DE69215870T2

DE69215870T2 - Feststellung kardiovaskulärer läsionen

Info

Publication number: DE69215870T2
Application number: DE69215870T
Authority: DE
Inventors: David M Goldenberg
Original assignee: Immunomedics Inc
Current assignee: Immunomedics Inc
Priority date: 1991-05-06
Filing date: 1992-04-24
Publication date: 1997-05-22
Anticipated expiration: 2012-04-25
Also published as: KR100211394B1; ATE146082T1; IL101737A; EP0583390A1; US5364612A; WO1992019273A1; DE69215870D1; AU2024292A; CA2107567A1; JPH06507410A; CA2107567C; US5632968A; EP0583390A4; JP2823357B2; AU657553B2; EP0583390B1; IL101737A0; SG46446A1

Description

Diese Erfindung betrifft Reagenzien und Verfahren zum Nachweis und zur Abbildung von kardiovaskulären Läsionen wie arteriosklerotischen Plaques, vaskulären Blutgerinnseln einschließlich Thromben und Embolien, einem myokardialen Infarkt und anderen Organinfarkten. In der vorliegenden Erfindung werden monospezifischer Antikörper-Abbildungsmittel-Konjugate, die für eine Art von Leukozyten spezifisch sind, sowie multispezifischer Antikörper- Abbildungsmittel-Konjugate, die für mindestens eine Art von Leukozyten oder für Fibrin-, Myosin- oder Thrombozyten-assoziierte Antigene spezifisch sind, verwendet. Ebenfalls in der vorliegenden Erfindung verwendet werden multispezifischer Antikörper-Abbildungsmittel-Konjugate, die für mindestens zwei verschiedene Antigene, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fibrin-, Myosin- oder Thrombozyten-assoziierten Antigenen, spezifisch sind.
Wenn es einen Insult im vaskulären Endothelium gibt, akkumulieren zirkulierende Blutzellen, insbesondere Leukozyten, Granulozyten neigen dazu, sich in höchsten Anzahlen zu konzentrieren, aber auch Monozyten und Lymphozyten akkumulieren zu einem geringeren Grad. Diese Zellen wandern durch das vaskuläre Endothelium, um sich an den Verletzungsflächen zu versammein. Die Granulozyten überleben in dem extravaskulären Raum für bis zu etwa drei Tagen, wonach die mononukleären Zellen. Monozyten und Lymphozyten, die vorherrschende Population werden.
Es sind zwei Phasen mit einem vaskulären Insult verbunden; eine kurze frühe Zunahme der vaskulären Permeabilität und eine mehr herausgezögerte zweite Phase bestehend aus einer erhöhten Permeabilität, Bindung von Leukozyten, hauptsächlich von Granulozyten, an die Gefäßwand, Diapedese von überwiegend Leukozyten durch die Gefäßwand, Akkumulation von Leukozyten in der verletzten Fläche, Leukozyten-Phagozytose, Durchsickern von Fibrinogen und Thrombozyten aus dem Gefäß, Fibrin-Ablagerung in der verletzten Fläche, intravaskulärer Gerinnselbildung mit Gefäßzerstörung, Verschlingen von nekrotischen Zell- und Gewebstrümmern durch Makrophagen, Wanderung von Fibroblasten und Bildung von Bindegeweben und die Gefäßneubildung durch Hineinwachsen von Kapillaren. Somit ist die Infiltration durch Leukozyten, insbesondere Granulozyten ein sehr frühes und bedeutendes Ereignis.
Die gut entwickelte arteriosklerotische Plaque ist ein Ergebnis des Zusammenspiels von entzündlichen Ereignissen und Reparaturereignissen, was zu einer Läsion führt, die aus extrazellulären Calciumsalzen, Cholesterinkristallen, Glycosaminoglycanen und Blutzellen und Plasmabestandteilen besteht. Die endotheliale Permeabilität der Arterienwände wird in den frühen Stadien der Arteriosklerose induziert, was den Zustrom von zirkulierenden Makromolekülen und Blutzellen, insbesondere Leukozyten (und hauptsächlich Granulozyten), erlaubt. Sekundäre Veränderungen können eine Verringerung der Permeabilität der arteriellen Intima und die spätere Ablagerung von Thrombozyten und/oder Fibrin sowie proliferative, degenerative, nekrotische und Reparatur-Prozesse, die zu arteriomatösen Läsionen führen, umfassen. Hier ist wiederum die Konzentration und Extravasation von Leukozyten in der verletzten Fläche eine frühe Komponente.
Während des entzündlichen Prozesses können Leukozyten aktiviert werden. Dies ist mit einer Hochregulierung bestimmter Zelloberflächen-Antigene verbunden. WO-A-9010463 offenbart, daß eine Konjugation von Markierungsstoffen an monoklonale Antikörper, die spezifisch für diese Antigene sind, für ein Abbilden der Entzündungsstellen verwendet werden kann.
Hinsichtlich der Blutgerinnsel, wenn Gefäße verletzt sind, kann ein Gefäßverschluß durch die Bildung von Fibrin, die Aggregation von Thrombozyten oder Kombination von beidem auftreten. Während dieser Ereignisse findet eine Verklebung und Aggregation der Leukozyten, unabhängig von der Aggregation der Thrombozyten, statt. Sehr früh, sogar vor der Fibrinbildung, findet eine Extravasation von Leukozyten statt.
Eine Thrombose der tiefen Venen (Deep Vein Thrombosis, DVT) und eine pulmonäre Embolie sind in der allgemeinen Bevölkerung sehr häufig, wobei 30%-60% von ansonsten gesunden Männern und Frauen und bis zu 80% von Patienten mit einem hohen Risiko betroffen sind. Es ist geschätzt worden, daß soviel wie 20% aller Patienten in Krankenhäusern von thromboembolischen Ereignissen betroffen sind. Es ist geschätzt worden, daß in den Vereinigten Staaten alleine 2,5 Mio. Fälle jedes Jahr auftreten (Sherry, Semin. Nucl. Med. 7:205-211, 1977).
Der Großteil der üblicherweise angewendeten nuklearmedizinischen Tests für Thrombose von tiefen Venen (Deep Vein Thrombosis, DVT) umfaßt unspezifische Radiopharmazeutika, die für die Radionuklid-Venographie benutzt werden. Somit besteht ein großer Bedarf an einem Thrombose-spezifischen Radiopharmazeutikum für eine spezifische, sensitive und schnelle Enthüllung von Thromben durch eine nichtinvasive externe Szintigraphie. Die Kontrast- Venographie, ein übliches radiologisches Verfallren, ist der "Goldene Standard" für DVT gewesen. Sie besitzt aber eine hohe Häufigkeit von Nebenwirkungen, die ihre wiederholte Anwendung begrenzen (Rabinov und Paulin, Arch. Surg. 104:134-144, 1972). Kompressions-B-Typ-Ultraschall eignet sich ebenfalls für die Diagnose des Vorkommens von Thromben in den Beinen, aber dies ist begrenzt auf die Region und, wiederum, nicht läsions-spezifisch (Lensing et al., N. Engi. J. Med. 320:342-345, 1989). Daher wird nach Radiopharmazeutika zum Erzielen einer Einfachheit, Schnelligkeit und Spezifität bei dem Nachweis und der Diagnose von DVT gesucht.
Wo die vorgenannten Agenzien für DVT nützlich sein können, können sie jedoch daran scheitern, pulmonäre Embolien zu enthüllen, die lebensbedrohende Läsionen sind. Verschiedene Thromben können verschiedene Agenzien erfordern. Venöse Thromben bestehen vor allem aus Fibrinpolymeren mit eingefangenen Zellen, alternierend mit Schichten von Thrombozyten, während arterielle Thromben vor allem aus aggregierten Thrombozyten mit weniger Fibrin bestehen (Freiman, in: Coleman et al., Hrsg., Hemostasis and Thrombosis - Basic Principles and Clinical Practice, New York, NY, Lippincott, 56: 766-780, 1982). Somit besteht ein Bedarf, ein Radiopharmazeutikum zu besitzen, das sowohl arterielle als auch venöse Ablagerungen binden kann.
Was den überwiegenden Teil anbelangt, scheinen die erhältlichen Agenzien auf Fibrin-gerichtete oder Thrombozyten-gerichtete Pharmazeutika begrenzt zu sein, wie dies überblicksmäßig von Knight (Semin. Nucl. Med., 20:52-67, 1990) untersucht wurde. Beispielsweise offenbart EP-A-0241907 eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend einen einzelnen heterobifunktionalen Antikörper, der den Thrombus über nur eine Determinante bindet. Die zweite Spezifität des Antikörpers wird verwendet, um ein thrombolytisches Agens zu binden, das für eine Verwendung beim Abbilden markiert sein kann.
Fibrin-spezifische Radiopharmazeutika schließen radiomarkiertes Fibrinogen, lösliches Fibrin, Anti-Fibrin-Antikörper und -Antikörperfragmente, Fragment- E&sub1; (ein 60 kDa-Fragment von menschlichem Fibrin, das durch kontrollierten Plasmin-Verdau von vernetztem Fibrin erzeugt wird), Plasmin (ein Enzym im Blut, das für das Auflösen frischer Thromben verantwortlich ist), Plasminogenaktivatoren (z.B. Urokinase, Streptokinase und Gewebeplasminogenaktivator), Heparin und Fibronectin (ein adhäsives Plasmaglykoprotein von 450 kDa) ein. Thrombozyten-gerichtete Pharmazeutika schließen radiomarkierte Thrombozyten, Anti-Thrombozyten-Antikörper und -Antikörperfragmente, Anti-aktivierte-Thrombozyten und Anti-aktivierte-Thrombozytenfaktoren ein, die übersichtsmäßig durch Knight (vorstehend zitiert) sowie durch Koblik et al. (Semin. Nuci. Med., 19: 221-237, 1989) untersucht worden sind. Das Abbilden von Thrombozyten ist am nützlichsten während der akuten Phase der Thrombose, wenn die aktive Thrombozytenaggregation stattfindet, so daß diese auf Thrombozyten basierenden Abbildungsverfahren Schwierigkeiten beim Enthüllen von Blutgerinnseln, die älter als 24 - 48 h waren, besitzen (Oster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3465-3468, 1985). Eine andere Besorgnis ist, daß die Abbildung von Thrombozyten durch gleichzeitige Heparinverabreichung bei der Behandlung dieser Patienten gehemmt werden kann (Seabold et al., J. Nucl. Med. 29: 1169-1180, 1988). Eine Heparinisierung kann ebenfalls die Gesamtzahl der Läsionen, die mit Anti- Fibrin-Antikörpern festgestellt werden, verringern (Alavi et al., J. Nucl. Med., 29: 825, 1988). Im Vergleich zu Anti-Fibrin-Antikörpern scheint Fragment-E&sub1;, das radiomarkiert ist, Blutgerinnsel früher anzuzeigen (Koblik et al., vorstehend zitiert). Jedoch ist Fragment-E&sub1; schwierig zu isolieren und herzustellen, und seine Bindung an Blutgerinnsel ist vorübergehend (Knight et al., Radiology, 156: 509-514, 1985). Daher besteht weiterhin ein Bedarf nach einem Präparat, das eine Kombination von zwei oder mehr dieser Blutgerinnsel-abbildenden Agenzien, wobei jedes das andere/die anderen ergänzt, enthält; z.B. ein Anti-Fibrin-Antikörper oder -Antikörperfragment oder Fragment E&sub1; und ein Anti-Leukozyten-Antikörper oder -Antikörperfragment und/oder ein Anti-Thrombozyten- oder Anti-aktivierte Thrombozyten- Antikörper oder -Antikörperfragment, oder ein Anti-Fibrin-Antikörper oder -Antikörperfragments und ein Anti-Thrombozyten- oder Anti-aktivierte Thrombozyten-Antikörper oder -fragment; wobei alle auf geeignete Weise markiert sind.
Eine unzureichende Blut- und Sauerstoff-Versorgung des Myokardiums, Symptome einer myokardialen Ischämie oder ischämischen Herzkrankheit induzierend, sind übliche Ereignisse, die aus einer stenotischen koronaren Arteriosklerose resultieren. Ein akuter und totaler Verschluß der Koronararterien führt zu einer schweren Ischämie und folglich zu myokardialer Infarktbildung. Chronologisch gesehen manifestieren sich in der ersten Stunde subzelluläre Veränderungen des ischämischen Herzmuskels als mitochondriale Granula, Verringerung von Glykogen und respiratorischen Enzymen. Danach, nach etwa eins bis sechs Stunden, werden eine Margination und ein Verklumpen des nukleären Chromatins, ein Verlust der nukleären und der Myofilament-Architektur und eine Infiltration mit Granulozyten beobachtet. In der nächsten Phase, nach etwa sechs bis zwölf Stunden, werden typische ischämische Nekrosen gesehen. Nach 24 Stunden sind schwere histologische Veränderungen leicht zu sehen, die zu herdförmigen Blutungen verschiedener Größe und erweiterten Kapillaren bis zum zweiten bis vierten Tag führen.
Die zur Verfügung stehenden Tests zum Diagnostizieren, genauem Feststellen und Bestimmen des Umfangs der myokardialen Infarktbildung (MI) wie Elektrokardiogramm (EKG), Kreatininkinase- (Creatinine Kinase, CK-MB) Kurven, Auswurfs-Anteils (Ejection Fraction) sind alle mit einigen Beschränkungen belastet. Es sind nukleäre Abbildungsverfahren unter Verwendung von &sup9;&sup9;mTC-pyrophosphat oder ²&sup0;¹Thallium (TI) zum Diagnostizieren und Quantifizieren von MI entwickelt worden. In den letzten Jahren sind Antikörper und Antikörper-Fragmente gegen Myosin auf experimentelle und klinische Weise verwendet worden, um die Lokalisation in myokardialen Zellen anzuzeigen, die auf irreversible Weise durch einen ischämischen Insult geschädigt wurden (Khaw et al., J. Nucl. Med. 28: 1671-1678, 1987; Johnson et al., J. Am. Coll. Cardiol. 13: 27-35, 1989). Es wird behauptet, daß die Aufnahme eines Myosin-Antikörpers spezifisch für den Zelltod ist (Framie et al., J. Clin. Invest. 72: 535-544, 1983), und es wurde in klinischen Studien (vorstehend zitiert) festgestellt, daß mindestens 24 h erforderlich sind, bevor das Abbilden enthüllend war. Somit wären mindestens zwei oder mehr Tage nach einem ischämischen Insult erforderlich, bevor eine Anti-Myosin-Abbildung erfolgreich geschehen könnte, weil ein ausreichender Zelltod zuerst folgen muß, um zu ausreichenden Antigenstellen zu führen, die für die Anti-Myosin-Antikörper-Bindung zur Verfügung stehen. Somit besteht ein Bedarf nach einem Agens oder einer Kombination von Agenzien, die vor dem Auftreten von weitreichendem Zelltod und myokardialem Schaden diagnostisch sein werden und ebenfalls die Merkmale eines Anti- Myosin-Antikörpers und eines Leukozyten-abbildenden Agens kombinieren können. Für eine frühe Infarktbildung oder sogar arteriomatöse Plaques reicht deshalb ein Anti-Leukozyten-Antikörper zum Abbilden, beispielsweise innerhalb der ersten Stunden nach dem ischämischen Insult, aus.

