DE3586188T2

DE3586188T2 - Antikoerper-metallionen-komplexe.

Info

Publication number: DE3586188T2
Application number: DE19853586188
Authority: DE
Inventors: Vernon Leon Alvarez; John Walter Frank Goers; Chyi Lee; Thomas Joseph Mckearn; John Dennis Rodwell; Richard Charles Siegel
Original assignee: Cytogen Corp
Current assignee: Cytogen Corp
Priority date: 1984-08-31
Filing date: 1985-08-29
Publication date: 1992-12-03
Anticipated expiration: 2005-08-30
Also published as: DK195186A; AU588832B2; WO1986001410A1; GR852111B; JPS62500119A; CA1260827A; DK195186D0; JPH0651720B2; AU4770185A; JPH06234800A; JPH0733399B2; DE3586188D1; EP0173629B1; EP0173629A1

Description

1. BEREICH DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das allgemeine Gebiet von Antikörpersystemen, die in der Lage sind, Metall-Ionen an Zielorte in vivo oder in vitro zu liefern. Bei Ausführungsarten, bei denen die Metall-Ione aus Radioisotopen oder einem anderen feststellbaren Ion bestehen, können die Antikörpersysteme aufgrund des mit dem Antikörper verbundenen Radioisotops oder anderen feststellbaren Ions identifiziert und/oder festgestellt werden. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf wasserlösliche Antikörperchelatmetall-Ionkomplexe, die Metall-Ione umfassen, welche durch koordinierte Bindung mittels einem kompatiblen Chelat mit einem Antikörpermolekül verbunden sind, das im wesentlichen die Immunisierungsspezifizität und Immunisierungsreaktivität des ursprünglichen Antikörpers behält. Die Erfindung bezieht sich auch auf mehrere Verfahren zur Bereitung solcher Antikörperchelatmetall-Ionkomplexe, sowie Antikörperchelatverbindungen, die bei der Bereitung solcher Komplexe nützlich sind.
Die Antikörperchelatmetall-Ionkomplexe der Erfindung können in einer Anzahl von Anwendungen in vitro oder in vivo Verwendung finden, die die Feststellung oder Lieferung eines gekennzeichneten Antikörpers oder eines Metall-Ions betreffen, einschliesslich, doch nicht beschränkt auf immunologische Proben, die Darstellung von spezifischem Gewebe und Lieferung von Metall-Ionen und/oder Radioisotopen an spezifische Gewebestellen.

2. VORGESCHICHTE DER ERFINDUNG

Einige Mittel sind als Trägermoleküle mit eingeschränktem Erfolg in den dargestellten Systemen verwendet worden.
In der Praxis sollte der Träger nicht-toxisch und der Zielort spezifisch sein. Im idealen Fall sollte ein Mechanismus für die Erhaltung der feststellbaren Verbindung oder Mittel am Zielort vorhanden sein.
Radiopharmazeutische Verfahren, die derzeit in nichteingreifenden Darstellungsverfahren in vivo verwendet werden, basieren auf der Fähigkeit seitens des Zielorgans, das radiopharmazeutische Label aus der Zirkulation zu entfernen. In diesen Verfahren werden verschiedene Substanzen bei der Lieferung radioaktiver Verbindungen an das gewünschte Ziel verwendet. Solche Substanzen beinhalten Substrate, Substratanaloge, Ligande, Hormone, Radionukleide, bifunktionale Chelate (Verbindungsgruppen, die ein Chelat an einem Ende enthalten, das zur Bindung eines Schwermetalls oder Radioisotops in der Lage ist, und einer reaktiven Gruppe am anderen Ende, die sich einer Zielzelle mittels Kovalenzbindung anhaften kann) und Liposome (Eckelman und Levanson, 1977, Intl. J. Appl. Radiat. Isot. 28:67-82).
Andere derzeit verfügbare nicht-eingreifende Verfahren sind die Emissionstomographie, die nukleare magnetische Resonanzdarstellung und die in vitro Spektroskopie. Ein Verfahren, bei dem Isothiozyanat als Koppelungsmittel eingesetzt wurde, wurde dazu benutzt, um fluoreszente Verbindungen an Antikörpermolekülen zwecks Verwendung in der fluoreszenten Mikroskopie zu befestigen ( Brandtzaeg, 1973, Scand. J. Immunol. 2: 273-290).

2.1 RADIOIMMUNISIERUNGSDARSTELLUNG UNTER VERWENDUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN

Monoklonale Antikörper, die in dem Hybridenverfahren von Kohler und Milstein (1975, Nature 256:495-497); 1976, Eur.J. Immunol. 6: 511-519) oder in verwandten Verfahren hergestellt wurden, stellen deutliche Vorteile bei der Verwendung als Träger für Darstellungssysteme dar. Erstens verbinden sich monoklonale Antikörper nur mit einer molekularen Stelle (z.B. einem Epitop) mittels spezifischer Verbindungskonstanten. Zweitens sind solche Antikörper homogen und können folglich relativ leicht gereinigt werden. Drittens können monoklonale Antikörper in grosser Zahl mittels besonderer Hybridenzellstämme hergestellt werden.
Die Entdeckung von durch Tumore produzierte oder mit Tumoren zusammenhängende Antigene hat die Bereitung monoklonaler Antikörper gestattet, die für dichte Tumore, wie z.B. menschliche Kolontumore, Brusttumore, Hepatomtumore, Melanome und Kleinzelltumore immunspezifisch sind (siehe Rezensionen von Carrasquillo et al., 1984, Cancer Treatment Repts. 68: 317-328; Kennel et al., 1984, Bio. Sci., 34: 150-156). Verfahren zur Feststellung und Lokalisierung von Tumoren sind entwickelt worden, wobei Antikörper oder Antikörperfragmente verwendet wurden, die für eine Vielfalt von Kategorien tumorassoziierter Antigene spezifisch sind, einschliesslich der folgenden: onkofötale Antigene, Plazentaantigene, onkogene oder tumor-virus- assoziierte Antigene, gewebe-assoziierte Antigene, organ-assoziierte Antigene, ektopische Hormone, normale Antigene und Abweicher derselben. Beispielsweise haben Goldenberg et al. die klinische Feststellung von Tumoren bei Menschen dargestellt, und zwar unter Verwendung von 131I-radiogekennzeichneten Antikörpern, die für das karzinoembryonische Antigen spezifisch sind (1978, New Engl. J. Med., 298:1384-1388; siehe auch Offenlegungen in U.S. Patent Nr. 4,331,647, Goldenberg erteilt, U.S. Patent Nr. 3,927,193, Hansen et al erteilt). In den von Goldenberg et al. angewandten Verfahren waren jedoch entweder die wiederholte Injektion anderer radioaktiver Stoffe oder die einzelne Injektion von Mischungen radioaktiver Antikörper zur Erzielung der ausreichenden Auflösung für die Unterscheidung von Tumoren und Bereichen,die nicht die Ziele waren, erforderlich.
Die Entwicklung monoklonaler Antikörper, spezifisch für Myosin, einer kontraktilen, proteinhaltigen Substanz, die für die im Kreislauf befindlichen Antikörper nach dem Herzzellentod oder -schaden zugängig ist, hat die Entwicklung von Verfahren gestattet, bei denen die Radioimmunisierungsdarstellung zur Lokalisierung und quantitativen Bestimmung von Myokardinfarkten eingesetzt wird (siehe U.S. Patent Nr. 4,036,945 -Haber). Strauss (1984, Diagnostic Imaging, Februar 1984, Seite 54) hebt die möglichen Verwendungen und potentiellen Probleme solcher Antikörper hervor.

2.2. DAS ANBRINGEN VON RADIOKENNZEICHNUNGEN

Eine Anzahl von Radioisotopen, einschliesslich ¹²&sup5; Jod, ¹³¹ Jod, ¹¹¹ Indium und &sup6;&sup7; Kupfer, wurden mit monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern zur Verwendung bei der Feststellung von Tumoren in vivo in Tiermodellen verbunden. Vincour (1984, Diagnostic Imaging, Feb. 1984, Seiten 56-61) bespricht die mit solchen radiogekennzeichneten Antikörpern erlebten Probleme, wobei er besonders die Notwendigkeit der Entwicklung von Radiolabeln vermerkt, die an das Antikörpermolekül (Id.at 57) fester angebracht werden.
Kürzlich haben Hnatowich et al. (1983, Science, 220: 613-615) und Powe et al. (1984, Cancer Drug Delivery 1: 125-135) ein Verfahren beschrieben, bei dem ¹¹¹ In mit Antikörpermolekülen oder -fragmenten verbunden wurde, unter Verwendung des wasserlöslichen zyklischen oder bizyklischen Anhydrids von diäthylentriaminpentaazetischer Säure (DTPA). In beiden diesen Hinweisen wurde der Antikörper mit dem wasserlöslichen Chelat DTPA mittels einer Azylierungsreaktion verbunden.
Das DE-A1-3239410 beschreibt die Radiokennzeichnung monoklonaler Antikörper oder Antikörperfragmente entweder direkt oder mittels chelatgebundenen Radionukleiden.
Die Verbindung der chelierten Gruppe mit dem Antikörper wurde durch die Koppelung an reaktive Gruppen auf dem polypeptiden Teil des Antikörpers erreicht. Solche Gruppen entstehen durch Zufall überall in dem polypeptiden Teil des Antikörpers. Als Folge ist die Modifizierung des Antikörpers deutlich weniger selektiv als das Verfahren der vorliegenden Erfindung.

2.3. RADIOIMMUNISIERUNGSDARSTELLUNGEN UND LOKALISIERUNG

Ein allgemeines Merkmal der in vivo Darstellungen des Standes der Technik, erzeugt entweder durch mit Antikörpern verbundene radioaktive Metallchelate oder ¹³¹ Jod, ist die ungezielte Lokalisierung in Organen, wie z.B. der Leber oder der Milz (oder der Schilddrüse im Falle von ¹³¹ I). Diese nicht-spezifische Lokalisierung ergibt sich bei Darstellungen, die die Lage, Orientierung oder Grösse des vorgesehenen Ziels nicht genau wiedergeben.
Häufig wird dies durch die "Hintergrundsubtraktion" der nicht-spezifisch lokalisierten Radioaktivität nicht adäquat kompensiert.

2.4. RADIOIMMUNISIERUNGSTHERAPIE

Die primären Unterscheidungen zwischen den bei der Radioimmunisierungsdarstellung und Radioimmunisierungstherapie verwendeten Stoffen bestehen aus der Menge und dem Typ der eingesetzten Strahlung. In einem therapeutischen Kontext wird die Strahlung zur Abtötung von Zielzellen eingesetzt, wobei eine minimale Toxizität den nicht avisierten Zellen zugefügt wird. Folglich besitzt die Strahlung idealerweise eine hohe Energie und eine kurze Reichweite im Gewebe. Da therapeutische Anwendungen Antikörperverbindungen umfassen, die für Zellen tödlich sind, stellt jede nicht-spezifische Lokalisierung ein ernstes Problem dar, das mit "Hintergrundsubtraktion" nicht kompensiert werden kann. Folglich können Produkte und Verfahren, die bei in vivo Darstellungen einen eingeschränkten Erfolg bedeuten, nicht für alle therapeutischen Anwendungen geeignet sein.

