CN105143264A - 用于肝癌诊断和治疗的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用刻缺蛋白信号传导抑制剂治疗肝癌的方法。还提供了用于治疗肝癌的组合物和方法。

Description

用于肝癌诊断和治疗的组合物和方法
对相关申请的交叉引用
本申请要求2013年3月15日提交的美国临床申请No.61/789,475的权益，通过提述将其公开内容完整收入本文就像列出一样。
序列表
本申请含有序列表，已经以ASCII格式电子提交且通过述及完整收入本文。2014年3月13日创建的所述ASCII拷贝命名为P5570R1_WO_SL.txt，并且大小为115,666个字节。
发明领域
一般而言，本发明涉及分子生物学领域。更具体的说，本发明涉及治疗病理性肝状况(诸如癌症)的方法。
发明背景
肝癌是癌症的第五位最常见形式。每年诊断大约750,000例，而且每年约700,000人死于该疾病，使之成为世界上癌症死亡的第三位最常见原因(Ferlayetal.,Int.J.Cancer127:2893-2917(2010))。在美国，原发性肝癌的发生率处在上升中，而且虽然检测和治疗局限性疾病取得了一些进展，但是晚期肝癌的5年存活率仍然大大低于10％(American-Cancer-Society.2012.CancerFacts&Figures2012.Atlanta:AmericanCancerSociety)。
已建立的肝癌治疗包括手术切除肝含肿瘤的部分(部分肝切除术)、肝移植、经导管动脉化学栓塞(TACE)，通过各种方法(诸如射频消融(RFA)或冷冻手术)的原位肿瘤破坏和施用Sorafenib。晚期肝患者的治疗选项是有限的。如此，肝癌的有效治疗仍然是重要的未满足的医学需求。
刻缺蛋白信号传导在肝癌中的作用尚未较好了解。Qi等人报告了在体外和在体内刻缺蛋白1信号传导通过诱导细胞周期阻滞和凋亡而抑制人肝细胞癌细胞生长(Qietal.,CancerRes.63:8323(2003))，而且Viatour等人报告了在鼠和人HCC细胞中刻缺蛋白1胞内域的表达降低增殖且诱导凋亡(Viatouretal.,J.Exp.Med.208(10):1963(2011))。其他人报告了刻缺蛋白1小干扰RNA(siRNA)降低细胞侵入和迁移，但是不降低存活力(Zhouetal.Dig.Dis.Sci.)。还有其他人报告了抑制个别刻缺蛋白途径家族成员没有影响。总之，刻缺蛋白途径在肝癌中的作用尚未较好了解。
发明概述
提供了刻缺蛋白2信号传导抑制剂用于治疗具有或有风险患上增殖性肝病症的患者的用途。
在一个方面，提供了在有所需要的个体中治疗肝癌的方法，其包括对该个体施用有效量的刻缺蛋白2信号传导抑制剂的步骤。在一些实施方案中，该肝癌是肝细胞癌、肝瘤、胆管瘤、肝母细胞瘤、肝癌、肝血管肉瘤、或转移性肝癌。在一些实施方案中，该肝细胞癌包含先祖样或胆管瘤样肝肿瘤。在一些实施方案中，该肝癌是顽固性癌症。
在一些实施方案中，该方法进一步包含施用至少一种别的治疗剂。别的治疗剂的例子包括但不限于化疗剂和抗体。
在一些实施方案中，该肝癌包含表达EpCAM、AFP、刻缺蛋白2、Jag1、刻缺蛋白2和Jag1、核刻缺蛋白2ICD、Sox9、CK19、Ras、Prom1、Spp1、FoxM1、Plk1、ccnb1、Aurkb、Wnt2、Axin2、或Glul、或其任意组合的细胞。在具体的实施方案中，该肝癌包含AFP+EpCAM+细胞。在一些实施方案中，该肝癌包含AFP+EpCAM-、AFP+EpCAM+SPP1+、AFP-EpCAM+、AFP-EpCAM+刻缺蛋白2+、AFP+EpCAM-刻缺蛋白2+、AFP+EpCAM+Sox9+和AFP+EpCAM+Sox9+或AFP-EpCAM+SPP1+细胞。具体涵盖包含具有备选标志物表达组合的细胞的肝癌。
在一些实施方案中，使用免疫组织化学(IHC)在来自该个体的样品中测定EpCAM、AFP、刻缺蛋白2、Jag1、Sox9、CK19、Ras、Prom1、Spp1、FoxM1、Plk1、ccnb1、Aurkb、Wnt2、Axin2、或Glul蛋白质表达中至少一项。在一些实施方案中，表达是核酸表达。在一些实施方案中，通过选自下组的方法测定表达：RNAseq、微阵列分析、免疫组织化学、酶联免疫吸附测定法、基因表达序型分析、聚合酶链式反应、SAGE、MassARRAY技术、荧光原位杂交和Western印迹。
在一些实施方案中，施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂导致该肝癌中EpCAM、AFP、刻缺蛋白2、刻缺蛋白2ICD、Jag1、Prom1、Spp1、FoxM1、Plk1、ccnb1和Aurkb中至少一项的表达降低。在一些实施方案中，施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂导致该肝癌中Wnt2、Axin2和Glul中至少一项的表达升高。在一些实施方案中，通过RNAseq、微阵列分析、免疫组织化学、酶联免疫吸附测定法、和Western印迹测定表达。
上述实施方案的任何抗体可以是全长IgG1或IgG2a抗体。在一些实施方案中，该抗体引起癌细胞死亡，例如肝癌细胞死亡。上述实施方案中的任何抗体可以是缀合至生长抑制剂的，例如细胞毒剂。细胞毒剂的例子包括但不限于毒素、抗生素、放射性同位素和溶核酶。上述实施方案中的任何抗体可以通过本领域中的已知方法生成，例如在细菌中或在CHO细胞中。
在一个方面，提供了用于在有风险患上肝癌的个体中预防肝癌的方法，其包括对该个体施用有效量的刻缺蛋白2信号传导抑制剂的步骤。在一些实施方案中，该个体具有选自下组的肝状况：乙型或丙型肝炎、肝硬化、非病毒性/非酒精性脂肪肝炎、良性肝肿瘤、血管瘤、肝的腺瘤、和局灶性结节增生。在一些实施方案中，该刻缺蛋白2信号传导抑制剂是抗Jag1抗体，例如抗Jag1拮抗性抗体。
在一个方面，提供了用于抑制表达分泌型磷蛋白1(SPP1)的细胞生长的方法，其包括使该细胞与刻缺蛋白2信号传导抑制剂接触，由此抑制该细胞生长。在一个实施方案中，SPP1蛋白质包含图11中所示氨基酸序列。在一个实施方案中，使该细胞与该刻缺蛋白2信号传导抑制剂接触降低该细胞中的SPP1表达。例如，使该细胞与该刻缺蛋白2信号传导抑制剂接触将该细胞中的SPP1表达降低至少约50％、60％、70％、80％、90％、或100％。可以通过本领域中的任何方法来测定SPP1mRNA或蛋白质的表达。在一些实施方案中，该刻缺蛋白2信号传导抑制剂是抗刻缺蛋白2抗体，例如抗刻缺蛋白2负调节区(NRR)抗体，诸如本文中公开的任何抗刻缺蛋白2NRR抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗Jag1抗体，诸如本文中公开的任何抗Jag1抗体。在一些实施方案中，该细胞是肝癌细胞。在一些实施方案中，该肝癌细胞表达EpCAM、AFP、AFP和EpCAM、刻缺蛋白2、Jag1、刻缺蛋白2和Jag1、核刻缺蛋白2ICD、Ras、Prom1、Spp1、FoxM1、Plk1、ccnb1、Aurkb、Wnt2、Axin2、或Glul，或其任意组合。在一些实施方案中，使该细胞与该刻缺蛋白2信号传导抑制剂接触导致该细胞中EpCAM、AFP、刻缺蛋白2、刻缺蛋白2ICD、Jag1、Prom1、Spp1、FoxM1、Plk1、ccnb1和Aurkb中至少一项的表达降低。在一些实施方案中，施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂导致该细胞中Wnt2、Axin2和Glul中至少一项的表达升高。在一些实施方案中，通过RNAseq、微阵列分析、免疫组织化学、酶联免疫吸附测定法、和Western印迹测定表达。
在一个方面，提供了用于抑制表达分泌型磷蛋白1(SPP1)的细胞增殖的方法，该方法包括使该细胞与刻缺蛋白2信号传导抑制剂接触，由此抑制该细胞增殖。
在一个方面，提供了用于治疗具有肝癌的哺乳动物的方法，该肝癌包含表达Spp1基因的细胞，该Spp1基因编码包含与图11中所示多肽具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的氨基酸序列的肽，该方法包括对该哺乳动物施用有效量的刻缺蛋白2信号传导抑制剂，由此有效治疗该哺乳动物。在一些实施方案中，该细胞表达包含与图11中所示多肽具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的氨基酸序列的SPP1蛋白质。
