CN102947335A - 抗多聚遍在蛋白抗体及使用方法 - Google Patents

抗多聚遍在蛋白抗体及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了抗多聚遍在蛋白抗体及其使用方法。

Description

抗多聚遍在蛋白抗体及使用方法
相关申请
本申请要求2010年4月15日提交的美国临时申请No.61/324,602的权益，通过提及而将其完整收入本文。
对经EFS-WEB作为文本文件提交的序列表的引用
经EFS-Web作为ASCII格式的文本文件与本说明书同时提交了序列表，文件名为“P4410R1_Sequence_Listing.TXT”，创建日期为2011年4月13日，且大小为39.9千字节。经EFS-Web提交的序列表是本说明书的一部分且由此通过述及完整收入本文。
发明领域
本发明涉及抗多聚遍在蛋白(polyubiquitin)抗体领域，更具体的说就是不特异性结合单遍在蛋白(monoubiquitin)且对特定赖氨酸连接形式的多聚遍在蛋白特异性的抗多聚遍在蛋白抗体，及其使用方法。
发明背景
遍在蛋白(ubiquitin)是一种在诸多细胞途径中具有重要调节作用的小蛋白质。经由第11位赖氨酸(K11)连接的遍在蛋白链已经鉴定为细胞分裂的重要调节物(Jin et al.，2008；Kirkpatrick et al.，2006)，而且已经与遍在蛋白连接酶后期促进性复合物(APC/C)底物的降解信号传导，即真核细胞分裂中的一个关键步骤联系起来(Jin et al.，2008；Williamson et al.，2009)。APC/C募集两种E2酶，即启动遍在蛋白链的UbcH10和延长链的Ube2S，它们以高特异性装配K11连接的链(Garnett et al.，2009；Williamson et al.，2009；Wu et al.，2010)。这种APC/C特异性E2模块的Loss导致有丝分裂行进的缺陷(Williamson et al.，2009；Song and Rape，Molecular Cell in press)。虽然这些结果提示K11连接的链在有丝分裂期间驱动蛋白酶体对蛋白质的降解，但是由APC/C、UbcH10和Ube2S装配的遍在蛋白链的表征很大程度上依赖于体外实验。缺乏K11连接的多聚遍在蛋白链在细胞中调节蛋白质降解的直接证据，原因就在于缺乏可用于直接检测它们的工具。
发明概述
本发明提供抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体及其使用方法。在一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合包含K11赖氨酸连接的第一多聚遍在蛋白的分离的抗体，其中该抗体不特异性结合包含第二赖氨酸连接的第二多聚遍在蛋白，其中该第二赖氨酸连接不同于K11赖氨酸连接。在另一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合包含K11赖氨酸连接的第一多聚遍在蛋白和包含第二赖氨酸连接的第二多聚遍在蛋白二者的分离的抗体，其中该第二赖氨酸连接不同于K11赖氨酸连接，其中该抗体不特异性结合单遍在蛋白，且其中该抗体以与该抗体对该第一多聚遍在蛋白的结合亲和力相比实质性降低的结合亲和力结合第二多聚遍在蛋白。
在另一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合赖氨酸-11连接的多聚遍在蛋白的分离的抗体，其中该抗体不特异性结合单遍在蛋白。一方面，抗体包含至少一个高变(HVR)序列，该序列选自SEQ ID NO：2和57-60任一的HVR-L1、SEQ ID NO：3和61任一的HVR-L2、SEQ ID NO：4的HVR-L3、SEQID NO：6-11任一的HVR-H1、SEQ ID NO：12-17和67任一的HVR-H2、和SEQID NO：18-23、68和69任一的HVR-H3。另一方面，抗体包含至少一个选自HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3的序列，其中HVR-H1包含氨基酸序列X1 X2X3 X4 Ile X5(SEQ ID NO：24)，其中氨基酸X1选自丝氨酸和苏氨酸，氨基酸X2选自天冬酰胺、天冬氨酸、丝氨酸和甘氨酸，氨基酸X3选自酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸，氨基酸X4选自色氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和酪氨酸，而氨基酸X5选自丝氨酸和组氨酸；其中HVR-H2包含氨基酸序列X6 X7 Ile X8 ProX9 Gly X10 Thr X11(SEQ ID NO：25)，其中氨基酸X6选自甘氨酸和丙氨酸，氨基酸X7选自天冬氨酸、色氨酸、甘氨酸、谷氨酸和缬氨酸，氨基酸X8选自丝氨酸、酪氨酸和天冬酰胺，氨基酸X9选自天冬氨酸、丙氨酸、组氨酸和天冬酰胺，氨基酸X10选自酪氨酸和丝氨酸，而氨基酸X11选自酪氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺；且其中HVR-H3包含氨基酸序列X12 X13 X14 X15 X16X17 X18 X19 X20 X21 Asp(SEQ ID NO：26)，其中氨基酸X12选自精氨酸和赖氨酸，氨基酸X13选自谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和脯氨酸，氨基酸X14选自丝氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和色氨酸，氨基酸X15选自色氨酸、甘氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，氨基酸X16选自色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸，氨基酸X17选自丝氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸，氨基酸X18选自丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和甘氨酸、或不存在，氨基酸X19选自色氨酸、甘氨酸、丙氨酸和酪氨酸、或不存在，氨基酸X20为缬氨酸或不存在，而氨基酸X21选自甲硫氨酸和苯丙氨酸。
另一方面，抗体包含至少一个选自HVR-L1、HVR-L2的序列，其中HVR-L1包含氨基酸序列X22 X23 Ser X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30 X31(SEQ ID NO：73)，其中氨基酸X22选自精氨酸和甘氨酸，氨基酸X23选自丙氨酸和缬氨酸，氨基酸X24选自谷氨酰胺和组氨酸，氨基酸X25选自天冬氨酸、天冬酰胺和异亮氨酸，氨基酸X26选自亮氨酸和缬氨酸，氨基酸X27选自丝氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和谷氨酸，氨基酸X28选自苏氨酸和丝氨酸，氨基酸X29选自丙氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，氨基酸X30选自缬氨酸和异亮氨酸，而氨基酸X31选自丙氨酸和丝氨酸；且其中HVR-L2包含氨基酸序列X32 X33 X34 Phe X35 Tyr Ser(SEQ ID NO：74)，其中氨基酸X32选自丝氨酸和天冬酰胺，氨基酸X33选自谷氨酰胺和丙氨酸，氨基酸X34选自谷氨酸和丝氨酸，而氨基酸X35选自亮氨酸和缬氨酸。权利要求3的抗体，包含至少一个选自HVR-H2和HVR-H3的序列，其中HVR-H2包含氨基酸序列X36 Ile AsnPro X37 Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly(SEQ ID NO：75)，其中氨基酸X36选自丙氨酸和甘氨酸而氨基酸X37选自丙氨酸和天冬酰胺；且其中HVR-H3包含氨基酸序列Glu Trp Tyr X38 X39 Gly Tyr Val Met Asp Tyr(SEQ ID NO：76)，其中氨基酸X38选自苯丙氨酸和酪氨酸而氨基酸X39选自甘氨酸和天冬氨酸。
另一方面，抗体包含HVR-L1序列SEQ ID NO：2、HVR-L2序列SEQ IDNO：3、和HVR-L3序列SEQ ID NO：4。另一方面，抗体包含与图1B中克隆A3、A6、A9、B5、F5或G3所列HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3序列对应的HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3序列。另一方面，抗体包含与图4A中克隆1A11、1C12、1F12、2A3、2A6、2D7、2E6或2G4所列HVR-L1、HVR-L2、和HVR-L3序列对应的HVR-L1、HVR-L2、和HVR-L3序列。另一方面，抗体包含与图4B中克隆1A11、1C12、1F12、2A3、2A6、2E6或2G4所列HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3序列对应的HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3序列。
另一方面，抗体包含HVR-L1序列SEQ ID NO：2、HVR-L2序列SEQ IDNO：3、HVR-L3序列SEQ ID NO：4、HVR-H1序列SEQ ID NO：11、HVR-H2序列SEQ ID NO：17和HVR-H3序列SEQ ID NO：23。另一方面，抗体包含HVR-L1序列SEQ ID NO：58、HVR-L2序列SEQ ID NO：3、HVR-L3序列SEQID NO：4、HVR-H1序列SEQ ID NO：11、HVR-H2序列SEQ ID NO：17和HVR-H3序列SEQ ID NO：23。另一方面，抗体包含HVR-L1序列SEQ ID NO：59、HVR-L2序列SEQ ID NO：3、HVR-L3序列SEQ ID NO：4、HVR-H1序列SEQ ID NO：11、HVR-H2序列SEQ ID NO：17和HVR-H3序列SEQ ID NO：23。另一方面，抗体包含HVR-L1序列SEQ ID NO：2、HVR-L2序列SEQ ID NO：3、HVR-L3序列SEQ ID NO：4、HVR-H1序列SEQ ID NO：11、HVR-H2序列SEQID NO：67和HVR-H3序列SEQ ID NO：23。另一方面，抗体包含HVR-L1序列SEQ ID NO：58、HVR-L2序列SEQ ID NO：3、HVR-L3序列SEQ ID NO：4、HVR-H1序列SEQ ID NO：11、HVR-H2序列SEQ ID NO：67和HVR-H3序列SEQ ID NO：23。另一方面，抗体包含HVR-L1序列SEQ ID NO：59、HVR-L2序列SEQ ID NO：3、HVR-L3序列SEQ ID NO：4、HVR-H1序列SEQ ID NO：11、HVR-H2序列SEQ ID NO：67、和HVR-L3序列SEQ ID NO：23。
另一方面，抗体包含选自SEQ ID NO：5和62-66的轻链氨基酸序列。另一方面，抗体包含选自SEQ ID NO：27-32和70-72的重链氨基酸序列。
另一方面，抗体包含与下述序列组合之一的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的轻链和重链氨基酸序列：SEQ ID NO 5和32；SEQ ID NO：63和32；SEQ ID NO：65和32；SEQ ID NO：5和72；SEQ ID NO：63和72；及SEQ ID NO：65和72。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的抗体，其中该抗体与任一前述抗体结合K11连接的多聚遍在蛋白上相同抗原决定簇，且其中该抗体不特异性结合单遍在蛋白。在另一个实施方案中，本发明提供一种与任前述抗体竞争对多聚遍在蛋白的结合的分离的抗体，其中该抗体不特异性结合单遍在蛋白。在另一个实施方案中，本发明提供任何前述分离的抗体，其中该抗体特异性结合K11连接的多聚遍在蛋白化的蛋白质。在另一个实施方案中，本发明提供任何前述分离的抗体，其中该抗体调控至少一种由多聚遍在蛋白介导的信号传导途径。
在一个一般方面，任何上述抗体是单克隆抗体。在另一个一般方面，任何上述抗体是人抗体。在另一个一般方面，任何上述抗体是人源化抗体。在另一个一般方面，任何上述抗体是嵌合抗体。在另一个一般方面，任何上述抗体是结合K11连接的多聚遍在蛋白的抗体片段。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的核酸，其编码任何上述抗体。在另一个实施方案中，本发明提供一种载体，其包含编码任何上述抗体的分离的核酸。在另一个实施方案中，本发明提供一种宿主细胞，其包含编码任何上述抗体的分离的核酸。在另一个实施方案中，本发明提供一种宿主细胞，其包含载体，该载体包含编码任何上述抗体的分离的核酸。
在另一个实施方案中，本发明提供一种生成任何上述抗体的方法，包括在该抗体生成的条件下培养上文所述宿主细胞。一方面，该方法进一步包括自宿主细胞回收抗体。另一方面，该方法进一步包括纯化抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含任何上述抗体和细胞毒剂。在另一个实施方案中，本发明提供一种药物配制剂，其包含任何上述抗体和药学可接受载体。一方面，该药物配制剂进一步包含别的治疗剂。在一个此类方面，该别的治疗剂为化疗剂。
在另一个实施方案中，本发明提供作为药物使用的任何上述抗体。在另一个实施方案中，本发明提供在治疗细胞周期相关疾病或病症中使用的任何上述抗体。一方面，细胞周期相关疾病或病症选自与异常升高的细胞周期行进(cell cycle progression)有关的疾病或病症和与异常降低的细胞周期行进有关的疾病或病症。在一个此类方面，与异常升高的细胞周期行进有关的疾病或病症是癌症。在另一个此类方面，与异常降低的细胞周期行进有关的疾病或病症选自变性肌肉病症(degenerative muscle disorder)和变性神经病症(degenerative nerve disorder)。
在另一个实施方案中，本发明提供任何上述抗体在制备药物中的用途。一方面，药物用于选自癌症、变性肌肉病症、和变性神经病症的疾病或病症。在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗具有选自癌症、变性肌肉病症、和变性神经病症的疾病或病症的个体的方法，包括对个体施用有效量的任何上述抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供一种测定怀疑含有多聚遍在蛋白或多聚遍在蛋白化的蛋白质的样品中多聚遍在蛋白或多聚遍在蛋白化的蛋白质的存在的方法，包括使该样品暴露于至少一种前述抗体并测定该至少一种抗体对该样品中多聚遍在蛋白或多聚遍在蛋白化的蛋白质的结合。在另一个实施方案中，本发明提供一种将样品中的K11连接的多聚遍在蛋白化的蛋白质与非K11连接的多聚遍在蛋白化的蛋白质分开的方法，包括使该样品与至少一种前述抗体接触。在另一个实施方案中，本发明提供一种测定细胞或样品中K11连接的多聚遍在蛋白的功能和/或活性的方法，包括使该细胞或样品与至少一种前述抗体接触并评估所述接触步骤对该细胞或样品的影响。
附图简述
图1A和1B描绘实施例1中获得的Fab的轻和重链氨基酸序列。图1A描绘自未免疫种类的VH文库分离的克隆的轻链序列。由于文库设计，对于所有获得的克隆，轻链的序列是相同的。图1B描绘自未免疫VH文库种类分离的克隆的重链序列比对。为每一个克隆标示了自第3轮和第4轮分选鉴定的同胞克隆的数目。在图1A和1B中，为每一个克隆以带框的区域标示了HVR序列，第一个框标示HVR-L1(图1A)或HVR-H1(图1B)，第二个框标示HVR-L2(图1A)或HVR-H2(图1B)，而第三个框标示HVR-L3(图1A)或HVR-H3(图1B)。
图2描绘噬菌体点ELISA，展现每一个获得的克隆对一组遍在蛋白蛋白质在波长450nm处的相对结合信号，如实施例1中描述的。每一个Fab文库克隆含有gD标签，而且通过对抗gD抗体的结合来评估Fab在噬菌体上的展示。使用未包被孔作为阴性对照。
图3A-3C描绘纯化的G3 Fab的结合特性，如实施例1中描述的。图3A显示在ELISA中评估不同浓度的纯化的G3 Fab结合一组遍在蛋白蛋白质的能力的实验的结果。图3B描绘测量纯化的G3 Fab对K11连接的二遍在蛋白的亲和力的IC50竞争ELISA的结果。图3C显示在固定化背景中测定G3 Fab特异性识别一组遍在蛋白蛋白质的能力的Western印迹分析的结果。考马斯染色的凝胶展现出每一份样品的迁移率(mobility)。
图4A和4B描绘实施例2中获得的亲和力成熟克隆的轻和重链氨基酸序列。图4A描绘亲和力成熟克隆的轻链序列。图4B描绘亲和力成熟克隆的重链序列比对。为每一个克隆标示了自第4轮分选鉴定的同胞克隆的数目。在图4A和4B，为每一个克隆以带框的区域标示了HVR序列，第一个框标示HVR-L1(图4A)或HVR-H1(图4B)，第二个框标示HVR-L2(图4A)或HVR-H2(图4B)，而第三个框标示HVR-L3(图4A)或HVR-H3(图4B)。以灰色凸显相对于G3亲本序列的氨基酸变化。
图5A-5B描绘为了评估在噬菌体上展示的亲本G3克隆和8个亲和力成熟变体对一组遍在蛋白蛋白质的结合而实施的ELISA实验的结果，如实施例2E中描述的。
图6A和6B描绘实施例2中获得的杂合克隆的轻和重链氨基酸序列。图6A描绘杂合克隆的轻链序列。图6B描绘杂合克隆的重链序列比对。在图6A和6B中，为每一个克隆以带框的区域标示了HVR序列，第一个框标示HVR-L1(图6A)或HVR-H1(图6B)，第二个框标示HVR-L2(图6A)或HVR-H2(图6B)，而第三个框标示HVR-L3(图6A)或HVR-H3(图6B)。以灰色凸显相对于G3亲本序列的氨基酸变化。
图7A-7D描绘评估与亲本G3克隆和对照相比杂合IgG的结合特征的研究的结果，如实施例3中描述的。图7A提供ELISA结果，显示G3、1C12/2E6、和2A3/2E6 IgG在4M脲中对一组遍在蛋白蛋白质的结合。图7B提供G3、1C12/2E6、或2A3/2E6 IgG对K11连接的二遍在蛋白(1000、500、250、125、63、31、和16ng/道，标示了梯度)或单遍在蛋白、线性二遍在蛋白、K48连接的二遍在蛋白、和K63连接的二遍在蛋白(1μg/道)的2倍连续稀释液的结合的Western印迹分析。考马斯染色的凝胶(左上小图)提供每一种测试的遍在蛋白在凝胶中迁移的指示。图7C描绘实验的结果，其中用泛遍在蛋白抗体P4D1(中间小图)或2A3/2E6 IgG(右边小图)对单遍在蛋白、K48连接的多聚遍在蛋白2-7(长度为2至7个遍在蛋白亚基)、K63连接的多聚遍在蛋白2-7(长度为2至7个遍在蛋白亚基)、和K11连接的多聚遍在蛋白(1μg/道)进行免疫印迹。考马斯染色揭示样品的组成(左边小图)。图7D描绘实验的结果，其中用2A3/2E6 IgG(右边小图)对K11连接的二遍在蛋白(diubiquitin)(50ng/道)、K48连接的二遍在蛋白(1μg/道)、K63连接的二遍在蛋白(1μg/道)、来自293T细胞(100μg/道)和酿酒酵母(S.cerevisiae)的全细胞裂解物进行免疫印迹。考马斯染色揭示样品的组成(左边小图)。
图8A-8E显示测试杂合抗体2A3/2E6自体外遍在蛋白化反应特异性识别和/或免疫沉淀K11连接的多聚遍在蛋白化的蛋白质的能力的实验的结果。图8A提供在MuRF1自我遍在蛋白化之后用泛遍在蛋白抗体P4D1实施的Western印迹。添加E1(Ube1)、E2(UbcH5c)、和E3(MuRF1)酶导致MuRF1上单遍在蛋白转变成多聚遍在蛋白链(MuRF1-Ub(n))。图8B显示免疫沉淀测定法的结果，其中使用用野生型遍在蛋白实施的MuRF1自我遍在蛋白化测定法作为在不同浓度的脲存在下2A3/2E6IgG免疫沉淀的底物。用泛遍在蛋白抗体(P4D1)通过Western印迹检测输入反应以及免疫沉淀的材料。图8C显示与图8B所述同样实施的实验的免疫印迹结果，只是使用K11R遍在蛋白代替野生型遍在蛋白。图8D显示Western印迹，其源自在体外使用WT、K11R、K48R、和K63R遍在蛋白实施的MuRF1自我遍在蛋白化反应，用2A3/2E6抗体(K11)或同种型对照抗体任一免疫沉淀，并进行Western分析。括弧中的数字标示凝胶上的有关道和(E)中的柱。用泛遍在蛋白抗体对自我遍在蛋白化反应(道1、4、7、和10中的输入)和免疫沉淀(道2、3、5、6、8、9、11、和12)进行免疫印迹。切出考马斯染色凝胶的白线标示区域进行质谱术AQUA分析，如Western印迹指导的。图8E显示对图8D中标示的凝胶区域的质谱术AQUA分析的结果。标示了每一份样品中测量的K11、K48、和K63连接的量。在每一种情况中，使用同等型对照抗体在免疫沉淀中检测到可忽略量的遍在蛋白连接。
图9A-9D显示测试杂合抗体2A3/2E6自细胞裂解物特异性识别和/或免疫沉淀K11连接的多聚遍在蛋白化的蛋白质的能力的实验的结果。图9A显示实验设计和对来自模拟或用过表达WT或K0遍在蛋白的质粒转染的HEK293T细胞的细胞裂解物实施的免疫沉淀的Western印迹结果，其中用2A3/2E6抗体(K11)或同种型对照抗体任一进行免疫沉淀。括弧中的数字标示凝胶上和图9B的柱中的有关道。用泛遍在蛋白抗体对全细胞裂解物(输入，道1、4、和7)和免疫沉淀(道2、3、5、6、8、和9)进行免疫印迹。切出考马斯染色凝胶的白线标示区域进行质谱术AQUA分析，如Western印迹指导的。图9B显示与图9A中显示的Western印迹等同的考马斯染色凝胶。切出考马斯染色凝胶中的区域A和B用于输入和免疫沉淀。编号对应于图9A中的编号。图9C显示对图9A和9B中标示的凝胶区域实施的质谱术分析的结果。标示了每一份样品中测量的K11、K48、和K63连接的量。在每一种情况中，使用同等型对照抗体在免疫沉淀中检测到可忽略量的遍在蛋白连接。图9D提供图，比较输入和免疫沉淀(抗K11)中测量的总遍在蛋白连接中K11连接的百分比，证明杂合抗K11连接特异性抗体对K11连接的富集。
发明详述
I.定义
出于本文中的目的，“受体人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定义的人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。
“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)来表述。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性的实施方案。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中具有一处或多处改变的抗体，与不拥有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。
“激动性抗体(agonist antibody)”在用于本文时指模拟目的多肽的至少一项功能性活性的抗体。
“拮抗性抗体(antagonist antibody)”或“阻断性抗体(blocking antibody)”指抑制或降低其特异性结合的抗原的生物学活性的抗体。某些阻断性抗体或拮抗性抗体实质性或完全抑制抗原的生物学活性。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体中结合完整抗体结合的抗原的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，且相反，参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50％或更多。本文中提供了例示性的竞争测定法。
术语“抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体”和“结合抗K11连接的多聚遍在蛋白的抗体”指能够以足够亲和力结合K11连接的多聚遍在蛋白，使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向K11连接的多聚遍在蛋白的抗体。在一个实施方案中，根据例如通过放射免疫测定法(RIA)的测量，抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体结合无关的、非K11连接的多聚遍在蛋白的蛋白质的程度小于该抗体对K11连接的多聚遍在蛋白的结合的约10％。在某些实施方案中，结合K11连接的多聚遍在蛋白的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M到10-13M，例如10-9M到10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体结合在来自不同物种的K11连接的多聚遍在蛋白中保守的K11连接的多聚遍在蛋白表位。
在用于本文时，术语“抗多聚遍在蛋白抗体”指能够特异性结合多聚遍在蛋白分子的抗体。
在用于本文时，术语“抗遍在蛋白抗体”和“抗单遍在蛋白抗体”可互换使用，指能够特异性结合遍在蛋白分子的抗体。
术语“嵌合”抗体指其中的重和/或轻链的一部分自特定的来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体。
抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5大类：IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，并且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、和IgA2。与不同类免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。
在用于本文时，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于：放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。
“病症”指任何会受益于本发明抗体治疗的任何疾患。这包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物倾向于所讨论病症的病理状况。本文中要治疗的病症的非限制性例子包括癌症、和发育障碍(hypotrophy)病症，包括但不限于变性肌肉病症和变性神经病症。
“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。
药剂(例如药物配制剂)的“有效量”指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区一部分的C端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226，或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，又称作EU索引，如记载于Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。一般地，可变域的FR由4个FR域组成：FR1、FR2、FR3、和FR4。因而，HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以如下的顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”、和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有如本文中所限定的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”、和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。
“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第五版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组III。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体，例如非人抗体的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。
