DK175393B1 - Bifunktionelle chelateringsmidler, komplekser deraf, antistof-konjugater omfattende komplekserne samt fremgangsmåde til fremstilling af chelateringsmidlerne - Google Patents

Description

DK 175393 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte bifunktionelle chelateringsmidler med den nedenfor viste almene formel IA, komplekser deraf, antistof-konjugater omfattende disse komplekser samt en fremgangsmåde til fremstilling af chelate-► ringsmidleme.

5

Funktionaliserede chelateringsmidler eller bifunktionelle koordinatorer vides at være i stand til at blive covalent bundet til et antistof, der har specificitet for cancer, tumorcel-leepitoper eller antigener. Radionuklidkomplekser af sådanne antistofrchelaterings-middelkonjugater er nyttige til diagnostiske og/eller terapeutiske anvendelser som mid-10 ler til at overføre radionuklidet til en cancer- eller tumorcelle. Se f.eks. Meares rn.fi.

Anal. Biochem. 142. 68-78, (1984) og Krejcarek m.fl., Biochem. and Biophys. Res.

Comm. 77,581-585 (1977).

Aminocarboxylsyre-chelateringsmidler har været kendt og undersøgt i mange år. Typi-15 ske for aminocarboxylsyreme er nitrilotrieddikesyre (NTA), ethylendiamintetraeddike-syre (EDTA), hydroxyethylethylendiarriintrieddikesyre (HEDTA), diethylentriamin-pentaeddikesyre (DTPA), trans-1,2-diaminocyklohexantetraeddikesyre (DCTA) og l, 4,7,10-tetraazacyklododecantetraeddikesyre (DOTA). Talrige bifunktionelle chelateringsmidler baseret på aminocarboxylsyrer har været foreslået og fremstillet. F.eks. har 20 der været nævnt det cykliske dianhydrid af DTPA [Hnatowich Science 220. 613-615 (1983), US patent nr. 4.479.930] og blandede carboxylsyreanhydrider af DTPA [Gansow, US patenterne nr. 4.454.106 og 4.472.509, Krejcarek m.fl., Biochem. and v Biophys. Res. Com. 77, 581-585, (1977)]. Når anhydrideme kobles til proteiner, forlø ber koblingen via dannelse af en amidbinding og efterlader således fire af de oprindeli-25 ge fem carboxymethylgrupper på diethylentriamin (DETA)-grundskelettet [Hnatowich m. fl., Int. J. Appl. Isot. 33, 327-332, (1982)]. Desuden beskriver de amerikanske patenter nr. 4.432.907 og 4.352.751 bifunktionelle chelateringsmidler, der er nyttige til at binde metalioner til organiske forbindelser, såsom organiske målmolekyler eller antistoffer. Som ovenfor opnås koblingen via en amidgruppe gennem udnyttelse af diami- 30 notetraeddikesyreanhydrider. Eksempler på anhydrider indbefatter dianhydrider af EDTA, CDTA, propylendiamintetraeddikesyre og phenylen-l,2-diamintetraeddikesyre.

I DK 175393 B1 I

I 2 I

I US patent nr. 4.647.447 beskriver flere komplekse salte dannet af anionen af en kom- I

I pleksdannende syre til brug ved forskellige diagnostiske teknikker. Konjugation via en I

I carboxylgruppe i den kompleksdannende syre beskrives, hvilket giver kobling via en I

I amidbinding. I

I 5 I

I I J. of Radioanalytical Chemistry 57 (12), 553-564 (1980) beskriver Paik m.fl. brugen I

I af p-nitrobenzylbromid i en reaktion med en "blokeret" diethylentriamin, dvs. bis-(2- I

I phthalimidoethyl)amin efterfulgt af deblokeringsmetoder og caroxymethylering under I

I anvendelse af chloreddikesyre til dannelse af N'-p-nitrobenzyldiethylentriamin- I

I 10 N,N,N",N"-tetraeddikesyre. Da bindingen sker gennem et nitrogenatom, fås igen et te- I

I traeddikesyrederivat. Konjugation af det bifunktionelle chelateringsmiddel og chelate- I

I ring med indium diskuteres. Substitution på nitrogenatomet beskrives også af Eckel- I

I man m.fl. i J. of Pharm. Sci. 64(4), 704-706 (1975) ved reaktion af aminer, såsom ethy- I

I lendiamin eller diethylentriamin med et passende alkylbromid før carboxymethylering. I

I 15 Forbindelserne foreslås som mulige radiofarmaceutiske billeddannende midler. I

I En anden klasse af bifunktionelle chelateringsmidler baseret på aminocarboxylsyre- I

I funktionalitet er også velkendt fra litteraturen. Således beskriver Sundberg, Meares I

I m.fl. i J. of Med. Chem. 12(12), 1304 (1974) bifunktionelle analoger af EDTA. Repræ- I

I 20 sentative for disse forbindelser er l-(p-ammophenyl)-ethylendiamintetraeddikesyre og I

I l-(p-benzendiazonium)-ethylendiamintetraeddikesyre. Kobling til proteiner gennem I

I para-substituenten og bindingen af radioaktive metalioner til den chelaterende gruppe I

I diskuteres. Forbindelserne er også beskrevet i Biochemical and Biophysical Research I

I Communications 75(1), 149 (1977) og i de amerikanske patenter nr. 3.994.966 og I

I 25 4.043.998. Det er vigtigt at bemærke, at tilknytningen af den aromatiske gruppe til v I

I EDTA-strukturen sker gennem et carbonatom i ethylendiamingrundskelettet. Optisk I

I aktive bifunktionelle chelateringsmidler baseret på EDTA, HEDTA og DTPA er be- I

I skrevet i US patent nr. 4.622.420. I disse forbindelser binder en alkylengruppe den I

I aromatiske gruppe (som indeholder den funktionalitet, som er nødvendig til fastgørelse I

I 30 til proteinet) til carbonatomet i polyaminen, som indeholder den chelaterende funktio- I

I nalitet. Andre omtaler af sådanne forbindelser indbefatter Brechbiel m.fl., Inorg. Chem. I

..............."""τ"τ"η............ - ---jwwww» ->ττ DK 175393 B1 3 25. 2772-2781 (1986), US patent nr. 4.647.447 og international patentansøgning nr.

WO 86/06384.

- For nylig er visse makrocykliske bifunktionelle chelateringsmidler og brugen af deres 5 kobberchelatkonjugater til diagnostiske og terapeutiske anvendelser blevet beskrevet i US patent nr. 4.678.667 og af Moi m.fl. i Inorg. Chem. 26, 3458-3463 (1987). Tilknytningen af aminocarboxylsyrefunktionaliteten til resten af det bifunktionelle chelateren-de molekyle sker gennem et ringcarbonatom i det cykliske polyamin-grundskelet. En binder fastgjort i den ene ende til et ringcarbonatom i den cykliske polyamin er således 10 også fastgjort i sin anden ende til en funktionel gruppe, der er i stand til at reagere med proteinet.

En anden klasse af bifunktionelle chelateringsmidler, der også er værd at bemærke, består af forbindelser, hvori den chelaterende molekyldel, dvs. aminocarboxylsyren i mo-15 lekylet, er knyttet gennem et nitrogenatom til den funktionelle gruppe i molekylet indeholdende den molekyldel, som er i stand til at reagere med proteinet. Som et eksempel beskriver Mikola m.fl. i international patentansøgning nr. WO 84/03698 (offentliggjort den 27. september 1984) et bifunktionelt chelateringsmiddel fremstillet ved omsætning af p-nitrobenzylbromid med DETA efterfulgt af reaktion med bromeddikesyre til frern-20 stilling af aminocarboxylsyren. Nitrogruppen reduceres til den tilsvarende aminograppe og omdannes så til isothiocyanatgruppen ved reaktion med thiophosgen. Disse forbindelser er bifunktionelle chelateringsmidler, der er i stand til at chelatere lanthanider, som kan konjugeres til biorganiske molekyler til brug som diagnostiske midler. Da tilknytningen af binderdelen af molekylet sker gennem et af nitrogenatomeme i amino-25 carboxylsyren, går en potentiel aminocarboxylgruppe tabt for chelatering. Der fremstilles således et DETA-baseret bifunktionelt chelateringsmiddel indeholdende fire (ikke fem) syregrupper. I denne henseende ligner denne klasse af bifunktionelle chelateringsmidler de forbindelser, hvor tilknytningen til proteinet sker gennem en amidgruppe med påfølgende tab af en chelaterende carboxylgruppe.

30

I DK 175393 B1 I

I 4 I

I Camey, Rogers og Johnson har på den 3. internationale konference om monoklonale I

I antistoffer for cancer, San Diego, Californien (4-6/2 1988) vist et sammendrag med ti- I

tlen "Absence of Intrinsically Higher Tissue Uptake from Indium-111 Labeled Anti- I

I bodies: Co-administration of Indium-111 and Iodine-125 Labeled B72.3 in a Nude. I

I I

I 5 Mouse Model" og "Influence of Chelator Denticity in the Biodistribution of Indium- I

I 111 Labeled B72.3 Immunoconjugates in Nude Mice". Deri beskrives biofordelingen - I

I af indium-111 i et kompleks med et EDTA og DTPA bifunktionelt chelateringsmiddel. I

I Tilknytningen af den aromatiske ring til EDTA/DTPA molekyldelen sker gennem en I

I acetatmethylengruppe. Ved et møde [Florida Conf. on Chem. in Biotechnology, 26-29. I

I 10 april 1988, Palm coast, Florida] beskrev D.K. Johnsom m.fl. også bifunktionelle deri- I

I vater af EDTA og DTPA, hvor en p-isothiacyanatobenzyl-molekyldel er knyttet til I

I methylencarbonatomet i en af carboxymethylgruppeme. Tidligere beskrev Hunt m.fl. i I

I US patenterne nr. 4.088.747 og 4.091.088 chelateringsmidler på basis af ethylendia- I

I mindieddikesyre (EDDA), hvori tilknytningen af en aromatisk ring til EDDA molekyl- I

I 15 delen sker gennem alkylengruppen eller acetatmethylengruppen. Forbindelserne anfø- I

I res at være nyttige som chelater til undersøgelse af den hepatobiliære funktion. Det fo- I

I retrukne metal er technetium-99m. Indium-111 og indium 113m omtales også som væ- I

I rende nyttige radionuklider til billeddannelse. I

I 20 EP-A-0 292 689, publiceret 30. november 1988, beskriver substituerede 1,4,7-tris- I

I carboxymethyl-l,4,7,10-tetraazacyclododecaner og deres analoger samt komplekser I

I heraf med metalioner af sjældne jordarter til anvendelse inden for radioterapi. I 1

I EP-A-0 232 751, publiceret 19. august 1987, beskriver tris-carboxymethyl-tetraaza- I

I 30 dodecan-derivater, hvori den ijerde nitrogen-substituent om nødvendigt indeholder en I

I arylalkylgruppe. Ved "aryl" skal der ifølge EP-A-0 232 751 forstås phenyl og substitu- I

EP-A-0 296 522, publiceret 28. december 1988, beskriver funktionaliserede polyamin- I

I 25 chelateringsmidler, som danner komplekser med rhodium. Disse rhodium-komplekser t I

I kan bindes til et antistof eller et antistof-fragment, og de kan anvendes til terapeutiske I

I eller diagnostiske formål. I

--- — — ΊΓ'#“' ' :--" . •▼'jtlir-7·. rw Η '· DK 175393 B1 5 eret phenyl. Foretrukne substituerede phenylgrupper er grupper substitueret med en, to eller tre substituenter valgt blandt halogener, hydroxy, alkyl, alkoxy, carbamoyl og car-boxy. Substituentemes positioner er imidlertid ikke angivet.

5 EP-A-0 255 471, publiceret 3. februar 1988, beskriver forbindelser, der er nært beslægtede med forbindelserne ifølge opfindelsen, og'som både danner metalkomplekser og er i stand til at binde sig til proteiner, herunder antistoffer. Det fremgår imidlertid af skriftet, at forbindelserne udskilles hurtigt, hvilket ikke er hensigtsmæssigt ved behandling af cancer, og som heller ikke karakteriserer forbindelserne ifølge opfindelsen.

10

De kendte forbindelser lider generelt under en utilfredsstillende stabilitet, og det er derfor et formål med opfindelsen at tilvejebringe et kompleks, som ikke så let dissocierer, som hurtigt eliminerers fra hele legemet med undtagelse af det ønskede væv, og som konjugerer med et antistof til opnåelse af de ønskede resultater.

15

Overraskende er komplekserne og/eller konjugateme ifølge opfindelsen forholdsvis stabile (dvs. de dissocierer ikke let), og nogle udviser hurtig clearence fra hele legemet og fra visse organer, som ikke er målorganer, såsom lever, nyrer og knogler.

20 Stabiliteten forøges, hvis der er en ortho-gruppe til stede (CR3 er andet end hydrogen i formlen (1A)). Formålet med ortho-gruppen er at addere en kompleksdannende gruppe, f.eks. hydroxy, til metalionen (f.-eks. Lu). Den forøgede stabilitet ses f.eks. ved at sammenligne eksempel 44 (ikke ifølge opfindelsen) med eksempel 48.1 eksempel 44 er pH-stabiliteten ringe hos en nitro-D03A-Sm-forbindelse, der både har en ikke-ortho- 25 gruppe på phenyldelen og en ikke-acetat-funktion ved Q1. I modsætning hertil er pH-stabiliteten fremragende i eksempel 48 hos en nitro-ortho-hydroxy-D03A-Sm-forbindelse, hvor Q1 er andet end hydrogen og phenyldelen bærer en ortho-gruppe (om-fatteet af opfindelsen). Denne stabilitetsforøgelse er overraskende og kunne ikke forud ses.

30 I DK 175393 B1 I 6

I På lignende måde kan man sammenligne eksemplerne 46 og 50, hvor førstnævnte ikke I

I er omfattet af opfindelsen. Den forøgede pH-stabilitet i eksempel 50 i forhold til ek- I

I sempel 46 skyldes ikke ortho-gruppens elektrondonor-egenskaber og heller ikke den I

måde, på hvilken ortho-gruppen adderes til phenylringen. Derimod er det vigtigt, at der I

I 5 er fire bindende grupper (f.eks. OH-grupper) til stede til kompleksbinding med metal- I

I ler. Når Q1 2 er hydrogen, må der derfor være en ortho-gruppe til stede for at tilvejebrin- I

I ge fire bindende grupper, og således bidrager ortho-gruppen til den samlede binding af I

I metallet og dermed til stabiliteten af komplekset. Således er tilstedeværelsen af COOH- I

I gruppen ved Q1 og/eller en OH- eller COOH-gruppe ved R3 af afgørende betydning for I

I 10 stabiliteten af de omhandlede forbindelser og komplekser. I

I Opfindelsen vedrører hidtil ukendte bifunktionelle chelateringsmidler, der hver især in- I

I deholder en chelaterende funktionalitet og en kemisk reaktionsdygtig gruppe til cova- I

I lent binding til biomolekyler. Opfindelsen angår også bifunktionelle koordinator I

I 15 (BFC)-metalkomplekser og konjugater af komplekserne til antistoffer for at fremstille I

I et radionuklid (såsom samarium-153, lutetium-177 og yttrium-90) mærket antistof. I

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte bifunktionelle chelateringsmidler, I

I som danner komplekser med metalioner, især "radioaktive" metalioner, der har de I

I 20 sjældne jordarters type af kemi. Foretrukne metalioner af de sjældne jordarters type I

I indbefatter La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Y og Sc, og I

I især foretrækker man Sm, Ho, Y og Lu. Foretrukne radioaktive metalioner af de sjæld- I

I ne jordarters type indbefatter 153Sm, 166Ho, MY, 149Pm, 159Gd, 140La, 177Lu, 175Yb, 47Sc I

I og 142Pr, og særligt foretrukket er !53Sm, 166Ho, 90Y og ,77Lu. Andre radioaktive meta- I

I 25 lioner, der kan være af interesse, er 47Sc, ""Tc, l86Re, 188Re, 97Ru, 10sRh, 109Pd, 197Pt, J I

I 67Cu, 198Au, 199Au, 67Ga, 68Ga, n,In, n3mIn, n5mIn, n7mSn og 2,2Pb/212Bi. De således I

I dannede komplekser kan bindes (covalent) til et antistof eller et fragment deraf og an- I

I vendes til terapeutiske og/eller diagnostiske formål. Komplekserne og/eller kon- I

2

I jugateme kan sammensættes til brug in vivo eller in vitro. En foretrukket anvendelse af I

3

li 30 de præparatformede konjugater er til behanding af cancer hos dyr, især mennesker. I

-— ^IIIMI -- , .II'IIIIUM ill I ,-* DK 175393 B1 7

Anvendelse af komplekserne og/eller konjugateme ifølge opfindelsen, der indeholder et ikke-radioaktivt metal til diagnose og/eller behandling af sygdomstilstande, såsom cancer, er også mulig. Sådanne anvendelser kendes for ikke-radioaktive metaller under anvendelse af radiofrekvens til at inducere hypertermi (japansk Kokai Tokyo Koho JP 5 61.158.931) og fluorescens-immunstyret terapi (FIGS) [K. Pettersson m.fl., Clinical

Chemistry 29 (1), 60-64 (1983) og C. meares m.fl., Acc. Chem. Res. Π, 202-209 (1984)].

Nærmere bestemt angår opfindelsen et bifunktionelt chelateringsmiddel, som er ejen-10 dommeligt ved, at det har den almene formel A-TV-tt,, !

\ / lW2/-C--v N-O

15 m H

Q

(IA) hvori 20 den ene af grupperne R2 og R4 er hydrogen, og den anden er nitro, amino eller isothio-cyanato; R3 er CrC4-alkoxy, -0CH2C02H, hydroxy eller hydrogen; 25 hver af grupperne Q uafhængigt er hydrogen eller (CHR5)C02R; Q1 er hydrogen eller C02R; I DK 175393 B1 I 8

hver af grupperne R uafhængigt er hydrogen eller Ci-C4-alkyl, forudsat at mindst tre af I

I grupperne ffa summen af Q og Q1 2 er andet end hydrogen, og at R3 4 og Q1 ikke begge er I

I hydrogen; I

I 5 hver af grupperne R5 uafhængigt er hydrogen eller C]-C4-alkyl, og I

I m er 0,1 eller 2; I

I eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf. I

I 10 I

I På tegningen kan figurerne beskrives som følger: I

I fig. 1-7 og 15-21 viser biofordelingen af l53Sm administreret som et konjugat indehol- I

I dende 153Sm ifølge opfindelsen. Antistoffet CC49-IgG blev anvendt i konjugatet ifølge I

I 15 opfindelsen. Biofordelingen blev bestemt i nøgne mus, som var bærere af LS 174-T I

I tumor. I

I Fig. 8-14 og 22-28 viser biofordelingen af ,53Sm administreret som et konjugat inde- I

I holdende 153Sm ifølge opfindelsen. Konjugatet ifølge opfindelsen anvendte I

I 20 CC49-F(ab')2 som antistoffragment. Biofordelingen blev bestemt i nøgne mus, der var I

I bærere af LS 174-T tumor. I

I Fig. 29-34 viser biofordelingen af ,77Lu som et konjugat indeholdende I

I ,77Lu(PA-DOTMA) eller ,77Lu(PA-DOTA). Konjugatet anvendte CC49-IgG som anti- I

I 25 stof. Biofordelingen blev bestemt i (balb/C) mus, der var bærere af LS 174-T tumor. “ I

Overraskende er komplekserne og/eller konjugateme ifølge opfindelsen forholdsvis I

2

I stabile (dvs. de dissocierer ikke let), og nogle udviser hurtig clearence ffa hele legemet I

3

I og fra nogle organer, som ikke er målorganer, såsom lever, nyre og knogle. I

4

I 30 I

9 DK 175393 B1

Opfindelsen indbefatter udformningen og syntesen af hidtil ukendte bifunktionelle che-lanter, der hver indeholder en chelaterende funktionalitet og en kemisk reaktionsdygtig gruppe til covalent binding til biomolekyler. Opfindelsen angår også fremgangsmåder * til fremstilling af forskellige bifunktionelle koordinator (BFC)-metalkomplekser og 5 bindingen af komplekserne til antistof for at fremstille radionuklid (såsom sama-rium-153, lutetium-177 og yttrium-90) mærket antistof og/eller fragmenter, der er egnede til diagnostiske og/eller terapeutiske anvendelser.

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte bifunktionelle chelateringsmidler, 10 som danner komplekser med metalioner, især "radioaktive" metalioner, der har de sjældne jordarters type kemi. Foretrukne sjældne jordarttypemetalioner indbefatter La,

Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Y og Sc, og især foretrukket er Sm, Ho, Y og Lu. Foretrukne radioaktive sjælden jordarttype metalioner indbefatter 153Sm, 166Ho, ^Y, 149Pm, 159Gd, 140La, 177Lu, 175Yb, 47Sc og 142Pr, og særligt foretrukket 15 er l53Sm, 166Ho, ^ og 177Lu. Andre radioaktive metalioner, der kan være af interesse, er 47Sc, "mTc, 186Re, 188Re, 97Ru, ,05Rh, 109Pd, 197Pt, 67Cu, 198Au, ,wAu, 67Ga, 68Ga, luIn, ll3mln n5mln, U7mSn og 2I2Pb/212Bi. De således dannede komplekser kan forbindes (covalent bindes) til et antistof eller et fragment deraf og anvendes til terapeutiske og/eller diagnostiske formål. Komplekserne og/eller konjugateme kan sammensættes til 20 brug in vivo eller in vitro. En foretrukken anvendelse af de præparatformede konjugater er til behandling af cancer i dyr, især mennesker.

Anvendelser af komplekserne og/eller konjugateme ifølge opfindelsen, der indeholder et ikke-radioaktivt metal til diagnose og/eller behandling af sygdomstilstande, såsom 25 cancer, er også mulige. Sådanne anvendelser er kendt for ikke-radioaktive metaller under anvendelse af radiofrekvens til at inducere hyperthermi (japansk Kokai Tokkyo Koho JP 61.158.931) og fluorescent-immunstyret terapi (FIGS) [K. Pettersson m.fl.,

Clinical Chemistry 29 (1), 60-64 (1983) og C. Meares rn.fl., Acc. Chem. Res. 17, 202-209(1984)].

30

I DK 175393 B1 I

i 10 I

Når der ønskes et konjugat ifølge opfindelsen, skal R2 og R4 være andet end nitro. Når I

I R2 og R4 er nitro, haves et forstadium til bindermolekyldelen (L). Denne forstadiummo- I

I lekyldel kan være enhver molekyldel, som er dannet for R2 eller R4 til fremstilling af I

I forbindelserne med formlen I, og som ikke bindes til et antistof eller antistoffragment. I

I 5 I

I Som anvendt i den foreliggende beskrivelse betyder udtrykket "pattedyr" dyr, som næ- I

I rer deres unger med mælk udskilt af brystkirtler, fortrinsvis varmblodede pattedyr og I

I mere foretrukket mennesker. "Antistof' refererer til ethvert polyklonalt, monoklonalt I

I chimerisk antistof eller heteroantistof, fortrinsvis et monoklonalt antistof; "antistof- I

I 10 fragment" indbefatter Fab fragmenter og F(ab')2 fragmenter, og enhver del af et anti- I

I stof, som har specificitet overfor en ønsket epitop eller epitoper. Når der anvendes ud- I

I trykket "metalchelat/antistofkonjugat" eller "konjugat", skal "antistof' delen indbefatte I

I hele antistoffer og/eller antistoffragmenter, hvorunder semisyntetiske eller genetisk I

I manipulerede varianter deraf. I

I 15 I

I Som anvendt i den foreliggende beskrivelse refererer "kompleks" til en forbindelse I

I ifølge opfindelsen, f.eks. formel I i kompleks med en sjælden jordarttype metalion, især I

I en radioaktiv sjælden jordarttype metalion, hvori mindst et metalatom er chelateret el- I

I ler sekvestreret; "radioaktiv metalionchelat/- antistofkonjugat" eller "radioaktiv me- I

I 20 talionkonjugat" refererer til et radioaktivt metalionkonjugat, som er covalent bundet til I

I et antistof eller antistoffragment, "radioaktiv", når det anvendes sammen med ordet I

I "metalion", refererer til en eller flere isotoper af grundstofferne af den sjældne jordart- I

I type, som udsender partikler og/eller fotoner, såsom 153Sm, l66Ho, 90Y, 149Pm, I59Gd, I

I 140La, 177Lu, 175Yb, 47Sc og I42Pr, udtrykkene "bifunktionel koordinator", "bifunktionelt I

I 25 chelateringsmiddel" og "funktionaliseret chelant" anvendes indbyrdes ombyttelige og I

I refererer til forbindelser, som har en chelantmolekyldel, der er i stand til at chelatere en I

I metalion, og en binder/afstandsmolekyldel covalent bundet til chelantmolekyldelen, der I

I er i stand til at tjene som et middel til covalent fastgørelse til et antistof eller I

I antistoffragment. I

I 30 I

11 DK 175393 B1

Som anvendt i den foreliggende beskrivelse betyder "farmaceutisk acceptabel salt" ethvert salt af en forbindelse med formlen I, som er tilstrækkeligt ugiftigt til at være nyttigt i terapi eller diagnose af pattedyr. Saltene er således nyttige ifølge den foreliggende opfindelse. Repræsentative for de salte, som dannes ved standardreaktioner ud fra både 5 organiske og uorganiske kilder, indbefatter svovlsyre, saltsyre, phosphorsyre, eddikesyre, ravsyre, citronsyre, mælkesyre, maleinsyre, fumarsyre, palmitinsyre, cholinsyre, palmoinsyre, slimsyre, glutaminsyre, d-kamfersyre, glutarsyre, glycolsyre, phthalsyre, vinsyre, myresyre, laurinsyre, stearinsyre, salicylsyre, methansulfonsyre, benzolsulfon-syre, korksyre, picrinsyre, benzoesyre, kanelsyre og andre egnede syrer. Indbefattet er 10 også salte dannet ved standardreaktioner ud fra både organiske og uorganiske kilder, såsom ammonium, alkalimetalioner, jordalkalimetalioner og andre lignende ioner. Særligt foretrukket er saltene af forbindelserne med formlen I, hvor saltet er kalium, natrium, ammonium eller blandinger deraf. Naturligvis kan den frie syre af forbindelserne med formlen I anvendes, også den protonerede form af forbindelserne, f.eks. når car-15 boxylatet er protoneret og/eller nitrogenatomeme, dvs. når HC1 saltet er dannet.

Foretrukne forbindelser med formlen I indbefatter de forbindelser, hvor Q1 er hydrogen, og som har den følgende formel 20 r 3 R^—, f/ \\ fr.T ^_' \ '

\ ) <ch2j-C-N N-Q

" H

25 (H) Q

hvor, hvert Q uafhængigt er CHR5CC>2R, hvert R uafhængigt er hydrogen eller CpCi-alkyl, 30 og m, R2, R3, R4 og R5 har de ovenfor angivne betydninger, eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.

I DK 175393 B1

I 12 I

I I formel II, når R3 og R4 begge er hydrogen, repræsenteres forbindelserne ved følgende I

I formel I

I Q I

I

rN^\ ' I

/ i

Hfc-/' 'N—(CH2)-c-N I

I h I

I (III) Q I

I 10 i

I hvor: I

I hvert Q uafhængigt er hydrogen eller CHR5C02R, I

I hvert R uafhængigt er hydrogen eller CrC4-alkyl, I

I og m og R2 har de ovenfor angivne betydninger, eller I

I 15 et farmaceutisk acceptabelt salt deraf. I

I I formel II, når R2 er hydrogen, repræsenteres forbindelserne ved formlen I

I Q I

I !i ^ I

I U 'S-(CH2>-c---N N-Q I

I R1* " H . I

I 25 U7) Q I

I hvor: I

I hvert Q uafhængigt er hydrogen eller CHR5C02R, I

I hvert R uafhængigt er hydrogen eller CrC4-alkyl, I

I og m, R3 og R4 har de ovenfor angivne betydninger, eller I

I 30 et farmaceutisk acceptabelt salt deraf. I

DK 175393 Β1 13

Andre foretrukne forbindelser med formlen I indbefatter forbindelser, hvor Q1 er C02R og repræsenteres ved formlen r3 ?

Q

10 · (7I> hvor hvert Q uafhængigt er hydrogen eller CHR5C02R, hvert R uafhængigt er hydrogen eller CrC4-alkyl, forudsat at mindst et Q skal være andet end hydrogen, og 15 m, R2, R3, R4 og R5 har de ovenfor angivne betydninger eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.

Nogle foretrukne forbindelser med formlen VI er de, hvor R3 og R4 begge er hydrogen, hvilke forbindelser repræsenteres ved formlen 20

Q

f

---(' ')—-C_N N-Q

25 H

Q

(VII) hvor Q og m er som defineret ovenfor, og 30 R2 er valgt af gruppen bestående af nitro, amino og isothiocyanato, eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.

I DK 175393 B1 I

I 14 I

I Andre foretrukne forbindelser med formlen VI er de, hvor R2 er hydrogen og repræsen- I

I teres ved formlen I

I ? I

I 5 /r3 \ I

I i—\ ?°2R c 7 i

I // \\-(CH2)-C-N N"Q I

I ’;

I Q I

I 10 (VIII) I

I hvor I

I hvert Q uafhængigt er hydrogen eller CHR5C02R, I

I hvert R uafhængigt er hydrogen eller Ci-C4-alkyl, I

I 15 forudsat at mindst to af grupperne Q skal være andet end hydrogen, I

I m, R3 og R5 er som defineret ovenfor, og I

I R4 er valgt af gruppen bestående af nitro, amino og isothiocyanato, eller I

I et farmaceutisk acceptabelt salt deraf. I 1

20 De bifunktionelle chelateringsmidler, der er beskrevet heri, [repræsenteret ved enhver I

I af formlerne IA-VIII] kan anvendes til at chelatere eller sekvestrere sjælden jordarttype I

I metalioner, især radioaktiv sjælden jordarttype metalioner til dannelse af metalion- I

I chelater (også omtalt her som "komplekser"). På grund af tilstedeværelsen af den funk- I

I tionaliserende molekyldel [repræsenteret ved "RI" i formlen IA) kan komplekserne I

I 25 bindes til funktionaliserede bærere, såsom funktionaliserede polymere bærere, eller for- - I

I trinsvis når et kompleks med formlen IA, hvor R2 og R4 skal være andet end nitro, kan I

I være covalent bundet til proteiner eller mere specielt til antistoffer eller antistofffag- I

I menter. De her beskrevne komplekser (repræsenteret ved enhver af formlerne I-VIII i I

I kompleks med sjælden jordarttype metalioner, især radioaktiv sjælden jordarttype me- I

I 30 talioner) kan bindes covalent til et antistof eller antistoffragment, og omtales i den fore- I

I liggende beskrivelse som "konjugater". I

15 DK 175393 B1

Antistofferne eller antistoffiragmenteme, der kan anvendes i konjugateme, der beskrives heri, kan fremstilles ved velkendt teknik. Højt specifikke monoklonale antistoffer kan fremstilles ved hybridiseringsteknik af velkendt art, se f.eks. Kohier og Milstein [Nature 256, 495-497 (1975), og Eur. J. Immunol. 6, 511-519 (1976)]. Sådanne anti-5 stoffer har normalt en højt specifik reaktionsdygtighed. I de radioaktive metalionkonju-gater kan der anvendes antistoffer rettet mod ethvert ønsket antigen eller hapten. Fortrinsvis er antistofferne, der anvendes i de radioaktive metalionkonjugater, monoklonale antistoffer eller fragmenter deraf, som har høj specificitet for en eller flere ønskede epitoper. Antistoffer anvendt til den foreliggende opfindelse kan være rettet mod f.eks.

10 tumorer, bakterier, svampe, viruser, parasitter, mycoplasma, differentieringsantigener og andre cellemembranantigener, patogene overfladeantigener, toksiner, enzymer, allergener, lægemidler og ethvert biologisk aktivt molekyle. Nogle eksempler på antistoffer eller antistoffragmenter er CC-11, CC-46, CC-49, CC-49 F(ab')2, CC-83, CC-83 F(ab')2 og B72.3. [Se D. Colcher m.fl., Cancer Res. 48,4597.4603 (aug. 15, 1988) med 15 henblik på CC-49, CC-83 og B72.3 antistoffer], Hybridomacellelinien B72.3 er deponeret i The American Type Culture Collection (ATCC) og har nr. HB 8108. De forskellige CC antistoffer er beskrevet i amerikansk patentansøgning nr. 7-073.685, indleveret den 15. juli 1987, som er tilgængelig gennem NTIS. De andre murine monoklonale antistoffer binder til epitoper i TAG-72 [et tumorassocieret antigen]. En mere fuldstændig 20 liste over antigener kan findes i US patent nr. 4.193.983, hvortil der henvises. De radioaktive metalionkonjugater ifølge opfindelsen foretrækkes især til diagnose og behandling af forskellige cancerformer.

