KR101899835B1 - 항-ｌｒｐ６ 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-LRP6 항체 및 그의 사용 방법을 제공한다. 본 발명의 특정한 측면은 다중 Wnt 이소형에 의한 신호전달을 억제하는 이중특이적 항-LRP6 항체를 제공한다.
[대표도]
도 11b

Description

항-ＬＲＰ６ 항체 {ANTI-LRP6 ANTIBODIES}
<관련 출원에 대한 상호 참조>
본 출원은 2010년 3월 24일에 출원된 미국 가출원 번호 61/317,137 및 2010년 10월 20일에 출원된 미국 가출원 번호 61/394,836을 우선권 주장하며, 이들의 개시문은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
<발명의 분야>
본 발명은 항-LRP6 항체 및 암 또는 골격 장애의 치료를 위한 그의 사용 방법에 관한 것이다.
대부분의 다른 모르포겐 및 성장 인자 신호전달 경로와 유사하게, 포유동물 Wnt 신호전달은 19개의 상이한 리간드, 10개의 수용체, 및 다수의 보조수용체 (LRP5/6, Ror1/2 및 Ryk 포함)의 사용을 통해 발생 및 조직 항상성 동안 여러 번 활용된다 (문헌 [van Amerongen and Nusse, 2009]). 또한, Wnt, 예컨대 SFRP1/2/3/4/5 및 WIF1, 또는 LRP5/6 (DKK1/2/4 및 SOST 포함)에 결합하는 상이한 분비된 길항제는 리간드와 수용체 사이의 상호작용을 조절한다. 이들 막 및 세포외 단백질 및 이들의 다수의 이소형은 발현 수준에서의 차별적 조절 및 조합 단백질 상호작용을 제공한다. 대부분의 Wnt 이소형은 보조수용체 LRP5/6에 결합할 수 있는 것으로 나타났으며, LRP5/6 사용은 정규, 또는 β-카테닌 의존성, Wnt 신호전달을 특정한다. Wnt는 LRP5/6 및 FZD를 이종이량체화시켜 LRP5/6 세포내 도메인의 인산화 및 Axin 결합을 매개한다 (문헌 [Tamai et al., 2000; Semenov et al., 2001; Tamai et al., 2004]). DVL은 Axin 및 FZD 둘 다로의 직접적인 결합에 의해 복합체로 유입되고, DVL 올리고머화는 GSK3을 격리시키고 그의 인산화 및 β-카테닌의 불안정화를 억제하는 이들 단백질 복합체를 막의 세포질 대향면 상에서 확장시킬 수 있다 (문헌 [Mi et al., 2006; Bilic et al., 2007; Schwarz-Romond et al., 2007; Cselenyi et al., 2008; Piao et al., 2008; Zeng et al., 2008; Wu et al., 2009]).
포유동물 정규 Wnt 신호전달을 매개하는, 상당한 일차 서열 다양성을 나타내는 특징적인 다수의 리간드 이소형은 고도로 상동성인 보조수용체의 쌍과 대조적이다. LRP6 및 LRP5 세포외 도메인은 주로 각각 YWTD-유형 β-프로펠러 및 EGF-유사 도메인을 함유하는, N-말단으로부터 C-말단까지 E1 내지 E4로 명명된 4개의 상동성 영역으로 이루어진다 (문헌 [Jeon et al., 2001]). LRP6 및 LRP5의 유사한 위치에서의 각 반복부는 고도로 보존되는 반면, 동일한 단백질 내의 상이한 반복부는 상당히 더 다양성을 갖는다. 흥미롭게도, 문헌 [Bourhis et al. (2010)]은 Wnt9b가 시험관내에서 전적으로 E1-E2 영역 내에 결합하는 한편, Wnt3a는 E3-E4를 함유하는 단편에만 결합한다는 것을 입증하였고, 이는 각 반복부 또는 2개의 인접한 반복부의 조합이 Wnt 이소형의 상이한 하위세트에 결합한다는 것을 시사한다. 이러한 배열은 Wnt 단백질의 다양성을 수용할 수 있고, 또한 아마도 LRP5/6 길항제 리간드에 의한 이들의 차별적 조절을 허용할 것이다. Notch 및 VEGF 수용체에서, 이들의 세포외 영역은 각각 EGF-유사 및 Ig 도메인의 반복부를 함유하고, 다수의 리간드 이소형의 결합은 다른 반복부의 존재가 결합을 증진시킬 수 있을지라도 1 또는 2개의 반복부의 동일한 영역에 위치한다. (문헌 [Rebay et al., 1991; Davis-Smyth et al., 1996; Cunningham et al., 1997]).
수용체 티로신 키나제의 경우, 리간드-유도된 이량체화는 키나제 활성 및 신호전달의 자극을 개시한다. 리간드-유도된 수용체-보조수용체 이종이량체화가 정규 Wnt 신호전달에 필요한 반면, LRP5/6 또는 FZD 동종이량체화에 대한 역할은 명확하게 규정되어 있지 않다. 상이한 재조합 LRP6 단백질의 강제적 이량체화는 Wnt 신호전달을 활성화시키거나 억제할 수 있다.
β-카테닌-의존성 Wnt 신호전달은 수용체 FZD 및 보조수용체 LRP5/6 둘 다로의 Wnt 이소형 결합에 의해 개시되고, 이는 이어서 키나제 GSK3을 동원하고 비활성화시키기 위해 세포질 막 대향면에서 다량체 착체를 조립한다. Wnt 이소형과 수용체 사이의 기계적으로 상이한 상호작용이 이 과정을 조절하는지 여부 및 그 방법이 결정되도록 남아있다.
<개요>
본 발명의 한 측면은 제1 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 억제하며 제2 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 강화시키는, LRP6에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 제1 Wnt 이소형은 Wnt3 및 Wnt3a로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 제2 Wnt 이소형은 Wnt 1, 2, 2b, 4, 6, 7a, 7b, 8a, 9a, 9b, 10a 및 10b로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 제1 Wnt 이소형은 Wnt 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b 및 10b로 이루어진 군으로부터 선택되고, 제2 Wnt 이소형은 Wnt3 및 Wnt3a로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 측면은 LRP6의 E3-E4 영역에 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 또 다른 측면은 LRP6의 E1-E2 영역에 결합하는 항체를 제공한다. 또 다른 측면은 LRP6의 2개의 상이한 영역, 예컨대 LRP6의 E1-E2 영역 및 E3-E4 영역에 결합하는 항체를 제공한다. 한 측면에서 이러한 항체는 Wnt1 및 Wnt3a의 조합에 의해 유도된 Wnt 신호전달을 억제한다. 한 측면에서 이러한 항체는 자가분비 Wnt 신호전달을 억제한다.
본 발명의 한 측면은 LRP6에 결합하며 Wnt3 및 Wnt3a로 이루어진 군으로부터 선택된 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 억제하는 단리된 항체 및 LRP6에 결합하며 Wnt 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b 및 10b로 이루어진 군으로부터 선택된 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 억제하는 단리된 항체의 유효량을 암을 갖는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 LRP6에 결합하며 Wnt3 및 Wnt3a에 의해 유도된 신호전달을 억제하는 단리된 항체 및 LRP6에 결합하며 Wnt 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b 및 10b에 의해 유도된 신호전달을 억제하는 단리된 항체의 유효량을 암을 갖는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 LRP6에 결합하며 Wnt3 및 Wnt3a에 의해 유도된 신호전달을 억제하는 단리된 항체 및 LRP6에 결합하며 Wnt 1, 2, 2b, 4, 6, 7a, 7b, 8a, 9a, 9b, 10a 및 10b에 의해 유도된 신호전달을 억제하는 단리된 항체의 유효량을 암을 갖는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 한 측면은 골격 장애, 예컨대 골다공증, 골관절염, 골절 및 골 병변을 갖는 개체에게 유효량의 본원에 기재된 항-LRP6 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 개체에게 유효량의 본원에 기재된 항-LRP6 항체 및 Wnt 이소형을 투여하여 Wnt 이소형에 의해 유도된 Wnt 신호전달을 강화시키는 것을 포함하는, 상기 개체에서 Wnt 이소형에 의해 유도된 Wnt 신호전달을 강화시키는 방법을 제공한다.
또한, 이중특이적 항-LRP6 항체를 포함하는 특정 항-LRP6 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, LRP6에 결합하는 단리된 항체는 서열 9, 서열 11, 서열 13 및 서열 15로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 10 및 서열 12를 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 더 포함한다. 한 실시양태에서, LRP6에 결합하는 단리된 항체는 서열 9, 서열 11, 서열 13 및 서열 15의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 한 실시양태에서, LRP6에 결합하는 단리된 항체는 서열 10 및 서열 12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL을 더 포함한다.
한 실시양태에서, 항체는 서열 9, 서열 11, 서열 13 및 서열 15로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는, LRP6의 2개의 상이한 영역에 결합하는 단리된 이중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 제1 VH 및 서열 9, 서열 11 및 서열 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제2 VH를 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 서열 10 및 서열 12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 더 포함한다.
한 실시양태에서, LRP6의 2개의 상이한 영역에 결합하는 이중특이적 항체는 서열 9, 서열 11, 서열 13 또는 서열 15로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 한 실시양태에서, LRP6의 2개의 상이한 영역에 결합하는 이중특이적 항체는 서열 15의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 VH 및 서열 9, 서열 11 및 서열 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 VH를 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 서열 10 및 서열 12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL을 더 포함한다.
한 실시양태에서, LRP6의 2개의 상이한 영역에 결합하는 단리된 이중특이적 항체는 (a) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제1 VH 도메인, 및 (d) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (e) 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (f) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제2 VH 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, LRP6의 2개의 상이한 영역에 결합하는 단리된 이중특이적 항체는 (a) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터의 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제1 VH 도메인을 포함하고, (d) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (e) 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (f) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터의 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제2 VH 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, LRP6의 2개의 상이한 영역에 결합하는 단리된 이중특이적 항체는 (a) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제1 VH 도메인을 포함하고, (d) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (e) 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (f) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제2 VH 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, LRP6의 2개의 상이한 영역에 결합하는 단리된 이중특이적 항체는 (a) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터의 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제1 VH 도메인을 포함하고, (d) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (e) 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (f) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터의 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제2 VH 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, LRP6의 2개의 상이한 영역에 결합하는 단리된 이중특이적 항체는 (a) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제1 VH 도메인을 포함하고, (d) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (e) 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (f) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제2 VH 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, LRP6의 2개의 상이한 영역에 결합하는 단리된 이중특이적 항체는 (a) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터의 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제1 VH 도메인을 포함하고, (d) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (e) 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (f) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터의 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제2 VH 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 실시양태의 이중특이적 항체는 (a) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; (c) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 더 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 실시양태의 이중특이적 항체는 (a) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; (c) 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 더 포함한다.
한 실시양태는 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 제1 VH 및 서열 9, 서열 11 및 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 VH로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 VH를 포함하는, LRP6의 2개의 상이한 영역에 결합하는 단리된 이중특이적 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 이러한 항체는 서열 10 또는 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 더 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 제1 VH 및 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 제2 VH 및 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 Wnt3 및 Wnt3a로 이루어진 군으로부터 선택된 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 억제하며 Wnt 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b 및 10b로 이루어진 군으로부터 선택된 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 억제한다. 한 실시양태에서 이중특이적 항체는 Wnt 4, 7a, 7b 및 10a로 이루어진 군으로부터 선택된 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 추가로 억제한다. 한 실시양태에서 이중특이적 항체는 자가분비 Wnt 신호전달을 억제한다.
본 발명의 한 측면은 Wnt3 및 Wnt3a로 이루어진 군으로부터 선택된 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 억제하며 Wnt 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b 및 10b로 이루어진 군으로부터 선택된 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 억제하는 이중특이적 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 Wnt 4, 7a, 7b 및 10a로 이루어진 군으로부터 선택된 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 추가로 억제한다.
본 발명의 한 측면은 본원에 기재된, 이중특이적 항체를 포함하는, 임의의 항-LRP6 항체와 LRP6에의 결합에 대해 경쟁하는 항체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 본원에 기재된 이중특이적 항체와 동일한 2개의 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 2개의 에피토프 중 1개는 LRP6의 아미노산 잔기 R28, E51, D52, V70, S71, E73, L95, S96, D98, E115, R141 및 N185를 포함한다. 한 실시양태에서, 2개의 에피토프 중 1개는 LRP6의 아미노산 잔기 R28, E51, D52, V70, S71, E73, L95, S96, D98, E115, R141, N185, R29, W188, K202, P225, H226, S243 및 F266을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 본원에 기재된 항-LRP6 항체를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 또 다른 측면은 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포를 공급한다.
본 발명의 한 측면은 본원에 기재된 항-LRP6 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체를 제공한다. 또 다른 측면은 본원에 기재된 항-LRP6 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 제제를 제공한다.
본 발명의 한 측면은 의약으로서 사용하기 위한 본원에 기재된 항-LRP6 항체를 제공한다. 한 측면은 암 또는 골격 장애의 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 항-LRP6 항체를 제공한다. 한 측면은 제1 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달의 억제 및 제2 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달의 강화에 사용하기 위한 본원에 기재된 항-LRP6 항체를 제공한다. 한 측면은 예를 들어 암 또는 골격 장애의 치료에 유용한 의약의 제조에 사용하기 위한 본원에 기재된 항-LRP6 항체의 용도를 제공한다.
본 발명의 한 측면은 암, 예컨대 비소세포 폐암, 유방암, 췌장암, 난소암, 신장암 및 전립선암을 갖는 개체에게 유효량의 본원에 기재된 항-LRP6 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체의 치료 방법을 제공한다.
도 1a. LRP6.E3-E4 단백질에 대한 항체에 의한 0.1 mg/ml 정제된 Wnt3a로 유도된 HEK293 세포에서의 Wnt 루시페라제 리포터 활성의 억제를 보여주는 그래프.
도 1b. 비자극되거나 Wnt3a로 유도되고, 지시된 LRP6 항체 또는 정제된 단백질로 처리된 HEK293 세포의 웨스턴 블롯 분석.
도 1c. YW210.09 항체가 HEK293 세포에서 Wnt3a 농도에 비례하는 방식으로 Wnt 리포터 유전자 활성을 강화시킨다는 것을 보여주는 그래프.
도 2a. 루시페라제 리포터로 형질감염되고, LRP6 항체로 개별적으로 또는 조합하여 처리된 또는 Fzd8CRD-Fc 단백질로 처리된 PA-1 기형암종 세포에서의 자가분비 Wnt 신호전달의 농도-의존성 억제 및 강화를 보여주는 그래프.
도 2b. 0.3 mg/ml Wnt3a 단백질로 처리 또는 비처리되고, 10 mg/ml YW211.31 항체, 항-gD 모노클로날 항체 (음성 대조군) 또는 Fzd8CRD-Fc 단백질 (양성 대조군)로 처리된 PA-1 세포에서의 Wnt-유도된 유전자 SAX1 및 GAD1 및 Wnt-저해된 유전자 LEFTY2의 qPCR 발현 분석의 결과를 보여주는 그래프. 데이터는 Wnt3a를 첨가하지 않은 (NA) 세포로부터의 샘플에 대해 정규화된다.
도 3. 세포주에서 자가분비 신호전달에 대한 LRP6 항체 및 Fzd8CRD-Fc 단백질의 효과를 보여주는 요약 표.
도 4a. 0.2 μg/ml Wnt3a의 존재 및 부재 (NA) 하에 25 μg/ml YW211.31.57 항체 또는 Fzd8CRD-Fc 단백질로 처리된 4개의 세포주에서의 AXIN2 mRNA의 qPCR 발현 분석의 결과를 도시하는 그래프.
도 4b. NCI-H23 세포에서 Wnt-유도된 유전자의 발현이 YW211.31.57에 의해 강화되고 YW210.09 항체 (30 μg/ml)에 의해 길항된다는 것을 도시하는 그래프. CD4-Fc 단백질 (30 μg/ml)은 음성 대조군으로 작용한다.
도 4c. M14 세포에서의 Wnt-유도된 유전자의 발현이 YW211.31.57에 의해 강화되고, YW210.09 항체 (30 μg/ml)에 의해 길항된다는 것을 도시하는 그래프.
도 4d. Wnt 루시페라제 리포터와 안정하게 통합된 Hs578T 세포에서의 YW211.31.57 항체에 의한 Wnt3a-자극된 신호전달의 농도-의존성 억제를 보여주는 그래프.
도 4e. Wnt 루시페라제 리포터와 안정하게 통합된 Hs578T 세포에서의 YW211.31.57 항체에 의한 자가분비 Wnt 신호전달 신호전달의 농도-의존성 강화를 보여주는 그래프.
도 4f. Wnt 루시페라제 리포터로 형질감염된 EKVX 세포가 YW211.31.57 항체에 의한 자가분비 Wnt 신호전달 (NA)의 강화 및 Wnt3a-유도된 신호전달의 길항작용을 나타낸다는 것을 보여주는 그래프.
도 4g. 자가분비 Wnt 신호전달의 항체-매개 강화가 5 μg/ml Fzd8CRD-Fc 단백질에 의해 억제된다는 것을 보여주는 그래프.
도 5. Wnt 루시페라제 리포터와 안정하게 통합된 HEK293 또는 Hs578T 세포주에서 Wnt 이소형에 대한 발현 구축물의 형질감염에 의해 유도된 신호전달에 대한 10 mg/ml LRP6 항체 또는 Fzd8CRD-Fc 단백질의 효과의 요약 표. Wnt 루시페라제 리포터의 발현은 동일한 발현 구축물로 형질감염되었으나 단백질로 비처리된 세포에서 세포 수에 대해 정규화되고 수준에 대해 추가로 정규화된다.
도 6. Wnt 루시페라제 리포터와 안정하게 통합된 HEK293 세포주에서 신호전달에 대한 10 mg/ml LRP6 항체 또는 Fzd8CRD-Fc 단백질의 효과의 요약 표. 신호전달은 FZD 이소형 또는 LRP6에 융합된 Wnt 이소형으로 이루어진 키메라 단백질에 대한 발현 구축물의 형질감염에 의해 유도되었다. Wnt 루시페라제 리포터의 발현은 동일한 발현 구축물로 형질감염되었으나 단백질로 비처리된 세포에서 세포 수에 대해 정규화되고 수준에 대해 추가로 정규화된다.
도 7. Wnt 루시페라제 리포터와 안정하게 통합된 세포주에서 Wnt 이소형에 대한 발현 구축물의 형질감염에 의해 유도된 신호전달에 대한 10 mg/ml LRP6 항체 또는 항체 조합의 효과의 요약 표. Wnt 루시페라제 리포터의 발현은 동일한 발현 구축물로 형질감염되었으나 단백질로 비처리된 세포에서 세포 수에 대해 정규화되고 수준에 대해 추가로 정규화된다.
도 8a. YW211.31.57 및 YW210.09 항체의 조합이 Wnt3a, Wnt1, 또는 Wnt3a 및 Wnt1 둘 다의 발현을 위해 형질감염된, Wnt 루시페라제 리포터와 안정하게 통합된 HEK293 세포에서 신호전달을 억제한다는 것을 보여주는 그래프. 항-gD 항체 및 Fzd8CRD-Fc 단백질은 Wnt 신호전달의 억제에 대해 각각 음성 또는 양성 대조군으로 제시된다.
도 8b. YW211.31.57 및 YW210.09 항체의 조합이 Hs578T 세포에서 자가분비 Wnt 신호전달을 강화시킨다는 것을 보여주는 그래프.
도 8c. YW211.31.57 및 YW210.09 항체의 조합이 EKVX 세포에서 자가분비 Wnt 신호전달을 강화시킨다는 것을 보여주는 그래프.
도 9a 및 b. YW211.31.57 항체가 LRP6에의 Wnt3a 및 Wnt9b의 결합을 억제하고, YW210.09 항체는 오직 Wnt9b 결합을 억제한다는 것을 나타내는, 스트렙타비딘 바이오센서 상에 고정된 비오티닐화 LRP6 E1-E4 단백질로의 생체층 간섭법 검정.
도 9c. Wnt3a가 E3-E4 영역에 결합하고, 이러한 상호작용이 무손상 또는 1-아암 YW211.31 항체에 의해 차단된다는 것을 보여주는, LRP6의 보다 작은 비-중첩 단편으로의 생체층 간섭법 검정.
도 9d. YW210.09 항체가 LRP6 E1-E2 단백질 단편에 결합하고, Wnt9b 결합과 경쟁한다는 것을 보여주는, LRP6의 보다 작은 비-중첩 단편으로의 생체층 간섭법 검정.
도 9e. YW211.31.57 및 YW210.09 항체가 독립적인 에피토프를 확인하면서 임의의 순서로 순차적으로 첨가되었을 때 고정된 LRP6.E1-E4 단백질에 함께 결합할 수 있다는 것을 보여주는 생체층 간섭법 검정.
도 10a. 마우스를 YW210.09 항체로 처리하였을 때 Fzd8CRD-Fc 단백질에서 관찰된 것과 유사한 성장의 MMTV-Wnt1 동종이식 종양 퇴행을 보여주는 그래프.
도 10b. Ntera-2 이종이식 종양이 무손상 또는 1-아암 YW211.31 항체로 처리된 마우스에서 qPCR 분석에 의해 SP5 mRNA의 감소된 발현을 나타내지만, YW210.09 항체로 처리한 경우에는 그렇지 않다는 것을 보여주는 그래프.
도 10c. 배양물에서 마우스 두개관 체외이식편의 YW210.09 항체 처리가 RANK-Fc 단백질로의 처리와 유사하게 석회화된 두정골의 골 무기질 밀도 (BMD)를 유의하게 증가시키지만 YW211.31.62 항체 처리의 경우에는 그렇지 않다는 것을 보여주는 그래프.
도 11a. 이. 콜라이(E. coli) 또는 HEK293 세포에서 생산된 이중특이적 항-LRP6 항체가 0.1 μg/ml 정제된 Wnt3a로 유도된 HEK293 세포에서의 Wnt 루시페라제 리포터 활성을 농도-의존성 방식으로 유사하게 억제한다는 것을 보여주는 그래프. IC50 값은 각각 0.032 및 0.014 μg/ml이다.
도 11b. 0.1 μg/ml Wnt3a에 의한 자극의 존재 (c) 또는 부재 (b) 하에 지시된 대조 완충제 (PBS), 항체, 항체 조합 또는 Fzd8CRD-Fc 단백질 (각각 10 μg/ml)로 처리된, Wnt 루시페라제 리포터와 안정하게 통합된 PA-1 및 M14 세포 및 리포터로 형질감염된 CAL-51 세포에서 자가분비 Wint 신호전달에 대한 지시된 대조 완충제 (PBS), 항체, 항체 조합 또는 Fzd8CRD-Fc 단백질 (각각 10 μg/ml)로의 처리의 효과를 보여주는 그래프.
도 11c. 0.1 μg/ml Wnt3a에 의해 자극된, Wnt 루시페라제 리포터와 안정하게 통합된 PA-1 및 M14 세포 및 리포터로 형질감염된 CAL-51 세포에 대한 지시된 대조 완충제 (PBS), 항체, 항체 조합 또는 Fzd8CRD-Fc 단백질 (각각 10 μg/ml)로의 처리의 효과를 보여주는 그래프.
