JP2013529060A - 抗lrp6抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2010年3月24日に出願された米国仮出願第61/317137号、及び2010年10月20日に出願された米国仮出願第61/394836号の利益を主張し、その開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、抗LRP6抗体、及び癌又は骨疾患の治療のために同じものを使用する方法に関する。
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン(VL)フレームワーク又は重鎖可変ドメイン(VH)フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク”に由来する”アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含み得る。幾つかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、又は2以下である。幾つかの実施態様において、VLアクセプターヒトフレームワークは、Vはヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に、配列が同一である。
ここで定義された化学療法剤には、癌の増殖を促進しうるホルモンの効果を調節、低減、ブロック、又は阻害するように働く「抗ホルモン剤」又は「内分泌治療剤」が含まれる。それらはそれ自体がホルモンであってもよく、限定するものではないが、混合アゴニスト/アンタゴニストプロファイルを持つ抗エストロゲン、例えばタモキシフェン(NOLVADEX(登録商標))、4-ヒドロキシタモキシフェン、トレミフェン(FARESTON(登録商標))、イドキシフェン、ドロロキシフェン、ラロキシフェン(raloxifene)(EVISTA(登録商標))、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、及びSERM3などの選択的なエストロゲン受容体調節因子(SERM);アゴニスト特性を有さない純粋な抗エストロゲン類、例えばフルベストラント(FASLODEX(登録商標))、及びEM800(このような薬剤はエストロゲン受容体(ER)二量体化をブロックし、DNA結合を阻害し、ER代謝回転を増加させ、及び/又はERレベルを抑制しうる);アロマターゼインヒビター、例えば、ホルメスタン及びエキセメスタン(AROMASIN(登録商標))などのステロイド系アロマターゼインヒビター、及びアナストロゾール(ARIMIDEX(登録商標))、レトロゾール(FEMARA(登録商標))及びアミノグルテチミドなどの非ステロイド性アロマターゼインヒビター、及びボロゾール(RIVISOR(登録商標))、メゲストロールアセテート(MEGASE(登録商標))、ファドロゾール及び4(5)-イミダゾールを含む他のアロマターゼインヒビター;黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト、例えばロイプロリド(LUPRON(登録商標)及びELIGARD(登録商標))、ゴセレリン、ブセレリン、及びトリプトレリン;性ステロイド、例えばプロゲスチン、例えばメゲストロールアセテート及びメドロキシプロゲステロンアセテート、エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロール及びプレマリン、及びアンドロゲン/レチノイド、例えばフルオキシメステロン、全てのトランスレチオニン酸及びフェンレチニド;オナプリストン;抗プロゲステロン;エストロゲン受容体下方制御因子(ERD);抗アンドロゲン類、例えばフルタミド、ニルタミド及びビカルタミド;及び上記の何れかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体;並びに、上記のうちの2以上の組合せを含む。
本明細書で用いられる「細胞傷害性薬物」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び/又は細胞破壊を生ずる物質を指す。細胞傷害性薬物は、限定されないが、放射性同位体(例えば、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及びLuの放射性同位体):化学療法剤又は薬物(例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤)、成長阻害剤、酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素など、抗生物質、小分子毒素などの毒素、又は細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素(それらの断片及び/又はその変異体を含む)、及び以下に開示される様々な抗腫瘍剤又は抗癌剤を包含する。
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN−2により、AとBのそのプログラムのアラインメントにおいて同一と一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての%アミノ酸配列同一性値が、ALIGN−2コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したように得られる。
本発明は、幾つかのWntアイソフォームによりシグナル伝達を阻害し、かつ他のアイソフォームによりシグナル伝達を増強する予想外の能力を持つ抗LRP6抗体を提供する。実施例に記載されるように、特徴付けられた2つの抗LRP6抗体は、大部分のWntにおいて、一つの抗体は拮抗し、他は増強する相反する活性を更に示す。これらの2つの抗体は、LRP6の異なる領域に結合し(異なるWntアイソフォームに結合するように)、シグナル伝達の阻害がWnt結合の遮断によって生じる。
本発明の一態様は、キメラ、ヒト化、又はヒト抗体を含む、モノクローナル抗体である抗LRP6抗体を提供する。一実施態様において、抗LRP6抗体は、ファージライブラリーを使用して生成される。一実施態様において、抗LRP6抗体は、抗体フラグメント、例えば、Fv、Fab、Fab’、scFv、ダイアボディ、又はF(ab’)2断片である。その他の態様において、抗体は、全長抗体、例えば、インタクトなIgG1抗体、又は本明細書において定義された他の抗体クラス又はアイソタイプである。
所定の実施態様において、本明細書において与えられる抗体は、解離定数(Kd)が、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、又は≦0.001nM(例えば、10−8M未満、例えば、10−8Mから10−13M、例えば、10−9Mから10−13M)。
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)2、Fv,及びscFv断片、及び下記の他の断片を含む。所定の抗体断片の総説については、 Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照。scFv断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), 頁269-315 (1994)を参照;また、国際公開第93/16185号;及び米国特許第5571894号及び第5587458号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたFab及びF(ab’)2断片の議論については、米国特許第5869046号を参照のこと。
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。所定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第4816567号、及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域)及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。
本発明の抗体は、所望の活性または活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてのライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)に総説され、更に、例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 及びLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。所定の実施態様において、結合特異性の一つはLRP6に対してであり、他は、任意の他の抗原に対してである。所定の実施態様において、二重特異性抗体は、LRP6の2つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体はまたLRP6を発現する細胞に細胞傷害性薬物を局所化するために用いることができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、またはペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び/又は挿入及び/又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終構築物に到達させるために作成され得る。
所定の実施態様において、一つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異の対象となる部位は、HVRとFRを含む。保存的置換は、表1の「保存的置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表1の「典型的な置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持/改善、免疫原性の減少、又はADCC又はCDCの改善についてスクリーニングされた。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性、親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響する残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe.
