DE69433534T2

DE69433534T2 - Verfahren zur herstellung von makrozyklischen agentien und ihren chelaten und konjugaten

Info

Publication number: DE69433534T2
Application number: DE69433534T
Authority: DE
Inventors: Chi-Lin Roberta CHENG
Original assignee: Dow Chemical Co
Current assignee: Dow Chemical Co
Priority date: 1994-09-07
Filing date: 1994-09-07
Publication date: 2004-07-08
Anticipated expiration: 2014-09-08
Also published as: JPH10505357A; KR100367264B1; WO1996007435A1; ATE258806T1; KR970706024A; DE69433534D1; EP0783326A1; AU698763B2; AU7833994A; EP0783326B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung Isothiocyanatfunktionalisierter makrozyklischer Chelatierungsmittel und ein Verfahren um die makrozyklischen Chelatierungsmittel an biologische Moleküle zu konjugieren.
Metallionen können mittels bifunktionaler Chelatierungsmittel an biologische Moleküle gebunden werden. Solche bifunktionalen Chelatierungsmittel sind Verbindungen, die ein metallbindendes Mittel, welches mit Metallionen ein Chelat bildet, und eine zweite funktionelle Gruppe die in der Natur chemisch reaktiv ist und dazu geeignet ist, mit biologischen Molkülen eine kovalente Bindung zu bilden, enthalten. Die reaktive Funktionalität ist im Allgemeinen eine der verschiedenen bekannten nützlichen chemisch reaktiven Gruppen wie beispielsweise eine Bromacetylgruppe, ein Diazoniumion, ein Isothiocyanat oder ein Derivat einer Carboxylsäure; die reaktiven Funktionalitäten sind in der Lage, an ein Protein (z. B. das Lysinmittel eines Antikörpers) zu binden. Die biologischen Moleküle erkennen im Allgemeinen bestimmte externe oder interne Zellmarkierungen und wirken somit als zielbestimmende Gruppen für das Metallion.
Wenn das bifunktionale Chelatierungsmittel kovalent an einen Antikörper gebunden ist, der eine Spezifität für Krebs- oder Tumorzell-Epitope oder Antigene aufweist, sind Radionuclidchelate von solchen Antikörper/Chelatierungsmittel-Konjugaten nützlich in diagnostischen und/oder therapeutischen Applikationen als Mittel zur Beförderung des Radionuclids zu einer Krebs- oder Tumorzelle. Siehe z. B. Meares et al., Anal. Biochem., 142, 68–78 (1984); und Krejcarek et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm., 77, 581–585 (1977).
Isothiocyanat-funktionalisierte Derivate von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) werden in der Literatur berichtet und werden verwendet, um radioaktive Isotope mit Antikörpern zu verknüpfen. Siehe z. B. Gansow et al., Inorg. Chem., 25, 2772–2781 (1986); Meares et al., Anal. Biochem., 142, 68–78 (1984); und US-Patent 4,454,106.
Wenn kurzlebige Radionuclide, Radionuclide mit einer hohen spezifischen Aktivität, Radionuclide mit hoher Energie oder ein Radionuclid mit einer Kombination dieser Eigenschaften verwendet werden, ist es wünschenswert, das Radionuclid so dicht wie möglich am Zeitpunkt der Injektion in einen Patienten an die zielbestimmende Gruppe zu chelatieren, um maximale spezifische Radioaktivität und minimale Degradation des Radioimmunoglobulins bereitzustellen. Wenn Chelatierungsmittel wie beispielsweise EDTA und DTPA verwendet werden, erlaubt die schnelle Sequestration von Metallionen durch diese Chelatierungsmittel die Herstellung der Radionuclid/Antikörper/ Chelatierungsmittel-Konjugate die hergestellt werden sollen, durch Aktivieren des Chelatierungsmittels, Umsetzen des Chelatierungsmittels mit einem Antikörper und dann Chelatieren des Radionuclids um ein Chelatkonjugat zu bilden, gefolgt von Reinigung des Chelatkonjugats.
Obwohl jedoch Chelatierungsmittel, wie beispielsweise EDTA und DTPA, das Radionuclid schnell chelatieren, leiden sie unter dem Nachteil, dass eine solche Bindung kinetisch labil ist. Außerdem erlaubt die Verwendung von labilen Radionucliden zur Antikörpermarkierung auf diese Weise, dass im wesentlichen labile Spurenmetalle (die nicht radioaktiv sein können) in dieses Chelat eingebaut werden. Konkurrenz um solche nicht-radioaktiven Spurenmetalle verringert die biologische Wirksamkeit eines Radionuclid/Antikörper/Chelatierungsmittel-Komplexes, da eine niedrigere Menge an Radionuclid zu der Zielstelle befördert wird.
Ein weiterer Nachteil, der mit Chelatierungsmitteln wie beispielsweise EDTA und DTPA verbunden ist, ist die vorzeitige Freisetzung des chelatierten radioaktiven Isotops. Um die Rate der Metallfreisetzung in vivo zu verringern, wurden bifunktionale Chelatierungsmittel, basierend auf makrozyklischen Liganden wie beispielsweise DOTA (1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure) verwendet. Siehe z. B. Mirzadeh et al., Bioconjugate Chem., 1, 59–65 (1990); und Deshpande et al., J. Nucl. Med., 31, 473– 479 (1990).
Ein Nachteil bei der Verwendung makrozyklischer Chelatierungsmittel sind die relativ langsamen Chelatierungsraten, die bei Raumtemperatur stattfinden, siehe z. B. Mirzadeh et al., Bioconjugate Chem., 1, 59–65 (1990). Um die Radiolyse, die bei verlängerten Chelatierungszeiten erfolgt, zu verringern, wird das Medium, in dem die Chelatierung stattfindet, oft beheizt, um die Chelatierungsrate zu erhöhen. Da die Isothiocyanat-Funktionalität wärmeempfindlich ist, offenbart US-Patent 5,006,643 die Herstellung von Isothiocyanat-funktionalisierten Makrozyklen, die primäre oder sekundäre Amine enthalten, indem zuerst das Chelatierungsmittel mit Rhodium umgesetzt wird und anschließend das Chelat aktiviert wird. Chelatieren von Gadolinium an einen Tetraazamakrozyklus, der tertiäre Amine enthält, vor dem Aktivieren mit einer Isothiocyanat-funktionellen Gruppe, wird im US-Patent 4,885,363 offenbart. Basierend auf Makrozyklen ähnlicher Funktionalitäten offenbart EP-Anmeldung EP-A-0353450 die Chelatierung von Samarium, gefolgt von Aktivierung des Chelats. Verwendung der obigen Verfahren zur Herstellung von Metallion/Chelatierungsmittel/Protein-Konjugaten zur Verwendung in Radioimmunotherapie oder Radiodiagnostik erfordert die Bildung des Chelats, Aktivierung des Chelats und anschließend Konjugation des aktivierten Chelats an ein Protein innerhalb einer kurzen Zeitspanne, um einen bedeutenden Verlust an Aktivität zu verhindern.
Um einige der Schwierigkeiten bei der Herstellung von Konjugaten, die makrozyklische Chelatierungsmittel enthalten, zu verhindern, offenbart die PCT-Anmeldung WO 93/20852, veröffentlicht am 28. Oktober 1993, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Konjugaten durch Reinigen der makrozyklischen Chelatierungsmittel an mit Säure gewaschenem Kieselgel. Reinigen der Chelatierungsmittel auf diese Weise erlaubt die Aktivierung des Chelatierungsmittels mit Thiophosgen, um ein Isothiocyanat-Derivat vor der Chelatierung eines Metallion zu bilden. Die Chelatierung eines Metallions in dem offenbarten Verfahren kann rasch bei Raumtemperatur vorangehen. Das offenbarte Verfahren leidet jedoch noch immer an dem Nachteil, dass das Metallion vor der Konjugation mit einem biologischen Molekül mit dem Chelatierungsmittel umgesetzt wird. Dies ist insbesondere von Nachteil, wenn das Metallion ein kurzlebiges Radionuclid ist.
Es wäre daher vorteilhaft, ein Verfahren zu haben, das schnelle Konjugation des Chelatierungsmittels mit einem Protein vor Chelatieren des Metallions erlaubt. Ein solches Verfahren wäre insbesondere vorteilhaft, um Radiolyse und Proteinaggregatbildung zu verringern, wenn das Metallion ein Radionuclid ist. Ein Verfahren zu besitzen, bei dem die Ausbeute und Reinheit von jedem Schritt gesteigert wird, wäre auch insbesondere vorteilhaft bei der Herstellung von Verbindungen und Zusammensetzungen, die in pharmazeutischen Applikationen verwendet werden, bei denen die pharmazeutische Zusammensetzung die Reinheitskriterien erfüllen muss, die von verschiedenen Aufsichtsbehörden vorgeschrieben werden.
Die vorliegende Erfindung wird durch den Gegenstand der Ansprüche 1–21 definiert. Insbesondere ist die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Chelatkonjugaten, umfassend:

(i) Reinigen eines Polyazachelatierungsmittels durch Chromatographie an einer Kieselgelsäule, wobei das Kieselgel vor dem Beladen des Polyazachelatierungsmittels auf die Säule mit Säure gewaschen wurde und das Polyazachelatierungsmittel die Formel:
aufweist, wobei: jedes Q unabhängig Wasserstoff, (CHR⁵)_pCO₂R; (CHR⁵)_pPO₃H₂ oder (CHR⁵)_pP(O) OHR⁶ ist; Q¹ Wasserstoff oder (CHR⁵)_wCO₂R ist; jedes R unabhängig Wasserstoff, Benzyl oder C₁-C₄ Alkyl ist; mit der Bedingung, dass mindestens zwei von allen Q und Q¹ von Wasserstoff verschieden sein müssen; und dass mindestens ein Q (CHR⁵)_pP(O)OHR⁶ sein muss; jedes R⁵ unabhängig Wasserstoff, C₁-C₄-Alkyl oder -(C₁-C₂-Alkyl)phenyl ist; jedes R⁶ unabhängig -OH oder C₁-C₄-Alkyl ist; X und Y jeweils unabhängig Wasserstoff sind oder mit einem benachbarten X und Y verwendet werden können, um eine zusätzliche Kohlenstoff-Kohlenstoffbindung zu bilden; n 0 oder 1 ist; m eine ganze Zahl von 0 bis einschließlich 10 ist; p = 1 oder 2; r = 0 oder 1; w = 0 oder 1; mit der Bedingung, dass n nur dann 1 ist, wenn X und/oder Y eine zusätzliche Kohlenstoff-Kohlenstoffbindung bilden und die Summe von r und w 0 oder 1 ist; R² und R⁴ unabhängig Wasserstoff oder Amino sind; R³ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus C₁-C₄-Alkoxy, -OCH₂CO₂H, Hydroxy und Wasserstoff; mit der Bedingung, dass R² und R⁴ nicht beide Wasserstoff sein können, aber eines von R² und R⁴ Wasserstoff sein muss;
(ii) in Kontakt bringen des gereinigten Polyazachelatierungsmittels mit Thiophosgen in einer wässrigen Umgebung in Abwesenheit eines organischen Lösungsmittels bei einem pH-Wert von ungefähr 1 bis ungefähr 5, um ein Isothiocyanat-aktiviertes Polyazachelatierungsmittel zu bilden und das Isothiocyanat-aktivierte Polyazachelatierungsmittel zu erhalten;
(iii) in Kontakt bringen des Isothiocyanat-aktivierten Polyazachelatierungsmittels mit einem Protein, um ein Chelatierungsmittelkonjugat zu bilden und Gewinnen des Chelatierungsmittelkonjugats; und
(iv) in Kontakt bringen des Chelatierungsmittelkonjugats mit einem Radionuclid, um ein Chelatkonjugat zu bilden und Gewinnen des Chelatkonjugats.

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung von Chelatkonjugaten bereit, umfassend:

(i) Reinigen eines Polyazachelatierungsmittels, wie in Formel I definiert;
(ii) in Kontakt bringen des gereinigten Polyazachelatierungsmittels mit Thiophosgen, um ein Isothiocyanat-aktiviertes Polyazachelatierungsmittel zu bilden und Gewinnen des Isothiocyanat-aktivierten Polyazachelatierungsmittels;
(iii) in Kontakt bringen des Isothiocyanat-aktivierten Polyazachelatierungsmittels mit einem biologischen Molekül, um ein Chelatierungsmittelkonjugat zu bilden;
(iv) in Kontakt bringen des Chelatierungsmittelkonjugats mit einem Metallion, um ein Chelatkonjugat zu bilden und Gewinnen des Chelatkonjugats; die Verbesserung, welche umfasst: in Schritt (i): Reinigen des Polyazachelatierungsmittels durch Chromatographie an einer Kieselgelsäule, wobei das Kieselgel vor dem Beladen des Polyazachelatierungsmittels auf die Säule mit Säure gewaschen wurde; in Schritt (ii): in Kontakt bringen des gereinigten Polyazachelatierungsmittels mit Thiophosgen in einer wässrigen Umgebung in Abwesenheit eines organischen Lösungsmittels, bei einem pH-Wert von 1 bis 5; und in Schritt (iii): in Kontakt bringen des Isothiocyanat-aktivierten Polyazachelatierungsmittels mit einem biologischen Molekül bei zwischen 25° C und 40°C.