3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Nach den allgemeinen Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein Metall-Ion mit einem Antikörper oder Antikörperfragment, der oder das gegen ein Zielantigen gerichtet ist, verbunden. Die Verbindung wird durch die Verwendung von Chelaten (nämlich Verbindungen, die in der Lage sind, Elektronen zu spenden und sich mittels koordinierter Bindung mit einem Metall-Ion zu verbinden, und zwar zwecks Bildung von Strukturen, die Chelate oder Chelatkomplexe genannt werden) zwischen dem Metall-Ion und dem Antikörper zustandegebracht. Nach dem Zustandekommen der Antikörperchelatmetall-Ionkomplexe sollten nicht-spezifisch verbundene Metall-Ione entfernt werden. Nach der bevorzugten Ausführungsart der vorliegenden Erfindung wird die Entfernung nicht-spezifisch verbundener Metall-Ione von den Komplexen dadurch ausgeführt, dass ein Chromatographiesystem eines flüssigen Molekularsiebs von hochgradiger Wirkung verwendet wird. Dies erhöht die Präzision und Auflösung der bei der Verwendung der Komplexe in vivo erhaltenen Radiodarstellungen und bedeutet eine wesentliche Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik, bei dem weniger als 50% der Metall-Ione mit dem Chelatteil der Antikörperchelatverbindung spezifisch verbunden werden kann, und bei dem einige der Antikörper angehäuft werden können.
Ganz allgemein gesehen, wird durch die Erfindung die selektive Verbindung kompatibler Chelate an diejenigen Bereiche der Antikörper oder Antikörperfragmente vorgesehen, die weder Teil der antigenen Stelle des Moleküls, noch unmittelbar in diese involviert sind. Folglich, nach selektiver Verbindung eines kompatiblen Chelats mit einer dieser Stellen (die sich ausserhalb des antigenen Verbindungsbereichs befindet), besitzt die Antikörperverbindung im wesentlichen dieselbe Immunisierungsreaktivität und dieselbe Immunisierungsspezifizität, wie der nicht-gekoppelte Antikörper oder das nicht-gekoppelte Antikörperfragment.
In der vorliegenden Erfindung werden kompatible Chelate, die eine Amingruppe enthalten, welche aus der Gruppe, bestehend aus Primäramin-, Hydrazin-, Hydrazid-, Hydroxylamin-, Phenylhydrazin-, Semicarbazid- und Thiosemicarbazidgruppen selektiert werden, unmittelbar mit den oxydierten Kohlenhydratteilen der Antikörper oder Antikörperfragmente nach den hierin beschriebenen Verbindungsverfahren verbunden.
Die vorliegende Erfindung sieht eine Antikörperchelatverbindung vor, wie dies in einem jeden der Ansprüche 1 bis 6 beansprucht wird, und Antikörperchelatmetall- Ionkomplexe, wie dies in einem jeden der Ansprüche 7 bis 18 beansprucht wird, sowie eine Zusammensetzung für die therapeutische Behandlung von Zellerkrankungen, welche Zusammensetzung ein Antikörperchelatmetall-Ionkomplex umfasst, wie in Anspruch 19 beansprucht, und ein Verfahren zur Antigenprüfung, wie in Anspruch 20 beansprucht.

4. KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die Erfindung kann durch die nachfolgende Erläuterung der angefügten Zeichnungen umfassender verständlich gemacht werden:
Fig. 1 stellt das Entweichungsmuster von ¹¹¹ Indium- CYT-015-p-aminoanilin-diäthylentriaminpentaazetischer Säure (¹¹¹ In-CYT-015-ADTPA) auf Hochdruck-Flüssiggel- Penetrationschromatographie (siehe Abschnitt 6.2.2.) dar.
Fig. 2 verdeutlicht autoradiographische Darstellungen von nackten Brown Norway (BN) Mäusen mit Tumoren, denen ¹¹¹ Indiumgekennzeichneter Anti-Brown Norway (BN) Major- Histocompatibility-Complex (MHC), Antikörpermetall-Ionkomplex,¹¹¹ In-CYT-015-ADTPA injiziert wurde. Die Darstellungen A, B, C und D kamen jeweils 24, 24, 48 und 72 Stunden nach der Injektion zustande (siehe Abschn. 8.1.).
Fig. 3 verdeutlicht autoradiographische Darstellungen von nackten BN Kontrollmäusen mit Tumoren, denen ¹¹¹ Indium-gekennzeichneter anti-humaner MHC Antikörpermetall-Ionkomplex, ¹¹¹ In-CYT-012-ADTPA injiziert wurde. Die Darstellungen E und F kamen jeweils 24 und 72 Stunden nach der Injektion zustande (siehe Abschnitt 8.1.).
Fig. 4 verdeutlicht eine autoradiographische Darstellung von nackten Kontrollmäusen mit Tumoren, denen ¹¹¹ Indium-gekennzeichneter Anti-BN MHC Antikörpermetall-Ionkomplex, ¹¹¹ In-CYT-015-ADTPA injiziert wurde. Die Darstellungen G und H kamen jeweils 24 und 72 Stunden nach der Injektion zustande (siehe Abschn. 8.1.).
Fig. 5 demonstriert eine autoradiographische Darstellung einer Lewis-Ratte mit einer transplantierten BN X Lewis-Rattenniere, der ¹¹¹ Indium-gekennzeichneter Anti- BN-Antikörpermetall-Ionkomplex, ¹¹¹ In-CYT-015-ADTPA (Darstellung A) und dann 99m Technetium-DTPA (Darstellung B, siehe Abschnitt 8.2.) injiziert wurde.

5. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörpermetall- Ionkomplexe, welche durch die Verbindung eines Metall- Ions mit einem Antikörper oder Antikörperfragment hergestellt werden, die gegen ein Zielantigen gerichtet sind. Kompatible Chelate, die zur koordinierten Bindung mit einem Metall-Ion fähig sind, werden zur Verbindung des Metall-Ions mit dem Antikörper oder Antikörperfragment benutzt. Solche Chelate werden mit diesen Bereichen von Antikörpern oder Antikörperfragmenten, die nicht Teil der antigenen Stelle des Moleküls sind und auch mit dieser nicht unmittelbar involviert sind, selektiv verbunden.
Die Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur Bereitung von Antikörpermetall-Ionkomplexen die folgendes umfassen:
a) Die Reaktion eines Antikörpers oder Antikörperfragmentes mit einem Oxydationsmittel zur Bildung einer Aldehydgruppe im Kohlenhydratteil des Antikörpers oder Antikörperfragments.
b) Die Reaktion der Aldehydgruppe des sich ergebenden oxydierten Antikörpers oder Antikörperfragments mit einem kompatiblen, eine Amingruppe enthaltenden Chelat, selektiert aus der Gruppe, die aus Primäramin-, Hydrazin-, Hydrazid-, Hydroxylamin-, Phenylhydrazin-, Semicarbazid- und Thiosemicarbazidgruppen besteht, zur Bildung einer Antikörperchelatverbindung, die im wesentlichen dieselbe Immunisierungsreaktivität und Immunisierungsspezifizität, wie der nicht-gekoppelte Antikörper oder das nicht-gekoppelte Antikörperfragment, besitzt.
c) Die Kombinierung der Antikörperchelatverbindung mit einem Metall-Ion unter Bedingungen, welche die Chelierung des Metall-Ions mit dem Chelat der Antikörperchelatverbindung zur Bildung eines Antikörperchelatmetall-Ionkomplexes gestatten.
Unter bestimmten Bedingungen kann es wünschenswert sein, das oben beschriebene Verfahren zur Bereitung des Antikörperchelatmetall-Ionkomplexes in zwei Teile zu trennen. Im ersten Teil würde eine Antikörperchelatverbindung hergestellt werden, die als Zwischenform in der Herstellung des endgültigen Antikörperchelatmetall-Ionkomplexes angesehen wird. Solche Antikörperchelatverbindungen können zwecks späterer Kombination mit dem Metall- Ion von besonderem Interesse gelagert werden. Folglich würde der erste Teil des zweiteiligen Verfahrens die obengenannten Schritte a) und b) zur Bildung der Zwischenform der Antikörperchelatverbindung beinhalten. Der zweite Teil würde, möglicherweise zu einem späteren Zeitpunkt, die Zusammenfügung der Antikörperchelatverbindung mit einem Metall-Ion zur Herstellung des endgültigen Antikörperchelatmetall-Ionkomplexes beinhalten.
Derartige Antikörperchelatmetall-Ionkomplexe können auch mittels anderen Verfahren hergestellt werden, wie z.B. zuerst durch die koordinierte Bindung des kompatiblen Chelats an das Metall-Ion, und dann durch die Reaktion des Antikörpers oder Antikörperfragments mit dem Chelatmetall-Ionkomplex zur Bildung des Antikörperchelatmetall-Ionkomplexes. Folglich beinhaltet die Erfindung darüber hinaus ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörperchelatmetall-Ionkomplexes, das folgendes umfasst:
a) Die Reaktion eines Antikörpers oder Antikörperfragments mit einem Oxydationsmittel zur Bildung einer Aldehydgruppe im Kohlenhydratteil des Antikörpers oder Antikörperfragments.
b) Die Reaktion der Aldehydgruppe des sich ergebenden oxydierten Antikörpers oder Antikörperfragments mit einem Chelatmetall-Ionkomplex, wobei besagter Chelatmetall- Ionkomplex ein kompatibles Chelat umfasst, das eine Amingruppe enthält, die aus Primäramin-, Hydrazin-, Hydrazid-, Hydroxylamin-, Phenylhydrazin-, Semicarbazid- und Thiosemicarbazidgruppen selektiert wird, und zwar zur Bildung eines Antikörperchelatmetall-Ionkomplexes, der im wesentlichen dieselbe Immunisierungsreaktivität und dieselbe Immunisierungsspezifizität, wie der nicht-gekoppelte Antikörper oder das nicht-gekoppelte Antikörperfragment, besitzt.
In dieser Ausführungsart ist das kompatible Chelat mit dem Metall-Ion vor der Kovalenzbindung des Chelats mit dem Antikörper oder Antikörperfragment koordiniert verbunden.
Die Erfindung richtet sich auch auf Zwischenformen und endgültige Produkte der oben beschriebenen Verfahren. Spezifischerweise richtet sich diese Erfindung auf Antikörperchelatverbindungen, die ein kompatibles Chelat umfassen, das mittels Kovalenzbindung mit einem Kohlenhydratteil eines oxydierten Antikörpers oder Antikörperfragments verbunden ist, wobei die besagte Antikörperchelatverbindung im wesentlichen dieselbe Immunisierungsreaktivität und dieselbe Immunisierungsspezifizität, wie der nicht-gekoppelte Antikörper oder das nicht-gekoppelte Antikörperfragment, besitzt. Zusätzlich betrifft die Erfindung Antikörpermetall-Ionkomplexe, die eine Antikörperchelatverbindung umfassen, welche ein kompatibles Chelat umfasst, das mittels Kovalenzbindung mit einem Kohlenhydratteil eines oxydierten Antikörpers oder Antikörperfragments verbunden ist, wobei besagte Antikörperchelatverbindung mittels besagtem kompatiblen Chelat an ein Metall-Ion zur Bildung eines Antikörperchelatmetall-Ionkomplexes koordiniert gebunden ist, der im wesentlichen dieselbe Immunisierungsreaktivität und dieselbe Immunisierungsspezifizität, wie der nicht-gekoppelte Antikörper oder das nicht-gekoppelte Antikörperfragment, besitzt.
Unabhängig von dem Verfahren, das zur Herstellung der Antikörperchelatmetall-Ionkomplexe der Erfindung angewandt wird, wurde festgestellt, dass verbesserte Ergebnisse für die sich besonders in vivo ergebenden Verwendungsbereiche erzielt werden können, wenn die Komplexe zur Trennung der Antikörperchelatmetall-Ionkomplexe von nicht-chelatierter Metall-Ione zwecks Erzielung von Antikörperchelatmetall-Ionkomplexe gereinigt werden, die im wesentlichen frei von nicht-chelatierten Metall-Ionen sind."Im wesentlichen frei" von nicht-chelatierten Metall-Ionen bedeutet mindestens etwa 80-90 Prozent frei von solchen Ionen. Genauer ausgedrückt, enthalten die gereinigten Komplexe der Erfindung Metall-Ion, das für das Chelat chelatiert ist, sie sind jedoch im wesentlichen frei von Metall-Ion, das zufällig mit dem Antikörper verbunden ist, d.h. Metall-Ion, das mit dem Antikörperprotein oder -kohlenhydrat assoziiert und nicht mit dem Chelat verbunden ist. Die Reinigung kann mittels jedem geeigneten Reinigungsverfahren erfolgen, einschliesslich, doch nicht beschränkt auf hochwirksame Flüssiggel- Penetrationschromatographie.
Diese Reinigungsphase hat den zusätzlichen Vorteil, dass unerwünschte Ansammlungen von Antikörpern vor der Anwendung entfernt werden. Alle solche Antikörperansammlungen oder denaturierte Antikörper würden von dem retikuloendothelialen System zur Entfernung erfasst werden, und dieser Transport, weg von dem Zielort oder darzustellenden spezifischen Gewebe, würde den Lokalisierungsgrad oder die Qualität der Darstellung vermindern.
Die Antikörperchelatmetall-Ionkomplexe der Erfindung sind für die hochrangige Auflösung des in vivo darzustellenden Gewebes in idealer Weise geeignet. Diese Darstellung von spezifischem Gewebe beinhaltet die Verabreichung einer effektiven Menge eines Antikörperchelatmetall-Ionkomplexes an einen Menschen, wobei der besagte Antikörperchelatmetall-Ionkomplex immunisierungsreaktiv mit und immunisierungsspezifisch für einen antigenen Determinanten von besagtem spezifischen Gewebe ist und im wesentlichen nicht-immunisierungsreaktiv mit und nicht-immunisierungsspezifisch für nicht-spezifisches Gewebe ist, und der besagte antigene Determinant wird in wesentlicher Menge in nicht-spezifischem Gewebe nicht aufgefunden. Wie in den folgenden Beispielen demonstriert, kann dieses Verfahren zur Lokalisierung von spezifischem Gewebe mit einem Mindestmass an "Hintergrund"-Zerstreuung von Metall- Ion angewandt werden.
Weitere in vivo Anwendungen des Antikörperchelatmetall- Ionkomplexes der Erfindung schliessen die therapeutische Behandlung von Zellerkrankungen mit ein. Solche Verfahren umfassen die Verabreichung einer therapeutisch effektiven Menge eines Antikörperchelatmetall-Ionkomplexes der Erfindung, wobei der Antikörperchelatmetall-Ionkomplex immunisierungsreaktiv mit und immunisierungsspezifisch für einen Zielort ist, der mit besagter Zellerkrankung assoziiert wird, und im wesentlichen nicht-immunisierungsreaktiv mit und nicht-immunisierungsspezifisch für Gewebe ist, das mit besagter Zellerkrankung nicht assoziiert wird, und wobei das Metall-Ion zytotoxische Betapartikel oder Alphapartikel ausstrahlt.
Schliesslich können die Komplexe dieser Erfindung (nachstehend als Antikörperchelatmetall-Ionkomplexe abgekürzt) auch in Verfahren zum Testen von Antigen verwendet werden, das z.B. folgendes beinhaltet: a) Die Vermischung eines Antikörpermetall-Ionkomplexes mit einer Probe, bei der das Vorhandensein eines speziellen Antigens vermutet wird, wobei der Antikörperchelatmetall-Ionkomplex immunisierungsreaktiv mit und immunisierungsspezifisch für besagtes Antigen ist; und b) die Feststellung jeglicher Wechselwirkung von besagtem Antikörperchelatmetall- Ionkomplex mit einem Antigen in der Probe.

