KR101413055B1 - 발암의 줄기세포 융합 모델 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암세포 이동을 모델링하는 방법, 종양 세포 이동에 대한 효과를 위한 약물의 스크리닝 방법, 및 골수 유래 줄기세포와 유전적으로 변형된 세포의 융합과 관련된 종양 세포 이동 가능성을 검출하는 방법을 제공한다. 유비퀴틴에 대한 항체는 종양 세포 이동을 저해하는 것으로 나타났다.

Description

발암의 줄기세포 융합 모델{STEM CELL FUSION MODEL OF CARCINOGENESIS}

이 출원은 2005년 8월 25일자 미국 가출원 제 60/711,249호 "발암의 줄기세포 융합 모델"에 대한 우선권을 주장하며, 이는 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다.

본 발명은 세포 시스템, 암세포에 대한 모델링 방법, 약물 스크리닝 방법 및 암세포의 이동을 저해하는 방법에 관한 것이다.

암은 조직 이질성 및 유전자 불안정성으로 인해 치료하기 어렵다. 인간 질병으로서, 암은 일찍이 1600 B.C.에 고대 이집트 문헌에 기록되어 있다. 고대 그리스 의사인 히포크라테스는 양성 종양과 악성 종양의 차이를 인지하여, 악성 종양을 "암"이라고 명명하였다. 현재 개발국가에서 암은 사망 원인의 2순위를 차지하고 있다.

1970년대에 미국 대통령인 리차드 닉슨의 "암과의 전쟁"을 선언한 이래, 암에 대한 수많은 지식이 축적되었다. 수많은 암 발생 가설이 지난 2세기 동안 제안되었다. 초기 가설은 염증 가설, 배아 가설 및 기생 가설이다. 이후에, 실험적인 암 연구가 확립되면서, 화학 발암 물질이 동정되었다. 수십 개의 발암 물질과 종양 억제자 유전자가 인간 및 실험 동물 종양에 대한 분자적 분석을 통해 발견되었다. 이러한 연구들로, 유전자 돌연변이 가설이 확인되었고, 이 가설이 과거 30년간 지배적인 위치를 차지하였다.

이의 본래의 정밀함에도 불구하고, 현재 유전자 돌연변이 가설은 암의 수많은 중요한 암 특징들을 설명하지 못하고 있다. 실제, 유전자 돌연변이 가설의 한계가 많은 연구자들에 의해 철저히 규명되고 있다.

최근, "발암의 줄기세포 이론"은 줄기세포 연구와 "암 줄기세포"의 발견으로부터 얻은 통찰로 인해 탄력이 붙었다. 발암의 줄기세포 이론은 유전자 돌연변이가 축적되어 악성 세포가 된다는 것이다. 그러나, 여전히 유전자 돌연변이 가설에만 의존하고 있어, 줄기세포 이론은 침투 및 전이와 같은 암의 독특한 특징을 형성하는 원인을 완전히 규명하진 못하고 있다.

돌연변이는 드물게 일어나는 현상이다. 수학적 모델에 따르면, 보다 빈번하게 발생하는 현상이 악성 형질전환에 필수적이다. 게놈 불안정성은 암의 특징을 특성화할 수 있는 것으로 제안되었다. 게놈 불안정성의 표현형으로서 이배수성(aneuploidy)은 거의 모든 고형 인간 암에서 관찰되며, 유전자 돌연변이 가설로 설명하긴 어렵다. 이배수성은 자율적인 돌연변이 유발자로서 암의 원인으로 제시되었지만, 이배수성 기저 메카니즘은 명확하지 않은 상태이다.

그러나, 수행된 실질적인 진전에도 불구하고, 암의 기원은 수수께끼로 남아있다. 유전자 돌연변이 가설을 토대로 한 현재의 발암 모델은 암의 수많은 측면을 해명하는데 한계가 있어, 본 발명자들은 다단계 발암의 새로운 모델로서 암 발생에 유전자 돌연변이 및 세포 융합이 관여함을 제안하였다. 특히, 암은 "변형된" 전암성(pre-malignant) 세포와 골수 유래 줄기세포(BMDSC)의 융합으로 생길 수 있다. 악성의 특징인 "이배수성"은 이러한 세포 융합의 직접적인 결과이다. "줄기세포 융합" 모델은 악성 세포와 BMDSC 사이의 현저한 유사성을 설명해 준다. 또한, 이러한 모델은 비-돌연변이원이 발암원일 수 있는 이유와 상처 치유 및 만성 염증과 같은 비-돌연변이성 프로세스가 악성 형질전환을 촉진할 수 있는 이유를 설명해 준다.

발명의 개요

본 발명의 일예는, 암 세포의 이동을 모델링하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 바람직하기로는 골수 유래 줄기세포를 제공하는 단계, 유전적으로 변형된 세포를 제공하는 단계, 상기 골수 유래 줄기세포와 상기 유전적으로 변형된 세포를 융합하는 단계 및 그로 인해 융합 세포를 만드는 단계; 및 상기 융합 세포의 이동에 대한 표시자를 측정하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 2가지 타입의 세포의 직접 융합 대신, 골수 유래 줄기세포와 유전적으로 변형된 세포의 사전 융합으로부터 융합된 세포를 수득 또는 배양할 수 있다.

본 발명의 다른 예는 종양 세포 이동에 있어 생물학적 제제 또는 화학적 제제의 효과를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 골수 유래 줄기세포와 유전적으로 변형된 세포의 융합으로부터 유래된 융합 세포를 제공하는 단계, 상기 융합 세포를 생물학적 제제 또는 화학적 제제와 접촉시키는 단계 및 종양 세포 이동이 촉진되었는지, 저해되었는지 또는 변화되지 않았는지를 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또다른 예는 종양 세포 이동을 저해하는 방법을 제공하며, 이는 유비퀴틴에 대한 항체를 유효량으로 종양 세포에 접촉시키는 단계를 포함한다. 바람직하기로는, 상기 항체는 MEL-14, [예, MEL-14-F(ab')₂], 항체 14372 또는 항체 10C2-2이다.

본 발명의 방법은 시험관 내 종양 세포 이동 연구 및 마커-유전자 변형된 골수, 예컨대 eGFP 유전자 전환체가 이식된 동물을 이용한 생체내 연구를 위한, 새롭고 개선된 발암 모델을 제공한다. 본 발명의 추가적인 특징 및 이점은 첨부된 도면을 참조하여 임의의 구체적인 실시예에 대한 하기 상세한 설명으로 나타날 것이다.