Die vorliegende Erfindung ist auch ein nach einem der vorhergehend erwähnten Verfahren hergestelltes Chelatkonjugat. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Chelatierungsmittelkonjugat bereit, das hergestellt ist nach dem Verfahren von:

(i) Reinigen eines Polyazachelatierungsmittels durch Chromatographie an einer Kieselgelsäule, wobei das Kieselgel vor dem Beladen des Polyazachelatierungsmittels auf die Säule mit Säure gewaschen wurde und das Polyazachelatierungsmittel die Formel:
aufweist, wobei: jedes Q unabhängig Wasserstoff, (CHR⁵)_pCO₂R; (CHR⁵)_pPO₃H₂ oder (CHR⁵)_pP(O) OHR⁶ ist; Q¹ Wasserstoff oder (CHR⁵)_wCO₂R ist; jedes R unabhängig Wasserstoff, Benzyl oder C₁-C₄-Alkyl ist; mit der Bedingung, dass mindestens zwei von allen Q und Q¹ von Wasserstoff verschieden sein müssen; und dass mindestens ein Q (CHR⁵)_pP(O)OHR⁶ sein muss; jedes R⁵ unabhängig Wasserstoff, C₁-C₄-Alkyl oder -(C₁-C₂-Alkyl)phenyl ist; jedes R⁶ unabhängig -OH oder C₁-C₄-Alkyl ist; X und Y jeweils unabhängig Wasserstoff sind oder mit einem benachbarten X und Y verwendet werden können, um eine zusätzliche Kohlenstoff-Kohlenstoffbindung zu bilden; n 0 oder 1 ist; m eine ganze Zahl von 0 bis einschließlich 10 ist; p = 1 oder 2; r = 0 oder 1; w = 0 oder 1; mit der Bedingung, dass n nur dann 1 ist, wenn X und/oder Y eine zusätzliche Kohlenstoff-Kohlenstoffbindung bilden und die Summe von r und w 0 oder 1 ist; R² und R⁴ ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und Amino; R³ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus C₁-C₄-Alkoxy, -OCH₂CO₂H, Hydroxy und Wasserstoff; mit der Bedingung, dass R² und R⁴ nicht beide Wasserstoff sein können, aber eines von R² und R⁴ Wasserstoff sein muss;
(ii) in Kontakt bringen des gereinigten Polyazachelatierungsmittels mit Thiophosgen, um ein Isothiocyanat-aktiviertes Polyazachelatierungsmittel zu bilden und Gewinnen des Isothiocyanat-aktivierten Polyazachelatierungsmittels; und
(iii) in Kontakt bringen des Isothiocyanat-aktivierten Polyazachelatierungsmittels mit einem biologischen Molekül, um ein Chelatierungsmittelkonjugat zu bilden.

Die Fähigkeit, ein Chelatierungsmittelkonjugat vor der Addition eines Metallions herzustellen, um ein Chelatkonjugat zu bilden, besitzt verschiedene Vorteile, insbesondere wenn das Metallion ein Radionuclid ist und das Chelatkonjugat als ein radiopharmazeutisches oder radiodiagnostisches Mittel verwendet wird. Diese Vorteile beinhalten: (a) das Chelatierungsmittelkonjugat kann effizient hergestellt werden, ist im Wesentlichen metallfrei und kann bei entsprechender Lagerung zu beliebiger Zeit zur Applikation verwendet werden; (b) das Verfahren ist vereinfacht und Strahlungsunfälle werden deutlich reduziert durch die Tatsache, dass radioaktives Material in den Großteil der Herstellung nicht involviert ist; (c) Radiomarkieren des Chelatierungsmittelkonjugats erfordert nur wenige Minuten an Kontaktzeit mit dem radioaktiven Material und Schäden an dem biologischen Molekül aufgrund von Radiolyse werden minimiert; und (d) Radiomarkieren und Reinigungsschritte sind vereinfacht und könnten durch einen Radiopharmazeuten an der Stelle der Applikation mit geringem Bedarf an fachmännischer Einweisung durchgeführt werden. Das spätere Verfahren könnte auch mit einfachen Flüssigkeits-Überführungsvorrichtungen durchgeführt werden, welche hilfreich wären, um den Kontakt mit dem radioaktiven Material zu verringern.
In einer weiteren Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung ein Chelatierungsmittelkonjugat, umfassend ein biologisches Molekül, das an ein Chelatierungsmittel der Formel I konjugiert ist, wobei das Chelatierungsmittelkonjugat weniger als ungefähr 3% Aggregatbildung enthält, wie durch Hochleistungsflüssigchromatographie gemessen wird.
In noch einer weiteren Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung ein Chelatkonjugat, umfassend ein Metallion, ein Chelatierungsmittel und ein biologisches Molekül, worin das Metallion durch das Chelatierungsmittel gebunden ist, das Chelatierungsmittel an das biologische Molekül konjugiert ist und das Chelatierungsmittel die Formel I besitzt, wobei das Chelatkonjugat weniger als ungefähr 5% Aggregatbildung enthält, wie durch Hochleistungsflüssigchromatographie gemessen.
Wie hierin verwendet, bedeutet die Bezeichnung "Chelatierungsmittel" eine Verbindung, die geeignet ist, ein Metallion zu chelatieren oder zu sequestieren. Die Bezeichnung "Chelat" bedeutet ein Chelatierungsmittel, welches ein Metallion chelatiert hat.
Die Bezeichnung "bifunktionales Chelatierungsmittel" betrifft Verbindungen, die ein Mittel aufweisen, das geeignet ist um ein Metallion zu chelatieren, und ein Markierungs-/ Abstands-Mittel, das kovalent an das Chelatierungsmittel gebunden ist, das geeignet ist, aktiviert oder funktionalisiert zu werden, um als ein Mittel zu dienen, um kovalent an ein biologisches Molekül zu binden.
Die Bezeichnung "biologisches Molekül" bezieht sich auf ein beliebiges Hormon, Antigen, Hapten oder Protein, wie beispielsweise einen Antikörper oder ein Antikörperfragment, welches dazu dient, eine bestimmte biologische Zielstelle zu erkennen. Ein solches biologisches Molekül dient, wenn es an ein funktionalisiertes Chelat gebunden ist dazu, das gebundene Metallion zu bestimmten Zielgeweben zu transportieren. Bevorzugt ist das biologische Material ein Protein. Weiter bevorzugt ist das biologische Material ein Antikörper oder Antikörperfragment.
Wie hierin verwendet, bedeutet "Antikörper" einen beliebigen polyclonalen, monoclonalen, chimären, Heteroantikörper, rekombinanten Antikörper oder Derivate davon. Bevorzugt ist der Antikörper ein monoclonaler Antikörper. Wie hierin verwendet, beinhaltet die Bezeichnung "Antikörperfragment" Fab-Fragmente und F(ab¹)₂-Fragmente und beliebige Teile eines Antikörpers, einschließlich rekombinante und Derivate davon, die Spezifität gegenüber einem gewünschten Epitop oder Epitopen aufweisen. Die Antikörperfragmente können durch konventionelle enzymatische Verfahren oder durch genetische oder Protein-technische Verfahren hergestellt werden, wie beispielsweise die Herstellung von Einzelketten-Antikörpern.
Die Bezeichnungen "aktiviert" oder "aktivierend" in Bezug auf ein Chelatierungsmittel bedeuten, dass das Chelatierungsmittel mit einer funktionellen Gruppe modifiziert wurde, die geeignet ist, eine kovalente Bindung mit einem biologischen Molekül zu bilden.
Die Bezeichnung "Chelatierungsmittelkonjugat" wie hierin verwendet, betrifft ein biologisches Material, das kovalent an ein bifunktionales Chelatierungsmittel gebunden ist. Die Bezeichnung "Chelatkonjugat" wie hierin verwendet, betrifft ein biologisches Material, das kovalent an ein Chelat gebunden ist. Die Bezeichnung "Antikörper/Chelat-Konjugat" betrifft einen Antikörper, der kovalent an ein bifunktionales Chelat (d. h. an das bifunktionale Chelatierungsmittel, das ein chelatisiertes Metallion aufweist) gebunden ist. Die Bezeichnung "Fremdmetallion" wie hierin verwendet, bedeutet ein beliebiges Metallion, das von einem gewünschten Metallion verschieden ist, das absichtlich mit dem Chelatierungsmittel in Kontakt gebracht wird, um ein Chelat zu bilden.
Ein allgemeines Gesamtverfahren, das die Schritte zur Herstellung von in der vorliegenden Erfindung verwendeten Konjugaten widergibt, ist in dem folgenden Schema I angegeben.
Schema I
Die Fähigkeit, vor der Chelatierung eines Metallions ein Chelatierungsmittelkonjugat zu bilden, wie in Schema I gezeigt, weist verschiedene Vorteile auf, wie oben dargelegt, insbesondere, wenn das Metallion ein Radionuclid ist. Ein besonderer Vorteil ist, dass das Chelatierungsmittelkonjugat hergestellt, gelagert und das Metallion kurz vor Verwendung chelatiert werden kann.
Die Bildung eines Chelatierungsmittelkonjugats durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung führt zu einem Chelatierungsmittelkonjugat, das im Allgemeinen weniger als ungefähr 3% Aggregatbildung aufweist, wie durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) gemessen. Bevorzugt enthält das Chelatierungsmittelkonjugat, welches durch ein Verfahren der vorliegenden Erfindung gebildet wird, weniger als ungefähr 2 Aggregatbildung, wie durch HPLC gemessen. Weiter bevorzugt enthalten die Chelatierungsmittelkonjugate, die durch ein Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, weniger als ungefähr 1% Aggregatbildung.
Ein durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestelltes Chelatkonjugat enthält im Allgemeinen weniger als ungefähr 5% Aggregatbildung, wie durch HPLC gemessen. Bevorzugt weist das Chelatkonjugat weniger als ungefähr 4% Aggregatbildung auf. Weiter bevorzugt weist das Chelatkonjugat weniger als 3% Aggregatbildung auf.
Ein durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestelltes Chelatkonjugat erlaubt auch den Einbau des gewünschten Metallions in einen hohen Prozentsatz an Chelatierungsmittelkonjugaten.
Unerwarteterweise wurde herausgefunden, dass beim Herstellen von Chelatkonjugaten durch die vorliegende Erfindung mehr Chelatierungsmittel pro Antikörpermolekül zugegeben werden können, z. B. mehr als zwei, ohne Auswirkung auf die Immunoreaktivität eines Antikörpers. Es wurde außerdem unerwarteterweise gefunden, dass nach Lagerung (z. B. –70°C) eines Chelatierungsmittelkonjugats, das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, die anschließend hergestellten Chelatkonjugate eine höhere Immunoreaktivität, weniger Aggregatbildung und in Tierversuchen bessere Aufnahme in Tumorgewebe aufweisen, bei geringerer Aufnahme in normales Gewebe als solches Material, das durch ein vergleichbares Verfahren, hergestellt wird, bei dem das Metallion vor Bildung des Chelatkonjugats chelatiert wird.
Waschen des Kieselgels mit Säure vor der Verwendung des Gels zum Reinigen eines Chelatierungsmittels stellt ein Verfahren zur Verringerung von Fremdmetallionen, speziell Calciumionen (Ca²⁺), während der Reinigung von makrozyklischen Chelatierungsmitteln durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von Kieselgel dar, wie in PCT-Anmeldung WO93120852, veröffentlicht am 28. Oktober 1993, offenbart. Das Waschen des Kieselgels mit einer starken Mineralsäure wie beispielsweise Chlorwasserstoff-, Salpeter-, Schwefel-, Perchlor- oder Bromwasserstoffsäure vor der Verwendung verringert die Menge an unerwünschten Metallionen, die an das Chelatierungsmittel während des Reinigungsprozesses gebunden sind, wesentlich. Bevorzugt ist die Mineralsäure, die zum Waschen des Kieselgels verwendet wird, Chlorwasserstoffsäure. Prozeduren zum Waschen von Kieselgel mit einer starken Säure, um Unreinheiten zu entfernen, sind im Stand der Technik bekannt, siehe z. B. Ralph K. Iler, The Chemistry of Silica, John Wiley & Sons (1979).
Die Eliminierung von unerwünschten Metallionen aus den makrozyklischen Chelatierungsmitteln während der anfänglichen Reinigung, führt zu verschiedenen Vorteilen in den darauf folgenden Schritten zur Bildung eines Chelatkonjugats. Die Eliminierung von unerwünschten gebundenen Metallionen aus den makrozyklischen Chelatierungsmitteln erlaubt schnelle Chelatierung des gewünschten Metallions bei Raumtemperatur, im Unterschied zu Erhitzen oder langen Reaktionszeiten, die benötigt werden, um das Calcium zu ersetzen. Die Fähigkeit, den Chelatierungsschritt eher bei Raumtemperatur durchzuführen als bei Temperaturen, welche die funktionalisierende Gruppe zerstören würden, erlaubt die Aktivierung des makrozyklischen bifunktionalen Chelatierungsmittels vor Chelatierung des Metallions. Die Fähigkeit, das makrozyklische Chelatierungsmittel vor Chelatierung des Metallions zu funktionalisieren, ist besonders vorteilhaft, da das aktivierte Chelatierungsmittel synthetisiert, an ein biologisches Molekül konjugiert, um ein Chelatierungsmittelkonjugat zu bilden, wenn benötigt gelagert und dann kurz vor der Verwendung mit dem Metallion umgesetzt werden kann. Dies ist insbesondere vorteilhaft, wenn das Metallion ein Radionuclid mit einer Halbwertszeit von 10 Tagen oder weniger ist, da eine entscheidende Menge an Radiolyse während der Zeit stattfinden kann, die zur Funktionalisierung des Chelats, Konjugation und Reinigung des Produkts aus jedem Schritt, notwendig ist.
Das vorliegende Verfahren kann für viele Klassen von Liganden verwendet werden, beinhaltend einen beliebigen tri- bis hexa- (carboxamidomethylierten), -(phosphonomethylierten), oder -(phosphinomethylierten) Polyazamakrozyklus, wobei der Polyazamakrozyklus 3 bis 6 Stickstoffe im Ring aufweist und die Gesamtzahl an Atomen im Ring 9 bis 24 Atome beträgt. Von besonderem Interesse sind Aminocarboxylsäure-Chelatierungsmittel, Aminophosphonsäure-Chelatierungsmittel und Polyaza-Chelatierungsmittel, welche sekundäre und tertiäre Amine enthalten. Bevorzugte polyazamakrozyklische Chelatierungsmittel besitzen die Formel:
wobei:
jedes Q unabhängig Wasserstoff, (CHR⁵)_pCO₂R, (CHR⁵)_pPO₃H₂ oder (CHR⁵)_pP(O) OHR⁶ ist;
Q¹ Wasserstoff oder (CHR⁵)_wCO₂R ist;
jedes R unabhängig Wasserstoff, Benzyl oder C₁-C₄-Alkyl ist;
mit der Bedingung, dass mindestens zwei von allen Q und Q¹ von Wasserstoff verschieden sein müssen; und dass mindestens ein Q (CHR⁵)_pP(O)OHR⁶ sein muss;
jedes R⁵ unabhängig Wasserstoff, C₁-C₄-Alkyl oder -(C₁-C₂-Alkyl)phenyl ist;
jedes R⁶ unabhängig -OH oder C₁-C₄-Alkyl ist;
X und Y jeweils unabhängig Wasserstoff sind oder mit einem benachbarten X und Y verwendet werden können, um eine zusätzliche Kohlenstoff-Kohlenstoffbindung zu bilden;
n 0 oder 1 ist;
m eine ganze Zahl von 0 bis einschließlich 10 ist;
p = 1 oder 2;
r = 0 oder 1;
w = 0 oder 1;
mit der Bedingung, dass n nur dann 1 ist, wenn X und/oder Y eine zusätzliche Kohlenstoff-Kohlenstoffbindung bilden und die Summe von r und w 0 oder 1 ist;
R² und R⁴ unabhängig Wasserstoff oder Amino sind;
R³ C₁-C₄-Alkoxy, -OCH₂CO₂H, Hydroxy oder Wasserstoff ist;
mit der Bedingung, dass R² und R⁴ nicht beide Wasserstoff sein können, aber eines von R² und R⁴ Wasserstoff sein muss.
Bevorzugte Amine der Polyazachelatierungsmittel der Formel I sind tertiäre Amine, wobei bevorzugt r 0 ist und jedes Q (CHR⁵)_pCO₂R ist.
Verfahren zur Synthese von Polyazamakrozyklen sind im Stand der Technik wohl bekannt. Beispiele für bevorzugte Chelatierungsmittel sind in Tabelle I angegeben und werden wie folgt benannt:

