JP6316874B2 - 抗ユビキチン抗体及び使用方法 - Google Patents

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Description

関連出願
本出願は、２０１０年４月１５日に出願された米国仮出願第６１／３２４６０２号の利益を主張し、それは、参照によりその全体が本明細書に援用される。
ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由でテキストファイルとして提出された配列表への参照
配列表は、ファイル名が「Ｐ４４１０Ｒ１_Ｓｅｑｕｅｎｃｅ_Ｌｉｓｔｉｎｇ.ＴＸＴ」で、２０１１年４月１３日の作成日付、３９．９キロバイトの大きさのＡＳＣＩＩ形式のテキストファイルとして明細書と同時にＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で提出されている。ＥＦＳ−Ｗｅｂを経由して提出された配列表は仕様の一部であり、本明細書にその全体が本明細書中で参考として援用される。
発明の分野
本発明は抗ポリユビキチン抗体の分野、より具体的にはモノユビキチンに特異的には結合せず、ポリユビキチンの特定のリジン結合型に特異的である抗ポリユビキチン抗体と、それを使用する方法に関する。
背景
ユビキチンは様々な細胞経路で重要な調節的役割を持つ小さなタンパク質である。位置１１のリジン（Ｋ１１）を介して結合したユビキチン鎖は、細胞分裂の重要なレギュレーターとして同定されており(Jin et al., 2008; Kirkpatrick et al., 2006) 、真核生物の細胞分裂の重要なステップである、ユビキチンリガーゼ後期促進複合体（ＡＰＣ／Ｃ）基質の分解のシグナル伝達に関与している (Jin et al., 2008; Williamson et al., 2009)。ＡＰＣ／Ｃは、２つのＥ２酵素、ユビキチン鎖開始ＵｂｃＨ１０及び鎖伸長Ｕｂｅ２Ｓを補充し、高い特異性で高い特異性でＫ１１−結合鎖を組み立てる(Garnett et al., 2009; Williamson et al., 2009; Wu et al., 2010)。このＡＰＣ／Ｃ特異的Ｅ２モジュールの欠損は、有糸分裂進行における欠陥をもたらす(Williamson et al., 2009; Song and Rape, Molecular Cellに印刷中)。これらの結果は、Ｋ１１−結合鎖が有糸分裂時にプロテアソームによるタンパク質分解を促進することを示唆しているが、ＡＰＣ／Ｃ、ＵｂｃＨ１０及びＵｂｅ２Ｓによって組み立てられるユビキチン鎖の特性評価は、大部分がインビトロの実験に依存している。細胞のタンパク質分解を制御しているＫ１１結合型ポリユビキチン鎖の直接の証拠は、直接それらを検出するために利用できるツールが無いため不足している。
概要
本発明は、抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体及びそれを使用する方法を提供する。一実施態様において、本発明は、Ｋ１１リジン結合を含む第一のポリユビキチンに特異的に結合する単離された抗体を提供し、その抗体は第二のリジン結合を含む第二のポリユビキチンには特異的に結合せず、その第二のリジン結合はＫ１１リジン結合とは異なる。その他の実施態様において、本発明は、Ｋ１１リジン結合を含む第一のポリユビキチン及び第二のリジン結合を含む第二のポリユビキチンの両方に特異的に結合する単離された抗体を提供し、その第二のリジン結合はＫ１１リジン結合とは異なり、その抗体はモノユビキチンに特異的に結合せず、かつその抗体は、第二のポリユビキチンに対して、第一のポリユビキチンに対する抗体の結合親和性と比べて実質的に減少した結合親和性で、結合する。
その他の実施態様において、本発明は、リジン１１結合型ポリユビキチンに特異的に結合した単離された抗体を提供し、その抗体はモノユビキチンに特異的には結合しない。一態様において、抗体は、配列番号２及び５７−６０；配列番号３及び６１；配列番号４；配列番号６−１１；配列番号１２−１７及び６７；及び配列番号１８−２３、６８及び６９のそれぞれ何れかのＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つの超可変（ＨＶＲ）配列を含む。その他の実施態様において、抗体はＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つの配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ１は、アミノ酸配列Ｘ１ Ｘ２ Ｘ３ Ｘ４ Ｉｌｅ Ｘ５（配列番号２４）を含み、ここでアミノ酸Ｘ１はセリン及びスレオニンから選択され、Ｘ２はアスパラギン、アスパラギン酸、セリン、グリシンから選択され、アミノ酸Ｘ３はチロシン、セリン、スレオニンから選択され、アミノ酸Ｘ４はトリプトファン、アスパラギン酸、グリシン、チロシンから選択され、アミノ酸Ｘ５はセリン及びヒスチジンから選択され；ＨＶＲ−Ｈ２はアミノ酸配列Ｘ６ Ｘ７ Ｉｌｅ Ｘ８ Ｐｒｏ Ｘ９ Ｇｌｙ Ｘ１０ Ｔｈｒ Ｘ１１（配列番号２５）を含み、アミノ酸Ｘ６は、グリシン及びアラニンから選択され、アミノ酸Ｘ７は、アスパラギン酸、トリプトファン、グリシン、グルタミン酸、バリンから選択され、アミノ酸Ｘ８はセリン、チロシン及びアスパラギンから選択され、アミノ酸Ｘ９はアスパラギン酸、アラニン、ヒスチジン及びアスパラギンから選択され、アミノ酸Ｘ１０は、チロシン及びセリンから選択され、アミノ酸Ｘ１１はチロシン、アスパラギン酸及びアスパラギンから選択され；及びＨＶＲ−Ｈ３はアミノ酸配列Ｘ１２ Ｘ１３ Ｘ１４ Ｘ１５ Ｘ１６ Ｘ１７ Ｘ１８ Ｘ１９ Ｘ２０ Ｘ２１ Ａｓｐ（配列番号２６）を含み、ここでアミノ酸Ｘ１２はアルギニン及びリジンから選択され、アミノ酸Ｘ１３はグルタミン酸、グリシン、アスパラギン酸及びプロリンから選択され、アミノ酸Ｘ１４はセリン、イソロイシン、バリン、及びトリプトファンから選択され、アミノ酸Ｘ１５は、トリプトファン、グリシン、チロシン、及びフェニルアラニンから選択され、アミノ酸Ｘ１６はトリプトファン、チロシン、ロイシン、グリシン、及びフェニルアラニンから選択され、アミノ酸Ｘ１７は、セリン、チロシン、フェニルアラニン、及びグリシンから選択され、アミノ酸Ｘ１８は、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、及びグリシンから選択されるか又は存在せず、アミノ酸Ｘ１９は、トリプトファン、グリシン、アラニン、及びチロシンから選択されるか又は存在せず、アミノ酸Ｘ２０はバリンか又は存在せず、かつアミノ酸Ｘ２１はメチオニン及びフェニルアラニンから選択される。
その他の態様において、抗体は、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２から選択される少なくとも一つの配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ１はアミノ酸配列Ｘ２２ Ｘ２３ Ｓｅｒ Ｘ２４ Ｘ２５ Ｘ２６ Ｘ２７ Ｘ２８ Ｘ２９ Ｘ３０ Ｘ３１（配列番号７３）を含み、アミノ酸Ｘ２２はアルギニン及びグリシンから選択され、アミノ酸Ｘ２３はアラニン及びバリンから選択され、アミノ酸Ｘ２４はグルタミン及びヒスチジンから選択され、アミノ酸Ｘ２５はアスパラギン酸、アスパラギン、及びイソロイシンから選択され、アミノ酸Ｘ２６はロイシン及びバリンから選択され、アミノ酸Ｘ２７はセリン、アスパラギン酸、グリシン、及びグルタミン酸から選択され、アミノ酸Ｘ２８はスレオニン及びセリンから選択され、アミノ酸Ｘ２９はアラニン、バリン、及びフェニルアラニンから選択され、アミノ酸Ｘ３０はバリン及びイソロイシンから選択され、アミノ酸Ｘ３１はセリンから選択され、かつＨＶＲ−Ｌ２はアミノ酸配列Ｘ３２ Ｘ３３ Ｘ３４ Ｐｈｅ Ｘ３５ Ｔｙｒ Ｓｅｒ（配列番号７４）を含み、アミノ酸Ｘ３２はセリン及びアスパラギンから選択され、アミノ酸Ｘ３３はグルタミン及びアラニンから選択され、アミノ酸Ｘ３４はグルタミン酸及びセリンから選択され、アミノ酸Ｘ３５はロイシン及びバリン７から選択される。請求項３に記載の抗体は、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つの配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ２はアミノ酸配列Ｘ３６ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｘ３７ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ（配列番号７５）を含み、アミノ酸Ｘ３６はアラニン及びグリシンから選択され、アミノ酸Ｘ３７はアラニン及びアスパラギンから選択され、かつＨＶＲ−Ｈ３はアミノ酸配列Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｘ３８ Ｘ３９ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｔｙｒ（配列番号７６）を含み、アミノ酸Ｘ３８はフェニルアラニン及びチロシンから選択され、アミノ酸Ｘ３９はグリシン及びアスパラギン酸から選択される。
その他の態様において、抗体は配列番号２のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３のＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号４のＨＶＲ−Ｌ３配列をそれぞれ含む。その他の態様において、抗体は、図１ＢのクローンのＡ３、Ａ６、Ａ９、Ｂ５、Ｆ５又はＧ３について明記されたものに対応するＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３配列を含む。その他の態様において、抗体は、図４Ａのクローンの１Ａ１１、１Ｃ１２、１Ｆ１２、２Ａ３、２Ａ６、２Ｄ７、２Ｅ６又は２Ｇ４について明記されたものに対応するＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３配列を含む。その他の態様において、抗体は、図４Ｂのクローンの１Ａ１１、１Ｃ１２、１Ｆ１２、２Ａ３、２Ａ６、２Ｅ６又は２Ｇ４について明記されたものに対応するＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３配列を含む。
その他の態様において、抗体は配列番号２のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３のＨＶＲ−Ｌ２配列、配列番号４のＨＶＲ−Ｌ３配列、配列番号１１のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１７のＨＶＲ−Ｈ２配列、及び配列番号２３のＨＶＲ−Ｈ３配列を含む。その他の態様において、抗体は配列番号５８のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３のＨＶＲ−Ｌ２配列、配列番号４のＨＶＲ−Ｌ３配列、配列番号１１のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１７のＨＶＲ−Ｈ２配列、及び配列番号２３のＨＶＲ−Ｈ３配列を含む。その他の態様において、抗体は配列番号５９のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３のＨＶＲ−Ｌ２配列、配列番号４のＨＶＲ−Ｌ３配列、配列番号１１のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１７のＨＶＲ−Ｈ２配列、及び配列番号２３のＨＶＲ−Ｈ３配列を含む。その他の態様において、抗体は配列番号２のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３のＨＶＲ−Ｌ２配列、配列番号４のＨＶＲ−Ｌ３配列、配列番号１１のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６７のＨＶＲ−Ｈ２配列、及び配列番号２３のＨＶＲ−Ｈ３配列を含む。その他の態様において、抗体は配列番号５８のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３のＨＶＲ−Ｌ２配列、配列番号４のＨＶＲ−Ｌ３配列、配列番号１１のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６７のＨＶＲ−Ｈ２配列、及び配列番号２３のＨＶＲ−Ｈ３配列を含む。その他の態様において、抗体は配列番号５９のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３のＨＶＲ−Ｌ２配列、配列番号４のＨＶＲ−Ｌ３配列、配列番号１１のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６７のＨＶＲ−Ｈ２配列、及び配列番号２３のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む。
その他の態様において、抗体は配列番号５及び配列番号６２−６６から選択される軽鎖アミノ酸配列を含む。その他の態様において、抗体は配列番号２７−３２及び配列番号７０−７２から選択される重鎖アミノ酸配列を含む。
その他の態様において、抗体は、以下の配列の組合わせの一つのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を持つ軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を含む：配列番号５及び配列番号３２；配列番号６３及び配列番号３２；配列番号６５及び配列番号３２；配列番号５及び配列番号７２；配列番号６３及び配列番号７２；及び配列番号６５及び配列番号７２。
その他の実施態様において、本発明は単離された抗体を提供し、ここで抗体は、上記抗体のいずれか１つと同じＫ１１結合型ポリユビキチン上の抗原決定基に特異的に結合し、前記抗体はモノユビキチンには結合しない。その他の実施態様において、本発明は、上記抗体のいずれか１つとポリユビキチンへの結合について競合する単離された抗体を提供し、その抗体はモノユビキチンに特異的には結合しない。その他の実施態様において、本発明は、上記単離された抗体の何れかを提供し、ここで抗体はＫ１１結合型ポリユビキチン化タンパク質に特異的に結合する。その他の実施態様において、本発明は、上記単離された抗体の何れかを提供し、ここで抗体は少なくとも一つのポリユビキチン媒介性シグナル伝達を調節する。
一つの一般的な態様では、上記抗体の何れかは、モノクローナル抗体である。その他の一般的な態様では、上記抗体の何れかは、ヒト抗体である。その他の一般的な態様では、上記抗体の何れかは、ヒト化抗体である。その他の一般的な態様では、上記抗体の何れかは、キメラ抗体である。その他の一般的な態様では、上記抗体の何れかは、Ｋ１１結合型ポリユビキチンに結合する抗体断片である。
その他の実施態様において、本発明は上記抗体の何れかをコードする単離された核酸を提供する。その他の実施態様において、本発明は上記抗体の何れかをコードする単離された核酸を含むベクターを提供する。その他の実施態様において、本発明は上記抗体の何れかをコードする単離された核酸を含む宿主細胞を提供する。その他の実施態様において、本発明は上記抗体の何れかをコードする単離された核酸を含むベクターを含む宿主細胞を提供する。
その他の実施態様において、本発明は、抗体が産生される条件下で上記記載の宿主細胞を培養することを含む、上記抗体の何れかを産生する方法を提供する。一態様において、本方法は、宿主細胞から抗体を回収することを更に含む。その他の態様において、本方法は、抗体の精製を更に含む。
その他の実施態様において、本発明は、上記抗体及び細胞傷害性薬物の何れかを含む、イムノコンジュゲートを提供する。その他の実施態様において、本発明は、上記抗体の何れか及び薬学的に許容可能な担体を含む、薬学的製剤を提供する。一態様において、薬学的製剤は更に付加的な治療剤を含む。一つのそうした態様において、更なる治療薬は、化学療法剤である。
その他の実施態様において、本発明は、医薬として使用のために上記抗体の何れかを提供する。その他の実施態様において、本発明は、細胞周期関連疾患又は障害の治療における使用のために上記抗体の何れかを提供する。一態様において、細胞周期関連疾患又は障害は、細胞周期進行の異常な亢進に関連する疾患又は障害、又は細胞周期進行の異常な低下に関連する疾患又は障害から選択される。一つのそうした態様において、細胞周期進行の異常な亢進に関連する疾患又は障害は癌である。その他のそうした態様において、細胞周期進行の異常な低下に関連する疾患又は障害は、変性筋障害及び変性神経障害から選択される。
その他の実施態様において、本発明は、医薬の製造における上記抗体の何れかの使用を提供する。一態様において、本医薬は、癌、変性筋障害、及び変性神経障害から選択される疾患又は障害に対する。その他の実施態様において、本発明は、上記抗体の何れかの有効量を個体に投与することを含む、癌、変性筋障害、及び変性神経障害から選択される疾患又は障害を有する個体を治療する方法を提供する。
その他の実施態様において、本発明は、ポリユビキチン又はポリユビキチン化タンパク質を含むことが疑われるサンプル中におけるポリユビキチン又はポリユビキチン化タンパク質の存在を決定する方法を提供し、サンプルを上記の抗体の少なくとも一つに曝露し、サンプル中のポリユビキチン又はポリユビキチン化タンパク質に対する少なくとも一の抗体の結合を測定することを含む。その他の実施態様において、本発明は、サンプルを上記抗体の少なくとも一つと接触させることを含む、サンプル中の非Ｋ１１結合型ポリユビキチン化タンパク質からＫ１１結合型ポリユビキチン化タンパク質を分離する方法を提供する。その他の実施態様において、本発明は、細胞又はサンプルを上記抗体の少なくとも一つと接触させ、細胞又はサンプル上で該接触工程の影響を評価することを含む、細胞又はサンプル中でのＫ１１結合型ポリユビキチンの機能及び／又は活性を決定する方法を提供する。
図１Ａ及び１Ｂは実施例１で得られたＦａｂの軽鎖と重鎖のアミノ酸配列を示す。図１Ａは、ＶＨライブラリーのナイーブ種から単離されたクローンの軽鎖配列番号４のを示す。ライブラリーの設計に起因して、軽鎖の配列は全ての取得されたクローンにおいて同一であった。図１Ｂは、ナイーブなＶＨライブラリー種から単離されたクローンの重鎖配列アラインメントを示す。選別の第三及び第四ラウンドの両方から同定された同胞種クローンの数は、各クローンで同じである。図１Ａ及び１Ｂの両方において、各クローンのＨＶＲ配列は、ボックス化領域で示され、第一のボックスがＨＶＲ−Ｌ１（図１Ａ）又はＨＶＲ−Ｈ１（図１Ｂ）を示し、第二のボックスがＨＶＲ−Ｌ２（図１Ａ）又はＨＶＲ−Ｈ２（図１Ｂ）を示し、第三のボックスがＨＶＲ−Ｌ３（図１Ａ）又はＨＶＲ−Ｈ３（図１Ｂ）を示す。 図２は、ファージスポットＥＬＩＳＡを示し、実施例１に記載のように、各取得クローンについて、波長４５０ｎｍにおける、ユビキチンタンパク質のパネルに対する相対的な結合シグナルを示している。Ｆａｂライブラリークローンの各々はｇＤタグを含んでおり、ファージ上のＦａｂの提示は抗ｇＤ抗体への結合により評価された。コーティングされていないウェルを陰性コントロールとして用いた。 図３Ａ−３Ｃは、実施例１に記載のように、精製されたＧ３のＦａｂの結合特性を示す。図３Ａは、ＥＬＩＳＡにおいて、異なる濃度の精製されたＧ３ Ｆａｂの、ユビキチンタンパク質のパネルへの結合能を評価する実験結果を示す。図３Ｂは、Ｋ１１結合ジユビキチンに対する精製Ｇ３ Ｆａｂの親和性を測定するＩＣ５０競合ＥＬＩＳＡの結果を示す。図３Ｃは、固定化された状況におけるユビキチンタンパク質のパネルを特異的に認識するＧ３ Ｆａｂの能力を決定するためのウエスタンブロット解析の結果を示す。クマシー染色したゲルは、各サンプルの移動度を示す。 図４Ａ及び４Ｂは実施例２で得られた親和性成熟クローンの軽鎖と重鎖のアミノ酸配列を示す。図４Ａは、親和性成熟クローンの軽鎖配列を示す。図４Ｂは、親和性成熟クローンの重鎖配列アラインメントを示す。選別の第四ラウンドから同定された同胞種クローンの数は、各クローンで同じである。図４Ａ及び４Ｂの両方において、各クローンのＨＶＲ配列は、ボックス化領域で示され、第一のボックスがＨＶＲ−Ｌ１（図４Ａ）又はＨＶＲ−Ｈ１（図４Ｂ）を示し、第二のボックスがＨＶＲ−Ｌ２（図４Ａ）又はＨＶＲ−Ｈ２（図４Ｂ）を示し、第三のボックスがＨＶＲ−Ｌ３（図４Ａ）又はＨＶＲ−Ｈ３（図４Ｂ）を示す。Ｇ３親配列に対するアミノ酸の変化は灰色で強調表示される。 図５Ａ−５Ｂは、実施例２Ｅに記載のように、親Ｇ３クローン、及びファージ上に提示された８つの親和性成熟変位体の、ユビキチンタンパク質のパネルに対する結合について評価するため行われたＥＬＩＳＡ実験の結果を示す。 図６Ａ及び６Ｂは実施例２で得られたハイブリッドクローンの軽鎖と重鎖のアミノ酸配列を示す。図６Ａは、ハイブリッドクローンの軽鎖配列を示す。図６Ｂは、ハイブリッドクローンの重鎖配列アラインメントを示す。図６Ａ及び６Ｂの両方において、各クローンのＨＶＲ配列は、ボックス化領域で示され、第一のボックスがＨＶＲ−Ｌ１（図６Ａ）又はＨＶＲ−Ｈ１（図６Ｂ）を示し、第二のボックスがＨＶＲ−Ｌ２（図６Ａ）又はＨＶＲ−Ｈ２（図６Ｂ）を示し、第三のボックスがＨＶＲ−Ｌ３（図６Ａ）又はＨＶＲ−Ｈ３（図６Ｂ）を示す。Ｇ３親配列に対するアミノ酸の変化は灰色で強調表示される。 図７Ａ−７Ｄは、実施例３に記載のように、親Ｇ３クローン及びコントロールに比較して、ハイブリッドＩｇＧの結合特性を評価する研究結果を示す。図７Ａは、４Ｍの尿素中にて、Ｇ３、１Ｃ１２／２Ｅ６ＩｇＧ及び２Ａ３／２Ｅ６ ＩｇＧのユビキチンタンパク質のパネルに対する結合を示す。図７Ｂは、Ｋ１１結合ジユビキチンの２倍段階希釈（勾配が示されるところでは、１０００、５００、２５０、１２５、６３、３１、及び１６ｎｇ／レーン）、又はモノユビキチン、直鎖ジユビキチン、Ｋ４８結合ジユビキチン、及びＫ６３結合ジユビキチン（１μｇ／レーン）に対する、Ｇ３、１Ｃ１２／２Ｅ６ ＩｇＧ、又は２Ａ３／２Ｅ６ ＩｇＧの結合のウエスタンブロット解析を与える。クマシー染色ゲル（左上パネル）は、試験されたユビキチンの各々がゲル中を移動する場所の指示を与える。図７Ｃは、モノユビキチン、Ｋ４８結合型ポリユビキチン２−７（長さが２から７のユビキチンサブユニット）、Ｋ６３結合型ポリユビキチン２−７（長さが２から７のユビキチンサブユニット）、及びＫ１１結合型ポリユビキチン（レーンあたり各々１μｇ）が、パンユビキチン抗体Ｐ４Ｄ１（中央パネル）又は２Ａ３／２Ｅ６ ＩｇＧ（右パネル）でイムノブロットされた実験結果を示す。クマシー染色は、サンプルの組成を明らかにした（左パネル）。図７Ｄは、Ｋ１１結合ジユビキチン（５０ｎｇ／レーン）、Ｋ４８結合ジユビキチン（１μｇ／レーン）、Ｋ６８結合ジユビキチン（１μｇ／レーン）、ヒト２９３Ｔ細胞からの全細胞溶解物（１００μｇ／レーン）、及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが、２Ａ３／２Ｅ６ ＩｇＧでイムノブロットされた実験結果を示す（右パネル）。クマシー染色は、サンプルの組成を明らかにした（左パネル）。 図８Ａ−８Ｅは、ハイブリッド抗体２Ａ３／２Ｅ６の、インビトロのユビキチン化反応からのＫ１１結合型ポリユビキチン化タンパク質を特異的に認識し、及び／又は免疫沈降させる能力を試験する実験の結果を示す。図８Ａは、ＭｕＲＦ１の自己ユビキチン化後に、パンユビキチン抗体Ｐ４Ｄ１で行ったウエスタンブロットを与える。Ｅ１（Ｕｂｅ１）酵素、Ｅ２（ＵｂｃＨ５ｃ）酵素、及びＥ３（ＭｕＲＦ１）酵素の添加によりＭｕＲＦ１上でモノユビキチンのポリユビキチンへの変換を生じた（ＭｕＲＦ１−Ｕｂ（ｎ））。図８Ｂは、免疫沈降アッセイの結果を示し、そこでは野生型ユビキチンにより行われたＭｕＲＦ１自己ユビキチン化アッセイが、様々な濃度の尿素の存在下で、２Ａ３／２Ｅ６ ＩｇＧによる免疫沈降のための基質として用いられた、インプット（ｉｎｐｕｔ）反応並びに免疫沈降された物質は、パンユビキチン抗体（Ｐ４Ｄ１）を用いたウェスタンブロットにより検出された。図８Ｃは、Ｋ１１Ｒユビキチンが野生型ユビキチンの代わりに使用されたのを除いて、図８Ｂに示されているものと全く同じように行った実験のイムノブロットの結果を示している。図８Ｄは、２Ａ３／２Ｅ６抗体（Ｋ１１）又はアイソタイプコントロール抗体のいずれかを用いて免疫沈降し、ウエスタン解析に供されたＷＴ、Ｋ１１Ｒ、Ｋ４８Ｒ、及びＫ６３Ｒユビキチンを用いてインビトロで行ったＭｕＲＦ１自己ユビキチン化反応から得られたウェスタンブロットを示している。括弧内の数字は、（Ｅ）のゲルとカラムで関連するレーンを示す。自己ユビキチン化反応（レーン１，４，７、及び１０にインプット）及び免疫沈降（レーン２、３、５、６、８、９、１１、及び１２）は、パンユビキチン抗体でイムノブロットした。白い線は、ウェスタンブロットによって導かれた、質量分析ＡＱＵＡ解析のために切り取られたクマシー染色ゲルの領域を示す。図８Ｅは、図８Ｄに示されたゲルの領域での質量分析ＡＱＵＡ解析の結果を示す。各サンプルで測定されたＫ１１結合、Ｋ４８結合、及びＫ６３結合の量が示されている。それぞれの場合において、無視できる量のユビキチン結合が、アイソタイプコントロール抗体を用いた免疫沈降で検出された。 図９Ａ−９Ｄは、ハイブリッド抗体２Ａ３／２Ｅ６の、細胞溶解物からのＫ１１結合型ポリユビキチン化タンパク質を特異的に認識し、及び／又は免疫沈降させる能力を試験する実験の結果を示す。図９Ａは、実験の設計と、擬似トランスフェクトされたか、又はＷＴ又はＫ０ユビキチンを過剰発現するプラスミドでトランスフェクトされ、２Ａ３／２Ｅ６抗体（Ｋ１１）又はアイソタイプコントロール抗体のどちらかにより免疫沈降された、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの細胞溶解物で行われた、免疫沈降のウエスタンブロットの結果を示す。括弧内の数字は、図９Ｂのゲルとカラムで関連するレーンを示す。全細胞溶解物（インプット、レーン１、４、及び７）及び免疫沈降（レーン２、３、５、６、８、及び９）は、パンユビキチン抗体でイムノブロットした。白い線は、ウェスタンブロットによって導かれた、質量分析ＡＱＵＡ解析のために切り取られたクマシー染色ゲルの領域を示す。図９Ｂは、図９Ａに示すウェスタンブロットのクマシー染色された同等のゲルを示す。クマシー染色ゲルの領域Ａ及びＢは、インプット及び免疫沈降のために切り出された。番号付けは、図９Ａにそれと対応している。図９Ｃは、図９Ａ及び９Ｂに示されたゲルの領域で行われた質量分光分析の結果を示す。各サンプルで測定されたＫ１１結合、Ｋ４８結合、及びＫ６３結合の量が示されている。それぞれの場合において、無視できる量のユビキチン結合が、アイソタイプコントロール抗体を用いた免疫沈降で検出された。図９Ｄは、インプット及び免疫沈降（抗Ｋ１１）で測定された全ユビキチン結合の中でのＫ１１結合の割合を比較し、ハイブリッド抗Ｋ１１結合特異的抗体によるＫ１１結合の濃縮を実証しているグラフを与える。
本発明の実施態様の詳細な記述
Ｉ．定義
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含み得る。幾つかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、Ｖはヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に、配列が同一である。
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例示であって典型的な実施態様は、以下で説明される。
「親和性成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、その一又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）において一又は複数の改変を持つものである。
本明細書中で用いる「アゴニスト抗体」は、対象のポリペプチドの機能的な活性の少なくとも一つを部分的ないし完全に模倣する抗体である。
「アンタゴニスト抗体」又は「阻止（ブロック）抗体」は、特異的に結合する抗原の生物学的活性を阻害するか又は低下させる抗体である。特定の阻止抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を、実質的に又は完全に阻害する。
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原を結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
参照抗体として「同一のエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて５０％以上、参照抗体のその抗原への結合をブロックする抗体、逆に競合アッセイにおいて５０％以上、その抗体のその抗原への結合をブロックするその参照抗体を指す。典型的な競合アッセイは、本明細書で提供される。
用語「抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体」及び「Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体に特異的に結合する抗体」は、抗体が、Ｋ１１結合型ポリユビキチンを標的とする診断薬剤及び／又は治療的薬剤として有用であるように十分な親和性でＫ１１結合型ポリユビキチンに結合することができる抗体を言う。一実施態様において、抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体の、無関係な非Ｋ１１結合型ポリユビキチンタンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体のＫ１１結合型ポリユビキチンへの結合の約１０％未満である。所定の実施態様において、Ｋ１１結合型ポリユビキチンへ結合する抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）。所定の実施態様において、抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体は、異なる種由来のＫ１１結合型ポリユビキチン間で保存されているＫ１１結合型ポリユビキチンのエピトープに結合する。
本明細書で使用される場合、「抗ポリユビキチン抗体」は、ポリユビキチン分子に特異的に結合することができる抗体を言う。
本明細書で使用される場合、「抗ユビキチン抗体」及び「抗モノユビキチン抗体」は同義的に使用され、ユビキチン分子に特異的に結合可能な抗体を指す。
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種から由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りは異なる起源又は種から由来する抗体を指す。
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラスがあり：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、及びこれらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２に、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
本明細書で用いられる「細胞傷害性薬物」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。細胞傷害性薬物は、限定されないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）：化学療法剤又は薬物（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤）、成長阻害剤、酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素など、抗生物質、小分子毒素などの毒素、又は細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又はその変異体を含む）、及び以下に開示される様々な抗腫瘍剤又は抗癌剤を包含する。