발명의 상세한 설명

본원에서, "전이"는 암이 신체의 한 곳에서 다른 곳으로 전파되는 것을 의미한다. 전파된 세포에 의해 형성된 종양을 "전이 종양" 또는 "전이부"라고 한다.

용어 "악성"은 암, 즉 통제되지 않고 분열하여, 근처 조직에 침투하고 혈류나 림프계를 통해 신체의 다른 부위로 퍼져나갈 수 있는, 비정상적인 세포를 의미한다.

용어 "변형된 세포" 또는 "유전적으로 변형된 세포"는 BMDSC와 융합된 후 골수 유래 줄기세포의 정상적인 분화 경로를 벗어날 정도의 유전적 변화 또는 유전자외적 변화(epigenetic change)가 있는 모든 세포로 정의된다. "변형된" 세포는 다단계 발암 모델에서 이른바 "개시" (전암성) 세포를 포함한다.

용어 "융합 세포"는 변형된 세포와 골수 유래 줄기세포의 융합에 의해 형성된 세포를 의미한다.

악성의 기원은 특히 인간 악성의 90% 이상을 포함하는 암에서 여전히 논쟁의 여지가 있다. 이에 본 발명자들에 의해 제안된 발암 모델은 악성이 높은 암의 발생 기원에 집중시켰다. 상기 모델에서 주된 현상은 골수 유래 줄기세포(BMDSC)와 "변형된" 조직 세포의 융합 단계(도 1)이다. 시판되는 컬럼을 이용하여, 분화된 세포 표면 마커를 발현하는 모든 골수 유래 세포를 제거함으로써, 정제된 BMDSC 개체군을 수득한다. 컬럼을 통과하는 음성 세포 계통은, CD34 양성, CD133 양성, 및 SCA-1 양성 세포에 대한 양성 선별에 의해 줄기세포를 더욱 농화시킬 수 있다. 이러한 작업은 마우스와 인간 BMDSC 둘다에 유효하다. 본 발명은 부분적으로 "변형된" 조직 세포와 BMDSC 사이의 융합으로 잡종 세포를 악성 형질전환시킬 수 있다는 인식에 관한 것이다. 따라서, 다단계 발암 모델 및 양성 종양 세포에서의 이른바 "개시된" 세포는 이동 능력을 가질 수 있다.

융합시, BMDSC의 정상적인 분화 경로는 "변형된" 조직 세포의 유전적 또는 비유전자적 장애의 존재로 인해 파괴될 수 있다. 유전적 장애는 유전자 돌연변이 가설에 의해 제안된 바에 따라, 유전자 돌연변이, 전좌, 결손 또는 증폭일 수 있다. 비유전자적 장애는 DNA 메틸화, 염색질 변형 또는 변형된 세포 시그널링과 같은 세포 성장과 기능의 탈규제를 발생시키는 DNA 서열 이외의 모든 변화일 수 있다. 융합에 의해 변형된 세포 및 BMDSC 둘다의 표현형을 가진 딸 세포가 만들어질 수 있다. 즉, 딸 세포는 BMDSC로부터 자가-갱신, 조직 침투 및 이동 능력을 취득할 수 있으며, 따라서 악성 세포로 전환된다. 따라서, 융합 프로세스, 이후의 유사 분열 및 염색체의 개별 카피수 감소가 이배수성을 초래할 것이다. 이배수성은 게놈 불안정성 및 암 진행의 추진력이 될 수 있다. 본 발명자의 모델에 따르면, 한번의 융합은 고전적인 다단계 발암 과정에 참여하는 여러가지 현상의 효과들과 동일한 (양성에서 악성으로) 형질전환 효과를 가질 수 있다.

발명자의 모델을 기초로 하며, 침투 및 전이와 같은 암의 악성 표현형 대부분은 BMSDC로부터 기원할 것이다. 융합은 다세포 유기체의 발생 및 유지 과정에서 자연스럽고 비교적 흔히 발생되는 현상이다. 유전자 돌연변이와 줄기세포 융합의 상대적인 가능성을 비교하여, 진화적인 과정으로서 정상 세포의 완전한 악성으로의 발생을 검토할 수 있다. 다발적인 희귀 현상을 빈번한 현상으로 치환하는 임의의 경로는 그러한 경로를 진화에서 특히 바람직하게 할 것이다.

BMDSC는 매우 가소적이다. 많은 연구들을 통해, 골수가 조혈 줄기세포(HSC) 뿐만 아니라 간엽 줄기세포(MSC), 내피 세포 전구체 및 간, 폐, 피부 및 장관의 상피 세포로 분화할 수 있는 상피 조직의 줄기세포도 포함하고 있는 것으로 입증되었다. 이들 BMDSC는 비-조혈 조직으로 이동하여, 유지 및 손상된 조직의 재생에 기능할 수 있다. 표 1에 요약한 것처럼, 생물학적 활성 측면 뿐만 아니라 이들 활성의 분자적 근간 측면에서 BMDSC와 전이성 암세포 사이의 놀라운 유사성이 있다.

표 1. 골수 유래 줄기세포와 전이성 암 세포의 유사성

BMDSC 및 전이성 암세포는 자가-갱신, 이동 및 조직 침투 능력이 있다. 특정 암세포는 공지된 줄기세포 마커를 발현한다. 예컨대, c-kit는 중증 난소암, 고환암, 악성 흑색종 및 소세포 폐암에서 강하게 발현된다. CD34는 피부섬유육종, 상피형 육종 및 고립 섬유성 종양에서 발현된다. 또한, 모든 타입의 암세포는 텔로머레이즈 양성인 줄기세포와 동일하게 텔로미어 유지력을 가진다. BMDSC는 특정 케모카인 수용체를 발현하며 케모카인-리간드 상호작용에 의해 결론에 다다른다.

흥미롭게, 동일한 케모카인-리간드 쌍이 BMDSC 및 악성 세포의 전이 회귀에 참여한다. 잘 분화되지 않은 암은 통상 매우 전이적이지만 방사능요법에 보다 민감해진다는 것은 잘 알려져 있는 현상이다. 이러한 현상은 문헌들에서 충분히 설명되어 있지 않지만, 방사능에 매우 민감한 BMDSC와 주목할만한 유사성을 나타낸다. 실제, 방사능에 대한 이러한 민감성은 골수 억제의 기초가 된다. 종합하면, 암 세포는 BMDSC로부터 이러한 특성들을 획득할 수 있다. 실제, 최근 결과들은, 골수 유래 세포가 만성적인 헬리코박터 감염 상태의 마우스에서 위암이 될 수 있다는 것을 입증하였다. 게다가, 공여 세포로부터 유래된 인간 피부암이 신장 이식 수여체에서 관찰된다는 보고가 있다.