IA ist 1-(4-Aminophenyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododekan-1,4,7,10-tetraessigsäure;
IB ist 1-[2-(4-Aminophenyl)ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyclododekan-4,7,10-triessigsäure;
IC ist 1-[2-(4-Aminophenyl)ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyclododekan-1,4,7,10-tetraessigsäure;
ID ist 1-(5-Amino-2-methoxybenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododekan-4,7,10-triessigsäure;
IE ist 1-(5-Amino-2-hydroxybenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododekan-4,7,10-triessigsäure; und
IF ist 1-[2-(4-Aminophenyl)ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyclododekan-1-(R,S,-acet-4,7,10-tris-R-methylessig)säure, deren Herstellung in der Europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 420 942, veröffentlicht am 10. April 1991, angegeben ist. Die Herstellung von IA–IF ist in der Europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 353 450, veröffentlicht am 7. Februar 1990 und in der Europäischen Patentveröffentlichung Nummer 0 420 942, veröffentlicht am 10. April 1991, angegeben.

Tabelle I
Weiter betrifft die Erfindung ein Chelatierungsmittelkonjugat, umfassend ein Protein, das konjugiert ist an ein Chelatierungsmittel der Formel:
wobei:
jedes Q unabhängig Wasserstoff, (CHR⁵)_pCO₂R, (CHR⁵)_pPO₄H₂ oder (CHR⁵)_pP(O) OHR⁶ ist;
Q¹ Wasserstoff oder (CHR⁵)_wCO₂R ist;
jedes R unabhängig Wasserstoff, Benzyl oder C₁-C₄-Alkyl ist;
mit der Bedingung, dass mindestens zwei von allen Q und Q¹ von Wasserstoff verschieden sein müssen;
jedes R⁵ unabhängig Wasserstoff, C₁-C₄-Alkyl oder -(C₁-C₂-Alkyl)phenyl ist;
mit der Bedingung, dass mindestens ein R⁵ -(C₁-C₂-Alkyl)phenyl sein muss;
jedes R⁶ unabhängig -OH oder C₁-C₄-Alkyl ist;
X und Y jeweils unabhängig Wasserstoff sind oder unabhängig mit einem benachbarten X oder Y verwendet werden können, um eine zusätzliche Kohlenstoff-Kohlenstoffbindung zu bilden;
n 0 oder 1 ist;
m eine ganze Zahl von 0 bis einschließlich 10 ist;
p = 1 oder 2;
r = 0 oder 1;
w = 0 oder 1;
mit der Bedingung, dass n nur dann 1 ist, wenn X und/oder Y eine zusätzliche Kohlenstoff-Kohlenstoffbindung bilden und die Summe von r und w 0 oder 1 ist;
R² und R⁴ unabhängig Wasserstoff oder Amino sind;
R³ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus C₁-C₄-Alkoxy, -OCH₂CO₂H, Hydroxy und Wasserstoff;
mit der Bedingung, dass R² und R⁴ nicht beide Wasserstoff sein können, aber eines von R2 und R⁴ Wasserstoff sein muss;
wobei das Chelatierungsmittelkonjugat nach Konjugation des Chelatierungsmittels an das Protein weniger als ungefähr 3% Aggregatbildung enthält, wie durch Hochleistungsflüssigchromatographie gemessen.
Des Weiteren ist die vorliegende Erfindung ein Chelatkonjugat, umfassend ein Radionuclid, ein Chelatierungsmittel und ein Protein, wobei das Radionuclid durch das Chelatierungsmittel gebunden ist, das Chelatierungsmittel an das Protein konjugiert ist und das Chelatierungsmittel die wie oben gezeigte Formel besitzt, wobei das Chelatkonjugat nach Konjugation des Chelats an das Protein weniger als ungefähr 3% Aggregatbildung enthält, wie durch Hochleistungsflüssigchromatographie gemessen.
Verfahren für die Carboxylierung eines Amins eines Liganden um Aminderivate zu bilden, welche eine Carboxyalkylgruppe enthalten, sind wohl bekannt, ebenso wie die Verfahren, welche Alkylphosphonium-, Alkylphosphinium- und Hydroxyalkylsubstituenten an den Aminstickstoffatomen ergeben. Siehe z. B. US-Patente 3,726,912 und 3,398,198, Pulukkody et al. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, Seite 605 (1993).
Aminophosphonsäurederivate von Liganden können durch eine Reihe von bekannten Syntheseverfahren hergestellt werden. Von besonderer Wichtigkeit ist die Reaktion einer Verbindung, die mindestens einen reaktiven Aminwasserstoff enthält, mit einer Carbonylverbindung (Aldehyd oder Keton) und Phosphorsäure oder Derivaten davon. [Siehe das Verfahren von Moeoritzer und Irani, J. Org. Chem, 31, 1603 (1966)].
Die Polyazachelatierungsmittel der vorliegenden Erfindung, die durch Flashchromatographie an mit Säure gewaschenem Kieselgel gereinigt wurden, können mit beliebigen der bekannten funktionellen Gruppen, die geeignet sind, mit einem biologischen Molekül eine kovalente Bindung auszubilden, aktiviert werden. Beispiele für solche funktionellen Gruppen sind Isothiocyanat, Bromacetamid, Maleimid, Imidoester, Thiophthalamid, Diazonium und Carboxyl. Die Verwendung von Polyaza-Chelatierungsmitteln, die im Wesentlichen frei von unerwünschten Metallionen sind, ist insbesondere wichtig, wenn funktionalisierende Gruppen verwendet werden, die pH-Wert und/oder thermisch instabil sind wie beispielsweise Isothiocyanat. Die aktivierenden funktionellen Gruppen befinden sich an Positionen R² oder R⁴ der Formel I an dem makrozyklischen Chelatierungsmittel.
Die Reaktion des Thiophosgens mit dem Chelatierungsmittel erfolgt bei einem pH-Wert von ungefähr 1 bis ungefähr 7. Bevorzugt ist der pH-Wert von 1 bis 5. Weiter bevorzugt ist der pH-Wert von 1 bis 3. Die Reaktion wird bevorzugt in einer wässrigen Umgebung durchgeführt, die eine Säurekonzentration von ungefähr 0,005 bis ungefähr 0,5 normal (N), bevorzugt ungefähr 0,01 bis ungefähr 0,2 N aufweist, wie in der PCT-Anmeldung 93/20852, veröffentlicht am 28. Oktober 1993, offenbart. Die Säure kann eine beliebige Mineralsäure sein, bevorzugt Chlorwasserstoffsäure. Die Reaktion zwischen dem Chelatierungsmittel und Thiophosgen in einer verdünnten Säure unter heftigem Vermischen und überschüssigem Thiophosgen ist sehr schnell und üblicherweise in weniger als 5 min bei Raumtemperatur (ungefähr 15°C bis ungefähr 25°C) abgeschlossen. Höhere oder tiefere Temperaturen können verwendet werden (z. B. ungefähr 0°C bis ungefähr 50°C), Raumtemperatur wird aber bevorzugt.
Die Menge des überschüssigen Thiophosgens, das zu der Mischung zugegeben wird, hängt von der Konzentration des Polyazachelatierungsmittels ab. Je geringer die Konzentration an Chelatierungsmittel umso größer der Überschuss an Thiophosgen, um die schnelle und vollständige Umwandlung von Amin zu Isothiocyanat sicherzustellen. Z. B. ist bei einer Konzentration an Chelatierungsmittel von 10^–3 M das Verhältnis von Thiophosgen zu Chelatierungsmittel 5–20 : 1. Wenn die Konzentration an Chelatierungsmittel 10^–8 M beträgt, ist das Verhältnis von Thiophosgen zu Chelatierungsmittel mehrere tausendmal höher (d. h. 10⁵ : 1). Das überschüssige Thiophosgen wird durch herkömmliche Verfahren wie beispielsweise Evakuierung, Chromatographie oder Extraktion entfernt.
Schnelles Vermischen von Thiophosgen mit der wässrigen Lösung kann unter Verwendung von dem Fachmann bekannter, herkömmlicher Ausrüstung durchgeführt werden, welche dazu geeignet ist, genügend Scherung zu bewirken, um Dispersion des Thiophosgens in der wässrigen Lösung zu bewirken. Bezeichnend für solche Mischungsmittel ist die Verwendung eines Waring-Mischers für Herstellungen im großen Maßstab und eines MIXXOR^TM-Typmischers, erhältlich von Alltech Inc., für Herstellungen im kleineren Maßstab.
Indem die Reaktion des Chelatierungsmittels mit Thiophosgen wie oben beschrieben durchgeführt wird, beträgt die erhaltene Reinheit des Isothiocyanat-aktivierten Chelatierungsmittels ungefähr 90 bis ungefähr 95%, wie durch Hochleistungsflüssigchromatographie gemessen.
Das Chelatierungsmittel kann anschließend an ein biologisches Molekül konjugiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Biomolekül ein monoclonaler Antikörper oder ein Fragment davon, welches für eine ausgewählte Zelloberflächenzielstelle spezifisch ist. Solche Antikörper können kommerziell erhältlich sein oder können durch Standard-Körperzell-Hybridisierungsverfahren hergestellt werden. Ein Beispiel für einen geeigneten monoclonalen Antikörper ist CC49, einer von einer Serie von monoclonalen Antikörpern, die spezifisch sind für TAG-72 (Tumorassoziiertes Glycoprotein), beschrieben in der veröffentlichten PCT-Anmeldung Nummer WO89/00692 am 26. Januar 1989 und der veröffentlichten PCT-Anmeldung Nummer WO90/04410 am 3. Mai 1990. Im Allgemeinen werden das Chelat und das Protein in einem molaren Verhältnis, das größer ist als 1 : 10 und kleiner als ungefähr 100 : 1 gemischt, abhängig von dem Protein und der Proteinkonzentration. Verhältnisse von ungefähr 0,5 : 1 bis ungefähr 4 : 1 werden bevorzugt.
Verfahren um Thiocyanat-derivatisierte Chelatierungsmittel an biologische Moleküle zu konjugieren, sind im Stand der Technik wohl bekannt. Im Allgemeinen wird, wenn das biologische Molekül ein Protein ist, eine Isothiocyanat-Verknüpfung mit der ε-Aminogruppe von Lysin gebildet. Die Konjugation beinhaltet im Allgemeinen Umsetzen des funktionalisierten Chelatierungsmittels mit dem biologischen Molekül für 2 bis 18 Stunden in einer wässrigen gepufferten Lösung bei pH-Wert 6–10 bei Raumtemperatur.
Die Reinheit des aktivierten Chelatierungsmittels, das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wird, erlaubt die Durchführung der Konjugation an ein biologisches Material, bevorzugt ein Protein, bei Temperaturen von 25°C bis 40°C, bevorzugt 30°C bis 40°C, ohne die erwartete Steigerung an Zersetzung der Chelatierungsmittel-aktivierten Gruppe (d. h. Hydrolyse des Isothiocyanats) oder Proteins. Da die Temperatur der Konjugationsreaktion erhöht ist, wäre zusätzlich zu einer erhöhten Konjugationsrate eine Steigerung der Proteinaggregatbildungs-Rate und Hydrolyse der Chelat-aktivierten Gruppen zu erwarten. Unerwarteterweise führt eine erhöhte Temperatur zu einer viel schnelleren Konjugationsratensteigerung im Verhältnis zu der Steigerungsrate der unerwünschten Nebenproduktbildung (z. B. Hydrolyse von Chelatierungsmittel und Proteinaggregate).
Das Chelatierungsmittelkonjugat kann anschließend in Kontakt mit einem Metallion gebracht werden, um ein Chelatkonjugat zu bilden. Obwohl ein beliebiges Metallion, ob ein radioaktives Metallion oder nicht, verwendet werden kann, sollte das gebildete Chelatkonjugat eine soweit angemessene Stabilität aufweisen, dass der Metallkomplex nicht leicht disassoziiert wird. Radionuclide werden aufgrund der Verwendung der entstehenden Produkte in einem radiopharmazeutischen Arzneimittel zur Therapie und/oder Diagnose, bevorzugt. Bevorzugte radioaktive Isotope sind die von Samarium (Sm-153), Holmium (Ho-166), Ytterbium (Yb-175), Lutetium (Lu-177), Gadolinium (Gd-159), Lanthan (La-140), Präseodym (Pr-142), Promethium (Pm-149), Yttrium (Y-90) und Indium (In-111).
Radionuclide können auf verschiedene Weise hergestellt werden. In einem Nuklearreaktor wird ein Nuclid mit Neutronen beschossen, um ein Radionuclid zu erhalten, z. B. Sm-152 + Neutron → Sm-153 + Gamma
Ein weiteres Verfahren, um Radionuclide zu erhalten, ist, Nuclide mit Partikeln zu beschießen, die von einem Linearbeschleuniger oder einem Zyclotron produziert werden. Noch ein weiterer Weg ist, das Radionuclid aus einer Mischung von Spaltungsprodukten zu isolieren. Das Verfahren, um die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Nuclide zu erhalten, ist dabei nicht entscheidend.
Ein Metallion wie beispielsweise ein Radionuclid kann mit dem Chelatkonjugat komplexiert werden durch Zugeben des Chelatkonjugats zu einer Lösung des Metallions. Sequestration des Metallions erfolgt direkt nach Mischen in einer wässrigen Lösung bei einem pH-Wert von 1 bis 10. Bevorzugt wird die Reaktion in einem Medium, das einen pH-Wert von 1 bis 7 und mehr bevorzugt 5 bis 7 aufweist, durchgeführt. Umgebungstemperaturen von 10°C bis 40°C können für die Chelatierung von Metallionen gut verwendet werden. Die Menge an Metallion, das verwendet wird, kann von Spurenmengen bis zu einer zu dem Chelatkonjugat äquimolaren Überschuss-Menge betragen. Bevorzugt erfolgt die Sequestration des Metallions bei Raumtemperatur, zwischen 15°C und 22°C.
Nach Bildung des Chelatkonjugats kann eine zusätzliche Menge eines Chelatierungsmittels zugegeben werden, um irgendwelche im Überschuss vorhandenen Metallionen zu entfernen.
Wenn die Sequestration eines Metallions durch ein Chelatierungsmittelkonjugat nach dem vorliegenden Verfahren durchgeführt wird, wurde herausgefunden, dass um die Chelatierung des Metallions zu vereinfachen, die Chelatierung in einem Puffer ausgeführt werden sollte, der so ausgewählt wird, dass das kationische Mittel des Puffers nicht mit dem Chelatierungsmittel assoziiert oder dass das anionische Mittel des Puffers nicht mit einem Lanthanidmetallion assoziiert. Mit "assoziiert" ist Interferenz oder Inhibition der Chelatierung des Metallions durch das Chelatierungsmittel gemeint. Z. B. beinhalten geeignete Puffer Alkalimetallsalze von Acetat und Aminpuffer, die kein primäres Amin enthalten. Beispiele für geeignete Aminpuffer beinhalten N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure] (HEPES) und 2-[N-Morpholino]-ethansulfonsäure (MES). Es wurde gefunden, dass für biologische Systeme verwendete Standardpuffer wie beispielsweise Phosphat, Citrat, Carbonat und Succinat einen nachteiligen Effekt auf die Chelatierung von Metallionen durch die Chelatierungsmittelkonjugate oder Chelatkonjugate der vorliegenden Erfindung aufweisen, insbesondere wenn das Metallion ein Lanthanid ist.
In dem Verfahren der Herstellung von Chelatkonjugaten der vorliegenden Erfindung ist es allgemein notwendig, alle bei der Herstellung der Chelatierungsmittelkonjugate vorhandenen Pufferlösungen zu entfernen, die in den folgenden Schritt des Chelatierens eines Metallions eingreifen können. Es wurde auch gefunden, dass wenn Chelatkonjugate durch das vorliegende offenbarte Verfahren hergestellt werden, Chelatkonjugate schneller und mit größerer Effizienz gereinigt werden können als bei der Herstellung von Chelatkonjugaten, wobei das Metallion mit dem Chelatierungsmittel vor der Bildung eines Chelatkonjugats komplexiert wird. Reinigung der Chelatkonjugate kann unter Verwendung von Standardverfahren des Stands der Technik, wie beispielsweise durch Gelfiltration, durchgeführt werden.
Die Erfindung wird durch eine Betrachtung der folgenden Beispiele weiter geklärt, die dazu gedacht sind, nur beispielhaft für die vorliegende Erfindung zu sein.
In den folgenden Beispielen werden die folgenden Ausdrücke verwendet.