De foretrukne lanthanid eller pseudo-lanthanid komplekser repræsenteres ved formlen 25 C[Ln(BFC)] (IX) t hvori: Ln er en lanthanid-ion, såsom Ce3+, Pr3*, Nd3+, Pm3+, Sm3+, Eu3+, Gd3+, Tb3+, 30 Dy3*, Ho3*, Er3*, Tm3*, Yb3* og Lu3* eller pseudo-lanthanidmetalion, såsom Sc3*, Y3* og La3* og særligt foretrukne metalioner er Y3*, Ho3*, Lu3* eller Sm3*, BFC repræsen- I DK 175393 B1

I 16 I

I terer en bifunktionel chelant og C repræsenterer en farmaceutisk acceptabel ion eller I

I gruppe af ioner med tilstrækkelig ladning til at gøre hele komplekset neutralt. Hvis I

BFC indeholder fire eller flere negativt ladede molekyldele, så er C en kation eller I

I gruppe af kationer, såsom H*, Li+, Na+, K+, Rb+, Cs+, Mg2+, Ca2+, Sr2+, Ba2+, NH4+, I

I 5 N(CH3)4+, N(C2H5)4+, N(C3H7)4+, N(C4H9)4+, As(C6H5)4+, [(C6H5)3P=]2N+ og andre ' I

I protonerede aminer. Hvis BFC indeholder tre negativt ladede molekyldele, kræves C I

ikke. Hvis BFC indeholder to negativt ladede molekyldele, så er C en anion, såsom F*, I

I cr, Br', r, cio4*, bf4\ H2P04·, hco3\ hco2·, ch3so3\ H3C-C6H4-S03\ PF6·, I

I CH3C02* og B(C6H5)4\ I

I 10 I

Konjugateme ifølge opfindelsen og i nogle tilfælde komplekserne ifølge opfindelsen I

I kan anvendes som et præparat. Præparatet omfatter en forbindelse med formlen LA. med I

antistoffet og/eller metalionen og en fysiologisk acceptabel bærer eller et hjælpestof. I

I Præparatet kan således bestå af en fysiologisk acceptabel bærer med et kompleks (me- I

I 15 talion + ligand), konjugat metalion + ligand + antistof) eller (ligand + antistof). Frem- I

I gangsmåder til fremstilling af sådanne præparater er velkendt. Præparatet kan være i I

I form af en suspension, injicerbar opløsning eller anden egnet form. Fysiologisk accep- I

I table suspenderingsmedier med eller uden tilsætninger kan anvendes. I

I 20 Præparaterne ifølge opfindelsen er i fast form eller flydende form indeholdende det ak- I

tive radionuklid i kompleks med liganden. Disse præparater kan være i form af et ud- I

I styr således, at to komponenter (dvs. ligand og metal, kompleks og antistof eller li- I

I gand/antistof og metal) blandes på det passende tidspunkt før brugen. Hvad enten de er I

I forblandede eller som et udstyr, kræver præparaterne i regelen en farmaceutisk accep- I

I 25 tabel bærer. I

I Injicerbare midler kan være enten i suspensionsform eller opløsningsform. Ved frem- I

I stilling af egnede præparater vil det erkendes, at vandopløseligheden af saltet i almin- I

I delighed er større end syreformen. I opløsningsform er komplekset (eller, når det øn- I

I 30 skes, de adskilte komponenter) opløst i en fysiologisk acceptabel bærer. Sådanne bære- I

I re omfatter et egnet opløsningsmiddel, konserveringsmidler, såsom benzylalkohol og I

17 DK 175393 B1 om nødvendigt stødpuder. Nyttige opløsnings midler indbefatter f.eks. vand, vandige alkoholer, glycoler og phosphonat- eller carbonatestere. Sådanne vandige opløsninger indeholder ikke mere end 50% af det organiske opløsningsmiddel efter rumfang.

5 Injicerbare suspensioner er midler, som kræver et flydende suspenderingsmedium med eller uden tilsætninger som bærere. Suspenderingsmediet kan f.eks. være vandig poly-vinylpyrrolidon, indifferente olier, såsom vegetabilske olier eller højt raffinerede mineralolier, eller vandige carboxymethylcellulose. Egnede fysiologisk acceptable tilsætninger om nødvendigt for at holde komplekset i suspension kan vælges blandt fortyk-10 kelsesmidler, såsom carboxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidon, gelatine og algina-teme. Mange overfladeaktive stoffer er også nyttige som suspenderingsmidler, f.eks. lecithin, alkylphenol, polyethylenoxidaddukter, naphthalensulfonater, alkylbenzensul-fonater og polyoxyethylensorbitanestere.

15 Mange stoffer, der påvirker hydrofiliciteten, vægtfylden og overfladespændingen af det flydende suspensionsmedium, kan hjælpe til at fremstille injicerbare suspensioner i individuelle tilfælde. F.eks. er siliconeantiskummemidler, sorbitol og sukkerarter alle nyttige suspenderingsmidler.

20 En "effektiv mængde" af præparatet anvendes til terapi. Dosen vil variere afhængende af den sygdom, der behandles. Selv om in vitro diagnose kan udføres med præparaterne ifølge opfindelsen, er in vivo diagnoser også inden for anvendelsen af præparater ifølge opfindelsen. Konjugateme og præparaterne ifølge opfindelsen kan også anvendes til radioimmunstyret kirurgi (RIGS), men andre metaller, der kunne anvendes til dette 25 formål, indbefatter også ""Te,11 'in,113mln, 67Ga og 68Ga.

Andre anvendelser af nogle af chelanteme ifølge opfindelsen kan indbefatte magnetisk ressonansbilleddannelse, f.eks. komplekserne med formlen I, især komplekser med formlen VI med Gd+\ fastgørelse til polymere bærere til forskellige formål, f.eks. som 30 diagnostiske midler og fjernelse af lanthanidmetal eller pseudolanthanidmetalion ved selektiv ekstraktion.

I DK 175393 B1 I 18

Den foreliggende opfindelse angiver chelanter, komplekser og antistofkonjugater, I

I hvoraf nogle er mere stabile og/eller har forbedret biofordeling og/eller har hurtigere I

clearance fra legemet end de kendte. I

I 5 En rimelig og almen syntetisk vej til en tolvleddet makrocyklisk bifunktionel chelant I

ifølge opfindelsen repræsenteret ved formlen I indebærer monofunktionalisering af den I

I makrocyklisk fri base (f.eks. 1,4,7,10-tetraazacyklododecan) ved kun et af nitrogen- I

atomerne med en passende elektrofil (f.eks. enhver passende substitueret Qf-halogen- I

I carboxylsyreester). Denne elektrofil skal have en passende bindermolekyldel eller pas- I

10 sende beskyttet bindermolekyldel, som kan muliggøre covalent fastgørelse af den bi- I

I funktionelle ligand til et protein, antistof eller antistoffragment. I

I Det er erkendt i den kendte teknik, at alkyleringsteknik til fremstilling af mono-N-funk- I

I tionelle polyazamakrocykliske forbindelser kan resultere i blandinger af produkter, der I

I 15 er vanskelige at adskille [T. Kaden, Top. Curr. Chem. 121, 157-75 (1984)]. Dette pro- I

I biem er blevet overvundet ved den beskrevne anvendelse af store overskud af makro- I

I cyklisk forbindelse (5-10 ækvivalenter i forhold til elektrofil), hvilket begunstiger dan- I

I nelse af monoalkyleringsadduktet [M. Studer og T.A. Kaden, Helv. Chim. Acta 69, I

I 2081-86 (1986), E. Kimura m.fl. J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1158-59 (1986)]. I

I 20 I

I Andre veje til mono-N-funktionelle polyazamakrocykliske forbindelser indebærer I

I langvarig beskyttelse, fimktionalisering og ijemelse af beskyttelse [P. S. Pallavicini I

I m.fl., J. Amer. Chem. Soc. 109, 5139-44 (1987), M.F. Tweedle m.fl. offentliggjort eu- I

I ropæisk patentansøgning nr. 0232-751]. En nylig rapport om en reduktiv aminering af I

I 25 substituerede phenylpyrudruesyrer og aminer er kommet fra Abbott Laboratories som I

I et sammendrag fra et nyligt møde (D.K. Johnson m.fl. Florida Conf. on Chem. in Bio- I

I technology, 26-29. april (1988), Palm Coast, Florida). I

I Almene syntetiske veje til chelanteme ifølge opfindelsen er beskrevet i synteseskema- I

I 30 eme I-IV i det følgende, og indebærer reaktion af en egnet elektrofil og polyazamakro- I

I cyklen i forskellige støkiometriske forhold, temperaturer og koncentrationer i et pas- I

19 DK 175393 B1 sende organisk opløsningsmiddel. Eksempler på egnende organiske opløsningsmidler er enhver hydrocarbon, der understøtter opløselighed, såsom acetonitril, isopropanol, methylenchlorid, toluen, chloroform, n-butanol, tetrachlorcarbon, tetrahydrofuran, 5% ethanol i chloroform, idet de mest foretrukne er chloroform, methylenchlorid, 5 n-butanol, 1,4- dioxan og acetonitril. Støkiometriske mængder eller næsten støkiometriske mængder af makrocyklisk forbindelse og elektrofil kan anvendes og giver det tilsvarende mono-N-alkyleringsprodukt i et enkelt trin. Temperaturintervallet for reaktionen er fra ca. 0°C til ca. tilbagesvalingstemperatur, fortrinsvis fra 0°C til 25°C. Reaktionstiden indtil afslutning er ca. 1 til ca. 24 timer.

10

Almindelig adgang til substituerede α-halogensyreestere er ønskelig for den samlede brugbarhed af synteseskemaeme Π og IV. En egnet metode indebærer bromering eller chlorering af syrehalogenidet, der udvikles in situ, f.eks. D. N. Harp m.fl. J. Org.

Chem. 40, 3420-27 (1975). Denne metode muliggør udelukkende a-halogenering af al-15 kansyre, der indeholder endog reaktionsdygtige benzylgrupper. En almen metode til substituerede syrehalogenider indebærer reaktion af den organiske syre med thionyl-chlorid eller sulfurylchlorid, f.eks. E. Schwenk m.fl. J. Amer. Chem. Soc. 70, 3626-27 (1944). Begge metoder udnytter den frie carboxylsyre, der ofte står til rådighed fra industrielle kilder.

20

Polyazamakrocykliske forbindelser, såsom 1,4,7,10-tetraazacyklododecan kan fremstilles ved dokumenterede metoder, såsom T. J. Atkins m.fl., J. Amer. Chem. Soc. 96, 2268-70 (1974) og T. J. Richman m.fl., Org. Synthesis 58, 86-98 (1978).

25 Carboxymethylering af den mono-N-funktionelle makrocykliske forbindelse kan udføres ved fremgangsmåden ifølge Desreux under anvendelse af bromeddikesyrederivater og en egnet base [J. F. Desreux, Inorg. Chem. 19,1319-24 (1980)].

Alle udgangsmaterialerne, der kræves til fremstilling af forbindelserne ifølge opfindel-30 sen, kan enten fås fra industrielle kilder eller kan fremstilles efter beskrivelser i litteraturen.

I DK 175393 B1 I

I 20 I

I I det følgende skema I fremstilles forbindelserne med formel I, hvor Q1 er hydrogen. I

I Selv om kun en forbindelse er angivet med de viste udtryk, kan andre lignende mole- I

I kyldele inden for formlen I, hvor Q1 er hydrogen, r = 0 eller 1, n = 0 eller 1 og m = I

I 0-10 også fremstilles ved denne fremgangsmåde. I

Skema I

21 DK 175393 B1

^ rL "'IquA

5 + a_ ’H chc1·»' 25°c j*

16 timer ^I

ho2 ’

2 H H

/ 10 / BrCH2C02CH3, / K2C03 CH3CI*' / 25eCf*17 timer ..

o h COOCH-, V v XN 3 M/C, a2. / ^ coocø3 CH3OB, 25°C, / 2.5 -timer·'· / h2h cooch3 V<ZN ( Tkonc.aci_ 25 /cooch3 80<>c' 2·5 7 XOOCH3 y/ 30

H H C00H

‘^urV- nHCl 35 l

Ncooa I DK 175393 B1 I 22

I I det følgende skema II fremstilles forbindelserne med formlen IA, hvor Q1 er hydro- I

gen. Selv om kun en forbindelse er angivet med de viste udtryk, kan andre lignende I

I molekyldele inden for formlen I, hvor Q1 er hydrogen, r = 0 eller 1, n - 0 eller 1 og m = I

0 til 10, også fremstilles ved denne metode. I

Skema II

23 DK 175393 B1

H

* o^h

K02 H * H

DPd/c, h2, ch3oh / 2)HCl{g)t C2H5OH / 10 * H2* -nflCl 15 BrCH2C02CH3, / K2C03, CH3CN / COOCH, 20 ( 3 _/****Λ

ØX.J

a2" k 25 / cooch3 HCl / kone. /

/ COOB

30 / r

£ ( COOH

®X.J' - h2n ^ 35 cooa I DK 175393 B1 I 24

I I det følgende skema III fremstilles forbindelserne med formlen IA, hvor Q1 er C02R. I

I Selv om kun en forbindelse er angivet med de viste udtryk, kan andre lignende mole- I

I kyldele inden for formlen I, hvor Q1 er C02R, m = 0 til 10, n = 0 eller 1 og r = 0 også I

fremstilles ved denne metode. I

25 DK 175393 B1

Skema III Br y—COOH ^>—COOCH3 5 (o) - o - CH3OH y o2h »o2

B\_ H

>—COOCH3 ' 02Κ η ” (§. €>—

BjCOOC

no2 h

H

15 BcCH2C02CH3, \ K2C°3f CB3CN, \ 25eC, 17 timer ' \ 20 02N\/\ COOCH3 r-y '©γ

HjCOOC

H2N ^ /°°«3 k 2 5 ^ [ COOCHj

IQL r·^ COOCH3 kone.. HCl I

“ \ H3COOC ^HsY \ k 1 ' tYrY- aooc 'v.J •3BC1 k

COOB

35

I DK 175393 B1 I

I 26 I

I I det følgende skema IV fremstilles forbindelserne med formlen II, hvor Q* er I

I CHR5C02R. Selv om kun en forbindelse er angivet med de viste udtryk, kan andre lig- I

I nende molekyldele inden for formlen II, hvor Q1 er CHR5C02R, også fremstilles ved I

I denne metode. I

I 5 I

I I skema IV kan det viste reagens indeholdende A' være enhver egnet bortgående gruppe I

I for en α-syre, dvs. A' er phenyl eller CF3. I

I Anvendelse af et optisk aktivt alkyleringsmiddel har minimeret de diastereomere og I

I 10 forenkler syntesen. Isolering af en enkelt diastereomer, som ville give et enkelt let ren- I

I set lanthanidkompleks, ville være ønskelige til radiochelatering og til antistof- I

I konjugation. I

27 DK 175393 B1

Skema IV

H ar ’ cooch(ch3)2

£> · @ — ν'β\ G

• T (80%) xA/y,, h-h H M02 ' \ (h3c)2chooc 10 K2C03, 10 CH3CH(50-95%) ^+ H3C COOCB-,

X

H3c Cooch3 0 15 028 V^S * 'V 0 = S=0

Dl r-^ lp.3 I

(HjCIjCHOOC \C00CH3 20 8 7>CB3 cooch3

pd/c, a2 1 ch3os I

25 a3C cCOCBj H3c COOH

Xh> (H3C)2CB00C ^hs/^ cqoce Cooa 30 I cooca3 8 y*CH3 ^pnc. SCi-„ H T^«3

cooca3.. COOH

35

I DK 175393 B1 I

I 28 I

I I følgende skema V fremstilles forbindelserne med formlen IV, hvor Q1 er hydrogen el- I

ler CHR5C02R og R2 er hydrogen. Selv om kun to forbindelser er angivet med de viste I

I udtryk, kan der ved denne metode også fremstilles andre lignende molekyldele inden I

I for formlen IV, hvor Q! er hydrogen eller CHR5C02R. I

29 DK 175393 B1

Skema V

B

OR , B OR R, Λ*- - ,n.

l\__ΛΙ + H"F V B R » B, Dioitan · 02H B / R'· B, / R β CBj, S R- = C02CB3 R· 8 H, COOCB3 R* e / 10 / BrCB2COOB BrCB2COOCB3

/ * T

* CB2COOCH3

ch2coob CH30 I

15 f c''1* ^ ^»-CHjCOOCBj

At^jcH2COOB ©TV

I T CS2C00CH3 T CH2C00B 0,„

A

°2ΐί (1) BC1, 90-100°C

20 (2) Pt02/H2

Pt02/H2

T

'T

CH2COOB CHjCOOH

25 oa I CB30 I

1 1

/ H N-CH,COOH /V L_—K H-CB,COOH

oT ^ [DJ‘V

CB2COOB CH2COOH 1 35

B2H B2N

I DK 175393 B1 I

I 30 I

I Den elektrofile molekyldel ("R1" i formlen) kan også fremstilles på i og for sig kendte I

I måder. Sådanne måder kan findes i Acc. Chem. Res. 17,202-209 (1984). I

Radionuklider kan fremstilles på flere måder. I en kernereaktor bombarderes et nuklid I

I 5 med neutroner til dannelse af et radionuklid, f.eks. I

I Sm-152 + neutron -* Sm-153+7 I

I En anden metode til at fremstille radionuklider er, at bombardere nuklider med partik- I

I 10 ler i en lineær accelerator eller en cyklotron. Endnu en anden måde er, at isolere radio- I

I nuklidet fra en blanding af fissionsprodukter. Fremgangsmåden til fremstilling af nu- I

I klideme, der anvendes ifølge opfindelsen, er ikke afgørende for denne. I

I Konjugateme ifølge opfindelsen kan fremstilles ved først at danne komplekset og derpå I

I 15 binde antistoffet eller antistoffragmentet. Fremgangsmåden indebærer således fremstil- I

I ling eller fremskaffelse af liganden, dannelse af komplekset med metallet og derpå til- I

I sætning af antistoffet. Alternativt kan en fremgangsmåde til fremstilling af mærkede I

I antistofkonjugater indebære først konjugering af BFC til antistoffet og dets påfølgende I

I chelatering til dannelse af det radionuklid-BFC mærkede Ab. Enhver egnet frem- I

I 20 gangsmåde, som resulterer i dannelsen af konjugateme ifølge opfindelsen, ligger inden I

I for opfindelsens rammer. I

I 30 'H og l3C NMR spektre blev tilvejebragt ved anvendelse af et Varian VXR-300, Bruker I

I APC 300, IBM/Bruker NR-80 eller et Jeol FX400 spektrometer. Alle spektre blev op- I

I de følgende eksempler er anvendt følgende udtryk og betingelser med mindre andet er I

I angivet. I

I 25 I

I Massespektre blev tilvejebragt på enten et Finnigan TSQ massespektrometer (Q*MS I

I modus) eller et VG ZAB-MS massespektrometer med høj opløsning (hurtig atombom- I

I bardement med xenon under anvendelse 3:1 dithiotreitokdithioerythritol). I

31 DK 175393 B1 taget ved 30°C med mindre andet er anført. 'H NMR blev udført ved henholdsvis 300 MHz, 80 MHz eller 400 MHz for det ovenfor anførte udstyr. ,3C NMR blev udført ved henholdsvis 75 MHz, 20 MHz eller 100 MHz med det ovenfor anførte udstyr. Værdierne for NMR er δ versus TMS (tetramethylsilan), eller når D20 var opløsningsmidlet 5 versus DSS (2,2-dimethyl-2-silapentan-5-sulfonsyre, natriumsalt).

Infrarøde spektre (IR) blev optaget på et Nicolet 5SX FT/IR instrument.

Til de kromatografiske fremgangsmåder var de fleste opløsningsmidler Fischer materi-10 aler af HPLC kvalitet. Ammoniumacetat blev købt fra Aldrich. Vand blev renset ved anvendelse af et Bamstead NANOpure® vandfiltreringssystem. Præparativ kromatografi af organiske forbindelser blev udført enten ved normal tyngdekromatografi under anvendelse af standardteknik eller ved lynkromatografi som beskrevet af C. W.

Still m.fl., J. Org. Chem. 43, 2923-24 (1978). Der blev anvendt følgende opløsnings-15 middelsystemer:

Opløsningsmiddelsvstem Komponenter

1 CHCl3:CH3OH:konc. NH4OH

2:2:1

20 V:V:V

2 CHCl3:CH3OH:konc. NH4OH

12:4:1

V:V:V

3 CHCl3:CH3OH:konc. NH^OH

25 16:4:1

V:V:V

4 CHCJ3:CH3OH:konc. NH4OH

4:2:1

V:V:V

30 5 CHCl3:CH3OH:konc.NH4OH

3:2:1 I DK 175393 B1

I 32 I

I V:V:V I

I 6 CHCl3:CH3OH:konc. NH4OH I

I 7:3:1 I

I V:V:V I

I 5 7 saltvand (0,85% NaCl i destilleret vand):konc. I

I NH4OH I

I 4:1 I

I V:V I

I 8 CHC13 :CH3OH :konc. NH4OH I

I 10 4:4:1 I

I V:V:V I

I Rf værdier er anført under anvendelse af disse opløsningsmiddelsystemer og i handelen I

I værende normal fase, silica TLC plader [GHLF 250 micron, Analtech Inc. eller Merck I

I 15 kiselgel 6OF254). Præparativ søjlekromatografi blev udført under anvendelse af Merck I

I kvalitet 60,60 A silicagel. I

I Alle procenter er efter vægt med mindre andet er anført. I

I 20 Nogle faste stoffer blev tørret under anvendelse af roterende inddamper (Buehi 461) I

I og/eller en vakuumovn ved en temperatur på ca. 55-60°C i flere timer. Desuden blev I

I anvendt en Virtis model 10-010 automatisk frysetørrer eller Speed Vac® koncentrator I

I til fjernelse af opløsningsmiddel. I

I 25 Samarium-153 og lutetium-177 blev fremstillet med researchreaktoren, University of I

I Missouri (Colombia, MO). Yttrium-90 blev købt fra Oak Ridge National Laboratory. I

I l-(4-isothiocyanatobenzyl)diethylentriaminpentaeddikesyre (SCN-Bz-DTPA) blev I

I fremstillet ved en modifikation af fremgangsmåden ifølge M. W. Brechbiel m.fl., I

I 30 Inorg. Chem. 25, 2772-2781 (1986), og renset til dannelse af en enkelt forbindelse på I

I anionbytter HPLC (Q-Sepharose®). Nogle af de anvendte kemikalier blev fremskaffet I

33 DK 175393 B1 fra de viste kilder: N-2-hydroxy- ethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsyre (HEPES), fri syre og natriumsalt blev købt fra Behring Diagnostics (La Jolla, CA), natriumcitrat (attesteret) var fra Fisher Scientific, thiophosgen var fra Aldrich Chemicals, ammoniumacetat, natriumacetat, ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og saltvand med phosphatbuffer 5 (PBS) var fra Sigma Diagnostics.

De anvendte HPLC søjler var: håndpakket Q-Sepharose® (Pharma- cia) enten 1,5 cm x 25 cm eller 2,5 cm x 25 cm, Zorbax® BIO rækken GF-250 (9,4 mm x 25 cm) fra Du Pont Instruments, Vydac® (varemærke for the Separations Group, Hesperia, CA) pro-10 tein C-4 (4,6 mm x 25 cm) fra the Separation Group (Hesperia, CA), og Mono-Q® og SP-Sephadex® (handelsnavn for Pharmacia Biotechnology Products) fra Pharmacia. Sep-Pak® (handelsnavn fra Waters Associates) C-18 patron blev købt fra Waters Associates (Milford, MA), Sephadex® G-25 engangssøjler (2,2 ml) fra Isolab Inc.

(Akron, OH) og Centricon®-30 (handelsnavn for Amicon Division, W. R. Grace & 15 Co., Danvers, MA) mikrokoncentratorer fra Amicon.

Der blev anvendt fem HPLC systemer til analyser og prøveadskillelser:

System I bestod af LKB 2150 pumpe og 2152 regulator, en UV detektor - LKB 2238 20 UV Cord, en Berthold LB 506 A HPLC radioaktivitetsovervåger (of the International Berthold Group) og en Gilson fraktionsopsamler 201-202 (Gilson International, Middleton, WI).

System II var udstyret med en autoprøveudtager, WISP 710 B, to pumper (model 510) 25 og en automatiseret gradientregulator (fra Waters Associates), en Perkin-Elmer LC-75 spektrofotometrisk detektor, en Beckman model 170 radioisotopdetektor og en fraktionsopsamler (Frac-100 fra Pharmacia).

I DK 175393 B1 I 34

I 5 System III bestod af to Waters M-6000A pumper med en Waters I

660 opløsn ingsmi ddelprogrammør, en Waters model 481 variabel I

I bølgelængdedetektor og et Waters datamodul og en ISCO frak- I

I tionsopsamler blev anvendt præparativt. I

I 10 System IV var Dionex BioLC® system udstyret med en variabel I

I bølgelængde UV detektor og I

I System V var en Waters model 590 pumpe med en ISCO model 2360 I

I gradientprogrammør og en Dionex variabel bølgelængdedetektor. I

B 15 I

I Til centrifugering og koncentration blev anvendt en Sorvall RT I

I 6000B (køler centrifuge fra Du Pont). En Speed Vac koncentra- I

I tor (Savant Instruments Inc., Hicksville, N.Y.) blev anvendt I

til fjernelse af flygtige opløsningsmidler. Radioaktivitets- I

I 20 målinger blev udført på en Capintec® radioisotopkalibrator I

(varemærke for Capintec Inc.) CRC-12 eller ved væskescinti1 la- I

I tion på Bechman LS 9800 (Beckman Instruments, Inc., Irvine, I

CA) eller på en Canberra 35+ f1erkanalsanalysator stillet I

I overfor en 7,5 cm thal 1 iumdrevet natriumiodidkrystal. I

I 25 I

I I eksemplerne angående dannelse af kompleks blev bestemmelsen I

af procent kompleks udført ved følgende almene ombygningsme- I

I tode, hvor dette er vist. I

I 30 En 10 ml plastsøjle blev fyldt med 1 til 2 ml SP-Sephadex® I

I C-25 harpiks, der blev kvældet i vand. Overskud af vand blev I

I fjernet ved at påføre tryk på toppen af søjlen. Prøveopløsniη- I

I gen (15 μΐ) blev sat til for oven på harpiksen, og derefter I

I blev 2 ml 4:1 (V:V) isotonisk saltvand: koncentreret NH^OH an- I

I 35 vendt som eluent. Eluenten blev opsamlet i et tælleglas. Yder- I

I ligere 2 ml eluent blev anvendt. Efter opsamling af eluent i I

I et andet tælleglas, blev der påført lufttryk på toppen af har- I

35 DK 175393 B1 piksen for at bringe den til tørhed. Den tørrede harpiks blev overført til et tredje tælleglas. Aktiviteten af hvert tælle-glas blev målt med en Nal kildetæller koblet til en Canberra f1erkanalSana 1ysator. Mængden af metallet som kompleks blev 5 anført som procent af den totale aktivitet, der blev fundet i eluenten. Mængden af metal i den frie ikke kompleksbundne tilstand blev anført som procent af det totale metal, der forbliver i harpiksen.

10 Fjernelse af ikke kompleksbundet metal ved ionbvtninq.

En 10 ml plastsøjle blev fyldt med 0,5 ml SP-Sephadex® C-25 harpiks kvældet i vand. Overskud af vand blev fjernet ved at centrifugere søjlen ved 3000 omdrejninger per minut i fire mi-15 nutter. Et rumfang på 200 til 500 μΐ af kompleksopløsningen blev anbragt oven på harpiksen, og glasset blev igen centrifugeret i fire minutter ved 3000 omdrejninger per minut. Det ikke kompleksbundne metal forblev i søjlen, og det kompleks-bundne metal blev elueret med opløsningsmidlet.

20

Fremsti 11 ing. af yttrium kompleks.

Komplekser blev fremstillet ved at fremstille en 3 x 10_4M yt-tr i umop 1øsn i ng i vand (VC13.6h2o, 303,25 g/mol eller Y(0Ac)3, 25 12,1% H2O). Radioaktiv Y3 + opløsning (Oakridge National Labo ratories) blev tilsat for at give den ønskede grad af radioaktivitet. Ti μΐ ligandopløsning {på 0,03M) blev sat til 990 μΐ af Y3+ opløsningen således, at der fremkom et 1:1 mol forhold mellem ligand og metal. Ti gange mængden af ligandopløsning 30 blev anvendt til et 10:1 forhold mellem ligand og metal. pH-værdien blev indstillet til 7,4 under anvendelse af mikroli-termængder HCl eller NaOH. Opløsningen blev så afprøvet for mængden af kompleksbundet yttrium under anvendelse af den ovenfor anførte kationbytter metode.

35

I DK 175393 B1 I

I 36 I

I Fremstilling af samarium kompleks. I

I Samarium komplekser blev dannet som oven for beskrevet for yt- I

I triumkomplekser med undtagelse af, at 3 x 10~4M samarium blev I

I 5 fremstillet ved opløsning af Sm203 (348,7 g/mol) i 0,1M HC1. I

I Radioaktiv Sm-153 blev fremskaffet som en ca. 3 x 10_4M opløs- I

I ning i 0,1M HCl fra the University of Missouri Research Reac- I

I tor, Columbia, Missouri. I

I 10 Følgende definitioner anføres for nogle udtryk, der anvendes i I

I den foreliggende tekst. I

I GI ossarium: I

I 15 Kone. betyder koncentretet, I

I “OAc betyder acetatmolekyldelen, "0C0CH3, I

I TLC betyder tyndtlagskromatografi, I

I DI H2O betyder afioniseret NANOpure® vand, I

I NANOpure® er rent vand fremskaffet fra et Barnstead NANOpure® I

I 20 vandfiltreringssystem. I

I Omgivelsernes temperatur betyder stuetemperatur eller ca. 20 I

I t i 1 ca. 25°C. I

I 25 Natten over betyder fra ca. 9 til 18 timer, I

I LC betyder væskekromatografi, I

I NBS betyder N-bromravsyrei mid, I

I MES betyder 2-(N-morfoli no)ethansu1 fonsyre , I

I HPLC betyder højtydende væskekromatografi, I

I 30 PBS betyder saltvand med phosphatstødpude fra Sigma indehol- I

I dende 120 mM NaCl, 2,7 mM KC1 og 10 mM phosphatstødpude, pH I

I 7,4> I

I SP-Sephadex® C-25 harpiks er en kationbytterharpiks med sul- I

I 35 fonsyrefunktiona1 itet, der forhandles af Pharmacia, Inc., I

I rpm betyder omdrejninger per minut, I

I pD betyder pH, hvor hydrogenet er deutereret, I

37 DK 175393 B1 DOTA = 1,4,7,10-tetraazocyk1ododecan-1,4,7,10-tetraeddikesyre, HEPES = N-2-hydroxyethy1 pi perazi n-N'-2-ethansulfonsyre, BFC * bifunktionel chelant,

Cyclen = 1, A,7,10-tetraazacyklododecan, 5 PA-DOTA = a-[2-(4-ami nophenyl ) ethyl]-1, A ,7,10-tetraazacyk1ododecan -1,4,7,10-tetraeddikesyre, PA-D0TMA = a-[2-{4-aminophenyl)ethyl]-l,4,7,10-tetraazacyklo-dodecan-l-eddikesyre-4,7,10-tris(methyleddike)syre, BA-D0TA *» a-(4-aminopheny1)-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1,4, 10 7,10-tetraeddikesyre, OMe-BA-DOTA = a-(5-amiηό-2-roethoxyphney1)-l,4,7,10-tetraazacyk-lododecan-l,4,7,10-tetraeddikesyre, EA-D03A = l-[2-(4-aminophenyl)ethyl]-l,4,7,10-tetraazacyklodo-decan-4,7,10-trieddikesyre, 15 DTPA = diethylentriaminpentaeddikesyre, SCN-Bz-DTPA = l-(4-isothiocyanatobenzyl)-diethylentriaminpen-taeddikesyre, EDTA = ethy1 end i am intetraeddikesyre, chelant er ækvivalent med ligand, 20 kompleks er ækvivalent med chelat, konjugat betyder chelant eller kompleks covalent bundet til et antistof eller anti stoffragment, og antistoffer betyder CC-49, CC-83 og B72.3 og deres fragmenter, såsom Fab og F(ab,)2· Andre mulige antistoffer er anført i det 25 foregående. Hybridomace11 el inien B72.3 er deponeret i The American Type Culture Collection og har nummeret ATCC HB 8108, og de andre nævnte murine monoklonale antistoffer bindes til epi-toper af TAG-72 et tumor associeret antigen.

i 30 Opfindelsen illustreres nærmere af følgende eksempler, der kun j skal være eksempler på brugen af opfindelsen.