본 발명자들은 BMDSC 및 "변형된" 세포 사이의 융합 현상이 암세포 이동을 초래한다고 과거에 제시하였다. 전술한 바와 같이, 융합은 수많은 유기체의 생명에서 기본적인 현상이다. 세포내 소포체 융합은 기본적인 세포 기능에 필연적이다. 외피보유 바이러스는 바이러스 캡시드를 막 융합을 통해 세포질로 전달한다. 효모에서부터 인간에까지, 생명은 융합으로 시작된다. 세포-세포 융합은 근육, 골 및 태반의 발생 동안에 정상적인 생물학적 과정의 한 부분이다. 일찍이 1911년에, 악성은 백혈구와 체세포 간의 혼성화(hybridization)의 결과일 수 있는 것으로 제시되었다. 또한, 포유류 체세포가 공동 배양된 정자를 취득하였을 때, 및/또는 인 시츄 정자의 실험적으로 유도된 침투를 통해, 발암성 형질전환이 이루어지는 것으로, 연구를 통해 확인되었다. 장기간 유지된 가설은 종양 세포와 림프구의 혼성화로 전이성 세포가 생긴다는 것이다. 그러나, 본 발명 이전에, 누구도 악성 형질전환이 BMDSC와 "변형된" 전암성 조직 세포의 융합 결과인 것으로 설명하거나 제시한 바 없었다.

줄기세포는 자발적인 세포 융합에 의해 다른 세포의 표현형을 습득할 수 있다. 여러가지 실험을 통해, BMDSC가 다양한 타겟 세포와 융합하는 것으로 입증되었다. 세포 융합 현상을 검출하기 위한 Cre/lox 재조합을 기초로하는 방법을 이용하여, Alvarez-Dolado et al. (Nature 425, 968-973 [2003])은, 골수 유래 세포가 간의 간세포, 뇌에서 푸르키니에 신경원(Purkinje neuron) 및 심장에서의 심근과 생체내에서 융합하여, 다핵 세포가 형성되는 것을 입증하였다. 일련의 골수 유래 간세포 이식을 통해, 세포 융합이 골수 유래 간세포의 주된 소스라는 것을 Wang et al. (Nature 422, 897-901[2003])이 입증하였다. 암컷 공여 마우스에서 수컷 수여체로 이식된 간세포의 세포 유전학적 분석으로, 이배체에서 이배체 융합(80, XXXY) 및 이배체에서 삼배체 융합(120, XXXXYY) 핵형을 입증하였다. 이론상, 융합은 정상적인 전암성 세포들 간에 여러 번 이루어질 수 있지만, 본 발명은 발암의 중요한 단계로 "변형된" 전암성 조직 세포와 BMDSC 사이의 융합을 포함한다. BMDSC와의 여러번의 융합이 있을 수 있으며, 그로 인해 융합이 발생된 이후에 사배체 이상의 핵형을 유도할 수 있다.

변형된 조직 세포와의 융합 이후에, 줄기세포의 정상적인 자가-갱신 및 분화는 변형된 세포로부터 유래된 비정상적인 신호에 의해 파괴되는 것으로 생각된다. 줄기세포가 돌연변이를 축적하여 형질전환됨을 제시하는 발암의 다른 줄기세포 모델과 반대로, 본 발명은 줄기세포가 분화된 세포 보다 DNA 손상에 대해 낮은 허용성을 가진다는 연구에 동의한다. 줄기세포는 다능성 분화 잠재력을 유지하기 위해 DNA 손상에 더욱 민감해져야 한다. BMDSC가 성숙한 세포 보다 방사능에 더욱 민감하다는 것은 의심의 여지가 없다. 이러한 사실은 임상적인 골수 제거의 근거이다. 또한, 조직 줄기세포가 DNA 손상 제제에 의한 사멸에 더욱 민감하다는 결과도 있다. 장음와(intenstinal crypt) 줄기세포의 세포자살율은 방사능 또는 세포독성 제제 노출에 의해 현저하게 증가되었다. 따라서, 줄기세포 보다는 조직 세포가 유전자 및 유전자외 장애를 축적할 것이 틀림없다. BMDSC와의 융합 이후에, 딸 세포는 형질전환되어 악성 종양이 된다.

염색체 비정상성은 100년 이상 동안 암의 뚜렷한 병리학적 특징들 중 하나로서 규명되었다. 이배수성은 거의 모든 고형 인간 암에서 관찰되었다. 또한, 임상 데이타는, 이배수성 정도가 질병의 중증도와 상호 관련 있음을 시사한다. 암의 이배수성 가설은 발암에서의 이배수성의 중요성을 강조하였지만, 이배수성의 근본 메카니즘은 명확하지 않다. 본원에 언급된 발암의 줄기세포 융합 모델에서, 이배수성은 개별 염색체 카피를 감소시키는 세포 융합의 필연적인 결과이다. 발암의 제안된 줄기세포 융합 모델에 대한 조기의 직접적인 적용을 통해, 전립선 암세포에서 과염색체(hyperchromasia)는 정상적인 전립선 상피 세포와 주입한 정자와의 예정된 융합의 결과일 수 있는 것으로, 실험으로 입증되었다. 게다가, 특정 인간 전암성 병변에서 바렛 식도, 궤양성 대장염 및 HPV-양성 비전형 경부 편평 세포와 같은, 사배체 세포의 빈도가 증가되는 것으로 나타났다. DNA 배수성 분석으로, 대부분의 이배수성 인간 전립선 암이 사배체인 것으로 입증되었다. 이러한 증거는, 암의 이배수성이 사배체화 현상(즉, 융합)으로부터 생긴다는 것을 나타낸다.

만성적인 조직 상해, 염증 및 암 사이의 관계가 오랜 기간동안 관찰되어 왔다. 이러한 관계의 기본적인 분자 및 세포 기작에 대한 수많은 우수한 연구와 검토들이 있다. 본 발명자의 조직 복구와 발암 사이의 상호관계 해석은 다음과 같다. 만성적인 조직 상해, 염증 및 이후의 조직 회복은 국소 조직 줄기세포의 재생 능력을 소진시킨다. 국소 염증 미세환경은 이후 BMDSC의 회귀 및 이들의 조직 회복 참여에 우호적이다. BMDSC는 "변형된" 조직 세포와 때때로 융합되어 악성 형질전환된다.

