BRPI0709338A2 - anticorpo, molécula de ácido nucleico isolada, célula, composições, método de detecção da proteìna alfa5beta1, uso de anticorpo, métodos de tratamento, kit, uso de uma composição, uso de uma antagonista de alfa5beta e uso de uma antagonista de vegf - Google Patents

Abstract

<B>ANTICORPO, MOLECULA DE áCIDO NUCLEICO ISOLADA, CéLULA, COMPOSIçõES, MéTODO DE DETECçãO DA PROTEìNA ALFA5BETAI, USOS DO ANTICORPO, MéTODOS DE TRATAMENTO, KIT, USO DE UMA COMPOSIçãO, USOS DE UM ANTAGONISTA DE ALFA5BETA E DE UM ANTAGONISTA DE VEGF<D>A presente invenção refere-se ao uso de antagonistas de VEGF e antagonistas de alfa5betal para o tratamento de câncer e inibição da angiogênese e/ou permeabilidade vascular, incluindo a inibição de angiogênese anormal em doenças. A presente invenção também se refere ao uso de um agonista de VEGFR e agonistas de alfa5betal para promover a angiogênese e a permeabilidade vascular. A presente invenção também se refere a novos anticorpos anti-alfa5betal, composições, kits que os compreendem e métodos de sua fabricação e utilização.

Description

"ANTICORPO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA, CÉLULA, COMPOSIÇÕES, MÉTODO DE DETECÇÃO DA PROTEÍNA ALFA5BETA1, USOS DO ANTICORPO, MÉTODOS DE TRATAMENTO, KIT, USO DE UMA COMPOSIÇÃO, USOS DE UM ANTAGONISTA DE ALFA5BETA E DE UM ANTAGONISTA DE VEGF"

Campo da Invenção A presente invenção refere-se ao uso de antagonistas de VEGF e antagonistas de alfaõbetal para o tratamento de câncer e inibição da angiogênese e/ou permeabilidade vascular, incluindo em angiogênese anormal em doenças. A presente invenção também se refere ao uso de um agonista de VEGFR e agonistas de alfaõbetal para promover a angiogênese e a permeabilidade vascular. A presente invenção também se refere a anticorpos anti-alfa5beta1, composições, kits que os compreendem e métodos de sua fabricação e utilização.

Antecedentes da Invenção

O papel importante de VEGF-A em angiogênese patológica e não patológica é bem estabelecido. A administração de VEGF em modelos in vivo inclui uma reação angiogênica potente (Plouet, J. et al (1989), EMBO J. 8: 3801-3808; Leung, D. W. e| ai (1989) Science 246: 1306-1309). A perda de um único alelo de VEGF-A gerou Ietalidade embriônica em camundongos (Carmeliet, P. et al (1996), Nature 380: 435-439; Ferrara, N. et al (1996), Nature 380: 439-442). VEGF também é conhecido como um fator de permeabilidade vascular devido à sua capacidade de indução de vazamento vascular (Senger, D. R. et al (1995), Science 219: 983-985; Dvorak, H. F. et al (1995), Am. J. Pathol. 146: 1029-1039). Desta forma, VEGF-A está envolvido na angiogênese de desenvolvimento, reprodutiva e óssea além de outra angiogênese não patológica.

VEGF-A liga-se a duas tirosino quinases receptoras (RTK),VEGFR-1 (Flt-1) e VEGFR-2 (KDR, Flk-1). Acredita-se geralmente que VEGFR-2 seja o principal mediador dos efeitos mitogênicos, angiogênicos e de aumento da permeabilidade de VEGF-A. Em fevereiro de 2004, a Agência de Controle de Alimentos e Medicamentos dos Estados Unidos (Food and Drug Administration - FDA) aprovou bevacizumab, um anticorpo monoclonal anti-VEGF (fator de crescimento endotelial vascular)-A, para o tratamento de câncer colo-retal metastático em combinação com regimes de quimioterapia com base em 5-fluorouracil (FU). Em seguida, o FDA aprovou pegaptinib, um aptâmero que bloqueia a isoforma de 165 aminoácidos de VEGF-A, para o tratamento da forma úmida (neovascular) de degeneração macular relativa à idade (AMD).

Apesar desses avanços, muitos pacientes tratados com antagonistas de VEGF eventualmente sucumbem à sua doença. Conseqüentemente, existe a necessidade de desenvolver novos medicamentos e tratamentos para o tratamento de doenças que não reagem mais ou reagem apenas parcialmente a terapias com antagonistas de VEGF. Também existe a necessidade de desenvolver terapias melhores e/ou alternativas para o tratamento de câncer e doenças pioradas, causadas ou afetadas por angiogênese anormal.

Descrição Resumida da Invenção

A presente invenção refere-se a medicamentos e métodos detratamento de pacientes que se beneficiariam de angiogênese reduzida, que sofram de angiogênese anormal e/ou que sofram de neoplasia. Segundo uma realização, a presente invenção fornece um método de inibição de angiogênese e/ou permeabilidade vascular em um paciente que compreende a etapa de administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de VEGF e um antagonista de alfaõbetal simultânea ou seqüencialmente. Segundo outra realização, a presente invenção fornece um método de tratamento de pacientes que sofrem de uma doença, em que opaciente havia reagido a um tratamento para a doença com um antagonista de VEGF1 mas reage parcialmente ou não reage mais ao antagonista de VEGF1 que compreende a etapa de administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de alfaõbeta. Segundo uma outra realização, a presente invenção fornece um método de tratamento de pacientes que sofrem de uma doença, em que a doença tenha sido resistente ou refratária a uma terapia com antagonista de alfaõbeta, isoladamente ou em combinação com quimioterapia, que compreende a etapa de administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de VEGF.

A presente invenção também se refere a novos anticorpos anti-alfa5beta1, kits e composições que os compreendem e métodos de sua fabricação ou utilização. Segundo uma realização, o novo anticorpo anti-alfaõbetal é o anticorpo 7H5 ou o anticorpo 7H12 descrito no presente, ou uma de suas formas humanizadas ou quiméricas. Segundo outra realização específica, o anticorpo 7H5 ou o anticorpo 7H12, ou sua forma humanizada ou quimérica, pode apresentar-se na forma de um fragmento de Fab, Fab', F(ab)'2, Fv de fita simples (scFv) ou Fv; um diacorpo, anticorpo multiespecífico e um anticorpo linear. Segundo uma outra realização, os novos anticorpos anti-alfaõbetal podem ser conjugados a outra entidade tal como, mas sem limitar-se a um agente terapêutico ou corante fluorescente ou outro marcador para detectar alfa5beta1 em pacientes ou em amostras de pacientes. Esses novos anticorpos alfa5beta1 podem ser utilizados em uma série de métodos terapêuticos e de diagnóstico. Esses anticorpos anti-alfa5beta1 podem ser utilizados, por exemplo, no tratamento de angiogênese anormal, neoplasia, doenças oculares e doenças autoimunes. Esses anticorpos podem ser utilizados para detectar proteína alfa5beta1 em pacientes ou amostras de pacientes por meio de contato desses anticorpos com proteína alfaõbetal em pacientes ou em amostras de pacientes e determinação qualitativa ouquantitativa do anticorpo anti-alfa5beta1 ligado à proteína alfa5beta1.

Segundo ainda outra realização, a presente invenção fornece um método de tratamento de câncer em pacientes que compreende a etapa de administração de um antagonista de VEGF e um antagonista de alfaõbetal simultânea ou seqüencialmente. Segundo uma realização preferida, o câncer reage a terapias com antagonistas de VEGF. Em outra realização, um método de tratamento de degeneração macular relativa à idade (AMD), que inclui degeneração macular relativa à idade úmida, em um paciente que sofre de AMD compreende a etapa de administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de VEGF e um antagonista de alfaõbetal simultânea ou seqüencialmente. Segundo ainda outra realização, é fornecido um método de tratamento de uma doença autoimune em pacientes que compreende a etapa de administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de VEGF e um antagonista de alfaõbetal simultânea ou seqüencialmente.

Em uma realização, o paciente a ser tratado pode receber administração do antagonista de VEGF inicialmente e ser tratado em seguida com o antagonista de alfaõbetal. Em outra realização, o paciente é tratado com o antagonista de VEGF e o antagonista de alfaõbetal simultaneamente. Segundo uma outra realização, o paciente é tratado com o antagonista de VEGF até que o paciente não reaja ao tratamento com antagonista de VEGF e, em seguida, o paciente é tratado com um antagonista de alfaõbetal. Em uma realização específica, o paciente é tratado com o antagonista de VEGF quando o câncer é não invasivo ou encontra-se em estágio precoce e é tratado com o antagonista de alfaõbetal quando o câncer é invasivo. Em uma outra realização, o paciente sendo tratado com o antagonista de alfaõbetal possui níveis elevados de alfaõbetal em um tecido doente em comparação com tecido de um paciente que não sofre da doença. Neste caso, o método pode incluiradicionalmente a etapa de detecção de alfa5beta1 no paciente, tal como em um tecido doente após o tratamento com um antagonista de VEGF. Segundo uma realização, o câncer invasivo é um câncer que sofreu metástase. Segundo uma outra realização, o câncer em estágio precoce é um câncer tratado por meio de terapia com adjuvantes (tal como quimioterapia ou remoção cirúrgica).

Em uma realização per ferida, o paciente sofre de uma doença que possui angiogênese anormal. Segundo outra realização, a doença é selecionada a partir do grupo que consiste de câncer, doença imune ou doença ocular. Segundo uma realização preferida, a doença é selecionada a partir do grupo que consiste de um tumor sólido, tumor metastático, tumor de tecido mole, doença que possui neovascularização ocular, doença inflamatória que possui angiogênese anormal, doença decorrente após transplante no paciente e doença que possui proliferação anormal de tecido fibrovascular. Segundo outra realização preferida, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste de câncer de mama (incluindo câncer de mama metastático), câncer da cervical, câncer colo-retal (incluindo câncer colo-retal metastático), câncer do pulmão (incluindo câncer do pulmão não de células pequenas), Iinfoma não de Hodgkins (NHL), leucemia linfocítica crônica, câncer das células renais, câncer da próstata, incluindo câncer da próstata refratário hormonal, câncer do fígado, câncer da cabeça e do pescoço, melanoma, câncer do ovário, mesotelioma, câncer de tecidos moles, tumor estromal gastrointestinal, glioblastoma multiforme e mieloma múltiplo. Segundo outra realização preferida, a doença é selecionada a partir do grupo que consiste de retinopatia, degeneração macular induzida pela idade (tal como AMD úmida), edema macular diabético, rubeose; psoríase, uma doença renal inflamatória, síndrome urêmica hemolítica, nefropatia diabética (tal como retinopatia diabética proliferativa), artrite (tal como artrite psoriática, osteoartrite, artrite reumatóide), doença intestinal inflamatória, inflamação crônica, deslocamento crônico daretina, uveíte crônica, vitrite crônica, rejeição de enxertos da córnea, neovascularização da córnea, neovascularização de enxertos da córnea, mal de Crohn, miopia, doença neovascular ocular, mal de Pagets, penfigóide, poliartrite, ceratotomia radial pós-laser, neovascularização da retina, síndrome de Sogren, colite ulcerativa, rejeição de enxertos, inflamação dos pulmões, síndrome nefrótica, edema, ascite associada a malignidades, apoplexia, angiofibroma e glaucoma neovascular. Em uma realização, o paciente recebe adicionalmente administração de um agente terapêutico selecionado a partir do grupo que consiste de um agente antineoplásico, um agente quimioterápico e um agente citotóxico.

Segundo uma realização preferida da presente invenção, o paciente a ser tratado com um antagonista de alfaõbetal está sofrendo de reincidência após tratamento com antagonista de VEGF ou tornou-se refratário a tratamento com antagonista de VEGF. Segundo outra realização, o paciente a ser tratado com um antagonista de alfaõbetal e um antagonista de VEGF está sofrendo de um câncer metastático ou foi tratado anteriormente com terapia adjuvante. Em uma realização, o possível paciente sofre reincidência, é refratário ou resistente a agentes quimioterápicos tais como irinotecan. Exemplos dessas doenças incluem, mas sem limitar-se a câncer colo-retal metastático, câncer colo-retal metastático reincidente, câncer de mama metastático, câncer de mama metastático reincidente, câncer de mama HER2+ metastático, câncer de mama adjuvante, câncer de mama HER2+ adjuvante, câncer pancreático metastático, câncer do cólon adjuvante, câncer do pulmão não de células pequenas adjuvante, câncer retal adjuvante, câncer do pulmão não de células pequenas adjuvante, câncer do pulmão não de células pequenas metastático, câncer do ovário metastático, câncer de células renais metastático e câncer de células renais adjuvantes.

Segundo uma realização, o paciente que sofre de uma doençadescrita no presente recebe administração de uma terapia de manutenção após tratamento para a doença com um antagonista de VEGF1 em que a terapia de manutenção é um antagonista de alfaõbetal isoladamente, seqüencial ou simultaneamente com um antagonista de VEGF.

Segundo uma realização preferida, o antagonista de VEGF podeser selecionado a partir do grupo que consiste de um anticorpo, uma imunoadesina, um corpo de peptídeo, uma molécula pequena e um ácido nucleico que se hibridiza em uma molécula de ácido nucleico que codifica VEGF sob condições estringentes (tal como ribozima, siRNA e aptâmero). Segundo uma realização preferida, o antagonista de VEGF é um anticorpo. Segundo outra realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Segundo uma realização preferida, o anticorpo anti-VEGF é capaz de ter competitivamente inibida a sua ligação a VEGF humano pelo anticorpo Avastin®. Segundo outra realização, o anticorpo anti-VEGF é humano, humanizado ou quimérico. Segundo uma realização específica, o anticorpo anti-VEGF é o anticorpo Avastin®. Segundo outra realização, o anticorpo anti-VEGF é selecionado a partir do grupo que consiste de um fragmento de Fab, Fab', F(ab)'2, Fv de fita simples (scFv), de Fv; um diacorpo e um anticorpo linear. Segundo uma outra realização, o antagonista de VEGF é um anticorpo biespecífico que liga VEGF e alfaõbetal e é um antagonista de alfaõbetal.

Segundo uma realização preferida, o antagonista de alfaõbetal pode ser selecionado a partir do grupo que consiste de um anticorpo, uma imunoadesina, um corpo de peptídeo, uma molécula pequena e um ácido nucleico que se hibridiza em uma molécula de ácido nucleico que codifica alfaõbetal sob condições estringentes. Segundo uma realização preferida, o antagonista de alfaõbetal é um anticorpo. Segundo outra realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Segundo uma outra realização, o anticorpo monoclonal é um anticorpo quimérico tal como o anticorpo anti-alfaõbetal humano conhecido como M200 ou F200. Segundo uma realização, o anticorpo anti-alfa5beta1 compreende a seqüência VH de SEQ ID Nc 1 e a seqüência VL de SEQ ID N0 2. Segundo uma outra realização, o anticorpo anti-alfaõbetal compreende a seqüência de SEQ ID N0 3 e a seqüência de SEQ ID N0 4. Segundo uma outra realização, o anticorpo anti-alfa5beta1 compreende a seqüência de SEQ ID N0 4 e a seqüência de SEQ ID N0 5. Segundo uma realização preferida, o anticorpo anti-alfa5beta1 é capaz de ter competitivamente inibida a sua ligação a alfaõbetal humano pelo anticorpo 7H5 ou pelo anticorpo 7H12. Segundo uma realização preferida, o anticorpo anti-alfa5beta1 é humano, humanizado ou quimérico. Segundo uma realização específica, o anticorpo anti-alfa5beta1 é o anticorpo 7H5, o anticorpo 7H12 ou um de seus anticorpos quiméricos ou humanizados. Segundo outra realização, o anticorpo anti-alfa5beta1 é selecionado a partir do grupo que consiste de um fragmento de Fab, Fab', F(ab)'2, Fv de fita simples (scFv), de Fv; um diacorpo e um anticorpo linear. Segundo uma outra realização, o antagonista de alfaõbetal é um anticorpo biespecífico que liga VEGF e alfaõbetal e é um antagonista de VEGF. Segundo ainda outra realização, o antagonista anti-alfaõbetal possui uma função efetora alterada. Segundo uma realização, um anticorpo anti-alfaõbetal é alterado para reduzir ou evitar a atividade de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) ou atividade de citotoxicidade dependente de complemento (CDC) (alterando-se, por exemplo, a seqüência de ácido nucleico que codifica a parte Fc do anticorpo). Segundo ainda outra realização, o anticorpo anti-alfaõbetal foi alterado para aumentar a sua meia vida em seres humanos (alterando, por exemplo, a seqüência de ácido nucleico que codifica a parte Fc do anticorpo).

Segundo uma realização, o antagonista de VEGF ou o antagonista de alfaõbetal é conjugado a um agente citotóxico ou um agente quimioterápico. Segundo outra realização, o agente citotóxico é um isótoporadioativo ou uma toxina.

A presente invenção fornece composições que compreendem um antagonista de VEGF1 um antagonista de alfaõbetal e um veículo farmaceuticamente aceitável. A presente invenção também fornece artigos industrializados que compreendem instruções de detecção de alfaõbetal em um paciente que tenha sido tratado com um antagonista de VEGF.

A presente invenção também se refere ao uso de agonistas de VEGFR e agonistas de alfaõbetal para promover a angiogênese e a permeabilidade vascular e composições que compreendem agonistas de VEGF e agonistas de alfaõbetal e um veículo farmaceuticamente aceitável. As terapias combinatórias com agonistas de VEGFR e agonistas de alfaõbetal podem ser utilizadas no tratamento de uma série de doenças que se beneficiariam do aumento da angiogênese e da permeabilidade vascular, que incluem, por exemplo, cura de feridas tal como no tratamento de feridas crônicas, feridas agudas e feridas normais.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 exibe o aumento do recrutamento de células estromais que expressam alfaõbetal após o tratamento de tumores de xenoenxerto de HT29 com o anticorpo anti-VEGF, B20-4.1.

A Figura 2 é um gráfico que exibe anticorpos 7Hõ e 7H12 que seligam a células HUVEC em um teste de ligação direta.

A Figura 3 exibe anticorpos 7H5 e 7H12 que se ligam a HUVEC mas não células RAJI por meio de análise FACS.

A Figura 4 é um gráfico que exibe a adesão de HUVEC a fibronectina na presença de anticorpos monoclonais 7H5 e 7H12.

A Figura 5 é (A) um gráfico de barras que exibe o efeito de 7H5 e 7H12 sobre a proliferação de células HUVEC por meio de contagem de células totais e (B) um gráfico de barras que exibe o efeito de 7H5 e 7H12 sobre aproliferação de células HUVEC por meio de manchas de azul de Alamar em um outro teste.

A Figura 6 exibe fotografias de migração de células HUVEC após tratamento com 7H5 após 0 h e 30 h em comparação com um controle negativo (IgG).

A Figura 7 é um gráfico de barras que exibe quantitativamente a migração de células HUVEC após tratamento com 7H5 e 7H12.

A Figura 8 é um gráfico de barras que exibe o percentual de células HUVEC que expressam caspase-3 ativada em um teste de apoptose após o tratamento com 7H5 e 7H12.

A Figura 9 é um gráfico de barras que exibe atividade de HUVEC caspase 3/7 após o tratamento com 7H5 e 7H12.

A Figura 10 é um gráfico que exibe a atividade de 7H12 e/ou bevacizumab em um modelo de cura de feridas de orelhas de coelhos.

A Figura 11 exibe os resultados de camundongos tratados comanticorpo anti-VEGF +/- anticorpo anti-alfa5beta1 em um modelo de câncer de mama na forma de (A) um gráfico que exibe o volume de tumor médio de grupo de camundongos tratados ou (B) uma plotagem Kaplan-Meier que exibe o percentual de animais remanescentes no estudo em função do tempo. Os animais foram removidos do estudo quando os seus tumores atingiram ou excederam 1500 mm3.

A Figura 12 exibe os resultados de camundongos tratados com anticorpo anti-VEGF +/- anticorpo anti-alfa5beta1 em um modelo de câncer de cólon na forma de (A) um gráfico que exibe o volume de tumor médio de grupo de camundongos tratados ou (B) uma plotagem Kaplan-Meier que exibe o percentual de animais remanescentes no estudo em função do tempo. Os animais foram removidos do estudo quando os seus tumores atingiram ou excederam 1500 mm3.A Figura 13 exibe os resultados de camundongos tratados com anticorpo anti-alfa5beta1 ou um agente quimioterápico em um modelo de câncer de cólon na forma de (A) um gráfico que exibe o volume de tumor médio de grupo de camundongos tratados ou (B) uma plotagem Kaplan-Meier que exibe o percentual de animais remanescentes no estudo em função do tempo. Os animais foram removidos do estudo quando os seus tumores atingiram ou excederam 1500 mm3.

A Figura 14 exibe uma plotagem Scatchard de ligação de 125I-7Ht5 a alfaõbetal em R9ab, uma linhagem de células de fibroblasto de coelho.

A Figura 15 exibe uma plotagem Scatchard de ligação de 125I-7H12 a alfaõbetal em R9ab, uma linhagem de células de fibroblasto de coelho.

A Figura 16 exibe os resultados de testes de ligação competitiva e mapeamento de epítopos de IgG alfaõbetal anti-integrina com vários anticorpos anti-alfaõbetal.

Descrição Detalhada da Invenção

Sem restrições à teoria, é proposto que o maior recrutamento de células estromais pode trazer outros fatores de crescimento vascular para locais doentes que poderiam compensar a perda de atividade de VEGF em pacientes tratados com terapias com antagonistas de VEGF. Direcionar-se a células estromais que expressam aõbl com um anticorpo anti-aõbl pode resultar na redução das células estromais, de forma a reduzir a produção de potenciais fatores de crescimento vascular compensatórios. Alternativa ou adicionalmente, é proposto que a inibição de interações entre matrizes extracelulares e endoteliais, particularmente a inibição de interações de ligação de alfaõbetal, potencializará terapias com antagonista de VEGF por meio da inibição do retorno de angiogênese ao longo de rastros de matrizes extracelulares deixados por veículos retornantes devido à terapia com antagonista de VEGF. O tratamento com antagonistas de alfaõbetalsimultaneamente ou após qualquer tratamento com antagonistas de VEGF pode inibir, portanto, a recuperação de veículos do tratamento com antagonistas de VEGF e, conseqüentemente, o retorno de crescimento neovascular.

"Alfa5beta1", "α5β1" ou "a5b1" é uma integrina que compreendeduas proteínas diferentes (ou seja, subunidades alfaõ e betai). Demonstrou-se que alfa5beta1 liga-se a fibronectina, L1-CAM e fibrinogênio. A integrina alfaõbetal também foi denominada Ativação Muito Posterior-5, VLA-5, alfa5beta1, CD49e/CD29, receptor de fibronectina, FNR e GPIc-lla. Segundo uma realização preferida, o alfaõbetal é um alfaõbetal humano.

"Alfaõ" também conhecido como CD49e, alfaõ, subunidade alfaõ de integrina, subunidade alfa de VLA-õ, subunidade IC de GPIc-IIa e cadeia alfa de FNR possui quatro isoformas geradas por meio de divisão alternativa (A-D). Eles variam nos seus domínios citoplasmáticos. Seqüências de aminoácidos para isoformas humanas de alfaõ podem ser encontradas, por exemplo, em números de acesso Genbank: X07979, U33879, U33882 e U33880, respectivamente.

"Betai" também é denominado CD29, betai, Plaqueta GPIIa; cadeia beta de VLA; cadeia de integrina beta-1, CD29; FNRB; MDF2; VLAB; GPIIA; MSK12 e VLAõB. Seqüências de aminoácidos para Betai humano podem ser encontradas, por exemplo, no número de acesso Genbank X062Õ6.

O termo "VEGF" ou "VEGF", da forma utilizada no presente, designa o fator de crescimento de células endoteliais vasculares de 16õ aminoácidos e fatores de crescimento de células endoteliais vasculares de 121, 189 e 206 aminoácidos relacionados, conforme descrito por Leung et al, Science, 246: 1306 (1989) e Houck et al, Mol. Endocrin., õ: 1806 (1991), junto com as suas formas processadas e alélicas de ocorrência natural. O termo "VEGF" também designa VEGFs de espécies não humanas, tais comocamundongo, rato ou primata. Às vezes, o VEGF de uma espécie específica é indicado por termos tais como hVEGF para VEGF humano, mVEGF para VEGF murino etc. O termo "VEGF" também é utilizado para designar formas truncadas do polipeptídeo que compreende os aminoácidos 8 a 109 ou 1 a 109 do fator de crescimento de células endoteliais vasculares humanas com 165 aminoácidos. Referência a qualquer dessas formas de VEGF pode ser identificada no presente pedido, tal como por "VEGF (8-109)", "VEGF (1-109)" ou "VEGFi65". As posições de aminoácidos para um VEGF nativo "truncado" são numeradas conforme indicado na seqüência de VEGF nativa. A posição de aminoácido 17 (metionina), por exemplo, em VEGF nativo truncado também é a posição 17 (metionina) em VEGF nativo. O VEGF nativo truncado possui afinidade de ligação para os receptores Flt-1 e KDR comparável com VEGF nativo. Segundo uma realização preferida, o VEGF é um VEGF humano.

"Antagonista de VEGF" designa uma molécula capaz de neutralizar, bloquear, inibir, anular, reduzir ou interferir nas atividades de VEGF, incluindo a sua ligação a VEGF, um ou mais receptores de VEGF ou o ácido nucleico que os codifica. Preferencialmente, o antagonista de VEGF liga VEGF ou um receptor de VEGF. Antagonistas de VEGF incluem anticorpos anti-VEGF e seus fragmentos de ligação de antígenos, polipeptídeos que ligam VEGF e receptores de VEGF e interação entre receptor e Iigante de bloco (tais como imunoadesinas e corpos de peptídeos), anticorpos anti-receptores de VEGF e antagonistas receptores de VEGF tais como inibidores de moléculas pequenas das tirosino quinases de VEGFR1 aptâmeros que ligam VEGF e ácidos nucleicos que se hibridizam sob condições estringentes em seqüências de ácidos nucleicos que codificam VEGF ou um receptor de VEGF (tal como RNAi). Segundo uma realização preferida, o antagonista de VEGF liga-se a VEGF e inibe a proliferação de células endoteliais induzida por VEGF in vitro. Segundo uma realização preferida, o antagonista de VEGFliga-se a VEGF ou um receptor de VEGF com maior afinidade que um não VEGF ou receptor não de VEGF. Segundo uma realização preferida, o antagonista de VEGF liga-se a VEGF ou um receptor de VEGF com Kd de 1 μΜ a 1 pM. Segundo outra realização preferida, o antagonista de VEGF liga-se a VEGF ou um receptor de VEGF de 500 nM a 1 pM.

Segundo uma realização preferida, o antagonista de VEGF é selecionado a partir do grupo que consiste de um polipeptídeo tal como um anticorpo, um corpo de peptídeo, uma imunoadesina, uma molécula pequena ou um aptâmero. Em uma realização preferida, o anticorpo é um anticorpo anti-VEGF tal como o anticorpo AVASTIN® ou um anticorpo receptor anti-VEGF tal como um anticorpo anti-VEGFR2 ou anti-VEGFR3. Outros exemplos de antagonistas de VEGF incluem: VEGF-Trap, Mucagen, PTK787, SU11248, AG-013736, Bay 439006 (sorafenib), ZD-6474, CP632, CP-547632, AZD-2171, CDP-171, SU-14813, CHIR-258, AEE-788, SB786034, BAY579352, CDP-791, EG-3306, GW-786034, RWJ-417975/CT6758 e KRN-633.

