CN101760452B - 一种胚胎干细胞和肿瘤细胞的杂合细胞系及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种胚胎干细胞和肿瘤细胞的杂合细胞系，以及该细胞系的构建方法和应用。本发明提供的胚胎干细胞和肿瘤细胞的杂合细胞系通过胚胎干细胞和肿瘤细胞融合获得，其构建方法包括以下步骤：A)分别构建胚胎干细胞和肿瘤细胞的单克隆细胞株；B)胚胎干细胞和肿瘤细胞的单克隆细胞株融合。本发明提供的细胞系可用于构建肿瘤细胞模型。本发明提供的杂合细胞，为进一步研究肿瘤的发生和恶化提供了一种全新的模型，使用本发明提供的方法，可以构建新的杂合细胞模型，从而从全新的角度研究肿瘤表观遗传学，对未来的临床治疗提供理论和应用基础，将会全面推动肿瘤的基础研究。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及胚胎干细胞，更具体地说，涉及一种胚胎干细胞和肿瘤细胞的杂合细胞系及其构建方法。
背景技术
胚胎干细胞是来自于囊胚内细胞团的多能性细胞。近年来研究者发现，胚胎干细胞可以通过细胞融合改变成体细胞的表观遗传学特性。体细胞和胚胎来源的细胞融合重新编程的关键在于通过细胞融合，体细胞核内的物质可以有效地和胚胎来源细胞核内的物质进行动态的相互影响，在此过程中，胚胎来源干细胞有效的改变体细胞的基因表达核染色体结构，使其恢复到未分化的状态。研究显示畸胎瘤细胞，胚胎干细胞(ES cells)和胚胎生殖细胞(EG cells)等都有相应的重新编程体细胞的能力。
但尚未见有胚胎干细胞和肿瘤细胞形成的杂合细胞系的报道，因此，胚胎干细胞是否可以通过细胞融合改变肿瘤细胞的表观遗传学特性也未知。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种胚胎干细胞和肿瘤细胞的杂合细胞系，以提供一种研究肿瘤细胞的新的模型。
本发明还有一个目的在于，提供一种胚胎干细胞和肿瘤细胞的杂合细胞系的构建方法。
本发明还有一个目的在于，提供一种胚胎干细胞和肿瘤细胞的杂合细胞系的应用。
本发明提供的胚胎干细胞和肿瘤细胞的杂合细胞系通过胚胎干细胞和肿瘤细胞融合获得。
本发明提供的胚胎干细胞和肿瘤细胞的杂合细胞系的构建方法，包括以下步骤：
A)分别构建胚胎干细胞和肿瘤细胞的单克隆细胞株；
B)胚胎干细胞和肿瘤细胞的单克隆细胞株融合。
根据本发明的一个优选实施例，所述方法还包括杂合细胞的筛选步骤。
根据本发明的一个优选实施例，所述方法还包括杂合细胞单克隆株构建的步骤。
本发明提供的胚胎干细胞和肿瘤细胞的杂合细胞系的应用为用于构建去分化的肿瘤细胞的应用。
本发明提供的胚胎干细胞和肿瘤细胞的杂合细胞系的应用为用于构建肿瘤细胞模型。
本发明提供的杂合细胞，为进一步的研究肿瘤的发生和恶化提供了一种全新的模型，使用本发明提供的方法，可以构建新的杂合细胞模型，从而从全新的角度研究肿瘤表观遗传学，对未来的临床治疗提供理论和应用基础，将会全面推动肿瘤的基础研究。
附图说明
图1是融合前胚胎干细胞E14和肿瘤细胞的单克隆细胞系的荧光检测结果，其中，图1A为E14的荧光检测结果，图1B为肿瘤细胞Hepa1-6细胞的荧光检测结果。
图2是杂合细胞的表型的荧光检测结果，其中，图A-C依次为胚胎干细胞样，成纤维样，和上皮样细胞表型的杂合细胞，1-4分别为相应细胞样的明场图像，绿色荧光标记图像、红色荧光标记图像、红色和绿色荧光重叠图像。
图3是胚胎干细胞，成体肿瘤细胞Hepa1-6以及杂合细胞的染色体核型与DNA含量检测结果示意图，其中，A—C依次代表胚胎干细胞，成体肿瘤细胞Hepa1-6以及杂合细胞，1和2分别为染色体核型检测结果与DNA含量检测结果的示意图。
