CN104363919A - 具有改进的体内稳定性、药物代谢动力学和功效的多聚体复合物 - Google Patents

具有改进的体内稳定性、药物代谢动力学和功效的多聚体复合物 Download PDF

Info

Publication number
CN104363919A
CN104363919A CN201380028790.8A CN201380028790A CN104363919A CN 104363919 A CN104363919 A CN 104363919A CN 201380028790 A CN201380028790 A CN 201380028790A CN 104363919 A CN104363919 A CN 104363919A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
antibody
factor
antigen
people
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201380028790.8A
Other languages
English (en)
Inventor
E·A·罗西
C·H·张
D·M·戈德堡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
IBC Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
IBC Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by IBC Pharmaceuticals Inc filed Critical IBC Pharmaceuticals Inc
Publication of CN104363919A publication Critical patent/CN104363919A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3092—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated mucins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6815—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6829—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxins or Pseudomonas exotoxin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/11—Protein-serine/threonine kinases (2.7.11)
    • C12Y207/11011—Protein-serine/threonine kinases (2.7.11) cAMP-dependent protein kinase (2.7.11.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/27—Endoribonucleases producing 3'-phosphomonoesters (3.1.27)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/32—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency specific for a neo-epitope on a complex, e.g. antibody-antigen or ligand-receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及基于抗体融合蛋白的多聚体复合物，其包含附着至每条抗体轻链的C-末端的AD部分。所述复合物进一步包含附着至DDD部分的效应子部分。所述DDD部分的两个拷贝形成结合所述AD部分的二聚体。所述复合物可为三聚体、五聚体、六聚体或其它多聚体。所述效应子部分可选自第二抗体或其抗原结合片段、细胞因子、干扰素、毒素、抗原、异种抗原、半抗原、鱼精蛋白、激素、酶、配体结合蛋白、促凋亡剂以及抗血管生成剂。出人意料地，与其中所述AD部分附着至所述抗体重链的同源复合物相比，所述AD部分附着至所述抗体轻链的C-末端引起改进的药物代谢动力学和体内稳定性以及功效。