「障害」は本発明の抗体による治療から利益を得る任意の状態である。これには、哺乳動物に問題の疾患に罹らせる病的状態を含む慢性及び急性の障害又は疾患が含まれる。本明細書において治療されるべき障害の非限定的な例は、癌、及び、限定しないが、変性筋障害及び変性神経障害を含む発育不全障害が含まれる。
「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）、貪食、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞の活性化を含む。
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。
用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸長する。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しているか、存在していない場合がある。本明細書に明記されていない限り、Fc領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメイン、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４で構成される。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異子孫が本明細書に含まれる。
「ヒト抗体」は、ヒトまたはヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリーや他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般的には、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3にあるサブグループである。一実施態様において、ＶＬについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループカッパＩである。一実施態様において、ＶＨについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループＩＩＩである。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来アミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。所定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、全てまたは実質的にＦＲの全てが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げている抗体を指す。
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの６つのＨＶＲＳを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性であり、及び／又は抗原認識に関与している。典型的な超可変ループはアミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる。（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。典型的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２に生じる。（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。ＶＨのＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」を含む。ＳＤＲは、略称（ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ−）ＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれる、ＣＤＲの領域内に含まれている。典型的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２に生じる。（Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照のこと）特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上掲のＫａｂａｔらに従い、本明細書において番号が付けられる。
「イムノコンジュゲート」は、１つ以上の異種分子にコンジュゲートした抗体であり、限定されないが、細胞傷害性薬物を含む。
「個体」又は「被検体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。所定の実施態様において、個体又は被検体はヒトである。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように、９５％以上または９９％の純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばFlatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
「単離された」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、しかし、その核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
「抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖および軽鎖（又はその断片）をコードする一つ以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内のそのような核酸分子、及び宿主細胞の一以上の位置に存在するそのような核酸分子を含む。
本明細書において使用する用語「Ｋ＊結合型ポリユビキチン」及び「Ｌｙｓ＊結合型ポリユビキチン」は互換可能であり、１のユビキチン部分のＣ末端と別のユビキチン部分の位置＊のリジンの間に少なくとも１のイソペプチド結合を含むポリユビキチン分子を指す。例えば、「Ｋ１１結合型ポリユビキチン」は、「Ｌｙｓ１１結合型ポリユビキチン」と互換可能に使用され、これらの用語はいずれも、分子中のユビキチン部分の一方のＣ末端と、他方のユビキチン部分の位置１１のリジンの間にイソペプチド結合を含むポリユビキチン分子を指す。
本明細書において使用する、第１リジン結合が第２リジン結合と「異なる」という表現は、１のユビキチン部分と別のユビキチン部分の間の第１リジン結合が、１のユビキチン部分と別のユビキチン部分の間の第２リジン結合とは異なるリジン残基（例えば、Ｋ６、Ｋ１１、Ｋ２７、Ｋ２９、Ｋ３３、Ｋ４８、及び／又はＫ６３）を含むことを示唆する。
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる変異を含み、又はモノクローナル抗体製剤の製造時に発生し、一般的に少量で存在している変異体などの、可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び/又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を一般的に含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作成され、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
「ネイキッド抗体」とは、異種の部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は薬学的製剤中に存在してもよい。
「天然型抗体」は、天然に生じる様々な構造をとる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から成る約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。
用語「パッケージ挿入物」は、効能、用法、用量、投与、併用療法、禁忌についての情報、及び／又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含まれている指示書を指すために使用される。
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって生成される。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２もまた、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して所定の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一と一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値が、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したように、得られる。
用語「薬学的製剤」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」は、被検体に非毒性であり、有効成分以外の製剤処方中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。
本明細書において使用する「ポリユビキチン」という用語は、ユビキチンの異なる重合体結合のヒト及び合成クラスに含まれる天然ヒト及び合成のユビキチン重合体鎖として定義され、それらには、限定されるものではないが、Ｋ６結合型ポリユビキチン、Ｋ１１結合型ポリユビキチン、Ｋ２７結合型ポリユビキチン、Ｋ２９結合型ポリユビキチン、Ｋ３３結合型ポリユビキチン、Ｋ４８結合型ポリユビキチン及びＫ６３結合型ポリユビキチンが含まれる。ポリユビキチンは、どのような長さを有してもよく、少なくとも２のユビキチン部分を含む。ポリユビキチンは、元来一本鎖タンパク質として発現されるユビキチンのタンデムリピートとは区別される。
本明細書で用いられるように、「治療」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」または 「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など文法上の変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理の過程においてのいずれかで実行できる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
本明細書で使用する用語「ユビキチン」及び「モノユビキチン」は互換可能に使用され、特に断らない限り、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型ユビキチンを指す。その用語は「全長」の未処理のユビキチン並びに、複数のユビキチン部分を含む分子を除いて、細胞中でのプロセシングから生じた任意の短縮型か又は翻訳後修飾型のユビキチンを網羅する。その用語はまた、天然に存在するユビキチンの変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。典型的なヒトユビキチンのアミノ酸配列は、配列番号１に示される。ＭＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＰＳＤＴＩＥＮＶＫＡＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＦＡ ＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＨＬＶＬＲＬＲＧＧ（配列番号１）。ユビキチンは、アミノ酸６、アミノ酸１１、アミノ酸２７、アミノ酸２９、アミノ酸３３、アミノ酸４８、及び／又はアミノ酸６３（上記配列番号１に太字で記載）に、少なくとも１のリジンを有する。
本明細書において使用する、「ユビキチン経路」という用語は、ユビキチン及び／又はポリユビキチンを含む細胞又は再構成されたインビトロ中の生化学的経路を指す。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の可変重鎖ドメイン及び軽鎖（それぞれＶＨおよびＶＬ）は、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各ドメインを持ち、一般的に似たような構造を有する。(例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照)。単一のＶＨ又はＶＬドメインが、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのそれぞれのライブラリーをスクリーニングするために抗原を特異的に結合する抗体由来のＶＨ又はＶＬドメインを用いて単離することができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照。
本明細書で使用される、用語「ベクター」は、それがリンクされている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なようにリンクされている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。
ＩＩ．組成物及び方法
一態様において、本発明は、第一のポリユビキチン結合を含む第一のポリユビキチン分子を特異的に認識することができるが、第二のポリユビキチン結合を含む第二のポリユビキチン分子は特異的に認識できない抗体の作成に一部が基づく。所定の実施態様において、Ｋ１１結合型ポリユビキチンに特異的に結合する抗体が提供される。本発明の抗体は、研究、及び、例えば、異常な細胞周期進行に関連する疾患及び障害の診断又は治療の両方において有用である。
本発明の抗Ｋ１１結合型ポリユビキチンの固有の特性は、面倒で高価な遺伝子操作や、質量分析などの生物物理学的手法に頼ることなしに、細胞系のポリユビキチンの異なるリジン結合型の区別に、それらを特に有用にしている。本発明の抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体は、特異的Ｋ１１結合型ポリユビキチンの機能と活性を、インビトロ及びインビボの両方で、特徴付けするために使用することができる。本発明の抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体はまた、疾患の発症及び病態における特異的Ｋ１１結合型ポリユビキチンの役割を決めることに使用することができる。本発明の抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体は、一以上の特異的リジン結合型ポリユビキチンが、抗ポリユビキチン抗体が特異的でないポリユビキチンの正常な活性に干渉することなしに、異常に制御されるか又は異常に機能している、疾患を治療するために更に使用することができる。
後期促進複合体、ＡＰＣ／Ｃは、有糸分裂時に合成されたＫ１１結合型ポリユビキチン鎖の大部分に関与するＥ３リガーゼをユビキチン化するとして作用することが知られている。特に、サイクリン、ジェミニン（ｇｅｍｉｎｉｎ）及びＰｌｋ１などの有糸分裂タンパク質のＡＰＣ／Ｃ媒介性Ｋ１１結合型ポリユビキチン化は、プロテアソームによるそれらの標識されたタンパク質のその後の分解をもたらす。内因性ユビキチンが、位置１１のリジンがアルギニンに変更され、よってリジン結合に用いることができないように変異される場合、得られた変異細胞は、重要な有糸分裂タンパク質の分解及び細胞周期停止の異常な欠如を示す。アフリカツメガエルでは、この突然変異は、原腸形成の前に胚の死をもたらす。Ｋ１１結合型ポリユビキチン標識の存在及び接近性は、それゆえ、正常な細胞周期の進行に重要な役割を果たし、本発明の抗体及びＦａｂは、細胞周期の制御が異常である障害及び疾患の調節のための有用な治療的手段を提供する。一実施態様において、本発明の抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体は、細胞周期の進行が異常に上方制御され、癌などの非常に多くの細胞分裂を生じる疾患及び障害を治療するために用いられる。その他の実施態様において、本発明の抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体は、細胞周期の進行が異常に下方制御され、細胞分裂が不足して、付随する組織の萎縮又は破壊を生じる疾患及び障害を治療するために用いられる。そのような疾患の例は、限定されないが、変性筋障害、変性神経障害（シャルコーマリートゥース症候群、急性灰白髄炎、筋萎縮性側索硬化症、及びギラン・バレー症候群を含むがこれらに限定されない）を含む。
本明細書に使用される用語「細胞増殖性障害」及び「増殖性疾患」は、異常な細胞増殖のある程度関連付けられている障害を言う。一実施態様において、細胞増殖性疾患は癌である。
用語 「癌」及び「癌性」は、無秩序な細胞成長/細胞増殖を典型的に特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を言う。癌の例には、限定されないが、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、及び白血病を含む。そのような癌のより具体的な例は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化器癌、虫垂癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜、子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、白血病、及びその他のリンパ増殖性疾患、及び様々な型の頭頸部癌を包含する。
本明細書で用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての新生細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性の細胞及び組織を意味する。「癌」、「癌性」、「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」という用語はここで意味するように相互排他的ではない。
用語「変性筋障害」は、正常な筋肉の機能が低下した骨格筋及び／又は平滑筋の増悪又は衰弱により典型的に特徴付けられた、筋肉含有動物の生理的状態を指すか又は記述する。変性筋疾患の例としては、限定されないが、筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、先天性筋強直症、悪液質、サルコペニア、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アイザック症候群、全身硬直症候群、家族性周期性四肢麻痺、ミオパチー、ミオトニア、横紋筋融解、筋萎縮、及び様々なタイプの筋力低下及び筋肉硬直が含まれる。
用語「変性神経障害」は、神経組織の変質又は神経組織における細胞間のコミュニケーションの悪化によって特徴づけられる。神経含有動物の生理的状態を指すか又は記述する。変性神経障害の例は、限定されないが、神経変性疾患（レビー小体病、ポリオ後症候群 、シャイ・ドレーゲル症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、パーキンソン病、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、ギラン・バレー症候群、シャルコー・マリー・トゥース症候群、線条体黒質変性症、及びタウオパシー、プリオン病、球麻痺、運動ニューロン疾患、認知症、により引き起こされるか又は関連する神経細胞/組織破壊、及び神経系ヘテロ変性障害（限定されないが、カナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチン症、アレキサンダー病、トゥレット症候群、メンケス症候群、コケーン症候群、ハレルフォルデン‐スパッツ症候群、ラフォラ病、レット症候群、肝レンズ核変性症、レッシュ・ナイハン症候群、及びウンフェルリヒト・ルントボルグ病を含む）を含む。
その他の態様において、本発明の抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体は、細胞集団及び与えられた細胞内のポリユビキチン密度と分布の決定、及びポリユビキチンの存在又は量に基づく細胞選別を含む、様々な種類の細胞や組織におけるユビキチンの検出など、Ｋ１１結合型ポリユビキチンの検出と単離のための試薬としての用途を見いだしている。その他の更なる態様において、本抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体は、本発明の対象抗体のものと似た遮断活性様式を持つポリユビキチンアンタゴニストの開発に有用である。更なる例として、本発明の抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体は、本明細書に例示された抗体と実質的に同じポリユビキチンの抗原決定基（線形及び立体構造型エピトープを含む）に結合する他の抗ポリユビキチン抗体の同定に使用可能である。
本発明の抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体は、ポリユビキチンがＫ１１結合型ポリユビキチン機能の小分子アンタゴニストをスクリーニングすることに関与している、生理学的経路に基づくアッセイで使用することができる。例えば、Ｋ１１結合型ポリユビキチン鎖は、後期を通じて正常な細胞周期の進行のために必要であることが知られているので（ＣＩＴＥ）、抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体の、処置された細胞又は組織における細胞周期の進行を調節（上方制御又は下方制御）する活性は、細胞周期進行の調節におけるＫ１１結合型ポリユビキチンの１つ又は複数の潜在的小分子アンタゴニストの活性と比較することができる。
Ａ．典型的な抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体
一態様において、本発明はＫ１１結合型ポリユビキチンに結合する単離された抗体を提供する。所定の実施態様において、抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体は、特異的にＫ１１結合型ポリユビキチンに結合するが、モノユビキチンには特異的に結合しない。所定の実施態様において、抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体は、Ｋ１１結合型ポリユビキチンに特異的に結合するが、他のリジン結合（すなわち、Ｋ６結合、Ｋ２７結合、Ｋ２９結合、Ｋ３３結合、Ｋ４８結合、及び／又はＫ６３結合）の何れかを有するポリユビキチンには特異的に結合しない。
一態様において、本発明は、配列番号６−１１及び２４の少なくとも一の配列を含むＨＶＲーＨ１領域を含む、抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体を提供する。一態様において、本発明は、配列番号１２−１７及び２５、６７、及び７５の少なくとも一の配列を含むＨＶＲーＨ２領域を含む抗体を提供する。一態様において、本発明は、配列番号１８−２３及び２６，６８、６９，及び７６の少なくとも一の配列を含むＨＶＲーＨ３領域を含む抗体を提供する。
一態様において、本発明は、配列番号６−１１及び２４の少なくとも一の配列を含むＨＶＲーＨ１領域、及び配列番号１２−１７及び２５、６７、及び７５の少なくとも一の配列を含むＨＶＲーＨ２領域を含む抗体を提供する。一態様において、本発明は、配列番号６−１１及び２４の少なくとも一の配列を含むＨＶＲーＨ１領域、及び配列番号１８−２３及び２６，６８、６９，及び７６の少なくとも一の配列を含むＨＶＲーＨ３領域を含む抗体を提供する。一態様において、本発明は、配列番号１２−１７、２５、６７、及び７５の少なくとも一の配列を含むＨＶＲーＨ２領域、及び配列番号１８−２３及び２６、６８、６９，及び７６の少なくとも一の配列を含むＨＶＲーＨ３領域を含む抗体を提供する。
一態様において、本発明は、配列番号２、５７−６０、及び７３の少なくとも一の配列を含むＨＶＲーＬ１領域を含む抗体を提供する。一態様において、本発明は、配列番号３、６１、及び７４の少なくとも一の配列を含むＨＶＲーＬ２領域を含む抗体を提供する。一態様において、本発明は、配列番号４の配列を含むＨＶＲーＬ３領域を含む抗体を提供する。
一態様において、本発明は、配列番号２、５７−６０、及び７３の少なくとも一の配列を含むＨＶＲーＬ１領域、及び配列番号３、６１、及び７４の少なくとも一の配列を含むＨＶＲーＬ２領域を含む抗体を提供する。一態様において、本発明は、配列番号２、５７−６０、及び７３の少なくとも一の配列を含むＨＶＲーＬ１領域、及び配列番号４のＨＶＲーＬ３配列を含む抗体を提供する。一態様において、本発明は、配列番号３、６１、及び７４の少なくとも一の配列を含むＨＶＲーＬ２領域、及び配列番号４のＨＶＲーＬ３配列を含む抗体を提供する。
一態様において、本発明は、以下の少なくとも一、少なくとも二、少なくとも三、少なくとも四、少なくとも五、又は六つ全てを含む抗体を提供する：
（ｉ）配列番号６−１１、及び２４の少なくとも一の配列を含むＨＶＲ−Ｈ１配列；
（ｉｉ）配列番号１２−１７、２５、６７、及び７５の少なくとも一の配列を含むＨＶＲ−Ｈ２配列；
（ｉｉｉ）配列番号１８−２３、２６、６８、６９、及び７６の少なくとも一の配列を含むＨＶＲ−Ｈ３配列；
（ｉｖ）配列番号２、５７−６０、及び７３の少なくとも一の配列を含むＨＶＲ−Ｌ１配列；
（ｖ）配列番号３、６１、及び７４の少なくとも一の配列を含むＨＶＲ−Ｌ２配列；及び
（ｖｉ）配列番号４のＨＶＲ−Ｌ３配列。
一態様において、本発明はＫ１１結合型ポリユビキチンに高い親和性で特異的に結合するが、他のリジン結合ポリユビキチンには実質的に低下した親和性で結合し、以下の少なくとも一、少なくとも二、少なくとも三、少なくとも四、少なくとも五、又は六つ全てを含む抗体を提供する。
（ｉ）配列番号６−１１、及び２４の少なくとも一の配列を含むＨＶＲ−Ｈ１配列；
（ｉｉ）配列番号１２−１７、２５、６７、及び７５の少なくとも一の配列を含むＨＶＲ−Ｈ２配列；
（ｉｉｉ）配列番号１８−２３、２６、６８、６９、及び７６の少なくとも一の配列を含むＨＶＲ−Ｈ３配列；
（ｉｖ）配列番号２、５７−６０、及び７３の少なくとも一の配列を含むＨＶＲ−Ｌ１配列；
（ｖ）配列番号３、６１、及び７４の少なくとも一の配列を含むＨＶＲ−Ｌ２配列；及び
（ｖｉ）配列番号４のＨＶＲ−Ｌ３配列。
一態様において、本発明は図１Ｂ、４Ｂ又は６Ｂに記載の重鎖ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、本発明は図１Ａ、４Ａ又は６Ａに記載の軽鎖ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、抗体は、図１Ｂ、４Ｂ又は６Ｂに記載の重鎖ＨＶＲ配列、及び図１Ａ、４Ａ又は６Ａに記載の軽鎖ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。
本発明の抗体の幾つかの実施態様は、以下の配列番号７９に記載されるように、ヒト化４Ｄ５抗体（ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８）（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）（また、米国特許第６４０７２１３号及びLee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93の中で言及される)の軽鎖可変ドメインを含む。
一実施態様において、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８軽鎖可変ドメイン配列は、位置２８、３０、３１、５３、６６，及び９１（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ，及びＨｉｓ（それぞれ上記に太字／イタリック体で示される））の一以上で改変されている。一実施態様において、改変されたｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８配列は、位置２８にＳｅｒ、位置３０にＳｅｒ、位置３１にＳｅｒ、位置５３にＳｅｒ、位置６６にＧｌｙ、及び／又は位置９１にＳｅｒを含む。従って、一実施態様において、本発明の抗体は、以下の配列番号８０に記載される配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８に関して置換された残基は上記に太字／イタリック体で示される。
本発明の抗体は、Ｋ１１結合型ポリユビキチンへの結合活性が保持されているという条件で、任意の適切なフレームワーク可変ドメイン配列を含むことができる。例えば、幾つかの実施態様において、本発明の抗体はヒトサブグループＩＩＩの重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。これらの抗体の一実施態様において、フレームワークコンセンサス配列は、位置７１、７３、及び／又は７８に置換を含む。これらの抗体の幾つかの実施態様において、位置７１はＡ、７３はＴ及び／又は７８はＡである。一実施態様において、これらの抗体は、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）（また、米国特許第６４０７２１３号及び第５８２１３３７号、及びLee et al., J. Mol. Biol. (2004)の中に言及される）の重鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む。一実施態様において、これらの抗体は、ヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。一実施態様において、これらの抗体は配列番号２−４、５７−６１、７３及び７４の軽鎖ＨＶＲ配列の少なくとも一、二、又は全てを含む。一実施態様において、これらの抗体は、米国特許第６４０７２１３号及び第５８２１３３７号に記載のｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８の軽鎖ＨＶＲ配列を含む。一実施態様において、これらの抗体はｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（配列番号７８３及び７８４）（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）（また、米国特許第６４０７２１３号及び第５８２１３３７号、及びLee et al., J. Mol. Biol. (2004)の中に言及される）の軽鎖可変ドメイン配列を含む。
一実施態様において、本発明の抗体は、所望の標的結合親和性を得るために親和性成熟している。一例において、Ｋ１１結合型ポリユビキチンに高い親和性で特異的に結合するが、他の（Ｋ１１でない）リジン結合ポリユビキチンには実質的に低下した親和性で結合する本発明の親和性成熟抗体は、ＨＶＲ−Ｈ２のアミノ酸位置６０及び６３に置換を含む。その他の例において、Ｋ１１結合型ポリユビキチンに高い親和性で特異的に結合するが、他の（Ｋ１１でない）リジン結合ポリユビキチンには実質的に低下した親和性で結合する本発明の親和性成熟抗体は、ＨＶＲ−Ｈ３のアミノ酸位置９８及び９９に置換を含む。その他の例において、Ｋ１１結合型ポリユビキチンに高い親和性で特異的に結合するが、他の（Ｋ１１でない）リジン結合ポリユビキチンには実質的に低下した親和性で結合する本発明の親和性成熟抗体は、ＨＶＲ−Ｌ１のアミノ酸位置２４、２５、２７、及び２８−３４に置換を含む。その他の例において、Ｋ１１結合型ポリユビキチンに高い親和性で特異的に結合するが、他の（Ｋ１１でない）リジン結合ポリユビキチンには実質的に低下した親和性で結合する本発明の親和性成熟抗体は、ＨＶＲ−Ｌ２のアミノ酸位置５０-５２及び５４に置換を含む。