신속한 갱신 과정을 정상적으로 경험하는 조직은 높은 턴오버율로서 암 발생 증가를 겪을 것으로 예상되며, 그 결과 국소 조직 줄기세포를 소모시키고 BMDSC를 침윤시켜야 한다. 정말로, 환경 공격에 계속적으로 노출되고 늘 갱신 상태로 있는 피부, 폐 및 위장관의 상피는, 암 발생 비율이 높은 조직이다. 동일한 연구에서 골수 유래 세포와 급박한 손상이 있는 피부 표피 세포 사이의 융합 존재가 배제되었지만, 상처 치유 기간 동안의 골수 유래 각질세포의 생착 증가는 성이 다른 골수 이식 마우스에서 입증되었다. 헬리코박터 감염은 위암 발생에 있어 중요한 유인 인자이다. 만성적인 조직 손상 및 진행중인 조직 회복은 위에서의 상피세포 증식과 세포자살의 균형을 형성한다. 실제로, 골수 유래 세포가 헬리코박터 감염 마우스에서 위암의 소스인 것으로, 근래 보고되었다.

노화는 가장 큰 암 발생 위험 요인이다. 암의 연령 분포 분석으로 초기 발암 다단계 이론이 생겨났다. 이후에, 유전자 돌연변이 가설은 암의 연령 분포가 암 발생에 충분한 다중적인 돌연변이를 축적하는데 필요한 시간을 반영하는 것으로 추정하였다. 그러나, 대안적으로, 노화에 관여하는 메카니즘 역시 줄기세포 기능에 영향을 준다는 것을 설명할 수 있다. 산화적 손상 및 세포 노화는 부적절한 세포-세포 융합 빈도를 증대시키고 악성 발생을 증가시킬 수 있다. 예컨대, 노화된 세포는 조직 갱생 또는 회복, 조직 미세환경을 변형시켜 이후 줄기세포의 활성을 변형시킬 수 있는 별개 인자를 초래한다. 또한, 줄기세포는 그 자체가 노화 관련 손상의 직접적인 타겟이다. 모발의 백화가 멜라노사이트 줄기세포의 자가-유지 결함에 의해 유발되는 것으로 입증되었다. 장 상피 줄기세포는 노화에 따라 중요한 기능 손상을 겪는 것으로 입증되었다. HSC의 노화 및 기능 부전은 백혈병 발생에 허용적인 조건을 형성할 수 있다. 따라서, 발암의 시간적 역학은 노화 진행 동안에 세포-세포 상호작용을 반영할 수 있다.

다른 조건이 세포-세포 융합을 부여할 수 있으며, 그 결과 조직 리모델링 및 바이러스 감염을 포함한 암 발생을 증가시킬 수 있다. 여성에서의 유방암 및 난소암과 만성 간염 이후의 간세포성 간암의 높은 발생율은, 조직 리모델링이 악성 형질전환을 촉진시키는 예일 수 있다. 엡스타인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus (EBV))는 버킷 림프종, 비-홉킨스 림프종, 홉킨스 질환, 비인두암, 위 선암종 및 유방암을 포함한 다양한 암과 관련있는 것으로 입증되었다. 초기 연구에서, EBV가 특히 종양으로부터 분리된 바이러스가 세포-세포 융합을 유도하는 것으로 입증되었다. 이들 데이타와 관련하여, 본 발명자들의 발암의 줄기세포 융합 모델은 EBV가 그렇게 많은 암과 관련된 이유를 설명할 수 있었다.

본 발명의 발암의 줄기세포 융합 모델은 쉽게 테스트할 수 있다. 이에, 본 발명자들은 여러가지 실험을 수행하였다. 양성 종양 세포와 BMDSC 사이의 융합을 시험관 내에서 수행하였다. 융합 후, 형태 및 전이와 침투 능력을 시험관 내와 생체내에서 결정하였다. 또한, 융합의 증거는, 성이 다른 골수 또는 형질전환 골수를 받은 마우스에서의 자발적인 고형 종양 발생 실험을 통해 입증할 수 있다. 그러나, 잉여 성 염색체는 종종 융합되었을 때 딸 세포에서 소실되기 때문에, 형광 인 시츄 혼성화(FISH)와 같이 성 염색체를 검출하기 위해 광범위로 사용되는 기법은 적절하지 않을 수 있다. 실제, 정상 암컷에서 생긴 상당한 수의 악성 종양은 성-염색질 음성으로 되며, 이는 잉의의 제2 X 염색체 소실을 시사한다. 형질전이된 DNA 종의 존재를 검출하는 방법 또는 공여체 유래의 미토콘드리아 DNA의 존재를 검출하는 방법이 적합할 수 있다. 마지막으로, 후기 발생 종양을 가진 이전의 골수 수여체로부터 취한 샘플을 조사함으로써, 회고적 연구를 수행할 수 있다. 성 염색체를 검출하는 FISH 방법 보다는 공여체 유래 미토콘드리아 DNA의 존재를 검출하는 방법과 같은 기법이, 더욱 유익할 수 있다.

암, 특히 악성 종양의 줄기세포 융합 모델은 암 연구 및 약물 개발 뿐만 아니라 줄기세포의 치료제 적용에 있어 상당한 관련성을 가진다. 악성 세포는 분화를 유도하는 치료제에 감수적일 수 있다. 분화는 자가-갱생 활성을 무력화하고 악성 세포가 전이화되어 조직에 침투하는 능력을 감소시킬 수 있다. 실제, 레티논산 또는 페록시좀 증식자-활성화된 수용체 감마(PPARγ) 작용제와 같은 수종의 분화-유발제는, 각각 급성 골수성 백혈병 또는 지방육종의 성공적인 치료제로 사용되었다. 유전자 전달을 통한 분화 신호의 악성 세포로의 도입은, 암 치료법에 있어 실행가능한 새로운 방법일 수 있다. 또한, 전이성 세포는 BMDSC와 유사한 회귀 패턴을 가질 수 있으며, 따라서 BMDSC 회귀를 차단하는 방법을 이용하여 암 전이를 저해할 수 있다. 이에 부응하여, 최근 연구는 RNA 간섭을 통한 케모카인 수용체 CXCR4의 침묵이 마우스에서 유방암 전이를 차단함을 입증하였다. 암은 그 유전적 특징이 무질서하기 때문에 조절하기 어렵다. 그러나, 암 세포의 BMDSC 유래 악성 특징이 새로운 치료법 고안에 있어 보존적인 타겟으로 존재할 수 있다.