Description

具有改进的体内稳定性、药物代谢动力学和功效的多聚体复合物
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.119(e)要求2012年6月1日提交的临时美国专利申请61/654,310、2012年6月20日提交的临时美国专利申请61/662,086、2012年7月19日提交的临时美国专利申请61/673,553、2012年8月13日提交的临时美国专利申请61/682,531、2012年8月24日提交的临时美国专利申请61/693,042以及2012年8月28日提交的临时美国专利申请61/694,072的权益，每个有优先权的申请均以引用的方式整体并入本文。
序列表
本申请含有序列表，所述序列表以ASCII格式通过EFS-Web提交并且由此以引用的方式整体并入。于2013年5月3日创建的所述ASCII副本命名为IBC137WO1_SL.txt并且大小为59,652字节。
领域
本发明涉及使用包含多个效应子部分的多聚体复合物的组合物和方法。优选地，效应子部分为融合蛋白，每个融合蛋白均包含来自A-激酶锚定蛋白(AKAP)的锚定域(AD)部分或来自蛋白激酶A(PKA)调节亚基RIα、RIβ、RIIα或RIIβ的二聚化和停靠域(DDD)部分。DDD部分的两个拷贝二聚化并且结合AD部分以形成多聚体复合物，所述多聚体复合物可为三聚体的、四聚体的、五聚体的、六聚体的或多聚体的。普通技术人员将认识到在替代实施方案中，AD和/或DDD部分可通过化学交联或其它已知方式附着至效应子。效应子可选自抗体、抗原结合抗体片段、抗原、细胞因子、趋化因子、白细胞介素、干扰素、生长因子、促凋亡剂、抗血管生成剂、毒素、配体结合蛋白、酶、治疗剂或聚合物如聚乙二醇(PEG)。优选地，至少一种效应子为抗体或抗原结合抗体片段，其中AD部分附着至抗体或抗体片段的每条轻链的C-末端。更优选地，至少一种效应子为IgG抗体。在某些实施方案中，所有效应子可为提供双特异性或多特异性抗原结合复合物的抗体或抗体片段。本发明多聚体复合物具有用于治疗各种各样疾病和医学病状如癌症、自身免疫疾病、免疫系统功能障碍、移植物抗宿主疾病、器官移植排斥、神经疾病、代谢性疾病、感染性疾病或心血管疾病的用途。
背景
最近生物医学研究的一个重要方面为开发日益完善的基于抗体的生物制品，如双特异性抗体、免疫细胞因子、抗体-毒素缀合物以及抗体-药物缀合物。开发更复杂和较不天然的融合蛋白面临产率、稳定性、免疫原性和药物代谢动力学(Pk)的问题。具体来说，基于包括单链Fv(scFv)、Fab或其它缺乏Fc的形式(Kontermann,2010,CurrOpin Mol Ther 12:176-83)的抗体片段的免疫缀合物常常难以生产具有均匀性和足够的产率，常常缺乏Fc-效应子功能并且固有地遭受短循环血清半衰期(T1/2)。通过比较，可以高产率、同时具有较长T1/2和体内稳定性生产IgG的免疫缀合物。此外，完整的单克隆抗体(mAb)提供具有Fc-效应子功能的高亲合力二价结合，所述Fc-效应子功能包括抗体依赖型细胞介导细胞毒性(ADCC)和补体依赖型细胞毒性(CDC)。IgG的增强的Pk归因于两大因素。其较大的分子大小(大约150kDa)阻止了肾清除，所述肾清除负责快速消除较小的构建体(<60kDa)，如scFv；和其动态结合新生儿Fc受体(FcRn)(Kue&Aveson,2011,MAbs 3:422-30)超过T1/2。
多特异性或双特异性抗体有用于许多生物医学应用中。例如，具有用于肿瘤细胞表面抗原和用于T细胞表面受体的结合位点的双特异性抗体可指导通过T细胞的特异性肿瘤细胞的溶解。识别神经胶质瘤和T细胞上的CD3表位的双特异性抗体已成功用于治疗人患者中的脑肿瘤(Nitta等人，Lancet.1990；355:368-371)。生产双特异性抗体的许多方法为已知的(参见，例如美国专利号7,405,320)。双特异性抗体可通过四重杂交瘤方法生产，所述四重杂交瘤方法涉及使各自产生识别不同抗原位点的单克隆抗体的两种不同杂交瘤融合(Milstein和Cuello.Nature.1983；305:537-540)。融合的杂交瘤能够合成两条不同的重链和两条不同的轻链，其可随机缔合以得到10种不同抗体结构的异质群体，占总抗体分子的1/8的仅所述抗体结构中的一种将为双特异性的并且因此必须进一步从其它形式纯化。融合的杂交瘤常常在细胞遗传学上比亲本杂交瘤稳定性更差，使得生产细胞系的产生更成问题。
用于生产双特异性抗体的另一种方法使用异双官能性交联剂以化学系栓两种不同的单克隆抗体，以使得所得到的杂交缀合物将结合两个不同靶标(Staerz等人，Nature.1985；314:628-631；Perez等Nature.1985；316:354-356)。由此方法产生的双特异性抗体基本上为两个IgG分子的异缀合物，其缓慢扩散到组织中并且从循环中快速去除。双特异性抗体还可通过将两个亲本单克隆抗体的每个还原成对应的半个分子，然后使所述半个分子混合并且允许再氧化以获得杂交结构来生产(Staerz和Bevan.Proc Natl Acad Sci USA.1986；83:1453-1457)。另一替代方法涉及使用适当接头化学交联两种或三种经过单独纯化的Fab’片段。所有这些化学方法由于高制造成本、费力的生产过程、大量的纯化步骤、低产率(<20％)以及异质产物而为商业开发所不希望的。
其它方法包括通过经由逆转录病毒衍生的穿梭载体将相异可选择标记物基因转移到随后融合的各自亲本杂交瘤中(DeMonte等人，Proc Natl Acad Sci USA.1990,87:2941-2945)；或用含有不同抗体的重链基因和轻链基因的表达质粒转染杂交瘤细胞系来改进产生杂交的杂交瘤的效率。这些方法也面临以上讨论的不可避免的纯化问题。
通过重组DNA技术生产的抗体的不连续VH和VL结构域可彼此成对以形成具有结合能力(美国专利号4,642,334)的二聚体(重组Fv片段)。然而，此类非共价缔合的分子在生理条件下不是足够稳定以具有任何实际使用。可将同源VH和VL结构域与具有适当组成和长度(通常由多于12个氨基酸残基组成)的肽接头接合以形成具有结合活性的单链Fv(scFv)。通过改变接头长度制造具有多价和多特异性的基于scFv的药剂的方法公开于美国专利号5,844,094、美国专利号5,837,242和WO 98/44001中。与产生具有多价和多特异性的基于scFv的药剂频繁相关的常见问题为低表达水平、异质产物、导致聚集的溶液不稳定性、血清不稳定性以及亲和性受损。
对接和锁定(Dock-and-Lock)TM(DNLTM)技术已用来以各种形式生产各种免疫缀合物(Rossi等人,2012,Bioconjug Chem 23:309-23)。基于维妥珠单抗(veltuzumab)(抗CD20)和依帕珠单抗(epratuzumab)(抗CD22)的双特异性六价抗体(bsHexAb)通过使融合至二聚化和停靠域(DDD)的稳定(Fab)2与含有在每条重链(CH3-AD2-IgG)的C-末端上附加的锚定域(AD)的IgG组合来构建(Rossi等人,2009,Blood 113,6161-71)。与其亲本mAb的混合物相比，这些基于Fc的bsHexAb(此后称为“Fc-bsHexAb”)诱导独特的信号传导事件(Gupta等人,2010,Blood 116:3258-67)并且在体外展现出潜在的细胞毒性。然而，Fc-bsHexAb从小鼠循环中清除比亲本mAb快大约两倍(Rossi等人,2009,Blood 113,6161-71)。虽然Fc-bsHexAb在离体情况下高度稳定，但也可能例如通过细胞内加工在体内发生一些解离。此外，Fc-bsHexAb缺乏CDC活性。
基于Fc的免疫细胞因子还已组装成DNLTM复合物，其包含融合至CH3-AD2-IgG Fc的C-末端的干扰素-α2b(IFNα2b)的两个或四个分子(Rossi等人,2009,Blood 114:3864-71；Rossi等人,2010,Cancer Res70:7600-09；Rossi等人,2011,Blood 118:1877-84)。Fc-IgG-IFNα维持高特异性活性、接近重组IFNα并且在体外和在体内对抗非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)异种移植物显著有效。Fc-IgG-IFNα在小鼠中的T1/2比PEG化的IFNα长，但为亲本mAb的一半。类似于Fc-bsHexAb，Fc-IgG-IFNα随时间在体内解离并且展现出减小的CDC，但ADCC增强。
存在对产生具有较长T1/2、更好药物代谢动力学性质、增加的体内稳定性和改进的体内功效的改进型多聚体复合物的方法和组合物的需要。
概述
本发明涉及用于生产具有较长T1/2、更好药物代谢动力学性质和增加的体内稳定性的改进型DNLTM复合物的组合物和方法。在优选的实施方案中，改进型DNLTM复合物包含其中AD部分融合至抗体轻链的C-末端的IgG组分。出人意料地，与早已有效的基于Fc的对应物相比，从重链至轻链的AD附着位点的重新定位大致上引起改进的药物代谢动力学、体内稳定性和Fc效应子功能，连同增加的体内功效。
在各种实施方案中，本发明复合物可出于治疗目的和/或诊断目的向患有病状的受试者施用。熟练的技术人员将认识到可用多官能性、二价、三价、多特异性或双特异性复合物诊断和/或治疗的任何病状可用本发明组合物治疗。示例性病状包括但不限于癌症、增生、神经变性疾病、阿尔茨海默氏疾病、心血管疾病、代谢性疾病、血管炎、病毒感染、真菌感染、细菌感染、糖尿病性视网膜病、黄斑变性、自身免疫疾病、水肿、肺动脉高压、脓毒症、心肌梗塞血管生成、斑块新血管形成、再狭窄、血管创伤后新内膜形成、毛细血管扩张、血友病关节、血管纤维瘤、与慢性炎症相关的纤维变性、肺纤维化、深静脉血栓形成或伤口肉芽形成(wound granulation)。
在具体实施方案中，公开的方法和组合物可用来治疗自身免疫疾病，如急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham's chorea)、重症肌无力、全身性红斑狼疮、狼疮肾炎、风湿热、多腺体综合症、大疱性类天疱疮、1型糖尿病、2型糖尿病、亨诺赫-舍恩莱茵紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安氏动脉炎、艾迪生氏病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、肉样瘤病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯丘综合症、血管闭塞性脉管炎、斯耶格伦氏综合症、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常天疱疮、韦格纳氏肉芽肿病、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨、巨细胞性动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、牛皮癣或纤维化肺泡炎。
在某些实施方案中，复合物可具有用于治疗性治疗癌症的用途。可以预期，可靶向任何类型的肿瘤和任何类型的肿瘤抗原。可靶向的示例性类型的癌症包括急性成淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、胆癌、乳癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈部癌、霍奇金氏淋巴瘤、肺癌、甲状腺髓样癌、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑素瘤、肝癌、前列腺癌以及膀胱癌。
可靶向的肿瘤相关的抗原包括但不限于碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、AFP、PSMA、CEACAM5、CEACAM-6、CSAp、B7、纤连蛋白的ED-B、因子H、FHL-1、Flt-3、叶酸受体、GROB、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、HM1.24、胰岛素样生长因子-1(ILGF-1)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、巨噬细胞抑制因子(MIF)、由PAM4抗体结合的抗原、NCA-95、NCA-90、Ia、HM1.24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、腱生蛋白、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、汤姆森-弗里德里希抗原、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、VEGFR、EGFR、PlGF、PSA、PSMA、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5以及致癌基因产物。
可利用的示例性抗体包括但不限于hR1(抗IGF-1R，2010年3月12日提交的美国专利申请序号12/722,645)、hPAM4(抗粘蛋白，美国专利号7,282,567)、hA20(抗CD20，美国专利号7,251,164)、hA19(抗CD19，美国专利号7,109,304)、hIMMU31(抗AFP，美国专利号7,300,655)、hLL1(抗CD74，美国专利号7,312,318)、hLL2(抗CD22，美国专利号7,074,403)、hMu-9(抗CSAp，美国专利号7,387,773)、hL243(抗HLA-DR，美国专利号7,612,180)、hMN-14(抗CEACAM5，美国专利号6,676,924)、hMN-15(抗CEACAM6，美国专利号7,541,440)、hRS7(抗EGP-1，美国专利号7,238,785)以及hMN-3(抗CEACAM6，美国专利申请序号7,541,440)，各引用专利或申请的实施例部分以引用的方式并入本文。熟练的技术人员将认识到此列表并非限制性的并且如下更详细地讨论可使用任何已知的抗体。
在其它实施方案中，本发明复合物可用来治疗感染病原生物体如细菌、病毒或真菌的受试者。可治疗的示例性真菌包括小孢子菌属(Microsporum)、毛癣菌属(Trichophyton)、表皮癣菌属(Epidermophyton)、申氏孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)或白色念珠菌(Candida albican)。示例性病毒包括人免疫缺陷病毒(HIV)、疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病病毒、流感病毒、人乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、仙台病毒、猫白血病病毒、呼肠孤病毒(Reo virus)、脊髓灰质炎病毒(polio virus)、人血清微小样病毒、猿猴病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳腺瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、登革病毒(Dengue virus)、风疹病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T细胞白血病病毒、埃-巴二氏病毒、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水疱性口炎病毒、辛德毕斯病毒(Sindbis virus)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒或蓝舌病毒。示例性细菌包括炭疽杆菌(Bacillusanthracis)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、肺炎球菌属(Pneumococcus spp.)、流感嗜血杆菌B(Hemophilis influenzae B)、梅毒密螺旋体(Treponemapallidum)、莱姆病螺旋体(Lyme disease spirochetes)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)或支原体属(Mycoplasma)。
用于感染的复合物可包含例如用于病原体上的一个或多个抗原决定簇的结合位点，并且可缀合或附着至用于病原体的治疗剂，例如抗病毒剂、抗生素剂或抗真菌剂。或者，稳定系栓的缀合物可包含用于病原体抗原的第一结合位点和用于附着至一种或多种治疗剂的半抗原或载体的第二结合位点。可缀合至、并入到或靶向结合本发明复合物的用于对抗感染性生物体的治疗剂包括但不限于无环鸟苷、阿苯达唑(albendazole)、金刚烷胺(amantadine)、阿米卡星(amikacin)、阿莫西林(amoxicillin)、两性霉素B、氨必西林(ampicillin)、氨曲南(aztreonam)、阿奇霉素(azithromycin)、杆菌肽(bacitracin)、复方新诺明(bactrim)、联苯苄唑(bifonazole)、羧苄青霉素(carbenicillin)、卡泊芬净(caspofungin)、头孢克洛(cefaclor)、头孢唑林(cefazolin)、头孢菌素(cephalosporin)、头孢吡肟(cefepime)、头孢曲松(ceftriaxone)、头孢噻肟(cefotaxime)、氯霉素(chloramphenicol)、西多福韦(cidofovir)、克拉霉素(clarithromycin)、克拉维酸(clavulanic acid)、克霉唑(clotrimazole)、邻氯青霉素(cloxacillin)、多西环素(doxycycline)、益康唑(econazole)、、红霉素(erythromycin)、灭滴灵(flagyl)、氟康唑(fluconazole)、氟胞嘧啶(flucytosine)、可耐(foscamet)、呋喃唑酮(furazolidone)、更昔洛韦(ganciclovir)、庆大霉素(gentamycin)、亚胺培南(imipenem)、异烟肼、伊曲康唑(itraconazole)、卡那霉素(kanamycin)、酮康唑(ketoconazole)、林可霉素(lincomycin)、利奈唑胺(linezolid)、美罗培南(meropenem)、咪康唑(miconazole)、米诺环素(minocycline)、萘替芬(naftifine)、萘啶酸(nalidixic acid)、新霉素(neomycin)、奈替米星(netilmicin)、呋喃妥因(nitrofurantoin)、制霉菌素(nystatin)、奥塞米韦(oseltamivir)、苯唑西林(oxacillin)、巴龙霉素(paromomycin)、盘尼西林(penicillin)、喷他脒(pentamidine)、氧哌嗪青霉素-三唑巴坦(piperacillin-tazobactam)、利福布汀(rifabutin)、利福平(rifampin)、金刚乙烷(rimantadine)、链霉素(streptomycin)、磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、四环素、噻康唑(tioconazole)、妥布霉素(tobramycin)、托西拉酯(tolciclate)、托萘酯(tolnaftate)、甲氧苄啶磺胺甲噁唑、伐昔洛韦(valacyclovir)、万古霉素(vancomycin)、扎那米韦(zanamir)以及阿奇霉素。
在各种实施方案中，复合物可包含一种或多种毒素，如细菌毒素、植物毒素、蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、抗肿瘤核糖核酸酶(onconase)、豹蛙酶(Rap)、Rap(N69Q)或PE38。在优选的实施方案中，复合物可包含附着至毒素的两个AD部分和四个拷贝的IgG抗体，如附着至DDD部分的豹蛙酶。此类复合物已证实为高度有效的，具有改进的毒性和药物代谢动力学性质(参见，例如美国专利申请序号12/871,345，所述专利的实施例部分以引用的方式并入本文)。
本发明复合物还可包含选自由以下组成的组的免疫调节剂：细胞因子、趋化因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素、红细胞生成素、血小板生成素、肿瘤坏死因子-α(TNF)、TNF-β、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、干扰素-λ、命名为“S1因子”的干细胞生长因子、人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、促黄体激素(LH)、肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、苗勒抑制物质、小鼠促性腺素相关的肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、整联蛋白、NGF-β、血小板生长因子、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子-I、胰岛素样生长因子-II、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、FLT-3、血管抑素、血小板反应蛋白、内皮抑素以及淋巴毒素。在某些优选的实施方案中，复合物可包含附着至免疫调节剂如细胞因子的两个AD部分和四个拷贝的抗体或抗体片段，其各自附着至DDD部分。细胞因子复合物例如公开于美国专利号7,906,118和8,034,3522中，所述专利各自的实施例部分均以引用的方式并入本文。
可并入本发明复合物中使用的趋化因子包括但不限于RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β和IT-10。
可并入本发明复合物中使用的抗血管生成剂包括但不限于血管抑素、杆状斯达汀(baculostatin)、血管能抑素、乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂(maspin)、抗VEGF抗体或肽、抗胎盘生长因子抗体或肽、抗Flk-1抗体、抗Flt-1抗体或肽、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活剂抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、干扰素12、IP-10、Gro-β、血小板反应蛋白、2-甲氧基雌二醇、增殖蛋白相关的蛋白质、羧胺三唑、CM101、马立马司他(Marimastat)、戊聚糖多硫酸盐、血管生成素2、干扰素-α、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、利诺胺(Linomide)、沙利度胺(thalidomide)、己酮可可碱、染料木黄酮、TNP-470、内皮抑素、紫杉醇、蛇毒解离素(accutin)、血管抑素、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板因子4或米诺环素。
在又其它实施方案中，一种或多种治疗剂如阿普利啶(aplidin)、阿扎利平(azaribine)、阿那曲唑(anastrozole)、氮胞苷、博来霉素、硼替佐米(bortezomib)、苔癣抑素-1(bryostatin-1)、白消安(busulfan)、刺孢霉素(calicheamycin)、喜树碱、10-羟基喜树碱、卡莫司汀(carmustine)、西乐葆(celebrex)、苯丁酸氮芥、顺铂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨(cladribine)、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪(dacarbazine)、多西他赛(docetaxel)、更生霉素(dactinomycin)、葡糖苷酸更生霉素、柔红霉素(daunorubicin)、地塞米松(dexamethasone)、己烯雌酚、阿霉素、2-吡咯啉基阿霉素(2P-DOX)、氰基吗啉代阿霉素、葡糖苷酸阿霉素、葡糖苷酸表柔比星、乙炔雌二醇、雌莫司汀(estramustine)、依托泊苷(etoposide)、葡糖苷酸依托泊苷、磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、3',5'-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨(fludarabine)、氟他胺(flutamide)、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、吉西他滨(gemcitabine)、己酸孕酮、羟基脲、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、甲酰四氢叶酸、洛莫司汀(lomustine)、氮芥、乙酸地加瑞克(medroprogesterone acetate)、乙酸甲地孕酮、美法仑(melphalan)、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌(mitoxantrone)、光辉霉素(mithramycin)、丝裂霉素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、丁酸苯酯、泼尼松(prednisone)、丙卡巴肼(procarbazine)、紫杉醇(paclitaxel)、喷司他丁(pentostatin)、PSI-341、司莫司汀链脲霉素(semustine streptozocin)、他莫昔芬(tamoxifen)、紫杉烷、紫杉酚、丙酸睾丸酮、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派(thiotepa)、替尼泊苷(teniposide)、拓扑替康(topotecan)、尿嘧啶氮芥、万珂(velcade)、长春花碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春新碱、反义寡核苷酸、干扰RNA或其组合可缀合至或并入到复合物中。
在涉及预靶向的实施方案中，复合物可包含结合与患病的细胞、组织或病原体相关的抗原的第一抗体或其片段，同时包含可结合可靶向构建体上的半抗原的第二抗体或其片段。在施用复合物和向疾病相关的细胞、组织或病原体定位之后，可添加可靶向构建体以结合定位的复合物。任选地，可在施用可靶向构建体之前施用清除剂以从循环中清除未定位的复合物。这些方法为本领域中已知的并且描述于美国专利号4,624,846、WO 92/19273和Sharkey等,Int.J.Cancer 51:266(1992)中。示例性可靶向构建体可具有X-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Y)-NH2的结构，其中化合物包括X或Y上的硬酸阳离子螯合剂和剩余X或Y上的软酸阳离子螯合剂；并且其中化合物进一步包含至少一种诊断性或治疗性阳离子和/或一种或多种螯合的或化学结合的治疗剂、诊断剂或酶。
各种实施方案可涉及用来诱导患病细胞凋亡的复合物。进一步的细节可见于美国专利申请公布号20050079184中，所述专利的全文以引用的方式并入本文。此类结构可包含对选自由以下组成的组的抗原具有结合亲和性的第一和/或第二前体：CD2、CD3、CD8、CD10、CD21、CD23、CD24、CD25、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD48、CD52、CD55、CD59、CD70、CD74、CD80、CD86、CD138、CD147、HLA-DR、CEA、CSAp、CA-125、TAG-72、EFGR、HER2、HER3、HER4、IGF-1R、c-Met、PDGFR、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、TNFR1、TNFR2、NGFR、Fas(CD95)、DR3、DR4、DR5、DR6、VEGF、PIGF、ED-B纤连蛋白、腱生蛋白、PSMA、PSA、碳酸酐酶IX以及IL-6。在更具体的实施方案中，用来诱导凋亡的复合物可包含单克隆抗体、Fab片段、嵌合抗体或片段、人源化抗体或片段或人抗体或片段。在优选的实施方案中，复合物可包含以下的组合：抗CD74X抗-CD20、抗CD74X抗CD22、抗CD22X抗CD20、抗CD20X抗HLA-DR、抗CD19X抗CD20、抗CD20X抗CD80、抗CD2X抗CD25、抗CD8X抗CD25以及抗CD2X抗CD147。在更优选的实施方案中，嵌合抗体或抗体片段、人源化抗体或抗体片段或人抗体或抗体片段可来源于LL2(抗CD22)、LL1(抗CD74)或A20(抗CD20)的可变结构域。
各种实施方案可涉及用来治疗炎症性和免疫调节异常性疾病、感染性疾病、病理性血管发生或癌症的复合物和方法。在本申请中，复合物结合选自由以下组成的组的两个不同靶标：(A)先天免疫系统的促炎效应子、(B)凝血因子、(C)补体因子和补体调节蛋白以及(D)与炎症性或免疫调节异常性病症或与病理性血管发生或癌症特异性相关的靶标，其中后一种靶标不为(A)、(B)或(C)。至少一个靶标为(A)、(B)或(C)。靶标的适合组合描述于2004年12月8日提交的题目为"Methods and Compositions for Immunotherapy and Detection ofInflammatory and Immune-Dysregulatory Disease,Infectious Disease,Pathologic Angiogenesis and Cancer"的美国临时申请号60/634,076中，所述专利的内容整体并入本文。
结合分子可结合的先天免疫系统的促炎效应子可为促炎效应子细胞因子、促炎效应子趋化因子或促炎效应子受体。适合的促炎效应子细胞因子包括MIF、HMGB-1(高流动组盒子蛋白质1)、TNF-a、IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15以及IL-18。促炎效应子趋化因子的实例包括CCL19、CCL21、IL-8、MCP-1、RANTES、MIP-1A、MIP-1B、ENA-78、MCP-1、IP-10、GROB以及嗜酸性细胞活化趋化因子(Eotaxin)。促炎效应子受体包括IL-4R(白细胞介素-4受体)、IL-6R(白细胞介素-6受体)、IL-13R(白细胞介素-13受体)、IL-15R(白细胞介素-15受体)以及IL-18R(白细胞介素-18受体)。
复合物还可与至少一种凝血因子，具体为组织因子(TF)或凝血酶反应。在其它实施方案中，复合物与至少一种补体因子或补体调节蛋白反应。在优选的实施方案中，补体因子选自由以下组成的组：C3、C5、C3a、C3b和C5a。当结合分子与补体调节蛋白特异性反应时，补体调节蛋白优选地选自由CD46、CD55、CD59和mCRP组成的组。
在某些实施方案中，本领域中已知的任何治疗蛋白或肽可附着至AD或DDD序列并且用作要求保护的方法和组合物中的效应子。许多此类治疗蛋白或肽为已知的并且例如描述于2005年11月2日提交的美国专利申请公布号20060084794,"Albumin fusion proteins"中，所述专利以引用的方式整体并入本文。列出各种已知的有用的示例性治疗蛋白或肽(包括示例性标识符、专利参考号和优选指示)的20060084794的表1具体以引用的方式整体并入本文。有用的另外治疗蛋白或肽例如描述于美国专利号6,309,633中，所述专利以引用的方式整体并入本文，并且可包括但不限于促肾上腺皮质激素、依比拉肽(ebiratide)、血管紧张素、血管紧张素II、天冬酰胺酶、心房钠尿肽、心房利尿钠肽、杆菌肽、β-内啡肽、凝血因子VII、凝血因子VIII和凝血因子IX、血液胸腺因子、骨形成因子、骨形成蛋白、缓激肽、蛙皮素(caerulein)、降钙素基因相关的多肽、降钙素、CCK-8、细胞生长因子、EGF、TGF-α、TGF-β、酸性FGF、碱性FGF、趋化因子、胆囊收缩素、胆囊收缩素-8、胆囊收缩素-促胰酶素、粘菌素、集落刺激因子、GMCSF、MCSF、促肾上腺皮质激素释放因子、细胞因子、去氨加压素、二肽、歧化酶、强啡肽、章鱼素、内啡肽、内皮素、内皮素拮抗肽、内皮素(endotherin)、脑啡肽、上皮生长因子、红细胞生成素、促卵泡激素、促生长激素神经肽(gallanin)、胃抑制肽、胃泌素释放多肽、胃泌素、G-CSF、胰高血糖素、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶、促性腺激素、短杆菌肽、短杆菌肽、生长因子、生长激素释放因子、生长激素、h-ANP、激素释放激素、人绒毛膜促性腺激素、人绒毛膜促性腺激素β-链、人胎盘催乳素、胰岛素、胰岛素样生长因子、IGF-I、IGF-II、干扰素、白细胞介素、肠多肽、激肽释放酶、京都啡肽、促黄体素释放素、促黄体激素、促黄体激素释放激素、溶菌酶氯化物、促黑素细胞激素、黑素细胞刺激激素、蜂毒素、促胃动素、胞壁酰肽、胞壁酰二肽、神经生长因子、神经营养因子、NT-3、NT-4、CNTF、GDNF、BDNF、神经肽Y、神经降压素、催产素、胰抑制素、胰多肽、促胰酶素、甲状旁腺激素、五肽胃泌素、多肽YY、脑垂体腺苷酸环化酶激活多肽、血小板衍生的生长因子、多粘菌素B、催乳激素、蛋白质合成刺激多肽、PTH-相关的蛋白质、松弛素、肾素、分泌素、血清胸腺因子、生长调节素、生长激素抑制素、物质P、超氧化物、超氧化物歧化酶、特夫素(taftsin)、四肽胃泌素、血小板生成素、胸腺体液因子、胸腺生成素、胸腺素、胸腺刺激素、甲状腺激素释放激素、甲状腺刺激激素、促甲状腺素释放激素TRH、胰蛋白酶、促吞噬肽、肿瘤生长因子、肿瘤坏死因子、短杆菌酪肽、尿抑胃素、尿激酶、血管活性肠多肽、抗利尿激素(vasopressin)以及功能等效物。
在其它优选的实施方案中，复合物可包含结合抗原呈递细胞(APC)上的抗原如树突细胞(DC)抗原的抗体或其片段，其附着至异种抗原或诱变处理或化学修饰的抗原(参见，例如美国专利号7,901,680、USSN 12/754,740；所述专利各自的实施例部分均以引用的方式并入本文)。此类复合物用来诱导对抗选择的靶抗原例如肿瘤相关的抗原的免疫应答。可靶向的示例性DC抗原包括但不限于CD209(DC-SIGN)、CD34、CD74、CD205、TLR 2(toll样受体2)、TLR 4、TLR 7、TLR 9、BDCA-2、BDCA-3、BDCA-4以及HLA-DR。在其它实施方案中，DC靶向抗体或其片段可附着至病原体相关的抗原以诱导对抗造成感染性疾病的病原体的免疫应答。在美国专利申请序号12/915,515中公开了痘病毒相关的抗原的一个示例性实施方案，所述专利的实施例部分以引用的方式并入本文。
在替代实施方案中，DNLTM复合物可包含用来递送干扰RNA种类如siRNA的附着至寡核苷酸载体部分如鱼精蛋白、树枝状聚合物或其它聚合物的抗体或抗原结合抗体片段。用于此类目的的示例性复合物公开于2010年12月9日提交的美国专利申请序号12/964,021中，所述专利的实施例部分以引用的方式并入本文。
附图简述
以下附图形成本说明书的部分并且被包括以进一步证明本发明的某些实施方案。可通过参考一个或多个这些附图并结合本文提出的具体实施方案的详述更好地理解这些实施方案。
图1.DNLTM模块和缀合物。(a)Ck-AD2-IgG(Ck-AD2-IgG-依帕珠单抗或Ck-AD2-IgG-维妥珠单抗)，具有融合至每条κ轻链羧基末端的AD2的IgG-AD2模块(module)。(b)二聚CH1-DDD2-Fab-维妥珠单抗，具有融合至Fd链的羧基末端的DDD2的Fab-DDD模块。(c)22*-(20)-(20)，包含Ck-AD2-IgG-依帕珠单抗和两个二聚CH1-DDD2-Fab-维妥珠单抗模块的bsHexAb。(d)22-(20)-(20)，包含CH3-AD2-IgG-依帕珠单抗和两个二聚CH1-DDD2-Fab-维妥珠单抗模块的bsHexAb。(e)具有经过柔性肽接头融合至IFNα2b的羧基末端的DDD2的二聚IFNα2b-DDD2模块。(f)20*-2b，用与两个二聚IFNα2b-DDD2模块融合的Ck-AD2-IgG-维妥珠单抗构建的具有四聚IFNα2b的免疫细胞因子。(g)20-2b，用与两个二聚IFNα2b-DDD2模块融合的CH3-AD2-IgG构建的具有四聚IFNα2b的IgG-IFNα。IgG重(H)链和轻(L)链的可变(V)结构域和恒定(C)结构域表示为椭圆形。DDD2肽和AD2肽分别示为深螺旋和浅螺旋，其中位置指示反应性硫氢基(SH)并且“锁定”二硫桥键指示为接合螺旋的线。
图2.22*-(20)-(20)和22-(20)-(20)在小鼠和兔体内的药物代谢动力学。在这个和其它图中，使用星号(*)指示包含轻链缀合的AD部分的DNLTM复合物，而没有星号指示包含重链缀合的AD部分的DNLTM复合物。在指示的时间间隔中，使用双特异性ELISA测量血清样品中的完整分子的浓度。向动物皮下施用22*-(20)-(20)(圆形)、22-(20)-(20)(正方形)或依帕珠单抗(三角形)。最后对小鼠取血，而连续对兔取血。(a)对3只小鼠(平均值±SD)的组给药1.0mg的bsHexAb或等摩尔量的依帕珠单抗(0.41mg)。(b)对4只小鼠的组给药0.5mg的bsAb。通过使用具有Prism软件的一阶指数衰减模型的非线性回归分析绘制单独的数据点。(c,d)向兔施用18mg(6mg/kg)的bsAb。示出各个动物的Pk曲线(c)和每个组的平均值SD±(d)。
图3.20*-2b和20-2b在小鼠体内的药物代谢动力学和体内稳定性。通过皮下(a)或静脉内(b，c，d)注射向3只小鼠的组施用1.0mg的20*-2b(圆形)或20-2b(正方形)。(c)针对从各个动物获得的每个数据点，使用双特异性(实线)或维妥珠单抗特异性(虚线)的ELISA形式测量完整IgG-IFNα和总IgG(维妥珠单抗)的血清浓度。(d)对于每个数据点，％完整IgG-IFNα通过将用双特异性ELISA测量的血清浓度除以用维妥珠单抗特异性测定确定的血清浓度并且使商乘以100来计算。绘制％完整IgG-IFNα与注射后的小时数的图，并且通过线性回归分析(±SD)确定解离速率。
图4.效应子功能。比较了(a)20*-2b、20-2b以及维妥珠单抗和(b)22*-(20)-(20)、22-(20)-(20)、维妥珠单抗以及依帕珠单抗之中的体外CDC。(c)比较了22*-(20)-(20)、22-(20)-(20)、维妥珠单抗以及依帕珠单抗之中的体外ADCC。mAb hMN-14用作每个实验的非结合同种型对照。
图5.播散性Daudi伯基特淋巴瘤异种移植物的体内功效。(a)通过IV注射对8只SCID小鼠的组接种Daudi。在第7天，通过SC注射向小鼠施用单次剂量的1.0μg或0.25μg的20*-2b或20-2b。向对照组施用0.6μg的维妥珠单抗或盐水。(b)在第0天通过IV注射对10只SCID小鼠的组接种。在第1天和第5天，通过SC注射向小鼠施用高(1mg)或低(10μg)剂量的22*-(20)-(20)或22-(20)-(20)。向对照组施用高剂量的依帕珠单抗、高剂量依帕珠单抗加CH1-DDD2-维妥珠单抗或盐水。通过对数秩分析Kaplan-Myer存活曲线图来确定统计显著性。
图6.CD20结合。用递增浓度的PE-标记的20*-2b或维妥珠单抗孵育Daudi细胞并且通过流式细胞计量术评价结合。MFI，平均荧光强度。
图7.体外细胞毒性。在定量相对活细胞密度之前，用递增浓度的20*-2b(圆形)或20-2b(正方形)孵育Daudi细胞三天。
图8.22*-(20)-(20)和22-(20)-(20)在小鼠体内的体内解离。针对从各个动物获得的每个数据点，使用双特异性或依帕珠单抗特异性的ELISA测量完整bsHexAb和总IgG(依帕珠单抗)的血清浓度。通过将用双特异性ELISA测量的血清浓度除以用依帕珠单抗特异性测定确定的血清浓度并且使商乘以100来计算％完整bsHexAb。绘制％完整IgG-IFNα与注射后的小时数的图，并且通过线性回归分析确定解离速率。误差棒，标准偏差。
图9.22*-(20)-(20)和22-(20)-(20)在兔体内的体内解离。针对每个数据点，使用双特异性或依帕珠单抗特异性的ELISA测量完整bsHexAb和总IgG的血清浓度。通过将用双特异性ELISA测量的血清浓度除以用依帕珠单抗特异性测定确定的血清浓度并且使商乘以100来计算％完整bsHexAb。在兔体内没有观察到解离。误差棒，标准偏差。
图10.来自全血的Raji细胞和正常B细胞的离体衰竭。在FACS分析之前，在37℃下用5nM的指示mAb孵育肝素化的全血两天。
图11.Ck-AD2-IgG-pdHL2表达载体的示意性图示。
图12.Ck-AD2-IgG-pGSHL表达载体的示意性图示。
详述
定义
除非另外指出，否则“一个”或“一种”意指“一个(种)或多个(种)”。
如本文所使用，术语“和”与“或”可用来意指连词或转折连词。即，这两个术语均应该理解为等效于“和/或”，除非另外说明。
“治疗剂”为对疾病的治疗有用的原子、分子或化合物。治疗剂的实例包括抗体、抗体片段、肽、药物、毒素、酶、核酸酶、激素、免疫调节剂、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、螯合剂、硼化合物、光活化剂、染料以及放射性同位素。
“诊断剂”为对诊断疾病有用的原子、分子或化合物。有用的诊断剂包括但不限于放射性同位素、染料(如具有生物素-抗生物素蛋白链菌素复合物)、造影剂、荧光化合物或分子以及用于磁共振成像(MRI)的增强剂(例如，顺磁离子)。
如本文所使用的“抗体”是指全长(即，天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组方法形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合)部分，像抗体片段。“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体以及人抗体。
“裸抗体”为没有附着至治疗剂或诊断剂的抗体或其抗原结合片段。完整裸抗体的Fc部分可提供效应子功能，如补体固定和ADCC(参见，例如Markrides,Pharmacol Rev 50:59-87,1998)。裸抗体诱导细胞死亡的其它机制可包括凋亡。(Vaswani和Hamilton,Ann AllergyAsthma Immunol 81:105-119,1998。)
“抗体片段”为完整抗体的一部分，如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、sFv、scFv、dAb等。与结构无关，抗体片段与由全长抗体识别的相同抗原结合。例如，抗体片段包括由可变区组成的分离片段，如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段或其中轻可变区和重可变区由肽接头(“scFv蛋白”)连接的重组单链多肽分子。常常缩写为“scFv”的“单链抗体”由包含VH和VL结构域的多肽链组成，所述VH和VL结构域相互作用以形成抗原结合位点。VH结构域和VL结构域通常由1至25个氨基酸残基的肽连接。抗体片段还包括双抗体、三抗体和单结构域抗体(dAb)。
“嵌合抗体”为重组蛋白，其含有包括来源于一个物种的抗体(优选啮齿动物抗体)的互补决定区(CDR)的可变结构域，而抗体分子的恒定结构域来源于人抗体的那些恒定结构域。对于兽医学应用，嵌合抗体的恒定结构域可来源于其它物种如猫或狗的恒定结构域。
“人源化抗体”为重组蛋白，其中来自一个物种的抗体(例如，啮齿动物抗体)的CDR从啮齿动物抗体的可变重链和可变轻链转移到人重链可变结构域和轻链可变结构域(包括人构架区(FR)序列)中。抗体分子的恒定结构域是来源于人抗体的那些恒定结构域。
“人抗体”为从转基因小鼠中获得的抗体，所述转基因小鼠已被基因工程化以响应于抗原挑战而产生特异性人抗体。在此技术中，将人重链基因座和轻链基因座的元件引入到来源于胚胎干细胞系的小鼠品系中，所述胚胎干细胞系含有内源性重链基因座和轻链基因座的靶向破坏。转基因小鼠可合成对人抗原有特异性的人抗体，并且小鼠可用来产生分泌人抗体的杂交瘤。用于从转基因小鼠中获得人抗体的方法由Green等人,Nature Genet.7:13(1994)、Lonberg等人,Nature368:856(1994)以及Taylor等人,Int.Immun.6:579(1994)描述。完全地人抗体还可通过基因转染或染色体转染方法以及噬菌体展示技术来构建，所有所述方法和技术均为本领域中已知的。(参见，例如McCafferty等人,Nature 348:552-553(1990)用于从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变结构域基因库(gene repertoire)中体外产生人抗体及其片段)。在此技术中，将抗体可变结构域基因同框克隆到丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因中，并在噬菌体颗粒的表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体功能性质的选择也导致选择编码展现那些性质的抗体的基因。以此方式，噬菌体模拟B细胞的一些性质。可以各种形式进行噬菌体展示，对于它们的综述，参见例如Johnson和Chiswell,Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571(1993)。还可由体外激活的B细胞来产生人抗体。(参见，美国专利号5,567,610和5,229,275)。
如本文中所使用，术语“抗体融合蛋白”为重组产生的抗原结合分子，其中抗体或抗体片段连接至另一种蛋白质或肽，如相同的或不同的抗体或抗体片段或DDD肽或AD肽。融合蛋白可包含单一抗体组分、不同抗体组分的多价或多特异性的组合或相同抗体组分的多个拷贝。融合蛋白可额外包含抗体或抗体片段和治疗剂。适用于此类融合蛋白的治疗剂的实例包括免疫调节剂和毒素。一种优选的毒素包含核糖核酸酶(RNA酶)，优选地重组RNA酶。
“多特异性抗体”为可同时结合至少两个具有不同结构的靶标(例如，两个不同抗原、在相同抗原上的两个不同表位或半抗原和/或抗原或表位)的抗体。“多价抗体”为可同时结合至少两个具有相同或不同结构的靶标的抗体。价态指示抗体对单一抗原或表位具有多少个结合臂或位点；即，一价的、二价的、三价的或多价的。抗体的多价性意味着抗体可使用多种相互作用结合抗原，从而增加结合抗原的亲合力。特异性指示抗体能够结合多少个抗原或表位；即，单特异性的、双特异性的、三特异性的、多特异性的。使用这些定义，天然抗体(例如，IgG)为二价的，因为它具有两个结合臂，但所述抗体为单特异性的，因为它结合一个表位。多特异性的、多价的抗体为具有多于一个具有不同特异性的结合位点的构建体。
“双特异性抗体”为可同时结合两个具有不同结构的靶标的抗体。双特异性抗体(bsAb)和双特异性抗体片段(bsFab)可具有：至少一个臂，其特异性结合例如B细胞抗原或表位、T细胞抗原或表位、骨髓样细胞抗原或表位、浆细胞抗原或表位以及肥大细胞抗原或表位；和至少一个其它臂，其特异性结合带有治疗剂或诊断剂的可靶向的缀合物。可使用分子工程来产生各种双特异性抗体。
“异种抗原”为在多于一个物种中发现的抗原。当在本文中在疫苗中使用以在受试者体内诱导免疫应答时，异种抗原来自不同于受试者的物种。例如，用于人疫苗中的异种抗原可来自小鼠、大鼠、兔或另一种非人物种。
如果施用的量为生理上显著的，认为以“治疗有效量”施用了本文描述的抗体或免疫毒素制剂或组合物。如果其的存在导致受体受试者生理学的可检测变化，药剂为生理上显著的。在具体实施方案中，如果其的存在引起抗肿瘤应答或减轻自身免疫疾病病况的体征和症状，抗体制剂为生理上显著的。生理上显著的作用还可为导致靶细胞的生长抑制或死亡的在受体受试者体内唤起体液免疫应答和/或细胞免疫应答。
抗体
用于制备对抗几乎任何靶抗原的单克隆抗体的技术为本领域中熟知的。参见，例如Kohler和Milstein,Nature 256:495(1975)和Coligan等人(编著),CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,第1卷,第2.5.1-2.6.7页(John Wiley&Sons 1991)。简而言之，可通过用包含抗原的组合物注射小鼠、去除脾脏以获得B-淋巴细胞、使B-淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤、克隆杂交瘤、选择产生针对抗原的抗体的阳性克隆、培养产生针对抗原的抗体的克隆以及从杂交瘤培养物中分离抗体来获得单克隆抗体。
MAb可通过各种已确立的技术从杂交瘤培养物分离和纯化。此类分离技术包括使用蛋白A琼脂糖凝胶的亲和色谱法、体积排阻色谱法和离子交换色谱法。参见，例如Coligan的第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页。还参见Baines等人，在METHODS IN MOLECULARBIOLOGY，第10卷，第79-104页中的“Purification of ImmunoglobulinG(IgG)”，(The Humana Press,Inc.1992)。
在初始生成针对免疫原的抗体之后，可对抗体测序并且随后通过重组技术来制备。鼠抗体和抗体片段的人源化和嵌合为本领域技术人员所熟知的。使用来源于人源化抗体、嵌合抗体或人抗体的抗体组分排除了与鼠恒定区的免疫原性相关的潜在问题。
嵌合抗体
嵌合抗体为重组抗体，其中人抗体的可变区已置换为例如小鼠抗体的可变区，包括小鼠抗体的互补决定区(CDR)。嵌合抗体在向受试者施用时展现出降低的免疫原性和增加的稳定性。用于克隆鼠免疫球蛋白可变结构域的一般技术公开于例如Orlandi等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86:3833(1989)中。用于构建嵌合抗体的技术为本领域技术人员所熟知的。作为一个实例，Leung等人,Hybridoma 13:469(1994)通过使编码鼠LL2(抗CD22单克隆抗体)的Vκ结构域和VH结构域的DNA序列与各自的人κ和IgG1恒定区结构域组合来产生LL2嵌合体。
人源化抗体
用于产生人源化MAb的技术为本领域中熟知的(参见，例如Jones等人,Nature 321:522(1986)、Riechmann等人,Nature 332:323(1988)、Verhoeyen等人,Science 239:1534(1988)、Carter等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 89:4285(1992)、Sandhu,Crit.Rev.Biotech.12:437(1992)以及Singer等人,J.Immun.150:2844(1993))。可通过将来自小鼠免疫球蛋白的可变重链和可变轻链的小鼠CDR转移到人抗体的相应可变结构域中来人源化嵌合单克隆抗体或鼠单克隆抗体。嵌合单克隆抗体中的小鼠构架区(FR)也置换为人FR序列。因为将小鼠CDR简单地转移到人FR中常常导致抗体亲和性减小或甚至失去，所以可能需要另外的修饰以便恢复鼠抗体的原始亲和性。此举可通过将FR区中的一个或多个人残基置换为其鼠对应物以获得对其表位拥有良好结合亲和性的抗体来实现。参见，例如Tempest等人,Biotechnology 9:266(1991)和Verhoeyen等人,Science 239:1534(1988)。通常，不同于其鼠对应物并且位于一个或多个CDR氨基酸残基附近或接近一个或多个CDR氨基酸残基的那些人FR氨基酸残基将为取代的候选物。
人抗体
用于使用组合方法或用人免疫球蛋白基因座转化的转基因动物来产生完全地人抗体的方法为本领域中已知的(例如，Mancini等人,2004,New Microbiol.27:315-28；Conrad和Scheller,2005,Comb.Chem.High Throughput Screen.8:117-26；Brekke和Loset,2003,Curr.Opin.Phamacol.3:544-50)。完全地人抗体还可通过基因转染或染色体转染方法以及噬菌体展示技术来构建，所有所述方法和技术均为本领域中已知的。参见例如McCafferty等人,Nature 348:552-553(1990)。预期此类完全地人抗体展现出比嵌合抗体或人源化抗体甚至更少的副作用并且在体内起基本上内源性人抗体的作用。在某些实施方案中，要求保护的方法和工序可利用通过此类技术产生的人抗体。
在一个替代方案中，可使用噬菌体展示技术来产生人抗体(例如，Dantas-Barbosa等人,2005,Genet.Mol.Res.4:126-40)。人抗体可从正常人或从表现出具体疾病病况(如癌症)的人中产生(Dantas-Barbosa等人,2005)。从患病个体构建人抗体的优点在于循环抗体库可偏向针对疾病相关抗原的抗体。
在此方法的一个非限制性实例中，Dantas-Barbosa等人(2005)从骨肉瘤患者中构建了人Fab抗体片段的噬菌体展示文库。一般来说，从循环血液淋巴细胞中获得总RNA(同上)。从μ、γ和κ链抗体库克隆重组Fab并且插入到噬菌体展示文库中(同上)。将RNA转变成cDNA并且用来使用针对重链和轻链免疫球蛋白序列的特异性引物制得Fab cDNA文库(Marks等人,1991,J Mol.Biol.222:581-97)。根据Andris-Widhopf等人(2000,在Phage Display Laboratory Manual,Barbas等人(编著),第一版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY第9.1至9.22页中所述)进行文库构建。最终Fab片段用限制性核酸内切酶消化并且插入到噬菌体基因组中以制得噬菌体展示文库。此类文库可通过本领域中所已知的标准噬菌体展示方法筛选(参见，例如Pasqualini和Ruoslahti,1996,Nature 380:364-366；Pasqualini,1999,The Quart.J.Nucl.Med.43:159-162)。
可以各种形式进行噬菌体展示，对于它们的综述，参见例如Johnson和Chiswell,Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571(1993)。还可由体外激活的B细胞来产生人抗体。参见美国专利号5,567,610和5,229,275，其以引用的方式整体并入本文。熟练的技术人员将认识到，这些技术为示例性的并且可利用用于制备和筛选人抗体或抗体片段的任何已知方法。
在另一个替代方案中，可使用已被基因工程化以产生人抗体的转基因动物来使用标准免疫方案产生针对基本上任何免疫原性靶标的抗体。用于从转基因小鼠中获得人抗体的方法由Green等人,NatureGenet.7:13(1994)、Lonberg等人,Nature 368:856(1994)以及Taylor等人,Int.Immun.6:579(1994)公开。所述系统的一个非限制性实例为来自Abgenix(Fremont,CA)的(例如Green等人,1999,J.Immunol.Methods 231:11-23)。在和类似动物中，已使小鼠抗体基因失活并且置换为功能性人抗体基因，而小鼠免疫系统的其余部分保持完整。
将用含有人IgH和Igκ基因座的部分，包括大部分可变区序列连同辅助基因和调控序列的种系构型YAC(酵母人工染色体)转化。人可变区库可用来产生生产抗体的B细胞，所述B细胞可通过已知技术加工成杂交瘤。用靶抗原免疫的将通过正常免疫应答产生人抗体，其可通过以上所讨论的标准技术收获和/或生产。可获得的各种品系，其各自均能够产生不同类别的抗体。已示出转基因产生的人抗体具有治疗潜能，同时保留正常人抗体的药物代谢动力学性质(Green等人,1999)。熟练的技术人员将认识到，要求保护的组合物和方法不限于使用系统，但可利用已被基因工程化以产生人抗体的任何转基因动物。