Aufgaben der Erfindung

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Antikörper-, Ab-Fragment- oder Ab-Subfragment-Abbildungsmittel-Konjugat bereitzustellen, das an eine Art von Leukozyten bindet zum Anzielen und frühen Abbilden einer kardiovaskulären Läsion, wie Arteriosklerose, vaskulären Blutgerinnseln einschließlich Thromben und Embolien, und myokardialen Infarkten und anderen Organinfarkten.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein multispezifischer Antikörper-, Ab-Fragment- oder Ab-Subftagment-Zusammensetzung-Abbildungsmittel-Konjugat bereitzustellen, das auf selektive Weise an mindestens eine Art von Leukozyten bindet, und auf selektive Weise an mindestens ein Antigen bindet, das mit Fibrin, Myosin oder Thrombozyten assoziiert ist, zum Anzielen und frühen Abbilden von kardiovaskulären Läsionen mit einem erhöhten Verhältnis von Ziel zu Hintergrund.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein multispezifischer Antikörper-, Ab-Fragment- oder Ab-Subftagment-Zusammensetzung-Abbildungsmittel-Konjugat bereitzustellen, das auf selektive Weise mindestens zwei verschiedene Antigene, ausgewählt aus Fibrin-, Myosin- oder Thrombozytenassoziierten Antigenen, bindet, zum Anzielen und frühen Abbilden von kardiovaskulären Läsionen mit einem erhöhten Verhältnis von Ziel zu Hintergrund.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zum Leiten eines Konjugats aus einem monospezifischen oder multispezifischen Antikörper und einem Agens zu kardiovaskulären Läsionen mit einer höheren Wirksamkeit und einem erhöhten Verhältnis von Ziel zu Hintergrund bereitzustellen.
Noch ein weiteres Objekt der Erfindung ist, Reagenzien und Verfahren für einen wirksameren Nachweis von kardiovaskulären Läsionen bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es noch, Reagenzien und Verfahren für einen früheren Nachweis von kardiovaskulären Läsionen bereitzustellen.
Weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann im Lichte der folgenden Diskussion ersichtlich werden.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden gelöst durch Bereitstellung eines Konjugats aus einem monospezifischen Antikörper und einem Abbildungsmittel zum Anzielen und Abbilden kardiovaskulärer Läsionen umfassend einen monospezifischen Antikörper oder Antikörperfragment, das mit mindestens einem Abbildungsmittel konjugiert ist, wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment auf spezifische Weise an eine Art von Leukozyten bindet.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird gelöst durch Bereitstellen eines multispezifischer Antikörper-Mittel-Konjugats zum Anzielen und Abbilden kardiovaskulärer Läsionen umfassend eine immunreaktive multispezifische Zusammensetzung (composite) von mindestens zwei verschiedenen im wesentlichen monospezifischen Antikörpern oder Antikörperfragmenten, konjugiert mit mindestens einem Abbildungsmittel, wobei mindestens einer dieser Antikörper oder Antikörperfragmente auf spezifische Weise an eine Art von Leukozyte bindet und mindestens einer der Antikörper oder Antikörperfragmente an ein Antigen, das mit Fibrin, Myosin oder Thrombozyten assoziiert ist, bindet.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird gelöst durch Bereitstellung eines multispezifischer Antikörper-Mittel-Konjugats zum Anzielen und Abbilden kardiovaskulärer Läsionen umfassend eine immunreaktive multispezifische Zusammensetzung von mindestens zwei verschiedenen im wesentlichen monospezifischen Antikörpern oder Antikörperfragmenten, konjugiert mit mindestens einem Abbildungsmittel, wobei mindestens zwei der Antikörper oder Antikörperfragmente auf spezifische Weise an mindestens zwei verschiedene Antigene, ausgewählt aus Fibrin-, Myosin- oder Thrombozytenassoziierten Antigenen, binden.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird gelöst durch Bereitstellen eines multispezifischer Antikörper-Mittel-Konjugats zum Anzielen und Abbilden verschiedener kardiovaskulärer Läsionen umfassend eine immunreaktive multispezifische Zusammensetzung von mindestens zwei ver schiedenen im wesentlichen monospezifischen Antikörpern oder Antikörperfragmenten, konjugiert mit mindestens einem Abbildungsmittel, wobei mindestens einer der Antikörper oder Antikörperfragmente auf spezifische Weise an eine Art von Leukozyten bindet und mindestens einer der Antikörper oder Antikörperfragmente an ein Antigen bindet, das mit Fibrin, Myosin oder Thrombozyten assoziiert ist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird gelöst durch Bereitstellen eines multispezifischer Antikörper-Mittel-Konjugats zum Anzielen und Abbilden verschiedener kardiovaskulärer Läsionen umfassend eine immunreaktive multispezifische Zusammensetzung von mindestens zwei verschiedenen im wesentlichen monospezifischen Antikörpern oder Antikörperfragmenten, konjugiert mit mindestens einem Abbildungsmittel, wobei mindestens zwei der Antikörper oder Antikörperfragmente auf spezifische Weise an zwei verschiedene Antigene, ausgewählt aus Fibrin-, Myosin- oder Thrombozytenassoziierten Antigenen, binden.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfallren bereit zum Abbilden verschiedener kardiovaskulärer Läsionen, wobei das Verfahren das Injizieren eines Säugetiers auf parenterale Weise mit einer wirksamen Menge zum Anzielen und Abbilden der vorgenannten Konjugate aus monospezifischem oder polyspezifischem Antikörper und Mittel umfaßt.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren bereit zum frühen Diagnostizieren von kardiovaskulären Läsionen umfassend das Injizieren eines Säugetiers auf parenterale Weise mit einer wirksamen Menge zum Anzielen der vorgenannten Konjugate aus monospezifischem oder multispezifischem Antikörper und Agens.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung sterile injizierbare Zubereitungen (preparations) und Kits zur Verwendung bei der Ausübung des vorgenannten Verfahrens bereit.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt eine Verbesserung gegenüber im Stand der Technik bekannten Abbildungsverfahren für kardiovaskuläre Läsionen, wie arterioskierotischen Plaques, vaskulären Blutgerinnseln einschließlich Thromben und Embolien, myokardialen Infarkten und anderen Organinfarkten, bereit, weil sie ein sensitives Leiten des diagnostischen Mittels zu der pathologischen Stelle sehr früh nachdem die Verletzung geschieht ermöglicht, und somit eine bessere Diagnose und eine frühere Durchführung der Therapie ermöglicht.
Eine bevorzugte Verbesserung ist die Verwendung von multispezifischen Antikörperzusammensetzungen. Die multispezifische Antikörperzusammensetzung zum Anzielen umfaßt mindestens zwei verschiedene im wesentlichen monospezifische Antikörper oder Antikörperfragmente, wobei mindestens einer der Antikörper oder Antikörperfragmente auf spezifische Weise an eine Art von Leukozyten bindet und mindestens einer der Antikörper oder Antikörperfragmente auf spezifische Weise an ein Antigen, das mit Fibrin, Myosin oder Thrombozyten assoziiert ist, bindet. So wird mindestens eine antikörperbindende Stelle auf der Zusammensetzung an einen ersten Leukozyten-Zelltyp binden, während mindestens eine zweite antigenbindende Stelle auf der gleichen Zusammensetzung zum Anzielen an ein Antigen binden wird, das mit Fibrin, Myosin oder Thrombozyten assoziiert ist. Die Leukozytenarten schließen Granulozyten, Monozyten, B-Lymphozyten und T-Lymphozyten ein, die an der Entwicklung kardiovaskulärer Läsionen beteiligt sind.
Das immunologische Profil der im wesentlichen monospezifischen, vorzugsweise monoklonalen Antikörper, die zur Herstellung der Antikörperzusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, kann eingestellt werden, um ein optimales Binden an die kardiovaskulären Läsionen und eine minimale Bindung an Nicht-Ziel-Stellen sicherzustellen. Ein Gemisch von Antikörpern, Antikörperfragmenten oder Subfragmenten mit verschiedenen Spezifitäten, d.h. Leukozyten und Fibrin-, Myosin- und Thrombozytenassoziierten Antigenen, kann den Prozentsatz der injizierten Dosis, die die Zielstelle erreicht, verbessern, wenn das richtige Verhältnis der Spezifitäten verwendet wird. Der Abbildungsmittel-Bestandteil des Antikörper-Mittel- Konjugats wird dadurch an der Zielstelle mit einer höheren Wirksamkeit und einem erhöhten Verhältnis von Ziel zu Hintergrund lokalisiert. Da die Leukozyteninfiltration ein sehr frühes Ereignis bei kardiovaskulären Läsionen ist, erlaubt dieses Verfahren eine sehr frühe Erkennung des Auftretens von Arteriosklerose, ischämischer Herzkrankheit, Blutgerinnseln und Embolien, sogar früher als unter Verwendung anderer zur Zeit bekannter Antikörper- Radiokonjugate oder diagnostischer Mittel.
Die erfindungsgemäßen immunreaktiven Konjugate können einen monospezifischen, bispezifischen, trispezifischen oder, auf allgemeinere Weise, multispezifischen Antikörper/-Fragment/-Subfragment, Fv oder Einzelketten-bindende Proteine umfassen, konjugiert mit einem zum Abbilden dienenden Radioisotop, fluoreszierenden Mittel, Computertomographie-Kontrastmittel oder paramagnetischer Spezies (Magnetresonanz-Kontrastmittel). Der Antikörperbestandteil des Konjugats kann mit ganzen Antikörpern, Antikörperfragmenten, Subfragmenten (Fv oder kleinere Bindungseinheiten) einer einzelnen Säugetierart oder eine auf gentechnische Weise hergestellte Kombination von Arten (wie eine Kombination von Mensch und Nagetier, in sogenannten humanisierten oder chimärisierten Antikörpern) hergestellt werden. Die Antikörper können ganzes Immunglobulin jeder beliebigen Klasse sein, z.B. IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, chimäre oder hybride Antikörper mit zweifachen oder vielfachen Antigen- oder Epitop-Spezifitäten, oder Fragmente z.B. F(ab')&sub2;, F(ab)&sub2;, Fab, Fab', Fv und dergleichen, einschließlich von Hybridfragmenten, und schließen zusätzlich ein beliebiges Immunglobulin oder jedes natürliche, synthetische oder auf gentechnische Weise hergestellte Protein, z.B. ein Einzelketten-Antikörperfragment, das wie ein Antikörper wirkt, durch Bindung an ein spezifisches Antigen unter Bildung eines Komplexes, ein.