一実施態様において、本発明の抗体は、配列番号２７−３２及び７０−７２の少なくとも一の重鎖可変ドメイン配列を含む。一実施態様において、本発明の抗体は、配列番号５及び６２−６６の少なくとも一の軽鎖可変ドメインを含む。一実施態様において、本発明の抗体は、配列番号２７−３２及び７０−７２の少なくとも一つの配列を含む重鎖可変ドメインを含み、また配列番号５及び６２−６６の少なくとも一つの配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。他の実施態様において、特定のクローン番号に対応する本発明の抗体は、図１Ｂ、４Ｂ又は６Ｂにそのクローン番号について記載されるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変ドメインを含む。他の実施態様において、特定のクローン番号に対応する本発明の抗体は、図１Ａ、４Ａ又は６Ａにそのクローン番号について記載されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。他の実施態様において、特定のクローン番号に対応する本発明の抗体は、図１Ｂ、４Ｂ又は６Ｂにそのクローン番号について記載されるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変ドメインを含み、また図１Ａ、４Ａ又は６Ａにそのクローン番号について記載されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
一態様において、本発明は、上記抗体の何れかとＫ１１結合型ポリユビキチンへの結合について競合する抗体を提供する。一態様において、本発明は、上記抗体の何れかと同じＫ１１結合型ポリユビキチン上の抗原決定基に結合する抗体を提供する。
本明細書に示すように、本発明の抗体は、特定のリジン結合を有する単離されたポリユビキチンに結合する。本明細書に示すように、本発明の抗体はまた、特定のリジン結合を有するポリユビキチンに対し、そのポリユビキチンが異種タンパク質に付着している場合、特異的に結合する。
上記実施態様の何れかにおいて、抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体はヒト化されている。一実施態様において、抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体は、上記実施態様の何れかにおけるＨＶＲを含み、更に、アクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。その他の実施態様において、抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体は、上記実施態様の何れかにおけるＨＶＲを含み、更に、配列番号２７−３２、及び７０−７２の何れかのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、又はＦＲ４配列を含むＶＨを含む。その他の実施態様において、抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体は、上記実施態様の何れかにおけるＨＶＲを含み、更に、配列番号５及び６２−６６の何れかのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、又はＦＲ４配列を含むＶＬを含む。
その他の態様において、抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体は、配列番号２７−３２、及び７０−７２の何れかのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。所定の実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体は、Ｋ１１結合型ポリユビキチンへ結合する能力を保持する。所定の実施態様において、配列番号２７−３２及び７０−７２の何れか一において合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。所定の実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体は、配列番号２７−３２及び７０−７２の何れかのＶＨ配列を、その配列の翻訳後修飾を含み、含む。
その他の態様において、抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体は、配列番号５、及び６２−６６の何れかのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。所定の実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体は、Ｋ１１結合型ポリユビキチンへ結合する能力を保持する。所定の実施態様において、配列番号５及び６２−６６の何れか一において合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。所定の実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体は、配列番号５及び６２−６６の何れかのＶＬ配列を、その配列の翻訳後修飾を含み、含む。
その他の態様において、抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体が提供され、その抗体は、上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＨ、及び上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＬを含む。一実施態様において、抗体は、配列番号２７−３２、及び７０−７２及び配列番号５及び６２−６６の何れかに、それぞれＶＨとＶＬを、それらの配列の翻訳後修飾を含み、含む。
本発明の更なる態様では、上記実施態様のいずれかに記載の抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体は、キメラ、ヒト化またはヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一実施態様において、抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体は、抗体フラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）２断片である。その他の態様において、抗体は、全長抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ１抗体、又は本明細書において定義された他の抗体クラス又はアイソタイプである。
少なくとも一の抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体、又は抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体をコードする少なくとも一のポリヌクレオチドを含む組成物が提供される。所定の実施態様において、組成物は、薬学的組成物であり得る。本明細書で使用される場合、組成物は、一以上のポリユビキチンに結合する１つ以上の抗体、及び／又は一以上のポリユビキチンに結合する一以上の抗体をコードする配列を含む一以上のポリヌクレオチドを含む。これらの組成物は、適切な担体、例えば、当技術分野で周知である、緩衝液を含む薬学的に許容される賦形剤などを更に含み得る。
更なる態様にて、以下のセクション1-7で説明されるように、上記実施態様のいずれかに記載の抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体は、単独または組み合わせで、任意の特徴を組み込むことができる。
１．抗体親和性
所定の実施態様において、本明細書において与えられる抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）。
一実施態様において、以下のアッセイにより説明されるように、Ｋｄは、目的の抗体のＦａｂ型とその抗原を用いて実施される放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。非標識抗原の力価測定系の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）−標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する（例としてChen, et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照)。アッセイの条件を決めるために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）にて一晩コートして、その後２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温（およそ２３℃）で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した所望のＦａｂと混合する（例えば、Presta等、(1997) Cancer Res. 57: 4593-4599の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。ついで所望のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまでに長時間（例えばおよそ６５時間）かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で（例えば１時間）インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））を含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０ＴＭ；Ｐａｃｋａｒｄ）を加え、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴＴＭγ計測器（Ｐａｃｋａｒｄ）にて１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下濃度のＦａｂを選択してそれぞれ競合結合測定に用いる。
他の実施態様によると、例えば、〜１０反応単位（ＲＵ）の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを使用してＫｄを測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＢＩＡＣＯＲＥ Ｉｎｃ．）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動力学的な測定のために、Ｆａｂの２倍の段階希釈（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、２５℃で、およそ２５μｌ／分の流速で、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ２０ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（ｓｉｍｐｌｅ ｏｎｅ−ｔｏ−ｏｎｅ Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。例えば、 Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計（ｓｔｏｐ−ｆｌｏｗ ｅｑｕｉｐｐｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ）（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ ＴＭ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。当業者によって理解されるように、上記のアミンカップリング法（ＣＭ５チップ）の代わりに、チップ表面に対する標的抗原のための別のカップリング化学（例えば、ストレプトアビジン／ビオチン、疎水性相互作用、又はジスルフィド化学）はまた容易に利用可能である。
２．抗体断片
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、及び下記の他の断片を含む。所定の抗体断片の総説については、 Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), 頁269-315 (1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
ダイアボディは２価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照。トリアボディ及びテトラボディもまた Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。所定の実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である(Domantis, Inc., Waltham, MA; 例えば、米国特許第6,248,516 B1号を参照)。
抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体の分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌やファージ）による生産を含む。
３．キメラ及びヒト化抗体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。所定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４８１６５６７号、及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
所定の実施態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したまま、ヒト化されている。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはその一部）が、非ヒト抗体から由来し、ＦＲ（またはその一部）がヒト抗体配列に由来する、一以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部をも含む。所定の実施態様において、ヒト化抗体の幾つかのＦＲ残基は、抗体特異性又は親和性を回復もしくは改善するめに、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換されている。
ヒト化抗体およびそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、 Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 米国特許第５８２１３３７号、第７５２７７９１号、第６９８２３２１号、及び第７０８７４０９号；Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記述); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (「リサーフェシング」を記述); Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (「ＦＲシャッフリング」を記述);及びOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 及びKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (ＦＲのシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。
ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)）；軽鎖または重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域(例えば、Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992);及びPresta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)を参照); ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域 (例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照); 及びＦＲライブラリスクリーニング由来のフレームワーク領域 (例えば、Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及び Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照)を含む。
４．ヒト抗体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つまたはインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、 Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)を参照。 また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術を記載している、米国特許第６０７５１８１号及び第６１５０５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５７７０４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７０４１８７０号及び、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号）を参照。このような動物で生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、さらに種々のヒト定常領域と組み合わせることにより、例えば、更に改変される可能性がある。
ヒト抗体は、ハイブリドーマベースの方法によって製造することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒトヘテロ細胞株が記載されている。(例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987);及びBoerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照)ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体はまた、Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)に記載されている。更なる方法は、例えば、米国特許第７１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）及びNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (ヒト-ヒトハイブリドーマを記載している)に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）もまた、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 及びVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載される。
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。このような可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術が、以下に説明される。
５．ライブラリー由来の抗体
本発明の抗体は、所望の活性または活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてのライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)に総説され、更に、例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 及びLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。
所定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーが個別ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりクローニングされ、ファージライブラリーにランダムに再結合され、その後、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、またはＦａｂ断片のいずれかとして提示する。免疫された起源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性なしで免疫原に高親和性抗体を提供する。代わりに、Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)に記載されるように、ナイーブなレパートリーが、任意の免疫感作無しで、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対して、抗体の単一起源を提供するために、（例えば、ヒトから）クローン化することができる。最後に、ナイーブなライブラリはまた、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)に記載されるように、非常に可変なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再構成を達成するために、幹細胞由来の未転位Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することにより合成することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記述する特許公報は、例えば、米国特許第５７５０３７３号、及び米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号及び第２００９／０００２３６０号を含む。
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書でヒト抗体またはヒト抗体の断片とみなされる。
６．多重特異性抗体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。所定の実施態様において、結合特異性の一つはＫ１１結合型ポリユビキチンに対してであり、他は、任意の他の抗原に対してである。所定の実施態様において、二重特異性抗体は、Ｋ１１結合型ポリユビキチンの２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体はまたＫ１１結合型ポリユビキチンを発現する細胞に細胞傷害性薬物を局所化するために用いることができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
多重特異性抗体を作製するための技術は、限定されないが、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の組換え共発現(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983))、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照)及び“ｋｎｏｂ-ｉｎ-ｈｏｌｅ”エンジニアリング（例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照）を含む。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ−ヘテロ２量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号）、２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４６７６９８０号、及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照)、２重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること(例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)を参照)、二重特異性抗体フラグメントを作製するため、「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照)、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること(例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照)、及び、例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作成することができる。
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能性抗原結合部位を持つ改変抗体もまた本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６Ａ１号を参照)。
本明細書中の抗体又は断片はまた、Ｋ１１結合型ポリユビキチン並びにその他の異なる抗原（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号参照）に結合する抗原結合部位を含む、「２重作用（Ｄｕａｌ Ａｃｔｉｎｇ）ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」を含む。
７．抗体変異体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、またはペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び／又は挿入及び/又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終構築物に到達させるために作成され得る。
ａ）置換、挿入、および欠失変異体
所定の実施態様において、一つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異の対象となる部位は、ＨＶＲとＦＲを含む。保存的置換は、表１の「保存的置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表１の「典型的な置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされた。
アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ．
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
置換変異体の一つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体など）の一以上の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的には、さらなる研究のために選択され得られた変異体は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性を減少）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。典型的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるファージディスプレイベースの親和性成熟技術を用いて、簡便に生成され得る。簡潔に言えば、一つ以上のＨＶＲ残基が変異し、変異体抗体は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
変更（例えば、置換）は、例えば抗体の親和性を向上させるために、ＨＶＲで行うことができる。このような変更は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基で（例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照）、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）で行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリから構築し選択し直すことによる親和性成熟が、例えばHoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様において、多様性が、種々の方法（例えば、変異性ＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発）のいずれかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、ライブラリーは、所望の親和性を持つ抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するするもう一つの方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４から６残基）がランダム化されたＨＶＲ指向のアプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発、またはモデリングを用いて、特異的に同定され得る。ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的にされる。
所定の実施態様において、置換、挿入、または欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限りにおいて、一以上のＨＶＲ内で発生する可能性がある。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変（例えば本明細書で与えられる保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。このような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側であってもよい。上記に与えられた変異体ＶＨ又はＶＬ配列の所定の実施態様において、各ＨＶＲは不変であるか、又はわずか１個、２個または３個のアミノ酸置換が含まれているかの何れかである。
突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085により説明されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基またはグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判断するために、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）に置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。代わりに、又は更に、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基が、置換の候補として標的とされるか又は排除され得る。変異体はそれらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