抗体克隆和产生
各种技术，如嵌合抗体或人源化抗体的生产，可涉及抗体克隆和构建的工序。感兴趣的抗体的抗原结合Vκ(可变轻链)和VH(可变重链)序列可通过各种分子克隆工序获得，如RT-PCR、5’-RACE和cDNA文库筛选。来自表达鼠抗体的细胞的抗体的V基因可通过PCR扩增来克隆并且测序。为证实其可靠性，可使克隆的VL基因和VH基因在细胞培养物中表达为嵌合Ab，如Orlandi等人所述(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86:3833(1989))。基于V基因序列，然后可设计并且构建人源化抗体，如由Leung等人(Mol.Immunol.,32:1413(1995))所描述。
cDNA可通过一般分子克隆技术从任何已知的产生鼠抗体的杂交瘤系或转染细胞系制备(Sambrook等人,Molecular Cloning,Alaboratory manual,第2版(1989))。可使用引物VK1BACK和VK1FOR(Orlandi等人,1989)或由Leung等人(BioTechniques,15:286(1993))描述的延伸引物组来扩增抗体的Vκ序列。可使用引物对VH1BACK/VH1FOR(Orlandi等人,1989)或由Leung等人(Hybridoma,13:469(1994))描述的使鼠IgG的恒定区退火的引物来扩增VH序列。可通过长的寡核苷酸模板合成和PCR扩增的组合来构建人源化的V基因，如由Leung等人(Mol.Immunol.,32:1413(1995))所描述。
可将Vκ的PCR产物亚克隆到阶段载体(staging vector)中，如基于pBR327的阶段载体(VKpBR)，所述阶段载体含有Ig启动子、信号肽序列以及合宜的限制位点。VH的PCR产物可亚克隆到类似阶段载体中，如基于pBluescript的VHpBS。含有Vκ和VH序列连同启动子和信号肽序列的表达盒可从VKpBR和VHpBS切除并且分别连接到适当的表达载体中，如pKh和pG1g(Leung等人,Hybridoma,13:469(1994))。可将表达载体共转染到适当的细胞并且监测上清液中嵌合抗体、人源化抗体或人抗体的产生。或者，可切除Vκ和VH表达盒并且亚克隆到单一表达载体中，如pdHL2，如由Gillies等人(J.Immunol.Methods 125:191(1989)并且还在Losman等人,Cancer,80:2660(1997)中示出)所描述。
在一个替代实施方案中，可将表达载体转染到已预先适应在无血清培养基中转染、生长和表达的宿主细胞中。可使用的示例性细胞系包括Sp/EEE、Sp/ESF和Sp/ESF-X细胞系(参见，例如美国专利号7,531,327；7,537,930和7,608,425；所述专利各自的实施例部分均以引用的方式并入本文)。这些示例性细胞系基于用突变型Bcl-EEE基因转染、暴露于甲氨蝶呤以扩增转染的基因序列并且预先适应无血清细胞系用于蛋白质表达的Sp2/0骨髓瘤细胞系。
抗体片段
可通过已知技术产生识别特定表位的抗体片段。抗体片段为抗体的抗原结合部分，如F(ab')2、Fab'、F(ab)2、Fab、Fv、sFv等。F(ab’)2片段可通过胃蛋白酶消化抗体分子而产生，并且Fab'片段可通过还原F(ab’)2片段的二硫键桥而产生。或者，可构建Fab'表达文库(Huse等人,1989,Science,246:1274-1281)以允许快速和容易鉴别具有希望的特异性的单克隆Fab'片段。F(ab)2片段可通过木瓜蛋白酶消化抗体而产生。
单链Fv分子(scFv)包含VL结构域和VH结构域。VL结构域和VH结构域缔合形成靶结合位点。这两个结构域由肽接头(L)进一步共价连接。用于制得scFv分子和设计适合的肽接头的方法描述于美国专利号4,704,692、美国专利号4,946,778、R.Raag和M.Whitlow,“SingleChain Fvs.”FASEB第9卷:73-80(1995)以及R.E.Bird和B.W.Walker,“Single Chain Antibody Variable Regions,”TIBTECH,第9卷:132-137(1991)中。
用于产生单结构域抗体(DAB)的技术也为本领域中已知的，如例如在Cossins等人(2006,Prot Express Purif 51:253-259)中所公开，所述参考文献以引用的方式并入本文。
用于产生单结构域抗体的技术也为本领域中已知的，如例如在Cossins等人(2006,Prot Express Purif 51:253-259)中所公开，所述参考文献以引用的方式并入本文。单结构域抗体(VHH)可通过标准免疫技术从例如骆驼、羊驼或美洲驼获得。(参见，例如Muyldermans等人，TIBS 26:230-235,2001；Yau等人，J Immunol Methods 281:161-75,2003；Maass等人，J Immunol Methods 324:13-25,2007)。VHH可具有有效的抗原结合能力，并可与常规VH-VL对所不可及的新型表位相互作用。(Muyldermans等人,2001)。羊驼血清IgG含有约50％仅有重链的骆驼IgG抗体(HCAb)(Maass等人,2007)。羊驼可用已知抗原(如TNF-α)免疫并且可分离结合和中和靶抗原的VHH(Maass等人,2007)。已鉴定出扩增几乎所有羊驼VHH编码序列的PCR引物，并且可将其用来构建羊驼VHH噬菌体展示文库，可使用所述文库通过本领域中熟知的标准生物淘选技术分离抗体片段(Maass等人,2007)。在某些实施方案中，可在要求保护的组合物和方法中利用抗胰腺癌VHH抗体片段。
可通过蛋白水解全长抗体或通过在大肠杆菌(E.coli)或另一种具有编码用于片段的DNA的宿主中表达来制备抗体片段。可通过常规方法由胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全长抗体来获得抗体片段。这些方法例如由Goldenberg美国专利号4,036,945和4,331,647所描述并且参考文件包含在其中。还参见Nisonoff等人，Arch Biochem.Biophys.89:230(1960)；Porter,Biochem.J.73:119(1959),Edelman等人，在METHODS IN ENZYMOLOGY第1卷，第422页(Academic Press 1967)以及Coligan第2.8.1-2.8.10页和第2.10.-2.10.4页中所述。
抗体同种异型
治疗性抗体的免疫原性与输注反应风险增加和治疗性应答的持续时间减少相关(Baert等人,2003,N Engl J Med 348:602-08)。治疗性抗体在宿主中诱导免疫应答的程度可部分地通过抗体的同种异型来确定(Stickler等人,2011,Genes and Immunity 12:213-21)。抗体同种异型与抗体的恒定区序列中特定位置上的氨基酸序列变化相关。含有重链γ-型恒定区的IgG抗体的同种异型命名为Gm同种异型(1976,JImmunol 117:1056-59)。
对于常见的IgG1人抗体而言，最普遍的同种异型为G1m1(Stickler等人,2011,Genes and Immunity 12:213-21)。然而，G1m3同种异型也频繁出现于白种人中(Stickler等人,2011)。已报道了当向非G1m1(nG1m1)接受者(如G1m3患者)施用时，G1m1抗体含有倾向于诱导免疫应答的同种异型序列(Stickler等人,2011)。当向G1m1患者施用时，非G1m1同种异型抗体不作为免疫原性的(Stickler等人,2011)。
人G1m1同种异型包含重链IgG1的CH3序列中的Kabat位置356上的氨基酸天冬氨酸和Kabat位置358上的亮氨酸。nG1m1同种异型包含Kabat位置356上的氨基酸谷氨酸和Kabat位置358上的甲硫氨酸。G1m1和nG1m1同种异型均包含Kabat位置357上的谷氨酸残基，并且同种异型有时称为DEL同种异型和EEM同种异型。针对示例性抗体利妥昔单抗(SEQ ID NO:85)和维妥珠单抗(SEQ ID NO:86)示出G1m1和nG1m1同种异型抗体的重链恒定区序列的非限制性实例。
利妥昔单抗重链可变区序列(SEQ ID NO:85)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
维妥珠单抗重链可变区(SEQ ID NO:86)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Jefferis和Lefranc(2009,mAbs 1:1-7)综述了IgG同种异型的特征的序列变化及其对免疫原性的影响。他们报道了与G1m17同种异型中的Kabat 214上的赖氨酸残基相比，G1m3同种异型的特征在于Kabat位置214上的精氨酸残基。nG1m1,2同种异型的特征在于Kabat位置356上的谷氨酸、Kabat位置358上的甲硫氨酸以及Kabat位置431上的丙氨酸。G1m1,2同种异型的特征在于Kabat位置356上的天冬氨酸、Kabat位置358上的亮氨酸以及Kabat位置431上的甘氨酸。除了重链恒定区序列变体之外，Jefferis和Lefranc(2009)报道了κ轻链恒定区中的同种异型变体，其中Km1同种异型的特征在于Kabat位置153上的缬氨酸和Kabat位置191上的亮氨酸，Km1,2同种异型的特征在于Kabat位置153上的丙氨酸和Kabat位置191上的亮氨酸，并且Km3同种异型的特征在于Kabat位置153上的丙氨酸和Kabat位置191上的缬氨酸。
关于治疗性抗体，维妥珠单抗和利妥昔单抗分别为用于治疗各种各样血液恶性肿瘤和/或自身免疫疾病的对抗CD20的人源化抗体和嵌合IgG1抗体。表1比较了利妥昔单抗与维妥珠单抗的同种异型序列。如在表1中所示，利妥昔单抗(G1m17,1)为DEL同种异型IgG1，在利妥昔单抗中的赖氨酸与维妥珠单抗中的精氨酸的Kabat位置214(重链CH1)上具有额外序列变化。已报道了在受试者中维妥珠单抗比利妥昔单抗的免疫原性小(参见，例如Morchhauser等人,2009,J Clin Oncol 27:3346-53；Goldenberg等人,2009,Blood 113:1062-70；Robak&Robak,2011,BioDrugs 25:13-25)，这种作用已归因于人源化抗体与嵌合抗体之间的差异。然而，EEM同种异型与DEL同种异型之间的同种异型差异也可能解释维妥珠单抗的更低免疫原性。
表1.利妥昔单抗与维妥珠单抗的同种异型
为了减小治疗性抗体在nG1m1基因型个体中的免疫原性，希望选择对应于G1m3同种异型的抗体同种异型，其特征在于Kabat 214上的精氨酸；和nG1m1,2无效同种异型，其特征在于Kabat位置356上的谷氨酸、Kabat位置358上的甲硫氨酸以及Kabat位置431上的丙氨酸。出人意料地，发现重复皮下施用G1m3抗体经过很长一段时间并不会引起显著的免疫应答。在替代实施方案中，与G1m3同种异型一样的人IgG4重链具有Kabat 214上的精氨酸、Kabat 356上的谷氨酸、Kabat 359上的甲硫氨酸以及Kabat 431上的丙氨酸。因为免疫原性看起来似乎至少部分地与那些位置上的残基相关，所以对于治疗性抗体的人IgG4重链恒定区序列的使用也是一个优选的实施方案。G1m3IgG1抗体与IgG4抗体的组合也可用于治疗性施用。
已知的抗体
在各种实施方案中，要求保护的方法和组合物可利用本领域中已知的任何各种抗体。有用的抗体可从许多已知的来源中商业获得。例如，各种分泌抗体的杂交瘤细胞系可从美国典型培养物保藏所(American Type Culture Collection)(ATCC,Manassas,VA)获得。对抗各种疾病靶标(包括但不限于肿瘤相关的抗原)的大量抗体已保藏于ATCC和/或已公布可变区序列并且可供用于要求保护的方法和组合物中。参见，例如美国专利号7,312,318；7,282,567；7,151,164；7,074,403；7,060,802；7,056,509；7,049,060；7,045,132；7,041,803；7,041,802；7,041,293；7,038,018；7,037,498；7,012,133；7,001,598；6,998,468；6,994,976；6,994,852；6,989,241；6,974,863；6,965,018；6,964,854；6,962,981；6,962,813；6,956,107；6,951,924；6,949,244；6,946,129；6,943,020；6,939,547；6,921,645；6,921,645；6,921,533；6,919,433；6,919,078；6,916,475；6,905,681；6,899,879；6,893,625；6,887,468；6,887,466；6,884,594；6,881,405；6,878,812；6,875,580；6,872,568；6,867,006；6,864,062；6,861,511；6,861,227；6,861,226；6,838,282；6,835,549；6,835,370；6,824,780；6,824,778；6,812,206；6,793,924；6,783,758；6,770,450；6,767,711；6,764,688；6,764,681；6,764,679；6,743,898；6,733,981；6,730,307；6,720,155；6,716,966；6,709,653；6,693,176；6,692,908；6,689,607；6,689,362；6,689,355；6,682,737；6,682,736；6,682,734；6,673,344；6,653,104；6,652,852；6,635,482；6,630,144；6,610,833；6,610,294；6,605,441；6,605,279；6,596,852；6,592,868；6,576,745；6,572；856；6,566,076；6,562,618；6,545,130；6,544,749；6,534,058；6,528,625；6,528,269；6,521,227；6,518,404；6,511,665；6,491,915；6,488,930；6,482,598；6,482,408；6,479,247；6,468,531；6,468,529；6,465,173；6,461,823；6,458,356；6,455,044；6,455,040；6,451,310；6,444,206；6,441,143；6,432,404；6,432,402；6,419,928；6,413,726；6,406,694；6,403,770；6,403,091；6,395,276；6,395,274；6,387,350；6,383,759；6,383,484；6,376,654；6,372,215；6,359,126；6,355,481；6,355,444；6,355,245；6,355,244；6,346,246；6,344,198；6,340,571；6,340,459；6,331,175；6,306,393；6,254,868；6,187,287；6,183,744；6,129,914；6,120,767；6,096,289；6,077,499；5,922,302；5,874,540；5,814,440；5,798,229；5,789,554；5,776,456；5,736,119；5,716,595；5,677,136；5,587,459；5,443,953；5,525,338，所述专利各自的实施例部分以引用的方式并入本文。这些抗体仅为示例性的并且各种各样的其它抗体和它们的杂交瘤为本领域中已知的。熟练的技术人员将认识到，可通过简单研究对抗感兴趣的选择的疾病相关的靶标的抗体的ATCC、NCBI和/或USPTO数据库来获得对抗几乎任何疾病相关的抗原的抗体序列或分泌抗体的杂交瘤。使用本领域中熟知的标准技术，可将克隆抗体的抗原结合结构域扩增、切除、连接到表达载体中、转染到适配的宿主细胞中并且用于蛋白质产生(参见，例如美国专利号7,531,327；7,537,930；7,608,425以及7,785,880，所述专利各自的实施例部分以引用的方式并入本文)。
在要求保护的方法和组合物的范围内可用于治疗癌症的具体抗体包括但不限于LL1(抗CD74)、LL2和RFB4(抗CD22)、RS7(抗上皮糖蛋白-1(EGP-1))、PAM4和KC4(两者均抗粘蛋白)、MN-14(抗癌胚抗原(CEA，又称为CD66e)、Mu-9(抗结肠特异性抗原p)、Immu 31(抗α-胎蛋白)、TAG-72(例如，CC49)、Tn、J591或HuJ591(抗PSMA(前列腺特异性膜抗原))、AB-PG1-XG1-026(抗PSMA二聚体)、D2/B(抗PSMA)、G250(抗碳酸酐酶IX)、hL243(抗HLA-DR)、阿仑单抗(抗CD52)、贝伐单抗(抗VEGF)、西妥昔单抗(抗EGFR)、吉妥单抗(抗CD33)、替伊莫单抗(抗CD20)、帕尼单抗(抗EGFR)、利妥昔单抗(抗CD20)、托西莫单抗(抗CD20)、GA101(抗CD20)以及曲妥单抗(抗ErbB2)。此类抗体为本领域中已知的(例如，美国专利号5,686,072；5,874,540；6,107,090；6,183,744；6,306,393；6,653,104；6,730.300；6,899,864；6,926,893；6,962,702；7,074,403；7,230,084；7,238,785；7,238,786；7,256,004；7,282,567；7,300,655；7,312,318；7,585,491；7,612,180；7,642,239；以及美国专利申请公布号20040202666(现在被废除)；20050271671和20060193865，所述专利各自的实施例部分均以引用的方式并入本文)。有用的具体已知的抗体包括hPAM4(美国专利号7,282,567)、hA20(美国专利号7,251,164)、hA19(美国专利号7,109,304)、hIMMU31(美国专利号7,300,655)、hLL1(美国专利号7,312,318)、hLL2(美国专利号7,074,403)、hMu-9(美国专利号7,387,773)、hL243(美国专利号7,612,180)、hMN-14(美国专利号6,676,924)、hMN-15(美国专利号7,541,440)、hR1(美国专利申请12/772,645)、hRS7(美国专利号7,238,785)、hMN-3(美国专利号7,541,440)、AB-PG1-XG1-026(美国专利申请11/983,372，保藏为ATCC PTA-4405和PTA-4406)以及D2/B(WO 2009/130575)，关于附图和实施例部分，每个列举的专利或申请的文本以引用的方式并入本文。
抗TNF-α抗体为本领域中已知的，并且可用于治疗免疫疾病如自身免疫疾病、免疫功能障碍(例如，移植物抗宿主疾病、器官移植排斥)或糖尿病。已知的对抗TNF-α的抗体包括人抗体CDP571(Ofei等人,2011,Diabetes 45:881-85)；鼠抗体MTNFAI、M2TNFAI、M3TNFAI、M3TNFABI、M302B以及M303(Thermo Scientific,Rockford,IL)；英利昔单抗(Centocor,Malvern,PA)；赛妥珠单抗(UCB,Brussels,Belgium)；以及阿达木单抗(Abbott,Abbott Park,IL)。这些和许多其它已知的抗TNF-α抗体可用于要求保护的方法和组合物中。用于治疗免疫失调或自身免疫疾病的其它抗体包括但不限于抗B细胞抗体，如维妥珠单抗、依帕珠单抗、米拉珠单抗(milatuzumab)或hL243；托珠单抗(抗IL-6受体)；巴利昔单抗(抗CD25)；达利珠单抗(抗CD25)；依法利珠单抗(抗CD11a)；莫罗单抗-CD3(抗CD3受体)；抗CD40L(UCB,Brussels,Belgium)；那他珠单抗(抗α4整联蛋白)以及奥马珠单抗(抗IgE)。
可使用已知的对抗B细胞抗原的抗体来治疗1型糖尿病和2型糖尿病，如对抗CD22的抗体(依帕珠单抗)、对抗CD74的抗体(米拉珠单抗)、对抗CD19的抗体(hA19)、对抗CD20的抗体(维妥珠单抗)或对抗HLA-DR的抗体(hL243)(参见，例如Winer等人,2011,NatureMed 17:610-18)。还已提出抗CD3抗体用于治疗1型糖尿病(Cernea等人,2010,Diabetes Metab Rev 26:602-05)。
巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)为先天性和获得性免疫和凋亡的重要调节剂。已报道了CD74为MIF的内源性受体(Leng等人,2003,JExp Med 197:1467-76)。拮抗性抗CD74抗体对MIF介导的细胞内途径的治疗作用可用于治疗广范围的疾病病况，如膀胱癌、前列腺癌、乳癌、肺癌、结肠癌以及慢性淋巴细胞性白血病(例如，Meyer-Siegler等人,2004,BMC Cancer 12:34；Shachar&Haran,2011,LeukLymphoma 52:1446-54)；自身免疫疾病如类风湿性关节炎和全身性红斑狼疮(Morand&Leech,2005,Front Biosci 10:12-22；Shachar&Haran,2011,Leuk Lymphoma 52:1446-54)；肾疾病如肾脏同种异体移植排斥(Lan,2008,Nephron Exp Nephrol.109:e79-83)以及众多炎症性疾病(Meyer-Siegler等人,2009,Mediators Inflamm epub March 22,2009；Takahashi等人,2009,Respir Res 10:33；米拉珠单抗(hLL1)为治疗性用于治疗MIF介导的疾病的示例性抗CD74抗体。
补体系统为涉及常常由细胞受体激活的血清糖蛋白的蛋白水解裂解的复杂级联。“补体级联”为组成型和非特异性的，但它必须被激活以便起作用。补体激活引起单向顺序的酶促反应和生物化学反应。在此级联中，具体补体蛋白C5形成两种高度活性、炎症性的副产物C5a和C5b，所述副产物共同使白细胞激活。这反过来引起许多其它炎症性副产物，包括有害的细胞因子、炎症性酶和细胞粘附分子。总之，这些副产物可导致见于许多炎症性疾病中的组织破坏。此级联最终导致炎症性应答、吞噬细胞趋化性和调理作用以及细胞溶解减少。
补体系统可经过两种相异的途径(经典途径和旁路途径)激活。大多数补体组分是有编号的(例如，C1、C2、C3等)，但一些称为“因子”。一些组分必须被酶促裂解以激活其功能；其它组分简单组合以形成活性的复合物。经典途径的活性组分包括C1q、C1r、C1s、C2a、C2b、C3a、C3b、C4a以及C4b。旁路途径的活性组分包括C3a、C3b、因子B、因子Ba、因子Bb、因子D以及备解素。每种途径的最后阶段均为相同的，并且涉及组分组装成膜攻击复合物。膜攻击复合物的活性组分包括C5a、C5b、C6、C7、C8以及C9n。
虽然可通过抗体复合物靶向补体系统的任何这些组分，但是某些补体组分为优选的。C3a、C4a和C5a引起肥大细胞释放趋化因子如组胺和血清素，其吸引吞噬细胞、抗体和补体等。这些形成一组优选的靶标。另一组优选的靶标包括C3b、C4b和C5b，其增强外来细胞的吞噬作用。另一个优选的组的靶标为这两个组的前驱物组分(predecessor component)，即C3、C4和C5。C5b、C6、C7、C8和C9诱导外来细胞(膜攻击复合物)的溶解并且形成又一个优选的组的靶标。
补体C5a像C3a为过敏毒素。其介导炎症并且为用于诱导嗜中性释放抗微生物蛋白酶和氧自由基的趋化性吸引剂。因此，C5a和其前驱物C5为特别优选的靶标。通过靶向C5，不仅C5a受影响，而且C5b也受影响，所述C5b启动膜攻击复合物的组装。因此，C5为另一个优选的靶标。C3b和其前驱物C3也为优选的靶标，因为经典补体途径和旁路补体途径均取决于C3b。这些蛋白质影响此因子、C1抑制剂、蛋白H和因子I的水平，并且根据本发明这些也为优选的靶标。补体调节蛋白如CD46、CD55和CD59可为抗体复合物结合的靶标。
凝血因子也为优选的靶标，特别是组织因子和凝血酶。组织因子又称为组织促凝血酶原激酶、CD142、凝血因子III或因子III。组织因子为整合的膜受体糖蛋白和细胞因子受体超家族的一员。组织因子的配体结合细胞外结构域由两个结构模块组成，所述结构模块的特征在于与作为2型细胞因子受体的一员的组织因子的分类一致。组织因子涉及于凝血蛋白酶级联中，并且通过在组织因子的细胞外结构域与循环凝血因子、丝氨酸蛋白酶因子VII或因子VIIa之间形成高亲和性复合物来启动外在凝血级联和内在凝血级联。然后这些酶活性的复合物使因子IX和因子X激活，从而引起凝血酶产生和凝块形成。
组织因子由各种细胞类型(包括单核细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞)表达，并且由IL-1、TNF-α或细菌脂多糖诱导。蛋白激酶C涉及于内皮细胞组织因子表达的细胞因子激活中。由内毒素和细胞因子诱导组织因子为用于启动见于患有革兰氏阴性脓毒的患者中的播散性血管内凝血的重要机制。组织因子还似乎涉及于各种非止血功能中，包括炎症、癌症、脑功能、免疫应答以及肿瘤相关的血管生成。因此，靶向组织因子的抗体复合物不仅对凝血病的治疗有用，而且对脓毒症、癌症、病理性血管生成以及根据本发明的其它免疫性和炎症性调节异常疾病的治疗有用。凝血途径与细胞因子网络之间的复杂相互作用通过若干细胞因子影响各种细胞中的组织因子表达的能力和通过结合受体的配体的作用来表明。已报道了配体结合(因子VIIa)以给出细胞内钙信号，从而表明组织因子为真正的受体。
凝血酶为凝血因子II(凝血酶原)的激活形式；其使纤维蛋白原转化为纤维蛋白。凝血酶为巨噬细胞的潜在化学吸引素，并且可改变其细胞因子和花生四烯酸代谢物的产生。其对伴随脓毒症的凝血病特别重要。众多研究已记载了在脓毒症患者体内或在动物模型中在LPS施用之后的凝血系统的激活。尽管超过30年的研究，但是LPS诱导的肝脏毒性的机制仍了解很少。现在清楚的是，它们涉及细胞介质与体液介质之间复杂和顺序的一系列相互作用。在相同时间段里，革兰氏阴性全身性脓毒症和其后遗症已变为主要的健康问题，针对LPS或各种炎症性介质尝试使用单克隆抗体仅产生治疗失败。靶向凝血酶和至少一种其它靶标的抗体复合物解决了脓毒症治疗中的临床失败。
在其它实施方案中，抗体复合物结合I类MHC、II类MHC或辅助分子，如CD40、CD54、CD80或CD86。抗体复合物还可结合T-细胞激活细胞因子或细胞因子介质如NF-κB。
在某些实施方案中，两种不同靶标之一可为癌细胞受体或癌症相关的抗原，具体为选自由以下组成的组的一种抗原：B-细胞谱系抗原(CD19、CD20、CD21、CD22、CD23等)、VEGF、VEGFR、EGFR、癌胚抗原(CEA)、胎盘生长因子(PlGF)、腱生蛋白、HER-2/neu、EGP-1、EGP-2、CD25、CD30、CD33、CD38、CD40、CD45、CD52、CD74、CD80、CD138、NCA66、CEACAM1、CEACAM6(癌胚抗原相关的细胞粘附分子6)、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC16、IL-6、α-胎蛋白(AFP)、A3、CA125、结肠特异性抗原-p(CSAp)、叶酸受体、HLA-DR、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、Ia、EL-2、胰岛素样生长因子(IGF)和IGF受体、KS-1、Le(y)、MAGE、坏死抗原、PAM-4、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、Pr1、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、S100、T101、TAC、TAG72、TRAIL受体以及碳酸酐酶IX。
与脓毒症和免疫调节异常以及其它免疫病症相关的靶标包括MIF、IL-1、IL-6、IL-8、CD74、CD83以及C5aR。已发现对抗C5aR的抗体和抑制剂改进患有脓毒症的啮齿动物的存活(Huber-Lang等人,FASEB J 2002；16:1567-1574；Riedemann等人,J Clin Invest 2002；110:101-108)和猴体内的脓毒性休克和成人呼吸窘迫综合症(Hangen等人,J Surg Res 1989；46:195-199；Stevens等人,J Clin Invest 1986；77:1812-1816)。因此，对于脓毒症，两种不同靶标之一优选地为与感染相关的靶标，如LPS/C5a。其它优选靶标包括HMGB-1、组织因子、CD14、VEGF以及IL-6，其各自均与败血症或脓毒性休克相关。优选的抗体复合物为靶向来自HMGB-1、组织因子和MIF的两个或更多个靶标如MIF/组织因子和HMGB-1/组织因子的那些抗体复合物。
在还其它的实施方案中，不同靶标之一可为与移植物抗宿主疾病或移植排斥相关的靶标，如MIF(Lo等人,Bone Marrow Transplant,30(6):375-80(2002))。不同靶标之一还可为与急性呼吸窘迫综合症相关的靶标，如IL-8(Bouros等人,PMC Pulm Med,4(1):6(2004)；与动脉粥样硬化或再狭窄相关的靶标，如MIF(Chen等人,Arterioscler Thromb Vasc Biol,24(4):709-14(2004)；与哮喘相关的靶标，如IL-8(在印付之前以电子文档公开的Hata等人,Int Immunol,Oct.112004；与肉芽肿疾病相关的靶标，如TNF-α(Ulbricht等人,Arthritis Rheum,50(8):2717-8(2004)；与神经病相关的靶标，如氨基甲酰化的EPO(红细胞生成素)(Leist等人,Science 305(5681):164-5(2004)或与恶病质相关的靶标，如IL-6和TNF-α。
其它靶标包括C5a、LPS、IFN-γ、B7、CD2、CD4、CD14、CD18、CD11a、CD11b、CD11c、CD14、CD18、CD27、CD29、CD38、CD40L、CD52、CD64、CD83、CD147、CD154。通过某些微生物抗原(包括LPS)引起的单核细胞的激活可通过针对CD18、CD11b或CD11c的抗体抑制至一定程度，这因此牵涉到β2-整联蛋白(Cuzzola等人,J Immunol 2000；164:5871-5876；Medvedev等人,J Immunol 1998；160:4535-4542)。已发现CD83在巨细胞性动脉炎(GCA)中起作用，所述巨细胞性动脉炎为影响中等尺寸和大尺寸动脉(主要为主动脉本身的主动脉弓的颅外分支)，从而导致血管狭窄和随后的组织缺血以及失明、中风和主动脉弓综合症的严重并发症的全身性血管炎(Weyand和Goronzy,N Engl J Med 2003；349:160-169；Hunder和Valente于：Inflammatory Diseases of Blood Vessels.G.S.Hoffman和C.M.Weyand编著,Marcel Dekker,New York,2002；255-265中所述)。发现针对CD83的抗体在人GCA的SCID小鼠模型中消除血管炎(Ma-Krupa等人,J Exp Med 2004；199:173-183)，从而向这些调查研究者表明在激活时表达CD83的树突细胞为GCA中的关键抗原加工细胞。在这些研究中，它们使用了小鼠抗CD83MAb(来自Research Diagnostics的IgG1克隆HB15e)。CD154(TNF家族的一员)在CD4-阳性T-淋巴细胞的表面上表达，并且已报道了针对CD154的人源化单克隆抗体在患有活性全身性红斑狼疮(SLE)的患者体内产生显著的临床益处(Grammar等人,J Clin Invest 2003；112:1506-1520)。还表明此抗体可能在其它自身免疫疾病中有用(Kelsoe,J Clin Invest2003；112:1480-1482)。事实上，此抗体还被报道为在患有顽固免疫性血小板减少性紫癜的患者体内有效(Kuwana等人,Blood 2004；103:1229-1236)。
在类风湿性关节炎中，重组白细胞介素-1受体拮抗剂、IL-1Ra或阿那白滞素(anakinra)已示出活性(Cohen等人,,Ann Rheum Dis2004；63:1062-8；Cohen,Rheum Dis Clin North Am 2004；30:365-80)。在至今需要用甲氨蝶呤伴随治疗的这些患者的治疗方面的改进为使阿那白滞素与一种或多种抗促炎效应子细胞因子或抗促炎效应子趋化因子(如上所列出)组合。事实上，在用于类风湿性关节炎的抗体治疗综述中，Taylor(Curr Opin Pharmacol 2003；3:323-328)表明除了TNF之外，针对此类细胞因子如IL-1、IL-6、IL-8、IL-15、IL-17和IL-18的其它抗体也有用。
本发明的药物组合物可用来治疗具有代谢性疾病(如淀粉样变性)或神经退化性疾病(如阿尔茨海默氏疾病)的受试者。巴匹珠单抗(Bapineuzumab)正处于阿尔茨海默氏疾病疗法的临床试验中。其它提出用于治疗阿尔茨海默氏疾病的抗体包括Alz 50(Ksiezak-Reding等人,1987,J Biol Chem 263:7943-47)、罗氏单抗(gantenerumab)和苏兰珠单抗(solanezumab)。已报道了抗TNF-α抗体英利昔单抗减少淀粉样蛋白斑并且改进认知。
在一个优选的实施方案中，可使用要求保护的组合物和方法治疗的疾病包括心血管疾病，如纤维蛋白凝块、动脉粥样硬化、心肌缺血和梗塞。纤维蛋白抗体(例如scFv(59D8)；T2G1；MH1)为已知的并且正作为显露所述凝块和肺栓塞的成像剂处于临床试验中，而抗粒细胞抗体(如MN-3、MN-15、抗NCA95和抗CD15抗体)可靶向心肌梗塞和心肌缺血。(参见，例如美国专利号5,487,892；5,632,968；6,294,173；7,541,440，所述专利各自的实施例部分均以引用的方式并入本文)。可使用抗巨噬细胞、抗低密度脂蛋白(LDL)、抗MIF和抗CD74(例如，hLL1)抗体来靶向动脉粥样硬化斑块。阿昔单抗(Abciximab)(抗糖蛋白IIb/IIIa)已批准在经皮冠状动脉介入治疗和不稳定心绞痛的治疗中辅助用于预防再狭窄(Waldmann等人,2000,Hematol 1:394-408)。已报道了抗CD3抗体降低动脉粥样硬化的发展和进展(Steffens等人,2006,Circulation 114:1977-84)。对抗氧化的LDL的抗体在小鼠模型中诱导已建立的动脉粥样硬化的消退(Ginsberg,2007,J Am Coll Cardiol52:2319-21)。示出抗ICAM-1抗体在大鼠中减少脑动脉闭塞后的缺血性细胞损伤(Zhang等人,1994,Neurology 44:1747-51)。针对白细胞抗原的商业上可获得的单克隆抗体由以下代表：OKT抗T细胞单克隆抗体(可获自Ortho Pharmaceutical Company)，其结合正常T淋巴细胞；由具有ATCC人藏登记号HB44、HB55、HB12、HB78和HB2的杂交瘤产生的单克隆抗体；G7Ell、W8E7、NKP15和GO22(BectonDickinson)；NEN9.4(New England Nuclear)；以及FMCll(Sera Labs)。对抗纤维蛋白和血小板抗原的抗体的描述包含于Knight,Semin.Nucl.Med.,20:52-67(1990)中。
可使用的其它抗体包括对抗感染性疾病因子(agent)的抗体，所述感染性疾病因子如细菌、病毒、支原体或其它病原体。对抗此类感染性因子的许多抗体为本领域中已知的，并且任何此类已知的抗体可用于要求保护的方法和组合物中。例如，对抗人免疫缺陷病毒I(HIV-1)的gp120糖蛋白抗原的抗体为已知的，并且某些此类抗体可对人具有免疫保护作用。参见，例如Rossi等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86:8055-8058,1990。已知的抗HIV抗体包括由Johansson等人(AIDS.2006Oct 3；20(15):1911-5)描述的抗包膜蛋白抗体，以及由Polymun(Vienna,Austria)描述和销售、还描述于美国专利5,831,034、美国专利5,911,989和Vcelar等人,AIDS 2007；21(16):2161-2170以及Joos等人,Antimicrob.Agents Chemother.2006；50(5):1773-9中的抗HIV抗体，所有所述参考文献均以引用的方式并入本文。
对抗疟疾寄生虫的抗体可针对孢子体阶段、裂殖子阶段、裂殖体阶段以及配子体阶段。已产生了单克隆抗体对抗孢子体(环子孢子抗原)，并且已示出在体外和在啮齿动物中使孢子体中和(N.Yoshida等人,Science 207:71-73,1980)。若干小组已开发了针对刚地弓形虫(T.gondii)的抗体，原生动物寄生虫涉及在弓形虫病中(Kasper等人,J.Immunol.129:1694-1699,1982；同上，30:2407-2412,1983)。已开发了对抗血吸虫表面抗原的抗体并且已发现在体内或在体外起对抗血吸虫的作用(Simpson等人,Parasitology,83:163-177,1981；Smith等人,Parasitology,84:83-91,1982；Gryzch等人,J.Immunol.,129:2739-2743,1982；Zodda等人,J.Immunol.129:2326-2328,1982；Dissous等人,J.immunol.,129:2232-2234,1982)。
克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)为恰加斯氏病的致病因子，并且通过吸血的食虫椿象科昆虫来传播。已产生在体外特异性抑制寄生虫的一种形式向另一种形式(上鞭毛体至锥鞭毛体阶段)分化的抗体，并且所述抗体与细胞表面糖蛋白反应；然而，哺乳动物(血流)形式的寄生虫不存在此抗原(Sher等人,Nature,300:639-640,1982)。
抗真菌抗体为本领域中已知的，如抗-核盘菌(Sclerotinia)抗体(美国专利7,910,702)；抗葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖(antiglucuronoxylomannan)抗体(Zhong和Priofski,1998,Clin Diag Lab Immunol 5:58-64)；抗-念珠菌(Candida)抗体(Matthews和Bumie,2001,2:472-76)；以及抗鞘糖脂抗体(Toledo等人,2010,BMC Microbiol 10:47)。
已开发了对抗造成大部分人感染的大多数微生物(细菌、病毒、原生生物、真菌、其它寄生虫)的适合的抗体，并且许多已在先前用于体外诊断目的。这些抗体和可通过常规方法产生的更新的抗体适合用于本发明。
免疫缀合物
在某些实施方案中，抗体或其片段可缀合至一种或多种治疗剂或诊断剂。治疗剂不需要为相同的，而可为不同的，例如药物和放射性同位素。例如，131I可并入抗体或融合蛋白的酪氨酸和附着至赖氨酸残基的ε氨基的药物中。还可将治疗剂和诊断剂例如附着至经过还原的SH基团和/或碳水化合物侧链。用于制得治疗剂或诊断剂与抗体或融合蛋白的共价缀合物或非共价缀合物的许多方法为本领域中已知的并且可利用任何所述已知的方法。
治疗剂或诊断剂可经过二硫键形成而连接在还原抗体组分的铰链区。或者，可使用异双官能性的交联剂如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰酯(SPDP)附接此类药剂。Yu等人，Int.J.Cancer 56:244(1994)。参见，例如Wong,CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING(CRC出版社1991)；MONOCLONALANTIBODIES:PRINCIPLES AND APPLICATIONS,Birch等人(编著),第187-230页(Wiley-Liss,Inc.1995)中的Upeslacis等人,“Modification of Antibodies by Chemical Methods”；MONOCLONAL ANTIBODIES:PRODUCTION,ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION,Ritter等(编著),第60-84页(剑桥大学出版社1995)中的Price,“Production and Characterization of Synthetic Peptide-DerivedAntibodies”。或者，可经过抗体Fc区中的碳水化合物部分缀合治疗剂或诊断剂。碳水化合物基团可用来增加结合巯基的相同药剂的载荷，或碳水化合物部分可用来结合不同的治疗剂或诊断剂。
用于经由抗体碳水化合物部分将肽缀合至抗体组分的方法为本领域技术人员所熟知的。参见，例如Shih等人,Int.J.Cancer 41:832(1988)；Shih等人,Int.J.Cancer 46:1101(1990)以及Shih等人,美国专利号5,057,313，所述参考文献以引用的方式整体并入本文。一般方法涉及使具有氧化碳水化合物部分的抗体组分与具有至少一个游离胺官能的载体聚合物反应。此反应产生初始希夫碱(Schiff base)(亚胺)键联，其可通过还原成仲胺来稳定以便形成最终缀合物。
如果用作免疫偶联物的抗体组分的抗体为抗体片段，则可能不存在Fc区。然而，有可能将碳水化合物部分引入到全长抗体或抗体片段的轻链可变区中。参见，例如，Leung等人，J.Immunol.154:5919(1995)；Hansen等人，美国专利号5,443,953(1995)；Leung等人，美国专利号6,254,868，所述参考文献以引用的方式整体并入本文。使用工程化的碳水化合物部分来附接治疗剂或诊断剂。
在一些实施方案中，螯合剂可附着至抗体、抗体片段或融合蛋白并且用来螯合治疗剂或诊断剂，如放射性核素。示例性的螯合剂包括但不限于DTPA(如Mx-DTPA)、DOTA、TETA、NETA或NOTA。将金属或其它配体缀合至蛋白质和使用螯合剂将金属或其它配体附着至蛋白质的方法为本领域中熟知的(参见，例如美国专利号7,563,433，所述专利的实施例部分以引用的方式并入本文)。
在某些实施方案中，放射性金属或顺磁离子可通过与具有附着用于结合离子的多种螯合基团的长尾的试剂反应而附着至蛋白质或肽。这样的尾可为具有可结合螯合基团的侧基的聚合物如聚赖氨酸、多糖或其它衍生链或可衍生链，所述螯合基团例如像乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、聚胺、冠醚、双缩氨基硫脲、聚肟以及已知有用于此目的的类似基团。
螯合物可直接连接至抗体或肽，例如在美国专利4,824,659中所公开，所述专利以引用的方式整体并入本文。特别有用的金属螯合物组合包括2-苄基-DTPA及其单甲基类似物和环己基类似物，它们与总能量范围为60keV至4,000keV的诊断同位素一起用于放射成像，所述同位素为例如125I、131I、123I、124I、62Cu、64Cu、18F、111In、67Ga、68Ga、99mTc、94mTc、11C、13N、15O、76Br。在与非放射性金属如锰、铁和钆复合时，相同的螯合物可用于MRI。如NOTA、DOTA和TETA的大环螯合物可与各种金属和放射性金属一起使用，最特别地分别与放射性核素镓、钇和铜一起使用。可通过根据感兴趣的金属定制环的大小来使此类金属-螯合物复合物变得非常稳定。本发明涵盖其它环类型的螯合物如大环聚醚，其对于稳定结合的核素如用于RAIT的223Ra有价值。
最近，已例如通过使F-18与金属或其它原子如铝反应公开了用于PET扫描技术中的18F-标记的方法。18F-Al缀合物可与螯合基团复合，如直接附着至抗体或在预靶向方法中用来标记可靶向构建体的DOTA、NOTA或NETA。此类F-18标记技术公开于美国专利号7,563,433中，所述专利的实施例部分以引用的方式并入本文。
预靶向
在某些实施方案中，可通过预靶向的方法，利用双特异性或多特异性抗体复合物施用治疗剂。在预靶向中，双特异性或多特异性抗体包含结合由靶向细胞或组织展现的抗原的至少一个结合臂，同时包含结合可靶向构建体上的半抗原的至少一个其它结合臂。可靶向构建体包含一种或多种半抗原和一种或多种治疗剂和/或诊断剂。
预靶向为多步骤过程，起初被开发来解决直接靶向抗体的缓慢血液清除，这种缓慢血液清除促成对正常组织如骨髓的不希望的毒性。对于预靶向而言，放射性核素或其它诊断剂或治疗剂被附着至数分钟内从血液清除的小递送分子(可靶向构建体)。首先施用具有用于可靶向构建体以及靶抗原的结合位点的预靶向双特异性或多特异性抗体，允许游离抗体从循环中清除并且然后施用可靶向构建体。
预靶向的方法例如公开于Goodwin等人,美国专利号4,863,713；Goodwin等人,J.Nucl.Med.29:226,1988；Hnatowich等人,J.Nucl.Med.28:1294,1987；Oehr等人,J.Nucl.Med.29:728,1988；Klibanov等人,J.Nucl.Med.29:1951,1988；Sinitsyn等人,J.Nucl.Med.30:66,1989；Kalofonos等人,J.Nucl.Med.31:1791,1990；Schechter等人,Int.J.Cancer 48:167,1991；Paganelli等人,Cancer Res.51:5960,1991；Paganelli等人,Nucl.Med.Commun.12:211,1991；美国专利号5,256,395；Stickney等人,Cancer Res.51:6650,1991；Yuan等人,Cancer Res.51:3119,1991；美国专利号6,077,499；7,011,812；7,300,644；7,074,405；6,962,702；7,387,772；7,052,872；7,138,103；6,090,381；6,472,511；6,962,702以及6,962,702，所述参考文献各自均以引用的方式并入本文。
治疗或诊断受试者体内的疾病或病症的预靶向方法可通过以下来提供：(1)向受试者施用包含双特异性抗体或抗体片段的抗体复合物；(2)任选地向受试者施用清除组合物，并且允许组合物使抗体从循环中清除；以及(3)向受试者施用可靶向构建体，所述可靶向构建体含有一种或多种螯合的或化学结合的治疗剂或诊断剂。
对接和锁定TM(DNLTM)
在优选的实施方案中，二价或多价抗体或复合至一种或多种效应子如细胞因子、毒素、异种抗原或siRNA载体的抗体被形成为对接和锁定TM(DNLTM)复合物(参见，例如美国专利号7,521,056；7,527,787；7,534,866；7,550,143；7,666,400；7,901,680；7,906,118；7,981,398；8,003,111，所述专利各自的实施例部分均以引用的方式并入本文。)。通常，技术利用了在cAMP-依赖型蛋白激酶(PKA)的调节(R)亚基的二聚化和停靠域(DDD)序列与来源于任何各种AKAP蛋白的锚定结构域(AD)序列之间发生的特异性和高亲和性结合相互作用(Baillie等人,FEBS Letters.2005；579:3264。Wong和Scott,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004；5:959)。DDD肽和AD肽可附着至任何蛋白质、肽或其它分子。因为DDD序列自发地二聚化并且结合AD序列，所以技术允许在可附着至DDD序列或AD序列的任何选择的分子之间形成复合物。
虽然标准DNLTM复合物包含具有附着至一个AD连接的分子的两个DDD连接的分子的三聚体，但是复合物结构的变化允许形成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体以及其它多聚体。在一些实施方案中，DNLTM复合物可包含结合相同抗原决定簇或两种或更多种不同抗原的两种或更多种抗体、抗体片段或融合蛋白。DNLTM复合物还可包含一种或多种其它效应子，如蛋白质、肽、免疫调节剂、细胞因子、白细胞介素、干扰素、结合蛋白、肽配体、载体蛋白、毒素、核糖核酸酶如抗肿瘤核糖核酸酶、抑制性寡核苷酸如siRNA、抗原或异种抗原、聚合物如PEG、酶、治疗剂、激素、细胞毒性剂、抗血管生成剂、促凋亡剂或任何其它分子或聚集物。
1968年，首次从兔骨骼肌中分离出PKA，其在由第二信使cAMP结合R亚基而触发的最彻底研究的信号转导途径之一中起关键作用(Walsh等人,J.Biol.Chem.1968；243:3763)。全酶的结构由通过R亚基保持为失活形式的两个催化亚基组成(Taylor,J.Biol.Chem.1989；264:8443)。发现PKA的同工酶具有两种类型的R亚基(RI和RII)，并且每种类型均具有α同工型和β同工型(Scott,Pharmacol.Ther.1991；50:123)。因此，PKA调节亚基的四种同工型为RIα、RIβ、RIIα和RIIβ。R亚基仅分离为稳定二聚体并且示出二聚化结构域由RIIα的前44个氨基末端残基组成(Newlon等人,Nat.Struct.Biol.1999；6:222)。如下所讨论，其它调节亚基的氨基酸序列的类似部分涉及在二聚化和停靠中，每个部分均位于调节亚基的N-末端附近。cAMP结合R亚基引起用于广谱丝氨酸/苏氨酸激酶活性的活性催化亚基释放，所述活性催化亚基通过PKA的区室化经过其与AKAP对接而朝向选择的底物(Scott等人,J.Biol.Chem.1990；265；21561)。
自从1984年表征了第一种AKAP(微管相关的蛋白质-2)(Lohmann等人,Proc.Natl.Acad.Sci USA.1984；81:6723)，已在酵母至人范围内的物种中鉴定出多于50种AKAP具有多种多样的结构，所述AKAP定位至各种亚细胞位点包括质膜、肌动蛋白细胞骨架、细胞核、线粒体以及内质网(Wong和Scott,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004；5:959)。用于PKA的AKAP的AD为具有14-18个残基的两亲性螺旋(Carr等人,J.Biol.Chem.1991；266:14188)。AD的氨基酸序列在各个AKAP之间十分不同，其中针对RII二聚体所报道的结合亲和性在2nM至90nM范围内(Alto等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003；100:4445)。AKAP将仅结合二聚R亚基。对于人RIIα，AD结合由23个氨基末端残基形成的疏水表面(Colledge和Scott,Trends Cell Biol.1999；6:216)。因此，人RIIα的二聚化结构域和AKAP结合结构域均位于相同N-末端的44氨基酸序列内(Newlon等人,Nat.Struct.Biol.1999；6:222；Newlon等人,EMBO J.2001；20:1651)，所述44氨基酸序列在本文中称为DDD。
我们已开发了一种平台技术，其利用人PKA调节亚基的DDD和AKAP的AD作为一对优良的接头模块用于将任何两个实体(在下文称为A和B)对接成非共价复合物，所述复合物可通过在DDD和AD的至关重要的位置中引入半胱氨酸残基以促进形成二硫键而进一步锁定为DNLTM复合物。所述途径的一般方法如下。通过将DDD序列连接至A的前体来构建实体A，从而产生下文称为a的第一组分。因为DDD序列将实现二聚体的自发形成，因此A将主要由a2组成。通过将AD序列连接至B的前体来构建实体B，从而产生下文称为b的第二组分。a2中含有的DDD的二聚基序将产生用于结合b中含有的AD序列的对接位点，因此促进a2与b容易地缔合以形成主要由a2b组成的二元三聚复合物。此结合事件通过随后的反应以经过二硫桥键共价固定两个实体而稳定，这基于有效局部浓度的原则非常有效地发生，因为初始结合相互作用会使置于DDD和AD上的反应性巯基靠近(Chmura等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001；98:8480)以位点特异性地连接。使用接头、适配子模块和前体的各种组合，可产生和使用各种各样的具有不同化学计量的DNLTM构建体(参见，例如美国专利号7,550,143；7,521,056；7,534,866；7,527,787和7,666,400。)。
通过远离两个前体的官能团附接DDD和AD，还预期此类位点特异性连接保留两个前体的原始活性。此方法在本质上为模块化的并且可潜在应用于位点特异性和共价连接广范围的物质，包括肽、蛋白质、抗体、抗体片段以及具有广范围活性的其它效应子部分。利用描述于以下实施例中的构建AD和DDD缀合的效应子的融合蛋白方法，可将几乎任何蛋白质或肽并入到DNLTM构建体中。然而，所述技术并非限制性的并且可利用其它缀合方法。
已知用于制得融合蛋白的各种方法，包括核酸合成、杂交和/或扩增以产生编码感兴趣的融合蛋白的合成双链核酸。可通过标准分子生物学技术将此类双链核酸插入到用于融合蛋白产生的表达载体中(参见，例如Sambrook等人,Molecular Cloning,A laboratory manual,第2版,1989)。在此类优选的实施方案中，AD和/或DDD部分可附着至效应子蛋白或肽的N-末端或C-末端。然而，熟练的技术人员将认识到，AD或DDD部分附着至效应部分的位点可取决于效应子部分的化学性质和效应子部分中涉及其生理活性的部分而改变。可使用本领域中已知的技术进行各种效应子部分的位点特异性附着，如使用二价交联试剂和/或其它化学缀合技术。
AD部分和DDD部分中的结构-功能关系
对于不同类型的DNLTM构建体，可利用不同的AD序列或DDD序列。示例性DDD和AD序列提供于下文中。
DDD1
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ IDNO:1)
DDD2
CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ IDNO:2)
AD1
QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO:3)
AD2
CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SEQ ID NO:4)
熟练的技术人员将认识到，DDD1和DDD2基于蛋白激酶A的人RIIα同工型的DDD序列。然而，在替代实施方案中，DDD部分和AD部分可基于蛋白激酶A的人RIα形式的DDD序列和相应的AKAP序列，如下以DDD3、DDD3C和AD3所举例说明。
DDD3
SLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK(SEQ ID NO：5)
DDD3C
MSCGGSLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK(SEQ ID NO：6)
AD3
CGFEELAWKIAKMIWSKVFQQGC(SEQ ID NO：7)
在其它的替代实施方案中，可在DNLTM复合物的构建中利用AD部分和/或DDD部分的其它序列变体。例如，仅存在对应于PKA RIα、RIIα、RIβ和RIIβ的DDD部分的人PKA DDD序列的4个变体。RIIαDDD序列为以上公开的DDD1和DDD2的基础。以下示出四种人PKA DDD序列。DDD序列代表RIIα的残基1-44、RIIβ的残基1-44、RIα的残基12-61和RIβ的残基13-66。(应注意，DDD1的序列与人PKA RIIαDDD部分相比稍有改变。)