35

I DK 175393 B1 I

I 38 I

I Fremstilling af udqanqsmateri a 1 er. I

I Eksempel A I

I 5 Fremstilling af d,1-2-brom-4-(4-nitropheny1)butansyremethyl- I

I ester. I

I Til en opløsning af 5 ml tetrachlorcarbon og 15 ml (0,2 mol) I

I thionyIchlorid blev sat 10,46 g (0,05 mol) 4-(4-nitrophenyl)- I

I 10 butansyre under en nitrogenatmosfære. Opløsningen blev bragt I

I til tilbagesvaling i en timer med begyndende frigørelse af hy- I

I drogenchloridgas og svovldioxidgas. Til den varme opløsning I

I blev sat 11,0 g (0,06 mol) N-bromravsyreimid i 25 ml tetra- I

I chlorcarbon og tre dråber 48% vandig hydrogenbromidkatalysa- I

I 15 tor. Der blev iagttaget frigørelse af bromgas. Den mørkerøde I

I opløsning blev tilbagesvalet i 35 min. Opløsningen blev afkø- I

I let og hældt i 100 ml methanol under omrøring. TLC analyse I

I (60:40 ethyl acetat:hexan v:v) viste et nyt produkt (Rf = 0,69 I

I si 1 i c iumdi oxidpi ader). Overskud af opløsningsmiddel blev fjer- I

I 20 net ved roterende inddampning, og den mørkerøde olie blev fil- I

I treret gennem en s i 1 i cageIpude (2,5 cm x 12,5 cm) under anven- I

I delse af methylench1 or id som eluent. Afdampning af opløsnings- I

I midlet gav en klar olie, udbytte 15,43 g, som var en 85:15 I

I blanding af titelproduktet og methylester af butansyreudgangs- I

I 25 derivatet. Ti te 1 produktet blev karakteriseret ved: I

I Ih NMR (CDCl3) I

I 8,16(d), 7,38(d), 4,20(dd ) , 3,79(s), 2,88(m), I

I »c NMR (C0C13, 75 MHz) I

I 169,6, 147,5, 129,3, 123,7, 53,0, 44,4, 35,5, 33,0. I

I 30 I

I Eksempel B I

I Fremstilling a-[2-(4-nitropheny1)ethy1]-l,4,7,10-tetraazacyklo- I

I dodecan-l-eddikesyre-l-methylester. I

I 35 I

I Til en omrørt opløsning af 1,72 g (10,0 mmol) 1,4,7,10-tetra- I

I azacyklododecan i 17 ml pentenstabi1 i seret chloroform blev sat I

39 DK 175393 B1 2,07 g (5,82 mmol) d, 1 -2-brom-4-(4-nitropheny1)butansyreroethy1 -ester (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel A) i løbet af fem minutter under en nitrogenatmosfære under omrøring. Reaktionsblandingen blev omrørt i 48 timer ved ca. 25®C. TLC (un-5 der anvendelse af opløsningsmiddelsystem 2 på Analtech silica-gelplader) viste dannelse af ti te 1 produktet (Rf = 0,73). Den gule chloroformopløsning blev påført på en 2,5 cm x 40 cm s i -licagelsøjle til lynkromatografi (forud elueret med 5% met ha-nolisk chloroform), elueret med 250 ml 5% methanolisk chloro-10 form efterfulgt af eluering med opløsningsmiddelsystem 2. Fraktioner indeholdende ren titelprodukt blev forenet og inddampet til dannelse af 2,15 g (5,46 mmol, 94%) af titelproduktet som et lysegult glas. Triturer ing af en chloroformopløs-ning af dette glas med diethylether resulterede i udfældning 15 af et hvidt pulver (smeltepunkt 156-59eC) med analytisk renhed og karakteriseret ved

Ih nmr (cdci3) 8,14(d), 7.39(d), 3,71(s), 3,39(dd), 2,5-3,0(m), 2,08(m), 2,01(m), 20 13C NMR (CDC13, 75 MHz) 172,7, 149,3, 146,4, 129,2, 123,6, 62,3, 51,2, 48,9, 47,2, 45,8, 45,4, 32,8, 30,9.

Eksempel C 25

Fremstilling af 2-brom-2-(4-nitropheny1)ethansyremethylester.

En blanding af p-nitrophenyleddikesyre (25,0 g, 0,14 mol) og thionylchlorid (15,1 ml, 0,21 mol) i tør benzen (100 ml) blev 30 omrørt ved tilbagesvaling under en N3 pude i tre timer. Blandingen blev så inddampet til tørhed i vakuum. Remanensen blev opløst i tetrachlorcarbon og omrørt ved tilbagesvaling under en nitrogenpude. Brom (7,2 ml, 0,14 mol) blev tilsat i små portioner gennem en periode på tre dage til den under tilbage-35 svaling værende blanding. Reaktionsblandingen fik lov at afkøle, og syrechloridet blev mættet med methanol (50 ml tilsat langsomt). Den fremkomne bromester (27 g, 71%) blev udvundet I DK 175393 B1

I 40 I

I som en gul olie ved destillation ved reduceret tryk (kogepunkt I

168eC ved 1,1 mm) gennem en femten centimeter kolonne af glas- I

I spiraler. Strukturen af titelproduktet blev bekræftet ved: I

I 5 1H NMR (CDC13) I

I 8,25(d), 7.81(d), 5,51(s ), 3,86(s). I

I Eksempel D I

I 10 Fremstilling af a-(4-nitrophenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklodode- I

I cand-l-eddikesyre-1-methyl ester. I

I Til 529 mg (2,068 mmol) 2-brom-2-{4-nitrophenyl)ethansyrerne- I

I thylester (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel C) i 20 I

I 15 ml acetonitril blev på en gang sat en opløsning af 354 mg I

I (2,068 mmol) 1,4,7,10-tetraazacyk1ododecan i 20 ml acetonitril I

I indeholdende netop tilstrækkelig meget methanol til at bevirke I

I fuldstændig opløsning. Den fremkomne lyserøde opløsning blev I

I omrørt i 1¾ time og derpå koncentreret i vakuum ved 35eC til I

I 20 et lille rumfang. Denne rå monoestertetraamin blev renset ved I

I kromatografi på silicagel og eluering med 20¾ (w/v) NH4OAC/- I

I CH3OH. Den således isolerede rensede monoestertetraamin, som I

I triacetatsaltet, blev så omdannet til den frie amin. 270 mg i I

I 3 ml vand blev således behandlet ved 0°C med vandig K2CO3 (10 I

I 25 vægt%) til en pH-værdi på 11. Den basiske opløsning blev så I

I ekstraheret med 10 ml chloroform fem gange, og chloroform!age- I

I ne blev forenede, tørret over natriumsulfat og koncentreret I

I til dannelse af 160 mg (42% udbytte) af den ønskede monoester- I

I tetraamin, karakteriseret ved NMR og massespektrometri med I

I 30 hurtigt atombombardement {[M+H]+=366) og ved: I

I Ih NMR (CDC13) I

I 8,12(d), 7,44(d), 4,7 5(S), 3,76(s), 2,67-2,44(m), I

I NMR (CDC13) I

I 35 171,5, 147,6, 144,0, 130,3, 124,0, 67,0, 49,8, 47,9, 46,9, 46,0. I

41 DK 175393 B1

Eksempel E

Fremstilling af N-(2-methoxy-5-nitrobenzy1)-1,4,7,10-tetraaza-cyklododecan.

5

Til en omrørt ch1oroformopløsning (20 ml) indholdende 2,9 g 1,4,7,10-tetraazacyklododecan (16,8 mmol) blev sat en chloro-formopløsning (20 ml) indeholdende 2,1 g 2-methoxy-5-nitroben-zylbromid (8,5 mmol) i en portion. Efter omrøring ved stuetem-10 peratur i tre timer blev reaktionsblandingen filtreret og filtratet koncentreret i vakuum til dannelse af en remanens, som blev kromatograferet (si 1iciumdioxid, opløsningsmiddelsystem 3). Det monoalkylerede produkt blev isoleret i et udbytte på 79% (smeltepunkt 154-156eC) og karakteriseret ved: 15 13C NMR (CDC13) 162,47, 140,63, 127,92, 125,49, 124,53, 109,91, 55,88, 53,25, 50,90, 47,18, 45,45, 45,29.

20 Eksempel F

Fremstilling af N-(2-hydroxy-5-nitrobenzyl)-1,4,7,10-tetraaza- cyklododecan. | 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Til en 1,4-dioxanopløsning (20 ml) af 1,4,7,10-tetraazacyklo- 2 dodecan (2,3 g, 14 mmol) blev sat en dioxanopløsning (15 ml) 3 af 2-hydroxy-5-nitrobenzylbromid (1,2 g, 7 mmol) i en portion 4 under stadig omrøring. Efter flere minutter blev K2CO3 (1 g) 5 tilsat, og omrøringen blev fortsat i en time ved stuetempera- 6 tur. Reaktionsblandingen blev så filtreret, og filtratet kon 7 centreret i vakuum til dannelse af et gult halvfast stof, som 8 blev kromatograferet (søjle) på silicagel og elueret med op- 9 lcsningsmiddelystem 5. Det ønskede monoalkylerede produkt blev 10 isoleret af den sidste 1/3 lysegul eluent, som også indeholdt 11 ureageret am in. Efter koncentration blev den gule olie tr i tureret med CHCI3 (100 ml) og filtreret for at fjerne CHCl3-op- . løseligt aminudgangsmateriale. Slutproduktet blev så isoleret

DK 175393 B1 I

42 I

i reh form som et gult fast stof (1,2 g, 55%), (smeltepunkt I

142-145eC) og yderligere karakteriseret ved: I

13C NMR (D20) I

5 25,04, 25,28, 26,83, 31,80, 36,54, 101,88, 107,22, 110,92, I

111,80, 115,26, 159,99. I

Eksempel G I

10 Fremstilling af 1-[2-(4-nitropheny1)ethy1]-1,4,7,10-tetraaza- I

cyklododecan. I

Til en omrørt opløsning af 3,50 g (20,3 mmol) 1,4,7,10-tetra- I

azacyklodocecan i 50 ml pentenstabi1 i seret chloroform blev

15 dråbevis i løbet af fem minutter under kraftig omrøring og un- I

der nitrogen sat 4,00 g (17,4 mmol) 1-(2-bromethy1)-4-nitro- I

benzen. I

Omrøring blev fortsat i ca. 18 timer ved stuetemperatur (ca. I

20 25°C), hvorefter krystaller af aminhydrobromid udfældede af I

opløsningen. Hele reaktionsblandingen blev påført på en lynsi- I

licagelsøjle (2,5 cm x 45 cm), som forud var elueret med 5% I

methanol i chloroform. 200 ml af denne opløsning blev anvendt I

som eluent efterfulgt af eluering med opløsningsmiddel system I

25 3. Af det ønskede produkt blev adskilt 1,45 g (9,7 mmol) p- I

nitrostyren (Rf = 0,98, opløsningsmiddel system 1). Det ønske- I

de monofunktionelle titelprodukt blev isoleret som en orange- I

gul olie (2,27 g, 7,06 mmol, 40,6%) som størknede ved henstand I

(Rf = 0,73, opløsningsmiddel system 1). I

30 I

En prøve af titelproduktet blev omkrystalli seret af CHClj/cyk- I

lohexan og udviste følgende egenskaber: smeltepunkt = 146,5- I

148,5°C. I 1

*H NMR (CDC13) I

8,13 5 (d, m), 7,395(d, m), 2,9l(t), 2,77(t), 2,72(t), 2,50(t), I

2,60(s ) , I

43 DK 175393 B1 13C NMR (CDCl3, 75 MHz) 148,5, 146,7, 129,6, 123,4, 55,5, 51,4, 46,9, 45,9, 45,1, 33,7.

Eksempel H 5

Fremstilling af 1-(4-ni trobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododecan.

Til 50 ml chloroform blev sat 3,5 g (20,3 mmol) 1,4,7,10-tetra-azacyk1ododecan og 1,7 g (7,87 mmol) p-nitrobenzylbromid, og 10 blandingen blev omrørt under nitrogen i 24 timer ved 25eC. Chloroformopslæmningen af hydrobromidsalt blev så påført på en 2,5 cm x 42,5 cm søjle af lynsilicagel (opløsningsmiddelsystem 3). Der fremkom 2,13 g (6,93 mmol) af titelproduktet som et bleggult, fast stof med analytisk renhed i en udbytte på 88% 15 (Rf = 0,85, opløsningsmiddelsystem 3), smeltepunkt = 128-129eC og yderligere karakteriseret ved

Ih NMR (CDC13) 8,19(d), 7,49(d), 3,69(s), 2,82(t), 2,70(t), 2,59(m), 20 13C NMR C0C13), 75 MHz) 147,2, 128,4, 123,8, 58,8, 51,7, 47,1, 46,3, 45,1.

(Intet eksempel I for at undgå forveksling med senere biologi eksempe 1 numre ) .

25

Eksempel J

Fremstilling af 1-(4-aminobenzy1)-1,4,7,10-tetraazacyk1ododecan.

30 I 10 ml methanol blev opløst 690 mg (2,25 mmol) 1-(4-nitrobenzyl )-1,4,7,10-tetraazacyklododecan (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel H). Til opløsningen blev sat 350 mg 10% palladium på carbon som katalysator. Overskud af hydrogen blev skyllet gennem opløsningen ved 25°C. Inden for 45 min. viste 35 TLC, at titelproduktet var fremstillet (Rf = 0,33 opløsningsmiddel system 3). Kromatografisk rensning af det dannede titelprodukt blev udført på en 2,5 cm x 40 cm lynsi 1iciumdioxid-

I DK 175393 B1 I

I 44 I

I søjle {opløsningsmiddelsystem 3) og gav 480 mg (77%) af titel- I

I produktet som en bleggul klar olie. I

I Titelproduktet som den frie base (103 mg, 0,37 mmol) blev om- I

I 5 dannet til hydrochloridsaltet ved at boble vandfri hydrogen- I

I chlorid gennem ethanolopløsninger af den frie base. Det frem- I

I komne tetrahydrochlor idsal t af ti te 1 produktet efter vask med I

I kold ethanol og tørring i vakuum fremkom i et udbytte på 147 I

I mg (0,347 mmol), smeltepunkt 255-260®C under dekomponer ing og I

I 10 blev yderligere karakteriseret ved I

I (020, pD = 1,9) I

I 7,56(d), 7,47(d), 3,95(s), 3,28(t), 3,23(t) , 3,09(t), 2,96(t) I

I 13C NMR (020, pD = 1,9, 75 MHz) I

I 15 138,3, 134,2, 132,2, 126,0, 58,5, 50,3, 46,7, 44,6, 44,3. I

I Eksempel K I

I Fremstilling af 2-methoxy-5-nitrobenzy1 nitri 1. I

I I

I Til en opløsning af natriumcyanid (6 g, 121,9 mmol) i vand I

I (5,3 ml) ved 70°C blev i små portioner under omrøring sat en I

I varm opløsning af 2-methoxy-5-nitrobenzy1 brom id (25 g, 101,6 I

I mmol) i ethanol (15 ml). Reaktionsblandingen blev så tilbage- I

I 25 svalet i 1¾ time, afkølet og filtreret. Filterkagen blev va- I

I sket med acetonitril, og filtratet blev inddampet i vakuum til I

I dannelse af 2-methoxy-5-nitrobenzylnitril (19,5 g, 100%) som I

I et brunligt fast stof. Produktet blev karakteriseret ved I

I 30 13C NMR (C0C13) I

I 161,4, 141,0, 125,7, 124,6, 119,8, 116,5, 110,2, 56,3, 18,8, I

I 35 I

£__·' ~ ’ ....."· ...... .’- ·»··· -mw~ -Twww!.!.^ DK 175393 B1 45

Eksempel L

Fremstilling af 2-methoxy-5-nitrophenyleddikesyre.

5 En opslæmning af 2-methoxy-5-nitrobenzylnitri1 (19,5 f) (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel K) i koncentreret HCL (20 ml) blev ti 1 bagesval et i tre timer. Efter afkøling blev det rå produkt udvundet ved filtrering og vasket med vand. Det faste stof blev optaget i varm vandig natriumhydroxid og fi 1 — 10 treret varm. Den orange opløsning blev afkølet og syrnet med HC1. Bundfaldet blev filtreret, vasket med vand og tørret til dannelse af 2-methoxy-5-nitrophenyleddikesyre som et hvidt fast stof (15 g, 70%). Produktet blev karakteriseret ved 15 13C NMR (CDCI3-CD3OD)

172,8, 162,5, 140,7, 126,2, 124,7, 124,1, 109,7, 55,8, 35,0. Eksempel M

20 Fremstilling a-brom-(2-methoxy-5-ni trophenyl)eddikesyremethyl-ester.

Til en opslæmning af 2-methoxy-5-ni trophenyleddikesyre (2,266 g, 10,74 mmol) (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel L) i 25 tør benzen (50 ml) blev sat tnionylchlorid (4,0 ml, 54,8 mmol).

Et tørrerør og kondensator blev anbragt på kolben og blandingen blev tiIbagesvalet i to timer. Den fremkomne gule opløsning blev koncentreret i vakuum til et lille rumfang og optaget i tør tetrachlorcarbon. Brom (0,6 ml, 11,6 mmol) blev ti 1 — 30 sat og opløsningen blev tilbagesvalet i to dage under udelukkelse af atmosfærisk fugtighed. Reaktionsblandingen blev koncentreret til et lille rumfang og methanol (50 ml) blev tilsat. Efter afdampning af overskud af methanol i vakuum, blev den fremkomne olie renset kromatografisk (silicagel, methylen-35 chlorid-hexan 4:1). Titelproduktet (2,399 g, 74%) fremkom som en gul olie. Produktet blev karakteriseret ved

I DK 175393 B1 I

I 46 I

I Ih nmr {cdci3) I

I 8,45{dd ) , 8.15(d), 6,95(d), 5,75(s), 3,99(s), 3,78(s). I

I Eksempel N I

I 5 I

I Fremstilling af o-{2-methoxy-5-nitrophenyl)-1,4,7,10-tetraaza- I

I cyk1ododecan-1-eddikesyremethylester. I

I En opløsning af a-brom-(2-methoxy-5-nitrophenyl)-eddikesyre I

I 10 (2,399 g, 7,89 mmol) (fremstillet ved fremgangsmåden i eksem- I

I pel M) i chloroform (10 ml) blev sat til en omrørt opløsning I

I af 1,4,7,10-tetraazacyklododecan (2,72 g, 15,79 mmol) i chlo- I

I roform (50 ml). Blandingen blev omrørt ved stuetemperatur i to I

I timer. Den uklare blanding blev så koncentreret til et lille I

I 15 rumfang i vakuum ved stuetemperatur. Det rå produkt blev ren- I

I set ved kromatografi (silicagel opløsningsmiddelsystem 3). Ti- I

I te 1 forbinde Isen blev udvundet som et gult fast stof (2,60 g, I

I 83%) og karakteriseret ved I

I 20 13C NMR (CDCI3) I

I 170,7, 161,6, 139,9, 125,0, 124,5, 124,2, 110,2, 59,5, 55,5, I

I 50,5, 48,0, 47,3, 45,6, 44,3, 43,5. I

I Eksempel 0 I

I 25 I

Fremstilling af d,1-2-brom-4-(4-nitrophenyl)-butansyreisopro- I

I pylester. I

I 4-(4-ni trophenyl)-butansyre (21,0 g, 0,10 mol) blev sat til I

I 30 en opløsning af tetrachlorcarbon (10 ml) og thionylchlorid (30 I

I ml, 0,4 mol) under en nitrogenatmosfære under anvendelse af I

I fremgangsmåden ifølge Harpp m.fl. J. Org. Chem. 40, 3420-27 I

I (1975). Opløsningen blev bragt til tilbagesvaling i en time I

med begyndende hurtig frigørelse af hydrogenchlorid og svovl- I

I 35 di oxid. På dette punkt blev N-bromravsyreimid (22,0 g, 0,12 I

I mol) tilsat som en opløsning i tetrachlorcarbon (50 ml) og I

I otte dråber 48% vandig hydrogenbromidkatalysator blev sat til I

47 DK 175393 B1 den varme oplosning, hvorefter der blev iagttaget bromfrigørelse. Den mørkerøde opløsning blev tilbagesvalet i yderligere 3 5 min. Opløsningen blev afkølet og hældt i isopropanol (400 ml) under omrøring. TLC analyse (methylenchlorid, silicagel-5 plader) afslørede et nyt produkt (Rf = 0,73). Overskud af opløsningsmiddel blev fjernet, og den mørkerøde olie blev filtreret gennem en lynsi 1 icagelpude (7, 5 cm x 15 cm) under an vendelse af methylenchlorid som eluent. Opløsningsmiddel blev fjernet i vakuum, og den lysegule olie blev påført på en lyn-10 silicagelasøjle (7,5 cm x 45 cm) og elueret med methylenchlorid til dannelse af 25,0 g (0,076 mol) af bromestertitelpro-duktet som en klar olie i et udbytte på 75% som et isopropa-nolsolvat, der indeholdt mindre end 5% ubromeret ester og var karakteriseret ved 15 XH NMR (CDC13) 8,16(d , 2H), 7,3 8(d , 2H), 5,05(septet, IH), 4,14(dd, IH), 2,88(m, 4H) , 2,39(m, 4H), l,29(d, 6H) 13C NMR (C0C13) 20 168,7, 147,7, 129,3, 123,8, 69,9, 45,1, 35,6, 33,0, 21,5, 21,2.

Eksempel P

Fremstilling af a-[3-(4-nitrophenyl)propyl]-l,4,7,10-tetraaza-25 cyklododecan-l-eddikesyre-l-methylester.

Til en omrørt opløsning af 3,137 g (18,2 mmol) cyclen som fri base i 30 ml pentenstabi 1 iseret chloroform blev sat 4,81 g (14, 6 mmol korrigeret) d,l-2-brom-4-(4-nitrophenylJbutansyre-30 isopropy1 ester (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 0) i løbet af 5 min. under en nitrogenatmosfære og under omrøring. Reaktionsopløsningen blev omrørt i 24 timer ved stuetemperatur. TLC analyse (opløsningsmiddelsystem 2) afslørede omdannelse til det monoalkylerede titelprodukt (Rf = 0,78 påvisning 35 med ninhydrin, jod og UV aktivitet). Den gule chloroformopløsning blev påført på en 2,5 cm x 42,5 cm 1yns i 1 i cage 1 søj1e , der forud var elueret med 5% methanolisk chloroform. Eluering med

I DK 175393 B1 I

I 48 I

I 300 ml af dette opløsningsmiddelsystem blev efterfulgt af elu- I

I ering med opløsningsmiddel system 2 og gav fraktioner indehol- I

I dende rent titelprodukt, som blev forenede og inddampet og gav I

I 4,85 g (5,48 mmol) af titelproduktet som fri base i form af en I

I 5 lys olie i et udbytte på 79%, som blev yderligere karakterise- I

I ret ved I

I Ih nmr (coci3) I

I 8,15(d, 2H) , 7,40(d, 2H), 5,07(p, IH), 3,35(dd, IH), I

I 10 2,65-3,0(m, 13H), 2,5-2,64{M, 4H), 2,14(m, IH), 2,00{m, IH), I

I 1,28(dd, 6H) I

I 13c NMR (CDCI3) I

I 171,6, 149,5, 146,5, 129,2, 123,6, 68,1, 62,7, 49.2, 47,5, I

I 45,9, 45,7, 32,9, 31,0, 22,1, 22,0 I

I 15 IR (CDC13) cm"l I

I 3231(N-H), 2978, 2933, 1721 (estercarbony1), 1601, 1512, 1458, I

I 1345, 1108. I

I Hurtigt atombombardement massekspektrum, M/e 422 (M+H)]+, 408, I

I 20 392. I

I Fremstilling af slutprodukter-ligander. I

I Eksempel 1 I

I 25 I

I Fremstilling af <x-(4-nitrophenyl)-l,4,7,10-tetraazacyklododecan- I

I 1,4,7,10-tetraeddikesyre, monomethyl, triethylester . I

I I 46 ml acetonitril indeholdende 4,6 g (33,3 mmol) frisk pul- I

I 30 veriseret vandfri ka1 iumcarbonat blev opløst 700 mg (1,91 I

I mmol) a-(4-nitropheny1)-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1-eddike- I

I syre-l-methylester (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel I

I D) . Til denne suspension blev på en gang sat 1,022 g (6,12 I

I mmol) ethyl bromacetat. Efter fire timers omrøring ved stuetem- I

I 35 peratur blev suspensionen vakuumfiltreret, filterkagen blev I

I vasket med 15 ml acetonitril to gange, og filtratet inddampet I

I i vakuum ved 38eC til dannelse af den rå tetraester som et I

49 DK 175393 B1 purpurfarvet fast stof. Tetraesteren blev så renset ved sili-cagelkromatografi og eluering med 5% C2H50H/CHC13 og derpå opløsningsmiddel system 3 til dannelse af 620 mg (0,988 mmol, 52%) af det ønskede produkt. Dette produkt blev karakteriseret 5 ved hurtig atombombardement massespektrometri ([M+H]+=624) og yderligere karakteriset ved IH NMR (CDC13) 8,24(d), 7,45(d), 4,94(s), 4,35-4,10(m), 3,79(s). 3,75-1,84(m), 10 1.34-l,22(m) *3C NMR (CDC13) ; 174,3, 173,8, 173,6, 171,5, 147,6, 138,9, 131,5, 123,4, 64,8, 61,5, 61,4, 60,2, 55,4, 55,0, 53,1, 52,9, 52,7, 52,4, 51,9, 51,7, 48,8, 48,3, 44,9, 19,1 14,1.

15

Eksempel 2

Fremstilling af a-(4-nitropheny1)-1,4,7,10-tetraazacyk1odode-can-1,4,7,10-tetraeddikesyre.

20 I 30 ml 6N HC1 blev opløst 300 mg (0,478 mmol) a-(4-nitrophe-ny 1) -1,4,7,10-tetraazacyklododecan-l,4,7,10-tetraeddikesyre, monomethyl, triethylester (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 1), og blandingen blev opvarmet til tilbagesvaling 25 natten over. Efter denne tilbagesvalingsperiode blev opløsningen koncentreret i vakuum ved 70°C til dannelse af et gult fast stof. Dette faste stof blev opløst i 3 ml vand, filtreret og filtratet inddampet til dannelse af 253 mg (0,378 mmol, 79%) af dét rå produkt. Dette produkt blev renset ved præpara-3g tiv TLC [silicagel udviklet i 20% NH40Ac/CH30H (w/v)] og karakteriseret ved hurtig atombombardement massespektrometri ([M+H]+=526) og yderligere karakteriseret ved lH NMR (D20) 35 8,21 (d), 7.42(d), 4,83(s), 3,83-2,19(m ) , l,92(s) 13C NMR (020) 175,0, 173,6, 171,8, 167,0, 166,3, 146,9, 138,3, 130,1, 123,0, 62,2, 54,0, 53,0, 52,2, 50,4, 97,3, 46,8, 44,8, 42,8, 20,0.

I DK 175393 B1 I

I 50 I

I Eksempel 3 I

I Fremstilling af a-(4-aminopheny1)-1,4,7,10-tetraazacyklodode- I

I can-1,4,7,10-tetraeddikesyre (BA-DOTA). I

I 5 I

I Metode A: I

I Katalytisk hydrogener i ng af nitrogruppen i tetraeddikesyren I

I (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 2) blev udført un- I

I 10 der anvendelse af Adams katalysator (Pt02> og hydrogen i ho- I

I vedsagelig kvantitativt udbytte til dannelse af titelproduk- I

I tet. Dette produkt blev karakteriseret ved hurtig atombombar- I

I dement {[M+H]+=496) og anionbytning HPLC (på Q-Sepharose®) og I

I yderligere karakteriseret ved I

I 15 I

I Ih nmr (d2o) I

I 8,12(d), 7,86(d), 5,66(s), 4,73-4,57 {m), 4,27-3,78(m), 3,39-2,91(m) I

I NMR (020) I

I 176,54, 176,52, 176,46, 141,1, 128,9, 120,9, 112,5, 65,0, I

I 20 55,9, 53,6, 49,7, 49,5, 49,3, 45,7, 45,4, 44,9, 44,6, 41,4. I

I Metode 8: I

I En anden metode til syntese af denne forbindelse var, at om- I

I 25 danne monoestertetraaminforbindel sen fra eksempel D til mono- I

I syretetraaminforbindel sen (6N HC1, tilbagesvaling natten over) I

I efterfulgt af vandig alkylering under anvendelse af bromeddi- I

I kesyre og derpå reduktion af nitrogruppen til amingruppen I

I (Pt02 katalysator) til dannelse af et produkt identisk med det I

I 30 ovenfor beskrevne. I

I Eksempel 4 I

I Fremstilling af a-(4-nitropheny1)-1,4,7,10-tetraazacyklodode- I

I 35 can-l,4,7-trieddikesyre. I 1

I 60 ml 6N HC1 blev opløst 2,0 g (15,48 mmol) af monoesterte- I

I traaminforbindel sen (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel I

51 DK 175393 B1 D). Blandingen blev opvarmet til 95°C natten over (ca. 10 timer), hvorefter den blev koncentreret i vakuum ved 75°C til dannelse af 2,53 g (5,11 mmol, 96%) af monosyretetraamintetra-hydrochloridet som et gult fast stof.

5

Ovennævnte monosyretetraamintetrahydrochlorid (0,5 g, 1,0 mmol) blev opløst i 15 ml vand og indstillet til pH 9 med NaOH. En separat opløsning af bromeddikesyre blev fremstillet (0,71 g, 5,13 mmol) og sat til den vandige opløsning af mono-10 syretetraaminen. Opløsningen pH-værdi blev igen indstillet til 9 og holdt på denne værdi under reaktionen ved.små tilsætninger af 1,0N NaOH. Medens reaktionsblandingen blev omrørt, blev lige store portioner udtaget på forskellige tidspunkter, og forløbet af alkyleringen blev overvåget ved anionbytning HPLC.

15 Når mængden af di alkyler ingsprodukt (i alt tre acetatgrupper til stede) havde nået et maksimum, blev hele reaktionsblandingen lyofiliseret til dannelse af et mørkt fast stof. Denne rå blanding af alkylerede produkter blev så renset ved silicagel-kromatografi (eluering med opløsningsmiddel system 1) efter-20 fulgt af præparativ anionbytningskromatografi (eluering med en gradient af 0-100% 1M NH4OAC) og derpå med præparative TLC plader (udviklet i opløsningsmiddel system 4) og til slut ved silicagelkromatografi (eluering med opløsningsmiddel system 4). Denne omfattende rensningsprocedure gav som et gult fast 25 stof 30 mg (0,06 mmol, 6,0%) af titelproduktet. Dette produkt blev karakteriseret ved hurtig atombombardement massespektro-metri ([M+H] + = 468_) anionbytning HPLC og yderligere karakteriseret ved 1 2 3 4 5 6 7H NMR (D2O) 2 8,12(bs), 7,35(bs) , 4,76{s), 3,57-3,44(m) , 2,97-1,83 (m) , l,80(s) 3 13C NMR (D20) 4 181,75, 180,68, 179,00, 175,37, 147,70, 141,22, 133,08, 5 123,53, 68,44, 59,72, 56,00, 52,80, 49,96, 49,29, 47,86, 6 45,36, 44,26, 42,78, 42,25, 23,72.

7

I DK 175393 B1 I

I 52 I

I Eksempel 5 I

I Fremstilling af a-(4-aminopheny1)-1,4,7,10-tetraazacyklodode- I

I can-1,4,7-trieddikesyrepentahydrochlorid og o-(4-aminopheny1)- I

I 5 1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1,4,10-trieddikesyrepentahydro- I

I c h 1 o r i d. I

I En rå blanding af alkylerede produkter blev fremstillet ved I

I fremgangsmåden beskrevet i eksempel 4. Denne rå blanding blev I

I 10 kromatograferet på en si 1icagelsøjle og elueret med 20% NH4OAC/ I

I CH3OH (w:v). De ønskede fraktioner fra denne søjle blev for- I

I enet og inddampet til tørhed. Det rå produkt, der havde væ- I

I sentlige mængder NH4OAC blev opløst i 80 ml NANOpure® vand og I

I lyofil i seret til dannelse af et lysebrunt fast stof. Dette fa- I

I 15 ste stof blev opløst i 20 ml NANOpure® vand, rystet med Pt02 I

I katalysator under en H2 atmosfære, indtil hydrogenoptagelsen I

I standsede. Katalysatoren blev fraskilt ved vakuumfiltrering, I

I og filtratet lyofiliseret til dannelse af et gult fast stof. I

I Det faste stof blev opløst i 3 ml opløsningsmiddel system 4 og I

I 20 kromatograferet på silicagel under anvendelse af opløsnings-

I middel system 4. De samlede fraktioner blev så destilleret i I

I vakuum og lyofiliseret til dannelse af 779,6 mg lysegult fast I

I stof. *3C NMR og proton NMR antyder, at dette produkt er en I

I 50/50 blanding af de to mulige geometriske isomerer. Blandin- I

I 25 gen af isomerer blev bragt i kontakt med overskud af HC1 og I

I lyofiliseret til dannelse af 548,4 mg {61% udbytte) at titel- I

I produkterne. Smeltepunkt > 270°C. Anionbytningskromatografi I

I {HPLC system III) viste en større top (> 94% renhed). Hurtigt I

I atombombardement massespektrum viste de geometriske isomerer I

I 30 [M+H]+ = 438. I

I 3 5 I

DK 175393 B1 v;*·"_i1' · ' _* T ' _'"^wn Μ^^^^Ρ,ιί.- _;_ "'· -.'jd'l· ’l· 53

Eksempel 6

Fremstilling af a-[2-(4-nitropheny1)ethy1]-1,4,7,10-tetraaza-cyklododecan-1,4,7,10-tetraedd ikesyre-1,4,7,10-tetramethyl ester.