在用于本文时，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的每个区。一般地，天然的4链抗体包含6个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，且三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后一种是最高序列变异性的和/或牵涉抗原识别。例示性的高变环存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、和96-101(H3)。(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。例示性的CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基24-34、L2的50-56、L3的89-97、H1的31-35B、H2的50-65、和H3的95-102(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。除了VH中的CDR1外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”，或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR包含在称作缩短的-CDR，或a-CDR的CDR区内。例示性的a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2、和a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34、L2的50-55、L3的89-96、H1的31-35B、H2的50-58、和H3的95-102(见Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))。除非另有指示，可变域中的HVR残基和其它残基(例如，FR残基)在本文中依照Kabat等，见上文编号。
“免疫缀合物”指与一种或多种异源分子，包括但不限于细胞毒剂缀合的抗体。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如，牛、绵羊、猫、犬、和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类诸如猴)、家兔、和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的”抗体指已经与其天然环境的组分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述，见例如Flatman等，J.Chromatogr.B848：79-87(2007)。
“分离的”核酸指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但是核酸分子在染色体外或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。
“编码抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体的分离的核酸”指编码抗体重和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括单一载体或不同载体中的此类核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置的此类核酸分子。
在用于本文时，术语“K*连接的多聚遍在蛋白”和“Lys*连接的多聚遍在蛋白”可互换使用，指在一个遍在蛋白模块的C-末端与另一个遍在蛋白模块中的第*位赖氨酸之间包含至少一个异肽键的多聚遍在蛋白分子。例如，“K11连接的多聚遍在蛋白”与“Lys11连接的多聚遍在蛋白”可互换使用，这两个术语都指在分子中一个遍在蛋白模块的C-末端与分子中另一个遍在蛋白模块的第11位赖氨酸之间包含异肽键的多聚遍在蛋白分子。
在用于本文时，表述第一赖氨酸连接“不同”于第二赖氨酸连接指一个遍在蛋白模块与另一个遍在蛋白模块之间的该第一赖氨酸连接所牵涉的赖氨酸残基(例如，K6、K11、K27、K29、K33、K48、和/或K63)不同于一个遍在蛋白模块与另一个遍在蛋白模块之间的该第二赖氨酸连接。
在用于本文时，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特性，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。
“裸抗体”指未与异源模块(例如细胞毒性模块)或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物配制剂中。
“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫化物键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域(CH1、CH2、和CH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域或轻链可变域，接着是一个恒定轻(CL)域。根据其恒定域氨基酸序列，抗体轻链可归入两种类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定用于比对序列的合适参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.编写，并且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office，Washington D.C.，20559)，其中其以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech，Inc.，South San Francisco，California可获得ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统，包括数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y乘100
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。应当领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
术语“药物配制剂”指处于如下的形式，使得容许其中含有的活性成分的生物学活性是有效的，且不含对会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的别的组分的制剂。
“药学可接受载体”指药物配制剂中与活性成分不同的，且对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂、或防腐剂。
在用于本文时，术语“多聚遍在蛋白(polyubiquitin)”定义为所有种类的天然的人的和合成的遍在蛋白聚合链，其落入遍在蛋白不同聚合连接方式的人的和合成的类别，包括，但不限于，K6连接的多聚遍在蛋白、K11连接的多聚遍在蛋白、K27连接的多聚遍在蛋白、K29连接的多聚遍在蛋白、K33连接的多聚遍在蛋白、K48连接的多聚遍在蛋白和K63连接的多聚遍在蛋白。多聚遍在蛋白可以是任何长度的，包括至少两个遍在蛋白模块(moity)。多聚遍在蛋白有别于最初作为单一蛋白质表达的遍在蛋白串联重复体。
在用于本文时，“治疗/处理”(及其语法变型)指试图改变所治疗个体的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或者在临床病理学的过程期间实施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减轻/减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速率、改善或减轻疾病状态、和消退或改善的预后。在一些实施方案中，使用本发明的抗体来延迟疾病的形成或减缓疾病的进展。
在用于本文时，术语“遍在蛋白(ubiquitin)”和“单遍在蛋白(monoubiquitin)”可互换使用，指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然遍在蛋白，除非另有说明。该术语涵盖“全长”，未加工的遍在蛋白以及遍在蛋白因细胞中的加工所致的任何缩短或翻译后修饰形式，由多个遍在蛋白模块构成的分子除外。该术语还涵盖遍在蛋白的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。一种例示性人遍在蛋白的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：1：MQIFV
Figure BDA00002587640500161
TLTG
Figure BDA00002587640500162
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Figure BDA00002587640500164
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QLEDGRTLSDYNIQ
Figure BDA00002587640500167
ESTLHLVLRLRGG(SEQ ID NO：1)。遍在蛋白具有氨基酸6、氨基酸11、氨基酸27、氨基酸29、氨基酸33、氨基酸48、和/或氨基酸63处的至少一个赖氨酸残基(在上文SEQ ID NO：1中以粗体标示)。
在用于本文时，术语“遍在蛋白途径”指细胞中的或在体外重建的、包括遍在蛋白和/或多聚遍在蛋白的生化途径。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构，其中每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)。(见例如Kindt等KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007))。单个VH或VL域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合特定抗原的抗体。见例如，Portolano等，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等，Nature352：624-628(1991)。
在用于本文时，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及整合入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
II.组合物和方法
一方面，本发明部分基于能够特异性识别含有第一多聚遍在蛋白连接的第一多聚遍在蛋白分子但不特异性结合含有第二多聚遍在蛋白连接的第二多聚遍在蛋白分子的抗体的创建。在某些实施方案中，提供特异性结合K11连接的多聚遍在蛋白的抗体。本发明的抗体既可用于研究，又可用于例如例如诊断或治疗例如涉及异常细胞周期行进的疾病和病症。
本发明的抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体的独特特性使得它们特别可用于区分细胞系统中不同赖氨酸连接形式的多聚遍在蛋白，而不需要求助于麻烦且昂贵的遗传操作或生物物理方法诸如质谱术。本发明的抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体可用于在体外和在体内表征特定K11连接的多聚遍在蛋白的功能和活性。本发明的抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体还可用于确定特定K11连接的多聚遍在蛋白在疾病的形成和发病机理中的作用。本发明的抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体还可用于治疗其中一种或多种特定赖氨酸连接的多聚遍在蛋白受到异常调节或功能发挥异常的疾病，而不会干扰抗多聚遍在蛋白抗体对其不特异性的多聚遍在蛋白的正常活性。
已知后期促进性复合物(anaphase-promoting complex)(APC/C)起遍在蛋白化E3连接酶(其负责有丝分裂期间合成的大部分K11连接的多聚遍在蛋白链)的作用。特别地，由APC/C介导的对有丝分裂蛋白质诸如细胞周期蛋白、孪蛋白、和Plk1的K11连接的多聚遍在蛋白化导致随后蛋白酶体对那些经标记的蛋白质的降解。当内源遍在蛋白发生突变，使得第11位赖氨酸变成精氨酸且因此不能用于赖氨酸连接时，所得突变细胞表现出重要有丝分裂蛋白质降解异常缺失和细胞周期停滞。在蟾蜍(Xenopus)中，这种突变导致胚胎在原肠胚形成前死亡。K11连接的多聚遍在蛋白标记物的存在和可及性如此在正常细胞周期行进中发挥重要作用，而且本发明的抗体和Fab提供有用的治疗手段来调控细胞周期调节异常的病症和疾病状态。在一个实施方案中，本发明的抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体用于治疗其中细胞周期行进异常上调，导致细胞分裂太多的疾病和病症，诸如癌症。在另一个实施方案中，本发明的抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体用于治疗其中细胞周期行进异常下调，导致细胞分裂太少和伴随消瘦或组织破坏的疾病和病症。此类疾病的例子包括但不限于变性肌肉病症和变性神经病症(包括但不限于Charcot MarieTooth综合征、脊髓灰质炎、肌萎缩侧索硬化、和Guillain-Barre二氏综合征)。
在用于本文时，术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症指癌症。
术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中典型特征为细胞生长/增殖不受调控的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤(例如何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤、和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、阑尾癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤(glioblastoma)、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝肉瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌(liver cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、白血病和其它淋巴增殖性病症、及各种类型的头和颈癌。
术语“肿瘤”在本文中使用时指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
术语“变性肌肉病症”指向或描述含肌肉动物中典型特征为骨骼肌和/或平滑肌衰退或弱化使得正常肌肉功能降低的生理疾患。变性肌肉病症的例子包括但不限于肌营养不良、强直性肌营养不良、先天性肌强直病、恶病质、肌肉减少症(sarcopenia)、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化、艾萨克(Isaac)氏综合征、僵人综合征、家族性周期性麻痹(familiar periodic paralyses)、肌病、肌强直、横纹肌溶解、肌肉萎缩和各种类型的肌肉无力和肌肉强直。
术语“变性神经病症”指向或描述含神经动物中典型特征为神经组织退化或神经组织的细胞间通讯衰退的生理疾患。变性神经病症的例子包括但不限于神经变性疾病(包括但不限于Lewy体疾病、脊髓灰质炎后综合征、Shy-Draeger综合征、橄榄体脑桥小脑萎缩、帕金森(Parkinson)氏病、多系统萎缩、肌萎缩侧索硬化、Guillian-Barre二氏综合征、Carcot Marie Tooth综合征、纹状体黑质变性、由τ病引起或与τ病有关的和神经细胞/组织破坏、朊病毒病、延髓性麻痹、运动神经元疾病、痴呆、和神经系统异型变性疾病(包括但不限于卡纳万(Canavan)病、亨庭顿(Huntington)氏病、神经元蜡样脂褐质沉积症、亚历山大(Alexander)氏病、图雷特(Tourette)氏综合征、Menkes卷发综合征、科凯恩(Cockayne)综合征、Halervorden-Spatz综合征、拉福拉(lafora)病、Rett综合征、肝豆状核变性、Lesch-Nyhan综合征、和Unverricht-Lundborg综合征)。
另一方面，本发明的抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体可用作试剂来检测和分离K11连接的多聚遍在蛋白，诸如检测各种细胞类型和组织中的多聚遍在蛋白，包括测定多聚遍在蛋白密度和在细胞群体中和给定细胞内的分布，和基于多聚遍在蛋白的存在或量的细胞分选。在又一个方面，本发明的抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体可用于开发具有与本发明主题抗体相似的阻断活性样式的多聚遍在蛋白拮抗剂。又例如，本发明的抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体可用于鉴定与本文中例示的抗体结合多聚遍在蛋白上基本上相同抗原决定簇(包括线性和构象表位)的其它抗多聚遍在蛋白抗体。
本发明的抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体可用于基于涉及多聚遍在蛋白的生理途径的测定法，以筛选K11连接的多聚遍在蛋白功能的小分子拮抗剂。例如，由于已知K11连接的多聚遍在蛋白链是正常细胞周期行进通过后期(cell cycle progression through anphase)所必需的(CITE)，因此可以将抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体调控(上或下调)处理细胞或组织中细胞周期行进的活性与K11连接的多聚遍在蛋白的一种或多种潜在小分子拮抗剂调控细胞周期行进的活性比较。
A.例示性抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体
一方面，本发明提供结合K11连接的多聚遍在蛋白的分离的抗体。在某些实施方案中，抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体特异性结合K11连接的多聚遍在蛋白，但不特异性结合单遍在蛋白。在某些实施方案中，抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体特异性结合K11连接的多聚遍在蛋白，但不特异性结合具有任何其它赖氨酸连接(即K6、K27、K29、K33、K48、和/或K63连接)的多聚遍在蛋白。
一方面，本发明提供一种抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体，其包含HVR-H1区，该HVR-H1区包含SEQ ID NO：6-11和24中至少一种的序列。一方面，本发明提供一种抗体，其包含HVR-H2区，该HVR-H2包含SEQ ID NO：12-17，25，67和75中至少一种的序列。一方面，本发明提供一种抗体，其包含HVR-H3区，该HVR-H3区包含SEQ ID NO：18-23，26，68，69和76中至少一种的序列。
一方面，本发明提供一种抗体，其包含HVR-H1区和HVR-H2区，该HVR-H1区包含SEQ ID NO：6-11和24中至少一种的序列，该HVR-H2区包含SEQ ID NO：12-17，25，67和75中至少一种的序列。一方面，本发明提供一种抗体，其包含HVR-H1区和HVR-H3区，该HVR-H1区包含SEQ ID NO：6-11和24中至少一种的序列，该HVR-H3区包含SEQ ID NO：18-23，26，68，69和76中至少一种的序列。一方面，本发明提供一种抗体，其包含HVR-H2区和HVR-H3区，该HVR-H2区包含SEQ ID NO：12-17，25，67和75中至少一种的序列，该HVR-H3区包含SEQ ID NO：18-23，26，68，69和76中至少一种的序列。
一方面，本发明提供一种抗体，其包含HVR-L1区，该HVR-L1区包含SEQID NO：2，57-60和73中至少一种的序列。一方面，本发明提供一种抗体，其包含HVR-L2区，该HVR-L2区包含SEQ ID NO：3，61和74中至少一种的序列。一方面，本发明提供一种抗体，其包含HVR-L3区，该HVR-L3区包含SEQ IDNO：4的序列。
一方面，本发明提供一种抗体，其包含HVR-L1区和HVR-L2区，该HVR-L1区包含SEQ ID NO：2，57-60和73中至少一种的序列，该HVR-L2区包含SEQ ID NO：3，61和74中至少一种的序列。一方面，本发明提供一种抗体，其包含HVR-L1区和HVR-L3序列SEQ ID NO：4，该HVR-L1区包含SEQ IDNO：2，57-60和73中至少一种的序列。一方面，本发明提供一种抗体，其包含HVR-L2区和HVR-L3序列SEQ ID NO：4，该HVR-L2区包含SEQ ID NO：3，61和74中至少一种的序列。
一方面，本发明提供一种抗体，其包含下述至少一项、至少两项、至少三项、至少四项、至少五项或所有六项：
(i)HVR-H1序列，其包含SEQ ID NO：6-11和24中至少一种序列；
(ii)HVR-H2序列，其包含SEQ ID NO：12-17，25，67和75中至少一种序列；
(iii)HVR-H3序列，其包含SEQ ID NO：18-23，26，68，69和76中至少一种序列；
(iv)HVR-L1序列，其包含SEQ ID NO：2，57-60和73中至少一种序列；
(v)HVR-L2序列，其包含SEQ ID NO：3，61和74中至少一种序列；和
(vi)HVR-L3序列SEQ ID NO：4。
一方面，本发明提供一种抗体，其以高亲和力特异性结合K11连接的多聚遍在蛋白，但以实质性降低的亲和力结合具有一些其它赖氨酸连接的多聚遍在蛋白，该抗体包含下述至少一项、至少两项、至少三项、至少四项、至少五项或所有六项：
(i)HVR-H1序列，其包含SEQ ID NO：6-11和24中至少一种序列；
(ii)HVR-H2序列，其包含SEQ ID NO：12-17，25，67和75中至少一种序列；
(iii)HVR-H3序列，其包含SEQ ID NO：18-23，26，68，69和76中至少一种序列；
(iv)HVR-L1序列，其包含SEQ ID NO：2，57-60和73中至少一种序列；
(v)HVR-L2序列，其包含SEQ ID NO：3，61和74中至少一种序列；和
(vi)HVR-L3序列SEQ ID NO：4。
一方面，本发明提供抗体，其包含图1B、4B、或6B中所示重链HVR序列。在一个实施方案中，抗体包含图1A、4A、或6A中所示轻链HVR序列。在一个实施方案中，抗体包含图1B、4B、或6B中所示重链HVR序列和图1A、4A、或6A中所示轻链HVR序列。
本发明的抗体的一些实施方案包含如下文SEQ ID NO：79中所示的人源化4D5抗体(huMAb4D5-8)(
Figure BDA00002587640500211
Genentech，Inc.，South SanFrancisco，CA，USA)(也参见美国专利No.6,407,213和Lee等，J.Mol.Biol.(2004)，340(5)：1073-93)的轻链可变域。
1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg ValThr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
Figure BDA00002587640500212
Val
Figure BDA00002587640500213
Ala Val Ala Trp Tyr Gln GlnLys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser
Figure BDA00002587640500214
Leu Tyr Ser GlyVal Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
Figure BDA00002587640500215
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile SerSer Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
Figure BDA00002587640500216
Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107(SEQ ID NO：79)(HVR残基是加下划线的)
在一个实施方案中，huMAb4D5-8轻链可变域序列在第28、30、31、53、66、和91位(分别如上文以粗体/斜体所示的Asp、Asn、Thr、Phe、Arg、和His)的一个或多个位置处被修饰。在一个实施方案中，修饰的huMAb4D5-8序列在第28位包含Ser，在第30位包含Ser，在第31位包含Ser，在第53位包含Ser，在第66位包含Gly，和/或在第91位包含Tyr。因而，在一个实施方案中，本发明的抗体包含含有下文SEQ ID NO：80所示序列的轻链可变域：
1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg ValThr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
Figure BDA00002587640500217
Val
Figure BDA00002587640500218
Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln LysPro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser
Figure BDA00002587640500219
Leu Tyr Ser Gly Val ProSer Arg Phe Ser Gly Ser
Figure BDA000025876405002110
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser LeuGln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
Figure BDA00002587640500221
Tyr Thr Thr Pro Pro ThrPhe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107(SEQ ID NO：80)(HVR残基是加下划线的)
相对于huMAb4D5-8，替代的残基用如上以粗体/斜体标明。
本发明的抗体可包含任何合适的框架可变域序列，前提条件是基本上保留了对K11连接的多聚遍在蛋白的结合活性。例如，在一些实施方案中，本发明的抗体包含人亚组III重链框架共有序列。在这些抗体的一个实施方案中，框架共有序列包含在第71、73和/或78位的替代。在这些抗体的一些实施方案中，第71位是A、第73位是T和/或第78位是A。在一个实施方案中，这些抗体包含huMAb4D5-8(
Figure BDA00002587640500222
Genentech，Inc.，South SanFrancisco，CA，USA)(也参见美国专利No.6,407,213和5,821,337，和Lee等，J.Mol.Biol.(2004)，340(5)：1073-93)的重链可变域框架序列。在一个实施方案中，这些抗体进一步包含人κI轻链框架共有序列。在一个实施方案中，这些抗体包含选自SEQ ID NO：2-4，57-61，73和74轻链HVR序列中至少一条、两条或所有的轻链HVR序列。在一个实施方案中，这些抗体包含如美国专利No.6,407,213和5,821,337中所描述的huMAb4D5-8的轻链HVR序列。在一个实施方案中，这些抗体包含huMAb4D5-8(SEQ ID NO：783和784)(