在一些实施方案中，该肝癌是肝细胞癌、肝瘤、胆管瘤、肝母细胞瘤、肝癌、肝血管肉瘤、或转移性肝癌。在一些实施方案中，该肝癌是顽固性癌症。本文中的任何抗体可以是全长IgG1或IgG2a抗体。在一些实施方案中，该抗体引起癌细胞死亡，例如肝细胞死亡。本文中的任何抗体可以是缀合至生长抑制剂的，例如细胞毒剂。细胞毒剂的例子包括但不限于毒素、抗生素、放射性同位素和溶核酶。本文中的任何抗体可以通过本领域中的已知方法生成，例如在细菌中或在CHO细胞中。
在一些实施方案中，该方法进一步包含施用至少一种别的治疗剂。别的治疗剂的例子包括但不限于化疗剂和抗体。
在一些实施方案中，该肝癌包含表达EpCAM、AFP、AFP和EpCAM、刻缺蛋白2、Jag1、刻缺蛋白2和Jag1、核刻缺蛋白2ICD、Ras、Prom1、Spp1、FoxM1、Plk1、ccnb1、Aurkb、Wnt2、Axin2、或Glul、或其任意组合的细胞。在一些实施方案中，施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂导致该肝癌中EpCAM、AFP、刻缺蛋白2、刻缺蛋白2ICD、Jag1、Prom1、Spp1、FoxM1、Plk1、ccnb1和Aurkb中至少一项的表达降低。在一些实施方案中，施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂导致该肝癌中Wnt2、Axin2和Glul中至少一项的表达升高。在一些实施方案中，通过RNAseq、微阵列分析、免疫组织化学、酶联免疫吸附测定法、和Western印迹测定表达。
在一个方面，提供了用于治疗与如下的蛋白质的表达或活性升高有关的肝细胞增殖性病症的方法，该蛋白质与图8C中所示多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％氨基酸序列同一性，该方法包括对需要此类治疗的个体施用有效量的抗Jag1拮抗性抗体，由此有效治疗该肝细胞增殖性病症。在一些实施方案中，该细胞增殖性病症是癌症，诸如肝癌。在一些实施方案中，该个体具有选自下组的肝状况：乙型或丙型肝炎、肝硬化、良性肝肿瘤、血管瘤、肝的腺瘤、和局灶性结节增生。
在某些实施方案中，该抗Jag1抗体是本文中描述的抗Jag1抗体。在某些实施方案中，该抗Jag1抗体是人抗体、人源化抗体、或嵌合抗体。在某些实施方案中，上述实施方案的任何抗体是抗体片段。
在一个方面，提供了用于治疗与如下的蛋白质的表达或活性升高有关的肝细胞增殖性病症的方法，该蛋白质与图11中所示多肽具有至少90％氨基酸序列同一性，该方法包括对需要此类治疗的个体施用有效量的抗Jag1拮抗性抗体，由此有效治疗该肝细胞增殖性病症。在一些实施方案中，该细胞增殖性病症是癌症，诸如肝癌。在一些实施方案中，该个体具有选自下组的肝状况：乙型或丙型肝炎、肝硬化、良性肝肿瘤、血管瘤、肝的腺瘤、和局灶性结节增生。
在一个方面，提供了用于在个体中降低血清SPP1蛋白质水平的方法，该方法包括对该个体施用有效量的刻缺蛋白2信号传导抑制剂，由此降低该个体中的血清SPP1水平。在一个实施方案中，该个体具有肝癌。在一个实施方案中，对该个体施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂之前的血清SPP1蛋白质水平为至少约80ng/ml。在某些实施方案中，对该个体施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂之前的血清SPP1蛋白质水平介于约80ng/ml和约500ng/ml之间，介于约86ng/ml和约250ng/ml之间，介于约120ng/ml和约170ng/ml之间，或约165ng/ml。在一些实施方案中，对该个体施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂导致血清SPP1蛋白质水平低于80ng/ml。在具体的实施方案中，施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂之前的血清SPP1蛋白质水平为施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂之前24小时。可以通过任何适宜方法测定(诸如酶联免疫吸附测定法)施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂之前或之后的血清SPP1蛋白质水平。在具体的实施方案中，血清SPP1蛋白质水平在施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂之后约1、2、3、6或12个月降低。在一些实施方案中，该肝癌是肝细胞癌、肝瘤、胆管瘤、肝母细胞瘤、肝癌、肝血管肉瘤或转移性肝癌。在一些实施方案中，该刻缺蛋白2信号传导抑制剂是siRNA、小分子抑制剂或抗体。在一些实施方案中，该抗体是拮抗性抗体。
在某些实施方案中，上述实施方案的任何抗体是单克隆抗体。在某些实施方案中，上述实施方案的任何抗体是人抗体、人源化抗体、或嵌合抗体。在某些实施方案中，上述实施方案的任何抗体是抗体片段。
在一些实施方案中，该方法进一步包含施用至少一种别的治疗剂。别的治疗剂的例子包括但不限于化疗剂和抗体。在一些实施方案中，Sorafenib是别的治疗剂。
在一些实施方案中，该肝癌包含表达EpCAM、AFP、AFP和EpCAM、刻缺蛋白2、Jag1、刻缺蛋白2和Jag1、核刻缺蛋白2ICD、Ras、Prom1、Spp1、FoxM1、Plk1、ccnb1、Aurkb、Wnt2、Axin2、或Glul、或其任意组合的细胞。在一些实施方案中，Ras是突变型Ras。在一些实施方案中，施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂导致该肝癌中EpCAM、AFP、刻缺蛋白2、刻缺蛋白2ICD、Jag1、Prom1、Spp1、FoxM1、Plk1、ccnb1和Aurkb中至少一项的表达降低。在一些实施方案中，施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂导致该肝癌中Wnt2、Axin2和Glul中至少一项的表达升高。在一些实施方案中，通过RNAseq、微阵列分析、免疫组织化学、酶联免疫吸附测定法、和Western印迹测定表达。
在一个方面，提供了用于在哺乳动物中治疗肝肿瘤的方法，其中该肝肿瘤的生长至少部分依赖于刻缺蛋白2信号传导的生长强化效应，其包括使该肿瘤与结合刻缺蛋白2或Jag1的抗体接触。在一个实施方案中，该抗体对该肿瘤的结合拮抗刻缺蛋白2的生长强化活性。在一些实施方案中，该哺乳动物是人。
在一个方面，提供了用于治疗肝癌的方法，其包括对具有升高的血清SPP1蛋白质水平的个体施用有效量的刻缺蛋白2信号传导抑制剂。在一个实施方案中，该个体的血清SPP1蛋白质水平为至少约80ng/ml。在某些实施方案中，对该个体施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂之前的血清SPP1蛋白质水平介于约80ng/ml和约500ng/ml之间，介于约86ng/ml和约250ng/ml之间，介于约120ng/ml和约170ng/ml之间，或约165ng/ml。在一些实施方案中，对该个体施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂导致血清SPP1蛋白质水平低于80ng/ml。在具体的实施方案中，施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂之前的血清SPP1蛋白质水平为施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂之前24小时。可以通过任何适宜方法(诸如酶联免疫吸附测定法)测定施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂之前或之后的血清SPP1蛋白质水平。在具体的实施方案中，该个体中的血清SPP1蛋白质水平在施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂之后约1、2、3、6或12个月降低、。在一些实施方案中，该肝癌是肝细胞癌、肝瘤、胆管瘤、肝母细胞瘤、肝癌、肝血管肉瘤或转移性肝癌。在一些实施方案中，该刻缺蛋白2信号传导抑制剂是siRNA、小分子抑制剂或抗体。在一些实施方案中，该抗体是拮抗性抗体，诸如抗刻缺蛋白2拮抗性抗体或抗Jag1拮抗性抗体。