5

Til en opløsning af 1,43 g (3,63 mol) a-[2-(4-nitrophenyl)-ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1-eddikesyre-1-methyl-ester (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel B) i 40 ml argonskyllet acetonitril blev sat 1,71 g (12,34 mmol) vandfri 10 kaliumcarbonat under kraftig omrøring. Til reaktionsblandingen blev sat 1,78 g (11,61 mmol) methyl bromacetat og reaktionsblandingen blev omrørt ved ca. 25eC i 48 timer. TLC analyse viste dannelse af et nyt produkt (Rf = 0,62 opløsningsmiddel system 2). Til opslæmningen blev sat 6,0 g lynsilicagel og 15 acetonitril blev fjernet på roterende fordamper. Det fremkomne materiale blev påført på en 2,5 cm x 40 cm si 1 i cage 1 søj1e, der forud var elueret med 5% methanolisk chloroform. Ca. 400 ml af den fremkomne opløsning blev anvendt til at eluere flere ikke polære urenheder og ureageret alkyleringsmiddel. Derefter blev 20 opløsningsmiddel system 2 påført, fraktioner indeholdende produkt (Rf = 0,62) blev opsamlet, forenet og inddampet til dannelse af 2,1 g (3,44 mmol, 95%) af titelproduktet som et bleggult glas. 1H NMR viste, at dette produkt var en 2:1 blanding af konformationsisomerer eller geometriske isomerer.

25

Ih NMR (CDC13, 50eC) 8,137(d), 8.128(d), 7,398(d), 7,385(d), 3,82(s), 3,76(s), 3,75(s ) , 3,74(s), 3,68(s ) , l,5-3,52(m) 13C NMR (CDC13, 50eC, 75 MHz) 30 175,8, 174,2, 174,1, 174,0, 149,0, 129,5, 129,3, 123,6, 60,1, 55,1, 52,8, 52,7, 52,6, 52,4, 52,2, 52,1, 52,0. 51,2, 51,1, 51,0, 49,1, 48,8, 47,5, 45,2, 34,2, 32,6.

35

I DK 175393 B1 I

I 54 I

I Eksempel 7 I

I Fremstilling af o-[2-(4-aminophenyl)ethyl]-l,4,7,10-tetraaza- I

I cyk1ododecan-1,4,7,10-tetraeddikesyre-1,4,7,10-tetramethy1 ester . I

I 5 . I

I I 25 ml methanol indeholdende 400 mg 10% palladium på carbon I

I som katalysator under en nitrogenatmosfære blev opløst 1,41 g I

I (2,31 mol) a-[ 2-(4-nitropheny1)ethy1]-1,4,7,10-tetraazacyklo- I

I dodecan-1,4,7,10-tetraeddikesyre-1,4,7,10-tetramethy1 es ter I

I 10 (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 6). Overskud af hy- I

I drogen blev skyllet gennem opløsningen ved en atmosfære i tre I

I timer. TLC viste dannelse af et stærkt ninhydrinpositivt mate- I

riale (Rf = 0,62 opløsningsmiddel system 2). Den methanoliske I

I katalysatoropslæmning blev filtreret gennem celite og afdamp- I

I 15 ning af opløsningsmidlet gav ti te 1 produktet 1,21 g (2,08 mmol, I

I 91%) som et hvidt fast glas (som en 2:1 blanding af konforma- I

I ti onsisomerer). Den mindre konformat ionsi somere eller geome- I

I triske isomere blev adskilt fra den større isomer blev lynkro- I

I matografi under anvendelse af 10% methanolisk chloroform til I

I 20 dannelse af ti te 1 produktet som et urent hvidt pulver (MP * I

I 89-95*C) og karakteriseret ved I

I Ih NMR {CDC13, 50“C) I

I 6,94(d), 5,89(d), 6,69(d), 6,66(d), 3,91{s), 3,80(s), 3,78(s), I

I 25 3,74(s) , 3,7 3 (s) , 3,72(s), 3,71(s), 1,5-3,5(m) I

I 13c NMR (CDC13, 50eC, 75 MHz) I

I 176,1, 174,0, 173,9, 172,2, 170,4, 169,6, 144,2, 144,1, 130,6, I

I 130,5, 129,5, 129,1, 115,9, 115,8, 62,6, 58,7, 55,1, 54,3, I

I 52,7, 52,5, 52,3, 52,2, 52,1, 52,0, 51,9, 51,8, 51,7, 50,2, I

I 30 50,0, 47,3, 44,7, 32,8, 31,8, 30,0, 25,2. I

I Hurtigt atombombardement massespektrum, m/e 602 [M+Na+], 618 I

I [M+K+]+, [624 M+2Na+-H+]+. I

I 35 I

55 DK 175393 B1

Eksempel 8

Fremstilling af a-[2-(4-aminophenyl)ethyl]-l,4,7,10-tetraaza-cyklododecan-l,4,7,10-tetraeddikesyre (PA-OOTA).

5 I 50 ml koncentreret saltsyre blev opløst 1,5 g (2,59 mmol) a-[2-(4-aminophenyl)ethyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododecan-1,4, 7,10-tetraeddikesyre-1,4,7,10-tetramethylester (som den rå 2:1 blanding fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 7). Reak-10 tionsblandingen blev tilbagesvalet ved ca. 105®C i seks timer.

TLC (opløsningsmiddel system 1) viste omdannelse af esteren (Rf = 0,88) til titelproduktet, som hydrochloridsaltet (Rf = 0,43). Overskud af opløsningsmiddel blev fjernet på roterende fordamper og det fremkomne hvide faste stof blev tørret. Ti- 15 telproduktet som hydrochloridsaltet fremkom i et udbytte på 1,6 g og var karakteriseret ved aH NMR (D2O, pD = 1,0, 90®C) 7,48(d), 7,42(d), 2,8-4,3(m), 2,23(m), 2,03(m) 20 13C NMR (D20, pD = 1,0, 90°C, 75 MHz) 176,4, 174,9, 171,6, 144,7, 132,9, 132,8, 130,4, 125,7, 61,7, 56,8, 56,0, 53,7, 53,1, 51,6, 47,9, 34,3, 37,6.

Hurtigt atombombardement massespektrum m/e 524 [M+H]+, 546 25 tM+Na+]+, 568 [M+2Na+-H+]+.

Under anvendelse af lynkromatografi og opløsningsmiddel system 1 blev ethvert spor af urenheder af esteren fjernet fra titelproduktet som hydrochloridsaltet. På en 2,5 cm x 57,5 cm lyn-30 silicagelsøjle blev påført 1,10 g af titelproduktet som hydrochloridsaltet. Fraktioner indeholdende kun ti te 1 produktet, som det blandede ammoniumkaliumsalt, blev forenet og gav 580 mg. 1 HPLC analyse viste, at materialet havde mere end 98% arealrenhed ved 230 og 254 nm.

I DK 175393 B1 I

I 56 I

I Hurtigt atombombardement massespektrum, m/e 562 (M+K)+, 584 I

I [M+ K++Na + -H + ], 600 [M+2K+-H+]+. I

I Eksempel 9 I

I I

I Isolering af a-[2-(4-aminopheny1) ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyk- I

I 1ododecan-l,4,10-tri eddikesyre, blandet ammonium, kaliumsalt. I

I En rå opløsning indeholdende både tetra og trisyren (2,05 g) I

I 10 (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 8) blev opløst i en I

I minimal mængde opløsningsmiddel system 1 og påført på en 30 cm I

I x 7,5 cm søjle af lynsi 1icagel, som forud var blevet elueret I

I med dette opløsningsmiddel. Eluering af fraktioner indehol- I

I dende titelproduktet (Rf = 0,63 i opløsningsmiddel system 1) I

I 15 blev opsamlet og gav 200 mg a-[2-(4-aminopheny1)ethy1]-1,4,7, I

I 10-tetraa2acyklododecan-l,4,10-trieddikesyre, blandet ammoni- I

I um, kaliumsalt. og ^3C NMR analyse antydede, at denne tri- I

I syre var den symmetriske isomer (1,4,10-tri syresti 11 ingsisomer) I

I 20 1H NMR (D20, pD = 0,5 med DC! , T = 90eC) I

I 7,52(d9; 7,46(d), 3,60(m), 3,54(m), 3,19(m) I

I 13C NMR (D20, pD = 0,5, T = 90eC) I

I 176,1, 170,2, 140,0, 132,7, 131,1, 126,1, 57,6, 57,2, 56,1, I

I 54,9, 53,2, 51,5, 51,2, 31,2. I

I 25 I

I Hurtigt atombombardement massespektrum, m/e 466 [M+H+]+, 488 I

I [M+Na+]+, 504 [M+K+]+, 526 [M+K++Na+-H+]+, 542 [M++2K-H]+. I

I Eksempel 10 I

I 30 I

I Fremstilling af a-(2-methoxy-5-nitropheny1)-1,4,7,10-tetraaz- I

I cyklododecan-1,4,7,10-tetraeddikesyretetramethylester. I

I Methylbromacetat (565 μΐ, 5,97 mmol) blev sat til en omrørt I

I 35 blanding af a-(2-methoxy-5-nitropheny1)-1,4,7,10-tetraazacyklo- I

I dodecan-l-eddikesyremethylester (580 mg, 1,47 mmol) (fremstil- I

I let ved fremgangsmåden i eksempel N) og pulveriseret kalium- I

57 DK 175393 B1 carbonat (1,15 g, 8,32 mmol) i acetonitril (20 ml). Reaktions-blandingen blev omrørt ved stuetemperatur i to timer. Blandingen blev så filtreret, og filtratet blev så koncentreret til en olie i vakuum. Det rå produkt blev renset ved kromatografi ^ 5 (silicagel, 8% methanol i methylenchlor id). Titelproduktet fremkom som et gult fast stof (469 mg, 52%), TLC Rf = 0,4 (silicagel, 10% CH30H i ΟΗΟΙβ), og blev karakteriseret ved 13C NMR (C0C13) 10 173,2, 172,6, 161,2, 139,1, 125,1, 124,6, 120,5, 110,7, 57,0, 55.6, 53,5, 52,6, 51,3, 50,8, 46,8, 46,0, 44,0.

Eksempel 11 15 Fremstilling af a-(2-methoxy-5-nitropheny1)-1,4,7,10-tetraaza-cyklododecan-1,4,7,10-tetraeddikesyre.

En opløsning af a-(2-methoxy-5-nitrophenyl)-1,4,7,10-tetraaza-cyklododecan-l,4,7,10-tetraeddikesyretetramethylester (frem-20 stillet ved fremgangsmåden i eksempel 10) i koncentreret HC1 (5 ml, J.T. Baker ULTREX) blev opvarmet under tilbagesvaling under en nitrogenatmosfære i 5 timer. Opløsningen blev så koncentreret til tørhed i vakuum og efterlod en fast rest. Denne blev renset ved kromatografi (silicagel opløsningsmiddel sy-25 stem 6) til dannelse af titelproduktet som et urent hvidt fast stof (209 mg). Dette materiale blev omdannet til tetrahydro-chloridsaltet og blev .karakteriseret ved 13C NMR (D20-DC1, 30eC) 30 171,0 166,9, 161,2, 139,0, 125,5, 119,3, 110,7, 56,8, 54,5, 52.7, 51,0, 49,2, 49,0 46,3, 42.9.

35

I DK 175393 B1 I

I

I 58 I

Eksempel 12 I

I Fremstilling af a-(2-methoxy-5-aminophenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1,4,7,10- I

I tetraeddikesyretetraammoniumsalt. I

Is I

I Til en opløsning af o*-(2-methoxy-5-nitrophenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododecan- I

I 1,4,7,10-tetraeddikesyre (157 mg) (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 11) i I

I vand (20 ml) blev sat platinoxid (20 mg). Denne blanding blev hydrogeneret (1 atmos- I

I fære hydrogen) i 1 time ved stuetemperatur. Efter filtrering blev materialet renset yder- I

I 10 ligere ved kromatografi (silicagel opløsningsmiddel system 5) til dannelse af titelfor- I

I bindeisen (141 mg) som et urent hvidt fast stof karakteriseret ved I

I ,3CNMR(D20)-DC1) I

I 175,5, 172,6, 172,3, 159,9, 128,8, 127,5, 124,6, 123,8, 115,5, 61,2, 58,1, 57,3, 55,7, I

I 15 53,4,51,6,49,6,47,4,. I

I Eksempel 13 I

I Fremstilling af l-(2-methoxy-5-nitrobenzyl)-l,4,7,10-tetraazacyklododecan-4,7,10- I

I 20 trieddikesyre. I

I En 6M saltsyreopløsning (3 ml) indeholdende 0,25 g l-(2-methoxy-5-nitrobenzyl)- I

I l,4,7,10-tetraazacyklododecan-4,7,10-trieddikesyre-4,7,10-trimethylester (0,45 mmol) I

I blev omrørt og opvarmet til 100°C i 24 timer. Efter afkøling til stuetemperatur blev der I

I 25 tilsat 5 ml vand, og den vandige opløsning blev frysetørret til dannelse af et brunligt I

I fast stof. Efter søjlekromatografi (silica, opløsningsmiddel system 5) blev trisyren iso- I

I leret i et udbytte på 60% som et urent hvidt fast stof, smeltepunkt 228-230°C under de- I

I komponering og yderligere karakteriseret ved I

59 DK 175393 B1 'H NMR (D20) 8,18(d), 8,09(s), 7,12(d), 3,87(s), 2,10-3,60(m), ,3CNMR(D20) 180,45, 179,80, 163,66, 140,22, 128,60, 126,24, 122,66, 111,50, 59,91, 59,06, 56,44, 5 52,75, 50,92,48,84.

Eksempel 14

Fremstilling af l-(2-methoxy-5-aminobenzyl)-l ,4,7-10-tetraazacyklododecan-4,7,l 0-10 trieddikesyre.

Til en nitrogenskyllet vandig (50 ml) opløsning indeholdende 50 mg Pt02 blev sat 50 mg l -(2-methoxy-5-nitrobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-4,7,10-tri eddikesyre (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 13). Efter hydrogenering i en Pair bombe i 15 en time, blev opløsningen filtreret, og det vandige filtrat frysetørret til dannelse af ani linderivatet som et brunligt fast stof (95% udbytte), smeltepunkt >240°C under de-komponering, som blev yderligere karakteriseret ved ’HNMR(D20) 20 7,54(bs), 7,21 (d), 7.09(d), 7,05(s), 6,88(s), 3,84(s), 3,78(s), 2,85-3,56(m).

,3CNMR(D20) 180,59, 179,77, 153,38, 124,16, 124,03, 122,82, 120,18, 113,68, 112,43, 59,06, 57,02, 55,96,53,67,50,52,50,08,49,70,49,04,48,32.

25 Eksempel 15

Fremstilling af 1 -(2-hydroxy-5-nitrobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-4,7,10-tri eddikesyre. 1

Til en vandig opløsning (1 ml) af l-(2-hydroxy-5-nitrobenzyl)- 1,4,7,10-tetraazacyklo-dodecan (200 mg, 0,62 mmol) (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel F) blev sat

I DK 175393 B1 I

I 60 I

I bromeddikesyre (300 mg; 2,2 mmol) og NaOH (3,5 ml, = 1M) under omrøring ved I

I stuetemperatur. Reaktionens forløb blev overvåget ved LC (anionbytning, I

I Q-Sepharose®) og pH-værdien blev holdt på ca. 8 ved tilsætning af NaOH efter behov. I

I Efter 12 timer blev opløsningen frysetørret og den faste rest kromatograferet (søjle) på I

I 5 silicagel og elueret med opløsningsmiddel system 5. Den større gule fraktion blev kon- I

I centreret, opløst i H20 og frysetørret til dannelse af det ønskede produkt som et klart I

I gult pulver (150 mg, 49%), smeltepunkt 230-235°C under dekomponering, og som blev I

I yderligere karakteriseret ved I

I 10 13CNMR(D20) I

I 166,41, 165,60, 160,00, 119,91, 116,02, 113,85, 111,71, 104,59, 45,20, 44,50, 43,96, I

I 36,43. I

I Eksempel 16 I

I 15 I

I Fremstilling af l-(2-hydroxy-5-aminobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-4,7,10-tri- I

I eddikesyre. I 1

I Fremstilling af O!-[2-(4-nitrophenyl)ethyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododecan-l-(R,S)- I

I eddike-4,7,10-tris-(R-methyleddike)syre-l-isopropyl-4,7,10-trimethylester (PN-DTMA I

I 30 trimethylisopropylester). I

Til en argonskyllet vandig opløsning (25 ml) af N-(2-hydroxy- 5-nitro- I

I 20 benzyl)-l,4,7,10-tetraazacyklododecan-4,7,10-trieddikesyre (200 mg, 0,4 mmol) (frem- I

I stillet ved fremgangsmåden i eksempel 15) blev sat Pt02 (130 mg) efterfulgt af indfø- I

I ring af H2 (Parr hydrogenator). Efter total forsvinding af den gule farve blev opløsnin- I

I gen skyllet med argon og filtreret. Den vandige opløsning blev så frysetørret til dannel- I

I se af produktet som et brunligt fast stof (146 mg, 78%). I

I 25 I

I Eksempel 17 I

61 DK 175393 B1

Til en opløsning af 1,00 g (2,37 mmol) a-[3-(4-nitrophenyl)propyl]-1,4,7,10-tetra-azacyklododecan-1 -eddikesyre- 1-methylester (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel P) i 35 ml tør acetonitril blev sat 1,15 g (8,32 mmol) vandfri kaliumcarbonat under kraftig omrøring under nitrogen. Optisk aktiv a-benzensulfonat af mælkesyre-5 methylester (1,79 g, 7,36 mmol S:R = 98,2) blev tilsat, og blandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 60 timer. TLC analyse viste dannelse af nye produkter (Rf =0,71, opløsningsmiddel system 2 for tetraesteme og Rr = 0,89 for triesteren). Den fremkomne opløsning med suspenderet carbonatsalte blev hældt i 40 ml chloroform, og de udfældede uorganiske salte blev filtreret. Opløsningsmidlet blev fjernet fra dette filtrat, og 10 den rå orange olie blev kromatograferet to gange på en 2,5 cm x 40 cm lynsilicagelsøjle under anvendelse opløsningsmiddel system 2 som eluent til dannelse af titelproduktet som en ikke opspaltet blanding af tetraesterdiastereomerer (1,00 g, 1,47 mmol, 62% udbytte), som var fri for underalkylerede produkter.

15 'H NMR analyse af dette materiale viste, at det indeholdt ca. 0,5 ækvivalenter ureageret benzensulfonatderivat. NMR spektrene af dette materiale var ikke sammenflydende ved 60°C i chloroform: 'H NMR (CDCI3,60°C) 20 7,9-8,l(m, 2H, 7,2-7,4(m, 2H), 5,06(m, IH), 3,4-4,0(m, 9H), l,7-3,4(m, 20H), l,0-l,7(m, 15H).

IR (CDCI3) cm*1 2980,2840,1725, 1710 (estercarbonyl), 1590,1510,1440, 1340.

25 Hurtigt atombombardement massespektrum, m/e 702 [M+Na+]+, 687.

Eksempel 18

Fremstilling af a-[2-(4-aminophenyl)ethyl]-1,4,7,10-[tetraazacyklododecan- 30 1 -(R,S)-eddike-4,7,l 0-tris-(R-methyleddike)syre-1 -isopropyl-4,7,10-trimethyl ester (PA-DOTMA trimethylisopropylester).

I DK 175393 B1 I

I 62 I

I o’-[2-(4-nitropheny])ethyl]-1,4,7-10-tetraazacyklododecan-1 -(R,S)-eddike-4,7, 1 O-tris- I

I (R-methyleddike)syre-1 -isopropyl-4,7, 10-trimethylester (950 mg, l ,40 mmol ukorrige- I

I ret) (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 17), der indeholdt ureageret I

I a- [3-(4-ni trophenyl)propyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1 -eddikesyre-1 -methyl- I

I 5 ester, blev opløst i 10 ml 30% vandig methanol indeholdende 1,00 g 10% palladium på I

I carbon som katalysator under en nitrogenatmosfære. Overskud af hydrogen blev skyllet I

I gennem opløsningen i 7 timer. På dette punkt viste TLC undersøgelse dannelse af et I

I stærkt ninhydrinpositivt materiale (Rf = 0,62 opløsningsmiddel system 2, Rr = 0,71 for I

I udgangsmateriale). Den methanoliske katalysatoropslæmning blev filtreret gennem ce- I

I 10 lite og afdampning af opløsningsmidlet gav 800 mg af det rå titelprodukt som en klar I

I olie, der indeholdt benzensulfonsyre (Rf = 0,09 opløsningsmiddel system 2) fra den I

I ledsagende hydrogenolyse af benzensulfonatesteren. Den rå olie blev kromatograferet I

I på en 2,5 cm x 20 cm lynsilicagelsøjle med 10% methanol i chloroform, som eluerede I

I et lysegult bånd i hulrumsrumfanget. Opløsningsmiddel system 2 blev så påført for at I

I 15 eluere titelproduktet (480 mg) i et udbytte på 52% som en blanding af ikke opspaltede I

I diastereomerer og geometriske isomerer. Tre tydelige ab kvartetter blev iagttaget i det I

I aromatiske område af1 HNMR I

’H NMR (CDCI3,30°C) I

I 20 6,63-8,0(m, (kvartetter), 4H), 5,07(m, IH, iropropylmethin H), 3,53-3,9(m, 13H med I

I fire singletter ved 3,85, 3,73, 3,69 og 3,56), 3,46(m, IH), 3,25(bred, t, 3H), 2-3,l(m, I

I 14H), l,0-2,0(m, 15H). I

I 13C NMR (CDClj, 30°C) I

I 177,3,177, 176,4,176,2,175,9, 174,3,172,9, 170,6,145,3, 144,9, 130,8, 129,7, 129,3, I

I 25 129,1, 128,8, 128,4, 127,5, 126,3, 115,2, 115,1, 114,9, 69,0, 68,4, 67,3, 61,6, 57,8, I

I 57,4, 56,7, 56,5, 56,4, 52,9, 52,7, 52,1, 50,8, 50,7, 50,6, 47,3, 47,1, 47,0, 46,9, 46,5, I

I 46,3, 46,1, 44,8, 44,5, 44,3, 34,1, 32,9, 32,5, 32,2, 31,8, 24,8, 22,2, 22,1, 22,0, 21,8, I

I 21,6,15,8,14,9,7,7,7,5,7,4,7,1. I

I IR (CDCI3) cm'1 I

I 30 2960,2840,1720,1510,1450,1375. I

63 DK 175393 B1

Hurtigt atombombardement massespektrum, m/e 672 [M+Na+]+, 686.

Eksempel 19 5 Fremstilling af a-[2-(4-aminophenyl)ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1 -(R,S)-eddike-4,7,10-tris-(R-methyleddike)syre, (PA-DOTMA).

Den diastereomere blanding af of-[2-(4-aminopheny)ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyklo-dodecan* 1 -(R,S)-eddike-4,7,10-tris-(R-methyleddike)-syre-l -isopropopyl-4,7,10-trime-10 thylester (400 mg, 0,59 mmol) (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 18) blev opløst i 50 ml 6N koncentreret saltsyre og tilbagesvalet i 30 timer. TLC analyse (opløsningsmiddel system 1) viste omdannelse af ester (Rf = 0,98 opløsningsmiddel system 1) til to nye pletter (Rf = 0,6 høj diastereomer og Rf - 0,54 lav diastereomer opløsningsmiddel system 1, begge pletter UV, ninhydrin og jodpositive). Overskud af opløs-15 ningsmiddel blev fjernet på roterende fordamper, og efter tørring fremkom en blanding af rå diastereomere af titelproduktet (403 mg) som hydrogenchloridsaltet. Præparativ adskillelse af de to diastereomere af titelproduktet blev opnået ved at påføre 290 mg (0,51 mmol) af det rå salt på en 1 x 13 cm silicalyngelsøjle, der blev elueret med opløsningsmiddel system 8. Den høje Rf diastereomere (119 mg, 0,21 mmol) fremkom i re-20 nere form end den lave Rf diastereomere (90 mg, 0,16 mmol), idet den høje Rf diastereomere eluerede ffa søjlen først: 'H NMR for høj Rf diastereomer: Ή NMR (D20,90°C, pD = 7,5) 7,12(d, 2H), 6,80(d, 2H), 3,66(m, IH), 3,57(bred t, 3H), 2-3,4(M, 19H), l,89(m, IH), 25 l,37(m, IH), 1,15(d, 3H), l,10(d, 3H), l,06(d, 3H).

13C NMR (D20, 90°C pD = 7,5) 184,4, 184,2, 184,0, 183,3, 135,9, 132,6, 131,7, 119,1, 78,2, 69,0, 61,7, 57,4, 54,1, 49,7,49,6, 48,2, 47,7,47,2, 34,8, 33,8, 9,6, 9,1, 9,0. 1

Hurtigt atombombardement massespektrum, m/e 566 [M+H4]*, 588 [M+Na+]+, 604 [M+K+]+, 626 [M+K++Na+-HT, 642 [M+2K+-H+]+.

I DK 175393 B1

I 64 I

I Fremstilline af slutprodukter - komplekser. I

I Metal ligandkomplekser blev fremstillet på forskellige måder som vist nedenfor. Frem- I

I gangsmådeme indbefattede blanding af metallet og liganden i vandig opløsning og ind- I

I 5 stilling af pH-værdien til den ønskede værdi. Kompleksdannelse blev udført i opløs- I

I ninger indeholdende salte og/eller stødpuder samt vand. Somme tider fandtes opvarme- I

I de opløsninger at give højere kompleksudbytter end, når kompleksdannelsen blev ud- I

I ført ved omgivelsernes temperatur. Oparbejdningen anvendt til syntesen af BFC har I

I også vist sig at påvirke kompleksdannelsen. I

I 10 I

I Eksempel 20 I

I Fremstilling af Q!-(4-aminophenyl)-l,4,7,10-tetraazacyklododecan-l,4,7,10-tetraeddike- I

I syre, ammoniumsalt, samarium(III)kompleks, Sm(BA-DOTA). I

I 15 I

I En lille prøve, 53 mg (0,094 mmol) o:-(4-aminophenyl)-l,4,7,10-tetraazacyklo- I

I dodecan-l,4,7,10-tetraeddikesyre (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 3) blev I

I opløst i 100 μΐ vand og behandlet med 3 ml 0,043M Sm(OAc)3 opløsning (48,8 mg, I

I 0,128 mmol) ved pH 6-7. Denne opløsning blev opvarmet til 100°C, og graden afkom- I

20 pleksdannelse blev bestemt ved anionbytnings HPLC. Når kompleksdannelsen var I

I fuldstændig ifølge anionbytningskromatografi HPLC system III, blev opløsningen af I

I komplekset afkølet til stuetemperatur (ca. 25°C) og frysetørret. Samariumkomplekset I

blev renset ved silicagelkromatografi (eluering med opløsningsmiddel system 1). Den- I

I ne fremgangsmåde gav titelproduktet i et udbytte på 82%. Dette kompleks blev karak- I

I 25 teriseret ved TLC, hurtigt atombombardement massespektrometri, anionbytnings I

I HPLC og yderligere karakteriseret ved I

I ’H(D20) I

I 8,94, 7,81, 7,21, 6,97, 6,80, 5,63, 5,01, 4,58, 4,01, 3,56, 1,78, 1,53, 1,24, 1,10, 0,77, I

I 30 -2,80,-2,95,-3,21,-3,91. I

65 DK 175393 B1 13CNMR(D20) 190,3, 184,9, 181,4, 146,8, 134,3, 122,7, 116,4,80,8, 72,6, 64,2, 57,2, 55,8, 54,7, 53,4, 51,5,49,7, 45,5,43,5,23,6.

5 Hurtigt atombombardement massespektrum, [M+H+]+ = 645 (Sm isotop mønster).

Eksempel 21

Fremstilling af a-(4-aminophenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklodocecan-1,4,7,10-tetraeddike-10 syre, samarium(III)kompleks.

En opløsning af 150 μΐ Sm-153 (3 x lO^M i 0,1 N HC1) og 600 μΐ SmCl3 (3 x lO^M) i 0,1N HC1 blev fremstillet ved at sætte Sm-153 opløsningen til SmCl3 opløsningen. Derefter blev 5,0 μΐ 2,OM NaOAc tilsat efterfulgt af 45 μΐ 50 mM ligand (fremstillet 15 ved fremgangsmåden i eksempel 3) i HEPES buffer. Opløsningens pH-værdi blev indstillet til 7 med 275 μΐ 0,5M HEPES. Denne opløsning blev delt i to fraktioner på 500 μΐ hver, og en fraktion blev opvarmet i en time til 100°C.

Opløsningerne blev ledet gennem SP-Sephadex® kationbytterharpiks. Procenten af 20 metal som kompleks blev bestemt ved anvendelse af den tidligere beskrevne metode. Resultaterne viste 99,6% af metallet som et kompleks for den opvarmede prøve og 96,6% for den ikke opvarmede prøve.

Stabilitet af chelater ved pH-profil.

25

Stabiliteten af metalligandkomplekser blev målt ved at underkaste dem forskellige pH-værdier og analysere for kompleks i opløsning. Ved lav pH-værdi kan protonering af liganden forårsage frigørelse af metal. Ved høj pH-værdi konkurrerer metalhydroxider med chelatdannelse. Når man således ser efter indifferente chelater, vil et 30 ønskeligt indifferent chelat forblive som chelat, når det udsættes for høje og lave pH-værdier.

I DK 175393 B1 I

I 66 I

I Profiler af indifferentheden ved forskellige pH-værdier for nogle af chelateme ifølge I

I opfindelsen blev udviklet under anvendelse af de metoder, der er beskrevet i de foregå- I

I ende eksempler. I nogle tilfælde blev ikke chelateret metal fjernet ved at lede opløsnin- I

gen gennem en kationbytterharpiks. Fortyndet natriumhydroxid og saltsyreopløsning I

I 5 blev anvendt til at indstille pH-værdien af kompleksopløsningeme fra 1 til ca. 14. Pro- I

I centen af metal som kompleks blev så bestemt ved de tidligere beskrevne metoder. I

I På lignende måde blev flere bifunktionelle chelatkonjugater fremstillet og underkastet I

I pH 2,8, 4,0 og 6,0. Mængden af konjugat, der forbliver i opløsning, blev bestemt ved I

I 10 HPLC under anvendelse af en radiometrisk detektor. Resultaterne er vist i eksempel I

I XX i biologiafsnittet. I

I Eksempel 22 I

I 15 pH-stabilitet af a-(4-aminophenyl)-l,4,7,10-tetraazacyklododecan-l,4,7,10-tetraeddike- I

I syre, samarium(III)kompleks. I

I De opvarmede og ikke opvarmede prøver fra eksempel 20 blev hver delt i 2 x 250 μΐ I

I portioner. En 250 μΐ portion blev indstillet med HC1 for at få de pH-værdier, der er re- I

I 20 præsenteret i følgende tabel. Den anden 250 μΐ portion blev indstillet med μΐ mængder I

I af NaOH til de ønskede pH-værdier. Når først den ønskede pH-værdi var nået, blev en I

I portion på 25 μΐ udtaget, og procenten af metal som kompleks blev bestemt som tidli- I

I gere beskrevet. Resultaterne er følgende I

67 DK 175393 B1 _% Kompleks_ _2M_opvarmet ikke opvarmet I 98,9 92,7 3 99,6 93,3 5 5 99,6 92,9 7 99,6 95,7 9 99,9 95,8 II 99,6 95,7 13 99,6 94,5 10

Disse data viser stabiliteten for denne prøve, hvad enten den er opvarmet eller ej og uanset den afprøvede pH-værdi.

Eksempel 23 15

Fremstilling af a-(4-aminophenyl)-l,4,7,10-tetraazacyklododecan-l,4,7,10-tetraeddike-syre, yttrium(III)kompleks.

Ti μΐ af en opløsning indeholdende 1,4 mg/100 μΐ Of-(4-aminophenyl)-l,4,7,10-tetraaza-20 cyklododecan-l,4,7,10-tetraeddikesyre (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 3) blev sat til 100 μΐ Y(OAc)3 (0,003M), hvortil der var sat Y-90. Til denne opløsning blev sat 500 μΐ vand efterfulgt af 125 μΐ NaOAc (0,5M). Vand (265 μΐ) blev sat til opløsningen for at bringe det samlede rumfang op på 1 ml. Denne opløsning blev delt i to portioner. En portion blev opvarmet til 100°C i 1 time. Både den opvarmede og den ik-25 ke opvarmede prøve blev undersøgt for at bestemme procenten af metal som kompleks under anvendelse af den tidligere beskrevne kationbyttermetode. Resultaterne viste 84% og 4% af metallet som kompleks for henholdsvis den opvarmede prøve og den ikke opvarmede prøve.