따라서, 암 전이는 호중구, 림프구 및 그외 백혈구를 포함하여 BMDSC와 그 후대와 동일한 보존적인 분자 메카니즘을 이용할 것이다. 이에, 본 발명자들은 호중구, 림프구 및 그외 백혈구의 생체내 이동성과 삼출을 차단할 수 있는 유비퀴틴 항체가 암 세포의 이동 및 삼출을 차단하여 전이를 차단하는 지를, 실험하였다. 또한, 종양에서 BMDSC/변형된 세포의 존재를 결정하는 것은 줄기세포를 이용한 치료법의 가능성있는 의도되지 않은 결론으로 연구자들의 주의를 환기시킬 수 있다(즉, 줄기세포의 부적절한 투여는 악성 발생을 실제 증가시킬 수 있다).

만성 조직 손상 및 이후의 복구는 조직 줄기세포를 소거시키고 BMDSC를 보충하며, 따라서 BMDSC와 조직 세포의 융합 기회를 증가시킨다. 노화, 바이러스 감염 및 조직 리모델링과 같은 그외 인자 역시 세포 융합 발생을 강화시킨다. 중요한 점은, 하나의 융합 단계는 복수의 돌연변이 없이도 다수의 "악성" 특징들이 "변형된" 세포를 형질전환시킬 수 있도록 한다는 점이다.

종양 세포 및 비-종양 세포의 융합 및 종양 형성 효과와 관련된 수백건의 연구들이 수행되었지만, 골수 유래 줄기세포 및 종양 세포의 융합에 대한 연구는 본 발명 이전에 과학 문헌들에선 찾아볼 수 없었다.

따라서, 본 발명의 제1 예는, (a) 골수 유래 줄기세포를 제공하는 단계; (b) 유전적으로 변형된 세포를 제공하는 단계; (c) 골수 유래 줄기세포를 유전적으로 변형된 세포와 융합하여 융합 세포를 만드는 단계; 및 (d) 융합 세포의 이동 표시자를 측정하는 단계를 포함하는, 암 세포 이동을 모델링하는 방법을 포함한다. BMDSC 및 유전적으로 변형된 세포 둘다 상업적이고 학술적인 조직 배양물 및 살아있는 소스로부터 쉽게 입수가능하다. 이처럼, 세포 융합은 수많은 프로토콜을 이용할 수 있어 통상적으로 실행한다(예, 하이브리도마 프로토콜은 protocol-online.org. 참조). 융합된 세포(및 이의 후대)의 이동 표시자 측정 단계는 시험관 내 "스크래치 분석(scratch assay)"(예, Lal A, Glazer CA, Martinson HM, et al. Cancer Res 2002, 62:3335-3340) 또는 생체내 동물 연구(예, 하나 이상의 융합 세포를 포함한 종양 세포의 주입 및 하기 실시예에 언급된 바와 같은 전이 모니터링)를 통해 수행할 수 있다.

또한, 본 발명은 생체내 또는 시험관 내에서 생물학적 제제 또는 화학적 제제의 종양 세포 이동 효과를 스크리닝하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 골수 유래 줄기세포와 유전적으로 변형된 세포의 융합으로부터 유래된 융합 세포를 제공하는 단계; 상기 융합된 세포에 생물학적 제제 또는 화학제와 접촉시키는 단계; 및 종양 세포 이동이 촉진, 저해 또는 무변화인지를 결정하는 단계를 포함한다. 보존적인 단백질은 상기 제제의 이동에 있어 효과를 스크리닝하기 위한 특히 좋은 타겟일 것이다.

유비퀴틴(ub)은 자연계에서 발견되는 가장 보존적인 단백질이다. 이의 76개의 아미노산 서열은, 곤충, 송어 및 인간처럼 진화적으로 다양한 종들간의 완벽한 상동성을 보인다. 유비퀴틴은 수종의 다른 막 수용체의 외부 표면 도메인 부분을 이룬다. 림프구 회귀 리셉터(LHR)의 경우에, ub의 존재는 림프절을 통한 림프구의 결합 및 이동을 용이하게 하는 LHR 기능과 밀접하게 관련되어 있다. ub에 연결된 것으로 확인된 수용체 모두 세포 이동성을 매개하는 것으로도 알려져 있다. 이러한 사실에 대한 가능성있는 설명은, ub가 세포외 기질을 통한 세포 이동을 매개하는데 참여한다는 것이다. 이러한 잠재적인 ub 기능은 세포 분화, 기생충 감염, 종양 침투 및 종양 세포 전이와 같은 수많은 진핵생물의 프로세스 연구와 중요한 관련성을 가진다.

따라서, 예로, 생물학적 제제 또는 화학적 제제는 MEL-14 (CD62L) (Abcam Plc., Zymed Laboratories, et al.; abcam.com, 유비퀴틴에 대한 21종의 여러가지 항체)와 같은 유비퀴틴에 대한 항체이다. 이 항체에 접촉되는 세포는 스크래치 분석하거나 또는 동물 실험에 사용하여, 후술한 바와 같이 세포 이동에서의 항체 효과를 결정한다.

본 발명의 다른 예는, 유비퀴틴에 대한 항체를 유효량으로 종양 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는, 종양 세포 이동을 저해하는 방법을 포함한다. 바람직하기로는 상기 예는 종양 세포를 항체와 접촉시키기 전에 종양 세포에서 융합된 세포의 존재를 확인하는 단계를 포함하며, 그로 인해 상기한 저해는 악성 가능성이 더 큰 종양을 타겟화할 수 있다.

종양 세포 샘플이 1종 이상의 사배체 DNA 및 1종 이상의 골수 유래 줄기세포에 특이적인 세포 표면 마커를 가진 세포를 함유하는지는 결정할 수 있다. 상기한 표면 세포 마커로는 c-kit, CD34 및 CD133와 CXCR4와 같은 케모카인 수용체가 있다. 또한, Cre/lox 재조합을 이용하여 골수 유래 줄기세포 및 비-줄기세포의 융합을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

도 1은 골수 유래 줄기세포와 "변형된" 조직 세포의 융합에 의해 매개되는 악성 형질전환을 예시한 것이다.

비제한적인 실시예들

본 발명에 사용되는 실험 기법들은 잘 확립되어 있으며, 널리 사용되고 있다.

