitettiin, lisättiin yhdessä erässä 496 μΐ (4,5 mmol) etyyli-bromiasetaattia. Sen jälkeen kun seosta oli kuumennettu 68 °C:ssa N2-kaasukehän alla 1 tunti, tulokseksi saatu sus-25 pensio suodatettiin. Suodatuskakku pestiin CH3CN:llä (2 x 10 ml). Sen jälkeen suodos haihdutettiin, jolloin saatiin raakatuote viskoosina öljynä, jota trituroitiin dietyyli-eetterin (30 ml) kanssa ja joka haihdutettiin, jolloin saatiin 650 mg (saanto 100 %) 1-[2-(4-nitrofenyyli)etyy- 30 li]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani4,7,10-trietikkahapon trietyyliesteriä, joka karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 1H-NMR (CDC13) : 8,2 (d) , 7,6 (d) , 4,3 (q) , 2,6 - 3,8 (m), 1,55 (t); 35 FAB-massaspektri: [M + H]* = 588.

66 103792

Esimerkki 20 1-[2 -(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon valmistus

Suspensioon, joka sisälsi 200 mg (0,35 mmol) 1-[2-5 (4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani- 4,7,10-trietikkahapon trietyyliesteriä (valmistettu esimerkin 19 mukaisella menettelytavalla) 15 ml:ssa vettä, lisättiin 59 μΐ NaOH:a (50-painoprosenttista, 3 ekv.). Seosta sekoitettiin 80 °C:ssa 6 tuntia. Syntynyt homogee-10 ninen oranssi liuos jäähdytettiin sitten huoneen lämpötilaan ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin oranssia kiinteätä ainetta, joka puhdistettiin HPLC:n (Q-Sepharose™, HPLC-systeemi III) avulla käyttämällä lineaarista 60 minuutin liuotingradienttia, jonka muodosti 0 - 10-%:inen 15 HOAc:n vesiliuos, jolloin saatiin (50 %) hydrolysoitu tuote 1-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklo-dodekaani-4,7,10-trietikkahappo, joka karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 1H-NMR (D20) : 8,22 (d) , 7,55 (d) , 3,60 - 3,90 (m), 3,10 - 20 3,40 (m).

Esimerkki 21 1-[2 -(4-aminofenyyli)etyyli] -1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon (EA-D03A) valmistus

Parrin hydrauslaitteeseen laitettiin 50 ml vesiliu-25 osta, joka sisälsi 214 mg (0,43 mmol) 1-[2-(4-nitrofenyyl-i)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trie-tikkahappoa (valmistettu esimerkin 20 mukaisella menettelytavalla) ja 40 mg 10 % Pd/C -katalysaattoria. Suspensiota ravistettiin, kunnes vedyn kulutus lakkasi. Suodatuksen 30 jälkeen vesiliuos kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 197 mg : (98 %) 1-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-4,7,10-trietikkahappoa kellertävänruskeana kiinteänä aineena, joka karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 67 103792 1H-NMR (D20) : 7,35 (d) , 7,20 (d) , 3,10 - 3,70 (m) ; 13C-NMR (D20) : 173,85, 172,50, 137,90, 131,90, 130,22, 121,55, 56,25, 55,14, 54,42, 50,12, 49,65, 49,31, 31,00. Esimerkki 22 5 1-(2-metoksi-5-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon 4,7,10-trimetyylies-terin valmistus

Asetonitriililiuokseen (20 ml), joka sisälsi 1,0 g (3 mmol) 1-(2-metoksi-5-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-10 atsasyklododekaania (valmistettu esimerkin E mukaisella menettelytavalla), lisättiin yhdessä erässä 1,6 g (11 mmol) metyylibromiasetaattia. Tunnin kuluttua lisättiin kaliumkarbonaattia (0,3 g), ja sekoitusta jatkettiin huoneen lämpötilassa 12 tuntia. Sen jälkeen reaktioseos 15 suodatettiin ja suodos väkevöitiin (alipaineessa). Jäännös käsiteltiin kromatografisesti pylväässä (silikageeli, CH3CN-CH3OH-seos tilavuussuhteessa 9:1), jolloin saatiin haihdutuksen jälkeen triesteriä valkeana kiinteänä aineena 68 %:n saannolla, ja se karakterisoitiin seuraavien tieto-20 jen perusteella: "H-NMR (CDC13) : 8,19 (d) , 8,14 (s), 7,18 (d) , 2,58 - 3,99 (m) ; nC-NMR (CDC13) : 173,53, 172,83, 164,59, 142,28, 128,51, 127,69, 126,49, 112,30, 57,25, 56,90, 55,03, 54,21, 53,06, 25 52,09, 52,00, 51,54, 50,68, 50,30, 49,85, 49,63, 49,31, 49,00, 48,68, 48,37, 48,05, 47,70, 47,39.

Esimerkki 23 1- (2-metoksi-5-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon valmistus 3 0 6 M suolahappoon tehtyä liuosta (3 ml) , joka sisäl- • si 0,25 g (0,45 mmol) 1-(2-metoksi-5-nitrobentsyyli)- 1.4.7.10- tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon 4.7.10- trimetyyliesteriä (valmistettu esimerkin 22 mukaisella menettelytavalla), sekoitettiin ja kuumennettiin 35 100 °C:ssa 24 tuntia. Huoneen lämpötilaan jäähdytyksen 68 103792 jälkeen lisättiin 5 ml vettä ja vesiliuos kylmäkuivattiin, jolloin saatiin kellertävänruskeaa kiinteätä ainetta. Pyl-väskromatografiakäsittelyn (silikageeli, liuotinseos 5) trihappo eristettiin likaisenvalkoisena kiinteänä aineena 5 (sp=228-230°C, hajoaa) 60 %:n saannolla ja karakteri soitiin tarkemmin seuraavien tietojen perusteella: XH-NMR (DaO) : 8,18 (s), 8,09 (s), 7,12 (d) , 3,87 (s), 2,10 - 3,60 (m); nC-NMR (D20): 180,45, 179,80, 163,66, 140,22, 128,60, 10 126,24, 122,66, 111,50, 59,91, 59,06, 56,44, 52,75, 50,92, 48,84.

Esimerkki 24 1- (2-metoksi-5-aminobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon valmistus 15 Typellä huuhdottuun vesiliuokseen (50 ml), joka si sälsi 50 mg Pt02:a, lisättiin 50 mg 1-(2-metoksi-5-nitro-bentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-tri-etikkahappoa (valmistettu esimerkin 23 mukaisella menettelytavalla) . Sen jälkeen kun liuosta oli hydrattu Parrin 20 pommissa 1 tunti, se suodatettiin ja vesisuodos kylmäkuivattiin, jolloin saatiin aniliinijohdannainen kellertävänruskeana kiinteänä aineena (saanto 95 %) , sp. >240 °C (hajoaa), ja se karakterisoitiin tarkemmin seuraavien tietojen perusteella: 25 XH-NMR (D20) : 7,54 (leveä s), 7,21 (d) , 7,09 (d) , 7,05 (s), 6,88 (s), 3,84 (s), 3,78 (s), 2,85 - 3,56 (m); 13C-NMR (D20): 180,59, 179,77, 153,38, 124,16, 124,03, 122,82, 120,18, 113,68, 112,43, 59,06, 57,02, 55,96, 53,67, 50,52, 50,08, 49,70, 49,04, 48,32.

30 Esimerkki 25 1-(2-hydroksi-5-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon valmistus

Vesiliuokseen (1 ml), joka sisälsi 1-(2-hydroksi-5-ni trobent syy1i) -1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaania 35 (200 mg, 0,62 mmol; valmistettu esimerkin F mukaisella 69 103792 menettelytavalla), lisättiin bromietikkahappoa (309 mg, 2,2 mmol) ja NaOH:a (2,5 ml, noin 1 M) sekoittaen liuosta samalla huoneen lämpötilassa. Reaktion etenemistä seurattiin LC:n avulla (anionivaihto, Q-Sepharose™) , ja pH pi-5 dettiin suunnilleen arvossa 8 lisäämällä tarpeen mukaan NaOH:a. 12 tunnin kuluttua liuos kylmäkuivattiin ja kiinteä jäännös käsiteltiin kromatografisesti (pylväs) silika-geelillä käyttäen eluointiin liuotinseosta 5. Keltainen pääjae väkevöitiin, liuotettiin veteen ja kylmäkuivattiin, 10 jolloin saatiin haluttua tuotetta kirkkaankeltaisena jauheena (150 mg, 49 %), sp = 230 - 235 °C (hajoaa) , ja se karakterisoitiin tarkemmin seuraavien tietojen perusteella : 13C-NMR (D20) : 166,41, 165,60, 160,00, 119,91, 116,02, 15 113,85, 111,71, 104,59, 45,20, 44,50, 43,96, 36,43.

Esimerkki 26 1-(2-hydroksi-5-aminobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon valmistus . Argonilla huuhdottuun vesiliuokseen (25 ml), joka 20 sisälsi N-(2-hydroksi-5-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra- atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahappoa (200 mg, 0,4 mmol; valmistettu esimerkin 25 mukaisella menettelytavalla), lisättiin Pt02:a (130 mg) ja johdettiin sen jälkeen H2:ä (Parrin hydrauslaite) . Sen jälkeen kun keltainen ' 25 väri oli hävinnyt kokonaan, liuos huuhdottiin argonilla ja suodatettiin. Sen jälkeen vesiliuos kylmäkuivattiin, jolloin saatiin haluttu tuote kellertävänruskeana kiinteänä aineena (146 mg, 78 %).

Esimerkki 27 30 a-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa- : syklododekaani-1-(R,S)-etikka-4,7,10-tris(R-metyylietik- ka) hapon 2-isopropyyli-4,7,10-trimetyyliesterin (PN-DOTMA-trimetyyli-isopropyyliesterin) valmistus

Liuokseen, joka sisälsi 1,00 g (2,37 mmol) a-[3-(4-35 nitrofenyyli)propyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani- 103792 1-etikkahapon 1-metyyliesteriä (valmistettu esimerkin P mukaisella menettelytavalla) 35 ml:ssa kuivaa asetonitrii-liä, lisättiin 1,15 g (8,32 mmol) vedetöntä kaliumkarbonaattia samalla voimakkaasti typen alla sekoittaen. Lisät-5 tiin optisesti aktiivista maitohapon metyyliesterin bent-seenisulfonaattia (1,79 g, 7,36 mmol, S:R = 98,2), ja seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 60 tuntia. TLC-analyysi osoitti uusien tuotteiden muodostuneen (otsikon mukaisten tetraestereiden Rf = 0,71, liuotinsysteemi 2, ja 10 triestereiden Rf = 0,89). Tulokseksi saatu liuos, joka sisälsi suspendoituneita karbonaattisuoloja, kaadettiin 40 ml:aan kloroformia ja saostuneet epäorgaaniset suolat suodatettiin pois. Tästä suodoksesta poistettiin liuotin, ja puhdistamaton oranssi öljy käsiteltiin kahdesti kroma-15 tografisesti flash-silikageelipylväässä, jonka koko oli 2,5 cm x 41 cm, käyttäen eluenttina liuotinseosta 2, jolloin saatiin otsikon mukaista tuotetta erottamattomien tetraesteridiastereomeerien seoksena (1,00 g, 1,47 mmol, saanto 62 %), joka ei sisältänyt alialkyloituneita tuot-20 teitä.

Tämän aineen 1H-NMR-analyysi osoitti sen sisältävän noin 0,5 ekvivalenttia reagoimatonta bentseenisulfonaatti-johdannaista. Tämän aineen NMR-spektrit eivät sulautuneet yhteen 60 °C:ssa kloroformissa: 25 1H-NMR (CDC13, 60 °C) : 7,9 - 8,1 (m, 2 H), 7,2 - 7,4 (m, 2 H), 5,06 (m, 1 H), 3,4 - 4,0 (m, 9 H), 1,7 - 3,4 (m, 20 H), 1,0-1,7 (m, 15 H); IR (CDCI3, cm'1) : 2980, 2840, 1725, 1710 (esterikarbonyyli) , 1590, 1510, 1440 , 1340; 30 FAB-massaspektri (m/e) : 702 ([M + Na*]+), 687.

103792

Esimerkki 28 α-[2 -(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1-(R,S)-etikka-4,7,10-tris(R-metyylietik-ka) hapon 2-isopropyyli-4,7,10-trimetyyliesterin (PA-DOTMA-5 trimetyyli-isopropyyliesterin) valmistus a-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1-(R,S)-etikka-4,7,10-tris(R-metyylietik-ka)hapon 2-isopropyyli-4,7,10-trimetyyliesteri (950 mg, 1,40 mmol, korjaamatta) (valmistettu esimerkin 27 mukai-10 sella menettelytavalla), joka sisälsi reagoimatonta a-[3- (4-nitrofenyyli)propyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-l-etikkahapon 1-metyyliesteriä, liuotettiin 10 ml:aan metanolin 30-%:ista vesiliuosta, joka sisälsi 1,00 g 10 % Pd/C -katalysaattoria typpikaasukehän alla. Liuoksen läpi 15 johdettiin ylimäärin vetyä 7 tunnin ajan. Tässä vaiheessa TLC-tutkimus osoitti voimakkaasti ninhydriinipositiivisen aineen muodostuneen (Rf 0,62, liuotinseos 2, lähtöaineen Rf = 0,71). Metanolia sisältävä katalysaattoriliete suodatettiin piimään läpi, ja haihdutettaessa liuotin saatiin 20 800 mg puhdistamatonta otsikon mukaista tuotetta kirkkaana öljynä, joka sisälsi bentseenisulfonaattiesterin samanaikaisen hydrogenolyysin seurauksena muodostunutta bentsee-nisulfonihappoa (Rf = 0,09, liuotinseos 2). Epäpuhdas öljy käsiteltiin kromatografisesti flash-silikageelipylväässä, . 25 jonka koko oli 2,5 cm x 20 cm, käyttäen eluenttina 10 % metanolia sisältävää kloroformia, joka eluoi huokostilaan vaaleankeltaisen vyöhykkeen. Sen jälkeen käytettiin liuo-tinseosta 2 otsikon mukaisen tuotteen (480 mg) eluointiin 52 %:n saannolla erottamattomien diastereomeerien ja geo-30 metristen isomeerien seoksena. 1H-NMR-spektrin aromaatti-. sella alueella havaittiin kolme eri AB-kvartettia: XH-NMR (CDClj, 30 °C) : 6,63 - 8,0 (kvartetit, 4 H), 5,07 (m, 1 H, isopropyylin metiini-H) , 3,53 - 3,9 (m, 13 H, neljä singlettiä kohdissa 3,85, 3,73, 3,69 ja 3,56), 3,46 72 103792 (m, 1 H), 3,25 (leveä t, 3 H) , 2 - 3,1 (tn, 14 H), 1,0 - 2,0 (m, 15 H); 13C-NMR (CDCIj, 30 °C) : 177,3, 177, 176,4, 176,2, 175,9, 174,3, 172,9, 170,6, 145,3, 144,9, 130,8, 129,7, 129,3, 5 129,1, 128,8, 128,4, 127,5, 126,3, 115,2, 115,1, 114,9, 69,0, 68,4, 67,3, 61,6, 57,8, 57,4, 56,7, 56,5, 56,4, 52.9, 52,7, 52,1, 50,8, 50,7, 50,6, 47,3, 47,1, 47,0, 46.9, 46,5, 46,3, 44,8, 44,5, 44,3, 34,1, 32,9, 32,5, 32,2, 31,8, 24,8, 22,2, 22,1, 22,0, 21,8, 21,6, 15,8, 10 14,9, 7,7, 7,5, 7,4, 7,1; IR (CDCIj, cm'1) : 2960, 2840, 1720, 1510, 1450, 1375; FAB-massaspektri (m/e) : 672 ([M + Na+]+), 686.

Esimerkki 29 a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-15 syklododekaani-1-(R,S)-etikka-4,7,10-tris(R-metyylietik-ka)hapon (PADOTMA) valmistus a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1-(R,S)-etikka-4,7,10-tris(R-metyylietik-ka) hapon 2-isopropyyli-4,7,10-trimetyyliesterin diastereo-20 meerien seos (400 mg, 0,59 mmol; valmistettu esimerkin 28 mukaisella menettelytavalla) liuotettiin 50 ml:aan väkevää (6 N) suolahappoa, ja liuosta refluksoitiin 30 tuntia. TLC-analyysi (liuotinseos 1) osoitti esterin (Rf = 0,98, liuotinseos 1) muuttuneen kahdeksi uudeksi täpläksi (no-25 peammin liikkuvan diastereomeerin Rf = 0,6 ja hitaammin liikkuvan R£ = 0,54, liuotinseos 1, molemmat täplät UV-, ninhydriini- ja jodipositiivisia). Ylimääräinen liuotin poistettiin pyöröhaihduttimella, ja kuivauksen jälkeen saatiin otsikon mukaisen tuotteen puhdistamattomien dia-30 stereomeerien seos (403 mg) hydrokloridisuolana. Otsikon • mukaisen tuotteen kahden diastereomeerin preparatiivinen erotus tehtiin siirtämällä 290 mg (0,51 mmol) raakasuolaa flash-silikageelikromatografiapylvääseen, jonka koko oli 1 cm x 13 cm ja joka eluoitiin liuotinseoksella 8. Suurem-3 5 man Rf-arvon omaava diastereomeeri (119 mg, 0,21 mmol) 103792 saatiin puhtaammassa muodossa kuin diastereomeeri (90 mg, 0,16 mmol), jonka Rf-arvo oli pienempi, koska suuremman Rf-arvon omaava diastereomeeri eluoitui pylväästä ensin. Sen diastereomeerin ^-NMR-spektri, jolla oli suurempi Rf: 5 1H-NMR (D20, 90 °C, pD = 7,5): 7,12 (d, 2 H), 6,80 (d, 2 H), 3,66 (m, 1 H), 3,57 (leveä t, 3 H), 2 - 3,4 (m, 19 H), 1,89 (m, 1 H), 1,37 (m, 1 H), 1,15 (d, 3 H), 1,10 (d, 3 H), 1,06 (d, 3 H); 13C-NMR (D20, 90C, pD = 7,5): 184,4, 184,2, 184,0, 183,3, 10 135,9, 132,6, 131,7, 119,1, 78,2, 69,0, 61,7, 61,5, 61,1, 57,4, 54,1, 49,7, 49,6, 48,2, 47,7, 47,2, 34,8, 33,8, 9,6, 9,1, 9,0; FAB-massaspektri (m/e) : 566 ([M + H*]*), 588 ([M + Na+]+), 604 ([M + K+]+), 626 ( [M + K* + Na+ - H+]+), 642 ([M + 2K+ - 15 ΗΊΊ .

Lopputuotteiden, kompleksien, valmistus

Metalli-ligandikompleksit valmistettiin erilaisin, alla esitetyin menetelmin. Menetelmät käsittivät metallin ja ligandin sekoittamisen vesiliuoksessa ja pH:n säätämi-20 sen haluttuun arvoon. Kompleksien muodostus toteutettiin liuoksissa, jotka sisälsivät suoloja ja/tai puskureita sekä vettä. Joskus kuumennettujen liuosten havaittiin antavan parempia saantoa kuin muodostettaessa kompleksi ympäristön lämpötilassa. Myös BFC:n valmistuksessa käytetyn 25 tuotteeneristys- ja -puhdistusmenettelyn on osoitettu vai kuttavan kompleksin muodostukseen.

Esimerkki 30 a- (4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7,10-tetraetikkahapon ammoniumsuolan samarium(III) - 30 kompleksin [Sm(BA-DOTA)] valmistus

Pieni erä (53 mg, 0,094 mmol) a-(4-aminofenyyli)- 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l,4,7,10-tetraetikkahap-poa (valmistettu esimerkin 3 mukaisella menettelytavalla) liuotettiin 100 μl:aan vettä ja käsiteltiin 3 ml :11a 35 0,043 M Sm(OAc) 3-liuosta (48,8 mg, 0,128 mmol) pH:ssa 103792 6-7. Tätä liuosta kuumennettiin 100 °C:ssa ja määritettiin kompleksinmuodostumisaste anioninvaihto-HPLC:llä. Kun kompleksin muodostuminen oli täydellistä anionivaihtokro-matografian mukaan (HPLC-systeemi III), liuos jäähdytet-5 tiin huoneen lämpötilaan (noin 25 °C) ja kylmäkuivattiin. Samariumkompleksi puhdistettiin silikageelikromatografiän avulla (eluenttina liuotinseos 1). Tämä menettelytapa antoi tulokseksi otsikon mukaista tuotetta 82 %:n saannolla. Tämä kompleksi karakterisoitiin TLC:n, FAB-massaspektro-10 metrian ja anioninvaihto-HPLC:n avulla sekä lisäksi seu-raavien tietojen perusteella: 'H-NMR (D20) : 8,94, 7,81, 7,21, 6,97, 6,80, 5,63, 5,01, 4,58, 4,01, 3,56, 1,78, 1,53, 1,24, 1,10, 0,77, -2,80, -2,95, -3,21, -3,91; 15 13C-NMR (D20) : 190,3, 184,9, 181,4, 146,8, 134,3, 122,7, 116,4, 80,8, 72,6, 64,2, 57,2, 55,8, 54,7, 53,4, 51,5, 49,7, 45,5, 43,5, 23,6.