PKA RIα
SLRECELYVQKHNIQALLKDVSIVQLCTARPERPMAFLREYFEKLEKEEAK(SEQ ID NO：8)
PKA RIβ
SLKGCELYVQLHGIQQVLKDCIVHLCISKPERPMKFLREHFEKLEKEENRQILA(SEQ ID NO：9)
PKA RIIα
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVGQQPPDLVDFAVEYFTRLREARRQ(SEQ IDNO：10)
PKA RIIβ
SIEIPAGLTELLQGFTVEVLRHQPADLLEFALQHFTRLQQENER(SEQ IDNO：11)
已对AD结构域和DDD结构域的结构-功能关系进行了调查研究。(参见，例如Burns-Hamuro等人,2005,Protein Sci 14:2982-92；Carr等人,2001,J Biol Chem 276:17332-38；Alto等人,2003,ProcNatl Acad Sci USA 100:4445-50；Hundsrucker等人,2006,BiochemJ 396:297-306；Stokka等人,2006,Biochem J 400:493-99；Gold等,2006,Mol Cell 24:383-95；Kinderman等人,2006,Mol Cell 24:397-408，所述参考文献各自的整个正文以引用的方式并入本文。)
例如，Kinderman等人(2006,Mol Cell 24:397-408)检测了AD-DDD结合相互作用的晶体结构，并且得出结论人DDD序列含有以下在SEQ ID NO:1中加下划线的在二聚体形成或AKAP结合中重要的许多保守氨基酸残基。(参见Kinderman等人,2006的图1，其以引用的方式并入本文。)熟练的技术人员将认识到，在设计DDD序列的序列变体时，将希望避免改变任何加下划线的残基，而对于二聚化和AKAP结合不太关键的残基可进行保守氨基酸取代。
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：1)
如下所更详细地讨论，已表征保守氨基酸取代的二十种常见L-氨基酸中的每一种。因此，基于Kinderman(2006)和保守氨基酸取代的数据，基于SEQ ID NO:1的潜在替代DDD序列在表2中示出。在设计表2中，仅考虑高度保守的氨基酸取代。例如，带电荷的残基仅取代具有相同电荷的残基，具有小侧链的残基取代类似大小的残基，羟基侧链仅取代其它羟基等。因为脯氨酸对氨基酸二级结构的奇特作用，没有其它残基取代脯氨酸。有限数量的此类潜在替代DDD部分序列在以下SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:31中示出。熟练的技术人员将认识到，DDD部分的属种内数目几乎不受限制的替代种类可通过标准技术，例如使用商业肽合成器或熟知的定点诱变技术来构建。氨基酸取代对AD部分结合的作用还可容易地通过例如在Alto等人(2003,Proc Natl Acad Sci USA 100:4445-50)中所公开的标准结合测定来确定。
表2.DDD1中的共有氨基酸替换(SEQ ID NO:1).共有序列公开为SEQ ID NO:87。
THIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：12)
SKIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：13)
SRIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：14)
SHINIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：15)
SHIQIPPALTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：16)
SHIQIPPGLSELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：17)
SHIQIPPGLTDLLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：18)
SHIQIPPGLTELLNGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：19)
SHIQIPPGLTELLQAYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：20)
SHIQIPPGLTELLQGYSVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：21)
SHIQIPPGLTELLQGYTVDVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：22)
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLKQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：23)
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRNQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：24)
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQNPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：25)
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPELVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：26)
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVDFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：27)
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFLVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：28)
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFIVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：29)
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFVVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：30)
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVDYFTRLREARA(SEQ ID NO：31)
Alto等(2003,Proc Natl Acad Sci USA 100:4445-50)对各种AKAP蛋白的AD序列进行生物信息学分析以设计称为AKAP-IS的RII选择性AD序列(SEQ ID NO:3)，其对DDD的结合常数为0.4nM。AKAP-IS序列设计成AKAP与PKA结合的肽拮抗剂。AKAP-IS序列中取代倾向于使与DDD的结合减弱的残基在以下SEQ ID NO:3中已加下划线。熟练的技术人员将认识到，在设计AD序列的序列变体时，将希望避免改变任何加下划线的残基，而对于DDD结合不太关键的残基可进行保守氨基酸取代。表3示出AKAP-IS的序列(AD1,SEQ IDNO:3)中的潜在保守氨基酸取代，类似于在以上表2中对于DDD1(SEQ ID NO:1)所示出的保守氨基酸取代。
有限数量的此类潜在替代AD部分序列在以下SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:49中示出。此外，可能的AD部分序列的属种内的很多种类可通过熟练技术人员基于Alto等人(2003)的数据来制得、测试并且使用。应注意，Alto(2003)的图2示出基于真实结合实验制得并同时保持对DDD部分的结合活性的许多潜在氨基酸取代。
AKAP-IS
QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：3)
表3.AD1(SEQ ID NO:3)中的保守氨基酸取代。共有序列公开为SEQ ID NO:88。
NIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：32)
QLEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：33)
QVEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：34)
QIDYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：35)
QIEFLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：36)
QIETLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：37)
QIESLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：38)
QIEYIAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：39)
QIEYVAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：40)
QIEYLARQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：41)
QIEYLAKNIVDNAIQQA(SEQ ID NO：42)
QIEYLAKQIVENAIQQA(SEQ ID NO：43)
QIEYLAKQIVDQAIQQA(SEQ ID NO：44)
QIEYLAKQIVDNAINQA(SEQ ID NO：45)
QIEYLAKQIVDNAIQNA(SEQ ID NO：46)
QIEYLAKQIVDNAIQQL(SEQ ID NO：47)
QIEYLAKQIVDNAIQQI(SEQ ID NO：48)
QIEYLAKQIVDNAIQQV(SEQ ID NO：49)
Gold等人(2006,Mol Cell 24:383-95)利用结晶学和肽筛选开发出SuperAKAP-IS序列(SEQ ID NO:50)，其对PKA的RII同工型展现出与RI同工型相比高5个数量级的选择性。加下划线的残基指示相对于AKAP-IS序列的氨基酸取代的位置，所述氨基酸取代增加对RIIα的DDD部分的结合。在此序列中，N-末端Q残基编号为残基编号4并且C-末端A残基为残基编号20。可进行取代以影响对RIIα的亲和性的残基为残基8、11、15、16、18、19和20(Gold等人,2006)。预期在某些替代实施方案中，可用SuperAKAP-IS序列取代AKAP-ISAD部分序列来制备DNLTM构建体。可用来取代AKAP-IS AD序列的其它替代序列于SEQ ID NO:51-53中示出。相对于AKAP-IS序列的取代已加下划线。预期如同SEQ ID NO:4中示出的AD2序列，AD部分还可包括额外的N-末端残基半胱氨酸和甘氨酸以及C-末端残基甘氨酸和半胱氨酸。
SuperAKAP-IS
QIEYVAKQIVDYAIHQA(SEQ ID NO：50)
替代AKAP序列
QIEYKAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO：51)
QIEYHAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO：52)
QIEYVAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO：53)
Gold等人的图2公开了来自各种AKAP蛋白的另外DDD结合序列，如下所示。
RII-特异性AKAP
AKAP-KL
PLEYQAGLLVQNAIQQAI(SEQ ID NO：54)
AKAP79
LLIETASSLVKNAIQLSI(SEQ ID NO：55)
AKAP-Lbc
LIEEAASRIVDAVIEQVK(SEQ ID NO：56)
RI-特异性AKAP
AKAPce
ALYQFADRFSELVISEAL(SEQ ID NO：57)
RIAD
LEQVANQLADQIIKEAT(SEQ ID NO：58)
PV38
FEELAWKIAKMIWSDVF(SEQ ID NO：59)
双特异性AKAP
AKAP7
ELVRLSKRLVENAVLKAV(SEQ ID NO：60)
MAP2D
TAEEVSARIVQVVTAEAV(SEQ ID NO：61)
DAKAP1
QIKQAAFQLISQVILEAT(SEQ ID NO：62)
DAKAP2
LAWKIAKMIVSDVMQQ(SEQ ID NO：63)
Stokka等人(2006,Biochem J 400:493-99)还开发出AKAP与PKA结合的肽竞争剂，如在SEQ ID NO:64-66中示出。肽拮抗剂命名为Ht31(SEQ ID NO:64)、RIAD(SEQ ID NO:65)和PV-38(SEQ IDNO:66)。Ht-31肽对于PKA的RII同工型展现出较高的亲和性，而RIAD和PV-38对于RI示出较高的亲和性。
Ht31
DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY(SEQ ID NO：64)
RIAD
LEQYANQLADQIIKEATE(SEQ ID NO：65)
PV-38
FEELAWKIAKMIWSDVFQQC(SEQ ID NO：66)
Hundsrucker等人(2006,Biochem J 396:297-306)开发出AKAP与PKA的结合的其它肽竞争剂，与PKA的RII形式的DDD的结合常数低至0.4 nM。各种AKAP拮抗性肽的序列提供于Hundsrucker等人的表1中，再现于以下表4中。AKAPIS代表一种合成RII亚基结合肽。所有其它肽均来源于所指示的AKAP的RII结合结构域。
表4.AKAP肽序列
在不同AKAP蛋白的AD结构域中高度保守的残基在以下通过参考AKAP IS序列(SEQ ID NO:3)加下划线指示。残基与Alto等人(2003)所观察到的相同，其中添加了C-末端丙氨酸残基。(参见Hundsrucker等人(2006)的图4，其以引用的方式并入本文。)对于RIIDDD序列具有特别高的亲和性的肽拮抗剂的序列为AKAP-IS、AKAP7δ-wt-pep、AKAP7δ-L304T-pep和AKAP7δ-L308D-pep的序列。
AKAP-IS
QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：3)
Carr等人(2001,J Biol Chem 276:17332-38)检测了来自人和非人蛋白的不同AKAP-结合DDD序列之间的序列同源性程度并且鉴定在不同DDD部分中看起来似乎为最高度保守的DDD序列中的残基。其在以下通过参考SEQ ID NO：1的人PKA RIIα DDD序列加下划线指示。特别保守的残基进一步以斜体指示。残基与Kinderman等人(2006)所表明的对结合AKAP蛋白重要的那些残基重叠，但不与其相同。熟练的技术人员将认识到，在设计DDD的序列变体时，最优选的是避免改变最保守的残基(斜体)，并且优选还避免改变保守残基(加下划线)，而既未加下划线也不是斜体的残基可考虑进行保守氨基酸取代。
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQOPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：1)
基于Carr等人(2001)的数据，针对DDD1(SEQ ID NO：1)序列的一组修饰的保守氨基酸取代在表5中示出。甚至对于这个缩减组的取代序列，存在超过65,000个可通过熟练技术人员在无需过多实验的情况下产生、测试和使用的可能替代DDD部分序列。熟练的技术人员可容易地得到此类替代DDD氨基酸序列，如上表2和表3所公开。
表5.DDD1中的共有氨基酸替换(SEQ ID NO：1).共有序列公开为SEQ ID NO：89。
S H I Q I P P G L T E L L O G Y T V E V L R
T N S I
熟练的技术人员将认识到，DDD或AD氨基酸序列中的这些和其它氨基酸取代可用来使用本领域中标准的技术和仅通过常规实验来产生AD或DDD部分的属种内的替代种类。
氨基酸取代
在替代实施方案中，公开的方法和组合物可涉及具有一个或多个取代氨基酸残基的蛋白质或肽的产生和使用。例如，用来制得DNLTM构建体的DDD和/或AD序列可如上所讨论进行修饰。
熟练的技术人员将意识到一般来说，氨基酸取代通常涉及一种氨基酸用具有相对类似性质的另一种氨基酸替代(即，保守氨基酸取代)。各种氨基酸的性质和氨基酸取代对蛋白质结构和功能的作用为广泛研究的主题和本领域中的知识。
例如，可考虑氨基酸的亲水指数(Kyte&Doolittle,1982,J.Mol.Biol.,157:105-132)。氨基酸的相对亲水特征有助于所得到的蛋白质的二级结构，其反过来定义了蛋白质与其它分子的相互作用。每种氨基酸在其疏水性和电荷特征的基础上确定亲水指数(Kyte&Doolittle,1982)，这些为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。在进行保守取代中，使用其亲水指数在±2内的氨基酸为优选的，亲水指数在±1内的氨基酸为更优选的，并且亲水指数在±0.5内的氨基酸为甚至更优选的。
氨基酸取代还可考虑氨基酸残基的亲水性(例如，美国专利号4,554,101)。已给氨基酸残基确定以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0)；谷氨酸(+3.0)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)以及色氨酸(-3.4)。用具有类似亲水性的其它氨基酸替代氨基酸为优选的。
其它考虑包括氨基酸侧链的大小。例如，用具有松散侧链的氨基酸如色氨酸或酪氨酸替代具有紧凑侧链如甘氨酸或丝氨酸的氨基酸通常不是优选的。各种氨基酸残基对蛋白质二级结构的作用也是考虑因素。通过实证研究，已确定不同氨基酸残基对蛋白质结构域采用α-螺旋、β-折叠或回转二级结构趋势的作用并且为本领域中已知的(参见，例如Chou&Fasman,1974,Biochemistry,13:222-245；1978,Ann.Rev.Biochem.,47:251-276；1979,Biophys.J.,26:367-384)。
基于此类考虑和广泛实证研究，已构建保守氨基酸取代的表格并且为本领域中已知的。例如：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。或者：Ala(A)leu、ile、val；Arg(R)gln、asn、lys；Asn(N)his、asp、lys、arg、gln；Asp(D)asn、glu；Cys(C)ala、ser；Gln(Q)glu、asn；Glu(E)gln、asp；Gly(G)ala；His(H)asn、gln、lys、arg；Ile(I)val、met、ala、phe、leu；Leu(L)val、met、ala、phe、ile；Lys(K)gln、asn、arg；Met(M)phe、ile、leu；Phe(F)leu、val、ile、ala、tyr；Pro(P)ala；Ser(S)、thr；Thr(T)ser；Trp(W)phe、tyr；Tyr(Y)trp、phe、thr、ser；Val(V)ile、leu、met、phe、ala。
氨基酸取代的其它考虑包括残基是否位于蛋白质的内部或为暴露于溶剂。对于内部残基，保守取代将包括：Asp和Asn；Ser和Thr；Ser和Ala；Thr和Ala；Ala和Gly；Ile和Val；Val和Leu；Leu和Ile；Leu和Met；Phe和Tyr；Tyr和Trp。(参见，例如rockefeller.edu上的PROWL网站)对于溶剂暴露的残基，保守取代将包括：Asp和Asn；Asp和Glu；Glu和Gln；Glu和Ala；Gly和Asn；Ala和Pro；Ala和Gly；Ala和Ser；Ala和Lys；Ser和Thr；Lys和Arg；Val和Leu；Leu和Ile；Ile和Val；Phe和Tyr。(同上)已构建各种矩阵来辅助选择氨基酸取代，如PAM250评分矩阵、Dayhoff矩阵、Grantham矩阵、McLachlan矩阵、Doolittle矩阵、Henikoff矩阵、Miyata矩阵、Fitch矩阵、Jones矩阵、Rao矩阵、Levin矩阵和Risler矩阵(同上)。
在确定氨基酸取代中，还可考虑分子间或分子内键的存在，如在带正电荷残基(例如，His、Arg、Lys)与带负电荷残基(例如，Asp、Glu)之间形成离子键(盐桥)或在半胱氨酸残基附近之间形成二硫键。
在编码的蛋白质序列中用任何氨基酸取代任何其它氨基酸的方法为熟知的，并且为熟练技术人员例如通过定点诱变技术或通过合成和组装编码氨基酸取代和剪接成表达载体构建体的寡核苷酸进行常规实验的事情。
治疗剂
在替代实施方案中，可使用缀合至本发明免疫毒素或在免疫毒素之前、同时或之后分开施用的治疗剂如细胞毒性剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、抗生素、激素、激素拮抗剂、趋化因子、药物、前药、毒素、酶或其它药剂。有用的药物可拥有选自由以下组成的组的药学性质：抗有丝分裂、抗激酶、烷基化、抗代谢物、抗生素、生物碱、抗血管生成剂、促凋亡剂以及其组合。
有用的示例性药物包括但不限于5-氟尿嘧啶、阿普利啶、阿扎利平、阿那曲唑、蒽环霉素、苯达莫司汀(bendamustine)、博来霉素、硼替佐米、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、卡铂、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、Cox-2抑制剂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、喜树碱、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、多西他赛、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、2-吡咯啉基阿霉素(2P-DOX)、氰基-吗啉基阿霉素、葡糖苷酸阿霉素、葡糖苷酸表柔比星、雌氮芥、表鬼臼毒素、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、葡糖苷酸依托泊苷、磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、3',5'-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、法尼基蛋白转移酶抑制剂、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、来那度胺、甲酰四氢叶酸、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、亚硝基脲、普卡霉素(plicomycin)、丙卡巴肼、紫杉醇、喷司他丁、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、链脲霉素(streptozocin)、他莫昔芬、紫杉酚、替莫唑胺(temazolomide)(DTIC的水性形式)、反铂(transplatinum)、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、拓扑替康、尿嘧啶氮芥、长春瑞滨、长春花碱、长春新碱和长春花生物碱(vinca alkaloid)。
有用的毒素可包括蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)(例如抗肿瘤核糖核酸酶(onconase))、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素以及假单胞菌内毒素。
有用的趋化因子可包括RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β以及IP-10。
在某些实施方案中，抗血管生成剂，如血管抑素、杆状斯达汀、血管能抑素、乳腺丝抑蛋白、抗VEGF抗体、抗PlGF肽和抗体、抗血管生长因子抗体、抗Flk-1抗体、抗Flt-1抗体和肽、抗Kras抗体、抗-cMET抗体、抗MIF(巨噬细胞游走抑制因子)抗体、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白细胞介素-12、IP-10、Gro-β、血小板反应蛋白、2-甲氧基雌二醇、增殖蛋白相关的蛋白质、羧胺三唑、CM101、马立马司他、戊聚糖多硫酸盐、血管生成素-2、干扰素-α、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、利诺胺(罗喹美克(roquinimex))、沙利度胺、己酮可可碱、染料木黄酮、TNP-470、内皮抑素、紫杉醇、蛇毒解离素、血管抑素、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板因子4或米诺环素可以是有用的。
有用的免疫调节剂可选自细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、群落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、红细胞生成素、血小板生成素以及其组合。特别有用的为淋巴毒素，如肿瘤坏死因子(TNF)；造血因子，如白介素(IL)；群落刺激因子，如粒细胞群落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)；干扰素，如干扰素-α、干扰素-β或干扰素-γ；以及干细胞生长因子，如命名为“S1因子”的干细胞生长因子。αβγ包括在细胞因子之中的是：生长激素，如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素以及牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)以及促黄体激素(LH)；肝细胞生长因子；前列腺素、成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素、OB蛋白；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；苗勒抑制物质；小鼠促性腺激素相关的肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；促血小板生成素(TPO)；神经生长因子，如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II；红细胞生长素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素-α、干扰素-β以及干扰素-γ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；白细胞介素(IL)，如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、kit配体或FLT-3、血管抑素、血小板反应蛋白、内皮抑素、肿瘤坏死因子以及LT。
有用的放射性核素包括但不限于111In、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au以及211Pb。治疗性的放射性核素优选地衰变能量在20keV至6,000keV范围内，针对俄歇(Auger)发射体优选地在60keV至200keV范围内、针对β发射体在100keV至2,500keV范围内以及针对α发射体在4,000keV至6,000keV范围内。有用的β粒子发射核素的最大衰变能优选为20-5,000keV，更优选为100-4,000keV，并且最优选为500-2,500keV。随着俄歇发射粒子大致上衰变的放射性核素也为优选的。例如，Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、1-125、Ho-161、Os-189m以及Ir-192。有用的发射β粒子的核素的衰变能量优选地为<1,000keV，更优选地<100keV，并且最优选地<70keV。随着α粒子产生而大致上衰变的放射性核素也为优选的。此类放射性核素包括但不限于：Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213以及Fm-255。有用的α粒子发射放射性核素的衰变能优选为2,000-10,000keV，更优选为3,000-8,000keV，并且最优选为4,000-7,000keV。另外潜在的有用放射性同位素包括11C、13N、15O、75Br、198Au、224Ac、126I、133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、109Pd、105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se、201Tl、225Ac、76Br、169Yb等。一些有用的诊断核素可包括18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94Tc、94mTc、99mTc或111In。
治疗剂可包括光活化剂或染料。荧光组合物(如荧光染料)和其它色原或染料(如对可见光敏感的卟啉)已通过将适合的光引导至损伤而用来检测并治疗损伤。在治疗中，这已被称为光辐射、光照疗法或光动力学疗法。参见Jori等人(编著),PHOTODYNAMIC THERAPYOF TUMORS AND OTHER DISEASES(Libreria Progetto 1985)；van den Bergh,Chem.Britain(1986),22:430。此外，已将单克隆抗体与光活化的染料偶联用于实现光照疗法。参见Mew等人,J.Immunol.(1983),130:1473；同上,Cancer Res.(1985),45:4380；Oseroff等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986),83:8744；同上,Photochem.Photobiol.(1987),46:83；Hasan等人,Prog.Clin.Biol.Res.(1989),288:471；Tatsuta等人,Lasers Surg.Med.(1989),9:422；Pelegrin等人,Cancer(1991),67:2529。
其它有用的治疗剂可包含寡核苷酸、尤其为优选针对致癌基因和致癌基因产物如bcl-2或p53的反义寡核苷酸。治疗性寡核苷酸的优选形式为siRNA。熟练的技术人员将认识到任何siRNA或干扰RNA种类可附着至抗体或其片段用于递送至靶向组织。针对各种各样标靶的许多siRNA种类在本领域中为已知的，并且在要求保护的方法和组合物中可利用任何此类已知的siRNA。
可能有用的已知siRNA种类包括对以下具有特异性的那些：IKK-γ(美国专利7,022,828)；VEGF、Flt-1和Flk-1/KDR(美国专利7,148,342)；Bcl2和EGFR(美国专利7,541,453)；CDC20(美国专利7,550,572)；转导蛋白(β)样3(美国专利7,576,196)；KRAS(美国专利7,576,197)；碳酸酐酶II(美国专利7,579,457)；补体组分3(美国专利7,582,746)；白细胞介素-1受体相关的激酶4(IRAK4)(美国专利7,592,443)；存活素(美国专利7,608,7070)；超氧化物歧化酶1(美国专利7,632,938)；MET原癌基因(美国专利7,632,939)；淀粉样蛋白β前体蛋白(APP)(美国专利7,635,771)；IGF-1R(美国专利7,638,621)；ICAM1(美国专利7,642,349)；补体因子B(美国专利7,696,344)；p53(7,781,575)以及载脂蛋白B(7,795,421)，所述参考专利各自的实施例部分均以引用的方式并入本文。
另外的siRNA种类可从已知商业来源获得，如Sigma-Aldrich(StLouis,MO)、Invitrogen(Carlsbad,CA)、Santa Cruz Biotechnology(SantaCruz,CA)、Ambion(Austin,TX)、Dharmacon(Thermo Scientific,Lafayette,CO)、Promega(Madison,WI)、Mirus Bio(Madison,WI)和Qiagen(Valencia,CA)以及许多其它来源。siRNA种类的其它可公开获得的来源包括位于斯德哥尔摩生物信息学中心的siRNAdb数据库、MIT/ICBP siRNA数据库、位于博得研究院的RNAi联合shRNA文库以及位于NCBI的探针数据库。例如，在NCBI探针数据库中存在30,852种siRNA种类。熟练的技术人员将认识到对于感兴趣的任何基因，已经设计了siRNA种类，其可容易地使用可公开获得的软件工具设计。任何所述siRNA种类均可使用本发明DNL复合物来递送。
本领域中已知的示例性siRNA种类列于表6中。虽然siRNA作为双链分子递送，但出于简单性的原因，表6中仅示出有义链序列。
表6.示例性siRNA序列
熟练的技术人员将认识到，表6代表本领域中已知的siRNA种类总数中的极少量样本，并且任何所述已知siRNA均可用于要求保护的方法和组合物中。
诊断剂
诊断剂优选地选自由以下组成的组：放射性核素、放射造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂以及光活化剂。此类诊断剂为熟知的并且可使用任何此类已知的诊断剂。诊断剂的非限制性实例可包括放射性核素，如110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr、或其它γ-发射体、β-发射体或正电子发射体。有用的顺磁性离子可包括铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)或铒(III)。金属造影剂可包括镧(III)、金(III)、铅(II)或铋(III)。超声造影剂可包含脂质体，如充气脂质体。不透射线的诊断剂可选自化合物、钡化合物、镓化合物以及铊化合物。各种各样的荧光标记为本领域中已知的，包括但不限于异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛以及荧光胺。有用的化学发光标记可包括鲁米诺、异鲁米诺、芳香族吖啶酯、咪唑、吖啶盐或草酸酯。
治疗性治疗的方法
各种实施方案涉及治疗受试者如哺乳动物(包括人、家养宠物或陪伴宠物如狗和猫)体内的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的细胞毒性免疫缀合物。
在一个实施方案中，可用本发明免疫毒素治疗的免疫疾病可包括例如关节疾病如强直性脊柱炎、青年类风湿性关节炎、类风湿性关节炎；神经疾病如多发性硬化症和重症肌无力；胰腺疾病如糖尿病，尤其为青年发病型糖尿病；胃肠道疾病如慢性活动肝炎、乳糜泻、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、恶性贫血；皮肤疾病如牛皮癣或硬皮病；过敏性疾病如哮喘和移植中的相关病状如移植物抗宿主疾病和同种异体移植排斥。
细胞毒性免疫缀合物的施用可通过在施用治疗有效量的另一种抗体的同时或之后来补充，所述另一种抗体结合靶细胞表面上的另一种抗原或与靶细胞表面上的另一种抗原反应。优选的另外MAb包含至少一种人源化的、嵌合的或人的MAb，所述MAb选自由与以下反应的MAb组成的组：CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD95、CD126、CD133、CD138、CD154、CEACAM5、CEACAM6、B7、AFP、PSMA、EGP-1、EGP-2、碳酸酐酶IX、PAM4抗原、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、Ia、MIF、HM1.24、HLA-DR、腱生蛋白、Flt-3、VEGFR、PlGF、ILGF、IL-6、IL-25、腱生蛋白、TRAIL-R1、TRAIL-R2、补体因子C5、致癌基因产物或其组合。有用的各种抗体如抗CD19、抗CD20和抗CD22抗体为本领域技术人员所已知的。参见，例如Ghetie等人,Cancer Res.48:2610(1988)；Hekman等人,Cancer Immunol.Immunother.32:364(1991)；Longo,Curr.Opin.Oncol.8:353(1996),美国专利号5,798,554；6,187,287；6,306,393；6,676,924；7,109,304；7,151,164；7,230,084；7,230,085；7,238,785；7,238,786；7,282,567；7,300,655；7,312,318；7,501,498；7,612,180；7,670,804；以及美国专利申请公布号20080131363；20070172920；20060193865和20080138333，所述参考文献和专利各自的实施例部分均以引用的方式并入本文。
免疫毒素疗法可用同时或依序施用至少一种治疗剂来进一步补充。例如，“CVB”(1.5g/m2环磷酰胺、200-400mg/m2依托泊苷和150-200mg/m2卡莫司汀)为用来治疗非霍奇金氏淋巴瘤的方案。Patti等人,Eur.J.Haematol.51:18(1993)。其它适合的组合化学治疗方案为本领域技术人员熟知的。参见，例如Freedman等人,于CANCERMEDICINE,第2卷,第3版,Holland等人(编著),第2028-2068页(Lea&Febiger 1993)中"Non-Hodgkin's Lymphomas"所述。举例来说，用于治疗中间级非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的第一代化学治疗方案包括C-MOPP(环磷酰胺、长春新碱、丙卡巴肼和强的松)和CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松)。有用的第二代化学治疗方案为m-BACOD(甲氨蝶呤、博来霉素、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松和甲酰四氢叶酸)，而适合的第三代方案为MACOP-B(甲氨蝶呤、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、泼尼松、博来霉素和甲酰四氢叶酸)。另外的有用药物包括丁酸苯酯、苯达莫司汀和苔藓抑素-1。
本发明免疫毒素可根据制备药学上有用的组合物的已知方法配制，从而使免疫毒素与药学上适合的赋形剂组合成混合物。无菌磷酸盐缓冲盐水为药学上适合的赋形剂的一个实例。参见，例如Ansel等人,PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,第5版(Lea&Febiger 1990)和Gennaro(编著),REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第18版(Mack Publishing Company 1990)以及其修订版本。
本发明免疫毒素可配制用于通过例如推注注射或连续输注来静脉内施用。优选地，在小于约4小时的时间段内输注免疫毒素，并且更优选地在小于约3小时的时间段内输注免疫毒素。例如，可在30min内，优选地甚至15min内输注第一25-50mg，并且在接下来2至3小时内输注剩余部分。用于注射的制剂可与添加的防腐剂一起存在于单位剂型中，例如在安瓿或在多剂量容器中。组合物可采用如在油性或水性媒介物中的混悬液、溶液或乳液等形式，并且可含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可呈在使用前用适合媒介物(例如，无菌无热原水)复原的粉末形式。
可采用另外的药学方法控制免疫毒素的作用持续时间。可通过使用聚合物来复合或吸附免疫毒素来制备控释制剂。例如，生物相容的聚合物包括聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)基质和硬脂酸二聚体和癸二酸的聚酐共聚物基质。Sherwood等人，Bio/Technology 10:1446(1992)。从这样一种基质释放的速率取决于免疫毒素的分子量、基质内的免疫毒素的量以及被分散的颗粒的大小。Saltzman等人，Biophys.J.55:163(1989)；Sherwood等人，同上。其它固体剂型描述于Ansel等人，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERYSYSTEMS，第5版(Lea&Febiger 1990)和Gennaro(编著),REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第18版(MackPublishing Company 1990)以及其修订版本。
还可向哺乳动物皮下施用或甚至通过其它肠胃外途径施用免疫毒素。此外，可通过连续输注或通过单次或多次推注来施用。优选地，在小于约4小时的时间段内输注免疫毒素，并且更优选地在小于约3小时的时间段内输注免疫毒素。
一般来说，对于人施用的免疫毒素的剂量将取决于如患者年龄、体重、身高、性别、一般医学病状和以往病史等因素而变化。期望为接受者提供在约1mg/kg至25mg/kg范围内的作为单次静脉内输注的免疫毒素的剂量，虽然如情况需要也可施用较低或较高的剂量。对于70kg患者1-20mg/kg的剂量例如为70-1,400mg，或对于1.7m患者为41-824mg/m2。需要时可重复剂量，例如每周一次持续4-10周，每周一次持续8周，或每周一次持续4周。在维持疗法中需要时，其还可以较低频率给予，如每隔一周一次持续若干个月，或每月或每季度一次持续许多个月。
或者，可以每2周或3周一次剂量施用免疫毒素，总共重复至少3次剂量。或者，可以每周2次施用构建体，持续4至6周。如果使剂量降至约200-300mg/m2(对于1.7m患者为每剂340mg，或者对于70kg患者为4.9mg/kg)，那么其可每周施用一次或甚至两次持续4至10周。或者，剂量方案可减少，即每2或3周一次持续2-3个月。然而已确定甚至可通过缓慢静脉内输注根据重复给药循环施用甚至更高的剂量，如每周一次或每2-3周一次20mg/kg。给药方案可任选地以其它时间间隔重复，并且剂量可在对剂量和方案适当调整下通过各种肠胃外途径给予。
在优选的实施方案中，免疫毒素用于治疗癌症。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、成胶质细胞瘤、黑素瘤、肉瘤和白血病、骨髓瘤或淋巴恶性肿瘤。此类癌症的更具体的实例如下所述并且包括：鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、尤因氏肉瘤(Ewing sarcoma)、韦尔姆斯氏瘤(Wilms tumor)、星形细胞瘤、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃部癌或胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、肝细胞癌瘤、神经内分泌肿瘤、甲状腺髓样癌、甲状腺分化癌、乳癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌、前列腺癌、外阴癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈部癌。术语“癌症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如，其细胞未迁移至受试者体内原始恶性疾病或肿瘤部位以外的部位的肿瘤)和继发性恶性细胞或肿瘤(例如，由转移产生的肿瘤，恶性细胞或肿瘤细胞迁移至与原始肿瘤部位不同的次级部位)。有助于本发明的治疗方法的癌症涉及表达、过度表达或异常表达IGF-1R的细胞。
癌症或恶性肿瘤的其它实例包括但不限于：急性儿童成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性骨髓性白血病、成人霍奇金氏淋巴瘤、成人淋巴细胞性淋巴瘤、成人非霍奇金氏淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、AIDS相关的淋巴瘤、AIDS相关的恶性肿瘤、肛门癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑瘤、乳癌、肾盂和输尿管癌、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、子宫颈癌、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性成淋巴细胞性白血病、儿童急性骨髓性白血病、儿童脑干神经胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、儿童颅外胚细胞瘤、儿童霍奇金氏病、儿童霍奇金氏淋巴瘤、儿童下丘脑和视通路神经胶质瘤、儿童成淋巴细胞性白血病、儿童成神经管细胞瘤、儿童非霍奇金氏淋巴瘤、儿童松果体和幕上原始神经外胚层瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视通路和下丘脑神经胶质瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食道癌、尤因氏肉瘤和相关肿瘤、外分泌胰腺癌、颅外胚细胞瘤、性腺外胚细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、女性乳癌、戈谢氏病(Gaucher's Disease)、胆囊癌、胃部癌、胃肠良性肿瘤、胃肠肿瘤、胚细胞瘤、妊娠性滋养层细胞瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金氏淋巴瘤、高丙种球蛋白血症、下咽癌、肠癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、卡波济氏肉瘤(Kaposi's Sarcoma)、肾癌、喉癌、唇口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴增生性病症、巨球蛋白血症、男性乳癌、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、原发灶隐匿的转移性鳞状颈癌、转移性原发性鳞状颈癌、转移性鳞状颈癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞赘瘤、骨髓发育不良综合症、髓细胞性白血病、骨髓性白血病、骨髓增生性病症、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、原发灶隐匿性转移性鳞状颈癌、口咽癌、骨肉瘤/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨骼的恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢胚细胞瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、胰腺癌、病变蛋白血症、真性红细胞增多症、副甲状腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉状瘤病肉瘤、塞扎里综合症(Sezary Syndrome)、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层和松果体瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、移行肾盂和输尿管癌、滋养层细胞瘤、输尿管和肾盂细胞癌、输尿管癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视通路和下丘脑神经胶质瘤、阴门癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、韦尔姆斯氏瘤，和除赘瘤以外位于上列器官系统中的任何其它过度增生性疾病。
本文描述和要求保护的方法和组合物可用来治疗恶性或恶变前病状并且用来预防发展成赘生性或恶性病况，包括但不限于以上所述的那些病症。此类用途表明在已知的或怀疑先前进展至瘤形成或癌症的病状中，具体来说，其中非赘生性细胞生长由过度增生、化生组成，或最具体地，出现发育异常(针对此类异常生长病状的综述，参见Robbins和Angell,Basic Pathology，第2版,W.B.Saunders Co.,Philadelphia,第68-79页(1976))。
发育异常常为癌症的前兆，并且主要发现于上皮中。其为非赘生性细胞生长的最无序形式，涉及个别细胞一致性和细胞结构定向的失去。在存在慢性刺激或炎症的情况下，发育异常特征性地发生。可治疗的发育异常病症包括但不限于无汗性外胚层发育不良、前面部发育不良、窒息性胸廓发育不良、心房-手指发育不良、支气管肺发育不良、大脑发育不良、子宫颈非典型增生、软骨外胚层发育不良、锁骨颅骨发育不良、先天性外胚层发育不良、颅骨干发育不良、颅腕跗发育不良、颅骨干骺端发育不良、牙本质发育异常、骨干结构不良、外胚层发育不良、牙釉质发育不良、脑性眼球发育不全、偏侧骨骺发育不良、多发性骨骺发育不良、点状骨骺发育不良、上皮异常增生、面指生殖器发育异常、家族性颌骨纤维性发育异常、家族性白色皱褶性发育异常、纤维肌肉发育异常、骨纤维性结构不良、旺盛骨性发育不良、遗传性肾视网膜发育不良、有汗性外胚层发育不良、少汗性外胚层发育不良、淋巴细胞减少性胸腺发育不良、乳腺发育不良、下颌骨颜面发育不良、干骺端发育不良、蒙蒂尼氏发育异常(Mondinidysplasia)、单骨纤维性骨发育不良、粘液上皮发育异常、多发性骨骺发育不良、眼耳脊椎发育不良、眼齿指发育不良、眼椎骨发育不全、牙原性发育不良、眼下颌骨发育不良、根尖周牙骨质异常增生、多骨纤维性结构不良、假性软骨发育不全性脊椎骨骺发育不良、视网膜发育不良、中隔-眼发育不良、脊椎骨骺发育不良和脑室径向发育不良。
可治疗的另外赘生前病症包括但不限于良性异常增生性病症(例如良性肿瘤、纤维囊性病状、组织肥大、肠息肉或腺瘤以及食道发育异常)、粘膜白斑病、角化病、博文氏病(Bowen's disease)、农夫皮肤(Farmer's Skin)、日光性唇炎以及日光性角化病。
在优选的实施方案中，使用本发明的方法来抑制癌症，具体为上文所列的那些癌症的生长、进展和/或转移。
另外的过度增生性疾病、病症和/或病状包括但不限于恶性疾病和相关病症的进展和/或转移，如白血病(包括急性白血病(例如急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓细胞性白血病(包括成骨髓细胞性、早幼粒细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病))和慢性白血病(例如慢性骨髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病))、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如霍奇金氏病和非霍奇金氏病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病和实体肿瘤，包括但不限于肉瘤和癌瘤，如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、韦尔姆斯氏瘤、子宫颈癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑脊膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。
表达载体
还其它实施方案可涉及包含编码抗体、抗体片段、毒素或免疫毒素如DNLTM构建体的组分融合蛋白的核酸的DNA序列。融合蛋白可包含例如附着至AD或DDD部分的抗体或片段或毒素。
各种实施方案涉及包含编码DNA序列的表达载体。载体可含有编码人免疫球蛋白的轻链恒定区和重链恒定区以及铰链区的序列，嵌合的、人源化的或人的可变区序列可附着至所述人免疫球蛋白。载体可额外地含有在选择的宿主细胞中表达编码蛋白质的启动子、增强子和信号序列或前导序列。特别有用的载体为pdHL2或GS。更优选地，轻链恒定区和重链恒定区以及铰链区可来自人EU骨髓瘤免疫球蛋白，其中将同种异型位置中的任选地至少一种氨基酸改变为存在于不同IgG1同种异型中的氨基酸，并且其中基于EU编号系统的EU重链的任选地氨基酸253可用丙氨酸替代。参见Edelman等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 63:78-85(1969)。在其它实施方案中，可将IgG1序列转化为IgG4序列。
熟练的技术人员将认识到，对表达构建体基因工程化并且插入到宿主细胞中以表达工程化的蛋白质的方法为本领域中熟知的并且为进行常规实验的事情。表达克隆的抗体或片段的宿主细胞和方法已例如描述于美国专利号7,531,327和7,537,930中，所述专利各自的实施例部分均以引用的方式并入本文。
试剂盒
各种实施方案可涉及含有适用于治疗或诊断患者体内的患病组织的组分的试剂盒。示例性试剂盒可含有如本文所描述的一种或多种免疫毒素。如果含有用于施用的组分的组合物未配制用于通过消化道递送，如通过口服递送，那么可包括能够通过一些其它途径递送试剂盒组分的装置。用于如肠胃外递送等应用的一种类型装置为注射器，其用来将组合物注射到受试者体内。还可使用吸入装置。在某些实施方案中，可将治疗剂提供在含有无菌液体制剂或冻干制剂的预填充注射器或自动注射笔的形式中。
试剂盒组分可包装在一起或分开到两个或更多个容器中。在一些实施方案中，容器可为含有适用于复原的组合物的无菌冻干制剂的小瓶。试剂盒还可含有一种或多种适用于复原和/或稀释其它试剂的缓冲液。可使用的其它容器包括但不限于袋、盘、盒、管等。试剂盒组分可无菌包装和保持在容器内。可包括的另一个组件为提供给试剂盒使用者的说明书。
实施例
提供以下实施例来说明(但并非限制)本发明的权利要求。
实施例1.通过将AD部分附着至抗体轻链的C-末端的DNLTM构建体的产生和使用示出改进的稳定性、药物代谢动力学和功效