アミノ酸配列挿入は、一残基から百以上の残基を含有するポリペプチド長にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素に対する抗体のＮ末端またはＣ末端への融合（例えばＡＤＥＰＴの場合）、または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。
ｂ）グリコシル化変異体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は抗体がグリコシル化される程度を増加または減少するように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、一以上のグリコシル化部位が作成または削除されるようにアミノ酸配列を変えることによって簡便に達成することができる。
抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに付着する糖を変えることができる。哺乳動物細胞によって生成された天然型抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ−結合により一般的に付着した分岐鎖、二分岐オリゴ糖を含んでいる。例えばWright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、二分岐糖鎖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合した、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸、並びにフコースを含み得る。幾つかの実施態様において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の改変は一定の改善された特性を有する抗体変異型を作成するために行われ得る。
一実施態様において、抗体変異体は、Ｆｃ領域に（直接または間接的に）付着されたフコースを欠いた糖鎖構造を有して提供される。例えば、このような抗体のフコース量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％、または２０％から４０％であり得る。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定されるＡｓｎ２９７に付着しているすべての糖構造の合計（例えば、コンプレックス、ハイブリッド及び高マンノース構造）に対して、Ａｓｎ２９７の糖鎖中のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）でおよそ２９７の位置に位置するアスパラギン残基を指し、しかし、Ａｓｎ２９７もまた位置２９７の上流または下流のおよそ±３アミノ酸に、すなわち抗体の軽微な配列変異に起因して、位置２９４と３００の間に配置され得る。このようなフコシル化変異体はＡＤＣＣ機能を改善させた可能性がある。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照。「フコース非修飾」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連する出版物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、国際公開第２０００／６１７３９号、国際公開第２００１／２９２４６号、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号、米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号、米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号、米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２００３／０８５１１９号、国際公開第２００３／０８４５７０号、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００５／０３５７７８号、国際公開第２００５／０５３７４２号、国際公開第２００２／０３１１４０号、Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)が含まれる。フコース非修飾抗体を産生する能力を有する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞(Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８ Ａ１号，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；及び国際公開第２００４／０５６３１２ Ａ１号，Ａｄａｍｓら、特に実施例１１)、及びノックアウト細胞株、α−１、６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）を含む。
抗体変異体は、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖とともに更に与えられる。このような抗体変異体はフコシル化を減少させ、及び／又はＡＤＣＣ機能を改善している可能性がある。そのような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔら）；米国特許第６６０２６８４号（Ｕｍａｎａら）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａら）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。このような抗体変異体はＣＤＣ機能を改善させた可能性がある。このような抗体変異体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌら）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
ｃ）Ｆｃ領域変異体
所定の実施態様において、１つまたは複数のアミノ酸改変が、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入することができ、それによってＦｃ領域変異体を生成する。Ｆｃ領域の変異体は、１つまたは複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域の配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでもよい。
所定の実施態様において、本発明は、インビボにおける抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（例えば補体およびＡＤＣＣなど）が不要または有害である用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体を意図している。インビトロ及び／又はインビボでの細胞毒性アッセイでは、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠くが（それゆえ、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認するために行うことができる。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介する初代細胞は、ＦｃＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃＲＩ、ＦｃＲＩＩ及びＦｃＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)の４６４ページの表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５５００３６２号(例えば、Hellstrom, I. et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)を参照) 及びHellstrom, I et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照)に説明される。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)に開示されるように、インビボで、例えば動物モデルにおいて評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイはまた、抗体が体Ｃ１ｑを結合することができないこと、したがって、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために行うことができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる(例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003);及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照)。ＦｃＲｎ結合、及びインビボでのクリアランス／半減期の測定ではまた、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる（例えば、Petkova, S.B. et al., Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照)。
エフェクター機能が減少した抗体は、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、３２９の一つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２以上での置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
ＦｃＲへの改善又は減少させた結合を持つ特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照)。
所定の実施態様において、抗体変異体はＡＤＣＣを改善する１つまたは複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４における置換（ＥＵの残基番号付け）を含む。
幾つかの実施態様において、改変された（すなわち改善されたか減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる、Ｆｃ領域における改変がなされ、例えば、米国特許第６１９４５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)に説明される。
増加した半減期を持ち、胎仔への母性ＩｇＧの移送を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体 (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 及びKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１号（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一つまたは複数の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域の残基の１以上の置換を有するものが含まれる：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換（米国特許第７３７１８２６号）。
Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); 米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及び、Ｆｃ領域の変異体の他の例に関しては国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
ｄ）システイン改変抗体変異体
所定の実施態様において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン改変抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂｓ」を作成することが望まれ得る。特定の実施態様において、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で起きる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中でさらに記載されるように、イムノコンジュゲーを作成するために、例えば薬物部分またはリンカー−薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。所定の実施態様において、以下の残基のいずれかまたは複数がシステインに置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。
ｅ）抗体誘導体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手されている追加の非タンパク質部分を含むように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体又はランダム共重合体の何れか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含するポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造において好都合である。ポリマーは何れかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変動してよく、そして、１つより多い重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であることができる。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が特定の条件下で治療に使用されるのか等を考慮しながら決定することができる。
その他の実施態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱されてもよい抗体と非タンパク質部分のコンジュゲートが、提供される。一実施態様において、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである(Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)。放射線は、任意の波長であって良いが、限定されないものの、通常の細胞に害を与えないが、抗体非タンパク質部分の近位細胞が死滅される温度に非タンパク質部分を加熱する波長が含まれる。
Ｂ．組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号で説明したように、組換えの方法および組成物を用いて製造することができる。一実施態様において、本明細書に記載される抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。更なる実施態様において、そのような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様において、宿主細胞は〜を含む（例えば、〜で形質転換される）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第ニベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様において、抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体を作る方法が提供され、その方法は、上記のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、および必要に応じて、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。
抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体の組換え生産のために、例えば上述したように、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニングおよび/または発現のために1つ以上のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に適切な宿主細胞は、本明細書に記載の原核生物または真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は、細菌で製造することができる。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、第５７８９１９９号及び第５８４０５２３号を参照。(また、大腸菌における抗体の発現を説明している、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003),頁245-254も参照。）発現の後、抗体は可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され得、更に精製することができる。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含む抗体をコードするベクターのための、適切なクローニング又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路は、「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の生成をもたらす。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)を参照。
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。
植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載)を参照。
脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞系は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株 (Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３細胞又は２９３細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載されるＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及びＹ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。
Ｃ．アッセイ
本明細書で提供される抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体は、同定され、当技術分野で公知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、または特徴づけることができる。
１．結合アッセイとその他のアッセイ
一態様において、本発明の抗体は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法など公知の方法により、その抗原結合活性について試験される。
その他の態様において、競合アッセイが、例えば、Ｆａｂｓ Ａ３、Ａ６、Ａ９、Ｂ５、Ｆ５、又はＧ３、又は抗体Ｇ３、１Ａ１１、１Ｃ１２、１Ｆ１２、２Ａ３、２Ａ６、２Ｄ７、２Ｅ６、２Ｇ４、又はハイブリッド抗体１Ｃ１２／２Ｅ６又は２Ａ３／２Ｅ６（本明細書に記載）の何れかと、Ｋ１１結合ポリユビキチンへの結合について競合する抗体を同定するために用いられ得る。所定の実施態様において、そのような競合抗体は、Ｆａｂｓ Ａ３、Ａ６、Ａ９、Ｂ５、Ｆ５、又はＧ３、又は抗体Ｇ３、１Ａ１１、１Ｃ１２、１Ｆ１２、２Ａ３、２Ａ６、２Ｄ７、２Ｅ６、２Ｇ４、又はハイブリッド抗体１Ｃ１２／２Ｅ６又は２Ａ３／２Ｅ６の何れかにより結合される同じエピトープ（例えば、直鎖状又は構造型エピトープ）へ結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な典型的な方法が、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。
典型的な競合アッセイにおいて、固定化Ｋ１１結合型ポリユビキチンは、Ｋ１１結合型ポリユビキチンに結合する第一の標識化抗体（例えば、抗体Ｇ３，１Ａ１１，１Ｃ１２，１Ｆ１２，２Ａ３，２Ａ６，２Ｄ７，２Ｅ６，２Ｇ４、又はハイブリッド抗体１Ｃ１２／２Ｅ６又は２Ａ３／２Ｅ６）、及び第一の抗体とＫ１１結合型ポリユビキチンへの結合について競合する能力について試験されている第二の非標識化抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。コントロールとして、固定化Ｋ１１結合型ポリユビキチンが、第二の未標識の抗体でなく、第一の標識された抗体を含む溶液中でインキュベートされる。Ｋ１１結合型ポリユビキチンへの第一の抗体の結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰の未結合の抗体が除去され、固定化されたＫ１１結合型ポリユビキチンに結合した標識の量が測定される。もし、固定化Ｋ１１結合型ポリユビキチンに結合した標識の量が、コントロールサンプルと比較して試験サンプル中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体がＫ１１結合型ポリユビキチンへの結合に対して、第一の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。
２．活性のアッセイ
一態様において、アッセイは、生物学的活性を有するそれらの抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体を同定するために与えられる。生物学的活性は、例えば、細胞又は組織におけるＫ１１結合型ポリユビキチン化タンパク質の分解速度を調節すること、及び細胞の細胞周期の進行の速度を調節することを含み得る。インビボ及び／又はインビトロでこのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。
所定の実施態様において、本発明の抗体は、そのような生物学的活性について試験される。
Ｄ．イムノコンジュゲート
本発明はまた、化学療法剤又は薬物、成長抑制剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位元素など、1つ以上の細胞傷害性薬物にコンジュゲートした本明細書中の抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、そこでは抗体は、限定されないが、メイタンシノイド（米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号及び欧州特許ＥＰ０ ４２５２３５ Ｂ１を参照）；モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５６３５４８３号及び第５７８０５８８号及び第７４９８２９８号を参照）などのアウリスタチン；ドラスタチン、カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５７１２３７４号、第５７１４５８６号、第５７３９１１６号、第５７６７２８５号、第５７７０７０１号、第５７７０７１０号、第５７７３００１号、及び第５８７７２９６号を参照；Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993);及びLode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); ダウノマイシン又はドキソルビシンなどのアントラサイクリン (Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002);及び米国特許第６６３０５７９号を参照）；メトトレキサート、ビンデシン、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセルなどのタキサン、トリコテセン、及びＣＣ１０６５を含む一つ以上の薬物とコンジュゲートしている。
その他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートした、本明細書に記載の抗体を含み、限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。
その他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性コンジュゲートを形成するために放射性原子にコンジュゲートした本明細書に記載されるような抗体を含む。様々な放射性同位体が放射性コンジュゲートの生産のために入手可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体を含む。検出のためにコンジュゲートを使用する場合は、それはシンチグラフィー試験のための放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像化ｍｒｉとしても知られている）のためのスピン標識、例えば再び、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含んでよい。
抗体と細胞傷害性薬物のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート (SMCC)、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルズベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えばビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）など、を使って作成され得る。Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)に記載されるように、例えば、リシンイムノトキシンを調製することができる。カーボン−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である国際公開第９４／１１０２６号を参照。リンカーは、細胞中に細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光解離性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992);米国特許第５２０８０２０号）が使用され得る。
本明細書において、イムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定されないが、市販の(例えばＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａからの）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＰＢ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、ＳＶＳＢ（スクシンイミジル（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むクロスリンカー試薬を用いて調製されるコンジュゲートを限定されないが明示的に熟考している。
Ｅ．診断及び検出のための方法および組成物
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体の何れかは、生物学的サンプル中のＫ１１結合型ポリユビキチンの存在を検出するのに有用である。本明細書で使用する"検出"という用語は、定量的または定性的検出を包含する。所定の実施態様において、生物学的サンプルは、限定されないが、腫瘍細胞、筋細胞又は神経細胞などの細胞又は組織を含む。
一実施態様において、診断又は検出の方法に使用される抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体が提供される。更なる態様において、生物学的サンプル中のＫ１１結合型ポリユビキチンの存在を検出する方法が提供される。所定の実施態様において、本方法は、抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体のポリユビキチン又はポリユビキチン化タンパク質への結合を許容する条件下で、本明細書に記載のように抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体と生物学的サンプルを接触させること、及び複合体が抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体とポリユビキチン又はポリユビキチン化タンパク質の間に形成されているかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロ又はインビボでの方法であり得る。一実施態様において、例えばＫ１１結合型ポリユビキチンが患者の選択のためのバイオマーカーであるなど、抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体が抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体による治療にふさわしい被検体を選択するために使用される。
本発明の抗体を用いて診断することができる典型的な障害は、細胞周期関連疾患又は障害が含まれ、それらは異常に亢進した細胞周期の進行に関連する疾患又は障害、又は異常に低下した細胞周期の進行に関連する疾患または障害を含み得る。一つの態様において、細胞周期進行の異常な亢進に関連する疾患又は障害は癌である。その他の態様において、細胞周期進行の異常な低下に関連する疾患又は障害は、例えば、変性筋障害及び変性神経障害である。
所定の実施態様において、標識された抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体が与えられる。標識は、限定されるものではないが、（例えば、蛍光、発色、高電子密度の化学発光、放射性標識など）直接検出される標識又は部分、並びに、例えば、酵素反応や分子間相互作用を介して間接的に検出されるような酵素やリガンドのような部分が含まれる。このような標識の例には、ラジオアイソトープ３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ(米国特許第４７３７４５６号)、ルシェフェリン、２,３-ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)、アルカリフォスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、色素前駆体、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定な遊離ラジカルなどを酸化する過酸化水素を利用する酵素とカップリングさせたもの、などが含まれる。
Ｆ．薬学的処方物
本明細書に記載の抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体の薬学的処方物は、所望の程度の純度を有するその抗体と任意の薬学的に許容される担体(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.: Williams and Wilkins PA, USA (1980))とを、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で混合することによって調製される。 薬学的に許容される担体は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における典型的な薬学的に許容される担体は、介在性薬物分散剤、例えば、水溶性の中性アクティブヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。所定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒＨｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８に開示されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つまたは複数の追加のグルコサミノグリカンと組み合わされる。