I DK 175393 B1

I 68 I

I Eksempel 24 I

I Fremstilling af a-(4-aminophenyl)-l ,4,7,10-tetraazacyklododecan-l ,4,7,10-tetraeddike- I

I syre, lutetium(III)kompleks. I

I En opløsning af o:-(4-aminopheny])-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1,4,7,10-tetra- I

I eddikesyre (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 3) blev opløst i destilleret vand I

I til dannelse af en koncentration på 1,63 mg/ml. I

I 10 En lutetiumchloridopløsning blev fremstillet ved at opløse lutetiumchlorid i 0,1N HC1 I

I til en koncentration på 3,9 mg/ml (0,01 M). Lutetium.177 (0,3 mmolær) blev anvendt I

I som sporstof. I

I Et rumfang på 30 μΐ 0,01M lutetiumopløsning blev sat til 2 μΐ Lu-177 opløsning. Den I

15 passende mængde ligand fra ovenstående blev tilsat, og HEPES buffer (0,1 M, pH 7,6) I

I blev tilsat for at få et samlet rumfang på 1,0 ml. De fremkomne opløsninger var 0,3 I

mmolær i ligand og lutetium. Opløsningen blev så opvarmet til 100°C i en en time, og I

I procenten af Lu som kompleks blev bestemt til at være 86% ved den tidligere beskrev- I

ne kationbytningsmetode. I

1 20

Eksempel 25 I

Fremstilling af or-(4-isothiocyanatophenyl)-l,4,7,l0-tetraazacyklododecan-l,4,7,10-te- I

I traeddikesyre, samarium(III) kompleks. I

I 25

I En prøve, 7 mg (10,8 pmol) af Of-(4-aminophenyl)-l,4,7,10-tetraazacyklo- I

I dodecan-l,4,7,10-tetraeddikesyre, samarium(III)kompleks (fremstillet ved fremgangs- I

måden i eksempel 20) blev op løst i 400 μΐ vand. Overskud af thiophosgen (50 μΐ) blev I

I tilsat efterfulgt af400 μΐ CHC13, og den tofasede reaktionsblanding blev omrørt kraftigt I

I 30 i 30 min. Efter denne tid blev vandlaget ekstraheret med 500 μΐ CHC13 fire gange, og I

“ ' ~ .-ί IIII·^ Ύί - 1 1 LI ιν«^%4Μι^ DK 175393 B1 69 vandlaget blev så lyofiliseret til dannelse af det ønskede titelprodukt i kvantitativt udbytte.

UV viste, at denne forbindelse havde et bånd ved 272 og 282 nm. TLC, silicagel frem-5 kaldt med 75:25 V:V CH3CN:H20, gav Rf = 0,38. Udgangsmaterialet havde en Rf = 0,19. IR viste -SCN strækning ved 2100 cm1. Hurtigt atombombardement massespektrum [M+HY = 687.

Eksempel 26 10

Fremstilling af a-(4-aminophenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-l ,4,7,10-tetraeddike-syre, ammoniumsalt, yttrium(III)kompleks.

En prøve, 90 mg (160 mmol) af a-(4-aminophenyl)-l,4,7,10-tetraazacyklo-15 dodecan-l,4,7,10-tetraeddikesyre (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 3), blev opløst i 1 ml vand. Til denne opløsning blev sat 3 ml vand indeholdende 51 mg (192 mmol) Y(OAc)3. Reaktionsblandingen pH = 6-7 blev så opvarmet til 100°C i to timer.

Den fremkomne opløsning blev så ledet gennem glasuld og lyofiliseret til dannelse af 126 mg gult fast stof. Det faste stof blev kromatograferet på silicagel (opløsningsmid-20 del system 1) til dannelse af 71 mg (76%) af det ønskede kompleksprodukt. Analyse ved anionbytning viste samme tilbageholdelsestid som fandtes for det analoge Sm kompleks. Titelproduktet var karakteriseret ved ,3CNMR(D20) 25 180,8, 180,5, 179,9, 146,1, 133,4, 122,0, 116,1, 74,9,66,3, 56,3, 55,8, 55,4, 55,1, 54,8, 52,2,46,0,44,0, 23,6.

’H NMR (D20) 6,90(d),6,70(d),4,40(s), 3,45-3,06(m),2,71-2,10(m), l,75(s). 2 2

Hurtigt atombombardement massespektrum, [M + H+]+ = 582.

I DK 175393 B1 I 70

I Eksempel 27 I

Fremstilling af a-(4-isothiocyanatophenyl)-1,4,7,1O-tetraazacyklododecan-1,4,7,10- I

I tetraeddikesyre, natriumsalt, yttrium* (Ill)kompleks. I

I 5

I En prøve af a-(4-aminophenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1,4,7,10-tetraeddike- I

I syre, yttriumkomplekset (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 36) (10 mg, 17 I

I pmol) blev opløst i 400 μΐ H20. Til denne opløsning blev sat 64 μΐ thiophosgen (over- I

I skud) og 400 μΐ CHClj, og den fremkomne blanding blev kraftigt omrørt i 40 min. I lø- I

10 bet af denne tid blev der foretaget flere små tilsætninger af fast NaHC03 for at holde I

pH-værdien på ca. 8. Efter endt reaktion blev vandlaget fraskilt og ekstraheret med 1 I

ml CHCI3 fire gange og lyofiliseret. Titelproduktet blev karakteriseret ved TLC og UV I

I spektroskop]. I

I 15 Eksempel 28 I

I Fremstilling af a-[2-(4-aminophenyl)ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1,4,7,10- I

I tetraeddikesyre, yttrium(III)kompleks, ammoniumsalt. NH4[Y(PAS-DOTA)]. I

20 Liganden a-[2-(4-aminophenyl)ethyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododecan-l,4,7,10-tetra- I

eddikesyre (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 8) blev omdannet til det bian- I

I dede protonerede ammoniumsalt ved kromatografi på en stærk kationbytterharpiks (SP- I

I Sephadex® C-25, Pharmacia). Søjlen var i den protonerede form og blev vasket med I

I J destilleret vand. En koncentreret vandig opløsning af liganden blev påført på søjlen ef- I

I 25 terfulgt af vask af søjlen med destilleret vand. Liganden blev elueret af søjlen med I

I 0,5M NH4OH. Eluenten blev bragt til tørhed. I 1

En opløsning af Y(OAc)3 · 4H20 (0,0728 g, 0,215 mmol) i 5 ml destilleret vand blev I

I sat til en varm opløsning af den blandede protonerede ammoniumsaltligand (0,120 g, I

I 30 0,215 mmol) i 5 ml vand. Opløsningen blev bragt til tilbagesvaling og pH-værdien ind- I

I stillet til ca. 7,0 med 0,1Μ NH4OH. Efter en time ved til- bagesvaling blev opløsningen I

71 DK 175393 B1 afkølet og reduceret til tørhed. Overskud af NH4OAc blev fjernet ved at opvarme det hvide faste stof i et oliebad til ca. 105°C i vakuum. Titelproduktet (som indeholdt ca. 1 ækvivalent ammoniumacetat), var et udbytte på 0,142 g (94%) og blev karakteriseret ved 5 ,3C NMR (DA 88°C, 75 MHz) 23,8, 27,6, 35,4, 49,6, 55,0, 56,2, 56,9, 57,1, 65,7, 68,0, 121,7, 132,6, 138,8, 180,7, 181,4,182,0, 183,1.

10 Hurtigt atombombardement massespektrum, m/e 610 (positiv ion, [M'+2+]+), 608 (negativ ion, M').

Eksempel 29 15 Fremstilling af a-[2-(4-aminophenyl)ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1,4,7,10-tetraeddikesyre, samarium(III)kompleks, ammoniumsalt. NH4[Sm(PA-DOTA)].

Når fremgangsmåden i eksempel 28 blev gentaget under anvendelse af Sm(OAc)3 · 3H20 (0,082 g, 0215 mmol) i stedet for Y(OAc)3 · 4H20, blev titelpro-20 duktet (der indeholdt ca. et ækvivalent ammoniumacetat) fremstillet i et udbytte på 0,155 g (94%) og blev karakteriseret ved ,3C NMR (DA 88°C, 75 MHz) 23,5, 27,2, 35,6, 50,5, 54,5, 56,0, 57,2, 57,9, 69,5, 71,5, 122,3, 133,0, 139,7, 181,2, 25 188,4,189,3,190,9.

Hurtigt atombombardement massespektrum, m/e 673 (positiv ion, [M'+2H+]+, Sm isotop mønster), m/e 671 (negativ ion, M', Sm isotop mønster).

I DK 175393 B1 I 72 I Eksempel 30

I Fremstilling af o?-[2-(4-isothiocyanatophenyl)ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododecan- I

I 1,4,7,10-tetraeddikesyre, samarium(III)-kompleks, ammoniumsalt. I

I 5 NH4[Sm(SCN-PA-DOTA)].

I Opløsninger af Sm(OAc)3 · 3H20 (27,9 mg, 381,56 g/mol, 73,1 pmol) i 10 ml destille- I

I ret vand og 42 mg PA-DOTA, blandet ammoniumkaliumsalt (632,97 g/mol, 66,4 I

I pmol) (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 8) i 10 ml destilleret vand blev I

I 10 blandet og opvarmet på dampbad. Efter 30 min. var reaktionen til dannelse af I

I [Sm(PA-DOTA)] afsluttet bestemt ved HPLC under anvendelse af fremgangsmåden I

I beskrevet i eksempel 41. Opløsningen blev bragt til at reagere med en opløsning af I

45,4 mg CSC12 (114,98 g/mol, 395 pmol) i 20 ml chloroform ved rystning i en skille- I

tragt. Reaktionene var afsluttet efter ca. et minut bestemt ved HPLC og ved fravær af I

I 15 en positiv prøve med ninhydrin (0,2% i ethanol), når den vandige opløsning blev I

I udplettet på en silicagel TLC plade (udgangschelatet, [Sm(PA-DOTA)], gav positiv re- I

I aktion). Chloroformlaget blev fjernet, og det vandige lag blev vasket med to 20 ml por- I

I tioner chloroform. Det vandige lag blev reduceret til tørhed ved tilsætning af 100 ml I

I acetonitril og inddampet ved omgivelsernes temperatur under en strøm af nitrogen ,til I

I 20 dannelse af 56 mg af titelproduktet. I

I Hurtigt atombombardement massespektrum, m/e 715 (positiv ion, [M‘+2H+]+, Sm iso- I

I top mønster), m/e 713 (negativ ion, M', Sm isotop mønster). I

I 25 Eksempel 31 I

I HPLC analyse af hastigheden af chelatering af Y3+ med PA-DOTA. I

I Hastigheden af PA-DOTA chelatering med Y3+ blev undersøgt som en funktion af den I

I 30 oparbejdning, der blev anvendt ved syntesen af PA-DOTA. Omfanget af chelateringen I

I blev overvåget ved HPLC under anvendelse af en Alltech Econosphere® Cl 8 100 mm I

73 DK 175393 B1 søjle. Den anvendte gradient var: A) 95:5 af pH 6,0, 0,05M NaOAc stødpude:CH3CN, B) 30:70 af pH 6,0, 0,05M NaOAc stødpude: CH3CN, A til B på 15 min. En opløsning af PA-DOTA hydrochloridsalt (tilbageholdelsestid =1,31 min) og af PA-DOTA blandet ammoniumkaliumsalt (tilbageholdelsestid = 4,55 min), begge fremstillet ved frem-5 gangsmåden i eksempel 8, blev fremstillet som 1,6 mM, pH 6,0 0,5M NaOAc stødpude. En ml (1,6 pmol) af hver af de to opløsninger blev bragt til at reagere med 0,2 ml (8 μτηοΐ) Y(OAc)3 · 4H20 opløsning (40 mM i pH 6,0, 0,5M NaOAc stødpude). Chelat-dannelsen blev bestemt ved fremkomsten af en top ved en tilbageholdelsestid = 3,96 min. (bekræftet ved sammenligning med en prøve fra eksempel 28). Chelatdannelses-10 resultaterne var som følger.

PA-DOTA salt_% kompleks_tid(minVtemp.

PA-DOTA, HC1 salt >90 <l/stuetemperatur PA-DOTA blandet <10 15/stuetemperatur

15 ammonium-kaliumsalt >85 10/90°C

Det er klart, at fremgangsmåden til rensning af BFC har en virkning på chelate-ringshastigheden.

20 Eksempel 32

Fremstilling af of-[2-(4-aminophenyl)ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1 -(R,S)-eddike-4,7,10-tris-(methyleddike)syre, samarium(III)kompleks, ammoniumsalt. NH4[Sm(PA-DOTMA)].

25

En opløsning af Sm(OAc)3 · 3H20 (13,2 mg i 2 ml destilleret vand) blev sat til en opløsning af -[2-(4-aminophenyl)ethylJ-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-l-(R,S)-eddike- 4,7,10-tris-(methyleddike)syre (30 mg i 2 ml destilleret vand) (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 29, høj Rf diastereomer). Opløsningen med en pH-værdi på 6,5 30 blev opvarmet på dampbad, og reaktionen blev overvåget ved HPLC Efter 30 min. op-

I DK 175393 B1 I

I 74 I

I varmning blev opløsningen reduceret til tørhed på roterende fordamper og tørret i en I

vakuumovn. I

I Hurtigt atombombardement massespektrum, m/e 715 (positiv ion, [Μ+2ΗΎ, Sm iso- I

I 5 top mønster), 737 (positiv ion, [M+H++Na+]+, Sm isotop mønster) 713 (negativ ion, I

I (M‘), Sm isotop mønster). I

I I de følgende eksempler blev kompleksopløsningeme ledet gennem en ionbytningssøjle I

I for at fjerne eventuelt overskud af frit metal fra opløsningen. Labile systemer ville ven- I

I 10 de tilbage til ligevægt, og lignende mængder af det frie metal ville være i opløsning. I

I Indifferente systemer ville ikke komme i ligevægt igen, og mængden af ikke chelateret I

I metal skulle aftage. Selv om således et kompleks kan dannes i lavt udbytte, kunne en I

I rensning ved at lede den gennem en ionbytningsharpiks resultere i et brugbart stabilt I

I kompleks uden ikke kompleksbundet metal. I

I 15 I

I Eksempel 33 I

I Fremstilling af a-(2-methoxy-5-aminophenyl)-l,4,7,10-tetraazacyklododecan- I

I 1,4,7,10-tetraeddikesyre, samarium(HI)kompleks. I

I 20 I

I En 3 x 10'2M opløsning af o!-(2-methoxy-5-aminophenyl)-l,4,7,10-tetraazacyklo- I

I dodecan-1,4,7,10-tetraeddikesyre (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 12) blev I

I fremstillet ved at opløse 5,8 mg i 325 μΐ NANOpure® vand. En portion på 10 μΐ af I

denne opløsning blev sat til 990 μΐ 3 x 10'4M SmCl3 (i 0,1M HC1), hvortil der var sat I

25 Sm-153. pH-værdien blev så bragt til 7,0 med NaOH. Denne opløsning blev delt i to , I

fraktioner på 500 μΐ hver og en fraktion blev opvarmet i en time til 100°C. Både den I

opvarmede og den ikke opvarmede prøve blev undersøgt for at bestemme procenten af I

metal som kompleks ved kationbytningsmetoden beskrevet tidligere. Opløsningen blev I

så ledet gennem SP-Sephadex® harpiks. Kompleksdannelse blev igen bestemt af de I

30 rensede prøver. Resultaterne er vist i følgende tabel. I

OK 175393 B1

IS

_Opvarmet_ikke opvarmet_ renset_ikke renset_renset_ikke renset %Kompleks 96 95 97 89 5 Eksempel 34 pH stabilitet af a-(2-methoxy-5-aminophenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododecan- 1,4,7,10-tetraeddikesyre, samarium(III)kompleks.

10 Den opvarmede og den ikke opvarmede rensede prøve fra eksempel 43 blev hver delt i 2 x 250 μΐ portioner. En portion blev indstillet med HC1 og den anden med NaOH til at give de pH-værdier, der er vist i følgende tabel. Efter at den ønskede pH-værdi var nået, fik prøven lov at henstå i 10 min., og mængden af metal som kompleks blev bestemt ved kationbytningsmetoden, der er beskrevet tidligere. Resultaterne er vist i følgende 15 tabel.

_% Kompleks_ _pH_ opvarmet_ikke opvarmet 2 95 94 20 3 97 95 5 98 97 7 96 97 9 98 96 11 97 98 25 13 100 99

Eksempel 35

Fremstilling af a-(2-methoxy-5-nitrophenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-30 1,4,7,10-tetraeddikesyre, samarium(III)kompleks.

i

I DK 175393 B1 I

I 76 I

I En 3 x 10’2M opløsning af o;-(2-niethoxy-5-nitrophenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklo- I

I dodecan-l,4,7,10-tetraeddikesyre (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 11) blev I

I fremstillet ved at opløse 7,9 mg i 464 μΐ NANOpure® vand. En portion på 10 μΐ af I

I denne opløsning blev sat til 950 μΐ 3 x lO^M SmCl3 (i 0,1N HC1), hvortil der var sat I

I 5 Sm-153. pH-værdien blev så bragt til 7,0 med NaOH. Denne opløsning blev delt i to I

I fraktioner på 500 μΐ hver, og en fraktion blev opvarmet i 1 time til 100°C. Både den I

I opvarmede og den ikke opvarmede prøve blev undersøgt for at bestemme procenten af I

I metal som kompleks under anvendelse af kationbytningsmetoden, der er beskrevet tid- I

I ligere. Opløsningerne blev ledet gennem SP-Sephadex® harpiks. Kompleksdannelse I

I 10 blev så bestemt på de rensede prøver under anvendelse af den tidligere beskrevne al- I

I mene fremgangsmåde. Resultaterne er vist i følgende tabel. I

I Opvarmet_ikke opvarmet_ I

I renset ikke renset_renset_ikke renset I

I 15 %Kompleks 100 72 100 46 I

I Eksempel 36 I

I pH-stabilitet af a-(2-methoxy-5-nitropehnyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododecan- I

I 20 1,4,7,10-tetraeddikesyre, Sm(III)kompleks. I

I Den opvarmede og den ikke opvarmede rensede prøve fra eksempel 35 blev hver delt i I

I to portioner. Den ene portion blev indstillet med fortyndet HC1 og den anden med I

I NaOH for at få de pH-værdier, der er vist i følgende tabel. Efter at den ønskede I

I 25 pH-værdi var nået, fik prøven lov at henstå i 10 min., og mængden af metal som kom- I

I pleks blev bestemt ved den tidligere beskrevne kationbytningsmetode. Resultaterne er I

I vist i følgende tabel. I

77 DK 175393 B1 % Kompleks_ _pH _opvarmet_ikke opvarmet 2 99 99 4 100 100 5 5 100 100 7 100 100 9 100 100 11 100 100 13 100 100 10

Eksempel 37

Fremstilling af a-(4-nitrophenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1,4,7,10-tetraeddike-syre, samarium(III)kompleks.

15

En 0,0219M (100 μΐ, 2,195 mmol) opløsning af a-(4-nitrophenyl)- 1,4,7,10-tetra-azacyklododecan-1,4,7,-trieddikesyre (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 4) blev bragt i kontakt med en 0,043M (25 μΐ, 1,075 mmol) opløsning af Sm(OAc)3. Reaktionsblandingen blev underkastet anionbytning HPLC (Q-Sepharose® søjle, 1 cm x 20 25 cm, strømningshastighed = 2 ml/min., elueret med 0-1M NH40Ac gradient i løbet af 30 min). Efter en time var komplekset (tilbageholdelsestid =11,1 min.) dannet i et udbytte på 77% (areal%) og var helt opspaltet fra ligandtoppen (tilbageholdelsestid = 15,5 min.). Yderligere bevis for at titelkomplekset var dannet fremkom på silicagel TLC (opløsningsmiddel system 4), hvorved liganden havde en Rf = 0,59 og komplekset 25 havde en Rf= 0,00.

Eksempel 38

Fremstilling af ot-(4-aminophenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododecan- 1,4,7-trieddikesyre, 30 samarium(III)kompleks og a-(4-aminophenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1,4,10-trieddikesyre, samarium- (Ill)kompleks.

I DK 175393 B1 I 78

I En opløsning, 0,022M (100 μΐ, 2,2 pmol) af de isomere (fremstillet ved fremgangsmå- I

I den i eksempel 5) blev bragt i kontakt med en 0,043M (6,4 μΐ, 0,275 μιηοΐ) opløsning I

I af Sm(OAc)3. Reaktionsblandingen blev underkastet anionbytning HPLC I

I (Q-Sepharose® søjle, 1 cm x 25 cm, strømningshastighed = 2 ml/min., elueret med I

I 5 0-0,25M NH4OAc gradient i løbet af 30 min.). Efter 40 min. var komplekset (tilbage- I

holdelsestid = 9,0 min.) dannet i et udbytte på 66% (areal%) og var fuldstændigt op- I

I spaltet fra ligandtoppen (tilbageholdelsestid = 18,5 min.). I

I Eksempel 39 I

I 10 I

Fremstilling af a-(4-aminophenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1,4,7-trieddikesyre, I

samarium-153-kompleks og a-(4-aminophenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1,4,10- I

I trieddikesyre, samarium-153 kompleks. I

I 15 En 3 x 10'2M opløsning af Qi-(4-aminophenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1,4,7-tri- I

I eddikesyre-pentahydrochlorid og or-(4-aminophenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododecan- I

I 1,4,10-trieddikesyrepentachlorid (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 5) blev I

I fremstillet ved at opløse 4,2 mg i 300 μΐ NANOpure® vand. En portion på 10 μΐ af I

I denne opløsning blev sat til 15 μΐ 2 x 10'2M SmCl3 (i 0,1N HC1), hvortil der er tilsat I

I 20 Sm-153. Rumfanget blev bragt til 1 ml ved tilsætning af vand. pH-værdien blev så I

I bragt til 7,0 med NaOH. Denne opløsning blev delt i to fraktioner på 500 μΐ hver, og en I

I fraktion blev opvarmet i en time til 100°C. I

I Både den opvarmede og den ikke opvarmede prøve blev undersøgt for at bestemme I

I 25 procenten af metal som kompleks ved den tidligere beskrevne kationbytningsmetode. I

I Resultaterne viste 89% og 96% af metallet som kompleks for henholdsvis den opvar- I

I mede og den ikke opvarmede prøve. I

79 DK 175393 B1

Eksempel 40 pH stabilitet af a-(4-aminophenyl)-l,4,7,10-tetraazacyklododecan-l,4,7-trieddikesyre, samarium(iri)kompleks og a-(4-aminophenyl)-l,4,7,10-tetraazacyklododecan-l ,4,10-5 1,4,10-trieddikesyre, samarium(III)kompleks.

Den opvarmede prøve fra eksempel 39, og den ikke opvarmede prøve blev hver opdelt i to portioner. Den ene portion blev indstillet med HC1 og den anden med NaOH til de pH-værdier, der er vist i følgende tabel. Når først den ønskede pH-værdi var nået, fik 10 prøven lov at henstå i 10 min., og procenten af metal som kompleks blev bestemt ved den tidligere beskrevne kationbyttermetode. Resultaterne er vist i følgende tabel.

% Kompleks_ _pH_ opvarmet_ikke opvarmet 15 1 86 83 3 99 99 5 99 99 7 89 96 9 99 98 20 11 96 89 13 97 97

Eksempel 41 25 Fremstilling af a-(4-nitrophenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1,4,7-tetraeddikesyre, samarium(III)kompleks.

Tretten mikroliter af en 2 x 10‘2M opløsning af Q!-(4-nitrophe- nyl)-1,4,7,10-tetraaza-cyklododecan-1,4,7-trieddikesyre (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 4), 15 30 μΐ SmCl3 (0,02M 0,1N HC1) og 2 μΐ Sm-153 fik rumfanget bragt op til 1 ml med NA-NOpure® vand. pH-værdien blev indstillet til 7,0 med NaOH. Denne opløsning blev I DK 175393 B1

I 80 I

I delt i to fraktioner på 500 μΐ hver og en fraktion blev opvarmet i en time til 100°C. Bå- I

I de den opvarmede og den ikke opvarmede prøve blev undersøgt for at bestemme pro- I

I centen af metal som kompleks under anvendelse af den tidligere beskrevne kationbyt- I

I termetode. Resultaterne viste 74% og 42% af metallet som kompleks for henholdsvis I

5 den opvarmede og den ikke opvarmede prøve. I

I Eksempel 42 I

I pH stabilitet af a-(4-nitrophenyl)-l,4,7,10-tetraazacyklododecan-l,4,7-trieddikesyre, I

I 10 samarium(III)kompleks. I

I Den opvarmede prøve fra eksempel 41 blev delt i to portioner. En portion blev indstil- I

I let med HC1, og den anden med NaOH til dannelse af de pH-værdier, der er vist i føl- I

I gende tabel. Efter at den ønskede pH-værdi var nået fik prøven lov at henstå i 10 min., I

I 15 og mængden af metal som kompleks blev bestemt ved den tidligere beskrevne kation- I

I byttermetode. Resultaterne er vist i følgende tabel. I

I _pH_% kompleks_ I

I 1 67 I

I 20 2 70 I

I 4 70 I

I 5 72 I

I 7 74 I

I 9 76 i

I 25 10 76 . I

I 12 75 I

I 13 76 I

....... "— --- mr'- - :-: ~ ~~ DK 175393 B1 81

Eksempel 43 (Sammenligningseksempel)

Fremstilling af l-[2-(4-nitrophenyl)ethyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododecan-4,7,10-tried-dikeeddikesyre, samarium(III)kompleks.

5

Ti mikroliter 1,48 mg/100 μΐ (0,03M) opløsning af l-[2-(4-nitro- phenyl)ethyl]-l,4,7,l0-tetraazacyklododecan-4,7,10-tetraeddikesyre blev sat til 15 μΐ SmCl3 opløsning (0,02M i 0,1N HC1) og fik tilsat Sm-153. Rumfanget blev bragt op til 1 ml med NANOpure® vand. Denne opløsning blev delt i to fraktioner på 500 μΐ og en 10 fraktion blev opvarmet i en time til 100°C. Både den opvarmede og den ikke opvarmede prøve blev undersøgt for at bestemme procenten af metal som kompleks under anvendelse af den tidligere beskrevne kationbyttermetode. Resultaterne viste 81% og 43% af metallet som kompleks for henholdsvis den opvarmede og den ikke opvarmede prøve.

15

Eksempel 44 (Sammenligningseksempel) pH stabilitet af l-[2-(4-nitrophenyl)ethyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododecan-4,7,10-tri-eddikesyre, samarium(III)kompleks.

20

Den opvarmede prøve fra eksempel 43 blev delt i to portioner. En portion blev indstillet med HC1, og den anden med NaOH for at få de pH-værdier, der er vist i følgende tabel. Efter at den ønskede pH-værdi var nået, fik prøven lov at henstå i 10 min., og mængden af metal som kompleks blev bestemt ved den tidligere beskrevne kationbyt-25 termetode. Resultaterne er vist i følgende tabel.

I DK 175393 B1 I 82

_eH_ % kompleks_ I

I 1 20 I

I 2 37

I 4 49 I

I 5 5 58 I

I 7 81 - I

I 9 62 I

I 10 64 I

I 12 64 I

I 10 13 54 I

Eksempel 45 (Sammenligningseksempel) I

I Fremstilling af l-[2-(4-aminophenyl)ethyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododecan-4,7,10-tri- I

I 15 eddikesyre, samarium(III)kompleks. I

I Tre μΐ 4,65 mg/100 ml opløsning af l-[2-(4-aminophenyl)ethyl]- 1,4,7,10-tetra- I

I azacyklododecan-4,7,10-trieddikesyre blev sat til en opløsning af 15 μΐ SmCl3 (0,02M i I

I 0,1N HC1) der forud havde fået tilsat Sm-153. Rumfanget blev bragt op på 1 ml med I

I 20 NAN Opure® vand. Opløsningens pH-værdi blev indstillet til 7,3 ved anvendelse af I

I NaOH. Opløsningen blev delt i to portioner og en portion blev opvarmet til 100°C i en I

I time. Både den opvarmede og den ikke opvarmede prøve blev undersøgt for at be- I

I stemme procenten af metal som kompleks ved den tidligere beskrevne kationbytterme- I

I tode. Resultaterne viste 96% og 93% af metallet som kompleks for henholdsvis den I

I 25 opvarmede og den ikke opvarmede prøve. I

I Eksempel 46 (Sammenligningseksempel) I

I pH stabilitet af l-[2-(4-aminophenyl)ethyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododecan-4,7,10-tri- I

I 30 eddikesyre, samarium(III)kompleks. I

83 DK 175393 B1

Den opvarmede og den ikke opvarmede prøve fra eksempel 45 blev hver delt i to portioner. En portion af hver prøve blev indstillet med HC1 og den anden med NaOH til skabelse af de pH-værdier, der er vist i følgende tabel. Efter at den ønskede pH-værdi var nået, fik prøven lov at henstå i 10 min., og mængden af metal som kompleks blev 5 bestemt ved den tidligere beskrevne kationbyttermetode. Resultaterne er vist i følgende tabel.

% Kompleks__ _pH_opvarmet_ikke opvarmet 10 1 44 13 3 50 42 5 73 55 7 96 93 9 98 98 15 11 89 90 13 28 37

Eksempel 47 20 Fremstilling af l-(2-hydroxy-5-nitrobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-4,7,10-tri-eddikesyre, samarium(III)kompleks.

En 3 x 10‘2M opløsning af l-(2-methoxy-5-nitrobenzyl)-l,4,7,10-tetraaza-cyklododecan-4,7,10-trieddikesyre (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 15) 25 blev fremstillet ved at opløse 3,9 mg i 260 μΐ NANOpure® vand. En portion på 10 μΐ af denne opløsning blev sat til 15 μΐ 2 x 10'2M SmCl3 (i H20), hvortil der var sat 10 μΐ Sm-153 i 0,1N HC1 (3 x lO^M). Rumfanget blev bragt op på 1 ml ved tilsætning af 965 μΐ DI H20. pH-værdien blev så bragt til 7,0 med NaOH. Denne opløsning blev delt i to fraktioner på 500 μΐ hver, og en fraktion blev opvarmet i 1 time til 100°C. Både den 30 opvarmede og den ikke opvarmede prøve blev undersøgt for at bestemme procenten af metal som kompleks ved den tidligere beskrevne kationbyttermetode. Resultaterne vi- __________ j

I DK 175393 B1 I

I 84 I

I ste 71 % og 74% af metallet som kompleks for henholdsvis den opvarmede og den ikke I

I opvarmede prøve. I

I Eksempel 48 I

I 5 I

pH-stabilitet af 1 -(2-hydroxy-5-nitrobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-4,7,10-tri- I

I eddikesyre, samarium(IH)kompleks. I

Den opvarmede og den ikke opvarmede prøve fra eksempel 47 blev hver delt i to porti- I

I 10 oner på 250 μΐ. En portion blev indstillet med HC1 og den anden med NaOH til de I

pH-værdier, der er vist i følgende tabel. Efter at den ønskede pH-værdi var nået, fik I

I prøven lov at henstå i 10 min., og mængden af metal som kompleks blev bestemt ved I

I den tidligere beskrevne kationbyttermetode. Resultaterne er vist i følgende tabel. I

I 15 % Kompleks_ I

I _pH _opvarmet_ikke opvarmet I

I 1 65 51 I

I 3 98 93 I

I 5 99 99 I

I 20 7 100 100 I

I 9 100 99 I

I 11 100 96 I

I 13 100 98 I

I 25 Eksempel 49 I

I Fremstilling af 1 -(2-hydroxy-5-aminobenzyl)-1,4,7,1O-tetraazacyklododecan-4,7,10-tri- I

I eddikesyre, samarium(III)kompleks. I

I 30 En 3 x 10'2M opløsning af l-(2-hydroxy-5-aminobenzyl)-l,4,7,10- tetraazacyklodode- I

I can-4,7,10-trieddikesyre (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 16) blev fremstil- I

85 DK 175393 B1 let ved at opløse 3,2 mg i 100 μΐ NANOpure® vand. En portion på 10 μΐ af denne opløsning (fortyndet til 20 μΐ) blev sat til 15 μΐ 2 x 10'2M SmCl3 (i H20), hvortil der var sat Sm-153. Rumfanget blev bragt op på 1 ml ved tilsætning af 950 pL DI H20 og 20 μΐ 0,1N NaOH. Denne opløsning blev delt i to fraktioner på hver 500 μΐ og en fraktion 5 blev opvarmet i 1 time til 100°C. Både den opvarmede og den ikke opvarmede prøve blev undersøgt for at bestemme procenten af metal som kompleks ved den tidligere beskrevne kationbyttermetode. Når mindre end 95% af metallet var kompleksbundet, blev opløsningen ledet gennem SP-Sephadex® harpiks. Procenten af metal som kompleks blev igen bestemt. Resultaterne er vist i følgende tabel.

10

Opvarmet_Ikke-opvarmet_ renset ikke renset_renset_ikke renset %kompleks 99 68 99 21 15 Eksempel 50 pH-stabilitet af 1 -(2-hydroxy-5-aminobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-4,7,10-trieddikesyre, samarium(III)kompleks. 1 2 3 4 5 6

Den opvarmede og den ikke opvarmede rensede kromatograferede prøve fra eksempel 2 49 blev hver opdelt i to portioner på 250 μΐ. En portion på 250 μΐ blev indstillet med 3 HC1, og den anden med NaOH til de pH-værdier, er der vist i følgende tabel. Når først 4 den ønskede pH-værdi var nået, fik prøven lov at henstå i 10 min., og procenten af me 5 tal som kompleks blev bestemt ved den tidligere beskrevne kationbyttermetode. Resul- 6 taterne er som vist i følgende tabel.