"Anticorpo anti-VEGF" é um anticorpo que se liga a VEGF com suficiente afinidade e especificidade. Preferencialmente, o anticorpo anti-VEGF de acordo com a presente invenção pode ser utilizado como um agente terapêutico no direcionamento e interferência com doenças ou condições em que é envolvida a atividade de VEGF. Anticorpo anti-VEGF normalmente não se ligará a outros homólogos de VEGF tais como VEGF-B ou VEGF-C, nem outros fatores de crescimento tais como PIGF1 PDGF ou bFGF. Um anticorpo anti-VEGF preferido é um anticorpo monoclonal que se liga ao mesmo epítopo do anticorpo anti-VEGF monoclonal A4.6.1 produzido pelo hibridoma ATCC HB 10709. De maior preferência, o anticorpo anti-VEGF é um anticorpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante gerado de acordo com Presta et al (1997), Câncer Res. 57: 4593-4599, incluindo mas sem limitar-se ao anticorpo conhecido como bevacizumab (BV; Avastin®). Segundo outrarealização, anticorpos anti-VEGF que podem ser utilizados incluem, mas sem limitar-se aos anticorpos descritos em WO 2005/012359. Segundo uma realização, o anticorpo anti-VEGF compreende a região leve variável e pesada variável de qualquer um dos anticorpos descritos nas Figuras 24, 25, 26, 27 e 29 de WO 2005/012359 (tais como G6, G6-23, G6-31, G6-23.1, G6-23.2, B20, B20-4 e B20.4.1). Em outra realização preferida, o anticorpo anti-VEGF conhecido como ranibizumab é o antagonista de VEGF administrado para doença ocular tal como neuropatia diabética e AMD.

O anticorpo anti-VEGF "Bevacizumab (BV)", também conhecido como "rhuMAb VEGF" ou "Avastin®", é um anticorpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante gerado de acordo com Presta et ai (1997), Câncer Res. 57: 4593-4599. Ele compreende regiões de estrutura IgGI humana que sofreu mutação e regiões de determinação de complementaridade de ligação de antígenos do anticorpo monoclonal anti-hVEGF murino A.4.6.1 que bloqueia a ligação de VEGF humano aos seus receptores. Cerca de 93% da seqüência de aminoácidos de Bevacizumab, incluindo a maior parte das regiões de estrutura, são derivados de IgGI humano e cerca de 7% da seqüência são derivados do anticorpo A4.6.1 murino. Bevacizumab possui massa molecular de cerca de 149.000 daltons e é glicosilado. Outros anticorpos anti-VEGF incluem os anticorpos descritos na Patente Norte-Americana n° 6.884.879 e WO 2005/044853.

O anticorpo anti-VEGF Ranibizumab ou o anticorpo LUCENTIS® ou rhuFab V2 é um fragmento de Fab anti-VEGF humano amadurecido por afinidade humanizado. Ranibizumab é produzido por meio de métodos de tecnologia recombinante padrão em vetor de expressão de Escherichia coli e fermentação de bactérias. Ranibizumab não é glicosilado e possui uma massa molecular de cerca de 48.000 daltons. Vide WO 00/45331 e US 2003/0190317.

"Antagonista de alfa5beta1" designa qualquer molécula que inibea atividade biológica de alfaõbetal Segundo uma realização preferida, a molécula antagonista liga especificamente alfaõbetal. Segundo uma realização preferida, a molécula antagonista liga-se a alfaõ. Segu ndo uma realização preferida, um antagonista de alfaõbetal liga preferencialmente alfaõbetal com maior afinidade com relação a uma integrina não de alfaõbetal. Segundo uma realização preferida, o antagonista é selecionado a partir do grupo que consiste de um polipeptídeo tal como um anticorpo, um corpo de peptídeo ou uma imunoadesina, uma molécula pequena ou aptâmero que inibe a ligação de alfaõbetal ao seu Iigante (particularmente, fibronectina) ou um ácido nucleico que se hibridiza sob condições estringentes em uma molécula de ácido nucleico que codifica alfaõbetal (tal como RNAi que interfere com a expressão de alfaõ). Uma atividade biológica de alfaõbetal pode ser qualquer um, uma combinação ou todos os efeitos selecionados a partir do grupo que consiste de (1) ligação a fibronectina, (2) aumento da migração celular sobre fibronectina, (3) aumento da sobrevivência de células que compreendem alfaõbetal na presença de fibronectina, (4) aumento da proliferação de células que compreendem alfaõbetal na presença de fibronectina e (õ) aumento da formação de tubos de células que compreendem alfaõbetal na presença de fibronectina.

Exemplos de anticorpos antagonistas anti-alfaõbetal incluemM200 e F200 (WO 2004/089988A2), o anticorpo 7Hõ e o anticorpo 7H12 descritos no presente e seus anticorpos quiméricos, totalmente humanos e humanizados. Anticorpos M200 e F200, por exemplo, podem ser derivados das cadeias leve variável e pesada variável do anticorpo anti-alfaõbetal humano de camundongo, IIA1 (Pharmingen, San Diego CA). Exemplos de inibidores de moléculas pequenas de alfaõbetal incluem Ac-PHSCN-NH2 (WO-9822617A1) e ácido (S)-2-[(2,4,6-trimetilfenil)sulfonil]amino-3-[7-benziloxicarbonil-8-(2-piridinilaminometil)-1-oxa-2,7-diazaspiro-(4,4)-non-2-en-3-il]car-bonilamino]propiônico. Segundo uma realização preferida, o antagonista antiõbetal liga alfaõbetal e não alfaVbeta3, alfaVbetaõ ou alfaVbetal. Segundo uma realização preferida, o antagonista de alfaõbetal liga-se a alfaõbetal com Kd de 1 μΜ a 1 pM. Segundo outra realização preferida, o antagonista de alfaõbetal liga-se a alfaõbetal com Kd de Õ00 nM a 1 pM. Segundo uma realização preferida, o anticorpo alfaõbetal é um anticorpo que pode competir com o anticorpo 7Hõ ou o anticorpo 7H12 pela ligação a alfaõbetal em um teste de ligação competitiva. Segundo uma outra realização preferida, o anticorpo é um anticorpo que pode ser inibido competitivamente de ligar-se a alfaõbetal pelo anticorpo produzido a partir do hibridoma depositado como alfaõ/betal 7HÕ.4.2.8 (ATCC N0 PTA-7421) ou o hibridoma depositado como Alfaõ/betal 7H12.Õ.1.4 (ATCC N0 PTA-7420) em sete de março de 2006.

"Agonista de VEGFR" designa uma molécula que possa ativar um receptor de VEGF ou aumentar a sua expressão. Agonistas de VEGFR incluem, mas sem limitar-se, por exemplo, a agonistas Iigantes de um VEGFR1 variantes de VEGF, anticorpos e fragmentos ativos.

"Agonista de alfaõbetal" designa uma molécula que possa ativar alfaõbetal ou aumentar a sua expressão. Os agonistas de alfaõbetal incluem, mas sem limitar-se, por exemplo, a agonistas Iigantes de alfaõbetal.

Moléculas, tais como anticorpos, caracterizadas por ligação asobreposição ou áreas similares sobre um alvo podem ser identificadas por meio de testes de ligação/inibição competitiva.

Em uma realização, HUVEC ou outras células que expressam alfaõbetal são utilizadas em um teste de inibição competitiva e utiliza-se FACS para avaliar localidades de ligação de dois anticorpos anti-alfaõbetal entre si. Células HUVEC podem ser lavadas, por exemplo, em um tubo cônico e centrifugadas por cinco minutos a 1000 rpm. A pelota é tipicamente lavada duas vezes. Em seguida, as células podem ser novamente suspensas,contadas e mantidas sobre gelo até a utilização. 100 μΙ de um primeiro anticorpo anti-alfa5beta1 (tal como a partir de 1 μ9/ηιΙ de concentração ou concentração inferior) podem ser adicionados ao recipiente. Em seguida, 100 μΙ (tal como 20 χ 105 células) de células podem ser adicionados por cavidade e incubados sobre gelo por trinta minutos. Em seguida, 100 μΙ de um anticorpo anti-alfa5beta1 biotinilado (5 μg/ml de padrão) podem ser adicionados a cada cavidade e incubados sobre gelo por trinta minutos. As células são lavadas em seguida e peletizadas por cinco minutos a 1000 rpm. O sobrenadante é aspirado. Um segundo anticorpo R-ficoeritrina conjugado a estreptavidina (Jackson 016-110-084) é adicionado à cavidade (100 μΙ a 1:1000). Em seguida, a placa pode ser embalada em uma folha de alumínio e incubada sobre gelo por trinta minutos. Após a incubação, a pelota pode ser lavada e peletizada por cinco minutos a 1000 rpm. A pelota pode ser novamente suspensa e transferida para tubos de microtítulo para análise de FACS.

"Agente ou fator angiogênico" é um fator de crescimento queestimula o desenvolvimento de vasos sangüíneos, por exemplo, promovendo a angiogênese, o crescimento de células endoteliais, a estabilidade de vasos sangüíneos e/ou vasculogênese etc. Fatores angiogênicos incluem, por exemplo, mas sem limitar-se a VEGF e membros da família de VEGF, PIGF, família de PDGF, família de fatores de crescimento de fibroblastos (FGFs), Iigantes TIE (angiopoietinas), efrinas, Del-1, fatores de crescimento de fibroblastos: ácid o (aFGF) e básico (bFGF), folisatina, fator estimulante de colônias de granulócitos (G-CSF), fator de crescimento de hepatócitos (HGF)/fator de difusão (SF), lnterleucina-8 (IL-8), Leptina, Midcina, fator de crescimento de placenta, fator de crescimento de células endoteliais derivadas de plaquetas (PD-ECGF), fator de crescimento derivado de plaquetas, especialmente PDGF-BB ou PDGFR-beta, Pleiotrofina (PTN), Progranulina, Proliferina, fator de crescimento de transformação alfa (TGF-alfa), fator decrescimento de transformação-beta (TGF-beta), fator de necrose tumorosa-alfa (TNF-alfa), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)/fator de permeabilidade vascular (VPF) etc. Também incluiria fatores que aceleram a cura de feridas, tais como hormônio do crescimento, fator de crescimento similar a insulina I (IGF-I)1 VIGF, fator de crescimento epidérmico (EGF)1 CTGF1 membros da sua família, TGF-alfa e TGF-beta. Vide, por exemplo, Klagsbrun e D1Amore, Annu. Rev. Physiol., 53: 217-39 (1991); Streit e Detmar, Oncogene, 22: 3172-3179 (2003); Ferrara & Alitalo1 Nature Medicine 5 (12): 1359-1364 (1999); Tonini et al, Oncogene, 22: 6549-6556 (2003) (a Tabela 1, por exemplo, relaciona fatores angiogênicos conhecidos); e Sato, Int J. Clin. Oncoi, 8: 200-206 (2003).

"Kd" ou "valor Kd" para um anticorpo anti-VEGF de acordo com a presente invenção, em uma realização preferida, é medido por meio de teste de ligação de VEGF radiomarcado (RIA) realizado com a versão Fab do anticorpo e uma molécula de VEGF, conforme descrito por meio do teste a seguir, que mede a afinidade de ligação de solução de Fabs para VEGF por meio de equilíbrio de Fab com uma concentração mínima de VEGF (109) marcado com (125I) na presença de uma série de titulação de VEGF não marcado e captura em seguida de VEGF ligado com uma placa revestida com anticorpo anti-Fab (Chen et al (1999), J. Mol. BioL, 293: 865-881). Para estabelecer condições para o teste, placas de microtítulos (Dynex) são revestidas por uma noite com 5 μg/ml de anticorpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) em 50 mM de carbonato de sódio (pH 9,6) e bloqueadas em seguida com albumina de soro bovino a 2% (p/v) em PBS por duas a cinco horas à temperatura ambiente (cerca de 23 0C). Em uma placa não adsorvente (Nunc #269620), 100 pM ou 26 pM de [125I]VEGF (109) são misturados com diluições em série de um FAB de interesse, tal como Fab-12 (Presta et al (1997), Câncer Res. 57: 4593-4599). O Fab de interesse é incubado em seguida por umanoite; entretanto, a incubação pode prosseguir por 65 horas para garantir que o equilíbrio seja atingido. Em seguida, as misturas são transferidas para a placa de captura para incubação à temperatura ambiente por uma hora. A solução é removida em seguida e a placa é lavada por oito vezes com 0,1% Tween 20 em PBS. Após a secagem das placas, adiciona-se 150 μΙ/cavidade de cintilante (MicroScint-20; Packard) e as placas são contadas em um contador gama Topcount (Packard) por dez minutos. Concentrações de cada Fab que geram 20% ou menos de ligação máxima são selecionadas para uso em testes de ligação competitiva. Segundo outra realização, o Kd ou valor Kd é medido utilizando testes de ressonância de plasma de superfície empregando BIAçore® 2000 ou BlAcore® 3000 (BlAcore, Inc., Piscataway NJ) a 25 0C com lascas de CM5 de hVEGF (8-109) a cerca de dez unidades de resposta (RU). Resumidamente, lascas de biossensores de dextran carboximetilado (CM5, BlAcore Inc.) são ativadas com cloridrato de N-etH-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. VEGF humano é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, em 5 μg/ml (cerca de 0,2 μΜ) antes da injeção em velocidade de fluxo de 5 μΙ/minuto para atingir cerca de dez unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção de VEGF humano, 1 M de etanolamina é injetado para bloquear grupos não reagidos. Para medições cinéticas, diluições seriais em duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com 0,05% Tween 20 (PBST) a 25 0C sob velocidade de fluxo de cerca de 25 μΙ/min. Taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (k0ff) são calculadas utilizando um modelo de ligação Langmuir um a um simples (Software de Avaliação BlAcore versão 3.2) por meio de configuração simultânea do sensograma de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) foi calculada como razão k0ff/k0n. Vide, por exemplo, Chen, Y. et al (1999), J. Moi Biol., 293: 865-881). Caso a taxa deassociação exceda 106 M"1 S"1 por meio do teste de ressonância de plasma de superfície acima, a taxa de associação pode ser determinada utilizando um método de resfriamento fluorescente que mede o aumento ou a redução da intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, passagem de faixa de 16 nm) a 25 0C de 20 nM de anticorpo anti-VEGF (forma de Fab) em PBS1 pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de forma curta de VEGF humano (8-109) ou VEGF de camundongo conforme medido em um espectrômetro, tal como um espectrômetro equipado com fluxo de parada (Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro SLM-Aminco série 8000 (ThermoSpectronic) com uma cubeta agitada. Testes de ligação similares podem ser realizados para determinar o Kd de um anticorpo ou Fab anti-alfa5beta1 utilizando alfaõbetal como alvo.

Da forma utilizada no presente, um paciente a ser tratado é um mamífero (tal como ser humano, primata não humano, rato, camundongo, vaca, cavalo, porco, carneiro, cabra, cão, gato etc.). O paciente pode ser um paciente clínico, um voluntário de teste clínico, um animal experimental etc. O paciente pode ser suspeito de ter ou estar em risco de ter câncer, doença imune ou qualquer outra doença que possua angiogênese anormal, ser diagnosticado com câncer, doença imune ou qualquer outra doença que possua angiogênese anormal. V ários métodos de diagnóstico para câncer, doença imune ou qualquer outra doença que exibe angiogênese anormal e a delineação clínica dessas doenças são conhecidos na técnica. Segundo uma realização preferida, o paciente a ser tratado segundo a presente invenção é um ser humano.

A expressão "angiogênese anormal" ocorre quando novos vasossangüíneos crescem excessiva ou inadequadamente (em que, por exemplo, o local, tempo ou início da angiogênese é indesejado do ponto de vista médico) em um estado doente, de forma que cause um estado doente. Angiogêneseexcessiva, inadequada ou descontrolada ocorre quando houver crescimento de vasos sangüíneos novos que contribui para a piora do estado doentio ou causa um estado doentio, tal como em câncer, especialmente tumores sólidos vascularizados e tumores metastáticos (que incluem câncer do cólon, câncer do pulmão (especialmente câncer do pulmão de células pequenas) ou câncer da próstata), doenças causadas por neovascularização ocular, especialmente cegueira diabética, retinopatias, principalmente retinopatia diabética ou degeneração macular induzida pela idade, neovascularização coroidal (CNV), edema macular diabético, miopia patológica, mal de Von Hippel-Lindau, histoplasmose do olho, Oclusão da Veia da Retina Central (CRVO), neovascularização da córnea, neovascularização da retina e rubeose; psoríase, artrite psoriática, hemangioblastoma tal como hemangioma; doenças renais inflamatórias, tais como glomerulonefrite, especialmente gIomeruIonefrite mesangioproliferativa, síndrome urêmica hemolítica, nefropatia diabética ou nefroesclerose hipertensiva; várias doenças inflamatórias, tais como artrite, especialmente artrite reumatóide, doença intestinal inflamatória, psoríase, sarcoidose, arteriosclerose arterial e doenças que ocorrem após transplantes, endometriose ou asma crônica e mais de setenta outras condições. Os novos vasos sangüíneos podem alimentar os tecidos doentes, destruir tecidos normais e, no caso de câncer, os novos vasos podem permitir que células de tumores escapem para a circulação e abriguem-se em outros órgãos (metástases de tumores). A presente invenção contempla o tratamento dos pacientes que estão em risco de desenvolver as doenças mencionadas acima.

Outros pacientes que são candidatos para receber os anticorpos ou polipeptídeos de acordo com a presente invenção possuem, ou encontram-se em risco de desenvolver proliferação anormal de tecido fibrovascular, acne rosácea, síndrome da imunodeficiência adquirida, oclusão arterial, queratite atópica, úlceras bacterianas, mal de Bechets, tumores no sangue, mal deobstrução da carótida, neovascularização coroidal, inflamação crônica, deslocamento da retina crônico, uveíte crônica, vitrite crônica, desgaste excessivo de lentes de contato, rejeição de enxerto da córnea, neovascularização da córnea, neovascularização de enxerto da córnea, mal de Crohn, mal de Eales, ceratoconjuntivite epidérmica, úlceras fúngicas, infecções por simplex da Herpes, infecções por Herpes zóster, síndromes de hiperviscosidade, sarcoma de Kaposi, leucemia, degeneração de lipídios, mal de Lyme, queratólise marginal, úlcera de Mooren, infecções por micobactérias diferentes de hanseníase, miopia, doença neovascular ocular, caroços óticos, síndrome de Osler-Weber (Osler-Weber-Rendu, osteoartrite, mal de Pagets, pars planitis, penfigóide, filectenulose, poliartrite, complicações pós-laser, infecções por protozoários, pseudoxantoma elástico, queratite seca de pterígio, queratotomia radial, neovascularização da retina, retinopatia do prematuro, fibroplasias retrolentas, sarcóide, esclerite, anemia de células foice, síndrome de Sogrens, tumores sólidos, mal de Stargarts, mal de Stevens Johnson, queratite límbica superior, sífilis, lúpus sistêmico, degeneração marginal de Terrien, toxoplasmose, trauma, tumores de sarcoma de Ewing, tumores de neuroblastoma, tumores de osteossarcoma, tumores de retinoblastoma, tumores de rabdomiossarcoma, colite ulcerativa, obstrução das veias, sarcoidose de Wegeners e deficiência de Vitamina A, angiogênese indesejada associada a diabete, doenças parasíticas, cura anormal de feridas, hipertrofia após cirurgia, lesão ou trauma, inibição do crescimento capilar, inibição da ovulação e formação de corpos lúteos, inibição de implantes e inibição do desenvolvimento de embriões no útero.

Terapias anti-angiogênese são úteis no tratamento geral derejeição de enxertos, inflamações do pulmão, síndrome nefrótica, pré-eclâmpsia, efusão do pericárdio, tal como a associada a pericardite, e efusão plêurica, doenças e disfunções caracterizadas por permeabilidade vascularindesejável, tal como edema associado a tumores do cérebro, ascite associada a malignidades, síndrome de Meig, inflamação dos pulmões, síndrome nefrótica, efusão do pericárdio, efusão plêurica, permeabilidade associada a doenças cardiovasculares tais como a condição após enfartes do miocárdio, apoplexias e similares.

Outras doenças dependentes de angiogênese de acordo com a presente invenção incluem angiofibroma (sangue anormal de veículos que são propensos a sangramento), glaucoma neovascular (crescimento de vasos sangüíneos no olho), más formações arteriovenosas (comunicação anormal entre artérias e veias), fraturas sem ligação (fraturas que não curam), placas arterioscleróticas (endurecimento das artérias), granuloma piogênico (lesão comum da pele composta de vasos sangüíneos), escleroderma (uma forma de doença de tecido conjuntivo), hemangioma (tumor composto de vasos sangüíneos), tracoma (principal causa de cegueira no terceiro mundo), juntas hemofílicas, adesões vasculares e cicatrizes hipertróficas (formação anormal de cicatrizes).

"Tratamento" designa tratamento terapêutico e medidas profiláticas ou preventivas. Os necessitados de tratamento incluem os que já possuem a disfunção, bem como aqueles em que a disfunção deva ser evitada.

Os termos "recorrência", "reincidência" ou "reincidente" designamo retorno de um câncer ou doença após a determinação clínica do desaparecimento da doença. Um diagnóstico de metástase distante ou recorrência local pode ser considerado reincidência.

O termo "refratário" ou "resistente" designa um câncer ou doença que não reagiu ao tratamento.

A expressão "terapia adjuvante" designa o tratamento fornecido após a terapia primária, normalmente cirurgia. Terapia adjuvante para câncer ou doença pode incluir terapia imune, quimioterapia, terapia de radiação outerapia hormonal.

A expressão "terapia de manutenção" designa novo tratamento programado que é fornecido para ajudar a manter os efeitos de um tratamento anterior. Terapia de manutenção é freqüentemente administrada para ajudar a manter o câncer em remissão ou prolongar uma reação a uma terapia específica, independentemente do progresso da doença.

A expressão "câncer invasivo" designa um câncer que se espalhou além da camada de tecido na qual começou para os tecidos vizinhos normais. Cânceres invasivos podem ou não ser metastáticos.

A expressão "câncer não invasivo" designa um câncer muitoprecoce ou um câncer que não se espalhou além do tecido de origem.

A expressão "sobrevivência livre de progresso" em oncologia designa o período de tempo durante e após o tratamento em que um câncer não cresce. Sobrevivência livre de progresso inclui o período de tempo em que os pacientes experimentaram reação completa ou reação parcial, bem como o período de tempo em que os pacientes experimentaram doença estável.

A expressão "doença progressiva" em oncologia pode designar um crescimento de tumor de mais de 20% desde o início do tratamento, seja devido a um aumento de massa ou a uma difusão do tumor.

"Disfunção" é qualquer condição que se beneficiaria dotratamento com o anticorpo. Por exemplo, mamíferos que sofrem ou necessitam de profilaxia contra angiogênese anormal (angiogênese excessiva, inadequada ou descontrolada) ou permeabilidade vascular. Isso inclui doenças ou disfunções agudas e crônicas que incluem as condições patológicas que predispõem o mamífero à disfunção em questão. Exemplos não limitadores de disfunções a serem tratadas no presente incluem tumores benignos e malignos; não Ieucemias e malignidades linfóides; disfunções neuronais, gliais, astrocitais, hipotalâmicas e outras glandulares, macrofagais, epiteliais,estromais e blastocoélicas; e disfunções inflamatórias, angiogênicas e imunológicas.

Os termos "câncer" e "canceroso" designam ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada pelo crescimento celular desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas sem limitar-se a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia. Exemplos mais específicos desses cânceres incluem câncer de células escamosas, glioblastoma, câncer da cervical, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer do cólon, câncer colo-retal, carcinoma do endométrio, carcinoma das glândulas salivares, câncer do fígado, câncer renal, câncer da próstata, câncer da vulva, câncer da tireóide, carcinoma hepático, câncer da cabeça e do pescoço, câncer retal, câncer colo-retal, câncer do pulmão incluindo câncer do pulmão de células pequenas, câncer do pulmão não de células pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, câncer de células escamosas (tal como câncer de células escamosas epitelial), câncer da próstata, câncer do peritôneo, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou estomacal incluindo câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, retinoblastoma, astrocitoma, tecomas, arrenoblastomas, hepatoma, malignidades hematológicas que incluem linfoma não de Hodgkins (NHL), mieloma múltiplo e malignidades hematológicas agudas, carcinoma endometrial ou uterino, endometriose, fibrossarcomas, coriocarcinoma, carcinoma das glândulas salivares, câncer da vulva, câncer da tireóide, carcinomas do esôfago, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano, carcinoma nasofaríngeo, carcinomas da laringe, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinomas da pele, Schwannoma, oligodendroglioma, neuroblastomas, rabdomiossarcoma, sarcoma osteogênico, leiomiossarcomas, carcinomas do trato urinário, carcinomas da tireóide, tumor de Wilm, bem como linfoma de células B (incluindo linfoma não de Hodgkin(NHL) folicular/de baixo grau; NHL linfocítico pequeno (SL); NHL folicular/de grau intermediário; NHL difuso de grau intermediário; NHL imunoblástico de alto grau; NHL linfoblástico de alto grau; NHL de células não divididas pequenas de alto grau; NHL de doença volumosa; Iinfoma de células manto;Iinfoma relativo à AIDS; e Macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crônica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células Hairy; leucemia mieloblástica crônica; e disfunção Iinfoproliferativa pós-transplante (PTLD), bem como proliferação vascular anormal associada a facomatoses e síndrome de Meigs.

"Tumor", da forma utilizada no presente, indica toda proliferaçãoe crescimento de células neoplásticas, sejam malignas ou benignas, e todas as células e tecidos pré-cancerosos e cancerosos.

A expressão "composição antineoplástica" ou "agente antineoplásico" designa uma composição útil no tratamento de câncer que compreende pelo menos um agente terapêutico ativo, tal como "agente anticancerígeno". Exemplos de agentes terapêuticos (agentes anticancerígenos) incluem, mas sem limitar-se, por exemplo, a agentes quimioterápicos, agentes inibidores do crescimento, agentes citotóxicos, agentes utilizados em terapia de radiação, agentes antiangiogênese, agentes apoptóticos, agentes antitubulina e outros agentes para o tratamento de câncer, tais como anticorpos anti-HER-2, anticorpos anti-CD20, um antagonista receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) (tal como um inibidor de tirosino quinase), inibidor de HER1/EGFR (tal como erlotinib (Tarceva®), inibidores de fator de crescimento derivado de plaquetas (tais como Gleevec® (Mesilato de Imatinib)), um inibidor de COX-2 (tal como celecoxib), interferonas, citoquinas, antagonistas (tais como anticorpos neutralizantes) que se ligam a um ou mais dos receptores de ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-beta, BAFF1 BR3, APRIL, BCMA ou VEGF alvo, TRAIL/Apo2 e outros agentes químicosorgânicos e bioativos etc. Suas combinações também são contempladas na presente invenção.

"Agente inibidor do crescimento", da forma utilizada no presente, designa um composto ou composição que inibe o crescimento de uma célula, seja in vitro e/ou in vivo. Desta forma, o agente inibidor do crescimento pode ser aquele que reduz significativamente o percentual de células malignas em fase S. Exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem agentes que bloqueiam o progresso do ciclo celular (em local diferente da fase S), tais como agentes que induzem a suspensão de G1 e a suspensão da fase M. Os bloqueadores clássicos da fase M incluem as vincas (vincristina e vinblastina), TAXOL® e inibidores topo II, tais como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposida e bleomicina. Os agentes que prendem G1 também invadem a prisão da fase S, por exemplo, agentes alquilantes de DNA, tais como tamoxifen, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracil e ara-C. Informações adicionais podem ser encontradas em The Molecular Basis of Câncer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, intitulado Cell Cycle Regulation, Oncogenes and Antineoplastic Drugs de Murakami et aI (WB Saunders: Filadélfia, 1995), especialmente pág. 13.