Monoklonale Antikörper sind zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet und sind wegen ihren hohen Spezifitäten bevorzugt. Sie werden leicht hergestellt durch das, was man nun allgemein als übliche Verfahren betrachtet zur Immunisierung von Säugetieren mit einem immunogenen Antigen-Präparat, Fusion von Immunlymph- oder Milz-Zellen mit einer permanenten/immortalen Myelom-Zellinie und Isolieren von spezifischen Hybridom-Klonen. Unüblichere Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern werden nicht ausgeschlossen, wie Interspeziesfusionen und auf gentechnische Weise hergestellte Manipulationen der hypervariablen Regionen, da es hauptsächlich die Antigen-Spezifität der Antikörper ist, die ihre Nützlichkeit in der vorliegenden Erfindung beeinträchtigt. Die Verwendung von rein menschlichen monoklonalen Antikörpern ist ebenfalls bevorzugt, da dies die Immunogenizität des Reagenzes gegenüber dem Patienten verringern würde.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung stellt man sich auch die Verwendung von Antigen-spezifischen Fragmenten zur Bildung des multispezifischer Antikörper-Agens-Konjugats vor. Antikörperfragmente können durch Pepsin- oder Papain-Verdau von ganzen Immunglobulinen durch übliche Verfahren hergestellt werden. Es ist bekannt, daß Antikörperfragmente durch enzymatische Spaltung von Antikörpern mit Pepsin unter Bereitstellung eines 5S- Fragments hergestellt werden können, das als F(ab')&sub2; bezeichnet wird. Dieses Fragment kann unter Verwendung eines Thiol-reduzierenden Agens, und wahlweise einer Schutzgruppe für die Sulfhydrylgruppen, die aus der Spaltung der Disulfidbrücken resultieren, unter Erzeugung von monovalenten 3,5S-Fab'-Fragmenten weiter gespalten werden. Auf alternative Weise dazu erzeugt eine enzymatische Spaltung unter Verwendung von Pepsin zwei monovalente Fab-Fragmente und ein Fc-Fragment auf direkte Weise. Diese Verfahren werden inter alia durch Goldenberg, in den US Patentschriften Nr. 4,036,945 und 4,331,647 und den darin enthaltenen in Bezug genommenen Druckschriften beschrieben sowie in Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys., 89, 230 (1960); Porter, Biochem. J., 73, 119 (1959); und Edelman et al., in "Methods in Immunology and Immunochemistry", Bd. 1, 422 (Acad. Press, 1967) und sind im Stand der Technik üblich.
Andere Verfahren zur Spaltung von Antikörpern, wie die Trennung der schweren Ketten unter Bildung von monovalenten leichte-schwere-Kettenfragmenten, weitere Spaltung von Fragmenten oder andere enzymatische, chemische oder gentechnische Verfahren können ebenfalls angewendet werden, solange die Fragmente ihre Spezifität gegenüber dem Antigen beibehalten, gegen das ihre Ausgangsantikörper hervorgerufen werden.
Antikörper gegen Leukozyten-Antigene können durch Inokulieren eines Wirts mit Leukozyten der Patientenart hergestellt werden. Beispielsweise können Antikörper zur Verwendung beim Menschen durch Immunisierung von Mäusen oder anderen Säugetierarten mit menschlichen Leukozyten hergestellt werden. Anti-Mensch-Leukozyten-Serum kann von dem Wirt gesammelt und affinitätsgereinigt werden, um einen polyklonalen Antikörper zur Herstellung der Zusammensetzung bereitzustellen. Alternativ dazu können Splenozyten von dem immunisierten Wirt genommen und mit einer geeigneten Tumorzelllinie unter Verwendung somatischer Zellhybridisations-Verfahren zur Bildung von Hybridomen fusioniert werden, die Anti-Leukozyten-Antikörper erzeugen. Diese Hybridome können isoliert, subkioniert und kultiviert werden, um monoklonale Antikörper zu erzeugen.
Monoklonale Antikörper oder Fragmente, die ein Leukozyten-Antigen erkennen und binden, sind im Handel erhältlich oder können durch somatische Zellhybridisationsverfahren hergestellt werden, die ursprünglich durch Köhler, B. und Milstein, C., Nature (1975) 256: 495-497 beschrieben und übersichtsmäßig in Länge dargestellt wurden in Monoclonal Antibodies, Kennett, T.J., et al., Hrsg., Plenum (1980). Im Handel erhältliche monoklonale Antikörper gegen Leukozyten-Antigene werden dargestellt durch: Monoklonale OKT Anti-T-Zell-Antikörper (erhältlich von Ortho Pharmaceutical Company), die normale T-Lymphozyten binden; die monoklonalen Antikörper, die durch die Hybridome mit den ATCC-Empfangsnummern HB44, HB55, HB12, HB78 und HB2 erzeugt werden; G7E11, W8E7, NKP15 und G022 (Becton Dickinson); NEN9.4 (New England Nudear); und FMC11 (Sera Labs).
Der Katalog von Immunotech (Marseille, Frankreich, mit weltweitem Vertrieb einschließlich Pel Freeze, Brown Deer, WI, USA) führt im Handel erhältliche monoklonale Anti-Leukozyten-Antikörper auf, von denen viele zur Herstellung von Zusammensetzungen oder Therapiereagenzien gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Diese schließen Antikörper, die auf spezifische Weise an T-Zellen, aktivierte T-Zellen, B-Zellen, Monozyten und Granulozyten, einschließlich Subpopulationen davon, binden, ein. Bestimmte dieser Antikörper binden an Antigene, die mehr als einer Art von Leukozyten gemein sind, z.B. Monozyten und Granulozyten, B-Zellen und Granulozyten, T-Zellen und B-Zellen, T-Zellen und Granulozyten, T-Zellen und Monozyten und Granulozyten und B-Zellen und dergleichen. Die durch Immunotech hergestellten und vertriebenen Antikörper sind anderen Antikörpern von sonstwo erhältlichen Klonen ähnlich.
Geeignete Anti-T-Zell-Antikörper schließen Antikörper ein, die das CD1-, CD2-, CD4-, CD6-, CD7- oder CD8-Antigen binden. Bevorzugte Anti-T- Zell-Antikörper sind jene, die das CD3-Antigen und das CD-5-Antigen binden. Ein bevorzugter Antikörper, der sowohl Monozyten- als auch Granulozyten-Antigene bindet, ist ein monoklonaler Antikörper, der insbesondere das CDW14-Antigen bindet. Bevorzugte Antikörper, die B-Zellen binden, schließen Antikörper ein, die das CD19- oder CD21-Antigen binden. Antikörper, die an aktivierte T-Zellen binden, schließen monoklonale Antikörper ein, die an das CD25- oder CD26-Antigen binden. Die CD-Antigene sind Leukozyten-Determinanten, die Antikörper mit bestirrunten Leukozyten-Spezifitäten definieren. Ein Paar von Antikörpern, das das gleiche Epitop auf dem gleichen CD-Antigen bindet, wird die Bindung an die gleiche Leukozytenart kreuzblockieren. Antikörper, die auf spezifische Weise an das Ia- (HLA-DR-) Histokompatibilitätsantigen binden, das Monozyten, B-Lymphozyten und aktivierten T-Leukozyten gemein ist, werden als Anti-HLA-DR- Klasse II-Antikörper klassifiziert und sind von besonderer Nützlichkeit für bestimmte Anwendungen.
Die im Handel erhältlichen monoklonalen Antikörper gegen Leukozyten- Antigene stammen typischerweise aus der Maus oder Ratte und sind typischerweise IgGs oder IgMs, obwohl es nicht beabsichtigt ist, daß geeignete Antikörper zur Verwendung bei der Herstellung von erfindungsgemäßen Konjugaten hinsichtlich ihrer Spezies oder Ig-Klasse begrenzt sind. Im allgemeinen können Antikörper gewöhnlich gegen die meisten Antigene unter Verwendung der vielen üblichen Verfahren, die nun im Stand der Technik bekannt sind, hervorgerufen werden. Jeder beliebige Antikörper, der an ein Leukozyten-Antigen bindet, das in ausreichender Konzentration an einer kardiovaskulären Läsion in dem Körper eines Säugetiers gefunden wird, kann zur Herstellung der zum Anzielen dienenden multispezifischer Antikörper- Zusammensetzung zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Es ist im allgemeinen wünschenswert, Antikörper mit einer relativ hohen Immunreaktivität zu verwenden, d.h. einer Bindungskonstante von mindestens etwa 10&sup5; l/Mol, bevorzugt mindestens etwa 10&sup7; l/Mol und einer hohen Immunspezifität, d.h. mindestens etwa 40%, bevorzugt mindestens etwa 60%, und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 70-95%, für Leukozyten- Antigene.
Es kann für bestimmte Anwendungen bevorzugt sein, Antikörper mit einer etwas niedrigeren Bindungskonstante in der vorliegenden Erfindung zu verwenden. Antikörper mit höheren Bindungskonstanten binden wahrscheinlich auffeste Weise nicht nur an Leukozyten an der Stelle der Verletzung, sondern auch an Leukozyten, die in dem zirkulatorischen System, dem Knochenmark oder normalen Geweben anwesend sind. Andererseits werden Antikörper mit einer niedrigeren Bindungskonstante dazu neigen, sich hauptsächlich an konzentrierten Leukozytenherden an der Stelle einer Läsionmittels einer Art von Massenhandlungswirkung (Mass Action Effect) abzulagern. Dies wird eine vorzeitige Clearance und eine Nicht-Zielablagerung des Abbildungsmarkierungsstoffes verringern.
Eine Beschreibung von gegenwärtigen Antikörpern gegen Fibrin- und Thrombozyten-Antigene ist in Knight, Semin. Nucl. Med., 20: 52-67 (1990) enthalten. Anti-Myosin-Antikörper werden in Khaw et al., J. Clin. Invest, 58: 439-446, 1976; Khaw et al., Hybridoma, 3: 11-23 (1984) beschrieben.
Antikörper-Zusammensetzungen zum Abbilden können durch eine Vielzahl von üblichen Verfahren hergestellt werden, die von einer einfachen Glutaraldehyd-Bindung bis zu eleganteren und spezifischeren Bindungen zwischen fünktionellen Gruppen reichen. Die Antikörper und/oder Antikörperfragmente werden vorzugsweise auf kovalente Weise miteinander gebunden, auf direkte Weise oder durch einen kurzen oder langen Linker-Anteil, durch eine oder mehrere fünktionelle Gruppen auf dem Antikörper/-fragment, z.B. Amin-, Carboxyl-, Phenyl-, Thiol- oder Hydroxyl-Gruppen. Zusätzlich zu Glutaraldehyd können verschiedene übliche Linker verwendet werden, z.B. Diisocyanate, Diisothiocyanate, Bis-(hydroxysuccinimid)ester, Carbodiimide, Maleimidhydroxysuccinimidester und dergleichen.
Ein einfaches Verfahren ist, die Antikörper/-fragmente in Gegenwart von Glutaraldehyd unter Bildung der Antikörperzusammensetzung zu mischen. Die anfänglichen Schiff'sche Base-Bindungen können stabilisiert werden, z.B. durch Borhydrid-Reduktion zu sekundären Aminen. Dieses Verfahren wird üblicherweise verwendet, um andere Konjugate von Proteinen herzustellen z.B. Peroxidase-Antikörper-Konjugate für immunhistochemische Verwendungen oder fur Immunoassays. Ein Diisothiocyanat oder ein Carbodiimid kann anstelle von Glutaraldehyd als ein Linker, der nicht für eine Stelle spezifisch ist, verwendet werden.