FAB-massaspektri: [M + H+] * = 645 (Sm-isotooppimalli).

Esimerkki 31 2 0 a - (4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa- ni-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium(III)kompleksin valmistus

Valmistettiin liuos, joka sisälsi 150 μΐ Sm-153:a (3 x 10'4 mol/1 0,1 N HCl:ssa) ja 600 μΐ SmCl3:a (3 x ·. 25 10‘4 mol/1 0,1 N HCl:ssa), lisäämällä Sm-153-liuos

SmCl3-liuokseen. Sitten lisättiin 5,0 μΐ 2,0 M NaOAc:a ja sen jälkeen 45 μΐ 50 mM ligandin (valmistettu esimerkin 3 mukaisella menettelytavalla) HEPES-puskuriliuosta. Liuokseen pH säädettiin 275 μ1:1ΐ3 0,5 M HEPES:ää arvoon 7. 30 Tämä liuos jaettiin kahteen 500 μ1:η suuruiseen osaan, ja / toista osaa kuumennettiin 1 tunti 100 °C:ssa.

Liuokset laskettiin SP-Sephadex™-kationinvaihto-hartsin läpi. Kompleksoituneen metallin prosenttiosuus määritettiin aikaisemmin kuvattua menettelytapaa käyttäen. 35 Tulokset osoittavat, että 99,6 % metallista oli kompleksi- • · 75 103792 na kuumennetun näytteen tapauksessa ja 96,6 % kuumentamattoman näytteen tapauksessa.

Kelaattien pH-stabiilisuus

Metalli-ligandikompleksien stabiilisuus mitattiin 5 asettamalla ne alttiiksi erilaisille pH-arvoille ja analysoimalla kompleksi liuoksesta. Matalassa pH:ssa ligandin protonoituminen voi aiheuttaa metallin vapautumisen. Korkeassa pH:ssa metallihydroksidit klpailevat kelaatin muodostumisen kanssa. Niinpä inerttejä kelaatteja etsittäessä 10 toivottu inertti kelaatti säilyy siis kelaattina sekä korkeassa että matalassa pH:ssa.

Eräiden tämän keksinnön mukaisten kelaattien inert-tiysprofiilit muodostettiin seuraavissa esimerkeissä kuvattuja menetelmiä käyttäen. Joissakin tapauksissa kela-15 toitumaton metalli poistettiin laskemalla liuos kationin- vaihtohartsin läpi. Kompleksiliuosten pH-.n säätämiseen noin arvosta 1 suunnilleen arvoon 14 käytettiin laimeita natriumhydroksidi- ja suolahappoliuoksia. Kompleksina säilyneen metallin prosenttiosuus määritettiin sitten aikai-20 semmin kuvatuin menetelmin.

Samalla tavalla valmistettiin useita bifunktionaa-lisia kelaattikonjugaatteja, ja ne asetettiin alttiiksi pH:lle 2,8, 4,0 ja 6,0. Liuoksessa säilyneen konjugaatin määrä määritettiin HPLC:llä säteilynmittausdetektoria 25 käyttäen. Tulokset on esitetty biologisessa osassa esimer kissä XX.

Esimerkki 32 a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7,10 -tetraetikkahapon samarium (III)kompleksin 30 pH-stabiilisuus

Esimerkistä 30 peräisin olevat kuumennettu ja kuumentamaton näyte jaettiin kumpikin kahteen yhtä suureen osaan, joiden koko oli 250 μΐ. Toisen 250 μ1:η erän pH säädettiin HCl:lla seuraavassa taulukossa esitettyihin 35 arvoihin. Toisen 250 μ1:η erän pH säädettiin mikrolitra- •

7 O

103792 luokkaa olevilla määrillä NaOH:ta haluttuihin arvoihin. Kun haluttu pH saavutettiin, otettiin 25 μ1:η näyte ja siitä määritettiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuus aikaisemmin kuvatulla tavalla. Tulokset olivat seu-5 raavat:

Kompleksina % pH Kuumen- Kuumen nettu tamaton 10 .......— .........1 I 98,9 92,7 3__99 7 6 93r 3 5__99 T 6 92 > 9 7__99? 6 95.7 15 9 99 r9 95 T 8 II 99.6 95.7 il 99 r 6 9^. 5 20 Nämä tulokset osoittavat tämän näytteen stabiili- suuden, kuumennettiin sitä sitten tai ei, testaus-pH:sta riippumatta.

Esimerkki 33 a-( 4-aminofenyyli )-l ,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-25 ni-1,4,7,10-tetraetikkahapon yttrium(III)kompleksin val mistus 10 pl:aan liuosta, joka sisälsi 1,4 mg a-(4-aminofenyyli )-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l, 4,7,10-tetra-etikkahappoa/100 μΐ (valmistettu esimerkin 3 mukaisella 30 menettelytavalla), lisättiin 100 μΐ Y(0Ac)3:a (0,003 M), johon oli lisätty Y-90:ää. Tähän liuokseen lisättin 500 μΐ vettä ja sen jälkeen 125 μΐ NaOAcra (0,5 M). Liuokseen lisättiin vettä (265 μΐ) sen kokonaistilavuuden saamiseksi 1 mlrksi. Tämä liuos jaettiin kahteen yhtä suureen osaan. 35 Toinen osa kuumennettiin 100 °C:seen 1 tunniksi. Sekä kuu- 103792 mennettu että kuumentamaton näyte tutkittiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuuden määrittämiseksi aikaisemmin kuvattua kationinvaihtomenettelyä käyttäen. Tulokset osoittivat, että 84 % metallista oli kompleksina kuumen-5 netun näytteen tapauksessa ja 4 % kuumentamattoman näytteen tapauksessa.

Esimerkki 34 o- (4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7,10-tetraetikkahapon lutetium(III)kompleksin valio mistus a- (4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7,10-tetraetikkahappoliuos (valmistettu esimerkin 3 mukaisella menettelytavalla) liuotettiin tislattuun veteen niin, että liuoksen väkevyydeksi tuli 1,63 mg/ml.

15 Lutetiumkloridiliuos valmistettiin liuottamalla lutetiumkloridi 0,1 N HCl:oon niin, että tuloksena oli liuos, jonka väkevyys oli 3,9 mg/ml (0,01 M). Merkkiaineena käytettiin lutetium-177:ää (0,3 mM) .

30 μΐ 0,01 M lutetiumliuosta lisättiin 2 μΐ-.aan Lu-20 177-liuosta. Lisättiin asianmukainen määrä edellä saatua ligandia ja kokonaistilavuuden kasvattamiseksi 1,0 mlrksi HEPES-puskuria (0,1 M, pH 7,6). Syntyneet liuokset olivat 0,3 mM ligandin ja lutetiumin suhteen. Liuos kuumennettiin sitten 100 °C:seen 1 tunniksi, ja kompleksina olevan Lu:n 25 prosenttiosuudeksi määritettiin aikaisemmin kuvatulla ka- tioninvaihtomenetelmällä 86 %.

Esimerkki 35 a-(4-isotiosyanaattifenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium(III)-30 kompleksin valmistus Näyte-erä, 7 mg (10,8 μπιοί) , a-(4-aminofenyyli)- 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l,4,7,10-tetraetikkahapon samarium(III)kompleksia (valmistettu esimerkin 30 mukaisella menettelytavalla) liuotettiin 400 μl:aan vettä. 35 Lisättiin ylimäärin (50 μΐ) tiofosgeenia ja sen jälkeen 103792 400 μΐ CHCl3:a, ja kaksifaasista reaktioseosta sekoitettiin voimakkaasti 30 minuuttia. Tämän jälkeen vesikerros uutettiin 500 μΐ-.lla CHCl3:a (neljästi) ja kylmäkuivattiin sitten, jolloin saatiin haluttua otsikon mukaista tuotetta 5 kvantitatiivisella saannolla.

UV-spektrissä tällä yhdisteellä esiintyi absorptio-huippu aallonpituuksilla 272 nm ja 282 nm. TLC (silikagee-li, kehitys CH3CN-H20-seoksella tilavuussuhteessa 75:25) antoi Rf-arvoksi 0,38. Lähtöaineen Rf-arvo on 0,19.

10 IR-spektrissä esiintyi SCN-venytyshuippu aaltoluvulla 2100 cm'1; FAB-massaspektri: [M + H]+ = 687.

Esimerkki 36 o- (4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7,10-tetraetikkahapon ammoniumsuolan yttrium(III)-15 kompleksin valmistus Näyte-erä, 90 mg (160 mmol), a-(4-aminofenyyli)- 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l,4,7,10-tetraetikkahap-poa (valmistettu esimerkin 3 mukaisella menettelytavalla) liuotettiin 1 ml:aan vettä. Tähän liuokseen lisättiin 3 ml 20 vettä, joka sisälsi 51 mg (192 mmol) Y(OAc)3:a. Reaktio-seosta (pH =6-7) kuumennettiin sitten 100 °C:ssa 2 tuntia. Tulokseksi saatu liuos laskettiin sitten lasivillan läpi ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 126 mg keltaista kiinteätä ainetta. Tämä kiintoaine käsiteltiin kromatogra-·. 25 fisesti silikageelillä (liuotinseos 1) , jolloin saatiin 71 mg (76 %) haluttua kompleksituotetta. Anioninvaih-toanalyysi osoitti viipymäajan samaksi kuin vastaavalla Sm-kompleksilla. Otsikon mukainen tuote karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 30 13C-NMR (D20) : 180,8, 180,5, 179,9, 146,1, 133,4, 122,0, 116,1, 74,9, 66,3, 56,3, 55,8, 55,4, 55,1, 54,8, 52,2, 46,0, 44,0, 23,6; XH-NMR (D20) : 6,90 (d) , 6,70 (d) , 4,40 (s), 3,45 - 3,06 (m), 2,71 - 2,10 (m), 1,75 (s); 35 FAB-massaspektri: [M + H+] = 582.

103792

Esimerkki 37 α-(4-isotiosyanaattifenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon natriumsuolan yttrium(III)kompleksin valmistus 5 Näyte-erä a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon yttrium(111)komp-leksia (valmistettu esimerkin 36 mukaisella menettelytavalla; 10 mg, 17 μΐ) liuotettiin 400 ^l:aan vettä. Tähän liuokseen lisättiin 64 μΐ (ylimäärin) tiofosgeenia ja 10 400 μΐ CHCl3:a, ja tulokseksi saatua reaktioseosta sekoi tettiin voimakkaasti 40 minuuttia. Tänä aikana tehtiin useita pieniä kiinteän NaHC03:n lisäyksiä pH:n pitämiseksi suunnilleen arvossa 8. Reaktion päätyttyä vesikerros erotettiin ja uutettiin 1 ml:lla CHCl3:a (neljästi) ja kylmä-15 kuivattiin. Otsikon mukainen tuote karakterisoitiin TLCrn ja UV-spektroskopian avulla.

Esimerkki 38 a-[2 -(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-, syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon yttrium(III)komp- 20 leksin ammoniumsuolan, NH4 [Y(PA-DOTA)] :n, valmistus

Ligandi, o-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahappo (vai-mistettu esimerkin 8 mukaisella menettelytavalla), muunnettiin protonoidun muodon ja ammoniumsuolan sekoituk-25 seksi kromatografisesti voimakasta kationinvaihtohartsia (SP-Sephadex™ C-25, Pharmacia) käyttäen. Pylväs oli proto-noidussa muodossa ja huuhdottiin tislatulla vedellä. Li-gandin väkevä vesiliuos laitettiin pylvääseen, jonka jälkeen pylväs huuhdottiin tislatulla vedellä. Ligandi eluoi-30 tiin pylväästä 0,5 M NH4OH:lla. Eluentti poistettiin haih-/ duttamalla liuos kuiviin.

Liuos, joka sisälsi Y(OAc) 3-4H20: ta (0,0728 g, 0,215 mmol) 5 mlrssa tislattua vettä, lisättiin lämpimään liuokseen, joka sisälsi protonoidussa ja ammoniumsuolan 35 muodossa olevaa sekaligandia (0,120 g, 0,215 mmol) 80 103792 5 mlrssa vettä. Liuos kuumennettiin palautusjäähdyttimen alla kiehuvaksi, ja sen pH säädettiin 0,1 M NH4OH:lla suunnilleen arvoon 7,0. Tunnin refluksoinnin jälkeen liuos jäähdytettiin ja haihdutettiin kuiviin. Ylimääräinen NH4OAc 5 poistettiin kuumentemalla valkeata kiinteätä ainetta öljy-hauteessa noin 105 °C:ssa alipaineessa. Otsikon mukaisen tuotteen (joka sisälsi noin 1 ekvivalentin ammoniumase-taattia) saanto oli 0,142 g (94 %), ja se karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 10 13C-NMR (D20, 88 °C, 75 MHz): 23,8, 27,6, 35,4, 49,6, 55,0, 56,2, 56,9, 57,1, 65,7, 68,0, 121,7, 132,6, 138,8, 180,7, 181.4, 182,0, 183,1 FAB-massaspektri (m/e): 610 (positiivinen ioni, [M- + 2H+]+), 608 (negatiivinen ioni, M).

15 Esimerkki 39 a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium(III) -kompleksin ammoniumsuolan, NH4 [Sm(PA-DOTA)] :n, valmistus Toistettaessa esimerkin 38 mukainen menettely käyt-20 tämällä Y (OAc) 3 -4H20:n tilalla Sm (OAc) 3 *3H20: ta (0,082 g, 0,215 mmol) saatiin valmistetuksi otsikon mukainen tuote (joka sisälsi noin 1 ekvivalentin ammoniumasetaattia) 0,155 g-.n (94 %) saannolla, ja se karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 25 13C-NMR (D20, 88 °C, 75 MHz): 23,5, 27,2, 35,6, 50,5, 54,5, 56,0, 57,2, 57,9, 69,5, 71,5, 122,3, 133,0, 139,7, 181,2, 188.4, 189,3, 190,9; FAB-massaspektri (m/e) : 673 (positiivinen ioni, [M' + 2H*] Sm-isotooppimalli), 671 (negatiivinen ioni, M', 30 Sm-isotooppimalli).

103792

Esimerkki 40 o-[2 -(4-isotiosyanaattifenyyli)-etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium (III) kompleksin ammoniumsuolan, NH4 [Sm(SCN-PA-DOTA)] :n, 5 valmistus

Liuokset, jotka sisälsivät Sm(OAc) 3 -3H20: ta (27,9 mg, 381,56 g/mol, 73,1 μπιοί) 10 ml:ssa tislattua vettä ja 42 mg (632,97 g/mol, 66,4 μπιοί) PA-DOTA:n ammonium- kaiiumsekasuolaa (valmistettu esimerkin 8 mukaisella 10 menettelytavalla) 10 ml:ssa tislattua vettä, sekoitettiin ja niitä kuumennetiin höyryhauteella. 30 minuutin kuluttua reaktio Sm(PA-DOTA):n muodostamiseksi oli mennyt loppuun HPLC:llä esimerkissä 41 kuvattua menetelmää käyttäen määritettynä. Liuoksen annettiin reagoida toisen liuoksen 15 kanssa, joka sisälsi 45,4 mg CSCl2:a (114,98 g/mol, 395 μπιοί) 20 ml: ssa kloroformia, ravistemalla niitä ero-tussuppilossa. Reaktio meni loppuun noin 1 minuutissa HPLC:llä määritettynä ja sillä perusteella, että positii-. vista reaktiota ei ilmennyt ninhydriinitestissä (0,2 % 20 etanolissa), kun vesiliuoksesta suoritettiin täpläanalyysi silikageeli-TLC-levyllä [lähtökelaatti, Sm(PA-DOTA), oli testissä positiivinen]. Kloroformikerros poistettiin ja vesikerros pestiin kahdella 20 ml:n erällä kloroformia. Vesikerros haihdutettiin kuiviin lisäämällä siihen 100 ml 25 asetonitriiliä ja tekemällä haihdutus ympäristön lämpöti lassa typpivirran alla, jolloin saatiin 56 mg otsikon mukaista tuotetta.

FAB-massaspektri (m/e) : 715 (positiivinen ioni, [M' + 2H+]% Sm-isotooppimalli), 713 (negatiivinen ioni, M", 30 Sm-isotooppimalli).

Esimerkki 41 Y3+:n ja PA-DOTA:n välisen kelaatin muodostumisno-peuden HPLC-analyysi PA-D0TA:n ja Y3+:n välisen kelaatin muodostumisen 35 nopeutta tutkittiin PA-DOTA:n valmistuksessa käytetyn 103792 tuotteeneristys- ja -puhdistusmenettelyn funktiona. Kelaa-tinmuodostumisastetta seurattiin HPLC:llä 100 mm:n Alltech Econosphere™ Cl8 -kolonnia käyttäen. Käytetty gradientti oli: A) 0,05 M NaOAc-puskuri, pH 6,0, ja CH3CN suhteessa 5 95:5, B) 0,05 M NaOAc-puskuri, pH 6,0, ja CH3CN suhteessa 30:70, A vaihtui B:ksi 15 minuutissa. Sekä PA-DOTA:n hyd-rokloridisuolan (viipymäaika = 1,31 min) että PA-DOTA:n ammonium-kaliumsekasuolan (viipymäaika = 4,55 min), jotka molemmat oli valmistettu esimerkin 8 mukaisella menettely-10 tavalla, liuos valmistettiin väkevyydeltään 1,6 mM:ksi 0,5 M NaOAc-puskuriin, pH 6,0. Yhden millilitran (1,6 pmol) kumpaakin liuosta annettiin reagoida 0,2 ml:n (8 pmol) kanssa Y( OAc )3 · 4H20-liuosta (40 mol/1 0,5 M NaOAc-puskurissa, pH 6,0). Kelaatin muodostuminen määritettiin 15 retentioajalla 3,96 min esiintyvän piikin perusteella (varmistettu esimerkistä 38 peräisin olevaan näytteeseen vertaamalla). Tulokset kelaatin muodostumisesta olivat seuraavat: 20 PA-DOTA-suola Komplek- Aika (min)/- __sinä (%) lämpötila_, >90 juoneen lämpöt.

PA-DOTA:n ammonium- <10 15/huoneen lämpöt

kaliumsekasuola >85 10/ 90°C

25 BFC:n puhdistuksessa käytetty menetelmä vaikuttaa selvästi kelaatin muodostumisen nopeuteen.

Esimerkki 42 a- [2-( 4-aminofenyyli )etyyli] -1,4,7,10-tetra-atsa-30 syklododekaani-l-(R,S)-etikka-4,7,10-tris(metyylietikka)- .· hapon samarium( III )kompleksin ammoniumsuolan, NH4[Sm(PA- DOTMA)]:n, valmistus

Sm(0Ac)3*3H20-liuos (13,2 mg 2 ml:ssa tislattua vettä) lisättiin a- [2-(4-aminofenyyli )etyyli] -1,4,7,10-tetra-35 atsasyklododekaani-1- (R, S) -etikka-4,7,10-tris (metyylietik- • · 103792 ka)hapon (valmistettu esimerkin 29 mukaisella menettelytavalla; diastereomeeri, jonka Rf-arvo on suurempi) liuokseen (30 mg 2 mltssa tislattua vettä). Liuosta, jonka pH oli 6,5, kuumennettiin höyryhauteella ja reaktiota seurattiin 5 HPLC:n avulla. 30 minuutin kuumennuksen jälkeen liuos haihdutettiin kuiviin pyöröhaihduttimella ja kuivattiin vakuumiuunissa.

FAB-massaspektri (m/e): 715 (positiivinen ioni, [M' + 2H*]*, Sm-isotooppimalli), 737 (positiivinen ioni, [M + 10 H* + Na+]*, Sm-isotooppimalli), 713 (negatiivinen ioni, M", Sm-isotooppimalli).

Seuraavissa esimerkeissä kompleksien liuokset laskettiin ioninvaihtopylvään läpi mahdollisen ylimääräisen vapaan metallin poistamiseksi liuoksesta. Labiilit systee-15 mit palaisivat tasapainotilaan ja liuoksessa olisi samanlainen määrä vapaata metallia. Inertit systeemit eivät palaisi tasapainotilaan eikä kelatoitumattoman metallin määrän pitäisi pienentyä. Niinpä, vaikka kompleksia voikin muodostua pienellä saannolla, puhdistus laskemalla se 20 ioninvaihtohartsin voisi tuottaa tulokseksi sopivan stabiilin kompleksin, joka ei sisällä kompleksoitumatonta metallia.

