CN101273124B - 干细胞融合癌发生模型 - Google Patents
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Abstract
建立癌细胞迁移模型的方法，筛选作用于肿瘤细胞迁移的药物的方法，和检测与骨髓源干细胞和基因改变的细胞融合相关的肿瘤细胞迁移的潜能(图1)的方法。抗泛素抗体显示抑制肿瘤细胞迁移。
Description
发明背景
相关申请的交互参照
本申请主张2005年8月25日提交的、题为“干细胞融合癌发生模型”的美国临时申请No.60/711,249的优先权利益，其所有内容合并作为参考。
技术领域
本发明涉及一种细胞系统和方法，用于建立癌细胞迁移的模型、筛选对抗和抑制癌细胞迁移的药物。
技术背景
癌症因为组织异质性和基因不稳定性而难以治疗，作为人类疾病，癌症早在公元前1600年在古埃及文书中已有记述，古希腊医师希波克拉底(Hippocrates)，认识到良性和恶性肿瘤之间的差异，并命名恶性肿瘤为“carcinos”。在发达国家中，目前癌症是死亡的第二位主要原因。
自从美国总统理查德尼克松在1970年代宣告“对癌症作战”以来，已经积累了巨量的癌症知识。过去两个世纪里，已经提出了许多癌症发生的假说。早期的假说包括刺激假说、胚胎假说和寄生假说。后来，随着实验肿瘤学的建立，鉴别了化学致癌物。通过对人类和实验动物肿瘤的分子分析，发现了许多致癌基因和抑癌基因。这些研究的结果是建立了基因突变假说，其在过去的三十年里一直处于统治地位。
尽管当前的基因突变假说具有内在的精准性，但它仍不能解释癌症的许多重要特性。事实上，许多研究者已经对基因突变假说的局限性作了完整的阐述。
近来，随着对干细胞研究得到的了解以及“癌症干细胞”的发现，“癌症发生的干细胞理论”得势。癌症发生的干细胞理论认为干细胞累积基因突变而转变成恶性细胞，然而，由于它仍完全依赖于基因突变假说，干细胞理论不能完全解释是什么导致了癌症的区别性特性，如浸润和转移。
突变是罕见的事件。数学模型提示，恶性转化需要更频繁的事件。基因组不稳定性被提出是癌症特点的起动特征。作为基因组不稳定性的表现型，已经在几乎所有的人类实体瘤中发现了非整倍性并且难以用基因突变假说来解释。已经提出非整倍性作为自主增变株是癌症的原因，但非整倍性下潜在的机制尚未知。
因此，尽管已经取得了很大进展，但癌症的起源仍然是个谜。因为当前以基因突变假说为基础的癌症发生模型在解释癌症的许多方面中有局限性，所以发明人提出一个新的多阶段癌症发生模型，其中认为，癌症发展涉及基因突变和细胞融合。具体讲，癌症可以是“改变”的癌前细胞和骨髓来源的干细胞(BMDSC)之间融合所致。“非整倍性”，作为恶性肿瘤的一个特征，是该细胞融合的直接结果。“干细胞融合”模型解释了恶性细胞和BMDSC之间显著的相似性。该模型也解释了为什么非诱变剂可能是致癌物，以及为什么非诱变过程，例如创伤愈合和慢性炎症可以促进恶性转化。
发明内容
本发明的一个实施方案中，公开了一种建立癌细胞迁移模型的方法。该方法优选包括提供骨髓来源的干细胞，提供基因改变的细胞，将骨髓来源的干细胞和基因改变的细胞融合，由此产生融合细胞；并且测量融合细胞迁移的指示物。或者，除了直接融合两种类型的细胞，人们还可以从骨髓源干细胞和基因改变的细胞的预先融合中获得或培养融合细胞。
本发明的另一个实施方案中，描述了一种筛查生物或化学剂对肿瘤细胞迁移作用的方法。该方法包括提供来源于骨髓源干细胞和基因改变细胞融合的融合细胞，将该融合细胞与生物或化学剂接触，并检测肿瘤细胞的迁移是否被促进、抑制或不变。