A expressão "agente citotóxico", da forma utilizada no presente, indica uma substância que inibe ou evita o funcionamento das células e/ou causa destruição das células. A expressão destina-se a incluir isótopos radioativos (tais como I131, I125, Y90 e Re186), agentes quimioterápicos e toxinas, tais como toxinas enzimaticamente ativas de origem animal, vegetal, fúngica ou bacteriana, ou seus fragmentos.

"Agente quimioterápico" é um composto químico útil notratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentes alquilantes, tais como tiotepa e ciclofosfamida CYTOXAN®; sulfonatos de alquila, tais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas, tais comobenzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etilenoiminas e metilamelaminas, incluindo altretamina, trietilenomelamina,

trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecan); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; sarcodictiina; espongistatina; mostardas de nitrogênio, tais como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato oxido de mecloretamina, melfalan, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracil; nitrosuréias, tais como camustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimustina; antibióticos, tais como os antibióticos de enediina (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama 11 e caliqueamicina ômega 11 (vide, por exemplo, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engi, 33: 183-186 (1994); dinemicina, incluindo dinemicina A; bifosfonatos, tais como clodronato; esperamicina; bem como neocarzinostatin cromóforo e cromóforos antibióticos de enediina cromoproteína relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina ADRIAMYCIN® (incluindo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e desoxidoxorrubicina), epirubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tais como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabólitos, tais como metotrexato e 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais, tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamido glicosídeo; ácido aminolevulínico; eniluracil; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; epotilona; etoglucídeo; nitrato de gálio; hidroxiuréia; lentinan; lonidainina; maitansinóides, tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etil hidrazida; procarbazina; complexo de polissacarídeos PSK® (JHS Natural Products, Eugene OR); razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxóides, tais como paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton NJ), ABRAXANE® livre de Cremophor, formulação de nanopartículas de paclitaxel elaborada com albumina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) e docetaxel TAXOTERE® (Rhône-Poulenc Rorer1 Antony, França); clorambucil; gencitabina GEMZAR®; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposida (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina NAVELBINE®; novantrona; teniposida; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato;irinotecan (Camptosar, CPT-11); inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinóides, tais como ácido retinoico; capecitabina; combrestatina; Ieucovorina (LV); oxaliplatina, incluindo o regime de tratamento de oxaliplatina (FOLFOX); inibidores de PCK-alfa, Raf1 H-Ras e EGFR (tais como erlotinib (Tarceva®)) que reduzem a proliferação celular e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima.

Também são incluídos nesta definição agentes anti-hormonais que agem para regular ou inibir a ação hormonal sobre tumores tais como antiestrógenos e moduladores receptores de estrógenos seletivos (SERMs)1 que incluem, por exemplo, tamoxifen (incluindo tamoxifen NOVALDEX®), raloxifeno, droloxifeno, 4-hydroxytamoxifen, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno FARESTON; inibidores da aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrógenos nas glândulas adrenais, tais como 4 (5)-imidazóis, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestanie, fadrozol, vorozol RIVISOR®, Ietrozol FEMARA® e anastrozol ARIMIDEX®; e anti-andrógenos, tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, Ieuprolida e goserelin; bem como troxacitabina (análogo de citosina nucleosídeo de 1,3-dioxolano); oligonucleotídeos sem sentido, particularmente os que inibem a expressão de genes em processos de sinalização relacionados à proliferação celular aberrante, tais como PKC-alfa, Ralf e H-Ras; ribozimas, tais como inibidor da expressão de VEGF (por exemplo, ribozima ANGIOZYME®) e inibidor da expressão de HER2; vacinas, tais como vacinas de terapia genética, por exemplo vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN® e vacina VAXID®; rlL-2 PROLEUKIN®; inibidor da topoisomerase 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; Vinorelbina e Esperamicinas (vide a Patente Norte-Americana n° 4.675.187) e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima.O termo "pró-fármaco", da forma utilizada no presente pedido, designa uma forma precursora ou derivada de uma substância farmaceuticamente ativa (tal como molécula pequena) que é menos citotóxica para células doentes em comparação com o fármaco parental e é capaz de ser ativada de forma enzimática ou convertida na forma parental mais ativa. Vide, por exemplo, Wilman1 Prodrugs in Câncer Chemotherapy, Biochemical Society Transactions, 14, págs. 375-382, 615a Reunião de Belfast (1986) e Stella et al, Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, Directed Drug Deliveryl Borchardt et al, (ed.), págs. 247-267, Humana Press (1985). Os pró-fármacos de acordo com a presente invenção incluem, mas não se limitam a pró-fármacos que contêm fosfato, pró-fármacos que contêm tiofosfato, pró-fármacos que contêm sulfato, pró-fármacos que contêm peptídeos, pró-fármacos modificadas com D-aminoácidos, pró-fármacos glicosilados, pró-fármacos que contêm β-lactama, pró-fármacos que contêm fenoxiacetamida opcionalmente substituída ou pró-fármacos que contêm fenilacetamida opcionalmente substituída, 5-fluorocitosina e outros pró-fármacos de 5-fluorouridina que podem ser convertidas no fármaco livre citotóxico mais ativo. Exemplos de fármacos citotóxicos que podem ser derivados em forma de pró-fármaco para uso na presente invenção incluem, mas sem limitar-se aos agentes quimioterápicos descritos acima.

"Isolado", quando utilizado para descrever os vários polipeptídeos descritos no presente, indica polipeptídeo que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de uma célula ou cultura celular do qual foi expresso. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que tipicamente interfeririam com utilizações diagnosticas ou terapêuticas para o polilpeptídeo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em realizações preferidas, o polipeptídeo será purificado (1) até um grau suficiente para a obtenção de pelo menos quinze resíduos deseqüência de aminoácidos interna ou N-terminal, utilizando um sequenciador de xícaras de centrifugação; ou (2) até a homogeneidade, por meio de SDS-PAGE, sob condições redutoras ou não redutoras, utilizando azul deCoomassie ou, preferencialmente, manchas de prata. O polipeptídeo isolado inclui o polipeptídeo in situ em células recombinantes, já que pelo menos um componente do ambiente natural do polipeptídeo não estará presente. Normalmente, entretanto, o polipeptídeo isolado será preparado por meio de pelo menos uma etapa de purificação.

Ácido nucleico codificador de polipeptídeo "isolado" ou outro ácido nucleico codificador de polipeptídeo é molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual normalmente é associada na fonte natural do ácido nucleico codificador de polipeptídeo. Uma molécula de ácido nucleico codificadora de polipeptídeo isolada é diferente na forma ou ambiente em que é encontrada na natureza. As moléculas de ácido nucleico codificadoras de polipeptídeos isoladas são diferenciadas, portanto, da molécula de ácido nucleico codificadora de polipeptídeo específica que existe em células naturais. Uma molécula de ácido nucleico codificadora de polipeptídeo isolada inclui, entretanto, moléculas de ácido nucleico codificadoras de polipeptídeo contidas em células que normalmente expressam o polipeptídeo no qual, por exemplo, a molécula de ácido nucleico encontra-se em um sítio cromossômico diferénte de células naturais.

A expressão "seqüências de controle" designa seqüências de DNA necessárias para a expressão de uma seqüência de codificação ligada operativamente em um organismo hospedeiro específico. As seqüências de controle que são apropriadas para procariontes, por exemplo, incluem uma seqüência promotora, opcionalmente uma seqüência operadora, e um sítio de ligação de ribossomos. As células eucarióticas são conhecidas por utilizarempromotores, sinais de poliadenilação e amplificadores.

Ácido nucleico é "ligado operativamente" quando é colocado em relação funcional com outra seqüência de ácido nucleico. DNA para uma seqüência prévia ou líder de secreção, por exemplo, é ligado operativamente a DNA para um polipeptídeo caso seja expresso na forma de proteína prévia que participa da secreção do polipeptídeo; um promotor ou amplificador é ligado operativamente a uma seqüência de codificação caso afete a transcrição da seqüência; ou um sítio de ligação de ribossomos é ligado operativamente a uma seqüência de codificação caso seja posicionado de forma a possibilitar a tradução. Geralmente, "ligado operativamente" indica que as seqüências de DNA que são ligadas são contíguas e, no caso de líder de secreção, contíguas e em fase de leitura. Os aprimoradores, entretanto, não necessitam ser contíguos. A ligação é obtida por meio de ligação em sítios de restrição convenientes. Caso estes sítios não existam, os adaptadores de oligonucleotídeos sintéticos ou Iigantes são utilizados de acordo com a prática convencional.

"Condições estringentes" ou "condições de alta estringência", da forma definida no presente, podem ser identificadas por aquelas que: (1) empregam baixa resistência iônica e alta temperatura para lavagem, tal como 0,015 M de cloreto de sódio/0,0015 M de citrato de sódio/0,1% de dodecil sulfato de sódio a 50 0C; (2) empregam durante a hibridização um agente desnaturante, tal como formamida, por exemplo 50% (v/v) formamida com albumina de soro bovino a 0,1%/0,1% Ficoll/0,1% polivinilpirrolidona/50 mM de tampão fosfato de sódio sob pH 6,5 com 750 mM de cloreto de sódio, 75 mM de citrato de sódio a 42 °C; ou (3) hibridização por uma noite em uma solução que emprega 50% formamida, 5 χ SSC (0,75 M de NaCI, 0,075 M de citrato de sódio), 50 mM de fosfato de sódio (pH 6,8), 0,1% pirofosfato de sódio, 5 χ solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão sonicado (50 μg/ml),0,1% SDS e 10% sulfato de dextran a 42 °C, com lavagem por dez minutos a 42 0C em 0,2 χ SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio), seguidos por lavagem em alta estringência por dez minutos que consiste de 0,1 χ SSC contendo EDTA a 55 °C.

"Percentual (%) de identidade de seqüência de aminoácidos",com relação às seqüências de polipeptídeos identificadas no presente, é definido como o percentual de resíduos de aminoácidos em uma possível seqüência que são idênticos aos resíduos de aminoácidos no polipeptídeo sendo comparado, após o alinhamento das seqüências e introdução de intervalos, se necessário, para atingir o percentual máximo de identidade de seqüências, sem considerar nenhuma substituição conservadora como parte da identidade de seqüências. O alinhamento para propósitos de determinação do percentual de identidade de seqüências de aminoácidos pode ser atingido de várias formas que se encontram dentro do conhecimento da técnica, utilizando, por exemplo, software de computador disponível ao público, tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos no assunto podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para atingir o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das seqüências sendo comparadas. Para os propósitos do presente, entretanto, valores percentuais de identidade de seqüência de aminoácidos são gerados utilizando o programa de computador de comparação de seqüências ALIGN-2. O programa de computador de comparação de seqüências ALIGN-2 foi elaborado pela Genentech, Inc. e o código fonte (Tabela 1) foi depositado com documentação de usuário no Escritório Norte-Americano de Direitos Autorais, Washington DC 20559, Estados Unidos, onde foi registrado com o n° de Registro de Direitos Autorais Norte-Americano TXU510087. O programa ALIGN-2 é disponível ao público por meio da Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia. O programaALIGN-2 deverá ser compilado para uso em um sistema operativo UNIX, preferencialmente UNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de seqüências são estabelecidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.

As seqüências de aminoácidos descritas no presente são seqüências de aminoácidos contíguas, a menos que especificado em contrário.

Da forma utilizada no presente, o termo "imunoadesina" designa moléculas similares a anticorpos que combinam a especificidade de ligação de uma proteína heteróloga ("uma adesina") com as funções efetoras de domínios constantes de imunoglobulina. Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem uma fusão de uma seqüência de aminoácidos com a especificidade de ligação desejada, que é diferente do sítio de ligação e reconhecimento de antígenos de um anticorpo (ou seja, é "heteróloga") e uma seqüência de domínio constante de imunoglobulina. A parte de adesina de uma molécula de imunoadesina é tipicamente uma seqüência de aminoácidos contígua que compreende pelo menos o sítio de ligação de um receptor ou ligante, tal como VEGFR ou um Iigante de fibronectina. A seqüência de domínio constante de imunoglobulina na imunoadesina pode ser obtida a partir de qualquer imunoglobulina, tal como os subtipos lgG-1, lgG-2, lgG-3 ou lgG-4, IgA (incluindo lgA-1 e lgA-2), IgE, IgD ou IgM. Corpos de peptídeos, que freqüentemente compreendem uma seqüência derivada da seleção de exibição de fagos de seqüências que ligam especificamente um alvo fundido a uma parte Fc de uma imunoglobulina, podem ser considerados imunoadesinas no presente.

O termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais amplo e cobre especificamente, por exemplo, anticorpos monoclonais isolados (incluindo anticorpos agonistas, antagonistas e neutralizantes), composições de anticorpos com especificidade poliepitópica, anticorpos policlonais, anticorpos de fita simples e fragmentos de anticorpos (vide abaixo), desde que liguem especificamente um polipeptídeo nativo e/ou exibam uma atividade biológica ouatividade imunológica de acordo com a presente invenção. Segundo uma realização, o anticorpo liga-se a uma forma oligomérica de uma proteína alvo, tal como uma forma trimérica. Segundo uma outra realização, o anticorpo liga-se especificamente a uma proteína, ligação esta que pode ser inibida por um anticorpo monoclonal de acordo com a presente invenção (tal como um anticorpo depositado de acordo com a presente invenção etc.). A expressão "fragmento funcional ou análogo" de um anticorpo é um composto que possui uma atividade biológica qualitativa em comum com um anticorpo ao qual está se referindo. Um análogo ou fragmento funcional de um anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser, por exemplo, um que possa ligar-se especificamente a VEGF ou alfaõbetal. Em uma realização, o anticorpo pode evitar ou reduzir substancialmente a capacidade de indução da proliferação celular de um VEGF.

"Anticorpo isolado" é aquele que tenha sido identificado, separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interfeririam com utilizações em diagnóstico ou terapêuticas para o anticorpo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em realizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) até mais de 95% em peso de anticorpo, conforme determinado por meio do método de Lowry, e, de maior preferência, mais de 99% em peso; (2) até grau suficiente para a obtenção de pelo menos quinze resíduos de seqüência de aminoácidos interna ou N-terminal, utilizando um seqüenciador de xícara de centrifugação; ou (3) até a homogeneidade, por meio de SDS-PAGE, sob condições redutoras ou não redutoras, utilizando azul de Coomassie ou, preferencialmente, manchas de prata. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ em células recombinantes, desde que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não esteja presente. Normalmente, entretanto, oanticorpo isolado será preparado por meio de pelo menos uma etapa de purificação.

A unidade básica de anticorpo de quatro cadeias é uma glicoproteína heterotetramérica composta de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas (um anticorpo de IgM consiste de cinco das unidades heterotetraméricas básicas, juntamente com um polipeptídeo adicional denominado cadeia J, contendo, portanto, dez sítios de ligação de antígenos, enquanto os anticorpos de IgA secretados podem polimerizar-se para formar conjuntos polivalentes que compreendem de duas a cinco das unidades básicas de quatro cadeias juntamente com a cadeia J). No caso de IgGs1 a unidade de quatro cadeias é geralmente de cerca de 150.000 daltons. Cada cadeia L é ligada a uma cadeia H por uma ligação de dissulfeto covalente, enquanto as duas cadeias H são ligadas entre si por uma ou mais ligações de dissulfeto, dependendo do isotipo de cadeia H. Cada cadeia HeL também contém pontes de dissulfeto intracadeias em espaços regulares. Cada cadeia H contém, no terminal N1 um domínio variável (Vh) seguido por três domínios constantes (Ch) para cada uma das cadeias α e γ e quatro domínios Ch para os isótipos μ e ε. Cada cadeia L contém, no terminal N, um domínio variável (Vl) seguido por um domínio constante (Cl) na sua outra extremidade. O Vl é alinhado ao Vh e o Cl é alinhado ao primeiro domínio constante da cadeia pesada (CH1). Acredita-se que resíduos de aminoácidos específicos formem uma superfície intermediária entre os domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada. O pareamento de Vh e Vl forma um sítio de ligação de antígenos isolado. Para a estrutura e propriedades das diferentes classes de anticorpos, vide, por exemplo, Basic and Clinicai Immunology, oitava edição, Daniel P. Stites, Abba I. Terr e Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk CT, 1994, pág. 71 e Capítulo 6.

A cadeia L de qualquer espécie de vertebrado pode serclassificada em um dentre dois tipos claramente distintos, denominados capa e lambda, com base nas seqüências de aminoácidos dos seus domínios constantes. Dependendo da seqüência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas (Ch)i as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes ou isotipos. Existem cinco classes de imunoglobulinas: IgA1 IgD1 IgE1 IgG e IgM1 que contêm cadeias pesadas denominadas α, δ, γ, ε e μ, respectivamente. As classes γ e α são adicionalmente divididas em subclasses com base em diferenças relativamente menores de função e seqüência de Ch; seres humanos, por exemplo, expressam as subclasses a seguir: IgGI, lgG2, lgG3, IgG4, IgAI e lgA2.

O termo "variável" designa o fato de que certos segmentos dos domínios variáveis diferem extensamente de seqüência entre os anticorpos. O domínio V media a ligação de antígenos e define a especificidade de um anticorpo específico para o seu antígeno específico. Entretanto, a variabilidade não é distribuída regularmente ao longo da série de 110 aminoácidos dos domínios variáveis. Ao contrário, as regiões V consistem de estiramentos relativamente invariáveis denominados regiões de estrutura (FRs) de quinze a trinta aminoácidos separados por regiões mais curtas de extrema variabilidade, denominadas "regiões hipervariáveis" que contêm de nove a doze aminoácidos de comprimento cada uma. Cada um dos domínios variáveis de cadeia leve e pesada compreende quatro FRs1 que adotam em grande parte configuração de folha beta, conectadas por três regiões hipervariáveis, que formam circuitos que conectam e, em alguns casos, fazem parte da estrutura de folha beta. As regiões hipervariáveis de cada cadeia são mantidas juntas em boa proximidade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação de antígenos de anticorpos (vide Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991)). Os domíniosconstantes não estão diretamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem diversas funções efetoras, tais como a participação do anticorpo em citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC).

A expressão "região hipervariável", quando utilizada no presente, designa os resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação de antígenos. A região hipervariável compreende geralmente resíduos de aminoácidos de uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" (por exemplo, por volta dos resíduos cerca de 24 a 34 (L1), 50 a 56 (L2) e 89 a 97 (L3) no Vl e por volta de cerca de 31 a 35B (H1), 50 a 65 (H2) e 95 a 102 (H3) no Vh (em uma realização, H1 é de cerca de 31 a 35); Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991)) e/ou os resíduos de um "laço hipervariável" (por exemplo, resíduos 26 a 32 (L1), 50 a 52 (L2) e 91 a 96 (L3) no VL e 26 a 32 (H1), 53 a 55 (H2) e 96 a 101 (H3) no Vh (Chothia e Lesk, J. Mol. Bioi 196: 901-917 (1987)).

A expressão "anticorpo monoclonal", da forma utilizada no presente, designa um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos para um único sítio antigênico. Além disso, ao contrário das preparações de anticorpos policlonais que incluem diferentes anticorpos dirigidos a diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado a um único determinante sobre o antígeno. Além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos por poderem ser sintetizados de forma não contaminada por outros anticorpos. O adjetivo "monoclonal" não deve ser considerado exigindo a produção do anticorpo por meio de qualquer métodoespecífico. Os anticorpos monoclonais úteis na presente invenção podem ser preparados, por exemplo, por meio da metodologia de hibridoma descrita em primeiro lugar por Kohler et al, Nature, 256: 495 (1975), ou pode ser fabricada utilizando métodos de DNA recombinante em células vegetais, animais, eucarióticas ou bacterianas (vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana n° 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpos de fagos, utilizando as técnicas descritas, por exemplo, em Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991) e Marks et al, J. Mol. Biol. , 222: 581-597 (1991), por exemplo, e nos Exemplos abaixo.

Os anticorpos monoclonais do presente incluem anticorpos"quiméricos", em que uma parte da cadeia leve e/ou pesada é idêntica ou homóloga a seqüências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencentes a uma classe ou subclasse específica de anticorpos, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a seqüências correspondentes de anticorpos derivados de outras espécies ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos desses anticorpos, desde que exibam a atividade biológica de acordo com a presente invenção (vide a Patente Norte-Americana n° 4.816.567; e Morrison et al, Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A. 81: 6851-6855 (1984)). Os anticorpos quiméricos de interesse no presente incluem anticorpos "primatizados", que compreendem seqüências de ligação de antígenos de um domínio variável derivadas de primatas não humanos (por exemplo, Macaco do Velho Mundo cercopitecídeos, Chimpanzé etc.) e seqüências de regiões constantes humanas.

Um anticorpo "intacto" é aquele que compreende um sítio deligação de antígenos, bem como um Cl e pelo menos domínios contantes de cadeia pesada, Ch 1, Cr2 e Ch3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de seqüência nativa (por exemplo, domínios constantes deseqüências nativas humanas) ou suas variantes de seqüências de aminoácidos. Preferencialmente, o anticorpo intacto possui uma ou mais funções efetoras.

"Fragmentos de anticorpos" compreendem uma parte de um anticorpo intacto, preferencialmente a região variável ou de ligação de antígenos do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos de Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos, anticorpos lineares (vide a Patente Norte-Americana n° 5.641.870, Exemplo 2; Zapata et al, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)); moléculas de anticorpos de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.

A expressão "anticorpos lineares" geralmente designa os anticorpos descritos em Zapata et al, Protein Eng., 8 (10): 1057-1062 (1995). Resumidamente, estes anticorpos compreendem um par de segmentos Fd em conjunto (VH-CH1-VH-CH1) que, junto com os polipeptídeos de cadeia leve complementares, formam um par de regiões de ligação de antígenos. Os anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos.

A digestão de papaína de anticorpos produz dois fragmentos idênticos de ligação de antígenos, denominados fragmentos "Fab", e um fragmento "Fc" residual, cuja designação reflete a capacidade de cristalização rápida. O fragmento de Fab consiste de uma cadeia L inteira, juntamente com o domínio de região variável da cadeia H (Vh), e o primeiro domínio constante de uma cadeia pesada (Ch1). Cada fragmento de Fab é monovalente com relação à ligação de antígenos, ou seja, contém um único sítio de ligação de antígenos. O tratamento com pepsina de um anticorpo gera um único fragmento F(ab')2 grande, que corresponde aproximadamente a dois fragmentos de Fab ligados por dissulfeto que possuem atividade de ligação de antígenos divalentes e ainda são capazes de reticular antígenos. Os fragmentos de Fab' diferem dos fragmentos de Fab por conterem alguns resíduos adicionais no terminal carbóxido domínio Ch1, incluindo uma ou mais cisteínas da região de articulação do anticorpo. Fab'-SH é a designação do presente para Fab' em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes apresenta(m) um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpos F(ab')2 foram originalmente produzidos na forma de pares de fragmentos de Fab' que contêm cisteínas de articulação entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos também são conhecidos.

O fragmento de Fc compreende as partes carbóxi-terminais das duas cadeias H mantidas juntas por dissulfetos. As funções efetoras de anticorpos são determinadas por seqüências na região Fc1 que também é a parte reconhecida por receptores de Fc (FcR) encontrados em certos tipos de células.

"Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém sítio de reconhecimento e de ligação de antígenos completo. Esse fragmento consiste de um dímero de um domínio de região variável de cadeia leve e de cadeia pesada em associação firme e não covalente. Da dobra desses dois domínios, emanam seis laços hipervariáveis (três laços da cadeia HeL cada) que contribuem com os resíduos de aminoácidos para ligação de antígenos e conferem especificidade de ligação de antígenos ao anticorpo. Entretanto, mesmo um domínio variável isolado (ou metade de um Fv que compreende apenas três CDRs específicas para um antígeno) possui a capacidade de reconhecer e ligar antígeno, embora em afinidade menor que todo o sítio de ligação.

"Fv de cadeia isolada", também abreviado como "sFv" ou "scFv", são fragmentos de anticorpos que compreendem os domínios de anticorpos Vh e Vl conectados a uma única cadeia de polipeptídeo. Preferencialmente, o polipeptídeo de sFv compreende adicionalmente um Iigante de polipeptídeo entre os domínios Vh e VL, o que permite que o sFv forme a estrutura desejada para ligação de antígenos. Para análise de sFv, vide Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds.,Springer-Verlag, Nova Iorque, págs. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, abaixo.

O termo "diacorpos" designa fragmentos de anticorpos pequenos preparados por meio da construção de fragmentos de sFv (vide parágrafo anterior) com Iigantes curtos (cerca de cinco a dez resíduos) entre os domínios Vh e VL, de forma a atingir-se o pareamento intercadeias mas não intracadeias dos domínios V, resultando em um fragmento bivalente, ou seja, um fragmento contendo dois sítios de ligação de antígenos. Os diacorpos biespecíficos são heterodímeros de dois fragmentos de sFv "cruzados", em que os domínios Vh e Vl dos dois anticorpos estão presentes sobre diferentes cadeias de polipeptídeos. Os diacorpos são descritos mais completamente, por exemplo, em EP 404.097, WO 93/11161 e Hollinger et aí, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 90: 6444-6448 (1993).

As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, de roedores) são anticorpos quiméricos que contêm seqüência mínima derivada do anticorpo não humano. Em sua maioria, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor), em que resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador), tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano que apresente a capacidade, afinidade e especificidade de anticorpo desejada. Em alguns casos, os resíduos de região de estrutura (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor nem no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Geralmente, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um, tipicamente dois domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos os laços hipervariáveis correspondem aos de umaimunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs são as de uma seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compreenderá opcionalmente pelo menos uma parte de região constante de imunoglobulina (Fc)1 tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, vide Jones et al, Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct Biol. 2: 593-596 (1992).

"Anticorpo dependente de espécie" é um anticorpo que possui afinidade de ligação mais forte para um antígeno de uma primeira espécie de mamífero que para um homólogo daquele antígeno de uma segunda espécie de mamífero. Normalmente, o anticorpo dependente de espécie "liga-se especificamente" a um antígeno humano (ou seja, possui valor de afinidade de ligação (Kd) de não mais de cerca de 1 χ 1CT7 Μ, preferencialmente não mais de cerca de 1 χ 10"8 e, de maior preferência, não mais de cerca de 1 χ 10"9 Μ), mas possui afinidade de ligação para um homólogo do antígeno de uma segunda espécie de mamífero não humano que é pelo menos cerca de cinqüenta vezes, pelo menos cerca de quinhentas vezes ou pelo menos cerca de mil vezes mais fraca que a sua afinidade de ligação para o antígeno humano. O anticorpo dependente de espécie pode ser de qualquer dos diversos tipos de anticorpos definidos acima, mas é preferencialmente um anticorpo humano ou humanizado.

Nessas realizações, a extensão da ligação do polipeptídeo, anticorpo, antagonista ou composição a uma proteína "não alvo" será de menos de cerca de 10% da ligação do polipeptídeo, anticorpo, antagonista ou composição à sua proteína alvo específica, conforme determinado por meio de análise de ordenamento de células ativadas por fluorescência (FACS) ou radioimunoprecipitação (RIA). Com relação à ligação de um polipeptídeo, anticorpo, antagonista ou composição a uma molécula alvo, a expressão"ligação especí fica", "liga-se especificamente a" ou "é específica para" um polipeptídeo específico ou um epítopo sobre um polipeptídeo alvo específico indica ligação que é mensuravelmente diferente de uma interação não específica. A ligação específica pode ser medida, por exemplo, por meio da determinação da ligação de uma molécula em comparação com a ligação de uma molécula controle, que geralmente é uma molécula com estrutura similar que não possui atividade de ligação. A ligação específica pode ser determinada, por exemplo, por meio de competição com uma molécula controle que é similar ao alvo, tal como excesso de alvo não marcado. Neste caso, indica-se ligação específica caso a ligação do alvo marcado a uma sonda seja competitivamente inibida por alvo não marcado em excesso. A expressão "ligação específica", "liga-se especificamente a" ou "é específico para" um polipeptídeo específico ou um epítopo sobre um polipeptídeo alvo específico, da forma utilizada no presente, pode ser exibida, por exemplo, por uma molécula que possui Kd para o alvo de pelo menos cerca de 10"4 M, alternativamente pelo menos cerca de 10"5 M, alternativamente pelo menos cerca de 10"6 M, alternativamente pelo menos cerca de 10"7 M, alternativamente pelo menos cerca de 10"8 M, alternativamente pelo menos cerca de 10"9 M, alternativamente pelo menos cerca de 10"10 M, alternativamente pelo menos cerca de 10"11 M, alternativamente pelo menos cerca de 10"12 M ou mais. Em uma realização, a expressão "ligação específica" indica ligação em que uma molécula liga-se a polipeptídeo específico ou epítopo sobre um polipeptídeo específico sem ligação substancial a nenhum outro polipeptídeo ou epítopo de polipeptídeo.