본 첫번째 연구의 목표는 골수 유래 줄기세포 및 형질전환된 세포의 상호 작용이 종양 진행을 변형시킬 수 있다는, 이전에 제안된 발암 가설을 조사하는 것이다. 두가지 유형의 실험을 수행할 수 있다. 실험의 첫번째 세트로, 마우스 골수 유래 세포를 형질전환에 의해 eGFP를 발현하는 마우스로부터 분리하고, 혼성 세포 형성을 촉진시키는 조건하에서 클론텍의 레드 형광 단백질로 표지된 형질전환된 인간 및 마우스 세포에 일시적으로 형질감염시킨다. 이러한 혼성 세포는 테스트중인 세포주에 적합한 마우스 종에 주입한다.

원발성 또는 전이성 종양 성장의 변형은 시간에 따라 모니터링한다. 본 실험에 의해 확인할 2가지 기본적인 의문은, 종양 진행이 다양한 형질전환 단계에서의 골수 유래 줄기세포와 종양 세포의 융합에 의해 매개되는지, 그리고 인간 또는 마우스 이종 이식편에 수용체에 대한 항체를 처리하는 것이 상기 이종 종양의 전이 표현형을 변형시킬 것인 지이다. 이러한 가설들을 조사하기 위한 모델로 제공되는 대표적인 수용체는 CXCR4이며, 이는 전이성 종양 세포에서 발현된다.

형질전환된 마우스(308, 308 10Gy5, 또는 4T1) 및 인간(DU145 또는 PC-3 M) 세포주의 투여에 대한 숙주 면역 반응이 최소화되도록, 유방암, 피부암 및 전립선암에 대해 잘 확립된 모델 시스템인, 흉선이 없는 누드 마우스 Balb/c 또는 SCID에서의 종양 성장과 진행에 대해 잘 확립되어 있는 이종이식 모델을 사용하여야만 한다. 마우스 세포주를 흉선이 없는 누드 마우스에 투여하기 위해, 피하 접종 또는 꼬리 정맥 주사를 이용한다. 인간 세포주를 SCID 마우스에 투여한다. 세포주를 단독으로 또는 조합된 분획을 0일째에 주사하고, 이후 최대 40일 동안 종양을 증식시킨다. 이후에 마우스를 치사시키고, 조직을 적출한 다음. 종양 체적과 상대적인 폐 전이율을 정량한다.

실시예 1.

그룹 A: 8 형질전환 마우스

이형접합성 형질전환 eGFP 마우스[C57BL/6-TgN(ACTbEGFP)lOsb](Jackson Laboratory)를 GFP 표지된 골수 세포의 소스로 사용한다. GFP 마우스는 UV 광에서 그린 형광물질의 발현에 의해 식별한다. 2달 내지 4달된 웅성 이형접합체를 BMT에 대한 공여체로서 사용한다. 공여체의 성은 수여체 숙주의 성과 다르다.

골수 유래 세포는 이형접합성 GFP 마우스로부터 한스 밸런스 용액으로 대퇴골과 경골을 수세하여 수득한다. 체세포 혼성을 만들기 위해, 10⁶ 골수 유래 세포와 10⁶ 종양 세포를 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 처리하기 전에 24시간 동안 60 mm 디쉬에 둔다. 121℃에서 5분간 자동멸균하여, 분자량 3000-3700의 PEG 5 g을 준비하였다. 자동멸균한 PEG는 37℃로 미리 데운 2x 멸균 혈청 무첨가 배지 5 ml와 혼합하여, 50% 용액을 준비하였다. 디쉬 당 50% PEG 1 ml을 공-배양한 세포에 서서히 첨가한 다음, 37℃에서 1분간 세포를 배양하였다.

이후, 혈청 무첨가 배지 1 ml을 첨가하고, 1분 더 배양하였다. 다시 배지 2 ml을 첨가하여 2분 더 배양하였다. 혈청 무첨가 배지 4 ml을 첨가하여 4분간 배양하였다. 혈청이 함유된 배지를 각 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 48시간 배양하였다. 2일 후, 각 디쉬에 트립신을 처리하고, 선별하기 위해 4개의 100 mm 플레이트에 다시 접종하였다. 공배양한 세포의 2가지 타입에 특징적인 마커를 발현하는 세포를 선별하고, 90% 컨플루언스로 배양한 다음, 이후 실험에 사용한다.

실시예 2: 마우스 및 인간 양성 종양 세포의 발암성 및 진행 변형

마우스에, GFP 표지된 골수 세포를 단독으로 또는 형질전환된 양성 인간 또는 마우스 세포와 조합하여 접종한다.

그룹 A: 마우스 72마리, 균주: 흉선이 없는 누드 마우스, 308 세포; SCID, DU145 또는 PC-3 M 종양(통증 카테로리 D). 필요한 마우스 총 수: (4마리 마우스/처리)(6회 처리)(3회 실험) = 마우스 72마리.

마우스에 GFP 표지된 골수(BM) 유래 세포 및/또는 형질전환된 양성 인간 또는 마우스 세포를 접종한다. 종양 접종은 벨 자(bell jar)에서 이소플루오란으로 마취시킨 마우스에 대해 수행한다. 마우스는 폴리프로필렌 원심분리 튜브 내부에 이소플루오란이 처리된 코튼볼이 있는 용기에 둔다. 시술하는 동안, 호흡율, 운동성, 근육 이완 및 유동 운동(directed movement) 결핍을 관찰함으로써, 마우스를 모니터링한다. 접종한 후, 마우스는 케이지에 다시 넣고, 정상적인 의식을 찾을 때까지 모니터링한다.

5 X 10⁵ 세포가 함유된 PBS 100 ㎕를 각 마우스에 투여한다. 비흉선 마우스에 308 세포, BM 세포 또는 BM 세포와 308 세포의 PEG 처리한 혼합물을 처리한다. 접종은 피하로 투여하거나 꼬리 정맥 주사에 의해 투여한다. 꼬리 정맥으로 감염시킨 마우스는, 규제 박스에 가두어 둔다. 꼬리를 알콜로 소독한 다음, 2% 자일로카인을 국소 마취제로 적용한다. 각 마우스에 25-30 게이지 바늘을 이용하여 용액을 200 ㎕ 이하로 주사한다. 주사로 인해 괴사가 발생되면, 꼬리에 에틸 클로라이드를 뿌리고, 베타딘에 담근 다음, 괴사 영역 바로 위를 멸균 가위로 제거한다. 이후, 출혈을 멈추게 하기 위해 질산은으로 꼬리를 소작한다.