本发明的又一个实施方案中，描述了抑制肿瘤细胞迁移的方法，包括将肿瘤细胞与有效量的抗泛素抗体接触。优选，该抗体是MEL-14(例如，MEL-14-F(ab’)2)、抗体14732或抗体10C2-2。
本发明的方法表达了一种新的和改进的肿瘤发生模型，用于体外研究肿瘤细胞迁移，和用移植了标记基因修饰的骨髓的动物，例如eGFP转基因动物，进行体内研究。本发明的其他特征和优势，当结合附图阅读时，从下面具体描述的某些具体实施方案中浮现。
附图说明
图1是通过骨髓源干细胞和“改变的”组织细胞之间的融合介导恶性转化的示意图。
具体实施方式
用在这里，“转移”指癌症从身体一个部位扩散到另一部位。由扩散的细胞形成的肿瘤被称为“转移性肿瘤”或“转移瘤”。
术语“恶性的”是指癌性的，例如不受控制分裂、浸润附近组织并可通过血流与淋巴系统扩散到身体其他部位的异常细胞。
术语“改变的细胞”或“基因改变的细胞”这里被定义为任何有基因或外遗传改变、足以在与BMDSC融合之后偏移骨髓源干细胞正常分化途径的细胞。“改变的”细胞包括在多阶段癌发生模型中所谓的“启动”(癌前)细胞。
术语“融合细胞”指改变的细胞和骨髓源干细胞融合形成的细胞。
恶性肿瘤的起源仍有争议，尤其对于占人类恶性肿瘤90％以上的癌。发明人提出的癌发生模型致力于高度恶性癌的发展起源。该模型的关键事件是骨髓源干细胞(BMDSC)和“改变的”的组织细胞之间的融合(图一)。通过商购柱去除表达分化细胞表面标志的骨髓源细胞，可获得纯化的BMDSC种群。过柱的谱系阴性细胞通过正选择CD34阳性、CD133阳性和Scal阳性细胞而进一步富集干细胞。这项工作可用于鼠和人BMDSC。本发明部分与识别可能导致杂交细胞恶性转化的“改变的”组织细胞与BMDSC之间的融合有关。在多阶段癌发生模型中所谓的“起动”细胞和良性肿瘤细胞可以赋予迁移能力。
融合以后，由于存在“改变”的组织细胞的基因或外遗传异常，BMDSC的正常分化途径被破坏。基因的异常可包括基因突变假说提出的基因突变、易位、缺失和扩增。外遗传异常可以是DNA序列以外、导致细胞生长和功能的调节异常，例如DNA甲基化，染色质修饰、或细胞信号的改变。融合可以生成同时具有改变细胞和BMDSC表型的子细胞。换句话说，子细胞可以从BMDSC获得自我更新、组织浸润和迁移的能力，从而转化成恶性细胞。此外，融合过程、后续的有丝分裂和丧失染色体个体拷贝将导致非整倍性。非整倍性可能成为基因组不稳定和癌症进展的推动力量。根据本发明人的模型，一个单纯的融合事件可以与经典的多阶段癌发生过程中涉及的多个事件具有同样的转化(从良性到恶性)效果。
在本发明人的模型基础上，癌症的多数恶性表型，如浸润和转移，可来自BMDSC。在多细胞生物的发育和生存过程中，融合是自然的和相对经常的事件。在比较基因突变和干细胞融合的相对可能性中，可以将正常细胞向完全恶性细胞的发展视作一个进化过程。在进化过程中，用常见事件代替多个罕见事件，将会引起这样途径的任何途径是绝对优选的。
BMDSC有很强的可塑性。许多研究证明骨髓不仅含有造血干细胞(HSC)，还含有间质干细胞(MSC)、内皮祖细胞、和上皮组织干细胞，后者可以分化为肝、肺、皮肤和胃肠道上皮细胞。这些BMDSC迁移到非造血组织，并且可能在维护和修复损伤组织中起作用。如同表一所总结，BMDSC和转移癌细胞之间在生物活性和这些活性的分子基础方面有惊人的相似性。
表一、骨髓源干细胞和转移癌细胞之间的相似性
BMDSC和转移癌细胞都能够自我更新、迁徙和组织侵润，某些癌细胞表达假定的干细胞标志。例如，浆液性卵巢癌、睾丸癌、恶性黑色素瘤、和小细胞肺癌强烈表达c-kit。皮肤纤维肉瘤、上皮样肉瘤、和单发纤维瘤表达CD34。另外，与端粒酶阳性的干细胞类似，所有类型的肿瘤细胞均获得了维持端粒的能力。BMDSC表达特定的化学因子受体并通过化学因子-配体的相互作用到达其目的。