在一些方面，提供了用于治疗具有肝癌的个体的方法，其包括下述步骤：对该个体施用刻缺蛋白2信号传导抑制剂；并测定刻缺蛋白2信号传导，其中治疗后的刻缺蛋白2信号传导与治疗前的刻缺蛋白2信号传导相比降低指示该个体中的肝癌减轻。在一些实施方案中，通过测量刻缺蛋白2ICD核定位(例如通过来自该个体的肝癌样品的免疫组织化学分析)来测定刻缺蛋白2信号传导。在一些实施方案中，通过测量选自下组的基因的表达来测定刻缺蛋白2信号传导：刻缺蛋白2、Jag1、Hes和Hey1。可以通过任何方法测定表达，例如RT-PCR、微阵列、和RNAseq分析。在一些实施方案中，该肝癌是肝细胞癌、肝瘤、胆管瘤、肝母细胞瘤、肝癌、肝血管肉瘤、和转移性肝癌。在一些实施方案中，该刻缺蛋白2信号传导抑制剂是siRNA、小分子抑制剂或抗体。在一些实施方案中，该抗体是拮抗性抗体，诸如抗刻缺蛋白2拮抗性抗体或抗Jag1拮抗性抗体。
在一些方面，用于抑制细胞增殖的方法包括用针对刻缺蛋白2或Jag1的抗体处理哺乳动物肝癌细胞，由此抑制该肝癌细胞增殖。在某些实施方案中，该细胞在患者中。在某些实施方案中，该细胞在培养液中。在某些实施方案中，该细胞是肝癌细胞。在某些实施方案中，该抗体是本文中描述的抗刻缺蛋白2或抗Jag1拮抗性抗体。在某些实施方案中，该抗体是人抗体、人源化抗体、或嵌合抗体。在某些实施方案中，上述实施方案的任何抗体是抗体片段。
在本文中的任何方法中，刻缺蛋白2信号传导抑制剂可以是下述抑制剂。在一些实施方案中，该刻缺蛋白2信号传导抑制剂是siRNA、小分子抑制剂或抗体。在一些实施方案中，该抗体是拮抗性抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗刻缺蛋白2抗体，例如抗刻缺蛋白2负调节区(NRR)抗体。在一些实施方案中，该抗体对除刻缺蛋白2以外的刻缺蛋白家族成员没有显著结合。在一些实施方案中，该抗体例如以≤10nM的Kd结合小鼠刻缺蛋白2NRR和人刻缺蛋白2NRR。在一些实施方案中，该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：1的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：3的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：4的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含符合SEQIDNO：9的共有序列的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含符合SEQIDNO：14的共有序列的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含符合SEQIDNO：19的共有序列的氨基酸序列的HVR-L3。
在又一些实施方案中，该抗体是抗Jag1抗体。在一些实施方案中，该抗体包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下述的HVR：(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO：84的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO：87的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO：92的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含：(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO：82的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO：85的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO：90的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个实施方案中，该抗体包含：(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO：82的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO：86的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO：91的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含：(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO：83的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO：85的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO：90的氨基酸序列的HVR-L3。
在某些实施方案中，本文中的实施方案的任何抗体是单克隆抗体。在某些实施方案中，上述实施方案的任何抗体是人抗体、人源化抗体、或嵌合抗体。在某些实施方案中，上述实施方案的任何抗体是抗体片段。
在又一个实施方案中，本文中的实施方案的任何抗体进一步包含如下的轻链可变域框架LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3、和LC-FR4，该轻链可变域框架LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3、和LC-FR4依次包含图18的huMAb4D5-8轻链可变域框架LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3、和LC-FR4的氨基酸序列。
在又一个实施方案中，本文中的实施方案的任何抗体进一步包含如下的重链可变域框架HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3、和HC-FR4，该重链可变域框架HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3、和HC-FR4依次包含图18的huMAb4D5-8重链可变域框架HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3、和HC-FR4的氨基酸序列。
在又一个实施方案中，本文中的实施方案的任何抗体进一步包含如下的轻链可变域框架LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3、和LC-FR4，该轻链可变域框架LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3、和LC-FR4依次包含图19的huMAb4D5-8轻链可变域框架LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3、和LC-FR4的氨基酸序列。
在又一个实施方案中，本文中的实施方案的任何抗体进一步包含如下的重链可变域框架HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3、和HC-FR4，该重链可变域框架HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3、和HC-FR4依次包含图19的huMAb4D5-8重链可变域框架HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3、和HC-FR4的氨基酸序列。