変更(例えば、置換)は、例えば抗体の親和性を向上させるために、HVRで行うことができる。このような変更は、HVRの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基で(例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照)、及び/又はSDR(a−CDR)で行うことができ、得られた変異体VH又はVLが結合親和性について試験される。二次ライブラリから構築し選択し直すことによる親和性成熟が、例えばHoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様において、多様性が、種々の方法(例えば、変異性PCR、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発)のいずれかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、ライブラリーは、所望の親和性を持つ抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するするもう一つの方法は、いくつかのHVR残基(例えば、一度に4から6残基)がランダム化されたHVR指向のアプローチを伴う。抗原結合に関与するHVR残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発、またはモデリングを用いて、特異的に同定され得る。CDR−H3及びCDR−L3がしばしば標的にされる。
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は抗体がグリコシル化される程度を増加または減少するように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、一以上のグリコシル化部位が作成または削除されるようにアミノ酸配列を変えることによって簡便に達成することができる。
所定の実施態様において、1つまたは複数のアミノ酸改変が、本明細書で提供される抗体のFc領域に導入することができ、それによってFc領域変異体を生成する。Fc領域の変異体は、1つまたは複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾(例えば置換)を含むヒトFc領域の配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4のFc領域)を含んでもよい。
所定の実施態様において、抗体の1つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン改変抗体、例えば、「thioMAbs」を作成することが望まれ得る。特定の実施態様において、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で起きる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中でさらに記載されるように、イムノコンジュゲーを作成するために、例えば薬物部分またはリンカー−薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。所定の実施態様において、以下の残基のいずれかまたは複数がシステインに置換され得る:軽鎖のV205(Kabat番号付け);重鎖のA118(EU番号付け);及び重鎖Fc領域のS400(EU番号付け)。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第7521541号に記載のように生成され得る。
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手されている追加の非タンパク質部分を含むように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキソラン、エチレン/無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸(単独重合体又はランダム共重合体の何れか)及びデキストラン又はポリ(n−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド/エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含するポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造において好都合である。ポリマーは何れかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変動してよく、そして、1つより多い重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であることができる。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び/又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が特定の条件下で治療に使用されるのか等を考慮しながら決定することができる。
その他の実施態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱されてもよい抗体と非タンパク質部分のコンジュゲートが、提供される。一実施態様において、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである(Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)。放射線は、任意の波長であって良いが、限定されないものの、通常の細胞に害を与えないが、抗体非タンパク質部分の近位細胞が死滅される温度に非タンパク質部分を加熱する波長が含まれる。
抗体は、例えば米国特許第4816567号で説明したように、組換えの方法および組成物を用いて製造することができる。一実施態様において、本明細書に記載される抗LRP6抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列、及び/又は抗体のVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗体の軽鎖及び/又は重鎖)をコードし得る。更なる実施態様において、そのような核酸を含む1つ以上のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。更なる実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様において、宿主細胞は〜を含む(例えば、〜で形質転換される):(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列、及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第ニベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、またはリンパ系細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。一実施態様において、抗LRP6抗体を作る方法が提供され、その方法は、上記のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、および必要に応じて、宿主細胞(または宿主細胞培養培地)から抗体を回収することを含む。
本明細書で提供される抗LRP6抗体は、同定され、当技術分野で公知の様々なアッセイによってその物理的/化学的性質及び/又は生物学的活性についてスクリーニングされ、または特徴づけることができる。
一態様において、本発明の抗体は、例えばELISA、ウエスタンブロット法など公知の方法により、その抗原結合活性について試験される。
一態様において、アッセイは、生物学的活性を有するそれらの抗LRP6抗体を同定するために与えられる。生物学的活性は、例えば、Wntアイソフォーム媒介性シグナル伝達の阻害又は増強、変調骨量/含量、細胞増殖の抑制、細胞増殖の増大を含み得る。インビボ及び/又はインビトロでこのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。