As "funções efetoras" de anticorpos designam as atividadesbiológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de seqüência nativa ou região Fc com variação de seqüência de aminoácidos) de um anticorpo e variam de acordo com o isotipo do anticorpo. Exemplos das funções efetoras deanticorpos incluem: citotoxicidade dependente de complemento e ligação de C1q; ligação de receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulagem para baixo de receptores da superfície celular; e ativação de células B. Uma "região Fc de seqüência nativa" compreende uma seqüência de aminoácidos idêntica à seqüência de aminoácidos de uma região Fc encontrada na natureza. Exemplos de seqüências de Fc são descritos, por exemplo, mas sem limitar-se a Kabat et al, Sequences of Immunological ínterest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991)).

Uma "região Fc variante" compreende uma seqüência deaminoácidos que difere daquela de uma região Fc de seqüência nativa em virtude de pelo menos uma "modificação de aminoácido", conforme definido no presente. Preferencialmente, a região Fc variante contém pelo menos uma substituição de aminoácido em comparação com uma região Fc de seqüência nativa ou com a região Fc de um polipeptídeo parental, tal como cerca de uma a cerca de dez substituições de aminoácidos e, preferencialmente, cerca de uma a cerca de cinco substituições de aminoácidos em uma região Fc de seqüência nativa ou na região Fc do polipeptídeo parental. Em uma realização, a região Fc variante do presente possuirá pelo menos cerca de 80% de homologia, pelo menos cerca de 85% de homologia, pelo menos cerca de 90% de homologia, pelo menos cerca de 95% de homologia ou pelo menos cerca de 99% de homologia com uma região Fc de seqüência nativa. Segundo uma outra realização, a região Fc variante do presente possuirá pelo menos cerca de 80% de homologia, pelo menos cerca de 85% de homologia, pelo menos cerca de 90% de homologia, pelo menos cerca de 95% de homologia ou pelo menos cerca de 99% de homologia com uma região Fc de um polipeptídeo parental.

"Percentual (%) de identidade de seqüência de aminoácidos" ou "homologia", com relação às seqüências de polipeptídeos e de anticorposidentificadas no presente, é definido como o percentual de resíduos de aminoácidos em uma possível seqüência que são idênticos aos resíduos de aminoácidos no polipeptídeo sendo comparado, após o alinhamento das seqüências, considerando qualquer substituição conservadora como parte da identidade de seqüência. O alinhamento para propósitos de determinação do percentual de identidade de seqüências de aminoácidos pode ser atingido de várias formas que se encontram dentro do conhecimento da técnica, utilizando, por exemplo, software de computador disponível ao público, tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos no assunto podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para atingir o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das seqüências sendo comparadas. Para os propósitos do presente, entretanto, valores percentuais de identidade de seqüência de aminoácidos são gerados utilizando o programa de computador de comparação de seqüências ALIGN-2. O programa de computador de comparação de seqüências ALIGN-2 foi elaborado pela Genentech, Inc. e o código fonte foi depositado com documentação de usuário no Escritório Norte-Americano de Direitos Autorais, Washington DC 20559, Estados Unidos, onde foi registrado com o n° de Registro de Direitos Autorais Norte-Americano TXU510087. O programa ALIGN-2 é disponível ao público por meio da Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia. O programa ALIGN-2 deverá ser compilado para uso em um sistema operativo UNIX, preferencialmente UNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de seqüências são estabelecidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.

A expressão "polipeptídeo que compreende uma região Fc"designa um polipeptídeo, tal como um anticorpo ou imunoadesina (vide definições abaixo), que compreende região Fe. A Iisina C-terminal (resíduo 447 de acordo com o sistema de numeração EU) da região Fc pode ser removida,por exemplo, durante a purificação do polipeptídeo ou por meio de elaboração recombinante do ácido nucleico que codifica o polipeptídeo. Conseqüentemente, uma composição que compreende polipeptídeos, incluindo anticorpos, que possuem uma região Fc de acordo com a presente invenção pode compreender populações de peptídeos com todos os resíduos K447 removidos, populações de polipeptídeos sem resíduos K447 removidos ou populações de polipeptídeos que possuem uma mistura de polipeptídeos com e sem o resíduo K447.

Ao longo de todo presente relatório descritivo e reivindicações, o sistema de numeração de Kabat é geralmente utilizado com referência a um resíduo no domínio variável (aproximadamente, resíduos 1 a 107 da cadeia leve e resíduos 1 a 113 da cadeia pesada) (por exemplo, Kabat et al, Sequences of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991)). O "sistema de numeração EU" ou "índice EU" geralmente é utilizado com referência a um resíduo em uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, o índice EU relatado em Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991), expressamente incorporado ao presente como referência). A menos que indicado em contrário no presente, referências a números de resíduos no domínio variável de anticorpos indicam numeração de resíduos por meio do sistema de numeração de Kabat. A menos que indicado em contrário no presente, referências a números de resíduos no domínio constante de anticorpos indicam numeração de resíduos por meio do sistema de numeração de EU.

As expressões "receptor de Fc" ou "FcR" são utilizadas paradescrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. Em uma realização, um FcR de acordo com a presente invenção é aquele que liga um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI,FcyRII e FcyRIII1 incluindo variantes alélicas e, alternativamente, formas divididas desses receptores. Os receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor de ativação") e FcyRIIB (um "receptor de inibição"), que possuem seqüências de a minoácidos similares que diferem principalmente nos seus domínios citoplasmáticos. O receptor de ativação FcyRIIA contém um motivo de ativação com base em tirosina imunorreceptora (ITAM) no seu domínio citoplasmático. O receptor de inibição FcyRIIB contém um motivo de inibição com base em tirosina imunorreceptora (ITIM) no seu domínio citoplasmático (vide análise M. em Daèron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). O termo inclui alótipos, tais como alótipos de FcyRIIIA: FcyRIIIA-Phe 158, FcyRIIIA-VaM58, FcyRIIA-RI31 e/ou FcyRIIA-HI31. FcRs são analisados em Ravetch e Kinet1 Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capei et al, Immunomethods 4: 25-34 (1994); e de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são englobados pelo termo "FcR" no presente. O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternos para o feto (Guyer et al, J. Immunol. 117: 587 (1976) e Kim et al, J. Immunol. 24: 249 (1994)).

O termo "FcRn" indica o receptor de Fc neonatal (FcRn). FcRn possui estrutura similar ao complexo principal de histocompatibilidade (MHC) e consiste de uma cadeia V ligada de forma não covalente a 32-microglobulina. As diversas funções do receptor de Fc neonatal FcRn são analisadas em Ghetie e Ward (2000), Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766. FcRn desempenha um papel no fornecimento passivo de IgGs de imunoglobulina de mãe para filho e na regulagem dos níveis de IgG em soro. FcRn pode agir como um receptor de salvados, ligando e transportando IgGs pinocitosados em forma intacta no interior e através das células, resgatando-os de um processo degradativo padrão.

Os documentos WO 00/42072 (Presta) e Shields et al, J. Bioi Chem. 9 (2): 6591-6604 (Presta) descrevem variantes de anticorpos com maiorou menor ligação a FcRs. O teor dessas publicações é incorporado especificamente ao presente como referência.

O "domínio CH1" de uma região Fc de IgG humana (também denominado domínio "C1" de Ή1") normalmente estende-se de cerca do aminoácido 118 até cerca do aminoácido 215 (sistema de numeração EU).

"Região de articulação" é geralmente definida como estendendo-se de Glu216 a Pro230 de IgGI humano (Burton1 Molec. Immunol. 22: 161-206 (1985)). As regiões de articulação de outros isotipos de IgG podem ser alinhadas com a seqüência de através da colocação dos primeiro e último resíduos de cisteína, formando ligações S-S intercadeias pesadas nas mesmas posições.

A "região de articulação inferior" de uma região Fc é normalmente definida como o estiramento de resíduos imediatamente C-terminais para a região de articulação, ou seja, os resíduos 233 a 239 da região Fe. Em relatórios anteriores, a ligação de FcR geralmente foi atribuída a resíduos de aminoácidos na região de articulação inferior de uma região Fc de IgG.

O "domínio CH2" de uma região Fc de IgG humana (também denominado domínio "C2" de "H2") normalmente estende-se de cerca do aminoácido 231 até cerca do aminoácido 340. O domínio CH2 é exclusivo pelo fato de que não é emparelhado de perto com outro domínio. Por outro lado, as cadeias de carboidrato ramificadas N-Iigadas são interpostas entre os dois domínios CH2 de uma molécula IgG nativa intacta. Especulou-se que o carboidrato pode fornecer um substituto para o pareamento entre domínios e ajudar a estabilizar o domínio CH2. Burton, Molec. Immunol. 22: 161-206 (1985).

O "domínio CH3" (também denominado domínio "C2" ou Ή3") compreende o estiramento de resíduos C-terminais até um domínio CH2 em uma região Fc (ou seja, de cerca do resíduo de aminoácido 341 até aextremidade C-terminal de uma seqüência de anticorpo, tipicamente no resíduo de aminoácido 446 ou 447 de um IgG).

Uma "região Fc funcional" possui uma "função efetora" de uma região Fc de seqüência nativa. Exemplos de "funções efetoras" incluem ligação 5 de C1q, citotoxicidade dependente de complemento, ligação de receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulagem para baixo de receptores da superfície celular (tais como receptor de células B; BCR) etc. Essas funções efetoras geralmente necessitam que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (tal 10 como um domínio variável de anticorpo) e podem ser determinadas utilizando vários testes conforme descrito no presente, por exemplo.

"C1q" é um polipeptídeo que inclui um sítio de ligação para a região Fc de uma imunoglobulina. C1q, juntamente com duas serino proteases, C1r e C1s, formam o complexo C1, o primeiro componente do processo de -citotoxicidade dependente de complemento (CDC). C1q humano pode ser adquirido comercialmente, por exemplo, por meio da Quidel, San Diego CA.

A expressão "domínio de ligação" designa a região de um polipeptídeo que se liga a uma outra molécula. No caso de um FcR1 o domínio de ligação pode compreender uma parte de uma de suas cadeias de polipeptídeo (tal como a sua cadeia alfa) que é responsável pela ligação de uma região Fe. Um domínio de ligação útil é o domínio extracelular de uma cadeia alfa de FcR.

Um anticorpo ou corpo de peptídeo com um Fc de IgG variante com afinidade de ligação de FcR "alterada" ou atividade de ADCC é aquele que possui atividade de ligação de FcR (tal como FcyR ou FcRn) e/ou atividade de ADCC aumentada ou reduzida em comparação com um polipeptídeo parental ou um polipeptídeo que compreende uma região Fc de seqüência nativa. O Fc variante que "exibe maior ligação" a um FcR liga pelo menos um FcR comafinidade mais alta (tal como valor IC50 ou Kd aparente mais baixo) que o polipeptídeo parental ou um Fc de IgG de seqüência nativa. Segundo algumas realizações, o aumento da ligação em comparação com um polipeptídeo parental é de cerca de três vezes, preferencialmente cerca de 5, 10, 25, 50, 60, 100, 150, 200, até 500 vezes, ou cerca de 25% a 1000% de melhoria da ligação. A variante de polipeptídeo que "exibe ligação reduzida" a um FcR liga pelo menos um FcR com afinidade mais baixa (tal como Kd aparente mais alto ou valor IC50 mais alto) que um polipeptídeo parental. A redução da ligação em comparação com um polipeptídeo parental pode ser de cerca de 40% ou mais de redução da ligação.

"Citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos" ou "ADCC" designa uma forma de citotoxicidade, em que Ig secretado e ligado a receptores de Fc (FcRs) presentes em certas células citotóxicas (por exemplo, Células Matadoras Naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) permitem que essas células efetoras citotóxicas liguem-se especificamente a uma célula alvo que contenha antígenos e subseqüentemente matem a célula alvo com citotoxinas. Os anticorpos "armam" as células citotóxicas e são absolutamente necessários para essa matança. As células primárias para a mediação de ADCC, células NK, expressam unicamente FcyRdI1 enquanto monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR sobre células hematopoiéticas é resumida na Tabela 3 da página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); para determinar a atividade de ADCC de molécula de interesse, pode ser realizado um teste de ADCC in vitro, tal como o descrito na Patente Norte-Americana n° 5.500.362 ou 5.821.337 ou nos Exemplos abaixo. Células efetoras úteis para esses testes incluem células mononucleares sangüíneas periféricas (PBMC) e células Matadoras Naturais (NK). Alternativa ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser determinada in vivo, tal como em modelo animal como odescrito em Clynes etal, PNAS (U. S. A.) 95: 652-656 (1998).

O polipeptídeo que compreende uma região Fc variante que "exibe aumento de ADCC" ou media citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC) na presença de células efetoras humanas mais eficientemente que um polipeptídeo que contém Fc de IgG do tipo selvagem ou um polipeptídeo parental é aquele que in vitro ou in vivo é substancialmente mais eficaz na mediação de ADCC, quando as quantidades de polipeptídeo com região Fc variante e o polipeptídeo com região Fc do tipo selvagem (ou o polipeptídeo parental) no teste são essencialmente as mesmas. Geralmente, essas variantes serão identificadas utilizando o ensaio de ADCC in vitro, conforme descrito no presente, mas são contemplados outros testes ou métodos de determinação da atividade de ADCC, por exemplo em um modelo animal etc. Em uma realização, a variante preferida é de cerca de cinco vezes a cerca de cem vezes, tal como cerca de 25 a cerca de 50 vezes, mais eficaz 15 na mediação de ADCC que o Fc do tipo selvagem (ou polipeptídeo parental).

"Citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" designa a Iise de uma célula alvo na presença de complemento. A ativação do processo clássico de complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (C1q) a anticorpos (da subclasse apropriada) que são ligados ao seu antígeno cognato. Para determinar a ativação do complemento, pode ser realizado teste de CDC, conforme descrito, por exemplo, em Gazzano-Santoro etal, J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).

Variantes de polipeptídeos com seqüências de aminoácidos com região Fc alterada e maior ou menor capacidade de ligação de C1q são descritas na Patente Norte-Americana n° 6.194.551 B1 e WO 99/51642. O teor dessas publicações é incorporado especificamente ao presente como referência. Vide também Idusogie et al, J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

"Células efetoras humanas" são leucócitos que expressam um oumais FcRs e realizam funções efetoras. Segundo uma realização, as células expressam pelo menos FcyRI 11 e realizam função efetora de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que mediam ADCC incluem células mononucleares sangüíneas periféricas (PBMC)1 células matadoras naturais (NK), monócitos, 5 células T citotóxicas e neutrófilos; em que PBMCs e células NK são preferidas. As células efetoras podem ser isoladas a partir de uma fonte nativa, tal como sangue ou PMBCs, conforme descrito no presente.

Métodos de medição da ligação a FcRn são conhecidos (vide, por exemplo, Ghetie 1997, Hinton 2004) e também descritos nos Exemplos abaixo. A ligação a FcRn humano in vivo e a meia vida em soro de polipeptídeos de ligação com alta afinidade para FcRn humano podem ser testadas, por exemplo, em camundongos transgênicos ou linhagens de células humanas transfectadas que expressam FcRn humano, ou em primatas que recebem administração de polipeptídeos variantes de Fe. Em uma realização, especificamente os anticorpos anti-alfa5beta1 de acordo com a presente invenção que contêm um Fc de IgG variante exibem aumento da afinidade de ligação para FcRn humano sobre um peptídeo que contém Fc de IgG do tipo selvagem em pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 60 vezes, pelo menos 70 vezes, pelo menos 80 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 125 vezes, pelo menos 150 vezes. Em uma realização específica, a afinidade de ligação para FcRn humano é aumentada em cerca de 170 vezes.

Para afinidade de ligação a FcRn, em uma realização, o EC50 ou Kd aparente (sob pH 6,0) do polipeptídeo é de menos de 1 μΜ, de maior 25 preferência menor ou igual a 100 nM, de maior preferência menor ou igual a 10 nM. Em uma realização, para aumento da afinidade de ligação a FcyRIII (F158; ou seja, isotipo de baixa afinidade), o EC50 ou Kd aparente é menor ou igual a 10 nM e, para FcyRIII (V158; isotipo de alta afinidade), o EC50 ou Kd aparenteé menor ou igual a 3 nM. Segundo uma outra realização, uma redução da ligação de um anticorpo a um receptor Fc com relação a um anticorpo controle (tal como o anticorpo Herceptin®) pode ser considerada significativa com rélação ao anticorpo controle se a razão entre os valores das absorções nos pontos intermediários do anticorpo de teste e as curvas de ligação do anticorpo controle (tal COmO A450 nm (anticorpo/A45o nm (Ab controle)) for ΓΠβΠΟΓ OU igual 3 40%. Segundo uma outra realização, um aumento da ligação de um anticorpo a um receptor Fc com relação a um anticorpo controle (tal como o anticorpo Herceptin®) pode ser considerada significativa com relação ao anticorpo controle se a razão entre os valores das absorções nos pontos intermediários do anticorpo de teste e as curvas de ligação do anticorpo controle (tal como A450 nm (anticorPo)/A450 nm (Ab controle)) for maior ou igual a 125%. Vide, por exemplo, o Exemplo 16.

Um "polipeptídeo parental" ou "anticorpo parental" é um 15 polipeptídeo ou anticorpo que compreende uma seqüência de aminoácidos da qual surgiu o polipeptídeo ou anticorpo variante e com o qual o polipeptídeo ou anticorpo variante está sendo comparado. Tipicamente, o polipeptídeo parental ou anticorpo parental não possui uma ou mais das modificações de regiões Fc descritas no presente e difere de função efetora em comparação com uma 20 variante de polipeptídeo conforme descrito no presente. O polipeptídeo parental pode compreender uma região Fc de seqüência nativa ou uma região Fc com modificações de seqüência de aminoácidos previamente existentes (tais como adições, exclusões e/ou substituições).

Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser derivados de uma biblioteca de fagos. Da forma utilizada no presente, "biblioteca" designa uma série de seqüências de anticorpos ou fragmentos de anticorpos, ou os ácidos nucleicos que codificam essas seqüências, em que as seqüências são diferentes na combinação de aminoácidos variantes que sãointroduzidos nessas seqüências segundo os métodos de acordo com a presente invenção.

"Exibição por fagos" é um método por meio do qual polipeptideos variantes são exibidos como proteínas de fusão para pelo menos uma parte de proteína de revestimento sobre a superfície de partículas de fago, tal como fago filamentoso. A utilidade de exibição de fagos reside no fato de que grandes bibliotecas de variantes de proteínas aleatorizadas seletivamente podem ser ordenadas rápida e eficientemente para as seqüências que ligam antígeno alvo com alta afinidade. A exibição de bibliotecas de proteínas e peptídeos em fago vem sendo utilizada para selecionar milhões de peptídeos em busca dos que possuem propriedades de ligação específicas. Métodos de exibição por fagos polivalentes vêm sendo utilizados para exibir pequenos peptídeos aleatórios e proteínas pequenas por meio de fusões ao gene Ill ou gene Vll de fago filamentoso. Wells e Lowman1 Curr. Opin. Struct Biol., 3: 355-15 362 (1992) e referências ali mencionadas. Em uma exibição por fagos monovalentes, uma biblioteca de peptídeos ou proteínas é fundida a um gene Ill ou uma de suas partes e expressa em baixos níveis na presença de proteína de gene Ill do tipo selvagem, de forma que as partículas de fagos exibam uma ou nenhuma cópia das proteínas de fusão. Os efeitos da avidez são reduzidos 20 com relação a fago polivalente, de tal forma que a seleção seja realizada com base na afinidade de Iigantes intrínsecos e são utilizados vetores de fagomídeos, que simplificam manipulações de DNA. Lowman e Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3: 205-0216 (1991).

Um "fagomídeo" é um vetor de plasmídeo que possui uma origem 25 de reprodução bacteriana, tal como Co1E1, e uma cópia de uma região intergênica de um bacteriófago. O fagomídeo pode ser utilizado sobre qualquer bacteriófago conhecido, incluindo bacteriófago filamentoso e bacteriófago lambóide. O plasmídeo também conterá geralmente um marcador selecionávelpara resistência a antibióticos. Segmentos de DNA clonados nesses vetores podem ser propagados como plasmídeos. Quando células que abrigam estes vetores possuem todos os genes necessários para a produção de partículas de fagos, o modo de reprodução do plasmídeo altera-se para reprodução de círculo rolante para gerar cópias de uma fita do DNA de plastídeo e partículas de fagos de pacotes. O fagomídeo pode formar partículas de fagos infecciosas ou não infecciosas. Este termo inclui fagomídeos que contêm um gene de proteína de revestimento de fago ou seu fragmento ligado a um gene de polipeptídeo heterólogo como uma fusão de gene, de tal forma que o polipeptídeo heterólogo seja exibido sobre a superfície da partícula de fago.

A expressão "vetor de fago" indica uma forma reprodutiva de fita dupla de um bacteriófago que contém um gene heterólogo e capaz de reprodução. O vetor de fago possui uma origem de reprodução de fago que permite a reprodução de fagos e a formação de partículas de fago. O fago é preferencialmente um bacteriófago filamentoso, tal como um fago M13, fl, fd, Pf3 ou um de seus derivados, ou um fago lambdóide, tal como lambda, 21, phi80, phi81, 82, 424, 434 etc. ou um de seus derivados.

Modificações covalentes de polipeptídeos tais como polipeptídeos, imunoadesinas, anticorpos e peptídeos curtos são incluídas no escopo da presente invenção. Um tipo de modificação covalente inclui a reação de resíduos de aminoácidos desejados de um polipeptídeo com um agente derivante orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou os resíduos N ou C-terminais do polipeptídeo. A derivação com agentes bifuncionais é útil, por exemplo, para reticular o polipeptídeo em uma superfície 25 ou matriz de suporte insolúvel em água para uso no método de purificação de anticorpos e vice versa. Os agentes reticulantes comumente utilizados incluem, por exemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeído, N-hidroxissuccinimido ésteres, tais como ésteres com ácido 4-azidossalicílico,imidoésteres homobifuncionais, incluindo dissuccinimidil ésteres tais como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionais, tais como bis-N-maleimido-1,8-octano, e agentes tais como 3-[(p-azidofenil)ditiopropioimidato de metila.

Outras modificações incluem a desamidação de resíduosglutaminila e asparaginila nos resíduos de glutamila e aspartila correspondentes, respectivamente, hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxila de resíduos serila ou treonila, metilação dos grupos examino de cadeias laterais de lisina, arginina e histidina (Τ. E. Creighton, 10 Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., São Francisco, págs. 79-86 (1983)), acetilação da amina N-terminal e amidação de qualquer grupo carboxila C-terminal.

Outras modificações incluem a conjugação de toxinas aos antagonistas tais como maitansina e maitansinóides, caliqueamicina e outros Outro tipo de modificação covalente do polipeptídeo compreende a ligação do polipeptídeo a um dentre uma série de polímeros não proteináceos, tais como polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol ou polioxialquilenos, da forma descrita nas Patentes Norte-Americanas US 4.640.835, US 4.496.689, US 4.301.144, US 4.670.417, US 4.791.192 e US 4.179.337.

O polipeptídeo de acordo com a presente invenção pode também ser modificado de maneira a formar uma molécula quimérica que compreende o polipeptídeo fundido a uma outra seqüência de aminoácidos ou polipeptídeo heteróloga (tais como imunoadesinas ou corpos de peptídeos).

Em uma realização, essa molécula quimérica compreende uma fusão do polipeptídeo com um domínio de transdução de proteína que dirige o polipeptídeo para fornecimento a vários tecidos e, mais particularmente,através da barreira de sangue do cérebro, utilizando, por exemplo, o domínio de transdução de proteína de proteína TAT do vírus da imunodeficiência humana (Schwarze etal, 1999, Science 285: 1569-72).

Em uma outra realização, essa molécula quimérica compreende uma fusão do polipeptídeo com um polipeptídeo de marcador que fornece um epítopo ao qual pode ligar-se seletivamente um anticorpo anti-marcador. O marcador de epítopo geralmente é colocado no terminal amino ou carboxila do polipeptídeo. A presença dessas formas marcadas com epítopo do polipeptídeo pode ser detectada utilizando um anticorpo contra o polipeptídeo de marcador. Além disso, o fornecimento do marcador de epítopo permite que o polipeptídeo seja facilmente purificado por meio de purificação de afinidade utilizando um anticorpo artti- marcador ou outro tipo de matriz de afinidade que se ligue ao marcador de epítopo. Diversos polipeptídeos de marcador e seus anticorpos correspondentes são conhecidos na técnica. Exemplos incluem marcadores póli-histidina (póli-his) ou póli-histidina-glicina (póli-His-gly); o polipeptídeo de marcador flu HA e seu anticorpo 12CA5 (Field et al, Moi Cell. Biol., 8: 2159-2165 (1988)); o marcador c-myc e seus anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4„B7 e 9E10 (Evan et al, Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)) e o marcador glicoproteína D (gD) do vírus simplex da herpes e seu anticorpo (Paborsky et al, Protein Engineering, 3(6): 547-553 (1990)). Outros peptídeos de marcador incluem o peptídeo de marcador (Hopp et al, Bio Technology, 6: 1204-1210 (1988)); o peptídeo de epítopo KT3 (Martin etal, Science, 255: 192-194 (1992)); um peptídeo de epítopo de α-tubulina (Skinner et al, J. BioL Chem., 266: 15163-15166 (1991)); e o marcador de peptídeo de proteína 10 de 25 gene T7 (Lutz-Freyermuth et al, Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A., 87: 6393-6397 (1990)).

Em uma realização alternativa, a molécula quimérica pode compreender uma fusão do polipeptídeo com uma imunoglobulina ou umaregião específica de uma imunoglobulina. Para uma forma bivalente da molécula quimérica (tal como uma "imunoadesina"), essa fusão poderá ser para a região Fc de uma molécula IgG. Fusões de Ig de acordo com a presente invenção incluem polipeptídeos que compreendem aproximadamente ou apenas os resíduos 94 a 243, resíduos 33 a 53 ou os resíduos 33 a 52 de seres humanos no lugar de pelo menos uma região variável em uma molécula de lg. Em uma realização particularmente preferida, a fusão de imunoglobulina inclui as regiões de articulação, CH2 e CH3 ou de articulação, CH1, CH2 e CH3 de uma molécula IgGI. Para a produção de fusões de imunoglobulina, vide também a Patente Norte-Americana n° 5.428.130, emitida em 27 de junho de 1995.