BFC = bifunktionales Chelatierungsmittel
DTPA = Diethylentriaminpentaessigsäure
PA-DOTA = 1-[2-(4-Aminophenyl)ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyclododekan-1,4,7,10-tetraessigäure.
HEPES = N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure.
MES = 2-(Morpholino)ethansulfonsäure.

Massenspektren (FAB mit Xenon) wurden an einem Vakuumgenerator ZAB HS Massenspektrometer erhalten. Proben für massenspektrometrische Analysen wurden, wenn nicht anders angegeben, durch Auflösen in einer 3 : 1-Mischung von Dithiothreitol : Dithioerythritol (magic bullet) hergestellt.
Analytische Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) von nicht-radioaktiven Proben wurde an einem Hewlett Packard 1090 Flüssigchromatograph mit einer Reversphasensäule (4,6 × 100 mm Alltech Econosphere C18 3 μ Säule) mit einer Flussrate von 1 ml pro Minute und Detektion bei 254 nm, durchgeführt. Proben wurden eluiert mit einem Gradienten von 0,05 M, pH 6,0, Natriumacetat/Acetonitril.
HPLC von radioaktiven Proben wurde unter Verwendung einer Gelfiltrationssäule (DuPont ZORBAX^TM GF-250 9,4 × 250 mm) mit einer Flussrate von 1,5 ml pro Minute und ausgestattet mit Radioaktivitäts- und Ultraviolettlichtdetektoren durchgeführt. Die mobile Phase war 0,25 M, pH-Wert 6,0, Natriumcitrat/10% Acetonitril.
Im Allgemeinen wurden Behälter für die Konjugationsreaktion und für Lagerung des Konjugats in 10%-iger (V/V) Salpetersäure für 48 Stunden getränkt und vor in Kontakt bringen mit der Antikörperlösung sorgfältig mit entionisiertem Wasser gespült. Pufferlösungen wurden entweder mit besonders reinen Reagenzien hergestellt oder durch Passieren durch ein Chelatierungsharz (CHELEX^TM 100, BioRad) vor in Kontakt bringen mit irgendwelchem unmarkierten Antikörper und/oder Konjugat dekontaminiert. Chelationsexperimente wurden im Allgemeinen durch HPLC mit UV- und Radioaktivitätsdualdetektoren verfolgt.
Beispiele
Beispiel 1: Reinigung von PA-DOTA durch Flash-Chromatographie
Eine 1,5 × 14 Inch Flashchromatographiesäule wurde mit 17,0 g Merck 60 A Kieselgel, 230–400 Netz (Aldrich Chemical Co.) gepackt, welches mit Säure gewaschen wurde, durch Alltech Inc. Rohes PA-H₄DOTA·3HCl (3,2 g, 75% rein durch HPLC-Analyse) wurde auf die Säule aufgebracht und mit einer mobilen Phase von 2 : 2 : 1 Chloroform : Methanol : konzentriertem Ammoniumhydroxyd eluiert. Fraktionen, die, wie durch Dünnschichtchromatographie untersucht, nur PA-DOTA (NH₄)₂ enthielten, wurden gesammelt und eingesetzt, um PA-DOTA (NH₄)₂ zu ergeben, das mehr als 98 Flächenreinheit war, wie durch HPLC-Analyse untersucht. Die Abwesenheit von Calzium in dem gewonnenen PA-DOTA (NH₄)₂ wurde durch Massenspektrometrie und HPLC unter Verwendung eines Elutionspuffergradienten von 95/5 Natriumacetat (0,05 M, pH = 6)/ Acetonitril zu 30/70 in 15 min bestätigt.
Chelatierung von Yttrium an dem oben erhaltenen PA-DOTA wurde durchgeführt durch Auflösen von 3 mg PA-DOTA in 3 ml 0,5 M Natriumacetatpufter (pH = 6) und 0,2 ml an 40 millimolarem Y(OAc)₃·4H₂O, was ungefähr einen fünffachen Überschuss an Yttrium darstellt. Das Ausmaß an Chelatierung wurde wie oben beschrieben durch HPLC angezeigt.
Chelatierung mit PA-DOTA, welches unter Verwendung von mit Säure gewaschenem Kieselgel gereinigt wurde, war in weniger als 5 min bei Raumtemperatur (18–25°C) abgeschlossen.
Vergleichsbeispiel A
Chelatierung mit PA-DOTA, das unter Verwendung von Kieselgel, das nicht mit Säure gewaschen wurde, gereinigt wurde, war in 15 min bei Raumtemperatur zu 4% abgeschlossen und war in 10 min bei 90°C zu 86% abgeschlossen.
Diese Ergebnisse zeigen, dass durch das Waschen des Kieselgels mit Säure zur Entfernung von Fremdmetallionen vor dessen Verwendung zur Reinigung des Chelatierungsmittels das Ausmaß, zu dem das gewünschte Metall bei Raumtemperatur sequestriert wird, stark erhöht wird.
Beispiel 2: Herstellung von SCN-PA-H₄DOTA·2HCl·2NH₄Cl
Zu 100 ml 0,01 M Chlorwasserstoffsäure wurden 250 mg Calcium-freie PA-H₂(NH₄)DOTA (0,448 mM, 2 der carboxylierten Gruppen sind protoniert und 2 der carboxylierten Gruppen sind Ammoniumsalze) wie in Beispiel 1 hergestellt, zugegeben und die Lösung in einen 40-oz. Waring-Mischer gegeben. Thiophosgen (170 μl, 2,23 mM) wurde zugegeben und der Mischer rasch gestartet. Nach 2 min Mischen wurde die Mischung in einen Scheidetrichter gegeben und überschüssiges Thiophosgen wurde mit drei 50 ml Portionen Chloroform extrahiert. Die wässrige Schicht wurde zu 100 ml Acetonitril gegeben und die Lösung bis zur Trockenheit an einem Rotationsverdampfer (ausgestattet mit einer Vakuumpumpe) bei Raumtemperatur reduziert. Der erhaltene Feststoff wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur an einer Vakuumlinie weiter getrocknet. Die Ausbeute betrug 321 mg (90% Ausbeute) an einem cremefarbenen Feststoff.
Charakterisierung des Produkts durch Massenspektrometrie und durch HPLC zeigte, dass das Produkt zu 96 Gew.-% ein Isothiocyanat-derivatisiertes PA-DOTA(SCN-PA-H₄DOTA·2HCl·2NH₄Cl) war. Der HPLC-Elutionsgradient betrug Natriumacetat/Acetonitril 95/5 bis 70/30 in 15 min und dann bis 40/60 in 20 min.
Vergleichsbeispiel B
Proben, die auf eine identische Weise hergestellt wurden, außer, dass die Reaktion durch Zugabe von 20 bis 50 Vol.-% Chloroform vor dem Mischen durchgeführt wurde, waren 84 bis 89% rein, wie durch HPLC gemessen.
Diese Ergebnisse zeigen, dass durch Mischen des Thiophosgens und des Chelatierungsmittels in einem wässrigen System in Abwesenheit eines organischen Lösungsmittels, ein hoch reines Isothiocyanat-aktiviertes Chelatierungsmittel erhalten werden kann.
Beispiel 3: Herstellung von [¹⁷⁷Lu(SCN-PA-DOTA)]
Zu 20 μl an SCN-PA-DOTA (4,88 × 10^–3 mol in Wasser), hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden 100 μl an Lu-177 (50 Mikrocurrie, 1 mM in 0,05 N HCl) zugegeben, um ein molares Verhältnis von Chelatierungsmittel zu Lu-177 von ungefähr 1 : 1 zu erhalten. Die Lösung wurde mit einem Vortex-Mischer für ungefähr 5 Sekunden gemischt, 100 μl HEPES-Puffer (0,5 M, pH 7) wurden zugegeben und die Lösung für 5 min vermischt. Der pH-Wert wurde gemessen und wenn nötig mit HEPES-Puffer auf einen pH-Wert zwischen 6 bis 7 eingestellt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für weitere 5 min fortschreiten gelassen, und die Ausbeute an [¹⁷⁷Lu(SCN-A-DOTA)] war 91,4%, wie durch HPLC ermittelt.
Der [¹⁷⁷Lu(SCN-PA-DOTA)]-Komplex wurde gereinigt durch Aufbringen der Probe auf einer Reversphasenkartusche (PRP-1-MINI-CLEAN^TM Säule, 80 μl), welche mit 800 μl Acetonitril, 400 μl Wasser und 800 μl 10 Vol.-%-igem Acetonitril in 20 mM Carbonatpuffer, pH 9,5 vorbehandelt war. Nach Beladen des Komplexes auf die Säule wurde das Reaktionsgläschen mit 200 μl und anschließend 600 μl an 10 Vol.-%-igem Acetonitril in Carbonatpuffer gespült, die Waschlösungen ebenfalls auf der Säule aufgebracht.
Der Komplex wurde dann von der Säule eluiert unter Verwendung eines 1 : 2-Verhältnisses an Carbonatpufter (20 mM, pH 9,5) : Acetonitril. Ungefähr 80% der Radioaktivität wurden in dem zweiten 50 μl Elutionsvolumen gewonnen.
Beispiel 4: Konjugation von [¹⁷⁷Lu(SCN-PA-DOTA)] mit IgG CC49 bei Raumtemperatur (21–22°C)
Zu 257 μl einer Antikörperlösung (IgG CC49, 14,5 mg/ml in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,5) wurden 25 μl an [¹⁷⁷Lu(SCN-PA-DOTA)] wie oben beschrieben hergestellt, zugegeben, um ein molares Verhältnis BFC : Antikörper von ungefähr 1,36 zu ergeben. Das aktivierte Chelat und die Antikörperlösung wurden mit einem Vortex-Mischer für ungefähr 10 Sekunden vermischt und bei Raumtemperatur für ungefähr 2 Stunden stehen gelassen, wobei ungefähr alle 10–15 min gemischt wurde. Das Verschwinden des [¹⁷⁷Lu (SCN-PA-DOTA)] wurde durch HPLC gemessen. Nach 120 min waren ungefähr 62% der ¹⁷⁷Lu-Aktivität mit dem Antikörper assoziiert, ungefähr 7% waren nicht-Antikörperassozüerte Unreinheiten und unreagiertes [¹⁷⁷Lu(SCN-PA-DOTA)] war ungefähr 30%.
Beispiel 5: Konjugation von [¹⁷⁷Lu(SCN-PA-DOTA)] mit IgG CC49 bei 37°C
Zu einer Antikörperlösung (15,7 mg CC49 IgG (39 nM) in 286 μl Carbonatpuffer, 20 mM, pH 9,5) wurden 21 nM an [¹⁷⁷Lu(SCN-PA-DOTA)]-Komplex (9,7 Millicurrie an Aktivität) in 11 μl des Eluenten aus Beispiel 3 zugegeben. Die Mischung wurde mit einem Vortex-Mischer gemischt und in einem 37°C-Ofen für eine Stunde stehen gelassen, wobei ungefähr alle 10–15 Minuten gemischt wurde. Der Fortschritt der Reaktion wurde durch HPLC-Analyse für das Verschwinden des Komplexes, wie in Beispiel 4 beschrieben, angezeigt. Nach einer Stunde war die mit dem Antikörper assoziierte ¹⁷⁷Lu-Aktivität, wie durch HPLC gemessen, 91%, weniger als 4% der ¹⁷⁷Lu-Aktivität waren mit Unreinheiten assoziiert, und 5% waren unreagiertes [¹⁷⁷Lu(SCN-PA-DOTA)].
Die Konjugationsreaktion wurde durch Isolierung und Reinigung des Konjugats an einer Gelfiltrationssäule (PD-10 Säule, SEPHADEX^TM G-25, Mittel, 9 ml), welche mit Phosphatgepuffertem Kochsalz ausgeglichen worden war, beendet.
Homogenität des markierten Antikörpers wurde durch HPLC und durch SDS-PAGE-Elektrophorese (Natriumdodekylsulfat-Polyacrylamid-Elektrophorese), gekoppelt mit Autoradiographie, untersucht. Immunoreaktivität wurde bestimmt durch IRMA und Säulenbindungs-Affinität und wurde als vergleichbar zu dem bei 25°C konjugierten gefunden. In vivo-Bioverteilung (in Ratten) des bei 37°C hergestellten Konjugats war nicht signifikant unterschiedlich zu dem bei 25°C hergestellten.
Die Ergebnisse zeigen, dass das Chelat bei 37°C rasch an einen Antikörper konjugiert werden kann, ohne die Immunoreaktivität oder Bioverteilung des Konjugats zu beeinflussen.
Beispiel 6: Konjugation von CC49 mit SCN-PA-DOTA und die darauftolgende Chelatierung mit ¹⁷⁷Lu
Zu einer Antikörperlösung von IgG CC49 (1,25 ml von einer ungefähr 10,4 mg/ml Lösung) wurden 1 ml einer DTPA-Lösung (0,25 M, pH 6) zugegeben und die Lösung in einem Konzentrator konzentriert (30 K, CENTRICON^TM) durch Zentrifugieren in einer DuPont Sorvall-Zentrifuge (RT 6000B) für 45 min bei 5500 rpm. Die mit DTPA behandelte Antikörperlösung wurde zweimal mit jeweils 1,5 ml eines Carbonatpuffers (20 mM; pH 9,5 ± 0,1) gewaschen und weiter konzentriert, um 0,9 ml einer Antikörperlösung von ungefähr 12 mg/ml an CC49 zu ergeben.