Bispezifische Antikörper können durch eine Vielzahl von üblichen Verfahren hergestellt werden, z.B. Disulfid-Spaltung und eine erneute Bildung von Gemischen von ganzen IgG oder vorzugsweise F(ab')&sub2;-Fragmenten, Fusionen von mehr als einem Klon unter Bildung von Polyomen, die Immunglobuline mit mehr als einer Spezifität erzeugen, und durch gentechnische Herstellung. Die bispezifischen Antikörper können an Kombinationen von Leukozyten und anderen Zellen oder Proteinen, die mit kardiovaskulären Läsionen assoziiert sind, wie Fibrin, Myosin, oder Thrombozyten, binden. Die bispezifischen Antikörper können ebenfalls an zwei verschiedene Antigene, ausgewählt aus Fibrin-, Myosin- oder Thrombozyten-assoziierten Antigenen, binden. Bispezifische ("Hybrid-")Antikörperfragmente sind hergestellt worden durch oxidative Bindung von F(ab')-Fragmenten, die aus der reduktiven Spaltung verschiedener Antikörper resultieren. Ein Teil dieser wird Fragmente enthalten, die für beide Antigene gegen die die ursprünglichen Antikörper erzeugt wurden, spezifisch sind. Dies wird auf vorteilhafte Weise durchgeführt durch Vermischen von zwei verschiedenen F(ab')&sub2;-Fragmenten, die durch Pepsinverdau von zwei verschiedenen Antikörpern erzeugt wurden, reduktive Spaltung unter Bildung eines Gemischs von Fab'-Fragmenten, gefolgt durch oxidative erneute Bildung der Disulfidbindungen unter Bildung eines Gemischs von F(ab')&sub2;-Fragmenten einschließlich von Hybridfragmenten, die einen F(ab')- Anteil enthalten, der spezifisch für jedes der ursprünglichen Antigene ist. Verfahren zum Herstellen derartiger Antikörperfragmente sind in Feteanu, "Labeled Antibodies in Biology and Medicine", S. 321-323 (McGraw-Hill Int. Bk. Co., New York et al., 1978); Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys., 93, 470 (1961); und Hammerling et al., J. Exp. Med., 128, 1461 (1968); und in U.S. Patent 4,331,647, offenbart.
Eine selektivere Bindung kann unter Verwendung eines heterobifunktionalen Linkers wie eines Maleimidhydroxysuccinimidesters erzielt werden. Die Reaktion des Letztgenannten mit einem Antikörper/-fragment wird die Amingruppen auf dem Antikörper/-fragment derivatisieren, und das Derivat kann dann z.B. einem Antikörper-Fab'-Fragment mit freien Sulfhydrylgruppen (oder einem größeren Fragment oder einem intakten Immunglobulin mit Sulfhydrylgruppen, die daran z.B. mit Traut's Reagenz angehängt wurden) umgesetzt werden. Ein derartiger Linker wird weniger wahrscheinlich Gruppen in dem gleichen Antikörper vernetzen und verbessert die Selektivität der Bindung.
Es ist vorteilhaft, die Antikörper/-fragmente an Stellen, die sich entfernt von der Antigenbindungsstelle befinden, zu binden. Dies kann beispielsweise erreicht werden durch Bindung an gespaltene Interchain-Sulfhydrylgruppen, wie vorstehend festgestellt. Ein anderes Verfahren umfaßt das Umsetzen eines Antikörpers, dessen Kohlenhydratanteil oxidiert worden ist, mit einem anderen Antikörper, der mindestens eine freie Aminofunktion besitzt. Dieses führt zu einer anfänglichen Schiff'sche-Base-(Imin)-Bindung, die vorzugsweise durch Reduktion zu einem sekundären Amin stabilisiert wird, z.B. durch Borhydridreduktion, unter Bildung der endgültigen Zusammensetzung. Derartige stellen-spezifische Bindungen werden für kleinere Moleküle oder Polypeptide oder für Festphasen-Polymerträgermaterialien in US Patent 4,671,958 offenbart und für größere Addenden in US Patent 4,699,784.
Unter den verschiedenen Arten von bispezifischer Antikörper-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind die folgenden eingeschlossen, die besonders nützlich für bestimmte Anwendungen sind: eine Zusammensetzung von Antikörpern/-fragmenten, spezifisch für Leukozyten und Myosin, für den Nachweis von myokardialen Infarkten und arteriosklerotischen Plaques. Somit ist für das allgemeine Ziel des Abbildens von MI eine kombinierte Zubereitung eines Anti-Myosin-Antikörpers und eines Anti-Leukozyten-Antikörpers bevorzugt. Bevorzugt sind Fab'- oder Einzelketten-Antikörper-Formen, die ein sehr schnelles Anzielen, durch Erreichen eines sehr hohen Verhältnisses von Läsion zu Blut, nach Injektion erlauben würden. Diese Verbesserung würde es dann zulassen, dieses diagnostische Verfahren in der Notaufnahme einzusetzen, wenn ein Patient mit Brustschmerz oder anderen Zeichen und Symptomen eines MI aufgenommen wird. Diese frühe Anwendung ist gegenwärtig nicht mit der Verwendung von Anti-Myosin-Antikörpern allein möglich (Johnson and Seldin, Semin. Nucl. Med. 19: 238-246, 1989).
Ebenfalls eingeschlossen ist eine Zusammensetzung aus Antikörpern/-fragmenten, die spezifisch für Leukozyten und Fibrin-assoziierte Antigene ist, für den Nachweis von Thromben; eine Zusammensetzung aus Antikörpern/-fragmenten, die spezifisch für Leukozyten und Thrombozyten-assoziierte Antigene sind, für den Nachweis von Thromben; und eine Zusammensetzung aus Antikörpern/-fragmenten, die spezifisch für Fibrin und Thrombozyten-assoziierte Antigene sind, für den Nachweis von Thromben und Embolien.
Die Begriffe "multispezifischer Antikörper-Agens-Konjugat" und "multispezifische Zusammensetzung", wie sie in den Patentansprüchen verwendet werden, umfassen auch bispezifische Antikörper-Agens-Konjugate bzw. bispezifische Zusammensetzungen.
Es können ähnliche Umsetzungen verwendet werden, um eine Vielzahl von Antikörpern und/oder Antikörperfragmenten, z.B. Fab- oder F(ab')&sub2;-Fragmente, aneinander unter Bildung von multispezifischen Zusammensetzungen zu binden. Bispezifische Zusammensetzungen können an einen Antikörper/- fragment gebunden werden, das spezifisch für eine dritte, vierte oder weitere Leukozyten-Zellart oder ein Myosin-, Fibrin- oder Thrombozyten-assoziiertes Antigen ist, unter Verwendung z.B. eines heterobifunktionalen Maleimidhydroxysuccinimidester-Linkers zum Derivatisieren einer Aminogruppe, gefolgt durch die Umsetzung des Derivats mit einem Fragment mit einer freien Sulfhydrylgruppe, wahlweise eingeführt mit einem Reagenz wie 2- Iminothiolan. Alternative Verbindungsarten werden dem Fachmann auf der Grundlage der Offenbarung für eine Bildung der bispezifischen Zusammensetzung leicht ersichtlich sein, und werden nur eine unbedeutende Variation und Anpassung derartiger Verfahren erfordern.
Unter den verschiedenen Arten von trispezifischer/multispezifischer Antikörper-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung aus Antikörpern/-fragmenten enthalten, die spezifisch für Leukozyten und Antigene ist, die mit Fibrin und Thrombozyten assoziiert sind, für den Nachweis von Thromben und pulmonären Embolien. Andere derartige multispezifische Zusammensetzungen werden dem Fachmann leicht ersichtlich sein. Der monospezifische Antikörper oder die monospezifische Antikörperzusammensetzung kann mit einem Radioisotop für ein szintigraphisches Abbilden oder einem Magnetresonanz-Abbildungsverstärkungsmittel markiert sein, oder konjugiert oder für eine Konjugation damit angepaßt sein, zur Verwendung als ein diagnostisches Abbildungsmittel. Jedes beliebige übliche Verfahren zur Radiomarkierung, das für die Markierung von Proteinen für die in vivo-Verwendung geeignet ist, wird im allgemeinen für die Markierung der Zusammensetzung geeignet sein. Dies kann durch direktes Markieren mit beispielsweise einem Radioisotop eines Halogens oder eines Metallions unter Anwendung üblicher Verfahren oder ausgeklügelterer Methodologien oder durch Befestigen eines Chelators für ein Radiometall oder ein paramagnetisches Ion erzielt werden. Derartige Chelatoren und ihre Befestigungsweisen an Antikörpern sind dem Fachmann wohl bekannt und werden inter alia in z.B. Childs et al., J. Nuc. Med., 26: 293 (1985); und in den US Patenten von Goldenberg 4,331,647, 4,348,376, 4,361,544, 4,468,457, 4,44,744 und 4,624,846 offenbart. Typische Beispiele sind Derivate von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA). Diese besitzen typischerweise Gruppen an der Seitenkette, durch welche der Chelator an den Antikörper gebunden werden kann. Alternativ dazu können Carboxyl- oder Amin-Gruppen auf einem Chelator aktiviert werden und dann an eine Antikörperzusammensetzung durch wohlbekannte Verfahren gekoppelt werden. Beispielsweise besitzt Deferoxamin, das ein Chelator für Ga-67 ist, eine freie Aminogruppe, die mit einem geeigneten Linker aktiviert werden kann zum Enthalten einer aktivierten Carboxyl-, Isothiocyanat-Gruppe oder einer ähnlichen Gruppe, und dann an Amine auf der Antikörperzusammensetzung gekoppelt werden kann.
Der Chelator kann an die Antikörperzusammensetzung gebunden sein, auf direkte Weise oder durch einen kurzkettigen oder langkettigen Linker-Anteil, durch eine oder mehrere funktionelle Gruppen auf dem Antikörper, z.B. Amin-, Carboxyl-, Phenyl-, Thiol- oder Hydroxyl-Gruppen. Verschiedene übliche Linker können verwendet werden, z.B. Diisocyanate, Diisothiocyanate, Carbodiimide, Bis-(hydroxysuccinimid)ester, Maleimidhydroxysuccinimidester, Glutaraldehyd und dergleichen, vorzugsweise einem selektiven sequentiellen Linker wie dem Anhydrid-Isothiocyanat-Linker, der in dem US Patent 4,680,338 offenbart ist.
Das Markieren mit entweder Iod-131 (I-131) oder Iod-123 (I-123) wird leicht bewirkt unter Anwendung eines oxidativen Verfahrens, wobei ein Gemisch von radioaktivem Kalium- oder Natriumiodit und der Antikörper mit Chloramin-T behandelt wird, beispielsweise wie durch Greenwood et al., Biochem. J., 89, 114 (1963) berichtet und von McConahey et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 29, 185 (1969) modifiziert wurde. Dies führt zu einem Austausch der Iodatome gegen die Wasserstoffatome auf dem Antikörpermolekül, vermutlich an Tyrosin-Resten, möglicherweise ebenfalls an Tryptophan- und sogar an Phenylalaninresten, in Abhängigkeit von den Verhältnissen der Reagenzien und den Reaktionsbedingungen. Alternativ dazu kann eine Lactoperoxydase-Iodierung angewendet werden, wie durch Feteanu, supra, Seite 303, und den darin zitierten Druckschriften beschrieben wurde.
Einige mehr fortgeschrittene Verfahren zum Markieren werden in den europäischen Patentanmeldungen EP-A-0205326, EP-A-0306168 und EP-A- 0336678 offenbart. Ein weiter Bereich von Markierungsverfahren wird in Feteanu, "Labeled Antibodies in Biology and Medicine", S. 214-309 (McGraw-Hill Int. Book Co., New York et al., 1978) offenbart. Die Einführung verschiedener Metallradioisotope kann gemäß den Verfahren nach Wagner et al., J. Nucl. Med., 20, 428 (1979); Sundberg et al., J. Med. Chem., 17, 1304 (1974); und Saha et al., J. Nucl. Med., 6, 542 (1976) erzielt werden. Die vorgenannten sind rein veranschaulichend für die vielen Verfahren zur Radiomarkierung von Proteinen, die im Stand der Technik bekannt sind.