Esimerkki 43 a-(2-metoksi-5-aminofenyyli )-1,4,7,10-tetra-atsa-25 syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium(III)-kompleksin valmistus

Valmistettiin o-(2-metoksi-5-aminofenyyli)- 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l,4,7,10-tetraetikkaha-pon (valmistettu esimerkin 12 mukaisella menettelytavalla) 30 3 x 10~2 M liuos liuottamalla 5,8 mg sitä 325 plraan NANO- pure™-vettä. 10 μ1:η erä tätä liuosta lisättiin 990 pl:aan 3 x 10‘4 M SmCl3:a (0,1 N HCl:ssa), johon oli lisätty Sm-153:a. Liuoksen pH säädettiin sitten NaOH:lla arvoon 7,0. Tämä liuos jaettiin kahteen 500 ml:n osaan, joista toista 35 kuumennettiin 1 tunti 100 °C:ssa. Sekä kuumennettu että 84 103792 kuumentamaton näyte tutkittiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuuden määrittämiseksi aikaisemmin kuvattua ka-tioninvaihtomenettelyä käyttäen. Liuos laskettiin sitten SP-Sephadex™-hartsin läpi. Taas määritettiin kompleksoitu-5 minen puhtaista näytteistä. Tulokset on esitetty seuraa-vassa taulukossa:

Kuumennettu Kuumentamaton 10 Puhdistettu Puhdistama- Puhdistettu Puhdistama- ton ton

Komplek- 96 95 97 89 sinä (%)

Esimerkki 44 15 ct-( 2-metoksi-5-aminofenyyli )-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium(III)-kompleksin pH-stabiilisuus

Esimerkistä 43 peräisin olevat kuumennettu ja kuumentamaton näyte jaettiin kumpikin kahteen yhtä suureen 20 osaan, joiden koko oli 250 μΐ. Toisen erän pH säädettiin HClzlla ja toisen NaOHtlla seuraavassa taulukossa esitettyihin arvoihin. Kun haluttu pH oli saavutettu, näytteen annettiin seistä 10 minuuttia ja siitä määritettiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuus aikaisemmin kuva-·. 25 tulla kationinvaihtomenetelmällä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa: φ · 85 103792

Kompleksina (%) pH Ruumen- tKuumen- nettu tamaton

5 2 " 95 9M

3 97 95 5__98 97 7__96 97 10 9__98 ~ 96 Π__97 98 13 100 99

Esimerkki 45 15 a-(2-metoksi-5-nitrofenyyli )-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium(III)- kompleksin valmistus

Valmistettiin o- (2-metoksi-5-nitrofenyyli)- 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l,4,7,10-tetraetikkaha-20 pon (valmistettu esimerkin 11 mukaisella menettelytavalla) 3 x 10‘2 M liuos liuottamalla 7,9 mg sitä 464 pl:aan NANO-pure™-vettä. 10 pl:n erä tätä liuosta lisättiin 950 pl:aan 3 x 10'4 M SmCl3:a (0,1 N HCl:ssa), johon oli lisätty Sm-153:a. Liuoksen pH säädettiin sitten NaOH:lla arvoon .! 25 7,0. Tämä liuos jaettiin kahteen 500 ml:n osaan, joista toista kuumennettiin 1 tunti 100 °C:ssa. Sekä kuumennettu että kuumentamaton näyte tutkittiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuuden määrittämiseksi aikaisemmin kuvattua kationinvaihtomenettelyä käyttäen. Liuokset lasket-30 tiin SP-Sephadex™-hartsin läpi. Sen jälkeen määritettiin • kompleksoituminen puhtaista näytteistä edellä kuvattua yleismenettelyä käyttäen. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa: 86 103792

Kuumennettu Kuumentamaton 5 Puhdistettu Puhdistama- Puhdistettu Puhdistama- ton ton

Kompiek- 100 72 100 46

Isms,, (JU_______J

Esimerkki 46 10 a- ( 2-metoksi-5-nitrofenyyli )-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium(III)-kompleksin pH-stabiilisuus

Esimerkistä 45 peräisin olevat kuumennettu ja kuumentamaton, puhdistettu näyte jaettiin kumpikin kahteen 15 yhtä suureen osaan. Toisen erän pH säädettiin laimealla Helillä ja toisen NaOHilla seuraavassa taulukossa esitettyihin arvoihin. Kun haluttu pH oli saavutettu, näytteen annettiin seistä 10 minuuttia ja siitä määritettiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuus aikaisemmin kuva-20 tulla kationinvaihtomenetelmällä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa:

Puhdistettu 25 - r pH Ruumen- Kuumen nettu tamaton 2 99 99 5 100 100 30 5 100 100 7 100 100 9 100 100 11 100 100 35 il loo loo 103792

Esimerkki 47 a-(4-nitrofenyyli )-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7-trietikkahapon samarium(III)kompleksin valmistus a- (4-nitrofenyyli )-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-5 ni-1,4,7-trietikkahapon (valmistettu esimerkin 4 mukaisel la menettelytavalla) 0,0219 M liuos (100 μΐ, 2,195 mmol) saatettiin kosketuksiin 0,043 M Sm(OAc)3-liuoksen (25 μΐ, 1,075 mmol) kanssa. Reaktioseokselle tehtiin anioninvaih-to-HPLC-käsittely (Q-Sepharose™-kolonni, 1 cm x 25 cm, 10 virtausnopeus 2 ml/min, eluointi 0 - 1 M NH4OAc-gradientil-la 30 minuutin aikana). Tunnin kuluttua kompleksia (viipymäaika = 11,1 min) oli muodostunut 77 %:n (pinta-ala-%) saannolla ja se oli täysin erillään ligandihuipusta (vii-pymäaika = 15,5 min). Lisäosoitus otsikon mukaisen komp-15 leksin muodostumisesta saatiin silikageeli-TLC:llä (liuo-tinseos 4), jossa ligandin Rf-arvo oli 0,59 ja kompleksin Rf-arvo 0,00.

Esimerkki 48 a- (4-aminof enyyli )-l ,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-20 ni-1,4,7-trietikkahapon samarium(III)kompleksin ja a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l,4,10-trietikkahapon samarium(III)kompleksin valmistus

Isomeerien (valmistettu esimerkin 5 mukaisella menettelytavalla) 0,022 M liuos (100 μΐ, 2,2 pmol) saatet-” 25 tiin kosketuksiin 0,043 M Sm(OAc)3-liuoksen (6,4 μΐ, 0,275 mmol) kanssa. Reaktioseokselle tehtiin anioninvaih-to-HPLC-käsittely (Q-Sepharose™-kolonni, 1 cm x 25 cm, virtausnopeus 2 ml/min, eluointi 0 - 0,25 M NH4OAc-gradien-tilla 30 minuutin aikana). 40 minuutin kuluttua kompleksia 30 (viipymäaika = 9,0 min) oli muodostunut 66 %:n (pinta-ala-.* %) saannolla ja se oli täysin erillään ligandihuipusta (viipymäaika = 18,5 min).

ββ 103792

Esimerkki 49 α-( 4-aminofenyyli )-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l, 4, 7-trietikkahapon samarium-153-kompleksin ja a-(4-aminofenyyli )-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l, 4,10-5 trietikkahapon samarium-153-kompleksin valmistus

Valmistettiin a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra- atsasyklododekaani-l ,4,7-trietikkahappopentahydrokloridin ja a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani- 1,4,10-trietikkahappopentahydrokloridin (valmistettu esi-10 merkin 5 mukaisella menettelytavalla) 3 x 10'2 M liuos liuottamalla 4,2 mg niitä 300 pl:aan NANOpure™-vettä. 10 μ1:η erä tätä liuosta lisättiin 15 pl:aan 2 x 10'5 M SmCl3:a (0,1 N HCl:ssa), johon oli lisätty Sm-153:a. Liuoksen tilavuudeksi muodostettiin 1 ml lisäämällä siihen vet-15 tä. pH säädettiin sitten NaOH:lla arvoon 7,0. Tämä liuos jaettiin kahteen 500 ml:n osaan, joista toista kuumennettiin 1 tunti 100 °C:ssa.

Sekä kuumennettu että kuumentamaton näyte tutkittiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuuden määrit-20 tämiseksi aikaisemmin kuvattua kationinvaihtomenettelyä käyttäen. Tulokset osoittivat, että 89 % metallista oli kompleksina kuumennetun näytteen tapauksessa ja 96 % kuumentamattoman näytteen tapauksessa.

Esimerkki 50 ·. 25 a-( 4-aminofenyyli )-l, 4,7,10-tetra-atsasyklododekaa ni-l, 4, 7-trietikkahapon samarium(III)kompleksin ja a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l, 4,10-trietikkahapon samarium(III)kompleksin pH-stabiilisuus

Esimerkistä 49 peräisin oleva kuumennettu ja kuu-30 mentamaton näyte jaettiin kumpikin kahteen yhtä suureen osaan. Toisen erän pH säädettiin HCl:lla ja toisen

• I

NaOH:lla seuraavassa taulukossa esitettyihin arvoihin. Kun haluttu pH oli saavutettu, näytteen annettiin seistä 10 minuuttia ja siitä määritettiin kompleksina olevan metal- ·· 89 103792

Iin prosenttiosuus aikaisemmin kuvatulla kationinvaihtome-netelmällä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa:

Kompleksina (%) ^ pH Ruumen-'.Kuumen nettu tamaton 1 86 83 3 99 99 10 5__99 99 7__89 96 9__99 98 11 96 89 15 13 ~ . 97 ~ 97

Esimerkki 51 a- (4-nitrof enyyli )-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7-trietikkahapon samarium(III)kompleksin valmistus 20 Seoksen, joka sisälsi 13 μΐ a-(4-nitrofenyyli)- 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l,4,7-trietikkahapon (valmistettu esimerkin 4 mukaisella menettelytavalla) 2 x 10"2 M liuosta, 15 μΐ 0,02 M SmCl3.a (0,1 N HCl:ssa) ja 2 μΐ Sm-153:a, tilavuudeksi muodostettiin 1 ml NANOpure™-vettä • 25 lisäämällä. pH säädettiin sitten NaOHrlla arvoon 7,0. Tämä liuos jaettiin kahteen 500 ml:n osaan, joista toista kuumennettiin 1 tunti 100 eC:ssa. Sekä kuumennettu että kuumentamaton näyte tutkittiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuuden määrittämiseksi aikaisemmin kuvattua ka-30 tioninvaihtomenettelyä käyttäen. Tulokset osoittivat, että 74 % metallista oli kompleksina kuumennetun näytteen tapauksessa ja 24 % kuumentamattoman näytteen tapauksessa.

103792

Esimerkki 52 α-( 4-nitrofenyyli )-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7-trietikkahapon samarium( III )kompleksin pH-stabii-lisuus 5 Esimerkin 51 mukainen kuumennettu näyte jaettiin kumpikin kahteen yhtä suureen osaan. Toisen erän pH säädettiin HCl:lla ja toisen NaOHrlla seuraavassa taulukossa esitettyihin arvoihin. Kun haluttu pH oli saavutettu, näytteen annettiin seistä 10 minuuttia ja siitä määritet-10 tiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuus aikaisemmin kuvatulla kationinvaihtomenetelmällä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa: pH Kompleksina (%) 1 67_ 2 70 5 70 - — 20 7 7Ϊ 9 75 10 76 12 75 *: 25 13__76_

Esimerkki 53 l-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-4,7,10-trietikkahaponlutetium(III)komplek-30 sin valmistus

Valmistettiin EA-D03a:n (valmistettu esimerkin 17 mukaisella menettelytavalla) liuos liuottamalla kiinteä aine veteen. Loppupitoisuus oli 0,01 mmol/ml.

Lutetiumkloridiliuos valmistettiin liuottamalla 35 lutetiumkloridi 0,1 N HCl:oon. Tulokseksi saatu lutetium- 103792 kloridipitoisuus oli 3,9 mg/ml (0,01 mmol Lu:a/ml). Merkkiaineena käytettiin lutetium-177:ää.

30 μΐ 0,01 M Lu-liuosta lisättiin 2 pl:aan Lu-177-liuosta. Lisättiin 30 μΐ ligandia ja kokonaistilavuuden 5 kasvattamiseksi 1,0 ml:ksi HEPES-puskuria (0,1 M, pH 7,6). Syntyneet liuokset olivat 0,3 mM ligandin ja lutetiumin suhteen.

Kompleksina olevan Lu:n prosenttiosuudeksi määritettiin aikaisemmin kuvatulla kationinvaihtomenetelmällä 10 98 %.

Esimerkki 54 1- [2-( 4-aminofenyyli)etyyli] -1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon yttrium(III)komplek-sin, Y(EA-D03A):n, valmistus 15 Ligandi, l-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10- tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahappo(valmistettu esimerkin 17 mukaisella menettelytavalla), muunnettiin protonoidun muodon ja ammoniumsuolan sekoitukseksi kromatografisesta voimakasta kationinvaihtohartsia (SP-Sepha-20 dex™ C-25, Pharmacia) käyttäen. Pylväs oli protonoidussa muodossa ja huuhdottiin tislatulla vedellä. Ligandin väkevä vesiliuos laitettiin pylvääseen, jonka jälkeen pylväs huuhdottiin tislatulla vedellä. Ligandi eluoitiin pylväästä 0,5 M NH40H:lla. Eluaatti poistettiin haihduttamalla : : 25 liuos kuiviin pyöröhaihduttimella ja kuivattiin vakuumiuu- nissa.

Liuos, joka sisälsi Y(0Ac)3«4H20:ta (0,203 g, 338,101 g/mol, 0,600 mmol) 10 ml:ssa tislattua vettä, lisättiin lämpimään liuokseen, joka sisälsi protonoidussa ja 30 ammoniumsuolan muodossa olevaa sekaligandia (0,300 g, 499,615 g/mol, 0,600 mmol) 10 ml:ssa tislattua vettä. Liuos kuumennettiin palautusjäähdyttimen alla kiehuvaksi, ja sen pH säädettiin 0,1 M NH40H:lla suunnilleen arvoon 7,0. 15 minuutin refluksoinnin jälkeen liuos jäähdytettiin ja 35 haihdutettiin kuiviin pyöröhaihduttimella. Ylimääräinen 103792 anunoniumasetaatti poistettiin kuumentemalla valkeata kiinteätä ainetta öljyhauteessa noin 105 °C:ssa alipaineessa. Otsikon mukaisen tuotteen (joka sisälsi noin 1 ekvivalentin ammoniumasetaattia) saanto oli 373 mg (99 %), ja se 5 karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 13C-NMR (D20, 88 °C, 75 MHz): 24,4, 28,4, 51,2, 56,5, 57,2 (2 C), 57,7, 67,2, 67,6, 120,5, 132,3, 135,2, 182,1, 182,5, 183,0; FAB-massaspektri (m/e): 552 (positiivinen ioni, [M + H*]+), 10 610 (negatiivinen ioni, [M + 0Ac']').

Esimerkki 55 1- E2— (4-aminofenyyli )etyyli] -1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-4,7,10-trietikkahaponsamarium(III kompleksin, Sm(EA-D03A):n, valmistus 15 Toistettaessa esimerkin 54 mukainen menettely käyt tämällä Y(0Ac)3*4H20:n tilalla Sm(0Ac)3·3Η20:ta (0,229 g, 381,531 g/mmol, 0,600 mmol) saatiin valmistetuksi otsikon mukainen tuote (joka sisälsi noin 1 ekvivalentin ammoniumasetaattia) 408 mg:n (99 %) saannolla, ja se karakterisoi-20 tiin seuraavien tietojen perusteella: 13C-NMR (D20, 88 °C, 75 MHz): 23,8, 27,0, 51,4, 57,5, 58,1 (3 C), 68,7, 73,4, 120,3, 132,2, 134,7, 185,0, 186,8, 192,1; FAB-massaspektri (m/e): 615 (positiivinen ioni, [M + H*]*, 25 Sm-isotooppimalli), 673 (negatiivinen ioni, [M + OAc']',

Sm-isotooppimalli).

Esimerkki 56 1- [2-( 4-nitrofenyyli )etyyli] -1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-4,7,10-trietikkahaponsamarium(III)komplek-30 sin valmistus 10 μΐ liuosta, joka sisälsi 1,48 mg 1-(4-nitrofenyyli )-l, 4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7, 10-trietikka-happoa/100 μΐ (0,03 M; valmistettu esimerkin 20 mukaisella menettelytavalla), lisättiin 15 μ1:β3η0,02 M SmCl3-liuosta 35 (0,1 N HCl:ssa), johon oli lisätty Sm-153:a. Liuoksen ti- 103792 lavuudeksi muodostettiin 1 ml lisäämällä siihen NANOpure™-vettä. Tämä liuos jaettiin kahteen 500 ml:n osaan, joista toista kuumennettiin 1 tunti 100 °C:ssa. Sekä kuumennettu että kuumentamaton näyte tutkittiin kompleksina olevan 5 metallin prosenttiosuuden määrittämiseksi edellä kuvattua kationinvaihtomenettelyä käyttäen. Tulokset osoittivat, että 81 % metallista oli kompleksina kuumennetun näytteen tapauksessa ja 43 % kuumentamattoman näytteen tapauksessa.

Esimerkki 57 10 1- [2-( 4-nitrofenyyli )etyyli] -1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-4,7,10-trietikkahaponsamarium(IIIJkomplek-sin pH-stabiilisuus

Esimerkin 56 mukainen kuumennettu näyte jaettiin kumpikin kahteen yhtä suureen osaan. Toisen erän pH sää- 15 dettiin HCl:lla ja toisen Na0H:lla seuraavassa taulukossa esitettyihin arvoihin. Kun haluttu pH oli saavutettu, näytteen annettiin seistä 10 minuuttia ja siitä määritettiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuus aikaisemmin kuvatulla kationinvaihtomenetelmällä. Tulokset on esi- 20 tetty seuraavassa taulukossa: pH Kompleksina m 25 -1 20 2 37 4 49 5 58 30 7 81 9 62 10 64 12 64

Ti 54 35 --*- 103792

Esimerkki 58 1- [2-( 4-aminofenyyli )etyyli] -1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-4,7,10-trietikkahaponsamarium(IIIJkomplek-sin valmistus 5 3 μΐ liuosta, joka sisälsi 4,65 mg 1-(4-aminofenyy li )-l, 4, 7, 10-tetra-atsasyklododekaani-4, 7, 10-trietikkahap-poa/100 ml (valmistettu esimerkin 20 mukaisella menettelytavalla), lisättiin 15 pl:aan 0,02 M SmCl3-liuosta (0,1 N HCl:ssa), johon oli aikaisemmin lisätty Sm-153:a. Liuoksen 10 tilavuudeksi muodostettiin 1 ml lisäämällä siihen NANOpure™-vettä. Tämä liuos jaettiin kahteen yhtä suureen osaan, joista toista kuumennettiin 1 tunti 100 °C:ssa. Sekä kuumennettu että kuumentamaton näyte tutkittiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuuden määrittämiseksi 15 aikaisemmin kuvattua kationinvaihtomenettelyä käyttäen. Tulokset osoittivat, että 96 % metallista oli kompleksina kuumennetun näytteen tapauksessa ja 93 % kuumentamattoman näytteen tapauksessa.

Esimerkki 59 20 1- [2-(4-aminofenyyli )etyyli] -1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-4,7,10-trietikkahaponsamarium(III)komplek-sin pH-stabiilisuus

Esimerkin 58 mukaiset kuumennettu ja kuumentamaton näyte jaettiin kumpikin kahteen yhtä suureen osaan. Toisen : 25 erän pH säädettiin HCl:lla ja toisen NaOHrlla seuraavassa taulukossa esitettyihin arvoihin. Kun haluttu pH oli saavutettu, näytteen annettiin seistä 10 minuuttia ja siitä määritettiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuus aikaisemmin kuvatulla kationinvaihtomenetelmällä. Tulokset 30 on esitetty seuraavassa taulukossa: « 103792

Kompleksina (%) pH --

Kuumenettu Kuumentamaton 5 1 iJH 13 "" 3 50 ^2 5__73__55 7 96 93_ 10 9 98 _98_ il 89 90_ — — 37

Esimerkki 60 15 1-(2-hydroksi-5-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra- atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium(III)-kompleksin valmistus

Valmistettiin l-(2-metoksi-5-nitrobentsyyli)-. 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon 20 (valmistettu esimerkin 25 mukaisella menettelytavalla) 3 x 10'2 M liuos liuottamalla 3,9 mg sitä 260 pliaan NANOpure™-vettä. 10 μ1:η erä tätä liuosta lisättiin 15 pliaan 2 x 10‘2 M SmCl3-vesiliuosta, johon oli lisätty 10 pl 3 x 10'4 M Sm-153:a (0,1 N HClissa). Liuoksen tilavuus muodostettiin : 25 1 mliksi lisäämällä siihen 965 pl tislattua vettä. pH sää dettiin sitten NaOHilla aivoon 7,0. Tämä liuos jaettiin kahteen 500 ml:n osaan, joista toista kuumennettiin 1 tunti 100 °C:ssa. Sekä kuumennettu että kuumentamaton näyte tutkittiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuuden 30 määrittämiseksi aikaisemmin kuvattua kationinvaihtomenet- telyä käyttäen. Tulokset osoittivat, että 71 % metallista oli kompleksina kuumennetun näytteen tapauksessa ja 74 % kuumentamattoman näytteen tapauksessa.