本発明はまた、化学療法剤又は薬物、成長抑制剤、毒素(例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片)、又は放射性同位元素など、1つ以上の細胞傷害性薬物にコンジュゲートした本明細書中の抗LRP6抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗LRP6抗体の何れかは、生物学的サンプル中のLRP6の存在を検出するのに有用である。本明細書で使用する「検出」という用語は、定量的または定性的検出を包含する。所定の実施態様において、生物学的サンプルは細胞又は組織を含む。
本明細書に記載の抗LRP6抗体の薬学的処方物は、所望の程度の純度を有するそのような抗体と任意の薬学的に許容される担体(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.: Williams and Wilkins PA, USA (1980))とを、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸のような緩衝液;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤;防腐剤(例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド;ヘキサメトニウムクロライド;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;およびm−クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン;マンノサッカライド、ジサッカライド、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物;キレート剤、例えば、EDTA;糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール;塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体(例えば、Zn−タンパク質錯体);及び/又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における典型的な薬学的に許容される担体は、介在性薬物分散剤、例えば、水溶性の中性アクティブヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、例えば、rHuPH20(HYLENEX(登録商標)、Baxter International,Inc.)などのヒト可溶性PH−20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。所定の典型的なsHASEGP及び使用法は、rHuPH20を含み、米国特許出願公開第2005/0260186号及び第2006/0104968に開示されている。一態様において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼなどの1つまたは複数の追加のグルコサミノグリカンと組み合わされる。
活性成分はまた、調製されるマイクロカプセルに、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって、捕捉され得る、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−(メチルメタクリレート)マイクロカプセル、コロイド薬物送達系で(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)、またはマクロエマルジョンで。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示される。
本明細書で提供される抗LRP6抗体のいずれかを、治療方法で使用することができる。
一態様では、医薬として使用するための抗LRP6抗体が提供される。更なる態様において、Wnt媒介性障害、例えば、癌又は骨格障害又は骨障害の治療に使用される抗LRP6抗体が提供される。所定の実施態様において、治療の方法に使用される抗LRP6抗体が提供される。所定の実施態様において、本発明は、個体に抗LRP6抗体の有効量を投与することを含む、癌又は骨格障害又は骨障害を有する個体を治療する方法に使用される抗LRP6抗体を提供する。一つのそのような実施態様において、この方法は、例えば後述するように、少なくとも1つのさらなる治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。更なる実施態様において、本発明は、第一のWntアイソフォームによって誘導されたシグナル伝達の阻害、及び第二のWntアイソフォームによって誘導されたシグナル伝達の増強に使用される抗LRP6抗体を提供する。所定の実施態様において、本発明は、個体において、第一のWntアイソフォームによって誘導されたシグナル伝達を阻害し、及び第二のWntアイソフォームによって誘導されたシグナル伝達を増強する方法に使用される抗LRP6抗体を提供し、第一のWntアイソフォームによって誘導されたシグナル伝達を阻害し、及び第二のWntアイソフォームによって誘導されたシグナル伝達を増強するために、抗LRP6抗体の有効量を個体に投与することを含む。上記実施態様のいずれかに記載の「個体」は、好ましくはヒトである。
本発明の他の実施態様において、上述した障害の治療、予防、及び/又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器とラベルまたは容器上にあるまたは容器に付属するパッケージ挿入物を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、IV輸液バッグ 等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、疾患の治療、予防、及び/又は診断に有効である、それ自体か、又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の抗体である。ラベルまたはパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、(a)組成物が本発明の抗体を包含する組成物を含む第一の容器;および(b)組成物が更なる細胞障害性又はその他の治療的薬剤を包含する組成物を含む第2の容器を含み得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療することに用いることができることを示すパッケージ挿入物をさらに含んでいてもよい。別法として、または加えて、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含む第二(または第三)の容器をさらに含んでもよい。これは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業的およびユーザーの立場から望まれる他の物質を更に含んでもよい。
実施例1:
実験手順
細胞培養及び細胞アッセイ
細胞株EKVXとM14を、10%ウシ胎児血清および2mMグルタミンを補充したRPMI−1640培地中で増殖させ、JHH−1細胞は、同じサプリメントによりウィリアムズの培地Eで増殖させた。他のすべての細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)から入手し、推奨されているように維持された。
SP5:AATGCTGCTGAACTGAATAGAAA(配列番号32)、
AACCGGTCCTAGCGAAAA(配列番号33)、
CCGAGCACTGTTTCAAATCTCCCA(配列番号34);
ZNRF3:TGAGAGTGTGACATTGTTGGAA(配列番号35)、
GTAAAATCTGTGTGCAATTATCATGT(配列番号36)、
AATCATTGAAAATGACTAACACAAGACCCTGTAAAT(配列番号37);
マウスMmp7:TGAGGACGCAGGAGTGAA(配列番号38)、