在某些实施方案中，该抗体是结合Jag1的分离的抗体，其包含(a)与SEQIDNO：94的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；(b)与SEQIDNO：97的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。在一些实施方案中，该抗体包含SEQIDNO：94的VH序列。在一些实施方案中，该抗体包含SEQIDNO：97的VL序列。在一些实施方案中，该抗体包含SEQIDNO：94的VH序列和SEQIDNO：97的VL序列。在一些实施方案中，该抗体包含(a)与SEQIDNO：95的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；(b)与SEQIDNO：98的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。在一些实施方案中，该抗体包含SEQIDNO：95的VH序列。在一些实施方案中，该抗体包含SEQIDNO：98的VL序列。在一些实施方案中，该抗体包含SEQIDNO：95的VH序列和SEQIDNO：98的VL序列。
在某些实施方案中，该抗体是结合Jag1的分离的抗体，其包含(a)与SEQIDNO：93的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；(b)与SEQIDNO：96的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。在一些实施方案中，该抗体包含SEQIDNO：93的VH序列。在一些实施方案中，该抗体包含SEQIDNO：96的VL序列。在一些实施方案中，该抗体包含SEQIDNO：93的VH序列和SEQIDNO：96的VL序列。
在一个方面，提供一种制品，其包含：(a)容器；(b)该容器内装的用于治疗肝癌的包含抗刻缺蛋白2抗体或抗锯齿蛋白1抗体和载剂的组合物；和(c)贴在该容器上的标签或与该容器一起包括的包装插页，其涉及该组合物用于治疗性处理或诊断性检测肝癌的用途。
在一个方面，提供了一种抗刻缺蛋白2抗体，其用于治疗肝癌。在某些实施方案中，该肝癌是肝细胞癌。在某些实施方案中，该抗体是抗刻缺蛋白2NRR拮抗性抗体。在一个方面，提供了一种抗Jag1抗体，其用于治疗肝癌。在某些实施方案中，该肝癌是肝细胞癌。在某些实施方案中，该抗体是抗Jag1拮抗性抗体。
在一个方面，提供了抗刻缺蛋白2抗体在制备用于治疗性处理肝癌的药物中的用途。在一个方面，提供了抗锯齿蛋白1抗体在制备用于治疗性处理肝癌的药物中的用途。
在一个方面，提供了本文中描述的制品在制备用于治疗性处理肝癌的药物中的用途。在一个方面，提供了本文中描述的制品在制备用于治疗或预防肝细胞增殖性病症的药物中的用途。
附图简述
图1A-F图示AKT/RasHTV肝癌模型中的肝癌标志物表达的表征。图1A-C描绘呈AFP+EpCAM-(图1A)、AFP+EpCAM+(图1B)和AFP-EpCAM+(图1C)的肿瘤的免疫组织化学染色。图1D描绘标志物表达的流行性，以总细胞的百分百表示。图1F描绘刻缺蛋白2信号传导的激活的免疫组织化学染色，通过刻缺蛋白2蛋白在核中的定位来指示。图1E描绘具有核刻缺蛋白2染色的百分百细胞。
图2A-D图示用抗刻缺蛋白2或抗Jag1拮抗性抗体处理的Ras/AKTHTV小鼠中降低的肿瘤负荷。图2A描绘自在HTV那天开始用同种型对照抗体(左上)、抗刻缺蛋白2抗体(右上)或抗Jag1抗体(左下)处理的HTV小鼠分离的肝。图2B描绘在HTV注射时施用的抗体处理后的Ras/AKTHTV小鼠肝重量，以百分比体重表示。图2C描绘HTV注射后两周施用的抗体处理后的Ras/AKTHTV小鼠肝重量，以百分比体重表示(p<0.05，n>8)。图2D描绘抗体处理后的Ras/AKTHTV小鼠肝重量(p<0.02，n>6)。
图3A-H图示用刻缺蛋白抑制性抗体处理携带AKT/RasHTV肿瘤的小鼠阻碍广泛肿瘤类型发生。图3A描绘用抗刻缺蛋白2、抗Jag1或同种型对照抗体处理的AKT/RasHTV小鼠的肝中AFP和EpCAM表达的免疫荧光分析。图3B和C描绘抗刻缺蛋白2和抗Jag1处理后缩小的EpCAM+(图3B；p<0.007，n≥7)和AFP+(图3C；p<0.03，n≥7)面积。图3D描绘用抗刻缺蛋白1抗体处理的AKT/RasHTV小鼠的肝中AFP和EpCAM表达的免疫荧光分析。图3E描绘用抗刻缺蛋白1、抗刻缺蛋白2、抗刻缺蛋白3、抗Jag1或同种型对照抗体处理AKT/RasHTV小鼠后EpCAM+细胞的百分百。图3F描绘用抗刻缺蛋白1、抗刻缺蛋白2、抗刻缺蛋白3、抗Jag1或同种型对照抗体处理AKT/RasHTV小鼠后细胞角蛋白19(CK19)的相对表达。图3G和图3H分别描绘用抗刻缺蛋白1、抗刻缺蛋白2、抗刻缺蛋白3、抗Jag1或同种型对照抗体处理AKT/RasHTV小鼠后Sox9的RNA和蛋白质水平。
图4A-E图示了用刻缺蛋白抑制性抗体处理AKT/RasHTV小鼠降低携带肿瘤的肝中的刻缺蛋白途径激活。图4A描绘刻缺蛋白2核免疫组织化学染色，以细胞的数目表示。图4B描绘刻缺蛋白2的相对表达，通过QRTPCR测定。图4C描绘携带AKT/RasHTV肿瘤的肝中Hes1的免疫组织化学染色。图4D描绘Hes1+细胞的分数，通过免疫组织化学测定。图4E描绘HeyL的相对表达，通过QRTPCR测定。
图5A-I图示在肝癌的AKT/Ras模型中刻缺蛋白抑制性抗体对刻缺蛋白信号传导途径成分的表达的影响。用针对刻缺蛋白1、刻缺蛋白2、刻缺蛋白3、或Jag1的拮抗性抗体或抗豚草阴性对照抗体处理进行AKT/RasHTV的小鼠，并在5周后针对刻缺蛋白1(图5A)、刻缺蛋白2(图5B)、刻缺蛋白3(图5C)、刻缺蛋白4(图5D)、Jag1(图5E)、Jag2(图5F)、DLL1(图5G)、DLL3(图5H)、DLL4(图5I)对自肝分离的RNA实施定量实时PCR。
图6A-I图示来自RNAseq分析的结果，该RNAseq分析是对来自用同种型对照、抗刻缺蛋白2或抗Jag1抗体处理的AKT/RasHTV小鼠的肝进行的。描绘了Prom1(图6A)、Spp1(图6B)、FoxM1(图6C)、Plk1(图6D)、ccnb1(图6E)、Aurkb(图6F)、Wnt2(图6G)、Axin2(图6H)和谷氨酰胺合成酶(Glul，图6I)的标准化计数。
图7A-B图示人HCC中刻缺蛋白2的表达。图7A描绘培养的人HCC细胞系中的刻缺蛋白1、刻缺蛋白2和刻缺蛋白3表达，通过RT-PCR测定。图7B描绘人HCC肿瘤中针对刻缺蛋白2、Jag1和Hes1的免疫组织化学染色。
图8A-D显示人(C)和鼠(D)刻缺蛋白2蛋白及人(A)和鼠(B)刻缺蛋白2负调节区(NRR)的例示性氨基酸序列。
图9显示人和鼠锯齿蛋白1蛋白的例示性氨基酸序列。
图10A-B显示用于噬菌体抗体文库筛选和选择的肽的氨基酸序列。在BEVS细胞中作为分泌型蛋白质表达所有蛋白质，以N端至C端方向列出它们的序列。图10A显示表达的蛋白质鼠锯齿蛋白1-DSL-EGF1-4(Q34-D377)的氨基酸序列。N端处的粗体代表短接头序列(ADLGS)(SEQIDNO：2)。C端处的粗体代表短接头序列(EFG)、凝血酶切割位点(LVPRGS)(SEQIDNO：26)、G间隔物和6-His标签(SEQIDNO：27)。图10B显示表达的蛋白质人Jag1-DSL-EGF1-4的氨基酸序列。只显示了Jag1序列，尽管该抗原还在C端包含TEV蛋白酶切割位点和6-His标签(SEQIDNO：27)。
图11显示人分泌型磷蛋白1(SPP1)的一种例示性氨基酸序列。
图12显示抗刻缺蛋白2NRR拮抗性抗体的H1、H2、和H3重链高变区(HVR)序列。氨基酸位置是依照下文所述Kabat编号系统编号的。
图13显示抗刻缺蛋白2NRR拮抗性抗体的L1、L2、和L3轻链HVR序列。氨基酸位置是依照下文所述Kabat编号系统编号的。
图14A-B显示抗刻缺蛋白2抗体的重链可变域的氨基酸序列比对。标示了互补决定区(CDR)的氨基酸位置。
图15A-B显示抗刻缺蛋白2抗体的轻链可变域的氨基酸序列比对。标示了互补决定区(CDR)的氨基酸位置。