103792

Esimerkki 61 1-(2-hydroksi-5-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium(m )-kompleksin pH-stabiilisuus 5 Esimerkin 60 mukaiset kuumennettu ja kuumentamaton näyte jaettiin kumpikin kahteen 250 pl:n osaan. Toisen erän pH säädettiin HClrlla ja toisen NaOHrlla seuraavassa taulukossa esitettyihin arvoihin. Kun haluttu pH oli saavutettu, näytteen annettiin seistä 10 minuuttia ja siitä 10 määritettiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuus aikaisemmin kuvatulla kationinvaihtomenetelmällä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa:

Kompleksina (%) 15 _ y ————j————

Pn Ruumen-.Kuumen nettu tamaton i 65 51 3 96 93 20 5 99 99 7 100 100 9 100 99 n 100 96 25 13 100 98

Esimerkki 62 1-(2-hydroksi-5-aminobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium(III)-30 kompleksin valmistus • Valmistettiin 1-(2-hydroksi-5-aminobentsyyli)- 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon (valmistettu esimerkin 26 mukaisella menettelytavalla) 3 x 10'2 M liuos liuottamalla 3,2 mg sitä 100 pl:aan NANOpure™-35 vettä. 10 μ1:η erä tätä liuosta lisättiin 15 pl:aan 2 x 103792 ΙΟ'2 M SmCl3-vesiliuosta/ johon oli lisätty Sm-153:a. Liuoksen tilavuus muodostettiin 1 ml:ksi lisäämällä siihen 950 μΐ tislattua vettä ja 20 μΐ 0,1 N Na0H:a. Tämä liuos jaettiin kahteen 500 ml:n osaan, joista toista kuumennet-5 tiin 1 tunti 100 °C:ssa. Sekä kuumennettu että kuumentamaton näyte tutkittiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuuden määrittämiseksi aikaisemmin kuvattua kationin-vaihtomenettelyä käyttäen. Kun alle 95 % metallista oli kompleksoituneena, liuos laskettiin SP-Sephadex™-hartsin 10 läpi. Kompleksina olevan metallin prosenttiosuus määritettiin uudelleen. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa:

Kuumennettu Kuumentamaton 15 -—: --r—-

Puhdis- Puhdis- Puhdis- Puhdistettu tamaton tettu tamaton

Komplek- 99 68 99 21 sinä (%) 20

Esimerkki 63 1-(2-hydroksi-5-aminobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium(III)-kompleksin pH-stabiilisuus : 25 Esimerkistä 62 peräisin olevat kuumennettu ja kuu mentamaton, puhdistettu näyte jaettiin kumpikin kahteen 250 μ1:η osaan. Toisen 250 μ1:η erän pH säädettiin HCl:lla ja toisen NaOH:lla seuraavassa taulukossa esitettyihin arvoihin. Kun haluttu pH oli saavutettu, näytteen annet-30 tiin seistä 10 minuuttia ja siitä määritettiin kompleksina * olevan metallin prosenttiosuus aikaisemmin kuvatulla ka- tioninvaihtomenetelmällä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa: 98 103792

Kompleksina (%) pH ,Kuumen- Kuumen nettu tamaton 5 1 60 56 2 TA 76 3 8Ϊ 87 5 97~ 98 10 7 99 99 9 99 98 n 99 99 13 99 99 Käyttömenetelmät - biologia

Bifunktionaaliset kelaatinmuodostajat, jotka sisältävät samassa molekyylissä metallin kanssa kelaatin muodostavan ryhmän, kuten esimerkiksi DTPA:n, ja reaktiivisen 5 kytkentäryhmän (aryyliamiinin), tiedetään voitavan liittää kovalenttisesti erilaisiin kohteeseen ohjaaviin biomole-kyyleihin, jotka ovat spesifisiä syöpä- tai kasvainsolujen epitooppien tai antigeenien suhteen. Sellaisten konjugaat-tien sisältämät radionuklidikompleksit ovat käyttökelpoi-10 siä diagnostisissa sovellutuksissa keinona kuljettaa ra-:: dionuklidi kasvain- tai syöpäsoluun. [Lähdeviite: Meares et ai.. Anal. Biochem. 142 (1984) 68 - 78; tutustukaa myös pohdintaan Mearesin ja Goodwinin julkaisussa J. Protein Chem. 3 (1984), nro 2, sivuilla 215 - 216; tuoreempia kir-15 jallisuuslähteitä ovat US-patenttijulkaisu 4 678 677 (Meares) , joka on julkaistu 7. heinäkuuta 1987, US-patentti-julkaisu 4 652 519 (Warshawsky et ai.), joka on julkaistu 24. maaliskuuta 1987, ja Brechbiel et ai., Inorg. Chem. 25 (1986) 2772 - 2781.] On ajateltavissa, että tuotteita, 20 joissa käytetään radioaktiivisia tai luminesoivia emtalle- 99 103792 ja, voidaan käyttää myös in vitro tehtävissä imuunimääri-tyksissä.

Taustatietoja

Leimattujen vasta-aineiden käyttökelpoisuus riippuu 5 monista seikoista, esimerkiksi (1) vasta-aineen spesifisyydestä, (2) kompleksin inerttiydestä tai stabiilisuudes-ta käyttöolosuhteissa (so. stabiilisuudesta seerumissa) ja (3) vasta-aineen integriteetistä, ts. siitä, että leimaus-prosessi ei vaikuta haitallisesti vasta-aineen spesifisyy-10 teen tai immuunireaktiivisuuteen.

Kompleksin stabiilisuus tai inerttiys on äärimmäisen tärkeätä, jotta radionuklidi-vasta-ainekonjugaatti on tehokas diagnostisena aineena. Kineettinen labiilisuus voi johtaa epästabiilisuuteen esimerkiksi seerumissa ja ra-15 dionuklidin eroamiseen kompleksista. Siten sen diagnostinen tehokkuus alenee. Lisäksi mahdollisuus normaalille kudokselle aiheutuvaan yleiseen säteilyvaurioon kasvaa. [Cole et ai., J. Nucl. Med. 28 (1987) 83 - 90.]

Radionuklidin liittäminen vasta-aineeseen 20 Radionuklidin liittäminen vasta-aineeseen voidaan toteuttaa joko kytkemällä BFC vasta-aineeseen alalla tunnetuin menettelytavoin, mitä seuraa radionuklidin kela-tointi vasta-aineelle soveltuvissa olosuhteissa, tai vaihtoehtoisesti konjugoimalla vasta-aine etukäteen muodostet-; 25 tuun (ympäristön tai korotettu lämpötila) metalli-BFC- kompleksiin. [Meares et ai., Acc. Chem. Res. 17 (1984) 202 - 209.] Annetaan esimerkkejä:

Esimerkki ZA (vertailuesimerkki) 1-(4-isotiosyanaattibentsyyli)dietyleenitriamiini-30 pentaetikkahapon samarium-153-kompleksin konjugointi

IgG:hen ja CC-49:n F(ab')2:een; [153Sm(SCN-Bz-DTPA) ] -IgG ja [153Sm(SCN-Bz-DTPA) ] -F(ab' )2-fragmentti 1-(4 -isotiosyanaattibentsyyli)dietyleenitriamiini-pentaetikkahapon samarium-153-kompleksi [153Sm(SCN-Bz-DTPA) ] 103792 valmistettiin sekoittamalla 150 ^l:aan liuosta, joka sisälsi 153Sm:a 0,1 N HClrssa, 9 μΐ 1-(4 - isotiosyanaattibent-syyli)dietyleenitriamiinipentaetikkahappoa, johon oli lisätty HEPES-puskuria (0,5 M, pH 8,9, noin 30 μΐ) sen pH:n 5 säätämiseksi suunnilleen arvoon 6. Konjugaation toteuttamiseksi 153 Sm-kompleksi in sekoitettiin 22,5 x 10‘9 mol IgG:tä tai CC-49:n F(ab')2:ta (proteiinin pitoisuus noin 1 x 10'4 mol/1 50 mmol-.ssa HEPES: ää, pH 8,5), ja pH säädettiin natriumkarbonaattiliuosta (1,0 M, 12 - 15 μΐ) lisää-10 mällä arvoon 8,9. Konjugointi tehtiin huoneen lämpötilassa (noin 25 °C) sen kestoajan ollessa noin 3 tuntia. 153Sm-kompleksilla leimattu IgG tai F(ab')a eristettiin ja karakterisoitiin esimerkissä XII kuvatulla tavalla.

Biologiaa koskeva kokeellinen osa 15 Esimerkit I ja II sekä vertailuesimerkit A - D:

Bifunktionaalisten kelaattien tutkiminen in vivo Eräiden harvinaisten maametallien kelaattien sta-biilisuutta on testattu in vivo eläimillä. Esimerkiksi Rosoff et ai. ovat raportoineet julkaisussa International 20 Journal of Applied Radiation and Isotopes 14 (1963) 129 -135 radioaktiivisten harvinaisten maametallien kelaattien jakautumisesta hiirissä tiettyjen aminokarboksyylihappojen tapauksessa. Havaittiin, että in vivo "kelaatinmuodostajan ja elimistön aineosien (epäorgaanisten ja orgaanisten) 25 välinen kilpailu harvinaisen maametallin ioneista määrää sen kerrostumisen ja erittymisen". Tämän keksinnön mukaisten harvinaisten maametallien vahvojen kelaattien arvellaan hajoavan hyvin vähäisessä määrin ja erittyvän, kun sen sijaan alalla tunnetut heikot ja kestävuudeltään kes-30 kinkertaiset kelaatit hajoavat helpommin ja kerrostuvat siten elimiin, kuten esimerkiksi maksaan. Maksan radionuk-lidipitoisuus ei kuitenkaan aina aiheudu heikon kompleksin muodostumisesta vaan on joissakin tapauksissa seurausta metallikelaatin affiniteetista maksaan. Kelaatteja on itse 35 asiassa valmistettu ja käytetty maksan toiminnan tutkimi- 103792 seen (Alan R. fritzberg, Radiopharmaceuticals: Progress and Clinical Perspectives, osa 1, 1986; US-patenttijulkaisut 4 088 747 ja 4 091 088}.

Esimerkin 3 mukaisen yhdisteen yttrium- ja samari-5 umkelaattien, jotka ovat esimerkkejä harvinaisten maame-tallien vahvoista kelaateista, biologinen jakautuminen määritettiin ja prosenttiosuutta annoksesta käytettiin in vivo -tutkimusmenettelynä kelaattien stabiilisuuden arvi-oimisesti kvalitatiivisesti. NTA:n ja EDTA:n kelaatit ovat 10 mukana vertailun vuoksi. Myös samariumia injektoitiin vertailuaineeksi kelatoimattomassa muodossa samariumkloridi-na.

Sprague-Dawley-rotat, jotka painoivat 150 - 200 g, hankittiin Charles River Laboratoriesilta. Nämä eläimet 15 sijoiitettiin häkkeihin, ja niille annettiin vettä ja ruokaa rajoittamattomasti. Eläimiä totutettiin oolosuhteisiin vähintään 5 vuorokauden ajan ennen käyttöä. Ennen kompleksin injektointia eläimet sijoitettiin lämpölampun alle (15 - 30 minuutiksi) häntälaskimon laajentamiseksi. Sen 20 jälkeen eläin laitettiin rajoittavaan häkkiin, häntä puhdistettiin alkoholilla pyyhkäisemällä ja eläimelle annettiin ruiske (50 - 200 μΐ) häntälaskimoon. Injektoinnin jälkeen eläin sijoitettiin toiseen häkkiin 2 tunniksi, jonka jälkeen se lopetettiin katkaisemalla siltä kaula. 25 Eläin leikeltiin sitten, osat huuhdottiin deionisoidulla vedellä, läpsäytettiin kuiviksi ja punnittiin laskentapul-loon, jonka oma paino oli määritetty. Valmistettiin vähintään 3 vertailunäytettä samasta aineesta, jota injektoitiin, ja niistä suoritettiin laskenta eläinkudosten kans-30 sa. Prosenttiosuus annoksesta on pulssien lukumäärä elimessä jaettuna pulssien lukumäärällä vertailunäytteessä kerrottuna 100:11a (ks. seuraava taulukko).

102 103792

Taulukko

Tiedot biologisesta jakautumisesta !" [Maksaan pää-| 5 Esimerkki Ligandi esi- Metalli tynyt osa(%) nro merkistä* injektoidus ta annoksesta

Ϊ 3 Y 0.1T

IX 3 Sm 0.29

10 (A) EDTA Sm__8. H

(B) EDTA Sm ^ {c) NTA Sm 8.6 ("Ö") SmCl3 Sm 39 15 *Kompleksien valmistuksessa käytettiin ligandi-metallisuh-detta 1:1 esimerkeissä I ja II, 5:1 esimerkeissä A ja noin 300:1 esimerkeissä B ja C.

Esimerkit III ja E

Valmistettiin edellä kuvatuin menetelmin yttriumin 20 (johon oli lisätty pieni määrä 90Y:a) 1:1-kompleksit esimerkin 3 mukaisen ligandin kanssa, joka on BA-DOTA, ja EDTA:n (vertailuesimerkki E) kanssa. Muutama 100 μ1:η erä siirrettiin sitten eri sentrifugiputkeen. Y(III):a lisättiin ylimäärin, niin että tilavuuden kokonaismuutos saa-25 tiin minimoiduksi, ja aika rekisteröitiin. Puolen tunnin kuluttua metallin lisäyksestä määritettiin kompleksin määrä prosentteina edellä kuvatulla kationinvaihtomenetelmäl-lä ja sitä verrattiin alkuperäiseen kompleksin määrään. Kompleksin määrä prosentteina lisätun metallin funktiona 30 antaa viitteen ligandi-metallikompleksin labiilisuudesta. Tulokset on esitetty taulukossa.

103792

Taulukko

Metallin ja li- Kompleksina (%) gandin mooli- -_

5 suhde BA-DOTA EDTA

Ϊ 80 98 10 — 86 100 — 78 10 250 88 H8 500 80 16

Esimerkki IV

15 1-[2-(4-isotiosyanaattifenyyli)etyyli]-1,4,7,10- tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium-153-kompleksin, [153Sm(SCN-EA-D03A)]-kompleksin, valmistus

100 pl:aan liuosta, joka sisälsi 153Sm:a 0,1 N

HClrssa, lisättiin 5 μΐ SCN-EA-D03A:ta (5 mmol/1 50 mM 20 HEPES:ssä, pH 8,2). Tätä seosta sekoitettiin pyörresekoit-timessa ja siihen lisättiin vähitellen HEPES-puskuria (0,5 M, pH 8,9; yhteensä noin 25 μΐ) pH:n säätämiseksi suunnilleen arvoon 7. Kelaatin muodostumisen etenemistä seurattiin HPLC:llä GF-250 -kolonnia käyttäen (HPLC-sys-\ 25 teemi I). Saavutettiin noin 50 %:n saanto.

Esimerkki V

a- [2-( 4-aminofenyyli )etyyli] -1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-

kompleksin, [153Sm( PA-DOTA)] -kompleksin, valmistus 30 150 pl:aan liuosta, joka sisälsi 153Sm:a 0,1 N

HClrssa (noin 4,6 mCi), lisättiin 1 μΐ natriumasetaattia (2,0 M) ja 9 μΐ a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,19-tetraetikkahapon ammo-nium-kaliumsekasuolaa (5 mmol 50 mmol:ssa HEPES:ää, pH 35 8,5, valmistettu esimerkin 9 mukaisella menettelytavalla).

104 103792

Seosta sekoitettiin mekaanisesti ja se titrattiin vähitellen HEPES-puskurilla (0,5 M, pH 8,9, lisäys noin 31 μΐ) pH-arvoon 7. Tätä seosta kuumennettiin sitten 98 °C:ssa hiukkahauteessa 1 tunti. Kuumennuksen päätyttyä 5 μΐ seok-5 sesta käytettiin analyysiin Mono-Q™-kolonnissa HPLC-systeemillä II käyttäen eluoinnissa gradienttiliuotinsystee-miä (0 - 15 minuuttia, 0 %:sta 100 %:iin B:tä; jossa systeemissä A = vesi ja B = 1,0 M ammoniumasetaatti, joka sisälsi 0,1 mmol EDTA:a). Saavutettiin 85 - 95 %:n saanto-10 ja 153Sm: iin perustuen. Näin valmistettu a-[2-(4-aminofenyy-1i)etyyli]-1,4,7,10 -tetra-at sasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-kompleksi karakterisoitiin vertaamalla sen kromatografiakäyttäytymista Mono-Q™- ja GF-250-kolonnissa identtisen ei-radioaktiivisen näytteen 15 käyttäytymiseen. Lisäosoitusta radioaktiivisen kompleksin läsnäolosta hankittiin muuntamalla se isotiosyanaattijoh-dannaisekseen ja konjugoimalla se sitten vasta-aineeseen. Kompleksi on myös valmistettu ilman kuumennusta (ympäristön lämpötilassa) 6-18 tuntia inkuboimalla, jolloin tu-20 loksena oli 70 - 80 %:n saanto.

Esimerkki VI

a-[2 -(4 - isotiosyanaattifenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon sama-rium-153-kompleksin, (153Sm (SCN-PA-DOTA) ] -kompleksin, valmis- • 25 tus

Esimerkissä V saatuun reaktioseokseen lisättiin 2 μΐ HEPES-puskuria (0,5 M, pH 8,9), 2 μΐ tiofosgeenia ja 0,2 ml kloroformia. Seosta sekoitettiin voimakkaasti mekaanisesti 2 tai 3 kertaa muutama sekunti kerrallaan. Klo-30 roformikerros heitettiin pois ja vesikerros, joka sisälsi ·* pääasiallisesti haluttua tuotetta, säästettiin ja puhdis- • · tettiin tarkemmin, a- [2-(4-isotiosyanaattifenyyli)etyyli]-1,4,7,10 - tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-kompleksin saanto oli HPLC:llä GF-250-35 kolonnissa HPLC-systeemiä I käyttäen tehdyn 153Sm-aktiivi- » 103792 suusmittauksen perusteella 85 - 90 %. Vesikerros johdettiin sen puhdistamiseksi SEP-Pak™ C-18 -patruunan läpi ja eluoitiin asetonitriili-vesiseoksella, joka sisälsi 90 % asetonitriiliä. Ensimmäiset 300 μΐ eluaattia heitettiin 5 pois, ja seuraavissa 900 μl:ssa ulos tullut SCN-johdannainen karakterisoitiin HPLC:llä GF-250-kolonnissa. 153Sm-aktiivisuuden talteensaanti oli parempi kuin 90 %. Pääosa liuottimesta haihdutettiin sitten 1,5 - 2 tunnin aikana, ja jäännös käytettiin vasta-aineeseen konjugoin- 10 tiin.

Esimerkki VII

a- (4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-kompleksin,

[153Sm(BA-DOTA) ] -kompleksin, valmistus 15 200 μΐ-.aan liuosta, joka sisälsi 153Sm:a 0,1 N

HCl:ssa, lisättiin 1 Ml natriumasetaattia (2,0 M) ja 12 μΐ a -(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,19-tetraetikkahappoa (5 mmol 50 mmol:ssa HEPES:ä, . pH 8,5; valmistettu esimerkin 3 mukaisella menetelmällä).

20 Seosta sekoitettiin mekaanisesti ja se titrattiin vähitel len HEPES-puskurilla (0,5 M, pH 8,9, lisäys noin 38 μΐ) pH-arvoon 7. Tätä seosta kuumennettiin sitten 98 °C:ssa hiukkahauteessa 1 tunti. Kuumennuksen päätyttyä 5 μΐ seoksesta käytettiin analyysiin Mono-Q™-kolonnissa (HPLC-sys-25 teemillä II, eluointi gradienttiliuotinsysteemillä: 0-15 minuuttia, 0 %:sta 100 %:iin B:tä; jossa systeemissä A = vesi ja B = 1,0 M ammoniumasetaatti, joka sisälsi 0,1 mmol EDTA:a) . Yleensä saavutettiin 85 - 95 %:n saantoja 153Sm:iin perustuen. Kompleksi on valmistettu myös inkuboimalla 30 seosta huoneen lämpötilassa 12 - 18 tuntia, mikä johti otsikon mukaisen tuotteen saantoon 80 - 90 %. Näin valmistettu a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklodode-kaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-kompleksi karakterisoitiin vertaamalla sen kromatografiakäyttäyty-35 mistä Mono-Q™-kolonnissa autenttisen näytteen käyttäytymi- 103792 seen, muuntamalla se isotiosyanaattijohdannaisekseen ja konjugoimalla se sitten vasta-aineeseen.

Esimerkki VIII

a - (4 -isotiosyanaattifenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-5 syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153 -kompleksin, [153Sm(SCN-BA-DOTA) ] -kompleksin, valmistus

Esimerkissä VII saatuun reaktioseokseen lisättiin 2 μΐ HEPES-puskuria (0,5 M, pH 8,9), 2 μΐ tiofosgeenia ja 0,2 ml kloroformia. Seosta sekoitettiin voimakkaasti melo kaanisesti 2 tai 3 kertaa muutama sekunti kerrallaan. Klo-roformikerros heitettiin pois ja vesikerros, joka sisälsi pääasiallisesti haluttua tuotetta, säästettiin ja puhdistettiin tarkemmin. a-(4-isotiosyanaattifenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon sama-15 rium-153-kompleksin saanto oli HPLC:llä GF-250-kolonnissa HPLC-systeemiä I käyttäen tehdyn, 153Sm-aktiivisuuteen perustuvan analyysin mukaan yli 90 %. Vesikerros johdettiin sen puhdistamiseksi SEP-Pak™ C-18 -patruunan läpi ja elu-oitiin asetonitriili-vesiseoksella, joka sisälsi 90 % ase-20 tonitriiliä. Ensimmäiset 0,3 ml eluaattia heitettiin pois, ja haluttu tuote tuli ulos seuraavissa 1,2 ml:ssa saannon ollessa 86 - 93 %. Pääosa liuottimesta haihdutettiin sitten noin 2 tunnin aikana, ja jäännös käytettiin vasta-aineeseen konjugointiin.