CCCAGAGAGTGGCCAAAT(配列番号39)、
CCTGTTTGCTGCCACCCATGA(配列番号40).
領域E1−E2(配列番号29のアミノ酸A19ーR644)及びE3−E4(配列番号29のアミノ酸V629−G1244)をコードするヒトLRP6のcDNA断片は、HSVシグナル配列とタンパク質タグとしてヒトIgGのFc領域(配列番号30(E1−E2−fc);配列番号31(E3−E4−fc))を含む哺乳類の発現ベクター中に別個にクローニングされた。LRP6.E1−E2−Fcタンパク質及びLRP6.E3−E4−Fcタンパク質は、一過性のトランスフェクションによりCHO細胞で発現させ、プロテインA/Gアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。LRP6.E1−E2−Fcタンパク質及びLRP6.E3−E4−Fcタンパク質はまた、合成ヒトFabファージディスプレイライブラリーをスクリーニングするために個別に使用された。固定化LRP6タンパク質上で選択後に、ファージクローンは単離され、Fcタンパク質ではなく、LRP6−Fc融合タンパク質断片に対する結合についてファージELISA法により確認された。その次に、ファージFabクローンが、ヒトIgG1モノクローナル抗体としての発現のために再編成された。LRP6.E1−E2−Fcに対する24の固有の抗体重鎖クローン、及びLRP6.E3−E4−Fcに対する22のクローンがトランスフェクトされ、一般的なハーセプチン由来ヒトカッパ軽鎖でHEK293細胞中に一過性に発現され、IgGタンパク質はアフィニティークロマトグラフィーにより精製された。続く大規模な抗体調製物は、CHO細胞で一過性のトランスフェクションにより産生された。
バイオレイヤーインターフェロメトリーを以前に記載のように実施した(Bourhis et al., 2010)。短く言うと、ビオチン標識化、Hisタグ付きLRP6タンパク質は、AviTagシステム(GeneCopoeia)を使用して、バキュロウイルス感染昆虫細胞から精製した。結合速度は20μg/mlのLRP6タンパク質がロードされたストレプトアビジン高結合FAバイオセンサーを使用してOctet REDシステム(ForteBio)で測定した。担体無しの精製ヒトWnt3a及びマウスWnt9bは、R&Dシステムズから購入し、精製DKK1タンパク質は以前に記載の通りに産生された(Bourhis et al., 2010)。
MMTV−Wnt1トランスジェニックマウスからの腫瘍をC57BL/6マウスの乳腺脂肪体中で継代し、機械的及び酵素的に解離させ、マトリゲル及びハンクス平衡塩類溶液(HBSS)中に再懸濁され、胸腺欠損NCRヌードマウス(タコニック)の乳腺脂肪体に注入された。腫瘍体積が250から800mm3に達したら治療が開始された。各治療群において、10匹のマウスに、30mg/kgの抗体又はタンパク質が腹腔内に(IP)2日ごとに投与された。腫瘍体積は、キャリパー測定を用いて解析した。
Wntアンタゴニストの単離及びLRP6モノクローナル抗体の増強
Wntシグナル伝達を操作するための治療用分子の候補を開発するために、Wnt3aタンパク質により誘導されたシグナル伝達を阻害又は増強することができる抗体が作成された。組換えLRP6.E1−E2−Fc(配列番号30)タンパク質及びLRP6.E3−E4−Fcタンパク質(配列番号31)が、ヒト合成Fabファージディスプレイライブラリーをスクリーニングするために使用され、単離されたファージクローンのLRP6への結合がELISAにより確認された。LRP6.E1−E2に対する24の固有の抗体重鎖クローン及びLRP6.E3−E4に対する22のクローンが単離され、再編成され、ヒトIgG1抗体として発現された。0.1mg/mlの精製Wnt3aで誘導されたHEK293細胞中において、LRP6.E3−E4抗体のうち六つが、濃度依存的にWntルシフェラーゼレポーター活性を阻害した(図1A)。これと他のすべてのグラフのエラーバーは、特に断りがない限り、少なくとも3反復サンプルの標準偏差を表す。これらの抗体は、YW211.03、YW211.08、YW211.11、YW211.12、YW211.31、及びYW211.33と命名された。LRP6.E1−E2抗体のいずれも、この阻害を示さなかった。LRP6.E3−E4ドメインを認識するYW211.31抗体は、約1μg/ml(又は6nM)のIC50を持ち、Wnt3aで刺激されたHEK293細胞におけるシグナル伝達の阻害において最も強力であった。YW211.31抗体は、精製されたFzd8CRDタンパク質及びDKK1タンパク質に類似して、LRP6タンパク質のレベルに影響を与えることなく、Wnt3a誘導性LRP6リン酸化及びβカテニンタンパク質の安定化を阻害した(図1Bは、Wnt3aで刺激されていないか又は刺激され、指定されたLRP6抗体又は精製タンパク質(βカテニン及びGAPDHタンパク質のレベルはロードしたコントロールのサンプルとして示される)で処置されたHEK293細胞のウエスタン解析を示す。)。RNAi実験は、βカテニンポリクローナル抗体により認識された低分子量のバンドのみがβカテニンタンパク質を表わしていることを示した。YW211.31抗体はまた、マウスNIH/3T3細胞中のWnt3a誘導性レポーター活性と、マウスL細胞中のβカテニンタンパク質の安定化を部分的に阻害するため、マウスLRP6機能に拮抗することができる。
自己分泌Wntシグナル伝達におけるLRP6モノクローナル抗体の作用
LRP6抗体が、内因性、又は自己分泌のWntシグナル伝達に拮抗又は増強する能力が、様々な腫瘍細胞株を用いて決定された(Bafico et al., 2004; DeAlmeida et al., 2007; Akiri et al., 2009)。テラトカルシノーマ細胞株のPA−1及びNTERA−2において、YW211.31抗体は、外因性Wnt3aで観察されたのと類似した効力で、自己分泌シグナル伝達により誘導されたレポーター活性を阻害する(図2Aは、ルシフェラーゼレポーターでトランスフェクトされ、かつ、LRP6抗体で(個別に又は組合わせの何れかで)、又はFzd8CRD−Fcタンパク質(陽性コントロール)で処置された、PA−1テトラカルシノーマ細胞における自己分泌Wntシグナル伝達の濃度依存性阻害及び増強を示す。)。
異なるWntアイソフォームにおけるLRP6抗体の相反する活性
YW211.31抗体は、全ての細胞株において外因性Wnt3aタンパク質によって誘導されたシグナル伝達を阻害するが、細胞株に依存した方法で自己分泌Wntシグナル伝達を阻害又は増強することができ、自己分泌シグナルを駆動する特定のWntのアイソフォームが抗体の活性を特定することを示唆している。従って、Wnt3a及び他のWntアイソフォームの外因性発現により誘導されたシグナル伝達における抗体の活性を測定した。HEK293細胞又はHs578T細胞の何れかにおいてWnt3aのトランスフェクションによって誘発されるWntシグナル伝達は、Wnt3aタンパク質処置により誘導されたシグナル伝達の阻害と同様の効力で、YW211.31.57抗体によって阻害される。驚くべきことに、両細胞株においてWnt1発現により誘導されたシグナル伝達は、YW211.31.57抗体によって増強された。Wnt1シグナル伝達及びWnt3aシグナル伝達の両方が、期待されるようにう、Fzd8CRD−Fcタンパク質によって阻害される。Wnt1シグナル伝達の増強もまた、スクリーニングで同定される他のWnt3aアンタゴニスト抗体で観察された。YW210.09抗体はまた、Wnt3a誘導性シグナル伝達及びWnt1誘導性シグナル伝達に対して対立する活性を示し、それはYW211.31.57の活性、即ち、Wnt3aシグナル伝達の増強およびWnt1シグナル伝達の阻害の相反であった。Wnt標的遺伝子のAxin2及びMmp7の低下した発現により観察されるように、YW210.09抗体はまた、MMTV−Wnt1マウス腫瘍から培養で増殖させた腫瘍細胞におけるWnt1シグナル伝達を、Fzd8CRD−Fcタンパク質の処置と同程度に、阻害する。MMTV−Wnt1細胞では、Wnt1シグナル伝達がすでにこれらの細胞内で最大であるため、YW211.31.57抗体は、Wnt1シグナル伝達を増強することができなかった。
Wntアイソフォームは、LRP6抗体の異なる活性を特定する