I DK 175393 B1 I

I 86 I

% Kompleks_ . I

I _gH_opvarmet_ikke opvarmet I

I 1 60 56 I

I 2 74 76 I

I 5 3 84 87 I

I 5 97 98 I

I 7 99 99 I

I 9 99 98 I

I 11 99 99 I

I 10 13 99 99 I

I Fremgangsmåder til anvendelse - biologi. I

I Bifunktionelle chelanter, der i samme molekyle har en metalchelaterende gruppe, så- I

I 15 som DTPA, og en reaktionsdygtig binder (arylaminen) er kendt for at være i stand til at I

I blive covalent bundet til forskellige målrettede biomolekyler, der har specificitet for I

I cancer eller tumorcelleepitoper eller antigener. Radionuklidkomplekser af sådanne kon- I

I jugater er nyttige til diagnostiske og/eller terapeutiske anvendelser som midler til at I

I overføre radionuklidet til en cancer eller tumorcelle. [Reference Meares m.fl., Anal. I

I 20 Biochem. 142, 68-78 (1984); se også diskussion på side 215-216 i J. Protein Chem., I

I 3(2) (1894) af Meares and Goodwinn, nyere referencer er Meares, US patent nr. I

I 4.678.677, udstedt 7. juli 1987, Warshawsky m.fl., US patent nr. 4.652.519, udstedt 24. I

I marts 1987 og Brechbiel m.fl., Inorg. Chem., 25,2772-2781 (1986)]. Det kan tænkes at I

I produktet under anvendelse af radioaktive eller luminiserende metaller også kan an- I

I 25 vendes til in vitro immunomålinger. I

I Baggrundsoplvsning. I

I Anvendeligheden af de mærkede antistoffer afhænger af en række faktorer, f.eks.: 1) I

I 30 specificiteten af antistoffet, 2) indifferentheden eller stabiliteten af komplekset under I

87 DK 175393 B1 brugsbetingelser (dvs. serumstabilitet), og 3) antistoffets integritet, dvs. specificiteten og immunoreaktionsdygtigheden af antistoffet påvirkes ikke af mærkningsprocessen.

Stabilitet eller indifferenthed af komplekset er af største betydning for effektiviteten af 5 konjugatet af radionuklid og antistof som et diagnostisk og/eller terapeutisk middel. Kinetisk labilitet kan føre til instabilitet, f.eks. i serum og dissociation af radionuklidet fra komplekset. Den formindsker derved den diagnostiske og terapeutiske effektivitet. Desuden frembyder den en større mulighed for almen stråleskade på normalt væv.

[Cole m.fl., J. Nucl. Med., 28, 83-90 (1987)].

10

Binding af radionuklid til antistof.

Fastgørelse af radionuklid til antistof kan udføres ved enten binding af BFC til antistoffet via fremgangsmåder af velkent art efterfulgt af chelatering af radionuklidet under 15 betingelser, der er forenelige med antistoffet, eller alternativ konjugation af antistoffet til forud dannet (omgivelserne eller forhøjet temperatur) metal-BFC kompleks. [Meares m.fl., Acc. Chem. Res. 17,202-209 (1984)]. Eksempler gives.

Eksempel ZA (Sammenligning) 20

Konjugation af l-(4-isothiocyanoatobenzyI)-diethylentriaminpentaeddikesyre, samarium-153 kompleks til IgG og F(ab')2 af CC-49. [153Sm(SCN-Bz-DTPA)]-IgG og [,53Sm(SCN-Bz-DTPA)]-F(ab')2 fragment. 1 2 3 4 5 6 l-(4-isothiocyanatobenzyl)diethylentriaminpentaeddikesyre, samarium-153 kompleks 2 [I53Sm(SCN-Bz-DTPA)] blev fremstillet ved at blande 150 μΐ ,53Sm i 0,1N HC1 med 9 3

μΐ 1 -(4-isothiocyanatobenzyl)diethylentriaminpentaeddikesyre, hvortil blev sat HEPES

4 stødpude (0,5M, pH 8,9, ca. 30 μΐ) for at bringe pH værdien til ca. 6. For at konjugere, 5 blev 22,5 x 10‘9 mol IgG eller F(ab')2 af CC-59 (ca. 1 x lO^M koncentration af protein 6 i 50 mmol HEPES, pH 8,5) blandet med 153Sm komplekset, og pH-værdien blev indstillet til 8,9 ved tilsætning af en natriumcarbonatopløsning (1,0M, 12-15 μΐ). Konjugation I DK 175393 B1

I δδ I

I blev udført ved stuetemperatur (ca. 25°C) i ca. 3 timer. Det med I53Sm kompleks mær- I

I kede IgG eller F(ab')2 blev isoleret og karakteriseret på lignende måde, som beskrevet i I

I eksempel XII. I

5 Biologiske forsøg. I

I Eksempel I og II og sammenligningseksempler A-D In vivo screening af bifunktio- I

nelle chelater. I

I 10 Stabiliteten af visse sjælden jordartchelater er blevet undersøgt ved in vivo afprøvning i I

I dyr. Rosoff m.fl. i International Journal of Applied Radiation and Isotopes 14,129-135 I

I (1963) rapporterer f.eks. om fordelingen af radioaktive sjældne jordartchelater i mus I

I for visse aminocarboxylsyrer. Det fandtes, at in vivo bestemmer konkurrencen mellem I

I chelateringsmidlet og legemsbestanddele (uorganiske og organiske), om de sjældne I

I 15 jordartioner, dets deponering og udskillelse. De stærke, sjældne jordartchelater ifølge I

I opfindelsen antages at dissociere meget lidt og kan udskilles, medens de svage og mel- I

I lemstærke chelater i den kendte teknik dissocieres lettere og derfor deponeres i organer I

I såsom leveren. Koncentrationerne af radionuklid i leveren skyldes dog ikke altid svag I

I kompleksdannelse, men skyldes i nogle tilfælde den affinitet, som metalchelatet har til I

I 20 leveren. Chelater er faktisk blevet frem- stillet og anvendt til bedømmelse af leverfunk- I

I tionen [Alan R. Fritzberg, Radiopharmaceuticals: Progress and Clinical Perspectives, I

I bind 1, 1986, US patenter nr. 4.088.747 og nr. 4.091.0S8. I

I Biofordelingen af yttrium og samarium chelateme af forbindelsen fra eksempel 3, et I

I 25 eksempel på et stærkt sjældent jordartchelat, blev bestemt og den procentiske dosis i I

I leveren blev anvendt som en in vivo screeningsmetode til kvalitativt at bestemme stabi- I

I liteten af chelateme. Chelater af NTA og EDTA er inkluderet til sammenligning. Sa- I

I marium blev også injiceret som samariumchlorid i ikke chelateret form som kontrol. I

I 30 Sprague-Dawley rotter, der vejede fra 150 til 220 g, blev købt fra Charles River Labo- I

I ratories. Disse dyr blev anbragt i bure og fik vand og mad ad libitum. Dyrene blev ak- I

89 DK 175393 B1 klimatiseret i mindst 5 dage før brugen. Før injektion af kompleks, blev dyrene anbragt under en varmelampe (15-30 min.) for at udvide halevenen. Dyrene blev så anbragt i et begrænsende bur, halen renset med alkohol, og dyrene fik en injektion (50-200 μΐ) via halevenen. Efter injektion blev dyrene anbragt i et andet bur i 2 timer, hvorefter dyrene 5 blev dræbt ved brækning af halsen. Dyrene blev så dissekeret, delene skyllet med afioniseret H20, aftørret og afvejet i en aftareret tælleflaske. Mindst tre standarder af samme materiale som det injicerede blev fremstillet og talt med dyrevævene. Den procenti-ske dosis er antallet i organet divideret med antallet i standarden multipliceret med 100 (se følgende tabel).

10

Tabel

Biofordelingsdata

Eksempel Ligand fra Metal % injiceret dosis nr_Eks. 1_i lever_ 15 I 3 Y 0,17 II 3 Sm 0,29 (A) EDT A Sm 8,4 (B) EDTA Sm 4,4 (C) NT A Sm 8,6 20 (D) SmCl3 Sm 39

Komplekser blev fremstillet med ligand/metal forhold på 1:1 for eksempel I og II, ved 5:1 for eksempel A og med ca. 300:1 for eksempel B og C.

25 Eksempel ΠΙ og E.

1:1 komplekserne af yttrium (hvortil der er sat en spormængde af 90Y) med liganden fra eksempel 3, som er BA-DOTA og EDTA (sammenligningseksempel E) blev fremstillet på de tidligere beskrevne måder. Flere portioner på 100 μΐ blev overført til ad-30 skilte centrifugeglas. Overskud af Y(III) blev tilsat således, at den totale rumfangsændring minimeres og tiden blev noteret. En halv time efter metaltilsætningen blev pro-

I DK 175393 B1 I

I 90 I

I centen af kompleks bestemt ved den tidligere beskrevne kationbyttermetode, og dette I

I blev sammenlignet med den oprindelige mængde kompleks. Procenten af kompleks I

I versus tilsat metal giver en indikation af labiliteten af ligand-metalkomplekset. Resulta- I

terne er anført i tabellen. I

I 5 I

I TABEL I

I Undersøgelse af kompleks I

I Metal/ligand % kompleks_ I

I molforhold_BA-DOTA_ EDTA - I

I 10 1 80 98 I

I 10 86 I

I 100 .. 78 I

I 250 88 48 I

I 500 80 16 I

I 15 I

I Eksempel IV I

I Fremstilling af a-[2-(4-aminophenyl)ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1,4,7,1 O-te- I

I traeddikesyre, samarium-153 kompleks; [,53Sm(SCN-EA-D03A)] kompleks. I

I 20 I

I Til 150 mikroliter (μΐ) ,53Sm opløsning i 0,1N HC1 (ca. 4,6 mCi) blev sat 1 μΐ natrium- I

I acetat (2,OM) og 9 μΐ a-[2-(4-aminophenyl)ethy]]-1,4,7,10-tetraazacyklododecan- I

I 1,4,7,10-tetraeddikesyre blandet ammonium, kaliumsalt (5 mmol i 50 mmol HEPES, I

I pH 8,5 fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 9). Blandingen blev rystet meka- I

I 25 nisk og titreret gradvis med HEPES stødpude (0,5M, pH 8,9; ca. 31 μΐ tilsat) til pH 7. I

I Den blev så opvarmet til 98°C i et sandbad i en time. Efter afslutning blev 5 μΐ af bian- I

I dingen anvendt til analyse på en Mono-Q® søjle på HPLC system II, elueret med et I

I gradientopløsningsmiddelsystem (0-15 min, fra 0 til 100 B; hvor A = vand og B = I

I 1,OM ammoniumacetat og 0,1 mmol EDTA). Der blev opnået udbytter på 85-95% be- I

I 30 regnet på ,53Sm. Det således fremstillede Q'-[2-(4-aminophenyl)ethyl]-1,4,7,10-tetraaza- I

I cyklododecan-l,4,7,10-tetraeddikesyre, samarium-153 kompleks blev karakteriseret I

91 DK 175393 B1 ved sammenligning med den identiske ikke radioaktive prøve ved deres respektive kromatografiske opførsel på Mono-Q® og GF-250 søjler. Yderligere bevis for tilstedeværelsen af det radioaktive kompleks blev bestemt ved omdannelse til isothiocyanato-derivatet og dets påfølgende konjugation til antistof. Komplekset er også blevet frem-5 stillet uden opvarmning (ved omgivelsernes temperatur) ved inkubation i 16-18 timer, som gav et udbytte på 70-80%.

Eksempel V

10 Fremstilling af Qf-[2-(4-isothiocyanatophenyl)ethyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododecan- 1,4,7,10-tetraeddikesyre, samarium-153 kompleks; [153Sm(SCN-PA-DOTA)] kompleks.

Til reaktionsblandingen fremstillet i eksempel 5 blev sat 2 μΐ HEPES buffer (0,5M, pH 15 8,9), 2 μΐ thiophosgen og 0,2 ml chloroform. Blandingen blev omrørt kraftigt mekanisk to eller tre gange i nogle fa sekunder hver gang. Chloroformlaget blev kasseret, og det vandige lag, der indeholdt hovedsageligt det ønskede produkt, blev bevaret og renset yderligere. Udbyttet af o[2-(4-isothiocyanatophenyl)ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyklo-dodecan-l,4,7,10-tetraeddikesyre, samarium-153 kompleks beregnet på 153Sm aktivitet 20 målt ved HPLC på GF-250 søjle under anvendelse af HPLC system I, var 85-90%. For at rense, blev det vandige lag ledet gennem en Sep-Pak® C-18 patron og elueret med 90% acetonitril i vand. De første 300 μΐ afløb blev kasseret og SCN-derivatet, der kom i de næste 900 μΐ, blev karakteriseret ved HPLC på GF-250. Udvindingen af 153Sm aktivitet var bedre end 90%. Hovedparten af opløsningsmidlet blev så afdam- pet gennem 25 en periode på 1,5 til 2 timer, og remanensen blev anvendt til konjugation til antistof.

Eksempel VI

Fremstilling af a-(4-aminophenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklodode- can-l,4,7,10-tetra- 30 eddikesyre, samarium-153 kompleks; [153Sm (BA-DOTA)] kompleks.

I DK 175393 B1 I

I 92 I

I Til 200 μΐ ,53Sm opløsning i 0,1N HC1 blev sat 1 μΐ natriumacetat (1,OM) og 12 μΐ I

I a-(4-aminophenyI)-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1,4,7,10-tetraeddikesyre (5 mmol i I

I 50 mmol HEPES, pH 8,5) (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 3). Blandingen I

I blev rystet mekanisk og tritureret gradvis med en HEPES stødpude (0,5M, pH 8,9; ca. I

I 5 38 μΐ tilsat) til pH 7. Den blev så opvarmet til 98°C i et sandbad i en time. Efter afslut- I

ning blev 5 μΐ af blandingen anvendt til analyse på en Mono-Q® søjle (HPLC system I I

I elueret med et gradientopløsningsmiddel system: 0 til 15 min. fra 0-100% B, hvor A = I

I vand og B ~ 1,0M ammoniumacetat og 0,1 mmol EDTA). I almindelighed blev opnået I

I udbytter på 85-95% beregnet på 153Sm. Komplekset er også blevet fremstillet ved inku- I

10 bation af blandingen ved stuetemperatur i 12-18 timer, hvilket resulterede i et udbytte I

af titelproduktet på 80-90%. Det således fremstillede a-(4-aminophe- nyl)-l,4,7,10-te- I

I traazacyklododecan-1,4,7,10-tetraeddikesyre, samarium-153 kompleks blev karakten- I

seret ved sammenligning med en autentisk prøve ved deres kromatografiske opførsel på I

I Mono-Q® søjlen, omdannelse til isothiocyanatoderivatet og dets påfølgende konjugati- I

I 15 on til antistof. I

I Eksempel VII I

Fremstilling af a-(4-isothiocyanatophenyl)ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododecan- I

I 20 1,4,7,10-tetraeddikesyre, samarium-153 kompleks; [153Sm(SCN-PA-DOTA)j kom- I

I pleks. I

Til reaktionsblandingen fremkommet i eksempel VI blev sat 2 μΐ HEPES buffer (0,5M, I

I pH 8,9), 2 μΐ thiophosgen og 0,2 ml chloroform. Den blev rystet mekanisk kraftigt to I

I 25 eller tre gange nogle fa sekunder hver gang. Chloroformlaget blev kasseret, og det van- I

I dige lag, der indeholdt hovedsageligt det ønskede produkt, blev bevaret og renset yder- I

I ligere. Ubyttet af a-(4-isothiocyanatophenyl)ethyl]-l,4,7,10-tetraazacyklodode- I

I can-1,4,7,10-tetraeddikesyre, samarium-153 kompleks ifølge analyse ved HPLC på I

I GF-250 søjle baseret på 153Sm aktivitet under anvendelse af HPLC system I var over I

I 30 90%. For at rense blev det vandige lag ledet gennem en Sep-Pak® C-l 8 patron og elue- I

I ret med 90% acetonitril i vand. De første 0,3 ml afløb blev kasseret, og det ønskede I

93 DK 175393 B1 produkt kom i de næste 1,2 ml med en udvindingsprocent på 86-93. Hovedparten af opløsningsmidlet blev så afdampet over en periode på ca. 2 timer, og remanensen blev anvendt til konjugation til antistof.

5 Eksempel VIII

Konjugation af 1 -[2-(4-isothiocyanatophenyl)ethyl]-1,4,7,1O-tetraazacyklododecan- 1,4,7,10-tetraeddikesyre, samarium-153 kompleks til antistof, [153Sm(SCN-EA-D03A)]-IgG konjugat.

10

Det anvendte antistof var CC-49, et murint monoklonalt IgG som bindes til en epitop af TAF-72 et tumorassocieret antigen. For at konjugere blev 187 μΐ af antistofopløsningen (1,20 x lO^M i 50 mmol HEPES, pH 8,5) blandet med 4,5 x 10'8 mol ,53Sm(SCN-EA-D03A) efterfulgt af tilsætning af en natriumcarbonatopløsning (1,0M) 15 for at hæve pH-værdien til 8,9. Reaktionen fik lov at fortsætte i to timer ved stuetemperatur. Efter afslutning blev det med I53Sm mærkede IgG isoleret ved centrifugal gel-filtrering på Sephadex G-25 (2,2 ml) engangssøjler og yderligere renset ved HPLC på GF-250 søjle elueret med en citratstødpude (0,25M, pH 7,4). Fraktionerne indeholdende det mærkede IgG blev samlet, koncentreret og ombyttet (3 x) til PBS ved anvendel-20 se af Centricon® koncentratorer. Den specifikke aktivitet af således fremstillet 153Sm mærket IgG var ca. 0,16 pCi/pg protein. Integriteten af [153Sm(EA-D03A)]-IgG præparatet blev bekræftet ved HPLC (S. I. Sivakoff, BioChrom. 1(1), 42-48 (1986)] og standard biokemiske metoder, f.eks. natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgel, elektrofo-rese og autoradiografi og fastfase radioimmunmåling (RIA). [Se David Colcher m.fl., 25 Cancer >Res. 43, 736-742 (1983)].

Eksempel IX (Sammenligningseksempel)

Konjugation af 1 -[2-(4-isothiocyanatophenyl)ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-30 4,7,10-trieddikesyre, samarium-153 kompleks til fragment F(ab')2 af CC-49; [,53Sm(SCN-EA-D03A)]- fragment F(ab')2 af CC-49.

I DK 175393 B1 I

I 94 I

F(ab')2 fragmentet af CC-49 fremstillet ved enzymatisk fordøjelse ved fremgangsmåden I

I beskrevet af Lamoyi og Nisonoff [E. Lamoyi og A. Nisonoff, J. Immunol. Methods, I

I 56, 235-243 (1983)] (225 μΐ af 1 x lO^M i 50 mmol HEPES, pH 8,5) blev blandet med I

I 2,9 x 10'8 mol 153Sm(SCN-E A-D03 A). Natriumcarbonat (1,0M, ca. 5 μΐ) blev tilsat for I

I 5 at bringe pH-værdien op på 8,9, og reaktionen blev fortsat i ca. 2½ time. Efter afslut- I

I ning blev det 153Sm mærkede fragment isoleret og karakteriseret som beskrevet i ek- I

I sempel VIII. I

I Eksempel X (A og Bl I

I 10 I

I In vivo lokalisering af [153Sm(EA-D03A)]-IgG og [l53Sm(EA-D03A)]- F(ab')2. I

I Anvendeligheden af det 153Sm(EA-D03A) mærkede IgG (fra eksempel IX) og F(ab')2 I

I af CC-49 (fra eksempel IX) blev påvist ved optagelsen af de mærkede materialer af I

I 15 human tumor xenograft i athymiske mus. Athymiske (Nu/Nu, CD1 baggrund) hunmus I

I blev således podet subkutant (S.C.) (0,1 ml/kilde) med den humane kolon carcinoma I

I cellelinie, LS-174 T (ca. 1 x 106 celler/dyr). Ca. 2 uger efter podningen fik hvert dyr in- I

I jiceret via halevenen ca. 2 pCi (15-30 pG) 153Sm mærket antistof i PBS. Musene blev I

I aflivet på forskellige tidspunkter. Efter fjernelse af blod blev tumoren og udvalgte væv I

I 20 udskåret og afVejet, og radioaktiviteten blev målt i en y tæller. Tallene per minut I

I (CPM) af 153Sm i hvert væv blev bestemt og udtrykt som CPM per gram væv per inji- I

I ceret dosis multipliceret med 100 (% injiceret dosis/gram). Resultaterne er vist på fig. I

I 1-14 og tabel I(A og IB. Det 153Sm(SCN-Bz-DTPA) mærkede IgG og F(ab')2 af CC-49 I

I (fra eksempel ZA) blev inkluderet i undersøgelsen til sammenligning. Resultaterne er I

I 25 vist i tabel IG og ID. I

I Eksempel XI

I Konjugation af a-[2-(4-isothiocyanatophenyl)ethyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododecan- I

I 30 1,4,7,10-tetraeddikesyre, samarium-153 kompleks til antistof; I

I []53Sm(SCN-PA-DOTA)]-IgG konjugat. I

95 DK 175393 B1

Det anvendte antistof var CC-49, et murint monoklonalt IgG som bindes til en epitop af TAG-72, et tumorassocieret antigen. For at konjugere blev 178 μΐ af antistofopløsningen (1,26 x lO^M i 50 mmol HEPES, pH 8,5) blandet med 3,4 x 10"8 mol a-[2-(4-isothiocyanatophenyl)ethyl]-1,4,7,1O-tetraazacyklododecan-1,4,7,10-tetraeddike-5 syre, samarium kompleks (fremstillet som beskrevet i eksempel V) efterfulgt af tilsætning af en natriumcarbonatopløsning (1,0M, ca. 17 μΐ) for at hæve pH-værdien til ca.

8,9. Reaktionen fik lov at fortsætte i 2 timer ved stuetemperatur. Efter afslutning blev det l53Sm mærkede IgG isoleret ved centrifugal gelfiltrering på Sephadex® G-25 (2,2 ml) engangssøjler, og yderligere renset ved HPLC på GF-250 søjle elueret med en cit-10 ratstødpude (0,25M, pH 7,4). Fraktionerne, som indeholdt det mærkede IgG, blev samlet, koncentreret og ombyttet (3 gange) til PBS ved anvendelse af Centricon® koncen-tratorer. Den specifikke aktivitet af det således fremstillede 153Sm mærkede IgG var ca.

0,16 pCi/pG protein. Homogeniteten og integriteten af a-[2-(4-isothiocyanato-phenyl)ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1,4,7,10-tetraeddikesyre, samarium-153 15 kompleks-IgG præparatet blev bekræftet ved HPLC og standard biokemiske metoder som i eksempel VIII.

Det følgende eksempel er et alternativ til fremstilling af mærkede antistofkonjugater, som indebærer først konjugering af BFC til antistoffet og påfølgende chelatering til 20 dannelse af det radionuklid-BFC mærkede antistof.

Eksempel XIA

Fremstilling af Ci-[2-(4-aminophenyl)ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1,4,7,10-25 tetraeddikesyre-Ab CC4$> konjugat (IgG CC49-PA-DOTA) og påfølgende chelatering med ,53Sm til dannelse af ,53Sm-mærket antistof (IgG CC49-PA-DSOTA-l53Sm).

Det 153Sm(PA-DOTA) mærkede antistof kan fremstilles ved først at koble BFC, f.eks. a- [2-(4-i sothi ocyanatophenyl)ethyI]- 1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1,4,7,10-tetraeddi-30 kesyre (SCN- PA-DOTA) til et antistof ved pH 8-9 efterfulgt af chelatering med I53Sm ved pH 6 ved stuetemperatur i flere timer.

I DK 175393 B1 I 96 i

I Ved et typisk forsøg blev IgG CC-49 koncentreret og ombyttet tre gange til en carbo- I

I natstødpude (50 mM, pH 9,1) i en Centricon® koncentrator (afskæring ved molekyl- I

I vægt på 30 K) således, at der fremkom en opløsning med en antistofkoncentration stør- I

I re end 1,5 x lO^M. Til dannelse af konjugatet blev 161 μΐ af antistofopløsningen inde- I

I 5 holdende 25 x 10'9 mol IgG CC-49 blandet med 5 μΐ SCN-PA-DOTA (5 mmol koncen- I

tration i samme carbonatstødpude fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 18). I

Blandingen fik lov at henstå ved stuetemperatur i fem timer og blev afsluttet ved filtre- I

ring gennem 30 K membranen i Centricon® koncentratoren ved 5000 omdrejninger per I

I min. på Sorvall RT centrifugen. Antistofkonjugatet blev yderligere vasket med 2 ml af I

I 10 en 0,25M DTPA opløsning i PBS ved pH 7,4, og fem gange (2 ml hver gang) med I

I MES stødpude (20 mM, pH 5,8) og centrifugeret i 30 min. efter hver vask. Til slut blev I

I PA- DOTA-IgG konjugatet koncentreret til et minimalt rumfang (ca. 100 μΐ) og dets I

integritet blev kontrolleret ved HPLC analyse på en GF-250 søjle. Til det rensede kon- I

I jugat blev sat en blanding af ,53Sm i 0,1N HC1 (50 μΐ) og 20 μΐ af en MES stødpude I

15 (1,0M, pH 6), blandet på en hvirvelblander og fik lov at henstå ved stuetemperatur nat- I

I ten over. Efter afslutning ved centrifugal gelfiltrering var mængden af inkorporeret I

I ,53Sm bedømt ved HPLC analyse, 0,22 BFC-Sm/antistof. At I53Sm var forbundet med I

I antistoffet gennem chelatering med BFC, som var bundet covalent til antistoffet, og ik- I

I ke skyldtes uspecifik binding, blev påvist ved sammenligning med resultater fra kon- I

I 20 trolforsøget. Ved kontrolforsøget blev IgG CC-49 opløsning blandet med 153Sm bian- I

I ding under identiske betingelser. Det på lignende måde isolerede antistof havde ingen I

I kendelig mængde ,53Sm forbundet dermed. Dette viste således, at uspecifik binding af I

I Sm-153 med antistoffet ikke fandt sted under disse betingelser. I

I 25 Eksempel XII . I

I Konjugation af oi-[2-(4-isothiocyanatophenyl)ethyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododecan- I

I 1,4,7,10-tetraeddikesyre, samarium-153 kompleks til fragment F(ab')2 af CC-49; I

I [,53Sm(SCN-PA-DOTA)]- F(ab')2-fragment. I

I 30 I

97 DK 175393 B1 F(ab')2 fragmentet af CC-49 [fremstillet ved enzymatisk fordøjelse ved fremgangsmåden beskrevet af E. Lamoyi m.fl., J. Immunol. Methods 56, 235-243 (1983)], (225 μΐ 1 x ΙΟ^Μ i 50 mmol HEPES, pH 8,5) blev blandet med 2,9 x 10*8 mol a- 2-(4-isothiocyanatophenyl)ethyl]-l ,4,7,10-tetrazacyklodoecan-l ,4,7,10-tetraeddikeyre, 5 samarium-153 kompleks fremstillet som beskrevet i eksempel V. Natriumcarbonat (1,0M, ca. 9 μΐ) blev tilsat for at bringe pH værdien op på ca. 8,9, og reaktionen blev fortsat i ca. 2½ time. Det med 153Sm mærkede fragment blev isoleret og karakteriseret som beskrevet i eksempel VIII. Den specifikke aktivitet var omkring 0,4 pCi/pG.

10 Eksempel XIII (A og BV

In vivo lokalisering af konjugatet afa;-[2-(4-isothiocyanatophenyl)ethyI]-l,4,7,10-tetraazacyklododecan-l,4,7,10-tetraeddikesyre, samarium-153 kompleks mærket IgG og F(ab')2; [153Sm(SCN-PA-DOTA]-IgG og (,53Sm(SCN-PA-DOTA)]-F(ab')2.

15

Anvendeligheden af konjugatet af a-[2-(4-isothiocyanatophenyl)- ethyl]-l,4,7,10-tetra-azacyklododecan-l,4,7,10-tetraeddikesyre, samarium-153 kompleks mærket IgG og F(ab')2 af CC-49 (fra eksempel XI og XII) blev påvist ved optagelsen af de mærkede materialer af human tumor xenograft i athymiske mus. Biolokaliseringen blev bestemt 20 ved anvendelse af fremgangsmåden beskrevet i eksempel XI. Resultaterne er vist på fig. 1-7 for IgG og fig. 8-14 for F(ab')2 og i tabellerne IIA og IIB.

Konjugatet af ,53Sm(SCN-Bz-DTPA) med IgG og F(ab')2 mærkede materialer (fremstillet af eksempel ZA) blev indbefattet i undersøgelsen til sammenligning. (Se tabel IC 25 og ID).

Eksempel XIV

Konjugation af of-(4-isothiocyanatophenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1,4,7,10-te- 30 traeddikesyre, samarium-153 kompleks til antistof [,53Sm(SCN-BA-DOTA)]-IgG.

I DK 175393 B1 I

I 98 I

I Hel IgG af CC-49 (174 μΐ 1,2 x lO^M og/eller 0,25M HEPES, pH 8,7) blev blandet I

I med 2,0 x 10'8 mol ar-(4-isothiocyanatophenyl)-l,4,7,10-tetraazacyklododecan- I

I 1,4,7,10-tetraeddikesyre, samarium-153 (2,8 mCi) fremstillet som i eksempel VII efter- I

I fulgt af tilsætning af en natriumcarbonatopløsning (1,0M ca. 2 μΐ) for at holde I

I 5 pH-værdien på ca. 8,7. Reaktionen fik lov at fortsætte i 2½ time ved stuetemperatur. I

I Efter afslutning blev det ,53Sm mærkede IgG isoleret ved centrifugal genfiltrering på I

I Sephadex® G-25 (2,2 ml) engangssøjler og yderligere renset ved HPLC på GF-250 I

I søjle elueret med en citratstødpude (0,025M, pH 7,4). Fraktionerne, som indeholdt det I

I mærkede IgG blev samlet, koncentreret og ombyttet (tre gange) til PBS ved anvendelse I

I 10 af Centricon® koncentratorer. Homogenitet og integritet af det med samarium-153 I

I mærkede IgG præparat blev bekræftet ved HPLC og standard biokemiske metoder, I

I som beskrevet i eksempel VIU. I

I Eksempel XV I

I 15 I

I Konjugation af Q!-(4-isothiocyanatophenyl)-l,4,7,10-tetraazacyklododecan-l,4,7,10- I

I tetraeddikesyre, samarium-153 kompleks til fragment F(ab')2 af CC-49; I

I [153Sm(SCN-BA-DOTA)]-fragment F(ab’)2 af CC-49. I

I 20 F(ab’)2 af CC-49 (84 μΐ 2,4 xlO^M i 0,25M HEPES stødpude, pH 8,7) fremstillet ved I

I enzymatisk fordøjelse ved fremgangsmåden beskevet af Lamoyi m.fl. blev blandet med I

I 2,1 x 10’8 mol a;-(4-isothiocyanatophenyl)-l,4,7,10-tetraazacyklododecan-l,4,7,10-te- I

I traeddikesyre, samarium-153 kompleks (fremstillet ved frem- gangsmåden i eksempel I

I VII). Natriumcarbonat (1,0M, ca. 2 μΐ) blev tilsat for at bringe pH-værdien op på 8,7 og I

I 25 reaktionen blev fortsat i ca. 2 timer. Efter afslutning blev det 153Sm mærkede fragment I

I isoleret og karakteriseret som beskrevet i eksempel VIII. I

Eksempel XVI (A og B) 99 DK 175393 B1

In vivo lokalisering af a-(4-isothiocyanatophenyl)-l,4,7,1O-tetraazacyklododecan- 1,4,7,10-tetraeddikesyre, samarium-153 kompleks mærket IgG (eksempel XV) og 5 F(ab')2 (eksempel XV) [,53Sm(BA-DOTA)]-IgG og [,53Sm(BA-DOTA)]-F(ab’)2·

In vivo undersøgelsen blev udført efter protokollen beskrevet i eksempel X, og resultaterne er vist på fig. 1-14 og i tabellerne IIIA og HIB.

10 Eksempel XVII (A og Bl

In vico lokalisering af a-[2-(4-isothiocyanatophenyl)ethyl]- 1,4,7,10-tetraazacyklo-dodecan-1,4,7, 10-tetraeddikesyre I77Lu-kompleks mærket IgG og F(ab')2; [177Lu(PA-DOTA)]-IgG og [,77Lu(PA-DOTA))-F(ab')2.

Titelforbindelseme blev fremstillet og in vivo undersøgelser blev udført efter protokollen beskrevet i eksempel IV, V, X, XI og XII, og resultaterne er vist i tabel IVA og IVB.