有趣的是，BMDSC和转移性癌细胞的归巢(homing)中涉及相同的化学因子-配体。一个公知的现象是低分化癌通常转移性高但对放疗较为敏感。这种现象在文献中尚未完全阐明，但与对放射敏感高的BMDSC有显著相似性。事实上，这种对放射的敏感性是临床骨髓细胞清除的基础。总之，癌细胞可能从BMDSC获得这些特性。事实上，最近的资料表明长期的螺杆菌感染的小鼠中，由骨髓源的细胞可以产生胃癌。此外，有报道说，在肾移植接受者中观察到了来源于供体细胞人类皮肤癌。
发明人过去已经主张，BMDSC和“改变的”细胞之间的融合事件引起癌细胞迁移。如上所述，融合在许多生物的一生中是一个基本现象。细胞内囊泡间的融合是细胞基本功能所必需的。包膜病毒通过膜融合使衣壳进入胞浆。从酵母到人类，生命开始于融合。在肌肉、骨和胎盘发育过程中，细胞-细胞融合是正常生物过程的一部分。早在1911年已经提出，恶性肿瘤可能是白细胞和体细胞杂交的结果。也有研究表明，哺乳动物的体细胞摄取共同培养的精子、和/或通过实验诱导的精子原位穿透时，发生致癌转化。一个长期成立的假说是，肿瘤细胞和淋巴细胞的杂交产生转移性细胞。但是，在本发明以前，尚没有人描述或提示恶性转化是BMDSC和“改变”的癌前组织细胞融合的结果。
干细胞能够通过自发的细胞融合获得其它细胞的表型。一些研究表明，BMDSC与各种靶细胞融合。应用以cre/lox重组为基础的方法检测细胞融合事件，Alvarez-Dolado等(Nature 425，968-973[2003])证明骨髓来源的细胞与肝细胞、脑中蒲肯野神经元胞、以及心脏的心肌细胞体内融合，导致多核细胞的形成。通过对骨髓来源的肝细胞的系列移植，王(Wang)等人(Nature 422，897-901[2003]))证明，细胞融合是骨髓源肝细胞的主要来源。细胞遗传学分析雌性供体小鼠移植到雄性受体小鼠的肝细胞，证明二倍体与二倍体融合(80，XXXY)和二倍体与四倍体融合(120，XXXXYY)的核型。理论上，融合可以在正常、 癌前和恶性细胞之间多次发生；但是，本发明具体涉及“改变的”癌前组织细胞和BMDSC之间的融合，作为癌发生的关键步骤。与BMDSC可以有多次融合，从而在融合发生后产生至少四倍体核型。
干细胞和改变的组织细胞融合之后，其正常的自我更新和分化被认为是被来自改变的细胞的不正常信号所破坏。与其它认为干细胞积累突变而产生转化的干细胞癌发生模型相反，本发明与表明干细胞比分化细胞更不耐受DNA损伤的研究一致。干细胞为了维持其多能分化的潜能，应该对DNA损伤更敏感。毋庸置疑，BMDSC比成熟细胞更对放射敏感。该事实是临床骨髓细胞清除的基础。还观察到，组织干细胞更易被DNA损伤剂杀死。当暴露于放射或细胞毒性剂时，小肠隐窝干细胞的凋亡水平明显升高。因此，更可能是组织细胞，而不是干细胞，累积基因或外基因异常。与BMDSC融合后，子细胞被转化而产生恶性肿瘤。
染色体异常被鉴别为癌症的一个独特病理特征已有100多年了。几乎所有的人类实体癌都可以观察到非整倍性。此外，临床资料表明，非整倍性的程度与疾病的严重程度相关。癌症非整倍性的假说强调非整倍性在癌发生中的重要性，但非整倍性下潜藏的机制仍不清楚。这里描述的癌发生的干细胞融合模型中，非整倍性是细胞融合导致个体染色体拷贝丢失的必然结果。在所提出的癌发生的干细胞融合模型的早期直接应用中，研究表明，前列腺癌细胞的染色质增加可能是正常前列腺上皮细胞和注入的精子融合的结果。此外，某些人类癌前病变中已经显示出四倍体细胞的频率增加，例如Barrett食管、溃疡型结肠炎和HPV阳性的非典型宫颈鳞状上皮细胞。DNA倍性分析表明，大多数非整倍体的人前列腺癌是四倍体。该证据表明癌的非整倍性源于一个四倍体事件(即，融合)。