Figure BDA00002587640500223
Genentech，Inc.，South San Francisco，CA，USA)的轻链可变域序列(也参见美国专利No.6,407,213和5,821,337，和Lee等，J.Mol.Biol.(2004)，340(5)：1073-93)。
在一个实施方案中，本发明的抗体是亲和力成熟的，以获得期望的靶物结合亲和力。在一个例子中，本发明的以高亲和力特异性结合K11连接的多聚遍在蛋白但以实质性降低的亲和力结合具有其它(非K11)赖氨酸连接的多聚遍在蛋白的亲和力成熟抗体包含HVR-H2氨基酸位置60和63处的替代。在另一个例子中，本发明的以高亲和力特异性结合K11连接的多聚遍在蛋白但以实质性降低的亲和力结合具有其它(非K11)赖氨酸连接的多聚遍在蛋白的亲和力成熟抗体包含HVR-H3氨基酸位置98和99处的替代。在另一个例子中，本发明的以高亲和力特异性结合K11连接的多聚遍在蛋白但以实质性降低的亲和力结合具有其它(非K11)赖氨酸连接的多聚遍在蛋白的亲和力成熟抗体包含HVR-L1氨基酸位置24，25，27和28-34处的替代。在另一个例子中，本发明的以高亲和力特异性结合K11连接的多聚遍在蛋白但以实质性降低的亲和力结合具有其它(非K11)赖氨酸连接的多聚遍在蛋白的亲和力成熟抗体包含HVR-L2氨基酸位置50-52和54处的替代。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含SEQ ID NO：27-32和70-72的至少一种重链可变域序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含SEQ ID NO：5和62-66的至少一种轻链可变域。在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变域，其包含SEQ ID NO：27-32和70-72中至少一种序列，而且该抗体还包含轻链可变域，其包含SEQ ID NO：5和62-66中至少一种序列。在其它实施方案中，与特定克隆编号对应的本发明抗体包含重链可变域，该重链可变域包含图1B、4B或6B中对该克隆编号所示HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3序列。在其它实施方案中，与特定克隆编号对应的本发明抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含图1A、4A和6A中对该克隆编号所示HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。在其它实施方案中，与特定克隆编号对应的本发明抗体包含重链可变域，该重链可变域包含图1B、4B或6B中对该克隆编号所示HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3序列，而且该抗体还包含轻链可变域，该轻链可变域包含图1A、4A和6A中对该克隆编号所示HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
一方面，本发明提供一种抗体，其与任何上述抗体竞争对K11连接的多聚遍在蛋白的结合。一方面，本发明提供一种抗体，其与任何上述抗体结合K11连接的多聚遍在蛋白上相同抗原决定簇。
如本文中所示，本发明的抗体特异性结合具有特定赖氨酸连接的分离的多聚遍在蛋白。如本文中所示，在该多聚遍在蛋白附着于异源蛋白质时，本发明的抗体还特异性结合具有特定赖氨酸连接的多聚遍在蛋白。
在任何上述实施方案中，抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体包含任何上述实施方案中的HVR，而且进一步包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在另一个实施方案中，抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体包含任何上述实施方案中的HVR，而且进一步包含VH，该VH包含SEQ ID NO：27-32和70-72中任何的FR1、FR2、FR3、或FR4序列。在另一个实施方案中，抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体包含任何上述实施方案中的HVR，而且进一步包含VL，该VL包含SEQ ID NO：5和62-66中任何的FR1、FR2、FR3、或FR4序列。
另一方面，抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体包含与SEQ ID NO：27-32和70-72中任何的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的VH序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)、插入、或删除，但是包含该序列的抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体保留结合K11连接的多聚遍在蛋白的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：27-32和70-72任一中替代、插入和/或删除了总共1到10个氨基酸。在某些实施方案中，替代、插入、或删除存在于HVR以外的区域(即在FR中)。任选地，抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体包含SEQ ID NO：27-32和70-72中任何的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。
另一方面，提供抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体，其中该抗体包含与SEQID NO：5和62-66中任何的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的VL序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)、插入、或删除，但是包含该序列的抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体保留结合K11连接的多聚遍在蛋白的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：5和62-66任一中替代、插入和/或删除了总共1到10个氨基酸。在某些实施方案中，替代、插入、或删除存在于HVR以外的区域(即在FR中)。任选地，抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体包含SEQ ID NO：5和62-66中任何的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。
另一方面，提供抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，抗体包含SEQ ID NO：27-32和70-72中任何的VH和SEQ ID NO：5和62-66中任何的VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
在本发明的又一个方面，依照任何上述实施方案的抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体是单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双抗体、或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如完整IgG1抗体或其它抗体类或同种型，如本文中定义的。
提供组合物，其包含至少一种抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体或包含编码抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体的序列的至少一种多核苷酸。在某些实施方案中，组合物可以是药物组合物。如本文中使用的，组合物包含结合一种或多种多聚遍在蛋白的一种或多种抗体和/或包含编码结合一种或多种多聚遍在蛋白的一种或多种抗体的序列的一种或多种多核苷酸。这些组合物可进一步包含合适的载体，诸如药学可接受赋形剂，包括缓冲剂，它们是本领域公知的。
在又一个方面，依照任何上述实施方案的抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体可单一地或组合地掺入下文1-7节中描述的任何特征：
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文中提供的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
在一个实施方案中，Kd是通过如下述测定法所述用Fab型式的感兴趣抗体及其抗原实施的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的。通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况中用最小浓度的(125I)标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(见例如Chen等，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。为了建立测定法的条件，将
Figure BDA00002587640500251
多孔板(Thermo Scientific)用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被过夜，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清清蛋白于室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM125I-抗原与连续稀释的感兴趣Fab(例如与Presta等，Cancer Res.57：4593-4599(1997)中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致)混合。然后将感兴趣的Fab温育过夜；然而，温育可持续更长时间(例如约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板，于室温温育(例如1小时)。然后除去溶液，并用PBS中的0.1％聚山梨酯20(TWEEN-
Figure BDA00002587640500252
)洗板8次。平板干燥后，加入150μl/孔闪烁液(MICROSCINT-20TM；Packard)，然后在TOPCOUNT TM伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20％的浓度用于竞争性结合测定法。
依照另一个实施方案，Kd是使用表面等离振子共振测定法使用
Figure BDA00002587640500253
-2000或
Figure BDA00002587640500254
-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)于25℃使用例如固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简言之，依照供应商的用法说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠pH 4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射以获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，于25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％聚山梨酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(
Figure BDA00002587640500261
Evaluation Software version 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。见例如Chen等，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过106M-1S-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的情况中，测量PBS pH 7.2中20nM抗抗原抗体(Fab形式)于25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。也容易获得用于靶抗原对芯片表面的其它偶联化学(例如链霉亲合素/生物素、疏水性相互作用、或二硫化物化学)来代替上文所述胺偶联方法学(CM5芯片)，正如本领域普通技术人员会理解的。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、和scFv片段，及下文所描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述，见Hudson等Nat.Med.9：129-134(2003)。关于scFv片段的综述，见例如Pluckthün，于The Pharmacology of MonoclonalAntibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编，(Springer-Verlag，New York)，第269-315页(1994)；还可见WO 93/16185；及美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基，并且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，见美国专利No.5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等，Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson等，Nat.Med.9：129-134(2003)。
单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；见例如美国专利No.6,248,516B1)。
可以通过多种技术，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成来生成抗体片段，如本文中所描述的。
3.嵌合的和人源化的抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体记载于例如美国专利No.4,816,567；及Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，自小鼠、大鼠、仓鼠、家兔、或非人灵长类，诸如猴衍生的可变区)和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换的”抗体，其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如CDR(或其部分)自非人抗体衍生，而FR(或其部分)自人抗体序列衍生。任选地，人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的相应残基替代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)，并且进一步记载于例如Riechmann等，Nature332：323-329(1988)；Queen等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337，7,527,791，6,982,321和7,087,409；Kashmiri等，Methods 36：25-34(2005)(描述了SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan，Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述了“重修表面”)；Dall’Acqua等，Methods 36：43-60(2005)(描述了“FR改组”)；及Osbourn等，Methods 36：61-68(2005)和Klimka等，Br.J.Cancer，83：252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”方法)。
可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区(见例如Sims等J.Immunol.151：2296(1993))；自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区(见例如Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；及Presta等J.Immunol.，151：2623(1993))；人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(见例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；和通过筛选FR文库衍生的框架区(见例如Baca等，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)及Rosok等，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地，人抗体记载于van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)及Lonberg，Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)。
可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述，见Lonberg，Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。还可见例如美国专利No.6,075,181和6,150,584，其描述了XENOMOUSETM技术；美国专利No.5,770,429，其描述了
Figure BDA00002587640500281
技术；美国专利No.7,041,870，其描述了K-M
Figure BDA00002587640500282
技术，和美国专利申请公开文本No.US 2007/0061900，其描述了
Figure BDA00002587640500283
技术)。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。
也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系(见例如Kozbor J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，第51-63页(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；及Boerner等，J.Immunol.，147：86(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：3557-3562(2006)。其它方法包括那些例如记载于美国专利No.7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)和Ni，Xiandai Mianyixue，26(4)：265-268(2006)(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma技术)也记载于Vollmers和Brandlein，Histology and Histopathology，20(3)：927-937(2005)及Vollmers和Brandlein，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology，27(3)：185-91(2005)。
也可以通过分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变域序列生成人抗体。然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。
5.文库衍生的抗体
可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离本发明的抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库并对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom等于Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brien等编，Human Press，Totowa，NJ，2001)，并且进一步记载于例如McCafferty等，Nature348：552-554；Clackson等，Nature 352：624-628(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks和Bradbury，于Methods in Molecular Biology248：161-175(Lo编，Human Press，Totowa，NJ，2003)；Sidhu等，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体，如记载于Winter等，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994)的。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如自人)克隆天然全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由Griffiths等，EMBO J，12：725-734(1993)描述的。最后，也可以通过自干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如：美国专利No.5,750,373、和美国专利公开文本No.2005/0079574，2005/0119455，2005/0266000，2007/0117126，2007/0160598，2007/0237764，2007/0292936和2009/0002360。
认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对K11连接的多聚遍在蛋白，而另一种针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合K11连接的多聚遍在蛋白的两个不同表位。也可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂定位于表达K11连接的多聚遍在蛋白的细胞。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。
用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(见Milstein和Cuello，Nature 305：537(1983))、WO 93/08829、和Traunecker等，EMBO J.10：3655(1991))、和“突起-入-空穴”工程化(见例如美国专利No.5,731,168)。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO 2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(见例如美国专利No.4,676,980，及Brennan等，Science，229：81(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(见例如Kostelny等，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(见例如Gruber等，J.Immunol.，152：5368(1994))；及如例如Tutt等J.Immunol.147：60(1991)中所描述的，制备三特异性抗体来生成多特异性抗体。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”(见例如US 2006/0025576A1)。
本文中的抗体或片段还包括包含结合K11连接的多聚遍在蛋白及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF”(见例如US2008/0069820)。
7.抗体变体
在某些实施方案中，涵盖本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可以期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将合适的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除、和/或插入和/或替代。可以进行删除、插入、和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如，抗原结合。
a)替代、插入、和删除变体
在某些实施方案中，提供了具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。保守替代在表1中在“保守替代”的标题下显示。更实质的变化在表1中在“例示性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC。
表1
初始残基 例示性替代 优选的替代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp，Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性、亲水性的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性的：Asp，Glu；
(4)碱性的：His，Lys，Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。
非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。
一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力、降低的免疫原性)和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。