20 Eksempel XVIII (A og Bl

In vivo lokalisering af a-[2-(4-isothiocyanatophenyl)ethyl]- 1,4,7,10-tetraazacyklo-dodecan-1,4,7,10-tetraeddikesyre, yttrium-90 kompleks mærket IgG og F(ab')2; [90Y(PA-DOTA)]-IgG og [90Y(PÅ-DOTA)]-F(ab')2· 25

Titelforbindelseme blev fremstillet og in vivo undersøgelser blev udført efter protokollen beskrevet i eksempel X med den undtagelse, at vævene blev fordøjet og talt ved væskescintillation, og resultaterne er vist i tabel VA og VB. '

I DK 175393 B1 I

I 100 I

I Eksempel XIX I

In vitro pH-stabilitet af [153Sm(BFC)]-CC-49-IgG og [mLu- (BFC)]-CC-49-IgG. I

I 5 [l53Sm(BFC)]-CC-49-IgG eller [I77Lu(BFC)]-CC-49-IgG fik lov at henstå i en 0,2M I

NaOAc buffer ved pH 6,0, 4,0 og 2,8 ved stuetemperatur, ved en proteinkoncentration I

I på ca. 5 x lO^M med ca. 0,5 kompleks/antistof. Prøver blev udtaget med visse tidsmel- I

I lemrum og analyseret ved HPLC (GF-250 søjle) for dissociation af 153Sm eller 177Lu I

aktivitet fra proteinet. I almindelighed blev undersøgelsen udført i 5 dage eller ind til I

I 10 90% af radiosiotopeme var blevet dissocieret. Resultaterne er udtrykt som den begyn- I

I dende hastighed af tab af radioisotop per dag. Resultaterne viste den bedre stabilitet af I

I 153Sm(PA-DOTA), 177Lu(PA-DOTA), ,53Sm(BA-DOTA), ,53Sm(PA-DOTMA) og I

I 153Sm(MeO-BA-DOTA) sammenlignet med standard [153Sm(Bz-DTPA)j komplekset I

I ved sur pH-værdi. Resultaterne er vist i tabellen nedenfor. I

I 15 I

I Denne større stabilitet af komplekserne in vitro passer også meget godt med den hurti- I

I gere clearence af 153Sm og 177Lu fra legemet og fra væv, der ikke er målvæv (f.eks. ny- I

I re, lever), se fig. 1 -34. I

I 20 % tab af isotop/dag___ I

I BFC_Isotop_6.0__4J)_2JS_ I

I Bz-DTPA 153Sm <2 35 35 I

I PA-DOTA 153Sm <2 <2 <2 I

I BA-DOTA 153Sm <2 <2 <2 I

I 25 PA-DOTA 177Lu <2 <2 <2 I

I MeOBA-DOTA 153Sm <2 <2 <2 I

I EA-D03A 153Sm <2 90 95 I

I PA-DOTMA 153Sm <2 <2 - I

101

Eksempel XX (A og Bl DK 175393 B1

In vivo lokalisering af a-(2-methoxy-5-aminophenyl)-l,4,7,10- tetraazacyklo-dodecan-l,4,7,10-tetraeddikesyre, samarium-153 kompleks mærket IgG og F(ab')2; 5 [153Sm(MeO-BA-DOTA)]-IgG og [' 53Sm(MeO-B A-DOTA)]-F(ab’)2.

Titelforbindelseme blev fremstillet ved fremgangsmåderne beskrevet i eksempel IV, V, XI og XII, og in vivo undersøgelser blev udført ved fremgangsmåderne i eksempel X. Resultaterne er vist i tabel VIA og VIB.

10

Eksempel XXI

Fremstilling af 153Sm(PA-DOTMA) kompleks.

15 Til 100 mikroliter (μΐ) 153Sm(0,3 x 10-3M i 0,0IN HC1; 5 mCi) blev sat 6 μΐ PA-DOTMA (høj Rf diastereomer fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 29, 5 mM i Milli-Q® vand), 20 μΐ af en MES buffer (1,0M, pH 6) og 1 μΐ af en HEPES buffer (0,5M, pH 8,7). Denne opløsning blev blandet i en hvirvelblander, og den endelige pH-værdi af blandingen var ca. 6. Efter opvarmning af blandingen til 90°C i 30 min.

20 blev den analyseret HPLC på GF-250 søjle for kompleksdannelsesgrad, og i almindelighed blev opnået udbytter på 90% eller bedre. Karakterisering af i53Sm-PA-DOTMA komplekset blev tilvejebragt ved sammenligning med det ikke radioaktive Sm kompleks, som var blevet syntetiseret og karakteriseret uafhængigt som beskrevet i eksempel 32.

25

Eksempel XXII

Fremstilling af ,53Sm(SCN-PA-DOTMA).

30 Til 153Sm(PA-DOTMA) komplekset fremstillet i eksempel XXI, der var blevet afkølet i 20 min. til stuetemperatur, blev sat 10 μΐ af en 1% thiophosgenopløsning i 90% ace-

I DK 175393 B1 I

I 102 I

I tonitril-vand medium. Blandingen blev omrørt kraftigt på en hvirvelblander og fik lov I

I at henstå ved stuetemperatur imellem 5 og 20 min. Reaktionen fandt sted straks som I

I overvåget ved HPLC analyse. For at rense det aktiverede 153Sm kompleks, blev det eks- I

I traheret tre gange (20 μΐ hver) med chloroform, og det vandige lag blev ført gennem en I

I 5 PRP patron (PRP patron = Mini-Clean® patron fra Alltech Associates, Deerfield, IL) I

I forbehandlet med 5 ml methanol og 5 ml af en MES stødpude (20 mmol, pH 5,8). Efter I

I at være vasket med 5 ml af MES bufferen og 5 ml Milli-Q® vand, blev det ekstraheret I

I med 900 μΐ 90% acetonitril til udvinding af ca. 90% af ,53Sm aktiviteten, idet de første I

I 100 μΐ blev kasseret. Blandingen blev inddampet til tørhed under reduceret tryk ved I

I 10 temperaturer under 40°C, og remanensen, der indeholdt det meste af titelproduktet, I

I blev anvendt til konjugation med antistoffet. I

I Eksempel XXIII f A og Bl I

I 15 Konjugation af ,53Sm(SCN-PA-DOTMA) til IgG og F(ab')2CC49. I

I Generelt blev antistoffet koncentreret og ombyttet til en carbonatbuffer (pH 9,1 eller I

I 9,5, 50 mmol) i en Centricon® koncentrator (afskæring ved en molekylvægt på 30 K) I

I således, at der fremkom en proteinkoncentration på 1,5 x 10"* M eller større. For at I

I 20 konjugere sættes et lille rumfang af carbonatstødpuden, den, som kræves til at bringe I

I den endelige proteinkoncentration på 1,5 x 10"*Μ, til isothiocyanatoderivatet af I

I 153 Sm(PA-DOTMA) (fremstillet i eksempel XXH) efterfulgt af det koncentrerede anti- I

I stof ækvimolært med PFC-,53Sm komplekset. Det blev blandet på en hvirvelblander og I

I fik lov at reagere ved stuetemperatur i en time eller indtil 40 til 50% af 153Sm blev bun- I

I 25 det til antistoffet, som vist ved HPLC analyse på en GF-250 søjle. Det mærkede anti- I

I stof blev isoleret ved to på hinanden følgende centrifugalgelfiltreringer på Sephadex® I

I G-25 søjler (2,2 ml). Homogeniteten, integriteten og immunoreaktionsdygtigheden af I

I det mærkede antistof blev analyseret ved HPLC analyse, og den tidligere beskrevne I

I standard biokemiske teknik. I

Eksempel XXIV (A og Bl 103 DK 175393 B1

Biofordelingsundersøgelser af ,S3Sm(PA-DOTMA) mærket IgG og F(ab’)2 CC49.

5 Undersøgelserne blev udført på lignende måde som beskrevet i eksempel X. Resultaterne er vist i tabel VIIA og VUB. Se fig. 15-28.

Eksempel XXV

10 Fremstilling af 177Lu(PA-DOTMA) kompleks.

Til 30 μΐ 177Lu(6 x 10'3M i 1,1N HC1, 4 mCi) blev sat 36 μΐ PA-DOTMA (fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 19); 5 mM opløsning i Milli-Q® vand). Opløsningen blev blandet på en hvirvelblander, og 115 μΐ af en MES buffer (1,0M, pH 6,0) blev til-15 sat for at neutralisere opløsningen til ca. 5,5 til 6. Den blev opvarmet til 90°C i 30 min. og gav mere end 90% chelatering. Blandingen blev ført gennem en PRP patron, forbehandlet med 5 ml methanol og 5 ml af en MES buffer (20 mM, pH 5,8). Den blev vasket med 5 ml Milli-Q® vand. Komplekset ekstraheret i 1000 μΐ 90% acetonitril kunne gøre rede for 78% af udgangsaktiviteten af 177Lu (de første 100 μΐ af ekstrakten blev 20 kasseret).

Eksempel XXVI

Fremstilling af 177Lu(SCN-PA-DOTMA).

25

Til 177Lu(PA-DOTMA) komplekset i 90% acetonitril fremkommet i eksempel XXVI blev sat 6 μΐ 10% thiophosgen i 90% acetonitril. Denne opløsning blev blandet på en hvirvelblander og blev efter 20 min. analyseret for dannelse af isothiocyanatderivatet ved HPLC. Reaktionen er i almindelighed kvantitativ. Fjernelse af opløsningsmidlet og 30 overskud af thiophosgen blev udført ved inddampning under reduceret tryk ved tempe- I DK 175393 B1 I 104

I raturer under 40°C i 1 til 2 timer. Remanensen blev anvendt til konjugation med an- I

I tistoffet. I

I Eksempel XXVII I

I 5 I

I Konjugation af 177Lu(PA-DOTMA) til IgG CC49. I

I Antistoffet IgG CC49 i en carbonatstødpude (50 mM, pH 9,1) blev blandet med en I

I ækvimolær mængde af isothiocyanatoderivatet (fremstillet ved fremgangsmåden i ek- I

I 10 sempel XXVI) i samme buffer. Reaktionen blev fortsat i 70 min. ved en antistof- I

I koncentration på 1,5 x lO^M, og det mærkede antistof blev isoleret og karakteriseret I

I ved fremgangsmåderne beskrevet i eksempel VIII. I

I Eksempel XXX I

I 15 I

I Langtidsundersøgelser af biofordelingen af ,77Lu(PA-DOTMA) og 177Lu(Pa-DOTA) I

I mærket IgG CC49. I

I Langtidsdyreforsøget blev udført med det 177Lu mærkede antistof, idet man udnyttede I

I 20 dets lange halveringstid (161 timer). Det blev udført med Balb/c mus gennem en perio- I

I de på 3 uger efter protokollerne beskrevet i eksempel X. Resultaterne er vist i tabel I

I VIIIA. Se fig. 29-34. I

I På tegningerne, som viser dataene fra følgende tabeller, blev anvendt symbolerne: I

DK 175393 B1 105 På tegningerne, som viser dataene fra følgende tabeller, blev anvendt symbolerne:

Kon iuaater_Symbol Tabel Figur Bio.Eks.

5 [153Sm(EA-D03A)]-IgG-CC-49 Δ IA 1-7 VTII

t153Sm(EA-D03A)]-F(ab')2-CC-49 Δ IB 8-14 IX

[153Sm<Bz-DTPA)]-IgG-CC-49 0 IC 1-7 ZA

[153Sm(Bz-DTPA)]-F(ab')2-CC-49 0 ID 3-14 ZA

[153Sm(PA-D0TMA)]-IgG-CC-49 Π HA 1-7 XI

10 [153Sm(PA-D0TA)]-F(ab')2-CC-40 P IIB 8-14 XII

[153Sm(BA-D0TA)]-IgG-CC-49 ]H IIIA 1-7 XIV

t153Sm(BA-DOTA)]-F(ab’)2-CC-49 ® IIIB 8-14 XV

[ 133Sm ( PA-DOTMA) J-IgG-CC-49 \7 VIIA 15-21 XXIII

[153Sm( PA-DOTMA) ]-F(ab’ )2-CC-49 VIIB 22-28 XXIV

15 [177Lu(PA-DOTMA)3-IgG-CC-49 ® VIIIA 29-34 XXVII

[177Lu(PA-DOTA)]-IgG-CC-49 ► VIIIA 29-34 XXVII

På tegningerne repræsenterer dataene følgende: 20 Pigur_Organ_ Titel_ 1 blod Biofordeling af l53Sm-BFC* 2 lever biofordeling af l^3Sm-BFC* 3 milt biofordeling af I®3Sm-BFC* 4 nyre biofordeling af l^3Sm-BFC* 25 5 tumor biofordeling af l^3Sm-BFC* 6 lår biofordeling af 153SM-BFC* 7 tilbageholdelse i hele legemet biofordeling af 133SM-BFC* 8 blod biofordeling af 153SM-BFC** 30 9 lever biofordeling af 153SM-BFC** 10 nyre biofordeling af 753SM_øpC** 11 milt biofordeling af 153sM-BFC** 12 tumor biofordeling af i53SM-BFC** 13 lår biofordeling af 1®3SM-BFC** 35 14 tilbageholdelse i hele legemet biofordeling af 153SM-BFC** 15 blod biofordeling af 153SM-BFC*

I DK 175393 B1 I

I 106 I

16 lever biofordeling af 153SM-8FC* I

I 17 milt biofordeling af 153sm-BFC* I

I 18 nyre biofordeling af 153SM-BFC* I

I 19 tumor biofordeling af 153SM-BFC* I

I 5 20 lår biofordeling af 153SM-BFC* I

I 21 tilbageholdelse I

I i hele legemet biofordeling af 153SM-BFC** I

I 22 blod biofordeling af 153sm-BFC** I

I 23 lever biofordeling af 153SM-BFC** I

I 10 24 milt biofordeling af 153SM-BFC** I

I 25 nyre biofordeling af 1®3SM-BFC** I

I 26 tumor biofordeling af *53SM-BFC** I

I 27 lår biofordeling af 153SM-BFC** I

I 28 tilbageholdelse I

I 15 i hele legemet biofordeling af 153SM-BFC** I

I 29 blod biofordeling af 177Lu-BFC*** I

I 30 lever biofordeling af 177Lu-BFC*** I

I 31 milt biofordeling af l77lu-BFC*** I

I 32 nyre biofordeling af l77Lu-BFC*** I

I 20 33 lår biofordeling af 177Lu-BFC*** I

I 34 tilbageholdelse I

I i hele legemet biofordeling af 177Lu-BFC*** I

I *CC49-IgG i nøgen mus med LS174-T-tumor- I

I 25 **CC49-F(ab')2 i nøgen mus med LS 174-T-tumor I

I ***CC49-IgGin balb/c mus. I

I I de nedenstående tabeller står AVG for gennemsnit og STD for standardafvigelse. I

I 30 I

I 35 I

DK 175393 B1 107 i_oieo<MOicot-« aiiDCTf-iocvjT-tro £ a ••-I— tH o ·-· - o (O o o *J IT) * Π o

O) CM

<ί ri

I CO CM CM O H CM CM

O l>* rø Ol CM O CM W

U CO-'-''-' i >ιηί-^·Γοσ>^·ο

CD < lO

O)

HH

r-i < (O CM CM (D O O Γ- γο QOCOr— t— *—iCMi—l o C-H »-*·--* 0 αιιο<-Ηθοοσ>οο 1 E * < ·<-

LU -U

E E CO

W 10 CM CO CM hH CO O

ro i- η ίο io r· o t- η in Ol O'-''--'

Η N >iHlO'«nrtNO

<—i tn «i ri in *r* < E «

HH O O

tø Ό «—» r— m <u h-> 4-> η o m in co cm cm σι j2 Φ οι c θΗίΐησ)ΐη»-Ηΐηο ni t- t_ — l η- ------- i- aiai oicocmooocmoo ου e •r ·*— ·*— ‘O --O +->

C C

•i— *r- ^ m co in <-h σι co o cm cm in o o i-η m cm

Ed? o.......

cn >r-iom«*r-cMO

CO < rH CM

in

H

M- m in co σι co co σι o co cm in in i-π o σι L.I— ----·· i * C 01 (Λ CM i-η o o o

E

r— ή V 4->

TJ

c. in O co in c- σι hj in η— o σ> n m >σ· ri o o.....i > ro m m i—i o co < CM n σι

•P

σι R) c > ro συ i~ t- υ "d ai *-> <u o o 00>*-l.Et-E ** i— dl *r- >. 3 <0 3

00 —I Σ Z l·- —I Η- II

C

K

I DK 175393 B1 I

I 108 I

H i_ »-< cm ro t- tn en r- I

I O ΟβΙ^Ιβ^ΝΝ I

£<=>''''**.. I

o> ·>-»— o o «-i ιο «-π o o I

«* +> co I

I

o o I

H u cm I

Η I

<m in »-i oo ro oo σ> 'i I

o t-ι o to in o> I

I

-O >oeiflt-ui>io I

<0 < «ο I

Hu. I

H I

Η f—i I

Η <o si οι ii w 'ί I

H **> OOCO<7>inmr~-.-t I

H ° i— ....... I

H a (UCOOOOC'J'JOO I

H e T-4 I

H <t -r- * I

H w +. i

I e ε co I

H (0(0 *3 O CO t—t CM O T—I 00 I

H CO«. CM O CO r-» in O' CM I

H m σ» o ....... I

H r-t\ >OC0<<t'9'i-H(>>O I

H «--* w <t to T-· I

I

H oo e w I

H <-< o o I

H (/)73 — I

H f- in I

H ©+»+> || CM t"· CO t—I to LO I

-Q © © C O'JONtOl'NIM I

H © (- t- '—' i_i— ....... I

H t— ©© ©(OOrHrHt-OOOO I

H O © E I

Η ·γ· -r- -r- i

Η •'O ·Ό 4-> I

H c c I

H r'r 7 NOlliNMlD« I

cm ui ifl si n » m rt I

Η ε & cd ...... I

H w >Η(0*}^ιΟ(μο I

(O < ID T-( I

in I

I i—I I

Η μ- i

H *° t- in o <o m o I

H QcniotMtoc-cocM I

H O) t_|— ....... I

H C ©(OOOt-IIOi-iOO I

H e i

H © -u I

H "O I

H C- lo I

H ° to co o in 'i w I

H CO r-( O) IO O) t- CM I

H ' > CO t- tn i-t CM CM © I

H m < rH T-« I

Η σ> I

Η i

H cn I

»I

C > I

π I

Η σ i. l. u I

H L- Ό © 4·* © o o I

H O O > ·— L E £- ε ^ I

H >-©·- > 3 <0 3 I

H CQ-IZZh--l|-ll I

Η I

H i DK 175393 B1 109 l_ to 10 ro «-i o O csi di t~ »» to co co to ro E O......

•-t— t-irHoooiO ro 4-» (/) rt

O

ot cm i-·

I -5 O ffl IC N II) O

O Φ rt (- t- η N (O

O C9 ~ i > lo io co co »-i cm o o < to t- o> n

<T OT C- r-l τ-l O LO CSI

o. o to o co id ro r- ro l·— t_h~ **«**·> *- o ojtorMi-tooajo to

E

N *r- CQ 4-<

E E CO

10 (0 «i r-t 00 CM t-H CO t~ tO

tot- eoiot-«otocr> ro to U> T-I \ > CM LO ti CO tD t-t t- i—1 in C «-< c- o E tn i—i o o —- tn o o *— r-t 0) +j 4^ li to to to co ro co co ai di c a ^ cn to co o ro to <0 1.1.-- i_h- *»»·.·.·.

t- 0) 0) <U</)CMOt-to«i© ro ϋ O E t-ι •Γ· *r »*- *—> 4*>

C C

*r- -I- iD «-< CO <D ID CD CD

Csl O O 00 O 00 σ> rH

e o .....

to > O O ^ (O N H O

CO <( H ^ CO

ID

T—I

M- (0 > id d d co N Ό- O O co o o *—i *—t t~ σ> i-i-.....

c <U(/)ror-iT-ii-icoo «»

E

0) 4-1

TJ

l_ LO

O r- »i σι cm o to to η- ot to to ot to ^ o o.»**..

-I- > Tj t- LO Tj ro CM LA

CO < CM «-« CO

a>

tn 4J

— a> at ε T3 4) r- O) O Φ C JZ r- ro a> σι. i_ c» e> t_ T3 o> +4 ai o (0r-

00>r-i_ES_.QQ) t— 0) -r- » 3 40 r— JC

to -j Σ Z I- -J ·>- H -r

I DK 175393 B1 I

I 110 I

L CM DJ t— ·*ί rn CO I

β οο>ΐΗΗη ^ I

EO~****** I

I Ol "~K OrH0U)r-«O<M I

-M W

I

U O I

O CM . I

I V-4 I

<m «ί o ^ t- in ro I

— o co cm r* in co in C3 * · * * * *

X> >OU>COOU)(MO I

(o <t ro 'i

I

i

H n—i I

< CD f- Cvl ιΛ O O O I

Q- O O in ID 00 CO I

I I— Ϊ.Η" ***** I

O «DtAOOOOlCMO I

i ε

N

H CD V I

ε ε <0 I

cow ·<* σι «ί ιλ N ixi to σ> I

roc. CSI rH ω <» 1Λ 'i 00 I

in u> o-«---'-

i-iv^ >OU>roi-<incM<o I

*—11 </)<«> .-i m I

H

ο Ε m M O O —>

CO Ό O

I H I

(14^4-* II CO in ID o CO O I

JD <D φ C Q>ctCSJi—CSJ I

m £_ l. — i_i— ******

Η Φ II (VCOOr-li-iCMinocO I

o υ e rH

H ·«- I

·—i *J I

C C

-r- -Γ- -et ro CO CM t- CO r- C*- I

rvii-iOCMrocot-f-i I

ε *> cd......

en >cMt-^ocor-icM I

H ro < æ η s m

I I

I ** I

(0 < O l·· O) ID 4 I

Q co co σ> id co cm ιο I

I Ol L K ******* I

c (UCOrHOOCOfOO Ti I

ε I 1— i

I φ +4 I

73

C- m I

O ro r- o in co ro I

<4- o o in r> σ> <<* cm I

o o--*****

··“ >int-*3iDincMco I

I CD < .-< r-< oo I

I I

tn +>

I ►— Φ I

Φ ε 73 Φ r— O) O Φ C _c (0 φ

σ t_ i_ cn ω I

C- 73 Φ -P φ O (Or- 00>--1-ΕΙ-.ΩΦ — dl 'r— >D<«r— X; æ —i ς: z h —j -r- i- <- DK 175393 B1 111 i- η η ία α οι in <u cm o σι in cm co r-i ε o - •'-l-^rirHOOOO 4-> (Λ Γ0 T* <n cm ^ r~>

I Ό IO i-· IO ID 4 O

O n ri O N n ^ N

o O '......

I >t**'^'OiOCOrlO

O < t- cn 1—1 < co cm cm σι ro t- co I— oomincoiocoi-· O £-1-.......

O dlCArioOOt-iOO

I B CM

< -ι- Ο. 4-< SE σι

CO (0 Μ (Μ Ol t- 1} ΟΙ Ol ID

ro l cm m cm in co »—i CO O O - »»"·-» r-t --- >COin«titOCMi-1© >—I 1/1 <t rH t- < -r- i-i ε ιο

►H O O

V) Ό — *— in

d> +1 4J II O r-ι O in CO CM ID

.O φ 4) C O *"M cm in CO CO CM

(0 UC-'-r h- οι a> ucncMooocooo

O O E

-f— *r- •Ό ··“) 4->

C C

·ι-·ι- in oo cm in co «—i cm CM t-tæor-ccooro e de o.......

en >comtn<ocMCMO

CO < ri M

m

«—I

Η-

10 ΟΙ *ί O CO O rH C7I

QC0rHt~00O*<»CM

o* i-l·-'**'··’·*

C Φ (/} CM »—I 1—1 O CM O O

E * r—' 'r 0) Ή x> c_ m O » m in co «-· rH σι c- M- in cd cm σι o co to cm o CS »**»**·«·

•1“ >^COIO'»^CMO

CO <t CM ri O) O) ft c > (0 OL. I_l_

C_ T3 φ +J Φ o O

00>I-I_EI-E ** i— 01 -r- >, 3 M0 3 oo —i ς: z v- —i H- ii c * I DK 175393 B1 I 112

i_ r-> <£> o ta r-t ao η I

roocMr-«t-cM«-icM I

E O I

Η σ> "-ΗοοοίΛτ-ιοσ I

'tf -M V) * I

I

u o I

CJ CM I

I I—i I

CM CM rH r-ι O rH r-l W I

— O l£> t- 00 in -3 I

C3 '»**** * I

η >ο<-Η^σ>ιηοο I

(O < rH I

o. I

I

H r—i I

< CO *-· CM C— t—I CM O I

t— OO*3C0r-<<7>CMT-l I

O Uh-....... I

o rotnooocoi-ioo I

I

<i I

H cl i-’ I

I E £ co I

to ro »a· n co η n o οι I

nu n ro- n cn cn «-< cm I

in cn c> - «- ».·.«·. I

«-* — >0^nr-l«3r-IO I

1—1 V) < ID «-Η I

I CQ ·ι~ I

>-i ε in I

n o o I

w tj I

r- un I

ω 4-» +> ii in cm m o c- in η I

ύ φ ti c Ost-n^T'^ocMi-H I

ro c_ u -— i_h- -

t- a> ro roooooocoiooo I

o υ e * I

H * r— - r~ ft- I

·>"»·'-»'+» I

c c I

-i- -r- in 3 r- co cn 3 σι I

CM CM O CM C- O η I

Edf a....... I

c/} >cMinnoocMr-)0 I

n < c- cm I

in

I T~M I

Η- I

ro u>CMTtnnr-co I

Qt-C0C0C0inr-iO I

σ> u i- ..... I

c rotooooincøoo I

E I

r— *r I

4) *j I

Ό I

u in I

o ««nocooino I

η- r- co co cm cn ^3 cm I

O o *.«.·.*»** I

•r· ><3t~-3rHt~CMO I

CO < r-· lO rH I

o> I

Μ I

CT I

ft) I

c > I

ro I

σ u i- u I

c tj ro -u ro o o I

00>r-C-EUE'? I

*-<u-r->3*rou I

CO _1 Σ 2 l·- -I t- II I

c I

* I

DK 175393 B1 113 i_ *3 co co co o co to <U WlOtM'it-'it-· EO - -f-HCMOr-ioinoo

4-> to * * CM

o cn cm

T* 1-H

i eo «ο <o σι to t- o

O tDCM(-«tfCMr«CM

O O ' ' ~ ~ ~ ~ i >co*rcocoto«-'0 O >4 co O) I—( i

f—I

< CO O LO t CO o to

J— Qlfl^nWMOO

0 Lt-.......

Q d)C/)OOOOt—*oo 1 e * * *“· < CD 4-> ε ε ω (/) (0 .-· to co t— co o

CO L LO Γ0 I— 1-1 CO O CM

U) OT O ' ~ ~ ~ '

H \ >(0»O4C0lOCMO

c 1—‘tø < ·-» *Λ t—I ·“ t—i εν)

i-t O O

tø "O O

r“ <D (i v I CJ> CM C- CO tD LO 4

.Q (1) tt) C QC-<DOC04C0O

« s_ c- " C- I ' ' ' ' ' ~ ~

i— tt) IU ll)(0<^OHOU)OO

o o ε -»c * •I- -I- *·” Ό ’’"I 4->

C C

•r- -r- CO CD <*) CO ΙΟ rH 00 CVI tO 'T CD O CD CO i—i S <K> CD.......

to >f^totococo«-<o co 4 h oo to

H

M-

cO cno)t-«OtD"4CM

O OM C* CD tO 0> OO CM

OT C-(— ~ ~ ~ ~

c tt)tn«-MOOOCMOO

•r- ε i— *r— <l> +* Ό

L lO

O « 0)C0CM*4f—1*4·* M- LO CD lO lO 00 ^ lO 00

O

-r- >«tC-lOCO’<iCMO

£D <i CNJ H

cn 4-> cn to c > (0 σι- i-i-

C- Ό CD +* β) O O

oo>,— t. e u ε

r— tt) ** ^ D CO D

co -· ε z i- -< i-

I DK 175393 B1 I

I 114 I

!_ r~< IO O C- ΙΛ O I

aiotMcocoiftco. i-m I

E ........ I

cn -r-t-ooo<MtMOO I

4 +J (Λ * I

i I

o o

cj cm I

I H I

cm <o co <o co σ> co cm I

.—. O CO ·Μ C71 ro «5 r-ι I

C3‘'*'‘‘‘ I

a >οι-··-ί'ί·ί'θο

(0 4 CM

lu. I

I I

I < φ GO (O ri (Cl CQ ΙΟ I

I I— oocococ-cmcmo I

O L H .......

o a>coooot-cooo I

I . ε * I

I 4 I

I to v I

I ε ε <o I

cocoh*cocmco4cococ'· CO L CM <M CO 4 (O O r-l I tnoi o .......

r-i\ >0*»CM0C-hH0 I oa *—· w < to r-i

n I

I t-l EU) I

I HH O o I

(I) Ό r- r— tf)

φ -H> 4-* II CM CM CM CM «-Η tf) t- I

J3 <U a> C O 4 CO CO CM CO rH O I

ro 1-0.--- i_)_. ......

(— O V (DCOOOOCDrHOO

u o e * I

*r* ‘r- ·ι—

I *·“> ·—> 4J I

c c

-r- -r- H* CM CO Hi (71 00 CO CM

CM H»«—IQIr-HCMOi-H I

Ede o»..*».- CO >CMCOCOt-4T-H©

I CO 4 C— CM

ίο I

I f”H I

I M- I

(Q CO r-H CO σι 4 CO CM I

Qcot-tocncMr-HO I

O) LI- .......

C 4JC/)0004CM0O

-Γ- E * I 41 -Μ u

C. IO

o cm » co σ> co co t— I

tf- (OCOO)CMIOhHhH

o ca .......

*r- >10Γ-ΌΟ·<5ΓΜΟ

I CO 4 t-* iO hH I

I σ> I

I *-> I

σ> I » I C > ro U S- i- t-

C- Ό Φ -H> Φ O O

O O > «— C.EC.E4 >— Φ -r- > 3 <0 3

ίΟ—ίεΖΗ—Ih- II

I I

I I

DK 175393 B1 115 i- <« n CM W (M Øl « Q> n ic β η η n o eo ........

•«-Η- ro O *-· r-ι to o o 4-1 l/) ri * * ' *

O

tn cm 1-4

I Γ0 r4 LO f- ID CM O

O t- C- c*» IO © CO «Η CJ o

I >tH^J-U)C0CMi-4O

© <. 1-4 01 σ> n

Γ—I

<£ CM 1-4 ι-H o li σι CVJ

I— Ol-4ifOCOCMCOO

O S- h-.......

Q φΟΙτ-ΜΟΟΟΎΟΟ I E * * * < •ίο. 4-* 3 e co _j m σι *-< co co co i-π co

t- L. CO 1-4 li i—< CO *“4 O

t— D) O -------

h \ >>«io^rcoiocMO

i—> (/) < H LO

< ·· > £ U1 1-4 O O ·—·

(Λ *D O

r— t—·

O) 44 44 II 01 H >» in 14 O N

.Q 4) <D C QIOCOCM*»CMCOO

ro £- i- — s-H - -- -- -- i— ro o rocor40i-4ocooo 0 O E ******* *r- *r“ *-*

•η ·ό 4J

c c •r- -r- li ro -i t~- co co tn σι

CM li t— li 1-4 o r-4 O

3de cd ~ -.....

_i >σιιοιο^σΐΓΜθ C- <!-<** *ϋ** c- * * 1-4 H- ro cm ϋ id m σι co σι

Qcocoincocooo σι l k -------

C OCOiil-lT-lOCOi-lO

E * 1 - -ΙΟ 44 Ό c_ in o o σι in μ οι n v*. m ϋ cm co σ> c- i-· o CD -------

•r- >(Ot-(OCOr4CMO

00 < CM 1-4 O) 44 σι « c > ro σ <- C- t- l td ro 44 ro o o M-

00>1-LEC.E

·— Φ -1- > 3 40 3 II

cd —i ε z L— —i ι έ *

I DK 175393 B1 I

I 116 I

s_ n ί r· n æ κι η I

(UOOJCMr-IC".CM*-i I

EQ I

C7> -'-h-OOOCMOOO I

-M </) * * * I

I

U O

O (Μ I

I

(M τ* O Γ0 CD O) <-T Cn I

o <r> ro oo io tj t-< CO «»»«.»»·.