典型的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
本明細書の製剤はまた、治療を受けている特定の徴候のために必要な一以上の活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものが含まれる場合がある。例えば、一以上の化学療法剤を更に提供することが望ましい可能性がある。このような活性成分は、意図した目的のために有効な量で組み合わされ適切に存在する。
活性成分はまた、調製されるマイクロカプセルに、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって、捕捉され得る、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル、コロイド薬物送達系で（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョンで。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示される。
徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスが成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形をしている。
インビボ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、達成することができる。
Ｇ．治療的方法及び組成物
本明細書で提供される抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体のいずれかを、治療方法で使用することができる。
一態様では、医薬として使用するための抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体が提供される。更なる態様において、異常な細胞周期制御に関連した障害（限定されないが、増殖障害、例えば癌、及び、限定されないが変性筋障害と変性神経障害を含む発育不全障害を含む）の治療に使用される抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体が提供される。所定の実施態様において、治療の方法に使用される抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体が提供される。所定の実施態様において、本発明は、個体に抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体の有効量を投与することを含む、異常な細胞周期制御に関連する障害を有する個体を治療する方法に使用される抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体を提供する。一つのそのような実施態様において、この方法は、例えば後述するように、少なくとも1つのさらなる治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。更なる実施態様において、本発明は、細胞周期進行速度が調整されるような細胞周期制御の調節に使用のための抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体を提供する。所定の実施態様において、本発明は、細胞周期進行を調節し、それによって細胞分裂の速度を調整するために、個体に抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体の有効量を投与することを含む、個体における細胞周期進行の速度を調節する方法で使用のための抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体を提供する。上記実施態様のいずれかに記載の「個体」は、好ましくはヒトである。
更なる態様にて、本発明は、医薬の製造又は調製における抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体の使用を提供する。一実施態様において、本医薬は、異常な細胞周期制御に関連した障害（限定されないが、増殖障害、例えば癌、及び、限定されないが変性筋障害と変性神経障害を含む発育不全障害を含む）の治療用である。更なる実施態様において、本医薬は、そうした障害を有する個体に、医薬の有効量を投与することを含む、異常な細胞周期制御に関連した障害を治療する方法に使用のためである。一つのそのような実施態様において、この方法は、例えば後述するように、少なくとも一つのさらなる治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。更なる実施態様において、本医薬は細胞周期進行の速度の調節のためである。更なる実施態様にて、本医薬は、細胞分裂の速度を調整するために本医薬の有効量を個体に投与することを含む、個体における細胞周期の進行の速度を調節する方法で使用用である。上記実施態様のいずれかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。
更なる態様にて、本発明は、異常な細胞周期制御に関連した障害を治療する方法を提供する。一実施態様において、本方法は、異常な細胞周期制御に関連した障害などを有する個体に、抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体の有効量を投与することを含む。一つのそのような実施態様において、この方法は、後述するように、少なくとも一つのさらなる治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。
更なる態様において、本発明は、例えば、上記の治療法のいずれかに使用される、本明細書で提供される抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体のいずれかを含む薬学的製剤を提供する。一実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体の何れかと、薬学的に許容される担体を含む。その他の実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体の何れかと、少なくとも１つの更なる治療剤を、例えば後述するように含む。
本発明の抗体は、治療において、単独で、または他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の抗体は少なくとも１つの更なる治療剤と同時投与され得る。所定の実施態様において、更なる治療薬は、化学療法剤である。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学物質である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド（trietylenephosphoramide）、トリエチレンチオホスホルアミド（triethiylenethiophosphoramide）及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標）；βラパチョーネ；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン（合成アナログトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標）、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン(scopolectin)及び９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１（例えばAgnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186(1994)参照）；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標)ドキソルビシン(モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシノイド(maytansinoid)類、例えばメイタンシン(maytansine)及びアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類(特にＴ-２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａ及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカーバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ａｒａ-Ｃ」）；チオテパ；タキソイド類、例えばＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭパクリタキセルのクレモフォー無添加アルブミン操作ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、及びＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドキセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲムシタビン(gemcitabine)（ＧＥＭＺＡＲ(登録商標)）；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナアナログ、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；プラチナ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボビン(leucovovin)；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標)）；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸のようなレチノイド；カペシタビン(capecitabine)（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標）；上述したもののいずれかの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体：並びに上記のうち２以上の組み合わせ、例えば、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニソロン併用療法の略称であるＣＨＯＰ、及び５−ＦＵ及びロイコボビン(leucovovin)とオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ）を組み合わせた治療法の略称であるＦＯＬＦＯＸが含まれる。
同様にこの定義に含まれるものには、癌の成長を助けるホルモンの作用を調節、低減、遮断又は阻害するように働き、多くの場合全身処置の形態で使用される抗ホルモン剤がある。それらはそれ自体がホルモンであってもよい。例として、抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節物質（ＳＥＲＭ）を含み、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ＥＶＩＳＴＡ（登録商標）ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェン；抗プロゲステロン；エストロゲンレセプター下方調節剤（ＥＲＤ）；卵巣を抑止又は停止させる機能がある作用剤、例えばＬＵＰＲＯＮ（登録商標）及びＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）酢酸ロイプロリド等の黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン及びトリプテレリン(tripterelin)；その他抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド；並びに副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ(登録商標)酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ(登録商標)エキセメスタン、フォルメスタニー(formestanie)、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ(登録商標)ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ(登録商標)レトロゾール、及びＡＲＩＭＩＤＥＸ(登録商標)アナストロゾールである。加えて、このような化学療法剤の定義には、クロドロネート（例えばＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）又はＯＳＴＡＣ（登録商標））、ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標）エチドロン酸、ＮＥ−５８０９５、ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）ゾレドロン酸／ゾレドロネート、ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標）アレンドロネート、ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）パミドロン酸、ＳＫＥＬＩＤ（登録商標）チルドロン酸、又はＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標）リセドロン酸、並びにトロキサシタビン（ｔｒｏｘａｃｉｔａｂｉｎｅ）（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に接着細胞の増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ−α、Ｒａｆ、及びＨ−Ｒａｓ、及び上皮成長因子レセプター（ＥＧＦ−Ｒ）；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチン及び遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ラパチニブ（lapatinib ditosylate）（ＧＷ５７２０１６としても知られるＥｒｂＢ−２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤）及び上記のもののいずれかの製薬的に許容される塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一または別々の製剤に含まれている）、及び、本発明の抗体の投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又はその後に起きうる分離投与を包含する。本発明の抗体はまた放射線治療と併用して用いることができる。
本発明の抗体（および任意の追加の治療剤）は、任意の適切な手段によって投与することができ、経口、肺内、および鼻腔内、及び局所治療が所望される場合、病巣内投与が含まれる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存し、任意の適切な経路、例えば、静脈内または皮下注射などの注射により行うことができる。限定されないが、様々な時間ポイント上の単一または複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で考えられている。
本発明の抗体は良好な医療行為に合致した方法で処方され、投与され、投薬される。この観点において考慮すべき要因は、治療すべき特定の障害、治療すべき特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の要因を包含する。抗体は、必要ではないが任意で、問題となる障害の予防又は治療のために、現在使用中の一又は複数の薬剤ともに処方される。そのような他の薬剤の有効量は製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類及び上記した他の要因に依存する。これらは一般的には本明細書に記載されるのと同じ用量及び投与経路において、又は、本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路により使用される。
本発明による抗体の結合標的の位置は、抗体の調製及び投与において考慮され得る。結合標的が細胞内分子である場合、本発明のある実施態様は、結合標的が存在している細胞内に導入されるべき抗体又はそれらの抗原結合断片を提供する。一実施態様において、本発明の抗体は、細胞内抗体として細胞内部に発現され得る。用語「細胞内抗体」は本明細書で使用される場合、細胞内部に発現され、かつ標的分子に選択的に結合可能である抗体又はその抗原結合部位を指し、Marasco, Gene Therapy 4: 11-15 (1997); Kontermann, Methods 34: 163-170 (2004); 米国特許第６００４９４０号及び第６３２９１７３号；米国特許出願公開第２００３／０１０４４０２号、及びＰＣＴ公報国際公開第２００３／０７７９４５号に記載される。抗体の細胞内部発現は、所望の抗体又はその抗原結合部位をコードする核酸（通常は抗原結合断片の抗体をコードする遺伝子に付随した野生型リーダー配列及び分泌シグナルを欠いている）を、標的細胞中に導入することにより達成される。細胞内に核酸を導入する任意の標準的な方法が用いることができ、限定されないが、マイクロインジェクション、弾道インジェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム、及び目的の核酸を運ぶレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びワクシニアベクターを用いたトランスフェクションを含む。細胞内部でポリユビキチンに結合し、かつ一以上のポリユビキチン媒介性細胞経路の調節することができる一つ以上の細胞内抗体が発現されるように、本発明の抗ユビキチン抗体の全て又は一部をコードする１つ又は複数の核酸を標的細胞に送達することができる。
その他の実施態様において、内部移行する抗体が提供される。抗体は、細胞内部への抗体の送達を促進する特定の特性を有し得るか又はそのような特性を有するように改変することができる。これを達成するための技術は、当技術分野で知られている。例えば、抗体のカチオン化は細胞への取り込みを促進することが知られている（例えば、米国特許第６７０３０１９号を参照）。リポフェクション又はリポソームは、細胞内に抗体を送達するために使用することができる。抗体断片が使用される場合には、標的タンパク質の結合ドメインに結合する最小阻害断片が一般的に有利である。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、ペプチド分子は、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するように設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成することができ、及び／又は組換えＤＮＡ技術により製造することができる。例えば、Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7889-7893 (1993)を参照。
標的細胞へのモジュレーターポリペプチドの移行は、当該分野で公知の方法によって向上させることができる。例えば、ＨＩＶ ＴＡＴ又はアンテナペディアホメオドメインタンパク質由来のものなど所定の配列を、細胞膜を介した異種タンパク質の効率的な取り込みへ向かわせることができる。例えば、Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 4325-4329 (1999)を参照。
結合標的が脳に位置しているとき、本発明の特定の実施態様では、血液脳関門を通過するための抗体又はその抗原結合断片を提供する。特定の神経変性疾患は、抗体又はその抗原結合断片が容易に脳に導入することができるような、血液脳関門の透過性の増加と関連している。血液脳関門が無傷のままの場合、それを通過して分子を輸送するために、幾つかの当該技術分野で知られたアプローチが存在し、限定されないが、物理的方法、脂質に基づく方法、及び受容体及びチャネルに基づく方法を含む。
血液脳関門を通過して抗体又はその抗原結合断片を輸送する物理的方法として、限定されないが、完全に血液脳関門を迂回するか、又は血液脳関門の開口部を作成することを含む。迂回方法としては、限定されないが、脳内に直接注射（例えば、Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)を参照; 間質性注入/対流強化送達 (例えば、Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2076-2080 (1994)を参照）、及び脳内送達装置の移植（例えば、Gill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003); 及びＧｌｉａｄｅｌ ＷａｆｅｒｓＴＭ、Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌを参照)を含む。関門の開口部を作成するための方法としては、限定されないが、超音波（例えば、米国特許出願公開第２００２／００３８０８６号）、浸透圧（高張性マンニトールの投与による(Neuwelt, E.A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, vols. 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989))）、例えば、ブラジキニン又は透過処理装置Ａ−７による透過処理（例えば、米国特許第５１１２５９６号、第５２６８１６４号、第５５０６２０６号、及び第５６８６４１６号）、及び抗体又はその抗原結合断片をコードする遺伝子を含むベクターを用いた、血液脳関門をまたぐ神経細胞のトランスフェクション（例えば、米国特許出願公開第２００３／００８３２９９号）を含む。
血液脳関門を横切って抗体又はその抗原結合断片を輸送する、脂質に基づいた方法は、限定されないが、血液脳関門の血管内皮細胞上の受容体に結合する抗体結合断片に結合されているリポソーム中に抗体又は抗原結合断片を封入すること（例えば、米国特許出願公開第２００２００２５３１３号を参照）、及び低密度リポソーム粒子（例えば、米国特許出願公開第２００４０２０４３５４号を参照）で、又はアポリポタンパク質Ｅ（例えば、米国特許出願公開第２００４０１３１６９２号を参照）で抗体又は抗原結合断片をコーティングすることを含む。
血液脳関門を横切って抗体又はその抗原結合断片を輸送する受容体及びチャネルに基づく方法としては、限定されないが、血液脳関門の透過性を高めるためにグルココルチコイドブロッカーを使用すること（例えば、米国特許出願公開第２００２／００６５２５９号、第２００３／０１６２６９５号及び第２００５／０１２４５３３号）、カリウムチャネルを活性化すること（例えば、米国特許出願公開第２００５／００８９４７３号を参照）、トランスフェリンで抗体をコーティングし、一以上のトランスフェリン受容体の活性を調節すること（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１２９１８６号参照）、及び抗体をカチオン化すること（例えば、米国特許第５００４６９７号参照）を含む。
疾患の予防又は治療のためには、本発明の抗体の適切な用量（単独で使用されるか、又は、一以上の更なる治療的薬剤との組み合わされる場合）は治療すべき疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体を予防又は治療目的のいずれにおいて投与するか、以前の治療、患者の臨床的履歴及び抗体に対する応答性、及び担当医の判断に依存する。抗体は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、抗体約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ）が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な一日当たり用量は上記した要因に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日間以上に渡る反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続するであろう。１つの例示される抗体用量は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの１つ以上の用量（又はこれらの何れかの組み合わせ）を患者に投与してよい。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が約２から約２０、例えば抗体の約６投与量を受けるように）投与してよい。初期の高負荷用量の後、１つ以上の低用量を投与してよい。しかしながら、他の用量用法も使用してよい。この治療法の進行は従来の手法及び試験により容易にモニタリングされる。
上記の製剤または治療方法のいずれかが、抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体の代わりか又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを用いて行うことができることが理解される。
Ｈ．製造品
本発明の他の実施態様において、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器とラベルまたは容器上にあるまたは容器に付属するパッケージ挿入物を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、IV輸液バッグ 等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な物質から形成されうる。容器は、疾患の治療、予防、及び／又は診断に有効である、それ自体か、又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の抗体である。ラベルまたはパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）組成物が本発明の抗体を包含する組成物を含む第一の容器；および（ｂ）組成物が更なる細胞障害性又はその他の治療的薬剤を包含する組成物を含む第２の容器を含み得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療することに用いることができることを示すパッケージ挿入物をさらに含んでいてもよい。別法として、または加えて、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含む第二（または第三）の容器をさらに含んでもよい。これは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業的およびユーザーの立場から望まれる他の物質のさらに含んでもよい。
上記の製造品のいずれかは、抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体の代わりか又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含み得ることが理解される。
ＩＩＩ．実施例
以下は本発明の方法および組成物の例である。上記提供される一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
実施例１：抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体の単離と特性評価
抗Ｋ１１結合型ポリユビキチン抗体のファージディスプレイに基づいた単離は、標準的な技術を使用して、いくつかの異なるライブラリを用いて行った。簡単に言えば、合成完全長Ｋ１１結合型ジユビキチン（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒａｐｅ’ｓ ｌａｂ，ＵＣ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）が９６ウェルマキシソープイムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ）（ＮＵＮＣ）上に固定化された。プレートは、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６中の５μｇ／ｍＬのＫ１１ジユビキチンで４℃で一晩コーティングされた。コーティングされたプレートは、その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳ中の２．５％のミルクの２００μＬ／ウェルでブロックされた。ナイーブなファージライブラリーを、２０％ＰＥＧ／２，５ＭのＮａＣｌの１／５の容積で、グリセロールストックから沈殿させ、２．５％のミルク／ＰＢＳＴ中に再懸濁し、２５℃で１時間インキュベートした。再懸濁されたファージがブロックされたプレートに添加され（１００μＬ／ウェル）、震盪させて４時間２５℃でインキュベートした。結合後、プレートはＰＢＳＴで１０回洗浄し、ファージは５０ｍＭのＨＣｌ／５００ｍＭのＫＣｌが１５０μＬ／ウェルで３０分間２５℃で震とうさせて溶出した。溶出は１Ｍのトリス、ｐＨ７，５を１５０μＬ／ウェルで中和され、その後、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを添加したＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌（ストラタジーン）で増殖された。
増幅されたファージは、上記のＫ１１結合ジユビキチンに対する選択の更なるラウンドで使用された。ラウンド２から４において、さまざまな結合型の可溶性モノユビキチン又はポリユビキチンが、対抗選択のためファージに追加された。第二ラウンドにおいて、１０μｇ／ｍＬの可溶性モノユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）が用いられた。３番目と４番目のラウンドでは、１０μｇ／ｍＬの各々の可溶性モノユビキチン、直鎖状ジユビキチン、Ｋ４８結合型ポリユビキチン２−７鎖，及びＫ６３結合型ポリユビキチン２−７鎖（全てＢｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）が用いられた。