很久以前已观察到慢性组织损伤、炎症和肿瘤之间的联系。关于潜藏在这种联系下面的分子和细胞学机制已有许多精密的研究和综 述。发明者对组织损伤和癌发生之间的关系作以下阐述。慢性组织损伤、炎症，和随后的组织修复耗尽了局部组织干细胞的再生能力。然后局部的炎症微环境有利于BMDSC的归巢并参与组织修复。BMDSC在偶然情况下和“改变”的组织细胞融合而导致恶性转化。
预期通常经历快速更新的组织有较高肿瘤发生率，因为高转换率可以导致局部组织干细胞的耗竭和BMDSC的侵入。事实上，皮肤、肺和胃肠道的上皮，长期处于环境伤害并一直处于自我更新的状态下，正是癌症比例高的组织。在性别错配的骨髓移植小鼠的伤口愈合过程中，骨髓源的角质细胞的植入增加，尽管同一研究排除了急性损伤中存在骨髓来源细胞和皮肤上皮细胞之间的融合。螺杆菌感染是胃癌发生的一个主要原因因素。慢性组织损伤和正在进行的组织修复造成胃内上皮细胞增值和凋亡的不平衡。事实上，最近有报道，在螺杆菌感染小鼠中，胃癌起源于骨髓来源的细胞。
衰老是癌症的最大危险因素之一。分析癌症的年龄分布产生了早期的癌发生多阶段理论。后来，基因突变假说设想癌症的年龄分布反映了为癌症发生积累足够的多重突变所需的时间。然而，另一种解释可能是造成衰老的机制同时也影响干细胞的功能。氧化损伤和细胞衰老可能增加了不正确的细胞-细胞融合的发生率而增加恶性肿瘤的机会。例如，衰老细胞危害组织更新和修复，分泌能够改变组织微环境的因子，进一步会改变干细胞的行为。另外，干细胞自身也是衰老相关损害的直接目标。已经证明头发变灰是由于黑色素干细胞的自我维护能力缺陷导致的。肠上皮干细胞已被证明随衰老遭到重要的功能损害。衰老和HSC的功能衰竭能够创造允许白血病发生的条件。因此，癌发生的时间动力学可能是衰老过程中细胞-细胞相互作用的反映。
其他可能促进细胞-细胞融合并因此增加癌症发生率的情况包括组织重建和病毒感染。女性乳腺癌和卵巢癌的高发率，和慢性肝炎后肝细胞癌的高发率可能是组织重建促进恶性转化的例子。已证明 Epstein-Barr病毒(EBV)和许多癌症有关，包括Burkitt氏淋巴瘤，非何杰金氏淋巴瘤，何杰金氏病，鼻咽癌，胃腺癌以及乳腺癌。早期研究表明EBV诱导细胞-细胞融合，特别是通过肿瘤分离出的病毒。与这些资料一致，本发明人的干细胞融合癌发生模型可以解释为何EBV感染与如此多的癌症相关。
这里所提出的干细胞融合癌发生模型是易于检验的。因而，发明人已进行了几个实验。在体外进行了良性肿瘤细胞与BMDSC之间的融合。融合后，体外和体内检测形态学以及转移和浸润的能力。此外，融合的证据还可以从彻底检查接受性别错配骨髓或转基因骨髓的小鼠产生的自发实体肿瘤中得以表明。然而，融合发生时，由于子细胞中富余的性染色体常常丢失，广泛应用的检测性染色体的荧光原位杂交法(FISH)也许不适用。事实上，在正常雌性中发展的相当数量的恶性肿瘤变得性染色质阴性，提示富余的第二X染色体丢失。检测转导的DNA片断或供体来源的线粒体DNA的方法也许更适用。最后，可以通过检测从以前接受骨髓移植、后来发生的癌症的接受者中收集的样本进行回顾性研究。诸如检测供体来源的线粒体DNA的存在的技术会比FISH检测性染色体的技术，可能更能提供信息。
癌症(cancer)、尤其是癌(carcinoma)的干细胞融合模型，对癌症研究和药物研发以及对于干细胞的治疗应用具有重要意义。恶性细胞可能对诱导分化的治疗易感。分化可以关闭其自我更新活性，并降低恶性细胞转移和浸润组织的能力。事实上，几个诱导分化剂，如维甲酸或γ-过氧化物酶体增值物激活受体激动剂，已经被分别成功用于治疗急性髓性白血病和脂肪肉瘤。通过基因转移将分化信号导入恶性细胞也许是一个新的可行的癌症治疗途径。另外，转移的细胞可能和BMDSC有类似的归巢模式；因此，阻断BMDSC归巢的途径可能被用于抑制癌症转移。与此相符合，最近的研究表明用RNA干扰技术沉默化学因子受体CXCR4阻断了小鼠乳腺癌的转移。肿瘤很难控制，因为其遗传学如此混乱。但是，癌细胞的起源于BMDSC的恶性性状可能存 在设计新疗法的保守靶点。