25 Esimerkki IX

1- [2- (4-isotiosyanaattifenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium-153-kompleksin konjugointi vasta-aineeseen; [153Sm(SCN-EA-D03A)]-IgG-konjugaatti 30 Käytetty vasta-aine oli CC-49, hiiren monoklonaali- nen IgG, joka sitoutuu TAG-72:n, kasvaimiin yhteydessä olevan antigeenin, epitooppiin. Konjugaation toteuttamiseksi 187 μΐ:aan vasta-aineliuosta (1,20 x 104 mol/1 50 mM HEPES:ssä, pH 8,5) sekoitettiin 4,5 x 10'8 mol 153Sm(SCN-EA-35 D03A):ta, joka oli valmistettu esimerkissä IV kuvatulla 107 103792 tavalla, ja seokseen lisättiin sen jälkeen natriumkarbo-naattiliuosta (1,0 M) sen pH:n nostamiseksi arvoon 8,9. Reaktion annettiin jatkua 2 tuntia huoneen lämpötilassa. Sen päätyttyä 153Sm:lla leimattu IgG eristettiin keskipako-5 geelisuodatuksella Sephadex GF-25 (2,2 ml) -kertakäyttöko-lonneissa ja puhdistettiin edelleen HPLC:llä GF-250-kolon-nissa käyttäen eluenttina sitraattipuskuria (0,25 M, pH 7,4). Leimattua IgG.-tä sisältävät jakeet yhdistettiin ja väkevöitiin ja tehtiin vaihto (3 x) PBS:ään Centricon™-10 väkevöintilaitteita käyttäen. Näin valmistetun 153Sm:llä leimatun IgG:n ominaisaktiivisuus oli noin 0,16 μCi/μg proteiinia. [153Sm(SCN-EA-D03A) ] -IgG-valmisteen integri teetti varmistettiin HPLC:llä [S. I. Sivakoff, BioChrom 1 (1986), nro 1, 42 - 48] ja tavanomaisin biokemiallisin 15 menettelytavoin, esimerkiksi natriumdodekyylisulfaatti- polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja autoradiografi-alla sekä radioimmunologisella kiinteäfaasimäärityksellä (RIA) . [Ks. David Colcher et ai., Cancer Res. 43 (1983) 736 - 742.]

2 0 Esimerkki X

1- [2 - (4 -isotiosyanaattifenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium-153-kompleksin konjugointi CC-49:n F (ab')2-fragmenttiin; [153Sm (SCN-EA-D03A) ] - CC-49-F (ab ') 2-fragmentti 25 CC-4 9 : n F (ab') 2-f ragmenttiin, joka oli valmistettu

entsymaattisesti hajottamalla Lamoyin ja Nisonoffin esittämällä menettelytavalla [E. Lamoyi ja A. Nisonoff, J. Immunol. Methods 56 (1983) 235 - 243] (225 μΐ 1 X 10 4 M

liuosta, jossa liuottimena oli 50 mM HEPES, pH 8,5) sekoi-30 tettiin 2,9 x 10~8 mol esimerkissä IV kuvatulla tavalla valmistettua 153Sm(SCN-EA-D03A) :ta. Lisättiin natriumkarbonaattia (1,0 M, noin 5 μΐ) pH:n säätämiseksi arvoon 8,9, ja reaktiota jatkettiin noin 2,5 tuntia. Sen päätyttyä 153Sm:lla leimattu fragmentti eristettiin ja karakterisoi-35 tiin esimerkissä IX kuvatulla tavalla.

103792

Esimerkki XI (A ja B) [153Sm (EA-D03A) ] -IgG:n ja [1S3Sm (EA-D03A) ] -F (ab 1 ) 2:n paikallistaminen in vivo [153Sm(EA-D03A) ] :11a leimatun CC-49:n IgG:n (esimer-5 kistä IX) ja F(ab')2:n (esimerkistä X) käyttökelpoisuutta havainnollistettiin leimattujen materiaalien kerääntymisellä kateenkorvattomien hiirien ihmisestä peräisin olevan kasvainsiirrännäiseen. Kateenkorvattorniin naarashiiriin (Nu/Nu, CDl-tausta) inokuloitiin subkutaanisesti (s.c.) 10 (0,1 ml/lähde) ihmisen paksusuolensyöpäsolulinjaa, LS-174 T (noin 1 x 106 solua/eläin) . Noin 2 viikon kuluttua inokulaatiosta kuhun eläimeen ruiskutettiin häntälaskimon kautta noin 2 /iCi (15 - 30 μg) 153Sm:lla leimattua vasta-ainetta PBS:ssä. Hiiret lopetettiin erilaisin aikavälein. 15 Verettömäksi tekemisen jälkeen kasvain ja tietyt kudokset leikattiin irti ja punnittiin, ja niiden radioaktiivisuus mitattiin gamma-laskurilla. Määritettiin 153Sm:n aiheuttama pulssimäärä minuutissa (min1) kussakin kudoksessa, ja se on ilmoitettu yksikkönä min Vgramma kudosta injektoitua 20 annosta kohden kerrottuna 100:11a (prosenttia injektoidus ta annoksesta/gramma). Tulokset on esitetty kuvissa 1-14 ja taulukoissa IA ja IB. 153Sm (SCN-Bz-DTPA) :11a leimattu IgG ja CC-49:n F(ab')2 (esimerkistä ZA) otettiin mukaan tutkimukseen vertailun vuoksi. Tulokset on esitetty taulukoissa 25 IC ja ID.

Esimerkki XII

a-[2-(4-isotiosyanaattifenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10 -tetraetikkahapon samarium-153-kompleksin konjugointi vasta-aineeseen; [153Sm(SCN-30 PA-DOTA)]-IgG-konjugaatti ·' Käytetty vasta-aine oli CC-49, hiiren monoklonaali- nen IgG, joka sitoutuu TAG-72:n, kasvaimiin yhteydessä olevan antigeenin, epitooppiin. Konjugaation toteuttamiseksi 178 μΐ:aan vasta-aineliuosta (1,26 x 10'4 mol/1 50 mM 35 HEPES:ssä, pH 8,5) sekoitettiin 3,4 x 10'8 mol a-[2-(4-iso- 109 103792 tiosyanaattifenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklodode-kaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-kompleksia (valmistettu esimerkissä VI kuvatulla tavalla), ja seokseen lisättiin sen jälkeen natriumkarbonaattiliuosta 5 (1,0 M, noin 17 μΐ) sen pH:n nostamiseksi arvoon 8,9.

Reaktion annettiin jatkua 2 tuntia huoneen lämpötilassa. Sen päätyttyä 153Sm:lla leimattu IgG eristettiin keskipako-geelisuodatuksella Sephadex™ GF-25 (2,2 ml) -kertakäyttö-kolonneissa ja puhdistettiin edelleen HPLC:llä GF-250-10 kolonnissa käyttäen eluenttina sitraattipuskuria (0,25 M, pH 7,4). Leimattua IgG:tä sisältävät jakeet yhdistettiin ja väkevöitiin ja tehtiin vaihto (3 x) PBS:ään Centricon™-väkevöintilaitteita käyttäen. Näin valmistetun 153Sm:llä leimatun IgG:n ominaisaktiivisuus oli noin 0,16 μCi/μg 15 proteiinia. a-[2-(4-isotiosyanaattifenyyli)etyyli] -1,4,7,10 -tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-kompleksi-IgG-valmisteen homogeenisuus ja integriteetti varmistettiin HPLC:llä ja tavanomaisin biokemiallisin menettelytavoin kuten esimerkissä IX.

20 Seuraava esimerkki on vaihtoehto leimattujen vasta- ainekonjugaattien valmistamiseksi, joka vaihtoehto käsittää BFC konjugoimisen ensin vasta-aineeseen ja kelaatin muodostamisen sen jälkeen, jolloin saadaan radionuklidi-BFC-leimattu vasta-aine.

25 Esimerkki XIIA

a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-l,4,7,10-tetraetikkahappo-CC-49-vasta-aine-konjugaatin (IgG CC-49 - PA-DOTA) valmistus ja sen kela-tointi 153Sm-.n kanssa 1S3Sm:lla leimatun vasta-aineen (IgG-30 CC-49-PA-DOTA-153Sm) muodostamiseksi .* 1S3Sm(PA-DOTA) : 11a leimattu vasta-aine voidaan vai- • · mistaa liittämällä BFC, esimerkiksi a-[2-(4-isotiosyanaat-tifenyyli)etyyli]-1,4,7,10 -tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahappo (SCN-PA-DOTA), ensin vasta-ai-35 neeseen pHrssa 8 - 9 ja muodostamalla sen jälkeen konju- 110 103792 gaatin ja 153Sm:n kelaatti pH:ssa 6 huoneen lämpötilassa kelatointiajan ollessa useita tunteja.

Eräässä tyypillisessä kokeessa IgG CC-49 väkevöi-tiin ensin ja tehtiin kolmesti vaihto karbonaattipuskuriin 5 (50 mM, pH 9,1) Centricon™-väkevöintilaitteessa (moolimas saltaan 30 kilodaltonia pienemmät aineosat pois), jolloin jäi jäljelle liuos, jonka vasta-ainepitoisuus oli yli 1,5 x 10'4 mol/1. Konjugaatin muodostamiseksi 161 μ1:Ά&η SCN-PA-DOTA:a (pitoisuus 5 mmol/1 samassa karbonaattipus-10 kurissa, valmistettu esimerkin 18 mukaisella menettelytavalla) . Seoksen annettiin seistä huoneen lämpötilassa 5 tuntia, ja reaktio päätettiin suodattamalla seos CentriconTM-väkevöint ilaitteessa olevan 30 kilodaltonin kalvon läpi kierrosnopeudella 5000 min'1 Sorvali RT -sent-15 rifugia käyttäen. Vasta-ainekonjugaatti pestiin lisäksi 2 ml :11a liuosta, joka sisälsi 0,25 mol/1 DTPA:ta PBS-.ssä ja jonka pH oli 7,4, ja viidesti (2 ml/kerta) MES-pusku-rilla (20 mm, Ph 5,8) sentrifugoiden kunkin pesun jälkeen 30 minuuttia. Lopuksi PA-DOTA-IgG-konjugaatti väkevöitiin 20 mahdollisimman pieneen tilavuuteen (noin 100 μΐ) ja sen integriteetti tarkistettiin HPLC-analyysillä GF-250-pyl-väässä. Puhdistettuun konjugaattiin lisättiin seos, joka sisälsi 153Sm:a 0,1 N HCl:ssa (50 μΐ) ja 20 μΐ MES-puskuria (1,0 M, pH 6), seos sekoitettiin pyörresekoittimessa ja 25 sen annettiin seistä huoneen lämpötilassa yön yli. Lopuksi tehdyn keskipakogeelisuodatuksen jälkeen HPLC-.llä arvioitu yhdisteen 153Sm:n määrä oli 0,22 BFC-Sm/vasta-aine. Mainittu 153Sm oli liittynyt vasta-aineeseen BFC:n kanssa kelatoitu-misen kautta, joka BFC oli sitoutunut kovalenttisesti vas-30 ta-aineeseen, eikä vertailukoetuloksiin vertailu osoitta-nut sen aiheutuvan epäspesifisestä sitoutumisesta. Vertailukokeessa IgG CC-49 -liuokseen sekoitettiin 1S3Sm-seos samoissa olosuhteissa. Samalla tavalla eristettyyn vasta-aineeseen ei ollut liittynyt mitään merkittävää määrää 35 153Sm:a. Tämä osoittaa sen, että näissä olosuhteissa ei ta- 103792 pahtunut mitään Sm-153:n epäspesifistä sitoutumista vasta-aineeseen .

Esimerkki XIII

a-[2 -(4-isotiosyanaattifenyyli)etyyli]-1,4,7,10-5 tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium- 153 -kompleksin konjugointi CC-49:n F (ab1)2-fragmenttiin; [153Sm (SCN-PA-DOTA) ] - CC-49-F (ab ') 2-fragmentti CC-49:n F (ab') 2-fragmenttiin [joka oli valmistettu entsymaattisesti hajottamalla menettelytavalla, jonka ovat 10 esittäneet E. Lamoyi et ai., J. Immunol. Methods 56 (1983) 235 - 243] (225 μΐ 1 x 10'4 M liuosta, jossa liuottimena oli 50 mmol HEPES: ää, pH 8,5) sekoitettiin 2,9 x 10‘8 mol esimerkissä VI kuvatulla tavalla valmistettua a-[2-(4-iso-tiosyanaattifenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklodode-15 kaani -1,4,7,10 -tetraetikkahapon samarium-153-kompleksia. Lisättiin natriumkarbonaattia (1,0 M, noin 9 μΐ) pH:n säätämiseksi suunnilleen arvoon 8,9, ja reaktiota jatkettiin noin 2,5 tuntia. 153Sm:lla leimattu fragmentti eristettiin ja karakterisoitiin esimerkissä IX kuvatulla tavalla. Omi-20 naisaktiivisuus oli noin 0,4 μCi/μg.

Esimerkki XIV (λ ja B) a - [2-(4-isotiosyanaattifenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium- 153 -kompleksilla leimatun IgG:n tai F(ab')2:n muodos-·' 25 tämän konjugaatin, [153Sm(SCN-PA-DOTA) ]-IgG:n ja [153Sm(SCN- PA-DOTA)]-F(ab1)2:n, paikallistaminen in vivo a-[2 -(4 -isotiosyanaattifenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium- 153 -kompleksilla leimatun CC-49:n IgG:n tai F(ab')2;n 30 (esimerkeistä XII ja XIII) käyttökelpoisuutta havainnoi- ·* listettiin leimattujen materiaalien kerääntymisellä ka- • « teenkorvattomien hiirien ihmisestä peräisin olevaan kas-vainsiirrännäiseen. Biologinen jakautuminen määritettiin esimerkissä XI kuvatulla menetelmällä. Tulokset on esitet- 103792 ty kuvissa 1-7 IgG:n tapauksessa ja kuvissa 8-14 F(ab')2:n tapauksessa; ks. myös taulukot IIA ja IIB.

153Sm (SCN-Bz-DTPA) : 11a leimattu IgG ja CC-49:n F(ab')2 (valmistettu esimerkissä ZA) otettiin mukaan tut-5 kimukseen vertailun vuoksi. [Ks. taulukot IC ja ID.] Esimerkki XV

a - (4-isotiosyanaattifenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153 -kompleksin konjugointi vasta-aineeseen; [153Sm (SCN-BA-10 DOTA)]-IgG-konjugaatti CC-49:n kokonaiseen IgG:hen (174 μΐ 1,2 x 10‘4 mol/1 0,25 M HEPES: ssa, pH 8,7) sekoitettiin 2,0 x 10"8 mol a-(4-isotiosyanaattifenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tet raet ikkahapon samarium-15 3 - kompleksi a 15 (2,8 mCi), joka oli valmistettu esimerkin VIII mukaisesti, ja seokseen lisättiin sen jälkeen natriumkarbonaattiliuos-ta (1,0 M, noin 2 μΐ) sen pH:n pitämiseksi suunnilleen arvossa 8,7. Reaktion annettiin jatkua 2,5 tuntia huoneen lämpötilassa. Sen päätyttyä 153Sm:lla leimattu IgG eristet-20 tiin keskipakogeelisuodatuksella Sephadex™ GF-25 (2,2 ml) -kertakäyttökolonneissa ja puhdistettiin edelleen HPLC:llä GF-250-kolonnissa käyttäen eluenttina sitraattipuskuria (0,25 M, pH 7,4). Leimattua IgG:tä sisältävät jakeet yhdistettiin ja väkevöitiin ja tehtiin vaihto (kolmesti) 25 PBS.-ään Centricon™-väkevöintilaitteita käyttäen. 153Sm:llä leimatun IgG-valmisteen homogeenisuus ja integriteetti varmistettiin HPLC:llä ja tavanomaisin biokemiallisin menettelytavoin, kuten esimerkissä IX on esitetty.

Esimerkki XVI

3 0 a - (4 -isotiosyanaattifenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa- . syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153 - kompleksin konjugointi CC-49:n F (ab')2-fragmenttiin; [153Sm (SCN-BA-DOTA) ] - CC-49-F (ab ' ) 2-fragmentti CC-4 9 : n F (ab ' ) 2-f ragmenttiin (84 μΐ 2,4 x 10‘4 M 35 liuosta, jossa liuottimena oli 0,25 M HEPES-puskuri, 103792 pH 8,7), joka oli valmistettu entsymaattisesti hajottamalla menettelytavalla, jonka ovat esittäneet E. Lamoyi et ai., sekoitettiin 2,1 x 10'B mol a-(4-isotiosyanaattifenyy-1i)-1,4,7,10 -tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetra-5 etikkahapon samarium-153-kompleksia (valmistettu esimerkin VIII mukaisella menettelytavalla). Lisättiin natriumkarbonaattia (1,0 M, noin 2 μΐ) pH:n säätämiseksi suunnilleen arvoon 8,7, ja reaktiota jatkettiin noin 2 tuntia. Sen päätyttyä 153Sm:lla leimattu fragmentti eristettiin ja ka-10 rakterisoitiin esimerkissä IX kuvatulla tavalla.

Esimerkki XVII (A ja B) a-(4-isotiosyanaattifenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-kompleksilla leimatun IgG:n (esimerkki XV) ja F(ab')2:n 15 (esimerkki XVI) , [l53Sm(BA-DOTA) ]-IgG:n ja [153Sm(BA-DOTA) ] -F(ab')2:n, paikallistaminen in vivo

In vivo -tutkimukset tehtiin esimerkissä XI kuvatulla tavalla, ja tulokset on esitetty kuvissa 1 - 14 ja taulukoissa IIIA ja IIIB.

20 Esimerkki XVIII (A ja B) a - [2- (4-isotiosyanaattifenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon 177Lu-kompleksilla leimatun IgG:n ja F(ab')2:n, [177Lu (PA-DOTA) ] -

IgG:n ja [177Lu (PA-DOTA) ]-F (ab' ) 2:n, paikallistaminen in 25 vivo

Otsikon mukaiset yhdisteet valmistettiin ja in vivo -tutkimukset tehtiin esimerkeissä V, VI, XI, XII ja XIII kuvatulla tavalla, ja tulokset on esitetty taulukoissa IVA ja IVB.

103792

Esimerkki XIX (A ja B) o - [2 - (4-isotiosyanaattifenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra- atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon yttrium-90-kompleksilla leimatun IgG:n ja F(ab')2:n, [90Y- 5 (PA-DOTA) ]-IgG:n ja [90Y (PA-DOTA) ] -F (ab') 2: n, paikallistaminen in vivo

Otsikon mukaiset yhdisteet valmistettiin ja in vivo -tutkimukset tehtiin esimerkissä XI kuvatulla tavalla, paitsi että kudokset hajotettiin ja niille suoritettiin 10 nestetuikelaskenta, ja tulokset on esitetty taulukoissa VA ja VB.

Esimerkki XX

[153Sm(BFC) ]-CC-49-IgG:n ja [177Lu (BFC) ] -CC-4 9- IgG: n pH-stabiilisuus in vitro 15 [153Sm (BFC) ] -CC-49- IgG:n tai [177Lu (BFC) ]-CC-49-IgG: n annettin seistä 0,2 M NaOAc-puskurissa pH:ssa 6,0, 4,0 ja 2,8 huoneen lämpötilassa proteiinipitoisuuden ollessa noin 5 x 10‘6 mol/1 ja kompleksin ja vasta-aineen suhteen ollessa noin 0,5. Näytteitä otettiin tietyin aikavälein, ja ne 20 analysoitiin HPLC:llä (GF-250 -kolonni) 153Sm- tai 177Lu-ak-tiivisuuden häviämisen proteiinista määrittämiseksi. Tutkimus kesti yleensä 5 vuorokautta tai siihen saakka, että 90 % radioisotoopeista oli dissosioitunut. Tulokset on ilmoitettu radioisotooppihäviön alkunopeutena vuorokaudes-25 sa. Tulokset osoittivat 153Sm (PA-DOTA) : n, 177Lu (PA-DOTA) : n, 153Sm (BA-DOTA) :n, 153Sm(PA-DOTMA) : n ja 153Sm (MeO-BA-DOTA) :n erinomaisen stabiilisuuden happamalla pH-alueella vertai-lukompleksiin 153Sm (Bz-DTPA) nähden. Tulokset on esitetty alla olevassa taulukossa.

30 Tämä kompleksien suurempi stabiilisuus in vitro korreloi myös hyvin 153Sm:n ja 177Lu:n nopeamman elimistöstä ja ei-kohdekudoksista (esim. munuaisesta, maksasta) poistumisen kanssa; ks. kuvat 1-34.