各ライブラリーから選別の第三及び第四ラウンドの両方からの９６個のクローンは、９６ウェル形式に、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン、及び１０１０ファージ／ｍＬのＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを含む１ｍＬの２ＹＴブロス中で、３７℃で一晩震とうさせて増殖させた。細胞をペレット化し、上清は、Ｋ１１結合型ジユビキチン、モノユビキチン、直鎖状ジユビキチン、Ｋ４８結合ポリユビキチン２−７、Ｋ６３結合ポリユビキチン２−７，抗ｇＤ抗体（ジェネンテック）又は未コーティングウェルへの結合に対するハイスループットファージスポットＥＬＩＳＡに使用した。Ｆａｂファージディスプレイライブラリーの全てが、軽鎖にカルボキシ末端のｇＤタグを含んでおり、これは、抗ｇＤ抗体の結合を観察することにより、表示レベルの評価を可能にする。ユビキチンタンパク質のパネルは、上記のように３８４ウェルのマキシソープイムノプレート（ＮＵＮＣ）に固定化した。プレートは、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６中において、２μｇ／ｍＬの各ユビキチンタンパク質で４℃で一晩コーティングされた。コーティングされたプレートは、その後、ＰＢＳＴ中の２．５％のミルクを６０μＬ／ウェルで、１時間、２５℃で震とうさせてブロックされた。１時間後、ブロッキングバッファーが除かれ、２０μＬ／ウェルのＰＢＳＴ及び１０μＬ／ウェルのファージ上清が添加された。プレートは振とうしながら１時間２５℃でインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで６回洗浄した。ＰＢＳＴ中で抗Ｍ１３西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を５０００倍希釈した３０マイクロリットルが、ファージ結合の検出のために使用された。洗浄後、結合した二次抗体をＴＭＢ基質（ＫＰＬ）を用いて検出し、等量の１Ｍリン酸と４５０ｎｍの分光光度測定値でクエンチングした。
ナイーブ抗ペプチドのＦａｂファージディスプレイライブラリーは、上記のように、上記で参照した精製されたＫ１１結合型ジユビキチン（ＵＣ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）に対して４ラウンドの選別を施された。用いた抗ペプチドのＦａｂファージディスプレイライブラリーは、全ての３つの重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲＬ３における無作為のアミノ酸が含まれており、長いＣＤＲＬ１を持ち、かつＣＤＲＬ２の配列多様性を許容している、改変されたヒト化抗体４Ｄ５フレームワークに基づいていた。特異的な抗Ｋ１１結合型ジユビキチンバインダーの濃縮は、４ラウンドの選別後に観察されなかった。
次に、ナイーブＹＳＧＸ Ｆａｂファージディスプレイライブラリーは、上記のように、上記で参照した精製されたＫ１１結合型ジユビキチン（ＵＣ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）に対して４ラウンドの選別を施された。ＹＳＧＸ Ｆａｂ ファージディスプレイライブラリーは３つ全ての重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲＬ３において無作為化アミノ酸を含んでおり（米国特許出願公開第２００５−０１０６６６７号及びFellouse et al. 2007 J. Mol. Biol. 373: 924-40を参照）、ヒト化抗体４Ｄ５に基づいている。Ｋ１１結合型ジユビキチンに対するバインダーにおいて適度な３倍濃縮のみが、４ラウンドの選別後に観察された。これらのバインダーに関して、全てがＫ１１結合型ジユビキチンへの結合に対して弱いシグナルを示し、他のユビキチン型及びポリユビキチン型に対して付加的な弱い結合を持っていた。
最後に、ナイーブＶＨ Ｆａｂファージディスプレイライブラリーは、上記で参照したＫ１１結合型ジユビキチンに対して４ラウンドの選別を施された。ＶＨ Ｆａｂ ファージディスプレイライブラリーは３つ全ての重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲＬ３において無作為化アミノ酸を含んでおり（米国特許出願公開第２００５０１１９４５５号及びLee C.W. et al. 2004 JMB 340: 1073-93を参照)、ヒト化抗体４Ｄ５に基づいている。２４倍濃縮が選別の４ラウンド後に観察された。強いＫ１１結合型ジユビキチン特異的バインダーがライブラリー選別から同定された。第三及び第四ラウンドの選別からのＶＨライブラリークローンの重鎖が配列決定された。ＶＨライブラリーの設計に基づいて、ＨＶＲ Ｈ１配列、ＨＶＲ Ｈ２配列、及びＨＶＲ Ｈ３配列はクローン特異的であると予想されていたが、重鎖フレームワーク配列及び全軽鎖配列（ＨＶＲ及びフレームワーク領域）は不変であることが予想された。ＨＶＲ Ｌ１配列はＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号２）であって、ＣＤＲ Ｌ２配列はＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号３），であって、ＨＶＲ Ｌ３配列はＱＱＳＹＴＴＰＰＴ（配列番号４）（図１Ａ）であった。６つの固有の重鎖配列が同定され（図１Ｂ）、識別子のＡ３、Ａ６、Ａ９、Ｂ５、Ｆ５及びＧ３が与えられた。クローンＧ３はＫ１１結合型ジユビキチンに対して最強のバインダーで、上記のファージスポットＥＬＩＳＡアッセイにおいて最も特異的であって、モノユビキチン、直鎖状ジユビキチン、Ｋ４８結合型ポリユビキチン２−７、又はＫ６３結合型ポリユビキチン１−７への結合を示さなかった（図２）。これらの６つのＦａｂの重鎖のＨＶＲ領域のコンセンサスアミノ酸配列は、ＨＶＲ−Ｈ１：Ｘ１ Ｘ２ Ｘ３ Ｘ４ Ｉｌｅ Ｘ５（配列番号２４）、Ｘ１はセリン及びスレオニンから選択され、Ｘ２はアスパラギン、アスパラギン酸、セリン、グリシンから選択され、Ｘ３はチロシン、セリン、スレオニンから選択され、Ｘ４はトリプトファン、アスパラギン酸、グリシン、チロシンから選択され、Ｘ５はセリン及びヒスチジンから選択される；ＨＶＲ−Ｈ２：Ｘ６ Ｘ７ Ｉｌｅ Ｘ８ Ｐ Ｘ９ Ｇ Ｘ１０ Ｔ Ｘ１１（配列番号２５）、Ｘ６は、グリシン及びアラニンから選択され、Ｘ７は、アスパラギン酸、トリプトファン、グリシン、グルタミン酸、バリンから選択され、Ｘ８はセリン、チロシン及びアスパラギンから選択され、Ｘ９はアスパラギン酸、アラニン、ヒスチジン及びアスパラギンから選択され、Ｘ１０は、チロシン及びセリンから選択され、Ｘ１１はチロシン、アスパラギン酸及びアスパラギンから選択される；及びＨＶＲ−Ｈ３：Ｘ１２ Ｘ１３ Ｘ１４ Ｘ１５ Ｘ１６ Ｘ１７ Ｘ１８ Ｘ１９ Ｘ２０ Ｘ２１ Ｄ（配列番号２６）、Ｘ１２はアルギニン及びリジンから選択され、Ｘ１３はグルタミン酸、グリシン、アスパラギン酸及びプロリンから選択され、Ｘ１４はセリン、イソロイシン、バリン、及びトリプトファンから選択され、Ｘ１５は、トリプトファン、グリシン、チロシン、及びフェニルアラニンから選択され、Ｘ１６はトリプトファン、チロシン、ロイシン、グリシン、及びフェニルアラニンから選択され、Ｘ１７は、セリン、チロシン、フェニルアラニン、及びグリシンから選択され、Ｘ１８は、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、及びグリシンから選択されるか又は存在せず、Ｘ１９は、トリプトファン、グリシン、アラニン、及びチロシンから選択されるか又は存在せず、Ｘ２０はバリンか又は存在せず、かつアミノ酸Ｘ２１はメチオニン及びフェニルアラニンから選択される。
Ａ．Ｇ３Ｆａｂの産生
ＶＨ Ｆａｂファージディスプレイライブラリーからｎｏクローンを，大腸菌アルカリホスファターゼ（ＰｈｏＡ）プロモーターの制御下で発現させた。軽鎖及び重鎖の両方が大腸菌内で分泌させるために、アミノ末端細菌ＳＴＩＩシグナル配列を含み、単一のファージミドベクターから発現された。重鎖カルボキシル末端は、Ｍ１３バクテリオファージの遺伝子産物ＩＩＩ（ｇｐＩＩＩ）が続くロイシンジッパーにインフレームで融合させ、ファージ上の二価のＦａｂ−ｚｉｐ断片の表示を可能にした。可溶性Ｆａｂを発現させるために、終止コドンが、ＦａｂのＣＨ１定常ドメインの終わりとロイシンジッパーの開始までの間のＧ３ファージミドに導入された。変異原性オリゴヌクレオチドＲＦ６４７１−１（ＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＴＡＡＴＡＡＣ ＧＣＡＴＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＧＡＧＧ）（配列番号３３）及びＲＦ６４７１−２（ＣＣＴＣＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＡＴＧＣＧ ＴＴＡＴＴＡＧＴＧＡＧＴＴＴＴＧＴＣＡＣＡＡＧＡ）（配列番号３４）がＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（ストラタジーン）を使用して停止コドンを挿入するために使用された。得られた可溶性Ｇ３ Ｆａｂ発現プラスミドは大腸菌株６２Ａ７（ジェネンテック）に形質転換され、カルベニシリンを含有する固形寒天上に蒔かれた。単一コロニーが、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む２ＹＴブロス２５ｍＬを植菌するために使用された。培養物を３７℃で一晩増殖させ、５ｍＬが、完全Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ．培地（３．５７ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．７１ｇのクエン酸ナトリウム２Ｈ２Ｏ、１．０７ｇのＫＣｌ、５．３６ｇの酵母エキス（認定）、５．３６ｇのＨｙｃａｓｅ ＳＦ（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ）、ｐＨはＫＯＨの添加で７．３に調整され、容積は超純水で８７２ｍＬに調整され、オートクレーブ滅菌し、５５℃へ冷却され、それに（リッターあたり）１ＭのＭＯＰＳ ｐＨ７．３を１１０ｍＬ、５０％グルコースを１１ｍＬ及び１ＭのＭｇＳＯ４を７ｍＬが添加された）に５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを接種するために使用された。培養物を振とうしながら２４時間３０℃で増殖させた。細胞を遠心分離により回収し、ペレットはー２０℃で保存した。Ｆａｂは、１０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（インビトロジェン）、０．２ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（ＵＳＢ）、及び１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（カルビオケム）を含む、冷やした洗浄緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）＋１５０ｍＭのＮａＣｌ）の３５ｍＬに細胞ペレットを再懸濁することにより精製した。ペレットを２５℃で４５分間急速にボルテックスすることにより再懸濁した。細胞の破片を遠心分離によりペレット化し、溶解液を、冷洗浄緩衝液で事前に平衡化した１ｍＬのタンパク質Ａ−セファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム上にロードした。カラムは、冷洗浄緩衝液５０ｍＬで洗浄し、０．１Ｍ酢酸３ｍＬで溶出し、２Ｍのトリス、ｐＨ１１．０を１５０μＬ加えて中和した。Ｆａｂは、アミコンウルトラ−１５遠心式フィルターユニット（１０ｋＤａのカットオフ、ミリポア）を用いて濃縮した。得られたＦａｂの濃度を分光光度計で測定した（１ ＯＤ２８０＝１．５ｍｇ／ｍＬ）。
Ｂ．Ｇ３Ｆａｂの解析
Ｇ３のＦａｂの親和性は、ＢＩＡＣＯＲＥ ３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定された。およそ６０共鳴単位（ＲＵ）のＫ１１結合型ジユビキチン（ジェネンテック）、Ｋ４８結合型ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、及びＫ６３結合型ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）が、製造者により提供されたアミン結合プロトコールを使用してＣＭ５チップの別々のフローセル上に固定化された。Ｇ３ Ｆａｂの１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．０１％のＴｗｅｅｎ ２０（ＨＢＳＴ）による２倍連続希釈（０．５−５００ｎＭ）が、ＨＢＳＴをランニング緩衝液として使用して各フローセルへ注入された。各フローセルにおいて信号が記録され、非共役及びブロックされたフローセルからの基準信号を減算した。８分間の解離時間の後、チップ表面を２０μＬの１０ｍＭのＨＣｌで再生した。データは、変動ベースラインで１：１結合モデルに適合させた。速度定数と結合定数は、製造業者によって提供されたソフトウェアを使用して、非線形回帰分析により同時に算出し、表２の一番上の行に示されている。Ｇ３のＦａｂの速度定数（ｋａ及びｋｄ）及び結合定数（ＫＤ）の３つの測定値からの平均値（Ａｖｇ．）と標準偏差（Ｓｔｄ．ｄｅｖ．）が示されている。Ｇ３はＫ６３結合型ジユビキチンに結合定数が１０５ｎＭで結合する。Ｋ４８結合型ジユビキチン又はＫ６３結合型ジユビキチンへの結合は検出できなかったことを実証している。
精製されたＧ３ Ｆａｂが、ＥＬＩＳＡによるユビキチンタンパク質のパネルへの結合について試験された。Ｋ６３結合型ジユビキチン（ＵＣ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）、モノユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、直鎖状ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｋ４８結合型ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ），、及びＫ６３結合型ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）が９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｂイムノプレート上へ固定化された。プレートは、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６中において、５μｇ／ｍＬの各ユビキチンタンパク質で２５℃で２時間コーティングされた。コーティングされたプレートは、その後、ＰＢＳＴ中の２．５％のミルクを２００μＬ／ウェルで、１時間、２５℃で震とうさせてブロックされた。Ｇ３ Ｆａｂの１２回の２倍連続希釈が、ＰＢＳＴ中の２．５％のミルク中で１．０μＭから０．５ｎＭまでなされた。１時間後、ブロッキング緩衝液が除去され、各Ｇ３ Ｆａｂ希釈の１００μＬ／ウェルが添加され、２５℃で１時間、震とうしてインキュベートした。次いで、プレートをプレートウォッシャーを使用してＰＢＳＴで１２回洗浄した。抗ヒトカッパ軽鎖特異的ＨＲＰ結合２次抗体（シグマアルドリッチ）のＰＢＳＴによる１：５０００の希釈がＦａｂ結合の検出用に用いられた。１００μＬ／ウェルの２次希釈が添加され、プレートを振とうしながら、３０分間２５℃でインキュベートした。次いで、プレートをプレートウォッシャーを使用してＰＢＳＴで１２回、手動でＰＢＳで２回洗浄した。結合した二次抗体をＴＭＢ基質（ＫＰＬ）を用いて検出し、続いて等量の１Ｍリン酸でクエンチングした。吸光度を４５０ｎｍで読み取った。Ｇ３ Ｆａｂは濃度依存性結合を、Ｋ１１結合型ジユビキチンのみに対して示したが、モノユビキチン、直鎖状ジユビキチン、Ｋ４８結合型ジユビキチン、又はＫ６３結合型ジユビキチンに対しては示さなかった。したがって、Ｇ３はＥＬＩＳＡフォーマットにおいてＫ１１結合型ジユビキチンに対して非常に特異的である。
Ｇ３ Ｆａｂは，親和性の別の推定値を得るためにＩＣ５０競合ＥＬＩＳＡで更に試験された。初回のタイタ−ＥＬＩＳＡが、ＯＤ４５０＝０．５のシグナルが達成されるであろうＦａｂの濃度を決定するために行われた。Ｋ１１結合型ジユビキチン（ジェネンテック）が９６ウェルのＭａｘｉｓｏｒｂイムノプレート上に、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６中に１μｇ／ｍＬの濃度で、４℃で一晩コーティングすることにより固定化された。コーティングされたプレートは、その後、ＰＢＳＴ中の２．５％のミルクを２００μＬ／ウェルで、１時間、２５℃で震とうさせてブロックされた。Ｇ３ Ｆａｂの１２回の２倍連続希釈が、ＰＢＳＴ中の２．５％のミルク中で１μＭから０．５ｎＭまでなされた。１時間後、ブロッキング緩衝液が除去され、各Ｇ３ Ｆａｂ希釈の１００μＬ／ウェルが添加され、２５℃で１５分間、震とうしてインキュベートした。次いで、プレートをプレートウォッシャーを使用してＰＢＳＴで６回洗浄した。ヤギ抗ヒトＦａｂ断片特異的ＨＲＰ結合２次抗体（シグマアルドリッチ）のＰＢＳＴによる１：５０００の希釈がＦａｂ結合の検出用に用いられた。１００μＬ／ウェルの２次希釈が添加され、プレートを振とうしながら、３０分間２５℃でインキュベートした。次いで、プレートをプレートウォッシャーを使用してＰＢＳＴで１２回、手動でＰＢＳで２回洗浄した。結合した二次抗体をＴＭＢ基質（ＫＰＬ）を用いて検出し、続いて等量の１Ｍリン酸でクエンチングした。吸光度を４５０ｎｍで読み取った。ＯＤ４５０＝０．５のＦａｂの濃度は９４ｎＭであった。可溶性Ｋ１１結合型ジユビキチン＋２．５％ミルク中９４ｎＭのＧ３ ＦａｂのＰＢＳＴによる２倍連続希釈を２５℃で１時間震とうさせてインキュベートした。次に、各Ｋ１１結合型ジユビキチン濃度での非結合Ｆａｂの量が、１μｇ／ｍＬのＫ１１結合型ジユビキチンでコーティングされてかつＰＢＳＴ中２．５％のミルクでブロックされた９６ウェルのＭａｘｉｓｏｒｂイムノプレートにより、その混合物をインキュベートすることにより測定された。Ｆａｂ／Ｋ１１の混合物は、振とうしながら２５℃で１５分間プレート上でインキュベートした。次いで、プレートをプレートウォッシャーを使用してＰＢＳＴで６回洗浄した。ヤギ抗ヒトＦａｂ断片特異的ＨＲＰ結合２次抗体（シグマアルドリッチ）のＰＢＳＴによる１：５０００の希釈がＦａｂ結合の検出用に用いられた。１００μＬ／ウェルの２次希釈が添加され、プレートを振とうしながら、３０分間２５℃でインキュベートした。次いで、プレートをプレートウォッシャーを使用してＰＢＳＴで１２回、手動でＰＢＳで２回洗浄した。結合した二次抗体をＴＭＢ基質（ＫＰＬ）を用いて検出し、続いて等量の１Ｍリン酸でクエンチングした。吸光度を４５０ｎｍで読み取った。吸光度をＫ１１結合型ジユビキチン濃度に対してプロットしたところ、ＩＣ５０が７５ｎＭであることとを示した（図３Ｂ）。これは、上記ＳＰＲによって決定された１０５ｎＭのＫＤと一致している。
Ｇ３ Ｆａｂはまた、Ｋ１１結合型ジユビキチン（ＵＣ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）、モノユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、直鎖状ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｋ４８結合型ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、及びＫ６３結合型ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）へ特異的に結合するその能力についてウエスタンブロット法で試験された。還元剤入り１×ＬＤＳ緩衝液中の１μｇの各タンパク質が７０℃で１０分間加熱され、ＭＥＳ緩衝液中、４−１２％のＮｕＰＡＧＥビストリス１．０ｍｍゲル（インビトロジェン）上で二通りに泳動された。一つのゲルを全てのタンパク質を検出するために、クマシーブルーで染色した。他のゲルは、１０％メタノール及び１×ＮｕＰａｇｅ転写緩衝液（インビトロジェン）中で、一定の３０Ｖで１時間湿式転写により、０．２μｍのニトロルロース（インビトロジェン）に転写された。膜上の非特異的結合部位は、振とうしながら２５℃で１時間、ＰＢＳＴ中の５％ミルクでのインキュベーションによってブロックした。次いで、膜を振とうしながら２５℃で１．５時間ＰＢＳＴ中の５％ミルク中の５μｇ／ｍＬのＧ３ Ｆａｂ溶液中でインキュベートした。膜を振とうしながら、ＰＢＳＴで３回洗浄した。Ｇ３ Ｆａｂは、振とうしながら２５℃で１時間、ＰＢＳＴ中の５％ミルク中のヤギ抗ヒトＦａｂ断片特異的ＨＲＰ結合二次抗体（シグマアルドリッチ）の１：１０，０００希釈液中で膜をインキュベートすることにより検出された。次いで、膜をＰＢＳＴで３回洗浄し、続いてＰＢＳ中で１回洗浄した。二次抗体は、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて検出し、続いてフィルムへブロットを露光した。Ｇ３ Ｆａｂは、Ｋ１１結合型ジユビキチンのみ検出したが、モノユビキチン、直鎖状ジユビキチン、Ｋ４８結合型ジユビキチン、又はＫ６３結合型ジユビキチンは検出しなかった（図３Ｃを参照）。従って、それはウェスタンブロット形式でもまたＫ１１結合型ジユビキチンに対して非常に特異的である。
実施例２：Ｋ６３結合型特異的Ｆａｂの親和性成熟
Ａ．Ｇ３ファージミドの一価Ｆａｂディスプレイへの変換及びテンプレート生成の停止
ＶＨライブラリからのＧ３ファージミドクローンは、親和性成熟を目的として、二価のＦａｂ−ｚｉｐ形式から一価のＦａｂディスプレイへ変換された。ＣＨ１定常ドメインおよびｇｐＩＩＩの端部との間のロイシンジッパーはクンケル突然変異誘発を用いて除去した（Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 (1985)を参照）。ライブラリー合成のために、ＴＡＡ停止コドンが、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、ＣＤＲ Ｌ３、ＣＤＲ Ｈ３、又はＣＤＲのＬ３及びＨ３の両方の何れかに別個に同時に導入された（それぞれ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ３の停止テンプレート、及びＬ３／Ｈ３の停止テンプレートを生じる）。停止コドンは、完全長Ｆａｂの発現を得て、ファージ上に表示するためにその停止の修復を必要とすることにより、特定のＣＤＲループ内に多様性を余儀なくする。変異原性オリゴヌクレオチドのＦ２２０−ｄｅｌｚｉｐ（ＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＴ）（配列番号３５）は、下記に列挙された停止コドン変異原性オリゴヌクレオチドのそれぞれと１μｇのＧ３ファージミドクンケルＤＮＡとに別々に組み合わされた。軽鎖のＣＤＲ Ｌ１内の位置２４（カバット番号付け）でのＴＡＡ停止コドンの挿入に使用されたＣＤＲ Ｌ１停止変異原性オリゴヌクレオチドは、４Ｄ５ＬＣ１．ｓｔｏｐ（ＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＴＡＡＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧ）（配列番号３６）であった。軽鎖のＣＤＲ Ｌ２内の位置５０（カバット番号付け）でのＴＡＡ停止コドンの挿入に使用されたＣＤＲ Ｌ２停止変異原性オリゴヌクレオチドは、４Ｄ５ＬＣ２．ｓｔｏｐ（ＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＡＣＴＡＡＧＣＡＴＣＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣ）（配列番号３７）であった。軽鎖のＣＤＲ Ｌ３内の位置８９（カバット番号付け）でのＴＡＡ停止コドンの挿入に使用されたＣＤＲ Ｌ３停止変異原性オリゴヌクレオチドは、４Ｄ５ＬＣ３．ｓｔｏｐ（ＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＴＡＡＣＡＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＡＣＴＣ）（配列番号３８）であった。重鎖のＣＤＲ Ｈ３内の位置９８（カバット番号付け）でのＴＡＡ停止コドンの挿入に使用されたＣＤＲ Ｈ３停止変異原性オリゴヌクレオチドは、ＶＨ５ＣＤＲＨ３：４１３Ｖｈ５ＳＲｏ６（ＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＧＴＧＡＧＧＣＣＴＣＧＴＡＡＣＴＧＣＣＣＣＣＣＴＡＣＧＴＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＡＣＴＡＧＴＣ）（配列番号３９）であった。得られた一価Ｆａｂファージミド停止テンプレートは親和性成熟ライブラリ生成のために使用された。
Ｂ．親和性成熟ライブラリの生成
二つの親和性成熟のアプローチが取られた。最初のアプローチでは、ライブラリは軽鎖においてのみアミノ酸の多様性を含んで生成された。後述するように、これらの「軽鎖」ライブラリは、それぞれの軽鎖ＣＤＲ位置のソフトランダム化（ｓｏｆｔ ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ）を許容した。第ニのアプローチでは、ライブラリは、重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲの両方において様々な組み合わせでアミノ酸の多様性を含んで生成された。これらの「重鎖」ライブラリーは、以下に説明するように、天然に生じるヒト抗体に見いだされるアミノ酸の多様性、又は主に表面に露出する残基のソフトランダム化のいずれかを含んでいた。
全てのライブラリは、クンケル突然変異誘発によって生成された（Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 (1985)を参照）。ソフトランダム化の場合には、野生型残基が５０％の時間を保持されれ、かつ５０％の時間は残りの１９アミノ酸の一つがコード化されるであろうように、縮重オリゴヌクレオチドが合成された。ソフトランダム化を達成するために、あるヌクレオチド位置が指定の塩基でその時間の７０％を占め、時間の１０％が三つの他の塩基の一つで占められるように、オリゴヌクレオチドが設計された (Gallop et al., J. Med. Chem. 37:1233 (1994))。そのようなソフトランダム化が、特定の塩基で含まれていたオリゴヌクレオチドについて、ソフトランダム化の存在はその塩基位置の番号の存在で示される。番号「５」は、塩基のアデニンが時間の７０％その位置に存在し、一方、塩基のグアニン、シトシン、チミンはぞれぞれ時間の１０％である。同様に、番号「６」は、グアニン、「７」はシトシン、「８」はチミンを指し、各場合において、他の三つの塩基の各々は時間の１０％だけ存在する。ハードランダム化の場合、縮重オリゴヌクレオチドは、天然型ヒト抗体内の特定の位置で見つかるアミノ酸の多様性が許容されるであろうように合成された。この場合、縮重コドンが用いられ、文字「Ｒ」は、グアニン又はアデニンをコード化し、「Ｙ」は、チミン又はシトシンをコードし、「Ｍ」は、アデニン又はシトシンをコードし、「Ｋ」は、グアニン又はチミンをコードし、「Ｓ」は、グアニン又はシトシンをコードし、「Ｗ」は、アデニン又はチミンをコードし、「Ｈ」は、アデニン、シトシン、又はチミンをコードし、「Ｂ」は、グアニン、チミン、又はシトシンをコードし、「Ｖ」は、グアニン、シトシン、又はアデニンをコードし、「Ｄ」は、グアニン、アデニン、又はチミンをコードし、「Ｎ」は、グアニン、アデニン、シトシン又はチミンをコードしている。
「軽鎖」ライブラリが作成され、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ１／Ｌ２／Ｌ３と命名された。Ｌ１ライブラリは、軽鎖の位置２４−３４（カバット番号付け）をソフトランダム化した。変異原性オリゴヌクレオチドＬ１（ＧＡＴＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣ７６８６７６５６７７５６６５８６８６５６７５７７６７６６８６６７６Ｔ ＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＡ）（配列番号４０）及び２０μｇのＬ１停止テンプレートのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）が、クンケル突然変異生成によるライブラリの作成に用いられた。Ｌ２ライブラリは、軽鎖の位置５０−５６（カバット番号付け）をソフトランダム化した。変異原性オリゴヌクレオチドＬ２（ＡＡＡＧＣＴＣＣＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＡＣ５６７６７６５６７８８７７８６８５７５６７ ＧＧＡＧＴＣＣＣＴＴＣＴＣＧＣＴＴＣＴＣＴ）（配列番号４１）及び２０μｇのＬ２停止テンプレートのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）が、クンケル突然変異生成によるライブラリの作成に用いられた。Ｌ３ライブラリは、軽鎖の位置８９−９７（カバット番号付け）をソフトランダム化した。変異原性オリゴヌクレオチドＬ３（ＧＡＣＴＴＣＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴ７５６７５６５６７８５７５７７５７７７７ ６７７６５７７ＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＣＣＡＡＧＧＴＧ）（配列番号４２）及び２０μｇのＬ３停止テンプレートのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）が、クンケル突然変異生成によるライブラリの作成に用いられた。Ｌ１／Ｌ２／Ｌ３ライブラリは、軽鎖の位置２４−３４、５０−５６、及び８９−９７（カバット番号付け）をソフトランダム化した。上述された変異原性オリゴヌクレオチドのＬ１（配列番号４０）、Ｌ２（配列番号４１），及びＬ３（配列番号４２）及び２０μｇのＬ３停止テンプレートのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）が、クンケル突然変異生成によるライブラリの作成に用いられた。
６つの「重鎖」ライブラリもまた作成され、Ｌ１／Ｌ２／Ｌ３ハード、Ｌ３／Ｈ１／Ｈ２、Ｌ３／Ｈ３、Ｌ１／Ｈ３、Ｈ２／Ｈ３、及びＨ３と命名された。Ｌ１／Ｌ２／Ｌ３ハードライブラリは、ハードランダム化された軽鎖の位置２８−３３、５０、５３、５５、９１−９４、及び９６（カバット番号付け）を、天然型抗体内でこれらの位置で見出されるアミノ酸の多様性を可能とするために、有していた。Ｌ１変異原性オリグヌクレオチドのＦ１１１−Ｌ１（ＡＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＣＡＧＴＣＡＧＲＤＴＲＫＴＲＶＷＡＮＷＴＨＴＧＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣ ＡＧＡＡＡＣ）（配列番号４３）及びＦ２０２−Ｌ１（ＡＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＣＡＧＴＣＡＧＲＤＴＲＫＴＲＶＷＡＮＷ ＴＨＴＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣ）（配列番号４４）が１：２の比率で混合され、Ｌ２変異原性オリグヌクレオチドのＦ２０１−Ｌ２（ＣＣＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＡＣＫＢＧＧＣＡＴＣＣＡＶＣＣＴＣＴ ＡＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴ）（配列番号４５）及びＦ２０３−Ｌ２（ＣＣＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＡＣＫＢＧＧＣＡ ＴＣＣＡＶＣＣＴＣＧＭＡＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＴＣＴＣＧＣ）（配列番号４６）が１：１の比率で混合され、かつＬ３変異原性オリグヌクレオチドのＦ１３３ａ（ＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＴＭＴＤＭＣＲＶＴ ＮＨＴＣＣＴＹＫＧＡＣＧＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＣＣ）（配列番号４７）、Ｆ１３３ｂ（ＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧ ＴＣＡＧＣＡＡＴＭＴＤＭＣＲＶＴＮＨＴＣＣＴＴＷＴＡＣＧＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＣＣ）（配列番号４８）、Ｆ１３３ｃ（ＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＳＲＴＤＭＣＲＶＴＮＨＴＣＣＴＹＫＧＡＣＧＴＴＣＧＧＡＣＡＧ ＧＧＴＡＣＣ）（配列番号４９）、Ｆ１３３ｄ（ＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＳＲＴＤＭＣＲＶＴＮＨＴ ＣＣＴＴＷＴＡＣＧＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＣＣ）（配列番号５０）が１：１：１：１の比率で混合された。これらの混合物の各々の等量及び２０μｇのＬ３停止テンプレートのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）が、クンケル突然変異生成によるライブラリの作成に用いられた。