我们将IgG分子与融合至κ轻链的C-末端的AD部分(下文指代“Ck”复合物或融合蛋白)合并，替代了Fc的C-末端(下文指代“CH”)来探索了改进的对接和锁定TM(DNLTM)复合物的产生和使用。在以下实施例中，Ck DNLTM复合物还由星号指示(例如，20*-2b)。两种示例性Ck-来源的原型抗CD22/CD20双特异性六价抗体(其包含依帕珠单抗(抗CD22)和维妥珠单抗(抗CD20)的四个Fab)和CD20-靶向的免疫细胞因子(其包含维妥珠单抗和干扰素-α2b的四个分子)与其Fc-来源的对应物相比展现出体外增强的Fc-效应子功能以及体内改进的药物代谢动力学、稳定性和抗淋巴瘤活性。这些想不到的优越结果有利于使用具有用于临床开发的Ck设计的DNLTM缀合物。
命名为20*-2b的Ck-IgG-IFNα具有与其Fc-IgG-IFNα对应物20-2b类似的分子大小和组成，其各自均包含维妥珠单抗和分别在轻链或重链的C-末端处融合的IFNα2b的4个拷贝。命名为22*-(20)-(20)的Ck-bsHexAb和其Fc-bsHexAb同系物22-(20)-(20)各自均包含依帕珠单抗和4个维妥珠单抗Fab，其分别在轻链和重链的C-末端处融合。与类似的基于Fc的免疫缀合物相比，Ck-IgG-IFNα和Ck-bsHexAb在体内更稳定、从循环中清除地更缓慢并且具有改进的Fc-效应子功能、显著增强的体内功效。
方法
抗体和细胞培养物—Immunomedics提供了维妥珠单抗(抗CD20IgG1)、依帕珠单抗(抗CD22IgG1)、鼠抗IFNαmAb、hMN-14(拉贝珠单抗(labetuzumab))、大鼠抗独特型mAb维妥珠单抗(WR2)以及大鼠抗独特型mAb依帕珠单抗(WN)。HRP-缀合的第二抗体来自Jackson Immunoresearch(Westgrove,PA)。热灭活的胎牛血清(FBS)获自Hyclone(Logan,UT)。所有其它细胞培养基和补充剂购自InvitrogenLife Technologies(Carlsbad,CA)。将SpESFX-10细胞(Rossi等人,2011,Biotechnol.Prog.27:766-775)和生产克隆维持在H-SFM中。Daudi细胞系购自ATCC并且在10％FBS-RPMI(Manassas,VA)中生长。
DNL TM 构建体—以下进一步详细描述了用于产生基于Ck的DNLTM构建体的方法。对于CH3-AD2-IgG-维妥珠单抗、CH3-AD2-IgG-依帕珠单抗、CH1-DDD2-Fab-维妥珠单抗以及IFNα2b-DDD2，先前已报道了哺乳动物表达载体和生产克隆的产生以及其用于DNLTM缀合20-2b和22-(20)-(20)的用途(Rossi等人,2008,Cancer Res.68:8384-8392；Chang等人,2009,Bioconjug.Chem.20:1899-1907；Rossi等人,2009,Blood 114:3864-3871；Rossi等人,2009,Blood113:6161-6171)。通过重组工程化产生Ck-AD2-IgG，从而将AD2肽融合至κ轻链的C-末端(图1a)。因为CK的天然C-末端为形成针对CH1的二硫桥键的半胱氨酸残基，所以16个氨基酸残基“铰链”接头(SEQ ID NO:122)用来使AD2与CK-VH1二硫桥键间隔开。此方法的目的为了获得所有Fab和效应子基团的全部结合和活性，同时保持全部Fc效应子功能。最终目的为了维持接近IgG的Pk并且防止在将复合物吸收到细胞中之后可能由蛋白质水解发生的模块细胞内解离。
构建第一CK-AD2-IgG模块用于维妥珠单抗(hA20)，其中随后产生用于米拉珠单抗(hLL1)、依帕珠单抗(hLL2)和hR1(抗IGF-1R)的另外CK-AD2-IgG模块。这些模块已用来产生六价抗体和免疫细胞因子，其可与用对应CH3-AD2-IgG模块制得的具有类似组成的构建体相比。使用先前用于表达同源CH3-AD2-IgG模块的pdHL2载体构建用于Ck-AD2-IgG-维妥珠单抗和Ck-AD2-IgG-依帕珠单抗的哺乳动物表达载体。合成包含在VK/CK内含子内的Bam HI限制位点至Ck内含子的Xho I限制位点3’范围内的pdHL2载体序列的2208-bp核苷酸序列(SEQ ID NO:130)，其中对于铰链接头插入编码序列(EFPKPSTPPGSSGGAP,SEQ ID NO:122)和对于CK在编码序列的3’端处结构内插入AD2。经过Bam HI和Xho I限制位点将此合成序列插入到用于维妥珠单抗和依帕珠单抗的IgG-pdHL2表达载体中。如针对CH3-AD2-IgG模块所描述，进行用SpESFX-10产生生产克隆(Rossi等人,2008,Cancer Res.68:8384-8392；Rossi等人,2009,Blood113:6161-6171)。在分批滚瓶培养中通过稳定转染生产克隆来产生Ck-AD2-IgG-维妥珠单抗和Ck-AD2-IgG-依帕珠单抗，并且使用MABSELECTTM(GE Healthcare)蛋白A亲和色谱法从上清液一步纯化。
在针对22-(20)-(20)(Rossi等人,2009,Blood 113:6161-6171)先前描述的相同方法之后，使Ck-AD2-IgG-依帕珠单抗与CH1-DDD2-Fab-维妥珠单抗(图1b)(来自维妥珠单抗的基于Fab的模块)缀合以产生bsHexAb 22*-(20)-(20)，其中22*指示依帕珠单抗的Ck-AD2模块并且每个(20)均象征维妥珠单抗Fab的稳定二聚体(图1c)。将22*-(20)-(20)的性质与22-(20)-(20)的性质比较，所述22-(20)-(20)为包含CH3-AD2-IgG-依帕珠单抗的同源Fc-bsHexAb(图1d)，其具有类似的组成和分子大小但构造不同。
在针对20-2b(Rossi等人,2009,Blood 114:3864-3871)先前描述的相同方法之后，使Ck-AD2-IgG-维妥珠单抗(图1a)与IFNα2b-DDD2(具有在其C-末端处融合的DDD2肽的IFNα2b模块(图1e))缀合以产生20*-2b(图1f)，所述20*-2b包含具有融合至每条轻链的二聚IFNα2b的维妥珠单抗。将20*-2b的性质与20-2b的性质比较(图1g)，所述20-2b为同源Fc-IgG-IFNα。通过MABSELECTTM亲和色谱法将bsHexAb和IgG-IFNα各自均从反应混合物中分离出来。
用于表达C K -AD2-IgG模块的DNA载体的产生。—合成包含从Bam HI限制位点(在VK/CK内含子内)至Xho I限制位点(居于重链表达盒之前)的pdHL2表达载体序列的2208个碱基对DNA序列(SEQ IDNO:130)，其中对于铰链接头插入编码序列(SEQ ID NO:122)和对于CK在编码序列的3’端处结构内插入AD2(SEQ ID NO:4)。在单个克隆步骤中，将此合成序列插入到用于维妥珠单抗的表达载体(hA20-pdHL2)中的Bam HI/Xho I限制位点中以产生CK-AD2-IgG-hA20-pdHL2(图11)。类似地，使用Bam HI/Xho I限制位点将2208个碱基对片段插入到用于依帕珠单抗、米拉珠单抗和hR1的pGSHL表达载体中(图12)。
用于IgG-pdHL2转化为CK-AD2-IgG-pdHL2载体的合成核酸序列在SEQ ID NO:130中示出。5’Bam HI和3’Xho I限制位点已加下划线。用于CK-铰链接头-AD2肽的编码序列用粗体示出。
GGATCCCGCAATTCTAAACTCTGAGGGGGTCGGATGACGTGGCCATTCTTTGCCTAAAGCATTGAGTTTACTGCAAGGTCAGAAAAGCATGCAAAGCCCTCAGAATGGCTGCAAAGAGCTCCAACAAAACAATTTAGAACTTTATTAAGGAATAGGGGGAAGCTAGGAAGAAACTCAAAACATCAAGATTTTAAATACGCTTCTTGGTCTCCTTGCTATAATTATCTGGGATAAGCATGCTGTTTTCTGTCTGTCCCTAACATGCCCTGTGATTATCCGCAAACAACACACCCAAGGGCAGAACTTTGTTACTTAAACACCATCCTGTTTGCTTCTTTCCTCAGGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGAGTTCCCTAAACCCAGCACTCCACCCGGATCTTCCGGCGGCGCTCCCTGTGGCCAGATCGAGTACCTGGCCAAGCAGATCGTGGACAACGCCATCCAGCAGGCCGGGTGCTAGAGGGAGAAGTGCCCCCACCTGCTCCTCAGTTCCAGCCTGACCCCCTCCCATCCTTTGGCCTCTGACCCTTTTTCCACAGGGGACCTACCCCTATTGCGGTCCTCCAGCTCATCTTTCACCTCACCCCCCTCCTCCTCCTTGGCTTTAATTATGCTAATGTTGGAGGAGAATGAATAAATAAAGTGAATCTTTGCACCTGTGGTTTCTCTCTTTCCTCATTTAATAATTATTATCTGTTGTTTTACCAACTACTCAATTTCTCTTATAAGGGACTAAATATGTAGTCATCCTAAGGCGCATAACCATTTATAAAAATCATCCTTCATTCTATTTTACCCTATCATCCTCTGCAAGACAGTCCTCCCTCAAACCCACAAGCCTTCTGTCCTCACAGTCCCCTGGGCCATGGTAGGAGAGACTTGCTTCCTTGTTTTCCCCTCCTCAGCAAGCCCTCATAGTCCTTTTTAAGGGTGACAGGTCTTACAGTCATATATCCTTTGATTCAATTCCCTGAGAATCAACCAAAGCAAATTTTTCAAAAGAAGAAACCTGCTATAAAGAGAATCATTCATTGCAACATGATATAAAATAACAACACAATAAAAGCAATTAAATAAACAAACAATAGGGAAATGTTTAAGTTCATCATGGTACTTAGACTTAATGGAATGTCATGCCTTATTTACATTTTTAAACAGGTACTGAGGGACTCCTGTCTGCCAAGGGCCGTATTGAGTACTTTCCACAACCTAATTTAATCCACACTATACTGTGAGATTAAAAACATTCATTAAAATGTTGCAAAGGTTCTATAAAGCTGAGAGACAAATATATTCTATAACTCAGCAATTCCCACTTCTAGGGGTTCGACTGGCAGGAAGCAGGTCATGTGGCAAGGCTATTTGGGGAAGGGAAAATAAAACCACTAGGTAAACTTGTAGCTGTGGTTTGAAGAAGTGGTTTTGAAACACTCTGTCCAGCCCCACCAAACCGAAAGTCCAGGCTGAGCAAAACACCACCTGGGTAATTTGCATTTCTAAAATAAGTTGAGGATTCAGCCGAAACTGGAGAGGTCCTCTTTTAACTTATTGAGTTCAACCTTTTAATTTTAGCTTGAGTAGTTCTAGTTTCCCCAAACTTAAGTTTATCGACTTCTAAAATGTATTTAGAATTTCGACCAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGCTGCACTCCGCCCGAAAAGTGCGCTCGGCTCTGCCAAGGACGCGGGGCGCGTGACTATGCGTGGGCTGGAGCAACCGCCTGCTGGGTGCAAACCCTTTGCGCCCGGACTCGTCCAACGACTATAAAGAGGGCAGGCTGTCCTCTAAGCGTCACCACGACTTCAACGTCCTGAGTACCTTCTCCTCACTTACTCCGTAGCTCCAGCTTCACCAGATCCCTCGAG(SEQ ID NO：130)
C K -AD2-IgG模块的产生和纯化—通过用Sal I限制酶消化使CK-AD2-IgG-hA20-pdHL2载体线性化并且通过电穿孔转染到SpESFX-10骨髓瘤细胞中。在电穿孔之后，将细胞铺在96孔组织培养板上并且用0.05μM甲氨蝶呤(MTX)选择转染子克隆。μ使用涂覆有WR2(hA20抗Id)的孔通过夹层ELISA筛选克隆的蛋白质表达并且用过氧化物酶缀合的山羊抗人Fab检测。
类似于上文转染三种CK-AD2-IgG-pGSHL表达载体，但替代MTX铺在用于选择的无谷氨酰胺培养基中。使用涂覆有抗体特异性的抗Id的孔通过夹层ELISA筛选克隆的蛋白质表达并且用过氧化物酶缀合的山羊抗人Fab检测。
在滚瓶中增大并培养最高产的克隆用于蛋白质表达。使用蛋白A亲和色谱法纯化CK-AD2-IgG模块。细胞系的生产力类似于IgG或CH3-AD2-IgG的生产力。还原性SDS-PAGE分辨出hA20κ-AD2多肽的蛋白质带，其中相对迁移率与其计算的分子量(26,951Da)一致并且大于hA20κ(23,204Da)(未示出)。预期地，Ck-AD2-IgG-hA20的重链多肽与hA20IgG的重链多肽共同迁移。
通过具有C K -AD2-IgG的DNL TM 制得的双特异性六价抗体—通过使Ck-AD2-IgG模块与具有不同特异性的CH3-DDD2-Fab模块组合并且在温和氧化还原条件下进行DNLTM缀合来产生双特异性六价抗体(bsHexAb)。产生并且表征六种bsHexAb和一种单特异性HexAb，如通过称为20Ck-(74)-(74)(或者，20*-(74)-(74))的构建体所举例说明，其中第一密码(20Ck或20*)指示Ck-AD2-IgG模块并且圆括号中的密码指示稳定的二聚Fab-DDD2模块。因此，20Ck-(74)-(74)(或20*-(74)-(74))包含与来源于米拉珠单抗的四个抗CD74Fab融合的维妥珠单抗(抗CD20)。7种HexAb的组成部分和化合价在表7中给出。
以类似方式产生并且纯化每种HexAb。22*-(20)-(20)的一种制剂的详述作为实例提供。使摩尔过量的CH3-DD2-Fab-hA20(42mg)与25mg的CK-AD2-IgG-hLL2于Tris-柠檬酸盐缓冲液(pH 7.5±0.2)中混合。分别添加2mM和1mM的还原型谷胱甘肽和EDTA，并且在室温下使反应保持过夜，在添加4mM氧化型谷胱甘肽之前在室温下孵育另外的4小时。向5ml MABSELECTTM(蛋白A)色谱柱施加反应混合物，在用0.1M柠檬酸盐(pH 3.5)洗脱bsHexAb之前用PBS洗涤所述色谱柱。将22*-(20)-(20)构建体渗析到0.04M PBS(pH 7.4)中。总共回收56mg的22*-(20)-(20)，代表96％产率。大小排阻HPLC(SE-HPLC)分辨出具有与大约368kDa分子量的蛋白质一致的保留时间的单个均匀蛋白质峰(未示出)。基于Ck-AD2的bsHexAb的SE-HPLC峰分辨具有比具有类似组成和分子量的对应的基于CH3-AD2的bsHexAb稍微更长的保留时间(未示出)，从而指示与后者相比前者具有更小的斯托克斯半径并且为更紧凑的分子。
20(C k )-2b，基于C k -AD2-IgG-hA20的IgG-IFNα免疫细胞因子-使用DNLTM方法通过使Ck-AD2-IgG-hA20与IFNα2b-DDD2组合制备包含与四个IFNα2b基团融合的维妥珠单抗的免疫细胞因子(图1f)。使CK-AD2-IgG-hA20(54mg)与81.1mg的IFNα-DDD2组合。添加EDTA(1mM)和还原型谷胱甘肽(2mM)并且在室温下使溶液保持5小时。将氧化型谷胱甘肽(4mM)添加至混合物，在室温下保持过夜。使用两个连续的亲和色谱法步骤将20*-2b纯化至接近同质。首先，将反应混合物施加至4ml MABSELECTTM(蛋白A)柱。用4个柱体积(16ml)的0.02％聚山梨醇酯-80、50mM柠檬酸盐(pH 3.5)洗脱蛋白质直接进入16ml的0.02％P-80、80mM咪唑、1M NaCl、100mMNa2HPO4，并且用50mM Na2HPO4、40mM咪唑、500mM NaCl将溶液调节至pH 7.3。将调节的洗脱液施加至8ml6FF柱，所述柱用0.02％P-80、40mM咪唑、0.5M NaCl、50mM NaPO4(pH 7.5)平衡。用5个柱体积的500mM咪唑、0.02％P-80、50mMNaCl、20mM NaH2PO4(pH 7.5)洗脱总共85mg的20(Ck)-2b。
SE-HPLC分辨出具有与大约250kDa蛋白质一致的保留时间的20*-2b的主要蛋白质峰(未示出)。20*-2b峰分辨出具有比包含相同组分(维妥珠单抗和四个IFNα2b)并且具有类似分子量的20-2b的保留时间更长的保留时间，从而指示类似于HexAb所观察到的前者具有更小的斯托克斯半径并且比后者更紧凑。
分析方法—使用4μm UHR SEC柱(Waters Corp.,Milford MA)进行大小排阻高效液相色谱法(SE-HPLC)。使用4％-20％梯度的Tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen,Gaithersburg,MD)进行SDS-PAGE。在水平电泳池(Bio-Rad,Hercules,CA)上使用pH 6-10.5琼脂糖IEF板(Lonza,Basel,Switzerland)在1000V、20mM和25瓦特下进行IEF持续1h。用2100多标记平板读数器(PerkinElmer,Waltham,MA)定量所有比色测定(ELISA和MTS)和荧光测定(CDC和ADCC)。
细胞结合—通过使用Express软件(Millipore Corp.,Billerica,MA)在PCA上进行流式细胞计量术来测量细胞结合。根据制造商规程(Invitrogen,Molecular Probes)使用R-藻红蛋白人IgG标记试剂盒来用藻红蛋白(PE)标记维妥珠单抗和20*-2b。在室温下用PE-维妥珠单抗和PE-20*-2b(0.1nM-15nM)孵育Daudi细胞30min并且在分析之前用1％BSA-PBS洗涤。通过线性回归分析浓度与平均荧光强度(MFI)的曲线图。
体外细胞毒性—以10,000个细胞/孔将Daudi细胞铺在96孔板中，并且在存在递增浓度的20*-2b或20-2b的情况下在37℃下孵育3天。使用基于MTS的CELLTITER 细胞增殖测定(Promega,Madison,WI)确定活细胞密度。
FcRn结合测量—根据Wang等人(2011,Drug Metab Dispos.39:1469-1477)的方法通过在X仪器(GE Healthcare)上进行表面等离子体共振来评价FcRn结合。根据Feng等人(2011,ProteinExpr.Purif.79:66-71)的方法产生可溶单链FcRn。经过柔性肽接头使人FcRn重链的细胞外结构域与β2-微球蛋白融合。使用修饰的pdHL2载体在转染子SpESFX-10细胞中表达融合蛋白，并且使用Ni-琼脂糖纯化。使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)将纯化的scFcRn固定到CM5生物传感器芯片上达到大约600个响应单位(RU)的密度。用pH 6.0的流动缓冲液(running buffer)[50mM NaPO4、150mM NaCl和0.05％(v/v)表面活性剂20]将测试品稀释至400nM、200nM、100nM、50nM和25nM并且结合固定的scFcRn持续3min以达到平衡，接着在30μL/min的流速下解离2min。在运行之间用pH 7.5的流动缓冲液再生传感器芯片。为了确定pH 6.0下的FcRn结合亲和性(KD)，同时使用来自所有五种浓度的数据来拟合两种状态反应模型(BIA评价软件；GE Healthcare)。拟合优度由χ2值指示。
Pk分析—在小鼠中静脉内(i.v.)或皮下(s.c)注射之后，比较20*-2b与20-2b之间的药物代谢动力学(Pk)和体内稳定性。通过静脉内或皮下注射给18只Swiss-Webster小鼠的组施用1mg剂量的20*-2b或20-2b。使用每个时间点3只小鼠，处死动物并且在6、16、24、48、72和96小时下放血。因此，每个血清样品代表独立的动物/时间点。为了测量完整IgG-IFNα和总共(完整加上解离的)IgG-IFNα，用0.5M Na2CO3中的5μg/mL WR2(维妥珠单抗的大鼠抗Id)(pH 9.5)吸附微量滴定孔。在用2％BSA-PBS封闭之后，在涂覆的孔中孵育抗体缓冲液中的血清稀释物(0.1％明胶、0.05％proclin、0.05％吐温-20、0.1M NaCl、0.1M NaPO4(pH 7.4))持续2h。为了测量完整IgG-IFNα，用小鼠抗IFNα mAb(5μg/mL抗体缓冲液)探测孔持续1h，接着用HRP缀合的山羊抗小鼠IgG-Fc检测。为了测量总维妥珠单抗IgG，用HRP缀合的山羊抗人IgG-Fc探测孔持续1h。
为了测量完整bsHexAb和总bsHexAb，用WN(依帕珠单抗的大鼠抗独特型)吸附微量滴定孔。在涂覆的孔中孵育血清稀释物持续2h。为了检测完整bsHexAb，用HRP缀合的WR2(1μg/mL的抗体缓冲液)探测孔持续1h。为了检测总依帕珠单抗IgG，用HRP缀合的山羊抗人IgG-Fc探测孔持续1h。
用邻苯二胺二盐酸盐底物溶液检测信号并且在490nM下测量OD。从构建体-特异性标准物曲线推出完整种类和总种类的浓度。使用Pk软件包(5.1版本；Pharsight Corp.；Mountain View,CA)分析Pk。
体内和离体方法—通过Lampire生物实验室(Pipersville,PA)进行来自兔的血清注射和收集。为了Pk研究，用稀释在PBS中的测试剂皮下(SC)注射10周龄的雄性Swiss-Webster小鼠(Taconic,Germantown,NY)和新西兰白兔并且还对小鼠静脉内(IV)注射。针对小鼠和兔分别通过心脏穿刺和从耳静脉获得血液样品。通过离心使血清从凝固的血液中分离出来，并且在通过ELISA分析之前在抗体缓冲液中稀释。
从健康供体收集人血液样本。如先前所描述测定体外ADCC和CDC活性(Rossi等人,2008,Cancer Res.68,8384-8392)。对于ADCC，用PBMC在37℃下孵育Daudi细胞4h，使用33nM的测试剂以50:1的效应子:靶标比率使所述PBMC从健康供体的血液中分离出来。
小鼠中的体内功效—在第0天用1.5x 107个Daudi细胞静脉内接种雌性8-12周龄C.B.17纯合SCID小鼠(Taconic)。为了比较bsHexAb，在第1天和第5天通过SC注射施用治疗。为了比较IgG-IFNα，在第7天以单次SC注射的形式施用治疗。盐水用作对照治疗。在后肢麻痹发展时或如果它们以另外的方式变为濒死的，那么对每日监测的动物实行人道地安乐死。另外，如果它们失去多于20％的初始体重，对小鼠实行安乐死。使用Kaplan-Meier曲线图、使用Prism(4.03版本)软件包(GraphPad Software,Inc.,San Diego,CA)分析存活曲线。从分析中审查出一些由临界Z测试确定的无关项。
统计学分析—对除了体内存活曲线以外的所有结果使用学生氏T-检验来确定统计学显著性(P<0.05)，所述体内存活曲线通过对数秩分析来评价。
结果
合成基于C k 的免疫缀合物—DNLTM合成产生22*-(20)-(20)、22-(20)-(20)、20*-2b以及20-2b的均质制剂。通过SDS-PAGE(非还原性)，使每种缀合物分辨为具有符合其预期大小的相对迁移率的紧密带群集(数据未示出)，并且在还原条件下，仅有代表每种缀合物的组分多肽的带为明显的，从而证明高纯度(未示出)。对于每种缀合物，SE-HPLC分辨出具有与其分子大小一致的保留时间的主峰(未示出)。分别与22-(20)-(20)和20-2b相比，针对22*-(20)-(20)和20*-2b所观察的更长保留时间可能由于其更紧凑的结构。等点聚焦示出20*-2b和20-2b具有类似的pI(计算的pI＝pH 7.22)，其中没有迹象表明未反应的IgG-AD2(pI＝pH 7.86)模块或IFNα2b-DDD2(pI＝pH 6.87)模块(未示出)。
如针对20*-2b所示，这两种缀合物均保留亲本mAb的全部结合，这展现出与维妥珠单抗至活Daudi细胞相同的结合(图6)。在Daudi细胞中Ck形式与Fc形式之间的细胞毒性(EC50＝0.2pM)也为类似的，从而证明等效的CD20结合和IFNα特异性活性(图7)。
药物代谢动力学—我们先前报道了Fc-bsHexAb的T1/2大约为其亲本mAb在小鼠体内的一半长时间(Rossi等人,2009,Blood113:6161-6171)。在皮下(SC)注射之后的72h时间段里测量小鼠体内的22*-(20)-(20)、22-(20)-(20)和依帕珠单抗的血清浓度的初始研究(图2a)中，22-(20)-(20)在16h处达到最大浓度并且用T1/2约1天清除，这类似于上文的发现。相比之下，依帕珠单抗和22*-(20)-(20)均在24h与48h之间达到峰值水平，同时类似于但慢于22-(20)-(20)而清除。经过5天监测清除的后续研究再次发现22*-(20)-(20)具有优越的Pk(示出高于大约2倍的最大血清浓度)，具有更长的T1/2和平均停留时间(MRT)(在大于3.8倍曲线下面积(AUC)中达到终点)。(图2b；表8)。
如在小鼠体内，与22-(20)-(20)相比在兔体内确定的Pk参数比针对22*-(20)-(20)的Pk参数大大约2倍，从而引起大3.3倍的AUC(图2c和图d；表8)。重要地，在SC施用之后小鼠和兔体内的22*-(20)-(20)的浓度持续更长时期。
表8.药物代谢动力学参数的概要
T1/2，消除半衰期；Tmax，最大浓度的时间；Cmax，最大浓度；AUC，曲线下面积；MRT，平均停留时间。
通过表面等离子体共振评价bsHexAb与新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和性(KD)并且发现分别对于22*-(20)-(20)和22-(20)-(20)为166nM和310nM(P＝0.01)。依帕珠单抗的亲和性(16nM)比22*-(20)-(20)强大约10倍(P＝0.007)(表9)。
表9.针对新生儿Fc受体结合亲和性的Biacore分析的概要
kd＝1/s；ka＝1/Ms；KD＝kd/ka，其以nM浓度给出
Fc-IgG-IFNα构建体如20-2b也比其亲本mAb快地从循环中清除(Rossi等人,2009,Blood 114:3864-3871)。然而，当在SC或静脉内(IV)注射之后比较20*-2b和20-2b的Pk参数时(图3)，T1/2、Cmax和MRT各自均与20-2b相比针对20*-2b再次高大约2倍，导致比AUC高大2.8倍(表8)。针对IV施用，20*-2b分别具有长2倍和2.8倍的T1/2和MRT以及大2倍的AUC。
体内稳定性—Fc-bsHexAb和Fc-IgG-IFNα在离体情况下在血清中为稳定的(Rossi等人,2009,Blood 114:3864-3871；Rossi等,2009,Blood 113:6161-6171)。然而，来自早期Pk研究的血清样品分析表明这些构建体推测是通过细胞内加工在体内随时间而解离。我们通过测量完整IgG-IFNα和总维妥珠单抗的浓度比较了20*-2b和20-2b的体内稳定性，这允许使完整种类与解离的种类区分开来(图3c)。对时间绘制％完整IgG-IFNα的曲线(图3d)，并且通过线性回归计算20-2b和20*-2b的体内解离速率分别为0.97％/h和0.18％/h。在小鼠体内SC注射bsHexAb之后对血清样品进行类似的分析，其中22-(20)-(20)和22*-(20)-(20)的体内解离速率分别计算为0.55％/h和0.19％/h(图8)。有趣地是，在兔体内SC注射之后22-(20)-(20)和22*-(20)-(20)均为体内完全稳定的(图9)。对于小鼠与兔之间的体内稳定性差异的原因为未知的。
效应子功能—我们报道了Fc-IgG-IFNα和Fc-bsHexAb在体外不会诱导可测量的CDC，甚至当其亲本mAb具有潜在活性时(Rossi等人,2009,Blood 114:3864-3871；Rossi等人,2009,Blood113:6161-6171)。与现有技术的结果一致，维妥珠单抗展现出强CDC，针对20-2b还没有出现活性(图4a)。然而，20*-2b诱导强CDC，所述强CDC接近维妥珠单抗的效力(图4a)。在这些体外条件下，依帕珠单抗缺乏CDC，而22-(20)-(20)实现中等增加，并且22*-(20)-(20)诱导甚至更大的活性，所述活性比维妥珠单抗小大约10倍的效力(图4b)。
不像CDC，基于Fc的缀合物不会具有减少的ADCC，相反20-2b展现出与维妥珠单抗相比增强的ADCC(Rossi等人,2009,Blood114:3864-3871)。取决于PBMC供体，依帕珠单抗在体外诱导几乎没有或没有ADCC，并且不出人意料地，22-(20)-(20)没有示出统计学显著的改进(图4c)。然而，当使用高ADCC供体的PBMC时，与22*-(20)-(20)相关的ADCC不与维妥珠单抗显著不同(图4c)。对于低ADCC PBMC供体，22*-(20)-(20)具有与依帕珠单抗(2.3％)和22-(20)-(20)(4.3％)相比增强的活性(11.4％溶解)，但所述活性低于维妥珠单抗(18.5％)(P＝0.0326，数据未示出)。
体内功效—如先前所报道，20-2b在治疗携带人Daudi伯基特淋巴瘤异种移植物的小鼠中显著有效，所述人Daudi伯基特淋巴瘤异种移植物对IFNα的直接杀死有高度敏感性(Rossi等,2009,Blood114:3864-3871)。使用相同的模型，基于Ck的缀合物展示出比其基于Fc的对应物甚至更有效的抗肿瘤活性(图5a)。虽然以单次1μg剂量的20-2b和20*-2b治愈了大多数的动物，其中平均存活时间(MST)大于189天，但是0.25μg的20*2b(而不是20-2b)也维持了其效力，从而提供显著改进的治疗功效的证据(针对20*2b治愈7/8的MST>189天与针对20-2b仅具有3/8存活者的MST>134.5天；P＝0.0351)。关于盐水对照，与1μg的20-2b相等摩尔的维妥珠单抗(0.6μg)仅使MST增加12.5天。在播散性Daudi模型中再次示出另一种不同Ck构建体对Fc-亲本构建体的优越性，其中向动物施用高(1mg)剂量或低(10μg)剂量的22*-(20)-(20)或22-(20)-(20)的两次注射(第1天和第5天)(图5b)。针对高剂量，对于22*-(20)-(20)和22-(20-(20)的具有100％和10％存活率的MST分别为>123天和71天(P<0.0001)。针对低剂量治疗，与对于22-(20)-(20)的没有存活者的MST为50.5天(P＝0.0014)相比，对于22*-(20)-(20)的具有2只小鼠存活的MST为91天。高剂量的每种bsHexAb比单独依帕珠单抗或与CH1-DDD2-Fab-维妥珠单抗组合的依帕珠单抗提高显著更多(P<0.0001)的存活率，所述依帕珠单抗以等于1mg剂量的bsHexAb的摩尔给出。在低100倍给药的情况下，这两种bsHexAb均比高剂量依帕珠单抗优越(P<0.003)，并且22*-(20)-(20)(而不是22-(20)-(20))比高剂量依帕珠单抗加上CH1-DDD2-Fab-维妥珠单抗优越(P<0.0001)。
讨论
包括bsAb(Kontermann,2010,Curr Opin Mol Ther 12:176-183)和免疫细胞因子(Kontermann,2012,Arch Biochem Biophys 526:194-205)的基于抗体的融合蛋白的各种形式可主要分为三类，基于其中融合至全IgG、Fc或抗原结合片段如Fab、scFv或双抗体的另外部分。尽管Fc-融合可增加T1/2，并且融合至抗原结合片段会影响靶向，但是仅有融合至IgG会预期实现抗体靶向、全部Fc效应子功能和显著延长的Pk。因为不是所有的IgG-融合设计为同样产生的，所以已知效应子活性和Pk在不同形式之中并且甚至在相同设计的具体构建体之间广泛变化。
DNLTM复合物为产生保留靶向抗体的全部抗原结合亲合力和所附效应子分子(例如，细胞因子)的生物活性并且在体外和体内均具有有效功效的免疫缀合物的例外(Rossi等人,2012,Bioconjug.Chem23:309-323；Rossi等人,2009,Blood 114:3864-3871；Rossi等人,2009,Blood 113:6161-6171；Rossi等人,2010,Cancer Res.70:7600-7609；Rossi等人,2011,Blood 118:1877-1884)。然而，Fc-bsHexAb和Fc-IgG-IFNα以其亲本mAb速率大约两倍的速率从循环中清除。次优的Pk为与免疫缀合物相关的常见缺陷，所述缺陷主要归因于与FcRn的动态结合受损(Kuo&Aveson,2011,MAbs.3:422-430)。为了改进Pk，我们工程化了新类别的IgG-AD2模块，所述IgG-AD2模块具有融合在轻链的C-末端处的AD2肽。新模块用来组装Ck-bsHexAb和Ck-IgG-IFNα，所述Ck-bsHexAb和Ck-IgG-IFNα不仅展现出与其基于Fc的同系物可比的体外性质(包括抗原结合、IFNα特异性活性和体外细胞毒性)，而且具有优越的Pk、体内稳定性和Fc效应子活性，这共同产生与已有效的基于Fc的对应物相比增加的体内功效。
Ck-bsHexAb和Ck-IgG-IFNα的优越Pk最可能归因于其对FcRn的增加的结合亲和性，针对22*-(20)-(20)在pH 6.0下所述结合亲和性为与22-(20)-(20)相比的两倍强。通过IgG的CH2结构域和CH3结构域的部分介导FcRn结合，其中关键接触位点位于Fc的C-末端附近(Huber等人,1993,J Mol Biol 230:1077-1083；Raghavan等,1994,Immunity.1:303-315)。考虑到22*-(20)-(20)的T1/2在依帕珠单抗的范围内(Rossi等人,2009,Blood 113:6161-6171)，出乎预料FcRn结合对于前者而言弱大约10倍(155nM)。然而，使用此相同的方法，我们在42nM和92nM下测量了其它人源化的mAb的FcRn KD，所述其它人源化的mAb通常具有类似于依帕珠单抗的Pk(数据未示出)。T1/2未必与pH 6.0下的FcRn KD直接相关(Dall'Acqua,2002,J Immunol169:5171-5180；Gurbaxani等人,2006,Mol Immunol 43,1462-1473)。已表明pH 7.4下的解离速率对确定T1/2同样重要或也许更重要(Wang,2011,Drug Metab Dispos.39：146:9-1477)。虽然FcRn:IgG接触限于Fc结构域，但是抗原结合结构域可负面影响FcRn结合，如通过大多数治疗性抗体共有非常类似的Fc(IgG1)而在FcRn KD和T1/2上广泛变化的事实所证明(Suzuki,2010,J Immunol184:1968-1976)。另外的因素包括胞吞作用、配体:抗体比、抗体结构稳定性、抗体pI以及甲硫氨酸氧化(Kuo&Aveson,2011,MAbs.3:422-430)。
对于融合蛋白，可通过融合配偶体的性质和位置来影响FcRn KD和T1/2(Suzuki等人,2010,J Immunol 184:1968-1976；Lee等人,2003,Clin Pharmacol Ther 73,348-365)。我们观察到每种IgG-IFNα的T1/2均比使用相同类别的IgG-AD2模块组装的对应bsHexAb短。例如，20*-2b的T1/2(37.9h)明显比22*-(20)-(20)的T1/2(106.5h)短，从而表明与其位置无关，IFNα基团可能通过降低加合物的pI来负面影响FcRn结合。
本实施例将轻链的C-末端鉴定为用于融合至IgG的最有利位置。融合至抗HER2IgG3的重链的N-末端的单链IL-12的免疫细胞因子保留HER2结合(Peng等人,1999,J Immunol 163:250-258)17。我们使用通过构建具有融合至维妥珠单抗重链的N-末端的AD2肽的IgG-AD2模块的DNLTM应用类似策略。然而，用此模块制得的bsHexAb和IgG-IFNα不结合细胞上的CD20(数据未示出)。α这可能因为额外的(Fab)2或(IFNα2b)2基团的大小很大。正是这些结合抗独特型mAb的缀合物表明抗原(所述抗原为CD20的小细胞外环)的性质可能为一个因素。重链的C-末端为用于融合至IgG的最常见和合宜的位置(Kontermann,2012,Arch Biochem Biophys 526:194-205)。然而，所述位置还为最可能负面影响FcRn结合和Pk的位置。例如，在抗HER2 IgG3的重链的C-末端处融合的GM-CSF的免疫细胞因子展现出与亲本mAb(110小时)相比明显减少的T1/2(10小时)(Dela Cruz等人,2000,JImmunol 165:5112-5121)。基于Fc的bsAb还受到Pk减小。作为一个实例，具有融合至抗EGFR IgG的重链的C-末端的抗IGF-1R scFv的bsAb在小鼠体内从循环中清除与亲本mAb(T1/2＝20.36h)相比快两倍(T1/2＝9.93h)(Dong等人,2011,MAbs.3:273-288)。
Croasdale和同事系统研究了融合位置与使用在重链或轻链的N-末端或C-末端处融合的抗IGF-1R IgG1的IgG-scFv四价bsAb、与抗EGFR scFv的作用(Croasdale等人,2012,Arch.Biochem Biophys526:206-18)。在轻链的C-末端处将scFv融合至IgG产生最高产率、具有最长T1/2以及为体内最有效的。作者指出每种构建体均结合FcRn和FcγRIIIa；然而，未报道KD。在不同形式之中，C-末端重链融合具有最短的T1/2。在重链的N-末端或C-末端处融合分别引起ADCC大致上减少或完全失去。或者，在轻链的C-末端处融合不减少ADCC。
我们的结果显示融合位置可影响ADCC。对于包含依帕珠单抗作为IgG(所述IgG具有最小的ADCC)的bsHexAb，针对22*-(20)-(20)而不是22-(20)-(20)测量出强ADCC，从而表明Fc效应子功能通过添加四个抗CD20Fab来提供并且其融合位置为关键的。另外，22*-(20)-(20)显示中等的CDC，这对于依帕珠单抗而言没有检测到，并且对于22-(20)-(20)仅适度增加，从而表明还可通过添加诱导CDC的mAb的Fab来给予缺乏CDC的mAb此效应子功能并且活性对融合位点的位置具有敏感性。这可用IgG-IFNα清楚证明，其中Fc-IgG-IFN(20-2b)不具有可检测的CDC并且20*-2b诱导类似于维妥珠单抗的有效活性。
虽然Fc-bsHexAb和Fc-IgG-IFNα在人体内或小鼠血浆和全血中非常稳定(Rossi等人,2009,Blood：3864-3871；Rossi等人,2009,Blood113:6161-6171)，但是具体来说Fc-融合在体内不完全稳定。与针对基于Ck的构建体的<0.2％/h相比，基于Fc的缀合物在小鼠体内以0.5–1.0％/h的速率解离。因为在离体情况下尚未观察到解离，所以我们推测所述解离通过细胞内加工而发生。有趣地是，甚至在5天后，也没有迹象表明兔中的体内不稳定性。重链的C-末端赖氨酸残基经常在抗体产生过程中由蛋白质水解裂解。常见的基于Fc的融合蛋白(其中额外的基团融合至C-末端赖氨酸)可潜在地通过蛋白酶(如纤溶酶)在体内裂解，所述融合蛋白在暴露的赖氨酸残基之后裂解(Gillies等人,1992,Proc Natl Acad Sci U.S.A 89,1428-1432)。
总之，此研究证明了具有在轻链的C-末端处融合的呈DNLTM复合物形式制得的bsAb和免疫细胞因子的优越体内性质，从而表明轻链的C-末端为用于具有预期临床使用的大多数免疫缀合物的优选融合位置。
实施例2.产生和使用用于治疗自身免疫疾病的基于Ck的DNLTM复合物
背景
全身性红斑狼疮(SLE)分成可涉及许多器官系统的自身免疫疾病；炎症性多系统风湿病症或胶原血管疾病。皮质类固醇保留长期管理大多数患者的基本原则，甚至在患者临床上有所缓解的情况下也要维持使用低剂量。高剂量类固醇(具体为0.5-1.0g加上静脉内甲泼尼龙)与通常在其它治疗无效时的严重情况下使用的免疫抑制剂(硫唑嘌呤(azathioprine)、环磷酰胺、甲氨蝶呤等)为用于管理急性发作(acuteflare)的标准治疗。与免疫抑制剂相关的细胞毒性以及长期全身皮质类固醇疗法的问题为开发靶向和毒性较小的疗法(具体为具有避免使用类固醇作用的那些疗法)提供动机。在过去50年里没有新药剂被批准为用于SLE的治疗剂，直到在2011年3月最近批准了Benlysta(贝利单抗(belimumab))。
虽然常规认为B细胞为产生免疫球蛋白的浆细胞的前体，但是它们也可对SLE的发病机理起其它作用，可能通过激活对自身抗原具有低亲和性的T细胞群(Looney,2010,Drugs 70:529-540；Mok,2010,Int J Rheum Dis 13:3-11；Goldenberg,2006,Expert Rev Anticancer Ther 6:1341-1353；Thaunat等人,2010,Blood 116:515-521)。由于B细胞在自身免疫的发病机理中的中心作用，预期靶向的抗B细胞免疫疗法为SLE提供治疗价值。例如，Benlysta为通过阻断B细胞活化因子来抑制B细胞活化的单克隆抗体(mAb)。
另一种B细胞靶标为CD22，其为免疫球蛋白超家族的B淋巴细胞限制性成员和调节B细胞活化和干扰T细胞的粘附分子的唾液酸粘附素家族的成员的135kD糖蛋白(例如，Carnahan等人,2007,MolImmunol 44:1331-1341；Haas等人,2006,J Immunol 177:3063-3073；Haas等人,2010,J Immunol 184:4789-4800)。CD22具有7个细胞外结构域并且在与其天然配体交联时快速内化，从而在原代B细胞中产生有效的共刺激信号。CD22由于其限制性表达为疗法中有吸引力的分子靶标；其不暴露在胚胎干细胞或前B细胞上并且通常也不从携带抗原的细胞表面脱落。
依帕珠单抗为先进临床试验中的人源化抗CD22抗体。已对患有非霍奇金氏淋巴瘤、白血病、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(macroglobulinemia)、干燥综合症(syndrome)和SLE的患者进行了用依帕珠单抗的临床试验，并且涵盖在多于1000位患者中的经验。在对非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)或其它B细胞恶性肿瘤用依帕珠单抗的初步临床研究中，患者以120至1000mg/m2/周范围内的剂量接受4次连续每周依帕珠单抗的输注(Goldenberg,2006,Expert Rev Anticancer Ther 6:1341-1353；Goldenberg等人,2006,Arthritis Rheum 54:2344-2345；Leonard等人,2003,J Clin Oncol21:3051-3059；Leonard等人,2008,Cancer 113:2714-2723)。治疗相关的毒性通常涉及恶心、寒冷/寒战、发热和其它主要在第一周输注过程中出现的瞬间轻度或中度的输注反应。在依帕珠单抗疗法之后外周B细胞水平降低，而其它方面在治疗之后未见到RBC、ANC、血小板、免疫球蛋白或T细胞水平一致变化。在第四周输注之后依帕珠单抗血液水平以剂量依赖型方式增加，并且依帕珠单抗在循环中保持具有23天的半衰期。有趣地是，在依帕珠单抗与抗CD20利妥昔单抗组合时报道了在NHL的无痛形式和攻击形式中的增强抗肿瘤作用(Goldenberg,2006,Expert Rev Anticancer Ther 6:1341-1353；Leonard等人,2005,J Clin Oncol 23:5044-5051；Leonard等人,2008,Cancer113:2714-2723；Strauss等人,2006,J Clin Oncol 24:3880-3886)。依帕珠单抗正处于用于治疗SLE患者的两个III期登记试验中。还值得注意的是利妥昔单抗也在患有SLE的患者体内显示活性(Ramos-Casals等人,2009,Lupus 18:767-776)。
因为利妥昔单抗和依帕珠单抗的组合在患者体内显示改进的抗淋巴瘤功效而没有使毒性增加(Leonard等人,2008,Cancer113:2714-2723)，所以我们工程化并评价了对抗CD20和CD22的bsAb，包括基于IgG-(scFv)2形式的早期设计(Qu等人,2008,Blood111:2211-2219)和基于六价IgG-(Fab)4形式的近期DNLTM设计，所述设计产生22-(20)-(20)和20-(22)-(22)(Rossi等人,2009Blood113:6161-6171)。确切来说，22-(20)-(20)包含依帕珠单抗和4个额外的维妥珠单抗Fab，并且因此二价结合CD22和四价结合CD20。同样，包含维妥珠单抗和4个依帕珠单抗Fab的其它bsAb(20-(22)-(22))二价结合CD20和四价结合CD22。对于此后称为CH3-HexAb的原始HexAb，两种类型的模块为CH3-AD2-IgG和CH1-DDD2-Fab。每种这些模块均呈融合蛋白形式在骨髓瘤细胞中产生并且通过蛋白A(CH3-AD2-IgG)或KappaSelect(CH1-DDD2-Fab)亲和色谱法纯化。
HexAb可为单特异性或双特异性的。CH3-HexAb包含在两条重链的羧基末端处连接全长IgG的一对Fab-DDD2二聚体，从而具有六个Fab臂和共用的Fc结构域。例如，20-(22)-(22)的密码指定双特异性HexAb包含维妥珠单抗的二价抗CD20IgG和依帕珠单抗的一对二聚抗CD22Fab臂，而22-(20)-(20)规定双特异性HexAb包含依帕珠单抗的二价抗CD22IgG和维妥珠单抗的一对二聚抗CD20Fab臂。
如在以上实施例1中所讨论，我们已通过利用新的IgG-AD2模块(Ck-AD2-IgG)开发出替代HexAb形式，所述新的IgG-AD2模块具有融合至κ轻链的羧基端而不是在Fc的末端处的AD2肽。与CH1-DDD2-Fab组合产生Ck-HexAb结构，所述结构具有与CH3-HexAb不同的构造但具有类似的组成(6个Fab和Fc)，具有连接在轻链的末端处的四个额外Fab。如上所讨论，与原始CH3-HexAb相比，Ck-HexAb展现出优越的效应子功能并且具有显著改进的药物代谢动力学(Pk)。
Ck-HexAb特别适用于体内应用，因为它们表现出有利的Pk、在体内稳定并且免疫原性可如同DDD肽和AD肽来源于人蛋白质和构成的抗体组分为人源化的那样小。另外，每种抗CD22/CD20均在体外有效地诱导针对各种表达CD20/CD22的淋巴瘤和白血病细胞系的直接细胞毒性而不需要第二抗体来实现超高交联，这对于亲本mAb而言是要求的。体内研究证实了bsAb抑制小鼠体内的伯基特淋巴瘤异种移植物生长的功效，从而指示其较大的大小不影响肿瘤靶向和组织穿透。
初步结果
使用依帕珠单抗的临床经验—已进行临床研究以检测单独与利妥昔单抗组合的依帕珠单抗在NHL的无痛和攻击形式中的功效。公布的数据显示可以<1-h输注高达至1,000mg/m2剂量每周给予抗体持续4周，其中最优剂量表现为360mg/m2，并且在43％的给予此最优剂量的有囊泡患者体内产生非常持久的目标应答，其中三分之一包含CR。在每周与利妥昔单抗组合持续四周时，有囊泡的无痛NHL患者表现出总体67％的目标应答(7％PR和60％CR/Cru)，其中在19个月随访时仅一位患者复发。我们和其它人已在多中心美国和欧洲试验中研究了利妥昔单抗和依帕珠单抗在其推荐的每周完整剂量x 4下的组合，其中结果表明比在类似患者群体中单独使用利妥昔单抗的历史研究中所观察到的CR率更高的CR率。
对于狼疮，已完成的研究登记了接受至少一次剂量的依帕珠单抗的331位独特个体(Shoenfeld等人(编著),Immunotherapeutic Agents for SLE.Future Medicine Ltd；2012)。在初步研究中，等人向患有中等活性SLE的14位患者施用360mg/m2(Dorner等人,2006,Arthritis Res Ther 8:R74)。在使用止痛剂/抗组胺剂术前用药(但没有类固醇)的情况下，患者每2周接受静脉内的360mg/m2依帕珠单抗持续四次剂量，并且持续高达至32周。药物早在6周就起作用，其中93％表示在6周时至少一种B水平或C水平疾病活性的不列颠群岛狼疮活性组(BILAG)指数有所改进，并且在10周时所有患者均实现至少一个BILAG身体系统有所改进。依帕珠单抗为耐受良好的并且平均输注时间为32min。在6周时，血液B细胞水平降低35％的平均值并且在治疗后6个月时保持降低。未检测到不利的安全信号。B细胞水平在治疗后降低约40％，其比使用抗CD20mAb的经验值小很多。治疗后T细胞水平、免疫球蛋白和其它标准安全实验室测试与基线保持不变。在这些患者体内未发现HAHA的迹象。未见到自身抗体和其它疾病相关的实验室测试一致变化。
这引起称为ALLEVIATE I和ALLEVIATE II的两个III期研究(SL0003/SL0004；ClinicalTrials.gov注册号:NCT00111306和NCT00383214)，所述研究意图为48周、随机化、双盲、安慰剂对照试验，接着为针对美国患者的开放标记、长期、安全性研究(SL0006)。方案包括在四个连续的12周循环里用360或720mg/m2的依帕珠单抗对患者输注(除了包括皮质类固醇和免疫抑制剂的背景疗法以外)：第一个循环，在第0周、第1周、第2周和第3周给予四次输注；对于随后的三个再治疗循环，在第0周和第1周给予两次输注。第一功效终点为第12周的BILAG应答者分析，因为太少的患者完成最初意图的24位患者应答变量评价。应答者的BILAG A或BILAG B减少一个级别(没有新BILAG A或小于两个新B)，并且在治疗时期过程中没有引入免疫抑制或增加类固醇剂量。研究始于2005年，由于药物供应中止而使研究在2006年过早停止。此时，仅对90位患者研究了很久足以用于分析并且合并两个组。
在SL0006中，对总共29位美国患者给予开放标记随访疗法。受试者通常具有严重的狼疮：平均BILAG得分为13.2并且43％具有至少一个BILAG A。总体上，63％用免疫抑制剂并且43％每日用25mg或更多的泼尼松。总共91％接受四次输注并且69％在第24周接受。使用治疗意向分析，BILAG应答在第12周分别在360mg/m2组、720mg/m2组和安慰剂组中达到44.1％、20％和30.3％，其中在6周内见到应答。依帕珠单抗表现出显著的避免使用类固醇的性质并且与健康相关的生活品质改进有相互关系。所述改进持续在停留于开放标记随访中的那些人中。在不利事件或严重不利事件中未发现显著的组间差异。在治疗的患者中，B细胞消减为大约20％-40％。
EMBLEM为用于具有至少一个BILAG A和/或两个BILAG B的患者的六种不同给药方案中的IIb期、12周、双盲研究(ClinicalTrials.gov registry:NCT00624351)。此研究包括每日使用平均14mg泼尼松的具有平均总BILAG得分为15.2和平均SLE疾病活性指数为14.8的227位SLE患者，并且大多数患者还采用免疫抑制剂。因此研究参与者具有比在任何其它公布的狼疮临床试验中所见的更多的多系统疾病活性。针对泼尼松背景给予每周一次的四次输注、每隔一周的两次输注或安慰剂，并且大多数情况为针对免疫抑制疗法。接受组合剂量为2400mg的那些人具有有意义的和统计学显著的改进，其中37.9％实现了‘增强的BILAG改进’，因而记录至少两个级别(例如，A到C、B到D)的改进。此外，不存在安全信号或显著的免疫抑制。187位患者中仅有4位(2.1％)发展了HAHA。
EMBODY(由总共接近2000位患者的两个组群组成的关键48周试验)始于2010年12月(ClinicalTrials.gov registry:NCT01262365)。
使用维妥珠单抗的临床经验—我们已在超过80位现有疗法难治愈/复发的NHL患者体内研究了维妥珠单抗(包括利妥昔单抗)，并且发现在所概述的所有剂量下在FL患者体内具有43％目标应答和27％完全应答率，这看起来似乎是持久的(15-25个月)(Morchhauser等人,2009,J Clin Oncol 27:3346-3353)。甚至在80mg/m2的剂量下看到活性。重要地是，输注特征看起来似乎优于利妥昔单抗的输注特征，其中没有3-4等级的不良反应并且输注时间为<2h(与针对利妥昔单抗的4-8h相比)。也在B细胞淋巴瘤的皮下(SC)制剂中检测了维妥珠单抗(Negrea等人,2011,Haematologica 96:567-573)。
也在患有免疫性血小板减少症(ITP)的患者体内研究了维妥珠单抗(ClinicalTrials.gov registry:NCT00547066)，并且显示出在此疾病中为活性的，甚至在静脉内施用(两次，在第1周和第3周时)和皮下施用(数据未示出)低剂量时。41位患者在分开的2周内接受2次剂量的维妥珠单抗。维妥珠单抗为耐受良好的(限制的1-2等级瞬间反应，除了一个3等级输注反应)，不具有其它安全问题。在38位可评估患者中，先前仅用类固醇和/或免疫球蛋白治疗的患有新诊断疾病或持久性疾病(ITP≤1年)的9位患者具有7个(78％)应答(包括3(33％)CR和4(44％)PR)，而具有高达至31年的慢性疾病和另外现有疗法的29位患者具有20个(69％)应答(包括4(13％)CR和10(35％)PR)。对于27位应答者，复发的平均时间随着具有10个(37％)应答>1年的应答分类(进行在3.0-3.8年的3个)而增加(MR:2.4个月、PR:5.5个月、CR:14.4个月)。再治疗了8位响应者(其中3位再次实现PR)，包括1位再治疗4次。在所有剂量下的第一注射之后，IV和SC途径均消减了B细胞。8位患者发展了具有不确定临床意义的低HAHA滴度。因此，维妥珠单抗其自身在NHL和自身免疫疾病中均为有希望的治疗剂。
由DNL TM 制得的六价bsAb—已报道了22-(20)-(20)和20-(22)-(22)的分子工程化、产生、纯化和生物化学/生物表征(Rossi等人,2009,Blood 113:6161-6171)。还已公布了由22-(20)-(20)和20-(22)-(22)诱导的作用机制和细胞信号传导的详细说明(Gupta等人,2010,Blood 116:3258-3267)。重要发现如下。
22-(20)-(20)和20-(22)-(22)均保持其亲本Fab/IgG与能够同时结合的所有6个Fab的结合性质。竞争性ELISA显示每种构建体均拥有所设计的官能价态，并且每个Fab均与亲本mAb的那些亲和性类似的Fab结合。流式细胞计量术对活NHL细胞表现出双特异性结合，其中保留时间比亲本mAb更长。bsAb的内化速率极大地受价态和构成抗体的内化性质影响。确切来说，具有来自缓慢内化的维妥珠单抗的四个Fab和来自快速内化的依帕珠单抗的两个Fab的22-(20)-(20)行为上类似于维妥珠单抗，从而显示出缓慢的内化速率。相反，具有来自快速内化的依帕珠单抗的四个Fab和来自缓慢内化的维妥珠单抗的两个Fab的20-(22)-(22)展现出类似于依帕珠单抗的快速内化。
两种抗CD20/CD22 bsAb比单独或组合地维妥珠单抗或依帕珠单抗更有效地诱导半胱天冬酶依赖型凋亡。尽管并入维妥珠单抗(其单独表现出有效的CDC)，但任一种bsAb能够诱导CDC。这两种bsAb均展现出ADCC，其中20-(22)-(22)比22-(20)-(20)更有效，可能由于在正常B细胞和NHL中CD20比CD22的密度更高以及维妥珠单抗比依帕珠单抗更有效地介导ADCC的事实。
bsAb在没有固定(对于依帕珠单抗而言需要)或与第二抗体超高交联(对于维妥珠单抗而言需要)的情况下抑制淋巴瘤细胞。此种直接的细胞毒性在Daudi伯基特淋巴瘤细胞中比存在固定或超高交联情况下的亲本mAb的组合更有效约50倍。在Raji细胞和Ramos细胞中，22-(20)-(20)比20-(22)-(22)更有效8倍至10倍，而所述20-(22)-(22)比亲本Ab的组合更有效8倍至10倍。因此，22-(20)-(20)可比在存在其它因子如效应细胞的情况下在体外以组合的形式给予的亲本mAb更有效100倍。