異なるWntのアイソフォームが様々な細胞株において内因性に発現された異なるFZDアイソフォームに優先的に結合することができ、我々のLRP6抗体の特異的活性の恐らくは主要因である可能性がある。この可能性を検討するために、異なるWnt−FZDの対を共有結合で連結するキメラタンパク質が、特定のWntアイソフォーム又はFZDアイソフォームがLRP6抗体の活性を決定するかどうかを試験するために構築された。FZD4又はFZD5どちらに融合したWnt3a又はWnt1は、内因性Wnt発現の推定的欠損下で、HEK293細胞においてWntシグナル伝達を活性化するが、FZD4又はFZD5の過剰発現は、Wntシグナル伝達を誘導しない。YW211.31.57抗体はFZD4又はFZD5のどちらかに融合したWnt3aのシグナル伝達活性を阻害し、FZD4又はFZD5どちらかに融合したWnt1の活性を増強する(図6は、データの概要、10μg/mlの抗体、10μg/mlのFzd8CRDを用いて行われたアッセイの要約を与える)。YW210.09抗体は、両方を阻害するWnt1キメラに対する相反する活性を示す。従って、抗体の活性は、FZDアイソフォームとではなくWntアイソフォームと相関している。Fzd8CRD−Fcタンパク質は、4つのWnt−FZDキメラのいずれかにより誘導されたシグナル伝達に影響を与えず、WntsのFZD−結合部位の独立して機能するキメラと一致している。
Wntシグナル伝達の抗体媒介性増強はLRP6二量体化を含む
YW211.31抗体による自己分泌Wntシグナル伝達の増強は、恐らくはLRP6の二量体化を通じて、結合活性作用を必要とする。YW211.31の一価Fab断片及び組換えワンアーム型YW211.31抗体は、EKVX細胞及びHs578T細胞において、これらの細胞株中でWnt3a誘導性シグナル伝達を阻害する濃度で、自己分泌Wntシグナル伝達の増強を示さない。対照的に、YW211.31 Fab断片及びワンアーム型mAbは、PA−1テトラカルシノーマ細胞株中で自己分泌Wntシグナル伝達及びWnt3a誘導シグナル伝達の両方を、インタクトなIgG抗体と同様の効力で、阻害する。ワンアーム型YW211.31抗体の架橋が全IgG分子のWnt増強機能を回復させるするかどうかを試験するために、YW211.31.57抗体によって増強される自己分泌Wntシグナル伝達及びWnt2誘導性シグナル伝達を示すHT−1080軟部組織肉腫細胞株、並びにFc架橋により亢進されるApomab抗体誘導性アポトーシスを使用した(Adamsら、2008)。ワンアーム型YW211.31抗体は、自己分泌Wntシグナル又はWnt2トランスフェクションによって誘導されたシグナル伝達に影響を与えない。Apomab媒介性アポトーシスを増強する抗Fc抗体との架橋結合条件の下では、ワンアーム型抗体の架橋が、YW211.31.57全抗体で観察される自己分泌Wntシグナル伝達及びWnt2シグナル伝達の両方の増強を部分的に再構築することが決定された。
Wntアンタゴニストの結合を阻害することによるWntシグナル伝達の抗体媒介性増強
DKK1アイソフォーム及びSOSTなどの細胞外LRP6アンタゴニストの活性を阻害することもWntシグナル伝達を増強することができる(Niidaら、2004)。外因性DKK1タンパク質はHEK293細胞においてWnt1誘導性シグナル伝達を阻害し、YW211.31.57抗体は、この拮抗作用をブロックすることができ、DKK1タンパク質の存在下で十分に高い濃度にて、シグナル伝達を増強することさえできる(図4G)。これに対して、YW211.31ワンアーム型抗体は、これらの同じ濃度でWnt1シグナル伝達のDKK1拮抗作用を非常に弱く阻害する。YW211.31.57の完全抗体は、試験された全てのDKK1濃度でDKK1活性に効果的に拮抗するが、ワンアーム型抗体は低いDKK1濃度でさえも、最小限度か、あるいはまったく影響がない。ワンアーム型YW211.31抗体でなく完全抗体で観察された外因性DKK1活性の強力な拮抗作用は、完全抗体に固有のWnt−増強活性に寄与するかもしれない。あるいは、DKK1タンパク質は、このアッセイにおいてWnt1誘導性シグナル伝達を完全には阻害することができなかったので、インタクトなYW211.31抗体は、LRP6の二量体化を介して、残存するシグナル伝達を単に増強することも可能である。
Wntシグナル伝達拮抗作用はLRP6抗体の組み合わせにおいて優勢である。
上記のアッセイはLRP6のE1−E2領域内でWnt3aとWnt3が結合し、YW211.31.57抗体による結合が抑制されることを示している。Wnt1クラスにおけるWntアイソフォームは、E3−E4領域に結合すると予測されており、この結合はYW210.09抗体によってブロックされる。何れの理論に縛られることなく、Wntシグナル伝達の増強は、Wntアイソフォーム及び抗体の両方が同じLRP6の分子を結合することができる場合に生じる可能性があり、恐らくは抗体によるWntとLRP6の二量体化によりFZDのリクルートメントを必要とする。このモデルは、両方の抗体の組み合わせがWntシグナルアイソフォームのどちらかのクラスによって誘発されるシグナル伝達を阻害するであろうと予測しており、その理由は、LRP6二量化は恐らく依然として生じるであろうが、Wnt結合が、1つまたは他の抗体によってブロックされるであろうゆえである。予測されるように、HEK293細胞をYW211.31.57抗体及びYW210.09抗体と同時に処置することは、Wnt3a又はWnt1の何れかの発現により開始されたシグナル伝達を阻害する(図7及び8A)。図8Aに示されたアッセイは、Wnt3a、Wnt1の何れか又はWnt3aとWnt1の両方の発現コンストラクトでトランスフェクトされているWntルシフェラーゼレポーターを安定に組込まれたHEK293細胞中で実施された。全ての抗体とタンパク質は、10μg/mlでそれぞれ使用した。この分析は、Wnt1クラスの他の3つのWntアイソフォームに拡張され、YW211.31.57抗体とYW210.09抗体の組合わせが、YW210.09単独と同程度に、Wntシグナル伝達を阻害することが見出された(図7)。Wnt3aとWnt1の両方が同時に発現される場合、どちらの抗体も、Wntシグナル伝達に拮抗しないが、両方の抗体の組み合わせではシグナル伝達を阻害する(図8A)。この結果の一つの可能な説明は、各抗体がただ一つのWntアイソフォームの結合を阻害し、両方の抗体が同時にLRP6の分子に結合し、Wnt結合部位の両方をブロックすることができるということである。
LRP6抗体は複数の部位へのWntの結合を差動的に阻害する。
LRP6抗体の相反する活性は、YW211.31.57及びYW210.09は、LRP6上の異なるWntアイソフォーム結合部位と相互作用し、かつWnt結合は、アンタゴニスト抗体により拮抗されるが増強抗体により許容されることを示していた。精製された固定化LRP6細胞外ドメインタンパク質に対する精製されたWntタンパク質を測定するバイオレイヤーインターフェロメトリーアッセイは(実施例1を参照)、Wnt3aは、YW211.31.57抗体に対するエピトープが存在するLRP6のE3−E4領域へ結合し、Wnt9b(抗体相互作用についてWnt1と同一クラスにある)は、YW210.09抗体もまた結合するE1−E2領域のみに結合することを示した(Bourhisら、(2010)。YW210.09でなく、YW211.31.57抗体は、LRP6.E1−E4タンパク質断片へのWnt3aの結合を阻害する(図9A)。逆に、YW211.31.57でなくYW210.09は、Wnt9bのLRP6.E1−E4への結合を阻害する(図9B)。これらのアッセイにおいて、LRP6タンパク質への抗体結合は平衡に到達され、干渉縞におけるその後の波長シフトが、Wntタンパク質結合の会合段階と解離段階において示される。
LRP6抗体はWnt駆動型腫瘍及び骨形成において活性である。