因此，癌症转移可能应用与BMDSC及其子代包括中性粒细胞、淋巴细胞和其他白细胞相同的保守分子机制。因此，本发明人考查了针对泛素的抗体，其能阻断中性粒细胞、淋巴细胞和其他白细胞的运动性和体内渗出，是否能阻断癌细胞的运动和渗出，并因此阻断转移。此外，确定肿瘤中存在BMDSC/改变的细胞的融合能够提醒研究人员注意可能未加注意的干细胞为基础的治疗的后果，(即，不合适的施用干细胞可能急剧增加恶性肿瘤的发生率)。
慢性组织损伤和继发的修复耗尽组织干细胞并招募BMDSC，因此增加了BMDSC与组织细胞融合的机会。其他因素，如衰老、病毒感染和组织重建，也增加细胞融合的发生率。重要的是，一个融合步骤可以给予多个“恶性”特征，用于转化“改变的”细胞而不需要多个突变。
尽管已经进行了数以百计的涉及肿瘤细胞和非肿瘤细胞融合以及对肿瘤发生的作用的研究，但是在本发明之前的科学文献中，还未发现骨髓源干细胞和肿瘤细胞融合的研究。
因此，在本发明的第一个实施方案中，癌细胞迁移的建模方法，包括以下步骤：a)提供骨髓来源的干细胞；b)提供一个基因改变的细胞；c)融合骨髓来源的干细胞和基因改变的细胞，由此产生融合细胞；和d)测量融合细胞的迁移指示物。BMDSC和基因改变的细胞都很容易从商业和研究机构的组织培养和活体来源获得。同样，细胞融合是常规操作，从而有许多可用的方案(参见，例如，protocol-online.org的杂交瘤方案)。检测融合细胞(及其后代)迁移的指示物可以通过体外“划痕分析”(例如，Lal A，Glazer CA，Martinson HM等.Cancer Res2002，62：3335-3340)或通过动物体内研究(如注射包括一种或多种融合细胞的肿瘤细胞和监测转移，如下文实施例所述)。
本发明进一步涉及体内或体外检测生物或化学剂对肿瘤细胞迁移作用的方法。该方法包括提供从骨髓源干细胞和基因改变的细胞得到的融合细胞；将该融合细胞与生物或化学剂接触，并检测肿瘤细胞的迁移是否被促进、抑制或不变。保守的蛋白将是用于检测试剂对迁移作用的非常好的靶标。
泛素(ub)是自然界中所发现的最为保守的蛋白质。在其76个氨基酸序列中，进化差异如昆虫、鲑鱼和人类的物种之间有完全的同源性。泛素构成数种其它膜受体的部分膜外区。对于淋巴细胞归巢受体(LHR)，在促进淋巴细胞通过淋巴结结合和迁移中，ub的存在与LHR的功能密切相关。已知所有与ub结合的受体都介导细胞运动。对此现象的可能解释是ub参与通过细胞外基质介导细胞运动。ub这种潜在的功能对于研究许多真核过程，例如细胞分化、寄生虫感染、肿瘤浸润和肿瘤细胞转移有重要意义。
因此，例如，生物或化学剂是拮抗泛素的抗体，如MEL-14(CD62L)(可通过Abcam Plc、Zymed Laboratories等获得；参见abcam.com的21种不同的泛素抗体)。如下面所描述，用该抗体接触的细胞已经经过划痕分析或用于动物实验中以测定该抗体对细胞迁移的作用。
本发明的另一实施方案中，阐述了抑制肿瘤细胞迁移的一种方法，包括使用有效量的抗泛素抗体接触肿瘤细胞。优选，本实施方案包括在使用抗体接触肿瘤细胞之前，证实肿瘤细胞中存在融合细胞，使得抑制作用靶定有更大恶性潜能的肿瘤。
人们可以测定肿瘤细胞样本中是否含有至少四倍体DNA和至少一个对骨髓源干细胞特异的细胞表面标记的细胞。此类细胞表面标记包括c-kit、CD34和CD133，以及化学因子受体，如CXCR4。人们还可以 包括用Cre/lox重组来检测骨髓源干细胞和非干细胞的融合。