A presente invenção fornece métodos e composições para inibição ou prevenção de reincidência do crescimento de tumores ou reincidência do crescimento de células cancerosas. Em várias realizações, câncer é reincidência do crescimento de tumor ou reincidência do crescimento 15 de células cancerosas em que a quantidade de células cancerosas não foi significativamente reduzida ou aumentou, ou o tamanho do tumor não foi significativamente reduzido, aumentou, ou não apresenta nenhuma redução adicional de tamanho ou de quantidade de células cancerosas. A determinação de se as células cancerosas são reincidência do crescimento de tumor ou reincidência do crescimento de células cancerosas pode ser realizada in vivo ou in vitro por meio de qualquer método conhecido na técnica para determinar a eficácia do tratamento de células cancerosas. Tumor resistente a tratamento anti-VEGF é exemplo de reincidência do crescimento de tumor.

Uma "quantidade eficaz" de um polipeptídeo, anticorpo, antagonista ou composição, da forma descrita no presente, é quantidade suficiente para conduzir um propósito especificamente indicado. Uma "quantidade eficaz" pode ser determinada empiricamente e por meio de métodos conhecidos com relação ao propósito indicado.A expressão "quantidade terapeuticamente eficaz" designa a quantidade de um anticorpo, polipeptídeo ou antagonista de acordo com a presente invenção eficaz para "tratar" uma doença ou disfunção em um mamífero (também denominado paciente). No caso de câncer, a quantidade terapeuticamente eficaz da droga pode reduzir o número de células cancerosas, reduzir o tamanho do tumor, inibir (ou seja, reduzir a velocidade até certo ponto e, preferencialmente, suspender) a infiltração de células cancerosas em órgãos periféricos; inibir (ou seja, reduzir até certo ponto e, preferencialmente, suspender) a metástase tumorosa; inibir, até certo ponto, o crescimento de tumores; e/ou melhorar, até certo ponto, um ou mais dos sintomas associados ao câncer. Desde que possa evitar o crescimento de células cancerosas existentes e/ou matá-las, a droga pode ser citostática e/ou citotóxica. Em uma realização, a quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade inibidora do crescimento. Em outra realização, a quantidade t5 terapeuticamente eficaz é uma quantidade que estende a sobrevivência de um paciente. Em outra realização, a quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade que aumenta a sobrevivência livre de progresso de um paciente.

No caso de cura de feridas, a expressão "quantidade eficaz" ou "quantidade terapeuticamente eficaz" designa uma quantidade de uma droga eficaz para acelerar ou melhorar a cura de feridas em um paciente. Uma dose terapêutica é uma dose que exibe um efeito terapêutico sobre o paciente e uma dose subterapêutica é uma dose que não exibe efeito terapêutico sobre o paciente tratado.

Uma "ferida crônica" designa uma ferida que não cura. Vide, por exemplo, Lazarus et al, Definitions and Guidelines for Assessment of Wounds and Evaluation of Healing, Arch. Dermatol. 130: 489-93 (1994). Feridas crônicas incluem, mas sem limitar-se, por exemplo, a úlceras arteriais, úlceras diabéticas, úlceras de pressão, úlceras venosas etc. Uma ferida aguda podedesenvolver-se em uma ferida crônica. Feridas agudas incluem, mas sem limitar-se a feridas causadas, por exemplo, por lesões térmicas, trauma, cirurgia, extirpação de câncer de pele extenso, infecções fúngicas e bacterianas profundas, vasculite, escleroderma, pênfigo, necrólise epidérmica 5 tóxica etc. Vide, por exemplo, Buford, Wound Healing and Pressure sores; HealingWell.com, publicado em: 24 de outubro de 2001. Uma "ferida normal" indica uma ferida que sofre reparo de cura de ferida normal.

"Quantidade inibidora do crescimento" de um polipeptídeo, anticorpo, antagonista ou composição de acordo com a presente invenção é uma quantidade capaz de inibir o crescimento de células, especialmente tumorosas, tais como células de câncer, in vitro ou in vivo. Uma "quantidade inibidora do crescimento" de um polipeptídeo, anticorpo, antagonista ou composição de acordo com a presente invenção para fins de inibição do crescimento de células neoplásticas pode ser determinada empiricamente e por meio de métodos conhecidos ou de exemplos fornecidos no presente.

"Quantidade citotóxica" de um polipeptídeo, anticorpo, antagonista ou composição de acordo com a presente invenção é uma quantidade capaz de causar a destruição de células, especialmente tumorosas, tais como células de câncer, in vitro ou in vivo. Uma "quantidade citotóxica" de um polipeptídeo, anticorpo, antagonista ou composição de acordo com a presente invenção para fins de inibição do crescimento de células neoplásticas pode ser determinada empiricamente e por meio de métodos conhecidos na técnica.

"Doença autoimune" no presente designa uma doença ou disfunção que surge dos próprios tecidos ou órgãos do indivíduo e é dirigida contra eles, sua manifestação, co-segregado ou condição resultante. Exemplos de doenças ou disfunções autoimunes incluem, mas sem limitar-se a artrite (artrite reumatóide, tal como atrite aguda, artritre reumatóide crônica, artrite da gota, artrite da gota aguda, artrite inflamatória crônica, artrite degenerativa,artrite infecciosa, artrite de Lyme, artrite proliferativa, artrite psoriática, artrite vertebral e artrite reumatóide de início juvenil, osteoartrite, artrite crônica progressiva, artrite deformans, poliartrite crônica primária, artrite reativa e espondilite anquilosante), doenças da pele hiperproliferativas inflamatórias, psoríase tal como psoríase de placas, psoríase gutatte, psoríase pustular e psoríase das unhas, dermatite incluindo dermatite de contato, dermatite de contato crônica, dermatite alérgica, dermatite de contato alérgica, dermatite herpetiforme e dermatite atópica, síndrome de hiper IgM ligada por x, urticária tal como urticária idiopática crônica, incluindo urticária autoimune crônica, polimiosite/dermatomiosite, dermatomiosite juvenil, necrólise epidérmica tóxica, escleroderma (incluindo escleroderma sistêmico), esclerose tal como esclerose sistêmica, esclerose múltipla (MS) tal como MS espinhoótica, MS progressiva primária (PPMS) e MS reincidente, esclerose sistêmica progressiva, aterosclerose, arteriosclerose, esclerose disseminada e esclerose atáxica, f5 doença intestinal inflamatória (IBD) (por exemplo, mal de Crohn, colite tal como colite ulcerativa, colite ulcerosa, colite microscópica, colite colagenosa, colite poliposa, enterocolite necrotizante e colite transmural, bem como doença intestinal inflamatória autoimune), pioderma gangrenoso, eritema nodoso, colangite esclerosante primária, episclerite, síndrome de mal-estar respiratório, 20 incluindo síndrome de mal-estar respiratório em adultos ou aguda (ARDS), meningite, inflamações totais ou parciais da úvea, irite, coroidite, uma disfunção hematoiógica autoimune, espondilite reumatóide, perda súbita da audição, doenças mediadas por IgE tais como anafilaxia e rinite alérgica e atópica, encefalite tal como encefalite de Rasmussen e encefalite dos membros e/ou do 25 tronco cerebral, uveíte tal como uveíte anterior, uveíte anterior aguda, uveíte granulomatosa, uveíte não granulomatosa, uveíte facoantigênica, uveíte posterior ou uveíte autoimune, glomerulonefrite (GN) com e sem síndrome nefrótica tal como glomerulonefrite aguda ou crônica como GN primária, GNmediada imune, GN membranosa (nefropatia membranosa), GN membranosa idiopática, GN proliferativa membranosa (MPGN), incluindo Tipo I e Tipo II, bem como GN de rápida progressão, condições alérgicas, reações alérgicas, eczema incluindo eczema alérgico ou atópico, asma, tal como asma dos 5 brônquios, asma brônquica e asma autoimune, condições que envolvem a infiltração de células T e reações inflamatórias crônicas, doença inflamatória pulmonar crônica, miocardite autoimune, deficiência da adesão de leucócitos, eritematose do lúpus sistêmico (SLE) ou eritematodes do lúpus sistêmico tais como SLE cutânea, SLE cutânea subaguda, síndrome do lúpus neonatal (NLE)1 eritematose do lúpus disseminada, lúpus (incluindo nefrite, cerebrite, pediátrico, não renal, discóide, alopecia), diabetes mellitus de início juvenil (Tipo I), incluindo diabetes mellitus dependente de insulina (IDDM) pediátrica, diabetes mellitus de início em adultos (diabete Tipo II), diabete autoimune, diabetes insipidus idiopática, reações imunes associadas à hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citoquinas e linfócitos T, tuberculose, sarcoidose, granulomatose incluindo granulomatose linfomatóide, granulomatose de Wegener, agranulocitose, vasculitide incluindo vasculite (incluindo vasculite de vasos grandes (incluindo polimialgia reumática e artrite de células gigantes (de Takayasu)), vasculite de vasos médios (incluindo mal de Kawasaki e poliartrite nodosa), poliartrite microscópica, imunovasculite, vasculite do SNC1 vasculite por hipersensibilidade, cutânea ou de hipersensibilidade, vasculite necrotizante sistêmica e vasculite associada a ANCA, tal como síndrome ou vasculite de Churg-Strauss (CSS), artrite temporal, anemia aplástica, anemia aplástica autoimune, anemia positiva de Coombs, anemia Diamond Blackfan, anemia hemolítica ou anemia hemolítica imune incluindo anemia hemolítica autoimune (AIHA), anemia perniciosa, mal de Addison, aplasia ou anemia de glóbulos vermelhos pura (PRCA), deficiência de Fator VIII, hemofilia A, neutropenia autoimune, pancitopenia, leucopenia,doenças que envolvam a diapedese de leucócitos, disfunções inflamatórias do SNC, síndrome de lesões a múltiplos órgãos tais como as que se seguem a septicemia, trauma ou hemorragia, doenças mediadas por complexo de antígeno e anticorpo, doença da membrana base anti-glomerular, síndrome de anticorpos anti-fosfolipídios, neurite alérgica, mal de Bechet o u de Behcet, síndrome de Castleman1 síndrome de Goodpasture, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjogren, síndrome de Stevens-Johnson, penfigóide tal como penfigóide bolhosa e penfigóide da pele, pênfigo (incluindo pênfigo vulgar, pênfigo foliáceo, penfigóide do muco-membrana do pênfigo e pênfigo eritematoso), poliendocrinopatias autoimunes, síndrome ou mal de Reiter, nefrite do complexo imune, nefrite mediada por anticorpos, neuropatia crônica tal como polineuropatias IgM ou neuropatia mediada por IgM1 trombocitopenia (conforme desenvolvido por pacientes com enfarte do miocárdio, por exemplo), incluindo púrpura trombocitopênica trombótica (TTP) e trombocitopenia autoimune ou mediada por imunicidade tal como púrpura trombocitopênica idiopática (ITP) incluindo ITP crônica ou aguda, doença autoimune dos testículos e ovário incluindo orquite autoimune e ooforite, hipotireoidismo primário, hipoparatireoidismo, doenças endócrinas autoimunes incluindo tireoidite tal como tireoidite autoimune, mal de Hashimoto, tireoidite crônica (tireoidite de Hashimoto) ou tireoidite subaguda, mal da tireóide autoimune, hipotireoidismo idiopático, mal de Grave, síndromes poliglandulares tais como síndromes poliglandulares autoimunes (ou síndromes de endocrinopatia poliglandular), síndromes paraneoplásticas, incluindo síndromes paraneoplásticas neurológicas tais como síndrome miastênica de Lambert-Eaton ou síndrome de Eaton-Lambert, síndrome de rigidez humana ou de rigidez pessoal, encefalomielite tal como encefalomielite alérgica ou alergia de encefalomielite e encefalomielite alérgica experimental (EAE)1 miastenia grave, degeneração do cerebelo, neuromiotonia, opsoclonus ou síndrome deopsoclonus mioclonus (OMS) e neuropatia sensorial, síndrome de Sheehan, hepatite autoimune, hepatite crônica, hepatite Iupoide1 hepatite de células gigantes, hepatite ativa crônica ou hepatite ativa crônica autoimune, pneumonite intersticial linfóide (LIP)1 bronquiolite obliterans (não de transplante) contra NSIP, síndrome de Guillain-Barré, mal de Berger (nefropatia de IgA), nefropatia de IgA idiopática, dermatose de IgA linear, cirrose biliar primária, pneumonocirrose, síndrome de enteropatia autoimune, doença celíaca, psilose celíaca (enteropatia do glúten), psilose refratária, psilose idiopática, crioglobulinemia, esclerose lateral amilotrófica (ALS; mal de Lou Gehrig), doença das artérias coronarianas, doença interna das orelhas autoimune (AIED), perda de audição autoimune, síndrome de opsoclonus myoclonus (OMS), policondrite tal como policondrite refratária ou retardada, proteinose alveolar pulmonar, amiloidose, esclerite, linfocitose não cancerosa, Iinfocitose primária, que inclui infocitose de células B monoclonais (tal como gamopatia monoclonal benigna e gamopatia monoclonal de significado indeterminado, MGUS), neuropatia periférica, síndrome paraneoplástica, canalopatias tais como epilepsia, enxaqueca, arritmia, disfunções musculares, surdez, cegueira, paralisia periódica e canalopatias do SNC, autismo, miopatia inflamatória, glomeruloesclerose segmentai focai (FSGS), oftalmopatia endócrina, uveorretinite, coriorretinite, disfunção hepatológica autoimune, fibromialgia, falha endócrina múltipla, síndrome de Schmidt, adrenalite, atrofia gástrica, demência pré-senil, doenças demielinantes tais como doenças demielinantes auioimunes, nefropatia diabética, síndrome de Dressler, alopecia areata, síndrome de CREST (calcinose, fenômeno de Raynaud1 dismobilidade do esôfago, esclerodactilia e telangiectasia), infertilidade autoimunológica masculina e feminina, doença de tecidos conectivos misturados, doença de Chagas, febre reumática, aborto recorrente, pulmão de fazendeiro, eritema multiforme, síndrome pós-cardiotomia, síndrome de Cushing, pulmão de criadorde pássaros, angite granulomatosa alérgica, angite linfocítica benigna, síndrome de Alport1 alveolite tal como alveolite alérgica e alveolite fibrosante, doença pulmonar intersticial, reação de transfusão, hanseníase, malária, leishmaníase, cipanossomíase, esquistossomíase, ascaríase, aspergilose, síndrome de Sampter, síndrome de Caplan, dengue, endocardite, fibrose do endomiocárdio, fibrose pulmonar intersticial difusa, fibrose pulmonar intersticial, fibrose pulmonar idiopática, fibrose cística, endoftalmite, eritema elevatum e diutinum, eritroblastose fetal, facite eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, flaríase, ciclite tal como ciclite crônica, ciclite heterocrônica, iridociclite ou ciclite de Fuch, púrpura de Henoch-Schonlein, infecção por vírus da imunodeficiência humana (HIV), infecção por ecovírus, cardiomiopatia, mal de Alzheimer, infecção por parvovírus, infecção por vírus da rubéola, síndromes pós-vacinação, infecção por rubéola congênita, infecção por vírus Epstein-Barr, caxumba, síndrome de Evan, falha gonadal autoimune, coréia de Sydenham, nefrite pós-estreptococo, tromboangite ubiterans, tirotoxicose, tabes dorsalis, coriodite, polimialgia de células gigantes, oftalmopatia endócrina, pneumonite por hipersensibilidade crônica, ceratoconjuntivite seca, ceratoconjuntivite epidêmica, síndrome nefrítica idiopática, nefropatia por mudanças mínimas, lesões por reperfusão de isquemia e familiar benigna, autoimunidade da retina, inflamação das juntas, bronquite, doença das vias aéreas obstruídas crônica, silicose, aftas, estomatite aftosa, disfunções arterioscleróticas, aspermiogênese, hemólise autoimune, mal de Boeck, criogíobülinernia, contratura de Dupuytren, endoftalmia facoanafilática, enterite alérgica, eritema nodosum leprosum, paralisia facial idiopática, síndrome de fadiga crônica, febre reumática, mal de Hamman-Rich, perda de audição sensoneural, hemoglubinúria paroxismática, hipogonadismo, ileíte regional, leucopenia, mononucleose infecciosa, mielite transversal, mixedema idiopático primário, nefrose, oftalmia simpática, orquite granulomatose, pancreatite,poliradiculite aguda, pioderma gangrenoso, tireoidite de Quervain, atrofia espênica adquirida, infertilidade devido a anticorpos antiespermatozóides, timoma não maligno, vitiligo, doenças associadas a vírus Epstein-Barr e SCID1 síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), doenças parasíticas tais como leishmania, síndrome de choque tóxico, envenenamento com alimentos, condições que envolvem a infiltração de células T, deficiência na adesão de leucócitos, reações imunes associadas à hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citoquinas e linfócitos T, doenças que envolvem diapedese de leucócitos, síndrome por lesões de múltiplos órgãos, doenças mediadas por complexo antígeno-anticorpo, doença da membrana base antiglomerular, neurite alérgica, poliendocrinopatias autoimunes, ooforite, mixedema primário, gastrite atrófica autoimune, oftalmia simpática, doenças reumáticas, doença do tecido conjuntivo misto, síndrome nefrótica, insulite, falhas poliendócrinas, neuropatia periférica, síndrome poliglandular autoimune do tipo I, hipoparatireoidismo idiopático com início em adultos (AOIH), alopecia total, cardiomiopatia dilatada, epidermiólise bolhosa adquirida (EBA), homocromatose, miocardite, síndrome nefrótica, colangite esclerosante primária, sinusite purulenta ou não purulenta, sinusite aguda ou crônica, sinusite etmóide, frontal, maxilar ou esfenóide, disfunção relativa a eosinófilos tal como eosinofilia, eosinofilia por infiltração pulmonar, síndrome de eosinofilia-mialgia, síndrome de Loffler, pneumonia eosinofílica crônica, eosinofilia pulmonar tropical, aspergilose broncopneumônica, aspergiloma ou granulomas que contêm eosinófiios, anafilaxia, espondiloartritides soronegativas, doença autoimune poliendócrina, colangite esclerosante, esclerose, episclerose, candidíase mucocutânea crônica, síndrome de Bruton, hipogamaglobulinemia infantil transitória, síndrome de Wiskott-Ald rich, ataxia telangiectasia, angiectase, disfunções autoimunes associadas a doença de colágeno, reumatismo, doença neurológica, disfunção por reperfusão isquêmica, reduçãoda reação da pressão sangüínea, disfunção vascular, angiectasia, lesões dos tecidos, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia cerebral e doença que acompanha vascularização, disfunções por hipersensibilidade alérgica, glomerulonefritides, lesões por reperfusão, lesões por reperfusão de tecidos do miocárdio ou outros, dermatoses com componentes infiamatórios agudos, meningite purulenta aguda ou outras disfunções inflamatórias do sistema nervoso central, síndromes associadas a transfusão de granulócitos, toxicidade induzida por citoquinas, inflamação séria aguda, inflamação intratável crônica, pielite, pneumonocirrose, retinopatia diabética, disfunção de artérias grandes diabética, hiperplasia endoarterial, úlcera péptica, vasculite e endometriose.

Os tratamentos de câncer podem ser avaliados, por exemplo, mas sem limitar-se a regressão de tumores, peso do tumor ou contração detamanho, tempo para o progresso, duração de sobrevivência, sobrevivência livre de progresso, velocidade de reação geral, duração da reação, qualidade de vida, expressão de proteína e/ou atividade. Como os agentes antiangiogênicos descritos no presente dirigem-se à vasculatura do tumor e, não necessariamente, às próprias células neoplásticas, eles representam uma classe exclusiva de drogas anticancerígenas e, portanto, podem necessitar de medidas exclusivas e definições de reações clínicas a drogas. Contração de tumor de mais de 50% em uma análise bidimensional, por exemplo, é a linha de corte padrão para declarar uma reação. Os antagonistas de alfa5beta1 e antagonistas de VEGF de acordo com a presente invenção, entretanto, podem causar inibição de difusão rnetastática sem a contração do tumor primário, ou podem simplesmente exercer um efeito tumoristático. Conseqüentemente, podem ser empregadas abordagens de determinação da eficácia da terapia, que incluem, por exemplo, medição de plasma ou marcadores urinários de angiogênese e medição de reação por meio de formação de imagens radiológicas.Dependendo da indicação a ser tratada e dos fatores relevantes à dosagem com que os médicos com conhecimento no campo estariam familiares, os anticorpos de acordo com a presente invenção serão administrados em uma dosagem que seja eficaz para o tratamento daquela indicação, ao mesmo tempo que minimizam a toxicidade e os efeitos colaterais. Para o tratamento de câncer, doença autoimune ou doença de imunodeficiência, a dosagem terapeuticamente eficaz pode estar, por exemplo, na faixa de 50 mg/dose a 2,5 g/m2. Em uma realização, a dosagem administrada é de cerca de 250 mg/m2 a cerca de 400 mg/m2 ou 500 mg/m2. Em uma outra realização, a dosagem é de cerca de 250 a 375 mg/m2. Em ainda outra realização, a faixa de dosagem é de 275 a 375 mg/m2.

Os tratamentos para degeneração macular relativa à idade (AMD) podem ser avaliados, mas sem limitar-se à redução da velocidade ou à prevenção de perda de visão adicional. Para terapia de AMD, a eficácia in vivo pode ser medida, por exemplo, por meio de um ou mais dos seguintes: determinação da alteração média da melhor acuidade visual corrigida (BCVA) com relação à linha base até um tempo desejado, determinação da proporção de pacientes que perdem menos de quinze letras de acuidade visual em um tempo desejado em comparação com a linha base, determinação da proporção de pacientes que ganham acuidade visual maior ou igual a quinze letras em um tempo desejado em comparação com a linha base, determinação da proporção de pacientes com equivalente Snellen de acuidade visual de 20/2000 ou pior em um tempo desejado, determinação do Questionário de Funcionamento Visual NEI, determinação do tamanho de CNV e quantidade de vazamento de CNV em um tempo desejado, conforme determinado por meio de angiografia de fluoresceína etc.

O termo "detecção" destina-se a incluir a determinação da presença ou ausência de uma substância ou a quantificação da quantidade deuma substância. O termo refere-se, portanto, ao uso dos materiais, composições e métodos de acordo com a presente invenção para determinações qualitativas e quantitativas. De forma geral, o método específico utilizado para detecção não é crítico para a prática da presente invenção.

"Detecção", por exemplo, pode incluir, de acordo com a presenteinvenção: Observação da presença ou ausência de produto genético alfaõ, moléculas de mRNA ou um polipeptídeo alfa5; alteração dos níveis de um polipeptídeo alfaõ ou quantidade ligada a um alvo; alteração da função/atividade biológica de um polipeptídeo alfaõ. Em algumas realizações, "detecção" pode incluir a detecção dos níveis de alfaõ do tipo selvagem (tais como níveis de mRNA ou de polipeptídeos). A detecção pode incluir a quantificação de uma alteração (aumento ou redução) de qualquer valor de 10% a 90% ou de qualquer valor de 30% a 60% ou mais de 100%, em comparação com um controle. A detecção pode incluir a quantificação de uma alteração de qualquer valor de duas vezes a dez vezes, inclusive, ou mais, tal como cem vezes.

A palavra "marcador", da forma utilizada no presente, designa um composto ou composição detectável que é conjugado direta ou indiretamente ao anticorpo. O marcador pode ser detectável por si próprio (tais como 20 marcadores de radioisótopos ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de marcador enzimático, pode catalisar a alteração química de um composto ou composição de substrato que seja detectável.

Novos Anticorpos Αnticorpos Anti-Apha 5 Beta 1

São fornecidos no presente novos anticorpos que podem ligar alfaõbetal e inibir competitivamente a ligação de um anticorpo anti-alfaõbetal a alfaõbetal humano. Segundo uma realização, o anticorpo anti-alfaõbetal é produzido por um hibridoma selecionado a partir do grupo que consiste do hibridoma depositado como alfaõ/betal 7HÕ.4.2.8 (ATCC N0 PTA-7421) e ohibridoma depositado como Alfa5/beta1 7H 12.5.1.4 (ATCC N0 PTA-7420 no ATCC em sete de março de 2006. Segundo outra realização, o anticorpo é produzido por um hibridoma selecionado a partir do grupo que consiste do hibridoma depositado como alfa5/beta1 7H5.4.2.8 (ATCC N0 PTA-7421) ou o hibridoma depositado como Alfa5/beta1 7H12.5.1.4 (ATCC N0 PTA-7420 no ATCC em sete de março de 2006. Segundo ainda outra realização, o anticorpo compreende a seqüência de domínio pesado variável (VH) e leve variável (VL) do anticorpo produzido pelo hibridoma depositado como alfa5/beta1 7H5.4.2.8 (ATCC N0 PTA-7421) no ATCC em sete de março de 2006. Em uma outra realização, o anticorpo compreende a seqüência de domínio pesado variável (VH) e leve variável (VL) do anticorpo produzido pelo hibridoma depositado como alfa5/beta1 7H12.5.1.4 (ATCC N0 PTA-7420) no ATCC em sete de março de 2006. São também contempladas formas humanas ou quiméricas dos anticorpos dos hibridomas depositados.

Segundo uma realização, o anticorpo liga um alfaõbetal humanocom Kd de 500 nM a 1 pM. Segundo uma outra realização, o anticorpo não liga alfaVbeta3, alfaVbeta5 ou alfaVbetal. Segundo uma outra realização, o anticorpo compreende uma seqüência Fc de um IgG humano, tal como IgGI humano ou lgG4 humano. Em uma outra realização, uma seqüência Fc foi alterada ou modificada de outra forma, de maneira que não possui função efetora de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), freqüentemente relacionada à sua ligação a receptores de Fc (FcRs). Existem muitos exemplos de alterações ou mutações de seqüências Fc que podem alterar a função efetora. WO 00/42072 (Presta) e Shields et al, J. Bioi Chem. 9 (2): 6591-6604 (2001), por exemplo, descrevem variantes de anticorpos com maior ou menor ligação a FcRs. O teor dessas publicações é incorporado especificamente ao presente como referência. O anticorpo pode apresentar-se na forma de um fragmento Fab, Fab', F(ab)2, Fv de fita simples (scFv) ou Fv;um diacorpo e um anticorpo linear. Além disso, o anticorpo pode ser um anticorpo multiespecífico que se liga a alfaõbetal e é um antagonista de alfaõbetal, mas também liga um ou mais alvos diferentes e inibe a sua função (tal como VEGF). O anticorpo pode ser conjugado a um agente terapêutico (tal como um agente citotóxico, um radioisótopo e um agente quimioterápico) ou um marcador para detectar alfaõbetal em amostras de pacientes ou in vivo por meio de formação de imagens (tal como radioisótopo, corante fluorescente e enzima).

Moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos anti-alfaõbetal, vetores de expressão que compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam um ou ambos os domínios variáveis e células que compreendem as moléculas de ácido nucleico também são contempladas. Estes anticorpos podem ser utilizados nas terapias descritas no presente e para detectar proteína alfaõbetal em amostras de pacientes (tais como FACS1 imunohistoquímica (IHC)1 testes ELISA) ou em pacientes.