도 12. Wnt 루시페라제 리포터와 안정하게 통합된 HEK293 또는 Hs578T 세포주에서 Wnt 이소형에 대한 발현 구축물의 형질감염에 의해 유도된 신호전달에 대한 항체 또는 Fzd8CRD 단백질 (10 μg/ml)의 효과의 요약 표.
도 13a. Wnt3a 형질감염의 존재 또는 부재 하의 및 지시된 항체 또는 Fzd8CRD-Fc 단백질 (5 μg/ml)로 18시간 동안 처리된 HEK293 세포의 웨스턴 분석. β-액틴 또는 GAPDH 단백질 수준은 각각 상부 및 하부 겔에 대한 샘플 부하 대조군으로 제시된다.
도 13b. 30 mg/kg LRP6 이중특이적 항체 또는 Fzd8CRD 단백질로 16시간 처리된 SCID-bg 마우스에서의 M14 이종이식 종양이 qPCR 분석에 의해 AXIN2 및 APCDD1 mRNA의 감소된 발현을 나타내지만, 대조군 항-gD 항체로 처리된 경우에는 그렇지 않다는 것을 보여주는 그래프.
도 14. NAVK 모티프에 의해 만들어진 상호작용의 중요한 네트워크를 보여주는, LRP6 그루브의 잔기와의 CDR H3 상호작용의 상세도.
도 15. CDR H1,2, L1,2 및 3에 의해 만들어진 상호작용의 세부사항.
도 16. 카바트 CDR을 보여주는 예시적인 항-LRP6 항체의 중쇄 가변 영역 (VH).
도 17. 카바트 CDR을 보여주는 예시적인 항-LRP6 항체의 경쇄 가변 영역 (VL).
<본 발명의 실시양태의 상세한 설명>
I. 정의
본원의 목적을 위해 "수용자 인간 프레임워크"는 아래에서 정의되는 바와 같이 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 (VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크 "로부터 유래된" 수용자 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다. 일부 실시양태에서, VL 수용자 인간 프레임워크는 VL 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 서열이 동일하다.
"친화도"는 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같은 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내인성 결합 친화도를 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 방법을 포함하는 당업계에 공지된 통상의 방법으로 측정할 수 있다. 결합 친화도 측정을 위한 구체적 및 예시적 실시양태를 아래에 기재한다.
"친화도 성숙" 항체는 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는 변경을 갖지 않는 부모 항체에 비해 하나 이상의 초가변 영역 (HVR) 내의 하나 이상의 변경을 갖는 항체를 지칭한다.
용어 "항-LRP6 항체" 및 "LRP6에 결합하는 항체"는 항체가 LRP6을 표적화하는데 있어 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 LRP6에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 관련되지 않은 비-LRP6 단백질에의 항-LRP6 항체의 결합의 정도는 예를 들어 방사성면역검정 (RIA)에 의해 측정된 바와 같이 LRP6에의 상기 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, LRP6에 결합하는 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 상이한 종으로부터의 LRP6 사이에 보존된 LRP6의 에피토프에 결합한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 바람직한 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 항체 구조를 포함한다.
"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 일부를 포함하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편들로 형성된 다중특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
참조 항체로서 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 검정에서 참조 항체가 그의 항원에 결합하는 것을 50％ 이상 차단하는 항체, 및 반대로 참조 항체가 경쟁 검정에서 항체가 그의 항원에 결합하는 것을 50％ 이상 차단하는 것을 지칭한다. 예시적인 경쟁 검정이 본원에 제공된다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 기재한다. 암의 예는 암종, 림프종 (예를 들어, 호지킨 및 비-호지킨 림프종), 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예는 편평세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포암, 위장암, 충수암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 백혈병 및 다른 림프구증식성 장애, 및 다양한 유형의 두경부암을 포함한다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물을 지칭한다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시클로스포스파미드 (시톡산(CYTOXAN)®); 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메트우레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민 (알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올로멜라민 포함); 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀(MARINOL)®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜치신; 베툴린산; 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 (히캄틴(HYCAMTIN)®), CPT-11 (이리노테칸, 캄프토사르(CAMPTOSAR)®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴 및 9-아미노캄프토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체 KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로소우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예컨대 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 (예를 들어, 문헌 [Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); CDP323, 경구 알파-4 인테그린 억제제; 다이네미신 (다이네미신 A 포함); 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 발색단백질 에네디인 항생 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (아드리아마이신(ADRIAMYCIN)®, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포솜 주사(독실(DOXIL)®), 리포솜 독소루비신 TLC D-99(미오세트(MYOCET)®), peg화 리포솜 독소루비신 (카엘릭스(CAELYX)®) 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물, 예컨대 메토트렉세이트, 겜시타빈 (겜자르(GEMZAR)®), 테가푸르(우프토랄(UFTORAL)®), 카페시타빈(젤로다(XELODA)®), 에포틸론 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄; 엽산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 다당류 복합체 (제이에이치에스 내츄럴 프로덕츠 (JHS Natural Products, 오레곤주 유진)); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2'-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신 (엘디신(ELDISINE)®, 필데신(FILDESIN)®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (탁솔(TAXOL)®); 파클리탁셀의 알부민-조작 나노입자 제제 (아브락산(ABRAXANE)TM), 및 독세탁셀 (탁소테레(TAXOTERE)®); 클로란부실; 6-티오구아닌; 메르캅토푸린; 메토트렉세이트; 백금 제제, 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴 (예를 들어, 엘록사틴(ELOXATIN)®) 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (벨반(VELBAN)®), 빈크리스틴 (온코빈(ONCOVIN)®), 빈데신 (엘디신®, 필데신®), 및 비노렐빈 (나벨빈(NAVELBINE)®)을 비롯한, 튜불린 중합이 미세소관을 형성하는 것을 방지하는 빈카; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토크산트론; 류코보린; 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산 (벡사로텐 (타르그레틴(TARGRETIN)®) 포함); 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스(BONEFOS)® 또는 오스탁(OSTAC)®), 에티드로네이트 (디드로칼(DIDROCAL)®), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (조메타(ZOMETA)®), 알렌드로네이트 (포사맥스(FOSAMAX)®), 파미드로네이트 (아레디아(AREDIA)®), 틸루드로네이트 (스켈리드(SKELID)®), 또는 리세드로네이트 (악토넬(ACTONEL)®); 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상 세포 증식에 관여하는 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것, 예컨대 예를 들어 PKC-알파, Raf, H-Ras, 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예컨대 테라토프(THERATOPE)® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어 알로벡틴(ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)® 백신, 및 백시드(VAXID)® 백신; 토포이소머라제 1 억제제 (예를 들어, 루르토테칸(LURTOTECAN)®); rmRH (예를 들어, 아바렐릭스(ABARELIX)®); BAY439006 (소라페닙; 바이엘(Bayer)); SU-11248 (수니티닙, 수텐트(SUTENT)®, 화이자(Pfizer)); 페리포신, COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕시브 또는 에토리콕시브), 프로테오솜 억제제 (예를 들어, PS341); 보르테조밉 (벨케이드(VELCADE)®); CCI-779; 티피파르닙 (R11577); 오라페닙, ABT510; Bcl-2 억제제, 예컨대 오블리머센 나트륨 (게나센스(GENASENSE)®); 픽산트론; EGFR 억제제 (하기 정의 참조); 티로신 키나제 억제제(하기 정의 참조); 세린-트레오닌 키나제 억제제, 예컨대 라파마이신 (시롤리무스, 라파뮨(RAPAMUNE)®); 파르네실트랜스퍼라제 억제제, 예컨대 로나파르닙 (SCH 6636, 사라사르(SARASAR)TM); 및 상기한 것 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기한 것 중 2종 이상의 조합물, 예컨대 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 요법에 대한 약어) 및 FOLFOX (5-FU 및 류코보린과 조합된 옥살리플라틴 (엘록사틴TM)을 이용한 치료 요법에 대한 약어)를 포함한다.
본원에 정의된 바와 같은 화학요법제는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제하는 작용을 하는 "항호르몬 작용제" 또는 "내분비 치료제"를 포함한다. 이들은 혼합된 효능제/길항제 프로파일을 갖는 항에스트로겐, 예를 들어 타목시펜 (놀바덱스(NOLVADEX)®), 4-히드록시타목시펜, 토레미펜 (파레스톤(FARESTON)®), 이독시펜, 드롤록시펜, 랄록시펜 (에비스타(EVISTA)®), 트리옥시펜, 케옥시펜, 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절자 (SERM), 예컨대 SERM3; 효능제 특성을 갖지 않는 순수한 항에스트로겐, 예컨대 풀베스트란트 (파슬로덱스(FASLODEX)®) 및 EM800 (이같은 작용제는 에스트로겐 수용체 (ER) 이량체화를 차단하고/거나, DNA 결합을 억제하고/거나, ER 턴오버를 증가시키고/거나 ER 수준을 저해할 수 있음); 아로마타제 억제제, 예를 들어 스테로이드성 아로마타제 억제제, 예컨대 포르메스탄 및 엑세메스탄 (아로마신(AROMASIN)®), 및 비스테로이드성 아로마타제 억제제, 예컨대 아나스트라졸 (아리미덱스(ARIMIDEX)®), 레트로졸 (페마라(FEMARA)®) 및 아미노글루테티미드, 및 다른 아로마타제 억제제, 예를 들어 보로졸 (리비소르(RIVISOR)®), 메게스트롤 아세테이트 (메가세(MEGASE)®), 파드로졸 및 4(5)-이미다졸; 황체화 호르몬-방출 호르몬 효능제, 예를 들어 류프롤리드 (루프론(LUPRON)® 및 엘리가드(ELIGARD)®, 고세렐린, 부세렐린 및 트립테렐린; 성 스테로이드, 예를 들어 프로게스틴, 예컨대 메게스트롤 아세테이트 및 메드록시프로게스트론 아세테이트, 에스트로겐, 예컨대 디에틸스틸베스트롤 및 프레마린, 및 안드로겐/레티노이드, 예컨대 플루옥시메스테론, 모든 트랜스레티온산 및 펜레티니드; 오나프리스톤; 항프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향 조절제 (ERD); 항안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 및 상기한 것 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기한 것 중 2 종 이상의 조합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 호르몬 그 자체일 수 있다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 공급원 또는 종으로부터 유래된 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 다른 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.
항체의 "클래스"는 그의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 5가지 주요 클래스의 항체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 서브클래스 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 상이한 클래스의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "세포독성제"는 세포 기능의 억제 또는 저해 및/또는 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 세포독성제는 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제 또는 약물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제); 성장 억제제; 효소 및 그의 단편, 예컨대 뉴클레오티드분해 효소; 항생제; 독소, 예컨대 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소 활성 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함); 및 아래에서 개시되는 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
"이펙터 기능"은 항체 이소형에 따라 상이한, 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
작용제, 예를 들어 제약 제제의 "유효량"은 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안 바람직한 치료 또는 예방 결과를 달성하기에 유효한 양을 지칭한다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 이 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카르복실-말단으로 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같이 EU 인덱스로도 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 하기 FR 도메인으로 이루어진다: FR1, FR2, FR3 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 본원에서 교환가능하게 사용되며, 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 본원에서 정의된 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 교환가능하게 사용되고, 외인성 핵산이 도입된 세포 (이러한 세포의 자손 포함)를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이는 1차 형질전환된 세포 및 계대배양 횟수와 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 부모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일하지 않을 수 있으나, 돌연변이를 함유할 수 있다. 본래 형질전환된 세포에 대해 스크리닝 또는 선택되는 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 이용하여 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확하게 제외된다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택시 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 행한다. 일반적으로, 서열의 하위군은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에서와 같은 하위군이다. 한 실시양태에서, VL의 경우에 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH의 경우에 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 하위군 III이다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 실질적으로 적어도 하나, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR)은 비-인간 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열이 초가변성이고/이거나 구조적으로 한정된 루프 ("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 각각의 영역을 의미한다. 일반적으로, 천연 4-쇄 항체는 하기 6개의 HVR을 포함한다; VH 내의 3개 (H1, H2, H3) 및 VL 내의 3개 (L1, L2, L3). HVR은 일반적으로 초가변 루프로부터의 및/또는 "상보성 결정 영역" (CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 후자는 서열 변동성이 가장 높고/거나 항원 인식과 관련된다. 예시적인 초가변 루프는 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3)에서 발생한다. (문헌 [Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]). 예시적인 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 24-34, L2의 50-56, L3의 89-97, H1의 31-35B, H2의 50-65 및 H3의 95-102에서 발생한다. (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]). VH 내의 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원에 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기", 즉 "SDR"을 포함한다. SDR은 단축-CDR, 또는 a-CDR로 불리는 CDR의 영역 내에 함유된다. 예시적인 a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2, 및 a-CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 31-34, L2의 50-55, L3의 89-96, H1의 31-35B, H2의 50-58, 및 H3의 95-102에서 발생한다. (문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조). 달리 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인 내의 다른 잔기 (예를 들어, FR 잔기)는 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따라 넘버링된다.
"면역접합체"는 세포독성제를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분에서 분리된 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는 예를 들어 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전 포커싱 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정된 바와 같이 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제한다. 항체 순도의 평가 방법의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌 [Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조한다.
"단리된" 핵산은 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 통상적으로 함유하는 세포에 함유되는 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체 외에 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"항-LRP6 항체를 코딩하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 그의 단편)를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자 (단일 벡터 또는 별도의 벡터 내의 이러한 분자(들) 및 숙주 세포에서 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들) 포함)를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하기 위해 사용되고, 즉 이러한 집단을 구성하는 개별 항체는 일반적으로 소량으로 존재할 수도 있는, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 포함하거나 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 생성되는 가능한 변이체 항체를 제외하고는 동일하고/하거나, 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단결정자에 대해 지시된다. 따라서, 수식 어구 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 얻은 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체 제조를 필요로 하는 것으로서 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 이뮤노글로불린 로커스의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조할 수 있고, 상기 방법 및 모노클로날 항체를 제조하기 위한 다른 예시적인 방법이 본원에 기재된다.
"네이키드 항체"는 이종 모이어티 (예를 들어, 세포독성 모이어티) 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체를 지칭한다. 네이키드 항체는 제약 제제에 존재할 수 있다.
"천연 항체"는 변화하는 구조를 갖는 자연 발생 이뮤노글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 디술피드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 이루어진 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 중쇄는 가변 영역 (VH) (또한 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로 불림)에 이어 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 영역 (VL) (또한 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로 불림)에 이어 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2가지 유형 중 하나로 분류될 수 있다.
용어 "포장 삽입물"은 적응증, 사용, 투여량, 투여, 조합 요법, 금기사항, 및/또는 이러한 치료 제품의 사용에 대한 경고에 대한 정보를 함유하는, 치료 제품의 상업용 패키지에 통상적으로 포함되는 설명서를 지칭하기 위해 사용된다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(％)"는 서열을 정렬시키고 필요한 경우에는 최대 서열 동일성 퍼센트 달성을 위해 갭을 도입한 후 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않으면서 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 당업계 기술 범위 내의 다양한 방법, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린(Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교할 전장 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 서열 정렬에 적절한 파라미터를 정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상, 아미노산 서열 동일성 ％ 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.) 소유로서, 원시 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱턴 디.씨.)에 사용자 문서로 제출되어 있고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크. (캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코)를 통해 공개적으로 이용가능하거나, 원시 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 비롯하여 UNIX 운영 시스템에서 사용되도록 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 있으며 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 ％ (대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대해 특정 아미노산 서열 동일성 ％를 갖거나 또는 이를 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라는 어구로 기재될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다:
100 x X/Y의 분율
여기서, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 A 및 B의 프로그램 정렬시에 상기 프로그램에 의해 동일한 매치로 스코어링된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 전체 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에는 B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 ％가 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 ％와 동일하지 않을 것임을 이해할 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 ％ 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 상기 단락에 기재한 바와 같이 수득한다.
용어 "제약 제제"는 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태로 존재하며, 제제가 투여될 대상체에게 허용되지 않는 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"제약상 허용되는 담체"는 대상체에게 비독성인, 활성 성분 이외의 다른 제약 제제 내의 성분을 지칭한다. 제약상 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "LRP6"은 달리 나타내지 않는 한 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 비롯한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 LRP6을 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 비프로세싱된 LRP6 뿐만 아니라 세포에서의 프로세싱으로부터 생성된 임의의 형태의 LRP6을 포함한다. 상기 용어는 또한 LRP6의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 인간 LRP6의 아미노산 서열은 서열 29에 제시된다. 또한, NCBI 등록 번호 AAI43726, 문헌 [Strausberg, R. L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 : 16899-16903 (2002) (He, X, et al., Development, 131:1663-1677 (2004); Chen, M., et al., J. Biol. Chem., 284:35040-35048 (2009)]을 참조한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료" (및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 문법적 변형 형태)는 치료할 개체의 자연적 과정을 변경시키고자 하는 임상적 개입을 지칭하고, 임상적 병리상태의 예방을 위해 또는 임상적 병리상태의 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 호전, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 전이의 방지, 질환 질행 속도의 감소, 질환 병태의 호전 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환의 발생을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 느리게 하기 위해 사용된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체를 항원에 결합시킬 때 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 초가변 영역 (HVR)을 포함한다. (예를 들어, 문헌 [Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조.) 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정한 항원에 결합하는 항체는 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 그 벡터가 연결된 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 이 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라 벡터가 그 내부로 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 통합되는 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그 벡터가 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
II. 조성물 및 방법
본 발명은 일부 Wnt 이소형에 의한 신호전달을 억제하고 다른 이소형에 의한 신호전달을 강화시키는 예상하지 못한 능력을 갖는 항-LRP6 항체를 제공한다. 실시예에 기재되는 바와 같이, 특성화된 2개의 항-LRP6 항체는 추가로 대부분의 Wnt에 대해 하나는 항체 길항이고 다른 하나는 강화인 상호 활성을 나타낸다. 이들 2개의 항체는 (상이한 Wnt 이소형과 마찬가지로) LRP6의 상이한 영역에 결합하고, 신호전달의 억제는 Wnt 결합 차단으로부터 일어난다.
본 발명의 항-LRP6 항체와의 기능적 상호작용을 기반으로, 시험된 14개의 Wnt 이소형을 3개의 클래스로 분류할 수 있다: Wnt3 및 Wnt3a는 항-LRP6 항체 YW211.31에 의해 억제되고 항-LRP6 항체 YW210.09에 의해 강화됨; Wnt 1, 2, 2B., 6, 8A, 9A, 9B 및 10B는 항-LRP6 항체 YW211.31에 의해 강화되고 항-LRP6 항체 YW210.09에 의해 길항됨; 및 Wnt 4, 7A, 7B 및 10A는 항-LRP6 항체 YW211.31에 의해 강화되고 항-LRP6 항체 YW210.09에 의해 억제되지 않음 (도 3c). 이러한 분류는 Wnt3/3a 서브패밀리가 가장 진화적으로 다양한 것일지라도 Wnt 유전자의 제안된 계통발생에 분명하게 상응하지 않는다 (문헌 [Cho et al., 2010]). 상이한 클래스의 Wnt 이소형을 억제하는 항-LRP6 항체의 조합을 사용하여 Wnt 신호전달과 관련된 질환을 치료하기에 효과적인 요법을 제공할 수 있다.
LRP6의 항체-매개 이량체화는 Wnt 이소형이 또한 아마도 FZD를 동원하면서 복합체에 결합할 수 있을 때에만 신호전달을 강화시킬 수 있다. 상이한 종양 세포에서의 내인성 자가분비 Wnt 신호전달은 LRP6 항체에 의해 길항되거나 증진될 수 있다. 이러한 보조수용체-리간드 상호작용의 복잡성은 Wnt 이소형에 의한 신호전달의 차별적 조절을 허용할 수 있고, 항체와 이용되어 특정 조직 또는 질환 상태에서 Wnt 신호전달을 차별적으로 조작할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 일부 세포형에서 자가분비, 또는 내인성, Wnt 신호전달을 억제하고 다른 세포형에서 자가분비 신호전달을 강화시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 LRP6의 이량체화를 매개하고, 동시에 LRP6에 결합하는 Wnt 이소형의 존재 하에 신호전달을 증진시키거나 강화시킨다. 일부 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 Wnt 길항제, 예컨대 DKK 이소형 및 SOST의 결합을 억제함으로써 Wnt 신호전달을 강화시킨다.
항-LRP6 항체를 사용하여 Wnt 이소형 유도된 신호전달에 의해 활성화된 또는 억제된 과정을 선택적으로 조절할 수 있다. 이러한 과정은, 예를 들어 상이한 암 유형에서의 세포 증식, 세포 운명 결정 및 줄기 세포 자가-재생, 및 발생 과정을 포함한다. 항-LRP6은 예를 들어 Wnt 매개 장애, 예컨대 암, 및 골 또는 골격계의 장애 및 혈관 장애의 치료에 유용하다. 항-LRP6 항체를 사용하여 치료될 수 있는 암의 예는 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 간세포암, 위장암, 췌장암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암 (신세포 암종 포함), 간암, 전립선암을 포함한다. 항-LRP6 항체를 사용하여 치료될 수 있는 골격 또는 골 장애의 예는 골다공증, 골관절염, 골절 및 골 병변을 포함한다. 항-LRP6 항체를 사용하여 치료될 수 있는 혈관 장애의 예는 망막 혈관 질환, 예컨대 노리병, 골다공증-가성신경교종 증후군 (OPPG), 가족성 삼출 유리체망막병증 (FEVR), 미숙아 망막병증 (ROP), 당뇨병성 망막병증, 연령-관련 황반 변성, 미숙아 망막병증, 코츠병 및 코츠 유사 반응, 및 망막 동맥 또는 정맥 폐쇄, 및 심근-관련 상태, 예컨대 심근경색 및 허혈성 심장 질환을 포함한다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 억제하며 또 다른 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 강화시키는, LRP6에 결합하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 Wnt3 및/또는 Wnt3a에 의한 신호전달을 억제한다. 한 실시양태에서, 항체는 Wnt 1, 2, 2b, 4, 6, 7a, 7b, 8a, 9a, 9b, 10a 및/또는 10b에 의한 신호전달을 강화시킨다. 한 실시양태에서, 항체는 Wnt3 및/또는 Wnt3a에 의한 신호전달을 억제하며 Wnt 1, 2, 2b, 4, 6, 7a, 7b, 8a, 9a, 9b, 10a 및/또는 10b에 의한 신호전달을 강화시킨다. 한 실시양태에서, 항체는 Wnt3 및 Wnt3a에 의한 신호전달을 억제하며 Wnt 1, 2, 2b, 4, 6, 7a, 7b, 8a, 9a, 9b, 10a 및 10b에 의한 신호전달을 강화시킨다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 LRP6의 E3-E4 영역 (제1 및 제2 베타-프로펠러)에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 Wnt 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b 및/또는 10b에 의한 신호전달을 억제한다. 한 실시양태에서, 항체는 Wnt3 및/또는 Wnt3a에 의한 신호전달을 강화시킨다. 한 실시양태에서, 항체는 Wnt 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b 및/또는 10b에 의한 신호전달을 억제하며 Wnt3 및/또는 Wnt3a에 의한 신호전달을 강화시킨다. 한 실시양태에서, 항체는 Wnt 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b 및/또는 10b에 의한 신호전달을 억제하며 Wnt3 및/또는 Wnt3a에 의한 신호전달을 강화시킨다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 LRP6의 E1-E2 영역 (제3 및 제4 베타-프로펠러)에 결합한다.