可以对HVR做出变化(例如，替代)，例如以改善抗体亲和力。可以对HVR“热点”，即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基(见例如Chowdhury，Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))，和/或SDR(a-CDR)做出此类变化，其中对所得的变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经记载于例如Hoogenboom等于Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brien等编，Human Press，Totowa，NJ，(2001))。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组、或寡核苷酸指导的诱变)将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉HVR指导的方法，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定牵涉抗原结合的HVR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，可以在一个或多个HVR内发生替代、插入、或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以对HVR做出保守变化(例如，保守替代，如本文中提供的)，其不实质性降低结合亲和力。此类变化可以在HVR“热点”或SDR外部。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR是未改变的，或者含有不超过1、2或3处氨基酸替代。
一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells(1989)Science，244：1081-1085所描述的。在此方法中，将残基或靶残基的组(例如，带电荷的残基诸如arg、asp、his、lys、和glu)鉴定，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外，利用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原间的接触点。作为替代的候选，可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合，及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体的糖基化位点的添加或删除。
在抗体包含Fc区的情况中，可以改变其附着的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的、双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2域的Asn297。见例如Wright等TIBTECH 15：26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖、和唾液酸，以及附着于双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供了抗体变体，其具有缺乏附着(直接或间接)于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中的岩藻糖量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过相对于附着于Asn297的所有糖结构(例如，复合的、杂合的和高甘露糖的结构)的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过MALDI-TOF质谱术测量的，例如如记载于WO 2008/077546的。Asn297指位于Fc区中的约第297位(Fc区残基的Eu编号方式)的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。见例如美国专利公开文本No.US 2003/0157108(Presta，L.)；US 2004/0093621(KyowaHakko Kogyo Co.，Ltd)。涉及“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的出版物的例子包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能够生成脱岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美国专利申请No US2003/0157108A1，Presta，L；及WO 2004/056312A1，Adams等，尤其在实施例11)，和敲除细胞系，诸如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(见例如Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda，Y.等，Biotechnol.Bioeng.，94(4)：680-688(2006)；及WO2003/085107)。
进一步提供了具有两分型寡糖的抗体变体，例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利No.6,602,684(Umana等)；及US 2005/0123546(Umana等)。还提供了在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO 1997/30087(Patel等)；WO 1998/58964(Raju，S.)；及WO 1999/22764(Raju，S.)。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中，本发明涵盖拥有一些但不是所有效应器功能的抗体变体，所述效应器功能使其成为如下应用的期望候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应器功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)的第464页上的表3中汇总了造血细胞上的FcR表达。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子记载于美国专利No.5,500,362(见例如Hellstrom，I.等Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))和Hellstrom，I等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；5,821,337(见Bruggemann，M.等，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))。或者，可以采用非放射性测定方法(见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology，Inc.MountainView，CA；和CytoTox
Figure BDA00002587640500351
非放射性细胞毒性测定法(Promega，Madison，WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如披露于Clynes等Proc.Nat’l Acad.Sci.USA95：652-656(1998)的。也可以实施C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以实施CDC测定法(见例如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg，M.S.等，Blood 101：1045-1052(2003)；及Cragg，M.S.和M.J.Glennie，Blood103：2738-2743(2004))。也可以使用本领域中已知的方法来实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定(见例如Petkova，S.B.等，Int’l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
具有降低的效应器功能的抗体包括那些具有Fc区残基238，265，269，270，297，327和329中的一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两处或更多处具有替代的Fc突变体，包括残基265和297替代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。
描述了具有改善的或降低的对FcR的结合的某些抗体变体(见例如美国专利No.6,737,056；WO 2004/056312，及Shields等，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一处或多处氨基酸替代，例如Fc区的位置298、333、和/或334(残基的EU编号方式)的替代的Fc区。
在一些实施方案中，对Fc区做出改变，其导致改变的(即，改善的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如记载于美国专利No.6,194,551、WO 99/51642、及Idusogie等J.Immunol.164：4178-4184(2000)的。
具有延长的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体记载于US2005/0014934A1(Hinton等)，新生儿Fc受体(FcRn)负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等，J.Immunol.24：249(1994))。那些抗体包含其中具有改善Fc区对FcRn结合的一处或多处替代的Fc区。此类Fc变体包括那些在Fc区残基238，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434中的一处或多处具有替代，例如，Fc区残基434的替代的(美国专利No.7,371,826)。
还可见Duncan和Winter，Nature 322：738-40(1988)；美国专利No.5,648,260；美国专利No.5,624,821；及WO 94/29351，其关注Fc区变体的其它例子。
d)经半胱氨酸工程化改造的抗体变体
在某些实施方案中，可以期望创建经半胱氨酸工程化改造的抗体，例如，“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在具体的实施方案中，替代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其它模块，诸如药物模块或接头-药物模块缀合，以创建免疫缀合物，如本文中进一步描述的。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸替代下列残基之任一个或多个：轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。可以如例如美国专利No.7,521,541所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三
Figure BDA00002587640500371
烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)、和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体要改进的具体特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。
在另一个实施方案中，提供了抗体和可以通过暴露于辐射选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，并且包括但不限于对普通细胞没有损害，但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。
B.重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物来生成抗体，例如，如记载于美国专利No.4,816,567的。在一个实施方案中，提供了编码本文中所描述的抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体的分离的核酸。此类核酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻和/或重链)。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的一种或多种载体(例如，表达载体)。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用下列载体转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸，所述第二载体包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了生成抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体的方法，其中该方法包括在适合于表达抗体的条件下培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，如上文提供的，并且任选地，自宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收抗体。
对于抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体的重组生成，将编码抗体的核酸(例如如上文所描述的)分离，并插入一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规规程将此类核酸容易地分离并测序(例如，通过使用寡核苷酸探针来进行，所述寡核苷酸探针能够特异性结合编码抗体的重和轻链的基因)。
适合于克隆或表达抗体编码载体的宿主细胞包括本文中所描述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中生成抗体，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，见例如美国专利No.5,648,237，5,789,199和5,840,523(还可见Charlton，Methods in MolecularBiology，第248卷(B.K.C.Lo编，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，第245-254页，其描述了抗体片段在大肠杆菌(E.coli.)中的表达)。表达后，可以将抗体在可溶性级分中自细菌细胞团糊分离，并可以进一步纯化。
在原核生物外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是适合于抗体编码载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化样式的抗体的真菌和酵母菌株。见Gerngross，Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)，及Li等，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。
适合于表达糖基化抗体的宿主细胞也自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞一起使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
也可以利用植物细胞培养物作为宿主。见例如美国专利No.5,959,177，6,040,498，6,420,548，7,125,978和6,417,429(其描述了用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适合于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如记载于例如Graham等，J.Gen Virol.36：59(1977)的)；幼年仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如记载于例如Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980)的)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如记载于例如Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)的；MRC 5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适合于抗体生成的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。
C.测定法
可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体鉴定、筛选、或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。
1.结合测定法和其它测定法
一方面，对本发明的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA、Western印迹等来进行。
另一方面，可使用竞争测定法来鉴定与例如任何Fab A3、A6、A9、B5、F5、或G3，或抗体G3、1A11、1C12、1F12、2A3、2A6、2D7、2E6、2G4，或杂合抗体1C12/2E6或2A3/2E6(如本文所述)竞争对K11连接的多聚遍在蛋白的结合的抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合与任何Fab A3、A6、A9、B5、F5、或G3，或抗体G3、1A11、1C12、1F12、2A3、2A6、2D7、2E6、2G4，或杂合抗体1C12/2E6或2A3/2E6(如本文所述)所结合表位相同的表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体所结合表位的详细例示性方法见Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”，Methods in Molecular Biologyvol.66(Humana Press，Totowa，NJ)。
在一种例示性竞争测定法中，在包含第一经标记抗体(其结合K11连接的多聚遍在蛋白，例如抗体G3、1A11、1C12、1F12、2A3、2A6、2D7、2E6、2G4，或杂合抗体1C12/2E6或2A3/2E6)和第二未标记抗体(其要测试与第一抗体竞争对K11连接的多聚遍在蛋白的结合的能力)的溶液中温育固定化K11连接的多聚遍在蛋白。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在包含第一经标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中温育固定化K11连接的多聚遍在蛋白。在允许第一抗体结合K11连接的多聚遍在蛋白的条件下温育后，除去过量的未结合抗体，并测量与固定化K11连接的多聚遍在蛋白联合的标记物的量。如果测试样品中与固定化K11连接的多聚遍在蛋白联合的标记物的量与对照样品相比实质性降低，那么这指示第二抗体与第一抗体竞争对K11连接的多聚遍在蛋白的结合。参见Harlow and Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY)。
2.活性测定法
一方面，提供了用于鉴定具有生物学活性的抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体的测定法。生物学活性可包括例如调控细胞或组织中K11连接的多聚遍在蛋白化的蛋白质的降解速率，及调控细胞的细胞周期行进速率。还提供了在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗体。
在某些实施方案中，对本发明的抗体测试此类生物学活性。
D.免疫缀合物
本发明还提供了包含与一种或多种细胞毒剂，诸如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白质毒素、细菌、真菌、植物、或动物起源的酶活性毒素、或其片段)、或放射性同位素缀合的本文中的抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体的免疫缀合物。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，包括但不限于美登木素生物碱(见美国专利No.5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP 0 425 235 B1)；auristatin诸如单甲基auristatin药物模块DE和DF(MMAE和MMAF)(见美国专利No.5,635,483和5,780,588及7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物(见美国专利No.5,712,374，5,714,586，5,739,116，5,767,285，5,770,701，5,770,710，5,773,001和5,877,296；Hinman等，Cancer Res.53：3336-3342(1993)；及Lode等，Cancer Res.58：2925-2928(1998))；蒽环类抗生素诸如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(见Kratz等，CurrentMed.Chem.13：477-523(2006)；Jeffrey等，Bioorganic & Med.Chem.Letters16：358-362(2006)；Torgov等，Bioconj.Chem.16：717-721(2005)；Nagy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：829-834(2000)；Dubowchik等，Bioorg.& Med.Chem.Letters 12：1529-1532(2002)；King等，J.Med.Chem.45：4336-4343(2002)；及美国专利No.6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)诸如多西他赛(docetaxel)、帕利他塞、larotaxel、tesetaxel、和ortataxel；单端孢霉素(trichothecene)；和CC1065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文中所描述的抗体，所述酶活性毒素包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的如本文中所描述的抗体。多种放射性同位素可用于生成放射性缀合物。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。在使用放射性缀合物进行检测时，它可以包含供闪烁法研究用的放射性原子，例如tc99m或I123，或供核磁共振(NMR)成像(又称为磁共振成像，mri)用的自旋标记物，诸如再一次的碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以使用多种双功能蛋白质偶联剂来生成抗体和细胞毒剂的缀合物，诸如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可以如Vitetta等，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感性接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等，Cancer Res 52：127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。
本文中的免疫缀合物或ADC明确涵盖，但不限于用交联试剂制备的此类缀合物，所述交联试剂包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC、和sulfo-SMPB，及SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，它们是商品化的(例如，来自Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)。
E.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文中提供的任何抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体可用于检测生物学样品中K11连接的多聚遍在蛋白的存在。在用于本文时，术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物学样品包含细胞或组织，诸如但不限于肿瘤细胞、肌肉细胞或神经细胞。
在一个实施方案中，提供了在诊断或检测方法中使用的抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体。在又一方面，提供了检测生物学样品中K11连接的多聚遍在蛋白的存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括在容许抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体结合多聚遍在蛋白或多聚遍在蛋白的蛋白质的条件下使生物学样品与抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体接触，如本文中所描述的，并检测是否在抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体与多聚遍在蛋白或多聚遍在蛋白化的蛋白质间形成复合物。此类方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，使用抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体来选择适合用抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体治疗的受试者，例如其中K11连接的多聚遍在蛋白是一种用于选择患者的生物标志。
可使用本发明的抗体来诊断的例示性病症包括细胞周期相关疾病或病症，其可以是与异常升高的细胞周期行进有关的疾病或病症或与异常降低的细胞周期行进有关的疾病或病症。一方面，与异常升高的细胞周期行进有关的疾病或病症是癌症。另一方面，与异常降低的细胞周期行进有关的疾病或病症是例如变性肌肉病症或变性神经病症。
在某些实施方案中，提供了经标记的抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体。标记物包括但不限于直接检测的标记物或模块(诸如荧光、发色、电子致密、化学发光、和放射性标记物)、及例如经由酶反应或分子相互作用间接检测的模块，诸如酶或配体。例示性的标记物包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H、和131I、荧光团诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明(rhodamine)及其衍生物、丹酰、伞形酮、萤光素酶，例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利No.4,737,456)、萤光素、2，3-二氢酞嗪二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶(其与采用过氧化氢氧化染料前体的酶诸如HRP偶联)、乳过氧化物酶、或微过氧化物酶、生物素/亲合素、自旋标记物、噬菌体标记物、稳定的自由基、等等。
E.药物配制剂
通过混合具有期望纯度的此类抗体与一种或多种任选的药学可接受载体(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编(1980))混合以冻干配制剂或水性溶液形式制备如本文中所描述的抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体的药物配制剂。一般地，药学可接受载体在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括但不限于缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性的药学可接受载体进一步包含间质药物分散剂诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(