종양 증식은 캘리퍼 측정으로 2주일 마다 종양의 부피를 모니터링하고, 식 :부피 = ½(길이)(길이²)으로 부피를 계산한다. 2, 3 및 4주에 동물을 희생시키고, 형성된 전이 범위와 종양 부피를 모니터링한다.

공기가 통하지 않는 챔버에서 종양과 장기를 적출하기 위해, 이산화탄소 질식에 의해 동물을 희생시킨다. 이러한 방법은 통증을 최소화시키는 통상적인 마우스 안락사 과정이며, 안락사에 대한 AVMA 패널에 권고되어 있다.

시술의 개략적인 개요

1. 형질전환 양성 세포 및 줄기세포의 혼합물을 피하 또는 꼬리 정맥 주사에 의해 투여하여, 308 및 DU145 이식편을 만든다.

2. 각 주사 방법에 대한 처리 그룹 - (6): 308 세포; BM 세포; BM 세포 + 308 세포의 PEG 처리한 혼합물; DU145; BM 세포, PEG 처리된 DU145와 BM 세포 혼합물.

3. 이산화탄소 질식으로 마우스를 희생시킨 후, 발생되는 원발성 종양과 전이된 장기를 적출한다.

4. 융합 현상과 관련된 진행 변형 또는 전이 형성을 검출하기 위해, 종양 샘플을 조직병리학적으로 분석한다. 조직병리 분석은 시간에 따른 종양 증식 비교, 상대적인 전이 갯수 및 크기, 종양의 조직학적 특징을 포함하여야 한다.

실시예 3: 발암성 또는 진행의 저해

마우스에, 형질전환된 전이성 인간(PC3-M) 또는 마우스(308 10Gy5 또는 4T1) 세포와, CRCX4 수용체 저해제를 접종한다. 필요한 마우스의 총 수: (4마리 마우스/처리)(3회 처리)(투여시점 3번)(3회 실험) = 마우스 108마리.

종양 접종은 벨 자(bell jar)에서 이소플루오란으로 마취시킨 마우스를 대상으로 수행한다. 마우스는 폴리프로필렌 원심분리 튜브 내부에 이소플루오란이 처리된 코튼볼이 있는 용기에 둔다. 시술하는 동안, 호흡율, 운동성, 근육 이완 및 유동 운동(directed movement) 결핍을 관찰함으로써, 마우스를 모니터링한다. 접종한 후, 마우스는 케이지에 다시 넣고, 정상적인 의식을 찾을 때까지 모니터링한다.

10⁴ 4T1세포가 함유된 PBS 100 ㎕를 4 Balb/c 마우스의 유방 지방 패드(mammary fat pad)에 주사한다. 비흉선 마우스에는 1 X 10⁶ 308 10Gy5 세포를 함유하는 PBS 100 ㎕를 처리한다. SCID 마우스에는 1 X 10⁶ PC-3M 세포를 함유하는 PBS 100 ㎕를 처리한다. 종양 세포를 접종하기 전에, 동시에 및 접종한 후에, CRCX4 수용체에 대한 항체를 투여한다. 4T1 세포는 Balb/c 유방 지방 패드에 주사한다. 308 10Gy5는 누드 마우스의 꼬리에 주사하고, PC-3 M 세포는 SCID 마우스의 꼬리 정맥에 주사한다. 꼬리 정맥으로 주사한 마우스는 주사하는 동안 규제 박스에 가두어 둔다. 꼬리를 알콜로 소독한 다음, 2% 자일로카인을 국소 마취제로 적용하며, 각 마우스에 25-30 게이지 바늘을 이용하여 용액을 200 ㎕ 이하로 주사한다. 주사로 인해 괴사가 생기면, 꼬리에 에틸 클로라이드를 뿌리고, 베타딘에 담근 다음, 괴사 영역 바로 위를 멸균 가위로 제거한다. 이후, 출혈을 멈추게 하기 위해 질산은으로 꼬리를 소작한다.

종양 증식은 캘리퍼 측정으로 2주일 마다 종양의 부피를 모니터링하고, 식 :부피 = ½(길이)(길이²)으로 부피를 계산한다. 10, 15 및 20일에 동물을 죽이고, 폐 전이 및 종양 부피를 모니터링한다.

동물은, 가능성 있는 전이 저해제를 접종하기 전에 또는 접종한 후에 모니터링하고, 종양 세포의 세포자살, 분화, 전이 저해에 있어 변형을 분석한다.

숙주 마우스에서 진행된 원발성 종양과 전이 부분을 이산화탄소 질식에 의해 마우스를 죽인 후 적출한다.

처리와 관련된 진행 또는 전이화에 대한 변형을 검출하기 위해, 종양 샘플을 조직병리학적으로 분석한다. 조직병리 분석은 시간에 따른 종양 증식 비교, 상대적인 전이 갯수 및 크기, 종양의 조직학적 특징을 포함하여야 한다.

시험관 내 암세포/융합 세포 이동 저해 분석:

세포: 2종의 전이성 암 세포주를 이용하여, 세포 이동성을 저해하는 유비퀴틴 항체의 능력을 테스트하였다. PC-3M은 인간 전립선 악성 암세포주이다. 4T1은 마우스의 유방 악성 암세포주이다. 둘다 10% FBS 및 글루타맥스 1이 보충된 DMEM 배지(DMEM 배지)에서 유지시켰다.

항체: 3종의 유비퀴틴 항체를 사용하였다. 14372는 유비퀴틴에 대한 다클론 항체이다. 10C2-2 및 Mel-14 는 둘다 유비퀴틴에 대한 단일클론 항체이다.

과정(1) : 각 웰에 멸균 커버슬립이 있는 6-웰 플레이트에, DMEM 배지 중에 1x10⁶ 세포/웰을 접종하고, 37℃ 및 5% 이산화탄소의 습윤 인큐베이터(표준 조건)에서 배양하였다.

다음날, 커버슬립 상의 컨플루언트 단일층을 파이펫 팁으로 한번 긁었다. 배지를 흡입 제거하고, 웰을 DMEM 배지 1 ml로 헹구었다. 각 세포주에 각 항체를 3가지 농도로 처리하였다: 5 ㎍/mL/10⁶ 세포, 25 ㎍/mL/10⁶ 세포 및 100 ㎍/mL/10⁶ 세포. 플레이트는 세포와 함께 11시간 동안 인큐베이션하였다. 대조군 세포는 DPBS를 처리하였다.