图16A-B显示用于实施本发明的例示性受体人可变重(VH)共有框架序列。序列标识符如下：
-人VH亚组I共有框架“A”减去KabatCDR(SEQIDNO：32，33，34，35)。
-人VH亚组I共有框架“B”、“C”、和“D”减去延伸的高变区(SEQIDNO：36，37，34，35；SEQIDNO：36，37，38，35；和SEQIDNO：36，37，39，35)。
-人VH亚组II共有框架“A”减去KabatCDR(SEQIDNO：40，41，42，35)。
-人VH亚组II共有框架“B”、“C”、和“D”减去延伸的高变区(SEQIDNO：43，44，42，35；SEQIDNO：43，44，45，35；和SEQIDNO：43，44，46，和35)。
-人VH亚组III共有框架“A”减去KabatCDR(SEQIDNO：47，48，49，35)。
-人VH亚组III共有框架“B”、“C”、和“D”减去延伸的高变区(SEQIDNO：50，51，49，35；SEQIDNO：50，51，52，35；和SEQIDNO：50，51，53，35)。
-人VH受体框架“A”减去KabatCDR(SEQIDNO：54，48，55，35)。
-人VH受体框架“B”和“C”减去延伸的高变区(SEQIDNO：50，51，55，35；和SEQIDNO：50，51，56，35)。
-人VH受体2框架“A”减去KabatCDR(SEQIDNO：54，48，57，35)。
-人VH受体2框架“B”、“C”和“D”减去延伸的高变区(SEQIDNO：50，51，57，35；SEQIDNO：50，51，58，35；和SEQIDNO：50，51，59，35)。
图17显示用于实施本发明的例示性受体人可变轻(VL)共有框架序列。序列标识符如下：
-人VL卡帕亚组I共有框架(κv1)：SEQIDNO：60，61，62，63
-人VL卡帕亚组II共有框架(κv2)：SEQIDNO：64，65，66，63
-人VL卡帕亚组III共有框架(κv3)：SEQIDNO：67，68，69，63
-人VL卡帕亚组IV共有框架(κv4)：SEQIDNO：70，71，72，63。
图18描绘huMAb4D5-8轻和重链的框架区序列(依出现次序分别为SEQIDNO60，61，30，63，50，51，59和35)。上标的数字指示依照Kabat的氨基酸位置。
图19描绘huMAb4D5-8轻和重链的经修饰/变体框架区序列(依出现次序分别为SEQIDNO60，61，62，31，50，51，53和35)。上标的数字指示依照Kabat的氨基酸位置。
图20显示实施例中描述的抗锯齿蛋白抗体的H1、H2、和H3重链高变区(HVR)序列。氨基酸位置是依照下文所述Kabat编号系统编号的。
图21显示实施例中描述的抗锯齿蛋白抗体的L1、L2、和L3轻链HVR序列。氨基酸位置是依照下文所述Kabat编号系统编号的。
图22显示抗锯齿蛋白抗体的轻和重链可变域框架序列(依出现次序分别为SEQIDNO60，61，62，77，50，99，57和35)。上标中的数字指示依照Kabat的氨基酸位置。
图23A-B显示实施例中描述的针对刻缺蛋白2(SEQIDNO：100)(B？)、刻缺蛋白1(SEQIDNO：101)(Y)、刻缺蛋白3(SEQIDNO：102)(W)和Jag1(SEQIDNO：103)(A-2)的抗体的重链可变域的氨基酸序列的比对。
图24A-B显示实施例中使用的针对刻缺蛋白2(SEQIDNO：104)、刻缺蛋白1(SEQIDNO：105)、刻缺蛋白3(SEQIDNO：106)和Jag1(SEQIDNO：107)的抗体的轻链可变域的氨基酸序列的比对。
图25A-B显示抗Jag1抗体的重(图25A)和轻(图25B)链可变域的氨基酸序列的比对。标示了互补决定区(CDR)的氨基酸位置。
发明详述
I.定义
出于本文中的目的，“受体人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定义的人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。
“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)来表述。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性的实施方案。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中具有一处或多处改变的抗体，与不拥有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。
术语“抗Jag1抗体”和“结合Jag1的抗体”指能够以足够亲和力结合Jag1，使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向Jag1的抗体。在一个实施方案中，根据例如通过放射免疫测定法(RIA)的测量，抗Jag1抗体结合无关的、非Jag1的蛋白质的程度小于该抗体对Jag1的结合的约10％。在某些实施方案中，结合Jag1的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M到10-13M，例如10-9M到10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗Jag1抗体结合在来自不同物种的Jap1中保守的Jag1表位。
“抗Jag1拮抗性抗体”指效果是降低Jag1介导的信号传导(例如Jag1介导的刻缺蛋白2信号传导)的抗Jag1抗体。
术语“抗刻缺蛋白2抗体”和“结合刻缺蛋白2的抗体”指能够以足够的亲和力结合刻缺蛋白2，使得抗体可用作靶向刻缺蛋白2中的诊断和/或治疗剂的抗体。在一个实施方案中，抗刻缺蛋白2抗体对无关的、非刻缺蛋白2蛋白的结合程度小于抗体对刻缺蛋白2的结合的约10％，如例如通过放射性免疫测定法(RIA)测量的。在某些实施方案中，结合刻缺蛋白2的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗刻缺蛋白2抗体结合来自不同物种的刻缺蛋白2间保守的刻缺蛋白2表位。
“抗刻缺蛋白2拮抗性抗体”指效果是降低刻缺蛋白2信号传导(如下文定义的)的抗刻缺蛋白2抗体(包括抗刻缺蛋白2NRR抗体)。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，且相反，参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50％或更多。本文中提供了例示性的竞争测定法。
“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体指显著抑制(部分地或完全地)其所结合的抗原的生物学活性的抗体。
术语“嵌合”抗体指其中的重和/或轻链的一部分自特定的来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体。
术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长/增殖不受调节的生理状况。肝癌的例子包括但不限于肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma)、肝瘤(hepatoma)、肝母细胞瘤(hepatoblastoma)、胆管瘤(cholangiocarcinoma)、肝母细胞瘤(hepatoblastoma)、肝癌(hepaticcarcinoma)、肉瘤(sarcoma)、淋巴瘤(lymphoma)和肝血管肉瘤(hepaticangiosarcoma)。肝癌还包括源自肝且转移至身体另一部分的癌。
术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与某种程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症为癌症。