Ｌ３／Ｈ１／Ｈ２ライブラリは、軽鎖の位置９１−９４、９６（カバット番号付け）及び重鎖の位置３０−３２、５０、５２（５２ａではなく）、５３、及び５４（カバット番号付け）をソフトランダム化した。Ｌ３変異原性オリグヌクレオチドのＦ５６３−Ｌ３ソフト１（ＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡ ８７８８５７５７７５７７ＣＣＴ７７７ＡＣＧＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＣＣ）（配列番号５１）、Ｆ５６４−Ｌ３ソフト２（ＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡ８７８８５７５７７５７７ＣＣＴＴＷＴＡＣＧＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＣＣ）（配列番号５２）、及びＦ５６５−Ｌ３ソフト３（ＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡ８７８８５７５７７５７７ＣＣＴＹＫＧＡＣＧＴＴＣＧＧ ＡＣＡＧＧＧＴＡＣＣ）（配列番号５３）が、１：０．５：１の比率で混合された。Ｌ３オリゴ混合物及び変異原性オリグヌクレオチドのＧ３ＣＤＲＨ１ソフト（ＧＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣ８７８５５８８７ ８ＴＡＴＡＴＴＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＴＣＡＧ）（配列番号５４）及びＧ３ＣＤＲＨ２ソフト（ＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧ ＧＴＴＧＣＴ６６８ＡＴＴ５５８ＣＣＴ５５８６６８ＧＧＴＴＡＴＡＣＴＴＡＣＴＡＴＧＣＣＧ）（配列番号５５）の等量、及び２０μｇのＬ３停止テンプレートのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）が、クンケル突然変異生成によるライブラリの作成に用いられた。
Ｌ３／Ｈ３ライブラリは、軽鎖の位置９１−９４、９６（カバット番号付け）及び重鎖の位置９８−１００及び１００ｂ（カバット番号付け）をソフトランダム化した。上述されたＬ３変異原性オリグヌクレオチドのＦ５６３−Ｌ３ソフト１（配列番号５１）、Ｆ５６４−Ｌ３ソフト２（配列番号５２），及びＦ５６５−Ｌ３ソフト３（配列番号５３）が、１：０．５：１の比率で混合された。Ｌ３オリゴ混合物及び変異原性オリグヌクレオチドのＧ３ＣＤＲＨ３ソフト（ＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＧＴ ＧＡＧＴＧＧＴＡＣ８８８６６８６６８ＴＡＣ６８８ＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣ）（配列番号５６）の等量、及び２０μｇのＬ３／Ｈ３停止テンプレートのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）が、クンケル突然変異生成によるライブラリの作成に用いられた。
Ｌ１／Ｈ３ライブラリは、軽鎖の位置２８−３３（カバット番号付け）をハードランダム化させ、天然型ヒト抗体内のこれらの位置に見いだされるアミノ酸の多様性を可能としており、重鎖の位置９８−１００及び１００ｂ（カバット番号付け）をソフトランダム化させた。Ｌ１変異原性オリグヌクレオチドのＦ１１１−Ｌ１（配列番号４３）及びＦ２０２−Ｌ１（配列番号４４）が、１：２の比率で混合された。Ｌ１オリゴ混合物と変異原性オリグヌクレオチドのＧ３ＣＤＲＨ３ソフト（配列番号５６）の等量、及び２０μｇのＬ１停止テンプレートのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）が、クンケル突然変異生成によるライブラリの作成に用いられた。
Ｈ２／Ｈ３ライブラリは、重鎖の位置５０、５２（５２ａでなく）、５３、５４、９８−１００、及び１００ｂ（カバット番号付け）をソフトランダム化した。変異原性オリゴヌクレオチドのＧ３ＣＤＲＨ２ソフト及びＧ３ＣＤＲＨ３ソフト（配列番号５５及び５６） 及び２０μｇのＨ３停止テンプレートのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）が、クンケル突然変異生成によるライブラリの作成に用いられた。
Ｈ３ライブラリは、重鎖の位置９８−１００及び１００ｂ（カバット番号付け）をソフトランダム化した。変異原性オリゴヌクレオチドのＧ３ＣＤＲＨ３ソフト（配列番号５６）及び２０μｇのＨ３停止テンプレートのクンケルＤＮＡ（実施例２Ａに記載）が、クンケル突然変異生成によるライブラリの作成に用いられた。
変異誘発反応は電気的形質転換受容性のＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ストラタジーン）大腸菌中へ電気穿孔され、３７℃で４５分間震とうさせて、２５ｍＬのＳＯＣ培地に回収された。２０マイクロリットルが除去され、１０倍希釈がカルベニシリンを含有する固形寒天プレート上に蒔かれ、ライブラリのサイズを決定するために、３７℃で一晩増殖させた。残った培養物は、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンと１０１０ファージ／ｍＬのＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを含有する５００ｍＬの２ＹＴブロスへ移された。細胞は、３７℃で１時間、震とうして感染させた。５０μｇ／ｍＬのカナマイシンが添加され、培養物は更に７時間３７℃で震とうして増殖させた。温度をその後３０℃へシフトさせ、培養物を更に２２時間増殖させた。ライブラリは、各々少なくとも〜３．５×１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含有した。ファージを、２０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／２．５ＭのＮａＣｌの１／５量により２ラウンドの沈降により培養上清から精製した。
Ｃ．親和性成熟ライブラリの選別
「軽鎖」ライブラリーは４ラウンドの選別を受けた。４つのライブラリの各々は、以下のプロトコールを用いる全４ラウンドを通して平行して別々に選別された。第一ラウンドは、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｂイムノプレート（ＮＵＮＣ）上に固定化されたＫ１１結合型ジユビキチンによるプレートベースでの選別であった。プレートは、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６中の５μｇ／ｍＬのＫ１１結合型ジユビキチンで４°Ｃで一晩コーティングされた。コーティングされたプレートは、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳＴ中の２．５％のミルクを２００μＬ／ウェルで、１時間、２５℃で震とうさせてブロックされた。ファージライブラリはＰＢＳＴ中の２．５％のミルクでＯＤ＝２．０まで希釈され、３０μｇ／ｍＬのモノユビキチンが対抗選択のために添加された。１時間後、ブロッキング緩衝液が除去され、１００μＬ／ウェルのファージが添加され、２５℃で１時間、震とうしてインキュベートした。結合後、プレートは、ＰＢＳＴにより、手作業でウェルを満たし、洗浄の間に緩衝液を取り除くことにより、２０回洗浄された。ファージは５０ｍＭのＨＣｌ／５００ｍＭのＫＣｌが１５０μＬ／ウェルで３０分間２５℃で震とうさせて溶出した。溶出は１Ｍのトリス、ｐＨ７，５を１５０μＬ／ウェルで中和され、その後、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを添加したＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌（ストラタジーン）で増殖された。
増幅されたファージは、溶液ベースの選別において、Ｋ１１結合型ジユビキチンに対する選択の更なるラウンドで使用された。Ｋ１１結合型ジユビキチン（ＵＣ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）は、ＥＺ−Ｌｉｎｋ スルホ−ＮＨＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の３倍モル過剰でビオチン化された。第二の選別において、ニュートラアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｂイムノプレート（ＮＵＮＣ）に固定化された。プレートは、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６中の５μｇ／ｍＬのニュートラアビジンで４°Ｃで一晩コーティングされた。コーティングされたプレートは、その後、ＰＢＳＴ中の２．５％のミルクを２００μＬ／ウェルで、１時間、２５℃で震とうさせてブロックされた。第一ラウンドの選別からのファージは、２５０ｎＭのビオチン化Ｋ１１結合型ジユビキチン（ＵＣ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）及びモノユビキチン、直鎖状ジユビキチン、Ｋ４８結合ポリユビキチン２−７、及びＫ６３結合ポリユビキチン２−７（全てＢｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍから）の各々を１０μｇ／ｍＬを対抗選択のために含む、ＰＢＳＴ中の２．５％ミルクで、ＯＤ＝１．０まで希釈した。ファージは、溶液中で２時間２５℃で回転により、ビオチン化Ｋ１１結合型ジユビキチンに結合させた。結合後、ファージはＰＢＳＴ中の２．５％のミルクで５倍に希釈され、ビオチン化Ｋ１１結合型ジユビキチンに結合したファージは、２５℃で１０分間の震とうにより、ニュートラアビジンプレート上へ捕獲された。捕獲後、プレートは、ＰＢＳＴにより、手作業でウェルを満たし、洗浄の間に緩衝液を取り除くことにより、３０回洗浄された。ファージは５０ｍＭのＨＣｌ／５００ｍＭのＫＣｌが１００μＬ／ウェルで３０分間２５℃で震とうさせて溶出した。溶出は１Ｍのトリス、ｐＨ７，５を１００μＬ／ウェルで中和され、その後、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを添加したＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌（ストラタジーン）で増殖された。
後者の選別のストリンジェンシーは、３つの方法で、即ち、選別に使用されたビオチン化Ｋ１１結合型ジユビキチンの量を減少させることにより、プレート洗浄の回数と時間を増加することにより、及びファージ結合の時間を減少させることにより増大した。第三の選別は、プレート洗浄回数を４０回に増やしたことを除いて、上述の第二の選別と同様に実施された。第四の選別は、ビオチン化Ｋ１１結合型ジユビキチンの量を１００ｎＭに減らし、結合時間を１時間に減らし、かつ４回の更なるプレート洗浄が追加されたことを除き、第三の選別と同様に実施された。これらの洗浄液は、２５℃で１５分間震とうしてインキュベートした。濃縮は、各ラウンドについて、Ｋ６３結合型ジユビキチンで回収されたファージの数を、プレート選別においてコーティングされていないウェル又は溶液選別においてニュートラアビジンコーティングされたウェルに対して、比較することで計算された。濃縮は、４つのライブラリの全てにおいて全４ラウンドで観察された（表３を参照）。
４ラウンドの選別後に、４８の個々のクローンが４つのライブラリの各々から選ばれ（合計１９２）、９６ウェル形式で、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン及び１０１０ファージ／ｍＬのＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを含有する２ＹＴブロスの１ｍＬで増殖させた。それらの培養物からの上清が、Ｋ１１結合型ジユビキチン（ＵＣ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）、モノユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、直鎖状ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｋ４８結合ポリユビキチン２−７（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｋ６３結合ポリユビキチン２−７（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、抗ｇＤ抗体（ジェネンテック）、又は非コーティングウェルに対する結合に対して、ハイスループットファージスポットＥＬＩＳＡで使用された。３２のクローンが、Ｋ１１結合型ジユビキチンに対する特異的結合を示すとして同定された。
「重鎖」ライブラリーは４ラウンドの選別を受けた。４つのライブラリの各々は、第一ラウンドで平行して選別され、次いで、２から４までの選別のために貯えられた。プレートベースの選別が、「軽鎖」ライブラリについて上述された通りに、第一ラウンドで使用された。増幅したファージが、選別の後のラウンドで使用された。後者の選別のストリンジェンシーは、４つの方法、即ち、選別に使用されたビオチン化Ｋ１１結合型ジユビキチンの量を減少させることにより、プレート洗浄の回数と時間を増加することにより、ファージ結合の時間を減少させることにより、及び、ニュートラアビジンで捕獲する前にファージ結合を競合するために、過剰の非ビオチン化Ｋ１１結合型ジユビキチンを添加することにより、増大した。第二の選別は溶液ベースであって、１００ｎＭのビオチン化Ｋ１１結合型ジユビキチンが使用され、全６つのライブラリが貯蔵され一緒に選別されることを除き、「軽鎖」ライブラリについて上述したとおりに実施された。第三の選別は、１０ｎＭのビオチン化Ｋ１１結合型ジユビキチンが使用され、結合時間が１時間に減少されることを除き、「軽鎖」ライブラリについて記述したとおりに実施された。第四の選別は、三つの平行した選別が、５ｎＭ、１ｎＭ、及び０．５ｎＭのビオチン化Ｋ１１結合型ジユビキチンにより行われたことを除き、「軽鎖」ライブラリについて上述したとおりに実施された。更に、ファージ結合の１時間後、及びニュートラアビジンで捕獲前に、３０μｇ／ｍＬの非ビオチン化Ｋ１１結合型ジユビキチン（ＵＣ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）が添加され、２５℃で３０分回転させてファージ結合を競合させ、遅いオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を持つクローンを選択した。濃縮は上記のように各ラウンドごとに算出した。濃縮は、全４ラウンドで観察された（表３を参照）。
４ラウンドの選別後に、１９２のクローンが選ばれ、９６ウェル形式で、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン及び１０１０ファージ／ｍＬのＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを含有する２ＹＴブロスの１ｍＬで増殖させた。それらの培養物からの上清が、Ｋ１１結合型ジユビキチン、モノユビキチン、直鎖状ジユビキチン、Ｋ４８結合ポリユビキチン２−７、Ｋ６３結合ポリユビキチン２−７、抗ｇＤ抗体、又は非コーティングウェルに対する結合に対して、ハイスループットファージスポットＥＬＩＳＡで使用された。２３のクローンが、Ｋ１１結合型ジユビキチンに対する特異的結合を示すとして同定された。単一スポット競合ファージＥＬＩＳＡが、どのクローンが親のＧ３クローンよりも親和性の最大の改善があったかを決定するために行われた。ファージスポットＥＬＩＳＡ（実施例２Ｃ）からのファージ上清を用いた。競合ＥＬＩＳＡが、ファージ上清が、精製Ｆａｂの代わりに使用され、可溶性Ｋ１１結合型ジユビキチン（ジェネンテック）の単一濃度（５０ｎＭ）のみ使用された点を除いて、ＩＣ５０ ＥＬＩＳＡについて記載のように行われた（実施例１Ｂ）。競合はまた、各クローンについても、任意の競合する抗原の非存在下でファージ結合シグナルを決定するために、任意の可溶性Ｋ１１結合型ジユビキチンを添加すること無しで行われた。５０ｎＭのＫ１１結合型ジユビキチンの存在下における結合の阻害率は、［１−（５０ｎＭのＫ１１におけるＯＤ４５０／Ｋ１１無しにおけるＯＤ４５０）］×１００％として計算された。Ｇ３親クローンは、５０ｎＭのＫ１１結合型ジユビキチンの存在下で、平均で３３％の阻害を示した。６０％又はそれ以上の阻害を示すクローンが、更なる解析のために選択された。
Ｄ．親和性成熟クローンの配列決定
単一スポット競争ファージＥＬＩＳＡ（実施例２Ｃ）で同定された最高の親和性クローンの軽鎖と重鎖の両方が配列決定された。合計８の固有の親和性成熟クローンが、複数の同一同胞とともに、同定された（図４Ａ及び４Ｂ）（表４参照）。クローンＧ３Ｌ１．１Ａ１１、Ｇ３Ｌ１．１Ｃ１２、Ｇ３ＨＣ．２Ａ３、及びＧ３ＨＣ．２Ｇ４は、ＣＤＲ Ｌ１内にのみ変異を含んでいた。クローンＧ３ＨＣ．２Ａ６及びＧ３ＨＣ．２Ｄ７は、ＣＤＲ Ｈ３内に変異を含んでいた。Ｇ３Ｌ２．１Ｆ１２は、このファージ選別に使用されたＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌などのアンバーサプレッサー株で発現された場合、グルタミンで置換可能であるアンバー停止コドンを含む、ＣＤＲ Ｌ２内に変異を含んでいた。クローンのＧ３ＨＣ．２Ｅ６は、ＣＤＲ Ｈ２内においてのみ変異を含んでいた。
上記クローンにおいて変異性を示した軽鎖ＨＶＲ領域のコンセンサスアミノ酸配列は：ＨＶＲ−Ｌ１：Ｘ２２ Ｘ２３ Ｓｅｒ Ｘ２４ Ｘ２５ Ｘ２６ Ｘ２７ Ｘ２８ Ｘ２９ Ｘ３０ Ｘ３１（配列番号７３）を含み、Ｘ２２はアルギニン及びグリシンから選択され、Ｘ２３はアラニン及びバリンから選択され、Ｘ２４はグルタミン及びヒスチジンから選択され、Ｘ２５はアスパラギン酸、アスパラギン、及びイソロイシンから選択され、Ｘ２６はロイシン及びバリンから選択され、Ｘ２７はセリン、アスパラギン酸、グリシン、及びグルタミン酸から選択され、Ｘ２８はスレオニン及びセリンから選択され、Ｘ２９はアラニン、バリン、及びフェニルアラニンから選択され、Ｘ３０はバリン及びイソロイシンから選択され、Ｘ３１はセリンから選択され、かつＨＶＲ−Ｌ２：Ｘ３２ Ｘ３３ Ｘ３４ Ｐｈｅ Ｘ３５ Ｔｙｒ Ｓｅｒ （配列番号７４）を含み、Ｘ３２はセリン及びアスパラギンから選択され、Ｘ３３はグルタミン及びアラニンから選択され、Ｘ３４はグルタミン酸及びセリンから選択され、Ｘ３５はロイシン及びバリン７から選択される、であった。
上記クローンにおいて変異性を示した重鎖ＨＶＲ領域のコンセンサスアミノ酸配列は：ＨＶＲ−Ｈ２：Ｘ３６ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｘ３７ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ（配列番号７５）、Ｘ３６はアラニン及びグリシンから選択され、Ｘ３７はアラニン及びアスパラギンから選択され、かつ ＨＶＲ−Ｈ３：Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｘ３８ Ｘ３９ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｔｙｒ（配列番号７６）、Ｘ３８はフェニルアラニン及びチロシンから選択され、Ｘ３９はグリシン及びアスパラギン酸から選択される、であった。
Ｅ．ファージ特異性ＥＬＩＳＡ
異なる結合のポリユビキチンに対する８つの親和性成熟クローンの特異性が、ファージＥＬＩＳＡでアッセイされた。ファージＥＬＩＳＡは、ファージ上清の代わりに、ＯＤ２６８＝１．０で始まる６回の５倍連続希釈が使用された点を除いて、実施例１で記載のように実行された。全ての親和性成熟クローンは、ファージ濃度依存的にＫ１１結合型ジユビキチンに結合した（図５）。Ｋ４８結合ポリユビキチンへの非常に弱い結合のみ、試験された最高のファージ濃度で見られた。
Ｆ．Ｆａｂの産生、親和性解析、及びハイブリッド生成
Ｇ３の親のＦａｂ可変ドメイン及び８つの親和性成熟Ｆａｂ可変ドメインが、軽鎖定常ドメインにｇＤタグを欠くＦａｂ発現プラスミド中にクローニングされた。更に、クローンＧ３Ｌ２．１Ｆ１２のＣＤＲ Ｌ２内のアンバーｓｔｏｐ（ＴＡＧ）が、グルタミンをコードするＣＡＧに変異された。変異原性オリグヌクレオチド５’−Ｇ３ＬＣ１Ｆ１２ｓｔｏｐＱ（ＣＣＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＡＣＡＡＣＣＡＧＧＡＡ ＴＴＣＧＴＧＴＡＣＡＧＣＧＧＡＧＴＣ）（配列番号７７）及び３’−Ｇ２ＬＣＦ１２ｓｔｏｐＱ（ＧＡＣＴＣＣＧＣＴＧＴＡ ＣＡＣＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＴＴＧＴＡＡＡＴＣＡＧＡＡＧＣＴＴＣＧＧ）（配列番号７８）が、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（ストラタジーン）を使用してＴＡＧコドンをＣＡＧコドンで置換するために使用された。得られたプラスミドは、大腸菌株６４Ｂ４（ジェネンテック）に形質転換され。可溶性Ｆａｂとして発現され、実施例１に記載のようにプロテインＡ−セファロースを使用して精製された。精製されたＦａｂは、実施例１に記載のように、それらの親和性を決定するために、同一のチップを用いて、ＳＰＲ実験に使用された。全ての８つのクローンは、親分子に対する、Ｋ１１結合型ジユビキチンの解離定数（ＫＤ）の改善を示し、Ｋ４８結合型ジユビキチン又はＫ６３結合型ジユビキチンの何れにも検出可能な結合は見られなかった（表２を参照）。
軽鎖中で変異を持つ高親和性クローンは、Ｇ３Ｌ１．１Ｃ１２及びＧ３ＨＣ．２Ａ３であり、解離定数はそれぞれ３５ｎＭと２５ｎＭであった。双方ともＣＤＲ Ｌ１の変化のみ含有しており（図４Ａ及び４Ｂを参照）、親のＧ３クローンに対して、会合定数（ｋａ）と解離定数（ｋｄ）の両方で改善が見られた（表２）。重鎖に変異を持つ最高親和性クローンは、４７ｎＭの解離定数を持つ、Ｇ３ＨＣ．２Ｅ６であった。このクローンはＣＤＲ Ｈ２の変化のみ含有しており、解離定数の改善のみが観察された。
実施例２Ｂに記載の親和性成熟ライブラリ設計に起因し、ＣＤＲ Ｌ１及びＣＤＲ Ｈ２の両方の変化を許容するであろうＣＤＲ変異の組合わせは無かった。従って、ハイブリッドのＦａｂファージミドは、軽鎖のＧ３Ｌ１．１Ｃ１２と重鎖のＧ３ＨＣ．２Ｅ６を組合わせたか（得られたクローンは１Ｃ１２／２Ｅ６）、又は軽鎖のＧ３ＨＣ．２Ａ３と重鎖のＧ３ＨＣ．２Ｅ６を組合わせた（得られたクローンは２Ａ３／２Ｅ６）、標準的な制限消化クローニング方法を使用して生産された（図６Ａ及び６Ｂを参照）。これらのハイブリッドはまた、可溶性Ｆａｂとして発現され、精製され、実施例１Ｃと１Ｄに記載されているように、ＳＰＲによって分析した。これらの重鎖と軽鎖の組み合わせは、添加剤の親和性の改善をもたらした（表２を参照）。１Ｃ１２／２Ｅ６と２Ａ３／２Ｅ６の両方とも、Ｇ３親Ｆａｂに比べ親和性のほぼ９倍の改善に相当する、Ｋ１１結合型ジユビキチンに対する１２ｎＭの解離定数を有し、そのことは両方のハイブリッドに対する会合定数と解離定数の両方の改善に起因していた。更に、１Ｃ１２／２Ｅ６又は２Ａ３／２Ｅ６のどちらとも、Ｋ４８結合型又はＫ６３結合型ジユビキチンに検出可能な結合を示さなかった。
Ｇ．ＩｇＧフォーマットへの変換及び親和性解析
親のＦａｂ（Ｇ３）及び２つの親和性成熟ハイブリッドＦａｂ（１Ｃ１２／２Ｅ６及び２Ａ３／２Ｅ６）は、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）として２９３細胞で発現させた。発現コンストラクトは、ヒトカッパＩｇＧ１の重鎖及び軽鎖をコードするｐＲＫ哺乳動物発現コンストラクト中にＦａｂ可変ドメインをクローニングすることにより作成された。ＩｇＧは、（実施例１におけるＦａｂの精製について記載されたように）標準的な方法論により、プロテインＡセファロースカラム上で、親和性クロマトグラフィーで精製され、ＰＤ１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＰＢＳにバッファー交換された。
ハイブリッドＦａｂの親和性は、ＣＭ５チップ上に直接抗原をアミン結合させるＳＰＲ実験にＳＰＲにより決定された（実施例２Ｆ）。これは、抗原上で利用可能なリジン側鎖の１級アミンを含有した。２つのユビキチンモノマーを一緒に連結してジユビキチンを形成するイソペプチド結合に関与するリジンは、カップリングには利用できないであろう。Ｋ１１、Ｋ４８、及びＫ６３結合型ジユビキチンは、イソペプチド結合に関与する異なるリジン残基を有するため、チップへのカップリングに利用可能なリジンもまた異なり、従って、異なるエピトープが、結果として抗体結合に利用可能か又は利用できない場合がある。
チップに結合したリジンの交絡作用を潜在的に避けるために、この実施例で生成されたＩｇＧの親和性を、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でＩｇＧ捕獲を使用するＳＰＲで試験した抗ヒトＦｃ捕捉抗体 （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のおよそ１１５００の共鳴ユニット（ＲＵ）が、製造者により供給されたアミン結合プロトコルを用いて、ＣＭ５チップのフローセルの１又は２に固定された。１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．０１％のＴｗｅｅｎ ２０（ＨＢＳＴ）中の６０μＬの０．５μｇ／ｍＬのＩｇＧが、フローセル２上で流量３０μＬ／分で注入され、結果として約８００ＲＵのＩｇＧが捕捉された。フローセル１は、基準の減算として働く捕捉抗体のみを有していた。Ｋ１１結合型ジユビキチン（ジェネンテック）、Ｋ４８結合型ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、又はＫ６３結合型ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）のＨＢＳＴによる２倍連続希釈が、フローセル１及び２に注入された（流量３０μＬ／分で全６０μＬ）。各フローセルにおいて信号が記録され、基準信号を減算した。４分間の解離時間の後、チップ表面を１５μＬの３ＭのＭｇＣｌ２で再生した。データは、Ｇ３ ＩｇＧの物質移動による１：１の結合モデルにフィットさせたか、又は１Ｃ１２／２Ｅ６ ＩｇＧ及び２Ａ３／２Ｅ６ ＩｇＧに対する変動ベースラインによる１：１の結合モデルにフィットさせた。速度定数と結合定数は、製造業者によって提供されたソフトウェアを使用して、非線形回帰分析により同時に算出し、表５に示されている。
Ｇ３ ＩｇＧはＫ１１ジユビキチン結合に対するＫＤが１２９ｎＭであり、１Ｃ１２／２Ｅ６ ＩｇＧ及び２Ａ３／２Ｅ６ ＩｇＧの両方ともＫＤが２０ｎＭで結合した。これらの親和性は矛盾が無く、抗原法の直接結合を使用して、同じＦａｂについて測定された結合定数の許容可能な誤差の２倍の範囲内であった（表２を参照）。更に、Ｋ４８結合型ジユビキチン又はＫ６３結合型ジユビキチンへの検出可能な結合は見られなかった。
実施例３：親和性成熟ハイブリッド抗Ｋ１１抗体の特性評価
Ａ．ＩｇＧ特異性ＥＬＩＳＡ
Ｇ３の親ＩｇＧ、１Ｃ１２／２Ｅ６ ＩｇＧ及び２Ａ３／２Ｅ６ ＩｇＧがＥＬＩＳＡによりユビキチンタンパク質のパネルへの結合について試験された。Ｋ１１結合型ジユビキチン（ジェネンテック）、モノユビキチン、直鎖状ジユビキチン、Ｋ４８結合型ジユビキチン、Ｋ６３結合型ジユビキチン、Ｋ４８結合ポリユビキチン、Ｋ６３結合ポリユビキチン（全てＢｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍから）が、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｂイムノプレート上に固定された。プレートは、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６中において、１μｇ／ｍＬの各タンパク質で２５℃で２時間コーティングされた。コーティングされたプレートは、その後、ＰＢＳＴ中の２．５％のミルクを２００μＬ／ウェルで、１時間、２５℃で震とうさせてブロックされた。Ｇ３親ＩｇＧ、１Ｃ１２／２Ｅ６ ＩｇＧ及び２Ａ３／２Ｅ６ ＩｇＧのＰＢＳＴ中２．５％ミルクによる１１回の２倍連続希釈が２０μｇ／ｍＬから０．０２μｇ／ｍＬまで行われた。１時間後、ブロッキング緩衝液が除去され、各ＩｇＧ希釈の１００μＬ／ウェルが添加され、２５℃で１時間、震とうしてインキュベートした。次いで、プレートをプレートウォッシャーを使用してＰＢＳＴで６回洗浄した。ヤギ抗ヒトＦｃγ特異的ＨＲＰ結合Ｆ（ａｂ’）２２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）のＰＢＳＴによる１：５０００の希釈がＩｇＧ結合の検出用に用いられた。１００μＬ／ウェルの２次希釈が添加され、プレートを振とうしながら、２５℃で３０分間インキュベートした。次いで、プレートをプレートウォッシャーを使用してＰＢＳＴで１２回、手動でＰＢＳで２回洗浄した。結合した二次抗体をＴＭＢ基質（ＫＰＬ）を用いて検出し、続いて等量の１Ｍリン酸でクエンチングした。吸光度を４５０ｎｍで読み取った。３つ全てのＩｇＧが、非常に低濃度のＩｇＧでさえも、Ｋ１１結合型ジユビキチンを認識した。Ｋ１１結合型ジユビキチン結合についてほぼ同じシグナルが、各ＩｇＧ濃度でＧ３、１Ｃ１２／２Ｅ６、及び２Ａ３／２Ｅ６について、それらの間に７倍から９倍の親和性の相違があるという事実にもかかわらず、観察された。従って、このＥＬＩＳＡフォーマットは、親のＩｇＧの親和性と親和性成熟変異体の親和性を区別することが出来なかった。更に、低ＩｇＧ濃度において、三つ全てのＩｇＧは高度に特異的であったが、しかし、ＩｇＧ濃度を２０μｇ／ｍＬへ上げると、Ｋ４８結合型ポリユビキチン、Ｋ６３結合型ジユビキチン、及びＫ６３結合ポリユビキチンに対する若干の非特異的な結合が、このアッセイ形式において１Ｃ１２／２Ｅ６及び２Ａ３／２Ｅ６の両方において見られた。