图4是杂合细胞的基因表达的电泳图，其中，图4A为E14(1)、Hepa1—6(2)、EH0926(3)和EH0929(4)中多能性基因OCT4、Rex1、Nanog、SOX2和组织特异性基因TTR、ALB的表达检测结果；图4B为胚胎干细胞ES(1)、成体肿瘤Hepal1-6(2)和杂合细胞ES×Hepa1—6(3)中肿瘤抑制基因P19、P16、原癌基因C-fos和βactin的表达检测结果。
图5是杂合细胞在体外形成拟胚体的检测结果，其中，图5A是明场下的拟胚体的检测结果，图5B是融合细胞形成的拟胚体表达的红色荧光的观测结果；图5C是融合细胞形成的拟胚体表达的绿色荧光的观测结果；图5D是图5B和图5C的重叠影像。
图6是胚胎干细胞(A)，成体肿瘤Hepa1-6(B)和杂合细胞(C)在体外形成的肿瘤细胞的组织切片检测结果，其中，图6A中切片图1-4分别为四倍镜下畸胎瘤组织类型的切片图；二十倍镜下神经胶质细胞的切片图；二十倍镜下脂肪组织的切片图；二十倍镜下肌肉组织的切片图；图6B中的切片图1为四倍镜下Hepa1-6的组织类型的切片图；切片图2为二十倍镜下肿瘤组织的边缘图片的切片图，切片图3为二十倍镜下肿瘤组织的内部图片的切片图；图6C中切片图1-4分别为四倍镜下畸胎瘤组织类型的切片图；二十倍镜下神经胶质细胞的切片图；二十倍镜下脂肪组织的切片图；二十倍镜下肌肉组织的切片图，其中，箭头所指为未分化神经管组织。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。
在本发明的下述实施例中，使用的E14细胞系购自于中科院干细胞平台(其编号为SCSP-205)，肿瘤细胞Hepa1-6(肝癌细胞)购自于中科院细胞库(其编号为TCM30)，来自于小鼠肝癌，是分化程度高的成体肿瘤细胞。
在本发明的下述实施例中，使用的慢病毒Hygromycin-RFP参考文献Jolanta Szulc et.al.A Versatile Tool for Conditional Gene Expression and Knockdown.Nature Methods，3，109-116(2006)中提供的方法构建。
在本发明的下述实施例中，使用的TE buffer、Buffer EC、促进反应缓冲液(enhancer)和改良的脂类转染试剂(Effectene Transfection Reagent)均为瞬时转染试剂盒内试剂，该试剂盒购自Qiagen；G418购自Gibco BRL；4，6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)和Rnase购自Sigma；碘化丙啶(Propidium Iodide)购自Invitrogen；GAPDH购自上海生工合成；PEGFPC1DNA购自Clontech；2×SYBRGreen master mix购自Qiagen。
在本发明的下述实施例中，使用的TRIzol总RNA抽提试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司；RT-PCR试剂盒购自上海申能博采生物技术公司。
在本发明的下述实施例中，使用的nu小鼠购自中科院动物中心。
在本发明的下述实施例中，使用的胚胎干细胞培养基的配方为：每400ml培养基含有343.2ml格拉斯哥极限必需培养基，40ml10％FBS，4ml0.1mM非必需氨基酸，4ml1mM丙酮酸钠，0.1mMβ巯基乙醇，40ul1000U/ml LIF，2ml青霉素-链霉素双抗。
在本发明的下述实施例中的“融合母体细胞”指的是融合前的细胞。