5.1. ANTIKÖRPER

Nach der vorliegenden Erfindung können Antikörper benutzt werden, die sich gegen jegliches Antigen oder Halbantigen richten. Obgleich konventionelle Antikörper (Antisera) benutzt werden können, bieten monoklonale Antikörper einige Vorteile. Jeder monoklonale Antikörper ist spezifisch für einen antigenen Determinanten. Zusätzlich können grosse Mengen eines jeden monoklonalen Antikörpers hergestellt werden.
Die in der vorliegenden Erfindung benutzten Antikörper können gegen jedes Ziel gerichtet werden, z.B. gegen Tumorantigene, bakterielle, pilzartige, virusartige, parasitäre, mykoplasmale, histokompatibilitäre, Differenzierungs- und andere Zellmembranantigene, pathogene Oberflächenantigene, Toxine, Enzyme, Allergene, Medikamente und alle biologisch aktiven Moleküle.
Medikamente von besonderem Interesse sind Opioide, Amphetamine, Barbiturate, Steroide, Katecholamine, Dilantine, Theophylline, Histamine, Kannabinoide und ähnliche. Für eine mehr umfassende Aufzählung von Antigenen, siehe U.S. Patent Nr. 4,193,983, speziell die Rubriken 7 bis 11, wobei auf diese Patentschrift als Bestandteil hierin bezug genommen wird. Falls die Darstellung der Erkrankung oder Störung des Herz- und Gefäßsystems nach, zum Beispiel, einem Myokardinfarkt erwünscht wird, können Antikörper verwendet werden, die sich gegen Myosin oder ein anderes Herz-Zytosolprotein richten. Zusätzlich kann eine Kombination von Antikörpern verwendet werden, die auf verschiedene antigene Determinanten reagieren. Immunoglobuline, die als Träger Verwendung finden, sind u.a. bestimmte Klassen von IgA, IgD, IgE, IgM; bestimmte Klassen von IgG; oder bestimmte Fragmente von Immunoglobulinen, z.B. Halbantikörpermoleküle (ein einziges schwer: leichtes Kettenpaar) oder Fab-, Fab'- oder (Fab')&sub2;-Fragmente.
Die Verwendung von Antikörperfragmenten kann für die Darstellungssysteme von Geweben vorteilhaft sein, weil diese Antikörperfragmente in zunehmendem Masse Zielorte durchdringen. Die Fab'-Fragmente von IgG-Immunoglobulinen werden gewonnen, indem das Antikörpermolekül mit Pepsin gespalten wird (was ein bivalentes Fragment (Fab')&sub2; ergibt), oder mit Papain (was zwei univalente Fragmente 2 Fab, ergibt). Parham, 1983, J. Immunol. 131:2895-2902; Lamoyi und Nisonoff, 1983, J. Immunol. Meth. 56: 235-243. Das bivalente (Fab')&sub2;-Fragment kann durch sanfte Reduktion einer oder weniger Disulfidbindungen zwecks Gewinnung univalenter Fab'-Fragmente gespalten werden. Die Fab- und (Fab')&sub2;-Fragmente sind kleiner als ein ganzes Antikörpermolekül, und folglich durchdringen sie einen Zielort oder Gewebe leichter. Dies kann ein Vorteil bei der Darstellung in vivo sein, da Verbindungen die in vivo Stellen leichter penetrieren (z.B. Tumormassen, Infektionsherde, usw.). Ein zusätzlicher Vorteil entsteht bei der Verwendung von Verbindungen, die mit Antikörperfragmenten gebildet werden, denn diese Fragmente überqueren eine plazentare Barriere nicht. Als Ergebnis der Verwendung dieser Ausführungsform der Erfindung kann eine in vivo Stelle (z.B. ein Tumor) in einer schwangeren Frau dargestellt werden, ohne dass der Fötus der Darstellungszusammensetzung ausgesetzt wird.

5.2. KOMPATIBLE CHELATE

Wie hierin verwendet, bedeutet die Bezeichnung "kompatibles Chelat" eine Zusammensetzung, die a) fähig ist, Elektronen abzugeben und sie durch koordinierte Bindung zwecks Bildung von Strukturen, genannt Chelate oder Chelatkomplexe, mit einem Metall-Ion zu verbinden, und b) zur Verbindung mit einem Antikörper oder Antikörperfragment geeignet ist, und zwar ohne Verlust der Fähigkeit zur Chelatierung von Metall-Ionen oder Zerstörung der Immunisierungsreaktivität oder der Immunisierungsspezifizität des Antikörpers oder Antikörperfragments. Falls erforderlich, können Derivate bekannter Chelate synthetisch hergestellt werden, so dass das Produkt ein kompatibles Chelat ist, welches für die Verbindung mit Antikörpern oder Antikörperfragmenten mittels Verfahren der Erfindung geeignet ist.
Von zusätzlichem Interesse sind kompatible Chelate, die multiple Stellen für die Chelierung von Metall- Ionen aufweisen. Bei kompatiblen Chelaten mit multiplen Stellen wurde eine einzige Kovalenzbindung an einen Antikörper oder Antikörperfragment eine Verbindung ergeben, die zur Bindung von Metall-Ion an eine Anzahl von Stellen in der Lage ist. Radioaktive Komplexe solcher Verbindungen besässen eine hohe spezifische Radioaktivität, d.h. eine hohe Radioaktivität pro Antikörpermolekül.
Andererseits kann eine höhere spezifische Radioaktivität (oder höheres Verhältnis von Metall-Ion zu Antikörpermolekül) durch die Verbindung einer einzigen kompatiblen Chelatstelle mit einer Mehrzahl von Stellen des Antikörpers oder Antikörperfragments erreicht werden.
Diese Mehrzahl von Stellen kann durch eine von zwei Verfahren in den Antikörper oder das Antikörperfragment eingeführt werden. Erstens kann man multiple Aldehydgruppen in demselben Antikörpermolekül generieren. Zweitens kann man an Aldehyd des Antikörpermoleküls ein "verzweigtes Bindeglied" mit multiplen funktionellen Stellen für die spätere Verbindung mit kompatiblen Chelaten anfügen. Die funktionellen Stellen des verzweigten Bindeglieds können Aldehydgruppen oder eine andere chemische Stelle sein, mit denen kompatible Chelate verbunden werden können. Noch höhere spezifische Radio-aktivitäten können erzielt werden, indem diese zwei Schritte zu kombinieren sind, d.h. durch die Verbindung kompatibler Chelate mit multiplen Stellen an verschiedene Stellen des Antikörpers oder Antikörperfragments.
Anschliessend werden einige bedeutsame kompatible Chelatklassen, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, aufgeführt. Kompatible Chelate sind (ohne, dass sie darauf beschränkt sind) Derivate von diäthylentriaminpentaazetischer Säure, äthylendiamintetraazetischer Säure (EDTA), dimercaptosuzzinischer Säure, 2,3-dimercaptopropansulfonischer Säure, Metallothionein und Kryptaten, wie kürzlich beschrieben von Gansow et al. (1981, J. Heterocyclic Chem. 18:297).

5.2.1. KOMPATIBLE CHELATE ZUR KOHLENHYDRATVERBINDUNG

Wie zuvor erläutert, werden kompatible Chelate dazu verwendet, Metall-Ione mit Antikörpermolekülen zu verbinden. Nach der vorliegenden Erfindung beinhalten geeignete kompatible Chelate zur Reaktion mit oxydierten Antikörpern oder oxydierten Antikörperfragmenten diejenigen, die ein Amin enthalten, welches aus der Gruppe selektiert wird, die aus Primäramin-, Hydrazin-, Hydrazid-, Hydroxylamin-, Phenylhydrazin-, Semicarbazid- und Thiosemicarabzidgruppen besteht.
Solche reaktiven, funktionellen Gruppen können als Teil der Struktur des Chelats existieren, oder sie können durch geeignete Chemie bei den Chelaten eingeführt werden, die solche Gruppen nicht enthalten.
Beispielsweise fehlt bei diäthylentriaminpentaazetischer Säure (DTPA) die geeignete Amingruppe zur leichten Verbindung mit oxydiertem Kohlenhydrat. Durch die chemische Modifizierung kann jedoch eine Vielzahl geeigneter Derivate produziert werden, wie z.B. Amin enthaltende Derivate von gemischten Anhydraten von DTPA, inklusive, aber nicht beschränkt auf P-Aminanilin-DTPA, Phenylhydrazid-DTPA, Hydrazid-DTPA, Hydroxylamin-DTPA, Semicarbazid-DTPA, Thiosemicarbazid-DTPA, Polyäthylenimin- DTPA, P-Phenylendiamin-DTPA, DTPA-Mono-[(4-Aminophenyl) Methyl]-Amid und Aminsäure enthaltende Derivate von DTPA, einschliesslich,aber nicht beschränkt auf α-N- DTPA-L-Lysin, Glykyl-Tyrosyl-Lysin-DTPA und L-Lysin- Benzyl-Ester-DTPA.

5.3. VERFAHREN ZUR BINDUNG VON ANTIKÖRPERN UND ANTIKÖRPERFRAGMENTEN

Nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein kompatibles Chelat (oder kompatibler Chelatmetall-Ionkomplex) mit einem Antikörper verbunden, der gegen ein Zielantigen gerichtet ist, und zwar mittels Bindung an die Kohlenhydratteile des Antikörpers oder Antikörperfragments.
Die Verbindung muss die Merkmale des Antikörpers oder Antikörperfragments, wie z.B. die Immunisierungsspezifizität und Immunisierungsreaktivität, nicht wesentlich verändern. Zusätzliche Überlegungen schliessen die Einfachheit der Reaktion und Stabilität der hergestellten Antikörperverbindung mit ein.

5.3.1. BINDUNG MIT OXYDIERTEN KOHLENHYDRATTEILEN

Glykoproteine sind biologisch wichtige Makromoleküle, die strukturelle Merkmale teilen, einschliesslich Kohlenhydratrückstände mit einer Kovalenzbindung an ein Polypeptidrückgrat. Da Antikörper Glykoproteine sind, können Verbindungen an den Kohlenhydratteil des Moleküls angefügt werden. Einige der Kohlenhydratteile befinden sich auf dem Fc-Gebiet des Immunoglobulins und sind für das Zustandekommen der C1-Bindung erforderlich. Der Kohlenhydratteil des Fc-Gebiets eines Immunoglobulins kann in der hierin beschriebenen Weise verwendet werden. Alternativ gesehen, können die Fab- oder Fab'-Fragmente eines jeden Immunoglobulins, die Kohlenhydratteile enthalten, nach dem hierin beschriebenen Reaktionsschema verwendet werden. Ein Beispiel für ein solches Immunoglobulin ist das menschliche IgM, aufgeführt von Putnam et al., (1973, Science 182: 287).
Wie nachfolgend ausführlich dargestellt, können die Kohlenhydratnebenketten von Antikörpern oder Fab- oder Fab'-Fragmenten zur Erzeugung von Aldehyden selektiv oxydiert werden. Die sich ergebenden Aldehyde können dann mit Amingruppen reagiert werden,(z.B. Ammoniakderivate, d.h. ein Primäramin, Hydroxylamin, Hydrazin, Hydrazid, Phenylhydrazin, Semicarbazid oder Thiosemicarbazid) zur Bildung einer Schiffschen Basis oder reduzierten Schiffschen Basis (z.B. Imin, Enamin, Oxim, Hydrazon, Phenylhydrazon, Semicarbazon oder Thiosemicarbazon, oder reduzierte Formen derselben).
Alternativ dazu kann der Kohlenhydratteil des Antikörpers mittels enzymatischen Techniken modifiziert werden, damit die Bindung an oder Reaktion mit anderen chemischen Gruppen möglich wird. Ein Beispiel für ein solches Enzym ist die Galaktoseoxydase, wobei Galaktose mit Sauerstoff zur Bildung eines Aldehyds oxydiert wird.