JQ >OrHrTinTiOO

(0 < rT

I

I I

< a> in *3· t- m ro to I

I— OOTic-TirOTJO

O l-l- - o oicrjoooiocNJOo

I E

< · I

CD +>

I 3 E oo I

—in τί t- m o w Τ» w c- I

t>- L. « N β « i O O

t- O) O-··'-'''

t-·^ >ococMComoo I

' W < T* 1-1

H cd I

> E V) ·-< o o W -D —' i— m Η φ4^4->ιι om «-» m co co co co η οι a> c ooommt-iocoo <0 L L —L I— τ—* » k fc ' '

k cd <u aitoooouocMOO

O O E *******

H >r~ -r- *r- I

"-> "O +>

C C

·Γ-·Γ- τι O Ti O O O in O

CM^miOTtr-l^·—I

3de cd »*»***» _j >cvjincOTio)^Ho C- <***t>H** c~ * *

I ^ I

I i*- (ø c- r~- m <m o o cr>

O 00 CM CD Tt co 00 O

D) 1-1- »»»«·'<.

c OJCOOOOlOtMOO

E * *

I r* *r I

I 0) 4-> I Ό s- ta

I o m cn t-ι cv σι oo o I

<4- tO (O C\l OD t" i—' r-< O O*·.»»'···*

-r- >CMtn*tCOOCMO

CO < T+ CO «Τ I οι i

I I

cn

I »I

I c > (0 σ i- t- t~

1- Ό 0) -ts Φ O O

00-><-l_Et-ET» r— 0) -r- > D -TO 3 æ_iszi-->t-u I cl

I I

DK 175393 B1 117 u « io co n <} m Φ gi <m co η n ^

B Q

•i-f-CJriOOi-'O 4-> CO CM

U)

II O C CM

H

N CO Ol 1“ N M

(O (O t-i CO O

σ> o .....

^ > (O ΙΟ Μ N O H

i < ρ- ο o 1 o O)

H t—l CO 00 O €0 *H

i o æ ci η ίο <J h i—i I- 1— ' ' * v v '

__. (DCO OOOOLOO

< E * * * * t~ ·“ o LO 44

O II

i E C co <(U < LO CM CD «Ο ·Η O) 0_t_ co to co co c~ «— O) o - - - ~ * > s. > ir> »o m ro co i-·

o W < H

o> -r~ < «—· tn > O -»

E Ό O

t— O «”·

0) 0)4-1 II O) C> N ID O M

ja Φ c □ iB t- r- o ί m (0 4-> I- ^ l-l— ' t— a> <υ (dc/)cmooi-ii-io u υ e *

φ -r- -r- -K

o ·π ΙΟ +1

•r- C II

-r-j-r· c Μ N iH o U) n *-·

c cv CM CD W CO C- CO

-Γ-d? O.....- > CO I- lO If Ί Π > < i-l

O

at Ί- ø IB N IB (O οι ΙΛ o σ> rr cm lo c- i-i O» t_K *»'***

C OJLOi-lOOOOO

— E

1— *r- 0) co 4-»

Ό II

1. C LO

O LO LO CO -M- LO Lf)

H_ ι-H CM ι-l O ** O

O O......

-r- > LO CO ΙΟ Γ0 CM CM

£Q <. CM «“*

C

<0

0 t. t. CO

1_ Ό <U 4-> <U O ^

O O > ·“ t- E t- II

i— o> -t- » rj <o il co _i ε z H· -i c c

IC

IC -le

I DK 175393 B1 I

I 118 I

[_ N N <ί O 51 Μ I

οι o ro w co o »-· EQ - ~ ~ *

-<-i— OOOCMCMO

+» u>

o I

Dl CM

H ^ i-ι I

<9 <o co (D ro co I

o o id <o co oo co I

o α ' - ' ' - '

> Q r-l <-H CM ID O I

CM < «-·

η I

u. η o n r* pi π I

i O O CO t- CO O tH

·—1 l-f— *·*·**· — φιοοοο^ιλο < B * I- O 4-1 o

I E CO

Q.L· co o id co co co I

— σι cd ~ - * - * * >- s. > o ro cm cm r-- o

O ΙΛ < rH

σι H CQ *—* V)

> o I

£ "Ό ·—·

t— O CO

ΦΜ-ΜΙΙ ID CM Dl CM C- ·9

J3 (uc QO'-a-'^cnr-r-H

«o -*-· i_ —

t~ Φ Φ (DIOOOOID^O I

I. O E * -K

0) -r-

I ϋ ·Ό -P I

-r- C

I ‘O -r- tf CMCO^O^iCM I

C CM (VJ H 'J ^ ^ ri ·> de o*-'»'*

> CM ^ CO LD CM .-I

> < U> CM

o σ»

i I

I π σι m CM CD CM I

O r-ι CD CO CD CO CM

CD - ^

I C Φί/5τ-ιΟΟΙΛΟΟ I

I E *

I Φ -M

t>

C- ID

O t- CD t- O 00 CM

<4- CO σι CM ID O *ί O CD «--·» »

I >- > O ΙΟ Μ Μ O H

I CQ < 1-t «9 rM H

I I

Ira I σ t- l C- Ό Φ -P φ o o q > >— (- ε u

<— Φ -i- > 3 <o II

cq _i s: z i- -i

I

I i DK 175393 B1 119

l_ (fl t- H (71 N ID

d) O N 'ί Η <71 Η E O......

07 Tj-»-7— r-lOOOr-lO

Ί -4-» co cg I <1

O O

CJ C CM

t H

o (71 'J f) t- (O (71

O) ^ (I) IO g N N

HH β * - « » > *

I > O) <ί ^ rt 07 H

i—. < <£> <

H

O

O

i co «-« co ιλ βο o> < α t- τί cd *i c- cg BJ LI--··*-*» i ajwooooino O m e a> -r- Σ 1 II ** E E C co (/)(0 - *3 CO CM 07 C- TI LT)

Γ0 L CT7 CO IO TI CO O

U) O) O*»««»» r—i \ > co id ti co oo cg *—i g/) r-l il) < ·· n-ι ε μ > o o w *o r— φ 4J gg 00 CO Ti r-ι C- pg

β φ QJ Q r-l iD lO Ti CO CO

Λ I- !_ t_t- - ^

I— Q)d7 d)(/)t—IOOOCOO

o o m ε I— -t— *r

•I~) 'ro II -M

C c •i- -i- C Ti C- CM O CO ti Ti cg in cm o cg u> o E <*> O......

to > ti cd Ti CO T-H rH

CO < r( »I

ΙΛ ri M- <0 LO CO O ^ r-l C"-

O C- 07 *» CM O) CM

07 I_h—

C 47 CO O r-l r-l O CO O

U7 E * * r— mr~ 47 II +> Ό

[_ C IA

O CO O 07 CO O Ti g- O O CO τι O ΙΛ O CJ **«· ‘ * -r- > r-l 07 LO CO 00 cg CQ <C CM «-*

C

(O

σι. t- t- Ό 47 4-> 47 O Ti 0 0>«-t-Et- I- O -r > 3 < 11

m J Σ z 7- J

c * I DK 175393 B1 I 120

σ> I

H "i i_ ro in co «i co o I

I 0) O in (O o ri I

o I

O *»’>-»-000(Μ00 I

** 10 * * I

OJ II * I

'-o I

C CM I

H Δι-t i

H <0 ΙΛ l£> CO in r-4 CO I

H w O «f ri CM CM ID I

u. ο«''-«'·. I

> O CM CM in o I

>—· < cm I

I < I

h i

o I

□ I

Η I co t- o σ> o co I

< Q O CM CM CO O I

m c_ t— I

I 0)(/)000(000 I

o to ε * * I

G) I

Σ +» I

I ε ε c co I

(ΛΠ3 ·Μ· ri CM CT) CO CO O I

co C- co to in (O co o I

Η in CT o»--·.·.« I

H \ > O « CM C" CM σ I

>— (Λ < ·* ri I

03 I

ε in I

> o o I

Μ T3 I

0) +< 4-> W t- CO (D CO CO ri I

JQ0)(L)|| O (O r-( C— O (O CO I

co c i_ c {_(-<'-><> ·> I

K“ 0) 0 ØlOOriOCOnO I

o o w ε I

·ι— I

·ό ··-> il +j I

c c I

·>-·>- CMTCOt-COlOOrl I

H cm ri in ri co co I

Ed? > C9 * · * « » * I

in ><M<øco<rt-T-< I

n c t~ r-> I

LO I

^1 *“* i

Η η- I

(0 ID to t~ ΙΛ O O I

OCOlHincOOlO I

H O) LH I

c cutnooomcoo I

w e * * I

·->-* * I

0) *·> I

ό I

t- c m I

o co co m c- σι T-< I

η- σ> in σ> o w to I

o o »«....« « I

-Γ- > CM ID CO C- CM CM I

00 < 1-1 ^ ri I

I I

tø I

o i_ t_ I

(- "D 0) 4-< φ O CO I

00>>— £-EI_ll I

>— <U -r- > 3 o ti I

00 _l Σ Z l~ -I C I

cl

I * I

* * I

DK 175393 B1 121

L. i-i Ol CO (O O CO

<D σι to m co to o EO - -- -1-- ·<-(— ooooroo

V (O TH

o en cm M r-t

I CD CM CM t— in CM

o m (> t* n « cm o co ------ i > o <} o n ic h to < to σι 1—4 F---1 < to cm tn tn ro o I— q co co ro t-ι o *-< o l_K - -- -- - q v to o o o o o o I E * r-l CL 4-> E e æ tom »a cocototnoo rot- c σι to a a ιησι ο - -- -- - η \ > »-< ro co ·μ i-· < —' in <. r-t *a 4-4 -r- I—· £ tn > o o W Ό *— m οι +14-» ii t- tn in r-ι cm ri Ώ o> a) c o co r-ι ia in i-4 co t_ t_ !_|— - -- -- - i— αιαι 0)C/5i-4»-400cmo O ϋ E * •f- *r- ’f— “Ό ·—> +4

C C

•l-.r- 1ί CO CO GO c— in to cm m to cm o oo to £ de co ------ to > te to in 4* h ri ro c i-ι co m 1-4 M-

ItJ f—4 t—4 CO co O O

O i-· m o cm i-ι cm cn li-......

C (UCOi-404—lOCMO

*· E * <U 4-4 Ό l. in O o r-ι in co o μ- o t- o io «a οι o co - - - - - - •i- >COC-IOCOOi-4 m < cm i-ι c (0 σ t_ l.

t- Ό (D 4-< OJ O

O O > ·“ t- E t.

·— æ ·4- > σ -co ii m -i ς z i- -i c * I DK 175393 B1

I 122 I

H S- N N Γ) U) H <} I

Φ O CO i-l tø © CM I

σ> eo **>*-« I

^ OOOOCMO I

+· tn * * I

υ I

o o I

CM I

H N H I

—c- co cm to o cn I

o σ> © co © t- I

jQ ø > k k . I

(0 > O th © ««» 4 o I

" < H I

u. I

Η I

p~i i

< I

H t— © tø cm «? co co I

H s; o o tø tø o co cm I

o I

Q 0) (O O O O C** CM O I

I

< I

I CL V I

Η E E CO I

H (/) to co lo © © tø tø I

H ns. co tø o cm cm © I

10 O) cd . - s. I

H t-«X. > O CO CM W 10 O I

Cø 1 ΙΛ < 4 t-l I

n I

H E tn I

> o o I

(Λ Ό I

H Φ -t-> 4-> tø co © ·~ι to cm co I

-O ib ω ii o r-t «s- co tø o *-< I

H IDC-C-CC.I— I

Η f- Φ Φ 0)(/)000tø<-<0 I

o o ε I

-r* I

H ”~t "O V I

c c I

H T--r- 4 ^ 10 CO © tØ I

' CM CO CO CO 10 CM O I

ε <x> o..... I

Η <Λ > τΊ ΙΟ CM «0 *3 ι-l I

H CO 4 10 rH I

H to i

I

I M- I

n> tø cm tø co tø I

H O O tø CO CM CM o I

O) t_|— ...... I

H C llCØrHOOlØCMO I

I

H »—

I φ *j I

Ό I

I t- u> I

H o 10 CM CO CO tø t— I

H **- o H o n co c— I

O u > t « > i > I

H ‘f > CM 10 O r·# i—I I

H CO < tH iø r-· I

H c I

to I

σ t_ l I

U Ό φ V φ O ^ I

o o > ·— u ε i- I

Γ- φ ·γ- > 3 mo II I

ca _ι ε 2 μ- _i I

c I

I I

DK 175393 B1 123 ro σι in cm o Q co ro in cm ro h ' ' ' ^ '

(/) O γη O O O

0) σ COrHfOt-t-

(0 CD CO ^ O «-Η ID

O > < σι m to cm r-i σι h

«3· CM

0 u m t- co ro co 1 d o in σ> cm CD I- ' ' ' ' '

σι <L ΙΛ ri O O O O

►η σ i ns i—> Ό n m οι Ί ic < 'i r-ι r- o »x ro Σ r-ι CD ' ' ' ' '

h- > -X CO CO CO CM

O < —1

O

<

CL

i-r σι o t- <ø

3 E O t- t- 00 Ol rH

_i ro 1------ Γ- L (7)00000 c- σι α> * < η s σ i—i ·—· tn ro

M T TJ

i-ι Ein r— i-< σι r-ι "X

> o O > O M ID t- N ffl OT T3 >'---' r— in < cm co o m cm α> 4-> 4-> II CM r-·

Δ 0) Φ C

ID L L

I- 01 01 o o co r- c- co co

•r- □ ΟΙ M 10 S O

•Ό "O LI—'··'·'

C C O) (/> O vH O O O

•r- -r- E * * •r

D Df V

_l LO CM »—* MJ CD

C- CD CM CM Ol »H in C~ Ml· CD ' ' ' ' ' i-l > O i-l O O ^ <t CO H i—l H-(0 σι c co co to id in

·.- O CD «-Ι O *X

i— LI—*---·

α> O (Λ CM O «-Ι CM O

ό e L ·*· o 4-> in l-ι O CM t- M- co o i-< w σι o ”X CD ' ' ' ' '

•r- CM > i-l O O IO CO

CO ^ CO H T-* ,

C

ro σ l l tj α> Ί-* ei m

O O > '— L L

r— OJ CD II

m -i s: z -» c

K

I DK 175393 B1 I

I 124 I

I η η n ^ t» I

Q O <3 ** (O rH

I— I

CO rH rH ,-H O O I

I

I I

Q ΙΟ t- o r-l I

TO CO CO O ID lO C— I

T3 > ' - ' > - I

< O IC ΙΟ N fH,

CD r-l I

I ^ CM I

o co co o σ> o I

Ο I» ^ rt Η Μ I

H q « « ·. I

O I— O O r-l O o I

O) <D to *

*-* o I

ro i—i Ό

Η o η ία r- o I

<t ">ί C- tø (M CM to I

I Σ H o * ^ ^ k I

(— > ή» co σ> co cm I

O < H I

o

< I

Cl

—r CO U ΙΛ O «“· I

3 E Ω O O CM ΙΟ Hf _ico i— ' ' - - '

I Γ- L LO rH r-1 rH O O I

c~ σ> <υ I

< rH \ σ

H I—I t/l TO

l-H Ό I

l-H ε (Λ to O CM CO CO I

> O O I- O Cl N IO Cl Ol I

(Λ TJ >.....

<— lo < rH σ> O Hf CM

β> Ή 4-> Il CM rH

n «u v c ro t_ i_

i— cd o> I

O U CM f- Hf σι rH

-I- -I- Q o CM to lO lO

·—>

CCVCOCMrHrHOO I

-r- Ε

I 3 if I

—I CM -i LO O Hi

C~ CO Hf 03 ΙΛ CO lO

t- i o . . . . -

rH > CO O rH LO CO

< CM rH rH

«> I

ro I

cr> I

I c c- Hi r- ro cm I

’>- Q to co hj co co I

I— L )- - « > « «

(U 01 CO O t-H rH rH O I

T> E *

O CO Μ Φ C- li) I

M— CM LO CO tO t£> O Hf O -

-i- CM > O rH O C- CO

CO < CO rH rH I

C I

ro σ c.

t- Ό o> cd «» I

o o > i- c_ c.

·— ro <- > .« ii

æ -j ς 2 -J I

c

* I

DK 175393 B1 125

Andre udførelsesformer ifølge opfindelsen vil være indlysende for fagfolk ud ffa den foreliggende beskrivelse eller praktisering af den beskrevne opfindelse. Det er meningen at beskrivelsen og eksemplerne kun skal betragtes som eksempler, idet opfindelsens ide og omfang er udtrykt i de følgende krav.

5 1

Claims (5)

1. Bifunktionelt chelateringsmiddel, kendetegnet ved, at det har den almene formel I I 5 I I q I I _ *3 I I \Z~\' /-(Cfi2)-C-V N-Q I I ,o ' y m h I Q i I (iå) I I hvori I I 15 I I den ene af grupperne R2 og R4 er hydrogen, og den anden er nitro, amino eller isothio- I I cyanato; I I R3 er Ci-C4-alkoxy, -OCH2CO2H, hydroxy eller hydrogen; I I 20 I I hver af grupperne Q uafhængigt er hydrogen eller (CHR5)C02R; I I Q1 er hydrogen eller C02R; I I 25 hver af grupperne Ruafhængigt er hydrogen eller CrC4*alkyl, forudsat at mindst tre af I I grupperne fra summen af Q og Q1 er andet end hydrogen, og at R3 og Q1 ikke begge er I I hydrogen; I I hver af grupperne R5 uafhængigt er hydrogen eller C|-C4-alkyl, og I I 30 I I m er 0,1 eller 2; I DK 175393 B1 127 eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.

2. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det farmaceutisk acceptable salt er valgt fra gruppen bestående af kalium-, natrium-, lithium-, ammonium-, calcium-, 5 magnesium- og hydrogenchlorid-addukter.

3. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R og R5 begge er hydrogen.

4. ..Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R er hydrogen og R5 er methyl. 10

5. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R3 og R4 begge er hydrogen.

6. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den har den almene formel 15 ? *-jX_ ? r > \___^-<C,)2>-C-'M"Q 1 (ΙΓ) *) hvori hver af grupperne Q er CHRSC02R; hvor 25 hver af grupperne R uafhængigt er hydrogen eller Cj-C4-alkyl, R3 er C|-C4-alkoxy, OCH2COOH eller hydroxy, og m, R2, R4 og R5 er som defineret i krav 1, eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf. I DK 175393 B1 I I 128 I

7. Forbindelse ifølge krav 6, kendetegnet ved, at den har den almene formel I I 5 I Γ -(CH2)-c-ir N-Q I I R^ * H I I (IV) Q I I 10 hvori I I Q og m er som defineret i krav 6; I I R3 er Ci-C4-alkoxy, -0CH2C02H eller hydroxy, og I I 15 I I R4 er nitro, amino eller isothiocyanato, eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf. I

8. Forbindelse ifølge krav 7, som er l-(2-methoxy-5-aminobenzyl)-l,4,7,10-tetra- I I azacyklododecan-4,7,10-trieddikesyre. I I 20 I

9. Forbindelse ifølge krav 7, som er l-(2-hydroxy-5-aminobenzyl)-l,4,7,10-tetraaza· I I cyklododecan-4,7,10-trieddikesyre. I

10. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den har den almene formel I I 25 q I i ° I I (vt) I DK 175393 B1 129 hvori hver af grupperne Q uafhængigt er hydrogen eller CHR5C02R; 5 hver af grupperne R uafhængigt er hydrogen eller Ci-C4-alkyl, forudsat at mindst to af grupperne Q er andet end hydrogen, og m, R2, R3, R4 og R5 er som defineret i krav 1; 10 eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.

11. Forbindelse ifølge krav 10, kendetegnet ved, at den har den almene formel Q 15 i-λ ?°2R \ / R2-/' \\-(CH2)-C“-N N_Q Q 20 <m> ' hvor Q og m er som defineret i krav 10, og

25 R2 er af nitro, amino eller isothiocyanato, eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.

12. Forbindelse ifølge krav 11, som er l-isopropyl-4,7,10-trimethylesteren af a-[2-(4-aminophenyl)ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1 -(R,S)-eddikesyre-4,7,10-tris-(R-methyleddikesyre). 30 I DK 175393 B1 I 130 I

13. Forbindelse ifølge krav 11, som er Oi-[2-(4-aminophenyl)ethyl]-l,4,7,10-tetraaza- I I cyklododecan-1 -(R,S)-eddikesyre-4,7,10-tris-(R-methyleddikesyre). I

14. Forbindelse ifølge krav 11, som er <x-[2-(4-isothiocyanatophenyl)ethyl]-l,4,7,10- I I 5 tetraazacyklododecan-l-(R,S)-eddikesyre-4,7,10-tris-(R-methyleddikesyre). I

15. Forbindelse ifølge krav 11, som er det blandede ammonium-kaliumsalt af α-[2-(4- I I aminophenyl)ethyl]-1,4,7,1O-tetraazacyklododecan-1,4,10-trieddikesyre. I

16. Forbindelse ifølge krav 11, som er a-(4-aminophenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklo- I I dodecan-l,4,7-trieddikesyre. I

17. Forbindelse ifølge krav 11, som er a-(4-aminophenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklo- I I dodecan-1,4,10-trieddikesyre. I I 15 I

18. Forbindelse ifølge krav 11, som er a-(4-aminophenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklo- I I dodecan-1,4,7,10-tetraeddikesyre. I

19. Forbindelse ifølge krav 11, som er a-(4-isothiocyanatophenyl)-1,4,7,10-tetraaza- I I 20 cyklododecan-1,4,7,10-tetraeddikesyre. I

20. Forbindelse ifølge krav 11, som er 1,4,7,10-tetramethylesteren af or-[2-(4-nitro- I I phenyl)ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1,4,7,10-tetraeddikesyre. I I 25 21. Forbindelse ifølge krav 11, som er 1,4,7,10-tetramethylesteren af a-[2-(4-amino- I I phenyl)ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1,4,7,10-tetraeddikesyre. I

22. Forbindelse ifølge krav 11, som er a-[2-(4-aminophenyl)ethyl]-l ,4,7,10-tetra- I I azacyklododecan-1,4,7,10-tetraeddikesyre. I I 30 I DK 175393 B1 131

23. Forbindelse ifølge krav 11, som er Of-[2-(4-isothiocyanatophenyl)ethyl]-l,4,7,10-tetraazacyklododecan-1,4,7,10-tetraeddikesyre.

24. Forbindelse ifølge krav 10, kendetegnet ved, at den har den almene formel 5 0 /3 /—S C02R C / // \\_(ch2)-c-N

10. H Q (vin) hvor 15 hver af grupperne Q uafhængigt er hydrogen eller CHR5C02R; hver af grupperne R uafhængigt er hydrogen eller Ci-C4-alkyl, forudsat at mindst to af grupperne Q er andet end hydrogen, 20 m, R3 og R5 er som defineret i krav 1, og R4 er nitro, amino eller isothiocyanato, eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.

25. Forbindelse ifølge krav 24, som er o;-(2-methoxy-5-nitrophenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1,4,7,10-tetraeddikesyre. 25

26. Forbindelse ifølge krav 24, som er tetraammoniumsaltet af a-(2-methoxy-5-aminophenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1,4,7,10-tetraeddikesyre. 1 Forbindelse ifølge krav 24, som er tetraammoniumsaltet af a-(2-methoxy-5- 30 isothiocyanatophenyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1,4,7,10-tetraeddikesyre. I DK 175393 B1 I I 132 I

28. Kompleks, kendetegnet ved, at det består af en forbindelse ifølge krav 1 eller et I I farmaceutisk acceptabelt salt deraf kompleksbundet til en ion af et metal valgt blandt I I La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Y og Sc. I I 5 29. Kompleks ifølge krav 28, hvori metallet er Sm, Lu eller Y. I

30. Kompleks ifølge krav 28, hvori metallet er l53Sm, 166Ho, “Y, 149Pm, 159Gd, 140La, I I 177Lu, 175Yb, 47Sc eller 142Pr. I I 10 31. Kompleks ifølge krav 30, hvori metallet er 153Sm, 177Lu eller I

32. Kompleks ifølge ethvert af kravene 28-31, kendetegnet ved, at metalionen er I I kompleksbundet til en forbindelse ifølge et af kravene 6, 7, 10,11 eller 24. I I 15 33. Kompleks ifølge krav 30, hvor metalionen er kompleksbundet til forbindelsen I I ifølge krav 18. I

34. Kompleks ifølge krav 33, hvor metallet er 153Sm eller ^Y. I I 20 35. Kompleks ifølge krav 30, hvor metalionen er kompleksbundet til forbindelsen I I ifølge krav 19. I

36. Kompleks ifølge krav 35, hvor metallet er 153Sm. I

37. Kompleks ifølge krav 30, hvor metalionen er kompleksbundet til forbindelsen I ifølge krav 22 eller 23. I

38. Kompleks ifølge krav 37, hvor metallet er 153Sm, ^Y eller l77Lu. I

39. Kompleks ifølge krav 30, hvor metalionen er kompleksbundet til en forbindelse I ifølge krav 24. I DK 175393 B1 133

40. Kompleks ifølge krav 39, hvor metallet er 153Sm, eller ,77Lu.

41. Kompleks ifølge krav 30, hvor metalionen er kompleksbundet til forbindelsen ifølge krav 26. 5

42. Kompleks ifølge krav 41, hvor metallet er 153Sm.

43. Kompleks ifølge krav 30, hvor metalionen er kompleksbundet til forbindelsen ifølge krav 27. 10

44. Kompleks ifølge krav 43, hvor metallet er 1S3Sm.

45. Kompleks ifølge krav 30, hvor metalionen er kompleksbundet til forbindelsen ifølge krav 13. 15

46. Kompleks ifølge krav 45, hvor metallet er ls3Sm, eller ,77Lu.

47. Kompleks ifølge krav 30, hvor metalionen er kompleksbundet til forbindelsen ifølge krav 14. 20

48. Kompleks ifølge krav 47, hvor metallet er ls3Sm, eller I77Lu.

49. Konjugat omfattende et kompleks ifølge krav 28, forudsat at R2 og R4 ikke er nitro, covalent bundet til et antistof eller et antistof-fragment. 25

50. Konjugat ifølge krav 49, hvor metallet er 153Sm, 166Ho, 90Y, 149Pm, 159Gd, 140La, ,77Lu, 175Yb, 47Sc eller ,42Pr. 1 2 Konjugat ifølge krav 50, hvor metallet er 153Sm, ^Y eller 177Lu. 2 30 I DK 175393 B1 I 134 I

52. Konjugat ifølge ethvert af kravene 49-51, kendetegnet ved, at antistoffet eller an- I I tistof-fragmentet er et monoklonalt antistof eller et fragment deraf. I

53. Konjugat ifølge krav 52, kendetegnet ved, at antistoffet eller antistof-fragmentet I I 5 er CC-49 (ATCC HB 9459), CC-49 F(ab')2, CC-83 (ATCC HB 9453), CC-83 F(ab')2 I I eller B72,3 (ATCC HB 8108). I

54. Konjugat ifølge ethvert af kravene 49-51, hvor forbindelsen er som defineret i I I krav 6,7, 10,11 eller 24. I I 10 I

55. Konjugat ifølge ethvert af kravene 50-53, hvor metalionen er ,53Sm kompleks- I bundet til forbindelsen ifølge krav 19. I

56. Konjugat ifølge ethvert af kravene 50-53, hvor metalionen er I53Sm, eller I I 15 l77Lu kompleksbundet til en forbindelse ifølge krav 24. I

57. Konjugat ifølge ethvert af kravene 50-53, hvor metalionen er l53Sm kompleks- I bundet til forbindelsen ifølge krav 27. I I 20 58. Konjugat ifølge ethvert af kravene 50-53, hvor metalionen er 153Sm, 90Y eller I I 177Lu kompleksbundet til forbindelsen ifølge krav 14. I

59. Konjugat omfattende en forbindelse ifølge krav 1 eller et farmaceutisk accepta- I I belt salt deraf, covalent bundet til et antistof eller et antistof-fragment. I

25 I

60. Konjugat ifølge krav 59, kendetegnet ved, at antistoffet eller antistof-fragmentet I er et monoklonalt antistof eller et fragment deraf. I 1 Konjugat ifølge krav 60, hvor antistoffet eller antistof-fragmentet er CC-49 I 30 (ATCC HB 9459), CC-49 F(ab’)2, CC-83 (ATCC HB 9453), CC-83 F(ab')2 eller B72.3 I (ATCC HB 8108). I DK 175393 B1 135

62. Konjugat ifølge ethvert af kravene 69-61, hvor forbindelsen er som defineret i krav 6, 7,10,11 eller 24.

63. Farmaceutisk formulering, kendetegnet ved, at den indeholder et konjugat ifølge 5 ethvert af kravene 49-58 sammen med en farmaceutisk acceptabel bærer.

64. Fremgangsmåde til fremstilling af et bifunktionelt chelateringsmiddel med den almene formel (LA.) ifølge krav 1 eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf, kendetegnet ved, at man: 10 (A) omsætter en forbindelse med formlen H 4 i/—"\ ^1 15 °2 / ‘CE2’-=-—W H (VA) hvor 20 Q1 er C02R; R er Ci-C/j-alkyl; og m er som defineret i krav 1, med en a-bromcarboxylsyreester med formlen

25 BrCH2C02R hvor R er CrC4-alkyl, i nærværelse af et organisk opløsningsmiddel og en base ved en temperatur mellem 0°C og tilbagesvalingstemperaturen, til opnåelse af forbindelser med formlen (IA), hvori I DK 175393 B1 I 136 I I Q1 og m er som tidligere defineret, I I R3, R4 og R5 er hydrogen; I I R er CrC4-alkyl, og I I R2 er nitro; eller I Is I I (B) omsætter produktet fra trin (A) med et hydrogeneringsmiddel, såsom Pd/C med I I hydrogen, under standardbetingelser til opnåelse af forbindelser med formlen (ΙΑ), I I hvori I I Q1 og m er som tidligere defineret, I I 10 R3, R4 og R5 er hydrogen; I I R er Cj-C4-alkyl, og I I R2 er amino; eller I I (C) omsætter produktet fra trin (B) med et de-esterificeringsmiddel, såsom en stærk I I 15 syre, til opnåelse af forbindelser med formlen (LA), hvori I I Q1 og m er som tidligere defineret; I I R3, R4 og R5 er hydrogen; I I R er hydrogen, og I I R2 er amino; eller I I 20 I I (D) omsætter en forbindelse med formlen (VA) som defineret ovenfor med et optisk I aktivt α-benzensul fonat med formlen I I I COOR I i. o I I —1 I o — s= o I é I 30 I DK 175393 B1 137 hvori R og R5 har de tidligere angivne betydninger, til opnåelse af forbindelser med formlen (IA), hvori Q1, R5 og m er som tidligere defineret; R3 og R4 er hydrogen; 5. er CrC4-alkyl, og R2 er nitro; eller (E) omsætter produktet fra trin (D) med et hydrogeneringsmiddel, såsom Pd/C med hydrogen, under standardbetingelser til opnåelse af forbindelser med formlen (IA), 10 hvori Q1, R5 og m er som tidligere defineret; R3 og R4 er hydrogen; R er Ci-C4-alkyl eller benzyl, og R2 er amino; eller 15 (F) omsætter produktet fra trin (E) med et deesterificeringsmiddel, såsom en stærk syre, til opnåelse af forbindelser med formlen (IA), hvori Q1, R5 og m er som tidligere defineret, R3, R4 og R er hydrogen, og • 20 R2 er amino; eller (G) omsætter en forbindelse med formlen ? 25 /hC -tC»2)-c-^ H°2 " H (IVA) 30 I DK 175393 B1 I I 13 S I I hvori R3 er C|-C4-alkoxy, -0CH2C02H eller hydroxy og m er et helt tal fra 0 til 2, med I I en α-bromcarboxylsyre med formlen I I BrCH2C02H I I 5 I I i nærværelse af et organisk opløsningsmiddel og en base ved en temperatur mellem 0°C I I og tilbagesvalingstemperaturen, til opnåelse af forbindelser med formlen (IA), hvori I I R3 og m er som ovenfor defineret; I I Q1, R, R2 og R5 er hydrogen, og I I 10 R4 er nitro; eller I I (H) omsætter produktet fra trin (G) med et hydrogeneringsmiddel, såsom Pd/C med I I hydrogen, under standardbetingelser til opnåelse af forbindelser med formlen (ΙΑ), I I hvori I I 15 R3 og m er som tidligere defineret; I I Q1, R, R2 og R5 er hydrogen, og I I R4 er amino, eller I I (J) omsætter en forbindelse med formlen I I 20 H I I OMe ' ^ I I f~\—(ch2)—i-—1 «-» I I /==S " H I I 25 ·:°2 K I (V1IIA) I I 30 I I BrCH2C02R I hvori Q1 er CH2C02R; R er CrC4-alkyl og m er et helt tal fra 0 til 2 med en a- I 2 I bromcarboxylsyre med formlen I DK 175393 B1 139 hvor R er som defineret ovenfor, i nærværelse af et organisk opløsningsmiddel og en base ved en temperatur mellem 0°C og tilbagesvalingstemperaturen, til opnåelse af forbindelser med formlen (IA), hvori Q1, Q og m er som tidligere defineret;

5 R2 og R5 er hydrogen, og R4 er nitro; eller (K) omsætter produktet fra trin (J) med et deesterificeringsmiddel, såsom en stærk syre, efterfulgt af et hydrogeneringsmiddel, såsom Pd/C med hydrogen, under standard-10 betingelser til opnåelse af forbindelser med formlen (IA), hvori Q1, Q og m er som tidligere defineret; R, R2 og R5 er hydrogen, og R4 er amino; eller 15 (L) omsætter produktet fra trin (B), (F), (H) eller (K) med thiophosgen til omdannelse af aminogruppen R2 eller R4 til den tilsvarende isothiocyanatogruppe.