在本发明的下述实施例中，由于转染成功的E14细胞系具有潮霉素抗性，因此，可使用潮霉素(Hygromycin)筛选转染后的E14细胞系；由于Hepa1-6细胞内具有新霉素抗性，因此，可使用G418筛选Hepa1-6细胞系。联合两种抗生素可以筛选融合后的融合细胞系。
实施例1、融合前的单克隆细胞系构建
1.1、胚胎干细胞E14单克隆细胞株构建
参照Gondon keller建立起来的无滋养层胚胎干细胞培养方法(Keller G M.In vitrodifferentiation of embryonic stem cells.Curr Opin Cell Biol，1995，7：862-869.)，培养E14细胞系，获得克隆样的E14细胞，然后计数2×105，培养过夜。
第二天在细胞中，加入慢病毒Hygromycin-RFP，于37℃孵育2小时后，离心，弃上清，使用PBS清洗细胞沉淀2遍，向清洗后的细胞沉淀中加入新鲜胚胎干细胞培养基，继续培养；
在转染24-36小时后，于显微镜下检测转染慢病毒的E14细胞的荧光表达，荧光检测结果如图1A所示。图1A的结果显示，E14细胞已带有颜色，证明转染成功，可用于细胞融合。
在转染48小时后，加入潮霉素200μg/ml，筛选两周后，挑取单克隆建系，获得带有Hygromycin抗性和RFP荧光表达的胚胎干细胞单克隆株。
1.2、肿瘤细胞Hepa1-6单克隆细胞株构建
培养肿瘤细胞Hepa1-6，获得Hepa1-6细胞，并于细胞转染前一天计数2×105。
将培养后的肿瘤细胞Hepa1-6铺于加有5ml培养基的6cm培养皿中，于37℃，置于5％CO2培养箱中，培养过夜。
取1μgPEGFPC1 DNA溶于TE buffer中，使其浓度为1μg/μl；然后加入Buffer EC至总体积为150μl，再加8μl enhancer吹打一次，并于室温下孵育2-5分钟，然后，向离心管中加入25μl Effectene Transfection Reagent，并上下吹打5次，于室温下放置5-10分钟。
移去培养皿中的培养基，然后加4mlPBS清洗Hepa1-6细胞一次，再向培养皿中加入4ml新鲜的含10％FBS的DMEM培养基；
另取1ml培养基加至加入了25μl Effectene Transfection Reagent的离心管中，上下吹打两次后立即加入到加有4ml新鲜的含10％FBS的DMEM培养基的培养皿中，并轻柔晃动培养皿，使其与培养基混合；放置入37℃，5％CO2培养箱中，培养24小时后，荧光显微镜下观察，荧光检测结果如图1B所示。
图1B的结果显示，ES细胞已带有颜色，证明转染成功，可以用于细胞融合。
于48小时后，向培养皿中加入500ug/ml新霉素(Neomycin)G418，进行筛选，两周后，从培养基上挑取单克隆培养，建系，获得带有neomycin抗性和GFP荧光表达的肿瘤细胞单克隆株。
实施例2、细胞融合及杂合细胞单克隆株构建
分别将稳定建系带有Hygromycin抗性RFP荧光表达的胚胎干细胞和带有neomycin抗性GFP荧光表达的肿瘤细胞进行融合，具体过程如下：
融合前进行细胞消化，并分别计数5×106个细胞，使得待融合的胚胎干细胞和肿瘤细胞的比例为1：1，充分混合两种细胞后，于1000rpm离心10分钟，完全弃去液体；然后，轻轻震荡离心管下侧，使沉淀完全松散；向离心管中缓慢加入1ml预热的50％PEG1500，加入时间持续1分钟，吹打细胞1-2分钟；向离心管中加入1ml预热的胚胎干细胞培养基，吹打细胞1分钟；再向离心管中加入3ml预热的胚胎干细胞培养基，吹打细胞3分钟；加10ml预热的胚胎干细胞培养基，于37℃孵育5分钟后，于1000rpm离心10分钟，并弃去上清；