5.3.1.1. CHEMISCHE VERFAHREN DER OXYDATION

Die Oxydation des Kohlenhydratanteils oder -teils von Antikörpermolekülen führt zur Formation von Aldehydgruppen. Eine Verschiedenartigkeit von Oxydationsmitteln kann verwendet werden, z.B. Perjodsäure, Paraperjodsäure, Natrium-Metaperjodat und Kalium-Metaperjodat. Von diesen werden Sauerstoffsäuren und Salze derselben bevorzugt, da sekundäre oder unerwünschte Nebenwirkungen seltener vorkommen. Zur allgemeinen Diskussion, siehe Jackson, 1944, Organic Reactions 2, Seite 341; Bunton, 1965, Oxidation in Organic Chemistry, Band 1, (Wiberg, Hrsg.), Academic Press, New York, Seite 367.
Die Oxydation von Antikörpern mit diesen Oxydationsmitteln kann mittels bekannter Verfahren erfolgen. Bei der Oxydation wird der Antikörper allgemein in Form einer wässrigen Lösung verwendet, wobei die Konzentration im allgemeinen weniger als 100 mg/ml, vorzugsweise 1 bis 20 mg/ml beträgt. Wenn eine Sauerstoffsäure oder Salz derselben als Oxydationsmittel verwendet wird, wird sie allgemein in Form einer wässrigen Lösung verwendet und die Konzentration beträgt generell 0,001 bis 10 mM, vorzugsweise 1,0 bis 10 mM. Die Menge der Sauerstoffsäure oder Salz derselben richtet sich nach der Art des Antikörpers, doch wird sie generell überreichlich verwendet, z.B. zwei- oder zehnmal so viel, wie das oxydierbare Kohlenhydrat. Die optimale Menge kann jedoch im Routineexperiment festgestellt werden.
Im Prozess der Oxydation von Antikörpern mit Sauerstoffsäuren oder Salze derselben liegen die wahlweisen Bereiche bei einem pH-Wert von ca. 4 bis 8, einer Temperatur von 0 bis 37 ºC, und einem Reaktionszeitraum von ca. 15 Minuten bis 12 Stunden.
Während der Oxydation des Glykoproteins mit einer Sauerstoffsäure oder Salz derselben, wird das Licht vorzugsweise ausgeschlossen, damit eine Überoxydation des Glykoproteins vermieden wird.

5.3.1.2. ENZYMATISCHE VERFAHREN DER OXYDATION

Die Oxydation des Kohlenhydratanteils von Antikörpermolekülen kann auch mit dem Enzym, der Galaktoseoxydase erfolgen (Cooper et al., 1959, J. Biol. Chem. 234: 445-448). Der Antikörper wird in wässriger Lösung verwendet, wobei die Konzentration allgemein 0,5 bis 20 mg/ml beträgt. Das Enzym wird generell bei ca. 5 bis 100 Einheiten pro ml Lösung, bei einem pH-Wert von etwa 5,5 bis etwa 8,0 verwendet. Der Einfluss des pH-Wertes, der Substratkonzentration, der Puffer und Pufferkonzentrationen auf die Enzymreaktion, wird in Cooper et al., supra, berichtet.

5.3.1.3. BEREITUNG VON ANTIKÖRPERCHELATVERBINDUNGEN

Die Antikörperchelatverbindungen der Erfindung (oder Antikörpermetallkomplexe, wenn vor-chelatiertes Metall- Ion mit dem Chelat vor der Reaktion des Chelats mit Antikörpern verbunden wird) können produziert werden, indem der oxydierte Antikörper mit einem kompatiblen Chelat reagiert wird, das eine verfügbare Amingruppe besitzt, selektiert aus der Gruppe, die aus Primäramin-, Hydrazin-, Hydrazid-, Hydroxylamin-, Phenylhydrazin-, Semicarbazid- und Thiosemicarbazidgruppen besteht. Die sich unmittelbar ergebenden Produkte (Antikörperchelatverbindungen oder Antikörpermetall- Ionkomplexe) enthalten eine Kohlenstoff-Nitrogen- Doppelbindung, die sich aus der Eliminierung eines Moleküls aus Wasser aus den ursprünglichen Zusatzprodukten ergibt:
Antikörper-CH=O+NH&sub2;-R T Antikörper-CH=N-R+H&sub2;O.
Zur weiteren Diskussion der Reaktion von Aldehyden mit Hydraziden, siehe March, 1978, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure, McGraw- Hill Co., New York, Seiten 824-825.
Eine Lösung des oxydierten Antikörpers, bei einer Konzentration von ca. 0,5 bis 20 mg/ml,wird mit dem kompatiblen Chelat (Molarratio der reaktiven Chelatgruppe zu Antikörperaldehyd von ca. 1 bis ca. 10 000) und der Lösung, inkubiert für die Dauer von ca. 1 bis 18 Stunden, gemischt. Geeignete Temperaturen sind von 0 bis 37 ºC, und der pH-Wert kann von ca. 6 bis 8 betragen.

5.3.1.4. STABILISIERUNGEN DER ANTIKÖRPERCHELATVERBINDUNGEN

Nachdem die Antikörperchelatverbindungen (oder Antikörpermetall-Ionkomplexe) zwischen dem Antikörper und einem kompatiblen Chelat, wie in Abschnitt 5.3.1.3. beschrieben, gebildet wurden, können sie mit einem geeigneten Reduzierungsmittel, wie z.B. Natrium-Cyanborhydrid oder Natriumborhydrid optimal stabilisiert werden:
Antikörper-CH=N-R Reduzierungsmittel
Antikörper-CH&sub2;-NH-R.
Das Reduzierungsmittel wird generell einem Molarexzess von zwischen 10 bis 100 Faltmolarexzessen über verfügbare Aldehydgruppen zugefügt. Zur allgemeinen Diskussion, siehe Jentoft und Dearborn, 1979, J.Biol. Chem. 254: 4359.

5.4. BEREITUNG VON KOMPLEXEN

Chelatmetall-Ionkomplexe können bereitet werden, indem das Metall-Ion dem Chelat direkt zugefügt wird. Die konventionellen Verfahren der Hinzufügung von Metall-Ionen zu Chelaten können zur Erreichung der Bindung an das Chelat angewandt werden. Zum Beispiel kann ¹¹¹ Indium (¹¹¹In) einer wasserlöslichen Chelatzusammensetzung durch die Inkubation von ¹¹¹ In-Cl&sub3; in Natriumazetat mit dem Chelat beigefügt werden, nämlich für die Dauer einer Stunde bei 37ºC.
Wie zuvor erläutert, kann nach der vorliegenden Erfindung das Metall-Ion mit dem Chelat verbunden werden, und zwar entweder vor oder nachdem das Chelat mit dem Antikörpermolekül verbunden wird. Welches Verbindungsverfahren auch immer gewählt wird, kann es für viele Anwendungsarten bedeutsam sein, dass jedes Metall- Ion, das nicht spezifisch mit der Chelatzusammensetzung verbunden ist, ehe die Komplexe besonders in vivo verwendet werden, entfernt wird. Nach der bevorzugten Ausführungsart wird das nicht-spezifisch verbundene Metall- Ion entfernt, indem ein hochwirksames flüssiges Molekular- Sieb-Chromatographieverfahren angewandt wird.
Bei Feststellungssystemen in vitro, z.B. verbesserte immunradiometrische Prüfungsverfahren, kann das Antikörpermolekül oder Antikörperfragment mit einem kompatiblen Chelat nach den hierin beschriebenen Verfahren verbunden werden, und die Antikörperchelat-Verbindungszwischenmittel können, falls erforderlich, gereinigt und im gefrorenen Zustand bei -20 ºC bis zur Verwendung gelagert werden. Das Metall-Ion kann dann mit der Antikörperchelatverbindung verbunden werden. Zum Beispiel kann ¹¹¹ Indium mittels Inkubation von ¹¹¹ In-Cl&sub3; mit der Antikörperchelatverbindung in einem Azetatpuffer, pH- Wert 6,0, bei 37ºC für die Dauer von 1 Stunde, verbunden werden. Solches Verbindungsverfahren gestattet günstigerweise die Reinigung des Antikörperchelat-Zwischenmittels, ohne dass die damit befasste Person exzessiv der Handhabung radioaktiven Materials ausgesetzt wird, und ohne die Erfordernis der Langzeitlagerung von Radioisotopen im Arbeitsbereich.

5.5. VERWENDUNGSARTEN VON ANTIKÖRPERMETALL-IONKOMPLEXEN

Die Antikörpermetall-Ionkomplexe der Erfindung sind in einer Vielfalt therapeutischer und diagnostischer Anwendungen in vitro und in vivo nützlich.
In diesen Anwendungsbereichen schliesst der Ausdruck "Zellerkrankung" durchweg alle Neoplasmen mit ein, einschliesslich Krebsen, Adenomen und Hyperplasien; bestimmte immunologische Erkrankungen, einschliesslich Autoimmunerkrankungen, Transplantat-versus-Wirt-Erkrankungen (z.B. nach Knochenmarktransplantationen), Immunhemmungserkrankungen (z.B. nach Nieren- oder Knochenmarktransplantation). Die Behandlung solcher Zellerkrankungen, die z.B. eine Knochenmarktransplantation beinhalten, kann die Säuberung (durch Abtöten) von unerwünschten Zellen, etwa maligne Zellen oder reife T-Lymphozyten, mit einschliessen.

5.5.1. THERAPIEN IN VIVO

Therapeutische Anwendungen werden allgemein auf die Behandlung verschiedener zellularer Erkrankungen konzentriert, einschliesslich derjenigen, die oben ausführlich beschrieben wurden, und zwar durch die Verabreichung einer effektiven Menge des Antimetall-Ionkomplexes der Erfindung. Die Eigenschaften des Antikörpers in bezug auf die Immunisierungsspezifizität für ein und Immunisierungsreaktivität mit einem besonderen Antigen, machen es auf ideale Weise geeignet für die Lieferung von Metall-Ionen an spezifischen Zellen, Geweben Organen oder anderen, mit dem besonderen Antigen ausgestatteten Stellen.
Angesichts dieses Aspektes der Erfindung funktioniert der Antikörper oder das Antikörperfragment des Antikörpermetall-Ionkomplexes, damit er den Komplex an den Zielort liefert, an dem das Metall-Ion, das für seine zelltötende Eigenschaften gewählt wurde, in der Lage ist, die näher gelegenen Zellen zu vernichten. Geeignete betaausstrahlende Ione für den therapeutischen Gebrauch enthalten folgendes: &sup4;&sup6;Scandium, &sup4;&sup7;Scandium, &sup4;&sup8;Scandium, &sup7;²Gallium und &sup7;³Gallium. Geeignete alpha-ausstrahlende Metall-Ione enthalten diejenigen mit einem relativ kurzen Halbzeitleben von etwa vier Tagen oder weniger, einschliesslich ²¹¹Wismut, ²¹²Wismut, ²¹³Wismut, und ²¹&sup4;Wismut, wobei ²¹²Wismut bevorzugt wird.
Die Anwendung in vivo kann die Benutzung pharmazeutischer Zusammensetzungen des Antikörpermetall-Ionkomplexes in jedem geeigneten Träger umfassen, einschliesslich von Serum oder physiologischer Kochsalzlösung, mit oder ohne einem weiteren Protein, wie z.B. dem menschlichen Serumalbumin. Die Dosierung der Komplexe kann von einer Person, vertraut mit den üblichen Fertigkeiten, leicht festgestellt werden und kann nach der Art der Zellerkrankung und dem verwendeten Metall- Ion unterschiedlich sein. Die Anwendungsweise kann parenteral sein, wobei die intravenöse Verabreichung allgemein vorgezogen wird.