본 발명의 또 다른 측면은 다중특이적 항-LRP6 항체를 제공한다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 다중특이적 항체는, 일부 실시양태에서, Wnt 이소형의 모든 3개의 클래스를 억제하는 유용성을 갖는다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 LRP6의 2개 이상의 상이한 영역 또는 에피토프에 결합할 수 있는 다중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 다중특이적 항체는 LRP6의 2개의 상이한 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 이중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 LRP6의 EI-E2 영역에 결합하고, LRP6의 E3-E4 영역에 결합한다. 한 실시양태에서, 다중특이적 항체는 Wnt3 및 Wnt3a로 이루어진 군으로부터 선택된 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 억제하며 Wnt 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b 및 10b로 이루어진 군으로부터 선택된 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 억제한다. 한 실시양태에서, 다중특이적 항체는 Wnt3 및 Wnt3a로 이루어진 군으로부터 선택된 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 억제하고, Wnt 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b 및 10b로 이루어진 군으로부터 선택된 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 억제하며 Wnt 4, 7a, 7b 및 10a로 이루어진 군으로부터 선택된 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 추가로 억제한다. 한 실시양태에서, 다중특이적 항체는 Wnt1 및 Wnt3a의 조합에 의해 유도된 Wnt 신호전달을 억제한다. 한 실시양태에서, 다중특이적 항체는 자가분비 Wnt 신호전달을 억제한다.
특정 실시양태에서, 다중특이적 항체는 Wnt3 및 Wnt3a로 이루어진 군으로부터 선택된 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 억제하며 Wnt 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b 및 10b로 이루어진 군으로부터 선택된 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 억제하는 이중특이적 항체이다. 특정 실시양태에서, 다중특이적 항체는 Wnt3 및 Wnt3a로 이루어진 군으로부터 선택된 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 억제하고, Wnt 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b 및 10b로 이루어진 군으로부터 선택된 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 억제하며 Wnt 4, 7a, 7b 및 10a로 이루어진 군으로부터 선택된 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 추가로 억제하는 이중특이적 항체이다. 특정 실시양태에서, 다중특이적 항체는 Wnt1 및 Wnt3a의 조합에 의해 유도된 신호전달을 억제하는 이중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 다중특이적 항체는 이중특이적 항체와 동일한 특이성을 갖는 단일특이적 항체의 조합보다 더 효과적으로 Wnt1 및 Wnt3a의 조합에 의해 유도된 신호전달을 억제하는 이중특이적 항체이다.
특정 실시양태에서, 다중특이적 항체는 이중특이적 항체와 동일한 특이성을 갖는 단일특이적 항체의 조합보다 더 효과적으로 자가분비 Wnt 신호전달을 억제하는 이중특이적 항체이다.
특정 실시양태에서, 항-LRP6 항체 또는 다중특이적 항-LRP6 항체는 Wnt 신호전달을 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 그 초과로 억제한다. Wnt 신호전달의 억제는 당업계에 공지되고 본원에 기재된 검정을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, Wnt 신호전달의 억제는 Wnt 리포터 검정, 예컨대 실시예에 기재된 Wnt 루시페라제 리포터 검정을 이용하여 결정될 수 있다.
Wnt 신호전달의 억제는 또한 실시예에 기재된 바와 같이, Wnt 표적 유전자, 예컨대 APCDD1, AXIN2, GAD1, LEFTY2 및 SAX1의 발현을 모니터링함으로써 결정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 항-LRP6 항체 또는 다중특이적 항-LRP6 항체는 Wnt 표적 유전자, 예컨대 APCDD1, AXIN2, GAD1, LEFTY2 및 SAX1의 발현을 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 억제한다. 한 실시양태에서, Wnt 표적 유전자의 발현은 유전자 발현 검정, 예컨대 PCR (qPCR 포함)을 이용하여 결정된다.
본 발명의 또 다른 측면은 LRP6에 결합하며 본원에 기재된 임의의 항-LRP6 항체와 결합에 대해 경쟁하는 항체를 제공한다. 본 발명의 또 다른 측면은 본원에 기재된 임의의 항-LRP6 항체와 동일한 LRP6 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
A. 예시적인 항-LRP6 항체
본 발명의 한 측면은 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함하는, 모노클로날 항체인 항-LRP6 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 파지 라이브러리를 이용하여 생성된다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디 또는 F(ab') 2 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 전장 항체, 예를 들어 무손상 IgG1 항체 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 클래스 또는 이소형이다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 표 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 표 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 표 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열 및 경쇄 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열 및 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열 및 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열 및 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열 및 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 표 3의 아미노산 서열로부터의 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 표 3의 아미노산 서열로부터의 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 표 3의 아미노산 서열로부터의 VH 및 VL을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 1의 아미노산 서열의 중쇄로부터의 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 2의 아미노산 서열의 경쇄 서열로부터의 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 1의 아미노산 서열의 중쇄로부터의 VH 및 서열 2의 아미노산 서열의 경쇄 서열로부터의 VL을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 3의 아미노산 서열의 중쇄로부터의 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 4의 아미노산 서열의 경쇄 서열로부터의 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 3의 아미노산 서열의 중쇄로부터의 VH 및 서열 4의 아미노산 서열의 경쇄 서열로부터의 VL을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 5의 아미노산 서열의 중쇄로부터의 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 6의 아미노산 서열의 경쇄 서열로부터의 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 5의 아미노산 서열의 중쇄로부터의 VH 및 서열 6의 아미노산 서열의 경쇄 서열로부터의 VL을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 7의 아미노산 서열의 중쇄로부터의 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 8의 아미노산 서열의 경쇄 서열로부터의 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 7의 아미노산 서열의 중쇄로부터의 VH 및 서열 8의 아미노산 서열의 경쇄 서열로부터의 VL을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 다중특이적 항-LRP6 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 다중특이적 항체는 서열 1, 서열 3, 서열 5 또는 서열 7 중 적어도 1개의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 다중특이적 항체는 서열 1, 서열 3, 서열 5 또는 서열 7 중 적어도 2개의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 다중특이적 항체는 서열 1, 서열 3, 서열 5 또는 서열 7 중 적어도 1개의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 이중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄 및 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄 및 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄 및 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 다중특이적 항-LRP6 항체는 서열 1, 서열 3, 서열 5 또는 서열 7 중 적어도 1개의 아미노산 서열의 중쇄로부터의 VH를 포함한다. 한 실시양태에서, 다중특이적 항체는 서열 1, 서열 3, 서열 5 또는 서열 7 중 적어도 2개의 아미노산 서열의 중쇄로부터의 VH를 포함한다. 한 실시양태에서, 다중특이적 항체는 서열 1, 서열 3, 서열 5 또는 서열 7의 아미노산 서열의 중쇄로부터의 VH를 포함하는 이중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 서열 1의 아미노산 서열의 중쇄로부터의 VH를 포함하고, 서열 7의 아미노산 서열의 중쇄로부터의 VH를 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 서열 3의 아미노산 서열의 중쇄로부터의 VH를 포함하고, 서열 7의 아미노산 서열의 중쇄로부터의 VH를 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 서열 5의 아미노산 서열의 중쇄로부터의 VH를 포함하고, 서열 7의 아미노산 서열의 중쇄로부터의 VH를 포함한다.
한 실시양태에서, 다중특이적 항-LRP6 항체는 서열 9, 서열 11, 서열 13 또는 서열 15 중 적어도 1개의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 한 실시양태에서, 다중특이적 항체는 서열 9, 서열 11, 서열 13 또는 서열 15 중 적어도 2개의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 한 실시양태에서, 다중특이적 항체는 서열 9, 서열 11, 서열 13 또는 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 이중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 제1 VH 및 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 제2 VH를 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 제1 VH 및 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 제2 VH를 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 제1 VH 및 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 제2 VH를 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) 표 4의 HVR-H1 아미노산 서열로부터의 HVR-H1; (b) 표 4의 HVR-H2 아미노산 서열로부터의 HVR-H2; (c) 표 4의 HVR-H3 아미노산 서열로부터의 HVR-H3; (d) 표 4의 HVR-L1 아미노산 서열로부터의 HVR-L1; (e) 표 4의 HVR-L2 아미노산 서열로부터의 HVR-L2; 및 (f) 표 4의 HVR-L3 아미노산 서열로부터의 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) 서열 1의 중쇄의 HVR-H1; (b) 서열 1의 중쇄의 HVR-H2; (c) 서열 1의 중쇄의 HVR-H3; (d) 서열 2의 경쇄의 HVR-L1; (e) 서열 2의 경쇄의 HVR-L2; 및 (f) 서열 2의 경쇄의 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 VH를 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) 서열 1의 중쇄의 HVR-H1; (b) 서열 1의 중쇄의 HVR-H2; 및 (c) 서열 1의 중쇄의 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 1의 중쇄의 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열 1의 중쇄의 HVR-H3 및 서열 2의 경쇄의 HVR-L3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 서열 1의 중쇄의 HVR-H3, 서열 2의 경쇄의 HVR-L3 및 서열 1의 중쇄의 HVR-H2를 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 1의 중쇄의 HVR-H1; (b) 서열 1의 중쇄의 HVR-H2; 및 (c) 서열 1의 중쇄의 HVR-H3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 및 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) 서열 2의 경쇄의 HVR-L1; (b) 서열 2의 경쇄의 HVR-L2; 및 (c) 서열 2의 경쇄의 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 2의 경쇄의 HVR-L1; (b) 서열 2의 경쇄의 HVR-L2; 및 (c) 서열 2의 경쇄의 HVR-L3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) (i) 서열 1의 중쇄의 HVR-H1, (ii) 서열 1의 중쇄의 HVR-H2 및 (iii) 서열 1의 중쇄의 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열 2의 경쇄의 HVR-L1, (ii) 서열 2의 경쇄의 HVR-L2 및 (c) 서열 2의 경쇄의 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) (i) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (c) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 1의 중쇄의 HVR-H1; (b) 서열 1의 중쇄의 HVR-H2; (c) 서열 1의 중쇄의 HVR-H3; (d) 서열 2의 경쇄의 HVR-L1; (e) 서열 2의 경쇄의 HVR-L2; 및 (f) 서열 2의 경쇄의 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 26의 아미노산을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) 서열 3의 중쇄의 HVR-H1; (b) 서열 3의 중쇄의 HVR-H2; (c) 서열 3의 중쇄의 HVR-H3; (d) 서열 4의 경쇄의 HVR-L1; (e) 서열 4의 경쇄의 HVR-L2; 및 (f) 서열 4의 경쇄의 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) 서열 3의 중쇄의 HVR-H1; (b) 서열 3의 중쇄의 HVR-H2; 및 (c) 서열 3의 중쇄의 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 3의 중쇄의 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열 3의 중쇄의 HVR-H3 및 서열 4의 경쇄의 HVR-L3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 서열 3의 중쇄의 HVR-H3, 서열 4의 경쇄의 HVR-L3 및 서열 3의 중쇄의 HVR-H2를 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 3의 중쇄의 HVR-H1; (b) 서열 3의 중쇄의 HVR-H2; 및 (c) 서열 3의 중쇄의 HVR-H3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열 21의 중쇄의 HVR-H3 및 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 및 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) 서열 4의 경쇄의 HVR-L1; (b) 서열 4의 경쇄의 HVR-L2; 및 (c) 서열 4의 경쇄의 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 4의 경쇄의 HVR-L1; (b) 서열 4의 경쇄의 HVR-L2; 및 (c) 서열 4의 경쇄의 HVR-L3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) (i) 서열 3의 중쇄의 HVR-H1, (ii) 서열 3의 중쇄의 HVR-H2 및 (iii) 서열 3의 중쇄의 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열 4의 경쇄의 HVR-L1, (ii) 서열 4의 경쇄의 HVR-L2 및 (c) 서열 4의 경쇄의 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) (i) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열 25 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (c) 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 3의 중쇄의 HVR-H1; (b) 서열 3의 중쇄의 HVR-H2; (c) 서열 3의 중쇄의 HVR-H3; (d) 서열 4의 경쇄의 HVR-L1; (e) 서열 4의 경쇄의 HVR-L2; 및 (f) 서열 4의 경쇄의 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) 서열 5의 중쇄의 HVR-H1; (b) 서열 5의 중쇄의 HVR-H2; (c) 서열 5의 중쇄의 HVR-H3; (d) 서열 6의 경쇄의 HVR-L1; (e) 서열 6의 경쇄의 HVR-L2; 및 (f) 서열 6의 경쇄의 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) 서열 5의 중쇄의 HVR-H1; (b) 서열 5의 중쇄의 HVR-H2; 및 (c) 서열 5의 중쇄의 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 5의 중쇄의 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열 5의 중쇄의 HVR-H3 및 서열 6의 경쇄의 HVR-L3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 서열 5의 중쇄의 HVR-H3, 서열 6의 경쇄의 HVR-L3 및 서열 5의 중쇄의 HVR-H2를 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 5의 중쇄의 HVR-H1; (b) 서열 5의 중쇄의 HVR-H2; 및 (c) 서열 5의 중쇄의 HVR-H3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 및 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) 서열 6의 경쇄의 HVR-L1; (b) 서열 6의 경쇄의 HVR-L2; 및 (c) 서열 6의 경쇄의 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 6의 경쇄의 HVR-L1; (b) 서열 6의 경쇄의 HVR-L2; 및 (c) 서열 6의 경쇄의 HVR-L3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) (i) 서열 5의 중쇄의 HVR-H1, (ii) 서열 5의 중쇄의 HVR-H2 및 (iii) 서열 5의 중쇄의 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열 6 경쇄의 HVR-L1, (ii) 서열 6의 경쇄의 HVR-L2 및 (c) 서열 6의 경쇄의 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) (i) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (c) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 5의 중쇄의 HVR-H1; (b) 서열 5의 중쇄의 HVR-H2; (c) 서열 5의 중쇄의 HVR-H3; (d) 서열 6의 경쇄의 HVR-L1; (e) 서열 6의 경쇄의 HVR-L2; 및 (f) 서열 6의 경쇄의 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 26의 아미노산을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) 서열 7의 중쇄의 HVR-H1; (b) 서열 7의 중쇄의 HVR-H2; (c) 서열 7의 중쇄의 HVR-H3; (d) 서열 8의 경쇄의 HVR-L1; (e) 서열 8의 경쇄의 HVR-L2; 및 (f) 서열 8의 경쇄의 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) 서열 7의 중쇄의 HVR-H1; (b) 서열 7의 중쇄의 HVR-H2; 및 (c) 서열 7의 중쇄의 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 7의 중쇄의 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열 7의 중쇄의 HVR-H3 및 서열 8의 경쇄의 HVR-L3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 서열 7의 중쇄의 HVR-H3, 서열 8의 경쇄의 HVR-L3 및 서열 7의 중쇄의 HVR-H2를 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 7의 중쇄의 HVR-H1; (b) 서열 7의 중쇄의 HVR-H2; 및 (c) 서열 7의 중쇄의 HVR-H3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 및 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) 서열 8의 경쇄의 HVR-L1; (b) 서열 8의 경쇄의 HVR-L2; 및 (c) 서열 8의 경쇄의 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 8의 경쇄의 HVR-L1; (b) 서열 8의 경쇄의 HVR-L2; 및 (c) 서열 8의 경쇄의 HVR-L3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) (i) 서열 7의 중쇄의 HVR-H1, (ii) 서열 7의 중쇄의 HVR-H2 및 (iii) 서열 7의 중쇄의 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열 8의 경쇄의 HVR-L1, (ii) 서열 8의 경쇄의 HVR-L2 및 (c) 서열 8의 경쇄의 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) (i) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (c) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 7의 중쇄의 HVR-H1; (b) 서열 7의 중쇄의 HVR-H2; (c) 서열 7의 중쇄의 HVR-H3; (d) 서열 8의 경쇄의 HVR-L1; (e) 서열 8의 경쇄의 HVR-L2; 및 (f) 서열 8의 경쇄의 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) 서열 1의 중쇄의 HVR-H1; (b) 서열 1의 중쇄의 HVR-H2; 및 (c) 서열 1의 중쇄의 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제1 VH 도메인, 및 (d) 서열 7의 중쇄의 HVR-H1; (e) 서열 7의 중쇄의 HVR-H2; 및 (f) 서열 7의 중쇄의 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제2 VH 도메인을 포함하는 다중특이적 항-LRP6 항체이다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제1 VH 도메인, 및 (d) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (e) 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (f) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제2 VH 도메인을 포함하는 다중특이적 항-LRP6 항체이다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) 서열 1의 중쇄의 HVR-H1; (b) 서열 1의 중쇄의 HVR-H2; 및 (c) 서열 1의 중쇄의 HVR-H3으로부터의 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제1 VH 도메인을 포함하고, (d) 서열 7의 중쇄의 HVR-H1; (e) 서열 7의 중쇄의 HVR-H2; 및 (f) 서열 7의 중쇄의 HVR-H3으로부터의 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제2 VH 도메인을 포함하는 다중특이적 항-LRP6 항체이다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터의 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제1 VH 도메인을 포함하고, (d) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (e) 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (f) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터의 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제2 VH 도메인을 포함하는 다중특이적 항-LRP6 항체이다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) 서열 3의 중쇄의 HVR-H1; (b) 서열 3의 중쇄의 HVR-H2; 및 (c) 서열 3의 중쇄의 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제1 VH 도메인을 포함하고, (d) 서열 7의 중쇄의 HVR-H1; (e) 서열 7의 중쇄의 HVR-H2; 및 (f) 서열 7의 중쇄의 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제2 VH 도메인을 포함하는 다중특이적 항-LRP6 항체이다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제1 VH 도메인을 포함하고, (d) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (e) 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (f) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제2 VH 도메인을 포함하는 다중특이적 항-LRP6 항체이다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) 서열 3의 중쇄의 HVR-H1; (b) 서열 3의 중쇄의 HVR-H2; 및 (c) 서열 3의 중쇄의 HVR-H3으로부터의 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제1 VH 도메인을 포함하고, (d) 서열 7의 중쇄의 HVR-H1; (e) 서열 7의 중쇄의 HVR-H2; 및 (f) 서열 7의 중쇄의 HVR-H3으로부터의 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제2 VH 도메인을 포함하는 다중특이적 항-LRP6 항체이다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터의 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제1 VH 도메인을 포함하고, (d) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (e) 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (f) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터의 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제2 VH 도메인을 포함하는 다중특이적 항-LRP6 항체이다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) 서열 5의 중쇄의 HVR-H1; (b) 서열 5의 중쇄의 HVR-H2; 및 (c) 서열 5의 중쇄의 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제1 VH 도메인을 포함하고, (d) 서열 7의 중쇄의 HVR-H1; (e) 서열 7의 중쇄의 HVR-H2; 및 (f) 서열 7의 중쇄의 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제2 VH 도메인을 포함하는 다중특이적 항-LRP6 항체이다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제1 VH 도메인을 포함하고, (d) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (e) 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (f) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제2 VH 도메인을 포함하는 다중특이적 항-LRP6 항체이다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) 서열 5의 중쇄의 HVR-H1; (b) 서열 5의 중쇄의 HVR-H2; 및 (c) 서열 5의 중쇄의 HVR-H3으로부터의 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제1 VH 도메인을 포함하고, (d) 서열 7의 중쇄의 HVR-H1; (e) 서열 7의 중쇄의 HVR-H2; 및 (f) 서열 7의 중쇄의 HVR-H3으로부터의 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제2 VH 도메인을 포함하는 다중특이적 항-LRP6 항체이다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 (a) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터의 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제1 VH 도메인을 포함하고, (d) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (e) 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (f) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터의 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 제2 VH 도메인을 포함하는 다중특이적 항-LRP6 항체이다.
다중특이적 항-LRP6 항체의 임의의 상기 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 2의 경쇄의 HVR-L1; (b) 서열 2의 경쇄의 HVR-L2; 및 (c) 서열 2 또는 서열 4의 경쇄의 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 더 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 2의 경쇄의 HVR-L1; (b) 서열 2의 경쇄의 HVR-L2; 및 (c) 서열 2의 경쇄의 HVR-L3을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 2의 경쇄의 HVR-L1; (b) 서열 2의 경쇄의 HVR-L2; 및 (c) 서열 4의 경쇄의 HVR-L3을 포함한다.
다중특이적 항-LRP6 항체의 임의의 상기 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 25의 아미노산을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 26의 아미노산을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 27 또는 서열 28의 아미노산을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 더 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 25의 아미노산을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 26의 아미노산을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 27의 아미노산을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 25의 아미노산을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 26의 아미노산을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 28의 아미노산을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체 또는 다중특이적 항-LRP6 항체는 아미노산 서열 N X1 X2 K (서열 41)를 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체 또는 다중특이적 항-LRP6 항체는 아미노산 서열 N X1 X2 KN (서열 42)을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체 또는 다중특이적 항-LRP6 항체는 아미노산 서열 N X1VK (서열 43)를 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체 또는 다중특이적 항-LRP6 항체는 아미노산 서열 NX1IK (서열 44)를 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체 또는 다중특이적 항-LRP6 항체는 아미노산 서열 NX1VKN (서열 45)을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체 또는 다중특이적 항-LRP6 항체는 아미노산 서열 NX1IKN (서열 46)을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태에서, X1은 아미노산이고 X2는 I 또는 V이거나; 또는 X1은 A, S, F, T, Y 또는 L이고 X2는 I 또는 V이거나; 또는 X1은 A, S, F, T, Y 또는 L이고 X2는 I이거나; 또는 X1은 A, S, F, T, Y 또는 L이고 X2는 V이다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체 또는 다중특이적 항-LRP6 항체는 아미노산 서열 NAVK (서열 47)를 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체 또는 다중특이적 항-LRP6 항체는 아미노산 서열 NAIK (서열 48)를 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체 또는 다중특이적 항-LRP6 항체는 아미노산 서열 NAVKN (서열 49)을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체 또는 다중특이적 항-LRP6 항체는 아미노산 서열 NAIKN (서열 50)을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
임의의 상기 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 인간화 항체이다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같이 HVR을 포함하고, 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 더 포함한다.
또 다른 측면에서, 항-LRP6 항체는 서열 1, 서열 3, 서열 5 또는 서열 7의 아미노산 서열의 중쇄의 VH에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서, 항-LRP6 항체는 서열 9, 서열 11, 서열 13 또는 서열 15의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열과 관련하여 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이러한 서열을 포함하는 항-LRP6 항체는 LRP6에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 서열 1, 서열 3, 서열 5 또는 서열 7, 또는 서열 9, 서열 11, 서열 13 또는 서열 15의 VH에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다.
또 다른 측면에서, 항-LRP6 항체는 서열 1, 서열 3, 서열 5 또는 서열 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 중쇄 서열은 참조 서열과 관련하여 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이러한 서열을 포함하는 항-LRP6 항체는 LRP6에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 서열 1, 서열 3, 서열 5 또는 서열 7에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다.
특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역 (즉, FR)에서 일어난다. 임의로, 항-LRP6 항체는 그 서열의 번역후 변형을 포함하여, 서열 1, 서열 3, 서열 5 또는 서열 7의 중쇄 및/또는 중쇄의 VH를 포함한다.