Figure BDA00002587640500431
Baxter International，Inc.)。某些例示性的sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20记载于美国专利公开文本No.2005/0260186和2006/0104968。在一方面，将sHASEGP与一种或多种别的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。
例示性的冻干抗体配制剂记载于美国专利No.6,267,958。水性抗体配制剂包括那些记载于美国专利No.6,171,586和WO2006/044908的，后一种配制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性组分，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的化合物。例如，可能希望进一步提供一种或多种化疗剂。此类活性组分适于以有效用于所需目的的量而组合存在。
活性成分可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)，或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Remington’sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编(1980)。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形商品形式，例如膜，或微胶囊。
用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可容易地实现，例如通过穿过无菌滤膜过滤。
G.治疗性方法和组合物
可以在治疗性方法中使用本文中提供的任何抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体。
在一方面，提供了作为药物使用的抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体。在别的方面，提供了在治疗与异常细胞周期调节有关的病症(包括但不限于增殖病症诸如癌症和发育障碍病症包括但不限于变性肌肉病症和变性神经病症)中使用的抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体。在某些实施方案中，提供了在治疗方法中使用的抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体。在某些实施方案中，本发明提供了在治疗具有与异常细胞周期调节有关的病症的个体的方法中使用的抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体，所述方法包括对个体施用有效量的抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，例如，如下文所描述的。在别的实施方案中，本发明提供了在调控细胞周期调节使得细胞周期行进速率得到调节中使用的抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体。在某些实施方案中，本发明提供了在个体中调控细胞周期行进速率的方法中使用的抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体，所述方法包括对个体施用有效量的抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体以调控细胞周期行进并由此调节细胞分裂速率。依照任何上述实施方案的“个体”优选是人。
在又一方面，本发明提供了抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，药物用于治疗与异常细胞周期调节有关的病症(包括但不限于增殖病症诸如癌症和发育障碍病症包括但不限于变性肌肉病症和变性神经病症)。在又一个实施方案中，药物在治疗与异常细胞周期调节有关的病症的方法中使用，所述方法包括对具有此类病症的个体施用有效量的药物。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，例如如下文所描述的。在又一个实施方案中，药物用于调控细胞周期行进速率。在又一个实施方案中，药物用于在个体中调控细胞周期行进速率的方法，所述方法包括对个体施用有效量的药物以调节细胞分裂速率。依照任何上述实施方案的“个体”可以是人。
在又一方面，本发明提供了治疗与异常细胞周期调节有关的病症的方法在一个实施方案中，所述方法包括对具有此类与异常细胞周期调节有关的病症的个体施用有效量的抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，如下文所描述的。依照任何上述实施方案的“个体”可以是人。
在又一方面，本发明提供了药物配制剂，其包含本文中提供的任何抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体，例如在任何上述治疗性方法中使用。在一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体和药学可接受载体。在另一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体和至少一种别的治疗剂，例如如下文所描述的。
可以单独或与疗法中的其它药剂组合使用本发明的抗体。例如，可以与至少一种别的治疗剂共施用本发明的抗体。在某些实施方案中，别的治疗剂是化学治疗剂。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)，
Figure BDA00002587640500461
)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinicacid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)
Figure BDA00002587640500462
CPT-11(伊立替康(irinotecan)，
Figure BDA00002587640500463
)、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33：183-186(1994))；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和美登醇(maytansinol)；安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；
Figure BDA00002587640500481
多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)(
Figure BDA00002587640500482
Figure BDA00002587640500483
)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、ABRAXANETM不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的纳米颗粒剂型紫杉醇(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)和
Figure BDA00002587640500485
多西他塞(doxetaxel)(
Figure BDA00002587640500486
-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)
Figure BDA00002587640500487
6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)
Figure BDA00002587640500488
铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)
Figure BDA00002587640500489
奥沙利铂(oxaliplatin)；亚叶酸(leucovorin)；长春瑞滨(vinorelbine)
Figure BDA000025876405004810
能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸(retinoids)，诸如维A酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物；
以及两种或多种上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。
该定义还包括作用为调节、降低、阻断、或抑制可促进癌生长的激素效果的抗激素剂，且常常是系统或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。实例包括抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)；抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD)；功能为抑制或关闭卵巢的药剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂，诸如
Figure BDA00002587640500492
和
Figure BDA00002587640500493
醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(triptorelin)；其它抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、
Figure BDA00002587640500494
醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、
Figure BDA00002587640500495
依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、
Figure BDA00002587640500496
伏罗唑(vorozole)、
Figure BDA00002587640500497
来曲唑(letrozole)和
Figure BDA00002587640500498
阿那曲唑(anastrozole)。另外，化疗剂的这种定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如
Figure BDA00002587640500499
或
Figure BDA000025876405004910
)、
Figure BDA000025876405004911
依替膦酸钠(etidronate)、NE-58095、
Figure BDA000025876405004912
唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)、
Figure BDA000025876405004913
阿伦膦酸盐(alendronate)、
Figure BDA000025876405004914
帕米膦酸盐(pamidronate)、
Figure BDA000025876405004915
替鲁膦酸盐(tiludronate)或
Figure BDA000025876405004916
利塞膦酸盐(risedronate)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉粘着细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如
Figure BDA000025876405004917
疫苗和基因疗法疫苗，例如疫苗、
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疫苗和
Figure BDA000025876405004920
疫苗；拓扑异构酶1抑制剂；
Figure BDA000025876405004922
rmRH；lapatinib ditosylate(ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016)；及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。
上文记录的此类联合疗法涵盖联合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在相同或不同配制剂中)，和分开施用，在该情况中，可以在施用别的治疗剂和/或佐剂之前、同时、和/或之后发生本发明的抗体的施用。也可以与放射疗法组合使用本发明的抗体。
可以通过任何合适的手段，包括胃肠外、肺内、和鼻内，及若期望用于局部治疗的话，损伤内施用来施用本发明的抗体(和任何别的治疗剂)。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。部分根据施用是短暂的还是长期的，剂量给药可以通过任何合适的路径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表，包括但不限于单次施用或在多个时间点里的多次施用、推注施用、和脉冲输注。
本发明的抗体应当以一种符合良好的医学实践的方式配制、确定剂量及给药。关于这一点考虑的因素包括在治疗的特定病症、在治疗的特定哺乳动物、患者个体的临床状态、病因、药物递送部位、给药方法、服药日程以及其它为开业医生所知的因素。抗体无需但可任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所述病症的药物一起配制。上述其它药物的有效量取决于配方中所存在的抗体的量、所治疗病症的类型、以及其它上述讨论的因素。这些药物通常以相同的剂量使用并具有本文中所描述的给药途径，或以约1-99％的本文所描述的剂量使用，或以任何剂量并通过任何途径使用，所述剂量和途径是凭经验确定的/经临床测定合适的。
在制备及给予抗体中要考虑本发明的抗体的结合靶的位置。当结合靶为细胞内分子时，对于要被导入其中结合靶所处的细胞中的抗体或其抗原结合片段提供了本发明的某些实施方案。在一个实施方案中，本发明的抗体可以作为胞内抗体在细胞内表达。如本文中所使用的，术语“胞内抗体”指如Marasco，Gene Therapy 4：11-15(1997)；Kontermann，Methods 34：163-170(2004)；美国专利号6,004,940和6,329,173；美国专利申请公开号2003/0104402和PCT公开号WO2003/077945中所述的，一种在细胞内表达并且能与靶分子选择性结合的抗体或其抗原结合部分。胞内抗体的细胞内表达受将编码期望抗体或其抗原结合部分的核酸(缺少野生型前导序列和通常与编码抗体或抗原结合片段的基因相关的分泌信号)导入靶细胞中的影响。可使用任何将核酸导入细胞中的标准方法，包括但不限于显微注射，弹道式注射(ballistic injection)，电穿孔，磷酸钙沉淀，脂质体以及使用携带有目的核酸的逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒和痘苗病毒载体进行转染。可将一种或多种编码本发明的抗多聚遍在蛋白抗体的全部或部分的核酸递送给靶细胞，使得一种或多种胞内抗体(intrabody)得以表达，从而能在细胞内与多聚遍在蛋白结合并调节一条或多条多聚遍在蛋白介导的细胞途径。
在另一个实施方案中，提供了内在化的抗体。抗体可具有某些增强将抗体递送入细胞中的特性，或可被修饰以具有上述特性。用于实现其的技术是本领域已知的。例如，已知抗体的阳离子化能促进其被细胞摄取(参见如美国专利号6,703,019)。脂质转染或脂质体也可用于将抗体递送入细胞中。在使用抗体片段的情况下，与靶蛋白结合域特异性结合的最小抑制性片段通常是有利的。例如，基于抗体的可变区序列，可设计保留与靶蛋白序列结合能力的的肽分子。上述肽可化学合成和/或通过重组DNA技术产生。参见如Marasco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：7889-7893(1993)。
可通过本领域已知的方法增加调节多肽进入靶细胞。例如，某些序列如来源于HIV Tat或触角足(Antennapedia)同源结构域蛋白的那些序列能指导异源蛋白穿过细胞膜从而有效地摄入。参见如Chen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：4325-4329(1999)。
当结合的靶位于脑中时，某些本发明的实施方案提供了穿过血脑屏障的抗体或其抗原结合片段。某些神经变性疾病与增加的血脑屏障透过性有关，使得抗体或抗原结合片段能容易地导入脑中。当血脑屏障保持完整时，存在着一些用于转运分子穿过该血脑屏障的本领域已知的方法，包括但不限于物理方法、基于脂质的方法以及基于受体和通道的方法。
将抗体或抗原结合片段转运穿过血脑屏障的物理方法包括但不限于完全绕过血脑屏障或通过在血脑屏障中产生开口。绕过方法包括但不限于直接注射入脑中(参见如Papanastassiou等，Gene Therapy 9：398-406(2002))、间质输注/对流增强的递送(convection-enhanced delivery)(参见如Bobo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2076-2080(1994))和在脑中插入递送装置(参见如Gill等，Nature Med.9：589-595(2003)；和Gliadel WafersTM，GuildfordPharmaceutical)。在屏障中产生开口的方法包括但不限于超声波(参见如美国专利公开号2002/0038086)、渗透压(如通过给予高渗的甘露醇(Neuwelt，E.A.，Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation，Vols 1 & 2，PlenumPress，N.Y.(1989)))、通过如缓激肽或透化剂A-7透化(参见如美国专利号5,112,596，5,268,164，5,506,206和5,686,416)和用含有编码抗体或抗原结合片段的基因的载体转染跨越血脑屏障的神经细胞(参见如美国专利公开号2003/0083299)。
基于脂质的将抗体或抗原结合片段转运穿过血脑屏障的方法包括但不限于将抗体或抗原结合片段包囊入连接有与血脑屏障的血管内皮上受体结合的抗体结合片段的脂质体中(参见如美国专利申请公开号20020025313)，以及将抗体或抗原结合片段包被在低密度脂蛋白颗粒(参见如美国专利申请公开号20040204354)或载脂蛋白E(参见如美国专利申请公开号20040131692)中。
基于受体和通道的将抗体或抗原结合片段转运穿过血脑屏障的方法包括但不限于使用糖皮质激素阻断剂来增加血脑屏障的透过性(参见如美国专利申请公开号2002/0065259，2003/0162695和2005/0124533)；激活钾通道(参见如美国专利申请公开号2005/0089473)，抑制ABC药物运载体(参见如美国专利申请公开号2003/0073713)；用转铁蛋白包被抗体并调节一种或多种转铁蛋白受体的活性(参见如美国专利申请公开号2003/0129186)，以及阳离子化抗体(参见如美国专利号5,004,697)。
为了预防或治疗疾病，本发明的抗体(当单独或与一种或多种其它别的治疗剂联合使用时)的合适剂量应取决于所要治疗的疾病的类型、抗体的种类、疾病的严重性和病程、所给予抗体的预防或治疗目的、之前的治疗、患者的临床史和对抗体的应答、以及主治医师的斟酌决定。抗体适合于在一次或一系列的治疗中给予患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg-15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可作为首次候选用量给予患者，无论是例如通过一次或多次单独的给药或通过连续输注。取决予上述提及的因素，一个典型的日剂量可在约1μg/kg-100mg/kg或更多的范围内。对于几天或更长时间的重复给药，取决于病情，治疗应通常持续直至出现病症得到期望的抑制为止。抗体的一个例证性的剂量应为约0.05mg/kg-约10mg/kg。因此，可将一个或多个约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任何组合)的剂量给予患者。上述剂量可间歇给予，如每周或每三周给予一次(如使得患者得到约2-约20个，或例如约6个剂量的抗体)。可给予初始较高的负荷剂量，接着给予一个或多个较低的剂量。然而，可使用其它给药方案。通过常规技术和测定方法易于监测该治疗的进展。
应当理解，可以替换抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体或在抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体外使用本发明的免疫缀合物实施任何上述配制剂或治疗性方法。
H.制品
在本发明的另一方面，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上文所描述的病症的材料。制品包含容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、管形瓶、注射器、IV溶液袋、等等。容器可以由多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器容纳单独或与另一种组合物组合有效治疗、预防和/或诊断状况的组合物，并且可以具有无菌存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射针可穿过的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示使用组合物来治疗选择的状况。此外，制品可以包含(a)具有其中含有的组合物的第一容器，其中组合物包含本发明的抗体；和(b)具有其中含有的组合物的第二容器，其中组合物包含别的细胞毒性或其它方面治疗性的药剂。在本发明的此实施方案中的制品可以进一步包含包装插页，其指示可以使用组合物来治疗特定的状况。或者/另外，制品可以进一步包含第二(或第三)容器，其包含药学可接受缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包含从商业和用户观点看期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针、和注射器。
应当理解，任何上述制品可包括本发明的免疫缀合物来代替或补充抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体。
III.实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，鉴于上文提供的一般描述，可以实施各种其它实施方案。
实施例1：抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体的分离和表征
使用标准技术用几个不同文库实施抗K11连接的多聚遍在蛋白抗体基于噬菌体展示的分离。简言之，在96孔Maxisorb免疫板(NUNC)上固定化酶促合成的全长K11连接的二遍在蛋白(Michael Rape’s lab，UC Berkeley)。将板于4℃用5μg/mL K11二遍在蛋白在50mM碳酸钠缓冲液，pH 9.6中包被过夜。随后将经过包被的板用200μL/孔含2.5％牛乳的含有0.05％Tween 20的PBS(PBST)封闭。用1/5体积的20％PEG/2.5M NaCl自甘油储液沉淀未免疫噬菌体文库并在2.5％牛乳/PBST中重悬浮并于25℃温育1小时。将重悬浮的噬菌体添加(100μL/孔)至经过封闭的板并于25℃摇动温育4小时。结合后，将板用PBST清洗10次，并于25℃用150μL/孔50mM HCl/500mM KCl摇动洗脱噬菌体30分钟。用150μL/孔1M Tris，pH 7.5中和洗脱液并随后在XL-1-Blue大肠杆菌(Stratagene)中添加M13K07辅助噬菌体来繁殖。
使用扩增的噬菌体如上所述进行另外几轮针对K11连接的二遍在蛋白的选择。在第2轮至第4轮中，将可溶性单遍在蛋白或不同连接形式的多聚遍在蛋白添加至噬菌体进行反选择。在第2轮中，使用10μg/mL可溶性单遍在蛋白(Boston Biochem)。在第3轮和第4轮中，使用10μg/mL可溶性单遍在蛋白、线性二遍在蛋白、K48连接的多聚遍在蛋白2-7、和K63连接的多聚遍在蛋白2-7链(都是Boston Biochem)中每一种。
将来自每一个文库的第3轮和第4轮分选的96个克隆以96孔形式在1mL含有50μg/mL羧苄青霉素和1010个噬菌体/mL M13K07辅助噬菌体的2YT培养基中于37℃摇动培养过夜。使细胞成团粒，并在高通量噬菌体点ELISA中使用上清液以结合K11连接的二遍在蛋白、单遍在蛋白、线性二遍在蛋白、K48连接的多聚遍在蛋白2-7、K63连接的多聚遍在蛋白2-7、抗gD抗体(Genentech)、或未包被的孔。所有Fab噬菌体展示文库在轻链上含有羧基末端gD标签，这允许通过观察抗gD抗体的结合来评估展示水平。如上所述在384孔Maxisorb免疫板(NUNC)上固定化这组遍在蛋白蛋白质。将板于4℃用2μg/mL每一种遍在蛋白蛋白质在50mM碳酸钠缓冲液，pH 9.6中包被过夜。随后将经过包被的板用60μL/孔含2.5％牛乳的PBST于25℃摇动封闭1小时。1小时后，除去封闭缓冲液并添加20μL/孔PBST和10μL/孔噬菌体上清液。将板于25℃摇动温育1小时。将板用PBST清洗6次。使用30μL抗M13辣根过氧化物酶缀合的二抗(GE Healthcare)在PBST中的1∶5,000稀释液来检测噬菌体结合。清洗后，检测结合的二抗，即使用TMB底物(KPL)，接着是等体积1M磷酸的淬灭及450nm的分光光度法读数。
对一个未免疫抗肽Fab噬菌体展示文库针对上文所述纯化的K11连接的二遍在蛋白(UC Berkeley)如上所述进行4轮分选。使用的抗肽Fab噬菌体展示文库在所有三个重链CDR和轻链CDRL3中含有随机化氨基酸，而且基于经修饰的人源化抗体4D5框架、具有较长的CDRL1且容许CDRL2序列变异。4轮分选后没有观察到特异性抗K11连接的二遍在蛋白结合物的富集。
接着，对一个未免疫YSGX Fab噬菌体展示文库针对上文所述纯化的K11连接的二遍在蛋白(UC Berkeley)如上所述进行4轮分选。使用的YSGX Fab噬菌体展示文库在所有三个重链CDR和在轻链CDRL3中含有随机化氨基酸(参见美国已公布专利申请No.2005-0106667和Fellouse et al.2007J.Mol.Biol.373：924-40)，而且基于人源化抗体4D5。4轮分选后只观察到针对K11连接的二遍在蛋白的结合物适度的3倍富集。在这些结合物中，都显示出对K11连接的二遍在蛋白的结合的弱信号及另外的对其它遍在蛋白和多聚遍在蛋白形式的弱结合。