5.5.2. DIAGNOSTIK IN VIVO

Diagnostische Anwendungen in vivo beinhalten die Darstellung spezifischer Gewebe- oder Zellerkrankungen durch Verabreichung einer ausreichenden Menge der Antikörpermetall-Ionkomplexe der Erfindung, so dass die Komplexe in der Lage sind, sich innerhalb des geeigneten Zeitraumes am Gewebe zu lokalisieren. Die Dosierung und anderen Aspekte der Verabreichung des Komplexes in vivo werden allgemein in dem vorangehenden Abschnitt dargelegt.
Eine breitgefächerte Vielfalt von Metall-Ionen für die Darstellung des Gewebes in vivo wurde getestet und klinisch verwendet. Bei der Darstellung mit Radioisotopen sind die folgenden Merkmale allgemein anerkannt als erwünscht und/oder erfolgreich: a) eine niedrige Strahlendosis für den Patienten; b) hohes Photonergebnis, das die Ausführung eines nuklearen medizinischen Vorgangs innerhalb eines kurzen Zeitraumes gestattet; c) die Möglichkeit der Produzierung in ausreichenden Mengen; d) annehmbare Kosten; e) einfache Vorbereitung der Anwendung; und f) keine Veranlassung für die anschliessende Isolierung des Patienten. Diese Merkmale lassen sich allgemein wie folgt übersetzen: a) die Strahlendosis für das kritischste Organ beträgt weniger als 5 rad; b) eine einzige Darstellung kann in einigen Stunden erhalten werden; c) der Radioisotop zerfällt durch die Emission eines Partikels nicht (z.B. β- oder β+) ; d) das Isotop kann leicht festgestellt werden; und e) die Halblebenszeit beträgt weniger als vier Tage. (Lamb und Kramer, "Commercial Production of Radioisotopes for Nuclear Medicine", in Radiotracers for Medical Applications, Band 1, Rayudu (Hrsg.), CRC Press, Inc., Boca Raton, Seiten 17-62).
Ein alternatives Verfahren für die Darstellung mit Radioisotopen beinhaltet die Positronemissionstomografie. Geeignete Positron ausstrahlende Isotopen sind z.B. &sup4;³Scandium, &sup4;&sup4;Scandium, &sup5;²Eisen, &sup5;&sup5;Kobalt und &sup6;&sup8;Gallium.
Bei der Gewebedarstellung können auch nicht-radioaktive paramagnetische Metall-Ione Verwendung finden, wie z.B. &sup5;&sup4;Eisen, &sup5;&sup6;Eisen, &sup5;&sup7;Eisen, &sup5;&sup8;Eisen, ¹&sup5;&sup7;Gadolinium und &sup5;&sup5;Mangan, die durch die nukleare magnetische Resonanzspektroskopie feststellbar sind.
Darstellungsfähige Gewebe können jedes dichte Neoplasma umfassen, auch bestimmte Organe, wie z.B. Lymphknoten, Nebenschilddrüsen, Milz und Niere, Entzündungs- oder Infektionsherde (z.B. die Makrophagen an diesen Stellen), Myokardinfarkte oder Thrombosen (neoantigene Determinanten auf Fibrin oder Plättchen) usw.

5.5.3. DIAGNOSTIK IN VITRO

Analytische Vorgänge in vitro zur Feststellung eines besonderen Antigens, unter Verwendung des Antikörpermetall- Ionkomplexes der Erfindung, beinhalten die Standardtechniken der immunradiometrischen Analyse. Für eine allgemeine Betrachtung dieser Techniken, siehe Hales und Woodhead, Methods in Enzymology 70: 334-355 (1980). Generell beinhalten immunradiometrische Analysen (IRA) gekennzeichnete Antikörper zur Feststellung nicht-gekennzeichneter Antigene. Zahlreiche Variationen der immunradiometrischen Analyse sind entwickelt worden, einschliesslich z.B. die zweistellige IRA und die indirekte IRA. Diese zwei Verfahren werden nachstehend allgemein diskutiert.
Der Zweck der zweistelligen IRA ist es, einen spezifischen Antikörper auf einer soliden Phase zu benutzen, z.B. Zellulose oder Sepharose, zwecks Gewinnung von Antigen. Während der Antikörper an die solide Phase gebunden bleibt, wird ein zweiter, gekennzeichneter Antikörper an eine andere Stelle des Antigens gebunden. Das zweite Antigen kann dann als eine Funktion der Menge des gebundenen, gekennzeichneten Antikörpers gemessen werden. In diesem Verfahren wird das Antigen an zwei verschiedene Antikörper an zwei Stellen des Antigens gebunden. In einem weiteren Verfahren wird gereinigtes Antigen an einer festen Phasenstütze adsorbiert oder mit dieser gekoppelt.
In der indirekten IRA wird der zur Messung des Antigens benutzte (erste) Antikörper, indirekt gekennzeichnet durch die Benutzung eines gekennzeichneten Antikörpers, und zwar an das Immunoglobulin derselben Sorte, wie dasjenige, in welchem der erste Antikörper gezüchtet wird. Dieser gekennzeichnete Anti-Immunoglobulinantikörper wird dann mit dem ersten Antikörper und dem Antigen reagiert. Der gekennzeichnete Antikörper kann auch bei den konventionellen oder zweiseitigen IRAs benutzt werden.
Diese und auch andere diagnostische Techniken sollen durch die vorliegende Erfindung erfasst werden.
Im Kontext dieser Erfindung haben alle diese IRA-Verfahren zum Testen von Antigen die folgenden zwei Schritte gemeinsam: a) die Mischung eines Antikörpermetall- Ionkomplexes mit einer Probe, bei der das Vorhandensein des Antigens vermutet wird, und b) die Feststellung der Interaktion - falls ein Antigen vorhanden ist - von besagtem Komplex mit dem Antigen.
Bei Diagnosen in vitro sind all die Gamma und Positron ausstrahlenden Metall-Ione, wie auch die paramagnetischen Metall-Ione in Abschnitt 5.5.2., sowie ¹&sup5;³Gadolinium, geeignet. Bei fluoreszenten diagnostischen Analysen können Ianthanide eingesetzt werden, einschliesslich Praseodymium, Neodymium, Samarium, Europium, Gadolinium, Terbium, Dysprosium, Holmium, Erbium, Thulium und Ytterbium.

6. BEISPIELE: BEREITUNG VON ANTIKÖRPERMETALL-IONKOMPLEXEN MITTELS KOHLENHYDRATBINDUNG

Die folgenden Experimente zeigen die Bildung spezifisch radiogekennzeichneter Antikörpermetall-Ionkomplexe, die nach den derzeitigen Erfindungen für Darstellungssysteme in vivo, Therapie in vivo und Feststellungssysteme in vitro nützlich sind.

6.1. BEREITUNG KOMPATIBLER CHELATE

Wie oben beschrieben, werden kompatible Chelate zur Bindung eines Metall-Ions, z.B. eines Radioisotops, an einen Antikörper oder an ein Antikörperfragment benutzt. Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Bereitung geeigneter kompatibler Chelate.
In allen nachstehenden Beispielen wurde das Wasser, das als Lösungsmittel oder zur Bildung von Lösungsmittelsystemen und Puffern benutzt wurde, zuerst durch eine Chelex Harz enthaltende Säule (BioRad Laboratories, Inc., Richmond, CA) geführt und in mit Säure gewaschenen Behältern gelagert.

6.1.1. DIÄTHYLENTRIAMINPENTAAZETISCHE SÄURE-ANHYDRIDE

Das gemischte Anhydrid aus diäthylentriaminpentaazetischer Säure (DTPA mixed anhydrid) wurde nach dem von Krejcarek und Tucker, 1977, Biochem. Biophys. Res. Commun. 77: 581-585 beschriebenen Verfahren bereitet. Kurz beschrieben, wurden 2,54 mmole DTPA und 12,7 mmole Triäthylamin in 20 ml Wasser aufgelöst und die Lösung wurde mittels Vakuum zur Gewinnung des DTPA-Salzes getrocknet. Das Salz wurde dann in 20 ml eines Lösungsmittelsystems aufgelöst, bestehend aus Azetonitril- Dimethylformamid (CH&sub3;CN-DMF) im Verhältnis 65:35, und wurde bis -5ºC in einem Eiswürfel-Salzbad abgekühlt. Nach Zusatz von 2,54 mmole Isobutylchloroformat wurde die Lösung mittels Stickstoff für die Dauer von zwanzig Minuten gerührt. Das gelöst verbliebene DTPA-gemischte Anhydridprodukt könnte von dem sich abgesetzten Triäthylamin-Hydrochlorid dadurch getrennt werden, dass die obenaufschwimmende Substanz entweder filtriert, zentrifugiert oder abgegossen wird.

6.1.2.P-AMINOANILIN-DIÄTHYLENTRIAMINPENTAAZETISCHE SÄURE

P-aminoanilin-diäthylentriaminpentaazetische Säureanhydrid (ADTPA) wurde wie folgt bereitet. Kurz beschrieben wurden 25,4 mmole P-Phenylendiamin in 50 ml eines CH&sub3;CN-DMF (65:35) enthaltenden Lösungsmittelsystems 2,0 g frisches DTPAgemischtes Anhydrid zugesetzt, das,wie in Abschnitt 6.1.1. beschrieben, bereitet wurde. Die Lösung wurde bei -5ºC für die Dauer von 2 Stunden mittels Stickstoff gehalten und gerührt, und danach über Nacht bei Zimmertemperatur (ca. 24ºC). Am Ende dieses Zeitraumes war die ursprünglich homogene Lösung eine heterogene Mischung geworden. Diese heterogene Reaktionsmischung wurde dann trocken evaporiert mittels Vakuum,und der sich ergebende Rückstand wurde in einer kleinen Aliquote (50 ml) destillierten Wassers aufgelöst. Der pHWert der Reaktionsmischung wurde auf 11,0 angeglichen, wobei eine Lösung (6M) von Natriumhydroxyd (NaOH) verwendet wurde. Unreagiertes P-Phenylendiamin wurde durch Ausscheidung mit Methylenchlorid entfernt. Die wässrige Phase wurde gesammelt, dann mittels Vakuum konzentriert und lyophilisiert zwecks Gewinnung eines blassen (weissen) Pulvers von rohem ADTPA. Das rohe ADTPA wurde mittels Umgehung gereinigt, und zwar durch eine gestopfte Kieselsäuregelsäule,unter Verwendung von äthanol-wässrigem Ammoniak (4:1), und danach mit destilliertem Wasser.

6.1.3. α-N-DIÄTHYLENTRIAMINPENTAAZETISCHES SÄURE-L-LYSIN

α-N-diäthylentriaminpentaazetisches Säure-L-Lysin (KDTPA) wurde wie folgt bereitet. 2,26 mmole N-&epsi;-Karbobenzoxyl- L-Lysin-Benzylester (Vega Biochemicals, Tucson, AZ) wurde mit 2,71 mmole Triäthylamin in 40 ml Azetonitril reagiert, wobei dies unter Umrühren bei Zimmertemperatur für die Dauer von 30 Minuten mittels Stickstoff gehalten wurde. Dann wurde 2,26 mmole frisch bereitetes DTPA-vermischtes Anhydrid in 20 ml CH&sub3;CN-DMF (65:35) zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde unter Umrühren mittels Stickstoff für die Dauer von 2 Stunden bei 0ºC gehalten, und dann über Nacht bei Zimmertemperatur. Die Lösung wurde bis zur Trockenheit mittels Vakuum evaporiert, und der sich ergebende Rückstand in 50 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Das nicht-reagierte Lysinester wurde entfernt, indem der pH-Wert auf 11,0 mit NaOH-Lösung angeglichen und mit Methylenchlorid extrahiert wurde. Die wässrige Lösung wurde dann mittels Vakuum konzentriert und der pH-Wert auf Neutralität mit einer kleinen Aliquote Salzsäure (HCl) angeglichen. Die Karbobenzoxyl-Schutzgruppe wurde dann entfernt, indem mit Palladium aktivierte Holzkohle (5% Palladium) unter 2,07 bar (30 lb.-inch²) Wasserstoff für die Dauer von 4 Stunden in einem Parr Hydrogenator benutzt wurde. Die sich ergebende Mischung wurde durch Celite gefiltert und das Filtrat wurde zwecks Gewinnung eines weissen Pulvers von rohem KDTPA lyophilisiert. Dieses Rohprodukt wurde ferner zur Gewinnung von KDTPA durch Elution gereinigt, und zwar durch eine Kieselsäuregelsäule mit äthanol-wässrigem Ammoniak (4:1) und danach mit destilliertem Wasser.