또 다른 측면에서, 서열 2, 서열 4, 서열 6 또는 서열 8의 아미노산 서열의 경쇄의 VL에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-LRP6 항체가 제공된다. 또 다른 측면에서, 서열 10, 서열 12, 서열 14 또는 서열 16의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-LRP6 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열과 관련하여 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이러한 서열을 포함하는 항-LRP6 항체는 LRP6에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 서열 2, 서열 4, 서열 6 또는 서열 8, 또는 서열 10, 서열 12, 서열 14 또는 서열 16의 VL에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다.
또 다른 측면에서, 서열 2, 서열 4, 서열 6 또는 서열 8의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함하는 항-LRP6 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 경쇄 서열은 참조 서열과 관련하여 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이러한 서열을 포함하는 항-LRP6 항체는 LRP6에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 서열 2, 서열 4, 서열 6 또는 서열 8에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다.
특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역 (즉, FR)에서 일어난다. 임의로, 항-LRP6 항체는 그 서열의 번역후 변형을 포함하여, 서열 2, 서열 4, 서열 6 또는 서열 8의 경쇄 및/또는 VL 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함하는 항-LRP6 항체가 제공된다.
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 제공된 항-LRP6 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 서열 9의 VH 서열 및 서열 10의 VL 서열, 또는 서열 11의 VH 서열 및 서열 12의 VL 서열, 또는 서열 13의 VH 서열 및 서열 14의 VL 서열, 또는 서열 15의 VH 서열 및 서열 16의 VL 서열을 포함하는 항-LRP6 항체로부터 선택된 항-LRP6 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 LRP6의 E1-E2 영역 내의 아미노산 잔기로 구성된 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 LRP6의 E3-E4 영역 내의 아미노산 잔기로 구성된 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 LRP6의 E1-E2 영역에 존재하는 아미노산 잔기로 구성된 에피토프에 결합하고, LRP6의 E3-E4 영역에 존재하는 아미노산 잔기로 구성된 에피토프에 결합하는 이중특이적 항체이다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 LRP6의 잔기 R28, E51, D52, V70, S71, E73, L95, S96, D98, E115, R141 및 N185를 포함하는 입체형태적 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 LRP6의 잔기 R28, E51, D52, V70, S71, E73, L95, S96, D98, E115, R141, N185, R29, W188, K202, P225, H226, S243 및 F266을 포함하는 입체형태적 에피토프에 결합한다.
한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 LRP6의 E1 β-프로펠러의 아미노산 잔기 R28, E51, D52, V70, S71, E73, L95, S96, D98, E115, R141 및 N185 중 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개 또는 모두와 상호작용한다. 추가 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 추가로 LRP6 잔기 R29, W188, K202, P225, H226, S243 및 F266 중 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개와 상호작용한다.
추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-LRP6 항체는 하기 섹션 1-7에 기재된 바와 같이 임의의 특징을 단독으로 또는 조합하여 혼입시킬 수 있다:
1. 항체 친화도
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다.
한 실시양태에서, Kd는 하기 검정에서 기재된 바와 같이 관심 항체의 Fab 버전 및 그의 항원을 사용하여 수행된 방사성표지된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 비표지 항원의 적정 시리즈의 존재 하에 Fab를 최소 농도의 (125I)-표지 항원과 평형화시킨 다음, 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써 측정된다 (예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)] 참조). 검정 조건을 확립하기 위해, 마이크로타이터(MICROTITER)® 멀티-웰 플레이트 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중의 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스(Cappel Labs))로 밤새 코팅한 후, PBS 중의 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 2 내지 5시간 동안 실온 (대략 23℃)에서 차단하였다. 비-흡착 플레이트 (눈크(Nunc) #269620)에서는 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 관심 Fab의 연속 희석물과 혼합한다 (예를 들어, 문헌 [Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함). 이어서, 관심 Fab를 밤새 인큐베이션하지만, 평형에 도달하는 것을 확실하게 하기 위해 더 오랜 시간 (예를 들어, 약 65시간) 동안 계속 인큐베이션할 수 있다. 그 후, 혼합물을 포획 플레이트로 옮겨 실온에서 (예를 들어, 1시간 동안) 인큐베이션한다. 이어서, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중의 0.1% 폴리소르베이트 20 (트윈-20®)으로 8회 세척하였다. 플레이트를 건조시킬 때, 150 μl/웰의 섬광제 (마이크로신트-20(MICROSCINT-20)™; 팩커드(Packard))를 첨가하고, 플레이트를 탑카운트(TOPCOUNT)™ 감마 계수기 (팩커드)로 10분 동안 계수한다. 최대 결합의 20％ 이하를 제공하는 각 Fab의 농도를 선택하여 경쟁 결합 검정에 사용한다.
또 다른 실시양태에 따르면, Kd는 예를 들어 약 10의 반응 단위 (RU)로 고정된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 비아코어(BIACORE)®-2000 또는 비아코어®-3000 (비아코어, 인크.(BIAcore, Inc.), 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여 측정된다. 간략하게, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 사용하여 5 μg/mL (약 0.2 μM)로 희석한 후에 커플링된 단백질 대략 10 반응 단위 (RU)가 달성되도록 5 μl/분의 유량으로 주사한다. 항원 주사 후, 미반응 기를 차단하기 위해 1M 에탄올아민을 주입한다. 동역학적 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)을 약 25 μl/분의 유량으로 25℃에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (트윈-20™) 계면활성제를 함유하는 PBS (PBST) 내에 주사한다. 간단한 일-대-일 랭뮤어 결합 모델 (비아코어® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 회합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅시켜 회합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon의 비로 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)]을 참조한다. 상기 표면-플라즈몬 공명 검정에 의한 온-레이트가 106 M-1s-1을 초과하는 경우, 온-레이트는 분광측정계, 예컨대 정지-유동 설치 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳이 장착된 8000-시리즈 SLM-아민코(AMINCO)™ 분광광도계 (써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정할 때 증가하는 농도의 항원의 존재 하에 PBS (pH 7.2) 중 20 nM의 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm, 방출 = 340 nm, 16 nm 통과 대역)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 이용하여 결정할 수 있다.
2. 항체 단편
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 단편, 및 하기 기재된 다른 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 문헌 [Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌 [Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]; 또한 WO 93/16185; 및 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458을 참조한다. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의에 대해, 미국 특허 번호 5,869,046을 참조한다.
디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]을 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (도만티스, 인크.(Domantis, Inc.), 매사추세츠주 월섬; 예를 들어 미국 특허 번호 6,248,516 B1 참조).
항체 단편은 본원에 기재된 바와 같은 무손상 항체의 단백질분해적 소화 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이 또는 파지)에 의한 생산을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
3. 키메라 및 인간화 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 클래스 또는 서브클래스가 부모 항체의 것으로부터 변화된 "클래스 스위칭" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 부모 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서 인간에 대한 면역원성이 감소하도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어 CDR (또는 그의 부분)이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR (또는 그의 부분)이 인간 항체 서열로부터 유래된 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 또한 임의로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화도를 복원하거나 또는 향상시키기 위해, 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 그의 제조 방법은 예를 들어 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에서 검토되었고, 예를 들어 문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)]; 미국 특허 번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; [Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)] (SDR (a-CDR) 그라프팅 기재); [Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)] ("리서페이싱" 기재); [Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)] ("FR 셔플링" 기재); 및 [Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)] (FR 셔플링에 대한 "가이드 선택" 접근법 기재)에 추가로 기재되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 "최적-적합" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위군의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)] 참조); 인간 성숙 (체세포 성숙) 프레임워크 영역 또는 인간 배선 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조); 및 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)] 참조)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
4. 인간 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 다양한 당업계의 공지된 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 항원 챌린지에 반응하여 인간 가변 영역을 갖는 무손상 인간 항체 또는 무손상 항체를 생성하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여하여 제조할 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내인성 이뮤노글로불린 로커스를 대체하거나 또는 염색체외에 존재하거나 동물의 염색체로 무작위적으로 통합된 인간 이뮤노글로불린 로커스의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 트랜스제닉 마우스에서, 내인성 이뮤노글로불린 로커스는 일반적으로 불활성화된다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해, 문헌 [Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 (제노마우스(XENOMOUSE)TM 기술 기재); 미국 특허 번호 5,770,429 (HuMab® 기술 기재); 미국 특허 번호 7,041,870 (K-M 마우스(K-M MOUSE)® 기술 기재), 및 미국 특허 출원 공보 번호 US 2007/0061900 (벨로시마우스(VelociMouse)® 기술 기재)을 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 무손상 항체로부터의 인간 가변 영역은 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과 조합시켜 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반의 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생성을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)] 참조.) 또한, 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체가 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]에 기재되어 있다. 추가의 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체 생산 기재) 및 문헌 [Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)] (인간-인간 하이브리도마 기재)에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마(Trioma) 기술)은 또한 문헌 [Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리하여 생성될 수 있다. 이어서, 이러한 가변 도메인 서열은 바람직한 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술은 아래 기재된다.
5. 라이브러리-유래 항체
본 발명의 항체는 바람직한 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 바람직한 결합 특성을 갖는 항체에 대하여 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에서 검토되고, 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)]에 추가로 기재되어 있다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 개별적으로 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 클로닝되고, 파지 라이브러리에 무작위적으로 재조합되며, 이는 이어서 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단일-쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 고-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 나이브 레퍼토리를 클로닝 (예를 들어, 인간으로부터)하여, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자가 및 또한 자가 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 최종적으로, 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터의 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 클로닝하고, 고도로 가변성인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내 재배열이 달성되도록 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 나이브 라이브러리를 또한 합성적으로 제조할 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하고 있는 특허 공보는 예를 들어 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공보 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 및 2009/0002360을 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 여겨진다.
6. 다중특이적 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 LRP6에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 LRP6의 2개의 상이한 에피토프에 결합한다. 이중특이적 항체는 또한 LRP6을 발현하는 세포에 세포독성제를 위치시키는데 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동-발현 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983))], WO 93/08829, 및 [Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조), 및 "놉-인-홀" 조작 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168 참조)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다중특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과의 조작 (WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편의 가교 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980, 및 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참조); 이중특이적 항체를 생산하기 위한 류신 지퍼의 사용 (예를 들어, 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 "디아바디" 기술의 사용 (예를 들어, 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조); 및 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체의 사용 (예를 들어, 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)] 참조); 및 예를 들어 문헌 [Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]에 기재된 바와 같은 삼중특이적 항체의 제조에 의해 제조될 수 있다
"옥토퍼스 항체"를 비롯하여, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다 (예를 들어, US 2006/0025576A1 참조).
본원의 항체 또는 단편은 또한 LRP6 뿐만 아니라 또 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다 (예를 들어, US 2008/0069820 참조).
7. 항체 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변경을 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물이 바람직한 특성, 예를 들어 항원-결합을 보유하도록, 최종 구축물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 "보존적 치환"의 표제 하에 표 1에 제시된다. 보다 더 실질적인 변화는 "예시적인 치환"의 표제 하의 표 1에 아미노산 측쇄 클래스에 관하여 아래 추가로 기재된 바와 같이 제공된다. 아미노산 치환은 관심 항체에 도입되고, 생성물은 바람직한 활성, 예를 들어 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
Figure 112012086169669-pct00001
Figure 112012086169669-pct00002
아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 클래스 중의 하나의 구성원을 또 다른 클래스로 교환하는 것을 수반할 것이다.
치환 변이체의 한 가지 유형은 부모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 부모 항체에 비해 특정 생물학적 특성 (예를 들어, 상승된 친화도, 감소된 면역원성)의 변형 (예를 들어, 개선)을 가질 것이고/거나 부모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 예를 들어 본원에 기재된 것과 같은 파지 디스플레이-기반의 친화도 성숙 기술을 이용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화도 성숙 항체이다. 간략하게, 하나 이상의 HVR 잔기가 돌연변이화되고, 변이체 항체가 파지 상에 디스플레이되고, 특정한 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
변경 (예를 들어, 치환)은 예를 들어 항체 친화도를 개선시키기 위해 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟", 즉 체세포 성숙 과정 (예를 들어, 문헌 [Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008] 참조), 및/또는 SDR (a-CDR) 동안 결합 친화도에 대해 시험된 생성된 변이체 VH 또는 VL로 높은 빈도에서 돌연변이화를 수행하는 코돈에 의해 코딩되는 잔기에서 이루어질 수 있다. 2차 라이브러리로부터의 구축 및 재선택에 의한 친화도 성숙은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)]에 기재되어 있다. 친화도 성숙의 일부 실시양태에서에서, 다양성은 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류-유발 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-유도된 돌연변이유발)에 의한 성숙을 위해 선택된 가변 유전자로 도입된다. 이어서, 2차 항체를 생성한다. 이어서, 바람직한 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하게 위해 라이브러리를 스크리닝한다. 다양성을 도입하는 다른 방법은 HVR-유도된 접근법과 연관되며, 여기서 여러 HVR 잔기 (예를 들어, 한 번에 4 내지 6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합과 연관된 HVR 잔기는 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 구체적으로 확인될 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDR의 외부일 수 있다. 상기에서 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이, 돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라고 지칭된다. 이 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기들의 군이 확인되고 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys 및 glu), 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어 항체와 항원과의 상호작용에 영향을 미치는지 여부를 결정한다. 추가의 치환은 초기 치환에 대한 기능적 감수성을 입증하는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기는 치환을 위한 후보로 표적화되거나 또는 제거될 수 있다. 변이체는 그들이 바람직한 특성을 함유하는지 여부를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이 범위가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소 (예를 들어, ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드가 상기 항체의 N- 또는 C-말단에 융합된 것을 포함한다.
b) 글리코실화 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 대한 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지형 이분지 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조한다. 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산 뿐만 아니라 이분지 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 내의 올리고사카라이드의 변형은 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 제조하기 위해 이루어질 수 있다.
한 실시양태에서, Fc 영역에 (직접 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1％ 내지 80％, 1％ 내지 65％, 5％ 내지 65％ 또는 20％ 내지 40％일 수 있다. 푸코스의 양은 예를 들어 WO 2008/077546에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광측정법에 의해 측정된 Asn 297에 부착된 모든 당구조물 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고만노스 구조물)의 합에 비해 Asn297에서 당 쇄 내의 푸코스의 평균적인 양을 계산하여 결정된다. Asn297은 Fc 영역의 약 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 나타내지만; Asn297은 또한 항체의 부가적 서열 변형에 의해 위치 297의 약 ±3 아미노산 상류 또는 하류, 즉 위치 294와 300 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공보 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (교와 핫꼬 고교 캄파니 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))를 참조한다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체에 대한 문헌의 예는 하기를 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌 [Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]. 탈푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (문헌 [Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1 (Presta, L); 및 WO 2004/056312 A1 (Adams et al., 특히 실시예 11)), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107 참조)가 포함된다.
이등분된 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체가 추가로 제공되는데, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 이분지 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된다. 이러한 항체 변이체는 푸코실화가 감소될 수 있고/거나 ADCC 기능이 개선될 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예가, 예를 들어 WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); 미국 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 내에 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는 예를 들어 WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 기재되어 있다.
c) Fc 영역 변이체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입되어 Fc 영역 변이체가 생성될 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 모든 이펙터 기능은 아니지만, 몇몇 이펙터 기능을 보유하고 있으므로, 생체내에서의 항체의 반감기가 중요하긴 하지만 특정의 이펙터 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 해로운 많은 적용 분야에 대한 바람직한 후보가 되는 항체 변이체를 고려한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체에 FcγR 결합은 없지만 (따라서, 아마도 ADCC 활성이 결여될 것임), FcRn 결합 능력은 보유하고 있는 것을 확인하기 위해서 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]의 페이지 464, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예가 미국 특허 번호 미국 특허 번호 5,500,362 (예를 들어, 문헌 [Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 및 Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)] 참조); 5,821,337 (문헌 [Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법을 이용할 수 있다 (예를 들어, 유동 세포측정법을 위한 악티(ACTI)™ 비-방사성 세포독성 검정 (셀테크놀로지, 인크.(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰); 및 사이토톡스(CytoTox) 96® 비-방사성 세포독성 검정 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨) 참조). 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. 또한, C1q 결합 검정을 수행하여, 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성이 결여되었는지를 확인할 수 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해 CDC 검정을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 제거율/반감기 결정은 또한 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).
감소된 이펙터 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에 치환을 갖는 Fc 돌연변이체 (잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는, 소위 "DANA" Fc 돌연변이체 포함)를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581).
FcR에 대해 개선되거나 또는 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재된다. (예를 들어, 미국 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조.)
특정 실시양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642, 및 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에 기재된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 나타내는 변경들이 Fc 영역에서 만들어진다.
모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)])에의 결합이 개선되고 반감기가 증가된 항체가 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에의 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434의 치환 (미국 특허 번호 7,371,826)을 갖는 것을 포함한다.
Fc 영역 변이체의 다른 예에 관해서는 또한 문헌 [Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351을 참조한다.
d) 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 실시양태에서, 항체의 하나 이상의 잔기를 시스테인 잔기로 치환시킨 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 "티오MAb"를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 이와 같이 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 일어난다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써 반응성 티올 기가 항체의 접근가능한 부위에 배치되게 되고, 이것을 이용하여 항체를 본원에 추가로 기재한 바와 같이 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시켜 면역접합체를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 임의의 하나 이상의 하기 잔기가 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카바트 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 7,521,541에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
e) 항체 유도체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 당업계에 공지되고 쉽게 입수가능한 추가의 비단백질성 잔기를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 그의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가 물에서의 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 변할 수 있고, 1개를 초과하는 중합체가 부착될 경우, 중합체들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 특정한 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건 하에 요법에서 사용될 것인지의 여부 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 고려사항을 기반으로 결정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체, 및 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (문헌 [Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 통상적인 세포에는 해를 끼치지 않지만 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포는 사멸시키는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
B. 재조합 방법 및 조성물
항체는 재조합 방법 및 조성물을 이용하여, 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 바와 같이 생산할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-LRP6 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩할 수 있다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 한 실시양태에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터 (예를 들어, 이들로 형질감염된 것)를 포함한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프성 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 실시양태에서, 상기에 제공된 바와 같은 항-LRP6 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체가 발현하는데 적합한 조건 하에 배양하는 것, 및 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 임의로 회수하는 것을 포함하는 항-LRP6 항체를 제조하는 방법이 제공된다.
항-LRP6 항체의 재조합 생산을 위해, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입한다. 이러한 핵산은 통상적인 절차를 이용하여 용이하게 단리하고 서열분석할 수 있다 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것에 의함).
항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않을 경우, 항체를 박테리아에서 생산할 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199 및 5,840,523을 참조한다. (또한, 이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현이 기재되어 있는 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254] 참조.) 발현 후에, 가용성 분획에서 박테리아 세포 페이스트로부터 항체를 단리할 수 있고, 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물 뿐만 아니라, 진핵 미생물, 예컨대 글리코실화 경로가 "인간화"되어 항체를 부분적으로 또는 전체적으로 인간 글리코실화 패턴으로 생산되게 하는, 진균 및 효모 균주를 비롯한 사상 진균 또는 효모가 항체 코딩 벡터의 클로닝 또는 숙주 발현에 적합하다. 문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)]을 참조한다.
글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 바큘로바이러스 균주가 곤충 세포와 함께, 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있는 것으로 확인되어 있다.
식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)TM 기술을 기재함)를 참조한다.
척추동물 세포를 또한 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에서 성장시키는데 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들어, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]에 기재되어 있는 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들어 문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]에 기재된 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예를 들어 DHFR- CHO 세포 (문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다.
C. 검정
본원에 제공된 항-LRP6 항체는 당업계에 공지된 다양한 검정에 의해 확인되거나, 스크리닝되거나, 또는 그의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 특성화될 수 있다.
1. 결합 검정 및 다른 검정
한 측면에서, 본 발명의 항체를 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯 등과 같은 공지된 방법으로 그의 항원 결합 활성에 대해 시험한다.
또 다른 측면에서, 경쟁 검정을 이용하여 LRP6에의 결합에 대해 본 발명의 항-LRP6 항체와 경쟁하는 항체를 확인할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 경쟁 항체는 본 발명의 항-LRP6 항체에 의해 결합된 동일한 에피토프 (예를 들어, 선형 또는 입체형태적 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하는 예시적인 방법의 상세내용은 문헌 [Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]에 제공된다.
예시적인 경쟁 분석에서, 고정된 LRP6을 LRP6에 결합하는 제1 표지된 항체 및 LRP6에의 결합에 대해 제1 항체와 경쟁하는 그의 능력에 대해 시험되는 제2 비표지된 항체를 포함하는 용액에서 인큐베이션한다. 제2 항체는 하이브리도마 상청액에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정된 LRP6을 제1 표지된 항체를 포함하고 제2 비표지된 항체를 포함하지 않는 용액에서 인큐베이션한다. LRP6에의 제1 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 인큐베이션한 후, 잉여량의 미결합 항체를 제거하고, 고정된 LRP6과 회합된 표지의 양을 측정한다. 고정된 LRP6과 회합된 표지의 양이 대조 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소된 경우에, 이것은 제2 항체가 LRP6에의 결합에 대해 제1 항체와 경쟁한다는 것을 나타낸다. 문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]을 참조한다.
2. 활성 검정
한 측면에서, 생물학적 활성을 갖는 그의 항-LRP6 항체를 확인하기 위한 검정이 제공된다. 생물학적 활성은 예를 들어 Wnt 이소형 매개된 신호전달의 억제 또는 강화, 조절된 골 질량/함량, 세포 증식의 억제, 세포 증식의 증가를 포함할 수 있다. 생체내 및/또는 시험관내에서 이러한 생물학적 활성을 갖는 항체가 또한 제공된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 이러한 생물학적 활성에 대해 시험된다. 생물학적 활성을 시험하기 위해 사용된 특정 검정은 실시예에 제공된다.
D. 면역접합체
본 발명은 또한 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소에 접합된 본원의 항-LRP6 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
한 실시양태에서, 면역접합체는 항체가 메이탄시노이드 (미국 특허 번호 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1 참조); 아우리스타틴, 예컨대 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF) (미국 특허 번호 5,635,483 및 5,780,588 및 7,498,298 참조); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 그의 유도체 (미국 특허 번호 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 및 5,877,296; 문헌 [Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); 및 Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)] 참조); 안트라시클린, 예컨대 다우노마이신 또는 독소루비신 (문헌 [Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)]; 및 미국 특허 번호 6,630,579 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀 및 오르타탁셀; 트리코테센; 및 CC1065를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 약물에 접합된 항체-약물 접합체 (ADC)이다.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 효소 활성 독소 또는 그의 단편 (디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함하나 이에 제한되지 않음)에 접합된 본원에 기재된 항체를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 방사성접합체를 형성하기 위해 방사성 원자에 접합된 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성접합체의 생산을 위해 이용가능하다. 그 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사성접합체는 검출용으로 사용되는 경우에 섬광조영 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123을 포함하거나, 핵 자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, mri로도 공지됨)용 스핀 표지, 예컨대 다시 아이오딘-123, 아이오딘-131, 인듐-111, 플루오린-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망가니즈 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO 94/11026을 참조한다. 링커는 세포 내에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산 불안정성 링커, 펩티다제-감수성 링커, 광분해성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 (문헌 [Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 번호 5,208,020)가 사용될 수 있다.