这两种bsAb均诱导CD22(以及CD20)扩大易位到脂筏(lipid raft)中。这两种bsAb在淋巴瘤细胞中均诱导强同质粘附，而在相同条件下亲本mAb为无效的，从而表明交联的CD20和CD22引起同质粘附，所述同质粘附可有助于增强体外细胞毒性。
Pk分析显示bsAb在小鼠体内的循环半衰期比亲本mAb的循环半衰期短2-3倍。小鼠体内的生物分布研究显示这两种bsAb均具有类似于维妥珠单抗和依帕珠单抗的组织吸收(tissue uptake)，从而表明bsAb因为在正常组织中吸收增加而不比其亲本mAb更快速地清除。
Daudi异种移植物中的体内研究显示20-(22)-(22)尽管具有更短的血清半衰期，但具有与等摩尔维妥珠单抗可比的抗肿瘤功效。虽然22-(20)-(20)的效力比20-(22)-(22)小，但它仍比依帕珠单抗和对照bsAb更有效。bsAb的极大增强的直接毒性与其改变涉及调节细胞生长、存活和凋亡的各种细胞内蛋白质的基础表达的能力相关，与导致细胞死亡的最终结果相关。在离体环境下，22-(20)-(20)和20-(22)-(22)均使来自健康志愿者全血的NHL细胞以及正常B细胞消减。
因为Pk分析显示CH3-HexAb在小鼠体内的循环半衰期比亲本mAb的循环半衰期短2-3倍，所以我们已开发出具有改进Pk目标的替代Ck-HexAb形式。在以上实施例1中的研究表明针对基于CH3的HexAb所观察到的血液清除速率增加是由于额外Fab基团的位置处于Fc的末端，从而干扰新生儿Fc受体(FcRn)(所述新生儿Fc受体负责在胞吞作用之后使IgG再循环)的结合(和/或释放)，产生极大延长的Pk。事实上，与22-(20)-(20)相比，22*-(20)-(20)展现出明显优越的Pk(实施例1)。在正常小鼠体内皮下注射之后，与22-(20)-(20)相比22*-(20)-(20)实现大两倍的Cmax和长三倍的循环半衰期，从而产生大三倍的曲线下面积。另外，经过整个5天的Pk研究，发现22*-(20)-(20)在体内高度稳定。这明显是因为两种不同ELISA形式，所述ELISA形式中的一种检测任何形式的依帕珠单抗，并且另一种仅定量基本上重叠Pk曲线而产生的完整22*-(20)-(20)。
SLE中的使用
选择22*-(20)-(20)DNLTM构建体为了在SLE中治疗使用。22*-(20)-(20)衍生自维妥珠单抗(人源化抗CD20单克隆抗体(mAb))和依帕珠单抗(人源化抗CD22mAb)以形成具有附着至依帕珠单抗的一个IgG的维妥珠单抗的四个Fab片段的共价缀合物(参见实施例1)。依帕珠单抗和维妥珠单抗均在自身免疫疾病中示出临床活性，并且与这两种mAb的组合疗法将比作为单一疗法的任一种情况更有效。使用两种不同作用机制(由抗CD20mAb引起的B细胞消减和由抗CD22mAb引起的B细胞调节)的更有效疗法通过使用能够靶向CD20和CD22的双特异性抗体来完成，这比目前需要患者在每个疗程中均输注许多小时的依次施用两种不同mAb更方便和更经济。
在SCID小鼠模型中评价了作为用于SLE的治疗剂22*-(20)-(20)的用途，其中用来自SLE患者的外周血淋巴细胞(PBL)植入动物(Mauermann等人,2004,Clin Exp Immunol 137:513-520)。通过监测抗dsDNA抗体的血清水平、SLE的特征标志单独和组合地将bsAb的功效与依帕珠单抗和维妥珠单抗比较。
从SLE患者中收集血液样品。为了植入，将获自单独SLE患者的3x107个PBL腹膜内(i.p.)注射到8至10周龄雌性SCID小鼠中。因此，每个动物均代表单独的狼疮患者。大约三分之二的小鼠得到成功植入，有迹象表明在2周内产生浓度≥100μg/mL的人抗体，在4周内产生达到峰值。使用具有植入迹象的小鼠来治疗。为了监测治疗作用，在第24天、第34天、第44天和第54天对小鼠取血，并且通过ELISA或蛋白A HPLC测试血清中总hIgG、抗dsDNA(狼疮疾病病况的度量)以及抗破伤风类毒素抗体的存在(以便证明功能性人体液免疫系统)。
使用涂覆有聚L-赖氨酸(5mg/ml，Sigma,St.Louis,MO,USA)、接着用λ噬菌体dsDNA(5mg/孔，Boehringer Mannheim,Germany)涂覆的maxisorb 96孔微量滴定板确定受体小鼠血清中作为SLE的指示物的人抗dsDNA抗体。用10％胎牛血清(FCS)的PBS封闭板并且用小鼠血清(1:1-5:40稀释的)孵育2h。用缀合至辣根过氧化物酶(Jackson)的山羊抗人IgG抗体检测结合抗dsDNA。
检验了使用22*-(20)-(20)DNLTM对SLE小鼠的作用。在体外使用22-(20)-(20)bsAb的现有研究发现其在大约1nM(大约350μg/mL)的浓度下对杀死人B细胞淋巴瘤细胞系有效，并且在体内一周三次10μg剂量的22-(20)-(20)控制了SCID小鼠体内IV移植的Daudi B细胞淋巴瘤细胞系的过生长(Rossi等人,2009,Blood 113:6161-6171)。然而，在离体情况下，bsAb在杀死正常B细胞方面有效性较小(图10)。基于这些结果，SLE植入的SCID小鼠最初用400μg的22*-(20)-(20)腹膜内治疗，每周两次持续2周(在第14天开始)。如果滴度复原，启动第二治疗循环，持续直到在第60天研究结束。如果在400μg下的疾病控制在2周治疗之后不充分，不间断随后给予400μg的动物组治疗，继续持续4周。如果在用400μg治疗2周之后疾病控制显著改进，接着为使用相同的每周两次方案持续2周的40μg较低剂量的观察期。相等数量的动物仅接受赋形剂(缓冲液)给予，以使得建立用于疾病进展的基线。我们的目的为了使用显著减少抗体产生、蛋白尿和肾损伤迹象的最小剂量建立治疗方案。除了缓冲液对照以外，确定了22*-(20)-(20)的亲本mAb、依帕珠单抗、维妥珠单抗及依帕珠单抗和维妥珠单抗IgG的组合以及维妥珠单抗-DDD2(二价Fab)的作用，每种均以等摩尔量并且根据相同给药方案作为22*-(20)-(20)测试组给出。
治疗组之间的主要比较物为治疗后的抗dsDNA抗体血清滴度的变化。基于Maurermann等使用此模型系统的结果，对照小鼠体内的抗dsDNA滴度在缓慢下降之前在第30至第40天时达到峰值。成功的疗法产生低很多的Cmax和抗dsDNA滴度更快速下降至低于疗法开始时的那些水平。针对每个动物均测量了从第14天至第70天的Cmax和抗dsDNA滴度的变化(ΔC70/14)。在疗法研究结束时，评价动物的蛋白尿和炎症性肾小球肾炎作为疾病进展或控制的另外度量。
观察到，用400μg剂量的22*-(20)-(20)每周两次持续四周治疗的SLE小鼠显示出与缓冲液对照、单独施用的依帕珠单抗或维妥珠单抗、或以相同摩尔剂量和方案作为22*-(20)-(20)施用时的依帕珠单抗和维妥珠单抗的组合相比抗dsDNA滴度显著减小，并且具有较低水平的蛋白尿和炎症性肾小球肾炎。
实施例3.用于对接和锁定TM的一般技术
以下讨论的一般技术用来产生具有附着至抗体重链的C-末端的AD或DDD部分的DNLTM复合物。如在以上实施例1中所述构建轻链附接的AD部分。除了优越的Pk、体内稳定性和改进的功效之外，发现Ck DNLTM构建体起到与其CH对应物类似的作用。
表达载体
已使用质粒载体pdHL2来产生许多抗体和基于抗体的构建体。参见Gillies等人,J Immunol Methods(1989),125:191-202；Losman等人,Cancer(Phila)(1997),80:2660-6。双顺反子哺乳动物表达载体引导IgG的重链和轻链的合成。许多不同IgG-pdHL2构建体的载体序列大部分相同，仅有的差异存在于可变结构域(VH和VL)序列中。使用本领域技术人员已知的分子生物学工具，可将这些IgG表达载体转化成Fab-DDD或Fab-AD表达载体。
为了产生Fab-DDD表达载体，将重链的铰链、CH2和CH3结构域的编码序列用编码铰链的前4个残基、14个残基的Gly-Ser接头和DDD部分如人RIIα的前44个残基(称为DDD1,SEQ ID NO:1)的序列替代。为了产生Fab-AD表达载体，将IgG的铰链、CH2和CH3结构域的序列用编码铰链的前4个残基、15个残基的Gly-Ser接头和AD部分如称为AKAP-IS的17个残基的合成AD(称为AD1,SEQ IDNO:3)的序列替代，所述17个残基的合成AD使用生物信息学和肽阵列技术产生并且显示以非常高的亲和性(0.4nM)结合RIIα二聚体。参见Alto等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A(2003),100:4445-50。设计两个穿梭载体以促进IgG-pdHL2载体转化为Fab-DDD1或Fab-AD1表达载体，如下所述。
CH1的制备
使用pdHL2质粒载体作为模板，通过PCR扩增CH1结构域。左侧PCR引物由CH1结构域的上游(5’)端和SacII限制核酸内切酶位点组成，所述SacII限制核酸内切酶位点为CH1编码序列的5’端。右侧引物由编码铰链前4个残基的序列(PKSC,SEQ ID NO:123)组成，所述残基后面为4个甘氨酸和丝氨酸，其中最后两个密码子(GS)包含Bam HI限制位点。将410 bp PCR扩增引物克隆到PCR克隆载体(Inc.)中，并且以T7(5’)方向针对插入物筛选克隆。
合成双链寡核苷酸以编码DDD1的氨基酸序列，所述氨基酸序列前面为接头肽的11个残基，其中前两个密码子包含BamHI限制位点。终止密码子和EagI限制位点附接至3’端。编码的多肽序列在以下示出。
GSGGGGSGGGGSHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：124)
合成在其3’端上有30个碱基对重叠的命名为RIIA1-44上和RIIA1-44下的两个寡核苷酸，并且组合所述寡核苷酸以包含174bpDDD1序列的中心154个碱基对。使寡核苷酸退火并且用Taq聚合酶进行引物延伸反应。在引物延伸后，通过PCR扩增双链体。将扩增引物克隆到中，并且以T7(5’)方向针对插入物进行筛选。
合成双链寡核苷酸以编码AD1的氨基酸序列，所述氨基酸序列前面为接头肽的11个残基，其中前两个密码子包含BamHI限制位点。终止密码子和EagI限制位点附接至3’端。编码的多肽序列在以下示出。
GSGGGGSGGGGSQIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：125)
合成编码以上肽序列的两个互补重叠的寡核苷酸(命名为AKAP-IS上和AKAP-IS下)并且使其退火。通过PCR扩增双链体。将扩增引物克隆到载体中并且以T7(5’)方向针对插入物进行筛选。
连接DDD1与CH1
用BamHI和NotI限制酶将编码DDD1序列的190bp片段从中切除并且然后连接到中的相同位点中以产生穿梭载体
连接AD1与CH1
用BamHI和NotI将含有AD1序列的110bp片段从中切除并且然后连接到中的相同位点中以产生穿梭载体
使用此模块设计，可将CH1-DDD1或CH1-AD1并入到pdHL2载体中的任何IgG构建体中。通过从pdHL2去除SacII/EagI限制性片段(CH1-CH3)并且将其替代为从对应穿梭载体切除的CH1-DDD1或CH1-AD1的SacII/EagI片段而将整个重链恒定结构域替代为以上构建体之一。
C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2
C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2为用于产生C-DDD2-Fab-hMN-14的表达载体，其具有DDD2的二聚化和停靠结构域序列(SEQ ID NO:2)，所述DDD2经过14个氨基酸残基Gly/Ser肽接头附接至hMN-14的Fd羧基末端。所分泌的融合蛋白主要由通过DDD2结构域的非共价相互作用保持在一起的两个相同拷贝的hMN-14 Fab构成。
表达载体工程化如下。合成制得包含部分接头肽和DDD2的残基1-13的编码序列的两个重叠互补寡核苷酸。使寡核苷酸退火并且用T4 PNK磷酸化，在5’端和3’端产生分别与用限制核酸内切酶BamHI和PstI消化的DNA连接相容的突出端。
使双链DNA与通过用BamHI和PstI消化而制备的穿梭载体连接以产生穿梭载体用SacII和EagI从中切除507bp片段，并且将其与通过用SacII和EagI消化而制备的IgG表达载体hMN-14(I)-pdHL2连接。最终的表达构建体命名为C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2。已利用类似的技术产生许多不同人源化抗体的Fab片段的DDD2-融合蛋白。
h679-Fd-AD2-pdHL2
h679-Fab-AD2被设计与C-DDD2-Fab-hMN-14配对。h679-Fd-AD2-pdHL2为用于产生h679-Fab-AD2的表达载体，所述表达载体拥有经过14个氨基酸残基的Gly/Ser肽接头附接至CH1结构域羧基末端的AD2的锚定结构域序列(SEQ ID NO:4)。AD2在AD1的锚定结构域序列之前具有一个半胱氨酸残基并且在其之后具有另一个半胱氨酸残基。
表达载体工程化如下。合成制得包含AD2和部分接头序列的编码序列的两个重叠互补寡核苷酸(AD2上和AD2下)。使寡核苷酸退火并且用T4 PNK磷酸化，从而在5'端和3'端上产生与分别用限制性核酸内切酶BamHI和SpeI消化的DNA连接相容的突出端。
将双链DNA连接到通过用BamHI和SpeI消化而制备的穿梭载体中以产生穿梭载体用SacII和EagI限制酶将含有CH1和AD2编码序列的429碱基对片段从穿梭载体中切除，并且将其连接到通过用这些相同的酶消化而制备的h679-pdHL2载体中。最终的表达载体为h679-Fd-AD2-pdHL2。
产生TF2 DNL TM 构建体
通过使C-DDD2-Fab-hMN-14与h679-Fab-AD2反应获得命名为TF2的三聚DNLTM构建体。如下以>90％产率产生TF2的试验批次。将蛋白L-纯化的C-DDD2-Fab-hMN-14(200mg)与h679-Fab-AD2(60mg)以1.4:1的摩尔比混合。总蛋白质浓度为在含有1mM EDTA的PBS中1.5mg/ml。后续步骤包括TCEP还原、HIC色谱法、DMSO氧化以及IMP 291亲和色谱法。在添加TCEP之前，SE-HPLC未显示任何a2b形成的迹象。添加5mM TCEP快速引起与针对二元结构预期的157kDa蛋白质一致的a2b复合物形成。通过IMP 291亲和色谱法将TF2纯化至接近均质(未示出)。IMP 291为含有679Fab结合到其上的HSG半抗原的合成肽(Rossi等人，2005,Clin Cancer Res11:7122s-29s)。IMP 291未结合部分的SE-HPLC分析证明a4、a2和游离κ链从产物中去除(未示出)。
通过测定确定TF2的功能性。将TF2、C-DDD1-hMN-14+h679-AD1(用作非共价a2b复合物的对照样品)或C-DDD2-hMN-14+h679-AD2(用作未还原a2和b组分的对照样品)稀释至1μg/ml(总蛋白质)并且流经固定有HSG的传感器芯片。TF2的应答大约为两个对照样品的应答的两倍，从而表明对照样品中仅h679-Fab-AD组分将结合并保留于传感器芯片上。随后注射WI2IgG、针对hMN-14的抗独特型抗体证明仅TF2具有与h679-Fab-AD紧密缔合的DDD-Fab-hMN-14组分，如另外的信号应答所指示。由WI2与固定于传感器芯片上的TF2结合引起的应答单位的额外增加与各自由C-DDD2-Fab-hMN-14的一个亚基促成的两个完全功能性结合位点相符。此由TF2结合WI2的两个Fab片段的能力所证实(未示出)。
产生TF10 DNL TM 构建体
使用类似方案产生包含两个拷贝C-DDD2-Fab-hPAM4和一个拷贝C-AD2-Fab-679的三聚TF10 DNLTM构建体。使用如上所述针对产生(抗CEA)2x抗HSG bsAb TF2所公开的方法产生TF10双特异性([hPAM4]2x h679)抗体。TF10构建体携带两个人源化PAM4Fab和一个人源化679Fab。
在稳定转染的骨髓瘤细胞中独立地表达两个融合蛋白(hPAM4-DDD2和h679-AD2)。组合组织培养上清液，从而产生两倍摩尔过量的hPAM4-DDD2。在室温下在使用1mM还原型谷胱甘肽的温和还原条件下孵育反应混合物24小时。还原之后，通过使用2mM氧化型谷胱甘肽温和氧化来完成反应。通过亲和色谱法使用IMP291亲和凝胶树脂分离TF10，所述树脂以高特异性结合h679 Fab。
实施例4.从多个抗体产生AD连接和DDD连接的Fab和IgG融合蛋白
使用前述实施例中描述的技术，构建表10中所示的IgG和Fab融合蛋白并且并入DNLTM构建体中。融合蛋白保留了亲本抗体的抗原结合特征，并且DNLTM构建体展现出所并入的抗体或抗体片段的抗原结合活性。
表10.包含IgG或Fab的融合蛋白
融合蛋白 结合特异性
C-AD1-Fab-h679 HSG
C-AD2-Fab-h679 HSG
C-(AD)2-Fab-h679 HSG
C-AD2-Fab-h734 铟-DTPA
C-AD2-Fab-hA20 CD20
C-AD2-Fab-hA20L CD20
C-AD2-Fab-hL243 HLA-DR
C-AD2-Fab-hLL2 CD22
N-AD2-Fab-hLL2 CD22
C-AD2-IgG-hMN-14 CEACAM5
C-AD2-IgG-hR1 IGF-1R
C-AD2-IgG-hRS7 EGP-1
C-AD2-IgG-hPAM4 MUC
C-AD2-IgG-hLL1 CD74
C-DDD1-Fab-hMN-14 CEACAM5
C-DDD2-Fab-hMN-14 CEACAM5
C-DDD2-Fab-h679 HSG
C-DDD2-Fab-hA19 CD19
C-DDD2-Fab-hA20 CD20
C-DDD2-Fab-hAFP AFP
C-DDD2-Fab-hL243 HLA-DR
C-DDD2-Fab-hLL1 CD74
C-DDD2-Fab-hLL2 CD22
C-DDD2-Fab-hMN-3 CEACAM6
C-DDD2-Fab-hMN-15 CEACAM6
C-DDD2-Fab-hPAM4 MUC
C-DDD2-Fab-hR1 IGF-1R
C-DDD2-Fab-hRS7 EGP-1
N-DDD2-Fab-hMN-14 CEACAM5
实施例5.用于siRNA的抗体-树枝状聚合物DNLTM复合物
阳离子聚合物(如基于聚赖氨酸、聚乙烯亚胺或聚酰胺-胺(PAMAM)的树枝状聚合物)与核酸形成复合物。然而，其作为用于递送治疗性基因或si删A的非病毒载体的潜在应用仍存在挑战。一种改进树枝状聚合物纳米颗粒的选择性和效力的方法可通过与在结合靶细胞时内化的抗体缀合来实现。
我们合成并且表征了一种新型免疫缀合物(命名为E1-G5/2)，其通过DNLTM方法制得以包含一半第5代(G5)PAMAM树枝状聚合物(G5/2)位点特异性连接至来源于在结合至表达于各种实体癌上的Trop-2抗原时快速内化的人源化抗体hRS7的Fab的稳定化二聚体。
方法
通过在温和氧化还原条件下组合两个自组装模块AD2-G5/2和hRS7-Fab-DDD2，接着在蛋白L柱上纯化来制备E1-G5/2。为制得AD2-G5/2，我们用马来酰亚胺基团对AD2肽衍生化以与通过用胱胺核心还原G5PAMAM产生的单个硫醇反应，并且使用反相HPLC来分离AD2-G5/2。我们在骨髓瘤细胞中将hRS7-Fab-DDD2产生为融合蛋白，如在以上实施例中所述。
通过大小排阻HPLC、SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析E1-G5/2的分子大小、纯度和组成。通过与对抗hRS7的抗独特型抗体结合、凝胶阻滞测定和DNA酶保护测定来评估E1-G5/2的生物功能。
结果
通过大小排阻HPLC显示E1-G5/2由侧接有若干次峰(未示出)的主峰(>90％)组成。E1-G5/2的三个组分(Fd-DDD2、轻链和AD2-G5/2)通过还原性SDS-PAGE检测并且通过蛋白质印迹法证实(未示出)。抗独特型结合分析显示E1-G5/2含有一群大小不同的抗体-树枝状聚合物缀合物，所有所述缀合物均能够识别抗独特型抗体，从而表明所购得的G5树枝状聚合物具有大小的结构变化性(未示出)。凝胶阻滞测定显示E1-G5/2能够以6:1(+/-)的配料比最大程度地浓缩质粒DNA，其中所得树枝状聚合物复合物(dendriplex)完全保护所复合的DNA免遭DNA酶I降解(未示出)。
结论
可使用DNLTM技术来构造可用抗体靶向的基于树枝状聚合物的纳米颗粒。所述药剂作为用于在体外和体内应用的药物、质粒或siRNA的载体具有改进的性质。在优选的实施方案中，可利用抗B细胞抗体(如抗CD20和/或抗CD22)将细胞毒性或细胞抑制性siRNA物质递送至靶向的B细胞用于治疗淋巴瘤、白血病、自身免疫疾病或其它疾病和病状。
实施例6.使用鱼精蛋白连接的抗体靶向递送siRNA
概述
在临床前研究中已显示RNA干扰(RNAi)下调如HER2、VEGF、Raf-1、bcl-2、EGFR和众多其它蛋白质等各种蛋白质的表达。尽管RNAi具有使特定基因沉默的潜力，但是RNAi的全部治疗潜力仍因缺乏用于在体内递送至靶细胞的有效递送系统而有待实现。
为解决此关键需要，我们开发了具有多个拷贝的人鱼精蛋白系栓于肿瘤靶向内化hRS7(抗Trop-2)抗体的新型DNLTM构建体以用于在体内靶向递送siRNA。产生包含截短的人鱼精蛋白(thP1，人鱼精蛋白1的残基8至29)的DDD2-L-thP1模块，其中DDD2和thP1的序列分别融合至人源化抗体轻链的N-末端和C-末端(未示出)。截短的hP1(thP1)的序列在以下示出。如以上实施例中所述，DDD2-L-thP1与抗体hRS7-IgG-AD2在温和氧化还原条件下的反应引起E1-L-thP1复合物形成(未示出)，所述E1-L-thP1复合物包含附着至hRS7重链的羧基末端的四个拷贝的thP1。
tHP1
RSQSRSRYYRQRQRSRRRRRRS(SEQ ID NO：126)
通过大小排阻HPLC和SDS-PAGE确定蛋白A纯化后的E1-L-thP1的纯度和分子完整性(未示出)。另外，通过凝胶迁移测定证明E1-L-thP1结合质粒DNA或siRNA的能力(未示出)。E1-L-thP1有效结合短双链寡核苷酸(未示出)和保护所结合的DNA免遭添加至样品中或存在于血清中的核酸酶消化(未示出)。
通过荧光显微术使用FITC缀合的siRNA和人Calu-3肺癌细胞系证实E1-L-thP1构建体使siRNA内化到表达Trop-2的癌细胞中的能力(未示出)。
方法
采用DNLTM技术产生E1-L-thP1。在骨髓瘤细胞中表达如以上实施例中所述构建的hRS7 IgG-AD模块并且使用蛋白A亲和色谱法从培养物上清液中纯化。在骨髓瘤细胞中DDD2-L-thP1模块表达为融合蛋白并且通过蛋白L亲和色谱法纯化。因为CH3-AD2-IgG模块拥有两个AD2肽并且每个均可结合DDD2二聚体，其中每个DDD2单体附着至鱼精蛋白部分，所以所得E1-L-thP1缀合物包含四个鱼精蛋白基团。E1-L-thp1由组分模块以接近定量产率形成并且用蛋白A纯化至接近均质(未示出)。
使用蛋白L亲和色谱法纯化DDD2-L-thP1并且通过大小排阻HPLC分析和还原与非还原条件下的SDS-PAGE来评价(数据未示出)。在9.6min时观察到主峰(未示出)。SDS-PAGE显示在还原性凝胶中主带在30kDa与40kDa之间，而在非还原性凝胶中主带为约60kDa(指示DDD2-L-thP1的二聚体形式)(未示出)。蛋白质印迹法的结果证实在用抗DDD抗体探测时存在单体DDD2-L-tP1和二聚DDD2-L-tP1(未示出)。
为了制备E1-L-thP1，将hRS7-IgG-AD2与DDD2-L-thP1以大致相等的量组合并且添加还原型谷胱甘肽(最终浓度1mM)。在室温下孵育过夜之后，添加氧化型谷胱甘肽(最终浓度2mM)并且再继续孵育24h。通过蛋白A柱色谱法从反应混合物中纯化E1-L-thP1并且用0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH 3.5)洗脱。中和产物峰(未示出)，浓缩，用PBS透析，过滤并且在2℃至8℃下储存于含有5％甘油的PBS中。通过还原性SDS-PAGE证实E1-L-thP1的组成(未示出)，所述还原性SDS-PAGE显示存在所有三种组分(AD2附接的重链、DDD2-L-htP1和轻链)。
DDD2-L-thP1和E1-L-thP1结合DNA的能力通过凝胶迁移测定来评价。DDD2-L-thP1在摩尔比为6或更高时阻滞1％琼脂糖中500ng线性形式的3kb DNA片段的迁移(未示出)。E1-L-thP1在摩尔比为4或更高时阻滞2％琼脂糖中250ng线性200bp DNA双链体的迁移(未示出)，然而针对单独的hRS7-IgG-AD2未观察到此种作用(未示出)。E1-L-thP1保护结合的DNA免遭外源性DNA酶和血清核酸酶降解的能力也得到证明(未示出)。
在表达Trop-2的ME-180子宫颈细胞系中检查E1-L-thP1促进结合的siRNA内化的能力(未示出)。使用FITC缀合的山羊抗人抗体监测E1-L-thP1复合物的内化。单独的细胞未显示荧光(未示出)。单独添加经过FITC标记的siRNA引起siRNA的最低程度内化(未示出)。在37℃下、在60min里观察到单独的E1-L-thP1的内化(未示出)。E1-L-thP1能够有效地促进结合的FITC-缀合的siRNA内化(未示出)。将E1-L-thP1(10μg)与FITC-siRNA(300nM)混合并且允许其形成E1-L-thP1-siRNA复合物，然后将其添加至表达Trop-2的Calu-3细胞中。在37℃下孵育4h之后，通过荧光显微术检查细胞的siRNA内化(未示出)。
检验E1-L-thP1通过siRNA内化诱导凋亡的能力。将E1-L-thP1(10μg)与不同量的siRNA(AllStars Cell Death siRNA,Qiagen,Valencia,CA)混合。将E1-L-thP1-siRNA复合物添加至ME-180细胞中。孵育72h之后，用胰蛋白酶处理细胞并且进行膜联蛋白V染色以评价凋亡。单独Cell Death siRNA或单独E1-L-thP1对凋亡无影响(未示出)。添加递增量的E1-L-thP1-siRNA产生凋亡的剂量依赖性增加(未示出)。这些结果表明E1-L-thP1可有效地将siRNA分子递送到细胞中并且诱导靶细胞的凋亡。
结论
DNLTM技术提供有效地将多个鱼精蛋白分子系栓于抗Trop-2hRS7抗体从而产生新型分子E1-L-thP1的模块化方法。SDS-PAGE显示出E1-L-thP1的均质性和纯度。DNA酶保护和凝胶迁移测定显示E1-L-thP1的DNA结合活性。E1-L-thP1同亲本hRS7抗体一样内化于细胞中并且能够有效地使siRNA分子内化到表达Trop-2的细胞中，如ME-180和Calu-3。
熟练技术人员将认识到，DNLTM技术并不限于任何特定抗体或siRNA种类。而是，可使用与本文所示相同的方法和组合物来制得包含任何抗体(例如，抗CD20或抗CD22)、任何siRNA载体和任何siRNA种类的靶向递送复合物。在靶向递送复合物中使用二价IgG将产生延长的循环半衰期和较高的对靶细胞的结合亲合力，从而引起吸收增加和功效改进。
实施例7.包含缀合至B细胞靶向抗体的四倍豹蛙酶(Rap)的基于核糖核酸酶的DNLTM免疫毒素
我们应用DNLTM方法产生一类新型的免疫毒素，每种所述免疫毒素均包含位点特异性连接至二价IgG的四个拷贝的Rap。我们使在大肠杆菌中产生的重组Rap-DDD模块与重组人源化IgG-AD模块组合，所述重组人源化IgG-AD模块经过结合CD20(hA20，维妥珠单抗)、CD22(hLL2，依帕珠单抗)或HLA-DR(hL243，IMMU-114)分别产生20-Rap、22-Rap和C2-Rap而在骨髓瘤细胞和靶向B细胞淋巴瘤和白血病中产生。针对每个构建体，Rap的二聚体共价系栓于各自IgG的每条重链的C-末端。类似地使用与在B细胞淋巴瘤/白血病上不表达的抗原(CEACAM5)结合的拉贝珠单抗(hMN-14)制得对照构建体14-Rap。
Rap-DDD2
pQDWLTFQKKHITNTRDVDCDNIMSTNLFHCKDKNTFIYSRPEPVKAICKGIIASKNV LTTSEFYLSDCNVTSRPCKYKLKKSTNKFCVTCENQAPVHFVGVGSCGGGGSLECGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARAVEHHHHHH(SEQID NO：127)
以上示出分泌的Rap-DDD2的推断出的氨基酸序列(SEQ IDNO:127)。Rap，加下划线；接头，斜体；DDD2，粗体；pQ，转化为焦谷氨酸的氨基末端谷氨酰胺。Rap-DDD2呈包涵体形式在大肠杆菌中产生，所述包涵体在变性条件下通过IMAC纯化，再折叠并且然后在通过Q-Sepharose阴离子交换色谱法纯化之前透析到PBS中。在还原性条件下的SDS-PAGE分辨出具有适合于Rap-DDD2的Mr(18.6kDa)的蛋白质带(未示出)。纯化的Rap-DDD2的最终产率为10mg/L的培养物。
采用DNLTM方法快速产生一组IgG-Rap缀合物。在骨髓瘤细胞中表达IgG-AD模块并且使用蛋白A亲和色谱法从培养物上清液中纯化。产生Rap-DDD2模块并且与IgG-AD2混合以形成DNLTM复合物。因为CH3-AD2-IgG模块拥有两个AD2肽并且每个肽均可系栓Rap二聚体，所以所得IgG-Rap DNLTM构建体包含四个Rap基团和一个IgG。几乎定量地从组成模块中形成IgG-Rap并且使用蛋白A纯化至接近均质。
在DNLTM反应之前，CH3-AD2-IgG呈单体和二硫键连接的二聚体形式存在(未示出)。在非还原性条件下，IgG-Rap分辨呈在针对单体CH3-AD2-IgG与二聚CH3-AD2-IgG之间预期大小的高分子量带群集(未示出)。使缀合物还原至其组成多肽的还原性条件显示出IgG-Rap的纯度，并且使DNLTM方法与仅代表重链-AD2(HC-AD2)、κ轻链和Rap-DDD2的带的一致性可视化(未示出)。
反相HPLC分析22-Rap(未示出)分辨出在代表单体(7.55min)形式和二聚体(8.00min)形式的CH3-AD2-IgG-hLL2的两个峰之间洗脱的在9.10min处的单个蛋白质峰。Rap-DDD2模块分离呈二聚体和四聚体的混合物形式(在DNLTM过程中还原成二聚体)，所述二聚体和四聚体分别在9.30min和9.55min处洗脱(未示出)。
通过将使用C8柱的反相HPLC与ESI-TOF质谱法偶联来完成22-Rap的LC/MS分析(未示出)。未修饰的22-Rap的光谱鉴定出除了一些微量糖形以外的具有两个G0F(G0F/G0F)或一个G0F加一个G1F(G0F/G1F)N-连接的聚糖的两种主要物质(未示出)。酶促去糖基化产生与22-Rap的计算质量一致的单一去卷积质量(未示出)。在用TCEP还原之后所得的光谱鉴定出用具有G0F或G1F结构的N-连接聚糖修饰的重链-AD2多肽以及另外的微量形式(未示出)。包含22-Rap的三个亚基多肽各自均在还原性和去糖基化的样品的去卷积光谱中鉴定出来(未示出)。结果证实了Rap-DDD2多肽和HC-AD2多肽具有转化为焦谷氨酸的氨基末端谷氨酰胺(pQ)；因此22-Rap具有由pQ修饰的8个组分多肽中的6个。
在三个NHL细胞系中评价体外细胞毒性。每个细胞系均在与CD22相比相当高的表面密度下表达CD20；然而hLL2(抗CD22)的内化速率比hA20(抗CD20)更快。14-Rap与22-Rap和20-Rap共有相同的结构，但其抗原(CEACAM5)不通过NHL细胞表达。使用呈单一药剂的IgG-Rap或使用亲本MAb加rRap的组合连续处理细胞。在1nM以上的浓度下，20-Rap和22-Rap杀死每个细胞系，从而表明其作用为仅仅细胞抑制性相反的细胞毒性的(未示出)。20-Rap为最有效的IgG-Rap，从而表明抗原密度可比内化速率更重要。对于Daudi和Ramos而言获得类似结果，其中20-Rap(EC50大约为0.1nM)比22-Rap更有效3-6倍(未示出)。利妥昔单抗耐受性的套细胞淋巴瘤系(Jeko-1)展现出与Daudi和Ramos相比增加的CD20但减小的CD22。重要地，在Jeko-1中20-Rap展现出非常有效的细胞毒性(EC50大约为20pM)，所述细胞毒性比22-Rap更有效25倍(未示出)。
DNLTM方法提供了有效地将多个细胞毒素系栓在靶向抗体上，从而产生由于改进的药物代谢动力学和靶向特异性而预期显示更高的体内效力的新型免疫毒素的模块方法。LC/MS、RP-HPLC和SDS-PAGE显示出IgG-Rap的均质性和纯度。使具有MAb的Rap靶向细胞表面抗原增强了其肿瘤特异性细胞毒素。抗原密度和内化速率为观察到的IgG-Rap的体外功效的关键因素。体外结果显示CD20靶向、CD22靶向或HLA-DR靶向的IgG-Rap对治疗B细胞淋巴瘤和白血病具有有效的生物活性。
实施例8.包含两种不同抗体部分和细胞因子的DNLTM构建体的产生和使用
在某些实施方案中，三聚DNLTM构建体可包含三种不同效应子部分，例如两种不同抗体部分和一种细胞因子部分。我们在此报道了命名为20-C2-2b的第一双特异性MAb-IFNα的产生和表征，所述20-C2-2b包含IFN-α2b的两个拷贝和位点特异性连接至维妥珠单抗(人源化抗CD20)的hL243(人源化抗HLA-DR；IMMU-114)的稳定F(ab)2。在体外，20-C2-2b抑制四个淋巴瘤细胞系和八个骨髓瘤细胞系中的每一种，并且比单特异性CD20靶向的MAb-IFNα或包含亲本抗体和IFNα的混合物在除一个外全部(HLA-DR-/CD20-)骨髓瘤系中更有效(未示出)，从而表明20-C2-2b应当在治疗各种造血病症中有用。20-C2-2b显示出比仅靶向HLA-DR或CD20的单特异性MAb-IFNα更大的对抗KMS12-BM(CD20+/HLA-DR+骨髓瘤)的细胞毒性(未示出)，从而表明20-C2-2b中的所有三种组分可对毒性有影响。我们的发现表明给定细胞对MAb-IFNα的应答性取决于其对IFNα和特异性抗体的敏感性以及靶向抗原的表达和密度。
因为20-C2-2b具有抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)而非CDC，并且可靶向CD20和HLA-DR，所以它对治疗表达任一种或两种抗原的广范围的造血病症有用。
抗体
用于以下讨论中的缩写为：20(CH3-AD2-IgG-v-mab，抗CD20 IgGDNLTM模块)；C2(CH1-DDD2-Fab-hL243，抗HLA-DR Fab2DNLTM模块)；2b(二聚IFNα2B-DDD2 DNLTM模块)；734(用作非靶向对照的抗铟-DTPA IgG DNLTM模块)。以下MAb由Immunomedics,Inc.提供：维妥珠单抗或v-mab(抗CD20 IgG1)、hL243γ4p(Immu-114，抗HLA-DR IgG4)、鼠抗IFNαMAb以及针对v-mab大鼠抗独特型MAb(WR2)和hL243(WT)。
DNL TM 构建体
使用DNLTM方法通过使IgG-AD2-模块与DDD2-模块组合来产生单特异性MAb-IFNα(20-2b-2b、734-2b-2b和C2-2b-2b)和双特异性HexAb(20-C2-C2)，如在前述实施例中所述。包含四聚IFNα2b和MAbh734[抗铟DTPA IgG1]的734-2b-2b用作非靶向对照MAb-IFNα。
哺乳动物表达载体的构建以及生产克隆的后续产生和CH3-AD2-IgG-v-mab的纯化公开于前述实施例中。表达的重组融合蛋白具有经过15个氨基酸长度的柔性接头肽连接至v-mab的CH3结构域的羧基末端的AD2肽。重链AD2和轻链多肽的共表达引起配备有两个AD2肽的IgG结构形成。通过电穿孔将表达载体转染到Sp/ESF细胞(Sp2/0的工程化的细胞系)中。pdHL2载体包含用于二氢叶酸还原酶的基因，从而允许克隆选择以及用甲氨蝶呤(MTX)进行的基因扩增。稳定的克隆从使用含有0.2μM MTX的培养基选择的96孔板中分离出来。经过夹层ELISA筛选克隆的CH3-AD2-IgG-vmab生产力。在使用无血清培养基的滚瓶培养中产生模块。
通过经由18个氨基酸长度的柔性接头肽将DDD2肽重组融合至人IFNα2b的羧基末端来如上所述产生DDD模块，IFNα2b-DDD2。同所有DDD模块的情况一样，表达的融合蛋白自发形成稳定的同型二聚体。
通过使用SacII和EagI限制性酶切除CH1-铰链-CH2-CH3结构域的序列并且将其替代为编码CH1-DDD2的507bp序列而从hL243-IgG-pdHL2载体中产生CH1-DDD2-Fab-hL243表达载体，所述编码CH1-DDD2的507bp序列使用相同酶从C-DDD2-hMN-14-pdHL2表达载体中切除。在通过电穿孔将CH1-DDD2-Fab-hL243-pdHL2转染到Sp/ESF细胞中之后，经过使用涂覆有小鼠抗人κ链以捕获融合蛋白的96孔微量滴定板的夹层ELISA筛选稳定的MTX耐受性克隆的生产力，这使用辣根过氧化物酶缀合的山羊抗人Fab检测到。在滚瓶培养中产生模块。
无血清H-SFM培养基中的滚瓶培养物和补料分批生物反应器生产产生与至今产生的其它IgG-AD2模块和细胞因子-DDD2模块可比的产率。如先前所述(Rossi等人,Blood 2009,114:3864-71)分别使用MABSELECTTM(GE Healthcare)和HF镍亲和凝胶(Sigma)通过亲和色谱法从培养液(culture broth)中纯化CH3-AD2-IgG-v-mab和IFNα2b-DDD2。将含有CH1-DDD2-Fab-hL243模块的培养液直接施加至亲和凝胶(GE-Healthcare)，用PBS将其洗涤至基线并且用0.1M甘氨酸(pH 2.5)洗脱。
通过DNL TM 产生20-C2-2b
以等摩尔量将三个DNLTM模块(CH3-AD2-IgG-v-mab、CH1-DDD2-Fab-hL243和IFN-α2b-DDD2)组合以产生bsMAb-IFNα，20-C2-2b。在室温下在温和还原条件下(1mM还原型谷胱甘肽)进行对接步骤过夜之后，添加氧化型谷胱甘肽(2mM)以促进二硫键形成(锁定)。使用三个连续的亲和色谱法步骤将20-C2-2b纯化至接近同质。最初，使用蛋白A(MABSELECTTM)纯化DNLTM混合物，所述蛋白A结合CH3-AD2-IgG-v-MAb基团并且消除未反应的IFNα2b-DDD2或CH1-DDD2-Fab-hL243。使用HF镍亲和凝胶通过IMAC进一步纯化蛋白A结合的物质，所述HF镍亲和凝胶特异性结合IFNα2b-DDD2部分并且消除缺乏此基团的任何构建体。最后的工艺步骤(使用hL243抗独特型亲和凝胶)去除缺乏CH1-DDD2-Fab-hL243的任何分子。
熟练的技术人员将认识到，亲和色谱法可用来纯化包含效应子部分的任何组合的DNLTM复合物，只要三个效应子部分中的每一个的配体可获得并且附着至柱物质。选择的DNLTM构建体为结合含有三个效应子部分中的每一个的配体的三个柱中的每一个并且可在洗涤去除未结合的复合物之后洗脱的一种构建体。
以下实施例为代表性的若干类似20-C2-2b制剂。将等摩尔量的CH3-AD2-IgG-v-mab(15mg)、CH1-DDD2-Fab-hL243(12mg)和IFN-α2b-DDD2(5mg)合并在30mL反应体积中并且将1mM还原型谷胱甘肽添加至溶液中。在室温下放置16h之后，将2mM氧化型谷胱甘肽添加至混合物中，将其在室温下再保持6h。将反应混合物施加至5mL蛋白A亲和柱，用PBS将其洗涤至基线并且用0.1M甘氨酸(pH 2.5)洗脱。含有大约20mg蛋白质的洗脱物用3M Tris-HCl(pH 8.6)中和并且在施加至5mLIMAC柱之前透析到结合缓冲液(10mM咪唑、300mM NaCl、50mMNaH2PO4，pH 8.0)中。用结合缓冲液将柱洗涤至基线并且用250mM咪唑、150mM NaCl、50mM NaH2PO4(pH 8.0)洗脱。
将含有大约11.5mg蛋白质的IMAC洗脱物直接施加至WP(抗hL243)亲和柱，用PBS将其洗涤至基线并且用0.1M甘氨酸(pH 2.5)洗脱。所述工艺产生7mg的高度纯化的20-C2-2b。这为20-C2-2b理论产率的大约44％，其为总起始材料(在本实施例中为16mg)的50％，其中各自25％的20-2b-2b和20-C2-C2产生为副产物。
20-C2-2b的产生和表征
通过使IgG-AD2模块(CH3-AD2-IgG-v-mab)与两种不同的二聚DDD-模块(CH1-DDD2-Fab-hL243和IFNα2b-DDD2)组合来产生双特异性MAb-IFNα。由于任一种DDD-模块与两个AD2基团的随机缔合，所以除了20-C2-2b以外预期形成两种副产物(20-C2-C2和20-2b-2b)。
非还原性SDS-PAGE(未示出)分辨出置于20-C2-C2(大约365kDa)与20-2b-2b(255kDa)之间的呈带群集的20-C2-2b(大约305kDa)。还原性SDS-PAGE分辨出包含20-C2-2b的五种多肽(v-mabHC-AD2、hL243Fd-DDD2、IFNα2b-DDD2以及共迁移的v-mab和hL243κ轻链)(未示出)。IFNα2b-DDD2和hL243Fd-DDD2不存在于20-C2-C2和20-2b-2b中。MABSELECTTM结合在DNLTM反应中产生的所有三种主要物质，但去除任何过量的IFNα2b-DDD2和CH1-DDD2-Fab-hL243。未结合级分(fraction)含有大部分20-C2-C2(未示出)。来自WT亲和色谱法的未结合级分包含20-2b-2b(未示出)。使每种样品受到SE-HPLC和免疫反应性分析，所述分析确证了SDS-PAGE分析的结果和结论。
在还原20-C2-2b之后，通过RP-HPLC分辨出其五种组分多肽并且针对每个峰产生单独的ESI-TOF去卷积质谱(未示出)。在Thr-106处使天然但非细菌表达的重组IFNα2进行O-糖基化(Adolf等人,Biochem J 1991；276(Pt 2):511-8)。我们确定了大约15％的包含IFNα2b-DDD2模块的多肽被O-糖基化并且可通过RP-HPLC和SDS-PAGE从未糖基化的多肽中分辨出(未示出)。20-C2-2b的LC/MS分析鉴定了IFNα2b-DDD2的O-糖基化物质和未糖基化物质，其中质量精度分别为15ppm和2ppm(未示出)。O-糖基化形式所观察到的质量指示了具有结构NeuGc-NeuGc-Gal-GalNAc的O-连接的聚糖，这也是针对20-2b-2b所预测的(<1ppm)(未示出)。LC/MS鉴定了v-mab和hL243κ链以及呈单一未修饰物质形式的hL243-Fd-DDD2(未示出)，其中观察到的质量匹配计算的质量(<35ppm)。v-mabHC-AD2的两种主要糖形鉴定为具有53,714.73(70％)和53,877.33(30％)的质量，从而分别指示通常与IgG缔合的G0F和G1F N-聚糖(未示出)。分析还证实了如针对具有氨基末端的谷氨酰胺的多肽所预测，HC-AD2的氨基末端被修饰成焦谷氨酸。
20-C2-2b的SE-HPLC分析分辨出具有与其计算的质量一致并且在较大20-C2-C2(6.6min)与较小20-2b-2b(6.85min)之间的保留时间(6.7min)的主要蛋白质峰以及可能代表经过IFNα2b的自缔合形成的非共价二聚体的一些较高分子量峰(未示出)。
免疫反应性测定证明了20-C2-2b与含有三个官能团的每种分子的均质性(未示出)。用对任何三个组分模块过量的抗体孵育20-C2-2b引起高分子量免疫复合物定量形成并且20-C2-2b峰消失(未示出)。和WT亲和性未结合的级分分别对WT和抗IFNα没有免疫反应性(未示出)。MAb-IFNα示出与其亲本MAb类似的结合亲合力(未示出)。
IFNα生物活性
使用基于细胞的报告基因测定测量各种MAb-IFNα的比活性并且与聚乙二醇干扰素α-2b比较(未示出)。预期地，具有两个IFNα2b基团的20-C2-2b的比活性(2454IU/pmol)显著低于20-2b-2b的比活性(4447IU/pmol)或734-2b-2b的比活性(3764IU/pmol)，而又大于聚乙二醇干扰素α-2b的比活性(P<0.001)(未示出)。20-2b-2b与734-2b-2b之间的差异不显著。当归一化为总IFNα的IU/pmol时所有药剂之间的比活性变化很小。基于这些数据，MAb-IFNα的每个IFNα2b基团的比活性为重组IFNα2b(大约4000IU/pmol)的大约30％。
在离体环境下，20-C2-2b DNLTM构建体比正常B细胞更有效地消减淋巴瘤细胞并且对T细胞没有影响(未示出)。然而，其确实有效消除了单核细胞(未示出)。在v-mab对单核细胞没有作用的情况下，在用hL243α4p和MAb-IFNα处理之后观察到消减，其中20-2b-2b和734-2b-2b展现出类似的毒性(未示出)。因此，20-C2-2b的可预测地较高效力归因于抗HLA-DR和IFNα的组合作用，所述作用可通过HLA-DR靶向来扩大。这些数据表明单核细胞消减可为与抗HLA-DR以及IFNα疗法相关的药效作用；然而，此副作用将可能为瞬间的，因为单核细胞群会从造血干细胞中重新形成。
熟练的技术人员将认识到在此描述的产生和使用双特异性免疫细胞因子或包含三个不同效应子部分的其它DNLTM构建体的方法可与抗体、抗体片段、细胞因子或其它可并入DNLTM构建体中的效应子的任何组合(例如抗CD20和抗CD22与IFNα2b的组合)一起使用。
实施例9.抗HIV DNLTM复合物
在中和HIV-1的各种抗体之中，鼠抗gp120抗体(P4/D10)通过其诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)以消除表达被P4/D10结合的抗原gp120表位的受感染T细胞的能力而著名(Broliden等人,1990,J Virol64:936-40)。还显示出阿霉素缀合的P4/D10中和并抑制体外HIV感染的细胞间扩散以及保护免遭体内HIV-1/MuLV感染的增强效力(Johansson等人,2006,AIDS 20:1911-15)。
连同一种或多种抗HIV剂制备包含P4/D10IgG或其它抗HIV抗体或其片段的DNLTM复合物。在本文说明的一个优选实施方案中，抗HIV剂为T20HIV融合抑制剂(恩夫韦地(enfuvirtide),)(Asboe,2004,HIV Clin Trials 5:1-6)。
在一个优选实施方案中，包含连接至具有对HIV-1有特异性的嵌合人抗体或人源化抗体(如P4/D10)的恩夫韦地(T20)的多个拷贝的新型类别抗HIV剂被制备呈DNLTM复合物形式。此类缀合物允许比使用未缀合的T20次数较少的给药来阻止HIV-1进入T细胞、中和游离HIV-1和消除被HIV感染的细胞。在示例性DNLTM构建体中，IgG抗体的每条轻链的C-末端经过短接头附着至AD2部分(SEQ ID NO:4)并且表达为如以上实施例中所述的融合蛋白。T20HIV融合抑制剂附着至DDD2部分(SEQ ID NO:2)并且也表达为融合蛋白。DDD2部分的两个拷贝自发形成结合AD2部分的二聚体，从而形成包含一个IgG抗体和T20的四个拷贝的DNLTM复合物。
DDD2-T20氨基酸序列在以下SEQ ID NO:128中示出。DDD2的序列已加下划线。接着为短接头和铰链区以及用于亲和纯化的聚组氨酸标记。C-末端处的T20序列以粗体示出。如下所示，DDD2-T20已产生并且用来制得DNLTM复合物。
DDD2-T20
MCGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARAEFPKPSTPPGSSGHHHHHHGSYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ IDNO：128)
P4/D10为在向人受试者施用时可诱导人抗小鼠抗体(HAMA)的鼠抗体。P4/D10的嵌合形式或人源化形式将更适合用于人治疗使用。通过用人抗体恒定区序列替代P4/D10的鼠恒定区序列来构建嵌合P4/D10(cP4/D10)。制备cP4/D10并且将其对gp160(包含gp120和gp41)的结合亲和性与鼠P4/D10和对照非靶向T4-2(抗CD4)抗体比较。确定了cP4/D10的亲和性(未示出)和体外活性(未示出)比亲本P4/D10低约2倍，这为可接受的并且可通过额外的亚克隆和人源化来进一步改进。对照非靶向抗体不结合gp160。
第一目标HIV患者群为HAART疗法失败的个体，其中若干次剂量的DNLTM缀合物可有效减少受感染细胞和循环病毒颗粒的数目。第二患者群为有效HAART的个体，具有达到和消去少数持久、产生病毒的细胞的目标。
使DDD2-T20与cP4/D10-AD2组合以产生对HIV有特异性的DNLTM构建体。当基于T20的摩尔浓度比较结果时，T20-DDD2构建体比未缀合的T20更有效并且*cP4/D10-T20 DNLTM构建体比未缀合物的T20更有效多于一个数量级。DNLTM构建体还展现出比T20的2.8小时显著更大的约24小时的体内半衰期。这些结果表明包含T20的DNLTM复合物展现出比未缀合的T20大致上更长的循环半衰期和大致上更高的功效。
实施例10.包含连接至CH3-AD2-IgG的四个IFN-α2b-DDD2部分的DNL缀合物的产生
如下制得包含连接至Ck-AD2-IgG的四个IFN-α2b-DDD2部分的DNL复合物。简而言之，使选择出来的Ck-AD2-IgG与大约2摩尔当量的IFN-α2b-DDD2组合并且在添加1mM EDTA和2mM还原型谷胱甘肽(GSH)之后，在室温下在温和条件下将混合物还原过夜。添加2mM的氧化型谷胱甘肽并且在室温下将混合物再保持12-24小时。经过蛋白A亲和柱纯化DNL缀合物。制备了包含锚定在Ck-AD2-IgG-hA20上的IFN-α2b的四个拷贝的DNL缀合物(命名为*20-2b)(对CD20具有特异性)。对从哺乳动物(m)或大肠杆菌(e)产生的IFN-α2b-DDD2中产生的*20-2b的SE-HPLC分析各自均显示具有与主要由IgG和4个IFN-α2b基团组成的共价复合物一致的保留时间的主峰。针对其它三个IFN-IgG缀合物观察到类似的SE-HPLC特征。
使用基于细胞的报告分子、病毒保护和淋巴瘤增殖测定将*20-2b的体外IFNα生物活性与商业PEG化的IFNα2剂(和)的体外IFNα生物活性比较。使用基于细胞的试剂盒确定比活性，所述试剂盒利用了携带融合至干扰素刺激的应答成分(element)的报告基因的转基因人前单核细胞细胞系。*20-2b的比活性比和高。具有四个IFNα2b基团有助于MAb-IFNα效力增强。当归一化为IFNα等效物时，比活性/IFNα比高约10倍并且仅比小约2倍。
在体外病毒保护测定中*20-2b、和的比较证明了*20-2b保持了具有类似于并且比高10倍的比活性的IFNα2b抗病毒活性。
IFNα2b可对一些肿瘤系具有直接抗增殖性或细胞毒性作用。使用对IFNα高度敏感的伯基特淋巴瘤细胞系(Daudi)在体外增殖测定中测量了*20-2b的活性。每种IFNα2剂均在体外具有高效力地有效抑制了(>90％)Daudi。然而，*20-2b比非靶向MAb-IFNα构建体更有效约30倍。
在雄性Swiss-Webster小鼠中评价*20-2b的药物代谢动力学(PK)性质并且与PEG-INTRON和α2b-413(由DNLTM制得的聚乙二醇化的IFN)的药物代谢动力学性质比较。根据制造商的说明书通过ELISA确定各时间下的血清样品中的IFN-α浓度。简单地说，根据试剂盒中提供的人IFN-α标准物适当稀释血清样品。结合微量滴定板孔的抗体捕获干扰素。然后第二抗体用来显示结合的干扰素，所述结合的干扰素通过添加四甲基联苯胺(TMB)之后的缀合至辣根过氧化物酶(HRP)的抗第二抗体来定量。在450nm处对板读数。PK分析的结果显示*20-2b与其它药剂相比显著更慢的消除和更长的血清停留。
实施例11.基于CD20异种抗原产生DDD模块
通过PCR扩增针对鼠CD20的cDNA序列，从而产生其中CD20异种抗原融合在其主要由SEQ ID NO:129组成的多肽的C-末端处的序列。
KSHHHHHHGSGGGGSGGGCGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：129)
使用全长鼠CD20 cDNA克隆作为模板和选择的PCR引物完成PCR扩增。将PCR扩增引物克隆到载体()中。通过用XbaI和Bam HI限制性内切酶消化来制备用于与CD20连接的DDD2-pdHL2哺乳动物表达载体。使用XbaI和Bam HI从中切除CD20扩增引物并且连接到DDD2-pdHL2载体中以产生表达载体CD20-DDD2-pdHL2。
通过用SalI酶消化来使CD20-DDD2-pdHL2线性化并且通过电穿孔稳定地转染到Sp/EEE骨髓瘤细胞中(参见，例如美国专利7,537,930，所述专利的实施例部分以引用的方式并入本文)。通过ELISA发现两个克隆具有可检测水平的CD20。在生产力没有大致上减小的情况下使两个克隆之一适应于在无血清培养基中生长。随后用从0.1μM至0.8μM的递增浓度甲氨蝶呤(MTX)经过5周扩增克隆。在此阶段，通过限制稀释亚克隆所述克隆并且增大最高产的亚克隆。
使克隆增大至含有总共20L的无血清杂交瘤SFM与0.8μMMTX的34个滚瓶并且允许实现最终培养。μ通过离心和过滤(0.2μM)使上清液澄清。将滤液渗滤到1X结合缓冲液(10mM咪唑、0.5MNaCl、50mM NaH2PO4，pH 7.5)中并且在制备中浓缩至310mL用于通过固定化金属亲和色谱法(IMAC)来纯化。将浓缩物载荷于30mLNi-NTA柱上，用500mL 0.02％吐温20的1X结合缓冲液并且然后290mL的30mM咪唑、0.02％吐温20、0.5M NaCl、50mM NaH2PO4(pH 7.5)洗涤所述柱。用110mL的250mM咪唑、0.02％吐温20、150mM NaCl、50mM NaH2PO4(pH 7.5)洗脱产物。纯化了大约6mg的CD20-DDD2。通过在还原性条件下的SDS-PAGE评价CD20-DDD2的纯度。CD20-DDD2为染色最重的带并且占总蛋白质的大约50％。
实施例12.通过DNL产生hLL1 Fab-(CD20)2
如在实施例1中所述产生Ck-AD2-IgG-hLL1(抗CD74)部分。如在实施例11中所述产生DDD2-mCD20部分。通过将还原的和冻干的hLL1 IgG-AD2添加至250mM咪唑、0.02％吐温20、150mM NaCl、1mM EDTA、50mM NaH2PO4(pH 7.5)中的CD20-DDD2中进行DNL反应。在黑暗中在室温下6h之后，在黑暗中在4℃下用CM载荷缓冲液(150mM NaCl、20mM NaAc，pH 4.5)透析反应混合物。将融合载荷于1mL Hi-Trap CM-FF柱()上，所述柱用CM载荷缓冲液预平衡。在样品载荷之后，用CM载荷缓冲液将柱洗涤至基线，接着用15mL的0.25M NaCl、20mM NaAc(pH 4.5)洗涤。用12.5mL的0.5M NaCl、20mM NaAc(pH 4.5)洗脱产物。DNL反应引起hLL1IgG与mCD20的二聚体位点特异性和共价的缀合。通过细胞培养测定，IgG和CD20部分均保留其在DNL构建体中的各自生理活性。
向患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者施用hLL1-mCD20 DNL构建体并且发现其诱导针对CD138negCD20+假定MM干细胞的免疫应答。免疫应答有效于减少或消除受试者体内的MM患病细胞。
* * *
按照本公开内容不需要过度的实验可制得和使用本文公开和要求保护的所有组合物和方法。虽然以优选实施方案的方式已描述了组合物和方法，但是本领域技术人员将清楚可对组合物和方法并且在本文描述的方法的步骤中或步骤顺序中在不偏离本发明的理念、精神和范围的情况下应用变化。更确切地来说，化学和生理学相关的某些药剂可替代本文描述的药剂，同时将实现相同或相似的结果。对本领域技术人员来说清楚的所有所述相似的替代和修改被认为处在如由随附权利要求限定的本发明的精神、范围以及理念内。