LRP6抗体の抗腫瘍治療効果の探索を開始するため、Wntリガンド駆動型腫瘍の2つのモデルが扱われた。Wnt1発現に依存するMMTV−Wnt1トランスジェニック乳腺腫瘍同種移植片と未知のWntアイソフォームの自己分泌Wntシグナルによって駆動されるNtera−2ヒトテトラカルシノーマ異種移植片(DeAlmeidaら、2007)。MMTV−Wnt1トランスジェニックマウスの乳腺腫瘍から単離された細胞が、無胸腺ヌードマウスに腫瘍を確立するために使用され、それらは2日ごとに抗体が投与された。迅速かつ持続的な腫瘍の退縮がFzd8CRD−Fcタンパク質に類似してYW210.09抗体で観察された(図10A)。YW211.31.57抗体は、コントロールバッファー(PBS)又は抗gD抗体処置と比較して、これらの条件下で腫瘍の増殖を変えなかった。マウスは抗体又はタンパク質の30mg/kgを2日ごとに投与された(矢印)(図10A)。これらの結果は、組織培養で扱われたMMTV−Wnt1腫瘍細胞のWnt標的遺伝子の発現における上記の抗体の作用と一致している。
LRP6二重特異性抗体はPan−Wnt阻害剤として働く。
Knobs−into−holes技術 (Atwellら、1997)がYW211.31.62とYW210.09の重鎖ヘテロダイマーによる2重特異性IgGハイブリッドを構築するために用いられた。LRP6二重特異性抗体は、大腸菌又はHEK293細胞の何れかで産生され、HEK293細胞中(図11A)、及び腫瘍細胞株のPA−1、M14及びCALー51(図11C)で、Wnt3a誘導性(0.1μg/ml)シグナル伝達を拮抗した。特記すべきは、二重特異性抗体は、YW211.31と少なくとも同じくらい強く阻害し、YW210.09のWnt3a増強活性を保持しない。二重特異性抗体は、PA−1細胞中のYW211.31抗体、及びM14細胞におけるYW210.09の阻害活性を保持し、試験したすべての3の腫瘍細胞株で自己分泌Wntシグナル伝達を阻害する(図11B)。興味深いことに、CAL−51乳癌細胞において、YW211.31が自己分泌Wntシグナル伝達を増強させ、YW210.09が自己分泌Wntシグナル伝達に影響を及ぼさないにも関わらず、二重特異性抗体は、シグナル伝達を阻害する。この新規なアンタゴニスト活性はYW211.31抗体とYW210.09抗体の組み合わせでは観察されない。上記アッセイにおいて、Wntルシフェラーゼレポーターを安定に組込んだPA−1細胞とM14細胞、及びレポーターでトランスフェクトされたCAL−51細胞は、指定されたコントロールバッファー(PBS)、抗体、抗体組合わせ、又はFzd8CRD−Fcタンパク質(各々10μg/ml)で、0.1μg/mlのWnt3aによる刺激の有る(11C)又は無し(11B)で処置された。
LRP6 E1−YW210.09 Fab複合体の構造
YW210.09 Fabとの複合体のLRP6の第一のβプロペラ−とEGFドメイン(E1とも呼ぶ)の結晶構造は、分子置換法により決定され、1.9ÅでRとRfreeがそれぞれ0.175及び0.220に精密化された。結晶学的非対照単位は1つのLRP6のE1ドメインと1つのYW210.09Fabからなる。解釈可能な電子密度は、E1ドメインの残基のAla20からLys324,Fab軽鎖及び重鎖のそれぞれ、残基Asp1からGlu213、Glu1からLys214を、Fab重鎖残基のSer127からThr131を除いて、トレース可能であった(全体を通じてKabatの番号付けが用いられる)。
典型的な抗LRP6抗体
所定の抗LRP6抗体のアミノ酸配列が配列リストに提供される。表2−4は、配列の記述を与える。特異的抗LRP6抗体のVHドメイン及びVLドメインのアミノ酸配列のアラインメントは図16及び図17に与えられる。
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Claims (76)
- LRP6に結合する単離された抗体であって、第一のWntアイソフォームによって誘導されるシグナル伝達を阻害し、第二のWntアイソフォームによって誘導されるシグナル伝達を増強する抗体。
- 第一のWntアイソフォームが、Wnt3及びWnt3aからなる群から選択される、請求項1に記載の抗体。
- 第二のWntアイソフォームが、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt4、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、及びWnt10bからなる群から選択される、請求項1に記載の抗体。
- 第一のWntアイソフォームが、Wnt3及びWnt3aからなる群から選択され、第二のWntアイソフォームが、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt4、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、及びWnt10bからなる群から選択される、請求項1に記載の抗体。
- 第一のWntアイソフォームが、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt6、Wnt8a、Wnt9a、Wnt9b、及びWnt10bからなる群から選択される、請求項1に記載の抗体。
- 第二のWntアイソフォームが、Wnt3及びWnt3aからなる群から選択される、請求項1に記載の抗体。
- 第一のWntアイソフォームが、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt6、Wnt8a、Wnt9a、Wnt9b、及びWnt10bからなる群から選択され、第二のWntアイソフォームが、Wnt3及びWnt3aからなる群から選択される、請求項1に記載の抗体。
- 抗体が、LRP6のE3−E4領域に結合する、請求項1から4の何れか一項に記載の抗体。
- 抗体が、LRP6のE1−E2領域に結合する、請求項1又は5から7の何れか一項に記載の抗体。
- LRP6の2つの異なる領域に結合する単離された抗体。
- 抗体がLRP6のE1−E2領域に結合し、かつLRP6のE3−E4領域に結合する、請求項10に記載の抗体。
- 抗体が、Wnt1とWnt3aの組合わせにより誘導されるWntシグナル伝達を阻害する、請求項10又は11に記載の抗体。
- 抗体が自己分泌Wntシグナル伝達を阻害する、請求項10、11、又は12に記載の抗体。
- LRP6への結合について、請求項1から13の何れか一項に記載の抗体と競合する抗体。
- 請求項1から13の何れか一項に記載の抗体と細胞傷害性薬物を含むイムノコンジュゲート。
- 請求項1から15の何れか一項に記載の抗体と薬学的に許容される担体を含有する薬学的製剤。
- 医薬としての使用のための、請求項1から14の何れか一項に記載の抗体。
- 癌又は骨格障害の治療に使用される、請求項1から14の何れか一項に記載の抗体。
- 第一のWntアイソフォームによって誘導されるシグナル伝達の阻害と、第二のWntアイソフォームによって誘導されるシグナル伝達の増強に使用される、請求項1から14の何れか一項に記載の抗体。
- 医薬の製造における、請求項1から14の何れか一項に記載の抗体の使用。
- 医薬が、癌又は骨格障害を治療する、請求項20の使用。
- 医薬が、第一のWntアイソフォームによって誘導されるシグナル伝達の阻害と、第二のWntアイソフォームによって誘導されるシグナル伝達の増強に使用される、請求項20の使用。
- 請求項1から15の何れか一項に記載の抗体の有効量を個体に投与することを含む、癌を有する個体を治療する方法。
- 癌が、非小細胞肺癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、腎臓癌、及び前立腺癌からなる群から選択される、請求項23に記載の方法。
- a)LRP6に結合し、Wnt3及びWnt3aからなる群から選択されるWntアイソフォームにより誘導されるシグナル伝達を阻害する単離された抗体、及び
b)LRP6に結合し、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt6、Wnt8a、Wnt9a、Wnt9b、及びWnt10bからなる群から選択されるWntアイソフォームにより誘導されるシグナル伝達を阻害する単離された抗体
の有効量を個体に投与することを含む、癌を有する個体を治療する方法。 - a)LRP6に結合し、Wnt3及びWnt3aに誘導されるシグナル伝達を阻害する単離された抗体、及び
b)LRP6に結合し、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt6、Wnt8a、Wnt9a、Wnt9b、及びWnt10bにより誘導されるシグナル伝達を阻害する単離された抗体