Zu 500 μl (40 nmol) der obigen Antikörperlösung wurden 120 μl (120 nmol) an SCN-PA-DOTA (1 mM Lösung in H₂O) gemischt. Der pH-Wert wurde mit einer Natriumcarbonatlösung (1,0 M) auf ungefähr 9,5 eingestellt, und die Lösung wurde bei 37 °C für 2 Stunden inkubiert. Die Konjugation wurde beendet durch Entnehmen aus der Wärme und Reinigung des Chelatierungsmittelkonjugats durch Gelfiltrationschromatographie mit einer Säule (PD-10 Säule, 9 mm Bett Vol. von Pharmacia SEPHADEX^TM G-25 dreimal vorbehandelt mit 6 ml an MES-Puffer (20 mM, pH 6)). Die Säule wurde eluiert mit demselben MES-Puffer. Der Durchfluss und die ursprüngliche Waschlösung von 2,4 ml Gesamtvolumen wurden verworfen. Die nächsten 1,5 bis 2,0 ml an Eluat, welche den Großteil des Chelatierungsmittelkonjugats enthielten, wurden gesammelt.
Zu dem Chelatierungsmittelkonjugat, das von der PD-10 Säule kam, wurden 60 μl an ¹⁷⁷Lu (1 mM in 0,05 N HCl) gegeben. Diese Lösung wurde mit einem Vortex-Mischer gemischt und nach 15 min bei Raumtemperatur, wurden 25 μl einer DTPA-Lösung (0,25 M, pH 6) zugegeben. Die Menge an ¹⁷⁷Lu-Aufnahme wurde durch HPLC-Analyse ermittelt. Es wurde gezeigt, dass das mit ¹⁷⁷Lu-markierte CC49, welches durch Gelfiltation an einer PD-10 Säule isoliert wurde, weniger als 1% jeweils an Aggregaten und nicht-gebundenem ¹⁷⁷Lu enthält. Immunoreaktivität des markierten CC49, das 0,97 ¹⁷⁷Lu-PA-DOTA-Moleküle pro Antikörper enthielt, wurde durch Affinitätsbindung an BSM (Muzin von Rinder Unterkieferdrüse) als 96.0 ± 1,0% ermittelt.
Beispiel 7: EDTMP als Fänger zur Entfernung von ungebundenem ¹⁷⁷Lu aus Radiomarkierungs-Mischungen und die darauffolgende Reinigung durch Ionenaustauschchromatographie
Ein CC49 PA-DOTA-Konjugat wurde, wie in Beispiel 6 beschrieben, hergestellt und gereinigt aus 32 nmol (4,8 mg) an CC49 und 96 nmol an SCN-PA-DOTA in 600 μl an Carbonatpufter bei pH 9,5 für 3 Stunden. Zu dem Chelatierungsmittelkonjugat in 2,0 ml an MES-Puffer (20 mM, pH 6,2) wurden 64 μl an ¹⁷⁷Lu (1 mM in 0,05 N HCl) zugegeben, nach wenigen Minuten gefolgt von 20 μl an einer Ethylendiamintetramethylenphosphorsäure-Lösung (EDTMP) (0,25 M, pH 6). HPLC-Analyse zeigte, dass 60% des ¹⁷⁷Lu an Antikörper gebunden, und das verbleibende überwiegend an EDTMP gebunden war. Die Lösung wurde dann in 4 gleiche Portionen geteilt und jede durch eine der folgenden 4 Säulen gereinigt. Säule 1 war eine vorgepackte PD-10 von Pharmacia, Säule 2 war vorgepackt mit 3 ml einer starken Anionenaustauschharz-Aufschlämmung (SEPHADEX^TM QAE Gel ein Diethyl[2-hydroxypropyl]-aminoethyl SEPHADEX^TM G25; ungefähr 0,3 g an Trockenperlen). Säule 3 war eine vorgepackte starke Anionenaustauschsäule (BioRad AG1 × 8,40–120 Maschengröße), und Säule 4 war ein quartäres Amin auf Kieselgelkartusche in einer vorgepackten Kartusche (SAX, von Varion). Auf jede der 4 Säulen, die mit 3 × 5 ml MES-Puffer vorbehandelt waren, wurde die Reaktionsmischung geladen und mit 4 ml PBS (Phosphatgepufferter Saline; 120 mm NaCl, 2,7 mm KCl und 10 mm Phosphat, pH 7,4) eluiert. Mit jeder dieser Säulen wurde, wie in Tabelle II zusammengefasst, eine vergleichbare Reinigung erzielt. Das mit ¹⁷⁷Lu markierte CC49 wurde von den Anionenaustauschsäulen in 1–2 ml an PBS mit guter Ausbeute (84–87%) und ausgezeichneter Homogenität des gereinigten markierten Antikörpers, eluiert.
Tabelle II Reinigung von ¹⁷⁷Lu CC49 durch Gelfiltration oder Anionenaustauschchromatographie EDTMP als Chelatierungsmittel
Beispiel 8: DTPA als Fänger zur Entfernung von ungebundenem ¹⁷⁷Lu aus Radiomarkierungs-Mischungen und darauffolgende Reinigung durch Ionenaustauschchromatographie
Monoclonaler Antikörper CC49 wurde konjugiert und wie in Beispiel 7 radiomarkiert, außer dass die Hälfte des Konjugats bei pH 7 in HEPES-Puffer chelatiert wurde und DTPA (Diethylentriaminopentaessigsäure) verwendet wurde, um ungebundenes Lu-177 zu reinigen. Die abschließende Reingiung wurde vervollständigt durch Ionenaustauschchromatographie an entweder SEPHADEX^TM QAE oder DOWEX^TM AG1 × 8-Säule, vorgewaschen mit 3 × 5 ml entionisiertem Wasser. Der markierte Antikörper wurde mit PBS eluiert. Die in Tabelle III gezeigten Ergebnisse sind vergleichbar mit den in Beispiel 7 beschriebenen.
Tabelle III Reinigung von ¹⁷⁷Lu CC49 durch Anionenaustausch-Chromatographie mit DTPA als Reiniger
Beispiel 9: Herstellung von MoAb CC49 PA-DOTA-Konjugat in größerem Maßstab
1. Konjugation
500 ml an Antikörper CC49 (8,8 mg/ml; 5,87 × 10^–5 M/l) wurden bei 37°C in einem mit Säure gewaschenen Kolben vorgeheizt. Der pH-Wert der Antikörperlösung wurde mit einer 1,0 M Natriumcarbonatlösung auf 9,5 ± 0,1 eingestellt (ungefähr 0,056 ml/ml an Antikörper in PBS). Dies war gefolgt von der Zugabe von 29,3 ml einer SCN-PA-DOTA-Lösung (5 mM in sterilem Wasser zur Injektion), unter vorsichtigem Verwirbeln. Das Ausgangsmolverhältnis an SCN-PA-DOTA zu Antikörper war 5 : 1. Die Lösung wurde in einem Wasserbad bei 37°C für 2 Stunden inkubiert. Nach Beendigung der Konjugationsreaktion wurde die Mischung durch Gelfiltrationschromatographie gereinigt.
2. Reinigung des Antikörperkonjugats:
A. Vorbehandlung einer Gelsäule
Zur Desinfektion und um Spurenmetall-Kontamination und Substanzen, die möglicherweise die darauffolgende Chelatierung des gereinigten Chelatierungsmittel-Konjugats unterbinden könnten, zu entfernen, wurde eine Gelsäule (Sephacryl S-200; Pharmacia BPG 200/950-Säule mit Fassungsvolumen = 20 l) vorbehandelt mit einer DTPA-Natriumhydroxidlösung (10 l an 50 mM DTPA in 0,7 M Natriumhydroxid), gefolgt von 100 l an sterilem Wasser zur Injektion und 100 l an NH₄OAc-Puffer (25 mM; pH 7,0).
B. Test des Säulenwaschens während des Verfahrens:
Als Vorsichtsmaßnahme wurde während des Verfahrens ein Funktionstest durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Säulenwäsche frei von DTPA oder irgendetwas anderem, das die Chelatierung der DOTA-Funktionalität nachteilig beeinflussen könnte, ist. Dieser Test mißt die Chelatierung von PA-DOTA-SCN mit ¹⁷⁷Lu in dem Säuleneluenten verglichen mit reinem Lösungsmittel.
C. Gelfiltrationschromatographie:
Die monoclonale Antikörper-Chelatierungsmittelkonjugat (PA-DOTA-CC49) -Mischung wurde auf die vorbehandelte Gelfiltrationssäule geladen (Sephacryl S-200, unter Verwendung eines Pharmacia BIOPROCESS^TM-Systems I mit einer BPG 200/950-Säule). Das gereinigte monoclonale Antikörper-Chelatierungsmittelkonjugat wurde mit einem Ammoniumacetatpuffer (25 mM, pH 7) eluiert. Das erhaltene Konjugat wies eine Proteinkonzentration von ungefähr 1,5 bis 2 mg/ml auf. Es wurde weiter konzentriert auf etwa 5–6 mg/ml. Das Konjugat wurde dann in Aliquoten bei –70°C gelagert. Im Allgemeinen wurde eine 80%-ige Gesamtausbeute, bezogen auf Proteinkonzentration, erzielt.
3. Chelatierung von CC49 PA-DOTA-Konjugat und Reinigung des mit ¹⁷⁷Lu markierten CC49
Ein wie oben hergestelltes PA-DOTA-CC49-Konjugat (12,0 ml an 5,3 mg/ml Protein; 63,6 mg; 424 nmol gesamt) wurde aufgetaut und auf Umgebungstemperatur (ungefähr 21–22° C) erwärmen gelassen. Zu diesem wurden 933 μl einer ¹⁷⁷Lu-Lösung (1 mM in 0,05 N HCl) zugegeben und für 15 Sekunden gemischt, das Verhältnis von ¹⁷⁷Lu zu Antikörper war 2,2. Nach 15 min bei Raumtemperatur wurden 460 μl einer DTPA-Lösung (5 mM, pH 6,0) zu der Chelatierungsmischung zugegeben und gemischt. Eine kleine Probe der Reaktionsmischung wurde entnommen und durch HPLC auf die an den Antikörper gebundene Menge an ¹⁷⁷Lu untersucht, welche als 93% ermittelt wurde. Reinigung des mit ¹⁷⁷Lu markierten CC49 wurde durch Passieren der Reaktionsmischung durch eine Anionenaustauschsäule (8 g an SEPHADEX^TM QAE) erreicht. Nach Verwerfen des Durchlaufs und 1 ml an Spülung wurde der markierte Antikörper in 30 ml PBS, das 5% Glycerin enthielt, eluiert. Eine 89%-ige Ausbeute, bezogen auf ¹⁷⁷Lu-Aktivität, wurde erreicht.
Beispiel 10: Lagerungsstabilität von CC49 PA-DOTA-Konjugat
Ein PA-DOTA-GC49-Konjugat wurde wie in Beispiel 9 hergestellt und in 0,9 ml Aliquoten in Glasserumfläschchen, die jeweils mit einem TEFLON^TM beschichteten grauen Gummistopfen und einer Aluminiumkappe verschlossen waren, bei –70°C gelagert. Ein Fläschchen des Konjugats wurde entnommen und zu bestimmten Zeitintervallen auf seine Chelatierbarkeit mit ¹⁷⁷Lu (im Überschuss und begrenzter Menge) und Erhaltung der Immunoreaktivität durch seine Bindung an ein BSM Argarosegel untersucht. Die Ergebnisse bestätigten, dass das Konjugat bei –70°C über längere Zeiträume gelagert werden konnte (untersucht für bis zu ungefähr 4 Monaten) ohne entscheidenden Verlust an Chelatierbarkeit oder Immunoreaktivität.
Beispiel 11: Vergleichende Bioverteilung von Chelatkonjugaten, hergestellt durch Verfahren A und Verfahren B, dargestellt in Schema I
Um die Wirkung des zur Herstellung von Chelatkonjugaten verwendeten Prozesses zu ermitteln, wurden Chelatkonjugate wie in den Verfahren A und B in Schema I hergestellt.
Probe 1 (Verfahren A) wurde durch Vermischen gleicher molarer Mengen an SCN-PA-DOTA mit ¹⁷⁷Lu bei pH 6–7, und Reinigung durch Reversphasen-Chromatographie hergestellt. Konjugation von [¹⁷⁷Lu(SCN-PA-DOTA)] mit CC49 wurde bei pH 9,5 ± 0,1 für 90 min bei 37°C durchgeführt und ergab ein Chelatkonjugat, das ungefähr 0,8 ¹⁷⁷Lu/Ab enthielt.
Probe 2 (Verfahren B), welches 1,1 ¹⁷⁷Lu/Ab enthielt, wurde wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellt. Die Proben wurden durch HPLC Immunoreaktivität und Trichloressigsäurefällung charakterisiert. Die in Tabelle IV gezeigten Ergebnisse zeigten, dass die beiden Herstellungen im Hinblick auf die untersuchten in vitro-Eigenschaften vergleichbar waren.
Tabelle IV in vitro-Tests von ¹⁷⁷Lu CC49 zur Verwendung in Bioverteilung
Bioverteilung von Studien der oben hergestellten Chelatkonjugate wurden in weiblichen 6–7 Wochen alten Bulb/C-Mäusen durchgeführt. Die Mäuse wurden intravenös behandelt über Schwanzvenen-Injektionen, nach 5 Stunden, 24 Stunden, 2 Tagen und 5 Tagen wurden Gruppen von 5 Tieren getötet und entsprechende Gewebeproben entnommen und analysiert. Die in Tabelle IVA für Probe 1 und in Tabelle IVB für Probe 2 gezeigten Ergebnisse lassen erkennen, dass es keinen entscheidenden Unterschied zwischen der Bioverteilung der beiden auf die beiden verschiedenen Weisen hergestellten Proben gab. Tabelle IVA Bioverteilung von ¹⁷⁷Lu-PA-DOTA CC49-Konjugat hergestellt nach Verfahren A