Claims (42)

1.一种融合蛋白，其包含：
a)抗体；以及
b)来自附着至所述抗体的每条轻链的C-末端的AKAP蛋白的AD(锚定域)部分。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述抗体附着至所述AD部分的两个拷贝。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述抗体结合选自由以下组成的组的抗原：AFP、α4整联蛋白、B7、碳酸酐酶IX、补体因子C1q、C1r、C1s、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5a、C5aR、C5b、C5、C6、C7、C8、C9n、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD3R、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD86、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CEACAM-5、CEACAM-6、CSAp、纤连蛋白的ED-B、EGFR、EGP-1(TROP-2)、EGP-2、ErbB2、因子H、FHL-1、纤维蛋白、Flt-3、叶酸受体、糖蛋白IIb/IIIa、gp41、gp120、GRO-β、HLA-DR、HM1.24、HM1.24、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、Ia、ICAM-1、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-λ、IgE、IGF-1R、IL-1、IL-1Ra、IL-2、IL-4R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-13R、IL-15R、IL-15、IL-17、IL-17R、IL-18、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、胰岛素样生长因子-1(ILGF-1)、IP-10、Le(y)、脂多糖(LPS)、MAGE、MCP-1、mCRP、MIF、MIP-1A、MIP-1B、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、NCA-90、NCA-95、NF-κB、PlGF、PSMA、RANTES、T101、TAC、TAG-72、腱生蛋白、汤姆森-弗里德里希抗原、凝血酶、组织因子、Tn抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、肿瘤坏死抗原、VEGF、VEGFR以及致癌基因产物。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述抗体选自由以下组成的组：hR1(抗IGF-1R)、hPAM4(抗粘蛋白)、KC4(抗粘蛋白)、hA20(抗CD20)、hA19(抗CD19)、hIMMU31(抗AFP)、hLL1(抗CD74)、hLL2(抗CD22)、RFB4(抗CD22)、hMu-9(抗CSAp)、hL243(抗HLA-DR)、hMN-14(抗CEACAM5)、hMN-15(抗CEACAM6)、hRS7(抗TROP-2)、hMN-3(抗CEACAM6)、CC49(抗TAG-72)、J591(抗PSMA)、D2/B(抗PSMA)、G250(抗碳酸酐酶IX)、英利昔单抗(抗TNF-α)、赛妥珠单抗(抗TNF-α)、阿达木单抗(抗TNF-α)、阿仑单抗(抗CD52)、贝伐单抗(抗VEGF)、西妥昔单抗(抗EGFR)、吉妥单抗(抗CD33)、替伊莫单抗(抗CD20)、帕尼单抗(抗EGFR)、利妥昔单抗(抗CD20)、托西莫单抗(抗CD20)、GA101(抗CD20)、曲妥单抗(抗ErbB2)、托珠单抗(抗IL-6受体)、巴利昔单抗(抗CD25)、达利珠单抗(抗CD25)、依法利珠单抗(抗CD11a)、莫罗单抗-CD3(抗CD3受体)、那他珠单抗(抗α4整联蛋白)以及奥马珠单抗(抗IgE)。
5.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述DDD部分的氨基酸序列选自由以下组成的组：RIIα的残基1-44、RIIβ的残基1-44、RIα的残基12-61以及RIβ的残基13-66。
6.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述DDD部分的所述氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:87以及SEQ ID NO:89。
7.一种多聚体复合物，其包含：
a)第一融合蛋白，其包含(i)第一抗体和(ii)来自附着至所述抗体的每条轻链的所述C末端的AKAP蛋白的AD(锚定域)部分；以及
b)第二融合蛋白，其包含(iii)效应子部分和(iv)来自蛋白激酶A(PKA)调节亚基RIα、RIβ、RIIα或RIIβ的DDD(二聚化和停靠域)部分；
其中所述DDD部分的两个拷贝形成结合所述AD部分的一个拷贝以便形成所述复合物的二聚体。
8.如权利要求7所述的复合物，其中所述效应子部分选自由以下组成的组：第二抗体或其抗原结合片段、细胞因子、干扰素、毒素、抗原、异种抗原、半抗原、鱼精蛋白、激素、酶、配体结合蛋白、促凋亡剂以及抗血管生成剂。
9.如权利要求7所述的复合物，其中所述效应子部分为第二抗体或其抗原结合片段、细胞因子、干扰素或毒素。
10.如权利要求7所述的复合物，其中所述第一抗体附着至两个AD部分并且每个AD部分均结合DDD部分的二聚体。
11.如权利要求7所述的复合物，其中所述第一抗体结合选自由以下组成的组的抗原：AFP、α4整联蛋白、B7、碳酸酐酶IX、补体因子C1q、C1r、C1s、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5a、C5aR、C5b、C5、C6、C7、C8、C9n、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD3R、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD86、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CEACAM-5、CEACAM-6、CSAp、纤连蛋白的ED-B、EGFR、EGP-1(TROP-2)、EGP-2、ErbB2、因子H、FHL-1、纤维蛋白、Flt-3、叶酸受体、糖蛋白IIb/IIIa、gp41、gp120、GRO-β、HLA-DR、HM1.24、HM1.24、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、Ia、ICAM-1、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-λ、IgE、IGF-1R、IL-1、IL-1Ra、IL-2、IL-4R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-13R、IL-15R、IL-15、IL-17、IL-17R、IL-18、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、胰岛素样生长因子-1(ILGF-1)、IP-10、Le(y)、脂多糖(LPS)、MAGE、MCP-1、mCRP、MIF、MIP-1A、MIP-1B、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、NCA-90、NCA-95、NF-κB、PlGF、PSMA、RANTES、T101、TAC、TAG-72、腱生蛋白、汤姆森-弗里德里希抗原、凝血酶、组织因子、Tn抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、肿瘤坏死抗原、VEGF、VEGFR以及致癌基因产物。
12.如权利要求7所述的复合物，其中所述第一抗体选自由以下组成的组：hR1(抗IGF-1R)、hPAM4(抗粘蛋白)、KC4(抗粘蛋白)、hA20(抗CD20)、hA19(抗CD19)、hIMMU31(抗AFP)、hLL1(抗CD74)、hLL2(抗CD22)、RFB4(抗CD22)、hMu-9(抗CSAp)、hL243(抗HLA-DR)、hMN-14(抗CEACAM5)、hMN-15(抗CEACAM6)、hRS7(抗TROP-2)、hMN-3(抗CEACAM6)、CC49(抗TAG-72)、J591(抗PSMA)、D2/B(抗PSMA)、G250(抗碳酸酐酶IX)、英利昔单抗(抗TNF-α)、赛妥珠单抗(抗TNF-α)、阿达木单抗(抗TNF-α)、阿仑单抗(抗CD52)、贝伐单抗(抗VEGF)、西妥昔单抗(抗EGFR)、吉妥单抗(抗CD33)、替伊莫单抗(抗CD20)、帕尼单抗(抗EGFR)、利妥昔单抗(抗CD20)、托西莫单抗(抗CD20)、GA101(抗CD20)、曲妥单抗(抗ErbB2)、托珠单抗(抗IL-6受体)、巴利昔单抗(抗CD25)、达利珠单抗(抗CD25)、依法利珠单抗(抗CD11a)、莫罗单抗-CD3(抗CD3受体)、那他珠单抗(抗α4整联蛋白)以及奥马珠单抗(抗IgE)。
13.如权利要求8所述的复合物，其中所述第二抗体或其抗原结合片段结合选自由以下组成的组的抗原：AFP、α4整联蛋白、B7、碳酸酐酶IX、补体因子C1q、C1r、C1s、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5a、C5aR、C5b、C5、C6、C7、C8、C9n、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD3R、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD86、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CEACAM-5、CEACAM-6、CSAp、纤连蛋白的ED-B、EGFR、EGP-1(TROP-2)、EGP-2、ErbB2、因子H、FHL-1、纤维蛋白、Flt-3、叶酸受体、糖蛋白IIb/IIIa、gp41、gp120、GRO-β、HLA-DR、HM1.24、HM1.24、HMGB-1、HSG、缺氧诱导因子(HIF)、Ia、ICAM-1、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-λ、IgE、IGF-1R、IL-1、IL-1Ra、IL-2、IL-4R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-13R、IL-15R、IL-15、IL-17、IL-17R、IL-18、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、胰岛素样生长因子-1(ILGF-1)、IP-10、Le(y)、脂多糖(LPS)、MAGE、MCP-1、mCRP、MIF、MIP-1A、MIP-1B、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、NCA-90、NCA-95、NF-κB、PlGF、PSMA、RANTES、T101、TAC、TAG-72、腱生蛋白、汤姆森-弗里德里希抗原、凝血酶、组织因子、Tn抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、肿瘤坏死抗原、VEGF、VEGFR以及致癌基因产物。
14.如权利要求8所述的复合物，其中所述第二抗体选自由以下组成的组：hR1(抗IGF-1R)、hPAM4(抗粘蛋白)、KC4(抗粘蛋白)、hA20(抗CD20)、hA19(抗CD19)、hIMMU31(抗AFP)、hLL1(抗CD74)、hLL2(抗CD22)、RFB4(抗CD22)、hMu-9(抗CSAp)、hL243(抗HLA-DR)、hMN-14(抗CEACAM5)、hMN-15(抗CEACAM6)、hRS7(抗TROP-2)、hMN-3(抗CEACAM6)、CC49(抗TAG-72)、J591(抗PSMA)、D2/B(抗PSMA)、G250(抗碳酸酐酶IX)、英利昔单抗(抗TNF-α)、赛妥珠单抗(抗TNF-α)、阿达木单抗(抗TNF-α)、阿仑单抗(抗CD52)、贝伐单抗(抗VEGF)、西妥昔单抗(抗EGFR)、吉妥单抗(抗CD33)、替伊莫单抗(抗CD20)、帕尼单抗(抗EGFR)、利妥昔单抗(抗CD20)、托西莫单抗(抗CD20)、GA101(抗CD20)、曲妥单抗(抗ErbB2)、托珠单抗(抗IL-6受体)、巴利昔单抗(抗CD25)、达利珠单抗(抗CD25)、依法利珠单抗(抗CD11a)、莫罗单抗-CD3(抗CD3受体)、那他珠单抗(抗α4整联蛋白)以及奥马珠单抗(抗IgE)。
15.如权利要求8所述的复合物，其中所述抗体片段选自由以下组成的组：F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、sFv、scFv以及dAb。
16.如权利要求7所述的复合物，其中所述DDD部分的所述氨基酸序列选自由以下组成的组：RIIα的残基1-44、RIIβ的残基1-44、RIα的残基12-61以及RIβ的残基13-66。
17.如权利要求7所述的复合物，其中所述DDD部分的所述氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:87以及SEQ ID NO:89。
18.如权利要求7所述的复合物，其中所述AD部分的所述氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48、M SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、M SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ IDNO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ IDNO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、M SEQ ID NO:79、SEQ IDNO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:44以及SEQ ID NO:88。
19.根据权利要求8所述的复合物，其中所述毒素选自由以下组成的组：细菌毒素、植物毒素、蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、豹蛙酶(Rap)以及Rap(N69Q)。
20.根据权利要求19所述的复合物，其中所述毒素为豹蛙酶(Rap)。
21.如权利要求8所述的复合物，其中所述细胞因子选自由以下组成的组：人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、促黄体激素(LH)、肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、苗勒抑制物质、小鼠促性腺素相关的肽、抑制素、活化素、血管内皮生长因子、整联蛋白、血小板生成素(TPO)、神经生长因子(NGF)、NGF-β、血小板生长因子、转化生长因子(TGF)、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子-I、胰岛素样生长因子-II、促红细胞生成素(EPO)、骨诱导因子、干扰素、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、干扰素-λ、集落刺激因子(CSF)、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)、粒细胞-CSF(G-CSF)、白细胞介素-1(IL-1)、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、LIF、kit-配体、FLT-3、血管抑素、血小板反应蛋白、内皮抑素、肿瘤坏死因子以及LT(淋巴毒素)。
22.如权利要求8所述的复合物，其中所述异种抗原选自由以下组成的组：碳酸酐酶IX、α-胎蛋白、α.-辅肌动蛋白-4、A3、对A33抗体具有特异性的抗原、ART-4、B7、Ba 733、BAGE、BrE3抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8/m、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、结肠特异性抗原-p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-1、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、Flt-1、Flt-3、叶酸受体、G250抗原、GAGE、gp100、GROB、HLA-DR、HM1.24、人绒毛膜促性腺激素(HCG)和其亚基、HER2/neu、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF-1)、HSP70-2M、HST-2、Ia、IGF-1R、IFN-.γ、IFN-.α、IFN-.β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、KC4抗原、KS-1抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-I、MART-2、NY-ESO-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、对PAM-4抗体具有特异性的抗原、胎盘生长因子、p53、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、PlGF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES、T101、SAGE、5100、存活素、存活素-2B、TAC、TAG-72、腱生蛋白、TRAIL受体、TNF-.α、Tn抗原、汤姆森-弗里德里希抗原、肿瘤坏死抗原、VEGFR、ED-B纤连蛋白、WT-1、17-1A抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管生成标记物、bcl-2、bcl-6、Kras、cMET、致癌基因标记物以及致癌基因产物。
23.一种治疗疾病的方法，其包括向受试者施用多聚体复合物，所述多聚体复合物包含：
a)第一融合蛋白，其包含(i)第一抗体和(ii)来自附着至所述抗体的每条轻链的所述C末端的AKAP蛋白的AD(锚定域)部分；以及
b)第二融合蛋白，其包含(iii)效应子部分和(iv)来自蛋白激酶A(PKA)调节亚基RIα、RIβ、RIIα或RIIβ的DDD(二聚化和停靠域)部分；
其中所述DDD部分的两个拷贝形成结合所述AD部分的一个拷贝以便形成所述复合物的二聚体。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述疾病为癌症、自身免疫疾病、免疫系统功能障碍、感染性疾病、代谢性疾病、心血管疾病以及神经疾病。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：非霍奇金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、T细胞淋巴瘤、T细胞白血病、急性淋巴样白血病、慢性淋巴样白血病、伯基特淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、毛细胞白血病、急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、多发性骨髓瘤、神经胶质瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、癌瘤、黑素瘤、肉瘤、神经胶质瘤、皮肤癌、口腔癌、胃肠道癌、结肠癌、胃癌、肺道癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、胰腺癌、骨癌、肝癌、胆囊癌、肾癌以及睾丸癌。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述自身免疫疾病选自由以下组成的组：急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病、重症肌无力、全身性红斑狼疮、狼疮肾炎、风湿热、多腺体综合症、大疱性类天疱疮、糖尿病、亨诺赫-舍恩莱茵紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安氏动脉炎、艾迪生氏病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、肉样瘤病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯丘综合症、血管闭塞性脉管炎、斯耶格伦氏综合症、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常天疱疮、韦格纳氏肉芽肿病、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨、巨细胞性动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、牛皮癣以及纤维化肺泡炎。
27.如权利要求23所述的方法，其中所述效应子部分选自由以下组成的组：第二抗体或其抗原结合片段、细胞因子、干扰素、毒素、抗原、异种抗原、半抗原、鱼精蛋白、激素、酶、配体结合蛋白、促凋亡剂以及抗血管生成剂。
28.如权利要求23所述的方法，其中所述效应子部分为第二抗体或其抗原结合片段、细胞因子、干扰素或毒素。
29.如权利要求23所述的方法，其中所述第一抗体附着至两个AD部分并且每个AD部分均结合DDD部分的二聚体。
30.如权利要求23所述的方法，其中所述第一抗体结合选自由以下组成的组的抗原：AFP、α4整联蛋白、B7、碳酸酐酶IX、补体因子C1q、C1r、C1s、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5a、C5aR、C5b、C5、C6、C7、C8、C9n、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD3R、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD86、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CEACAM-5、CEACAM-6、CSAp、纤连蛋白的ED-B、EGFR、EGP-1(TROP-2)、EGP-2、ErbB2、因子H、FHL-1、纤维蛋白、Flt-3、叶酸受体、糖蛋白IIb/IIIa、gp41、gp120、GRO-β、HLA-DR、HM1.24、HM1.24、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、Ia、ICAM-1、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-λ、IgE、IGF-1R、IL-1、IL-1Ra、IL-2、IL-4R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-13R、IL-15R、IL-15、IL-17、IL-17R、IL-18、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、胰岛素样生长因子-1(ILGF-1)、IP-10、Le(y)、脂多糖(LPS)、MAGE、MCP-1、mCRP、MIF、MIP-1A、MIP-1B、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、NCA-90、NCA-95、NF-κB、PlGF、PSMA、RANTES、T101、TAC、TAG-72、腱生蛋白、Thomson-Friedenreich抗原、凝血酶、组织因子、Tn抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、肿瘤坏死抗原、VEGF、VEGFR以及致癌基因产物。
31.如权利要求23所述的方法，其中所述第一抗体选自由以下组成的组：hR1(抗IGF-1R)、hPAM4(抗粘蛋白)、KC4(抗粘蛋白)、hA20(抗CD20)、hA19(抗CD19)、hIMMU31(抗AFP)、hLL1(抗CD74)、hLL2(抗CD22)、RFB4(抗CD22)、hMu-9(抗CSAp)、hL243(抗HLA-DR)、hMN-14(抗CEACAM5)、hMN-15(抗CEACAM6)、hRS7(抗TROP-2)、hMN-3(抗CEACAM6)、CC49(抗TAG-72)、J591(抗PSMA)、D2/B(抗PSMA)、G250(抗碳酸酐酶IX)、英利昔单抗(抗TNF-α)、赛妥珠单抗(抗TNF-α)、阿达木单抗(抗TNF-α)、阿仑单抗(抗CD52)、贝伐单抗(抗VEGF)、西妥昔单抗(抗EGFR)、吉妥单抗(抗CD33)、替伊莫单抗(抗CD20)、帕尼单抗(抗EGFR)、利妥昔单抗(抗CD20)、托西莫单抗(抗CD20)、GA101(抗CD20)、曲妥单抗(抗ErbB2)、托珠单抗(抗IL-6受体)、巴利昔单抗(抗CD25)、达利珠单抗(抗CD25)、依法利珠单抗(抗CD11a)、莫罗单抗-CD3(抗CD3受体)、那他珠单抗(抗α4整联蛋白)以及奥马珠单抗(抗IgE)。
32.如权利要求27所述的方法，其中所述第二抗体或其抗原结合片段结合选自由以下组成的组的抗原：AFP、α4整联蛋白、B7、碳酸酐酶IX、补体因子C1q、C1r、C1s、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5a、C5aR、C5b、C5、C6、C7、C8、C9n、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD3R、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD86、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CEACAM-5、CEACAM-6、CSAp、纤连蛋白的ED-B、EGFR、EGP-1(TROP-2)、EGP-2、ErbB2、因子H、FHL-1、纤维蛋白、Flt-3、叶酸受体、糖蛋白IIb/IIIa、gp41、gp120、GRO-β、HLA-DR、HM1.24、HM1.24、HMGB-1、HSG、缺氧诱导因子(HIF)、Ia、ICAM-1、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-λ、IgE、IGF-1R、IL-1、IL-1Ra、IL-2、IL-4R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-13R、IL-15R、IL-15、IL-17、IL-17R、IL-18、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、胰岛素样生长因子-1(ILGF-1)、IP-10、Le(y)、脂多糖(LPS)、MAGE、MCP-1、mCRP、MIF、MIP-1A、MIP-1B、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、NCA-90、NCA-95、NF-κB、PlGF、PSMA、RANTES、T101、TAC、TAG-72、腱生蛋白、Thomson-Friedenreich抗原、凝血酶、组织因子、Tn抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、肿瘤坏死抗原、VEGF、VEGFR以及致癌基因产物。
33.如权利要求27所述的方法，其中所述第二抗体选自由以下组成的组：hR1(抗IGF-1R)、hPAM4(抗粘蛋白)、KC4(抗粘蛋白)、hA20(抗CD20)、hA19(抗CD19)、hIMMU31(抗AFP)、hLL1(抗CD74)、hLL2(抗CD22)、RFB4(抗CD22)、hMu-9(抗CSAp)、hL243(抗HLA-DR)、hMN-14(抗CEACAM5)、hMN-15(抗CEACAM6)、hRS7(抗TROP-2)、hMN-3(抗CEACAM6)、CC49(抗TAG-72)、J591(抗PSMA)、D2/B(抗PSMA)、G250(抗碳酸酐酶IX)、英利昔单抗(抗TNF-α)、赛妥珠单抗(抗TNF-α)、阿达木单抗(抗TNF-α)、阿仑单抗(抗CD52)、贝伐单抗(抗VEGF)、西妥昔单抗(抗EGFR)、吉妥单抗(抗CD33)、替伊莫单抗(抗CD20)、帕尼单抗(抗EGFR)、利妥昔单抗(抗CD20)、托西莫单抗(抗CD20)、GA101(抗CD20)、曲妥单抗(抗ErbB2)、托珠单抗(抗IL-6受体)、巴利昔单抗(抗CD25)、达利珠单抗(抗CD25)、依法利珠单抗(抗CD11a)、莫罗单抗-CD3(抗CD3受体)、那他珠单抗(抗α4整联蛋白)以及奥马珠单抗(抗IgE)。
34.如权利要求27所述的方法，其中所述抗体片段选自由以下组成的组：F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、sFv、scFv以及dAb。
35.如权利要求23所述的方法，其中所述DDD部分的所述氨基酸序列选自由以下组成的组：RIIα的残基1-44、RIIβ的残基1-44、RIα的残基12-61以及RIβ的残基13-66。
36.如权利要求23所述的方法，其中所述DDD部分的所述氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:87以及SEQ ID NO:89。
37.如权利要求23所述的方法，其中所述AD部分的所述氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48、M SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、M SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ IDNO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ IDNO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、M SEQ ID NO:79、SEQ IDNO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:44以及SEQ ID NO:88。
38.根据权利要求27所述的方法，其中所述毒素选自由以下组成的组：细菌毒素、植物毒素、蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、豹蛙酶(Rap)以及Rap(N69Q)。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述毒素为豹蛙酶(Rap)。
40.如权利要求27所述的方法，其中所述细胞因子选自由以下组成的组：人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、促黄体激素(LH)、肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、苗勒抑制物质、小鼠促性腺素相关的肽、抑制素、活化素、血管内皮生长因子、整联蛋白、血小板生成素(TPO)、神经生长因子(NGF)、NGF-β、血小板生长因子、转化生长因子(TGF)、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子-I、胰岛素样生长因子-II、促红细胞生成素(EPO)、骨诱导因子、干扰素、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、干扰素-λ、集落刺激因子(CSF)、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)、粒细胞-CSF(G-CSF)、白细胞介素-1(IL-1)、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、LIF、kit-配体、FLT-3、血管抑素、血小板反应蛋白、内皮抑素、肿瘤坏死因子以及LT(淋巴毒素)。
41.如权利要求27所述的方法，其中所述异种抗原选自由以下组成的组：碳酸酐酶IX、α-胎蛋白、.α-辅肌动蛋白-4、A3、对A33抗体具有特异性的抗原、ART-4、B7、Ba 733、BAGE、BrE3抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8/m、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、结肠特异性抗原-p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-1、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、Flt-1、Flt-3、叶酸受体、G250抗原、GAGE、gp100、GROB、HLA-DR、HM1.24、人绒毛膜促性腺激素(HCG)和其亚基、HER2/neu、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF-1)、HSP70-2M、HST-2、Ia、IGF-1R、IFN-.γ、IFN-.α、IFN-.β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、KC4抗原、KS-1抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-I、MART-2、NY-ESO-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、对PAM-4抗体具有特异性的抗原、胎盘生长因子、p53、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、PlGF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES、T101、SAGE、5100、存活素、存活素-2B、TAC、TAG-72、腱生蛋白、TRAIL受体、TNF-.α、Tn抗原、汤姆森-弗里德里希抗原、肿瘤坏死抗原、VEGFR、ED-B纤连蛋白、WT-1、17-1A抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管生成标记物、bcl-2、bcl-6、Kras、cMET、致癌基因标记物以及致癌基因产物。
42.如权利要求23所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用选自由以下组成的组的治疗剂：抗体、抗体片段、药物、毒素、酶、激素、免疫调节剂、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、硼化合物以及放射性同位素。
CN201380028790.8A 2012-06-01 2013-05-24 具有改进的体内稳定性、药物代谢动力学和功效的多聚体复合物 Pending CN104363919A (zh)