Combinações Inovadoras Novas combinações para inibir a angiogênese e/ou permeabilidade vascular em um paciente que sofre de uma doença, combinações estas que compreendem um antagonista de VEGF e um antagonista de alfaõbetal. O antagonista de VEGF e o antagonista de alfaõbetal podem ser administrados em ciclos de tratamento simultâneos ou seqüenciais. Esses tratamentos combinatórios são úteis para o tratamento de doenças, incluindo as doenças que possuem angiogênese anormal e/ou permeabilidade vascular e se beneficiariam de uma terapia antiangiogênese. Essas doenças incluem, mas sem limitar-se a câncer, doença ocular e doença autoimune. Alternativamente, o paciente pode ser tratado com o antagonista de VEGF e receber em seguida administração do antagonista de alfaõbetal, tal como tratamento com o antagonista de VEGF até que o paciente não maisreaja a tratamento com antagonista VEGF e, em seguida, o paciente é tratado com um antagonista de alfaõbetal. Segundo uma realização, o paciente é tratado com o antagonista de VEGF quando o câncer é não invasivo e é tratado com o antagonista de alfa5beta1 quando o câncer é invasivo. Alguns pacientes que experimentam níveis elevados de alfaõbetal naturalmente ou em resposta a terapia com antagonista de VEGF1 em comparação com pacientes não doentes ou controle, podem reagir especialmente a esse tratamento de combinação. São contempladas combinações que compreendem adicionalmente um agente terapêutico (tal como um agente antineoplásico, um agente quimioterápico, um agente inibidor do crescimento e um agente citotóxico). Pacient es que estão por serem tratados com quimioterapia (tal como irinotecan) e antagonistas de alfaõbetal, ou que tenham sido tratados com quimioterapia e antagonistas de alfaõbetal, por exemplo, podem beneficiar-se da terapia com antagonista de VEGF. Alternativamente, pacientes que tenham sido tratados com quimioterapia e antagonistas de VEGF podem beneficiar-se da terapia com antagonista de alfaõbetal. Em uma realização preferida, o anticorpo anti-VEGF é o anticorpo Avastin®. Em outra realização preferida, o anticorpo anti-alfaõbetal é um anticorpo anti-alfaõbetal descrito no presente. São contemplados kits que compreendem um antagonista de VEGF, um antagonista de alfaõbetal e, opcionalmente, um agente quimioterápico.

Formulações Farmacêuticas Formulações terapêuticas dos anticorpos utilizados de acordo com a presente invenção são preparadas para armazenagem por meio da mistura de um anticorpo que apresente o grau desejado de pureza com veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações Iiofilizadas ou soluções aquosas. Veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são atóxicos para pacientes nas dosagens econcentrações empregadas e incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol; álcool butílico ou benzílico; alquil parabéns, tais como metil ou propil paraben; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol e m-cresol); polipeptídeos com baixo peso molecular (menos de cerca de dez resíduos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como olivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, que incluem glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trehalose ou sorbitol; contraíons formadores de sais, tais como sódio; complexos metálicos (tais como complexos de Zn e proteína); e/ou tensoativos não iônicos, tais como TWEEN®, PLURONICS® ou polietileno glicol (PEG). Exemplos de formulações de anticorpos são descritos em WO 98/56418, expressamente incorporada ao presente como referência. Formulações Iiofilizadas adaptadas para administração subcutânea são descritas em WO 97/04801. Essas formulações Iiofilizadas podem ser reconstituídas com um diluente apropriado até alta concentração de proteína e a formulação reconstituída pode ser administrada por via subcutânea ao mamífero a ser tratado no presente.

A formulação do presente pode também conter mais de um composto ativo conforme o necessário para a indicação específica sendo tratada, preferencialmente aqueles com atividades complementares que não se prejudiquem entre si. Pode ser desejável, por exemplo, fornecer adicionalmente um agente citotóxico, agente quimioterápico, citoquina ou agente imunossupressivo (tal como um que aja sobre células T, como ciclosporina ou um anticorpo que ligue células T, tal como que ligue LFA-1). A quantidadeeficaz desses outros agentes depende da quantidade de anticorpo presente na formulação, do tipo de doença ou disfunção ou tratamento e de outros fatores discutidos acima. Estes são geralmente utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administração conforme descrito no presente ou cerca de 1 a 99% das dosagens empregadas até aqui.

Os ingredientes ativos podem também ser capturados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por métodos de aglutinação ou por polimerização interfacial, tais como microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (tais como lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Estas técnicas são descritas em Remingtoris Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).

Podem ser fabricadas preparações de liberação prolongada. Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o antagonista, matrizes estas que se encontram na forma de artigos moldados, tais como filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes com liberação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (tais como póli(2-hidroxietilmetacrilato) ou álcool (poli)vinílico, polilactidas (Patente Norte-Americana n° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e L-glutamato de γ etila, etiieno-vinil acetato não degradável, copolímeros de ácido láctico e ácido giicóiico degraaáveis tais como LUPRON DEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico e ácido giicóiico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

As formulações a serem utilizadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isso é facilmente obtido por meio de filtragem através de membranas de filtragem estéreis.Artigos Industrializados ε Kits

Outra realização da presente invenção é um artigo industrializado que contém materiais úteis para o tratamento de tumores, doenças oculares ou doenças autoimunes e condições relacionadas. O artigo industrializado pode compreender um recipiente e um rótulo ou bula sobre o recipiente ou a ele associado. Os recipientes apropriados incluem, por exemplo, garrafas, ampolas, seringas etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma série de materiais tais como vidro ou plástico. Geralmente, o recipiente contém uma composição que é eficaz para o tratamento da condição e pode ter uma porta de acesso estéril (o recipiente pode ser, por exemplo, um saco de solução intravenosa ou uma ampola que contém uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um antagonista de VEGF ou um antagonista de alfa5beta1 ou um agonista de VEGF ou um agonista de alfaõbetal de acordo com a presente invenção. O rótulo ou bula indica que a composição é utilizada para o tratamento da condição específica. O rótulo ou bula compreenderá adicionalmente instruções de administração da composição de anticorpo ao paciente. Também são contemplados artigos industrializados e kits que compreendem terapias combinatórias descritas no presente.

A bula indica instruções costumeiramente incluídas emembalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, contra-indicações e/ou advertências referentes ao uso desses produtos terapêuticos, Em uma realização, a bula indica que a composição é utilizada para o tratamento de linfoma não de Hodgkin.

Além disso, o artigo industrializado pode compreender adicionalmente um segundo recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção(BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, que incluem outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

Também são fornecidos kits que são úteis para vários propósitos,tais como para isolamento ou detecção de alfa5beta1 e/ou VEGF em pacientes, opcionalmente em combinação com os artigos industrializados. Para isolamento e purificação de alfa5beta1, o "kit" pode conter um anticorpo anti-alfaõbetal acoplado a esferas (por exemplo, esferas de sepharose). Podem ser fornecidos "kits" que contêm os anticorpos para detecção e quantificação de alfa5beta1 in vitro, por exemplo em ELISA ou Western Blot. Da mesma forma que com o artigo industrializado, o kit compreende um recipiente e um rótulo ou bula sobre o recipiente ou a ele associado. O recipiente contém, por exemplo, uma composição que compreende pelo menos um anticorpo anti-alfa5beta1 de acordo com a presente invenção. Podem ser incluídos recipientes adicionais que contenham, por exemplo, diluentes, tampões e anticorpos controle. O rótulo ou bula pode fornecer uma descrição da composição, bem como instruções para o uso in vitro ou em diagnóstico desejado.

Anticorpos Monoclonais

Os anticorpos monoclonais podem ser fabricados, por exemplo,utilizando métodos de hibridoma, tais como os descritos por Kohler e Milsteín, Nature 256: 495 (1975), ou podem ser fabricados por meio de métodos de DNA recombinante (Patente Norte-Arnericana n° 4.816.567) ou podem ser produzidos por meio dos métodos descritos no presente no capítulo de Exemplos. Em um método de hibridoma, um camundongo, hamster ou outro animal hospedeiro apropriado é tipicamente imunizado com agente imunizante para gerar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligam especificamente ao agente imunizante. Alternativamente, os linfócitospodem ser imunizados in vitro.

O agente imunizante incluirá tipicamente um polipeptídeo ou uma proteína de fusão da proteína de interesse ou uma composição que compreende a proteína. Geralmente, linfócitos sangüíneos periféricos ("PBLs") são utilizados caso se deseje células de origem humana, ou células do baço ou células dos nódulos linfáticos são utilizadas caso se deseje fontes de mamíferos não humanos. Os linfócitos são fundidos em seguida a uma linhagem celular imortalizada, utilizando um agente de fusão apropriado, tal como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma. Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (Nova Iorque: Academic Press, 1986), págs. 59-103. As linhagens celulares imortalizadas são normalmente células de mamíferos transformadas, particularmente células de mieloma de origem humana, bovina e de roedores. Normalmente, são empregadas linhagens celulares de mieloma de rato ou camundongo. As células de hibridoma podem ser cultivadas em um meio de cultura apropriado que contém preferencialmente uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células imortalizadas não fundidas. Caso as células parentais não contenham a enzima hipoxantino guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), por exemplo, o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina ("meio HAT"), substâncias que evitam o crescimento de células com deficiência de HGPRT.

Linhagens celulares imortalizadas preferidas são aquelas que se fundem eficientemente, apoiam a expressão estável em alto nível de anticorpos pelas células produtoras de anticorpos selecionadas e são sensíveis a um meio tal como meio HAT. As linhagens celulares imortalizadas de maior preferência são linhagens de mieloma murino, que podem ser obtidas, por exemplo, através do Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia e da Coleção Norte-Americana de Cultivos de Tipos, Manassas, Virgínia. Linhagenscelulares de mieloma humano e heteromieloma humano/de camundongos também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos. Kozbor1 J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (Mareei Dekker Inc., Nova Iorque, 1987), págs. 51-63.

O meio de cultura em que são cultivadas células de hibridoma pode ser testado em seguida para determinar a presença de anticorpos monoclonais dirigidos ao polipeptídeo. A especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma pode ser determinada por meio de imunoprecipitação ou de um teste de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado por enzimas (ELISA). Estes métodos e testes são conhecidos na técnica. A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode ser determinada, por exemplo, por meio da análise Scatchard de Munson e Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Após a identificação das células de hibridoma desejadas, os clones podem ser subclonados por meio da limitação de procedimentos de diluição e cultivados por meio de métodos padrão. Goding1 acima. Meios de cultura apropriados para este propósito incluem, por exemplo, meio Eagle's Modificado da Dulbeeco ou meio RPMI-1640. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo na forma de ascite em mamíferos.

Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones podem ser isolados ou purificados do meio de cultura ou fluido de ascite por meio de procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina, tais como proteína A Sepharose, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese de gel, diálise ou cromatografia de afinidade.

Os anticorpos monoclonais podem também ser fabricados por meio de métodos de DNA recombinante, tais como os descritos na PatenteNorte-Americana n0 4.816.567. 0 DNA codificador dos anticorpos monoclonais de acordo com a presente invenção pode ser facilmente isolado e seqüenciado utilizando procedimentos convencionais (empregando, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos que sejam capazes de ligar-se especificamente a genes codificadores das cadeias pesada e leve de anticorpos murinos). As células de hibridoma de acordo com a presente invenção servem de fonte preferida desse DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são transfectados em seguida para células hospedeiras, tais como células COS de símios, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou células de mieloma que, de outra forma, não produzem proteína de imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. O DNA pode também ser modificado, por exemplo, por meio de substituição da seqüência de codificação por domínios constantes de cadeia leve e pesada humana no lugar das seqüências murinas homólogas (Patente Norte-Americana n° 4.816.567; Morrison et aí, acima), ou por meio de ligação covalente da seqüência de codificação de imunoglobulina com a seqüência de codificação para um polipeptídeo não de imunoglobulina, no todo ou em parte. Esse polipeptídeo não de imunoglobulina pode ser substituído pelos domínios constantes de um anticorpo de acordo com a presente invenção, ou pode ser substituído pelos domínios variáveis de um sítio de combinação de antígenos de um anticorpo de acordo com a presente invenção para criar um anticorpo bivalente quimérico.

Os anticorpos podem ser anticorpos monovalentes. Métodos de preparação de anticorpos monovalentes são conhecidos na técnica. Um método envolve, por exemplo, a expressão recombinante de cadeia leve de imunoglobulina e cadeia pesada modificada. A cadeia pesada geralmente é truncada em qualquer ponto da região Fc, de forma a evitar a retícula da cadeia pesada. Alternativamente, os resíduos de cisteína relevantes são substituídoscom outro resíduo de aminoácido ou são excluídos, de forma a evitar a retícula.

Métodos in vivo também são apropriados para a preparação de anticorpos monovalentes. A digestão de anticorpos para produzir seus fragmentos, particularmente fragmentos de Fab1 pode ser realizada utilizando 5 métodos rotineiros conhecidos na técnica, mas sem limitações.

Anticorpos humanizados ε humanos Os anticorpos podem ser anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. Formas humanizadas de anticorpos não humanos (tais como murinos) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou seus fragmentos (tais como Fv1 Fab1 Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação de antígenos de anticorpos) que tipicamente contêm seqüência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Os anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor), nas quais os resíduos de uma CDR do paciente são substituídos por resíduos de CDR de uma espécie não t5 humana (anticorpo doador), tal como camundongo, rato ou coelho que possui a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da região de estrutura Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Os anticorpos humanizados podem também compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor nem nas seqüências de estrutura ou CDR importadas. Geralmente, o anticorpo humanizado pode compreender substancialmente todos dentre pelo menos um, tipicamente dois domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma seqüência de consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compreenderá preferencialmente pelo menos uma parte de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de imunoglobulina humana. Jones et a/, Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature, 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Stmct. Biol., 2: 593-596 (1992).

Alguns métodos de humanização de anticorpos não humanos são descritos na técnica e abaixo nos Exemplos. Geralmente, um anticorpo humanizado contém um ou mais resíduos de aminoácidos nele introduzidos a partir de uma fonte que não é humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são freqüentemente denominados resíduos "importados", que são tomados tipicamente a partir de um domínio variável "importado". Segundo uma realização, a humanização pode ser essencialmente realizada seguindo-se o método de Winter e colaboradores (Jones et al, Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al, Science, 239: 1534-1536 (1988)), por meio da substituição de seqüências de CDR ou CDRs de roedores pelas seqüências correspondentes de um anticorpo humano. Conseqüentemente, esses anticorpos "humanizados" são anticorpos (Patente Norte-Americana n° 4.816.567), em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto tenha sido substituído pela seqüência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos, em que alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.

Como alternativa para a humanização, podem ser geradosanticorpos humanos. É agora possível produzir, por exemplo, animais transgênicos (tais como camundongos) que são capazes, mediante imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência da produção de imunoglobulina endógena. Descreveu-se, por exemplo, que a exclusão homozigótica do gene da região de ligação de cadeia pesada de anticorpos (JH) em camundongos quiméricos e mutantes de linhagem germinativa resulta na inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência do conjunto de genes de imunoglobulina dalinhagem germinativa humano nesses camundongos com mutação da linhagem germinativa resultará na produção de anticorpos humanos mediante desafio com antígenos. Vide, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 90: 2551 (1993); Jakobovits et al, Nature, 362: 255-258 (1993);Bruggermann et al, Year in Immuno., 7: 33 (1993); Patentes Norte-Americanas n° 5.545.806, 5.569.825, 5.591.669 (todas da GenPharm); 5.545.807; e WO 97/17852. Alternativamente, anticorpos humanos podem ser fabricados por meio da introdução de sítios de imunoglobulina humana em animais transgênicos, tais como camundongos, nos quais os genes de imunoglobulina endógenos foram parcial ou completamente desativados. Mediante desafio, é observada a produção de anticorpos humanos, que relembra de perto a observada em seres humanos em todos os aspectos, incluindo a redisposição genética, montagem e repertório de anticorpos. Esta abordagem é descrita, por exemplo, nas Patentes Norte-Americanas US 5.545.807, US 5.545.806, US 15 5.569.825, US 5.625.126, US 5.633.425 e US 5.661.016 e nas publicações científicas a seguir: Marks et al, Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Riechmann et al, Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al, Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, lntern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995).

Alternativamente, pode-se utilizar tecnologia de exibição por fagos (McCafferty et al, Nature 348: 552-553 (1990)) para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpos in vitro a partir de repertórios de genes de domínio variável (V) de imunoglobulina de doadores não imunizados. Segundo uma realização desta técnica, as seqüências de domínio V de anticorpos são clonadas em quadro em um gene de proteína de revestimento maior ou menor de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e exibidas na forma de fragmentos de anticorpos funcionais sobre a superfície da partícula de fago. Aexibição por fago pode ser realizada em uma série de formatos, conforme descrito, por exemplo, no capítulo de Exemplos abaixo ou conforme analisado, por exemplo, em Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993). Diversas fontes de segmentos de gene V podem ser utilizadas para exibição pelo fago. Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991) isolaram um conjunto diverso de anticorpos anti-oxazolona a partir de uma pequena biblioteca combinatória aleatória de genes V derivados dos baços de camundongos imunizados. Repertório de genes V de doadores humanos não imunizados pode ser construído e anticorpos para um conjunto 10 diverso de antígenos (incluindo autoantígenos) podem ser isolados seguindo-se essencialmente as técnicas descritas por Marks et al, J. Mol. Bioi 222: 581-597 (1991), ou Griffith et al, EMBO J. 12:725-734 (1993). Vide também as Patentes Norte-Americanas n° 5.565.332 e 5.573.905.

Conforme discutido acima, anticorpos humanos podem também 15 ser gerados por células B ativadas in vitro (vide as Patentes Norte-Americanas n° 5.567.610 e 5.229.275).

Anticorpos humanos podem ser produzidos utilizando diversos métodos conhecidos na técnica, incluindo bibliotecas de exibição de fagos. Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58 1 (1991). Os métodos de Cole et ale Boerner et al também são disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos. Cole et al, Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985); e Boerner ei ai, J. immunol., 147 (1): 86-95 (1991).

Anticorpos multiespecíficos

Os anticorpos multiespecíficos são anticorpos monoclonais,preferencialmente humanos ou humanizados, que possuem especificidades de ligação para dois ou mais antígenos diferentes (anticorpos biespecíficos, por exemplo, possuem especificidades de ligação para pelo menos doisantígenos). Uma das especificidades de ligação pode ser, por exemplo, para o anticorpo alfa5beta1 e a outra pode ser para qualquer outro antígeno. Segundo uma realização preferida, o outro antígeno é uma proteína da superfície celular, receptor ou subunidade receptora. A proteína da superfície celular, por exemplo, pode ser um receptor de células matadoras naturais (NK). Desta forma, segundo uma realização, um anticorpo biespecífico de acordo com a presente invenção pode ligar alfaõbetal e ligar um VEGF.

Foram descritos exemplos de métodos de fabricação de anticorpos biespecíficos. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos baseia-se na co-expressão de dois pares de cadeia leve e cadeia pesada de imunoglobulina, em que as duas cadeias pesadas possuem especificidades diferentes. Milstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983). Devido à disposição aleatória de cadeias leve e pesada de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura 15 potencial de dez moléculas de anticorpos diferentes, das quais apenas uma possui a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta é normalmente obtida por meio de etapas de cromatografia de afinidade. Procedimentos similares são descritos em WO 93/08829, publicada em treze de maio de 1993, e em Traunecker et al, EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).

Domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de

ligação desejadas (sítios de combinação de anticorpos e antígenos) podem ser fundidos a seqüências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão ocorre preferencialmente com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, que compreende pelo menos uma parte das regiões de articulação, CH2 e CH3. Prefere-se ter a primeira região constante de cadeia pesada (CH1) que contém o sítio necessário para ligação de cadeia leve presente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve deimunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados e são cotransfectados em um organismo hospedeiro apropriado. Para detalhes adicionais sobre a geração de anticorpos biespecíficos, vide, por exemplo, Suresh etal, Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).

Diversas técnicas de fabricação e isolamento de fragmentosde anticorpos biespecíficos diretamente a partir de cultura celular recombinante também foram descritas. Anticorpos biespecíficos foram produzidos, por exemplo, utilizando zíperes de leucina. Kostelny ei al, J. Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992). Os peptídeos de zíper de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por meio de fusão genética. Os homodímeros de anticorpos foram reduzidos na região de articulação para formar monômeros e, em seguida, novamente oxidados para formar os heterodímeros de anticorpos. Este método pode também ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpos. A tecnologia de "diacorpos" descrita por Hollinger et al, Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A., 90: 6444-6448 (1993) forneceu um mecanismo alternativo de fabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos. Os fragmentos compreendem um VH conectado a um VL por um Iigante que é curto demais para permitir o pareamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia. Conseqüentemente, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a emparelhar-se com os domínios VL e VH complementares de outro fragmento, de maneira a formar dois sítios de ligação de antígenos. Uma outra estratégia de fabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos utilizando dímeros Fv de fita simples (sFv) também foi relatada. Vide Gruber etal, J. Immunol., 152: 5368 (1994).

São contemplados anticorpos com mais de duas valências. Podem ser preparados, por exemplo, anticorpos triespecíficos. Tutt et al, J. Immunol. 147: 60 (1991).Anticorpos heteroconjugados Os anticorpos heteroconjugados são compostos de dois anticorpos ligados covalentemente. Esses anticorpos foram propostos, por exemplo, para dirigir células do sistema imunológico a células indesejadas (Patente Norte-Americana US 4.676.980) e para o tratamento de infecções por HIV. WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089. Contempla-se que os anticorpos podem ser preparados in vitro, utilizando métodos conhecidos na química de proteínas sintéticas, incluindo aqueles que envolvem agentes reticulantes. Imunotoxinas, por exemplo, podem ser construídas utilizando uma reação de troca de dissulfeto ou por meio da formação de uma ligação de tioéter. Exemplos de reagentes apropriados com este propósito incluem iminotiolato e 4-mercaptobutirimidato de metila e os descritos, por exemplo, na Patente Norte-Americana n° 4.676.980.

Elaboração de função efetora ΐ5 Pode ser desejável modificar o anticorpo de acordo com a

presente invenção com relação à função efetora, de forma a aumentar a eficácia do anticorpo no tratamento de câncer, por exemplo. Resíduo(s) de cisteína pode(m) ser introduzido(s), por exemplo, na região Fc, de forma a permitir a formação de ligações de dissulfeto intercadeias nessa região. O 20 anticorpo homodimérico gerado desta forma pode possuir capacidade de internalização aprimorada e/ou morte celular mediada por complemento aprimorada e citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Vide Caron ei ai, J. Exp. Med., 176: 1191-1195 (1992) e Shopes, J. !mmuno!., 148: 2918-2922 (1992). Anticorpos homodiméricos com atividade antitumorosa aprimorada podem também ser preparados utilizando reticulantes heterobifuncionais, conforme descrito em Wolff et al, Câncer Research, 53: 2560-2565 (1993). Alternativamente, pode ser construído um anticorpo que possui regiões Fc duplas e pode, portanto, apresentar capacidades de ADCC eIise de complemento aprimoradas. Vide Stevenson et al, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989).

Mutações ou alterações nas seqüências de região Fc podem ser elaboradas para aumentar a ligação de FcR (tal como FcgamaR1 FcRn).

Segundo uma realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção possui pelo menos uma função efetora alterada selecionada a partir do grupo que consiste de ADCC, CDC e ligação de FcRn aprimorada em comparação com um IgG nativo ou um anticorpo parental. Exemplos de várias mutações específicas úteis são descritos, por exemplo, em Shields, R. L. et al (2001), 10 JBC 276 (6) 6591-6604; Presta, L. G. (2002), Biochemical Society Transaetions 30 (4): 487-490; e publicação WO 00/42072.

Segundo uma realização, a mutação de receptor de Fc é uma substituição de pelo menos uma posição selecionada a partir do grupo que consiste de: 238, 239, 246, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 15 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ou 439 da região Fc, em que a numeração dos resíduos na região Fc é de acordo com o sistema de numeração EU.imunoconjugados

A presente invenção também se refere a imunoconjugados que compreendem um anticorpo conjugado a um agente citotóxico tal como um agente quirnioterápico, toxina (tal como uma toxina enzirnaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou seus fragmentos) ou um 25 isótopo radioativo (ou seja, radioconjugado).

Os agentes quimioterápicos úteis na geração desses imunoconjugados foram descritos acima. Toxinas enzirnaticamente ativas e seus fragmentos que podem ser utilizados incluem cadeia de difteria A,fragmentos ativos não de ligação da toxina de difteria, cadeia de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia rícina A, cadeia de abrina A, cadeia de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI1 PAPII e PAP-S), inibidor Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Uma série de radionucletos é disponível para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem 212Bi1 131I1 131In, 90Y e 186Re.

Os conjugados do anticorpo e agente citotóxico são fabricados 10 utilizando uma série de agentes acopladores de proteínas bifuncionais, tais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT)1 derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetila HCI), ésteres ativos (tais como suberato de di-succinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis(p-t5 azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tais como bis-(p-diazoniobenzoil)-etílenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolieno) e compostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Pode-se preparar, por exemplo, imunotoxina rícina, conforme descrito em Vitetta et al, Science, 238: 1098 (1987). Ácido 1- isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopentaacético marcado com carbono 14 (MX-DTPA) é um exemplo de agente quelante para conjugação de radionucleto ao anticorpo. Vide WO 94/11026.

Em uma outra realização, o anticorpo pode ser conjugado a um "receptor" (tal como estreptavidina) para utilização em pré-direcionamento do tumor, em que o conjugado de anticorpo e receptor é administrado ao paciente, seguido pela remoção de conjugado não ligado da circulação, utilizando agente Iimpante e, em seguida, administração de "ligante" (tal como avidina) que é conjugado a um agente citotóxico (tal como radionucleotídeo).Imunolipossomos

Os anticorpos descritos no presente podem também ser formulados como imunolipossomos. Os Iipossomos que contêm o anticorpo são preparados por meio de métodos conhecidos na técnica, conforme descrito em Epstein et al, Proc. NatL Acad. Sei. U. S. A., 82: 3688 (1985); Hwang et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 77: 4030 (1980); e Patentes Norte-Americanas n° 4.485.045 e 4.544.545. Lipossomos com maior tempo de circulação são descritos na Patente Norte-Americana n° 5,013,556.

Lipossomos particularmente úteis podem ser gerados por meio do método de evaporação de fase reversa com uma composição de lipídios que compreende fosfatidileolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Os Iipossomos são extrudados por meio de filtros com tamanho de poro definido para gerar Iipossomos com o diâmetro desejado. Os fragmentos de Fab' do anticorpo de acordo com a presente invenção podem ser conjugados aos Iipossomos descritos em Martin et al, J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) por meio de uma reação de intercâmbio de dissulfetos. Um agente quimioterápico (tal como doxorubicina) é opcionalmente contido no interior do lipossomo. Vide Gabizon et al, J. National Câncer Inst. 81 (19): 1484 (1989).

Composições farmacêuticas de anticorpos ε polipeptídeos

Os anticorpos que ligam especificamente polipeptídeo identificado no presente, bem como outras moléculas identificadas pelos testes de seleção descritos acima, podem ser administrados para o tratamento de várias disfunções conforme indicado acima e abaixo na forma de composições farmacêuticas.

Lipofectinas ou Iipossomos podem ser utilizados para fornecer os polipeptídeos e anticorpos ou composições de acordo com a presente invenção para células. Ao utilizar-se fragmentos de anticorpos, o menor fragmento inibidor que se liga especificamente ao domínio de ligação da proteína alvo épreferido. Com base nas seqüências de região variável de anticorpo, por exemplo, podem ser projetadas moléculas de peptídeos que retenham a capacidade de ligação da seqüência de proteínas alvo. Esses peptídeos podem ser sintetizados quimicamente e/ou produzidos por meio de tecnologia de DNA recombinante. Vide, por exemplo, Marasco et al, Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A, 90: 7889-7893 (1993).

A formulação do presente pode também conter mais de um composto ativo conforme o necessário para a indicação específica sendo tratada, preferencialmente aqueles com atividades complementares que não se prejudiquem entre si. Alternativa ou adicionalmente, a composição pode compreender um agente que aprimore a sua função, tal como agente citotóxico, agente quimioterápico ou agente inibidor do crescimento. Essas moléculas encontram-se adequadamente presentes em combinação, em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido. Os ingredientes ativos podem também ser capturados em

microcápsulas preparadas, por exemplo, por meio de técnicas de acumulação ou polimerização interfacial (por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de póli(metilmetacrilato), respectivamente) em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas), ou em macroemulsões. Estas técnicas são descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, acima.

As formulacoes a serem utilizadas para administracao in vivodevem ser estéreis. Isso é facilmente obtido por meio de filtragem através de membranas de filtragem estéreis.