の有効量を個体に投与することを含む、癌を有する個体を治療する方法。 - a)LRP6に結合し、Wnt3及びWnt3aに誘導されるシグナル伝達を阻害する単離された抗体、及び
b)LRP6に結合し、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt4、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、及びWnt10bにより誘導されるシグナル伝達を阻害する単離された抗体
の有効量を個体に投与することを含む、癌を有する個体を治療する方法。 - 請求項1から14の何れか一項に記載の抗体の有効量を個体に投与することを含む、骨格障害を有する個体を治療する方法。
- 骨格障害が、骨粗しょう症、変形性関節症、骨折、及び骨病変からなる群から選択される、請求項28に記載の方法。
- 個体におけるWntアイソフォームにより誘導されるWntシグナル伝達を増強する方法において、Wntアイソフォームにより誘導されるWntシグナル伝達を増強するために、請求項1から14の何れか一項に記載の抗体及びWntアイソフォームの有効量を個体に投与することを含む方法。
- 抗体が、配列番号9、配列番号11、配列番号13、及び配列番号15からなる群から選択されるVHを含む抗体、LRP6に結合する単離された抗体。
- 抗体が、配列番号10及び配列番号12からなる群から選択されるVLを含む、LRP6に結合する単離された抗体。
- 抗体が、配列番号9、配列番号11、配列番号13、及び配列番号15の重鎖からのVHからなる群から選択されるVHと、配列番号10及び配列番号12の軽鎖からのVLからなる群から選択されるVLを含む、LRP6に結合する単離された抗体。
- 抗体が、配列番号9、配列番号11、配列番号13、及び配列番号15のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の相同性を有するアミノ酸配列を含むVHを含む、LRP6に結合する単離された抗体。
- 抗体が、配列番号10及び配列番号12からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の相同性を有するアミノ酸配列を含むVLを含む、LRP6に結合する単離された抗体。
- 抗体が、配列番号9、配列番号11、配列番号13、及び配列番号15からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の相同性を有するアミノ酸配列を含むVHと、配列番号10及び配列番号12からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の相同性を有するアミノ酸配列を含むVLを含む、LRP6に結合する単離された抗体。
- 抗体が、配列番号9、配列番号11、配列番号13、及び配列番号15からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVHを含む、LRP6の2つの異なる領域に結合する単離された二重特異性抗体。
- 抗体が、配列番号9のアミノ酸配列を含む第一のVHと、配列番号15のアミノ酸配列を含む第二のVHを含む、請求項37に記載の二重特異性抗体。
- 抗体が、配列番号11のアミノ酸配列を含む第一のVHと、配列番号15のアミノ酸配列を含む第二のVHを含む、請求項37に記載の二重特異性抗体。
- 抗体が、配列番号13のアミノ酸配列を含む第一のVHと、配列番号15のアミノ酸配列を含む第二のVHを含む、請求項37に記載の二重特異性抗体。
- 抗体が、配列番号10及び配列番号12からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVLを更に含む、請求項37から40の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
- 抗体が、配列番号9、配列番号11、配列番号13、及び配列番号15からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも90%の相同性を有するアミノ酸配列を含むVHを含む、LRP6の2つの異なる領域に結合する二重特異性抗体。
- 抗体が、配列番号9のアミノ酸配列に少なくとも90%の相同性を有するアミノ酸配列を含む第一のVHと、配列番号15のアミノ酸配列に少なくとも90%の相同性を有するアミノ酸配列を含む第二のVHを含む、請求項42に記載の二重特異性抗体。
- 抗体が、配列番号11のアミノ酸配列に少なくとも90%の相同性を有するアミノ酸配列を含む第一のVHと、配列番号15のアミノ酸配列に少なくとも90%の相同性を有するアミノ酸配列を含む第二のVHを含む、請求項42に記載の二重特異性抗体。
- 抗体が、配列番号13のアミノ酸配列に少なくとも90%の相同性を有するアミノ酸配列を含む第一のVHと、配列番号15のアミノ酸配列に少なくとも90%の相同性を有するアミノ酸配列を含む第二のVHを含む、請求項42に記載の二重特異性抗体。
- 抗体が、配列番号10及び配列番号12からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の相同性を有するアミノ酸配列を含むVLを更に含む、請求項42から45の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
- LRP6の2つの異なる領域に結合する単離された二重特異性抗体であって、(a)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(c)配列番号19のアミノ酸配列を含むHVR−H3から選択される、少なくとも一つのVH HVR配列、少なくとも二つのVH HVR配列、又は三つ全てのVH HVR配列を含む第一のVHドメインと、(d)配列番号22のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(e)配列番号23のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(f)配列番号24のアミノ酸配列を含むHVR−H3から選択される、少なくとも一つのVH HVR配列、少なくとも二つのVH HVR配列、又は三つ全てのVH HVR配列を含む第二のVHドメインとを含む抗体。
- LRP6の2つの異なる領域に結合する単離された二重特異性抗体であって、(a)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(c)配列番号19のアミノ酸配列を含むHVR−H3からの三つのVH HVR配列の全てを含む第一のVHドメインを含み、かつ(d)配列番号22のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(e)配列番号23のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(f)配列番号24のアミノ酸配列を含むHVR−H3からの三つのVH HVR配列の全てを含む第二のVHドメインを含む抗体。
- LRP6の2つの異なる領域に結合する単離された二重特異性抗体であって、(a)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(c)配列番号21のアミノ酸配列を含むHVR−H3から選択される、少なくとも一つのVH HVR配列、少なくとも二つのVH HVR配列、又は三つ全てのVH HVR配列を含む第一のVHドメインを含み、かつ(d)配列番号22のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(e)配列番号23のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(f)配列番号24のアミノ酸配列を含むHVR−H3から選択される、少なくとも一つのVH HVR配列、少なくとも二つのVH HVR配列、又は三つ全てのVH HVR配列を含む第二のVHドメインを含む抗体。