인큐베이션한 다음 세포 이동의 결과로서 스크래치 종결에 대해 커버슬립을 조사하였다. 커버슬립을 고정하고 20℃에서 5분간 1:1 메탄올:아세톤으로 염색한 다음 DPBS로 헹구었다. 커버슬립을 글라스 슬라이드 위에 두었다. 니콘 RE2000 현미경으로 구성된 워크스테이션을 이용하여 4X 비율로 메타캄 소프트웨어로 이미지를 포착하였다.

생체내 암세포/융합 세포의 이동 저해 분석:

세포: 전이성 마우스 유방 악성종양 세포주, 4T1을 이용하여, 전이를 저해하는 유비퀴틴 항체의 능력을 테스트하였다. 세포는 상기 프로토콜에 기재된 배양 조건하에서 DMEM 배지에서 유지시켰다.

항체: 단일클론 유비퀴틴 항체 Mel-14를 사용하였다.

과정: 강화된 그린 형광 단백질(eGFP)에 대한 발현 벡터를 4T1 세포에 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염한지 48시간 후에 세포를 수확하고, DPBS 중의 10⁶ 세포 당 180 ㎍ 농도로 유비퀴틴 항체 Mel-14 또는 대조군 항체 Rat IgG2A 중 어느 하나와 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 다음, SCID 마우스의 꼬리 정맥에 총 부피 50 ㎕으로 250,000개의 세포를 주사하였다. 1주일 후, 마우스를 죽인 다음, 폐를 적출하여 4% 포르말린에 고정하였다. 전이성 콜로니의 존재를, Nikon Eclipse 600 현미경으로 10X 배율로 전체 편평 폐에서 조사하였다. 폐에서의 EGFP 양성 세포의 존재는, 전이가 이루어졌음을 의미한다.

결과:

표 2

다양한 농도의 유비퀴틴 항체에 의한 PC3M 세포의 시험관 내 이동 저해 정도

(++++ = 완벽 저해; - = 저해 없음)

표 3

다양한 농도의 유비퀴틴 항체에 의한 4T1 세포의 시험관 내 이동 저해 정도

(++++ = 완벽 저해; - = 저해 없음)

표 4

유비퀴틴 항체, Mel-14에 의한 4T1 세포의 생체내 전이 저해 정도

(++++ = 완벽 저해; - = 저해 없음)

참조 문헌:

1. Auerbach R, Lewis R, Shinners B, Kubal L, Akhtar N. "Angiogenesis Assays: A Critical Overview" Clinical Chemistry 49 (1), 1 Jan. 2003:32-40.

상기 표에서 알 수 있는 바와 같이, 유비퀴틴 항체는 종양 세포의 이동을 저해하였다.

치료 방법

본 발명의 방법은 개체에서 종양 이동을 저해하기 위해 사용할 수 있다. 척추동물 개체, 바람직하기로는 포유류, 더 바람직하기로는 인간에게 종양 세포 이동을 저해하는 유효량의 화합물을 투여한다. 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 바람직하기로는 약제학적 조성물의 형태로 투여된다.

화합물의 투여량은 바람직하기로는 유효량의 항체 또는 그외 제제를 포함하는 약제학적 투여 단위를 포함한다. 유효량은, 질병의 임의 관련 매개변수의 측정가능한 감소를 유발하는, 생체내 안정 상태 농도(steady state concentration)를 형성하는데 충분한 양을 의미한다.

단일클론 항체는 현재 환자에 직접적으로 융합에 의한 치료법으로 사용되고 있다. 항체는 물이나 염수로 재구성하기 전까지 동결건조하여 보관할 수 있다. 항체를 이용한 치료법에서 전형적이고 안전한 인간 투여량은 투여량 4 mg/kg 체중이다. 예컨대, 이는 유방암 항체 치료제 허셉틴(Herceptin)의 유효량이다. 즉, 본 발명의 일 예에 따라, 인간 환자에게 4 mg 항-유비퀴틴 항체/kg 체중으로 정맥내로 주입된다.

투여되는 활성 화합물의 양은 명확한 생물학적 제제 또는 화학적 제제, 질병 또는 상태, 투여 경로, 수여체의 건강과 체중, 그외 병용 처리제의 존재, 가능하다면 처리 빈도, 원하는 효과의 특성, 예컨대 종양 전이의 저해 및 숙련자의 평가에 따라 결정된다.

전술한 조성물 및 치료 방법은 바람직하지 않은 세포의 침투, 증식 및 전이와 관련있는 임의 질환이나 상태를 가진 개체에게서, 세포 이동(예, 침투 또는 전이)을 저해하는데 유용하다.

첨부된 청구항과 등가의 의미 및 범위내에서 다양한 변형을 가할 수 있다.

Claims (17)

1. 인간 이외의 대상에서 암세포 이동을 측정하는 방법으로서,
   (a) 골수 유래 줄기세포를 제공하는 단계;
   (b) 개시된 전암성 세포를 제공하는 단계;
   (c) 상기 골수 유래 줄기세포와 상기 개시된 전암성 세포를 융합하여 융합된 세포를 만드는 단계; 및
   (d) 상기 융합된 세포의 이동을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)는 골수 유래 줄기세포와 개시된 전암성 세포의 사전 융합으로부터 융합된 세포를 수득하는 단계 또는 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
3. 인간 이외의 대상에서 종양 세포 이동에 대한 생물학적 제제 또는 화학적 제제의 효과를 스크리닝하는 방법으로서,
   (a) 골수 유래 줄기 세포와 개시된 전암성 세포의 융합으로부터 유도되는 융합 세포를 제공하는 단계;
   (b) 상기 융합 세포를 생물학적 제제 또는 화학적 제제와 접촉시키는 단계; 및
   (c) 종양 세포의 이동이 촉진되는지, 저해되는지 또는 변화가 없는지를 결정하는 단계를 포함하는, 종양 세포 이동에 대한 생물학적 제제 또는 화학적 제제의 효과를 스크리닝하는 방법.
4. 제 3항에 있어서, 단계 (a)는 개시된 전암성 피부 세포, 유방 세포 또는 전립선 세포를 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
5. 제3항에 있어서, 단계 (a)는 암 또는 암 세포주로부터 개시된 전암성 세포를 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
6. 시험관 내(in vitro)에서 암세포 이동을 측정하는 방법으로서,
   (a) 골수 유래 줄기세포를 제공하는 단계;
   (b) 개시된 전암성 세포를 제공하는 단계;
   (c) 상기 골수 유래 줄기세포와 상기 개시된 전암성 세포를 융합하여 융합된 세포를 만드는 단계; 및
   (d) 상기 융합된 세포의 이동을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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