본원의 면역접합체 또는 ADC는 상업적으로 입수가능한 (예를 들어, 피어스 바이오테크놀로지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc.; 미국 일리노이주 록포드)로부터의) 가교-링커 시약 (BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트)를 포함하나 이에 제한되지 않음)으로 제조된 상기 접합체를 명백하게 고려하나 이에 제한되지 않는다.
E. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 항-LRP6 항체는 생물학적 샘플에서 LRP6의 존재를 검출하기에 유용하다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "검출"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직을 포함한다.
한 실시양태에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-LRP6 항체가 제공된다. 추가 측면에서, 생물학적 샘플에서 LRP6의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 LRP6에의 항-LRP6 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 생물학적 샘플을 본원에 기재된 바와 같은 항-LRP6 항체와 접촉시키는 것, 및 항-LRP6 항체와 LRP6 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 실시양태에서, 항-LRP6 항체는 예를 들어 LRP6이 환자의 선택을 위한 바이오마커인 경우에 항-LRP6 항체를 사용하는 요법에 적격인 대상체를 선택하는데 사용된다.
본 발명의 항체를 사용하여 진단될 수 있는 예시적인 장애는 암 및 골격계의 장애를 포함한다.
특정 실시양태에서, 표지된 항-LRP6 항체가 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (예컨대, 형광, 발색, 전자-밀집, 화학발광 및 방사성 표지) 뿐만 아니라 간접적으로, 예를 들어 효소적 반응 또는 분자 상호작용을 통해 검출되는 모이어티, 예를 들어 효소 또는 리간드를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예시적인 표지는 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 또는 루시페라제, 예를 들어 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제 (미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소, 예컨대 HRP, 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제와 커플링된 헤테로시클릭 옥시다제, 예컨대 우리카제 및 크산틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
F. 제약 제제
본원에 기재된 바와 같은 항-LRP6 항체의 제약 제제는 바람직한 정도의 순도를 갖는 이러한 항체를 하나 이상의 임의의 제약상 허용되는 담체 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합하여 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 제조한다. 제약상 허용되는 담체는 일반적으로 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체 (예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본원에서 예시적인 제약상 허용되는 담체는 또한 간질성 약물 분산제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (힐레넥스(HYLENEX)®, 백스터 인터내셔널, 인크.(Baxter International, Inc.))을 포함한다. 특정 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법 (rHuPH20 포함)은 미국 특허 공보 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에 기재되어 있다. 한 측면에서, sHASEGP는 콘드로이티나제와 같은 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제와 조합된다.
예시적인 동결건조된 항체 제제는 미국 특허 번호 6,267,958에 기재되어 있다. 수성 항체 제제는 미국 특허 번호 6,171,586 및 WO2006/044908에 기재된 것을 포함하고, 후자의 제제는 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
또한, 본원에서 제제는 치료되는 특정한 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로 유래한 영향을 주지 않는 보완적 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적절하게 존재한다.
활성 성분은 예를 들어 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 매크로에멀젼에서 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 봉입될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
지속-방출 제제를 제조할 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 일반적으로 멸균되어야 한다. 멸균은 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성할 수 있다.
G. 치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 임의의 항-LRP6 항체가 치료 방법에 사용될 수 있다.
한 측면에서, 의약으로서 사용하기 위한 항-LRP6 항체가 제공된다. 추가 측면에서, Wnt 매개 장애, 예컨대 암 또는 골격 또는 골 장애를 치료하는데 사용하기 위한 항-LRP6 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 항-LRP6 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 항-LRP6 항체를 암 또는 골격 또는 골 장애를 갖는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 항-LRP6 항체를 제공한다. 한 이러한 실시양태에서, 방법은 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 적어도 하나의 추가의 치료제의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 더 포함한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 제1 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 억제하며 제2 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 강화시키는데 사용하기 위한 항-LRP6 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 제1 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 억제하며 제2 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 강화시키기 위해 효과적인 항-LRP6 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 제1 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 억제하며 제2 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 강화시키는 방법에 사용하기 위한 항-LRP6 항체를 제공한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
추가 측면에서, 본 발명은 의약의 제조 또는 제제화에 있어서 항-LRP6 항체의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 의약은 Wnt 매개 장애, 예컨대 암 또는 골격 또는 골 장애의 치료를 위한 것이다. 추가 실시양태에서, 의약은 Wnt 매개 장애, 예컨대 암 또는 골격 또는 골 장애를 갖는 개체에게 유효량의 의약을 투여하는 것을 포함하는, 상기 Wnt 매개 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 한 이러한 실시양태에서, 방법은 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 적어도 하나의 추가의 치료제의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 더 포함한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 Wnt 매개 장애, 예컨대 암 또는 골격 또는 골 장애를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 방법은 이러한 Wnt 매개 장애를 갖는 개체에게 유효량의 항-LRP6 항체를 투여하는 것을 포함한다. 한 이러한 실시양태에서, 방법은 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 적어도 하나의 추가의 치료제의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
한 실시양태에서, Wnt 매개 장애는 암, 예컨대 예를 들어, 비소세포 폐암, 유방암, 췌장암, 난소암, 신장암 또는 전립선암이다. 또 다른 실시양태에서, Wnt 매개 장애는 골격 또는 골 장애, 예컨대 예를 들어, 골다공증, 골관절염, 골절 또는 골 병변이다.
한 실시양태는 LRP6에 결합하며 Wnt3 및 Wnt3a로 이루어진 군으로부터 선택된 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 억제하는 항체 및 LRP6에 결합하며 Wnt 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b 및 10b로 이루어진 군으로부터 선택된 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 억제하는 항체의 유효량을 암을 갖는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체의 치료 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태는 LRP6에 결합하며 Wnt3 및 Wnt3a에 의해 유도된 신호전달을 억제하는 항체 및 LRP6에 결합하며 Wnt 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b 및 10b에 의해 유도된 신호전달을 억제하는 항체의 유효량을 암을 갖는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체의 치료 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태는 LRP6에 결합하며 Wnt3 및 Wnt3a에 의해 유도된 신호전달을 억제하는 항체 및 LRP6에 결합하며 Wnt 1, 2, 2b, 4, 6, 7a, 7b, 8a, 9a, 9b, 10a 및 10b에 의해 유도된 신호전달을 억제하는 항체의 유효량을 암을 갖는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체의 치료 방법을 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 강화시키는 항-LRP6 항체 및 Wnt 이소형을 투여하여 Wnt 이소형에 의해 유도된 Wnt 신호전달을 강화시키는 것을 포함하는, 개체에서 Wnt 이소형에 의해 유도된 Wnt 신호전달을 강화시키는 방법을 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 예를 들어 임의의 상기 치료 방법에 사용하기 위한 본원에 제공된 임의의 항-LRP6 항체를 포함하는 제약 제제를 제공한다. 한 실시양태에서, 제약 제제는 본원에 제공된 임의의 항-LRP6 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 제제는 본원에 제공된 임의의 항-LRP6 항체, 및 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 적어도 하나의 추가의 치료제를 포함한다.
본 발명의 항체는 요법에서 단독으로 또는 다른 작용제와 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 적어도 하나의 추가의 치료제와 공동-투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 화학요법제이다. 또 다른 실시양태에서, 작용제는 암의 치료 또는 골격 또는 골 장애의 치료에 효과적인 항체이다. 상기 언급된 이러한 조합 요법은 조합 투여 (여기서 2종 이상의 치료제가 동일한 또는 별개의 제제에 포함됨), 및 개별 투여를 포함하고, 이 경우에 본 발명의 항체의 투여는 추가의 치료제 및/또는 아주반트의 투여 전에, 그와 동시에 및/또는 그 후에 수행될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 방사선 요법과 조합되어 사용될 수도 있다.
본 발명의 항체 (및 임의의 추가의 치료제)는 비경구, 폐내 및 비내를 비롯한 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 바람직한 경우에 국부 치료를 위해 병변내 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 임의의 적합한 경로, 예를 들어 부분적으로는 투여가 단기적인지 장기적인지에 따라 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해 수행될 수 있다. 다양한 시점에 걸쳐 단일 또는 다중 투여 등을 비롯한 다양한 투여 계획으로는 본원에서 볼루스 투여 및 펄스 주입이 고려된다.
본 발명의 항체는 우수한 의료 실무와 일치하는 방식으로 제제화되고 투약되고 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려할 인자는 치료할 특정 장애, 치료받을 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료 전문의에게 공지된 다른 요인을 포함한다. 반드시 그럴 필요는 없지만, 임의로, 항체는 해당 장애를 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제제화된다. 이러한 다른 작용제의 유효량은 제제 내에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 요인들에 따라 달라진다. 이는 일반적으로 상기 기재된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99％로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량 및 임의의 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적절한 투여량 (단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 조합으로 사용될 때)은 치료할 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 따라 달라질 것이다. 항체는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라서, 예를 들어 1회 이상의 개별 투여에 의해서든 아니면 연속 주입에 의해서든지 상관없이, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg)의 항체가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 한 가지 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 치료는 일반적으로 상태에 따라 질환 증상이 바람직한 수준으로 저해될 때까지 지속된다. 한 예시적인 항체 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 그의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 매 3 주마다 투여될 수 있다 (예를 들어, 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 항체가 환자에게 제공되도록 투여됨). 보다 높은 초기 부하 용량을 투여한 후, 1회 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상의 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
임의의 상기 제제 또는 치료 방법은 항-LRP6 항체 대신에 또는 이에 더하여 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
H. 제조품
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조품이 제공된다. 제조품은 용기, 및 용기상에 있거나 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 시린지, IV 용액 백 등을 포함한다. 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 용기가 형성될 수 있다. 용기는 조성물 자체를 보유하거나 또는 상기 조성물을 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 조합하여 보유하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥주사액 또는 바이알일 수 있음). 조성물 내의 적어도 한 가지 활성제는 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 상태를 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 또한, 제조품은 (a) 그 내부에 조성물을 함유하고 있는 제1 용기 (이 조성물은 본 발명의 항체를 포함함); 및 (b) 그 내부에 조성물을 함유하고 있는 제2 용기 (이 조성물은 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함함)를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 실시양태에서의 제조품은, 조성물이 특정한 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 표시하는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제조품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 정균 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 더 포함할 수 있다. 이것은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 예를 들어 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 추가로 포함할 수 있다.
임의의 상기 제조품이 항-LRP6 항체를 대신하여 또는 이에 더하여 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
III. 실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기 제공된 일반적인 설명으로 다양한 다른 실시양태가 실시될 수 있는 것으로 이해된다.
실시예 1
실험 절차
세포 배양 및 세포 검정
세포주 EKVX 및 M14를 10% 태아 소 혈청 및 2 mM 글루타민이 보충된 RPMI-1640 배지에서 성장시키고; JHH-1 세포를 동일한 보충물을 갖는 윌리암스 배지 E에서 성장시켰다. 모든 다른 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (ATCC)으로부터 얻고, 제안된 바와 같이 유지하였다.
세포를 24-웰 플레이트에서 제조업체의 제안에 따라 FuGENE 6 형질감염 시약 (로슈(Roche))으로 형질감염시켰다. 루시페라제 리포터 검정의 경우, 발현 플라스미드 DNA의 혼합물을 형질감염시켰다: 7.5 ng 탑글로우(TOPglow) (업스테이트(Upstate)) 또는 탑브라이트(TOPbrite) (문헌 [Zhang et al., 2009]) 반딧불이 루시페라제 Wnt 리포터, 0.5 ng pRL-SV40 레닐라 루시페라제 (프로메가(Promega)), 및 1 ng LEF1. 세포를 형질감염 24시간 후에 시작하여 16-20시간 동안 항체로 처리하였다. Wnt3a 단백질 (X에 따라 정제되거나, 또는 R&D 시스템즈(R&D Systems)로부터 구입함)을 항체 처리 개시 1시간 후에 시작하여 세포에 첨가하였다. 세포를 150 ul의 용해 완충제 (문헌 [DeAlmeida et al., 2007])에서 수확하고, 발광을 듀얼-글로(Dual-Glo) 루시페라제 시스템 (프로메가) 및 엔비전(Envision) 다중표지 판독기 (퍼킨엘머(PerkinElmer))를 이용하여 30-50 ul의 용해물에 대해 검정하였다. 반딧불이 루시페라제 수준을 형질감염 효율을 위해 레닐라 루시페라제 수준에 대해 정규화하고, 상대적 루시페라제 단위 (RLU)를 Wnt3a로 자극시키지 않은 세포에서의 수준에 대해 정규화하였다.
탑브라이트 리포터와 안정하게 통합된 HEK293 및 Hs578T 세포주를 히그로마이신 내성에 대해 선택하였다. Wnt 루시페라제 리포터의 발현을 HEK293 세포의 경우 안정하게 통합된 SV40-구동 레닐라 루시페라제 또는 Hs578T 세포의 경우 멀티톡스-플루오르(MultiTox-Fluor) 세포 생존율 검정 (프로메가)을 기반으로 세포 수에 대해 정규화하였다.
전장 Wnt1 또는 Wnt3a를 pRK5 발현 벡터에서 전장 FZD4, FZD5 또는 LRP6의 상류에 클로닝하여 Wnt 키메라 구축물을 만들었다. 24-아미노산 링커 (GGGSGGGT)3을 Wnt 및 FZD 또는 LRP6 서열 사이에 삽입하였다 (문헌 [Cong et al., 2004]).
1-아암 YW211.31 항체 변이체는 이. 콜라이에서 '놉스-인투-홀스(knobs-into-holes)' 공학 기술을 이용하여 YW211.31.62 중쇄 및 경쇄를 말단절단된 Fc 도메인과 공동-발현시켜 생산하였다 (문헌 [Ridgway, J.B.B. et al., Protein Engineering 9:617-621 (1996)]). 항체 가교를 위해, Fc-특이적 염소-항-인간 IgG 항체 또는 F(ab')2 단편 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))을 1시간 동안 1-아암 YW211.31 항체와 인큐베이션한 후에 세포에 혼합물을 첨가하였다.
웨스턴 분석을 위해, 1.2 x 106개 HEK293 세포를 10-cm 접시 상에 시딩하고, 3일 후에 10 μg/ml 항체, 또는 X μg/ml DKK1 (R&D 시스템즈) 또는 Fzd8CRD-Fc (DeAlmeida et al., 2007) 단백질로 1시간 동안 처리한 후에 추가로 1시간 동안 0.2 ug/ml Wnt3a 단백질을 첨가하였다. 세포를 차가운 PBS로 2회 세척하고, 얼음 상에서 0.5 ml 용해 완충제에서 용해시켰다. 20 μg의 단백질을 변성 SDS-폴리아크릴아미드 겔 (4-12%) 상에서 전기영동에 의해 분할하고, 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 포스포- 및 총 LRP6 (셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)), β-카테닌 (BD 트랜스덕션 래보러토리즈(BD Transduction Laboratories)), β-액틴 및 GAPDH에 대한 항체로 프로빙하였다. 단백질을 적외선 표지된 2차 항체 (로클랜드 이뮤노케미칼스(Rockland Immunochemicals)) 및 오디세이(Odyssey) 영상화기 (LI-COR)를 이용하여 시각화하였다.
정량적 실시간 PCR (qPCR) 발현 분석을 위해, RNA를 RNeasy 키트 (퀴아젠(QIAGEN))를 이용하여 세포로부터 단리하고, 7900 HT 고속 실시간 PCR 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)) 상에서 택맨(TaqMan) 1-단계 RT-PCR 마스터 믹스(Master Mix) 시약 키트 (어플라이드 바이오시스템즈)로 수행하였다. 상대적 RNA 수준을 △△Ct 방법을 사용하여 계산하고, 동일한 샘플 내의 인간 GAPDH 또는 마우스 Rpl19 RNA 수준에 대해 정규화하고, Wnt3a, 항체 또는 다른 단백질을 첨가하지 않은 (NA) 세포로부터의 샘플에 대해 추가로 정규화하였다. 프라이머 및 프로브 세트는 다음과 같다 (각각 정방향 프라이머, 역방향 프라이머, 및 프로브 서열에 대해 5'에서 3'으로 열거됨):
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인간 APCDD1, AXIN2, GAD1, LEFTY2 및 SAX1, 및 마우스 Rpl19 및 Axin2에 대해 사용된 프라이머 및 프로브는 이전에 기재되었다 (문헌 [DeAlmeida, et al. (2007); Liu et al., (2010)]).
GAPDH 프라이머 및 프로브는 어플라이드 바이오시스템즈로부터 구입하였다. 리포터 유전자 및 qPCR 검정을 위해, 모든 도면은 3 또는 4개의 실험 반복물의 평균 및 표준 편차를 나타낸다.
LRP6 항체 스크리닝 및 친화도 성숙
영역 E1-E2 (서열 29의 아미노산 A19-R644) 및 E3-E4 (서열 29의 아미노산 V629-G1244)를 코딩하는 인간 LRP6 cDNA 단편을 HSV 신호 서열 및 단백질 태그로서의 인간 IgG Fc 영역 (서열 30 (E1-E2-fc); 서열 31 (E3-E4-fc))을 함유하는 포유동물 발현 벡터로 개별적으로 클로닝하였다. LRP6.E1-E2-Fc 및 LRP6.E3-E4-Fc 단백질을 일시적 형질감염에 의해 CHO 세포에서 발현시키고, 단백질 A/G 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 또한, LRP6.E1-E2-Fc 및 LRP6.E3-E4-Fc 단백질을 개별적으로 사용하여 인간 합성 Fab 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하였다. 고정된 LRP6 단백질 상에서의 선택 후에, 파지 클론을 단리하고, LRP6-Fc 융합 단백질 단편 (및 Fc 단백질은 아님)에의 결합에 대해 파지 ELISA에 의해 확인하였다. 이어서, 파지 Fab 클론을 인간 IgG1 모노클로날 항체로서의 발현에 대해 다시 포맷하였다. LRP6.E1-E2-Fc에 대한 24개의 특징적인 항체 중쇄 클론 및 LRP6.E3-E4-Fc에 대한 22개의 클론을 형질감염시키고, HEK293 세포에서 공통적인 헤르셉틴-유래 인간 카파 경쇄와 일시적으로 발현시키고, IgG 단백질을 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 연속 대규모 항체 제제를 CHO 세포에서 일시적 형질감염에 의해 생산하였다.
YW211.31 항체를 His-태그 부착된 LRP6.E3-E4 단백질을 이용하여 친화도 성숙시켰다. CDR 루프 (H1/L3, H2/L3 및 H3/L3)의 3개의 상이한 조합을 소프트-무작위화 선택된 잔기에 의한 개별 라이브러리에서의 무작위화에 대해 표적화하였다. 또한, L1/L2/L3 CDR 조합을 하드 무작위화에 대해 표적화하였다. 선택의 제1 라운드에서, 무작위화 라이브러리로부터의 파지를 고정된 LRP6.E3-4-His 단백질로 선택한 후에, LRP6.E3-4-His의 농도가 300 nM으로부터 0.5 nM으로 점차적으로 감소되는 5 라운드의 용액-상 분류를 수행하고, 100-배 과량의 LRP6.E3-4-Fc 단백질을 첨가하여 보다 빠른 해리 속도를 갖는 항체를 고갈시켰다. 11개의 파지 클론을 정제하였고, 이들은 모두 파지 경쟁 ELISA에 의해 결정된 바와 같이 LRP3.E3-E4에 대해 개선된 친화도를 나타내었다. 이들 클론의 서열은 CDR-H1, CDR-H3 및 CDR-L3에서 1 내지 6개 아미노산 변화를 나타내었다. 정제된 항체의 해리 속도 상수를 비아코어(BIAcore) 기기를 이용하여 표면 플라즈몬 공명 분석에 의해 평가하였다.
생체층 간섭법 LRP6 단백질 결합 검정
생체층 간섭법은 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (문헌 [Bourhis et al., 2010]). 간략하게, 비오티닐화 His-태그 부착된 LRP6 단백질을 아비태그(AviTag) 시스템 (진코포에이아(GeneCopoeia))을 이용하여 바큘로바이러스-감염된 곤충 세포로부터 정제하였다. 결합 동역학은 20 μg/ml LRP6 단백질이 부하된 스트렙타비딘 고 결합 FA 바이오센서를 이용하여 옥텟(Octet) RED 시스템 (포르테바이오(ForteBio)) 상에서 측정하였다. 담체-무함유 정제된 인간 Wnt3a 및 마우스 Wnt9b를 R&D 시스템즈로부터 얻었고, 정제된 DKK1 단백질은 이전에 기재된 바와 같이 생산하였다 (문헌 [Bourhis et al., 2010]).
종양 및 골 연구
MMTV-Wnt1 트랜스제닉 마우스로부터의 종양을 C57BL/6 마우스의 유방 지방 패드에서 계대배양하고, 기계적으로 및 효소에 의해 해리시키고, 매트리겔(Matrigel) 및 행크(Hank) 밸런스 염 용액 (HBSS)에 재현탁시키고, 무흉선 NCr 누드 마우스 (타코닉(Taconic))의 유방 지방 패드에 주사하였다. 종양 부피가 250-800 mm3에 도달하면 처리를 개시하였다. 각각의 처리군에서, 10마리 마우스에게 30 mg/kg의 항체 또는 단백질을 격일로 복강내 (IP) 투여하였다. 종양 부피를 캘리퍼 측정을 이용하여 분석하였다.
Ntera-2 이종이식 종양 성장 및 생체내 연구를 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (문헌 [DeAlmeida et al., 2007]). 간략하게, NU/NU 무흉선 누드 마우스 (찰스 리버(Charles River))에게 마우스 당 천만개의 Ntera-2 세포 (HBSS 중 50% 매트리겔 내)를 피하 주사하고, 평균 종양 부피가 535-595 mm3에 도달하면 4 또는 5개의 동물 군으로 나누고, 단일 IP 용량의 100 mg/kg 항체 또는 30 mg/kg Fzd8CRD-Fc 단백질을 주사하였다. 종양 및 혈액 혈청 샘플을 처리 16시간 후에 수집하였다. 종양을 티슈라이저(TissueLyser) 시스템 (퀴아젠)을 이용하여 균질화하고, RNA를 RNeasy 키트 (퀴아젠)를 이용하여 추출하였다.