非限制性实施例
在这些研究中所用的试验技术是非常成熟并被广泛接受的。
第一个研究的目的是检验以前提出的癌发生假说，其中骨髓源干细胞和转化细胞的相互作用能够改变肿瘤进展。可以进行两类实验。在第一组实验中，从转基因表达eGFP的小鼠分离小鼠骨髓来源的细胞，并与用Clontech的红荧光蛋白标记的瞬时转染转化的人或小鼠细胞在有利于形成杂交细胞的条件下结合。然后，将这些杂交细胞注入与待检测细胞系相适合的小鼠种系中。
监测原发或转移肿瘤生长的改变作为时间的函数。该研究致力的两个基本问题是，在转化的各个阶段，通过骨髓源干细胞与肿瘤细胞的融合是否调节肿瘤进展，以及用针对受体的抗体处理人或鼠的异种移植物是否改变异种移植瘤的转移表型。用作模型检测这些假说的代表性受体是转移瘤细胞表达的CXCR4。
必须应用无胸腺的Balb/c或SCID裸鼠中肿瘤生长和发展的非常成熟的异种移植模型，以使宿主对施用成熟建立的乳腺、皮肤和前列腺癌的模型体系——转化的小鼠(308，30810Gy5，或4T1)和人(DU145或PC-3M)细胞系的免疫响应最小化。利用皮下接种或尾静脉注射将小鼠细胞系注入无胸腺裸鼠内。人的细胞系可以注入SCID小鼠。在第0天单独或联合注射含有细胞系的等份，然后观测肿瘤生长最多40天。然后处死小鼠，取下组织，量化肿瘤体积和肺转移瘤的水平。
实验一
第一组，8只转基因小鼠
使用杂合的eGFP转基因鼠[C57BL/6-TgN(ACTbEGFP)1Osb](Jackson Laboratory)作为GFP标记的骨髓细胞的来源。GFP小鼠通过在UV光下表现绿色荧光而识别。2到4个月龄的雌性杂合鼠用作为BMT供 体。供体的性别与受体宿主不同。
骨髓源细胞从杂合GFP小鼠通过用Hank’s平衡液冲洗股骨和胫骨得到。为了产生体细胞杂交，在用聚乙二醇(PEG)处理前24h，将106 骨髓源细胞和106肿瘤细胞置于60mm培养皿上。将5g分子量为3000-3700的PEG在121摄氏度高压加热5分钟制备。然后，高压加热过的PEG与5ml预温至37度的2X无血清培养液混合。然后将每个培养皿1ml 50％的PEG溶液缓慢加入共培养的细胞上，细胞在37摄氏度培养1小时。
然后加入1ml无血清培养液，继续再培养1分钟。再加入2ml培养液，继续培养2分钟。然后加入4ml无血清培养液，继续培养4分钟。然后每皿加入含血清的培养液，37摄氏度持续培养48小时。两天后，每个培养皿用胰蛋白酶传代，并重新铺于4个100mm的培养板上进行筛选。筛选同时表达两种类型共培养细胞的特征性标记的细胞，生长至90％汇合，用于后续实验。
实验2：改变小鼠或人良性肿瘤的肿瘤发生和进展。
将GFP标记的骨髓细胞，单独或与转化的人或小鼠良性肿瘤细胞一起，接种小鼠。
A组：72只小鼠。种系：用于308细胞的无胸腺裸鼠，用于DU145或PC-3肿瘤(疼痛类别D)的SCID。所需小鼠总数：(4只小鼠/处理)(6次处理)(3次实验)＝72只小鼠
用GFP标记的骨髓(BM)源细胞和/或转化的人或小鼠的良性细胞接种小鼠。肿瘤接种在钟形罩中用异氟烷麻醉的小鼠上进行。小鼠被放置于含有放在聚丙烯离心管内的异氟烷处理的棉球的罩中。过程中通过观察呼吸频率、运动、肌肉松驰和没有定向运动来监测小鼠。接种后将小鼠放回鼠笼，并进行监测至恢复正常意识。
每只小鼠施用含有5X105细胞的100ul PBS。无胸腺裸鼠接种308细胞、BM细胞、或PEG处理的BM细胞和308细胞的混合。SCID小鼠接种DU145细胞、BM细胞、或PEG处理的BM细胞和DU145细胞的混合。通过皮下施用或尾静脉注射接种。对于接受尾静脉注射的小鼠，将小鼠禁闭在限制盒中。酒精消毒尾巴后，用2％xylacaine局部麻醉。每只小鼠用25-30号针头注射不多于200ul的溶液。如果注射导致坏死，用乙基氯喷涂尾巴，浸在优碘(betadine)，用无菌剪刀从刚好在坏死部位上方除下。然后尾巴以硝酸银烧灼止血。