最后，对一个未免疫VH Fab噬菌体展示文库针对上文所述K11连接的二遍在蛋白进行4轮分选。该VH Fab噬菌体展示文库在所有三个重链CDR中含有随机化氨基酸(参见美国已公布专利申请No.US20050119455和Lee C.W.etal.2004JMB 340：1073-93)，而且基于人源化抗体4D5。4轮分选后观察到24倍富集。自此文库分选鉴定出强K11连接的二遍在蛋白特异性结合物。对来自第3轮和第4轮分选的VH文库克隆的重链测序。基于VH文库设计，HVRH1、HVR H2、和HVR H3序列预期是克隆特异性的，而重链框架序列和整个轻链序列(HVR和框架区)预期是不变的。HVR L1序列是RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：2)，CDR L2序列是SASFLYS(SEQ ID NO：3)，而HVR L3序列是QQSYTTPPT(SEQ ID NO：4)(图1A)。鉴定出6种独特重链序列(图1B)，并给予命名A3、A6、A9、B5、F5和G3。克隆G3是上文所述噬菌体点ELISA测定法中针对K11连接的二遍在蛋白的最强结合物和最特异性的；它显示出不结合单遍在蛋白、线性二遍在蛋白、K48连接的多聚遍在蛋白2-7、或K63连接的多聚遍在蛋白1-7(图2)。这6种Fab的重链HVR区的共有氨基酸序列是：HVR H1：X1 X2 X3 X4 Ile X5(SEQ ID NO：24)，其中X1选自丝氨酸和苏氨酸，X2选自天冬酰胺、天冬氨酸、丝氨酸和甘氨酸，X3选自酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸，X4选自色氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和酪氨酸，且X5选自丝氨酸和组氨酸；HVR H2：X6 X7 Ile X8 P X9 G X10 T X11(SEQ IDNO：25)，其中X6选自甘氨酸和丙氨酸，X7选自天冬氨酸、色氨酸、甘氨酸、谷氨酸和缬氨酸，X8选自丝氨酸、酪氨酸和天冬酰胺，X9选自天冬氨酸、丙氨酸、组氨酸和天冬酰胺，X10选自酪氨酸和丝氨酸，且X11选自酪氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺；和HVR H3：X12 X13 X14 X15 X16 X17 X18 X19X20 X21 D(SEQ ID NO：26)，其中X12选自精氨酸和赖氨酸，X13选自谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和脯氨酸，X14选自丝氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和色氨酸，X15选自色氨酸、甘氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，X16选自色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸，X17选自丝氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸，X18选自丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和甘氨酸、或不存在，X19选自色氨酸、甘氨酸、丙氨酸和酪氨酸、或不存在，X20为缬氨酸或不存在，且X21选自甲硫氨酸和苯丙氨酸。
A.G3 Fab的生成
在大肠杆菌碱性磷酸酶(PhoA)启动子的控制下表达来自VH Fab噬菌体展示文库的克隆。轻链和重链都含有氨基末端细菌stII信号序列以容许在大肠杆菌中分泌，而且自单一噬菌粒载体表达。重链羧基末端以符合读码框的方式融合至亮氨酸拉链，接着是M13噬菌体的基因产物III(gpIII)，容许在噬菌体上展示二价Fab-拉链片段。为了表达可溶性Fab，将一个终止密码子导入G3噬菌粒，在Fab CH1恒定域末端和亮氨酸拉链起点之间。使用
Figure BDA00002587640500561
Lightning定点诱变试剂盒(Stratagene)使用诱变寡核苷酸RF6471-1(TCTTGTGACAAAACTCACTAATAACGCATGAAACAGCTAGAGG)(SEQ ID NO：33)和RF6471-2(CCTCTAGCTGTTTCATGCGTTATTAGTGAGTTTTGTCACAAGA)(SEQ ID NO：34)来插入终止密码子。将所得可溶性G3 Fab表达质粒转化入大肠杆菌菌株62A7(Genentech)并在含有羧苄青霉素的固体琼脂上涂板。使用单个菌落接种25mL含有50μg/mL羧苄青霉素的2YT培养基。将培养物于37℃培养过夜并使用5mL接种500mL具有50μg/mL羧苄青霉素的完全C.R.A.P.培养基(3.57g(NH4)2SO4，0.71g柠檬酸钠2H2O，1.07g KCl，5.36g酵母提取物(经过证明的)，5.36g Hycase SF(Sheffield)，pH通过添加KOH调节至7.3而体积用超纯水调节至872mL，高压灭菌，冷却至55℃，对其添加(每L)110mL 1M MOPS pH 7.3，11mL 50％葡萄糖，和7mL 1M MgSO4)。将培养物于30℃摇动培养24小时。通过离心来收获细胞并将团粒保存于-20℃。纯化Fab，即在35mL含有10μg/mL DNA酶I(Invitrogen)、0.2mg/mL溶菌酶(USB)，和1mM苯甲基磺酰氟(Calbiochem)的冷清洗缓冲液(磷酸盐缓冲盐水(PBS)+150mM NaCl)中重悬浮细胞团粒。通过于25℃快速漩涡震荡45分钟使团粒重悬浮。通过离心使细胞碎片成团粒并在用冷清洗缓冲液预平衡的1mL蛋白A-sepharose(GE Healthcare)上加载裂解液。用50mL冷清洗缓冲液清洗柱，用3mL 0.1M乙酸洗脱，并用150μL 2M Tris，pH 11.0中和。使用Amicon Ultra-15离心滤器单元(10kDa截留，Millipore)浓缩Fab。以分光光度法(1 OD280＝1.5mg/mL)测定所得Fab浓度。
B.对G3 Fab的分析
通过表面等离振子共振(SPR)使用BIACORETM 3000(GE Healthcare)测定G3Fab的亲和力。使用制造商供应的胺偶联方案在CM5芯片的分开的流动室上固定化大约60个共振单位(RU)的K11连接的二遍在蛋白(Genentech)、K48连接的二遍在蛋白(Boston Biochem)、和K63连接的二遍在蛋白(Boston Biochem)。使用HBST作为运行缓冲液在每一个流动室上注射(总共60μL，流速30μL/min)G3 Fab在10mM Hepes，pH 7.2、150mMNaCl、和0.01％Tween 20(HBST)中的2倍连续稀释液(0.5-500nM)。记录每一个流动室的信号并减去来自未缀合且未封闭流动室的参照信号。8分钟的解离时段后，用20μL 10mM HCl再生芯片表面。将数据拟合具有移动基线的1：1结合模型。使用制造商提供的软件通过非线性回归分析同时计算动力学常数和结合常数，并显示于表2顶行。显示了G3 Fab的动力学常数(ka和kd)和结合常数(KD)来自3次测量的平均值和标准偏差。G3以结合常数105nM结合K11连接的二遍在蛋白。它没有展示出可检测的对K48连接的二遍在蛋白或K63连接的二遍在蛋白的结合。
Figure BDA00002587640500581
通过ELISA对纯化的G3 Fab测试对一组遍在蛋白蛋白质的结合。在96孔Maxisorb免疫板上固定化K11连接的二遍在蛋白(UC Berkeley)、单遍在蛋白(Boston Biochem)、线性二遍在蛋白(Boston Biochem)、K48连接的二遍在蛋白(Boston Biochem)、和K63连接的二遍在蛋白(Boston Biochem)。将板于25℃用5μg/mL每一种蛋白质在50mM碳酸钠缓冲液，pH 9.6中摇动包被2小时。将经过包被的板用200μL/孔含2.5％牛乳(milk)的PBST于25℃摇动封闭1小时。在含2.5％牛乳的PBST中生成G3Fab的12个2倍连续稀释液，从1.0μM到0.5nM。1小时后，除去封闭缓冲液并添加100μL/孔每一种G3 Fab稀释液并于25℃摇动温育1小时。然后使用洗板仪将板用PBST清洗12次。使用抗人卡帕轻链特异性HRP缀合的二抗(Sigma Aldrich)在PBST中的1∶5,000稀释液来检测Fab结合。添加100μL/孔二抗稀释液并将板于25℃摇动温育30分钟。使用洗板仪将板用PBST清洗12次并用PBS手工清洗2次。检测结合的二抗，即使用TMB底物(KPL)，接着是等体积1M磷酸的淬灭。于450nm读取吸光度。G3 Fab只对K11连接的二遍在蛋白显示出浓度依赖性结合，但是对单遍在蛋白、线性二遍在蛋白、K48连接的二遍在蛋白、或K63连接的二遍在蛋白没有(图3A)。如此，G3在ELISA形式中对K11连接的二遍在蛋白是高度特异性的。
在IC50竞争ELISA中进一步测试G3 Fab以获得亲和力的另一种估值。实施初始滴度ELISA以测定会实现信号OD450＝0.5的Fab浓度。在96孔Maxisorb免疫板上固定化K11连接的二遍在蛋白(Genentech)即于4℃以1μg/mL的浓度在50mM碳酸钠缓冲液，pH 9.6中包被过夜。将经过包被的板用200μL/孔含2.5％牛乳的PBST于25℃摇动封闭1小时。在含2.5％牛乳的PBST中生成G3Fab的12个2倍连续稀释液，从1μM到0.5nM。1小时后，除去封闭缓冲液并添加100μL/孔每一种G3Fab稀释液并于25℃摇动温育15分钟。然后使用洗板仪将板用PBST清洗6次。使用山羊抗人Fab片段特异性HRP缀合的二抗(Sigma Aldrich)在PBST中的1∶5,000稀释液来检测Fab结合。添加100μL/孔二抗稀释液并将板于25℃摇动温育30分钟。然后使用洗板仪将板用PBST清洗12次并用PBS手工清洗2次。检测结合的二抗，即使用TMB底物(KPL)，接着是等体积1M磷酸的淬灭。于450nm读取吸光度。OD450＝0.5时的Fab浓度为94nM。将可溶性K11连接的二遍在蛋白的2倍连续稀释液加94nM G3Fab在含2.5％牛乳的PBST中于25℃摇动温育1小时。然后测量在每一种K11连接的二遍在蛋白浓度未结合的Fab的量，即使用用1μg/mL K11连接的二遍在蛋白包被并用含2.5％牛乳的PBST封闭的96孔Maxisorb免疫板温育混合物。将Fab/K11混合物在板上于25℃摇动温育15分钟。然后使用洗板仪将板用PBST清洗6次。使用山羊抗人Fab片段特异性HRP缀合的二抗(SigmaAldrich)在PBST中的1∶5,000稀释液来检测Fab结合。添加100μL/孔二抗稀释液并将板于25℃摇动温育30分钟。然后使用洗板仪将板用PBST清洗12次并用PBS手工清洗2次。检测结合的二抗，即使用TMB底物(KPL)，接着是等体积1M磷酸的淬灭。于450nm读取吸光度。将吸光度对K11连接的二遍在蛋白浓度绘图并显示IC50为75nM(图3B)。这与上文通过SPR测定的105nMKD一致。
还在Western印迹中对G3 Fab测试其特异性结合K11连接的二遍在蛋白(UC Berkeley)、单遍在蛋白(Boston Biochem)、线性二遍在蛋白(BostonBiochem)、K48连接的二遍在蛋白(Boston Biochem)、和K63连接的二遍在蛋白(Boston Biochem)的能力。将1μg每一种蛋白质在含还原剂的1X LDS缓冲液(Invitrogen)中于70℃加热10分钟并在4-12％NuPAGE Bis Tris 1.0mm凝胶上在MES缓冲液(Invitrogen)中一式两份地运行。一块凝胶通过考马斯蓝来染色以检测所有蛋白质。另一块凝胶以恒定30V通过10％甲醇和1XNuPAGE转移缓冲液(Invitrogen)中的湿转移对0.2μm硝酸纤维素(Invitrogen)转移1小时。封闭膜上的非特异性结合位点，即在含5％牛乳的PBST中于25℃摇动温育1小时。然后将膜在含5μg/mL G3 Fab的含5％牛乳的PBST中于25℃摇动温育1.5小时。将膜在PBST中摇动清洗3次。检测G3 Fab，即将膜在山羊抗人Fab片段特异性HRP缀合的二抗(Sigma Aldrich)在含5％牛乳的PBST中的1∶10,000稀释液中于25℃摇动温育1小时。然后将膜在PBST中清洗3次，接着在PBS中清洗1次。检测二抗，即使用Super Signal West Pico化学发光底物(Pierce Biotechnology)，接着用印迹使胶片曝光。G3 Fab只检测K11连接的二遍在蛋白，而非单遍在蛋白、线性二遍在蛋白、K48连接的二遍在蛋白、或K63连接的二遍在蛋白(见图3C)。如此，它在Western印迹形式中对K11连接的二遍在蛋白也是高度特异性的。
实施例2：K11连接特异性Fab的亲和力成熟
A.G3噬菌粒到单价Fab展示的转化和终止模板的产生
为了亲和力成熟目的，将来自VH文库的G3噬菌粒克隆从二价Fab-拉链形式转化成单价Fab展示。使用Kunkel诱变(参见Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488(1985))消除CH1恒定域末端和gpIII之间的亮氨酸拉链。为了文库合成，将TAA终止密码子同时分开插入CDR L1、CDR L2、CDR L3或CDR H3，或CDR L3和H3中(分别产生L1、L2、L3、H3和L3/H3终止模板)。通过要求修复终止以获得全长Fab表达和噬菌体上的展示，终止密码子迫使促进特定CDR环内的多样性。分开将诱变寡核苷酸F220-delzip(TCTTGTGACAAAACTCACAGTGGCGGTGGCTCTGGT)(SEQ ID NO：35)与下文所列每一种终止密码子诱变寡核苷酸和1μgG3噬菌粒KunkelDNA组合。用于在轻链CDR L1内第24位(Kabat编号方式)插入TAA终止密码子的CDR L1终止诱变寡核苷酸是4D5LC1.stop(GTCACCATCACCTGCTA AGCCAGTCAGGATGTG)(SEQ ID NO：36)。用于在轻链CDR L2内第50位(Kabat编号方式)插入TAA终止密码子的CDRL2终止诱变寡核苷酸是4D5LC2.stop(GAAGCTTCTGATTTACTAAGCATCCTTCCTCTAC)(SEO ID NO：37)。用于在轻链CDR L3内第89位(Kabat编号方式)插入TAA终止密码子的CDRL3终止诱变寡核苷酸是4D5LC3.stop(GCAACTTATTACTGTTAACAATCTTATACTACTC)(SEQ ID NO：38)。用于在重链CDR H3内第98位(Kabat编号方式)插入TAA终止密码子的CDR H3终止诱变寡核苷酸是VH5CDRH3：413Vh5SRo6(GAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGTGAGGCCTCGTAACTGCCCCCCTACGTTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACACTAGTC)(SEQ IDNO：39)。使用所得单价Fab噬菌粒终止模板来产生亲和力成熟文库。
B.亲和力成熟文库的产生
采取两种亲和力成熟办法。在第一种办法中，生成只在轻链内含有氨基酸多样性的文库。这些“轻链”文库容许软随机化每一个轻链CDR位置，如下所述。在第二种办法中，生成在重链和轻链CDR二者中以各种组合含有氨基酸多样性的文库。这些“重链”文库含有在天然存在人抗体内找到的氨基酸多样性或主要是表面暴露残基的软随机化，如下所述。
所有文库是通过Kunkel诱变(参见Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488(1985))生成的。在软随机化(soft randomization)的情况中，合成简并寡核苷酸，使得野生型残基会保留50％的机会而50％的机会编码其余19种氨基酸之一。为了实现软随机化，设计寡核苷酸，使得某些核苷酸位置70％的机会被所示碱基占据且10％的机会被其它3种碱基之一占据(Gallop et al.，J.Med.Chem.37：1233(1994))。对于那些在特定碱基处包括此类软随机化的寡核苷酸，软随机化的百分比以该碱基位置处存在的数字来表示。数字“5”表示碱基腺嘌呤在该位置存在70％的机会，而碱基鸟嘌呤、胞嘧啶、和胸腺嘧啶每一种存在10％的机会。类似地，数字“6”指鸟嘌呤，“7”指胞嘧啶，而“8”指胸腺嘧啶，其中在每一种情况中，其它3种碱基每一种只存在10％的机会。在硬随机化(hard randomization)的情况中，合成简并寡核苷酸，使得会容许在天然人抗体内的某些位置处找到的氨基酸多样性。在这种情况中，使用简并密码子，其中字母“R”编码鸟嘌呤或腺嘌呤，“Y”编码胸腺嘧啶或胞嘧啶，“M”编码腺嘌呤或胞嘧啶，“K”编码鸟嘌呤或胸腺嘧啶，“S”编码鸟嘌呤或胞嘧啶，“W”编码腺嘌呤或胸腺嘧啶，“H”编码腺嘌呤、胞嘧啶、或胸腺嘧啶，“B”编码鸟嘌呤、胸腺嘧啶、或胞嘧啶，“V”编码鸟嘌呤、胞嘧啶、或腺嘌呤，“D”编码鸟嘌呤、腺嘌呤、或胸腺嘧啶，而“N”编码鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶、或胸腺嘧啶。
生成了4个“轻链”文库并称作L1、L2、L3、和L1/L2/L3。L1文库软随机化轻链位置24-34(Kabat编号方式)。通过Kunkel诱变使用诱变寡核苷酸L1(GATAGGGTCACCATCACCTGC768676567756658686567577676686676TGGTATCAACAGAAACCAGGA)(SEQ ID NO：40)和20μgL1终止模板的Kunkel DNA(实施例2A中所述)来生成文库。L2文库软随机化轻链位置50-56(Kabat编号方式)。通过Kunkel诱变使用诱变寡核苷酸L2(AAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTAC567676567887786857567GGAGTCCCTTCTCGCTTCTCT)(SEQ ID NO：41)和20μgL2终止模板的Kunkel DNA(实施例2A中所述)来生成文库。L3文库软随机化轻链位置89-97(Kabat编号方式)。通过Kunkel诱变使用诱变寡核苷酸L3(GACTTCGCAACTTATTACTGT756756567857577577776776577TTCGGACAGGGTACCAAGGTG)(SEQ ID NO：42)和20μg L3终止模板的Kunkel DNA(实施例2A中描述的)来生成文库。L1/L2/L3文库软随机化轻链位置24-34、50-56、和89-97(Kabat编号方式)。通过Kunkel诱变使用上文所述诱变寡核苷酸L1(SEQ ID NO：40)、L2(SEQ ID NO：41)、和L3(SEQ ID NO：42)和20μgL3终止模板的Kunkel DNA(实施例2A中所述)来生成文库。
还生成了6个“重链”文库并称作L1/L2/L3hard、L3/H1/H2、L3/H3、L1/H3、H2/H3、和H3。L1/L2/L3hard文库硬随机化轻链位置28-33、50、53、55、91-94、和96(Kabat编号方式)以容许在天然人抗体内的这些位置处找到的氨基酸多样性。L1诱变寡核苷酸F111-L1(ACCTGCCGTGCCAGTCAGRDTRKTRVWANWTHTGTAGCCTGGTATCAAC AGAAAC)(SEQ ID NO：43)和F202-L1(ACCTGCCGTGCCAGTCAGRDTRKTRVWANWTHTCTGGCCTGGTATCAACAGAAAC)(SEQ ID NO：44)以1∶2的比例混合，L2诱变寡核苷酸F201-L2(CCGAAGCTTCTGATTTACKBGGCATCCAVCCTCTACTCTGGAGTCCCT)(SEQ ID NO：45)和F203-L2(CCGAAGCTTCTGATTTACKBGGCATCCAVCCTCGMATCTGGAGTCCCTTCTCGC)(SEQ ID NO：46)以1∶1的比例混合，而L3诱变寡核苷酸F133a(GCAACTTATTACTGTCAGCAATMTDMCRVTNHTCCTYKGACGTTCGGACAGGGTACC)(SEQ ID NO：47)、F133b(GCAACTTATTACTGTCAGCAATMTDMCRVTNHTCCTTWTACGTTCGGACAGGGTACC)(SEQID NO：48)、F133c(GCAACTTATTACTGTCAGCAASRTDMCRVTNHTCCTYKGACGTTCGGACAG GGTACC)(SEQ ID NO：49)、F133d(GCAACTTATTACTGTCAGCAASRTDMCRVTNHTCCTTWTACGTTCGGACAGGGTACC)(SEQ ID NO：50)以1∶1∶1∶1的比例混合。通过Kunkel诱变使用等量的每一种这些混合物和20μg L3终止模板的Kunkel DNA(实施例2A中描述的)来生成文库。
L3/H1/H2文库软随机化轻链位置91-94、96(Kabat编号方式)和重链位置30-32、50、52(而非52a)、53、和54(Kabat编号方式)。L3诱变寡核苷酸F563-L3soft1(ACTTATTACTGTCAGCAA878857577577CCT777ACGTTCGGACAGGGTACC)(SEQ ID NO：51)、F564-L3soft2(ACTTATTACTGTCAGCAA878857577577CCTTWTACGTTCGGACAGGGTACC)(SEQ ID NO：52)、和F565-L3soft3(ACTTATTACTGTCAGCAA878857577577CCTYKGACGTTCGGACAGGGTACC)(SEQ ID NO：53)以1∶0.5∶1的比例混合。通过Kunkel诱变使用等量的L3寡聚物混合物和诱变寡核苷酸G3CDRH1soft(GCAGCTTCTGGCTTCACCTTC878558878TATATTAGCTGGGTGCGTCAG)(SEQ ID NO：54)和G3CDRH2soft(GGCCTGGAATGGGTTGCT668ATT558CCT558668GGTTATACTTACTATGCCG)(SEQ ID NO：55)和20μg L3终止模板的Kunkel DNA(实施例2A中描述的)来生成文库。
L3/H3文库软随机化轻链位置91-94、96(Kabat编号方式)和重链位置98-100和100b(Kabat编号方式)。上文所述L3诱变寡核苷酸F563-L3soft1(SEQ ID NO：51)、F564-L3soft2(SEQ ID NO：52)、和F565-L3soft3(SEQID NO：53)以1∶0.5∶1的比例混合。通过Kunkel诱变使用等量的L3寡聚物混合物和诱变寡核苷酸G3CDRH3soft(GTCTATTATTGTGCTCGTGAGTGGTAC888668668TAC688ATGGACTACTGGGGTCAAGGAACC)(SEQ ID NO：56)和20μg L3/H3终止模板的Kunkel DNA(实施例2A中描述的)来生成文库。
L1/H3文库硬随机化轻链位置28-33(Kabat编号方式)(以容许在天然人抗体内的这些位置处找到的氨基酸多样性)及软随机化重链位置98-100和100b(Kabat编号方式)。L1诱变寡核苷酸F111-L1(SEQ ID NO：43)和F202-L1(SEQ ID NO：44)以1∶2的比例混合。通过Kunkel诱变使用等量的L1寡聚物混合物和诱变寡核苷酸G3CDRH3soft(SEQ ID NO：56)和20μg L1终止模板的Kunkel DNA(实施例2A中描述的)来生成文库。
H2/H3文库软随机化重链位置50、52(而非52a)、53、54、98-100、和100b(Kabat编号方式)。通过Kunkel诱变使用等量的诱变寡核苷酸G3CDRH2soft和G3CDRH3soft(SEQ ID NO：55和56)和20μg H3终止模板的Kunkel DNA(实施例2A中描述的)来生成文库。
H3文库软随机化重链位置98-100和100b(Kabat编号方式)。通过Kunkel诱变使用诱变寡核苷酸G3CDRH3soft(SEQ ID NO：56)和20μg H3终止模板的Kunkel DNA(实施例2A中描述的)来生成文库。
将诱变反应电穿孔入电感受态XL1-Blue(Stratagene)大肠杆菌并在25mL SOC培养基中于37℃摇动回收45分钟。取出20μL并将10倍连续稀释液涂布到含有羧苄青霉素的固体琼脂板上并于37℃培养过夜以测定库容量。将剩余培养物转移至500mL含有50μg/mL羧苄青霉素和1010个噬菌体/mLM13K07辅助噬菌体的2YT肉汤。将细胞于37℃摇动感染1小时。添加50μg/mL卡那霉素并将培养物于37℃再摇动培养7小时。然后将温度变成30℃并将培养物再培养22小时。每一个文库含有至少～3.5x1010个集落形成单位(CFU)。通过2轮1/5体积20％聚乙二醇(PEG)/2.5M NaCl沉淀，自培养物上清液纯化噬菌体。
C.亲和力成熟文库分选
“轻链”文库经历4轮分选。4个文库每一个分开地使用下述方案平行进行所有4轮分选。第1轮是基于板的分选，其中K11连接的二遍在蛋白在96孔Maxisorb免疫板(NUNC)上固定化。将板于4℃用5μg/mL K11连接的二遍在蛋白(UC Berkeley)在50mM碳酸钠缓冲液，pH 9.6中包被过夜。将经过包被的板用200μL/孔含2.5％牛乳的含有0.05％Tween 20的PBS(PBST)于25℃摇动封闭1小时。将噬菌体文库在含2.5％牛乳的PBST中稀释至OD＝2.0并添加30μg/mL单遍在蛋白进行反选择。1小时后，除去封闭缓冲液并添加100μL/孔噬菌体并于25℃摇动温育2小时。结合后，将板用PBST清洗20次，即在各清洗间手工注满孔并倒出缓冲液。用150μL/孔50mM HCl/500mMKCl于25℃摇动洗脱噬菌体30分钟。用150μL/孔1M Tris，pH 7.5中和洗脱液并随后在XL1-Blue(Stratagene)大肠杆菌中添加M13K07辅助噬菌体来繁殖。
使用扩增的噬菌体以基于溶液的分选进行另外几轮针对K11连接的二遍在蛋白的选择。将K11连接的二遍在蛋白(UC Berkeley)用3倍摩尔过量的EZ-Link Sulfo-NHS-生物素(Pierce Biotechnology)生物素化。在第2次分选中，在96孔Maxisorb免疫板(NUNC)上固定化中性亲合素(PierceBiotechnology)。将板于4℃用5μg/mL中性亲合素在50mM碳酸钠缓冲液，pH 9.6中包被过夜。将经过包被的板用200μL/孔含2.5％牛乳的PBST于25℃摇动封闭1小时。将来自第1轮分选的噬菌体在含有250nM生物素化K11连接的二遍在蛋白(UC Berkeley)和10μg/mL单遍在蛋白、线性二遍在蛋白、K48多聚遍在蛋白2-7、和K63多聚遍在蛋白2-7(都来自Boston Biochem)每一种的含2.5％牛乳的PBST中稀释至OD＝1.0以进行反选择。容许噬菌体于25℃摇动结合生物素化K11连接的二遍在蛋白2小时。结合后，将噬菌体在含2.5％牛乳的PBST中稀释5倍并在中性亲合素板上于25℃摇动捕捉结合至生物素化K11连接的二遍在蛋白的噬菌体10分钟。捕捉后，将板用PBST清洗30次，即在各清洗间手工注满孔并除去缓冲液。用100μL/孔50mM HCl/500mMKCl于25℃摇动洗脱噬菌体30分钟。用100μL/孔1M Tris，pH 7.5中和洗脱液并随后在XL1-Blue(Stratagene)大肠杆菌中添加M13K07辅助噬菌体来繁殖。
以三种方式提高后几次分选的严格性：降低分选中使用的生物素化K11连接的二遍在蛋白的量；提高洗板的次数和持续时间；和降低噬菌体结合的持续时间。与上文所述第2轮同样地实施第3轮分选，只是洗板的次数提高至40。与第3次分选同样地实施第4次分选，只是生物素化K11连接的二遍在蛋白的量降低至100nM，结合时间降低至1小时，且再添加4次洗板。这些清洗每一次于25℃摇动温育15分钟。为每一轮计算富集，即将用K11连接的二遍在蛋白回收的噬菌体数目与未包被孔(对于板分选)或中性亲合素包被的孔(对于溶液分选)比较。在所有4轮中对所有4个文库都观察到富集(见表3)。
4轮分选后，自4个文库每一个挑取48个克隆(总共192个)并以96孔形式在1mL含有50μg/mL羧苄青霉素和1010个噬菌体/mL M13K07辅助噬菌体的2YT肉汤中培养。在高通量噬菌体点ELISA中使用来自那些培养物的上清液以结合K11连接的二遍在蛋白(UC Berkeley)、单遍在蛋白(BostonBiochem)、线性二遍在蛋白(Boston Biochem)、K48连接的多聚遍在蛋白2-7(Boston Biochem)、K63连接的多聚遍在蛋白2-7(Boston Biochem)、抗gD抗体(Genentech)、或未包被的孔(如实施例1中描述的)。鉴定出对K11连接的二遍在蛋白展现特异性结合的32个克隆。
表3：亲和力成熟期间K11连接的多聚遍在蛋白结合物的富集
Figure BDA00002587640500661
Figure BDA00002587640500671