115 103792

Isotooppihäviö (%)/vuorokausi gpQ Isotooppi pH

__6,0__ϋ,Ο 2 j 8

Bz-DTPA 1 -^Sm <2 35 35 5 PA-DOTA 1 -^Sm <2 <2 <2 BA-DOTA 1 -^Sm <2 <2 <2 PA-DOTA '^Lu <2 <2 <2

MeOBA-DOTA ^Sm <2 <2 <2 10 EA-D03A <2 90 95 PA-DOTMA ^Sm <2 <2 -

Esimerkki XXI (A ja B) a- ( 2-metoksi-5-aminofenyyli )-1,4,7,10-tetra-atsa-15 syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-kompleksilla leimatun IgG:n ja F(ab' )2:n, [153Sm(MeO-BA-DOTA) ] -IgG:n ja [153Sm(MeO-BA-DOTA) ] -F(ab' )2:n, paikallistaminen in vivo

Otsikon mukaiset yhdisteet valmistettiin esimer-20 keissä V, VI, XII ja XIII esitetyin menettelytavoin, ja in vivo -tutkimukset tehtiin esimerkin XI mukaisin menettelytavoin. Tulokset on esitetty taulukoissa VIA ja VIB.

Esimerkki XXII

100 pl:aan 153Sm-liuosta (väkevyys 0,3 x 10'3 M 25 0,01 N HCl:ssa; 5 mCi) lisättiin 6 μΐ PA-DOTMA:ta (esimer kin 29 mukaisella menetelmällä valmistettua diastereomee-ria, jolla on korkea Rf-arvo; 5 mmol/1 Milli-Q™-vedessä), 20 μΐ MES-puskuria (1,0 M, pH 6) ja 1 μΐ HEPES-puskuria (0,5 M, pH 8,7). Tämä liuos sekoitettiin pyörresekoitti-30 mella, ja sen loppu-pH oli noin 6. Sen jälkeen kun seosta 1 oli kuumennettu 90 °C:ssa 30 minuuttia, siitä analysoitiin HPLCillä GF-250-kolonnissa kompleksoitumisaste, ja yleensä saavutettiin vähintään 90 %:n saanto. 153Sm-DOTMA karakterisoitiin vertaamalla sitä ei-radioaktiiviseen Sm-komplek- « 116 103792 siin, joka oli valmistettu ja karakterisoitu erikseen esimerkissä 42 kuvatulla tavalla.

Esimerkki XXIII

153Sm (SCN-PA-DOTMA) :n valmistus 5 Esimerkissä XXI valmistettuun 153Sm (PA-DOTMA)-komp leksiin, jota oli jäähdytetty huoneen lämpötilassa 20 minuuttia, lisättiin 10 μΐ l-%:ista tiofosgeeniliuosta, jossa väliaineena oli asetonitriili-vesiseos, joka sisälsi 90 % asetonitriiliä. Seosta sekoitettiin voimakkaasti 10 pyörresekoittimessa, ja sen annettiin seistä huoneen läm pötilassa 5-20 minuuttia. HPLC-analyysiseurannan mukaan reaktio tapahtui välittömästi. Aktivoitu 153Sm-kompleksi uutettiin sen puhdistamiseksi kolmesti kloroformilla (200 μΐ/kerta), ja vesikerros johdettiin PRP-patruunan 15 läpi (PRP-patruuna = Mini-clean™-patruuna, joka oli hankittu Alltech Associatesilta, Deerfield, IL) , joka oli esikäsitelty 5 ml :11a metanolia ja 5 ml :11a MES-puskuria (20 mM, pH 5,8). Pesun jälkeen, joka tehtiin 5 ml:lla MES-puskuria ja 5 ml :11a Milli-Q™-vettä, se uutettiin 20 900 μΐ-.lla 90-%:ista asetonitriiliä heittäen ensimmäiset 100 μΐ pois, jolloin saatiin talteen noin 90 % 153Sm-aktii-visuudesta. Seos haihdutettiin kuiviin alennetussa paineessa alle 40 °C:n lämpötilassa, ja jäännös sisälsi suurimmaksi osaksi otsikon mukaista yhdistettä, joka käytet-*. 25 tiin vasta-aineeseen konjugointiin.

Esimerkki XXIV (A ja B) 153Sm(SCN-PA-DOTMA) :n konjugointi IgG:hen ja F(ab')2-CC-49:ään

Yleensä vasta-aine väkevöitiin ja tehtiin vaihto 30 karbonaattipuskuriin (pH 9,1 tai 9,5, 50 mM) Centricon™- väkevöintilaitteessa (moolimassaltaan 30 kilodaltonia pie-nemmät poistettiin), jolloin tuloksena oli vähintään proteiinipitoisuus 1,5 x 10"4 mol/1. Konjugaation toteuttamiseksi 153Sm(PA-DOTMA) :n isotiosyanaattijohdannaiseen (val-35 mistettu esimerkissä XXIII) lisättiin sellainen pieni mää- ψ 103792 rä karbonaattipuskuria, joka oli tarpeen lopullisen proteiinipitoisuuden alentamiseksi 1,5 x 10'4 mooliin/1, ja sen jälkeen ekvivalenttinen määrä väkevöityä vasta-ainetta suhteessa BFC-153Sm-kompleksiin. Seos sekoitettiin pyörre-5 sekoittimessa, ja sen annettiin reagoida huoneen lämpötilassa 1 tunti tai siihen saakka, että 40 - 50 % 153Sm:sta oli sitoutunut vasta-aineeseen GF-250-kolonnissa tehdyn HPLC-analyysin mukaan. Leimattu vasta-aine eristettiin kahdella peräkkäisellä keskipakogeelisuodatuksella Sepha-10 dex™ G-25 -kolonneja (2,2 ml) käyttäen. Leimatun vasta-aineen homogeenisuus, integriteetti ja immuunireaktiivi-suus määritettiin HPLC-analyysillä ja tavanomaisin biokemiallisin menettelytavoin, joita on kuvattu edellä.

Esimerkki XXV (A ja B) 15 153Sm(PA-DOTMA) :11a leimatun IgG:n ja F (ab1) 2-CC-49 :n biologista jakautumista koskevat tutkimukset

Tutkimukset tehtiin esimerkissä XI kuvatulla tavalla. Tulokset on esitetty taulukoissa VIIA ja VIIB. Ks. kuvat 15 - 28.

2 0 Esimerkki XXVI

177Lu (PA-DOTMA) -kompleksin valmistus 30 μ1:ΆΆΏ. 177Lu-liuosta (6 x 10'3 mol/1 1,1 N HCl:ssa, 4 mCi) lisättiin 36 μΐ PA-DOTMA:n (valmistettu esimerkin 29 mukaisella menettelytavalla) 5 mM Milli-Q™-25 vedessä. Liuosta sekoitettiin pyörresekoittimessa, ja lisättiin 115 μΐ MES-puskuria (1,0 M, pH 6,0) liuoksen pH:n säätämiseksi suunnilleen arvoon 5,5 - 6. Tätä liuosta kuumennettiin 90 °C:ssa 30 minuuttia yli 90-%:isen kelatoitu-misen saavuttamiseksi. Seos johdettiin PRP-patruunan läpi, 30 joka oli esikäsitelty 5 ml :11a metanolia ja 5 ml :11a MES-puskuria (20 mM, pH 5,8). Se pestiin 5 ml :11a Milli-Q™-vedellä. 1000 ul:aan 90-%:ista asetonitriiliä uutetuksi saatu kompleksi vastasi noin 78 % lähtö-177Lu-aktiivisuudes-ta (ensimmäiset 100 μΐ uutetta heitettiin pois).

118 103792

Esimerkki XXVII

177Lu (SCN-PA-DOTMA) : n valmistus 90-%:isessa asetonitriilissä olevaan 177Lu(PA-DOTMA)-kompleksiin, joka saatiin esimerkissä XXVI, lisät-5 tiin 6 μΐ liuosta, joka sisälsi 10 % tiofosgeenia ja 90 % asetonitriiliä. Tätä liuosta sekoitettiin pyörresekoitti-messa, ja 20 minuutin kuluttua siitä analysoitiin isotio-syanaattijohdannaisen muodostuminen HPLC:llä. Reaktio on yleensä kvantitatiivinen. Liuottimen ja ylimääräisen tio-10 fosgeenin poisto toteutettiin 1-2 tunnin alipainehaihdu-tuksella alle 40 °C:n lämpötilassa. Jäännös käytettiin vasta-aineeseen konjugointiin.

Esimerkki XXVIII

177Lu(PA-DOTMA) :n konjugointi IgG-CC-49 : ään 15 Karbonaattipuskurissa (50 mM, pH 9,1) olevaan vasta-aineeseen IgG-CC-49:ään sekoitettiin ekvivalenttinen moolimäärä massa puskurissa olevaa isotiosyanaattijohdannaista (valmistettu esimerkin XXVII:n mukaisella menettelytavalla) . Reaktiota jatkettiin 70 minuuttia vasta-aine-20 pitoisuuden ollessa 1,5 x 10"4 M, ja leimattu vasta-aine eristettiin ja karakterisoitiin esimerkissä IX kuvatulla menettelytavalla.

Esimerkki XXIX

177Lu (PA-DOTMA) : 11a ja 177Lu (PA-DOTA) : 11a leimatun v 25 IgG-CC-49:n biologista jakautumista pitkällä aikavälillä koskevat tutkimukset

Pitkäaikainen eläinkoe tehtiin 177Lu:lla leimatulla vasta-aineella käyttäen hyväksi sen pitkää puoliintumisai-kaa (161 tuntia). Koe tehtiin Balb/c-hiirillä kolmen vii-30 kon aikana esimerkissä XI esitetyä ohjelmaa noudattaen. m' Tulokset on esitetty taulukossa VIHA. Ks. kuvat 29 - 34.

Kuvissa, joissa seuraavien taulukoiden tulokset on esitetty graafisesti, on käytetty seuraavia symboleja: 119 103792

r--I ; ζ I

„ . ... Sym- Tau- Kuvat IB10I.

Konjugaatit ^ lukko esim.

• ,-^Sr.(EA-D03A)]-IgG-CC-^9 Δ IA 1-7 IX

5 i^SntEA-DOBAn-FUb^l-CC-ii? Δ IB B-1A X

' 15;Sn( Ez.-DTPA)]-IgG-CC-M9 O IC 1-7 ZA

;1:5^Sm(Bz-DTPA)]-F(ab,2)-CC-^9 O ID B-1A ZA

1 '^Smt PA-DOTA )]-IgG-CC-^9 □ HA ~ XII

: 1':'Sm(PA-DOTA)]-F(ab’2)-CC-il9 □ IIB 6-U XIII

i ' -’'Sn(BA-D0TA)]-IgG-CC-^9 " IIIA W XV

i 'D ^SiTi ( BA-DOT A) ]-F(ab' 2)-CC-M9 m TUB B - 7 Δ XVI

10 [ J'^5m(PA-DOTPiA)]-IgG-CC-^9 V VIIA 15-21 XXIV

[ l;,-'Sm(PA-DOTMA)]-F(ab,2)-CC-iJ9 V VIIB 22-2S XXV

! ‘^Lui FA-DOTMA)]-IgG-CC-^? · VIHA 2?-39 XXIX

i 'l77Zi:{PA-DOTA)j-IgG-CC-U9 ► VIHA 2 ? - 3 ^ XXIX

15

Oheisissa kuvissa esitetyt tiedot ovat seuraavat: 120 103792

Kuva Elin Otsikko I Veri 153Sm-BFC: n biol .jakaut, c 2 Maksa - " - O .

3 1 Perna__- " -_ i Munuainen_- " - _ 5 |Kasvain - " - 6 Reisi - " - 7 Retentio „ m kQkoeli- 1U _mistossa__ S Veri - " - ** 9 Maksa - " - 1° Munuainen - " - II Perna - " - 12 Kasvain - " - 15 ----- :—;---- 13 Reisi - - _- mistössä__ 15 Veri - " - * ‘0 Maksa - " - 20 | [Perna -"" - '.S |Munuainen - " - ‘5 Kasvain - " - 2C Reisi - " - mistössä 1_ 25 22 Veri - " - | 23 Maksa j - " -

Perna | - " - j 23 Munuainen [ - " - j ;· 30 *CC49-IgG karvattomissa hiirissä, joilla on LS174-T-kas-vain **CC49-F(ab')2 karvattomissa hiirissä, joilla on LS174-T-kasvain 35 ***CC49-IgG balb/c-hiirissä 103792 !----

Kuva Elin Otsikko 5 26 Kasvain 153gm-BFC:n bioL jakaut, 27 Reisi - " - 28 Retentio koko eli- - m jätössä ___ 29 Veri 17l,u-BFC n bioL jakay^ 30 Maksa - " - 10 31 Perna - ~ 32 Munuainen - " - 33 Reisi - " - ΙΕϋΙϊϊΓ ... -

_paistossa-_____I

15 *CC49-IgG karvattomissa hiirissä, joilla on LS174-T-kas-vain **CC49-F(ab')2 karvattomissa hiirissä, joilla on LS174-T-kasvain 20 ***CC49-IgG balb/c-hiirissä 122 103792 σ> co cm σ> m c— :3- cr\ r- in <\i - on td *- *- *^ *^ *^ *-~ «-.

I +j •-O'— omoo 3 M * *“ (d (!) M '& > 0 ---------- f\J > oo cm r\j o ·- cm cm q '“"t— ioo\c\jo(\Jin q 'J ΙΛ1^ΪΓηο»50

Tl m 10

o S

>H ___________ O 3 H ’LvOCMCMUOOOC— Λ -r_j o vo t— c— *— r\j — frt '' * ·' 1 ·- ►

G i) OOOOvOO

·· u * E φ Λ > ro CO "1?-------- 1-1 — f ojcofM^r·— coo p m in md t— o r~- m 5 *' t ^ £ — o-n-mmcMo -h m *“ 10 o 0)

P tT> M

J* \ --------- M S Ο vO Ό ΓΟ (M (M CT.

q w .h ir in σ% m *- m o

O h o) —X

y; in +j cm o o o cm o o

Λί :cd M. n P

G C O q 0) 3 en G ^ —--------- id id ir

Eh i cm & m co o — co αο o 0 cd £<\Jinoo*-inc\j cj -P — — *'·-' 1 in Π t—^oin^-c— c\io 0 3 in *“ cm

* -g S

M ' H y 1 O__±________ K -p 3 · —1 λ! ή vo co οί co m a> <C <d -p m cm in ^ o co m ' id ^ ^ ^ k ^

0 G -3 CM <- O O ~ I O

Q -H P

1 ® < — > W <#> r* _____ *- G — ^ D-------- 6 2 u-' j* ao in c— c* — vo co° -5 3 « "V. ^ SIS ^ rn »o m a- - I o"

Pj .p O in a) G G~ ο ο σ G c c e-

• H -H -H H

rH id id id id ή id id W -nine 3>w>w pa; P G in -H ioin -s- ajida) 3td qj m id n > 2 (¾ 2 « « « H c I l I I * 123 103792 0 Γ- (M n [>· o cm>» f-t o θ' ^ m 7 t\i t\j " H «n ^

rt OO'-O'-OO

M

Q) Λ > l O "Ό 0 c\j >m*-commcr\sr <0 '“HO'-Ooincriir W K r> w r« k, i_ 10 ^ ΟΟΙΠΜΠ^Ο » c <u <D « G - -M- , i---- —— - rl j* ι> e?, νβ in - g^ .'^Οοοσ'ΐηιη^ —

q $ OOOCMrrOO

··* *-< Γ" rQ O * Λ > C 0 — — — — — — — g 5 ,> OoO«-ruo-oo

en h (Vioco-ina-N

(η ® r *«. ►. i- tn ‘rJ θαθ·^·=Γ>— mo —t « O *— ^ <0 w e «

3 -US

Ό 3 PO -h 'oCMf-co'-totn

MO ^ q· Μ ΛΙ OD N (M OJ

O Ai 'T SO’-’-f-OOOO

* ω V u M -M » 3 0 e tn e 5; m -h ^ ~ .g ? 3 «o —tr- ——i----- S ? ti cnj > MOwoM^m? E"1 G w U in o en m co - m ·· V ^ 5 1 o « ° u e e> υ e us ό ---------- ^ ^ '"j f— m .=r o m m o

. _ 4j ONvO(MONtO(\J

• .q tn 2 »-»-* «.#-*-_ ia 3 t* o o ·—« m o o Γ 'S « ^ o I» O? £ Λ —g---1----- *aj 0) 10 Γ »o m e o in i- in m -n JJJm — ONoenr— ro O G ™ ------ Q -h — m r\j o A) w <*> — e — __- - • E il ------- tn e in n -H 0 G c~ *0 g G 0) 0) D1 T*, ?. “ - G G g- ^ +» o 5 -H -H H _.

‘Jj «JnJGiti-Hiorc^ m -h tn e 0 > tn > k w M ^ μ P 10 Ή «HU 11 OJfltl) G (ti d)G(ti >SftS««»Sg - * 103792 IS -*o m m «— o o 'j =r vo m ao m "d ·~- »- 5 - O o CTN o ^ μ '“ro 0) v & > m o "“0 --- <M > ΖΓ ΓΟ CO vO (\J ΙΠ ·— M =o t— t>- m c\j 3 ij ininromr-(M ^ t! « *° 2 a) ° •e « t'-

M --—---— I

Ifl r-t •n ^ 3\ [x <- r- O ΙΛ \o o äo \o m t— a) £ <m *“ o o co o ^ 5 M on ^ -C > in H CO ---------- o ^j- j* ·- a (m - m h- Ή y o vo n co m σ\ C £ nJtn-Pno-£ w - g <u r— tn « t- m 11 "" ~~ ~~ ~~ ~~ — — ^ μ in in o as m to -=r en m co O m ^ 3 5 ^ ^ θ' O ^

Ti U \S)

O ·Η » O

Ai 0 Cn ri > m· A! -P — ^ —Ό-------- O M — !r γ-h ai «o rg Ριη'-ονώοιη 3 -n -P>-H O O CO CT. CO CT\ rö C tn II .2 ^ ^ - vr, H -h (DC novo^roocM--^ w tn ^ — .-- ;t0 ^ a) o c ®__X cc e 3

^r rö 'j tn e a- ο (V

i ‘2 o m o o «- —

u rfl «J

U -P fror-r-^mo _ .. o s 21 Ö1 "O ^ _> H -H £j ------ i o P ----- ^ +J 10 ζ ^ oj o vc < CU ^ ^ tn σ' m ^ '[? "v-3-t— in.crrOCM1^ S 5 | ™ - i _ S. £ BQ <#> —--------- —' C --

Ett) Ci . CO e tn 0) Oi-trd m ·ρ 3 CC' -HrHtn in g S C h -h -POitn .-H 3 tn -H ro ro rö (0 -H C :θ

-P O Ή -P tn C S > tn (DO-P

W m x μ e tn -H -PMV) tt> to (D 3 (ti <D <DOrl > S en S «oi «Aig ___L- -1 ______ 103792 3 ro (M t~ 5· in r~* o o a- — oo #s k K K ^ $ o-oin-o cq I M - 3 0) v

5 X! > CO

3 o ”O

<ö ro > |a· o a- t— .=r in X «— M io oo (M <- Ln co rvj ^ , ·% ^ ·—. ^ - j. - r-» •HOinmOvOCNJ^ ^ M ΓΟ cm *~ 0) <u ° •5 --«-J-------Ϊ- 51 ^ oo co m o o ^ ^JOvOvOOOCO — Λ _J ** *— **" *s ·*» .¾ ™ oooc^roo 0 XJ M ~ 0) v C X! > a- e —σ-------- tn χ. > on a· in w in co m h (V «- »o a in a r-ι -H o os ro -- in (\j r? A UO ·— **·* (-. w 5 «) co £ * ^ ·"· 3 ~ C j 3 r Vi io o o -*-> Ä =r oo *- t- *- c\j Q<U A S 2 O — -- M in o 0 ^ £ * u t; - 8 0 -S C ®

Ji <0 X* ^ Ό :tu 4-> —0—------- 3 ?. « (M £ m m co t~- =0 r- 3 ^ S 3 ".“"."“'l ST 0 3 ^ u c w U C « 00 I m « o- ΓΜ --3 ------- 5 'j a- ω f- ^ o a

£l m '2 CO CO O' O O !\J

ns 3 Γ, - ^ *~ ^T3 tj *- O o co m o _ ^ -H 0) Co I 0 > -p — '—j M X2 —π— —_ 2_

< <U lo K

Oj ·η Γ. on t— o ~ lo co E-t C JJj O O in f- ctn a

Q -H -H

I «> in f- a- >o to oo L.