Beispiele von Verbindungen, die für die MRI-Abbildungsverstärkung nützlich sind umfassen paramagnetische Ionen z.B. Gd (III)-, Eu (III)-, Dy (III)-, Pr (III)-, Pa (IV)-, Mn (II)-, Cr (III)-, Co (III)-, Fe (II)-, Cu (II)-, Ni (II)-, Ti (III)-, und V (IV)-Ionen, oder Radikale, z.B. Nitroxide, und diese würden mit einem Substrat konjugiert sein, das paramagnetische Ionenchelatoren oder exponierte komplexbildende funktionelle Gruppen, beispielsweise SH, NH&sub2;, COOH, für die Ionen, oder Linker für die Radikal-Addenden trägt. Das MRI-Verstärkungsmittel muß in ausreichenden Mengen anwesend sein, um den Nachweis durch eine externe Kamera zu ermöglichen, bei Verwendung magnetischer Feldstärken, die vernünftigerweise erreichbar sind und mit der Sicherheit des Patienten und dem instrumentellen Design vereinbar sind. Die Erfordernisse für derartige Agenzien sind im Stand der Technik für solche Agenzien für jene Agenzien wohlbekannt, die ihre Wirkung auf Wassermoleküle in dem Medium besitzen und sind inter alia in, z.B. Pykett, Scientific American 246 78 (1982); und Runge et al., Am. J. Radiol., 141: 1209 (1987) offenbart.
Es liegt auf der Hand, daß viele der gleichen Verfahren zum Einführen von Metallen, direkt oder in der Form von Chelaten, in Antikörper geeignet sein werden für die Einführung von MRI-Agenzien in die Antikörper-Zusammensetzung der Erfindung unter Bildung von Abbildungsmitteln für infektiöse Läsionen. MRI-Agenzien besitzen vorteilhafterweise eine große Anzahl von paramagnetischen Ionen oder Radikalen für eine verbesserte Abbildung. Ein Verfahren zum Einführen einer Vielzahl von derartigen Ionen ist, ein Trägerpolymer mit Chelaten zu beladen, und den Träger an die Antikörperzusammensetzung zu binden, vorzugsweise stellenspezifisch, an einer Stelle, die von den antigenen Bindungsstellen der Zusammensetzung entfernt ist. Dies besitzt den Vorteil, daß größere Anzahlen von Chelatoren an dem Antikörper an weniger Stellen auf dem Antikörper selbst gebunden werden können, so daß die Immunreaktivität nicht ernsthaft gefährdet wird. Beispiele von Polymeren, die für das Beladen des Antikörpers mit Chelatoren nützlich sind, schließen z.B. Polyole, Polysaccharide, Polypeptide und dergleichen ein. Siehe US Patente 4,699,784 (Shih et al.) und siehe 4,046,722 (Rowland). Eine Art von Polysaccharid ist Dextran. Der Chelator kann funktionalisiert werden, um reaktive Gruppen in Bezug auf die Hydroxylgruppen des Dextrans zu enthalten, z. B. Anhydride, Isocyanate oder Isothiocyanate und dergleichen. Alternativ dazu kann das Dextran auf einer Anzahl von Wegen derivatisiert werden, beispielsweise durch Umwandlung in ein Aminodextran. Es wird klar sein, daß ähnliche Verfahren zum Laden einer Vielzahl von Arzneimittelmolekülen auf einen Antikörper oder eine Antikörperzusammensetzung nützlich sein werden, wie es nachfolgend umfassender diskutiert werden wird.
Das Verfahren zum Herstellen eines Antikörper-Konjugats mit einem Aminodextran-(AD-)Träger beginnt normalerweise mit einem Dextranpolymer, vorteilhafterweise einem Dextran mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht (MW) von etwa 10.000 - 100.000, bevorzugterweise etwa 10.000 - 40.000, und stärker bevorzugt etwa 15.000. Das Dextran wird dann mit einem oxidierenden Mittel umgesetzt, um eine kontrollierte Oxydation eines Teils seiner Kohlenhydratringe unter Bildung von Aldehydgruppen zu bewirken. Die Oxidation wird zweckmäßigerweise mit einem glycolytischen chemischen Reagenz, z.B. NaIO&sub4;, gemäß herkömmlichen Verfahren bewirkt.
Es ist zweckmäßig, die Menge an Oxidationsmittel so einzustellen, daß etwa 50-150, bevorzugterweise 100 Aldehydgruppen gebildet werden, für ein Dextran mit einem MW von etwa 40.000, mit etwa dem gleichen Verhältnis an Aldehydgruppen für andere MW-Dextrane. Eine größere Anzahl von Aldehydgruppen, und nachfolgend Aminogruppen, ist weniger vorteilhaft, weil das Polymer sich dann mehr wie Polylysin verhält. Eine niedrigere Anzahl führt zu einem weniger wünschenswerten Beladen des Chelators oder Boraddenden, was nachteilig sein kann.
Das oxidierte Dextran wird dann mit einem Polyamin, bevorzugterweise einem Diamin, und stärker bevorzugt einem Mono- oder Polyhydroxydiamin, umgesetzt. Geeignete Amine umfassen z.B. Ethylendiamin, Propylendiamin oder ähnliche Polymethylendiamine, Diethylentriamine oder ähnliche Polyamine, 1,3-Diamino-2-hydroxypropan oder andere wie hydroxylierte Diamine oder Polyamine, und dergleichen. Ein Überschuß des Amins in bezug auf die Aldehydgruppen kann verwendet werden, um eine im wesentlichen vollständige Umwandlung der Aldehydfünktionen zu Schiff'sche-Base-(Imin-) Gruppen sicherzustellen.
Eine reduktive Stabilisierung der resultierenden Zwischenstoffe wird durch Umsetzen des Schiff'sche-Base-Zwischenprodukts mit einem reduzierenden Agens, z.B. NaBH&sub4;, NaBH&sub3;CN oder dergleichen, bewirkt. Ein Überschuß des Reduktionsmittels wird verwendet, um eine im wesentlichen vollständige Reduktion der Imingruppen zu sekundären Aminogruppen, und eine Reduktion von irgendwelchen nicht umgesetzten Aldehydgruppen sicherzustellen. Das resultierende Addukt kann durch Passage durch eine übliche Größenbestimmungssäule zum Entfernen vernetzter Dextrane weiter gereinigt werden. Eine Schätzung der primären Anzahl von verfügbaren Aminogruppen auf dem AD kann durch Umsetzung einer abgewogenen Probe mit Trinitrobenzolsulfonsäure und Korrelation der optischen Dichte bei 420 nm mit einem Standard bewirkt werden. Dieses Verfahren führt normalerweise zu im wesentlichen vollständiger Umsetzung der errechneten Anzahl von Aldehydgruppen zu primären Aminogruppen auf dem AD.
Alternativ dazu, kann das Dextran derivatisiert werden durch übliche Verfahren zum Einführen von Aminofunktionen, z.B. durch Umsetzung mit Cyanbromid, gefolgt durch Umsetzung mit einem Diamin. Das AD sollte umgesetzt werden mit einem Derivat eines bestimmten Arzneimittels oder Chelators, in einer aktivierten Form, bevorzugterweise eines Carboxyl-aktivierten Derivats, hergestellt durch übliche Verfahren, z.B. unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder einer wasserlöslichen Variante davon.
Das szintigraphische Abbildungsverfahren der Erfindung wird ausgeübt durch Injizieren eines Säugetiers, bevorzugterweise eines Menschen, auf parenterale Weise mit einer wirksamen Menge für das szintigraphische Abbilden des radiomarkierten monospezifischer/multispezifischer Antikörper-Agens-Konjugats. Mit dem Begriff "auf parenterale Weise" ist beispielsweise gemeint: auf intravenöse, intraarterielle, intrathekale, interstitielle oder intrakavitäre Weise. Für das Abbilden von kardiovaskulären Läsionen ist die intravenöse oder intraarterielle Verabreichung bevorzugt. Es wird in Erwägung gezogen, daß ein Subjekt einer Dosierung von etwa 1 mCi bis 50 mCi an radiomarkiertem Konjugat erhalten wird, wobei die Menge eine Funktion des bestimmten Radioisotops und der Art der Verabreichung ist. Für eine intravenöse oder arterielle Injektion sind die Mengen normalerweise: etwa 2-10 mCi, bevorzugterweise etwa 2-5 mCi, an I-131; etwa 5-10 mCi, bevorzugterweise etwa 8 mCi, an I-123; etwa 10 - 40 mCi, bevorzugterweise etwa 20 mCi an Tc- 99m; etwa 2-5 mCi, bevorzugterweise etwa 4 mCi, an In-111 oder Ga-67.
Das radiomarkierte monospezifischer/multispezifischer Antikörper-Agens-Konjugat wird zweckmäßigerweise als eine injizierbare Zubereitung für eine Verwendung bei Säugetieren bereitgestellt, bevorzugterweise eine sterile injizierbare Zubereitung für eine Verwendung beim Menschen, zum Leiten eines szintigraphischen Abbildungsmittels zu einer kardiovaskulären Läsion, bevorzugterweise umfassend: eine sterile injizierbare Lösung enthaltend eine wirksame Menge der radiomarkierten Zusammensetzung in einem pharmazeutisch verträglichen sterilen Injektionsvehikel, bevorzugterweise phosphatgepufferter Salzlösung (Phosphate buffered saline, PBS) mit einem/einer physiologischem/-er pH und Konzentration. Andere übliche pharmazeutisch verträgliche Vehikel können wie erforderlich für die Stelle der parenteralen Verabreichung benutzt werden.
Eine repräsentative Zubereitung zur erfindungsgemäßen parenteralen Verabreichung wird normalerweise 0,1 - 20 mg, bevorzugterweise etwa 0,5 - 2,0 mg des radiomarkierten monospezifischer/polyspezifischer Antikörper- Agens-Konjugats in einer sterilen Lösung enthalten, die vorteilhafterweise ebenfalls z.B. etwa 10 mg menschliches Serumalbumin (1 % USP: Parke- Davis) pro ml 0,04 M Phosphatpuffer (pH 7,4, Bioware) enthalten, der 0,9% Natriumchlorid enthält.
Sobald genug Isotop an der Zielstelle abgelagert worden ist, wird ein Abtasten (scanning) mit entweder einer üblichen planaren und/oder SPECT- Gamma-Kamera oder durch Verwendung einer handgehaltenen Gammasonde, die auf externe oder interne Weise verwendet wird, um die kardiovaskuläre Läsion zu lokalisieren, bewirkt. Das Szintigram wird normalerweise mit einer Gamma-Abbildungs-Kamera aufgenommen, die eines oder mehrere Fenster für den Nachweis von Energien in dem Bereich von 50-500 KeV besitzt. Die Zielstelle kann jede beliebige kardiovaskuläre Läsion sein, die in einem relativ konzentrierten Herd vorliegt. Der Nachweis der kardiovaskulären Läsionen wird direkt durch die Reaktivität des monospezifischer/multispezifischer Antikörper-Agens-Konjugats mit den Leukozyten und spezifischen Zielantigenen, die an der Läsion zu der Zeit der parenteralen Verabreichung lokalisiert sind, sowie durch den Eintritt von markierten Leukozyten in die Läsion geschehen.