向沉淀中加入10ml新鲜的胚胎干细胞培养基，并种于10cm培养皿中，培养24小时后，镜下观察，根据观测结果，可见带有双荧光的融合细胞；
培养48小时后，加入新霉素和潮霉素抗生素进行筛选；
筛选两周内，每日镜下观察细胞并记录观测结果，其中，图2为融合筛选两周后的观测结果。
图2结果显示，在和胚胎干细胞融合之后，荧光和抗性双阳性的细胞有三种表型：A、胚胎干细胞克隆样生长表型：这种杂合细胞和胚胎干细胞表型类似，为紧实生长的克隆样，边缘光滑整齐，内部细胞轮廓不清。这种细胞占所有杂合细胞的5％左右，贴壁不牢。第二代挑单克隆建系后即进入生长停滞期，逐渐的发生调亡。所挑的六个克隆均不能存活；B、成纤维细胞样表型：这种类型的双阳性细胞占所有杂合细胞的10％-15％左右。细胞大，长宽之比约为6：1，内有2-3个细胞核，核质比为1：3-4。细胞倍增速度慢，达到80％汇合后可以形成漩涡样生长。单克隆挑选时间较其他两种类型细胞晚，为4-5周。建系2代后细胞逐渐生长停滞。在第4代左右即死亡；C、扁平样克隆表型：85％融合后的双阳性细胞为该种表型，细胞呈克隆样生长，但扁平，边缘不光滑，内部细胞清晰可见，轮廓清楚。细胞长宽比小于2，为典型上皮样细胞表型。细胞核质比大。于融合后12天单克隆挑选建系，所挑的6个克隆均能稳定生长，生长速度与第一代无异。细胞在体外生长40代，表型无变化，冻存后的细胞亦可稳定生长。
根据图2结果，带有双荧光的融合细胞系已经建立；然后，在荧光显微镜下找到红绿上双阳性细胞克隆，挑取2株单克隆，扩大建系，分别命名为EH0926和EH0929。
实施例3、稳定性检测
由于杂合体细胞是四倍体细胞，和正常的二倍体细胞染色体不同，因此，为了确定获得的杂合体细胞是否稳定，在本实施例中，制备了杂合细胞染色体标本，并使用流式细胞仪检测了杂合细胞的DNA含量，具体制备过程如下：
3.1、细胞染色体标本制备
取实施例2中获得的杂合细胞，采用常规方法，将其培养至对数生长期后，停止培养，除去培养液，然后用PBS洗涤细胞，再加入含0.1μg/ml秋水仙素的细胞培养液(0.1μg秋水仙素+1mlPBS)作用4小时后，离心，收集细胞沉淀。
用0.25％Trypsin/EDTA消化细胞2min，再加入培养基终止反应，获得单细胞悬液。并将消化处理过后的细胞悬液于1000rpm离心，收集沉淀并用PBS洗两次，1000rpm离心，收集细胞沉淀，使用0.075M的KCl低渗液重悬细胞沉淀后，于37℃作用30分钟；
然后于1000rpm离心5分钟，将收集获得的细胞沉淀用固定液(3：1的甲醇：冰醋酸)重悬并固定20分钟；
再次于1000rpm离心5分钟，将收集获得的细胞沉淀用固定液重悬，获得细胞悬液；取冰冻载玻片，将细胞悬液滴在冰冻载玻片上，并迅速将载玻片通过酒精灯火焰2～3次；用DAPI染色10分钟后，自来水冲洗，自然晾干；
然后，于荧光显微镜下观察，并记录染色体数目。选择30个分散良好的分裂相，镜下记数，以进行染色体数目分析。检测结果如图3-1所示，并取胚胎干细胞和肿瘤细胞作为对照。
3.2、细胞的DNA含量检测
取实施例2中获得的杂合细胞，进行传代培养，然后分别取第2、14代对数生长期的细胞进行如下处理：使用PBS清洗细胞3次后，再使用0.25％Trypsin/EDTA消化细胞2-3min，然后加入培养基以终止消化，并用洗管将消化后的细胞进行反复吹打，至获得单细胞悬液。
将消化终止后的细胞用PBS洗两次，1000rpm离心后，收集细胞沉淀，并用75％的酒精重悬，于-20℃固定过夜；
然后，分别使用75％的酒精和PBS洗涤固定后的细胞各三次；再使用100μg/ml Rnase在37℃处理30分钟；再用40ug/ml的propidium iodide染色后上流式细胞仪，观察DNA含量的变化，结果如图3-2所示，并取胚胎干细胞和肿瘤细胞作为对照。