N a, ω — a - ^ S'*'5 S rn" b LSI-___ °° • in c w ----- ro Q) 3 _

* in C 3 , C3 I

i—I -H tf) <D O-MtitJ

kj g n CP <-m w G -H -H -PQJtn h ns nt nt m ή c so ι-t h m p 3 > w 0)0v w μ k μ c μ ·η <D <Q OJ, 3 id <u α>0·Η

> 5 Λ a * os PWE

. ___ __ __[__j__i_ • · 126 103792

3 ΓΟ ΓΟ IA t- O' O' LO

^ im o en in t\i vo ^ "ji · · * h P ^ " ° £ ° °

4-> M

3 Λ »I

(d > X r-H —;q-------- rt -a- ro — o o -=r ao ‘π m m — ” -H n- q· to CO ·- o c. r— 5 ui 'Z a> O --— ..ri. —------

Tl 3 oo nj r\j σ\ ro r- ro '“J o in m m in m - Λ - o- o- O ~ o' o" C M ™ " 0) E -H > W ^ -½-------- ro ö m cn> f* cm σι r~ α σ' o 1—i y im in (M ~ in o - c 1 m in a- ro i\j ·- o 3 ^ N.» -o ίίί •h — Λ 0 Cn__M _ < 4J - d------- m ä o *— o in m c\j o m 0) ro Π ’-"CMincornr^ • |—J .jj n ^

O G φ $C\JOOOC0~OO

Λί w — „ 3 :<0 X tn Λ « Ή e o II ·> 3 ·· CC ^ —Ό-------- £ 21 S'"' p CONiniO-IMs· ^ Y 10 £} *- eno·— co o m

Λ ^ A »' *v ·- ^ K

1 tn ui *" ~ 0 3 0)

Cr> Ό Ui M -H--g --—----

1 o R

. .μ •HCO'^TOOO'— on

.. l-^Λί Ή CO'-C'COO-W

< QJ «I - ^

E-ι n y CO — O <\l O O

O G * v P -H £ | LT) *> M I mmm _ _ ____ _ __

PU <#> P

—- -- rooooco^--— cor—

E JriOOC\jcoomoc\J

ro O ui . ^ ^ ^ roa>3 ^-=rcoo — — cnjo £.5 3 » ~ - " : M ε o · e

_______-K

G C—*

Cl) QJCr a G G &—

5 H -H H

'j m m e m h idin 7j •HtnG3>oj>u) w M i<c oi o w h tnen cd td o) 3 id a) idid

> S ii ;3 ui X L·E

127 103792 0 m o m >— CO m r-t O f\J f— f\i >— f\) •H *> *>» tv ^ »V ►, ' i rt o o o m — oo 3 -P =*

-P M

0 0) (0 Ä > ^ O "~0— 10 <\i > c\j ·- ·- cr> — — lh ^ n o λ a- s o tn s· rt ^ ^ »s S -HO--oxinoo 5 w 'il <u o *-------

'n s 00*-(\lf--IMO

•h '"j o -=r oo <- en c\j — ™ 00000 — 00 e u ” a» β J2 > w ^ -4,________ 00 oo S? m 2- > on co m ·— m t— o i—f P m ί- ιη ca o> -- oj ·- «. *· «. r- .

c o e· m «— — o 3 Λ \0 1-

T3 W

•h ai 0 -P--— — —--- ·* in cm tn o r— tn m ω 71 1 i-rtciOW1- 5 'Τ' 5 o o o ra o o o M *π ΙΠ Ή alt rt m P * O »0 -Pc 01 G tn - > -* ·· <d ^ —σ-------- M 5 .y > m ^ noo α i- ^ p7 o ^tvoaif^om — E-J o G TJCMtncncocvj — o 1 nj U) C\) M oi —'rt ^ P--=--------

Xl ω P

rt 0 »-· c\j ;y m on t'- ra .. — r0 -h t— co ra ra ra *— o * Ή tXl ·— i o foooinooo -p ft —ί Λί 01 < 01 >

Eh ·π xx _________ Q -h ^ r-ymoracnono I J [~®OfMOv5-(\|

^ _J *- i*. *- ». *. «s V

e tn 10

. co G tn <U II

• oo dl 0 fcO

tn C 0 ---------G

H -H Dl , * *-J £ O 1 G G— ai am G G G &—

.^1 ·Η -H H

rtrtrtrt-Hrtrt ω -H a) G 3 > tn >ui H X H G tn -h uim ai rt ai G ro ai rtrt

> S di S « « «E

128 103792 3 -=r co αο on o co m rH cr> Ln r\j ·=τ r— .=r ·— Ή ^ ^

«J (ΜΟ*- OLOOO

r; +» * m OJ

M

P ° > £ 2 o-------- >aovooovvor—o

2 M OCMt^^TiM — CM

•f’ iti ·-«_ 10 -Hco^rmroin— o M αο r w G m <U « C --—--------

öi OcnouOr-nnOvO

5 '-j in q- m m =· m o i—i d 0 ™oooo«-oo'

Tl u m * ~ -Q a) t— -G > G “Π-------- B Ξ > - in o I- 5- CO o m yvoont^»-aooc\j 00 2 ^

lo 'rjonuoirmuocMO

G <D

5 « Ό “ ~“ <ΰ··-ι ^ j σνίΜΐ'Λΐηιη? H O D1 , t^oom^rmo

a 5 ; K 5 -O^OOOO

O τη +J II ^ MC tn C ^ <p M -H QJ ^ -G > C tn ^ u Τ|:2 <n >000000101 — 00 3 » c rt “I CO VO CO - ^ S 3 ^ > in in m o' - o" 1 tn *“ ^ u (0 dj U -P « i en----------- 0 3 r

tyi Ό '“J '.O' O' — o O — PO

H -H ‘J |CM f— VO tn CO m (M

.. i o • P^+J ·Ρ"-ΟΟΟΟϋΟΟ < 0) > i g C - Z-,_______ 0 -H in £ 1 1 r ισο no ro — — — — <Q — Ϊ coininocinn CQ dP >Γ^ “ “ ϋ ~v-inmrNo _ S m tv - ^ o c tn ^ n Qj 3 Ä 11 m c 3 __

: >-i -H tn — — — — — — G

^ e ° c c~ * Q) QH7 cc Sr-

^ «H *H H

•h rd (ö cd <d -h mrd ,π -Htnc3>tn>tn M h j< n c M -H lit» 0) (ti 0) 3 Iti OJ rtilti

> S ft S ><! Ä *SG

129 103792 3 — in o c— ·=χ in o 'j o (M m ^ in m r- ’Γ? V. K ^ rs ^

V\ OOOCNJCNJOO

h ^ Q) 3 Λ >

rd O “O

CM f» ro O m CO σι CO N

ro ·“ jj O ΙΛ 3· Ui m ID -- n «» ~ r Tj O’— ’-^rc^oo S 3 ~ G Q)

Tl « tji - --— —--- O tl rjOOQOsO — incoo

O IJOCOCOP- CMCMO

Xl o o o c~- m o o _ M * G 0) ·· Λ > ε ________ <S CO ^ n a· r co n co ? ΙΛ m t- m J MClIOO^iOO- rH , Vs k ·. . 4- c *- c _y o cm o t— *- o Z M « - ^ rt 0 '__ P — ”“ ““ “““ ““ H (MMCMN-ints M -O Oi ^ ® “1 ^ ^ ° h -S ~ in 5 OOOrn*-oo (ti n M ! * O :rt -PC rt λ; g « ^ ä > i * ·· <1> —o—I--—---- O CTi (A ·=»*!> Z> ,ν (Μ Γ (ΜΟϊΟΝΟιΟΝ 9, o 3^-r-Oxr-CMrO^ ro u c h .7- *~ jr

0_i (j £ ^ fv *·© 0Π C"— ^ *“ O

1 (ti IA t— CM

ΓΜ O) — ro « p--g—------- Λ w jj to 3 ^ •«S'-roois’Qtvj

: · —' Ό OMOO'N'-O

• Cm Ή ,, i o r ooo~cmoo b £ rt * <c rt o c P — --- 0 p u ‘ Γ (M oi m o» o n [s 1 ^ΙνΟίοσκΜίη-·- ^ §rJ *- Γ C* «. τ' r- r-

m .y in N 3· O 3- IM O II

c ro — tn — co c ro Ä c . ro O) 3 ^ * . in C 3 -------

Cj c n C G·—

^ c ^ 0) QJO

cc e-

r* ·Η *H ‘H

•H <β id rt *H fdfO

r—i -h IA C 3 > ro >ro ω M Λί M C m -h mm Φ «ti a» 3 rt Q) <ö (ti > a λ a * « «e 130 103792 3 ro f\j ιλ (\j σ> rH — ιΟ co - ro — o •H ‘ * * - k « ^ ™ ro o — — m o o "Γ — * * M * 0) Λ > rH. —o * cm > ro — tn r— in rvi o 3 — M r- ro in o ro >- id »- * * k * · >, E -h — 3- in ro <\j — o 5 * - co in 0) __«________ S o a- σ\ rg £ " r-^fomnoo ♦ι-l irt ·* *~ · ** ·*- *^ *» ·*.

tn z *- o o o - o o O U * * * i—I Q) 0 Ä > a « Τ“Γ------ ij- f as — ro ro us — cd c h 33--5--10--0 ·· “ *- · » »- *- «_ ».

3 'n-^in^rnocNJO

k <u M * << a >c o u\<-3-uo--orj m3 j in ro 5· n o o S o In 5 - o - o roo o 2 S cr ^ ******* 3 M \ C ^ rH Q) Id ^ - f> 3 n -M —0-------- H -h S <\j >ro^-c-roroinos H S ^^-c--=r — 0-0 •id J2 .5 *- ^ - *' - * i-

*12 fC QOsOiniTCrCMO

7. c % -***-*» m C S *

id K

1 --^--------

ij MrMa-voincr'cooN

·. I (A ->-iroroLncDrooo <d » · * * V ι tn 03 -^^---000- o 7 « £ £ Λ -ζ-_______ C α> ,Ο & EH -n u’ rOr-CTNO — O' ro 0 c Ϊ ins-wao'r-·- Q -H -H *- *~ *" *- ^ ·' * «.

1 u br-ofo-wo in ^ n pH <*> d) .: « c ·· h3 C « ------- * I" <U 3 r; ,-.

£ .S S S So· ^160 c c e-

e ° c -H -H pH

.¾ id id id id ή <d id ,_i -Hinco>w>in ω usiUGw-i-itnw li m oi d n) ii mm > £ A S « Pi p & 131 103792 *d c\j zr m co tn m «h orvirj — t— c\j —

rt OOOfMOOO

M * * * u

_ <U

G Ϊ3 t> 0) ,,------- c ο 0 ro > Jromeo''-» cp ·— MommoovoiT — q ftj ·- · . r ·- ·, w X h o*-»-ina-oo 0 ·* *“ •h m Λ a> __K________ c -—— ·· Gasins^t-inrovo 3 '-Joirc-S'm.sro >3 ^

f" ™ O O O vO OJ O O

rl M

Φ c λ > 3 TJ— - - ------ 'O 2 > MnoinaMnf·

g M t (\j ^ a- a· σ> O

£ -Homojcoinoo ω m ** *“ n 4) -5 ^ _____ ^ ____ ______ .,0 ^ ^co — tnrncomm g H S 3 T "Ί “l T °*.

« » S S “????«??

0 1 0 c <D

Λί Ο β 3 - > * U β -ö __L________ G I o -h fsi fT. f>osroooLno 3 - <d ™ Mzrinvo=--zr~ <o +J "J*'*''·*'*-*-*' E-ι Λ m Τ’ (M in n ? σν r- o m β ** r ·ο S * * 1 o__5________ Γ", +J 3

TT Λί oHt-t— ITifMOCOOO

<. dl Ή Ο (\i ff\ 31 lO S3 o H -n <d

OC G f OOOvJDfMOO

Q ® Ή M j*t *

• I G <D

< -H ^ >

Cm E op - G — ^ —O---—---- w 10 r in σ' - rj σ' n o ^ t- rt " S ^ ™ = ^ " h λ m 5 cvjins-ooojo k; n o w m— c a) *

K

G G~ • <U 0) C7> _ cc ε~

G -H Ή H

id rt «d <0 -h id (0 rj -h to g 3 > tn > w W M^MGuiHtnin <urt(UGrt(Urtrt

> S Λ S « « =<H

132 103792 3 o co on zr tn ^ On c\j co ro ro cr |j K ^ r. .s

™ (M - O O -- O

u ™ e) C ,„;C > <u LO _ _ _ _ _ _ __ c ° ^0

Il (M ·> CM CO CTN t— (M ΖΓ p ·— M o mo — s- on o c c *2 - ·' » t.

4j -h o in 5· r\i o - I s « K_______ •n -¾ .O — MO CO O OO — C j co on no vo — (1) *2 c o o o o m o •H Tj * * * * g1 « rH Ä > 0 m -0-------

H , =r > LO C\| MO MO — ON

•Q 11 ” CO LO MO MO ~ C~- r- C -H'*'*'*'*''*'*' C 1 in o in m co - £ ie r ^ o ω

ON

< --z~~------ > S On t— CM O ΓΟ o Otji -h o r— c~- o .=^ in

2 5« 4J CM O O - - O

O -P +J M * rH λ; tn <D * o ω a) - > (0 n tn —Q------- H -HO II CM £ c\j - o to ro -

c O C\J O LO ro f— CO

:<ö C β * ^ ^ ~ ^ CIO 2 CO C- LO ^ .TT - " tn — ON (0 φ

M· -P

1 w ...... —-—______ U 0) jj • u Ό ] o n o o cn in I -H ON — C\| LO C— — UO "j ÖN-P -Γ—ΟΟΟΟΟ m a; ^ | QJ ω Τ'! ·η ^ c — < ·Η „ P------ E-* 1110 ?! .in in m c in in q op c .«e -°

I “ * Π I LO CO LO PO C\l C\J

S s s ~ • · >H OS *4 "j o tn ————*-------- Tr co

ON O

VJ C II II

<u cc cc C ·Η -H * * -rH (0 (0 (0 (0 -H * ,-ι -h tn c C > tn W h X s-ι C tn -h QJ 10 <D C (0 O)

> 2 Cl. S « PS

133 103792

M IOJ (M sr o as (M

o ro uo o —

*3 ΙΟ o' O N N O

c S

rt e) 5 ä >______ g S >-3-vomvoroco 2 ,— £ o in ro ro co ro li rt·-— 2 -ri o »- *- cv m o S * 'π __ft_______ {H 3 ro ro *- t— σ% co β H o ro f- Ό o —

Cn O O O LO O

0 H * n « -h Λ >______ Λ _ "TT" 2 > — «-sr — 5· o\ C M ro O in ro co ro • · ^ k f» ·« K ^ >H *H O m 04 f\i o o M sr *— <t\ tn rt C t4 m 0 -------- > ru G λ cm σ\ w t- e H H q· ? JT O» S -- OO "d 5 tl ^ «jooouo^ro " . m +* * *

3 dJ cr n M

•H -n \ f- β) 3 C rt C. ' > rt -o 4-1 ·1 -.1,.. — — — — — — P .·* 2 Ä ^ «2 5 - ^ σχ o -H rvj ^ ro tn OJ - »a· C Μ ™ 1 C Φ CJ rt K£ υ --2------- i rt 3

CM 4J rl σ\ 5· in (\l CO (M

—.« -H «- 00 ro in co (N

3 "J - ^ ^ v *- • st ό p o o m o o - rt -rt m m ~ O « ft -P > I X —.,—______

N oi P

-'’•n in r t— co t— o co (\i < e o Cd C\ N ώ o - H -H «J --.*.*.*. .* O Π ro vo — — ro <- ? s 2 - ä ~ fi — W - —-----TJ.

>H 3

S m C II

°i "J 0) 0 _ e e e C -H r-I -tt ••o rt rt rt rt -ri 7ί -h tn e d > m M Η X U G u> ri rt rt 0) 3 rt a> > g ft S ft ft

I--‘ ' I---L

134 103792 G - -----

0J 3 'vO N >- O' (\ O

p .h , o cu -a- — on — '3 ·Η .-- r- ^ ^ 5 g — o o o — o 3 -p t\j

P P

G <D

(0 Μ·;ΰ >

o O

"CM ·> C7n a- m vO O

h 4- m in 3- m im

^ ” rt ·- . ·< ^ K ^ K

<U •HONS-rronON'-

d ·** iO

5 «

'Zl <D

? K

o --- ------- '—I h O j-j a: -- ro in o cjn •H q C- 3· O' 3· Λ) ^ S o o o o' in' o'

G P

c 0) OT Ä >______

n ιη_ O

ir> ~ > co (N O' t- 3- in <-· Il P σ\ m vo a· co o ftS <

G c! ^ 1 m ιβ s m o N

G Λ <— LH

Ό M

•H <U

0 *4 -P - —------ - ·* 5 oo co a- — r- c\j

S SL T

M *m tp *H ^ ^ ^ ^

^ ^ $ — O O O ro O

O G P

Ai ."G -P 0)

Ai G in m- > G^ JS "S T^«on,, rd | o G 3 LO (M O CM vD Crs

Eh U G .2 ~ ^ U G p -=T O a m — — 1 G CO ' ~ 0 ¢)

Cn G ui H -p---------- 1 m _5 r>. g m ro o a· — t~~

-s1^) '^r-cr^-CMcriM

< -p

Eh O +-0---0000 0 -P ni =* * OM £ I Φ in ^ <! i-» Λ —n—______ ® G II £ 1 -H U1 LOOCrcoO —

O G 3 O O m — o LG

<U — .s ^ _ S <#> ij — σ\ in ro to m ε tn ^ - w g £ . ro o - I * in g ------m-

»-H G

^ O G II

Φ

G G G

G *H *r-| *

•P G G G G *P

*P -P CO G G > tn M ρ λ; p g tn -p <D G <D G G Φ

> 2 ft 2 X K

135 103792 3 ro in co ~ ro o «”· O IT* vO C- O — d ^ ^ i. v ™. o o o oo o o

r* MM

M Z

0) Ä > O ~0-------

CM >lf»vOOOin«-CO

·— H O ? >- (\l C\1 O

id f' * ^ v *> *-, •H o cm cvi =r in o M cm C « a> o> c __«_ •H «m mm mm S' 2 no t— O σ-ν o ro O 1 O N a· iv C3 o 'p. d ~ . . .

.2 "OOOvOOO

Λ M * *

V

C A >

m S r* »“ CM CT> CO CO O

(Y} y ro vo in vo oo σ> m * ... v.

,Η J2 ΟΪ N S(M O

c · S ai •ö *_______ •H rt 0 d h m o m co r- -p m <- o λ o -¾ _. rt *> - ·- . ·. *s »- »- «<1> ΓΓ Jj 0--00--0 > ? 1? ti -5 c «

O ~ A

M ad O " ------— -¾ c Oi + > ro t- ro VO o -- 2 z. « 3 3 7 w £ N ώ ^ ^ ^

Eh U 0) w cj tn e>

1 λ; K

CM O “3” — - --—- Γ“ c *"1 o o c— in >o o xi (0 ’Jj ro ·— in co crv ro fö ij ^ V- ^ *' . — (β Tl o o o m ro o -P 4) * * l ui > * » b -Ö Ä —Π-______

< ·Η ΙΠ P

E-, o μ CO CO LH Γ— crv ·— O -P *j oi in en o in λ 0 M -H ·"·"-»-- *-

1 O) ,¾ CM vO CO t— CM C\J

< ·π in *— -=-^- CO e e 0)

| 0) -H

O C " ; QJ ·Η —. --- s e <#> :· ~ 3 ~ e e -p ω enow _, CC ro^r n id 3 .5 >< -h in M 3 H id id nj id -h n n rHidio 2 -H in e 3 > ω

Vj -n O W ^ii^CCO -rH CC

a>ida>3td<u * * > g η. ς: « « * 136 103792 O ·— σ* m νο ο οο r-J O' Ό ΙΠ CO Ό Ο 2 Ο Ο Ο Ο ΟΟ Ο Μ α> Λ > ο ~Ό-------

(Μ > XlOJOJ^-LnCM

fr; »— m ct» t- r~ - nj Ϊ -H XJ a- ro m vo s ΐί 3 £ O --—---_____ 3 ό fM m in m o (0 q m mm - o - [-1 ^ ^ ·' ► » l 5 o o o o o o c £ * — ® <» Ξ Λ > £ ΟΟ 1------- o jj- ? ® oo »n in o σ> r—I h t— σ' ^ σ c~- .3· 0 * - - ^ - v.