두개관을 문헌 [Mohammad et al., 2008]에 기재된 바와 같이 수확하여 배양하였다. 간략하게, 두개관을 생후 2일된 마우스 새끼로부터 해부하고, 반으로 절단하고, 경막, 혈관 및 두피로부터 분리하였다. 두개관을 조직 배양 플레이트에서 0.1% 소 혈청 알부민 및 각각 100 U/ml의 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 BGJb 배지 중에서 1일 동안 배양한 후에 10 μg/ml 항체 또는 단백질로 7일 동안 처리하였다. 골을 37℃에서 5% CO2의 습윤 대기 중에서 배양하였다. 마우스 두개관을 μCT 40 (스캔코 메디컬(SCANCO Medical), 스위스 바세르도르프) x선 마이크로-CT 시스템으로 영상화하였다. 마이크로-CT 데이터를 하기 파라미터로 수득하였다: x선 튜브 에너지 수준 = 45 kV, 전류 = 177 μA, 통합 시간 = 300 msec, 2000회 투영. 축 영상을 6 μm의 등방성 해상도에서 수득하였다. 히드록시아파타이트 (HA) 모형을 보정에 사용하였다. 마이크로-CT 스캔을 어날라이즈(Analyze) (어날라이즈다이렉트 인크.(AnalyzeDirect Inc.), 미국 켄자스주 레넥사)로 분석하였다. 각 샘플에 대해 횡단면에서의 최대-강도 투영도 및 3차원 표면 투시도를 생성하였다. 두정골 경계는 두정부를 분할하기 위한 트레이스 도구를 이용하여 수동으로 드로잉하였다. 이 영역 내에서, 샘플 부피 및 평균 골 무기질 밀도 (BMD)를 계산하였다. 영역 내에서 오직 석회화된 조직의 평균 BMD를 계산하기 위해 0.3 gm-HA/cm3의 역치를 영역에 적용하였다. 또한, 역치를 사용하여 두정부에 대한 전체 복셀에 대해 석회화 복셀의 수를 나눔으로써 두정부의 석회화 부피 백분율을 계산하였다. 각 샘플에 대해 하기 파라미터를 분석하였다: 두정부 부피, 두정부의 석회화 복셀의 BMD, 및 두정부 석회화 백분율. 군 사이의 차이는 p-값이 던넷(Dunnett) 시험에 의해 0.05 미만이라면 유의한 것으로 간주하였다.
마우스를 이용하는 모든 실험은 제넨테크 동물 실험 윤리 위원회 지침에 따라 수행하였다.
실시예 2
Wnt 길항제 및 강화 LRP6 모노클로날 항체의 단리
Wnt 신호전달을 조작하기 위한 후보 치료 분자를 개발하기 위해, Wnt3a 단백질에 의해 유도된 신호전달을 억제하거나 또는 증진시킬 수 있는 항체를 생성하였다. 재조합 LRP6.E1-E2-Fc (서열 30) 및 LRP6.E3-E4-Fc (서열 31) 단백질을 사용하여 인간 합성 Fab 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하고, ELISA에 의해 LRP6에의 단리된 파지 클론의 결합을 확인하였다. LRP6.E1-E2에 대한 24개의 특징적인 항체 중쇄 클론 및 LRP6.E3-E4에 대한 22개의 클론을 단리하고, 다시 포맷하고, 인간 IgG1 항체로 발현시켰다. 6개의 LRP6.E3-E4 항체는 0.1 mg/ml 정제된 Wnt3a로 유도된 HEK293 세포에서 Wnt 루시페라제 리포터 활성을 농도-의존성 방식으로 억제하였다 (도 1a. 언급된 경우를 제외하고 본 그래프 및 다른 모든 그래프의 오차 막대는 적어도 3개의 반복 샘플의 표준 편차를 나타낸다). 이들 항체를 YW211.03, YW211.08, YW211.11, YW211.12, YW211.31 및 YW211.33으로 명명하였다. LRP6.E1-E2 항체 중 어느 것도 이러한 억제를 나타내지 않았다. LRP6.E3-E4 도메인을 인식하는 YW211.31 항체가 Wnt3a-자극된 HEK293 세포에서 대략 1 ug/ml (또는 6 nM)의 IC50으로 신호전달을 억제하는데 가장 강력하였다. YW211.31 항체는 정제된 Fzd8CRD 및 DKK1 단백질과 유사하게 LRP6 단백질의 수준에 영향을 미치지 않으면서 Wnt3a-유도된 LRP6 인산화 및 β-카테닌 단백질 안정화를 억제하였다 (도 1b, 비자극되거나 Wnt3a로 유도되고, 지시된 LRP6 항체 또는 정제된 단백질로 처리된 HEK293 세포의 웨스턴 분석을 보여줌 (b-액틴 및 GAPDH 단백질 수준은 샘플 부하 대조군으로 나타냄)). RNAi 실험은 b-카테닌 폴리클로날 항체에 의해 인식되는 저분자량 밴드만이 b-카테닌 단백질을 나타낸다는 것을 입증하였다. YW211.31 항체는 또한 마우스 NIH/3T3 세포에서의 Wnt3a-유도된 리포터 활성 및 마우스 L 세포에서의 β-카테닌 단백질 안정화를 부분적으로 억제하므로 마우스 Lrp6 기능에 길항할 수 있다.
YW211.31 항체는 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 약 2 nM 및 스캐차드 분석에 의해 0.6 nM의 결합 친화도를 갖는다. YW211.31 항체의 친화도 및 잠재적 효능을 개선시키기 위해, His-태그 부착된 LRP6 E3-E4 단백질 및 선택된 CDR 잔기가 무작위화를 위해 표적화되는 CDR 조합 라이브러리를 이용하여 클론을 친화도-성숙시켰다. 파지 경쟁 ELISA에 의해 가장 개선된 친화도를 나타내는 4개의 파지 클론, YW211.31.11, YW211.31.11, 35, YW211.31.57 및 YW211.31.62를 다시 포맷하고, 전장 인간 IgG로 발현시켰다. 4개 모두의 친화도-성숙된 IgG의 해리 속도 상수가 감소하여, 가장 우수한 2개의 항체, YW211.31.57 및 YW211.31.62에 대한 친화도를 개선시켰다 (각각 KD 0.27 및 0.17 nM). YW211.31.57 및 YW211.31.62는 또한 Wnt3a-자극된 HEK293 세포에서 대략 0.1 μg/ml (0.6 nM)의 IC50 값으로 신호전달을 억제하는데 개선된 효능을 나타낸다.
스크린에서 단리된 어떠한 항체도 외인성 Wnt3a 단백질로의 자극의 부재 하에 HEK293 세포에서 신호전달을 활성화시키지 않았으나, 5개의 LRP6 E1-E2 및 2개의 E3-E4 항체가 Wnt3a-유도된 신호전달을 적어도 2-배 강화시켰다. 마우스 NIH/3T3 세포에서, YW210.09, E1-E2 항체는 또한 Wnt3a-유도된 신호전달을 적어도 1.5-배 강화시켰고, 이는 이것이 또한 마우스 LRP6을 인식한다는 것을 나타낸다. HEK293 세포에서, YW210.09 항체에 의한 Wnt3a-유도된 신호전달의 증진의 정도는 Wnt3a 농도에 비례한다 (도 1c). YW210.09 항체는 SPR 분석에 의해 측정된 바와 같이 인간 LRP6 E1-E2 단백질과 5 nm의 KD로 상호작용한다. ELISA 시험은 모든 길항제 및 강화 항체가 이들의 단리에 사용된 LRP6 단백질 단편에만 특이적으로 결합하고, 어떠한 것도 E1-E2 및 E3-E4를 둘 다 인식하지 않는다는 것을 나타낸다. FACS 분석은 가용성 LRP6 E1-E4 단백질이 HEK293 세포에의 YW211.31.57 및 YW210.09의 결합을 효율적이고 완전하게 차단한다는 것을 나타내고, 이들 항체는 다른 세포 표면 단백질을 인식하지 않는다.
실시예 3
자가분비 Wnt 신호전달에 대한 LRP6 모노클로날 항체의 효과
내인성, 또는 자가분비, Wnt 신호전달을 길항하거나 또는 강화시키는 LRP6 항체의 능력을 다양한 종양 세포주를 사용하여 결정하였다 (문헌 [Bafico et al., 2004; DeAlmeida et al., 2007; Akiri et al., 2009]). 기형암종 세포주 PA-1 및 NTERA-2에서, YW211.31 항체는 외인성 Wnt3a에서 관찰된 것과 유사한 효능으로 자가분비 Wnt 신호전달에 의해 유도된 리포터 활성을 억제한다 (도 2a는 루시페라제 리포터로 형질감염되고, LRP6 항체로 개별적으로 또는 조합하여 처리된 또는 Fzd8CRD-Fc 단백질 (양성 대조군)로 처리된 PA-1 기형암종 세포에서 자가분비 Wnt 신호전달의 농도-의존성 억제 및 강화를 보여줌).
PA1 세포에서, YW211.31 항체에 의한 Wnt 신호전달의 억제가 또한 내인성 Wnt 표적 유전자의 발현에서 관찰된다 (도 2b). 도 2b는 0.3 mg/ml Wnt3a 단백질로 처리 또는 비처리되고, 10 mg/ml YW211.31 항체, 음성 대조군으로서의 항-gD 모노클로날 항체 또는 양성 대조군 샘플로서의 Fzd8CRD-Fc 단백질로 처리된 PA-1 세포에서 Wnt-유도된 유전자 SAX1 및 GAD1 및 Wnt-저해된 유전자 LEFTY2의 qPCR 발현 분석의 결과를 보여주고, 이는 Wnt3a를 첨가하지 않은 (NA) 세포로부터의 샘플에 대해 추가로 정규화된다.
항체는 외인성 Wnt3a 단백질에 의해 유도되거나 또는 내인성, 자가분비 Wnt 신호전달에 의해 유지되는 SAX1, GAD1 및 APCDD1의 발현을 부분적으로 억제한다. 반대로, Wnt3a 단백질 또는 자가분비 Wnt 신호전달에 의한 LEFTY2 발현의 저해는 YW211.31 항체에 의해 해소된다. YW211.31과 달리, YW210.09 항체는 리포터 유전자 검정에 의해 PA-1 및 NTERA-2 세포주에서 Wnt3a-유도된 및 자가분비 Wnt 신호전달을 둘 다 강화시킨다 (도 2a). YW211.31.57 항체에 의한 Wnt 신호전달의 억제는 항체 농도가 커질수록 점진적으로 증가하는 반면, YW210.09 및 다른 항체에 의한 강화는 일부 세포형, 예컨대 PA-1 세포에서 높은 항체 농도에서 감소할 수 있다. 이는 높은 항체 농도가 1가 상호작용을 선호하여 LRP6 분자의 가교를 제한하므로 강화를 위해 수용체 LRP6 이량체화가 필요하다는 것을 제안할 수 있다. YW211.31.57 및 YW210.09 항체 둘 다의 조합으로 PA-1 또는 NTERA-2 세포를 처리하면 YW211.31.57 단독의 효과와 유사하게 Wnt3a-유도된 및 자가분비 Wnt 신호전달을 둘 다 길항한다.
자가분비 Wnt 신호전달을 나타내는 추가의 세포주를 확인하기 위해, Axin2 mRNA 또는 포스포-LRP5/6의 상대적으로 높은 발현을 나타내는 세포주를 Wnt 루시페라제 리포터 유전자 검정에서 Fzd8CRD-Fc 단백질에 의한 Wnt 신호전달의 억제에 대해 시험하였다. NSCLC 세포 NCI-H23 및 NCI-H2030 및 연부 조직 육종 세포 SW872 및 HT-1080 (다른 Wnt 길항제를 사용한 검정을 기반으로 하여 내인성 Wnt 신호전달을 갖는 것으로 이전에 보고됨)을 포함하는 9개의 세포주는 Fzd8CRD-Fc 단백질에 의해 억제되는 자가분비 Wnt 신호전달을 나타내었다 (문헌 [Guo et al., 2008; Akiri et al., 2009; Nguyen et al., 2009]). 도 3은 분산의 1-원 분석 (ANOVA)에 의해 분석된 데이터의 요약을 보여준다 (p-값 <0.01). 검정은 강화 효과를 증가시키기 위해 각각 1 mg/ml YW211.31.57 또는 YW210.09 항체로 처리된 NCI-H358 및 HT-1080 세포를 제외하고는 10 mg/ml의 항체를 사용하여 수행하였다.
Wnt 신호전달이 또한 9개의 모든 세포주에서 내인성 Wnt3a 단백질에 의해 유도되었고, YW211.31.57 항체는 Wnt3a에 대한 이 반응을 억제하였다 (도 3, 4a, 4d 및 4f). 놀랍게도, YW211.31.57 항체가 이들 9개 모두의 세포주에서 자가분비 Wnt 신호전달을 강화시킨 반면, YW210.09는 5개의 세포주에서 자가분비 Wnt 신호전달을 강화시키고 3개의 세포주에서 이를 억제하였다 (도 3, 4a-4c, 4e 및 4f). 자가분비 및 Wnt3a-유도된 신호전달에 대한 YW211.31.57 항체의 이러한 상호 활성은 루시페라제 리포터를 사용한 경우 뿐만 아니라, 시험된 6개의 세포주에서의 내인성 Wnt 표적 유전자, 예컨대 Axin2의 발현에서도 관찰되었다 (도 4a, 4b 및 4c). EKVX 및 유방 암종 Hs578T 세포주에서, YW211.31 항체에 의한 Wnt 신호전달의 증가는 이러한 증가가 Fzd8CRD-Fc 단백질에 의해 차단된다는 것을 입증함으로써 자가분비 Wnt(들)에 의존성인 것으로 확인되었다 (도 4g). EKVX 및 Hs578T 세포에서의 자가분비 Wnt 신호전달의 강화가 또한 스크린에서 확인된 5개의 다른 Wnt3a-유도된 신호전달의 항체 길항제에서 관찰된다.
도 4a에서, HT-1080, EKVX, NCI-H358 및 Hs578T에서의 AXIN2 mRNA의 qPCR 발현 분석은 YW211.31.57 (25 mg/ml) 항체가 자가분비 (NA) Wnt 신호전달을 강화시키고 Wnt3a (0.2 mg/ml)에 의해 유도된 신호전달을 억제하는 반면, Fzd8CRD-Fc (25 mg/ml)가 자가분비 (NA) 및 Wn3a-유도된 신호전달을 둘 다 길항한다는 것을 나타낸다. 도 4b 및 4c에서, NCI-H23 (B) 및 M14 (C) 세포에서의 Wnt-유도된 유전자의 발현은 YW211.31.57에 의해 강화되고, YW210.09 항체 (30 mg/ml)에 의해 길항된다. Wnt3a (0.2 mg/ml) 및 Fzd8CRD-Fc (30 mg/ml) 처리는 각각 자가분비 Wnt 신호전달의 강화 및 억제에 대한 양성 대조군으로 제시되고, CD4-Fc 단백질 (B) 또는 항-gD 항체 (C)는 음성 대조군 (30 mg/ml)으로 사용된다. M14 세포 (C)의 경우, AXIN2 및 SP5 발현이 Wnt3a 단백질 또는 YW211.31.57 항체에 의해 APCDD1 및 ZNRF3 발현보다 더 강력하게 강화된다. 도 4d 및 4e는 Wnt 루시페라제 리포터와 안정하게 통합된 Hs578T 세포에서, YW211.31.57 항체가 Wnt3a-자극된 신호전달의 농도-의존성 억제 (D) 및 자가분비 Wnt 신호전달의 강화 (E)를 나타내는 반면, Fzd8CRD-Fc 단백질이 0.1 mg/ml Wnt3a 자극의 존재 또는 부재 (NA) 하에 신호전달을 억제하고 YW210.09 항체는 이러한 신호전달을 강화시킨다는 것을 보여준다. RNAi 실험은 Hs578T 세포에서 Wnt3a-유도된 신호전달의 적어도 41%가 LRP5 발현에 의존하고, 이러한 신호전달이 YW211.31.57 항체가 아니라 Fzd8CRD-Fc 단백질에 의해 억제될 것으로 예상된다는 것을 나타낸다. 이러한 실험에서, SV40-구동된 루시페라제가 정규화를 위해 형질감염되지 않았으며, 대신 항체 및 단백질 처리가 이 세포주의 생존율에 유의한 영향을 미치지 않는다는 것을 독립적으로 확인하였다. 도 4f 및 4g는 Wnt 루시페라제 리포터로 형질감염된 EKVX 세포가 또한 YW211.31.57 항체에 의한 자가분비 Wnt 신호전달의 강화 및 Wnt3a-유도된 신호전달의 길항작용을 나타낸다는 것을 보여준다. 자가분비 Wnt 신호전달의 항체-매개 강화는 5 mg/ml Fzd8CRD-Fc 단백질에 의해 억제된다.
실시예 4
상이한 Wnt 이소형에 대한 LRP6 항체의 상호 활성
YW211.31 항체는 모든 세포주에서 외인성 Wnt3a 단백질에 의해 유도된 신호전달을 억제하지만, 자가분비 Wnt 신호전달을 세포주-의존성 방식으로 억제하거나 또는 강화시킬 수 있으며, 이는 자가분비 신호를 구동하는 특정 Wnt 이소형이 항체의 활성을 특정한다는 것을 제안한다. 따라서, Wnt3a 및 다른 Wnt 이소형의 외인성 발현에 의해 유도된 신호전달에 대한 항체의 활성은 결정하였다. HEK293 또는 Hs578T 세포에서 Wnt3a의 형질감염에 의해 유도된 Wnt 신호전달은 Wnt3a 단백질 처리에 의해 유도된 신호전달의 억제와 유사한 효능으로 YW211.31.57 항체에 의해 억제된다. 놀랍게도, 두 세포주에서 Wnt1 발현에 의해 신호전달은 YW211.31.57 항체에 의해 강화된다. Wnt1 및 Wnt3a 신호전달은 둘 다 예상한 바와 같이 Fzd8CRD-Fc 단백질에 의해 억제된다. Wnt1 신호전달의 강화가 또한 스크린에서 확인된 다른 Wnt3a 길항제 항체에서 관찰되었다. YW210.09 항체는 또한 YW211.31.57 활성과 상호적인 Wnt3a- 및 Wnt1-유도된 신호전달에 대한 반대 활성, 즉 Wnt3a의 강화 및 Wnt1 신호전달의 억제를 나타내었다. YW210.09 항체는 또한 Fzd8CRD-Fc 단백질 처리와 유사한 정도로 감소된 Wnt 표적 유전자 Axin2 및 Mmp7의 발현에 의해 관찰된 바와 같이, MMTV-Wnt1 마우스 종양으로부터의 배양물에서 성장시킨 종양 세포에서 Wnt1 신호전달을 억제한다. MMTV-Wnt1 세포에서, YW211.31.57 항체는 Wnt1 신호전달을 강화시키는데 실패하였고, 이는 아마도 Wnt1 신호전달이 이들 세포에서 이미 최대이기 때문일 것이다.
YW211.31.57 및 YW210.09 항체가 Wnt3a 및 Wnt1에 의해 개시되는 Wnt 신호전달에 대해 상호 활성을 갖는다는 것이 입증되었으므로, 이 분석을 또한 루시페라제 리포터를 HEK293 세포에서 2배 초과로 유도하는 19개의 Wnt 유전자 중 추가의 11개에 대해 수행하였다. 도 5는 10 μg/ml의 항체, 10 μg/ml Fzd8CRD를 사용하여 수행된 검정의 데이터의 요약을 제공한다. 오직 Wnt3a 및 Wnt3 활성이 YW211.31.57 항체에 의해 억제되고, 둘 다 YW210.09에 의해 강화된다. Wnt1 이외의 7개의 Wnt 이소형은 YW211.31.57에 의해 강화되고, YW210.09에 의해 억제된다. 제3 클래스의 Wnt 이소형 (Wnt7a, 7b 및 10a)은 어느 한 항체에 의해 억제되지 않고 적어도 YW211.31.57에 의해 강화되는 신호전달 활성을 나타낸다. 상이한 Wnt 이소형으로 형질감염된 Hs578T 세포에서, 항체는 이들 동일한 활성의 대부분을 나타낸다. 특히, YW211.31.57은 Wnt3 및 Wnt3a를 억제하고, 루시페라제 리포터를 유도하는 다른 Wnt 이소형 11개 모두를 적어도 2배 강화시킨다. YW210.09는 또한 Hs578T 세포에서 Wnt3 및 Wnt3a를 강화시킬 뿐만 아니라 HEK293 세포에서 길항되고 Hs578T 세포에서 시험될 수 있는 7개의 Wnt 이소형 중 5개를 억제한다. 이 클래스의 2개의 다른 Wnt 이소형, Wnt8a 및 Wnt9b는 Hs578T 세포에서 YW210.09 항체에 의해 영향을 받지 않는다. RNAi 실험이 Hs578T에서의 Wnt3a 신호전달은 LRP6 및 LRP5 둘 다에 의해 형질전환되지만 HEK293 세포에서는 그렇지 않다는 것을 나타내므로, Wnt 8a 및 Wnt9b는 주로 Hs578T 세포에서 LRP5를 통해 신호를 전달할 수 있다. HEK293 세포에서와 같이, 제3 클래스의 Wnt 이소형은 Hs587T 세포에서 어느 한 항체에 의해 억제되지 않았고, 본 발명자들은 이 클래스에 Wnt4 (HEK293 세포에서 신호전달을 유도하지 않음)를 추가할 수 있었다. 이 클래스에서 오직 Wnt7b의 활성이 YW210.09 항체가 Hs578T에서 그의 신호전달을 강화시키지만 HEK293 세포에서는 그렇지 않다는 점에서 다르게 거동한다. YW211.31.57 및 YW210.09 항체의 Wnt 이소형-특이적 활성과 대조적으로, Fzd8CRD-Fc 단백질은 HEK293 세포에서 Wnt6 및 Wnt9b를 제외하고 모든 Wnt의 활성을 강력하게 억제할 수 있다. Hs578T 세포에서, 자가분비 Wnt 신호전달은 Wnt4, Wnt7a 및 Wnt7b의 발현에 의해 유도된 신호전달과 같이 YW211.31.57 및 YW210.09 항체 둘 다에 의해 강화된다. 따라서, 이들 3개의 Wnt 이소형은 Hs578T 세포에서 자가분비 신호전달을 구동하는 것에 대한 후보이다.
Wnt7b에 대한 여러 siRNA는 Hs578T 세포에서 자가분비 신호전달을 억제하였으나 다른 Wnt 이소형의 경우에는 그렇지 않았으며, 이로부터 신호전달을 매개하는 특정 Wnt 단백질을 확인하였다. PA-1 세포에서 자가분비 Wnt 신호전달은 YW211.31.57 항체에 의해 억제되고 YW210.09에 의해 강화되므로, Wnt3 또는 Wnt3a는 아마도 이들 세포에서 내인성 신호전달을 활성화시킬 것이다. 실제로, Wnt3에 대한 siRNA는 PA-1 세포에서 자가분비 Wnt 신호전달을 억제하였으나 Wnt3a의 경우에는 그렇지 않았다. NCI-H23 NSCLC 세포 및 M14 흑색종 세포에서, YW211.31 항체에 의한 자가분비 Wnt 신호전달의 강화 및 YW210.09에 의한 길항작용은 NCI-H23 세포에서의 내인성 신호전달을 억제하는 Wnt2 RNAi, 및 M14 세포에서의 내인성 Wnt1 발현과 일치한다. 여러 siRNA를 사용하여, 본 발명자들은 NCI-H23 세포에서의 Wnt2 발현 및 M14 세포에서의 Wnt1 발현이 자가분비 Wnt 신호전달을 필요로 한다는 것을 확인하였다.