每周两次使用卡尺测量肿瘤大小以监测肿瘤生长，体积的计算使用以下公式：体积＝+1/2(长)(长2)。第2，3，4周处死动物，观察转移的程度和达到的肿瘤体积。
在密闭盒中通过二氧化碳窒息处死动物，以便收集肿瘤和器官，这是小鼠安乐死的一种常用方法，使其痛苦最小化，并被AVMA安乐死小组所推荐。
步骤的简要概述
1.通过皮下或尾静脉注射，施用良性转化细胞和干细胞，建立308和DU145异种移植物。
2.每种注射方法处理组-(6)：308细胞；BM细胞；BM细胞+308细胞的PEG-处理的混合物；DU145；BM细胞，PEG处理的DU145和BM细胞混合物。
3.CO2窒息处死小鼠后，取下原发肿瘤和发展了转移瘤的器官。
4.将肿瘤样进行组织病理学分析，检测与融合事件相关的进展或转移能力的改变。组织病理学分析包括比较肿瘤随时间的生长，转移灶的相对数量和大小，肿瘤的组织特点。
实验3：抑制肿瘤生成和进展
小鼠用转移性人(PC-3M)或鼠(308 10Gy5或4T1)转化细胞，和用CXCR4受体抑制剂接种。所需小鼠总数：(4只/处理)(3次处理)(3个施用时间点)(3次实验)＝108只。
肿瘤接种用钟形罩中异氟烷麻醉的小鼠上进行。小鼠被放置于含有放置在聚丙烯离心管内的异氟烷处理的棉球的罩中。过程中通过观察监测小鼠的呼吸频率、运动、肌肉松驰、和缺乏定向运动。接种后，将小鼠放回鼠笼并检测至恢复正常意识。
100ul含104 4T1细胞的PBS注射到4只BALB/c小鼠的乳腺脂肪垫中。无胸腺裸鼠接受100ul含1X106 308 10Gy5细胞的PBS。SCID鼠接受100ul含1X106 PC-3M细胞的PBS。肿瘤细胞接种前、接种时和接种后，施用针对CXCR4受体的抗体进行试验。4T1细胞注射到BALB/c乳腺脂肪垫中。308 10Gy5注射到裸鼠的尾静脉中，而PC-3M细胞注射到SCID小鼠的尾静脉中。注射期间，接受尾静脉注射的小鼠禁闭于限制盒中。用酒精消毒尾巴并用2％xylacaine局部麻醉后，每只小鼠用25-30号的针头注射不多于200ul的溶液。如果注射导致坏死，用乙基氯喷涂尾巴，浸在优碘中，用无菌剪刀恰在坏死部位上方切下。然后用硝酸银烧灼尾巴止血。
每周两次使用卡尺测量肿瘤大小以监测肿瘤生长，肿瘤体积的计算使用以下公式：体积＝1/2(长)(长2)。第10，15和20天处死小鼠观察肺转移和肿瘤体积。
用可能的转移抑制剂接种前或接种后监测动物，并分析肿瘤细胞凋亡、分化、和转移抑制。
CO2窒息处死小鼠后，取下宿主小鼠中发展的原发肿瘤和转移瘤。
将肿瘤样本进行组织病理学分析，以确定与处理相关的进展和转移的改变。组织病理学分析应包括比较肿瘤随时间的生长，转移灶的相对数量和大小，肿瘤组织的组织学特点。
体外癌细胞/融合细胞的迁移抑制分析
细胞：使用两个转移性的癌细胞系检测泛素抗体抑制细胞运动的能力。PC-3M是人前列腺癌细胞系，4T1是小鼠乳腺癌细胞系。两者都维持在以10％FBS和Glutamax1补充的的DMEM培养液中(DMEM培养基)。
抗体：使用三种泛素抗体。14372是多克隆泛素抗体。10C2-2和Mel-14都是单克隆泛素抗体。
步骤(1)：每孔有无菌盖片的6孔板的培养孔用含1×106细胞的DMEM培养液接种，在37℃和5％CO2下在湿润的培养箱中培养过夜(标准条件)。