異なるＩｇＧの親和性を区別することができ、かつ本アッセイ形式でＫ１１結合型ジユビキチンのより特異的な認識を与えるであろうよりストリンジェントな条件を同定するために、４Ｍの尿素を含む緩衝液（４Ｍ尿素、２０ｍＭのトリスｐＨ７．５、１３５ｍＭのＮａＣｌ、１％のトリトンＸ−１００、１０％のグリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２）中で、再びＥＬＩＳＡが行われた。これらのストリンジェントな条件下で、試験されたＩｇＧの最高濃度（２０μｇ／ｍＬ）を除いて、Ｋ１１結合型ジユビキチンへのごくわずかな結合がＧ３親ＩｇＧについて観察された（図７Ａ）。これに対して、親和性成熟変異体の１Ｃ１２／２Ｅ６及び２Ａ３／２Ｅ６について、最低のＩｇＧ濃度の０．０２μｇ／ｍＬを含み、強い結合が全ての濃度で見られた。更に、４Ｍの尿素緩衝液の使用は、維持されるべきＫ１１結合型ジユビキチンについて高度な特異性を与える。１Ｃ１２／２Ｅ６のみ、試験されたＩｇＧの最高濃度でＫ４８結合ポリユビキチンへの非常に弱い結合を示した。２Ａ３／２Ｅ６は、試験されたＩｇＧの最高濃度においてさえも（２０μｇ／ｍＬ）、Ｋ１１結合型ジユビキチン以外のユビキチン型のどれに対しても結合を示さなかった。従って、これらのストリンジェントな条件下で、ＥＬＩＳＡにおいて、親和性の増大は抗体の機能の増大につながる。
Ｂ．ＩｇＧのウエスタンブロット分析
Ｇ３親ＩｇＧ、１Ｃ１２／２Ｅ６ ＩｇＧ及び２Ａ３／２Ｅ６ ＩｇＧが、ウェスタンブロットで純粋なジユビキチン鎖を検出するその能力について最初に試験された。Ｋ１１結合型ジユビキチン（ジェネンテック）の１ＸＬＤＳ緩衝液（インビトロジェン）による１μｇから１５ｎｇへの７回の２倍連続希釈、及び１ＸＬＤＳ緩衝液（インビトロジェン）中のモノユビキチン、直鎖状ジユビキチン、Ｋ４８結合型ジユビキチン、及びＫ６３結合型ジユビキチン（全てＢｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍから）の各１μｇを、７０℃で１０分間加熱っし、ＭＥＳ緩衝液（インビトロジェン）中で非還元状態下で、４−１２％のビストリスＮｕＰＡＧＥ １．０ｍｍゲル（インビトロジェン）上で４通りに泳動された。一つのゲルを、全タンパク質を検出するためにクマシーブルーで染色した。他の３つのゲルは、１０％メタノール及び１×ＮｕＰａｇｅ転写緩衝液（インビトロジェン）中で、一定の３０Ｖで１時間湿式転写により、０．２μｍのニトロルロース（インビトロジェン）に転写された。膜上の非特異的結合部位は、振とうしながら２５℃で１時間、ＰＢＳＴ中の５％ミルクでのインキュベーションによってブロックした。次いで、膜を振とうしながら２５℃で１時間ＰＢＳＴ中の５％ミルク中の１μｇ／ｍＬのＧ３ ＩｇＧ、１Ｃ１２／２Ｅ６ ＩｇＧ又は２Ａ３／２Ｅ６ ＩｇＧ中でインキュベートした。膜を振とうしながら、ＰＢＳＴで３回洗浄した。ＩｇＧは、振とうしながら２５℃で１時間、ＰＢＳＴ中の５％ミルク中のヤギ抗ヒトＦｃγ特異的ＨＲＰ結合Ｆ（ａｂ’）２二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）の１：１０，０００希釈液中で膜をインキュベートすることにより検出された。次いで、膜をＰＢＳＴで３回洗浄し、続いてＰＢＳ中で１回洗浄した。二次抗体は、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて検出し、続いてフィルムへブロットを露光した。
三つ全てのＩｇＧはＫ１１結合型ジユビキチンのみを検出したが、モノユビキチン、直鎖状ジユビキチン、Ｋ４８結合型ジユビキチン、又はＫ６３結合型ジユビキチンは検出せず、ウェスタンブロットの文脈においてはＫ１１結合型ジユビキチンに非常に特異的であることを示している（図７Ｂ参照）。更に、親和性成熟変異体は、わずか１５ｎｇのＫ１１結合型ジユビキチンを検出可能であるという点でＧ３親ＩｇＧより遙かに感受性が高かったが、Ｇ３ ＩｇＧの検出限界はこの特定のブロット暴露で１２５ｎｇであった。従って、親抗体に対する本ハイブリッドの７倍から９倍の親和性の改善は、Ｋ１１結合型ジユビキチンの認識においてウェスタンブロットにおける機能の改善につながった。所望の抗原に対する親和性の増大にも関わらず、特異性は維持され、かつ１Ｃ１２／２Ｅ６ ＩｇＧ又は２Ａ３／２Ｅ６ ＩｇＧの何れも、試験された他のユビキチン型の何れかに対する結合を検出することができなかった。１Ｃ１２／２Ｅ６親和性成熟変異体及び２Ａ３／２Ｅ６親和性成熟変異体はＳＰＲ解析、特にＩｇＧ ＥＬＩＳＡ及び上述のジユビキチンに対するウェスタンブロットで同様に振る舞ったため、２Ａ３／２Ｅ６のみが更なる試験に使用された。
Ｋ１１結合特異的抗体がＫ１１結合型ジユビキチン抗原に対して産生され、そのためそれらは恐らくは結合そのものを認識したか、又はより可能性があるのは、Ｋ１１結合から生じたジユビキチンの構造のため接近して配置されたドナーユビキチンとアクセプターユビキチンの周辺表面残基を認識した。ジユビキチンは抗原の最小認識単位であり、Ｋ１１結合ポリユビキチンは、「モノマー」単位の反復としてジユビキチンを持つポリマーであり、抗体はまたＫ１１結合により連結したより長いポリユビキチン鎖にも結合するはずである。これを検証するために、２Ａ３／２Ｅ６ ＩｇＧがウエスタンブロットにおいて純粋なポリユビキチン鎖を検出するその能力について試験された。還元剤入りの１ＸＬＤＳ緩衝液（インビトロジェン）中のモノユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｋ４８結合ポリユビキチン２−７（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｋ６３結合ポリユビキチン２−７（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）及びＫ１１結合ポリユビキチン（ジェネンテック）の各々１μｇを、ＭＥＳ緩衝液（インビトロジェン）中で還元条件下、７０℃で１０分間加熱し、４−１２％のビストリスＮｕＰＡＧＥ １．０ｍｍゲル上で３通りに泳動された。一つのゲルを全てのタンパク質を検出するために、クマシーブルーで染色した。ウエスタンブロットの残りの部分は、０．４５μｍのニトロセルロース（インビトロジェン）への転写が３０Ｖで２時間行われた点を除き、上記のように行われた。コントロールのパンユビキチン抗体、Ｐ４Ｄ１は、モノユビキチン、Ｋ４８結合型ポリユビキチン２−７、Ｋ６３結合ポリユビキチン２−７、Ｋ１１結合型ポリユビキチンを認識したが、２Ａ３／２Ｅ６ ＩｇＧはＫ１１結合型ポリユビキチンのみを認識した（図７Ｃ）。従って、Ｋ１１結合型ジユビキチンと同じく、２Ａ３／２Ｅ６抗体はＫ１１結合を含むポリユビキチン鎖を検出できるが、他の結合のポリユビキチン鎖を認識しない。
２Ａ３／２Ｅ６抗体は純粋なＫ１１結合型ポリユビキチン鎖に特異的に結合できたたため、次に、２Ａ３／２Ｅ６ ＩｇＧが、哺乳動の全細胞溶解物物及び酵母の全細胞溶解物の両方に由来するＫ１１結合型ポリユビキチンを検出する能力について試験された。２９３Ｔ細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）と２ｍＭのＬ−グルタミンを補充した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で増殖した。細胞をプレートから掻き取り、４℃で１０分間、２０００ｒｐｍでスピンダウンし、冷ＰＢＳを２０ｍＬで洗浄し、再度ペレット化した。細胞を、８Ｍの尿素、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、及び２５ｍＭのＮａＣｌ、１０μＬ／ｍＬの１００ＸＨａｌｔプロテアーゼ阻害剤及びフォスファターゼ阻害剤（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、５ｍＭのＥＤＴＡ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、及び２ｍＭのＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含む緩衝液中に溶解し、次に、粘度を低下させるために簡潔に超音波処理した。溶解物は、免疫沈降（ＩＰ）緩衝液（２０ｍＭトリス，ｐＨ７．５，１３５ｍＭのＮａＣｌ，１％トリトンＸ−１００，１０％グリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２）で４Ｍの尿素へと２倍希釈された。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株のＹＲＧ−２（ストラタジーン）を３０℃で一晩ＹＥＰＤ培地で増殖した。細胞１８ｍＬを５分間３０００ｒｐｍでペレット化し、水で洗浄し、再ペレット化し、４００ｍｇの細胞ペレットが得られた。細胞は、製造元の指示に従って、２５μＭのＭＧ１３２（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ），２ｍＭのＮＥＭ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１ｍＭのＰＭＳＦ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、及び５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を補充した１ｍＬのＹ−ＰＥＲ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に溶解した。
還元剤入りの１×ＬＤＳ緩衝液（インビトロジェン）中で、５０ナノグラムのＫ１１結合型ジユビキチン（ジェネンテック）、１μｇのＫ４８結合型ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、１μｇのＫ６３結合型ジユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、２９３Ｔ細胞溶解物からの全タンパク質を１００μｇ、及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞溶解物の２２μＬを、７０℃で１０分間加熱し、ＭＥＳ緩衝液（インビトロジェン）中、還元条件下、４−１２％ビストリスＮｕＰＡＧＥ １．０ｍｍゲル上で、２通り、泳動した。ゲルの転写及びウエスタンブロットは、０．４５μｍのニトロセルロース（インビトロジェン）への転写が３０Ｖで２時間行われた点を除き、上記のように行われた。２Ａ３／２Ｅ６ ＩｇＧは陽性コントロールのＫ１１結合型ジユビキチンを検出したが、陰性コントロールのＫ４８結合型ジユビキチン又はＫ６３結合型ジユビキチンの何れも検出しなかった（図７Ｄ）。更に、２Ａ３／２Ｅ６は、２９３Ｔ細胞溶解物からのユビキチン化の特徴である高分子量スメア、並びに、酵母細胞溶解物からのいくつかの高分子量のバンドを認識することができた。従って、このＩｇＧはまた全細胞溶解物からのＫ１１結合型ポリユビキチン鎖を検出することができた。
Ｃ．自己ユビキチン化ＭｕＲＦ１の免疫沈降
さらに、抗体の特異性を特徴づけ、それが免疫沈降（ＩＰ）に使用することができるかどうかを判断するために、ＭｕＲＦ１自己ユビキチン化反応が、複数結合のポリユビキチン鎖で修飾された純粋な基質を生成するために使用された。ＭｕＲＦ１は、Ｅ１ユビキチン活性化酵素のＵｂｅ１及びＥ２ユビキチン結合酵素のＵｂｃＨ５ｃと組み合わされた場合、Ｋ１１結合型ポリユビキチン鎖、Ｋ４８結合型ポリユビキチン鎖、及びＫ６３結合型ポリユビキチン鎖を持つ基質の欠損下で自分自身で自己ユビキチン化することが知られているＥ３ユビキチンリガーゼである（Kim, H.T. et al. 2007 JBC 282:17375-86）。自己ユビキチン化反応は、総体積４０μＬ中、１００ｎＭの組み換え型ヒトＨｉｓ６−Ｕｂｅ１（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、５μＭの組み換え型ヒトＵｂｃＨ５ｃ（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、１μＭの組み換え型ヒトＨｉｓ６−ＭｕＲＦ１（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、１００μＭの組み換え型ヒトユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、２０ｍＭのトリスｐＨ７．５、２０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、及び１ｍＭのＤＴＴにより、３７℃で１．５時間行った。抗体の特異性を調べるために、反応は、野生型ユビキチン並びにＫ１１結合鎖の形成を阻止するＫ１１Ｒ変異体ユビキチンの両方で行われた。各反応物の６マイクロリッターが、４Ｍ、２Ｍ、１Ｍ、０．５Ｍ、又は０Ｍの尿素を含有する免疫沈降緩衝液（２０ｍＭのトリスｐＨ７．５、１３５ｍＭのＮａＣｌ、１％のトリトンＸ−１００、１０％のグリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２）により１００倍に希釈された。各免疫沈降反応物は、５０μＬのプロテインＡダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄ）（インビトロジェン）で、２５℃で１時間回転させて、前もって除去された。ビーズは磁石で捕捉され、上清を新しいチューブに移した。２Ａ３／２Ｅ６ ＩｇＧの２０マイクログラムを、各免疫沈降に追加し、回転しながら２５℃で一晩インキュベートした。翌日、ＩｇＧを、免疫沈降あたりプロテインＡダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）を１００μＬで、回転しながら１５分間２５℃でインキュベートすることにより捕捉した。ビーズが捕捉され、尿素の適切な量を含む溶解緩衝液１ｍＬで３回洗浄し、その後ＰＢＳの１ｍＬで２回洗浄し、各洗浄の間に捕捉した。最後の洗浄中にビーズを新しいチューブに移した。免疫沈降物質は、ビーズを還元剤を含む１×ＬＤＳサンプル緩衝液（インビトロジェン）の２０μＬに再懸濁し、７０℃で１０分間インキュベートすることにより溶出した。
各インプット反応の１０％と免疫沈降物質の１００％が、ＭＥＳ緩衝液中（インビトロジェン）還元条件下、４−１２％のビストリスＮｕＰＡＧＥ １．０ｍｍゲル（インビトロジェン）上で泳動した。ウェスタンブロットをパンユビキチンＰ４Ｄ１抗体により上記のように行った。結果は、尿素の全試験濃度において、野生型ユビキチンが自己ユビキチン化反応に使用された場合に、２Ａ３／２Ｅ６抗体は自己ユビキチン化ＭｕＲＦ１を免疫沈降することが可能であることを示していた（図８Ａ及び８Ｂ）。更に、インプットレーンに存在する残りのモノユビキチンの免疫沈降は見られなかった。
Ｋ１１Ｒ変異体ユビキチンが用いられる場合、それはＫ１１結合型ポリユビキチン鎖を生成するＭｕＲＦ１の能力をブロックするが、自己ユビキチン化はなおＫ４８結合鎖及びＫ６３結合鎖を生成する。従って、２Ａ３／２Ｅ６ ＩｇＧがＫ１１結合鎖に特異的である場合、Ｋ１１Ｒ変異体ユビキチンが用いられると自己ユビキチン化ＭｕＲＦ１の免疫沈降は観察されるべきではないことが期待されよう。実際に、４Ｍの尿素の存在下で免疫沈降が行われた場合にはそうであり、２Ａ３／２Ｅ６ ＩｇＧはそうした条件下でＫ１１結合鎖に高度に特異的であることを示している（図８Ｃ）。この特異性は尿素濃度を２Ｍに減らすと失われた。これは実施例３Ａに示されたＥＬＩＳＡにおいて４Ｍの尿素で見られた特異性の増大、並びにＫ４８結合及びＫ６３結合に対して生成された他のユビキチン結合特異的抗体による免疫沈降における４Ｍ尿素下で見られた特異性に一致している（例えば、米国特許出願公開第２００７０２１８０６９号に記載の抗体を参照）。
免疫沈降におけるＩｇＧの特異性を更に探索するために、四つのＭｕＲＦ１自己ユビキチン化反応が、上記の組換えヒト野生型ユビキチン、Ｋ１１Ｒ変異体ユビキチン、Ｋ４８Ｒ変異体ユビキチン、及びＫ６３Ｒ変異体ユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）を用いて行われた。アルギニン変異体へのリジンの使用は、ポリユビキチン結合がそれらの特定のリジンを介して形成されるのを防ぐ。４つの反応が、その後分割され、同等部分が２Ａ３／２Ｅ６ ＩｇＧ、及びユビキチンのいかなる型にも特異的に結合しないヒトカッパＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体（ジェネンテック）により免疫沈降に供された。各自己ユビキチン化反応からのインプット物質、並びに各免疫沈降サンプルが、上記のように、クーマシー染色での並列ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及びパンユビキチンＰ４Ｄ１抗体によるウエスタンブロット解析により分離された。
図８Ｄに示されるように、２Ａ３／２Ｅ６ ＩｇＧはＫ１１結合鎖が存在するときのみ（野生型ユビキチン、Ｋ４８Ｒユビキチン、又は変異体Ｋ６３Ｒユビキチンを使用した場合）、自己ユビキチン化ＭｕＲＦ１を免疫沈降することができた。Ｋ１１Ｒ変異体ユビキチンを用いた場合、ＭｕＲＦ１はＫ１１結合鎖を構築することができず（下の質量分析の確認を参照）、２Ａ３／２Ｅ６ ＩｇＧは、これらの条件下で自己ユビキチン化ＭｕＲＦ１の何れも免疫沈降することができなかった。これに対して、アイソタイプコントロール抗体は、４つの自己ユビキチン化反応の何れかに由来する自己ユビキチン化ＭｕＲＦ１の何れをも免疫沈降することができなかった。
パンユビキチンウェスタンブロットシグナルによって導かれ、質量分析が高分子量のゲル領域上（＞１８８ｋＤａ）で行われた。簡単に説明すると、この領域に対応するゲルの部分を切り出し、ゲル内トリプシン消化を行った。ゲル片を５０ｍＭアンモニウム重炭酸塩／５０％メタノールを用いて脱色され、その後アセトニトリル（ＡＣＮ）で乾燥した。トリプシンの効果的な取り込みを可能にするために、ゲル片を５０ｍＭ重炭酸アンモニウム／１０％のＡＣＮで希釈した２０ｎｇ／μＬの修飾化シクエンスグレードトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて氷上で２時間インキュベートした。消化は、３７℃で一晩行い、５０％ＡＣＮ／５％ギ酸（ＦＡ）の添加により停止した。同位体標識内部標準ペプチド（１ｐｍｏｌ）を、抽出の２ラウンド前に各試料に添加した。抽出されたペプチドは完全に乾燥させ、質量分析の少なくとも３０分前に１０％ＡＣＮ／５％ＦＡ／０．０１％過酸化水素水に再懸濁した。サンプルはサーモＡＱＵＡＳＩＬ Ｃ１８カラム（２．１×１５０ｍｍ）上に直接ロードされ、５％から９０％緩衝液Ｂ（９８％ＡＣＮ／０．１％のＦＡ）の２６分間の勾配に対して２００μＬ／分の流量で、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００キャピラリＬＣを用いて分離した。質量分析検出は、ユビキチンの配列を網羅する標識ペプチド及び非標識ペプチドの両方を検出するため、セグメント化されたマルチプルリアクションモニタリング（ＭＲＭ）法を用いてＡＢＩ４０００ ＱＴＲＡＰ上で行った。定量は、ＡＢＩ Ｍｕｌｔｉｑｕａｎｔ１．１ソフトウェアを使用して、各ペプチドの標識版及び非標識版の間のピーク面積を比較することによって行った。
野生型ユビキチンの反応からのインプットサンプルはＫ１１結合型ポリユビキチン鎖、Ｋ４８結合型ポリユビキチン鎖、およびＫ６３結合型ポリユビキチン鎖の混合物を示したが、一方、ユビキチン変異体Ｋ１１Ｒ、Ｋ４８Ｒ、Ｋ６３Ｒとの反応は、Ｋ１１結合、Ｋ４８結合、及びＫ６３結合が欠損していた（図８Ｅ）。野生型ユビキチンを用いた反応からの２Ａ３／２Ｅ６ ＩｇＧ抗体によって免疫沈降したサンプルでは、ポリユビキチンリン結合プロファイルは、インプット物質と同様に推移し（図８Ｅ参照）、基質分子の大半は３つの主要な結合（Ｋ１１、Ｋ４８及びＫ６３）のそれぞれを運ぶことを示唆している。同様の結果は、抗Ｋ４８及び抗Ｋ６３結合特異的抗体の特性評価の間に得られた（Newton, K. et al. 2008 Cell 134:668-678）。Ｋ４８Ｒ及びＫ６３Ｒ変異体ユビキチン反応からの２Ａ３／２Ｅ６ ＩｇＧ抗体を用いた免疫沈降は、対応するインプットに類似したポリユビキチン結合プロファイルにより自己ユビキチン化ＭｕＲＦ１をプルダウンした。これとは対照的に、２Ａ３／２Ｅ６ ＩｇＧは標的結合の欠如のため、Ｋ１１Ｒ変異体ユビキチン反応からのユビキチンを免疫沈降できなかった。これは２Ａ３／２Ｅ６ ＩｇＧが免疫沈降においてＫ１１結合鎖に高度に特異的であることを示している。予想されたように、アイソタイプコントロール抗体は、４つの反応のいずれかからもユビキチンをプルダウンすることができなかった。
Ｄ．細胞溶解液からの免疫沈降
２Ａ３／２Ｅ６ ＩｇＧはまた、全細胞溶解物からのＫ１１結合型ポリユビキチン鎖を免疫沈降する能力について試験された。２９３Ｔ細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）と２ｍＭのＬ−グルタミンを補充した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で増殖した。細胞は、ヒト野生型ユビキチン、Ｋ０変異体ユビキチン（全７つのリジンはアルギニンに変異させた）を過剰発現するプラスミドでトランスフェクトしたか、又は模擬トランスフェクトした（図９Ａ）。トランスフェクションは、２５μｇのＤＮＡ、５つの１０ｃｍプレート当たりリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を７５μＬ用いて、製造者の指示に従って行った。トランスフェクション後四十八時間で細胞を回収し、上記のように溶解した。各溶解物の総タンパク質濃度は、８Ｍ尿素中に１０ｍｇ／ｍｌに調整した。次に溶解物は、免疫沈降（ＩＰ）緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１３５ｍＭのＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、１０％グリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２）で４Ｍの尿素へ希釈され、５ｍｇ／ｍＬの全タンパク質濃度を得た。体積１ｍＬの（全タンパク質の５ｍｇ）が、免疫沈降反応ごとに使用された。
２Ａ３／２Ｅ６ ＩｇＧで行われた免疫沈降に加えて、ユビキチンの何れの型（ジェネンテック）にも結合しない、ヒトカッパＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体も使用した。各免疫沈降反応物は、プロテインＡダイナビーズ（インビトロジェン）の１００μＬにより、２時間２５℃で回転しながら前もって除去され、その後沈殿した物質を除去するために２分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。ビーズは磁石で捕捉され、上清を新しいチューブに移した。２Ａ３／２Ｅ６又はコントロールＩｇＧの４０μｇを、各免疫沈降に追加し、回転しながら２５℃で一晩インキュベートした。翌日、ＩｇＧを、免疫沈降あたりプロテインＡダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）を２００μＬで、回転しながら１５分間２５℃でインキュベートすることにより捕捉した。ビーズが捕捉され４Ｍ尿素免疫沈降緩衝液（４Ｍ尿素、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５，１３５ｍＭのＮａＣｌ，１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１０％グリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ，１．５ｍＭのＭｇＣｌ２）の１ｍＬで５回洗浄され、その後ＰＢＳを１ｍＬで５回洗浄され、各洗浄の間に捕捉された。最後の洗浄中にビーズを新しいチューブに移した。免疫沈降物質は、ビーズを還元剤を含む１×ＬＤＳサンプル緩衝液（インビトロジェン）の１５μＬに再懸濁し、７０℃で１０分間インキュベートすることにより溶出した。ウエスタンブロット解析のため、５ｍｇ／ｍＬの全細胞溶解物（インプット）の０．１％、及び免疫沈降物質の１０％が、ＭＥＳ緩衝液中（インビトロジェン）還元条件下、４−１２％のビストリスＮｕＰＡＧＥ １．０ｍｍゲル（インビトロジェン）上で泳動した。ウェスタンブロットをパンユビキチンＰ４Ｄ１抗体を用いて上記のように行った。質量分析のため、５ｍｇ／ｍＬの全細胞溶解物（インプット）の１０％、及び免疫沈降物質の９０％が、ＭＥＳ緩衝液中（インビトロジェン）還元条件下、４−１２％のビストリスＮｕＰＡＧＥ １．０ｍｍゲル（インビトロジェン）上で泳動した。ゲルはＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて染色した。
疑似トランスフェクトされた溶解物において、比較的少量のポリユビキチンが存在しており、２Ａ３／２Ｅ６により免疫沈降した（図９Ａ）。野生型ユビキチンを過剰発現させた場合、全細胞溶解液中のポリユビキチン鎖が、２Ａ３／２Ｅ６によってプルダウンされたポリユビキチン鎖と共に大幅に増加しており、Ｋ１１結合型ポリユビキチン鎖が、ユビキチンの過剰発現によって上方制御されることが示唆された。驚くべきことに、Ｋ０変異体ユビキチン（全てのリジン残基をアルギニンに変異させており、従って、イソペプチド結合を含むポリユビキチン鎖を形成することが出来ない）が過剰発現しているときは、ポリユビキチン鎖はまた、高度に上方制御される。これはＫ０の過剰発現が、内因性ユビキチンを含むユビキチン鎖の合成を増加へと導くことを示唆している。２Ａ３／２Ｅ６がそれらを免疫沈降することができたので、これらの鎖の大部分はＫ１１にリンクされていたに違いない。確かにその通りであったかどうかを判断するため、ゲル片を５０ｍＭ重炭酸アンモニウム／１０％のＡＣＮで希釈した２０ｎｇ／μＬの修飾化シークエンスグレードトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）で４５分間氷上でインキュベートし、その後トリプシン溶液が除去され、３７℃での一晩の消化に先立って５０ｍＭ重炭酸アンモニウム／５％ＡＣＮで置換されたことを除いて、上記のように、質量分光光度法的分析を行った。＞１８８ｋＤａに対応するクーマシー染色されたポリアクリルアミドゲルからの二つの分子量領域を分析した（図９Ｂ及び９Ｃ）。
これらのサンプルの定量分析は、インプット溶解物に存在するＫ１１結合の割合に比べて免疫沈降におけるＫ１１結合の濃縮を示していた（図９Ｃ及び９Ｄ）。Ｋ４８結合及びＫ６３結合の有意なレベルの検出は、個々の基質は、異種混在結合鎖として、又は恐らくは別の基質のリジン上の均質鎖としての何れかで、異なる結合のユビキチン鎖を一般的に運ぶことが示唆された。アイソタイプコントロールＡｂを用いて行った免疫沈降は、全ての場合で無視できる量の鎖のユビキチンを明らかにし（データ非表示）、図９Ａのウェスタンブロットの結果と一致する。
前述の発明は、理解を明確にする目的のために例示および実施例によってある程度詳細に説明してきたが、説明や例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。すべての特許および本明細書に引用される科学文献の開示は、参照によりその全体が援用される。

Claims (17)

  1. （ｉ）配列番号２のＨＶＲ−Ｌ１配列；配列番号３のＨＶＲ−Ｌ２配列；配列番号４のＨＶＲ−Ｌ３配列；配列番号６のＨＶＲ−Ｈ１配列；配列番号１２のＨＶＲ−Ｈ２配列；及び配列番号１８のＨＶＲ−Ｈ３配列；
    （ｉｉ）配列番号２のＨＶＲ−Ｌ１配列；配列番号３のＨＶＲ−Ｌ２配列；配列番号４のＨＶＲ−Ｌ３配列；配列番号７のＨＶＲ−Ｈ１配列；配列番号１３のＨＶＲ−Ｈ２配列；及び配列番号１９のＨＶＲ−Ｈ３配列；
    （ｉｉｉ）配列番号２のＨＶＲ−Ｌ１配列；配列番号３のＨＶＲ−Ｌ２配列；配列番号４のＨＶＲ−Ｌ３配列；配列番号８のＨＶＲ−Ｈ１配列；配列番号１４のＨＶＲ−Ｈ２配列；及び配列番号２０のＨＶＲ−Ｈ３配列；
    （ｉｖ）配列番号２のＨＶＲ−Ｌ１配列；配列番号３のＨＶＲ−Ｌ２配列；配列番号４のＨＶＲ−Ｌ３配列；配列番号９のＨＶＲ−Ｈ１配列；配列番号１５のＨＶＲ−Ｈ２配列；及び配列番号２１のＨＶＲ−Ｈ３配列；
    （ｖ）配列番号２のＨＶＲ−Ｌ１配列；配列番号３のＨＶＲ−Ｌ２配列；配列番号４のＨＶＲ−Ｌ３配列；配列番号１０のＨＶＲ−Ｈ１配列；配列番号１６のＨＶＲ−Ｈ２配列；及び配列番号２２のＨＶＲ−Ｈ３配列；又は
    （ｖｉ）配列番号６０のＨＶＲ−Ｌ１配列；配列番号３のＨＶＲ−Ｌ２配列；配列番号４のＨＶＲ−Ｌ３配列；配列番号１１のＨＶＲ−Ｈ１配列；配列番号１７のＨＶＲ−Ｈ２配列；及び配列番号２３のＨＶＲ−Ｈ３配列
    を含む、Ｋ１１結合ポリユビキチンと結合する、単離されたモノクローナル抗体。
  2. 以下の配列の組合わせの一つのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％配列同一性を持つ軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体：配列番号５及び２７；配列番号：５及び２８；配列番号：５及び２９；配列番号：５及び３０；配列番号：５及び３１。
  3. 以下の配列の組合わせの一つの軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を含む、Ｋ１１結合ポリユビキチンと結合する単離されたモノクローナル抗体：配列番号５及び２７；配列番号：５及び２８；配列番号：５及び２９；配列番号：５及び３０；配列番号：５及び３１。
  4. 抗体がＫ１１結合ポリユビキチン化タンパク質と特異的に結合する、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体。
  5. 抗体が少なくとも一つのポリユビキチン媒介性シグナル伝達を調節する、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体。
  6. 抗体が、Ｋ１１結合ポリユビキチンと結合する、ヒト化抗体、キメラ抗体又は抗体断片である、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体。
  7. 抗体がモノユビキチンに結合しない、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体。
  8. 抗体が、ストリンジェントな条件で、Ｋ１１結合ポリユビキチンと結合するがＫ４８結合ポリユビキチンと結合せず、ストリンジェントな条件が４Ｍ尿素を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体。
  9. 抗体が、ストリンジェントな条件で、Ｋ１１結合ポリユビキチンと結合するがＫ６３結合ポリユビキチンと結合せず、ストリンジェントな条件が４Ｍ尿素を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体。
  10. 請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体をコードする単離された核酸。
  11. 請求項１０に記載の核酸を含む、ベクター。
  12. 請求項１０に記載の核酸又は請求項１１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  13. 抗体が産生される条件下で請求項１２に記載の宿主細胞を培養することを含む、Ｋ１１リジン結合を含む第一のポリユビキチンに特異的に結合する抗体を産生する方法。
  14. 宿主細胞から抗体を回収することを更に含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体及び細胞傷害性薬物を含む、イムノコンジュゲート。
  16. 請求項１から９のいずれか一項に記載の少なくとも一つの抗体にサンプルを曝露すること、及びサンプル中のポリユビキチン又はポリユビキチン化タンパク質に対する前記少なくとも一つの抗体の結合を決定することを含む、ポリユビキチン又はポリユビキチン化タンパク質を含むことが疑われるサンプル中におけるポリユビキチン又はポリユビキチン化タンパク質の存在を決定する方法。
  17. 請求項１から９のいずれか一項に記載の少なくとも一つの抗体とサンプルを接触させることを含む、サンプル中の非Ｋ１１結合型ポリユビキチン化タンパク質からＫ１１結合型ポリユビキチン化タンパク質を分離する方法。
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