“重链”文库经历4轮分选。4个文库每一个平行进行第1轮分选，然后合并进行第2-4轮分选。在第1轮中使用基于板的分选，正如上文关于“轻链”文库所述。在后几轮分选中使用扩增的噬菌体。以四种方式提高后几次分选的严格性：降低分选中使用的生物素化K11连接的二遍在蛋白的量；提高洗板的次数和持续时间；降低噬菌体结合的持续时间；和在用中性亲合素捕捉之前添加过量的未生物素化K11连接的二遍在蛋白以竞争噬菌体结合。第2次分选是基于溶液的，而且如上文关于“轻链”文库所述实施，只是使用100nM生物素化K11连接的二遍在蛋白且一起合并和分选来自所有6个文库的噬菌体。第3次分选如关于“轻链”文库所述实施，只是使用10nM生物素化K11连接的二遍在蛋白且结合时间降低至1小时。第4次分选如上文关于“轻链”文库所述实施，只是用5nM、1nM、和0.5nM生物素化K11连接的二遍在蛋白进行3个平行分选。另外，在1小时噬菌体结合之后且在用中性亲合素捕捉之前，添加30μg/mL未生物素化K11连接的二遍在蛋白(UC Berkeley)并容许于25℃旋转竞争噬菌体结合30分钟以选择具有较慢解离速率的克隆。如上所述为每一轮计算富集。在所有4轮中都观察到富集(见表3)。
4轮分选后，挑取192个克隆并以96孔形式在1mL含有50μg/mL羧苄青霉素和1010个噬菌体/mL M13K07辅助噬菌体的2YT肉汤中培养。在高通量噬菌体点ELISA中使用来自那些培养物的上清液以结合K11连接的二遍在蛋白、单遍在蛋白、线性二遍在蛋白、K48连接的多聚遍在蛋白2-7、K63连接的多聚遍在蛋白2-7、抗gD抗体、或未包被的孔(如实施例1中描述的)。鉴定出对K11连接的二遍在蛋白展现特异性结合的23个克隆。实施单点竞争噬菌体ELISA以确定哪些克隆相对于亲本G3克隆具有最大亲和力改善。使用来自噬菌体点ELISA的噬菌体上清液(实施例2C)。如关于IC50 ELISA(实施例1B)所述实施竞争ELISA，只是使用噬菌体上清液代替纯化的Fab且仅使用单个浓度的(50nM)可溶性K11连接的二遍在蛋白(Genentech)。还在不添加任何可溶性K11连接的二遍在蛋白的情况中对每一个克隆实施竞争以测定任何竞争性抗原缺失下的噬菌体结合信号。计算在50nM K11连接的二遍在蛋白存在下的百分比结合抑制，即[1-(50nM K11的OD450/无K11的OD450)]x100％。G3亲本克隆在50nM K11连接的二遍在蛋白存在下显示平均33％的结合抑制(见表4)。选择显示60％抑制或更大的克隆进行进一步分析。
表4：亲和力成熟和亲本抗K11连接的多聚遍在蛋白Fab的IC50值
Figure BDA00002587640500681
Figure BDA00002587640500691
*以″G3L1″、″G3L2″、″G3L3″、或″G3L1L2L3″开始的克隆名称标示衍生它们的″轻链″CDR亲和力成熟文库。以″G3HC″开始的克隆名称标示它们来自合并″重链″亲和力成熟文库。
D.亲和力成熟克隆的测序
对单一点竞争噬菌体ELISA(实施例2C)中鉴定的最高亲和力克隆的轻和重链二者测序。鉴定了总共8个独特亲和力成熟的克隆(见图4A和4B)以及几个相同的同胞(见表4)。克隆G3L1.1A11、G3L1.1C12、G3HC.2A3、和G3HC.2G4只在CDR L1内含有突变。克隆G3HC.2A6和G3HC.2D7在CDR H3内含有突变。G3L2.1F12在CDR L2内含有突变，包括琥珀终止密码子，其在琥珀校正菌株诸如此噬菌体分选中使用的XL1-Blue大肠杆菌中表达时可以用谷氨酰胺替代。克隆G3HC.2E6只在CDR H2内含有突变。
在上述克隆中展示可变性的轻链HVR区的共有氨基酸序列是：HVR L1：X22 X23 Ser X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30 X31(SEQ ID NO：73)，其中X22选自精氨酸和甘氨酸，X23选自丙氨酸和缬氨酸，X24选自谷氨酰胺和组氨酸，X25选自天冬氨酸、天冬酰胺和异亮氨酸，X26选自亮氨酸和缬氨酸，X27选自丝氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和谷氨酸，X28选自苏氨酸和丝氨酸，X29选自丙氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，X30选自缬氨酸和异亮氨酸，且X31选自丙氨酸和丝氨酸；和HVR L2：X32 X33 X34 Phe X35 Tyr Ser(SEQ IDNO：74)，其中X32选自丝氨酸和天冬酰胺，X33选自谷氨酰胺和丙氨酸，X34选自谷氨酸和丝氨酸，且X35选自亮氨酸和缬氨酸。
在上述克隆中展示可变性的重链HVR区的共有氨基酸序列是：HVR H2：X36 Ile Asn Pro X37 Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly(SEQ IDNO：75)，其中X36选自丙氨酸和甘氨酸且X37选自丙氨酸和天冬酰胺；和HVR H3：Glu Trp Tyr X38 X39 Gly Tyr Val Met Asp Tyr(SEQ ID NO：76)，其中X38选自苯丙氨酸和酪氨酸且X39选自甘氨酸和天冬氨酸。
E.噬菌体特异性ELISA
通过噬菌体ELISA来评估8个亲和力成熟克隆对不同连接的多聚遍在蛋白的特异性。如实施例1中上述实施噬菌体ELISA，只是使用纯化的噬菌体的6个5倍连续稀释液(始于OD268＝1.0)来代替噬菌体上清液。所有亲和力成熟克隆以噬菌体浓度依赖性方式结合K11连接的二遍在蛋白(图5)。在测试的最高噬菌体浓度只看到很弱的对K48连接的多聚遍在蛋白的结合。
F.Fab生成、亲和力分析、和杂合体产生
将G3亲本和8种亲和力成熟的Fab可变域克隆入轻链恒定域上缺少gD标签的Fab表达质粒。另外，将克隆G3L2.1F12的CDR L2内的琥珀终止子(TAG)突变成CAG以编码谷氨酰胺。使用
Figure BDA00002587640500701
Lightning定点诱变试剂盒(Stratagene)使用诱变寡核苷酸5’-G3LC1F12stopQ(CCGAAGCTTCTGATTTACAACCAGGAA TTCGTGTACAGCGGAGTC)(SEQ ID NO：77)和3’-G2LCF12stopQ(GACTCCGCTGTACACGAATTCCTGGTTGTAAATCAGAAGCTTCGG)(SEQ ID NO：78)来用CAG密码子替换TAG密码子。将所得质粒转化入大肠杆菌菌株64B4(Genentech)，作为可溶性Fab表达，并使用蛋白A-Sepharose纯化，如实施例1中描述的。在SPR实验中使用纯化的Fab以测定它们的亲和力，如实施例1中描述的，使用相同的芯片。所有8种克隆显示出相对于亲本分子改良的对K11连接的二遍在蛋白的解离常数(KD)，而且没有显示出对K48连接的或K63连接的二遍在蛋白任一的可检测结合(见表2)。
轻链中有突变的最高亲和力克隆是G3L1.1C12和G3HC.2A3，解离常数分别为35nM和25nM。二者都只含有CDR L1变化(见图4A和4B)，而且观察到结合速率(ka)和解离速率(kd)二者相对于亲本G3克隆的改善(见表2)。重链中有突变的最高亲和力克隆是G3HC.2E6，解离常数为47nM。此克隆只含有CDR H2变化，而且只观察到解离速率改善。
由于实施例2B中描述的亲和力成熟文库设计，没有会容许CDR L1和CDR H2变化二者的CDR突变体组合。因此，产生了杂合Fab噬菌粒，其中使用标准限制性消化物克隆方法组合G3L1.1C12的轻链和G3HC.2E6的重链(产生克隆1C12/2E6)或组合G3HC.2A3的轻链和G3HC.2E6的重链(产生克隆2A3/2E6)(见图6A和6B)。这些杂合体(hybrid)也作为可溶性Fab表达，纯化，并通过SPR来分析，如实施例1C和1D中描述的。重和轻链的这些组合导致叠加的亲和力改善(additive affinity improvement)(见表2)。1C12/2E6和2A3/2E6都具有12nM的对K11连接的二遍在蛋白的解离常数，对应于与G3亲本Fab相比几乎9倍的亲和力改善，这是由于两种杂合体的结合和解离速率二者的改善。另外，1C12/2E6和2A3/2E6无一表现出对K48连接的或K63连接的二遍在蛋白任一的可检测结合。
G.IgG形式的转化和亲和力分析
在293细胞中作为人免疫球蛋白(IgG)表达亲本Fab(G3)和2种亲和力成熟杂合Fab(1C12/2E6和2A3/2E6)。通过将Fab可变域克隆入编码人卡帕IgG1重和轻链的pRK哺乳动物表达构建物来生成表达构建物(Gorman et al.，DNA Prot.Eng.Tech.2：3-10(1990))。通过标准方法学在蛋白A-sepharose柱上通过亲和层析来纯化IgG(如实施例1中关于Fab纯化所述)并使用PD10脱盐柱(GE Healthcare)交换缓冲液入PBS。
首先使用CM5芯片上直接的抗原的胺偶联通过SPR测定杂合Fab的亲和力(实施例2F)。这涉及抗原上可用赖氨酸侧链的伯胺。将两个遍在蛋白单体连接到一起以形成二遍在蛋白的异肽键的赖氨酸不会用于偶联。由于K11、K48、和K63连接的二遍在蛋白具有不同赖氨酸残基参与异肽键，因此可用于偶联至芯片的赖氨酸也是不同的，因此不同表位相应地可用于或不可用于抗体结合。
为了避免潜在混淆偶联至芯片的赖氨酸的影响，在BIACORETM 3000(GE Healthcare)上使用IgG捕捉方法在SPR中测试这个实施例中生成的IgG的亲和力。使用制造商供应的胺偶联方案在CM5芯片的流动室1和2上固定大约11,500个共振单位(RU)的抗人Fc捕捉抗体(GE Healthcare)。以30μL/min的流速在流动室2上注射60μL含0.5μg/mL IgG的10mM Hepes，pH 7.2、150mM NaCl、和0.01％Tween 20(HBST)，导致捕捉大约800RU的IgG。流动室1在它上面只有捕捉抗体以充当减法参照。在流动室1和2上注射(总共60μL，流速30μL/min)K11连接的二遍在蛋白(Genentech)、K48连接的二遍在蛋白(Boston Biochem)、或K63连接的二遍在蛋白(Boston Biochem)在HBST中的2倍连续稀释液(0.5-500nM)。记录每一个流动室的信号并减去参照信号。4分钟的解离时段后，用15μL 3M MgCl2再生芯片表面。将数据拟合具有质量转移的1:1结合模型(对于G3 IgG)或具有移动基线的1:1结合模型(对于1C12/2E6和2A3/2E6 IgG)。使用制造商提供的软件，通过非线性回归分析同时计算动力学常数和结合常数，并显示于表5。
G3 IgG具有129 nM的结合K11二遍在蛋白的KD，而1C12/2E6和2A3/2E6IgG都以20 nM的KD结合。这些亲和力是一致的且在可接受的、使用直接抗原偶联方法为同一Fab测量的结合常数的2倍误差范围内(见表2)。另外，没有观察到可检测的对K48连接的二遍在蛋白或K63连接的二遍在蛋白的结合。
表5：杂合IgG对不同赖氨酸连接的多聚遍在蛋白分子的SPR结合
Figure BDA00002587640500721
NDB＝未观察到可检测的结合
实施例3：亲和力成熟的杂合抗K11抗体的表征
A.IgG特异性ELISA
通过ELISA测试G3亲本、1C12/2E6、和2A3/2E6 IgG关于对一组遍在蛋白蛋白质的结合的特异性。在96孔Maxisorb免疫板上固定K11连接的二遍在蛋白(Genentech)、单遍在蛋白、线性二遍在蛋白、K48连接的二遍在蛋白、K63连接的二遍在蛋白、K48连接的多聚遍在蛋白、K63连接的多聚遍在蛋白(都来自Boston Biochem)。将板用1μg/mL每一种蛋白质在50mM碳酸钠缓冲液，pH 9.6中于25℃摇动包被2小时。将经过包被的板用200μL/孔含2.5％牛乳的PBST于25℃摇动封闭1小时。在含2.5％牛乳的PBST中生成G3亲本、1C12/2E6、和2A3/2E6IgG的11个2倍连续稀释液，从20μg/mL到0.02μg/mL。1小时后，除去封闭缓冲液并添加100μL/孔每一种IgG稀释液并于25℃摇动温育1小时。然后使用洗板仪将板用PBST清洗6次。使用山羊抗人Fcγ特异性HRP缀合F(ab’)2二抗(Jackson Immunoresearch)在PBST中的1∶5,000稀释液来检测IgG结合。添加100μL/孔二抗稀释液并将板于25℃摇动温育30分钟。然后使用洗板仪将板用PBST清洗12次并用PBS手工清洗2次。检测结合的二抗，即使用TMB底物(KPL)，接着是等体积1M磷酸的淬灭。于450nm读取吸光度。三种IgG都识别K11连接的二遍在蛋白，甚至在很低的IgG浓度。对G3、1C12/2E6、和2A3/2E6在每一个IgG浓度观察到大致相同的K11连接的二遍在蛋白结合信号，尽管事实是它们之间的亲和力有7-9倍的差异。如此，ELISA形式不能区分亲本IgG和亲和力成熟变体的亲和力。另外，在低IgG浓度，三种IgG都是高度特异性的，然而，在朝着20μg/mL提高IgG浓度时，在这种测定法形式中对1C12/2E6和2A3/2E6都能看到一些有限的对K48连接的多聚遍在蛋白、K63连接的二遍在蛋白、和K63连接的多聚遍在蛋白的非特异性结合。
为了鉴定会允许在这种测定法形式中区分不同IgG的亲和力及提供对K11连接的二遍在蛋白的更特异性识别的更严格条件，在含有4M脲的缓冲液(4M脲，20mM Tris，pH 7.5，135mM NaCl，1％Triton X-100，10％甘油，1mM EDTA，1.5mM MgCl2)中再次实施ELISA。在这些严格条件下，对G3亲本IgG观察到很小的对K11连接的二遍在蛋白的结合，测试的最高IgG浓度(20μg/mL)除外(图7A)。相反，对于亲和力成熟变体1C12/2E6和2A3/2E6，在所有浓度都看到强结合，包括最低的IgG浓度0.02μg/mL。另外，4M脲缓冲液的使用容许维持对K11连接的二遍在蛋白的高度特异性。只有1C12/2E6在测试的最高IgG浓度显示出很弱的对K48连接的多聚遍在蛋白的结合。2A3/2E6显示出不结合除K11连接的二遍在蛋白以外的任何遍在蛋白形式，甚至在测试的最高IgG浓度(20μg/mL)也不结合。因此，在这些严格条件下，亲和力的升高转化成抗体在ELISA中的功能的升高。
B.IgG Western印迹分析
首先对G3亲本、1C12/2E6、和2A3/2E6 IgG测试它们在Western印迹中检测纯二遍在蛋白链的能力。将K11连接的二遍在蛋白(Genentech)的7个2倍连续稀释液(从1μg到15ng)和1μg单遍在蛋白、线性二遍在蛋白、K48连接的二遍在蛋白、和K63连接的二遍在蛋白(都来自Boston Biochem)每一种在1X LDS缓冲液(Invitrogen)中于70℃加热10分钟并在4-12％Bis TrisNuPAGE 1.0mm凝胶(Invitrogen)上在还原性条件下在MES缓冲液(Invitrogen)中一式四份地运行。一块凝胶通过考马斯来染色以检测所有蛋白质。另三块凝胶以恒定30V通过10％甲醇和1X NuPAGE转移缓冲液(Invitrogen)中的湿转移对0.2μm硝酸纤维素(Invitrogen)转移1小时。封闭膜上的非特异性结合位点，即在含5％牛乳的PBST中于25℃摇动温育1小时。然后将膜在含1μg/mL G3、1C12/2E6、或2A3/2E6IgG的含5％牛乳的PBST中于25℃摇动温育1小时。将膜在PBST中摇动清洗3次。检测IgG，即将膜在山羊抗人Fcγ特异性HRP缀合的F(ab’)2二抗(Jackson Immunoresearch)在含5％牛乳的PBST中的1∶10,000稀释液中于25℃摇动温育1小时。然后将膜在PBST中清洗3次，接着在PBS中清洗1次。检测二抗，即使用Super Signal WestPico化学发光底物(Pierce Biotechnology)，接着用印迹使胶片曝光。
3种IgG都只检测K11连接的二遍在蛋白但不检测单遍在蛋白、线性二遍在蛋白、K48连接的二遍在蛋白、或K63连接的二遍在蛋白，指示它们在Western印迹背景中是对K11连接的二遍在蛋白高度特异性的(见图7B)。另外，亲和力成熟变体比G3亲本IgG灵敏得多，即它们能够检测少至15ng的K11连接的二遍在蛋白，而G3IgG检测极限在此特定印迹曝光中为125ng。因此，所述杂合体相对于亲本抗体的大约7-9倍亲和力改善转化成在Western印迹中识别K11连接的二遍在蛋白的功能改善。尽管对期望抗原的亲和力升高，但是特异性得到维持且1C12/2E6或2A3/2E6 IgG任一对测试的任何其它遍在蛋白形式没有可检测结合。由于1C12/2E6和2A3/2E6亲和力成熟变体在上文所述对二遍在蛋白的SPR分析、特异性IgG ELISA和Western印迹中表现相同，因此在进一步的测试中只使用2A3/2E6。
针对K11连接的二遍在蛋白抗原生成了K11连接特异性抗体，所以它们假定识别连接自身或更有可能供体和受体遍在蛋白上因源自K11连接的二遍在蛋白构象而位置密切接近的周围表面残基。由于二遍在蛋白是抗原的最小识别单位且K11连接的多聚遍在蛋白是二遍在蛋白作为重复“单体”单元的聚合物链，因此该抗体还应结合通过K11连接来连接的更长多聚遍在蛋白链。为了检查这一点，对2A3/2E6IgG测试它在Western印迹中检测纯多聚遍在蛋白链的能力。将1μg单遍在蛋白(Boston Biochem)、K48连接的多聚遍在蛋白2-7(Boston Biochem)、K63连接的多聚遍在蛋白2-7(Boston Biochem)、和K11连接的多聚遍在蛋白(Genentech)每一种在含还原剂的1X LDS缓冲液(Invitrogen)中于70℃加热10分钟并在4-12％Bis Tris NuPAGE 1.0mm凝胶(Invitrogen)上在还原性条件下在MES缓冲液(Invitrogen)中一式三份地运行。一块凝胶通过SimplyBlue考马斯染料(Invitrogen)来染色以检测所有蛋白质。其余如上所述实施Western印迹，只是转移至0.45μm硝酸纤维素(Invitrogen)以30V实施2小时。虽然对照泛遍在蛋白抗体P4D1识别单遍在蛋白、K48连接的多聚遍在蛋白2-7、K63连接的多聚遍在蛋白2-7、和K11连接的多聚遍在蛋白，但是2A3/2E6IgG只识别K11连接的多聚遍在蛋白(见图7C)。如此，正如对K11连接的二遍在蛋白，2A3/2E6抗体能检测含有K11连接的多聚遍在蛋白链，但是不识别其它连接的多聚遍在蛋白链。
由于2A3/2E6抗体能特异性结合纯K11连接的多聚遍在蛋白链，因此接下来对2A3/2E6 IgG测试它检测来自哺乳动物和酵母全细胞裂解物二者的K11连接的多聚遍在蛋白链的能力。在补充有10％胎牛血清(FBS)和2mM L-谷氨酰胺的高葡萄糖Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM)中培养293T细胞。自板刮取细胞，以2000rpm于4℃离心10分钟，用20mL冷PBS清洗，并成团粒。将细胞在含有8M脲、50mM Tris，pH 7.5、和25mM NaCl的缓冲液、10μL/mL 100X Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Pierce Biotechnology)、5mMEDTA(Pierce Biotechnology)、和2mMN-乙基马来酰亚胺(NEM，PierceBiotechnology)中裂解，然后简短超声处理以降低浓度。将裂解物在免疫沉淀(IP)缓冲液(20mM Tris，pH 7.5，135mM NaCl，1％Triton X-100，10％glycerol，1mM EDTA，1.5mM MgCl2)中稀释2倍至4M脲。将酿酒酵母菌株YRG-2(Stratagene)在YEPD培养基中于30℃培养过夜。将18mL细胞以3000rpm离心5分钟，在水中清洗，并成团粒，产生400mg细胞团粒。依照制造商的用法说明将细胞在1mL补充有25μM MG132(Cayman Chemical)、2mM NEM(Pierce Biotechnology，1mM PMSF(Calbiochem)、和5mM二硫苏糖醇(DTT)的Y-PER(Pierce Biotechnology)中裂解。
将50ng K11连接的二遍在蛋白(Genentech)、1μgK48连接的二遍在蛋白(Boston Biochem)、1μgK63连接的二遍在蛋白(Boston Biochem)、100μg来自293T细胞裂解物的总蛋白质、和22μL酿酒酵母细胞裂解物在含还原剂的1X LDS缓冲液(Invitrogen)中于70℃加热10分钟并在4-12％Bis TrisNuPAGE 1.0mm gels(Invitrogen)上在还原性条件下在MES缓冲液(Invitrogen)中一式两份运行。除转移至0.45μm硝酸纤维素(Invitrogen)以30V实施2小时外，如上所述实施凝胶转移和Western印迹。2A3/2E6IgG检测阳性对照K11连接的二遍在蛋白，但是不检测阴性对照K48连接的二遍在蛋白或K63连接的二遍在蛋白(图7D)。另外，2A3/2E6能够识别来自293T细胞裂解物的多聚遍在蛋白化特征性的高分子量涂片以及来自酵母细胞裂解物的几个高分子量条带。如此，此IgG也能够检测来自全细胞裂解物的K11连接的多聚遍在蛋白链。
C.自我遍在蛋白化MuRF1的免疫沉淀
为了进一步表征抗体的特异性及确定它是否能用于免疫沉淀(IP)，使用MuRF1自我遍在蛋白化反应来产生经多种连接的多聚遍在蛋白链修饰的纯底物。MuRF1是一种E3遍在蛋白连接酶，已知其在与E1遍在蛋白活化酶Ube1和E2遍在蛋白缀合酶UbcH5c组合时在具有K11连接的、K48连接的、和K63连接的多聚遍在蛋白链底物缺失下自我遍在蛋白化自身(Kim，H.T.et al.2007 JBC 282：17375-86)。自我遍在蛋白化反应用100nM重组人His6-Ube1(Boston Biochem)、5μM重组人UbcH5c(Boston Biochem)、1μM重组人His6-MuRF1(Boston Biochem)、100μM重组人遍在蛋白(Boston Biochem)、20mM Tris，pH 7.5、20mM KCl、5mM MgCl2、2mM三磷酸腺苷(ATP)、和1mM DTT以总体积40μL于37℃进行1.5小时。用野生型遍在蛋白以及K11R突变型遍在蛋白(Boston Biochem)二者实施反应以防止K11连接的链形成，从而探查抗体的特异性。将6μL每一个反应用含有4M、2M、1M、0.5M、或0M脲的IP缓冲液(20mM Tris，pH 7.5，135mM NaCl，1％TritonX-100，10％甘油，1mM EDTA，1.5mM MgCl2)稀释100倍。将每一个IP反应用50μL蛋白A Dynabeads(Invitrogen)于25℃旋转预澄清1小时。用磁体捕捉珠并将上清液转移至新管。将20μg2A3/2E6IgG添加至每一个IP并于25℃旋转温育过夜。次日，每一个IP用100μL蛋白A Dynabeads捕捉IgG，即于25℃旋转温育15分钟。捕捉珠并用1mL含有适宜量的脲的裂解缓冲液清洗3次，然后用1mL PBS清洗2次，在每一次清洗之间进行捕捉。在最后一次清洗期间，将珠转移至新管。洗脱IP材料，即将珠在20μL含还原剂的1X LDS样品缓冲液(Invitrogen)中重悬浮并于70℃温育10分钟。
在4-12％Bis Tris NuPAGE 1.0mm凝胶(Invitrogen)上在还原性条件下在MES缓冲液(Invitrogen)中运行10％每一个输入反应和100％IP材料。如上所述用泛遍在蛋白P4D1抗体进行Western印迹。结果证明了当在自我遍在蛋白化反应中使用野生型遍在蛋白时，在所有测试脲浓度下，2A3/2E6抗体能够免疫沉淀自我遍在蛋白化MuRF1(图8A和8B)。另外，没有看到输入道中存在的残留单遍在蛋白的IP。
当使用K11R突变型遍在蛋白时，它阻断MuRF1生成K11连接的多聚遍在蛋白链的能力；然而，自我遍在蛋白化仍然产生K48连接的和K63连接的链。因此，人们会预期，如果2A3/2E6 IgG是对K11连接的链特异性的话，那么在使用K11R突变型遍在蛋白时不应观察到自我遍在蛋白化MuRF1的IP。当在4M脲存在下实施IP时，情况确实如此，指示2A3/2E6 IgG在那些条件下是对K11连接的链高度特异性的(图8C)。这种特异性在脲浓度降低至2M时丧失。这与实施例3A中所示ELISA中对4M脲看到的特异性升高以及在4M脲下用针对K48和K63连接生成的其它遍在蛋白连接特异性抗体(参见例如已公布专利申请US20070218069中记载的抗体)进行的IP中看到的特异性一致。
为了进一步探查IgG在IP中的特异性，如上所述使用重组人野生型、K11R突变型、K48R突变型、和K63R突变型遍在蛋白(Boston Biochem)实施4个MuRF1自我遍在蛋白化反应。赖氨酸成精氨酸突变的使用防止多聚遍在蛋白连接经由那些特定赖氨酸形成。然后分成4个反应并对相等部分进行2A3/2E6IgG和没有特异性结合任何形式的遍在蛋白(Genentech)的人卡帕IgG1同种型对照抗体的IP。通过平行SDS-PAGE凝胶将来自每一个自我遍在蛋白化反应的输入材料以及每一份免疫沉淀样品分开，进行考马斯染色及用泛遍在蛋白P4D1抗体进行Western印迹分析，如上所述。
如图8D所示，2A3/2E6 IgG只在存在K11连接的链时(在使用野生型、K48R、或K63R突变型遍在蛋白时)能够IP自我遍在蛋白化MuRF1。在使用K11R突变型遍在蛋白时，MuRF1不能装配K11连接的链(见下文质谱术确认)，而2A3/2E6 IgG在那些条件下不能IP任何自我遍在蛋白化MuRF1。相反，同种型对照抗体不能自4个自我遍在蛋白化反应任一IP任何自我遍在蛋白化MuRF1。
根据泛遍在蛋白Western印迹信号的指导，对高分子量凝胶区(＞188kDa)实施质谱术分析。简言之，切出与此区对应的凝胶部分并进行凝胶中胰蛋白酶消化。将凝胶块使用50mM碳酸氢铵/50％甲醇脱色，然后用乙腈(ACN)弄干。为了容许有效摄取胰蛋白酶，将凝胶块与20ng/μL在50mM碳酸氢铵/5％CAN中稀释的改良测序级胰蛋白酶(Promega)一起在冰上温育2小时。消化于37℃实施过夜并通过添加50％ACN/5％甲酸(FA)来终止。将同位素标记的内部标准肽(1pmol)添加至每一份样品，之后进行两轮提取。将经过提取的肽完全干燥，并在10％ACN/5％FA/0.01％过氧化氢中重悬浮至少30分钟，之后进行质谱分析。将样品直接加载到Thermo AQUASIL C18柱(2.1x150mm)上并使用Agilent 1200毛细管LC以流速200μL/min在5％至90％缓冲液B(98％ACN/0.1％FA)的26分钟梯度上分开。在ABI 4000 QTRAP上实施质谱检测，即使用分段多重反应监测(MRM)方法来检测覆盖遍在蛋白序列的经标记和未标记肽二者。通过使用ABI Multiquant 1.1软件在经标记和未标记形式的每一种肽之间比较峰面积来实施定量。
来自野生型遍在蛋白反应的输入样品显示K11、K48、和K63连接的多聚遍在蛋白链的混合物，而用遍在蛋白突变体K11R、K48R和K63R进行的反应分别缺少K11、K48、和K63连接(图8E)。在由2A3/2E6 IgG自使用野生型遍在蛋白的反应免疫沉淀的样品中，多聚遍在蛋白连接概况保持与输入材料类似(见图8E)，提示大部分底物分子携带三种主要连接(K11、K48和K63)每一种。在抗K48和抗K63连接特异性抗体(Newton，K.et al.2008 Cell134：668-678)的表征期间获得类似的结果。用2A3/2E6 IgG对K48R和K63R突变型遍在蛋白反应的免疫沉淀下拉具有与其相应输入类似的多聚遍在蛋白连接概况的自我遍在蛋白化MuRF1。相反，2A3/2E6 IgG未能自K11R突变型遍在蛋白反应免疫沉淀多聚遍在蛋白，原因是缺少靶连接。这指示2A3/2E6IgG在IP中是对K11连接的链高度特异性的。正如预期的，同种型对照抗体不能自四个反应任一下拉遍在蛋白。
D.来自细胞裂解物的免疫沉淀
还对2A3/2E6IgG测试它自全细胞裂解物IP K11连接的多聚遍在蛋白链的能力。在补充有10％胎牛血清(FBS)和2mM L-谷氨酰胺的高葡萄糖Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM)中培养293T细胞。将细胞用质粒转染以过表达人野生型遍在蛋白、K0突变型遍在蛋白(7个赖氨酸都突变成精氨酸)，或模拟转染(图9A)。依照制造商的用法说明实施转染，每5块10cm板使用25μgDNA和75μL Lipofectamine 2000(Invitrogen)。转染后48小时，收获并裂解细胞，如上所述。将每一份裂解物的总蛋白质浓度在8M脲中调节至10mg/mL。然后用IP缓冲液(20mM Tris，pH 7.5，135mM NaCl，1％Triton X-100，10％甘油，1mM EDTA，1.5mM MgCl2)将裂解物稀释至4M脲，产生5mg/mL的总蛋白质浓度。每个IP反应使用1mL的体积(5mg总蛋白质)。