根据图3结果，与融合母体细胞相比，在胚胎干细胞与成体肿瘤Hepa1-6的杂合细胞中，染色体数目和DNA的含量均获得加倍。在细胞周期方面，杂合细胞的周期偏向于胚胎干细胞。另外，来源于肝脏的肿瘤的染色体数目并不均一，为非稳定的二倍体核型，其DNA含量也没有在正常细胞的二倍体峰值上。杂合细胞与融合母体细胞的细胞周期的对比结果显示，杂合细胞的细胞周期类型偏向于胚胎干细胞，而非成体肿瘤细胞。
实施例4、细胞总RNA抽提
为了检测杂合体细胞的基因表达，在本实施例中，采用RT-PCR方法检测了杂合细胞的分子特征，以b-actin作为对照，具体过程如下：
4.1、细胞总RNA抽提
参考生产厂商提供的方法，分别使用TRIzol总RNA抽提试剂盒，分别抽取各个细胞的总RNA，然后使用分光光度计检测抽提的RNA的纯度与含量。
4.2、cDNA的合成
按厂商提供的方法，使用RT-PCR试剂盒合成cDNA，其中，
反应体系(25μl)为：细胞RNA样品2μg，随机引物3μl，Rnase Free ddH2O 10μl。
反应过程为：70℃，10min。冰上骤冷，1min。短暂离心。加入10mM dNTP 1.5μl，Rnase Inhibitor 0.5μl(25units)，M-MMLV Reverse Transcriptase 1μl(200units)，5×RNA PCRBuffer 5μl，Rnase Free ddH2O4μl，轻弹，PCR仪中37℃，100min。
反应结束后，获得cDNA，并用β-actin检测，结果显示各个细胞反转录后的次DNA量相一致。
4.3、RT-PCR和Q-PCR检测细胞的分子特征
设计用于RT-PCR反应的引物，所使用的引物的序列如表1所示。
表1、引物序列及其应用
使用上述用于RT-PCR反应的引物，通过RT-PCR反应检测杂合细胞的分子特征，其中，反应体系为：cDNA模板0.5μl，10mM dNTP 0.5μl，Taq酶0.5μl，上下游PCR引物各0.5μl，PCR缓冲液(10×)5μl，以ddH2O补足50μl反应体系。
取上述RT-PCR反应产物，进行凝胶电泳检测，结果如图4所示。
图4A的结果显示，在胚胎干细胞和成体肿瘤细胞Hepa1-6融合所得到的杂合细胞中，来源于肝脏的特异性基因TTR和ALB表达消失，而多能性基因如OCT4、Nanog、SOX2重新表达肿瘤细胞的多能性表达增高或者可以完全重新表达。
图4B的结果显示，肿瘤抑制基因P19和P16在胚胎干细胞和杂合细胞中均有表达，根据该结果，在得到的杂合细胞中，肿瘤抑制因子表达状态发生了改变。原先完全不表达肿瘤抑制基因的Hepa1-6在与胚胎干细胞融合之后，肿瘤抑制基因重新表达。在原癌基因组，经过筛选，我们找到了在肿瘤中表达量高但是在胚胎干细胞中表达量极低的基因C-fos。在成体肿瘤中，C-fos的表达相对畸胎瘤细胞和胚胎干细胞有明显的区别，而在杂合细胞中，C-fos表达量相对融合母体肿瘤细胞明显降低，说明通过胚胎干细胞融合，肿瘤细胞的确发生了重新编程。
根据上述图4结果，肿瘤细胞通过与胚胎干细胞融合，肿瘤基因表达方式发生了变化。
实施例5、拟胚体(EB)的培养
由于能否在体外无白血病抑制因子(LIF)培养的条件下形成拟胚体(EB)，是检测多能性的重要指标，因此，在本实施例中，进行了EB的培养，以检测杂合体细胞是否具有多能性，具体培养过程如下：
0.25％胰酶消化ES细胞后，用吸管吹打成单细胞；细胞计数1-2×106，换成不加LIF的拟胚体细胞全培养基，置于不贴壁的培养皿中，悬浮培养；每天吹打两次，避免细胞贴壁；每两天换液一次，镜下观察，第5天的观测结果如图5所示。