第二天，用移液管头在盖片上汇合的单层细胞上划痕。吸去培养液，用1ml DMEM培养液洗孔。每个细胞系用各个抗体的三个不同浓度处理：5μg/mL/106细胞，25μg/mL/106细胞和100μg/mL/106细胞。带细胞的板继续培养11小时。对照细胞以DPBS处理。
培养结束后评价该片划痕的封闭情况，作为细胞运动的结果。用1∶1甲醇∶丙酮在20℃固定和染色盖片5分钟，然后用DPBS冲洗。将盖片放在载玻片上。使用Nikon TE2000显微镜构成的工作站在4X放大下用Metacam软件采集图像。
体内癌细胞/融合细胞转移抑制分析：
细胞：小鼠转移性乳腺癌细胞系4T1被用于检验泛素抗体抑制转移的能力。细胞在前面方案所述的培养条件下，维持在DMEM培养液中。
抗体：使用单克隆泛素抗体，Me1-14。
步骤：用增强的绿荧光蛋白表达载体(EGFP)瞬间转染4T1细胞。转染后48小时收集细胞，并以每106细胞180ug的浓度，用泛素抗体Mel-14、或对照抗体Rat IgG 2A在DPBS中培养1小时。培养后，以总量50ul在SCID小鼠的尾静脉中注射250,000细胞。一周后，处死小鼠，取下肺，固定在4％福尔马林中。在Nikon Eclipse600显微镜下10倍放大检测整个摊平的肺上存在的转移集落。肺中存在EGFP阳性细胞表示有转移发生。
结果
表二、不同浓度泛素抗体体外对PC-3M细胞迁移的抑制程度(++++＝完全抑制，-＝无抑制)
表三、不同浓度泛素抗体体外对4T1细胞迁移的抑制程度(++++＝完全抑制，-＝无抑制)。
表四、泛素抗体Mel-14体内对4T1细胞转移的抑制程度(++++＝完全抑制，-＝无抑制)
参考文献：
Auerbach R，Lewis R，Shinners B，Kubal L，Akhtar N.”血管生成分析：评论综述(Angiogenesis Assays：A Critical Overview)″ClinicalChemistry 49(1)，1 Jan.2003：32-40.
如以上表所示，抗泛素抗体抑制肿瘤细胞迁移。
治疗方法
本发明的方法可以用于抑制对象中的肿瘤迁移。给脊椎动物对象，优选哺乳动物，更优选人，使用一定量化合物有效抑制肿瘤转移。该化合物或其药学上可以接受的盐优选以药物组合物的形式给予。
化合物的剂量优选包括药物剂量单位，所述剂量单位包含有效量的抗体或其他药剂。有效量是指足以达到体内稳定浓度的量，其导致 任何疾病的相关指标出现可测量的降低。
单克隆抗体现在常规通过直接输注给患者用于治疗。抗体可以冷冻干燥并储存，直到用水或生理盐水复溶。对于基于抗体的治疗，4mg/kg体重的剂量是典型的和安全的人类剂量。例如，这是Herceptin乳腺癌抗体治疗的有效剂量。因此，在本发明的一个实施方案中，人类患者以每公斤体重4mg的抗泛素抗体的剂量静脉给药。
施用的活性化合物的量依赖于精确的生物或化学剂，疾病或病症，给药途径，接受者的健康情况和体重，存在其他同时进行的治疗，如果有的话，治疗频次，期望效果的性质，例如，抑制肿瘤转移，以及有经验的医生的判断。
前述组合物和治疗方法适用于在患有任何与有害的细胞浸润、增殖和转移有关的疾病或病症的对象中，抑制细胞迁移(如浸润或转移)。
在所附权利要求的等同范围和意义内，可能有各种修改。
Claims (5)
1.有效量的抗泛素抗体在制备通过使肿瘤细胞与所述抗泛素抗体接触而用于抑制肿瘤细胞迁移的药物中的应用。
2.权利要求1的应用，其中所述抗体为MEL-14。
3.权利要求1的应用，其中所述抗体选自抗体14372和10C2-2。
4.权利要求1的应用，其中所述接触发生在体外。
5.权利要求1的应用，其中所述接触发生在体内。
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