Das Magnetresonanz-Abbilden (MRI) wird in einem dem szintigraphischen Abbilden analogen Verfahren bewirkt, mit der Ausnahme, daß die Abbildungsmittel MRI-verstärkende Spezies anstatt von Radioisotopen enthalten werden. Es ist klar, daß das Magnetresonanz-Phänomen nach einem anderen Prinzip arbeitet als die Szintigraphie. Normalerweise wird das gebildete Signal mit den Relaxationszeiten der magnetischen Momente von Protonen in dem Kern der Wasserstoffatome von Wassermolekülen in der abzubildenden Region korreliert. Das Magnetresonanz-Abbildungsverstärkungsmittel wirkt durch das Erhöhen der Relaxationsrate, wodurch der Kontrast zwischen den Wassermolekülen in der Region, wo sich das Abbildungsmittel sammelt, und den Wassermolekülen sonstwo in dem Körper erhöht wird. Die Wirkung des Agens ist es jedoch, sowohl T&sub1; als auch T&sub2; zu erhöhen, wobei das erstere zu einem größeren Kontrast führt, während das Letztere in einem geringeren Kontrast resultiert. Dementsprechend ist das Phänomen konzentrationsabhängig, und es gibt normalerweise eine optimale Konzentration einer paramagnetischen Spezies für eine maximale Wirksamkeit. Die optimale Konzentration wird mit dem verwendeten bestimmten Agens, dem Abbildungsort, der Abbildungsweise, d.h. dem Spinecho, Sättigung-Erholung, Inversion-Erholung und verschiedenen anderen stark T&sub1;-abhängigen oder T&sub2;- abhängigen Abbildungsverfahren, und der Zusammensetzung des Mediums, in dem das Mittel gelöst oder suspendiert ist, variieren. Diese Faktoren, und ihre relative Bedeutung sind im Stand der Technik bekannt. Siehe beispielsweise Pykett, op. cit., und Runge et al., op. cit.
Das MRI-Verfahren der Erfindung wird ausgeübt durch Injizieren eines Säugetiers, bevorzugterweise eines Menschen, auf parenterale Weise mit einer wirksamen Menge für das Magnetresonanz-Abbilden eines erfindungsgemäßen Konjugats, umfassend eine monospezifischer/multispezifischer Antikörper-Zusammensetzung und ein MRI-Verstärkungsmittel. Es wird in Erwägung gezogen, daß ein Subjekt eine Dosierung des markierten Konjugats erhalten wird, die ausreicht, um das MRI-Signal an der Stelle der Läsion um mindestens etwa 20%, bevorzugterweise 50-500%, zu verstärken, wobei die Menge eine Funktion der bestimmten paramagnetischen Spezies und der Art der Verabreichung ist.
Wiederum wird der markierte Antikörper oder die markierte Antikörperzusammensetzung zweckmäßigerweise bereitgestellt als eine injizierbare Zubereitung zur Verwendung bei Säugetieren, bevorzugterweise als eine sterile injizierbare Zubereitung zur Verwendung beim Menschen, zum Leiten eines MRI-Agens zu einer kardiovaskulären Läsion, bevorzugterweise umfassend: eine sterile injizierbare Lösung, die eine wirksame Menge der markierten Zusammensetzung in einem pharmazeutisch verträglichen sterilen Injektionsvehikel enthält, bevorzugterweise phosphatgepufferte Salzlösung bei physiologischem pH und physiologischer Konzentration. Andere herkömmliche pharmazeutisch verträgliche Vehikel zur parenteralen Verabreichung können, wie für die Stelle der parenteralen Verabreichung erforderlich, verwendet werden.
Eine repräsentative Zubereitung zur erfindungsgemäßen parenteralen Verabreichung wird normalerweise etwa 0,1 - 20 mg, bevorzugterweise etwa 5 mg, des markierten multispezifischer Antikörper-Agens-Konjugats in einer sterilen Lösung enthalten, die vorteilhafterweise ebenfalls z.B. etwa 10 mg menschliches Serumalbumin (1 % USP: Parke-Davis) pro Milliliter 0,04 M Phosphatpuffer (pH 7,4, Bioware) enthält, der 0,9% Natriumchlorid enthält. Sobald genug an MRI-Agens an der Zielstelle abgelagert worden ist, wird ein Abtasten mit einer herkömmlichen Kamera zum Abbilden der Läsion bewirkt.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird das Lokalisierungsverhältnis des primären markierten Antikörper-Agens-Konjugats durch die Verwendung eines nichtmarkierten zweiten Antikörpers zum Ausspülen des nicht ans Ziel geleiteten zirkulierenden Konjugats und zum Fördern seiner Clearance verbessert, wie es für verwandte Abbildungsmittel in dem US Patent Nr.4,624,846 von Goldenberg offenbart ist. Der Begriff "Lokalisierungsverhältnis" wird in seinem herkömmlichen Sinn verwendet, d.h. das Verhältnis von Ziel- zu Nicht-Ziel-Antikörper-Konjugat. Im allgemeinen wird der zweite Antikörper in einer Menge verwendet, die das Lokalisierungsverhältnis des primären Antikörper-Agens-Konjugats um mindestens etwa 20% und typischerweise um 50% und mehr verbessert.
Der zweite Antikörper kann ganzer IgG oder IgM oder ein Fragment von IgG oder IgM sein, solange es das primäre Antikörper-Konjugat unter Bildung eines Komplexes binden kann, der aus dem Blutkreislauf und den nicht-Zielräumen einer schnelleren Clearance als das primäre Antikörper-Konjugat selbst unterworfen ist. Bevorzugterweise wird der zweite Antikörper ein ganzer IgG oder IgM sein. Wenn der primäre Antikörper ein IgG- oder IgM-Fragment ist, ist es bevorzugt, daß der zweite Antikörper ein ganzer IgG oder IgM ist, so daß der primäre/sekundäre Komplex seine Fähigkeit zum Aktivieren der Komplementkaskade beibehält. Umgekehrter kann, wo der primäre Antikörper ein ganzer IgG ist, der zweite Antikörper ein Fragment sein, wenn der Komplex noch seine Komplement-fixierende Fähigkeit behält. Es ist bevorzugt, daß mindestens einer des primären/sekundären Paares ein ganzer IgG oder IgM ist. Ein Vorteil der Verwendung von IgM ist, daß es einen Komplex eines höheren Molekulargewichts mit dem primären Antikörper oder mit losgelösten Konjugaten, wie komplexbildenden Mitteln und dergleichen, bildet. Dies wird die Rate und Wirksamkeit der Clearance von nicht ans Ziel geleitetem primärem Antikörper und/oder Abbildungsbestandteilen insbesondere aus dem Blut erhöhen. Der zweite Antikörper kann durch Verfahren hergestellt werden, die in dem vorgenannten Patent '846 von Goldenberg offenbart sind. Monoklonaler Anti-Spezies-IgG ist ebenfalls erhältlich und wird vorteilhafterweise als zweiter Antikörper in dem vorliegenden Verfahren verwendet. Nichtmetallische Konjugate, z.B. radioiodierte Verbindungsgruppen oder organische paramagnetische Spezies wie Nitroxide, können auch Haptene sein, für die der zweite Antikörper spezifisch ist, sowie Haptene, die für einen derartigen Zweck entworfen wurden. Der zweite Antikörper wird in das Subjekt injiziert, nachdem eine ausreichende Zeit im Anschluß an eine parenterale Verabreichung des primärer Antikörper-Agens-Konjugats vergangen ist, um dessen maximale Aufnahme an der Läsion zuzulassen, typischerweise irgendwo zwischen etwa 15 min bis etwa 24 h im Anschluß an die anfängliche Verabreichung, bevorzugterweise etwa 24 - 48 h nach Verabreichung. Wenn der primäre Antikörper nicht auf intravenöse Weise verabreicht wird, kann es vorteilhaft sein, mindestens einen Teil des zweiten Antikörpers durch die gleiche parenterale Route zu verabreichen. Es ist jedoch vorteilhaft, mindestens einen Teil des zweiten Antikörpers auf intravenöse Weise zu injizieren, um die Clearance des primären Antikörpers zu beschleunigen, der in das zirkulatorische System diffundiert ist. Normalerweise wird sowohl das Abbildungsmittel-Konjugat als auch der zweite Antikörper für die Clearance auf intraarterielle oder intravenöse Weise verabreicht werden. Die Menge an eingeführtem zweitem Antikörper wird im allgemeinen die Menge sein, die den zirkulierenden primären Antikörper um 10 - 85% innerhalb von etwa 0,3 bis etwa 24 h verringern kann. Das Verhältnis an zweitem Antikörper zu primärem Antikörper, das die Clearance beeinträchtigen wird, wird von den Bindungseigenschaften des primären und sekundären Antikörperpaars abhängen. Ein vorläufiges Durchmustern des Patientenbluts in vitro kann angewendet werden, um eine anfängliche Schätzung des geeigneten Verhältnisses bereitzustellen. Die Durchmusterung wird angewendet werden, um das Verhältnis von zweitem Antikörper zu primärem Antikörper zu bestimmen, das erforderlich ist, um eine Präzipitinbande in z.B. einem Geldiffusions-Test zu erhalten. Dies gibt den allgemeinen Bereich des molaren Verhältnisses von zweitem Antikörper zu primärem Antikörper an, der als ein Maß für die untere Grenze des Verhältnisses dient, da eine in vivo-Anwendung ein höheres Verhältnis von zweitem Antikörper zu primärem Antikörper erfordern kann, als durch derartige in vitro-Tests angezeigt wird.
In der Praxis wird das molare Verhältnis von zweitem Antikörper zu primärem Antikörper im allgemeinen im Bereich von etwa 5 - 50 liegen, obwohl der Bereich nicht als begrenzend angesehen werden sollte. Es ist festgestellt worden, daß molare Verhältnisse von zweitem Antikörper zu primärem Antikörper von 15 - 25, und bevorzugterweise von 20 - 25, vorteilhaft sein können, wenn sowohl der primäre als auch der zweite Antikörper ganze IgG sind.
Die Verwendung des zweiten Antikörpers für eine Clearance des zirkulierenden markierten primären Antikörpers und zum Verbessern des Lokalisierungsverhältnisses des primären Antikörpers kann weiter verbessert werden durch die Nutzung von bildverstärkenden-Subtraktionsverfahren, wie denen in den vorgenannten Goldenberg-Patenten sowie in den darin zitierten Druckschriften offenbarten. Dies ist ein Verfahren, das im Stand der Technik anerkannt wird, wobei ein beliebiger/s Antikörper oder -fragment, das mit einem zum unabhängigen Nachweis fähigen Radionukleid markiert ist, für eine Verwendung zum Normalisieren von Nicht-Ziel-Hintergrund-Spiegeln injiziert wird. Dieser Antikörper besitzt im wesentlichen die gleichen Kinetiken von Verteilung und Metabolismus wie der primäre Antikörper während der für das Abbilden erforderlichen Zeitspanne. Die Injektion derartiger Antikörper ist bevorzugt gegenüber herkömmlichen Subtraktionsmitteln, wie Tc-99m-markiertem Serumalbumin, die nichtsdestotrotz geeignet sind zur Verwendung zum Verbessern der Bildverarbeitung durch Ausgleichen des Hintergrunds. Die Verwendung des radiomarkierten beliebigen Antikörpers als ein Subtraktionsmittel läßt eine computerisierte Berichtigung für die Nicht-Ziel-Hintergrund-Strahlung von Organen zu, die die Clearance der Antikörper aus dem zirkulatorischen System bewirken. Es ist dem Fachmann klar, daß der primäre monoklonale Antikörper und der beliebige Antikörper, der als ein Subtraktionsmittel verwendet wird, bevorzugterweise von der gleichen Spezies oder Myelom/Hybridom sind, so daß der zweite Antikörper die Clearance des primären monoklonalen Antikörpers und des beliebigen Antikörper-Immunglobulins von den nicht angezielten Flächen mit im wesentlichen der gleichen Rate bewirken wird. Es ist weiterhin bevorzugt, daß der zweite Antikörper für eine konstante Region der Spezies des primären und des beliebigen Immunglobulins ist. Die Selektivität des Anzielens dieser Konjugate wird eine Anwendung bei der Verbesserung der Wirksamkeit von Arzneimitteln besitzen, die auf Thromben, Embolien, arteriosklerotische Plaques und andere derartige kardiovaskuläre Läsionen wirken.