6.1.4. HYDRAZID-DIÄTHYLENTRIAMINPENTAAZETISCHE SÄURE

Das Hydrazid-Derivat von DTPA (HDTPA) wurde wie folgt bereitet. 6,3 mmole anhydrisches Hydrazin wurde in 2 ml Dimethylformamid (DMF) aufgelöst und mit 2,54 mmole DTPA- gemischtem Anhydrid in 20 ml CH&sub3;CN-DMF (65:35) reagiert. Die heterogene Mischung wurde durch Umrühren bei 4ºC für die Dauer von 1 Stunde gehalten, dann bei Zimmertemperatur für die Dauer von 1 Stunde. Die Reaktionsmischung wurde bis zur Trockenheit mittels Vakuum evaporiert, und der Rückstand in äthanol-wässrigem Ammoniak (4:1) aufgelöst.
Das Produkt wurde dann durch Elution mittels Kieselsäuregel mit äthanol-wässrigem Ammoniak, danach mit destilliertem Wasser, gereinigt. Produktenthaltende Fragmente wurden gesammelt und der pH-Wert auf 3,0 angeglichen, in dem eine kleine Aliquote Salzsäure benutzt wurde. Die Lösung wurde gefiltert und das Filtrat zur Gewinnung von HDTPA lyophilisiert.

6.1.5. GLYCYL-TYROSYL-LYSIN-DIÄTHYLEN-TRIAMINPENTAAZETISCHE SÄURE

Das glycyltyrosyllysindiäthylentriaminpentaazetisches Säureanhydrid (GYK-STPA) wurde wie folgt bereitet. Das ursprüngliche Peptid-Reagierungsmittel N-FMOC-Glycyl- (o-Benzyl-Tyrosyl-(&epsi;-N-Karbobenzoxyl))-Lysin wurde nach standardisiertem synthetischem Festphasenverfahren bereitet, wie sie von Baranz und Merrifield, in The Peptides, Band 2, Gross und Meienhoffer (Hrsg.), Acad.Press, New York, Seiten 3-385,beschrieben sind. Das derivatisierte Peptid wurde von dem Harz abgespalten und teilweise enthemmt, indem hydrobromsaures Salzgas (HBr) durch eine Suspension der Reaktionsmischung in trifluorazetischer Säure enthaltendes Methoxylbenzol (einem 50fachen Molarexzess über Tyrosin) für die Dauer von 60 Minuten bei Zimmertemperatur geblasen wurde. Das Harz wurde mittels Filtrierung entfernt, und das Filtrat bis zur Trockenheit evaporiert.Der Rückstand wurde in einer minimalen Menge Methanol aufgelöst, und das Produkt mit Äther abgesetzt und ohne weitere Reinigung verwendet.
1 mole N-FMOC-Glycyl-Tyrosyl-Lysin in DMF wurde mit 1 mole DTPA-gemischtem Anhydrid reagiert, bereitet wie in Abschnitt 6.1.1., ausser, dass anstatt Triäthylamin Diisopropyläthylamin für 30 Minuten bei -15ºC und dann bei Zimmertemperatur für die Dauer von 1 Stunde gehalten wurde. Die Lösung wurde mittels kreisender Evaporierung entfernt und der ölige Rückstand in einer kleinen Aliquote DMF aufgelöst. Zur Absetzung des gewonnenen FMOC-GYK-DTPA wurde destilliertes Wasser zugesetzt. Die FMOC-Gruppe wurde durch Zusatz eines gleichen Volumens von 40% Dimethylamin zu einer Lösung von FMOC-GYK-DTPA in DMF entfernt, wonach eine Inkubation für die Dauer von 30 Minuten bei Zimmertemperatur folgte. Die Lösung wurde bis zur Trockenheit evaporiert und der Rückstand in destilliertem Wasser aufgenommen. Das Rohprodukt wurde durch Extrahierung mit Äthylazetat gereinigt und die sich ergebende wässrige Lösung von GYK-DTPA wurde bis zur Trockenheit lyophilisiert.

6.1.6. POLYÄTHYLENIMIN-DIÄTHYLENTRIAMINPENTAAZETISCHE SÄURE

Polyäthylenimindiäthylentriaminpentaazetische Säure (PEI-DTPA) wurde wie folgt bereitet: 2,54 mmole DTPA wurde in 100 ml H&sub2;O aufgelöst und der pH-Wert auf 5,0 unter Verwendung einer 6M NaOH-Lösung angeglichen. Dann wurden 12,7 mmole L-Äthyl-3-(3-Dimethylaminpropyl)-Karbodiimid (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und 144 umole Polyäthylenimin (Polysciences, Inc., Warrington, PA) hinzugefügt. Der pH-Wert wurde auf 5,0 unter Verwendung von wässriger HCl angeglichen und die Lösung unter Umrühren bei Zimmertemperatur über Nacht beibehalten. Das entstandene PEI-DTPA wurde von der Reaktionsmischung entweder durch Umkehrphasenchromatographie oder durch Gelfiltration getrennt.

6.1.7. DIÄTHYLENTRIAMINPENTAAZETISCHES SÄUREMONO- [(4-AMINOPHENYL)METHYL]-AMID

P-Nitrobenzylamin HCl (174 mg, 0,92 mmole) wurde mit 3ml 0,3N NaOH zur Bildung von gelbem Öl behandelt, und das Öl wurde mit CH&sub2;CL&sub2; extrahiert. Die organische Lage wurde getrennt und getrocknet in vacuo zur Gewinnung der p-nitrobenzylaminfreien Base.
DTPA-Anhydrid (CDTPA) wurde gemäss dem Verfahren nach Hnatowich et al., (1982, Int. J. Appl. Radiat. Isot. 33: 327-332) synthetisch hergestellt.
Eine Lösung von CDTPA (1,64 g, 4,6 mmole in 150 ml trockenem Dimethylformamid (DMF) wurde dem P-Nitrobenzylamin zugesetzt und auf 60ºC mittels N&sub2;-Gas aufgewärmt. Nach Umrühren für die Dauer von 24 Stunden zeigte die dünnlagige Chromatographie kein nicht-reagiertes P-Nitrobenzylamin in der Lösung. Die Lösung wurde in vacuo getrocknet und mit einer saturierten NaHCO&sub3;-Lösung hydrolisiert. Die P-Nitrobenzylamin-DTPA-Adduzierung wurde von dem Reaktionsgemisch unter Verwendung einer C&sub1;&sub8;- Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) getrennt. Dies wurde dann reduziert, wobei ein Parr Hydrogenator mit 5% Palladium aktivierter Holzkohle unter 2,07 bar (30 lbs./in² )H&sub2;-Gas für die Dauer von 4 Stunden verwendet wurde. Die Lösung wurde durch rotierende Evaporation getrocknet und das Öl mit Azetonäther (4:1) zur Gewinnung eines hellgelben Produktes pulverisiert.

6.1.8. L-LYSIN-BENZYL-ESTER-DIÄTHYLENTRIAMINPENTAAZETISCHE SÄURE

N-&epsi;-Z-L-Pentaazetische Säurelysinbenzylester-HCl1 (0,5 g, 1,12 mmole, Vega Chemical Co., Tucson, AZ) wurde dem pH- Wert 9,0 mit 5% NaHCO&sub3; und 0,1N NaOH-Lösungen angeglichen. Die wässrige Lösung wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert und die organische Lage getrennt. Die organische Lösung wurde mittels Natriumsulfat getrocknet und dann gefiltert, wobei das Filtrat bis zum trockenen Zustand in vacuo evaporiert und dabei die freie Basenform N-&epsi;-Z-L-Lysinbenzylester gewonnen wurde.
DTPA-Anhydrid (CDTPA) wurde synthetisch hergestellt, und zwar nach dem Verfahren von Hnatowich et al., (1982, Int. J. Appl. Radiat. Isot. 33: 327-332).
Die oben beschriebene freie Base N-&epsi;-Z-L-Lysinbenzylester wurde in einer Lösung von 2,19 g (6,15 mmole) CDTPA in 200 ml trockenem Dimethylformamid und bis 60ºC mittels N&sub2;-Gas für die Dauer von 24 Stunden gewärmt. Alle Lysinester wurden mit CDTPA durch Dünnlagenchromatographieanalyse reagiert. Die Reaktionsmischung wurde in vacuo getrocknet und das nicht-reagierte Anhydrid mit saturierter NaHCO&sub3;-Lösung hydrolysiert. Die N-&epsi;-Z-L-Lysinbenzylester-DTPA-Adduzierung wurde von der Mischung unter Verwendung einer C18-Umkehrphasen-HPLC isoliert. Die CBZ-Schutzgruppe wurde mittels Hydrogenolyse in einem Parr Hydrogenator mit 5% Palladium aktivierter Holzkohle und 2,07 bar (30 lbs./in²) H&sub2;-Gas für die Dauer von 5 Stunden entfernt. Die Lösung wurde getrocknet und der ölige Rückstand mit einer Azetonätherlösungsmischung (4:1) zur Gewinnung des festen Produktes pulverisiert.

6.2. BINDUNG DES CHELATS AN ANTIKÖRPER UND METALL-ION

Der in den folgenden Experimenten spezifische monoklonale Antikörper, verwendet zur Injektion bei Versuchstieren, war ein Ratten-IgG-Antikörper, spezifisch für ein grosses Histokompatibilitäts-Komplexantigen (MHC) der Klasse I von Brown Norway (BN) Ratten. Dieser Antikörper, bezeichnet als CYT-015, wurde durch die Fusion von Milzzellen von Lewis-Ratten bereitet, die zuvor durch die Injektion von Zellen von BN-Ratten immunisiert worden waren, und zwar mit Myelomzellenstamm SP2/0 AG14 nach dem Verfahren, das von McKearn et al., (1979, Immunol. Rev. 47: 91-115) beschrieben wird. Nach dem Klonen wurden CYT-015 enthaltende Aszites durch intraperitoneale Injektion von Zellen in zuvor prämierte nackte Mäuse erzeugt. Der IgG monoklonale Antikörper wurde von diesen Aszites durch spezifische Elution auf einer Protein-A-Sepharosissäule (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) gereinigt.
Ein mäuse-monoklonaler IgG-Antikörper, spezifisch für einen monographischen Determinanten eines menschlichen grossen Histokompatibilitätskomplexes der Klasse I, wurde als Trägerantikörper für Verbindungen verwendet, die Kontrolltieren injiziert wurden. Dieser Antikörper wird als CYT-012 bezeichnet.

6.2.1. FORMATION VON ANTIKÖRPERCHELATVERBINDUNGEN

Radiogekennzeichnete Antikörpermetall-Ionkomplexe wurden nach einem Verfahren der derzeitigen Erfindung erstens durch die Bildung von Antikörperchelatverbindungen bereitet. Der Kohlenhydratteil des Antikörpers (CYT-012 oder CYT-015) wurde oxydiert, in dem ca. 1 mg/ml Glycoprotein mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 10 mM Natrium-Metaperiodat (NaIO&sub4;) (pH-Wert 6,0) für die Dauer von 1 Stunde auf Eis im Dunkeln reagiert wurde. Die Probe wurde dann durch eine Sephadex G-25-Säule (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) passiert und die Proteinfragmente wurden gesammelt. Der oxydierte Antikörper wurde dann mit einem kompatiblen Chelat verbunden, und entweder sofort verwendet oder in gefrorenem Zustand bei -20ºC gelagert.
Beispielsweise wurde glycyltyrosyllysindiäthylentriaminpentaazetische Säure (GYK-DTPA) mit oxydiertem Antikörper gekoppelt, in dem eine Aliquote des Antikörpers mit einem 200-fachen Molarexzess von GYK-DTPA in PBS (pH- Wert 6,0) für die Dauer von 30 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert wurde. Um das Produkt zu stabilisieren, wurde Natriumcyanoborohydrid (NaCNBH&sub3;) einer endgültigen Konzentration von 10 mM zugesetzt, und diese Reaktionsmischung wurde bei Zimmertemperatur für einen Zeitraum von 2 Stunden bis über Nacht gehalten. Die Probe wurde dann durch eine Sephadex G-50-Säule (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) passiert und die Proteinfragmente gesammelt.
In anderen Experimenten wurde der oxydierte Antikörper entweder mit p-aminoanilin-diäthylentriaminpentaazetischer Säure (ADTPA) oder polyäthylenimin-diäthylentriaminpentaazetischer Säure (PEI-DTPA) durch das gleiche Verfahren gekoppelt, ausser dass ein 2000-facher Molarexzess von ADTPA oder PEI-DTPA verwendet wurde.