Applications Claiming Priority (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261654310P 2012-06-01 2012-06-01
US61/654,310 2012-06-01
US201261662086P 2012-06-20 2012-06-20
US61/662,086 2012-06-20
US201261673553P 2012-07-19 2012-07-19
US61/673,553 2012-07-19
US201261682531P 2012-08-13 2012-08-13
US61/682,531 2012-08-13
US201261693042P 2012-08-24 2012-08-24
US61/693,042 2012-08-24
US201261694072P 2012-08-28 2012-08-28
US61/694,072 2012-08-28
PCT/US2013/042594 WO2013181087A2 (en) 2012-06-01 2013-05-24 Multimeric complexes with improved in vivo stability, pharmacokinetics and efficacy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104363919A true CN104363919A (zh) 2015-02-18

Family

ID=49670522

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380028790.8A Pending CN104363919A (zh) 2012-06-01 2013-05-24 具有改进的体内稳定性、药物代谢动力学和功效的多聚体复合物

Country Status (6)

Country Link
US (2) US9446123B2 (zh)
EP (1) EP2854845B1 (zh)
CN (1) CN104363919A (zh)
CA (1) CA2874541A1 (zh)
ES (1) ES2672974T3 (zh)
WO (1) WO2013181087A2 (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107406496A (zh) * 2015-03-10 2017-11-28 百时美施贵宝公司 可通过转谷氨酰胺酶缀合的抗体和由其制备的缀合物
WO2019029129A1 (zh) * 2017-08-07 2019-02-14 上海科新生物技术股份有限公司 一种针对IL-17和TNF-α的双特异性融合蛋白
CN110157801A (zh) * 2018-02-12 2019-08-23 清华大学 一种组合标志物及其在制备胃癌发生风险预测试剂盒中的应用及其测定系统和方法
CN112553256A (zh) * 2021-02-20 2021-03-26 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 Il-2受体复合物及其制备方法与应用
CN112638403A (zh) * 2018-07-03 2021-04-09 康泰伦特药物解决方案有限责任公司 包括饰胶蛋白聚糖的多功能蛋白质分子及其用途
CN118286491A (zh) * 2024-04-03 2024-07-05 美尔健（深圳）生物科技有限公司 一种灵芝黄酮的制备工艺及其应用

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170088635A1 (en) * 2004-02-13 2017-03-30 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Dock-and-Lock (DNL) Complexes for Therapeutic and Diagnostic Use
WO2012145714A2 (en) 2011-04-22 2012-10-26 Emergent Product Development Seattle, Llc Prostate-specific membrane antigen binding proteins and related compositions and methods
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
CN104974259B (zh) * 2014-04-01 2019-06-14 三生国健药业（上海）股份有限公司 抗vegf/pigf双特异性抗体、其制备方法及用途
US11566082B2 (en) 2014-11-17 2023-01-31 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
EA201890613A1 (ru) 2015-09-21 2018-10-31 Аптево Рисёрч Энд Девелопмент Ллс Полипептиды, связывающие cd3
US10889615B2 (en) 2016-05-11 2021-01-12 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
ES2874974T3 (es) 2016-05-11 2021-11-05 Cytiva Bioprocess R & D Ab Matriz de separación
US10703774B2 (en) 2016-09-30 2020-07-07 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
US10654887B2 (en) 2016-05-11 2020-05-19 Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab Separation matrix
US11708390B2 (en) 2016-05-11 2023-07-25 Cytiva Bioprocess R&D Ab Method of storing a separation matrix
CN109311948B (zh) 2016-05-11 2022-09-16 思拓凡生物工艺研发有限公司 清洁和/或消毒分离基质的方法
US10730908B2 (en) 2016-05-11 2020-08-04 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
US11779604B2 (en) 2016-11-03 2023-10-10 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses and methods
CA3078974A1 (en) * 2017-10-12 2019-04-18 Immunowake Inc. Vegfr-antibody light chain fusion protein
US11434291B2 (en) 2019-05-14 2022-09-06 Provention Bio, Inc. Methods and compositions for preventing type 1 diabetes
MX2022015872A (es) 2020-06-11 2023-05-16 Provention Bio Inc Metodos y composiciones para prevenir diabetes tipo 1.
KR20220029524A (ko) * 2020-08-31 2022-03-08 (주)메디톡스 항-ｖｅｇｆ 육량체 항체, 및 이를 포함하는 조성물
CN116888473A (zh) 2021-02-18 2023-10-13 豪夫迈·罗氏有限公司 用于解析复杂、多步骤抗体相互作用的方法
WO2024064804A2 (en) * 2022-09-23 2024-03-28 Frontaim Biomedicines, Inc. Molecularly grafted immunoglobulin with multiple functions or binding specificities

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006032909A2 (en) * 2004-09-24 2006-03-30 The University Of Oslo Pka ii anchoring disruption polypeptide
CN101374546A (zh) * 2005-12-16 2009-02-25 Ibc医药公司 基于多价免疫球蛋白的生物活性装配体
CN101583376A (zh) * 2005-04-06 2009-11-18 Ibc药品公司 具有多功能或结合特异性的明确组成的改进的稳定束缚结构
CN102119175A (zh) * 2008-04-10 2011-07-06 Ibc药品公司 采用停靠与锁(dnl)技术制备具有增强的药物动力学的四聚细胞因子的模块方法
CN102186499A (zh) * 2008-08-20 2011-09-14 Ibc医药公司 用于癌症治疗的对接和锁定(dnl)疫苗
CN102481349A (zh) * 2009-01-12 2012-05-30 诺华有限公司 抗革兰氏阳性细菌疫苗中的Cna_B结构域

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1541435A (en) 1975-02-04 1979-02-28 Searle & Co Immunological materials
US4624846A (en) 1983-07-29 1986-11-25 Immunomedics, Inc. Method for enhancing target specificity of antibody localization and clearance of non-target diagnostic and therapeutic principles
NL8501219A (nl) 1985-04-29 1986-11-17 Stichting Vrienden Van De Stic Immunologisch complex, de bereiding en toepassing daarvan.
US4699784A (en) 1986-02-25 1987-10-13 Center For Molecular Medicine & Immunology Tumoricidal methotrexate-antibody conjugate
US5770198A (en) 1988-05-18 1998-06-23 The Research Foundation Of The State Of New York Platelet-specific chimeric 7E3 immunoglobulin
US5364612A (en) 1991-05-06 1994-11-15 Immunomedics, Inc. Detection of cardiovascular lesions
US20040018587A1 (en) 1994-10-13 2004-01-29 Lee Makowski Nanostructures containing antibody assembly units
US20030198956A1 (en) 2002-02-21 2003-10-23 Lee Makowski Staged assembly of nanostructures
US5871945A (en) 1994-11-23 1999-02-16 Icos Corporation Modulators of anchoring protein function
US6261537B1 (en) 1996-10-28 2001-07-17 Nycomed Imaging As Diagnostic/therapeutic agents having microbubbles coupled to one or more vectors
US6306393B1 (en) 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
DE69922159T2 (de) * 1998-01-23 2005-12-01 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Mehrzweck-antikörperderivate
US7534866B2 (en) 2005-10-19 2009-05-19 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for generating bioactive assemblies of increased complexity and uses
US7666400B2 (en) 2005-04-06 2010-02-23 Ibc Pharmaceuticals, Inc. PEGylation by the dock and lock (DNL) technique
US7550143B2 (en) 2005-04-06 2009-06-23 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods for generating stably linked complexes composed of homodimers, homotetramers or dimers of dimers and uses
US6756039B1 (en) 1999-05-10 2004-06-29 The Regents Of The University Of California Self assembling proteins
US7527787B2 (en) * 2005-10-19 2009-05-05 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies
US7060506B2 (en) 2000-01-31 2006-06-13 Cyclacel, Ltd. Compositions and methods for monitoring the modification of modification dependent binding partner polypeptides
US6524854B1 (en) 2001-09-11 2003-02-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of PKA regulatory subunit RII alpha expression
US7432342B2 (en) 2002-05-03 2008-10-07 Sequenom, Inc. Kinase anchor protein muteins, peptides thereof and related documents
US7906118B2 (en) * 2005-04-06 2011-03-15 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Modular method to prepare tetrameric cytokines with improved pharmacokinetics by the dock-and-lock (DNL) technology
EA008866B1 (ru) 2002-12-26 2007-08-31 Маунтин Вью Фамэсьютикэлс, Инк. ПОЛИМЕРНЫЙ КОНЪЮГАТ МОДИФИКАЦИЙ ИНТЕРФЕРОНА-β, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ПРОДУКТЫ НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
JP2006526408A (ja) 2003-04-22 2006-11-24 アイビーシー、ファーマシューティカルズ 多価タンパク質複合体
US20110020273A1 (en) 2005-04-06 2011-01-27 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Bispecific Immunocytokine Dock-and-Lock (DNL) Complexes and Therapeutic Use Thereof
US8491914B2 (en) 2004-02-13 2013-07-23 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Dock-and-lock (DNL) complexes for delivery of interference RNA
US8034352B2 (en) 2005-04-06 2011-10-11 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Tetrameric cytokines with improved biological activity
US8551480B2 (en) 2004-02-13 2013-10-08 Immunomedics, Inc. Compositions and methods of use of immunotoxins comprising ranpirnase (Rap) show potent cytotoxic activity
US8883160B2 (en) 2004-02-13 2014-11-11 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Dock-and-lock (DNL) complexes for therapeutic and diagnostic use
US8562988B2 (en) 2005-10-19 2013-10-22 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Strategies for improved cancer vaccines
US8003111B2 (en) 2005-04-06 2011-08-23 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Dimeric alpha interferon pegylated site-specifically shows enhanced and prolonged efficacy in vivo
US20110064754A1 (en) 2005-03-03 2011-03-17 Center For Molecular Medicine And Immunology Immunoconjugates Comprising Poxvirus-Derived Peptides and Antibodies Against Antigen-Presenting Cells for Subunit-Based Poxvirus Vaccines
US7608425B2 (en) 2004-07-23 2009-10-27 Immunomedics, Inc. Methods for protein expression in mammalian cells in serum-free medium
EP3332808B1 (en) 2005-03-03 2020-09-09 Immunomedics Inc. Humanized l243 antibodies
US9623115B2 (en) 2005-04-06 2017-04-18 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Dock-and-Lock (DNL) Complexes for Disease Therapy
US8481041B2 (en) 2005-04-06 2013-07-09 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Dock-and-lock (DNL) constructs for human immunodeficiency virus (HIV) therapy
US8349332B2 (en) 2005-04-06 2013-01-08 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multiple signaling pathways induced by hexavalent, monospecific and bispecific antibodies for enhanced toxicity to B-cell lymphomas and other diseases
CA2604032C (en) 2005-04-06 2017-08-22 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods for generating stably linked complexes composed of homodimers, homotetramers or dimers of dimers and uses
US8475794B2 (en) 2005-04-06 2013-07-02 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy with anti-CD74 antibodies provides enhanced toxicity to malignancies, Autoimmune disease and other diseases
US20120276100A1 (en) 2005-04-06 2012-11-01 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Compositions and Methods of Use of Immunotoxins Comprising Ranpirnase (Rap) Show Potent Cytotoxic Activity
US8158129B2 (en) 2005-04-06 2012-04-17 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Dimeric alpha interferon PEGylated site-specifically shows enhanced and prolonged efficacy in vivo
US20100226884A1 (en) * 2009-01-20 2010-09-09 Immunomedics, Inc. Novel Class of Monospecific and Bispecific Humanized Antibodies that Target the Insulin-like Growth Factor Type I Receptor (IGF-1R)
AU2006302848C1 (en) 2005-10-19 2012-08-02 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for generating bioactive assemblies of increased complexity and uses
EP2016173A4 (en) 2006-05-15 2010-06-09 Immunomedics Inc METHOD AND COMPOSITIONS FOR TREATING HUMAN IMMUNODEFECT VIRUS INFECTIONS WITH CONJUGATED ANTIBODIES OR ANTIBODY FRAGMENTS
US8202509B2 (en) * 2007-01-11 2012-06-19 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for improved F-18 labeling of proteins, peptides and other molecules
JP5851943B2 (ja) * 2012-06-13 2016-02-03 アルパイン株式会社 車載用表示装置

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006032909A2 (en) * 2004-09-24 2006-03-30 The University Of Oslo Pka ii anchoring disruption polypeptide
CN101583376A (zh) * 2005-04-06 2009-11-18 Ibc药品公司 具有多功能或结合特异性的明确组成的改进的稳定束缚结构
CN101374546A (zh) * 2005-12-16 2009-02-25 Ibc医药公司 基于多价免疫球蛋白的生物活性装配体
CN102119175A (zh) * 2008-04-10 2011-07-06 Ibc药品公司 采用停靠与锁(dnl)技术制备具有增强的药物动力学的四聚细胞因子的模块方法
CN102186499A (zh) * 2008-08-20 2011-09-14 Ibc医药公司 用于癌症治疗的对接和锁定(dnl)疫苗
CN102481349A (zh) * 2009-01-12 2012-05-30 诺华有限公司 抗革兰氏阳性细菌疫苗中的Cna_B结构域

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107406496A (zh) * 2015-03-10 2017-11-28 百时美施贵宝公司 可通过转谷氨酰胺酶缀合的抗体和由其制备的缀合物
WO2019029129A1 (zh) * 2017-08-07 2019-02-14 上海科新生物技术股份有限公司 一种针对IL-17和TNF-α的双特异性融合蛋白
CN110157801A (zh) * 2018-02-12 2019-08-23 清华大学 一种组合标志物及其在制备胃癌发生风险预测试剂盒中的应用及其测定系统和方法
CN110157801B (zh) * 2018-02-12 2021-03-09 清华大学 一种组合标志物及其在制备胃癌发生风险预测试剂盒中的应用及其测定系统和方法
CN112638403A (zh) * 2018-07-03 2021-04-09 康泰伦特药物解决方案有限责任公司 包括饰胶蛋白聚糖的多功能蛋白质分子及其用途
CN112553256A (zh) * 2021-02-20 2021-03-26 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 Il-2受体复合物及其制备方法与应用
CN112553256B (zh) * 2021-02-20 2021-06-22 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 Il-2受体复合物及其制备方法与应用
CN118286491A (zh) * 2024-04-03 2024-07-05 美尔健（深圳）生物科技有限公司 一种灵芝黄酮的制备工艺及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2013181087A2 (en) 2013-12-05
US9446123B2 (en) 2016-09-20
US20160340443A1 (en) 2016-11-24
US20130323204A1 (en) 2013-12-05
CA2874541A1 (en) 2013-12-05
ES2672974T3 (es) 2018-06-19
EP2854845A2 (en) 2015-04-08
WO2013181087A3 (en) 2014-02-06
EP2854845A4 (en) 2015-11-18
EP2854845B1 (en) 2018-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2018236844B2 (en) T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
JP5999217B2 (ja) 二重特異性免疫サイトカインドック−アンド−ロック（ｄｎｌ）複合体及びその治療的使用
EP2854845B1 (en) Multimeric complexes with improved in vivo stability, pharmacokinetics and efficacy
US9737617B2 (en) Multiple signaling pathways induced by hexavalent, monospecific and bispecific antibodies for enhanced toxicity to B-cell lymphomas and other diseases
US8906378B2 (en) Combination therapy with anti-CD74 antibodies provides enhanced toxicity to malignancies, autoimmune disease and other diseases
CN102186499B (zh) 用于癌症治疗的对接和锁定(dnl)疫苗
CN107115526A (zh) 用于小体积施用的同种异型选择的抗体的超滤浓缩
AU2011292178B2 (en) Compositions and methods of use comprising combinations of anti-CD74 antibodies with a therapeutic agent. the therapeutic agent may be attached to the anti-CD74 antibody or may be separately administered, either before, simultaneously with or after the anti-CD74 antibody

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20150218