Wnt3a-자극된 HEK293 세포에서 신호전달을 길항하는 실시예 2의 스크린으로부터 단리된 모든 항체가 도한 시험된 다른 모든 세포주에서 Wnt3a 자극을 억제하고, 또한 기형암종 세포주에서 자가분비 Wnt 신호전달을 억제하였기 때문에, 이들 항체가 시험된 다른 9개의 세포주에서 자가분비 Wnt 신호전달을 강화시키는 것은 놀라운 것이었다. 또한, YW210.09 항체는 시험된 모든 세포주에서 Wnt3a 신호전달을 강화시키고 7개의 세포주에서 자가분비 Wnt 신호전달을 증진시키지만, 다른 3개의 세포주에서는 내인성 신호전달을 억제한다. 이러한 연구는 상이한 Wnt 이소형 (동일한 세포주에서 발현됨)이 LRP6 항체의 활성을 결정하고, Wnt3a 길항제 및 강화 항체가 또한 대부분의 다른 Wnt 단백질에 대해 상호 효과를 갖는다는 것을 보여준다. 연구는 또한 상이한 Wnt 이소형의 동일한 세포주로의 도입이 LRP6 항체의 활성을 결정하고, Wnt3a 길항제 및 강화 항체가 또한 대부분의 다른 Wnt 단백질에 대해 상호 효과를 갖는다는 것을 보여준다. 이들의 두 LRP6 항체와의 기능적 상호작용을 기반으로, 시험된 14개의 Wnt 이소형을 하기 3개의 클래스로 분류할 수 있다: Wnt3 및 Wnt3a는 YW211.31에 의해 억제되고 YW210.09에 의해 강화됨; Wnt 1, 2, 2b, 6, 8a, 9a, 9b 및 10b는 YW211.31에 의해 강화되고 YW210.09에 의해 길항됨; 및 Wnt 4, 7a, 7b 및 10a는 YW211.31에 의해 강화되고 YW210.09에 의해 억제됨 (도 5). 이러한 분류는 Wnt3/3a 서브패밀리가 가장 진화적으로 다양한 것일지라도 Wnt 유전자의 제안된 계통발생에 분명하게 상응하지 않는다 (문헌 [Cho et al., 2010]).
실시예 5
Wnt 이소형은 LRP6 항체의 상이한 활성을 특정한다
상이한 Wnt 이소형이 다양한 세포주에서 내재적으로 발현되는 상이한 FZD 이소형에 우선적으로 결합할 수 있고, 이는 본 발명의 LRP6 항체의 차별적 활성을 설명할 수 있을 것으로 생각할 수 있다. 이러한 가능성을 조사하기 위해, 상이한 Wnt-FZD 쌍을 공유결합에 의해 연결한 키메라 단백질을 구축하여 특정 Wnt 또는 FZD 이소형이 LRP6 항체의 활성을 결정하는지 여부를 시험하였다. FZD4 또는 FZD5에 융합된 Wnt3a 또는 Wnt1은 내인성 Wnt 발현의 추정된 부재 하에 HEK293 세포에서 Wnt 신호전달을 강력하게 활성화시키는 반면, FZD4 또는 FZD5의 과다발현은 Wnt 신호전달을 유도하지 않는다. YW211.31.57 항체는 FZD4 또는 FZD5에 융합된 Wnt3a의 신호전달 활성을 억제하고, FZD4 또는 FZD5에 융합된 Wnt1의 활성을 강화시킨다 (도 6은 10 μg/ml의 항체, 10 μg/ml Fzd8CRD를 사용하여 수행한 검정의 데이터의 요약을 제공함). YW210.09 항체는 Wnt1 키메라에 대한 상호 활성 (둘 다 억제)을 나타낸다. 따라서, 항체의 활성은 Wnt 이소형과 관련되고, FZD 이소형과 관련되지 않는다. Fzd8CRD-Fc 단백질은 임의의 4개의 Wnt-FZD 키메라에 의해 유도된 신호전달에 대해 영향을 미치지 않으며, 이는 Wnt의 FZD-결합 부위의 독립적으로 기능하는 키메라와 일치한다.
LRP6에 Wnt1 또는 Wnt3a를 융합시키는 키메라의 발현은 LRP6 과다발현보다 훨씬 더 강력하게 Wnt 신호전달을 유도한다. YW211.31.57 및 YW210.09 항체는 이 유도를 억제할 수 없으며, 이는 항체의 억제 기능이 LRP6에의 Wnt 결합의 차단에 의존한다는 가설과 일치한다 (도 6).
본 연구는 FZD가 아니라 Wnt의 이소형이 항체의 활성을 결정한다는 것을 확인한다. FZD가 아니라 LRP6을 갖는 Wnt 이소형의 키메라 단백질 기능은 LRP6 항체에 의한 억제에 민감하지 않으며, 이는 길항작용이 리간드-보조수용체 상호작용의 차단에 의해 매개될 수 있다는 것을 제안한다. 이는 둘 다 LRP6의 E3-E4 영역 내에서 경쟁적으로 결합하는 Wnt3a 및 YW210.09 항체, 및 E1-E2 영역 내에서 결합에 대해 경쟁하는 Wnt9b 및 YW211.31 항체에서 시험관내 결합 연구에 의해 확인된다. 두 LRP6 항체의 에피토프는 각각 상이한 클래스의 Wnt 이소형에의 결합 부위를 규정하는데, 하나는 E1-E2 내에 있고, 하나는 E3-E4 도메인 내에 있다. 항체 또는 이들의 조합에 의해 억제되지 않는 이소형에 대해 적어도 제3 Wnt 결합 부위가 예상되고, 아마도 4개의 반복 도메인은 각각 상이한 하위세트의 Wnt 이소형에 결합할 것으로 보인다. 이러한 모듈 조직화는 각각 Wnt-결합 및 보조수용체 결합 길항제, 예컨대 SFRP 및 DKK 단백질 이소형에 의한 차별적 조절을 수용하는 상이한 Wnt의 구조적 다양성 및 이들의 결합 부위를 허용할 수 있다.
실시예 6
Wnt 신호전달의 항체-매개 강화는 LRP6 이량체화와 관련된다
YW211.31 항체에 의한 자가분비 Wnt 신호전달의 강화는 아마도 LRP6 이량체화를 통해 결합력 효과를 필요로 한다. YW211.31 및 재조합 1-아암 YW211.31 항체의 1가 Fab 단편은 EKVX 및 Hs578T 세포주에서 Wnt3a-유도된 신호전달을 억제하는 농도에서 상기 세포에서의 자가분비 Wnt 신호전달의 강화를 나타내지 않는다. 대조적으로, YW211.31 Fab 단편 및 1-아암 mAb는 무손상 IgG 항체에 대해 유사한 효능으로 PA-1 기형암종 세포주에서 자가분비 Wnt 및 Wnt3a-유도된 신호전달을 둘 다 억제한다. 1-아암 YW211.31 항체의 가교가 전체 IgG 분자의 Wnt 강화 기능을 복구하는지 여부를 시험하기 위해, YW211.31.57 항체에 의해 강화된 자가분비 Wnt 및 Wnt2-유도된 신호전달 뿐만 아니라 Fc 가교에 의해 증진된 아포맙 항체-유도된 아폽토시스를 나타내는 HT-1080 연부 조직 육종 세포주를 사용하였다 (문헌 [Adams et al., 2008]). 1-아암 YW211.31 항체는 자가분비 Wnt 신호전달 또는 Wnt2 형질감염에 의해 유도된 신호전달에 영향을 미치지 않는다. 아포맙-매개 아폽토시스를 증가시키는 항-Fc 항체와의 가교 조건 하에, 1-아암 항체의 가교가 YW211.31.57 전체 항체에서 관찰된 자가분비 Wnt 및 Wnt2 신호전달 둘 다의 강화를 부분적으로 재구성하는 것으로 결정되었다.
1-아암 및 Fab 항체 포맷이 가교되지 않는다면 Wnt 신호전달을 증진시키는데 실패하였으므로 항체-매개 Wnt 강화는 보조수용체 이량체화를 필요로 한다. 또한, 본원에 제시된 세포-기반의 생화학적 데이터는 가교된 LRP6에의 Wnt 결합이 또한 신호전달의 강화에 필요하다는 것을 나타내며, 이는 아마도 FZD의 복합체로의 Wnt-매개 동원에 대한 필요를 반영할 것이다. 과다발현된 LRP6의 작은 분획이 세포 표면에서 동종이량체로 확인될 수 있고, 이량체화가 세포외 도메인을 필요로 하지만, 이것이 LRP6 과다발현에 의해 유도된 Wnt-비의존성 b-카테닌 신호전달에 기여하는지 여부는 명확하지 않다 (문헌 [Liu et al., 2003]). LRP6 세포외 도메인의 고갈은 또한 신호전달을 Wnt-의존성 방식으로 활성화시키고, 상이한 방법에 의한 이 재조합 단백질의 강제 세포외 이량체화는 이 활성을 증진시키거나 또는 억제할 수 있다 (문헌 [Liu et al., 2003; Cong et al., 2004]). Wnt는 둘 다 세포내 DVL 단백질의 동종-올리고머화 기능을 필요로 하는 원형질 막에서의 LRP6 응집 및 인산화를 유도한다 (문헌 [Bilic et al., 2007]). 이러한 거대 응집체는 또한 Axin 및 GSK3을 함유하고, 아마도 b-카테닌 분해를 억제할 것이다.
실시예 7
Wnt 길항제의 결합 억제에 의한 Wnt 신호전달의 항체-매개 강화
세포외 LRP6 길항제, 예컨대 DKK1 이소형 및 SOST의 활성의 억제는 또한 Wnt 신호전달을 강화시킬 수 있다 (문헌 [Niida et al., 2004]). 외인성 DKK1 단백질은 HEK293 세포에서 Wnt1-유도된 신호전달을 억제하고, YW211.31.57 항체는 이 길항작용을 차단할 수 있으며, 심지어 DKK1 단백질의 존재 하에 충분히 높은 농도에서 신호전달을 강화시킬 수 있다 (도 4g). 대조적으로, YW211.31 1-아암 항체는 이들 동일한 농도에서 Wnt1 신호전달의 DKK1 길항작용을 단지 매우 약하게 억제한다. YW211.31.57 전체 항체는 시험된 모든 DKK1 농도에서 DKK1 활성을 효과적으로 길항하는 반면, 1-아암 항체는 심지어 낮은 DKK1 농도에서도 최소의 효과를 나타내거나 또는 효과를 나타내지 않았다. 전체 YW211.31 항체에서는 관찰되지만 1-아암 YW211.31 항체에서는 관찰되지 않는 외인성 DKK1 활성의 강력한 길항작용은 전체 항체에 특이적인 Wnt-강화 활성에 기여할 수 있다. 대안적으로, DKK1 단백질이 이 검정에서 Wnt1-유도된 신호전달을 완전하게 억제하지 못하므로, 또한 무손상 YW211.31 항체가 LRP6 이량체화를 통해 잔류 신호를 간단하게 강화시킬 수 있다.
LRP6과의 DKK1 상호작용의 항체 억제가 반드시 Wnt 강화 활성을 부여하지 않고, DKK1 길항작용이 LRP6 이량체화에 필요한 것으로 보이기 때문에, DKK1 활성의 억제는 아마도 보조수용체에 결합된 Wnt에 의한 잔류 신호전달의 강화에 의해 우세하게 매개될 것이다.
실시예 8
Wnt 신호전달 길항작용은 LRP6 항체 조합에서 우세하다
상기 검정은 Wnt3a 및 Wnt3이 LRP6의 E1-E2 영역 내에서 결합하고, YW211.31.57 항체에 의한 결합으로부터 억제된다는 것을 나타낸다. Wnt1 클래스의 Wnt 이소형은 E3-E4 영역에 결합할 것으로 예상되고, 이러한 결합은 YW210.09 항체에 의해 차단된다. 어떠한 이론으로도 제한되지 않고, Wnt 신호전달의 강화는 Wnt 이소형 및 항체가 둘 다 동일한 LRP6 분자에 결합할 수 있을 때 일어날 수 있고, 이는 아마도 항체에 의한 Wnt 및 LRP6 이량체화에 의해 FZD의 동원을 필요로 할 것이다. 이 모델은 LRP6 이량체화가 여전히 일어날 수 있더라도, Wnt 결합이 하나의 항체 또는 다른 항체 의해 차단될 것이기 때문에 두 항체의 조합이 어느 한 클래스의 Wnt 이소형에 의해 유도된 신호전달을 억제할 것이라고 예상한다. 예상된 바와 같이, HEK293 세포를 YW211.31.57 및 YW210.09 항체로 동시에 처리하였을 때 Wnt3a 또는 Wnt1의 발현에 의해 개시된 신호전달을 억제하였다 (도 7 및 8a). 도 8a에 나타낸 검정을 Wnt3a, Wnt1, 또는 Wnt3a 및 Wnt1 둘 다에 대한 발현 구축물로 형질감염된 Wnt 루시페라제 리포터와 안정하게 통합된 HEK293 세포에서 수행하였다. 모든 항체 및 단백질을 각각 10 μg/ml에서 사용하였다. 이 분석은 Wnt1 클래스의 3개의 다른 Wnt 이소형으로 확장되고, YW211.31.57 및 YW210.09 항체의 조합은 YW210.09 단독과 유사한 정도로 Wnt 신호전달을 억제하는 것으로 밝혀졌다 (도 7). Wnt3a 및 Wnt1을 둘 다 동시에 발현시켰을 때, 이떠한 항체도 Wnt 신호전달을 길항하지 않았으나, 두 항체의 조합이 신호전달을 억제하였다 (도 8a). 이러한 결과의 한 가지 가능한 설명은 각각의 항체가 오직 하나의 Wnt 이소형의 결합을 억제하고, 두 항체가 LRP6 분자에 동시에 결합할 수 있어 두 Wnt 결합 부위를 차단한다는 것이다.
YW211.31.57 또는 YW210.09 항체에 의해 길항되지 않는 제3 클래스의 4개의 Wnt 이소형은 어느 항체로도 차단되지 않는 LRP6 상의 부위에 결합할 수 있거나, 또는 대안적으로 항체에 의해 규정되는 어느 한 Wnt-결합 부위에 결합하는 능력을 가질 수 있다. 이들 Wnt 이소형 각각의 경우, 두 항체의 조합은 또한 이들의 신호전달을 억제하지 않고, 오히려 이들의 활성을 강화시키거나 또는 이에 영향을 미치지 않으며, 이는 이러한 Wnt 이소형이 YW211.31.57 및 YW210.09 에피토프와 구별되는 부위에 결합할 수 있다는 것을 제안한다 (도 7).
외인성 Wnt 이소형에 의해 유도된 Wnt 신호전달에 대한 YW211.31.57 및 YW210.09 항체 조합의 관찰된 활성은 또한 내인성, 자가분비 Wnt 신호전달로 확장된다. YW211.31.57 항체가 자가분비 Wnt 신호전달을 억제하고 YW210.09가 자가분비 Wnt 신호전달을 강화시키는 기형암종 세포주 PA-1 및 Ntera-2에서, 항체 조합은 신호전달을 억제한다 (도 2a). 두 항체가 자가분비 Wnt 신호전달을 강화시키는 Hs578T 및 EKVX 세포에서, 항체 조합이 또한 강화시킨다 (도 8b 및 8c).
실시예 9
LRP6 항체는 다중 부위에 대한 Wnt 결합을 차별적으로 억제한다
LRP6 항체의 상호 활성은 YW211.31.57 및 YW210.09가 LRP6 상의 특징적인 Wnt 이소형 결합 부위와 상호작용하고, Wnt 결합이 길항제 항체에 의해 경쟁되지만 강화 항체에 의해 허용된다는 것을 제안하였다. 정제되고 고정된 LRP6 세포외 도메인 단백질 단편에의 정제된 Wnt 단백질 결합을 측정하는 생체층 간섭법 검정 (실시예 1 참조)은 Wnt3a가 LRP6의 E3-E4 영역 (여기에 YW211.31.57 항체에 대한 에피토프가 존재함)에 결합하고, Wnt9b (항체 상호작용을 위해 Wnt1과 동일한 클래스임)가 오직 E1-E2 영역 (여기에 YW210.09 항체가 또한 결합함)에 결합한다는 것을 입증하였다 (문헌 [Bourhis et al. (2010)]). YW211.31.57 항체는 LRP6.E1-E4 단백질 단편에의 Wnt3a의 결합을 억제하였으나 YW210.09는 그렇지 않았다 (도 9a). 반대로, YW210.09는 LRP6.E1-E4에의 Wnt9b 결합을 억제하였으나 YW211.31.57은 그렇지 않았다 (도 9b). 이들 검정에서, LRP6 단백질에의 항체 결합은 평형 상태 도달을 허용하였고, Wnt 단백질 결합의 결합 및 해리 상에 대해 간섭 패턴에서 연속적인 파장 이동이 나타났다.
Wnt 결합의 항체-매개 억제는 또한 보다 작은 Wnt-결합 단편, Wnt3a의 경우 E3-E4 및 Wnt9b의 경우 E1-E2를 사용하여 검출할 수 있다 (도 9c 및 9d). 1-아암 YW211.31 항체는 또한 E3-E4 단편에의 Wnt3a 결합을 억제할 수 있다. 또한, YW211.31.57 및 YW210.09는 경쟁 없이 및 임의의 순서로 첨가되었을 때 LRP6.E3-E4 단백질에 순차적으로 결합할 수 있다 (도 9e). LRP6 단백질 상의 상이한 부위에서 오직 Wnt3a 및 YW211.31.57 항체 사이 및 오직 Wnt9b 및 YW210.09 사이의 결합에 대한 경쟁은 특정 Wnt 이소형에 의한 신호전달에 대한 각 항체의 억제 활성과 관련된다.
생체층 간섭법 검정은 이전에 정제된 DKK1 단백질이 LRP6의 E3-E4 및 E1-E2 단편 둘 다에 결합할 수 있고, 이러한 결합이 이들 각각의 단백질 영역에의 Wnt3a 및 Wnt9b의 결합을 억제할 수 있다는 것을 보여주었다. (문헌 [Bourhis et al. (2010)]). 이 검정을 이용하여 YW211.31.57 및 YW210.09 항체가 각각 LRP6.E1-E4 단백질에의 DKK1 결합을 억제할 수 있다는 것을 보여주었다. YW211.31.57 항체는 또한 LRP6.E3-E4 단백질에의 DKK1 결합을 억제하고, YW210.09 항체는 LRP6.E1-E2 단편에의 DKK1의 결합을 차단한다. 1-아암 YW211.31 항체는 Wnt 신호전달을 강화시킬 수 없고 세포에서 Wnt 신호전달에 대한 외인성 DKK1 활성을 유의하게 길항할 수 없더라도 그의 억제 활성은 완전하게 유지한다. 이러한 결과는 DKK1 길항작용이 Wnt 신호전달의 항체-매개 강화에 유의하게 기여하지 않을 수도 있다는 것을 제안한다.
실시예 10
LRP6 항체는 Wnt-구동된 종양 및 골 형성에 대해 활성이다
LRP6 항체의 항-종양 치료 효능의 연구를 시작하기 위해, Wnt 리간드-구동된 종양의 2개의 모델을 처리하였다. Wnt1 발현에 의존하는 MMTV-Wnt1 트랜스제닉 유방 종양 이종이식편 및 알려지지 않은 Wnt 이소형의 자가분비 Wnt 신호전달에 의해 구동되는 Ntera-2 인간 기형암종 이종이식편 (문헌 [DeAlmeida et al., 2007]). MMTV-Wnt1 트랜스제닉 마우스 유방 종양으로부터 단리된 세포를 사용하여 무흉선 누드 마우스로 종양을 확립하고, 이를 격일로 항체로 처리하였다. 신속하고 지속되는 종양 퇴행이 Fzd8CRD-Fc 단백질과 유사하게 YW210.09 항체에서 관찰되었다 (도 10a). YW211.31.57 항체는 대조 완충제 (PBS) 또는 항-gD 항체 처리와 비교하여 이들 조건 하의 종양 성장을 변경시키지 않았다. 마우스에게 30 mg/kg의 항체 또는 단백질을 격일로 투여하였다 (화살표 표시) (도 10a). 이러한 결과는 조직 배양물에서 처리된 MMTV-Wnt1 종양 세포에 대한 Wnt 표적 유전자 발현에 대해 상기 기재된 항체 효과와 일치한다.
또한, Ntera-2 기형암종 세포를 사용하여 무흉선 누드 마우스에 이종이식 종양을 확립하고, 이를 항체 또는 Fzd8CRD-Fc 단백질로 처리하였다. 항체 YW211.31.57, 1-아암 YW211.31, 또는 YW211.31.57 및 YW210.09의 조합으로 처리된 종양으로부터 추출된 RNA는 Wnt 표적 유전자 SP5의 발현을 완충제-주입 대조군 마우스로부터의 종양의 수준의 41-57%로 감소시킨 것으로 나타났으나, Fzd8CRD-Fc 단백질 처리는 SP5 발현을 8.0%로 감소시켰다. SP5 mRNA 수준을 동일한 종양 내의 GAPDH mRNA 수준에 대해 정규화하고, PBS-처리된 종양에 대해 추가로 정규화하였다. YW210.09를 제외한 모든 처리는 PBS 대조군과 비교하여 ANOVA에 의해 p-값 <0.005를 나타낸다. (도 10b). Axin2 발현은 Fzd8CRD-Fc에 의해 단지 56.2%로 감소하였고, 임의의 항체 처리에서 Axin2 발현의 유의한 변화가 검출되지 않았다. YW210.09 항체 처리는 SP5 또는 Axin2의 발현에 유의한 영향을 미치지 않았다. HEK293 세포에서의 Wnt3a-유도된 신호전달의 억제 또는 강화에 대해 검정된 혈청 샘플은 주사된 항체 및 단백질이 16시간 노출 전반에 걸쳐 생체내에서 적어도 일부 활성을 유지한다는 것을 확인하였다.
Wnt 신호전달의 활성화 또는 강화는 골모세포 분화 및 기능의 증진, 및 간접적으로 파골세포 분화의 억제에 의해 골 질량을 증가시킬 수 있으므로 (문헌 [Glass et al., 2005]), 기관유형 배양물에서 마우스 두개관골에 대한 LRP6 항체의 활성을 시험하였다. 미세해부된 두개관 체외이식편을 항체 또는 RANK-Fc와 배양하고, 이어서 두정골 부피 및 밀도를 마이크로-컴퓨터 단층촬영에 의해 분석하였다. 대조 샘플의 히스토그램 분석을 이용하여, 석회화 (골) 및 비-석회화 (연골) 조직에 대한 X선 감쇠 범위를 정하였다. YW210.09 항체로의 처리는 석회화된 두정골의 평균 골 무기질 밀도 (BMD)를 7.4%로 유의하게 증가시켰으며, 이는 파골세포 분화를 억제하기 위한 RANK-Fc 처리에서 관찰된 6.8% 증가와 유사하였다 (도 10c; 문헌 [Hsu et al., 1999]). YW211.31.62 항체로의 처리는 석회화된 두정골 BMD를 유의하게 변화시키지 않았다. 모든 처리는 7일 동안 10 μg/ml 항체 또는 단백질이었다. 도 10c에서, 데이터 점은 각 처리군에서 4마리 마우스로부터의 8개의 절반의 두개관을 나타내고; 평균 및 평균의 표준 편차는 각각 수평선 및 수직선으로 나타낸다. 오직 YW210.09 및 RANK-Fc 처리가 던넷 시험에 의해 각각 0.01 및 0.05 미만의 p-값 (t-시험에 의해 둘 다의 경우 <0.05)으로 비처리 샘플과 유의하게 상이하였다.