Podem ser fabricadas preparações de liberação prolongada. Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contenham oanticorpo, que se encontram na forma de artigos moldados, tais como filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes com liberação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (tais como póli(2-hidroxietilmetacrilato) ou álcool (poli)vinílico, polilactidas (Patente Norte-Americana n° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e L-glutamato de (-etila, etileno vinil acetato não degradável, copolímeros degradáveis de ácido láctico e ácido glicólico, tais como LUPRON DEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico e ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido póli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Embora polímeros tais como etileno-vinil acetato e ácido láctico-ácido glicólico permitam a liberação de moléculas por mais de cem dias, certos hidrogéis liberam proteínas por períodos de tempo mais curtos. Quando anticorpos encapsulados permanecerem no corpo por longo período, eles podem desnaturar-se ou agregar-se como resultado da exposição à umidade a 37 cC, o que resulta em perda da atividade biológica e possíveis mudanças de imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser idealizadas para estabilização, dependendo do mecanismo envolvido. Caso se descubra, por exemplo, que o mecanismo de agregação é a formação de ligação S-S intermolecular por meio de intercâmbio de tio-dissulfeto, pode-se atingir a estabilização por meio da modificação de resíduos sulfidrila, liofilização a partir de soluções ácidas, controle do teor de umidade, uso de aditivos apropriados e desenvolvimento de composições de matriz de polímeros específicas.

Uso EM DIAGNÓSTICO E FORMAÇÃO DE IMAGENS

Anticoraos marcados, seus derivados e análoaos aue se Iiaamespecificamente a um polipeptídeo podem ser utilizados para fins de diagnóstico para detectar, diagnosticar ou monitorar doenças e/ou disfunções associadas à expressão, expressão aberrante e/ou atividade de um polipeptídeo de acordo com a presente invenção. Segundo uma realização preferida, os anticorpos de acordo com a presente invenção podem serutilizados em testes de diagnóstico ou testes de formação de imagens queenvolvam a rejeição do anticorpo no paciente. A presente invenção fornece adetecção de expressão aberrante de um polipeptídeo VEGF ou alfaõbetal, quecompreende (a) teste da expressão do polipeptídeo em células (tais comotecido) ou fluido do corpo de um indivíduo utilizando um ou mais anticorpos deacordo com a presente invenção e (b) comparando o nível de expressãogenética com um nível de expressão genética padrão, por meio do quê umaumento ou redução do nível de expressão genética testado em comparaçãocom o nível de expressão padrão indica expressão aberrante.

Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem serutilizados para testar níveis de proteína em uma amostra biológica utilizandométodos imunohistológicos clássicos conhecidos dos técnicos no assunto(vide, por exemplo, Jalkanen et al, J. Cell. Biol. 101: 976-985 (1985); Jacksonet al, J. Cell. Biol. 105: 3087-3096 (1987)). Outros métodos com base emanticorpos úteis para a detecção da expressão de genes de proteínas incluemimunotestes, tais como o teste imunoabsorvente ligado por enzimas (ELISA) eo radioimunoteste (RIA). Marcadores de testes de anticorpos apropriados sãoconhecidos na técnica e incluem marcadores de enzimas, tais como glicoseoxidase; radioisótopos, tais como iodo (131 I, 125 I, 123 I, 121 I), carbono (14 C),enxofre (35 S), trítio (3 H), índio (115m In, 113m In,112 In,111 In) e tecnécio (" Tc,99mTc), tálio (201 Ti), gálio (68 Ga1 67 Ga), paládio (103 Pd), molibdênio (" Mo),xenônio (133 Xe), flúor (18 F), 153 Sm1 177 Lu, 159 Gd, 149 Pm, 140 La, 175 Yb, 166 Ho, 90 γ 47 Sc 186 Re 188 Re 142 Rr 105 Rh 97 R|J. jumjnQj; e marcadoresfluorescentes, tais como fluoresceína e rodamina, e biotina.

Métodos conhecidos na técnica podem ser aplicados para marcaranticorpos de acordo com a presente invenção. Esses métodos incluem, mas sem limitar-se ao uso de agentes de conjugação bifuncionais (vide, por exemplo, as Patentes Norte-Americanas US 5.756.065, US 5.714.631, 5US.696.239, US 5.652.361, US 5.505.931, US 5.489.425, US 5.435.990, US 5.428.139, US 5.342.604, US 5.274.119, US 4.994.560 e US 5.808.003, cujos teores são integralmente incorporados ao presente como referência).

O diagnóstico de uma doença ou disfunção associada à expressão ou expressão aberrante de VEGF e/ou alfa5beta1 em um animal, preferencialmente um mamífero e, de maior preferência, um ser humano pode compreender a etapa de detecção de alfa5beta1 e/ou moléculas de VEGF no mamífero. Em uma realização, após a administração de um antagonista de VEGF, o diagnóstico compreende: (a) administração (tal como por via 10 parenteral, subcutânea ou intraperitonea a um mamífero de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-alfa5beta1 marcado; (b) espera de um intervalo de tempo após a administração para permitir que a molécula marcada concentre-se preferencialmente em locais no paciente em que a molécula de alfa5beta1 é expressa (e para molécula marcada não ligada a ser limpa para o nível de fundo); (c) determinação do nível de fundo; e (d) detecção da molécula marcada no paciente, de tal forma que a detecção de molécula marcada avima do nível de fundo indica que o paciente possui uma doença ou disfunção específica associada à expressão ou expressão aberrante de alfa5beta1. O nível de fundo pode ser determinado por meio de vários métodos que incluem a comparação da quantidade de molécula marcada detectada com um valor padrão determinado anteriormente para um sistema específico.

Segundo uma realização específica, a expressão ou sobreexpressão de polipeptídeo alfa5beta1 é determinada em um teste dediagnóstico ou prognóstico após a administração de um agente terapêutico antagonista de VEGF por meio da avaliação de níveis de alfa5beta1 presente sobre a superfície de uma célula (tal como por meio de um teste imunohistoquímico utilizando anticorpos anti-alfa5beta1). Alternativa, ou adicionalmente, pode-se medir os níveis de ácido nucleico codificador depolipeptídeo alfa5beta1 ou mRNA na célula, por meio, por exemplo, de hibridização in situ fluorescente utilizando sonda com base em ácido nucleico correspondente a ácido nucleico que codifica alfa5beta1 ou seu complemento (FISH; vide WO 98/45479 publicada em outubro de W098), Southern Blot1 Northern Blot ou técnicas de reação em cadeia de polimerase (PCR)1 tais como PCR quantitativa em tempo real (RT-PCR). Pode-se também estudar a sobreexpressão de alfaõbetal medindo-se o antígeno retirado em um fluido biológico tal como soro, através, por exemplo, de ensaios baseados em anticorpos (vide também, por exemplo, a Patente Norte-Americana n° 4.933.294 emitida em doze de junho de 1990; WO 91/05264 publicada em 18 de abril de 1991; Patente Norte-Americana n° 5.401.638 emitida em 28 de março de 1995; e Sias et ai, J. Immunol. Methods, 132: 73-80 (1990)). Além dos testes acima, diversos testes in vivo são disponíveis para os técnicos no assunto. Pode-se, por exemplo, expor as células no corpo do mamífero a um anticorpo que seja opcionalmente marcado com marcador detectável, tal como um isótopo radioativo, e pode-se avaliar a ligação do anticorpo a células do mamífero, por exemplo, por meio de varrimento externo para avaliação da radioatividade ou de análise de uma biópsia retirada de um mamífero exposto anteriormente ao anticorpo.

Todas as publicações (incluindo as patentes e pedidos de patente) mencionadas no presente são integralmente incorporadas como referência, incluindo especificamente o Pedido Provisório Norte-Americano n° 60/784.704, depositado em 21 de março de 2006, o Pedido Provisório Norte-Americano n° 60/785,330, depositado em 22 de março de 2006, o Pedido Provisório Norte-Amerieano n° 60/871.743, depositado em 22 de dezembro de 2000.

As seqüências de DNA a seguir foram depositadas com base nostermos do Tratado de Budapeste junto à Coleção Norte-Americana de Cultura de Tipos (ATCC), 20110 University Blvd., Manassas VA 2209-, Estados Unidos, conforme descrito abaixo:<table>table see original document page 99</column></row><table>

Os depósitos do presente foram feitos com base nas disposições do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Fins de Procedimento de Patentes e suas Regulamentações (Tratado de Budapeste). Isso garante a manutenção de um cultura viável dos depósitos por trinta anos a partir da data do depósito. Os depósitos serão disponibilizados pela ATCC com base nos termos do Tratado de Budapeste e sujeito a acordo entre a Genentech, Inc. e a ATCC, que garante a disponibilidade permanente e irrestrita da prole da cultura dos depósitos ao público mediante emissão da patente norte-americana correspondente ou mediante a abertura ao 10 público de qualquer pedido de patente norte-americano ou estrangeiro, o que ocorrer primeiro, e garante a disponibilidade da prole às partes determinadas pelo Comissário Norte-Americano de Patentes e Marcas Comerciais com direito a tal de acordo com 35 U. S. C. 122 e as normas do Comissáro correspondentes (incluindo 3y C. F. R. 1.14 com referência específica a 886 OG 638). 15 O cessionário do presente pedido concordou que, se uma cultura

dos materiais em depósito morrer ou for perdido ou destruído quando cultivado sob condições apropriadas, os materiais serão imediatamente substituídos mediante notificação com outro idêntico. A disponibilidade do material depositado não deve ser considerada licença para a prática da presente invenção em contravenção aos direitos concedidos com base na autoridade de qualquer governo de acordo com as suas leis de patentes.

Os reagentes disponíveis comercialmente indicados nos Exemplos foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante, a menos que indicado em contrário. A fonte dessas células identificadas nos exemplos a seguir e em todo 25 o relatório descritivo por números de acesso ATCC é a Coleção Norte-Americanade Cultivos de Tipos, Manassas VA. A menos que indicado em contrário, a presente invenção utiliza procedimentos padrão de tecnologia de DNA recombinante, tais como os descritos acima e nos livros-texto a seguir: Sambrook et al, supra; Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates e Wiley Interscience1 N.Y., 1989); Innis et al, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc.: Nova Iorque, 1990); Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1988); Gait1 Oligonucleotide Synthesis (IRL Press: Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture1 1987; Coligan etal, Current Protocols in Immunology, 1991.

Ao longo do presente relatório descritivo e das reivindicações, a palavra "compreende", tal como "compreende" ou "que compreende", será compreendida como indicando a inclusão de um número inteiro indicado um grupo de números inteiros, mas não a exclusão de nenhum outro número inteiro ou grupo de números inteiros.

O relatório descritivo acima é considerado suficiente para permitir que os técnicos no assunto pratiquem a presente invenção. Os Exemplos a seguir são oferecidos unicamente para fins de ilustração e não se destinam a limitar o escopo da presente invenção de nenhuma forma. Na realidade, várias modificações da presente invenção, além das exibidas e descritas no presente, tornar-se-ão evidentes para os técnicos no assunto a partir do relatório descritivo acima e se encontrarão dentro do escopo das reivindicações anexas.

Exemplos

Recrutamento de Células Estromais que Expressam Alfa5Beta1 Após

Terapia anti-VEGF

Seções de xenoenxertos de carcinoma colo-retal humano HT-29 que haviam sido tratados com monoterapia com anticorpo anti-VEGF B20-4.1 em camundongos atímicos foram manchados para expressão anti-alfaõbetal. Em comparação com um grupo controle tratado com um anticorpo controle (anticorpo anti-erva de Santiago) neste estudo, monoterapia com B20-4.1 gerou um tempo mediano até o final (TTE) que correspondeu a pouca ou nenhuma atividade. Os tumores haviam sido medidos duas vezes por semana pelo período de 58 dias. Os animais sofreram eutanásia quando os seus tumores atingiram o volume final de 1000 mm3 ou no Dia 58, o que ocorresse primeiro, e o TTE foi calculado para cada camundongo. O resultado do tratamento havia sido determinado a partir de atraso do crescimento de tumor percentual (% TGD), definido como o aumento percentual de TTE médio de camundongos tratados contra controle, com diferenças consideradas significativas a 0,01 < P < 0,05 e altamente significativo a P < 0,01 utilizando análise de Logrank. O valor médio de TTE do grupo controle foi de 20,6 dias. Tratamento com monoterapia de B20-4.1 gerou um TTE médio de 20,1 dias que correspondeu a ausência de atividade.

A Figura 1 exibe seções de tumores manchadas com anticorpo anti-alfa5beta1. Observou-se um aumento do recrutamento de células estromais após tratamento anti-VEGF. Estas células estromais são positivas para integrina a5b1 (mancha verde clara).

Exemplo 2

Anticorpos Ant»-alpha5beta1 Camundongos receberam injeção de alfaõbetal humano purificado (Chemicon CCI027). Células de plasmacitoma que expressam anticorpos anti-alfa5beta1 foram isoladas e transformadas em linhagens de células de hibridoma. Duas linhagens de células de hibridoma denominadas 7H5.4.2.8 e 7H12.5.1.4 foram depositadas na ATCC. Vide acima. O anticorpo produzido a partir do hibridoma 7H5.4.2.8 é um anticorpo capa mlgG2a (também denominado no presente o "anticorpo 7H5"). O anticorpo produzido apartir do hibridoma 7H12.5.1.4 é um anticorpo capa mlgG2b (também denominado no presente o "anticorpo 7H12").

Exemplo 3 Teste de Ligação Direta de HUVEC

Cultivos de tecidos contendo células endoteliais de veia umbilicalhumana em crescimento (HUVEC) foram lavados por duas vezes com PBS. As células foram separadas do frasco de cultura com 3 a 4 ml de uma solução de mM de EDTA/PBS. Adicionou-se meio de cultura novo às células e misturou-se. Foi contada uma parcela das células na mistura. As células foram centrifugadas e lavadas com tampão de lavagem (50 mM de Tris, 150 mM de NaCI1 pH 7,5) por uma vez. A concentração celular foi ajustada de tal forma que as células pudessem ser semeadas a 25 μl por cavidade sobre placas de alta ligação de MSD com 96 cavidades a 25.000 células por cavidade ou 4000 células por cavidade sobre uma placa com 384 cavidades (Cat. n° L11XB-1 ou 1-5 L11XB-2, respectivamente, Meso Scale Diagnostics, LLC). As células foram incubadas por uma hora à temperatura ambiente sobre a placa para permitir a captura. Para bloquear a parede, 25 μl de tampão padrão (30% soro de feto bovino (FBS) em TBS (50 mM de Tris, 150 mM de NaCI) + 1 mM de CaCI2/1 mM de MgCI2, pH 7,5) foram adicionados à cavidade e incubados à 20 temperatura ambiente por trinta minutos a uma hora.

Anticorpos anti-alfa5beta1 foram diluídos em série com tampão de ensaio (TBS com 1 mM de CaCI2/1 mM de MgCI2, pH 7,2 + 2-4% FBS) para ter uma série de concentrações de anticorpos. As cavidades foram lavadas duas vezes com tampão de lavagem e secas com mata-borrão em seguida. 25 μl de diluição de anticorpo foram adicionados a uma cavidade e incubados em seguida sobre gelo por uma hora. As cavidades foram lavadas por três vezes com TBS.25 μl de uma solução de 0,5 μg/ml de xmuFc-sulfo-marcadorforam adicionados a cada cavidade e incubados sobre gelo por 45 minutos a uma hora. xmuFc-sulfo-marcador é um anti-lgG murino de cabra: R23-AC-5, MSD-SA-marcador: R32-21-AD-5, sobre gelo por 45 minutos a uma hora. As cavidades foram lavadas por três vezes com TBS. 150 μΙ de 2X tampão de leitura foram adicionados a cada cavidade (4X tampão de leitura MSD1 diluído até 2X com dH20, cat. R92TD-1 (livre de tensoativo)). O sinal eletroquimioluminescente (ECL) decorrente foi medido por fotodiodos e é quantificado na forma de unidade de luz relativa utilizando um leitor de MSD (protocolo 6000 padrão). A Figura 2 exibe os resultados do teste de ligação direta de HUVEC. O EC50 do anticorpo 7H5 foi de 0,22 nM. O EC50 do anticorpo 7H12 foi de 0,38 nM.

Exemplo 4

Teste de FACS de Anticorpo anti-Alfa5beta1

Anticorpos 7H12 ou 7H5 foram incubados com células RAJI (uma linhagem celular que não expressa mRNA de alfa5beta1) ou células HUVEC (uma linhagem celular que expressa altos níveis de mRNA de alfa5beta1) em 100 μΙ. As células ligadas foram detectadas utilizando um segundo anticorpo conjugado de forma fluorescente. A Figura 3 exibe por meio de análise FACS que 7H12 e 7H5 ligam-se a células HUVEC e não a células RAJI. Utilizando os mesmos métodos com sinoviócito de coelho (HIG-82) ou células de macacos rhesus (fibroblastos de Macaca mulatta CL-160 ou células endoteliais da retina CRL-1780), observamos que 7H12 e 7H5 ligam-se a células de coelhos e macacos.

Exemplo 5

Adesão Celular a Fibronectina na Presença de Anticorpos anti-Alfa5Beta1

Fibronectina (Sigma F1141 (bovina) ou Roche 1080948 (humana)) foi diluída até 1 μg/ml em um tampão de carbonato de sódio. 100 μΙ da solução de fibronectina foram adicionados por cavidade de uma placa com 96 cavidadesNUNC Maxisorp e mantidos para ligação por uma noite a 4 0C (placas Immuno com fundo plano e 96 cavidades NUNC), MaxiSorp N/Ster 439454 (VWR 62409-002)). As cavidades foram lavadas em seguida com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e bloqueadas com BSA a 1% (Sigma A9418) por pelo menos trinta minutos. As placas foram lavadas em seguida por três vezes com PBS. 20.000 células HUVEC foram adicionadas a cada cavidade e incubadas com diversas concentrações de 7H5 ou 7H12 em meios de crescimento que contêm 1,4 mM de MgCb e 1,4 mM de CaCI2. A mistura de incubação foi adicionada em seguida à placa revestida com fibronectina. Cerca de 20.000 células no mesmo meio de crescimento foram adicionadas a cada cavidade de controle quando nenhum anticorpo inibidor foi adicionado.

As placas foram centrifugadas por cinco minutos a 140 g para sincronizar o contato de células com substrato. As células foram incubadas em um incubador de CO2 por vários períodos de tempo (de 0 a 120 minutos). O período de tempo da incubação variou para cada linhagem celular. As placas foram lavadas em seguida por três vezes em PBS. Todo o líquido foi removido das cavidades e congelado a -80 °C. As placas foram descongeladas em seguida à temperatura ambiente. Tampão CyQunt (Molecular Probes CyQuant c7026) foi adicionado às cavidades e a placa foi incubada à temperatura ambiente por dez minutos. Foi medida a leitura de OD. A Figura 4 demonstra que o IC50 do anticorpo 7H5 era de 0,85 μg/ml (3,44 nM) e o IC50 do anticorpo 7H12 foi de 0,7 μg/ml (4,38 nM).

Exemplo 6

Teste de Proliferação Utilizando Células HUVEC

Placas com 96 cavidades foram revestidas com fibronectina (1μg/ml) por uma noite. A placa foi lavada em seguida com PBS. 3000 a 5000 células endoteliais (EC) foram adicionadas por 96 cavidades e mantidas para conectar-se completamente à cavidade. Foram adicionados anticorpos anti-alfaõ (incluindo controles de isotipos). São utilizadas três cavidades para cada condição. As células são incubadas em seguida com os anticorpos por uma a 24 horas. Anticorpos álfa5beta1 anti-integrina foram testados em várias concentrações (tais como 0 μg/ml1 4 μg/ml, 16 μg/ml, 60 μg/ml e 120 μg/ml).

As células são marcadas em seguida com BrdU por meio de suaincubação com 2 μΙ de solução padrão de BrdU (25 mg/ml em PBS) em 1 ml de meio de cultura de tecido (EGM2 + todos os suplementos da Clonetics (Cat. n° CC-4176)). Em seguida, estas células de incubação foram fixadas com PFA a 4%, tratadas com 1N HCI por vinte minutos, lavadas por várias vezes com PBS e bloqueadas em seguida em soro de cabra a 10% (PBS com 0,2% Triton) por uma a duas horas. As células foram manchadas em seguida com um anticorpo monoclonal contra BrdU (BD Cat. n° 347580 1:40) PBS com 0,2% de Triton e 5% de soro de cabra) e incubadas por uma noite a 4 °C. No dia seguinte, as células foram lavadas por três vezes com PBS e incubadas com um anticorpo secundário anti-coelho conjugado a Alexa 594 (1:800) por quatro horas à temperatura ambiente no escuro. As cavidades foram novamente lavadas e incubadas com DAPI (1: 10.000 em PBS) por dez minutos. Após uma lavagem final com PBS, a quantidade total de células por cavidade foi contada tomando-se uma fotografia da mancha de DAPI a 5X. As células que foram positivas para BrdU nos mesmos campos são fotografadas utilizando o filtro vermelho. A proliferação é avaliada como o percentual de células positivas para BrdU no campo. Os resultados foram analisados em seguida utilizando Excel. A Figura 5a exibe a contagem total de células HUVEC em 32 horas após um numero de células inicial de 5000. A Figura 5b exibe a contagem total de células HUVEC após 24 horas em concentração de anticorpo de 20 μg/ml.

Exemplo 7 Protocolo de Teste de Migração Células HUVEC foram cultivadas em EGM2 + todos ossuplementos da Clonetics (Cat. n° CC-4176) sobre 5 μ9/ηιΙ de Fibronectina revestida sobre placas com 24 cavidades até a confluência. As células no centro de cada cavidade foram cicatrizadas por uma extremidade de pipeta de 2 μΙ e as células removidas pela cicatrização foram retiradas por meio de 5 lavagem. O meio de cultura celular com anticorpo controle, 7H5 ou 7H12, foi adicionado a cavidades diferentes. Todos os anticorpos testados foram utilizados a 20 μg/ml. As células foram então mantidas em crescimento por um a dois dias. As áreas feridas são monitoradas.

A Figura 6 exibe uma fotografia de migração de HUVEC sobre 10 μ9/ml de fibronectina com 20 μg/ml de anticorpos anti-alfa (7H5) em ECM-2 após 0 horas e 30 horas. A Figura 7 é um gráfico do percentual de migração após trinta horas para células tratadas com os anticorpos 7H5 ou 7H12.

Exemplo 8

Testes de Apoptose de Imunomanchas de Caspase 3 Ativada por HUVEC

Placas com 96 cavidades foram revestidas com fibronectina (1μg/ml) por uma noite. As placas foram lavadas em seguida com PBS. Em seguida, 3000 a 5000 células HUVEC foram colocadas em placas com 96 cavidades e cultivadas por uma noite em meio completo (meio EBM-2 (Cambrex CC-3156) com EGM-2 SingIeQuots (Cambrex CC-4176). Caso células endoteliais de camundongo 2H11 sejam utilizadas para o teste de apoptose, o meio é meio 50/50 com 10% FBS.

No dia seguinte, um conjunto de cavidades foi alterado para meio livre de soro e incubado por quatro a seis horas para esgotar as células e colocá-las em um estado não proliferativo. O outro conjunto de células foi mantido em meio completo e representou células em proliferação ativa. Após quatro a seis horas, foram adicionados anticorpos (incluindo controles de isotipos). São geralmente utilizadas três cavidades para cada condição. As células são incubadas em seguida com os anticorpos por uma a 48 horas.Anticorpos alfaõbetal anti-integrina foram geralmente testados nas concentrações a seguir: 0 pg/ml, 4 Mg/ml, 16 pg/ml, 60 Mg/ml e 120 pg/ml.

Após esta incubação, as células foram fixadas com 4% PFA1 bloqueadas em 10% soro de cabra (PBS com 0,2% Triton) por uma a duas horas e manchadas em seguida com um anticorpo monoclonal que reconhece especificamente a forma ativada de Caspase 3 (tal como anticorpo anti-Caspase 3 ativa de coelho da BioVision1 diluído 1:50 em PBS com 0,2% Triton e 5% soro de cabra). O anticorpo anti-caspase 3 e células fixas foram incubados por uma noite a 4 °C. No dia seguinte, as células foram lavadas por três vezes com PBS e incubadas com um anticorpo secundário anti-coelho conjugado a Alexa 594 (1:800) por quatro horas à temperatura ambiente no escuro. As cavidades foram novamente lavadas e incubadas com DAPI (1: 10.000 em PBS) por dez minutos. Após uma lavagem final com PBS, a quantidade total de células por cavidade foi contada tomando-se uma fotografia da mancha de DAPI a 5X. As células que são positivas para caspase 3 ativada nos mesmos campos foram fotografadas utilizando o filtro vermelho. Avaliou-se a apoptose como o percentual de células positivas para caspase-3 ativada. Os resultados foram analisados em seguida utilizando Excel. A Figura 8 demonstra que 7H5 e 7H12 não induzem ativamente a apoptose.

Exemplo 9

Teste Colorimétrico da Atividade de Caspase-3/7 de HUVEC

Foi conduzido um teste de atividade de caspase 3/7 utilizando os anticorpos 7H5 e 7H12 (teste de Caspase-3/7 Apo-One da Promega, vide o Boletim Técnico n° 295 para instruções de um teste com 96 cavidades padrão).

Geralmente, placas com 96 cavidades foram revestidas comfibronectina (1 μ9/ηηΙ) por uma noite. As placas foram lavadas em seguida com PBS. Em seguida, 3000 a 5000 células HUVEC foram colocadas em placas com 96 cavidades e cultivadas por uma noite em meio completo (meio EBM-2(Cambrex CC-3156) com EGM-2 SingIeQuots (Cambrex CC-4176). Caso células endoteliais de camundongo 2H-11 sejam utilizadas para o teste de apoptose, o meio é meio 50/50 com 10% FBS.

No dia seguinte, um conjunto de cavidades foi alterado para meio livre de soro e incubado por quatro a seis horas para esgotar as células e colocá-las em um estado não proliferativo. O outro conjunto de células foi mantido em meio completo e representou células em proliferação ativa. Após quatro a seis horas, foram adicionados anticorpos (incluindo controles de isotipos). São geralmente utilizadas três cavidades para cada condição. As células foram incubadas em seguida com os anticorpos por 24 a 48 horas. Anticorpos alfa5beta1 anti-integrina foram geralmente testados nas concentrações a seguir: 0 pg/ml, 4 pg/ml, 16 pg/ml, 60 pg/ml e 120 pg/ml.

Após esta incubação, 100 μΙ do reagente Caspase 3/7 Apo-One foram adicionados a cada cavidade e a placa foi suavemente misturada utilizando um agitador de placas a 300 rpm por trinta segundos. A placa foi então incubada à temperatura ambiente por uma a oito horas, utilizando em seguida um leitor de placas. Foi medida a fluorescência de cada cavidade em um comprimento de onda de excitação de 485 nm e uma emissão de 530 nm.

Sinal fluorescente (RLU) resultante da divisão do substrato Caspase 3/7 indicou apoptose. A Figura 9 demonstra que 7H5 e 7H12 não induzem ativamente a apoptose.