“化学治疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化学治疗剂的例子包括烷化剂类(alkylatingagents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclosphosphamide)磺酸烃基酯类(alkylsulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)，)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinicacid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)CPT-11(伊立替康(irinotecan)，)、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycin)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogenmustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(chlorophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracilmustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(见例如Nicolaou等,Angew.ChemIntl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；CDP323，即一种口服α-4整联蛋白抑制剂；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括蒽环类抗生素A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycins)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和盐酸多柔比星脂质体注射液脂质体多柔比星TLCD-99PEG化的脂质体多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤、吉西他滨(gemcitabine)替加氟(tegafur)卡培他滨(capecitabine)埃博霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素诸如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酪(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinicacid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptiniumacetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(JHSNaturalProducts,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2’,2’-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoid)，例如帕利他塞(paclitaxel)清蛋白改造的纳米颗粒剂型帕利他塞(ABRAXANETM)和多西他塞(doxetaxel)苯丁酸氮芥(chloranbucil)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂剂，诸如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)(例如)、和卡铂(carboplatin)；长春药类(vincas)(其阻止微管蛋白聚合形成微管)，包括长春碱(vinblastine)长春新碱(vincristine)长春地辛(vindesine)和长春瑞滨(vinorelbine)依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；亚叶酸(leucovorin)；能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸(retinoids)，诸如视黄酸(retinoicacid)，包括贝沙罗汀(bexarotene)二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如或)、依替膦酸钠(etidronate)NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronicacid/zoledronate)阿伦膦酸盐(alendronate)帕米膦酸盐(pamidronate)替鲁膦酸盐(tiludronate)或利塞膦酸盐(risedronate)曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉异常(aberrant)细胞增殖的信号传导途径中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如疫苗和基因疗法疫苗，例如疫苗、疫苗和疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如)；rmRH(例如)；BAY439006(索拉非尼(Sorafenib)；Bayer)；SU-11248(舒尼替尼(sunitinib)，Pfizer)；哌立福辛(perifosine)、COX-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib)或依托昔布(etoricoxib))、蛋白体抑制剂(例如PS341)；保特佐米(bortezomib)CCI-779；替吡法尼(tipifarnib)(R11577)；orafenib、ABT510；Bcl-2抑制剂诸如奥利默森钠(oblimersensodium)pixantrone；EGFR抑制剂(见下文定义)；酪氨酸激酶抑制剂(见下文定义)；丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂诸如雷帕霉素(rapamycin)(西罗莫司(sirolimus),)；法尼基转移酶抑制剂诸如洛那法尼(lonafarnib)(SCH6636,SARASARTM)；及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或更多种上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。
如本文中所定义的，化学治疗剂包括“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”，其作用为调节、降低、阻断、或抑制可促进癌症生长的激素的效果。它们自身可以是激素，包括但不限于：具有混合的激动剂/拮抗剂概况的抗雌激素，包括他莫昔芬(tamoxifen)4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene)艾多昔芬(idoxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、雷洛昔芬(raloxifene)曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、和选择性雌激素受体调节剂类(SERM)诸如SERM3；没有激动剂特性的纯抗雌激素，诸如氟维司群(fulvestrant)和EM800(此类药剂可以阻断雌激素受体(ER)二聚化，抑制DNA结合，增加ER周转，和/或抑制ER水平)；芳香酶抑制剂，包括类固醇芳香酶抑制剂诸如福美坦(formestane)和依西美坦(exemestane)和非类固醇芳香酶抑制剂诸如阿那曲唑(anastrazole)来曲唑(letrozole)和氨鲁米特(aminoglutethimide)，而其它芳香酶抑制剂包括伏罗唑(vorozole)醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)法倔唑(fadrozole)、和4(5)-咪唑；促黄体生成激素释放激素激动剂，包括亮丙瑞林(leuprolide)(和)、戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)、和曲普瑞林(tripterelin)；性类固醇，包括妊娠素(progestines)诸如醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮、雌激素诸如己烯雌酚和倍美力(premarin)、和雄激素/类视黄醇诸如氟甲睾酮(fluoxymesterone)、全反式视黄酸(transretionicacid)和芬维A胺(fenretinide)；奥那司酮(onapristone)；抗孕酮；雌激素受体下调剂(ERD)；抗雄激素诸如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或更多种上述物质的组合。
抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5大类：IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，并且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、和IgA2。与不同类免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ、和μ。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分(C1q)结合抗体(适宜亚类的)起始的，该抗体已结合至其关联抗原。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoroetal.,J.Immunol.Methods202:163(1996)中所记载的。具有更改的Fc区氨基酸序列(具有变异Fc区的多肽)及提高或降低的C1q结合能力的多肽变体记载于例如美国专利No.6,194,551B1和WO1999/51642。还可参见例如Idusogieetal.,J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
在用于本文时，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于：放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱类(vincaalkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。
术语“细胞抑制剂”指在体外或在体内阻滞细胞生长的化合物或组合物。如此，细胞抑制剂可以是显著降低处于S期的细胞百分比的药剂。细胞抑制剂的其它的例子包括通过诱导G0/G1停滞或M期停滞来阻断细胞周期行进的药剂。人源化抗Her2抗体曲妥单抗是诱导G0/G1阻滞的细胞抑制剂的一个例子。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉烷类(taxanes)、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。某些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见Mendelsohn和Israel编，《TheMolecularBasisofCancer》，第1章，题为“Cellcycleregulation,oncogenes,andantieioplasticdrugs”，Murakaini等，W.B.Saunders，Philadelphia，1995，例如第13页。紫杉烷类(帕利他塞(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))是衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他赛Rhone-PoulencRorer)是帕利他塞(Bristol-MyersSquibb)的半合成类似物。帕利他塞和多西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞中有丝分裂的抑制。
“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。
药剂(例如药物配制剂)的“有效量”指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。
术语“表达”指基因中编码的信息转换成信使RNA(mRNA)，然后转换成蛋白质。
在本文中，“表达”感兴趣蛋白质的样品或细胞指其中测定出存在编码该蛋白质的mRNA或蛋白质(包括其片段)的样品或细胞。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区一部分的C端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226，或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，又称作EU索引，如记载于Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD,1991。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。一般地，可变域的FR由4个FR域组成：FR1、FR2、FR3、和FR4。因而，HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以如下的顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”、和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有如本文中所限定的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”、和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。
“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版,NIHPublication91-3242,BethesdaMD(1991),第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组III。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体，例如非人抗体的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。
在用于本文时，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上限定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触”)的每个区。一般地，抗体包含6个HVR：三个在VH中(H1、H2、H3)，且三个在VL中(L1、L2、L3)。本文中的例示性HVR包括：
(a)高变环，存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、和96-101(H3)(ChothiaandLesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)CDR，存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)、和95-102(H3)(Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991))；
(c)抗原接触，存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)、和93-101(H3)(MacCallumetal.J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和