a: Ein Gewebewert weggelassen aufgrund von Statistikabweichung > p-95-Wert.
b: Ein Tier weggelassen, Schwanzvene > 10% injizierte Dosis.
c: Ein Tier weggelassen, Gewebe falsch gewogen.

¹⁷⁷

a: Ein Gewebewert weggelassen aufgrund von Statistikabweichungen > p-95-Wert.
b: Ein Tier weggelassen, Schwanzvene > 10% injizierte Dosis.
c: Ein Tier weggelassen, Gewebe falsch gewogen.

Beispiel 12: Bioverteilung von ¹⁷⁷Lu CC49 Chelatkonjugaten in Mäusen mit Tumor
Um die Wirkung der Anzahl an Radionucliden, die an ein Antikörpermolekül gebunden sind, wie in Verfahren B hergestellt, zu ermitteln, wurden zwei Proben hergestellt, die ungefähr 1,2 oder ungefähr 2 ¹⁷⁷Lu/Antikörpermolkül enthalten.
Zwei Proben wurden unter Verwendung von Antikörperkonjugat hergestellt und wie in Beispiel 9 beschrieben mit ¹⁷⁷Lu gekennzeichnet mit Anfangs-Verhältnissen von BFCA/Ab 3 (Probe 3) und 5 (Probe 4) für Konjugation. in vitro-Integrität und Immunoreaktivität der beiden Proben waren vergleichbar, wie in Tabelle V gezeigt.
Tabelle V In vitro-Tests
Eine Bioverteilungsuntersuchung unter Verwendung der wie oben hergestellten Proben wurde in weiblichen CD-1 athymischen (nu/nu) Mäusen im Alter von 6–7 Wochen durchgeführt, die einen menschlichen LS-174 T Dickdarmkarzinom-Heterotransplantat in sich trugen. Die Mäuse wurden über die Schwanzvenen intravenös injiziert, und in verschiedenen Zeitabständen wurden Gruppen von 5 Tieren getötet und Gewebeproben entnommen und analysiert. Die in Tabelle VA und VB angegebenen Ergebnisse zeigten, dass ein geringfügiger Unterschied in der Tumoraufnahme und der Gesamtkörperretention bestand, insbesondere zu späteren Zeitpunkten, d. h. nach 120 Stunden. In anderen Geweben wurde kein entscheidender Unterschied zwischen den beiden Proben beobachtet. Die Ergebnisse zeigen auch, dass mehr als ein Chelat an ein Antikörpermolekül konjugiert werden kann, ohne die Bioverteilung des gekennzeichneten Antikörpers deutlich zu beeinflussen.
Tabelle VA: Bioverteilung von ¹⁷⁷Lu-PA-DOTA CC49-Konjugaten mit einem Verhältnis von 1,2 BFC : Ab, n = 5

a: Ein Gewebewert aussortiert wegen Statistikabweichung > p-95-Wert.
b: Ein Tier weggelassen wegen Schwanzvene > 10%.
c: Ein Tumor ausgelassen wegen Gewicht außerhalb annehmbarem Bereich.
d: Ein Tier weggelassen, da 3 oder mehr Gewebe abweichend waren.