Exemplo 10 Teste de Formação de Tubos

Anticorpos anti-alfa5beta1 podem ter determinada a sua capacidade de inibição da formação de tubos. A seguir encontra-se um exemplo de um teste de formação de tubos com base no teste de formação de tubos e crescimento de HUVECs descrito em Nakatsu et al (2003), MicrovascuIarResearch 66 (2003) 102-112.Geralmente, células HUVEC podem ser misturadas com microveículos Cytodex 3 revestidos com detran (Amersham Pharmacia Biogech1 Piscataway NJ) em uma concentração de 400 HUVEC por esfera em 1 ml de meio EGF-2. Esferas com células podem ser agitadas suavemente a cada vinte minutos por quatro horas a 37 cC e 5% CO2. Após incubação, as esferas com células podem ser transferidas para um frasco com cultura de tecidos de 25 cm2 (BD Biosciences, Bedford MA) e mantidas por doze a dezesseis horas em 5 ml de EGM-2 a 37 0C e 5% CO2. No dia seguinte, esferas com células podem ser lavadas por três vezes com 1 ml de EGM-2 e novamente suspensas em concentração de 200 esferas revestidas com células/ml em 2,5 mg/ml de fibrinogênio (Sigma, St. Louis MO). Quinhentos microlitros de solução de esferas e fibrinogênio podem ser adicionados a 0,625 unidades de trombina (Sigma) em uma cavidade de uma placa de cultura de tecidos de 24 cavidades. A solução de esferas e fibrinogênio pode coagular-se por cinco minutos à temperatura ambiente e, em seguida, a 37 °c e 5% CO2 por vinte minutos. Um mililitro de EGM-2 (que contém 2% de FBS) pode ser adicionado a cada cavidade e equilibrado com o coágulo de fibrina por trinta minutos a 37 0C e 5% CO2. Os meios serão removidos da cavidade e substituídos com 1 ml de meio novo. Cerca de vinte mil células de fibroblastas da pele (Detroit 551, ATCC, Rockville MD) podem ser colocadas em placas sobre o coágulo. Os meios podem ser alterados em dias alternados. Testes de esferas podem ser monitorados por sete dias.

Esferas revestidas com HUVEC podem ser cultivadas em géis de fibrina com ou sem 500 μΙ de anticorpos anti-alfa5beta1 (7H5 e 7H12) sobre o gel por dois a três dias e transferidas em seguida para o estágio de um Eclipse Nicon TE300, equipado com eixos multidimensionais e mantido a 37 0C e 5% CO2 por 72 horas. A concentração final de anticorpo a ser utilizada pode ser calculada considerando-se o volume de gel de fibrina, ou seja, a concentraçãofinal de anticorpo = peso total de anticorpo/volume do meio + volume de gel de fibrina. Imagens podem ser capturadas a partir de diversas esferas a cada vinte minutos utilizando software Metamorph. A quantificação de recipientes in vitro pode ser realizada utilizando uma imagem de alta resolução de esferas (tal como microscópio Olympus IX70 com uma objetiva de 4x). O número de brotos por esfera pode ser determinado em comparação com um controle (não tratado), em que o broto pode ser definido como um veículo com comprimento igual ao diâmetro da esfera. O comprimento de brotos pode ser medido por unidades arbitrárias.

Exemplo 11

Estudos de Combinação em Modelos de Tumores deAloenxerto/Xenoenxerto

A administração seqüencial e simultânea de terapia com antagonista de alfaõbetal e terapias com antagonista de VEGF pode ser avaliada em modelos de tumores de xenoenxerto/aloenxerto. Preferencialmente, os modelos apresentam pouca ou nenhuma reação à monoterapia com antagonista de VEGF. Encontram-se a seguir exemplos de modelos que podem ser utilizados: (a) aloenxerto fo5 em camundongos brutos atímicos (tumor de mama derivado dos camundongos transgênicos mmtv-Her2) (Finkle, D. et a/ (2004), Clin. Câncer Res. 10: 2499-2511); (b) xenoenxerto HT29 em camundongos brutos atímicos (linhagem colo-retal humana); e (c) RIP-TbAg (tumores pancreáticos em um modelo de Tg). As terapias podem ser tipicamente administradas por via intraperitoneal, subcutânea ou intravenosa. Anticorpo anti-VEGF pode ser administrado, por exemplo, a 10 mg/kg uma vez por semana ou 5 mg/kg duas vezes por semana. A quantidade de antagonista de alfaõbetal, tal como um anticorpo, a ser administrado pode ser estimada com base na sua própria afinidade e atividade. Em um experimento, o antagonista de VEGF e o antagonista de alfaõbetal podem ser administradosem um cronograma simultâneo por cinco a seis semanas. Alternativa ou adicionalmente, o antagonista de VEGF e o antagonista de alfaõbetal podem ser administrados seqüencialmente (por exemplo, anticorpo anti-VEGF por três semanas seguido por dosagem com anticorpo anti-alfa5beta1 por três semanas).

A eficácia do tratamento pode ser avaliada com base, entre outras coisas, no progresso do tumor, perfusão de tumores, densidade vascular do tumor, morfologia e/ou sobrevivência. O progresso de tumores pode ser medido, por exemplo, por volume de tumor e/ou pesos de tumores. Perfusão de FITC-lectina, bem como manchas de marcadores vasculares, pode ser utilizada para avaliar alterações vasculares concomitantemente com o progresso neoplásico.

Exemplo 12

Modelo de Tumor de Mama Humano MDA-MB231

Fêmeas de camundongos brutos HRLN receberam injeção de 5x106 células de câncer de mama humano MDA-MB231 por via subcutânea no flanco (HRLN é um nome de linhagem). Permitiu-se o crescimento de tumores até que eles atingissem um tamanho médio de 80 a 120 mm3 Camundongos portadores de tumores foram divididos em seguida em quatro grupos e o tratamento começou quando o volume médio do tumor por grupo era de cerca de 100 mm3.

Os volumes de tumores foram medidos duas vezes por semana durante o estudo. A medição do volume de tumor foi conduzida utilizando um método de medição de compasso. A anti-integrina de camundongo de hamster alfaõ mab, conhecida como 10E7, foi gerada na Genentech. Atingiu-se o final do experimento quando o tumor tinha 1,5 gramas ou após 60 dias, o que ocorresse primeiro. Os que reagiram podem haver seguido por mais tempo em alguns casos. Os animais sofreram eutanásia ao atingir-se o final do teste.

Os detalhes do tratamento são descritos abaixo:

(1) Grupo controle: injetou-se mab controle anti-erva deSantiago (10 mg/kg, por via interperitoneal (ip), uma vez por semana).

(2) Grupo de agente isolado anti-VEGF: injetou-se mab anti-VEGF B20.4.1 (10 mg/kg, ip, uma vez por semana)

(3) Grupo de combinação: B20.41 (10 mg/kg, ip, uma vez por semana) mais mab alfa5 anti-integrina de camundongo de hamster 10E7 (10 mg/kg, ip, duas vezes por semana).

(4) Grupo de agente isolado alfaõ anti-integrina: injetou-se alfa5 anti-integrina de camundongo de hamster mab 10E7 (10 mg/kg, ip, duas vezes por semana)

Dados de grupo de controle:

<table>table see original document page 112</column></row><table>

Dados do grupo de agente isolado anti-VEGF:<table>table see original document page 113</column></row><table>

Dados de anti-VEGF e anti-alfa5beta1:

<table>table see original document page 113</column></row><table><table>table see original document page 114</column></row><table><table>table see original document page 115</column></row><table>

Estes dados preliminares demonstram sinais iniciais de atividadecombinatória entre anti-alfa5 e anti-VEGF.

Após o final do estudo, foram calculados os volumes médios de tumor para cada grupo (Figura 11 A). Plotagens Kaplan-Meier também foram construídas para exibir o percentual de animais remanescentes no estudo em função do tempo (Figura 11B). Os dados demonstram que anticorpo α5β1 ánti-integrina aumenta a eficácia de anti-VEGF em um modelo de câncer de mama.

Exemplo 13

7H12 ε Bevacizumab no Modelo de Cura de Feridas de Orelhas de Coelho

Coelhos brancos da Nova Zelândia foram pesados e anestesiados com isofluorano. Em cada coelho, o pêlo foi preso a partir da superfície interna e junto das extremidades dos dois folíolos de orelhas. Qualquer pêlo restante foi removido dos locais cirúrgicos com loção depilatória. Os locais cirúrgicos foram limpos com esfregão de betadina, seguido por enxágüe com álcool. Utilizando uma técnica asséptica, foi utilizado um instrumento de biópsia de punção de 8 mm circular paraproduzir uma ferida até a profundidade da cartilagem de orelha em cada orelha. O pericôndrio subjacente foi removido com um elevador periosteal e uma tesoura fina. Bandagem adesiva Opsite® foi colocada sobre cada ferida e o coelho mantido em recuperação da anestesia.

Coberturas Opsite® foram removidas diariamente, as feridas foram inspecionadas, os tratamentos foram aplicados localmente e aplicou-se cobertura nova. A lacuna de ferida foi calculada medindo-se o diâmetro da ferida nos dias 0 (imediatamente após a cirurgia), 7, 10, 14 e 18. Os grupos de tratamento foram:

- Bevacizumab (anticorpo anti-VEGF), 100 μg em 30 μl para cada ferida diariamente (n = 4);

7H12 (anticorpo anti-alfa5beta1), 100 μg em 30 μl a cada ferida diariamente (n = 4);

Bevacizumab, 100 μg em 15 μΙ + 7H12, 100 μg em 15 μl a cada ferida diariamente (n = 4);

Trastuzumab (anticorpo anti-HER2), 100 μg em 30 μl a cada ferida diariamente (n = 3).

Os dados demonstram que terapias combinatórias anti-VEGF e anti-alfa5beta1 possuem um efeito notável nesse modelo de angiogênese contra agentes isolados (Fig. 10).

Exemplo 14

Terapia de Combinação anti-Alfa5beta1 ε anti-VEGF em Câncer do Cólon Fêmeas de camundongos nu/nu HRLN receberam injeção de 1 mm3 de fragmentos de tumores HT29 (tumor do cólon) por via subcutânea nos seus flancos. Permitiu-se o crescimento de tumores até que eles atingissem um tamanho médio de 80 a 120 mm3 antes do tratamento com terapias. Camundongos portadores de tumores foram divididos em quatro grupos:<table>table see original document page 117</column></row><table>

A medição do volume de tumor foi conduzida duas vezes porsemana utilizando um método de medição de compasso padrão. A anti-integrina de camundongo de hamster alfaõ mab, conhecida como 10E7, foi gerada na Genentech. O IgG controle foi um anticorpo monoclonal anti-erva de santiago. O peso do corpo foi medido cinco vezes ao longo de dois dias e, em seguida, duas vezes por semana até o final do estudo. O final do experimento foi um volume de tumor de 1 g ou 90 dias, o que ocorresse primeiro. Alguns dos que reagiram seguiram por mais tempo. Ao atingir-se o final, os animais sofreram eutanásia. O volume de dosagem foi de ml/kg (0,200 ml/20 g de 10 camundongo), que foi ajustado para o peso do corpo. Para animais que exibem regressão completa (CR), os tecidos no local de implante de tumor foram recolhidos no final e preservados em formulina seguidos por 70% EtOH para estudo posterior. Todas as amostras a serem congeladas foram colocadas em um criomolde, embaladas em folha de alumínio e rapidamente congeladas sobre nitrogênio líquido.

Após o final do estudo, foram calculados os volumes médios de tumor para cada grupo (Figura 12A). Plotagens Kaplan-Meier também foram construídas para exibir o percentual de animais remanescentes no estudo em função do tempo (Figura 12B). Os dados demonstram que anticorpo anti-integrina α5β1 aumenta aeficácia de anti-VEGF em um modelo de câncer do cólon.

Exemplo 15

Anti-AlfaSbetaI + Quimioterapia em um Câncer de Cólon

Fêmeas de camundongos nu/nu HRLN receberam injeção de 5 χ 5 106 células de tumores HCT116 (células de tumor do cólon) por via subcutânea nos seus flancos. Permitiu-se o crescimento de tumores até que eles atingissem um tamanho médio de 80 a 120 mm3 antes do tratamento com terapias. Camundongos portadores de tumores foram divididos em quatro grupos:

<table>table see original document page 118</column></row><table>

A medição do volume de tumor foi conduzida duas vezes porsemana utilizando um método de medição de compasso padrão. A anti-integrina de camundongo de hamster alfaõ mab, conhecida como 10E7, foi gerada na Genentech. O peso do corpo foi medido cinco vezes ao longo de dois dias e, em seguida, duas vezes por semana até o final do estudo. O final do experimento foi um volume de tumor de 1,5 g ou 60 dias, o que ocorresse primeiro. Alguns dos que reagiram seguiram por mais tempo. Ao atingir-se o final, os animais sofreram eutanásia. O volume de dosagem foi de 10 ml/kg (0,200 ml/20 g de camundongo), que foi ajustado para o peso do corpo. 10E7 foi administrado trinta dias antes da administração de irinotecan. Para animais que exibem regressão completa (CR), os tecidos no local de implante de tumorforam recolhidos no final e preservados em formulina seguidos por 70% EtOH para estudo posterior. Todas as amostras a serem congeladas foram colocadas em um criomolde, embaladas em folha de alumínio e rapidamente congeladas sobre nitrogênio líquido.

Após o final do estudo, foram calculados os volumes médios de tumor para cada grupo (Figura 13A). Plotagens Kaplan-Meier também foram construídas para exibir o percentual de animais remanescentes no estudo em função do tempo (Figura 13B). Os dados demonstram que um anticorpo alfa5beta1 anti-integrina não aumenta a eficácia da atividade de um agente quimioterápico (irinotecan) em um modelo de câncer do cólon, mas também não obstrui a atividade do agente quimioterápico. Esta observação é consistente com a nossa crença de que danos vasculares deverão ocorrer antes que a terapia anti-alfa5beta1 possa ser significativamente útil em anti-angiogênese, em geral e, particularmente, anti-angiogênese em um ambiente oncoológico. Essa lesão vascular pode ser causada por um antagonista de VEGF1 tal como o anticorpo AVASTIN®. Por si próprio, o agente quimioterápico neste modelo não causou lesão vascular significativa. Poder-se-á idealizar o uso de todos estes agentes (antagonista de VEGF/antagonista de alfa5beta1/agente quimioterápico) simultânea ou seqüencialmente, de tal forma que um antagonista de VEGF esteja presente para causar lesão vascular.

Exemplo 16 Plotagens Scatchard de Alfa5beta1 Os anticorpos anti-alfa5beta1 foram iodados utilizando o método de Iodogene e anticorpo rádio-marcado foi purificado a partir de 125I-Na livre por meio de filtragem de gel utilizando uma coluna PD-10. Células R9ab, uma linhagem de células de fibroblasto de coelhos (adquirida da ATCC, N0 CCL-193) foi semeada a cerca de 50.000 por cavidade em placas com 24 cavidades e incubada por 48 horas em CO2 a5% a 37 °C. As células foram lavadas por três vezes com tampão de ligação (50:50 DMEM/meio F12 contendo 2% FBS e 50 mM de HEPES1 pH 7,2) e incubadas em seguida sobre gelo por quinze minutos. As células lavadas foram incubadas por quatro horas sobre gelo com cerca de 50 pM de anticorpo monoclonal 125l-anti-alfa5beta1 que contém concentrações decrescentes de anticorpo monoclonal anti-alfa5beta1 não marcado diluído em série de 0,5 μΜ em tampão de ligação para treze concentrações testadas em três cópias. A s células foram lavadas por três vezes com tampão de ligação e solubilizadas em seguida com 200 μΙ de tampão de Iise SDS (1% SDS, 8 M de uréia, 100 mM de glicina, pH 3,0). Os Iisatos celulares foram contados sobre um contador gama Wallac Wizard 1470. Os dados de ligação foram avaliados utilizando o programa NewLigand da Genentech, que utiliza o algoritmo de encaixe de curvas de Munson e Robard (Munson, P. e Robard, D. (1980), Anal. Biochem. 107: 220-239) para determinar a afinidade de ligação do anticorpo e a concentração de sítios de ligação. As Figuras 14 e 15 demonstram que o anticorpo 7H5 possui um Kd de 0,10 nMeo anticorpo 7H12 possui um Kd de 0,30 nM, respectivamente, nestes testes de ligação.

Exemplo 17

Testes de Ligação Competitiva/Mapeamento de Epítopos IgG Alfa5Beta1anti-lntegrina

Diluições em série em três vezes de IgGs α5β1 anti-integrina foram incubadas em primeiro lugar com antígeno α5β1 de integrina humana revestido com placa Nunc Maxisorp de 96 cavidades (1 μg/ml; R&D) em tampão PBST (PBS e 0,5% (p/v) BSA e 0,05% (v/v) Tween 20) por uma a duas horas à temperatura ambiente, seguida pela adição de 0,3 nM de h7H5.v1 hlgG1 biotinilado (uma variante de anticorpo de 7H5 gerada pela Genentech, Inc.), que foi determinada em primeiro lugar por sinal de ligação abaixo domáximo (50-70%), por quinze minutos. Em seguida, a placa foi lavada com tampão PBT (PBS e 0,05% (v/v) Tween 20) por cinco vezes. O h7H5.v1 hlgG1 biotinilado ligado detectado com conjugado de peroxidase de rabanete silvestre de estreptavidina (Pierce) diluído a 1:2500 em tampão PBST, desenvolvido com substrato de 3, 3', 5, 5'-tetrametilbenzidina (TMB, Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg MD) por cerca de cinco minutos, resfriado com 1,0 M de H3PO4 e lido espectrofotometricamente a 450 nm. As curvas foram ajustadas com um programa de ajuste de curvas de regressão não lineares de quatro parâmetros (Kaleidagraph, Synergy Software).

A Figura 16 demonstra que h7H5.v1 ligado sofreu concorrência dequantidades crescentes de m7H5 frio. De fato, a curva de competição de m7H5 foi quase idêntica à curva de competição de h7H5.v1 (dados não exibidos). M7H12 frio também competiu com biotina-h7H5.v1 para ligação a alfa5beta1, o que indica que os epítopos de ligação de h7H5.v1 e m7H12 sobre alfa5beta1 são sobrepostos. O anticorpo controle, por outro lado, não competiu com h7H5.v1 ligado.Listagem de Seqüências

<110> Genentech, Inc.

<120> Terapias Combinatórias

<130> P2320R1

<150> US 60/784,704 <151> 21-03-2006

<150> US 60/785,330 <151> 22-03-2006

<150> US 60/871,743 <151> 22-12-2006

<160> 5

<210> 1 <211> 124 <212> PRT

<213> Mus musculus <400> 1

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser 15 10 15

Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Ile Ser Gly Phe Ser Leu Thr

20 25 30

Asp Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu

35 40 45

Glu Trp Leu Val Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Asn

50 55 60

Ser Ala Leu Lys Ser Arg Met Thr Ile Arg Lys Asp Asn Ser Lys

65 70 75

Ser Gln Val Phe Leu Ile Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Ser

80 85 90

Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Thr Tyr Tyr Gly Met Thr

95 100 105

Thr Thr Gly Asp Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 110 115 120

Thr Val Ser Ser

<210> 2 <211> 108 <212> PRT

<213> Mus musculus<400> 2

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu

1 5 10 15

Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser

20 25 30

Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ala Pro

35 40 45

Asn Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr

65 70 75

Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His

80 85 90

Gln Tyr Leu Arg Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

95 100 105

Glu Ile Lys

<210> 3 <211> 451 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Polipeptideo Sintético <400> 3

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser

1 5 10 15

Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Ile Ser Gly Phe Ser Leu Thr

20 25 30

Asp Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu

35 40 45

Glu Trp Leu Val Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Asn

50 55 60

Ser Ala Leu Lys Ser Arg Met Thr Ile Arg Lys Asp Asn Ser Lys

65 70 75

Ser Gln Val Phe Leu Ile Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Ser

80 85 90

Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Thr Tyr Tyr Gly Met Thr

95 100 105

Thr Thr Gly Asp Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val

110 115 120Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 125 130 135

Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 140 145 150

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 155 160 165

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 170 175 180

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 185 190 195

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 200 205 210

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys 215 220 225

Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 320 325 330

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 335 340 345

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 350 355 360

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 365 370 375

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 380 385 390

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 395 400 405Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 410 415 420

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 425 430 435

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 440 445 450

<210> 4 <211> 215 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Polipeptideo Sintético <400> 4

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu

15 10 15

Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser

20 25 30

Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ala Pro

35 40 45

Asn Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr

65 70 75

Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His

80 85 90

Gln Tyr Leu Arg Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

95 100 105

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

110 115 120

Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys

125 130 135

Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys

140 145 150

Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr

155 160 165

Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu

170 175 180Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys

185 190 195

Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

200 205 210

Asn Arg Gly Glu Cys 215

<210> 5 <211> 232 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Polipeptideo Sintético <400> 5

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser

15 10 15

Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Ile Ser Gly Phe Ser Leu Thr

20 25 30

Asp Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu

35 40 45

Glu Trp Leu Val Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Asn

50 55 60

Ser Ala Leu Lys Ser Arg Met Thr Ile Arg Lys Asp Asn Ser Lys

65 70 75

Ser Gln Val Phe Leu Ile Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Ser

80 85 90

Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Thr Tyr Tyr Gly Met Thr

95 100 105

Thr Thr Gly Asp Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val

110 115 120

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

125 130 135

Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly

140 145 150

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

155 160 165

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

170 175 180

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 185 190 195Pro Ser Ser Ser Leu 200

His Lys Pro Ser Asn 215

Gly Thr Lys Thr Tyr 205

Thr Lys Val Asp Lys 220

Thr Cys Asn Val Asp 210

Arg Val Glu Ser Lys 225

Tyr Gly Pro Pro Cys 230

Pro Ser

Claims (41)

1. ANTICORPO, carac terizado pelo fato de q ue pode ligar alfa5beta1 humano e inibir competitivamente a ligação de um anticorpo anti-alfaõbetal a alfa5beta1 humano, em que o anticorpo anti-alfa5beta1 é produzido por um hibridoma selecionado a partir do grupo que consiste do hibridoma depositado como Alfa5/beta1 7H5-4-2-8 (ATCC N°PTA-7421) ou o hibridoma depositado como Alfa5/beta1 7H12-5-1-4 (ATCC N0 PTA-7420) no ATCC em sete de março de 2006.

2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende a seqüência de domínio pesado variável (VH) e leve variável (VL) do anticorpo produzido pelo hibridoma depositado como alfa5/beta1 7H5-4-2-8 (ATCC N0 PTA-7421) no ATCC em sete de março de 2006.

3. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende a seqüência de domínio pesado variável (VH) e leve variável (VL) do anticorpo produzido pelo hibridoma depositado como alfa5/beta1 7H12-5-1-4 (ATCC N0 PTA-7420) no ATCC em sete de março de 2006.

4. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado ou quimérico do anticorpo anti-alfa5beta1 produzido por um hibridoma selecionado a partir do grupo que consiste do hibridoma depositado como alfa5/beta1 7H5- 4-2-8 (ATCC N0 PTA-7421) ou o hibridoma depositado como Alfa5/beta1 7H12- 5-1-4 (ATCC N0 PTA-7420) no ATCC em sete de março de 2006.

5. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma seqüência Fc de um IgGI humano ou lgG4 humano.

6. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a-4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma seqüência Fc que não possui função efetora de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).

7. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo multiespecífico.

8. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser conjugado a um agente terapêutico.

9. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é selecionado a partir dogrupo que consiste de um agente citotóxico, um radioisótopo e um agente quimioterápico.

10. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA, caracterizada pelo fato de que codifica o domínio de cadeia pesada variável (VH) ou o domínio de cadeia leve variável (VL) ou ambos os domínios VH e VL de qualquer um dosanticorpos conforme definidos em uma das reivindicações 1 a 4.

11. CÉLULA, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico conforme definida na reivindicação 10.

12. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a célula é o hibridoma depositado como alfa5/beta1 7H5-4-2-8(ATCC N0 PTA-7421) ou o hibridoma depositado como Alfa5/beta1 7H12-5-1-4 (ATCC N0 PTA-7420) no ATCC em sete de março de 2006.

13. COMPOSIÇÃO, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo conforme definido em uma das reivindicações 1 a 4 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

14. MÉTODO DE DETECÇÃO DA PROTEÍNA ALFA5BETA1em uma amostra de um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende contato do anticorpo conforme definido em uma das reivindicações 1 a 4 à amostra e detecção do anticorpo anti-alfa5beta1 ligado à proteína alfa5beta1.

15. USO DO ANTICORPO, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para inibição da angiogênese.

16. USO DO ANTICORPO, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para tratamento de uma doença, em que a doença possui angiogênese anormal.

17. MÉTODO DE INIBIÇÃO DA ANGIOGÊNESE E/OU PERMEABILIDADE VASCULAR, em um paciente que sofre de uma doença,caracterizado pelo fato de que compreende a administração de um antagonista de VEGF e um antagonista de alfa5beta1.

18. MÉTODO DE TRATAMENTO DE CÂNCER em um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de um antagonista de VEGF e um antagonista de alfaõbetal.

19. MÉTODO DE TRATAMENTO DE DOENÇA OCULAR emum paciente, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de um antagonista de VEGF e um antagonista de alfaõbetal.

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o paciente está sofrendo de uma doença que possui angiogênese ou permeabilidade vascular anormal.

21. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado pelo fato de que o paciente recebe adicionalmente administração de um agente terapêutico selecionado a partir do grupo que consiste de um agente antineoplásico, um agente quimioterápico, um agente inibidor docrescimento e um agente citotóxico.

22. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-VEGF pode ter competitivamente inibida a sua ligação a VEGF humano pelo anticorpo bevacizumab.

23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-VEGF é o bevacizumab.

24. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado pelo fato de que o antagonista de VEGF é um anticorpo.

25. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 17 a 19,caracterizado pelo fato de que o antagonista de alfaõbetal é um anticorpo.

26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-VEGF é um anticorpo humano ou humanizado.

27. COMPOSIÇÃO, caracterizada pelo fato de quecompreende um antagonista de VEGF, um antagonista de alfaõbetal e um veículo farmaceuticamente aceitável.

28. KIT, caracterizado pelo fato de que compreende instruções para detecção de alfaõbetal em um paciente que tenha sido tratado com umantagonista de VEGF.

29. USO DE UMA COMPOSIÇÃO, conforme definida na reivindicação 27 caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para inibição da angiogênese e/ou permeabilidade vascular em um paciente que sofre de uma doença.

30. USO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelofato de que a doença é selecionada a partir do grupo que consiste de câncer, doença ocular, doença autoimune em um paciente.

31. USO, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste de câncer demama, câncer da cervical, câncer colo-retal, câncer do pulmão, Iinfoma não-Hodgkins (NHL), câncer de células renais, câncer da próstata, câncer do fígado, câncer da cabeça e do pescoço, melanoma, câncer do ovário, mesotelioma, câncer de tecido mole e mieloma múltiplo.

32. USO DE UM ANTAGONISTA DE VEGF E UM ANTAGONISTA DE ALFA5BETA1, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para inibir a angiogênese e/ou permeabilidade vascular relacionada a uma doença.

33. USO DE UM ANTAGONISTA DE VEGF E UMANTAGONISTA DE ALFA5BETA1, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para tratar câncer.

34. USO DE UM ANTAGONISTA DE VEGF E UM ANTAGONISTA DE ALFA5BETA1, caracterizado pelo fato de ser na fabricaçãode um medicamento para tratar uma doença ocular.

35. USO1 de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a doença possui angiogênese ou permeabilidade vascular anormal.

36. USO, de acordo com uma das reivindicações 32 a 34, caracterizado pelo fato de que o medicamento compreende adicionalmente um agente terapêutico selecionado a partir do grupo que consiste de um agente antineoplásico, um agente quimioterápico, um agente inibidor do crescimento e um agente citotóxico.

37. USO, de acordo com uma das reivindicações 32 a 34, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-VEGF pode tercompetitivamente inibida a sua ligação a VEGF humano pelo bevacizumab

38. USO, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-VEGF é o bevacizumab

39. USO, de acordo com uma das reivindicações 32 a 34, caracterizado pelo fato de que o antagonista de VEGF é um anticorpo.

40. USO, de acordo com uma das reivindicações 32 a 34,caracterizado pelo fato de que o antagonista de alfa5beta1 é um anticorpo.

41. USO, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-VEGF é um anticorpo humano ou humanizado.