BEISPIEL 1

Multispezifisches Anti-Leukozyten-/Anti-Myosin-Konjugat

Eine bispezifische F(ab')&sub2;-Antikörperfragment-Zusammensetzung wird von einem Fab'-Fragment eines monoklonalen Antikörpers, der hochspezifisch für Granulozytenzellen ist und einem Fab'-Fragment eines monoklonalen Antikörpers, der für Herz-Myosin spezifisch ist, hergestellt. Die Disulfidbrücken zwischen den Ketten werden vorsichtig mit Cystein reduziert, wobei darauf geachtet wird, eine Spaltung der leichten und schweren Ketten zu vermeiden, um Fab'-SH-Fragmente zu bilden. Die SH-Gruppe(n) des einen Antikörpers wird (werden) mit einem Überschuß an Bismaleimid-Linker (1,1'- Methylendi-1,4-phenylen)bismaleinimid, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) aktiviert. Der zweite monoklonale Antikörper wird ebenfalls zu Fab'-SH umgewandelt und dann mit dem aktivierten ersten Antikörperfragment unter Erhalt einer bispezifischen Zusammensetzung umgesetzt. Die Zusammensetzung kann mit 2-Iminothiolan umgesetzt werden, um eine oder mehrere Sulffiydrylgruppen einzuführen, zur Verwendung bei der Kopplung der Zusammensetzung an einen dritten Antikörper/-fragment, unter Verwendung des gleichen Bismaleimid-Aktivierungs-Verfahrens, das vorstehend beschrieben wurde, oder zur Verwendung bei einer direkten Metallierung mit z.B. Tc- 99m von reduziertem (z.B. mit SnCl&sub2;) Pertechnetat. Der dritte Antikörper der Zusammensetzung kann die gleiche Antigen-Spezifität wie eine der beiden anderen zwei oder eine gänzlich verschiedene Spezifität wie die für Monozyten besitzen. Diese Zusammensetzung, konjugiert mit Tc-99m oder einem der mehreren anderen für das Abbilden nützlichen Radionuklide (z.B. solchen innerhalb eines Bereichs von 100-500 keV), ist für das Abbilden von myokardialen Infarkten früher und später Stadien nützlich.

BEISPIEL 2

Antikörpergemisch (Cocktail)

Die gleichen wie in Beispiel 1 verwendeten Antikörper können als Gemische von Antikörperfragmenten oder -subfragmenten für das verbesserte Abbilden von frühen und späten myokardialen Infarkten verabreicht werden.
In diesem Beispiel wird ein Anti-Myosin-Antikörper (wie durch Khaw et al., Circulation 57: 743-750, 1978; Khaw et al., J. Clin. Invest. 58: 439-446, 1976; Khaw et al., Hybridoma 3: 11-23, 1984, beschrieben), bevorzugterweise das Fab' des monoklonalen Antikörpers R11D10 von Khaw et al. (Hybridoma 3:11-23, 1984), mit einem Anti-Granulozyten-Antikörper-Fab' gemischt, und die Fragmente werden mit Tc-99m für eine parenterale Verabreichung markiert. Das Gemisch erzielt Ergebnisse, die mit dem der Zusammensetzung von Beispiel 1 vergleichbar sind.

BEISPIEL 3

Kardiovaskulärer Abbildungs-Antikörper

Ein Anti-Leukozytenantikörper, bevorzugterweise ein Anti-Granulozyten- Antikörper-Abbildungsmittel, wird aus einem monoklonalen Antikörper mit einer Selektivität für menschliche Granulozyten, wie einem NCA- (non specific crossreactive antigen) Antikörper hergestellt. Der Antikörper gegen das karzinoembryonale Antigen (Anti-CEA) wird zu Fab'-SH-Fragmenten umgewandelt und mit Zinnionen kombiniert, wie es in der europäischen Patentanmeldung EP-A-0 419 203 beschrieben ist, um ein fast unmittelbares Markieren mit Tc-99m von reduziertem Pertechnetat zu ermöglichen. Diese Einzelantikörper-Zubereitung wird zum Abbilden einer Anzahl von kardiovaskulären Läsionen, wie arteriosklerotischen Plaques, Thromben und Embolien, verwendet.

BEISPIEL 4

Szintigraphischer Abbildungs-Kit

Ein diagnostischer Kit zum Abbilden enthält: ein erstes steriles Fläschchen, das mit einem Gummiseptum ausgestattet ist, und den/die Thiol-aktivierten Antikörper von Beispielen 1,2 oder 3 enthält, und Zinnionen in der Form einer lyophilisierten Zubereitung und zusätzliche Septum-geschlossene sterile Fläschchen und sterile Spritzen zum Markieren und zur Injektion der Zubereitung.