H rj >— =r on m J3- »- -Q -V — — m S £ e ---------- ί or,03 5 c— o in — cm *- m £ $ n - zr m ~ _**—.*—.,**«· ·— ·- *»„

>- ~ ί — OO NO

O C η l-l * -VO c Φ -V Ό ^ > 0 Ή Λ —g------- 31J ΚΪ > o m co t- in vo m λ: σ m ό t\j o co o

Eh qj ^ JJ - - v v ·- r~l(0 J, 1Π VO lf\ r- r- C -M rn *“ rn -h tn <u

0) K

tn -—-s—_______ C m 3 .•O '-j—'-romoo σ\ C '"J ' in o oj — r\/ '»fi S - - - ^ im r. ' o -— o cm o

Hm « * V 5 > 0 tn -C —n—__ en o in ^ ho u £ o - in o o 7 1 mOt~-oo — σ ^ o H ^ ·- ·~ - -^+-> i,» on Ό PO O >— ^ -V UI <M *— S 0) Q) EH -r-i : o e *

Q -H ------tT

· I

e — C II

0< <#> QJ

— - _ e e e

£ 5 -H -H -K

en en ·η m m m m -h <00 7; -Htneo>tn mo w MJVMCtn-m nm oi m o) o m<u

^ o >S&,s«aS

137 103792 3 cm cnj m vo ·- a- •h o m *— \o o cm Ή . *- ·-_ k. ·

O O O O CM O

f* * m

U

a) A > o ~v- cm · t> f> m n m o O' «— H O O' O' CO O' f-

Hj K , , fk . k, k - ·

-Ή O O a- -=Γ O

m X t- v U) c <u •h u:

Cn --——------ 9 3 O' in (M s- m ao

0 'J ο Ό vo o co CM

. ’jj ^

^OOOC-CMO

<- H

G Q) c Ä B -T3------- n > co in θ' ο ο ό m ^ M m « O (M N O' I ( ·*> ·— #- ·— .. k- · •ri o on (m in in o 3 .* a- «- 3 Iff

T) <U

•w « ---------- „ fi Ji m O' r- m (\j on 2 * ^ ^ sr mo o - H Q> *2 - *. . - -. .- .- > C £ +» o o o m — o Η tT> II ^ 0 c « X M CO r- > X C +> —o—— — —--- ™ δ s ^ s ^ ^ ^ 3 -r in * t3 mo in m o <0 I X -H _ ·, J" 1

Eh cj O X in cy 03 -, C J C Iff ΙΟ «- 1 c a)

cn id K

^ rtj 3 ““ xi +j '“J o CM r— 'jo m o ro ω '2 o m m (v i\j o — 3 S ·--·-*>·»- ·-

ix t3 tJ’-OOincMO

I -H 4, Γ-. ° > —' -P „ ax A —ry——— —---j S a> in > EH Γ-l u Γ in (M o o in ΙΟ C C (rtSJ — OCMCOC— Q a> -x ^ v - I G },£ CM Ό ~ O ·— >— : £ g * 10 ~ e -p * co 3 in —---- mm3 m X 3 3 r-ι io in qj ^ -1-1 O 3 3 ^

.5 H -H rH

Σ) id io 3 as in u

2 H «0 C 3 > -X

^ »HiiXCmiu c <U id CU 3 (d oc * > ε Λ 2 « 138 103792 III - •JO ·ιΗ :o3 ro fO en Ln r\i ο > .μ oo ro tn γμ m '« ^ o- o" d" :<T3 -~Q) p C ' a > M______ ω _ --- e Z i •h ^ -h co <— m n> r-^ g ϋ O M "d" o *- o 3 S > or ^ ^ or ^ 3 --¥-*-----

M -H

td w m •n :ro +j m r— co m m > j_l o vo o> s- cm e -H 4) Γ) * * QJ :rd'>i—I*- oooo e a -------- 'H ^ 1

tjl ,— ·>Η CO

O Ji O ^ ώ O' 5· ΙΟ m en > »- e— O ~ no 0 <1) M ·=Γ ·-. u «. «.

•H « (0 ^ VO CO CO CM

XI -------

C -H

·· :rö rO vO

3 :ro+j «— σ\ m mo ►O k* M t— e— * »— r-- M d> 3 ·_ ». o · r~ >>-100^00 r-l di —-- < C 1 -H e— ΟΊ m3 LO O — ·— f- ·— s- ΜΊΟ II ^>-vO*,CMC3 c «m ** o ·- v

>0 ^ ^ CM CO *— in f\J

O « CP

a; ai ^ i Λί l-ι (0 -H pr·, - m -5 « 5 °ι ϊ ^ £ ®

Λ :id tn x: Φ 3 <p rZ ° rZ rZ

H C « > M * - * C O

..o 00------ 2 c ^ -H tn cm - 1 ro «o ^ cvj cx\ ~ m O . tn > *~ *-- *~ *“ in 0«d dJ 5-i S'-0 *' . ι-p «ro m — — VO ^r O tn -Ό— """ " —

Cp 3 -H

m t) id | -H μ) MO MO MO MO ΙΠ

o μ MO -=T >- O -=T

-J 4J <U 3 ^ * - i

f£ M X > M CM O’— CM O

S (U 11,1 -— 1

Eh -m ~ I

0 C cm -h m *- m q-h ΛΙ o m o *— cm r— 1 tn > — — in σ> < ^ m ^ o o ~ .

; dt#> « rd no 1— *— o no

.. O I

►3 tn -h j-·^ p (Ο (Ο (Ο Ή ? r-3 C-Htng3tn

,-H UI -H 11 M « -H C C -H II

~-JO Mid) <d id 3 tl) Q) _H | > S K S C «e 139 103792 Π ΓΓ ·η m — m ττ l; S (ts o rr -c u? ^ c > ti ^ ^ - =>- ? I % 11_____ E ^'u^r^-cor- 3 -H CO O tO Ο Γ".

3 uj > ei" vi" te"- rs*" r-"

nj Φ M

M _.äJS_____L_ ιΰ i

»0 '2 O

:rti jj oo co O *- o S > £ ^ ~ ^

C /J <L) 3 -Τ' _v . *- O

• H % O O - * O

O'

5 Z -H

n i; o t— 3^ tn f- O

CO > ·* VO C\J C\J LO

HJ n Φ M — *--··-«..

O ^re—vOONOOCM

λ; g - “—---

4J .. I

«5 G -H

•n >3 mj <0 — r- :« -P m — tn o *- r~ p o o oo tn — rH i Qj 3 *·~ ·~- · -* - »- H :5>pH---oo mg 0. -— - ———----

m G . I

> x) *H O CO

•H tO O Cn O O CO CO

0 0 n to > (M «~ cr> en M -)-> C ΦΜ»— — O . ,

ϋ Λ t? i< C\J r— — CM

G Q) " -I I. - .. ..I ... .1. ---

i—I -n rö I

3 G ·P Ή (0 -H 03 <0 ^ N £ C\J r- — O r- c S jjj 3 O cv o in m ”0 Ä >-< (O'- ~ d" o' en C - TJ· e =3 Λ ^ " _h cv — n

Uic * 0 =- CO tn o ~

.· Ι-P « > CO

u in ΦΜ C *'-*- m d fctjioCM*— <— Lom M X( i I -H -H .

o (fl ^~ jj hj iti — e- m cv C «* M --m — coo g Φ <1> 3 O -

E-ι -n r· t> l—· * *“ ’ * O

o e _---- - -

? 'H Kj ' M - O

< _ 2 o CV in CO Ϊ— m : ** ω > d~‘ -" cT ° ~ o tn S. _ g * . 3 »*: « 00 ^ c~- m »o to " 1 1PH v - — ' I -.- i .- i f" 3 , <" 3 -H _ ’"ί. “ G fö (β (TS -rH - ° -rH -rH to g 3 to ..

M u M -H G G -H

w 0) mmoo o_ _I > g a se k -

Claims (58)

103792 Patentoivaatimukset

1. Yhdiste, jonka kaava on ,-/3 V R2-// \\-(CH2)-c-N K-Q n h R4 10 , 0 (IA) Q jossa kukin Q on itsenäisesti vety tai (CHR5)pC02R, Q1 on vety tai C02R, kukin R on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli, 15 sillä edellytyksellä, että ainakin kaksi substituenteista Q ja Q1 on muita kuin vetyjä ja että kun Q1 on vety niin R3 on muu kuin vety, kukin R5 on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli, n on kokonaisluku nollasta viiteen, 20. on 1 tai

2, R2 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatti-, semikar-batsidi-, tiosemikarbatsidi-, maleimidi-, bromiasetamidi-tai karboksyyliryhmä, . R3 on C^-alkoksi, -0CH2C02H, hydroksi tai vety,

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, jossa R ja R5 ovat molemmat vetyjä.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, jossa R on vety ja R5 on metyyli.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, jossa R3 ja R4 ovat vetyjä ja Q1 on C02R, jossa R on patenttivaatimuksessa 1 määritelty.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, jonka kaava on io Q /"3 h R2-(/ Λ-(CHj)-c-M N-Q 15 " H (II) Q jossa kukin Q on itsenäisesti vety tai CHR5C02R, kukin R on itsenäisesti vety tai C1_4-alkyyli, 20 sillä edellytyksellä, että ainakin kaksi substituenteista Q on muita kuin vetyjä, m on kokonaisluku nollasta viiteen, R2 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatti-, semikar-. batsidi-, tiosemikarbatsidi-, maleimidi-, bromiasetamidi- 25 tai karboksyyliryhmä, R3 on Cx_4-alkoksi, -0CH2C02H tai hydroksi, R4 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatti-, semikar-batsidi-, tiosemikarbatsidi-, maleimidi-, bromiasetamidi-tai karboksyyliryhmä ja 30 kukin R5 on itsenäisesti vety tai C1.4-alkyyli, sillä edellytyksellä, että R2 ja R4 eivät molemmat voi olla vetyjä mutta toisen niistä on oltava vety; tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen yhdiste, 35 103792 jossa R2 on vety ja R4 on nitro-, amino-, isotiosyanaatti-, semikarbatsidi-, tiosemikarbatsidi-, maleimidi-, bromiasetamidi- tai kar-5 boksyyliryhmä; tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen yhdiste, joka on 1-(2-metoksi-5-aminobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklodo-dekaani-4,7,10-trietikkahappo.

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen yhdiste, joka on 1-(2-hydroksi-5-aminobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklo-dodekaani-4,7,10-trietikkahappo.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, jonka kaava on 15 Λ Q R2-// \\-(CH2)-c-M N-0

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen yhdiste, jossa R on vety tai R5 on C^-alkyyli.

12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen yhdiste, jonka kaava on 10 ? s /hC "s" ^ (VI) Q jossa kukin Q on itsenäisesti vety tai CHR5C02R ja 20 kukin R on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli, sillä edellytyksellä, että ainakin yksi Q on muu kuin ve ty, m on kokonaisluku nollasta viiteen, R2 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatti-, semikar-25 batsidi-, tiosemikarbatsidi-, maleimidi-, bromiasetamidi- tai karboksyyliryhmä, R3 on C^-alkoksi, -0CH2C02H, hydroksi tai vety, R4 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatti-, semikar-batsidi-, tiosemikarbatsidi-, maleimidi-, bromiasetamidi- 30 tai karboksyyliryhmä ja kukin R5 on itsenäisesti vety tai C1_4-alkyyli, sillä edellytyksellä, että R2 ja R4 eivät molemmat voi olla vetyjä mutta toisen niistä on oltava vety; tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola. 103792

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen yhdiste, jonka kaava on Q 5 2 /ΓΛ ?02R \ / n H 10 (VII) Q jossa kukin Q on itsenäisesti vety tai CHR5C02R ja kukin R on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli, sillä edellytyksellä, että ainakin yksi Q on muu kuin ve-15 ty, m on kokonaisluku nollasta viiteen, R2 on nitro-, amino-, isotiosyanaatti-, semikarbatsidi-, tiosemikarbatsidi-, maleimidi-, bromiasetamidi- tai kar-boksyyliryhmä ja 20 kukin R5 on itsenäisesti vety tai C1_4-alkyyli ; tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen yhdiste, joka on a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklo-dodekaani-1-(R,S)-etikka-4,7,10 -tris(R-metyylietikka)hapon 25 l-isopropyyli-4,7,10-trimetyylilesteri.

15. Patenttivaatimuksen 13 mukainen yhdiste, joka on a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklo-dodekaani-1-(R,S)-etikka-4,7,10-tris(R-metyylietikka)happo .

16. Patenttivaatimuksen 13 mukainen yhdiste, joka on o-[2-(4-isotiosyanaattifenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1-(R,S)-etikka-4,7,10-tris(R-metyylietikka) happo. « 103792

17. Patenttivaatimuksen 13 mukainen yhdiste, joka on a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklo-dodekaani-1,4,10-trietikkahapon ammonium-kaiiumsekasuola.

18. Patenttivaatimuksen 13 mukainen yhdiste, joka 5 on o-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani- 1,4,7-trietikkahappo.

19. Patenttivaatimuksen 13 mukainen yhdiste, joka on a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani- 1.4.10- trietikkahappo.

20. Patenttivaatimuksen 13 mukainen yhdiste, joka on a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani- 1.4.7.10- tetraetikkahappo.

20. H (V) Q jossa . kukin Q on itsenäisesti vety tai CHR5C02R,

21. Patenttivaatimuksen 13 mukainen yhdiste, joka on a-(4-isotiosyanaattifenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklo- 15 dodekaani-1,4,7,10-tetraetikkahappo.

22. Patenttivaatimuksen 13 mukainen yhdiste, joka on a-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklo-dodekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon 1,4,7,10-tetrametyy-liesteri.

23. Patenttivaatimuksen 13 mukainen yhdiste, joka on a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklo-dodekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon 1,4,7,10-tetrametyy-liesteri.

24. Patenttivaatimuksen 13 mukainen yhdiste, joka 25 on o-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklo- dodekaani-1,4,7,10 -1etraetikkahappo.

25. Patenttivaatimuksen 13 mukainen yhdiste, joka on a-[2-(4-isotiosyanaattifenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahappo.

25 Q1 on vety tai C02R ja kukin R on itsenäisesti vety tai C1_4-alkyyli, sillä edellytyksellä, että ainakin kaksi substituenteista Q ja Q1 on muita kuin vetyjä ja yksi Q on vety, m on kokonaisluku nollasta viiteen,

25 R4 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatti-, semikar-batsidi-, tiosemikarbatsidi-, maleimidi-, bromiasetamidi-tai karboksyyliryhmä, sillä edellytyksellä, että R2 ja R4 eivät molemmat voi olla vetyjä mutta toisen niistä on oltava vety, . 30 ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat. * 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, tun nettu siitä, että farmaseuttisesti hyväksyttävä suola on kalium-, natrium-, litium-, ammonium-, kalsium-, magnesium- tai vetykloridiadditiosuola. 103792

26. Patenttivaatimuksen 12 mukainen yhdiste, jonka kaava on 103792 Q /—\ C02R \ 1 5 \ /—(CH2)—'z-/ N\Q Rh ^ Q (VIII) 10 jossa kukin Q on itsenäisesti vety tai CHRsC02R, kukin R on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli, sillä edellytyksellä, että ainakin yksi Q on muu kuin vety, 15. on kokonaisluku nollasta viiteen, R3 on C^-alkoksi, -0CH2C02H, hydroksi tai vety, R4 on nitro-, amino-, isotiosyanaatti-, semikarbatsidi-, tiosemikarbatsidi-, maleimidi-, bromiasetamidi- tai kar-boksyyliryhmä ja 20 kukin R5 on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli; tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

27. Patenttivaatimuksen 26 mukainen yhdiste, joka on a-(2-metoksi - 5-nitrofenyyli)-1,4,7,10 -tetra-atsasyklo-dodekaani-1,4,7,10-tetraetikkahappo.

28. Patenttivaatimuksen 26 mukainen yhdiste, joka on a-(2-metoksi-5-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklo-dodekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon tetra-ammoniumsuola.

29. Patenttivaatimuksen 26 mukainen yhdiste, joka on a-(2-metoksi-5-isotiosyanaattifenyyli)-1,4,7,10-tetra- .· 30 atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon tetra-ammo niumsuola.

30. Kompleksi, joka sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaisen yhdisteen, jolla on kaava IA, tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan kompleksoi- 35 tuneena metalli-ionin kanssa, joka on La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Y tai Se. 103792

30 R2 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatti-, semikarbatsidi-, tiosemikarbatsidi-, maleimidi-, bromiasetamidi-tai karboksyyliryhmä, R3 on C1.4-alkoksi, -0CH2C02H, hydroksi tai vety, R4 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatti-, semikar-35 batsidi-, tiosemikarbatsidi-, maleimidi-, bromiasetamidi- 103792 tai karboksyyliryhraä ja kukin R5 on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli, sillä edellytyksellä, että R2 ja R4 eivät molemmat voi olla vetyjä mutta toisen niistä on oltava vety; 5 tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

31. Patenttivaatimuksen 30 mukainen kompleksi, jossa metalli-ioni on Sm, Lu tai Y.

32. Patenttivaatimuksen 30 mukainen kompleksi, jossa metalli-ioni on 153Sm, 166Ho, 90Y, 149Pm, 159Gd, 140La, 177Lu, 5 175Yb, 47Sc tai 142Pr.

33. Patenttivaatimuksen 32 mukainen kompleksi, jossa metalli-ioni on 153Sm, 177Lu tai 90Y.

34. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 30 - 33 mukainen kompleksi, jossa metalli-ioni on kompleksoitunut 10 patenttivaatimuksen 6, 7, 10, 12, 13 tai 26 mukaisen yhdisteen kanssa.

35. Patenttivaatimuksen 32 mukainen kompleksi, jossa metalli-ioni on kompleksoitunut patenttivaatimuksen 20 mukaisen yhdisteen kanssa.

36. Patenttivaatimuksen 35 mukainen kompleksi, jos sa metalli-ioni on 153Sm tai 90Y.

37. Patenttivaatimuksen 32 mukainen kompleksi, jossa metalli-ioni on kompleksoitunut patenttivaatimuksen 21, 24 tai 25 mukaisen yhdisteen kanssa.

38. Patenttivaatimuksen 37 mukainen kompleksi, jos sa metalli-ioni on 1S3Sm kompleksoituneena patentti- vaatimuksen 21 mukaisen yhdisteen kanssa.

39. Patenttivaatimuksen 37 mukainen kompleksi, jossa metalli-ioni on 153Sm, 90Y tai 177Lu kompleksoituneena pa- 25 tenttivaatimuksen 24 tai 25 mukaisen yhdisteen kanssa.

40. Patenttivaatimuksen 32 mukainen kompleksi, jossa metalli-ioni on kompleksoitunut patenttivaatimuksen 28 mukaisen yhdisteen kanssa.

41. Patenttivaatimuksen 40 mukainen kompleksi, jos- 3. sa metalli-ioni on 153Sm.

42. Patenttivaatimuksen 32 mukainen kompleksi, jossa metalli-ioni on kompleksoitunut patenttivaatimuksen 29 mukaisen yhdisteen kanssa.

43. Patenttivaatimuksen 42 mukainen kompleksi, jos- 3. sa metalli-ioni on 1S3Sm. 103792

44. Patenttivaatimuksen 32 mukainen kompleksi, jossa metalli-ioni on kompleksoitunut patenttivaatimuksen 15 mukaisen yhdisteen kanssa.

45. Patenttivaatimuksen 44 mukainen kompleksi, jos-5 sa metalli-ioni on 153Sm, 90Y tai 177Lu.

46. Patenttivaatimuksen 32 mukainen kompleksi, jossa metalli-ioni on kompleksoitunut patenttivaatimuksen 16 mukaisen yhdisteen kanssa.

47. Patenttivaatimuksen 46 mukainen kompleksi, josio sa metalli-ioni on 153Sm, 90Y tai 177Lu.

48. Konjugaatti, joka sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaisen yhdisteen, jolla on kaava IA, sillä edellytyksellä, että R2 ja R4 ovat muita kuin nitroryhmiä, tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan kompleksoituneena 15 metalli - ionin kanssa, joka on La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Y tai Se, ja sitoutuneena kovalenttisesti vasta-aineeseen tai vasta-ainefragmenttiin .

49. Patenttivaatimuksen 48 mukainen konjugaatti, 20 jossa metalli-ioni on 153Sm, 166Ho, 90Y, 149Pm, 1S9Gd, 140La, 177Lu, 175Yb, 47Sc tai 142Pr.

50. Patenttivaatimuksen 49 mukainen konjugaatti, jossa metalli-ioni on 153Sm, 90Y tai 177Lu.

, 51. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 48 - 50 mu- » < 25 kainen konjugaatti, jossa vasta-aine tai vasta-ainefrag-mentti on monoklonaalinen vasta-aine tai sen fragmentti.

52. Patenttivaatimuksen 51 mukainen konjugaatti, jossa vasta-aine tai vasta-ainefragmentti on CC-49, CC-49:n F(ab 1)2, CC-83, CC-83:n F(ab')2 tai B72.3.

53. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 48 - 52 mu kainen konjugaatti, jossa yhdiste on patenttivaatimuksessa 6, 7, 10, 12, 13 tai 26 määritelty.

54. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 48 - 52 mukainen konjugaatti, jossa metalli-ioni on 153Sm, joka on 103792 muodostanut kompleksin patenttivaatimuksen 21 mukaisen yhdisteen kanssa.

55. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 48 - 52 mukainen konjugaatti, jossa metalli-ioni on 153Sm, 90Y tai 5 177Lu, joka on muodostanut kompleksin patenttivaatimuksen 25 mukaisen yhdisteen kanssa.

56. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 48 - 52 mukainen konjugaatti, jossa metalli-ioni on 153Sm, joka on muodostanut kompleksin patenttivaatimuksen 29 mukaisen yh- 10 disteen kanssa.

57. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 48 - 52 mukainen konjugaatti, jossa metalli-ioni on 153Sm, 90Y tai 177Lu, joka on muodostanut kompleksin patenttivaatimuksen 16 mukaisen yhdisteen kanssa.

58. Diagnostinen formulaatio, tunnettu siitä, että se sisältää minkä tahansa patenttivaatimuksista 48 - 57 mukaista konjugaattia ja fysiologisesti hyväksyttävää kantajaa. 150 103792