在用2A3/2E6 IgG实施的IP之外，还使用了不特异性结合任何形式的遍在蛋白的人卡帕IgG1同种型对照抗体(Genentech)。将每一个IP反应用100μL蛋白A Dynabeads(Invitrogen)于25℃旋转预澄清2小时，接着以14,000rpm离心2分钟以清除沉淀的材料。用磁体捕捉珠并将上清液转移至新管。将40μg 2A3/2E6或对照IgG添加至每一个IP并于25℃旋转温育过夜。次日，每一个IP用200μL蛋白A Dynabeads捕捉IgG，即于25℃旋转温育15分钟。捕捉珠并用1mL 4M脲IP缓冲液(4M脲，20mM Tris，pH 7.5，135mM NaCl，1％Triton X-100，10％甘油，1mM EDTA，1.5mM MgCl2)清洗5次，然后用1mL PBS清洗5次，在每一次清洗之间进行捕捉。在最后一次清洗期间，将珠转移至新管。洗脱IP材料，即将珠在15μL含还原剂的1X LDS样品缓冲液(Invitrogen)中重悬浮并于70℃温育10分钟。对于Western印迹分析，在4-12％Bis Tris NuPAGE 1.0mm凝胶(Invitrogen)上在还原性条件下在MES缓冲液(Invitrogen)中运行0.1％5mg/mL全细胞裂解物(输入)和10％IP材料。如上所述使用泛遍在蛋白P4D1抗体进行Western印迹。对于质谱术分析，在4-12％Bis Tris NuPAGE 1.0mm凝胶(Invitrogen)上在还原性条件下在MES缓冲液(Invitrogen)中运行10％5mg/mL全细胞裂解物(输入)和90％IP材料。将凝胶用SimplyBlue染料(Invitrogen)染色。
在模拟转染的裂解物中，存在且由2A3/2E6免疫沉淀相对较少的多聚遍在蛋白(图9A)。当野生型遍在蛋白过表达时，全细胞裂解物内的多聚遍在蛋白链连同2A3/2E6拉下的多聚遍在蛋白链大大增多，提示K11连接的多聚遍在蛋白链在遍在蛋白过表达时上调。令人惊讶地，当K0突变型遍在蛋白(所有赖氨酸残基都突变成精氨酸且因此不能形成含有异肽键的多聚遍在蛋白链)过表达时，多聚遍在蛋白链也高度上调。这提示K0过表达导致含有内源遍在蛋白的多聚遍在蛋白链的合成升高。大部分这些链肯定是K11连接的，因为2A3/2E6能够IP它们。为了确定情况确实如此，如上所述实施质谱分析，只是将凝胶块与20ng/μL在50mM碳酸氢铵/5％CAN中稀释的改良测序级胰蛋白酶(Promega)一起在冰上温育45分钟，然后除去胰蛋白酶溶液并用50mM碳酸氢铵/5％CAN替换，之后于37℃消化过夜。分析了来自考马斯染色的聚丙烯酰胺凝胶的两个分子量区，其对应于＞188kDa(图9B和9C)。
对这些样品的定量分析显示出免疫沉淀中K11连接相对于输入裂解物中存在的K11连接百分比的富集(图9C和9D)。检测到显著水平的K48和K63连接提示，各个底物普遍携带不同连接的遍在蛋白链，或是作为异质的混合连接链，或者可能是作为同质的不同底物赖氨酸上的链。用同种型对照抗体实施的免疫沉淀揭示了所有情况中链中可忽略量的遍在蛋白(数据未显示)，与图9A中的Western印迹结果一致。
虽然出于清楚理解的目的，前述发明已经作为例示和例子相当详细地进行了描述，但是说明书和实施例不应解释为限制本发明的范围。通过提及而明确将本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容完整收录。
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权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种特异性结合包含K11赖氨酸连接的第一多聚遍在蛋白的分离的抗体，其中该抗体不特异性结合包含第二赖氨酸连接的第二多聚遍在蛋白，其中该第二赖氨酸连接不同于K11赖氨酸连接。
2.一种特异性结合包含K11赖氨酸连接的第一多聚遍在蛋白和包含第二赖氨酸连接的第二多聚遍在蛋白二者的分离的抗体，其中该第二赖氨酸连接不同于K11赖氨酸连接，其中该抗体不特异性结合单遍在蛋白，且其中该抗体以与该抗体对该第一多聚遍在蛋白的结合亲和力相比实质性降低的结合亲和力结合第二多聚遍在蛋白。
3.一种特异性结合赖氨酸-11连接的多聚遍在蛋白的分离的抗体，其中该抗体不特异性结合单遍在蛋白。
4.权利要求3的抗体，其包含至少一个高变(HVR)序列，该序列选自SEQ IDNO:2和57-60任一的HVR-L1、SEQ ID NO:3和61任一的HVR-L2、SEQID NO:4的HVR-L3、SEQ ID NO:6-11任一的HVR-H1、SEQ ID NO:12-17和67任一的HVR-H2、和SEQ ID NO:18-23,68和69任一的HVR-H3。
5.权利要求3的抗体，其包含至少一个选自HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3的序列，其中HVR-H1包含氨基酸序列X1X2X3X4Ile X5(SEQ ID NO:24)，其中氨基酸X1选自丝氨酸和苏氨酸，氨基酸X2选自天冬酰胺、天冬氨酸、丝氨酸和甘氨酸，氨基酸X3选自酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸，氨基酸X4选自色氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和酪氨酸，而氨基酸X5选自丝氨酸和组氨酸；其中HVR-H2包含氨基酸序列X6 X7 Ile X8 Pro X9 GlyX10 Tyr X11(SEQ ID NO:25)，其中氨基酸X6选自甘氨酸和丙氨酸，氨基酸X7选自天冬氨酸、色氨酸、甘氨酸、谷氨酸和缬氨酸，氨基酸X8选自丝氨酸、酪氨酸和天冬酰胺，氨基酸X9选自天冬氨酸、丙氨酸、组氨酸和天冬酰胺，氨基酸X10选自酪氨酸和丝氨酸，而氨基酸X11选自酪氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺；且其中HVR-H3包含氨基酸序列X12 X13X14 X15 X16 X17 X18 X19 X20 X21 Asp(SEQ ID NO:26)，其中氨基酸X12选自精氨酸和赖氨酸，氨基酸X13选自谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和脯氨酸，氨基酸X14选自丝氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和色氨酸，氨基酸X15选自色氨酸、甘氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，氨基酸X16选自色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸，氨基酸X17选自丝氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸，氨基酸X18选自丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和甘氨酸、或不存在，氨基酸X19选自色氨酸、甘氨酸、丙氨酸和酪氨酸、或不存在，氨基酸X20为缬氨酸或不存在，而氨基酸X21选自甲硫氨酸和苯丙氨酸。
6.权利要求3的抗体，其包含至少一个选自HVR-L1、HVR-L2的序列，其中HVR-L1包含氨基酸序列X22 X23 Ser X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30X31(SEQ ID NO:73)，其中氨基酸X22选自精氨酸和甘氨酸，氨基酸X23选自丙氨酸和缬氨酸，氨基酸X24选自谷氨酰胺和组氨酸，氨基酸X25选自天冬氨酸、天冬酰胺和异亮氨酸，氨基酸X26选自亮氨酸和缬氨酸，氨基酸X27选自丝氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和谷氨酸，氨基酸X28选自苏氨酸和丝氨酸，氨基酸X29选自丙氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，氨基酸X30选自缬氨酸和异亮氨酸，而氨基酸X31选自丙氨酸和丝氨酸；且其中HVR-L2包含氨基酸序列X32 X33 X34 Phe X35 Tyr Ser(SEQ ID NO:74)，其中氨基酸X32选自丝氨酸和天冬酰胺，氨基酸X33选自谷氨酰胺和丙氨酸，氨基酸X34选自谷氨酸和丝氨酸，而氨基酸X35选自亮氨酸和缬氨酸。
7.权利要求3的抗体，其包含至少一个选自HVR-H2和HVR-H3的序列，其中HVR-H2包含氨基酸序列X36 Ile Asn Pro X37 Gly Gly Tyr Thr Tyr TyrAla Asp Ser Val Lys Gly(SEQ ID NO:75)，其中氨基酸X36选自丙氨酸和甘氨酸而氨基酸X37选自丙氨酸和天冬酰胺；且其中HVR-H3包含氨基酸序列Glu Trp Tyr X38 X39 Gly Tyr Val Met Asp Tyr(SEQ ID NO:76)，其中氨基酸X38选自苯丙氨酸和酪氨酸而氨基酸X39选自甘氨酸和天冬氨酸。
8.权利要求3的抗体，其包含HVR-L1序列SEQ ID NO:2、HVR-L2序列SEQID NO:3、和HVR-L3序列SEQ ID NO:4。
9.权利要求3的抗体，其包含与图1B中克隆A3、A6、A9、B5、F5或G3所列HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3序列对应的HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3序列。
10.权利要求3的抗体，其包含与图4A中克隆1A11、1C12、1F12、2A3、2A6、2D7、2E6或2G4所列HVR-L1、HVR-L2、和HVR-L3序列对应的HVR-L1、HVR-L2、和HVR-L3序列。
11.权利要求3的抗体，其包含与图4B中克隆1A11、1C12、1F12、2A3、2A6、2D7、2E6或2G4所列HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3序列对应的HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3序列。
12.权利要求3的抗体，其包含与图6A中克隆1C1/2E6或2A3/2E6所列HVR-L1、HVR-L2、和HVR-L3序列对应的HVR-L1、HVR-L2、和HVR-L3序列。
13.权利要求3的抗体，其包含与图6B中克隆1C1/2E6或2A3/2E6所列HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3序列对应的HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3序列。
14.权利要求3的抗体，其包含HVR-L1序列序列SEQ ID NO:2、HVR-L2序列SEQ ID NO:3、HVR-L3序列SEQ ID NO:4、HVR-H1序列SEQ ID NO:11、HVR-H2序列SEQ ID NO:17和HVR-H3序列SEQ ID NO:23。
15.权利要求3的抗体，其包含HVR-L1序列序列SEQ ID NO:2、HVR-L2序列SEQ ID NO:3、HVR-L3序列SEQ ID NO:4、HVR-H1序列SEQ ID NO:11、HVR-H2序列SEQ ID NO:17或67和选自SEQ ID NO:23,68和69的HVR-H3序列。
16.权利要求3的抗体，其包含选自SEQ ID NO:2,57,58和59的HVR-L1序列、HVR-L2序列SEQ ID NO:3或61、HVR-L3序列SEQ ID NO:4、HVR-H1序列SEQ ID NO:11、HVR-H2序列SEQ ID NO:17和HVR-H3序列SEQ ID NO:23。
17.权利要求3的抗体，其包含HVR-L1序列序列SEQ ID NO:58、HVR-L2序列SEQ ID NO:3、HVR-L3序列SEQ ID NO:4、HVR-H1序列SEQ ID NO:11、HVR-H2序列SEQ ID NO:67和HVR-H3序列SEQ ID NO:23。
18.权利要求3的抗体，其包含HVR-L1序列序列SEQ ID NO:60、HVR-L2序列SEQ ID NO:3、HVR-L3序列SEQ ID NO:4、HVR-H1序列SEQ ID NO:11、HVR-H2序列SEQ ID NO:67和HVR-H3序列SEQ ID NO:23。
19.权利要求3的抗体，其包含选自SEQ ID NO:5和62-66的轻链氨基酸序列。
20.权利要求3的抗体，其包含选自SEQ ID NO:27-32和70-72的重链氨基酸序列。
21.权利要求3的抗体，其包含与任一下述序列组合的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的轻链和重链氨基酸序列：SEQ ID NO 5和32；SEQ IDNO:63和32；SEQ ID NO:65和32；SEQ ID NO:5和72；SEQ ID NO:63和72；和SEQ ID NO:65和72；SEQ ID NO:62和32；SEQ ID NO:64和32；SEQ ID NO:5和70；SEQ ID NO:5和71；SEQ ID NO:66和32
22.一种与权利要求1-21任一项的抗体结合K11连接的多聚遍在蛋白上相同抗原决定簇的分离的抗体，其中该抗体不特异性结合单遍在蛋白。
23.一种与权利要求1-21任一项的抗体竞争对多聚遍在蛋白的结合的分离的抗体，其中该抗体不特异性结合单遍在蛋白。
24.权利要求1-21任一项的分离的抗体，其中该抗体特异性结合K11连接的多聚遍在蛋白化的蛋白质。
25.权利要求1-21任一项的分离的抗体，其中该抗体调控至少一种由多聚遍在蛋白介导的信号传导途径。
26.权利要求1-21任一项的分离的抗体，其中该抗体是结合K11连接的多聚遍在蛋白的单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、或抗体片段。
27.一种分离的核酸，其编码权利要求1-21任一项的抗体。
28.一种载体，其包含权利要求27的核酸。
29.一种宿主细胞，其包含权利要求27的核酸。
30.一种生成特异性结合包含K11赖氨酸连接的第一多聚遍在蛋白的抗体的方法，包括在该抗体生成的条件下培养权利要求29的宿主细胞。
31.权利要求30的方法，进一步包括自宿主细胞回收抗体。
32.一种免疫缀合物，其包含权利要求1的抗体和细胞毒剂。
33.一种药物配制剂，其包含权利要求1的抗体和药学可接受载体。
34.权利要求33的药物配制剂，进一步包含别的治疗剂。
35.作为药物使用的权利要求1的抗体。
36.在治疗细胞周期相关疾病或病症中使用的权利要求1的抗体。
37.权利要求36的抗体，其中所述细胞周期相关疾病或病症选自与异常升高的细胞周期行进有关的疾病或病症和与异常降低的细胞周期行进有关的疾病或病症
38.权利要求37的抗体，其中所述与异常升高的细胞周期行进有关的疾病或病症是癌症。
39.权利要求37的抗体，其中所述与异常降低的细胞周期行进有关的疾病或病症选自变性肌肉病症和变性神经病症。
40.权利要求1的抗体在制备药物中的用途。
41.权利要求40的用途，其中所述药物用于选自癌症、变性肌肉病症、和变性神经病症的疾病或病症。
42.一种治疗具有选自癌症、变性肌肉病症、和变性神经病症的疾病或病症的个体的方法，包括对该个体施用有效量的权利要求1-26任一项的抗体。
43.一种测定怀疑含有多聚遍在蛋白或多聚遍在蛋白化的蛋白质的样品中多聚遍在蛋白或多聚遍在蛋白化的蛋白质的存在的方法，包括使该样品暴露于权利要求1-26任一项的至少一种抗体并测定该至少一种抗体对该样品中多聚遍在蛋白或多聚遍在蛋白化的蛋白质的结合。
44.一种将样品中的K11连接的多聚遍在蛋白化的蛋白质与非K11连接的多聚遍在蛋白化的蛋白质分开的方法，包括使该样品与权利要求1-26任一项的至少一种抗体接触。
45.一种测定细胞或样品中K11连接的多聚遍在蛋白的功能和/或活性的方法，包括使该细胞或样品与权利要求1-26任一项的至少一种抗体接触并评估所述接触步骤对该细胞或样品的影响。

Claims (45)

1.一种特异性结合包含K11赖氨酸连接的第一多聚遍在蛋白的分离的抗体，其中该抗体不特异性结合包含第二赖氨酸连接的第二多聚遍在蛋白，其中该第二赖氨酸连接不同于K11赖氨酸连接。
2.一种特异性结合包含K11赖氨酸连接的第一多聚遍在蛋白和包含第二赖氨酸连接的第二多聚遍在蛋白二者的分离的抗体，其中该第二赖氨酸连接不同于K11赖氨酸连接，其中该抗体不特异性结合单遍在蛋白，且其中该抗体以与该抗体对该第一多聚遍在蛋白的结合亲和力相比实质性降低的结合亲和力结合第二多聚遍在蛋白。
3.一种特异性结合赖氨酸-11连接的多聚遍在蛋白的分离的抗体，其中该抗体不特异性结合单遍在蛋白。
4.权利要求3的抗体，其包含至少一个高变(HVR)序列，该序列选自SEQ IDNO:2和57-60任一的HVR-L1、SEQ ID NO:3和61任一的HVR-L2、SEQID NO:4的HVR-L3、SEQ ID NO:6-11任一的HVR-H1、SEQ ID NO:12-17和67任一的HVR-H2、和SEQ ID NO:18-23,68和69任一的HVR-H3。
5.权利要求3的抗体，其包含至少一个选自HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3的序列，其中HVR-H1包含氨基酸序列X1X2X3X4Ile X5(SEQ ID NO:24)，其中氨基酸X1选自丝氨酸和苏氨酸，氨基酸X2选自天冬酰胺、天冬氨酸、丝氨酸和甘氨酸，氨基酸X3选自酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸，氨基酸X4选自色氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和酪氨酸，而氨基酸X5选自丝氨酸和组氨酸；其中HVR-H2包含氨基酸序列X6 X7 Ile X8 Pro X9 GlyX10 Tyr X11(SEQ ID NO:25)，其中氨基酸X6选自甘氨酸和丙氨酸，氨基酸X7选自天冬氨酸、色氨酸、甘氨酸、谷氨酸和缬氨酸，氨基酸X8选自丝氨酸、酪氨酸和天冬酰胺，氨基酸X9选自天冬氨酸、丙氨酸、组氨酸和天冬酰胺，氨基酸X10选自酪氨酸和丝氨酸，而氨基酸X11选自酪氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺；且其中HVR-H3包含氨基酸序列X12 X13X14 X15 X16 X17 X18 X19 X20 X21 Asp(SEQ ID NO:26)，其中氨基酸X12选自精氨酸和赖氨酸，氨基酸X13选自谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和脯氨酸，氨基酸X14选自丝氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和色氨酸，氨基酸X15选自色氨酸、甘氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，氨基酸X16选自色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸，氨基酸X17选自丝氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸，氨基酸X18选自丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和甘氨酸、或不存在，氨基酸X19选自色氨酸、甘氨酸、丙氨酸和酪氨酸、或不存在，氨基酸X20为缬氨酸或不存在，而氨基酸X21选自甲硫氨酸和苯丙氨酸。
6.权利要求3的抗体，其包含至少一个选自HVR-L1、HVR-L2的序列，其中HVR-L1包含氨基酸序列X22 X23 Ser X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30X31(SEQ ID NO:73)，其中氨基酸X22选自精氨酸和甘氨酸，氨基酸X23选自丙氨酸和缬氨酸，氨基酸X24选自谷氨酰胺和组氨酸，氨基酸X25选自天冬氨酸、天冬酰胺和异亮氨酸，氨基酸X26选自亮氨酸和缬氨酸，氨基酸X27选自丝氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和谷氨酸，氨基酸X28选自苏氨酸和丝氨酸，氨基酸X29选自丙氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，氨基酸X30选自缬氨酸和异亮氨酸，而氨基酸X31选自丙氨酸和丝氨酸；且其中HVR-L2包含氨基酸序列X32 X33 X34 Phe X35 Tyr Ser(SEQ ID NO:74)，其中氨基酸X32选自丝氨酸和天冬酰胺，氨基酸X33选自谷氨酰胺和丙氨酸，氨基酸X34选自谷氨酸和丝氨酸，而氨基酸X35选自亮氨酸和缬氨酸。
7.权利要求3的抗体，其包含至少一个选自HVR-H2和HVR-H3的序列，其中HVR-H2包含氨基酸序列X36 Ile Asn Pro X37 Gly Gly Tyr Thr Tyr TyrAla Asp Ser Val Lys Gly(SEQ ID NO:75)，其中氨基酸X36选自丙氨酸和甘氨酸而氨基酸X37选自丙氨酸和天冬酰胺；且其中HVR-H3包含氨基酸序列Glu Trp Tyr X38 X39 Gly Tyr Val Met Asp Tyr(SEQ ID NO:76)，其中氨基酸X38选自苯丙氨酸和酪氨酸而氨基酸X39选自甘氨酸和天冬氨酸。
8.权利要求3的抗体，其包含HVR-L1序列SEQ ID NO:2、HVR-L2序列SEQID NO:3、和HVR-L3序列SEQ ID NO:4。
9.权利要求3的抗体，其包含与图1B中克隆A3、A6、A9、B5、F5或G3所列HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3序列对应的HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3序列。
10.权利要求3的抗体，其包含与图4A中克隆1A11、1C12、1F12、2A3、2A6、2D7、2E6或2G4所列HVR-L1、HVR-L2、和HVR-L3序列对应的HVR-L1、HVR-L2、和HVR-L3序列。
11.权利要求3的抗体，其包含与图4B中克隆1A11、1C12、1F12、2A3、2A6、2D7、2E6或2G4所列HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3序列对应的HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3序列。
12.权利要求3的抗体，其包含与图6A中克隆1C1/2E6或2A3/2E6所列HVR-L1、HVR-L2、和HVR-L3序列对应的HVR-L1、HVR-L2、和HVR-L3序列。
13.权利要求3的抗体，其包含与图6B中克隆1C1/2E6或2A3/2E6所列HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3序列对应的HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3序列。
14.权利要求3的抗体，其包含HVR-L1序列序列SEQ ID NO:2、HVR-L2序列SEQ ID NO:3、HVR-L3序列SEQ ID NO:4、HVR-H1序列SEQ ID NO:11、HVR-H2序列SEQ ID NO:17和HVR-H3序列SEQ ID NO:23。
15.权利要求3的抗体，其包含HVR-L1序列序列SEQ ID NO:2、HVR-L2序列SEQ ID NO:3、HVR-L3序列SEQ ID NO:4、HVR-H1序列SEQ ID NO:11、HVR-H2序列SEQ ID NO:17或67和选自SEQ ID NO:23,68和69的HVR-H3序列。
16.权利要求3的抗体，其包含选自SEQ ID NO:2,57,58和59的HVR-L1序列、HVR-L2序列SEQ ID NO:3或61、HVR-L3序列SEQ ID NO:4、HVR-H1序列SEQ ID NO:11、HVR-H2序列SEQ ID NO:17和HVR-H3序列SEQ ID NO:23。
17.权利要求3的抗体，其包含HVR-L1序列序列SEQ ID NO:58、HVR-L2序列SEQ ID NO:3、HVR-L3序列SEQ ID NO:4、HVR-H1序列SEQ ID NO:11、HVR-H2序列SEQ ID NO:67和HVR-H3序列SEQ ID NO:23。
18.权利要求3的抗体，其包含HVR-L1序列序列SEQ ID NO:60、HVR-L2序列SEQ ID NO:3、HVR-L3序列SEQ ID NO:4、HVR-H1序列SEQ ID NO:11、HVR-H2序列SEQ ID NO:67和HVR-H3序列SEQ ID NO:23。
19.权利要求3的抗体，其包含选自SEQ ID NO:5和62-66的轻链氨基酸序列。
20.权利要求3的抗体，其包含选自SEQ ID NO:27-32和70-72的重链氨基酸序列。
21.权利要求3的抗体，其包含与任一下述序列组合的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的轻链和重链氨基酸序列：SEQ ID NO 5和32；SEQ IDNO:63和32；SEQ ID NO:65和32；SEQ ID NO:5和72；SEQ ID NO:63和72；和SEQ ID NO:65和72；SEQ ID NO:62和32；SEQ ID NO:64和32；SEQ ID NO:5和70；SEQ ID NO:5和71；SEQ ID NO:66和32
22.一种与权利要求1-21任一项的抗体结合K11连接的多聚遍在蛋白上相同抗原决定簇的分离的抗体，其中该抗体不特异性结合单遍在蛋白。
23.一种与权利要求1-21任一项的抗体竞争对多聚遍在蛋白的结合的分离的抗体，其中该抗体不特异性结合单遍在蛋白。
24.权利要求1-21任一项的分离的抗体，其中该抗体特异性结合K11连接的多聚遍在蛋白化的蛋白质。
25.权利要求1-21任一项的分离的抗体，其中该抗体调控至少一种由多聚遍在蛋白介导的信号传导途径。
26.权利要求1-21任一项的分离的抗体，其中该抗体是结合K11连接的多聚遍在蛋白的单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、或抗体片段。
27.一种分离的核酸，其编码权利要求1-21任一项的抗体。
28.一种载体，其包含权利要求27的核酸。
29.一种宿主细胞，其包含权利要求27的核酸。
30.一种生成特异性结合包含K11赖氨酸连接的第一多聚遍在蛋白的抗体的方法，包括在该抗体生成的条件下培养权利要求29的宿主细胞。
31.权利要求30的方法，进一步包括自宿主细胞回收抗体。
32.一种免疫缀合物，其包含权利要求1的抗体和细胞毒剂。
33.一种药物配制剂，其包含权利要求1的抗体和药学可接受载体。
34.权利要求33的药物配制剂，进一步包含别的治疗剂。
35.作为药物使用的权利要求1的抗体。
36.在治疗细胞周期相关疾病或病症中使用的权利要求1的抗体。
37.权利要求36的抗体，其中所述细胞周期相关疾病或病症选自与异常升高的细胞周期行进有关的疾病或病症和与异常降低的细胞周期行进有关的疾病或病症
38.权利要求37的与异常升高的细胞周期行进有关的疾病或病症，其中所述疾病或病症是癌症。
39.权利要求37的与异常降低的细胞周期行进有关的疾病或病症，其中所述疾病或病症选自变性肌肉病症和变性神经病症。
40.权利要求1的抗体在制备药物中的用途。
41.权利要求40的用途，其中所述药物用于选自癌症、变性肌肉病症、和变性神经病症的疾病或病症。
42.一种治疗具有选自癌症、变性肌肉病症、和变性神经病症的疾病或病症的个体的方法，包括对该个体施用有效量的权利要求1-26任一项的抗体。
43.一种测定怀疑含有多聚遍在蛋白或多聚遍在蛋白化的蛋白质的样品中多聚遍在蛋白或多聚遍在蛋白化的蛋白质的存在的方法，包括使该样品暴露于权利要求1-26任一项的至少一种抗体并测定该至少一种抗体对该样品中多聚遍在蛋白或多聚遍在蛋白化的蛋白质的结合。
44.一种将样品中的K11连接的多聚遍在蛋白化的蛋白质与非K11连接的多聚遍在蛋白化的蛋白质分开的方法，包括使该样品与权利要求1-26任一项的至少一种抗体接触。
45.一种测定细胞或样品中K11连接的多聚遍在蛋白的功能和/或活性的方法，包括使该细胞或样品与权利要求1-26任一项的至少一种抗体接触并评估所述接触步骤对该细胞或样品的影响。
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