其中，图5A是明场下的拟胚体的检测结果，说明杂合体细胞具有分化潜能；图5B是融合细胞形成的拟胚体表达的红色荧光的观测结果，说明杂合体细胞的一部分来源于胚胎干细胞细胞；图5C是融合细胞形成的拟胚体表达的绿色荧光的观测结果，说明杂合体细胞的一部分来源于肿瘤细胞。
图5结果显示，杂合细胞也可以在去除LIF和滋养层细胞以后自发形成拟胚体。
胚胎干细胞具有多能性的指标之一就是胚胎干细胞的培养过程中，在去除LIF和滋养层细胞以后，胚胎干细胞将自动分化为与种植后胚胎组织相似的具有三个胚层的拟胚体(EB)。因此，根据图5结果，即使肿瘤细胞已高度分化，依然可以通过与胚胎干细胞融合以后被重新编程，回复到多能态。
实施例6、细胞致瘤性检测
参照Gondon keller建立起来的无滋养层胚胎干细胞培养方法，培养E14细胞，然后将2×107个融合前和融合后的细胞分别移植到nu小鼠皮下(n＝3)，观察两个月，采用免疫组化方法分析组织类型的区别，以检测肿瘤的形成，其中，待肿瘤形成后当其体积大于1立方厘米时取材，进行组织切片的HE染色，于镜下进行观测，结果如图6所示。
图6结果显示，胚胎干细胞形成畸胎瘤的时间为3-4周，在组织切片中可见三个胚层的组织类型，包括代表外胚层的神经胶质和角化上皮组织；代表中胚层的肌肉和脂肪组织；代表内胚层的管状上皮等，充分说明了胚胎干细胞广泛的分化潜能。
在胚胎干细胞的组织切片中，成熟细胞占到整个组织的80％以上，只有20％左右呈现典型的未分化成熟细胞，表现为核质比大，细胞呈恶行性生长。成体肿瘤Hepa1-6在小鼠体内在3-4周可以形成肿瘤，为均一未分化成熟的肝癌细胞组织类型，表现为核质比大，细胞呈多核和分页核。切片可见癌巢组织，其间有坏死灶生成。胚胎干细胞和成体肿瘤Hepa1-6形成的畸胎瘤中，可见三个胚层的细胞类型，具有一定的分化潜能。但是成熟细胞所占比例比胚胎干细胞形成的成熟细胞比例低，未成熟组织占到整个组织切片的70％以上。虽然没有明显的未成熟神经管类型，但是可见到典型的癌巢组织。
因此，根据图6结果，虽然通过与胚胎干细胞融合，肿瘤细胞仍未改变其恶型性。
综上所述，本研究证明了成体细胞可以被胚胎干细胞重新编程，表现为迥然不同的细胞形态，生长特性及发育潜能，并且在和肿瘤细胞融合的试验中证实了胚胎干细胞可以在某种程度上改变肿瘤细胞的发育潜能和基因表达方式。
证实肿瘤细胞可以通过与胚胎干细胞融合而发生重新编程，体现于基因表达、分化状态及表观遗传学调控发生变化。但是这种重新编程是不完全的，肿瘤细胞虽然可以恢复为胚胎性质，但是肿瘤源性并没有完全改变。肿瘤细胞通过融合被重新编程为胚胎性质的肿瘤细胞，而这种细胞的建立可以通过分化，进一步了解肿瘤基因在表观遗传学上发生的改变。
本发明提供的杂合细胞，为进一步的研究肿瘤的发生和恶化提供了一种全新的模型，使用本发明提供的方法，可以构建新的杂合细胞模型，从而从全新的角度研究肿瘤表观遗传学，对未来的临床治疗提供理论和应用基础，将会全面推动肿瘤的基础研究。
Claims (3)
1.一种小鼠胚胎干细胞和小鼠肝癌细胞的杂合细胞系的构建方法，其中，所述小鼠胚胎干细胞为E14细胞，所述小鼠肝癌细胞为Hepal-6细胞，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
A)分别构建小鼠胚胎干细胞和小鼠肝癌细胞的单克隆细胞株；
B)将所述小鼠胚胎干细胞和小鼠肝癌细胞的单克隆细胞株融合；
C)筛选杂合细胞；
D)构建杂合细胞单克隆株。
2.权利要求1所述的构建方法构建的细胞系在构建去分化的肿瘤细胞中的应用。
3.权利要求1所述的构建方法构建的细胞系在构建肿瘤细胞模型中的应用。
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