BEISPIEL 5

Diagnostisches Abbilden einer myokardialen Infarktbildung

Ein 67 Jahre alter Mann, der schon lange eine rezidivierende Angina hat, wird in der Notaufnahme aufgenommen und klagt über ernste Schmerzen in der Brust und einen verwirrten Zustand. Der Beginn der Schmerzen in der Brust wird als etwa 40 min früher angegeben. Der Patient wird auf intravenöse Weise mit 0,25 mg (15 mCi Tc-99m) des Präparats aus Beispiel 3 injiziert, und dann wird das Herz des Patienten 30 min und wiederum zwei Stunden später durch Einzel-Photonenemission-Computertomographie (Single-photon emission computed tomography, SPECT) abgetastet (scanned). Beide Abtastsitzungen enthüllten eine Aufnahme von Tc99m in der apikalen Region des linken Ventrikels, mit einer erhöhten Ablesegenauigkeit bei dem zweistündigen Abtasten, obwohl die Läsion schon früher nachweisbar ist. Anschließende EKG-Veränderungen lassen einen frühen Infarkt vermuten, obwohl die atypischen Eigenschaften nicht eine abschließende Diagnose erlauben. Spätere Studien mit Thallium deuten auf eine Störung in der gleichen Fläche des Herzens, was den sehr frühen Nachweis, der durch die Anti-Granulozyten-Antikörper-Zubereitung vorgenommen wurde, bestätigt. Spätere EKGs zeigen ebenfalls definitive Wellenanomalien, die mit dem Abbildungsergebnissen übereinstimmen.

BEISPIEL 6

Diagnostisches Abbilden einer Thrombose tiefer Beinvenen

Eine 82 Jahre alte Frau stellt sich mit einem Ödem und Erythem in ihrer rechten Wade vor und erhält unmittelbar eine Heparin-Therapie. Ein Zusammensetzungs-Gemisch des Anti-Granulozyten-Antikörper-Fab', eines Anti- Fibrin-Antikörper-Fab' und des Fibrin-Fragments E&sub1; (jeweils mit einer Dosis von 0,2 mg und markiert mit insgesamt 20 mCi Tc-99m) wird auf intravenöse Weise in den linken Arm injiziert. Planare Bilder werden 30 min später aufgenommen, die klar eine Ansammlung der Radioaktivität in der Wadenregion des rechten Beines, in der Region der rechten tibialen Vene, zeigen. Es wird kein Anstieg der Radioaktivität in anderen Regionen des Körpers gesehen. Ein Kontrast-Venogramm bestätigt am nächsten Tag das Vorliegen einer Thrombose einer tiefen Beinvene, die auf die hintere tibiale Vene begrenzt ist. Drei Tage nach der ursprünglichen Antikörper-Abbildungs- Studie wird das gleiche Antikörpergemisch verabreicht, und es werden identische Abbildungsergebnisse erhalten, was zeigt, daß sowohl frühe als auch späte Thrombose-Abbildungen möglich sind.
Die vorhergehenden Beispiele können mit ähnlichem Erfolg durchgeführt werden, indem die auf allgemeine oder spezifische Weise beschriebenen Reaktanten und/oder Arbeitsbedingungen dieser Erfindung gegen die in den vorstehenden Beispielen angewendeten ausgetauscht werden.
Aus der vorhergehenden Beschreibung kann der Fachmann sich leicht der wesentlichen Eigenschaften dieser Erfindung versichern und, ohne den Geist und ihren Rahmen zu verlassen, verschiedene Veränderungen und Modifikationen der Erfindung vornehmen, um sie an die verschiedenen Verwendungsmöglichkeiten und Bedingungen anzupassen.

Claims

1. Erzeugnis, das zur Verwendung bei dem in vivoo-Nachweis einer kardiovaskulären Läsion geeignet ist, enthaltend, in einem geeigneten Behälter, eine immunreaktive multispezifische Zusammensetzung, die mindestens zwei verschiedene, im wesentlichen monospezifische Antikörper oder Antikörperfragmente umfaßt, wobei mindestens einer der Antikörper oder Antikörperfragmente spezifisch an ein Antigen bindet, das mit Fibrin, Myosin oder Thrombozyten assoziiert ist, und mindestens ein anderer der Antikörper oder Antikörperfragmente spezifisch an eine Art von Leukozyten oder an ein anderes Fibrin-, Myosin- oder Thrombozyten-asssoziertes Antigen bindet, und wobei die Zusammensetzung entweder mit einem Abbildungsmittel konjugiert ist oder modifiziert oder vorbehandelt ist zur Markierung mit einem Abhildungsmittel

2. Erzeugnis nach Anspruch 1, das weiterhin Zinnionen enthält.

3. Erzeugnis nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zusammensetzung mit einem Komplexbildner konjugiert ist.

4. Erzeugnis nach einem der Anspruche 1-3, dis zusätzlich in einem zweiten Behälter einen zweiten unmarkierten Antikörper oder Antikörperfragment enthält, der/das spezifisch an die multispezifische Zusammensetzung oder eines ihrer Bestandteile bindet.

5. Erzeugnis nach einem der Ansprüche 1-4, wobei die kardiovaskuläre Läsion ein myokardialer Infarkt oder eine atherosklerotische Plaque ist und wobei mindestens einer der Antikörper oder Antikörperfragmente spezifisch an eine Leukozyte bindet und mindestens einer der Antikörper oder Antikörperfragmente an Myosin bindet.

6. Erzeugnis nach Anspruch 5, wobei die Leukozyte entweder eine Granulozyte oder Monozyte ist.

7. Erzeugnis nach einem der Ansprüche 1-4, wobei die kardiovaskuläre Läsion eine Thrombose oder eine pulmonäre Embolie ist und wobei mindestens einer der Antikörper oder Antikörperfragmente spezifisch an eine Leukozyte bindet und mindestens einer der Antikörper oder Antikörperfragmente spezifisch an Fibrin bindet.

8. Erzeugnis nach Anspruch 7, wobei mindestens einer der Antikörper oder Antikörperfragmente spezifisch an eine Leukozyte bindet und mindestens einer der Antikörper oder Antikörperfragmente an Thrombozyten oder aktivierte Thrombozyten bindet.

9. Erzeugnis nach Anspruch 7, wobei mindestens einer der Antikörper oder Antikörperfragmente spezifisch an eine Leukozyte bindet, mindestens einer der Antikörper oder Antikörperfragmente spezifisch an Fibrin bindet, und ein dritter Antikörper oder Antikörperfragment in dem multispezifischen Konjugat spezifisch an Thrombozyten bindet.

10. Erzeugnis nach einem der Ansprüche 1-4, wobei die kardiovaskuläre Läsion eine Thrombose oder eine pulmonäre Embolie ist und wobei mindestens einer der Antikörper oder Antikörperfragmente spezifisch an Fibrin bindet und mindestens einer der Antikörper oder Antikörperfragmente an Thrombozyten, aktivierte Thrombozyten oder andere Thrombozyten-Antigene bindet.

11. Erzeugnis nach einem der Ansprüche 1-10, wobei das Abbildungsmittel ein Magnetresonanz-Abbildungsverstärkungsmittel ist.

12. Steriles injizierbares Präparat zur Anwendung beim Menschen zum Leiten eines Abbildungsmittels zu einer kardiovaskulären Läsion als Ziel, wobei das Präparat eine wirksame Menge zum Abbilden der immunreaktiven multispezifischen Zusammensetzung, wie in einem der Ansprüche 1-11 definiert, in einem pharmazeutisch verträglichen, sterilen Injektionsvehikel enthält.

13. Verwendung des Erzeugnisses nach einem der Ansprüche 1 - 12 bei der Herstellung eines Mittels zur Verwendung in einem Verfahren zum Abbilden einer kardiovaskulären Läsion, wobei in dem Verfahren ein Säugetier mit einer wirksamen Menge zum Anzielen mit dem Erzeugnis und Abbilden des Erzeugnisses parenteral injiziert wird.

14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Erzeugnis weiterhin einen zweiten, unmarkierten Antikörper oder Antikörperfragment enthält, der spezifisch an das multispezifische Konjugat oder eines seiner Bestandteile bindet, und wobei in dem Verfahren zu einer Zeit nach der Verabreichung des multispezifischen Konjugats, die ausreicht, eine maximale selektive Aufnahme desselben an der Stelle der Läsion zu erlauben, der zweite, unmarkierte Antikörper oder Antikörperfragment an das Subjekt in einer Menge parenteral verabreicht wird, die aus reichend ist, um das Lokalisierungsverhältnis des multispezifischen Konjugats um mindestens ungefähr 20% innerhalb einer Zeitspanne von ungefähr 0,3 bis ungefähr 24 Stunden zu erhöhen.

15. Verwendung nach Anspruch 13 oder 14, wobei das Abbildungsmittel ein Radioisotop ist, und wobei in dem Verfahren eine szintigrafische Abbildung der Läsion nach einer Zeitdauer erhalten wird, die für eine Lokalisation des multispezifischen Konjugats an der Stelle der Läsion ausreicht.

16. Erzeugnis nach einem der Ansprüche 1-10 oder Verwendung nach einem der Ansprüche 13-15, wobei das Abbildungsmittel ein Radioisotop ist, das vorzugsweise Gammastrahlung in dem Bereich von 50-500 KeV emittiert.

17. Erzeugnis nach Anspruch 16 oder Verwendung nach Anspruch 15, wobei das Radioisotop Tc-99m, 1-123, Ga-67 oder In-111 ist.

18. Verwendung nach Anspruch 13 oder 14, wobei das Abbildungsmittel ein Magnetresonanz-Abbildungsverstärkungsmittel ist und wobei in dem Verfahren eine Magnetresonanzabbildung der Läsion nach einer Zeitdauer erhalten wird, die für eine Lokalisierung des multispezifischen Konjugats an der Stelle der Läsion ausreicht.

19. Erzeugnis nach einem der Ansprüche 1-12 oder Verwendung nach einem der Ansprüche 13-18, wobei es sich bei der Leukozytenart um Granulozyten, Monozyten, B-Lymphozyten oder T-Lymphozyten handelt.

20. Erzeugnis oder Verwendung nach Anspruch 19, wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment spezifisch an das IA(DR)-Antigen bindet.

21. Erzeugnis nach einem der Ansprüche 1-12 oder Verwendung nach einem der Ansprüche 13-20, wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment ein monoklonaler Antikörper oder ein monoklonales Fragment ist.

22. Erzeugnis oder Verwendung nach Anspruch 21, wobei das Antikörperfragment ein F(ab')&sub2;-, Fab'-, Fab-, Fv-Fragment oder ein Einzelketten- Antikörper-Fragment ist.

23. Verwendung nach einem der Ansprüche 13-22, wobei die kardiovaskuläre Läsion ein myokardialer Infarkt, eine atherioskierotische Plaque, ein Embolus oder ein Thrombus ist.