6.2.2. BILDUNG VON ANTIKÖRPERMETALL-IONKOMPLEXEN

Das radioaktive Metall-Ion wurde dann mit den Antikörperchelatverbindungen verbunden, damit radioaktive Antikörpermetall-Ionkomplexe, die für Darstellungssysteme verwendbar sind, gebildet werden können.
Zum Beispiel wurde 20 µl Stock ¹¹¹ Indiumchlorid (¹¹¹In-Cl&sub3;) (New England Nuclear, Boston, MA), welches 1-2 mCi (3,7-7, 4x10&sup7; Bq) darstellt, 20 µl 0,5M Natriumazetat (pH- Wert 6,0) zugefügt und mit der Antikörperchelatverbindung, die wie oben dargestellt, bereitet (50-200 µg) für die Dauer von 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Probe wurde dann durch eine Sephadex G-50-Säule (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) ausgewaschen, und die Proteinfragmente gesammelt. Der gesammelte, ¹¹¹ In-gekennzeichnete Antikörpermetall-Ionkomplex wurde durch eine Waters Protein Pak 300SW hochleistungsflüssige Chromatographiesäule (HPLC) (Waters Association, Milford MA) re-chromatographiert und Fragmente wurden gesammelt. Das Fragment, das dem Elutionsvolumen von IgG im Molekulargewicht entspricht, repräsentiert den Antikörpermetall-Ionkomplex.
Fig. 1, z.B., stellt ein HPLC-Chromatogramm dar, das während der Reinigung und Isolierung des ¹¹¹Indium-gekennzeichneten Anti-Brown-Norway grossen Histokompatibilitätskomplex-Antikörpermetall-Ionkomplex, ¹¹¹ In-CYT- 015-ADTPA, gewonnen wurde. Wie in Fig. 1 dargestellt, zeigt die optische Dichte des Spitzenradioaktivität enthaltenden Fragments die Similarität des Antikörpermetall- Ionkomplexes und des monomeren, nicht-verbundenen IgG.

7. BEISPIELE: BEREITUNG VON ANTIKÖRPERMETALL-IONKOMPLEXEN DURCH KOHLENHYDRATVERBINDUNGEN

Die folgenden Beispiele zeigen die Bildung kompatibler Chelate und radiogekennzeichneter Antikörpermetall-Ionkomplexe, die, nach der derzeitigen Erfindung, für Darstellungssysteme in vivo, Therapie in vivo und Feststellungssysteme in vitro verwendbar sind.

7.1. HYDRAZID-FICOLL

Ficoll 70 wurde von Pharmacia Fine Chemicals, Inc., (Piscataway, New Jersey) erhalten. Das Karboxylmethylderivat von Ficoll 70 (CM-Ficoll) wurde genau wie beschrieben von Inman (1975, J.Immunol. 114: 704) bereitet.
Zwei Gramm CM-Ficoll wurden in 100 ml Wasser aufgelöst und 10 g fettiges Dihydrazid wurden langsam zugefügt. Der pH-Wert wurde auf 4,7 durch den tröpfchenweisen Zusatz von 1N HCl angeglichen, dann wurden 1,25 g L-Äthyl-3-(-3-Dimethyl-Aminopropyl)-Karbodiimid zugesetzt und der pH-Wert wurde mit 1N HCl auf 4,7 angeglichen. Die Reaktionsmischung wurde dann für die Dauer von 20 Stunden bei 23-25ºC gerührt. Das rohe Reaktionsprodukt wurde durch Gelfiltrationschromatographie auf einer 4,5 x 55 cm grossen Sephadex G-25-Säule gereinigt. Die Säule wurde mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung ausgewaschen (PBS, 0,01M Natriumphosphat, 0,15M Natriumchlorid, pH-Wert 7,4), und die ausgestossenen Volumenfragmente wurden geborgen. Das Hydrazid-Ficoll wurde dann gegen Wasser dyalisiert und lyophilisiert. Das Endprodukt enthielt ca. 150 Mole von Hydrazid/Mole von Ficoll.

7.2. (4-JODAZETYL)-AMINOBENZOISCHES HYDRAZID-FICOLL

Dreissig mg N-Succinimidyl-(4-Jodazetyl)-Aminomenzoat (SIAB, Pierce Chemical Co., Rockford, IL) wurden in 3 ml Azetonitril aufgelöst. Sechs 0,48 ml Aliquoten der SIAB- Lösung wurden 20 ml einer 5mg/ml Lösung Hydrazid-Ficoll (wie in Abschnitt 7,1, beschrieben) zugesetzt, in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,0, in Intervallen von 30 Minuten, aufgelöst. Bevor der zweite Zusatz der SIAB- Lösung erfolgte, wurden 5 ml Tetrahydrofuran dem Hydrazid- Ficoll zur Klärung der Lösung zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde dann für die Dauer von 20 Stunden bei 23-25 ºC gerührt. Die organischen Lösungsmittel wurden entfernt, in dem N&sub2;-Gas durch die Reaktionsmischung geblasen wurde, und die sich ergebende wolkige Lösung wurde durch Zentrifugierung geklärt. Die klare, obenaufschwimmende Substanz wurde lyophilisiert. Überschüssiges SIAB wurde entfernt, indem das trockene Pulver mit Tetrahydrofuran extrahiert wurde, und das überschüssige Lösungsmittel wurde durch Verdunstung unter reduziertem Druck entfernt. Das trockene Pulver wurde in 5 ml Wasser aufgelöst und für die Dauer von 4 Stunden bei 4ºC dialysiert. Das (4-Jodazetyl)-aminobenzoisches Hydrazid-Ficoll wurde in gefrorenem Zustand bei -70ºC gelagert und enthielt ca. 16 Jodazetylgruppen Hydrazid-Ficoll pro Mole.

7.3. 2-PYRIDYL-DISULFID-HYDRAZID-DTPA

Zehn mg Hydrazid-DTPA (bereitet wie in Abschnitt 6.1.4. beschrieben) wurden in 0,1 ml 0,2M doppelkohlensaurem Natronpuffer, pH-Wert 9,5 aufgelöst. Einzehntel ml eines 0,1M Natriumphosphatpuffers, p-H-Wert 7,2, wurde zugefügt und der pH-Wert der sich ergebenden Lösung wurde auf 8,0 angeglichen; dann wurden 0,3 ml Tetrahydrofuran und 0,1 ml N,N-Dimethylformamid zugesetzt. 100 mg N-Succinimdyl-3-(2- Pyridyl-Dithio)-Propionsäuresalz (Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Piscataway, NJ), aufgelöst in 1,0 ml Tetrahydrofuran, wurden der Hydrazid- DTPA-Lösung zugesetzt, und die Reaktionsmischung für die Dauer von 16 Stunden bei 23-25ºC gerührt. Das Tetrahydrofuran wurde entfernt, in dem N&sub2; durch die Lösung geblasen und die sich ergebende Suspension durch Zentrifugierung geklärt wurde. Unerwünschte Reaktionsprodukte wurden durch Zusatz von 1 ml Wasser abgesetzt, und die klare, obenaufschwimmende Substanz wurde durch wiederholte Gelfiltration auf Säulen mit Bio-Gel P-2 (BioRad Laboratories, Richmond, CA) gereinigt und mit Wasser ausgewaschen. Das Produkt enthielt ca. 0,15 - 0,20 Mole 2-Pyridyldisulfid/Mole-DTPA.

7.4. 3-MERCAPTOPROPIONISCHES HYDRAZID-DTPA- ¹&sup5;³Gd

1 mg 2-Pyridyldisulfidhydrazid-DTPA (PDS-DTPA, bereitet wie in Abschnitt 7.3. beschrieben) wurde in 0,1 ml Wasser aufgelöst und mit 8,9-10&sup5; Bq (0,024 mC1)¹&sup5;³GdCl&sub3; (Amersham Corporation, Arlington Heights, IL) gekennzeichnet, das in 0,1 ml 0,05M HCl aufgelöst wurde. Das PDS-DTPA-¹&sup5;³Gd wurde dann mit 5 mM Dithiothreitol verringert und das sich ergebende 3-mercaptopropionische Hydrazid-DTPA-¹&sup5;³Gd wurde mittels Gelfiltration auf Sephadex G-10 gereinigt.

7.5.¹&sup5;³Gd-DTPA-HYDRAZID-THIOAZETYL-AMINOBENZOISCHES HYDRAZID-FICOLL-AZETYLTHIO-IgG

1 mg Mäuse-Anti-N.Gonorrhoeae-monoklonales IgG wurde in 0,25 ml PBS, pH-Wert 7,4 verdünnt. Die IgG-Lösung wurde dann mit 5mM Dithiothreitol für die Dauer von 30 Minuten bei 23-25ºC reduziert. Der reduzierte Antikörper passierte dann eine 1x19 cm Sephadex G-50-Säule und wurde mit 0,1 M Tris(Hydroxylmethyl)-Aminomethanpuffer, pH-Wert 8,0, ausgewaschen, der 1 mM äthylendiamintetraazetische Säure (Tris/EDTA) enthielt. Ein mg (4-Jodazetyl)-aminobenzoisches Hydrazid-Ficoll (bereitet wie in Abschnitt 7.2. beschrieben) wurde dem reduzierten Antikörper zugesetzt, und die Reaktionsmischung wurde bei 4ºC für die Dauer von 16 Stunden zur Bildung einer jodazetyl-aminobenzoischen Hydrazid- Ficoll-Azetylthio-IgG-Verbindung inkubiert.
0,20 mg 3-mercaptopropionisches Hydrazid-DTPA-¹&sup5;³Gd (bereitet wie in Abschnitt 7.4. beschrieben) wurde der jodazetylaminobenzoischen Hydrazid-Ficoll-Azetylthio-IgG-Verbindung zugesetzt und die Reaktionsmischung bei 4ºC für die Dauer von 16 Stunden inkubiert. Der ¹&sup5;³Gd-DTPA-hydrazid-thioazetyl- aminobenzoische Hydrazid-Ficoll-Azetylthio-IgG-Komplex wurde durch Immunisierungsadsorbtion mit einem Harz gereinigt, bestehend aus Schaf-Antimaus-IgG-Antikörper (Cooper Biomedical, Scientific Division, Malvern, PA), mittels Kovalenzbindung an zyanogenbromidaktivierter Sepharose 4B (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Der gebundene Komplex wurde mit 0,1 M Glyzinpuffer, pH-Wert 2,0, ausgewaschen und in Tris/EDTA-Puffer entsalzt, wobei Sephadex G-25 verwendet wurde.
Dies ist ein Beispiel für die Bereitung eines Antikörpermetall-Ionkomplexes, der durch die Verbindung eines einzigen stellenkompatiblen Chelats mit einer Vielzahl von Stellen gebildet wurde, die an den Sulfhydrylgruppen von Antikörpern eingeführt wurden, wie in Abschnitt 5.2. beschrieben.

7.6. (4-JODAZETYL)-AMINOBENZOISCHES HYDRAZID-FICOLL-IgG

Ein halbes mg Mäuse-Anti-N.Gonorrhoeae-monoklonales IgG wurde nach dem Verfahren von Abschnitt 6.2.1. oxydiert. Nach der Dialyse versus PBS, pH-Wert 7,4, wurde der Antikörper mit PBS, pH-Wert 7,4, zu einem endgültigen Umfang von 0,577 ml verdünnt. 0,702 ml (4-Jodazetyl)aminobenzoische Hydrazid-Ficoll-Lösung (16,7 mg/ml, bereitet wie in Abschnitt 7.2. beschrieben) wurden zusammen mit 0,128 ml 110mM Natriumzyanoborohydrid-Lösung, verdünnt in 0,1M Natriumphosphat, pH-Wert 6,0, zugesetzt. Die Reaktionsmischung konnte für die Dauer von 2 Stunden bei 23-25ºC inkubiert werden. Die (4-Jodazetyl)-aminobenzoische Hydrazid-Ficoll-IgG-Verbindung wurde mittels Immunisierungsadsorbtion mit einem Harz gereinigt, zusammengesetzt aus Schaf-Antimaus-IgG (Cooper Biomedical, Scientific Division, Malvern, PA) mittels Kovalenzkoppelung an zyanogenbromidaktivierte Sepharose 4B (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Die gebundene Verbindung wurde mit 0,1M Glyzinpuffer, pH-Wert 2,0, ausgewaschen und in 0,1M Tris(Hydroxylmethyl)-Aminomethan, pH-Wert 8,0, entsalzt, das 1mM äthylendiamintetraazetische Säure enthielt, wobei Sephadex G-25 verwendet wurde. Die gereinigte Verbindung enthielt ca. 2-3 Mole der (4-Jodazetyl)-aminobenzoische Hydrazid-Ficoll/Mole des IgG und wurde bei -70ºC gelagert.