¹⁷⁷

Beispiel 13: Herstellung von ¹¹¹In PA-DOTA-CC49
Zu 85 μl (3 × 10⁹ mol) eines Chelatierungskonjugats (PA-DOTA-CC49) in 25 mM Ammoniumacetatpuffer bei pH 7, hergestellt wie in Beispiel 9 beschrieben, wurden 7,5 μl an ¹¹¹In 0,05 N Salzsäure, zugegeben, die Lösung gemischt und bei Raumtemperatur für 5 min absitzen gelassen. Nach Beendigung der Chelatierung des ¹¹¹In wurden 3 μl einer 5 mM DTPA-Lösung zugegeben und die Lösung wurde erneut gemischt. Der Prozentsatz an mit dem Konjugat assoziierten ¹¹¹In wurde durch HPLC an einer Gelfiltrationssäule (GF-250-Säule) als 64% ermittelt. Der ¹¹¹In-markierte Antikörper wurde gereinigt durch Passieren durch eine Anionenaustauschsäule (SEPHADEX^TM QAE). Der markierte Antikörper wurde charakterisiert durch HPLC, PAGE-SDS-Gel gekoppelt mit Autoradiographie und Immunoreaktivitätsassay. Die spezifische Aktivität des markierten Antikörpers wurde auf 1,4 mCi/mg geschätzt.
Wenn die Chelatierung bei 37°C für 15 min durchgeführt wurde, wurden 75% des ¹¹¹In an Antikörper gebunden (siehe Tabelle VI). Der gereinigte ¹¹¹In-markierte Antikörper war im Hinblick auf die durch HPLC-Analyse bestimmte Immunoreaktivität und physikalische Integrität identisch zu dem durch Chelatierung bei Raumtemperatur hergestellten. Die Ergebnisse in Tabelle VI zeigen auch, dass es wenig Aggregatbildung gab.
Tabelle VI: Bindung von ¹¹¹In an PA-DOTA-CC49
Beispiel 14: Herstellung von ¹⁵³Sm PA-DOTA-CC49
Zu 85 μl (3 × 10^–9 mol) eines Chelatierungsmittelkonjugats (PA-DOTA-CC49) in 25 mM Ammoniumacetatpuffer bei pH 7, hergestellt wie in Beispiel 10, wurden 3,8 μl an ¹⁵³Sm mit zusätzlichem Träger (2 mM Sm in 0,10 N Salzsäure) zugegeben, die Lösung wurde gemischt und bei Raumtemperatur für 15 min absitzen gelassen. Nach Beendigung der Chelatierung des ¹⁵³Sm wurden 3 μl einer 5 mM DTPA-Lösung zugegeben, und die Lösung wurde erneut gemischt. Der Prozentsatz an mit dem Konjugat assoziierten ¹⁵³Sm wurde durch HPLC an einer Gelfiltrationssäule (GF-250-Säule) als 83 ± 12% ermittelt. Der ¹⁵³Sm-markierte Antikörper wurde gereinigt durch Passieren durch ein Anionenaustauschharz (SEPHADEX^TM QAE-Säule), und charakterisiert durch HPLC, PAGE-SDS-Gel gekoppelt mit Autoradiographie und Immunoreaktivitätsassay. Die Ergebnisse zeigten, dass 98,4% des ¹⁵³Sm an Antikörper gebunden waren, mit weniger als 0,3% Aggregatbildung mit Immunoreaktivität durch Bindung an BSM von 97,7 ± 0,35 %.
Beispiel 15: Herstellung von ⁹⁰Y PA-DOTA-CC49
Zu 85 μl (3 × 10^–9 mol) eines Chelatierungsmittelkonjugats (PA-DOTA-CC49) in 25 mM Ammoniumacetatpuffer bei pH 7, hergestellt wie in Beispiel 10, wurden 8,3 μl an trägerfreiem ⁹⁰Y in 0,05 N Salzsäure zugegeben, die Lösung wurde gemischt und bei Raumtemperatur (ungefähr 21°C) für 30 min absitren gelassen. Weniger als 1% von ⁹⁰Y wurde Antikörper-gebunden vorgefunden. Nach Erhitren bei 37°C für 30 min wurde die Ausbeute an gebundenem ⁹⁰Y durch HPLC-Analyse als 11% ermittelt.
In anderen Versuchen, wenn kaltes Yttriumacetat für 10 min zugegeben wurde, war die Ausbeute an Chelatierung stark verbessert, diese Ergebnisse sind in Tabelle VII gezeigt.
Tabelle VII: Chelatierung von CC49 PA-DOTA-Konjugat mit ⁹⁰Y mit verschiedenen zugegebenen Mengen an kaltem Yttrium, 10 min Chelatierung in 25 mM Ammoniumacetat, pH 7
Der ⁹⁰Y-markierte Antikörper wurde gereinigt durch Passieren durch eine BioRad AG-1 × 8 Säule und charakterisiert durch HPLC und BSM-Immunoreaktivitätsassay. Im Allgemeinen waren in dem gereinigten Material mehr als 98% des ⁹⁰Y an den Antikörper gebunden, und Immunoreaktivität, wie durch Bindung an BMS gemessen, war ungefähr 93–95%.
Beispiel 16: Auswirkung verschiedener Ionen auf Chelatierung
Um die Auswirkung verschiedener Ionen auf Chelatierung von ¹⁷⁷Lu durch SCN-PA-DOTA im Allgemeinen zu ermitteln, wurden 7,5 μl einer der in Tabelle VIII aufgelisteten Lösungen (0,1 M) zu 85 μl (3 nanomol) eines PA-DOTA-CC49-Konjugats in 25 mM Ammoniumacetat bei ungefähr pH 7 zugegeben. Zu dieser Mischung wurden 7,5 μl einer ¹⁷⁷Lu-Lösung (1 mM in 0,05 N HCl) zugegeben, die Lösung gemischt und dann vor HPLC-Analyse für ungefähr 10 min bei Raumtemperatur absitzen gelassen. Die Auswirkung der verschiedenen Ionen auf die Chelatierung ist in Tabelle VIII gezeigt.
Tabelle VIII: Auswirkung verschiedener Ionen auf Chelatierung von CC49 PA-DOTA-Konjugat
Die Ergebnisse in Tabelle VIII zeigten eine hemmende Wirkung von Citrat und Phosphat unter den Anionen; und Calcium und Mangan unter den Kationen auf die Chelatierung des PA-DOTA-CC49-Konjugats.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Chelat-Konjugats umfassend: (i) reinigen eines Polyaza-Chelatierungsmittels durch Chromatographie an einer Kieselgelsäule, wobei das Kieselgel vor dem Laden des Polyaza-Chelatierungsmittels auf die Säule mit Säure gewaschen wurde und das Polyaza-Chelatierungsmittel die Formel:
besitzt, wobei: jedes Q unabhängig Wasserstoff, (CHR⁵)_pCO₂R; (CHR⁵)_pPO₃N₂ oder (CHR⁵)_pP(O)OHR⁶ ist; Q¹ Wasserstoff oder (CHR⁵)_wCO₂R ist; jedes R unabhängig Wasserstoff, Benzyl oder C₁-C₄ Alkyl ist; mit der Bedingung, dass mindestens zwei von allen Q und Q¹ von Wasserstoff verschieden sein müssen und mindestens ein Q (CHR⁵)_pP(O)OHR⁶ sein muss; jedes R⁵ unabhängig Wasserstoff, C₁-C₄ Alkyl oder -(C₁-C₂ Alkyl)phenyl ist; jedes R⁶ unabhängig -OH oder C₁-C₄ Alkyl ist; X und Y jeweils unabhängig Wasserstoff sind oder mit einem benachbarten X und Y verwendet werden können um eine zusätzliche Kohlenstoff-Kohlenstoff Bindung zu bilden; n 0 oder 1 ist; m eine ganze Zahl von 0 bis einschließlich 10 ist: p = 1 oder 2; r = 0 oder 1; w = 0 oder 1; mit der Bedingung, dass n nur dann 1 ist, wenn X und/oder Y eine zusätzliche Kohlenstoff-Kohlenstoff Bindung bilden und die Summe von r und w 0 oder 1 ist; R² und R⁴ unabhängig Wasserstoff oder Amino sind; R³ ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus C₁-C₄ Alkoxy, -OCH₂CO₂H, Hydroxy und Wasserstoff; mit der Bedingung, dass R² und R⁴ nicht beide Wasserstoff sein können aber eines von R² und R⁴ Wasserstoff sein muss; (ii) in Kontakt bringen des gereinigten Polyaza-Chelatierungsmittels mit Thiophosgen in einer wässrigen Umgebung in Abwesenheit eines organischen Lösungsmittels bei einem pH-Wert von ungefähr 1 bis ungefähr 5 um ein Isothiocyanat aktiviertes Polyaza-Chelatierungs-Mittel zu bilden und Gewinnen des Isothiocyanat aktivierten Polyaza-Chelatierungsmittels; (iii) in Kontakt bringen des Isothiocyanat aktivierten Polyaza-Chelatierungsmittels mit einem Protein um ein Chelatierungsmittel-Konjugat zu bilden und Gewinnen des Chelatierungsmittel-Konjugats; und (iv) in Kontakt bringen des Chelatierungsmittel-Konjugats mit einem Radionuclid-Ion um ein Chelat-Konjugat zu bilden und Gewinnen des Chelat-Konjugats.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei r 0 ist und jedes Q (CHR⁵)_pCO₂R ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Chelatierungsmittel α-[2-(4-Aminophenyl) ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyclododekan-1,4,7,10-tetraessigsäure ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 wobei das Radionuclid ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, ¹⁴⁵Yb, ¹⁷⁷Lu, ¹⁵⁹Gd, ¹⁴⁰La, ¹⁴²Pr, ¹⁴⁹Pm, ⁹⁰Y oder ¹¹¹In ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Radionuclid ¹¹¹Lu ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (iii) Umsetzen des Isothiocyanataktivierten Chelatkonjugats mit einem Antikörper bei ungefähr 37°C umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein Chelatierungsmittel zu dem in Schritt (iv) gebildeten Chelatkonjugat zugegeben wird, um überschüssiges Metallion zu entfernen.
Chelatkonjugat welches mit dem Verfahren von Anspruch 1 hergestellt ist.
Verfahren zur Herstellung eines Chelatkonjugats umfassend: (i) reinigen eines Polyaza-Ghelatierungsmittels der Formel:
wobei: jedes Q unabhängig Wasserstoff, (CHR⁵)_pCO₂R; (CHR⁵)_pPO₃H₂ oder (CHR⁵)_pP(O)OHR⁶ ist; Q¹ Wasserstoff oder (CHR⁵)_wCO₂R ist; jedes R unabhängig Wasserstoff, Benzyl oder C₁-C₄ Alkyl ist; mit der Bedingung, dass mindestens zwei von allen Q und Q¹ von Wasserstoff verschieden sein müssen und mindestens ein Q (CHR⁵)_pP(O)OHR⁶ sein muss; jedes R⁵ unabhängig Wasserstoff, C₁-C₄ Alkyl oder -(C₁-C₂ Alkyl)phenyl ist; jedes R⁶ unabhängig -OH oder C₁-C₄ Alkyl ist; X und Y jeweils unabhängig Wasserstoff sind oder mit einem benachbarten X und Y verwendet werden können um eine zusätzliche Kohlenstoff-Kohlenstoff Bindung zu bilden; n 0 oder 1 ist; m eine ganze Zahl von 0 bis einschließlich 10 ist; p = 1 oder 2; r = 0 oder 1; w = 0 oder 1; mit der Bedingung, dass n nur dann 1 ist, wenn X und/oder Y eine zusätzliche Kohlenstoff-Kohlenstoff Bindung bilden und die Summe von r und w 0 oder 1 ist; R² und R⁴ unabhängig Wasserstoff oder Amino sind; R³ ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus C₁-C₄ Alkoxy, -OCH₂CO₂H, Hydroxy und Wasserstoff; mit der Bedingung, dass R² und R⁴ nicht beide Wasserstoff sein können aber eines von R² und R⁴ Wasserstoff sein muss; (ii) in Kontakt bringen des gereinigten Polyaza-Chelatierungsmittels mit Thiophosgen um ein Isothiocyanat aktiviertes Polyaza-Chelatierungsmittel zu bilden und Gewinnen des Isothiocyanat aktivierten Polyaza-Chelatierungsmittels; (iii) in Kontakt bringen des Isothiocyanat aktivierten Polyaza-Chelatierungsmittels mit einem Protein um ein Chelatierungsmittel-Konjugat zu bilden; (iv) in Kontakt bringen des Chelatierungsmittelkonjugats mit einem Radionuclid um ein Chelatkonjugat zu bilden und Gewinnen des Chelatkonjugats; wobei die Verbesserung umfasst: in Schritt (i): Reinigen des Polyaza-Chelatierungsmittels durch Chromatographie an einer Kieselgelsäule, wobei das Kieselgel vor dem Laden des Polyaza-Chelatierungsmittels auf die Säule mit Säure gewaschen wurde; in Schritt (ii): in Kontakt bringen des gereinigten Polyaza-Chelatierungsmittels mit Thiophosgen in einer wässrigen Umgebung in Abwesenheit eines organischen Lösungsmittels bei einem pH-Wert von ungefähr 1 bis ungefähr 5; und in Schritt (iii): in Kontakt bringen des Isothiocyanat-aktivierten Polyaza-Chelatierungsmittels mit einem biologischen Molekül bei zwischen ungefähr 25°C und ungefähr 40°C.
Chelatkonjugat nach Anspruch 9 wobei das Chelatkonjugat weniger als ungefähr fünf Prozent Aggregatbildung enthält, wie durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie gemessen.
Chelatierungsmittelkonjugat hergestellt durch das Verfahren von: (i) Reinigen eines Polyaza-Chelatierungsmittels durch Chromatographie an einer Kieselgelsäule, wobei das Kieselgel vor dem Laden des Polyaza-Chelatierungsmittels auf die Säule mit Säure gewaschen wurde und das Polyaza-Chelatierungsmittel die Formel:
aufweist, wobei: jedes Q unabhängig Wasserstoff, (CHR⁵)_pCO₂R; (CHR⁵)_pPO₃H₂ oder (CHR⁵)_pP(O)OHR⁶ ist; Q¹ Wasserstoff oder (CHR⁵)_wCO₂R ist; jedes R unabhängig Wasserstoff, Benzyl oder C₁-C₄ Alkyl ist; mit der Bedingung, dass mindestens zwei von allen Q und Q¹ von Wasserstoff verschieden sein müssen und mindestens ein Q (CHR⁵)_pP(O)OHR⁶ sein muss; jedes R⁵ unabhängig Wasserstoff, C₁-C₄ Alkyl oder -(C₁-C₂ Alkyl)phenyl ist; jedes R⁶ unabhängig -OH oder C₁-C₄ Alkyl ist; X und Y jeweils unabhängig Wasserstoff sind oder unabhängig mit einem benachbarten X und Y verwendet werden können um eine zusätzliche Kohlenstoff-Kohlenstoff Bindung zu bilden; n 0 oder 1 ist; m eine ganze Zahl von 0 bis einschließlich 10 ist; p = 1 oder 2; r = 0 oder 1; w = 0 oder 1; mit der Bedingung, dass n nur dann 1 ist, wenn X und/oder Y eine zusätzliche Kohlenstoff-Kohlenstoff Bindung bilden und die Summe von r und w 0 oder 1 ist; R² und R⁴ unabhängig Wasserstoff oder Amino sind; R³ ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus C₁-C₄ Alkoxy, -OCH₂CO₂H, Hydroxy und Wasserstoff; mit der Bedingung, dass R² und R⁴ nicht beide Wasserstoff sein können aber eines von R² und R⁴ Wasserstoff sein muss; (ii) in Kontakt bringen des gereinigten Polyaza-Chelatierungsmittels mit Thiophosgen um ein Isothiocyanat-aktiviertes Polyaza-Chelatierungsmittel zu bilden und Gewinnen des Isothiocyanat aktivierten Polyaza-Chelatierungsmittels; und (iii) in Kontakt bringen des Isothiocyanat-aktivierten Polyaza-Chelatierungsmittels mit einem Protein um ein Chelatierungsmittel-Konjugat zu bilden.
Chelatierungsmittelkonjugat nach Anspruch 11, wobei das Chelatierungsmittelkonjugat weniger als ungefähr drei Prozent Aggregatbildung enthält wie durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie gemessen.
Chelatierungsmittelkonjugat umfassend ein Protein das an ein Chelatierungsmittel der Formel:
konjugiert ist, wobei: jedes Q unabhängig Wasserstoff, (CHR⁵)_pCO₂R; (CHR⁵)_pPO₃H₂ oder (CHR⁵)_pP(O)OHR⁶ ist; Q¹ Wasserstoff oder (CHR⁵)_wCO₂R ist; jedes R unabhängig Wasserstoff, Benzyl oder C₁-C₄ Alkyl ist; mit der Bedingung, dass mindestens zwei von allen Q und Q¹ von Wasserstoff verschieden sein müssen und mindestens ein Q (CHR⁵)_pP(O)OHR⁶ sein muss; jedes R⁵ unabhängig Wasserstoff, C₁-C₄ Alkyl oder -(C₁-C₂ Alkyl)phenyl ist; jedes R⁶ unabhängig -OH oder C₁-C₄ Alkyl ist; X und Y jeweils unabhängig Wasserstoff sind oder unabhängig mit einem benachbarten X und Y verwendet werden können um eine zusätzliche Kohlenstoff-Kohlenstoff Bindung zu bilden; n 0 oder 1 ist; m eine ganze Zahl von 0 bis einschließlich 10 ist; p = 1 oder 2; r = 0 oder 1; w = 0 oder 1; mit der Bedingung, dass n nur dann 1 ist, wenn X und/oder Y eine zusätzliche Kohlenstoff-Kohlenstoff Bindung bilden und die Summe von r und w 0 oder 1 ist; R² und R⁴ unabhängig Wasserstoff oder Amino sind; R³ ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus C₁-C₄ Alkoxy, -OCH₂CO₂H, Hydroxy und Wasserstoff; mit der Bedingung, dass R² und R⁴ nicht beide Wasserstoff sein können aber eines von R² und R⁴ Wasserstoff sein muss; wobei das Chelatierungsmittelkonjugat, nach Konjugation des Chelatierungsmittels an das Protein weniger als ungefähr drei Prozent Aggregatbildung enthält, wie durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie gemessen.
Chelatkonjugat umfassend ein Radionuclid, ein Chelatierungsmittel und ein Protein, wobei das Radionuclid durch das Chelatierungsmittel gebunden ist, das Chelatierungsmittel an das Protein konjugiert ist und das Chelatierungsmittel die Formel:
aufweist, wobei: jedes Q unabhängig Wasserstoff, (CHR⁵)_pCO₂R; (CHR⁵)_pPO₃H₂ oder (CHR⁵)_pP(O)OHR⁶ ist; Q¹ Wasserstoff oder (CHR⁵)_wCO₂R ist; jedes R unabhängig Wasserstoff, Benzyl oder C₁-C₄ Alkyl ist; mit der Bedingung, dass mindestens zwei von allen Q und Q¹ von Wasserstoff verschieden sein müssen und mindestens ein Q (CHR⁵)_pP(O)OHR⁶ sein muss; jedes R⁵ unabhängig Wasserstoff, C₁-C₄ Alkyl oder -(C₁-C₂ Alkyl)phenyl ist; jedes R⁶ unabhängig -OH oder C₁-C₄ Alkyl ist; X und Y jeweils unabhängig Wasserstoff sind oder unabhängig mit einem benachbarten X und Y verwendet werden können um eine zusätzliche Kohlenstoff-Kohlenstoff Bindung zu bilden; n 0 oder 1 ist; m eine ganze Zahl von 0 bis einschließlich 10 ist; p = 1 oder 2; r = 0 oder 1; w = 0 oder 1; mit der Bedingung, dass n nur dann 1 ist, wenn X und/oder Y eine zusätzliche Kohlenstoff-Kohlenstoff Bindung bilden und die Summe von r und w 0 oder 1 ist; R² und R⁴ unabhängig Wasserstoff oder Amino sind; R³ ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus C₁-C₄ Alkoxy, -OCH₂CO₂H, Hydroxy und Wasserstoff; mit der Bedingung, dass R² und R⁴ nicht beide Wasserstoff sein können aber eines von R² und R⁴ Wasserstoff sein muss; wobei das Chelatkonjugat, nach Konjugation des Chelatierungsmittels an das Protein weniger als ungefähr fünf Prozent Aggregatbildung enthält, wie durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie gemessen.
Chelatkonjugat nach Anspruch 14, wobei r 0 ist und jedes Q (CHR⁵)_pCO₂R ist.
Chelatkonjugat nach Anspruch 14, wobei das Chelatierungsmittel α-[2-(4-Aminophenyl)ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyclododekan-1,4,7,10-tetraessigsäure ist.
Chelatkonjugat nach Anspruch 14 wobei das Radionuclid ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, ¹⁷⁵Yb, ¹⁷⁷Lu, ¹⁵⁹Gd, ¹⁴⁰La, ¹⁴²Pr, ¹⁴⁹Pm, ⁹⁰Y Oder ¹¹¹In ist.
Chelatkonjugat nach Anspruch 17, wobei das Radionuclid ¹⁷⁷Lu ist.
Verfahren zur Herstellung eines Chelatierungsmittelkonjugats umfassend: (i) Reinigen eines Polyaza-Chelatierungsmittels durch Chromatographie an einer Kieselgelsäule, wobei das Kieselgel vor dem Laden des Polyaza-Chelatierungsmittls auf die Säule mit Säure gewaschen wurde, und das Polyaza-Chelatierungsmittel die Formel:
besitzt, wobei: jedes Q unabhängig Wasserstoff, (CHR⁵)_pCO₂R; (CHR⁵)_pPO₃H₂ oder (CHR⁵)_pP(O)OHR⁶ ist; Q¹ Wasserstoff oder (CHR⁵)_wCO₂R ist; jedes R unabhängig Wasserstoff, Benzyl oder C₁-C₄ Alkyl ist; mit der Bedingung, dass mindestens zwei von allen Q und Q¹ von Wasserstoff verschieden sein müssen und mindestens ein Q (CHR⁵)_pP(O)OHR⁶ sein muss; jedes R⁵ unabhängig Wasserstoff, C₁-C₄ Alkyl oder -(C₁-C₂ Alkyl)phenyl ist; jedes R⁶ unabhängig -OH oder C₁-C₄ Alkyl ist; X und Y jeweils unabhängig Wasserstoff sind oder unabhängig mit einem benachbarten X und Y verwendet werden können um eine zusätzliche Kohlenstoff-Kohlenstoff Bindung zu bilden; n 0 oder 1 ist; m eine ganze Zahl von 0 bis einschließlich 10 ist; p = 1 oder 2; r = 0 oder 1; w = 0 oder 1; mit der Bedingung, dass n nur dann 1 ist, wenn X und/oder Y eine zusätzliche Kohlenstoff-Kohlenstoff Bindung bilden und die Summe von r und w 0 oder 1 ist; R² und R⁴ unabhängig Wasserstoff oder Amino sind; R³ ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus C₁-C₄ Alkoxy, -OCH₂CO₂H, Hydroxy und Wasserstoff; mit der Bedingung, dass R² und R⁴ nicht beide Wasserstoff sein können aber eines von R² und R⁴ Wasserstoff sein muss; (ii) in Kontakt bringen des gereinigten Polyaza-Chelatierungsmittels mit Thiophosgen um ein Isothiocyanat aktiviertes Polyaza-Chelatierungsmittel zu bilden und Gewinnen des Isothiocyanat aktivierten Polyaza-Chelatierungsmittels; (iii) in Kontakt bringen des Isothiocyanat aktivierten Polyaza-Chelatierungsmittels mit einem Protein um ein Chelatierungsmittel-Konjugat zu bilden.
Chelatierungsmittelkonjugat umfassend ein Protein das an ein Chelatierungsmittel der Formel:
konjugiert ist, wobei: jedes Q unabhängig Wasserstoff, (CHR⁵)_pCO₂R; (CHR⁵)_pPO₃H₂ oder (CHR⁵)_pP(O)OHR⁶ ist; Q¹ Wasserstoff oder (CHR⁵)_wCO₂R ist; jedes R unabhängig Wasserstoff, Benzyl oder C₁-C₄ Alkyl ist; mit der Bedingung, dass mindestens zwei von allen Q und Q₁ von Wasserstoff verschieden sein müssen; jedes R⁵ unabhängig Wasserstoff, C₁-C₄ Alkyl oder -(C₁-C₂ Alkyl)phenyl ist; mit der Bedingung, dass mindestens ein R⁵ -(C₁-C₂ Alkyl)phenyl sein muss; jedes R⁶ unabhängig -OH oder C₁-C₄ Alkyl ist; X und Y jeweils unabhängig Wasserstoff sind oder unabhängig mit einem benachbarten X und Y verwendet werden können um eine zusätzliche Kohlenstoff-Kohlenstoff Bindung zu bilden; n 0 oder 1 ist; m eine ganze Zahl von 0 bis einschließlich 10 ist; p = 1 oder 2; r = 0 oder 1; w = 0 oder 1; mit der Bedingung, dass n nur dann 1 ist, wenn X und/oder Y eine zusätzliche Kohlenstoff-Kohlenstoff Bindung bilden und die Summe von r und w 0 oder 1 ist; R² und R⁴ unabhängig Wasserstoff oder Amino sind; R³ ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus C₁-C₄ Alkoxy, -OCH₂CO₂H, Hydroxy und Wasserstoff; mit der Bedingung, dass R² und R⁴ nicht beide Wasserstoff sein können aber eines von R² und R⁴ Wasserstoff sein muss; wobei das Chelatierungsmittelkonjugat nach Konjugation des Chelatierungsmittels an das Protein weniger als ungefähr drei Prozent Aggregatbildung enthält wie durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie gemessen.
Chelatkonjugat umfassend ein Radionuclid, ein Chelatierungsmittel und ein Protein, wobei das Radionuclid durch das Chelatierungsmittel gebunden ist, das Chelatierungsmittel an das Protein konjugiert ist und das Chelatierungsmittel die Formel:
aufweist, wobei: jedes Q unabhängig Wasserstoff, (CHR⁵)_pCO₂R; (CHR⁵)_pPO₃H₂ oder (CHR⁵)_pP(O)OHR⁶ ist; Q¹ Wasserstoff oder (CHR⁵)_wCO₂R ist; jedes R unabhängig Wasserstoff, Benzyl oder C₁-C₄ Alkyl ist; mit der Bedingung, dass mindestens zwei von der Summe von Q und Q¹ von Wasserstoff verschieden sein müssen; jedes R⁵ unabhängig Wasserstoff, C₁-C₄ Alkyl oder -(C₁-C₂ Alkyl)phenyl ist; mit der Bedingung, dass mindestens ein R⁵ -(C₁-C₂ Alkyl)phenyl sein muss; jedes R⁶ unabhängig -OH oder C₁-C₄ Alkyl ist; X und Y jeweils unabhängig Wasserstoff sind oder unabhängig mit einem benachbarten X und Y verwendet werden können um eine zusätzliche Kohlenstoff-Kohlenstoff Bindung zu bilden; n 0 oder 1 ist; m eine ganze Zahl von 0 bis einschließlich 10 ist; p = 1 oder 2; r = 0 oder 1; w = 0 oder 1; mit der Bedingung, dass n nur dann 1 ist, wenn X und/oder Y eine zusätzliche Kohlenstoff-Kohlenstoff Bindung bilden und die Summe von rund w 0 oder 1 ist; R² und R⁴ unabhängig Wasserstoff oder Amino sind; R³ ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus C₁-C₄ Alkoxy, -OCH₂CO₂H, Hydroxy und Wasserstoff; mit der Bedingung, dass R² und R⁴ nicht beide Wasserstoff sein können aber eines von R² und R⁴ Wasserstoff sein muss; wobei das Chelatkonjugat, bei Konjugation des Chelats an das Protein weniger als ungefähr drei Prozent Aggregatbildung enthält wie durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie gemessen.