전체 두정골 영역 (석회화 및 비-석회화)의 부피 및 이 영역에서 석회화 골의 비율은 항체 또는 RANK-Fc 처리에 의해 유의하게 변화하지 않았으며, 이는 YW210.09 항체가 세포 증식에서 전체적인 변화없이 무기질화를 증진시킬 수 있다는 것을 제안한다.
실시예 11
LRP6 이중특이적 항체는 Pan-Wnt 억제제로서의 역할을 한다
놉스-인투-홀스 공학 (문헌 [Atwell et al., 1997])을 이용하여 YW211.31.62 및 YW210.09 중쇄 이종이량체와의 이중특이적 IgG 하이브리드를 구축하였다. 이. 콜라이 또는 HEK293 세포에서 생산된 이 LRP6 이중특이적 항체는 HEK293 세포 (도 11a) 및 종양 세포주 PA-1, M14 및 CAL-51에서 Wnt3a-유도된 (0.1 μg/ml) 신호전달을 길항한다 (도 11c). 주목할만하게, 이중특이적 항체는 적어도 YW211.31만큼 강력하게 억제하고, YW210.09의 Wnt3a-강화 활성을 유지하지 않는다. 이중특이적 항체는 또한 PA-1 세포에서는 YW211.31 항체 및 M14 세포에서는 YW210.09의 억제 활성을 보존하면서, 시험된 모든 3개의 종양 세포주에서 자가분비 Wnt 신호전달을 억제한다 (도 11b). 흥미롭게도, YW211.31이 CAL-51 유방 암종 세포에서 자가분비 Wnt 신호전달을 강화시키고 YW210.09는 이에 대해 영향을 미치지 않을지라도, 이중특이적 항체는 신호전달을 억제한다. 이러한 신규 길항 활성은 YW211.31 및 YW210.09 항체의 조합에서는 관찰되지 않는다. 상기 검정에서, Wnt 루시페라제 리포터와 안정하게 통합된 PA-1 및 M14 세포 및 리포터로 형질감염된 CAL-51 세포를 0.1 μg/ml Wnt3a에 의한 자극의 존재 (11c) 또는 부재 (11b) 하에 지시된 대조 완충제 (PBS), 항체, 항체 조합, 또는 Fzd8CRD-Fc 단백질 (각각 10 μg/ml)로 처리하였다.
HEK293 세포에서 13개 Wnt 이소형의 형질감염에 의해 유도된 신호전달에 대해 시험하였을 때, 이중특이적 항체는 YW211.31 또는 YW210.09에 의해 차단된 모든 Wnt를 강력하게 억제하였다 (도 12). 표 12에 요약된 검정은 Wnt 루시페라제 리포터와 안정하게 통합된 HEK293 또는 Hs578T 세포주에서 Wnt 이소형에 대한 발현 구축물의 형질감염에 의해 유도된 신호전달에 대한 항체 또는 단백질 (10 μg/ml)의 효과를 결정하였다. 리포터 활성을 항체 또는 단백질로 비처리된 동일한 발현 구축물로 형질감염된 세포에서의 세포 수에 대해 정규화하고 수준에 대해 추가로 정규화하였다. 항-gD를 대조군으로 사용하였다. 배수-변화 값은 이들이 대조군 항-gD 항체 처리에서 관찰된 범위에서 벗어났을 때 (HEK293 세포에서 억제의 경우 0.80 미만 및 강화의 경우 1.30 초과, 및 Hs578T 세포에서 억제의 경우 0.65 미만 및 강화의 경우 1.30 초과) 적절한 것으로 간주하였다.
YW211.31 및 YW210.09 항체의 조합과 유사하게, 및 어느 한 항체 단독과는 달리, 이중특이적 항체는 Wnt1 및 Wnt3a의 조합에 의해 유도된 신호전달을 차단한다 (도 12). 놀랍게도, 이중특이적 항체는 또한 단독의 또는 조합된 동종이량체 항체에 의해 억제되지 않는 3개의 Wnt에 의한 신호전달을 감소시킨다. 이중특이적 항체의 이러한 길항 활성은 또한 Hs578T 세포에서 관찰되며, Wnt7a-유도된 신호전달에 대한 효과의 결여의 제외가 가능하다.
β-카테닌 단백질의 Wnt3a-유도된 안정화를 억제하는 이중특이적 항체의 능력을 조사하였다. Wnt3a로 형질감염된 또는 형질감염되지 않은 HEK293 세포를 YW211.31, YW210.09, 또는 이중특이적 항체, 또는 대조군 Fzd8CRD-Fc 단백질 또는 항-gD로 5 μg/ml의 농도에서 18시간 동안 처리하고, β-카테닌 단백질 수준 및 인산화된 LRP5/6 수준을 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정하였다. 도 13a. HEK293 세포에서, 이중특이적 항체는 YW211.31과 유사하게 및 β-카테닌 수준을 증가시키는 YW210.09와는 달리, β-카테닌 단백질의 Wnt3a-유도된 안정화를 억제한다 (도 13a). 이중특이적 및 YW211.31 항체는 둘 다 인산화된 LRP5/6의 고분자량 종의 Wnt3a에 의한 유도를 차단하였지만, YW210.09 항체는 그렇지 않았다. 놀랍게도, YW211.31 및 YW210.09는 총 LRP6 단백질의 항정 상태 수준에 영향을 미치지 않으면서, 이중특이적 항체는 Wnt3a 유도의 존재 또는 부재 하에 LRP6 단백질을 증가시킨다. Wnt 자극의 부재 하에, 이 안정화된 LRP6은 이중특이적 항체가 Wnt의 부재 하에 HEK293 세포에서의 Wnt 리포터 활성에 영향을 미치지 않을지라도 Ser1490 인산화를 약간 증가시킬 수 있었다.
생체내에서 Wnt 신호전달을 억제하는 이중특이적 항체의 능력을 또한 결정하였다. M14 흑색종 이종이식 종양을 갖는 SCID-bg 마우스에게 30 mg/kg LRP6 이중특이적 항체, Fzd8CRD 단백질 (양성 대조군), 또는 항-gD 항체 (음성 대조군)를 주사하였다. 처리 16시간 후에, RNA를 추출하고, qPCR에 의해 Wnt 표적 유전자의 발현에 대해 조사하였다. mRNA 수준을 동일한 종양 내의 GAPDH mRNA 수준에 대해 정규화하고, 항-gD-처리된 종양에 대해 추가로 정규화하였다. 모든 이중특이적 항체 및 Fzd8CRD 처리는 항-gD 대조군과 비교하여 ANOVA에 의해 p-값 <0.001을 나타낸다. 도 13b에 나타낸 바와 같이, LRP6 이중특이적 항체는 이종이식 종양으로 성장한 M14 흑색종 세포에서 Wnt 신호전달을 억제하였다. 항체로 처리된 종양으로부터 추출된 RNA는 각각 대조군 항-gD 항체로 처리된 종양에서의 수준의 46-57% 및 35-38%로 감소된 Wnt 표적 유전자 AXIN2 및 APCDD1의 발현을 나타낸다. 이러한 감소된 발현 수준은 Fzd8CRD 단백질의 주사에서 관찰된 것과 유사하고, 이는 이중특이적 항체가 생체내에서 안정하고 활성임을 나타낸다.
실시예 12
LRP6 E1-YW210.09 Fab 복합체의 구조.
YW210.09 Fab와의 복합체에서 LRP6 (또한 E1로 불림)의 제1 β-프로펠러 및 EGF 도메인의 결정 구조를 분자 대체법에 의해 결정하고, 각각 0.175 및 0.220의 R 및 Rfree를 갖는 1.9 Å 해상도로 정밀화하였다. 결정학적 비대칭 유닛은 1개의 LRP6 E1 도메인 및 1개의 YW210.09 Fab로 구성된다. 해석가능한 전자 밀도는 Fab 중쇄 잔기 Ser 127 내지 Thr 131을 제외하고 E1 도메인의 경우 잔기 Ala 20 내지 Lys 324, 각각 Fab 경쇄 및 중쇄의 경우 잔기 Asp 1 내지 Glu 213 및 Glu 1 내지 Lys 214의 추적을 허용하였다 (전반적으로 카바트 넘버링이 사용됨).
LRP6 E1 도메인은 β-프로펠러 모듈 및 표피 성장 인자 (EGF) 유사 모듈을 포함하는 모듈 골격으로 조립된다. β-프로펠러는 중심 채널에 대향하는 N-말단 모서리와 방사형으로 배열된 4-가닥 역-평행 β-시트에 의해 형성된 6개의 블레이트 및 각 블레이드의 제2 가닥에 위치한 YWTD 모티프로 이루어진다. LRP6 E1 β-프로펠러 구조는 단지 36%의 서열 동일성에도 불구하고 245C-α 원자 위에서 중첩시켰을 때 0.83 Å의 rmsd를 갖는 LDLr과 매우 유사하다 (문헌 [Jeon, H., et al., 2001]). 대부분의 보존된 잔기는 β-프로펠러 구조 완전성에 필수적인 β-시트를 형성하는 YWTD 코어 모티프 주변에 집중되지만, 표면 잔기는 매우 다양하여 이들 수용체의 기능적 다양성에 기여한다. LRP6은 그의 EGF 유사 도메인을 사용하여 프로펠러의 제1 및 제6 블레이드를 아래로 고정시키고, 그의 기계적 강도를 유지한다. EGF 유사 모듈은 β-프로펠러로부터 10-잔기 링커를 통해 C-말단으로 확장되고, β-프로펠러의 하부 측면에 대해 뒤로 폴딩되어, 제3 및 제4 블레이트 사이의 표면에 도킹된다. EGF 및 β-프로펠러 사이의 상호작용은 1226 Å2의 큰 총 매립 표면적 및 0.74의 형태 상보성에 의해 나타난 바와 같이 광범위하다. EGF 모듈의 제1 β-가닥 내의 3개의 잔기, Leu 296, Leu 298 및 Met 299는 일부 직접적인 또는 물 매개된 극성 상호작용에 의해 둘러싸인 β-프로펠러의 상보성 캐비티로 패킹되는 소수성 코어를 구성한다. 이러한 특징은 또한 LDLR 구조에서 관찰된다 (문헌 [Jeon, H., et al., 2001; Rudenko, G., et al., 2002]).
YW210.09 Fab는 종종 단백질-단백질 상호작용에 관여하는 것으로 밝혀진 구역인 β-프로펠러의 상부 중앙의 영역을 인식한다 (문헌 [Springer, T. A., 1998]). 파라토프는 3개의 중쇄 CDR (H1, H2, H3) 및 2개의 경쇄 CDR (L1 및 L3)을 포함하는 5개의 CDR로부터의 잔기로 구성된다. β-프로펠러에 결합하는 항체는 0.76의 형태 상보성 스코어로 1691Å2의 총 면적으로 매립된다. β-프로펠러의 상부 대향면 상의 산성 패치는 대략 총 면적의 1/3을 차지하지만, YW210 에피토프와 거의 중첩되지 않는다. 반대로, 중쇄 및 경쇄는 별도의 구역을 인식한다. 중쇄 CDR에 의해 형성된 직접적인 접촉은 매립된 면적의 80%를 나타내며, CDR H3이 단독으로 50% 넘게 차치한다. 이러한 절편은 17개의 잔기로 구성되고, 이들 중에서 잔기 His 98 내지 Lys 100c는 β-프로펠러와 직접적인 접촉을 형성한다. 중요하게는, 항체의 Asn 100은 LRP6의 Asn 185와 한 쌍의 수소 결합을 만들어 "핸드 쉐이크(hand shake)" 상호작용을 형성한다 (도 16). 또한, Val 100b 및 Lys 100c 주쇄는 뒤에서 LRP6의 Arg 28과 상호작용하는 카르보닐 기, 및 앞에서 2개의 물 분자 (Wat1 및 Wat2)를 통해 산성 패치와 상호작용하는 2개의 NH 기를 예외적인 형태로 배치한다 (도 14). Lys 100c 측쇄는 또한 LRP6의 Val 70 및 Ser 96 주쇄 카르보닐과의 수소 결합에 의해 산성 패치를 중화시킨다. LRP6의 Arg 141은 중앙에 앵커링되고, 가교 물 Wat2, LRP6의 Asn 185, 및 YW210.09의 Ala 100a와 상호작용한다. Arg 141은 함께 2개의 수소 결합 네트워크를 통합시키는 것으로 보인다. 추가로, Val 100b 측쇄는 β-프로펠러의 중심 채널의 소수성 캐비티로 도킹된다. 따라서, YW210.09 H3 서열 NAVK는 LRP6의 β-프로펠러 E1과 보기 드문 결합 패턴을 나타낸다. 다른 CDR은 β-프로펠러의 상부 상의 파라미터에서 잔기와 상호작용한다. LRP6에의 H3 결합에 관련된 다른 잔기는 E51, D52, V70, S71, E73, L95, S96, D98 및 E115를 포함한다. H1 및 H2는 제5 및 제6 블레이드에 접하고, L1 및 L3은 제6, 제1 및 제2 블레이드와 접한다 (도 15). LRP6에의 YW210.09의 결합에 관련된 추가의 LRP6 잔기는 R29, W188, K202, P225, H226, S243 및 F266을 포함한다. 결정 패킹 상호작용은 YW210.09가 LRP6 에피토프와 접촉하는 구역에 직접적으로 관련되지 않으며, 이는 결정 구조가 2개의 분자가 용액에서 어떻게 상호작용하는지를 반영해야 한다는 것을 나타낸다. 특징적인 CDR H3 NAVKN (서열 49) 모티프 및 LRP6 E1 β-프로펠러 사이의 상호작용은 라미닌(Laminin) 및 니도겐(Nidogen) 사이에 보고된 상호작용과 고도로 유사하다 (문헌 [Takagi, J., et al., 2003]). 둘 다의 경우에, 유의한 접촉이 상기 기재된 Asn 핸드쉐이크, 및 Phe 셔터에 의해 두 프로펠러에서 폐쇄된 β-프로펠러 중심 채널의 상부에 의해 형성된 소수성 캐비티에 진입하는 분지형 소수성 잔기를 통해 만들어진다. 인간 Dkk1에는 그의 Ile 42를 제외하고 YW210.09의 CDR H3 루프에서 발견되는 모티프와 동일한 모티프 (아미노산 40 내지 44: NAIKN (서열 50))가 존재한다. 이 모티프는 종 및 Dkk3을 제외한 패밀리 구성원 사이에서 엄격하게 보존되며, Dkk 생물학에서 이 모티프에 대한 특정 기능을 나타낸다. 보존된 모티프는 이전에 고려된 적이 없고 (문헌 [Brott, B. K., and Sokol, S. Y., 2002]), 무질서한 것으로 예측된 영역인 Dkk1의 N-말단 상에서 발견된다. 추가로, 이 특정한 모티프는 또한 LRP5/6과의 상호작용을 통해 Wnt 신호전달을 조절하는 2개 다른 단백질, 즉 스클레로스틴(Sclerostin) (문헌 [Semenov, M., et al., 2005]) 및 와이즈(Wise) (문헌 [Itasaki, N., et al., 2003])에서 보존된다. 이들 2개의 단백질은 시스테인 노트 단백질의 동일한 수퍼-패밀리에 속하고 (문헌 [McDonald, N. Q., and Hendrickson, W. A., 1993]), 또한 이 보존된 폴드의 "힐"로 불리는 이들의 루프 번호 2에서 확인된 모티프를 나타낸다 (문헌 [Lintern, K. B., et al., 2009; Veverka, V., et al., 2009]).
실시예 13
예시적인 항-LRP6 항체
특정 항-LRP6 항체의 아미노산 서열은 서열 목록에 제공된다. 표 2-4는 서열의 설명을 제공한다. 특정 항-LRP6 항체의 VH 및 VL 도메인의 아미노산의 정렬은 도 16 및 17에 제공된다.
Figure 112012086169669-pct00004
Figure 112012086169669-pct00005
Figure 112012086169669-pct00006
상기한 본 발명이 이해의 명료성을 목적으로 설명 및 실시예에 의해 어느 정도 상세히 기재되어 있으나, 상기 설명 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석되지 말아야 한다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시문은 명백하게 이들의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
참고문헌
Figure 112012086169669-pct00007
Figure 112012086169669-pct00008
Figure 112012086169669-pct00009
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SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC., et al. <120> ANTI-LRP6 ANTOBODIES <130> P4430R1-WO <150> US 61/394,836 <151> 2010-10-20 <150> US 61/317,137 <151> 2010-03-24 <160> 58 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Leu Arg Ala Arg Pro Pro Ile Arg Leu His Pro Arg Gly Ser Val 100 105 110 Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 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Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 32 aatgctgctg aactgaatag aaa 23 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 33 aaccggtcct agcgaaaa 18 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 34 ccgagcactg tttcaaatct ccca 24 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 35 tgagagtgtg acattgttgg aa 22 <210> 36 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 36 gtaaaatctg tgtgcaatta tcatgt 26 <210> 37 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 37 aatcattgaa aatgactaac acaagaccct gtaaat 36 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 38 tgaggacgca ggagtgaa 18 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 39 cccagagagt ggccaaat 18 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 40 cctgtttgct gccacccatg a 21 <210> 41 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X is I or V <400> 41 Asn Xaa Xaa Lys 1 <210> 42 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X is I or V <400> 42 Asn Xaa Xaa Lys Asn 1 5 <210> 43 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is any amino acid <400> 43 Asn Xaa Val Lys 1 <210> 44 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is any amino acid <400> 44 Asn Xaa Ile Lys 1 <210> 45 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is any amino acid <400> 45 Asn Xaa Val Lys Asn 1 5 <210> 46 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is any amino acid <400> 46 Asn Xaa Ile Lys Asn 1 5 <210> 47 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 47 Asn Ala Val Lys 1 <210> 48 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 48 Asn Ala Ile Lys 1 <210> 49 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 49 Asn Ala Val Lys Asn 1 5 <210> 50 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 50 Asn Ala Ile Lys Asn 1 5 <210> 51 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 51 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Thr Ile Ser Pro Ala Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Asp Trp Arg Phe His His Ala Gly Glu Tyr Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln 115 <210> 52 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 52 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Ser Pro Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Ser Tyr Ile Ser Arg Tyr Phe Ser Ser Val Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln 115 <210> 53 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 53 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Asp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Pro Gly Trp Ala Leu Arg Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln <210> 54 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 54 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Gly Asn 20 25 30 Asp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Tyr Gly Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Val Thr Tyr His Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 <210> 55 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 55 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser 20 25 30 Ser Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Val Ile Ser Pro Ser Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Pro Ala Gly Ala Phe Leu Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln 115 <210> 56 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 56 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Phe Tyr 20 25 30 Tyr Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Leu Arg Ala Arg Pro Pro Ile Arg Leu His Pro Arg Gly Ser Val 100 105 110 Met Asp Tyr Trp Gly Gln 115 <210> 57 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 57 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Phe Tyr 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Leu Arg Ala Arg Pro Pro Ile Arg Leu His Pro Arg Gly Ser Val 100 105 110 Met Asp Tyr Trp Gly Gln 115 <210> 58 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 58 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ala Ile Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105

Claims (76)

  1. (a) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (b) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및
    (c) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
    을 포함하는 제1 VH 도메인,
    (d) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (e) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
    (f) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 제1 VL 도메인,
    (g) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (h) 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및
    (i) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
    을 포함하는 제2 VH 도메인, 및
    (j) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (k) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
    (l) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 제2 VL 도메인
    을 포함하거나, 또는
    (a) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (b) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및
    (c) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
    을 포함하는 제1 VH 도메인,
    (d) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (e) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
    (f) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 제1 VL 도메인,
    (g) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (h) 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및
    (i) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
    을 포함하는 제2 VH 도메인, 및
    (j) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (k) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
    (l) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 제2 VL 도메인
    을 포함하거나, 또는
    (a) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (b) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및
    (c) 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
    을 포함하는 제1 VH 도메인,
    (d) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (e) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
    (f) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 제1 VL 도메인,
    (g) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (h) 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및
    (i) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
    을 포함하는 제2 VH 도메인, 및
    (j) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (k) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
    (l) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 제2 VL 도메인
    을 포함하는,
    LRP6의 2개의 상이한 영역에 결합하는 단리된 이중특이적 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (b) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및
    (c) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
    을 포함하는 제1 VH 도메인,
    (d) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (e) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
    (f) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 제1 VL 도메인,
    (g) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (h) 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및
    (i) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
    을 포함하는 제2 VH 도메인, 및
    (j) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (k) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
    (l) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 제2 VL 도메인
    을 포함하는, 이중특이적 항체.
  3. 제1항에 있어서,
    (a) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (b) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및
    (c) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
    을 포함하는 제1 VH 도메인,
    (d) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (e) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
    (f) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 제1 VL 도메인,
    (g) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (h) 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및
    (i) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
    을 포함하는 제2 VH 도메인, 및
    (j) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (k) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
    (l) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 제2 VL 도메인
    을 포함하는, 이중특이적 항체.
  4. 제1항에 있어서,
    (a) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (b) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및
    (c) 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
    을 포함하는 제1 VH 도메인,
    (d) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (e) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
    (f) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 제1 VL 도메인,
    (g) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (h) 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및
    (i) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
    을 포함하는 제2 VH 도메인, 및
    (j) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (k) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
    (l) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 제2 VL 도메인
    을 포함하는, 이중특이적 항체.
  5. 제1항에 있어서,
    (a) 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 제1 VH;
    (b) 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 제1 VL;
    (c) 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 제2 VH; 및
    (d) 서열 16의 아미노산 서열을 포함하는 제2 VL
    을 포함하거나, 또는
    (a) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 제1 VH;
    (b) 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 제1 VL;
    (c) 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 제2 VH; 및
    (d) 서열 16의 아미노산 서열을 포함하는 제2 VL
    을 포함하거나, 또는
    (a) 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 제1 VH;
    (b) 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 제1 VL;
    (c) 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 제2 VH; 및
    (d) 서열 16의 아미노산 서열을 포함하는 제2 VL
    을 포함하는, 이중특이적 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체와 LRP6에의 결합에 대해 경쟁하는 항체.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체와 동일한 2개의 에피토프에 결합하는 항체.
  8. 제7항에 있어서, 2개의 에피토프 중 1개가 LRP6 (서열 29)의 아미노산 잔기 R28, E51, D52, V70, S71, E73, L95, S96, D98, E115, R141 및 N185를 포함하는 것인 항체.
  9. 제8항에 있어서, 2개의 에피토프 중 1개가 LRP6 (서열 29)의 R29, W188, K202, P225, H226, S243 및 F266을 추가로 포함하는 것인 항체.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체인 이중특이적 항체.
  11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라, 인간 또는 인간화 항체인 이중특이적 항체.
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체를 코딩하는 단리된 핵산.
  13. 제12항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  14. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체.
  15. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하거나, 또는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 암 치료에 사용하기 위한 제약 제제.
  16. 삭제
  17. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체를 포함하는, 암 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 암이 비소세포 폐암, 유방암, 췌장암, 난소암, 신장암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
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  35. 삭제
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  38. 삭제
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  40. 삭제
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  43. 삭제
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  50. 삭제
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  60. 삭제
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  65. 삭제
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  76. 삭제
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