7.7. ¹&sup5;³Gd-DTPA-HYDRAZID-THIOAZETYL-AMINOBENZOISCHES HYDRAZID-FICOLL-IgG

0,081 mg 3-mercaptopropionisches Hydrazid-DTPA-¹&sup5;³Gd (bereitet wie in Abschnitt 7.4. beschrieben) wurden 0,050 mg (4-Jodazetyl)-aminobenzoischem Hydrazid- Ficoll-IgG, bereitet wie in Abschnitt 7.6. beschrieben, zugesetzt, und die Reaktionsmischung über Nacht bei 4ºC inkubiert. Das freie 3-mercaptoproprionische Hydrazid-DTPA-¹&sup5;³Gd wurde mittels Chromatographie auf Sephadex G-50 entfernt. Der sich ergebende ¹&sup5;³Gd- DTPA-hydrazid-thioazetylaminobenzoische Hydrazid-Ficoll- IgG-Komplex enthielt 13,5 Mole der DTPA/Mole des IgG.
Dies ist ein Beispiel für die Bereitung eines Antikörpermetall-Ionkomplexes, der durch die Verbindung eines einzigen stellenkompatiblen Chelats mit einer Vielzahl von Stellen gebildet wurde, die an den Kohlenhydratteilen von Antikörpern eingeführt wurden, wie in Abschnitt 5.2. beschrieben.

7.8. MALEIMID-HYDRAZID-FICOLL

22 mg 4-(N-Maleimidmethyl)-Zyclohexan-L-Karboxylsäure- N-Hydroxylsuccinimidester (SMCC, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurden in 3 ml Tetrahydrofuran aufgelöst. Sechs Aliquoten zu je 0,5 ml der SMCC-Lösung wurden 20 ml einer 5mg/ml Lösung des Hydrazid-Ficoll (bereitet wie in Abschnitt 7.1. beschrieben) zugesetzt, und in 0,1M Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 6,8, in Intervallen von 30 Minuten aufgelöst. 2 ml Tetrahydrofuran wurden der Reaktionsmischung zugesetzt, und zwar vor der zweiten und dritten Zugabe der SMCC-Lösung. Die organischen Lösungen wurden dann entfernt, indem N&sub2; durch die Reaktionsmischung geblasen wurde; die sich ergebende wolkige Lösung wurde durch Zentrifugierung geklärt. Die klare, obenaufschwimmende Substanz wurde lyophilisiert und das überschüssige SMCC wurde mittels Tetrahydrofuran extrahiert. Die organische Lösung wurde dann unter reduziertem Druck durch Evaporierung entfernt. Das Endprodukt enthielt ca. 15 Mole der Maleimid/Mole des Ficoll. Diese Zusammensetzung kann auf dieselbe Weise, wie das (4-Jodazetyl)-aminobenzoische Hydrazid- Ficoll verwendet werden, bereitet nach dem Verfahren von Abschnitt 7.2.

8. BEISPIELE: DARSTELLUNGEN UNTER VERWENDUNG VON RADIOGEKENNZEICHNETEN ANTIKÖRPERMETALL-IONKOMPLEXEN

Die folgenden Beispiele stellen Verfahren für Darstellungen in vivo zur Feststellung spezifischer Gewebe- oder Organkomponenten dar, wobei die nach der derzeitigen Erfindung bereiteten radiogekennzeichneten Antikörpermetall- Ionkomplexen verwendet wurden.

8.1. TUMORDARSTELLUNG

In einer Serie von Experimenten wurden radiogekennzeichnete Antikörpermetall-Ionkomplexe zur spezifischen Feststellung tumorartigen Gewebes bei Versuchstieren benutzt, wobei ein Radiodarstellungssystem angewandt wurde.
Nackten Mäusen wurde subkutan in das linke hintere Viertel 1x10&sup6; BN-Ratten-Lymphomzellen injiziert. Sieben Tage nach der Injektion, als die Tumorgrössen 2 bis 4 mm im Durchmesser betrugen, erhielten die Tiere eine retroorbitale Sinus- oder intravenöse Injektion von 10 µg ¹¹¹Indium gekennzeichnetem Anti-BN-Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) des Antikörpermetall-Ionkomplexes, ¹¹¹In-CYT-015-ADTPA. Kein Tier erhielt mehr als eine einzige Injektion des Komplexes.
Zwei Gruppen von Tieren dienten als Kontrollgruppen. Einer Kontrollgruppe nackter Mäuse ohne Tumore wurde entweder in den retroorbitalen Sinus oder intravenös 10 µg ¹¹¹In-CYT-015-ADTPA injiziert. Einer anderen Gruppe nackter Mäuse mit BN-Tumoren wurde 10 µg ¹¹¹In-CYT-012- ADTPA injiziert.
Die Radiodarstellung wurde wie folgt ausgeführt: 24, 48 oder 72 Stunden nach der Injektion mit radiogekennzeichnetem Antikörpermetall-Ionkomplex wurden die Tiere unmittelbar auf die umgekehrte Front einer Gammakamera plaziert (General Electric Maxi Camera 37, zwischenflächig ausgestattet mit einem ADEC Clinical Data System). Die Zählung von 10 000 bis 25 000 wurde routinemässig auf belichtetem Röntgenfilm ausgeführt, ohne Korrektur bezüglich Hintergrundbestrahlung.
Fig. 2 demonstriert in vivo Darstellungen der Radioaktivität, die in den BN-Tumor tragenden nackten Mäusen akkumuliert wurde, denen ¹¹¹In-CYT-015-ADTPA injiziert worden war. Die Darstellungen A,B,C und D erfolgten jeweils 24, 24, 48 und 72 Stunden nach der Injektion.
Fig. 2 demonstriert ferner deutlich, dass die Komplexe der Erfindung am vorgesehenen Zielort spezifisch lokalisiert sind, mit extrem niedrigem Niveau der nichtspezifischen Lokalisierung.
Fig. 3 stellt in vivo Darstellungen der Radioaktivität in den obengenannten BN-Tumor tragenden Kontrollmäusen dar. Die Darstellungen E und F erfolgten jeweils 24 und 72 Stunden nach der Injektion. Wie ersichtlich, besteht in Fig. 3 keine feststellbare Lokalisierung von Radioaktivität bei BN-Tumor tragenden nackten Mäusen, denen ¹¹¹In- CYT-012-ADTPA injiziert wurde, in welchem der AntikörperIn- spezifisch für menschliches MHC-Antigen der Klasse I ist.
Fig. 4 demonstriert in vivo Darstellungen von nackten Mäusen ohne Tumor, denen ¹¹¹ In-CYT-012-ADTPA injiziert worden war. Die Darstellungen G und H erfolgten jeweils 24 und 72 Stunden nach der Injektion. Wie in Fig. 4 ersichtlich, gab es auch keine feststellbare Lokalisierung von Radioaktivität bei nackten Mäusen ohne Tumor, denen der radiogekennzeichnete Antikörpermetall-Ionkomplex ¹¹¹In-CYT-015-ADTPA, spezifisch für das BN-Tumor-Antigen, injiziert worden war.

8.2. DARSTELLUNGEN DES NIERENTRANSPLANTATS

In einer weiteren Serie von Experimenten wurden radiogekennzeichnete Antikörpermetall-Ionkomplexe zur spezifischen Feststellung von transplantiertem Nierengewebe durch Radiodarstellung in vivo verwendet.
Versuchsratten mit einer transplantierten, funktionierenden Niere oder Nierenfremdtransplantat wurden wie folgt behandelt: Die linke Niere einer Lewis-Ratte wurde chirurgisch entfernt und eine Niere von einer BN x Lewis-Fl-Ratte statt dessen implantiert. Die Immunabwehr des Empfängers des fremden Nierentransplantats wurde chemisch unterdrückt (siehe Stuart et al., 1980, Immunol. Rev. 49: 127-165 ). Folglich besassen die Empfängerratten zwei funktionierende Nieren, wovon nur eine das BN MHC-Antigen in sich trug, das spezifisch durch den CYT-015-Antikörper erkannt ist.
Sechs bis zwölf Monate nach der Transplantation wurden den Empfängerratten 10 µg ¹¹¹In-CYT-015-ADTPA intravenös injiziert, und die Darstellung wurde, wie in Abschnitt 8.1. beschrieben, ausgeführt. In Fig.5 erfolgten die Darstellungen A und B ca. 1 Stunde und 20 Minuten nach der intravenösen Injektion. Wie in Fig. 5, Darstellung A, aufgezeigt, wurde das Radionukleid in der transplantierten Niere, innerhalb von 1 Stunde und 20 Minuten nach der intravenösen Injektion des gekennzeichneten Antikörpermetall-Ionkomplexes, lokalisiert. Minimale Akkumulation von Radioaktivität wurde in der Niere, den Lungen, der Milz oder der Leber des Tieres festgestellt.
Fig.5, Darstellung B, demonstriert die Darstellung, nachdem demselben Empfängertier ein kommerziell erhältliches Nierendarstellungsmittel, nämlich 99mTechnetium-DTPA-Chelat (Mallinkrodt, St. Louis, MO) injiziert worden war. Es ist klar ersichtlich, dass Darstellungen, die mit 99mTechnetium- DTPA-Chelat zustandekommen, gegenüber denjenigen, die mittels den Antikörpermetall-Ionkomplexen der Erfindung erzielt wurden, minderwertig sind.
Beide Nieren des Empfängertieres funktionierten deutlich.

Claims

1. Antikörperchelatverbindung, die folgendes umfaßt: Ein kompatibles Chelat, verbunden mittels einer Kovalenzbindung mit einem Antikörper oder Antikörperfragment und in der Lage, eine koordinierte Bindung an ein Metall-Ion einzugehen, in dem die Kovalenzbindung zwischen einem Amin des kompatiblen Chelats und einer Aldehydgruppe eines oxidierten Kohlenhydratanteils des Antikörpers oder Antikörperfragments besteht, wobei besagte Antikörperchelatverbindung im wesentlichen dieselbe Immunisierungsreaktivität und Immunisierungsspezifizität wie der nicht-gekoppelte Antikörper oder das nicht-gekoppelte Antikörperfragment besitzt, und worin die Kovalenzbindung (i) selektiv an einer Stelle gebildet wird, die sich außerhalb des antigenen Bindungsbereichs des Antikörpers oder Antikörperfragments befindet, und (ii) aus einem Imin, Enamin, Hydrazon, Oxim, Phenylhydrazon, Semikarbazon, Thiosemikarbazon und einer reduzierten Form derselben selektiert wird.

2. Antikörperchelatverbindung nach Anspruch 1, worin das Antikörperfragment aus Fab-Fragmenten, (Fab')&sub2;-Fragmenten und Halbantikörpermolekülen selektiert wird.

3. Antikörperchelatverbindung nach den Ansprüchen 1 oder 2, worin der Antikörper oder das Antikörperfragment ein monoklonaler Antikörper oder ein monoklonales Antikörperfragment ist.

4. Antikörperchelatverbindung nach den Ansprüchen 1 bis 3, worin das kompatible Chelat ein Amin enthaltendes Derivat eines Chelats ist, das aus diäthylentriamin-pentaazetischer Säure, äthylen-diamintetraazetischer Säure, dimercaptosuccinischer Säure, 2,3-dimercaptopropansulfonischer Säure und Matallothionein selektiert wird.

5. Antikörperchelatverbindung nach den Ansprüchen 1 bis 4, worin das kompatible Chelat aus p-aminoanilin-diäthylentriamin-pentaazetischer Säure, hydrazid-diäthylentriamin-pentaazetischer Säure, phenylhydrazid-diäthylentriamin-pentaazetischer Säure, hydroxylamin-diäthylentriamin-pentaazetischer Säure, semicarbazid-diäthylentriamin-pentaazetischer Säure, thiosemicarbazid-diäthylentriamin-pentaazetischer Säure, polyäthylenamin-diäthylentriamin-pentaazetischer Säure, p-phenylendiamin-diäthylentriamin-pentaazetischer Säure, α-N-diäthylentriamin-pentaazetischer Säure-L-Lysin, glycyl-tyrosyl-lysin-diäthylentriaminpentaazetischer Säure, diäthylentriamin-pentaazetischem Säuremono, [(4-Aminophenyl)methyl] -Amid und L-lysin-benzyl-ester-diäthylentriamin-pentaazetischer Säure selektiert wird.

6. Antikörperchelatverbindung nach Anspruch 1, worin das kompatible Chelat ein Amin enthaltendes Derivat eines Kryptats ist.

7. Antikörperchelatmetall-Ionkomplex, der eine Antikörperchelatverbindung nach den Ansprüchen 1 bis 6 umfasst, wobei besagte Antikörperchelatverbindung mittels besagtem kompatiblem Chelat mit einem Metall-Ion zwecks Bildung des besagten Antikörperchelatmetall-Ionkomplexes koordiniert verbunden ist.

8. Antikörperchelatmetall-Ionkomplex nach Anspruch 7, im wesentlichen frei von nicht-chelatierten Metall-Ionen.

9. Antikörperchelatmetall-Ionkomplex nach Anspruch 7, worin das Metall-Ion ein Radioisotop ist.