- LRP6の2つの異なる領域に結合する単離された二重特異性抗体であって、(a)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(c)HVR−H3 配列番号21からの三つのVH HVR配列の全てを含む第一のVHドメインを含み、かつ(d)配列番号22のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(e)配列番号23のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(f)配列番号24のアミノ酸配列を含むHVR−H3からの三つのVH HVR配列の全てを含む第二のVHドメインを含む抗体。
- LRP6の2つの異なる領域に結合する単離された二重特異性抗体であって、(a)配列番号20のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(c)HVR−H3 配列番号19から選択される、少なくとも一つのVH HVR配列、少なくとも二つのVH HVR配列、又は三つ全てのVH HVR配列を含む第一のVHドメインを含み、かつ(d)配列番号22のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(e)配列番号23のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(f)配列番号24のアミノ酸配列を含むHVR−H3から選択される、少なくとも一つのVH HVR配列、少なくとも二つのVH HVR配列、又は三つ全てのVH HVR配列を含む第二のVHドメインを含む抗体。
- LRP6の2つの異なる領域に結合する単離された二重特異性抗体であって、(a)配列番号20のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(c)配列番号19のアミノ酸配列を含むHVR−H3からの三つのVH HVR配列の全てを含む第一のVHドメインを含み、かつ(d)配列番号22のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(e)配列番号23のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(f)配列番号24のアミノ酸配列を含むHVR−H3からの三つのVH HVR配列の全てを含む第二のVHドメインを含む抗体。
- 抗体が、(a)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号26のアミノ酸配列を含むHVR−L2;(c)HVR−L3 配列番号27から選択される、少なくとも一つのVL HVR配列、少なくとも二つのVL HVR配列、又は三つ全てのVL HVR配列を更に含む、請求項47から52の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
- 抗体が、(a)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号26のアミノ酸配列を含むHVR−L2;(c)HVR−L3 配列番号27から選択される、三つ全てのVL HVR配列を更に含む、請求項47から52の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
- 抗体が、(a)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号26のアミノ酸配列を含むHVR−L2;(c)HVR−L3 配列番号28から選択される、少なくとも一つのVL HVR配列、少なくとも二つのVL HVR配列、又は三つ全てのVL HVR配列を更に含む、請求項47から52の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
- 抗体が、(a)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号26のアミノ酸配列を含むHVR−L2;(c)HVR−L3 配列番号28から選択される、三つ全てのVL HVR配列を更に含む、請求項47から52の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
- LRP6の2つの異なる領域に結合する単離された二重特異性抗体であって、配列番号15のアミノ酸配列を含む第一のVHと、配列番号9、配列番号11、及び配列番号13のアミノ酸配列を含むVHからなる群から選択される第二のVHを含む抗体。
- 配列番号10又は配列番号12のアミノ酸配列を含むVLを更に含む、請求項57に記載の二重特異性抗体。
- 配列番号15のアミノ酸配列を含む第一のVH、及び配列番号9のアミノ酸配列を含む第二のVH、及び配列番号10のアミノ酸配列を含むVLを含む、請求項57に記載の二重特異性抗体。
- Wnt3及びWnt3aからなる群から選択されるWntアイソフォームにより誘導されるシグナル伝達を阻害し、かつWnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt6、Wnt8a、Wnt9a、Wnt9b、及びWnt10bからなる群から選択されるWntアイソフォームにより誘導されるシグナル伝達を阻害する、請求項37から59の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
- 抗体が、Wnt4、Wnt7a、Wnt7b、及びWnt10aからなる群から選択されるWntアイソフォームにより誘導されるシグナル伝達を阻害する、請求項37から59の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
- 抗体が自己分泌Wntシグナル伝達を阻害する、請求項37から59の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
- LRP6に結合し、Wnt3及びWnt3aからなる群から選択されるWntアイソフォームにより誘導されるシグナル伝達を阻害し、かつWnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt6、Wnt8a、Wnt9a、Wnt9b、及びWnt10bからなる群から選択されたWntアイソフォームにより誘導されるシグナル伝達を阻害する単離された二重特異性抗体。
- 抗体が、Wnt4、Wnt7a、Wnt7b、及びWnt10aからなる群から選択されるWntアイソフォームにより誘導されるシグナル伝達を阻害する、請求項62に記載の二重特異性抗体。
- LRP6への結合について、請求項37から64の何れか一項に記載の二重特異性抗体と競合する抗体。
- 請求項37から64の何れか一項に記載の二重特異性抗体と同じ2つのエピトープに結合する抗体。
- 2つのエピトープの一つが、LRP6のR28、E51、D52、V70、S71、E73、L95、S96、D98、E115、R141、及びN185を含む、請求項66に記載の抗体。
- 2つのエピトープの一つが、LRP6のR28、E51、D52、V70、S71、E73、L95、S96、D98、E115、R141、N185、R29、W188、K202、P225、H226、S243、及びF266を含む、請求項67に記載の抗体。
- 請求項1から14又は31から68の何れか一項に記載のLRP6抗体又は二重特異性抗体をコードする単離された核酸。
- 請求項69に記載の核酸を含む宿主細胞。
- 請求項31から68の何れか一項に記載の抗体又は二重特異性抗体と薬学的に許容される担体を含有する薬学的製剤。
- 医薬として使用される、請求項31から68の何れか一項に記載の抗体又は二重特異性抗体。
- 癌の治療に使用される、請求項31から68の何れか一項に記載の抗体又は二重特異性抗体。
- 医薬の製造における、請求項31から68の何れか一項に記載の抗体又は二重特異性抗体の使用。
- 請求項31から68の何れか一項に記載の抗体又は二重特異性抗体の有効量を個体に投与することを含む、癌を有する個体を治療する方法。
- 癌が、非小細胞肺癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、腎臓癌、及び前立腺癌からなる群から選択される、請求項75に記載の方法。
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