(d)(a)、(b)、和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)、和94-102(H3)。
在一个实施方案中，HVR残基包含图12、13、20和21中鉴定的那些。
除非另有说明，HVR残基及可变域中的其它残基(例如FR残基)在本文中是依照Kabat等，见上文编号的。
“免疫缀合物”指与一种或多种异源分子，包括但不限于细胞毒剂缀合的抗体。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如，牛、绵羊、猫、犬、和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类诸如猴)、家兔、和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
“有风险患上肝癌的个体”指具有高于平均的获得肝癌的倾向的个体。有风险患上肝癌的个体的例子包括但不限于具有肝炎(例如乙型或丙型肝炎、肝硬化、良性肝肿瘤、血管瘤、肝的腺瘤、和局灶性结节增生的个体。
术语“抑制”表示与参照相比减少或降低活性、功能、和/或量。
“抑制细胞生长或增殖”意味着将细胞的生长或增殖降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或100％，而且包括诱导细胞死亡。
“分离的抗体”指已经与其天然环境的组分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述，见例如Flatman等,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。
“分离的核酸”指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但是核酸分子在染色体外或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。
“编码抗Jag1抗体的分离的核酸”或“编码抗刻缺蛋白2抗体的分离的核酸”指编码抗体重和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括单一载体或不同载体中的此类核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置的此类核酸分子。
如本文中使用的，术语“锯齿蛋白”(Jagged)或“Jag”指来自任何脊椎动物来源的任何天然锯齿蛋白，包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)，除非另有说明。该术语涵盖“全长”未加工Jag以及源自细胞中加工的任何形式的锯齿蛋白。该术语还涵盖锯齿蛋白的天然发生变体，例如剪接变体或等位变体。
如本文中使用的，术语“锯齿蛋白1”或“Jag1”指来自任何脊椎动物来源的任何天然Jag1，包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)，除非另有说明。该术语涵盖“全长”未加工Jag1以及源自细胞中加工的任何形式的Jag1。该术语还涵盖Jag1的天然发生变体，例如剪接变体或等位变体。一种例示性人和鼠Jag1的氨基酸序列显示于图9。
如本文中使用的，术语“表达的水平”或“表达水平”指生物学样品中多核苷酸、mRNA、或氨基酸产物或蛋白质的量。
在用于本文时，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特性，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。
“裸抗体”指未与异源模块(例如细胞毒性模块)或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物配制剂中。
“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫化物键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域(CH1、CH2、和CH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域或轻链可变域，接着是一个恒定轻(CL)域。根据其恒定域氨基酸序列，抗体轻链可归入两种类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
如本文中使用的，术语“刻缺蛋白”(Notch)指来自任何脊椎动物来源的任何天然刻缺蛋白，包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)，除非另有说明。该术语涵盖“全长”未加工刻缺蛋白以及源自细胞中加工的任何形式的刻缺蛋白。该术语还涵盖刻缺蛋白的天然发生变体，例如剪接变体或等位变体。
如本文中使用的，术语“刻缺蛋白2”指来自任何脊椎动物来源的任何天然刻缺蛋白2，包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)，除非另有说明。该术语涵盖“全长”未加工刻缺蛋白2以及源自细胞中加工的任何形式的刻缺蛋白2。该术语还涵盖刻缺蛋白2的天然发生变体，例如剪接变体或等位变体。一种例示性人刻缺蛋白2的氨基酸序列显示于图8。
术语“刻缺蛋白2信号传导抑制剂”指效果是降低刻缺蛋白2信号传导(如上文定义的)的药剂。刻缺蛋白2信号传导抑制剂包括刻缺蛋白2特异性拮抗剂和Jag1特异性拮抗剂。刻缺蛋白2特异性拮抗剂降低刻缺蛋白2信号传导且对由另一刻缺蛋白受体(哺乳动物中的刻缺蛋白1、3、或4)进行的信号传导没有显著影响。刻缺蛋白2特异性拮抗剂的例子包括阻断刻缺蛋白2结合刻缺蛋白2配体的药剂。Jag1特异性拮抗剂降低Jag1介导的信号传导。Jag1特异性拮抗剂的例子包括结合刻缺蛋白2的药剂。泛刻缺蛋白抑制剂(诸如γ分泌酶抑制剂)明确排除在本文中定义的刻缺蛋白2信号传导抑制剂以外。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定用于比对序列的合适参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，并且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(USCopyrightOffice,WashingtonD.C.,20559)，其中其以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco,California可获得ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统，包括数码UNIXV4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y乘100
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。应当领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
术语“药物配制剂”指处于如下的形式，使得容许其中含有的活性成分的生物学活性是有效的，且不含对会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的别的组分的制剂。
“药学可接受载体”指药物配制剂中与活性成分不同的，且对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂、或防腐剂。
“复发性”指患者的病在消退后回到其从前的患病状态，尤其是在表观恢复(apparentrecovery)或部分恢复(partialrecovery)后症状的回复。除非另有说明，复发状态指回到先前治疗(包括但不限于化疗和干细胞移植治疗)前的病的过程或回到先前治疗前的病。
“顽固性”或“不应性”指疾病或疾患对治疗有抗性或没有响应(例如，即使给予治疗，新生性浆细胞的数目仍增加)。除非另有说明，术语“顽固性”或“不应性”指对任何先前治疗(包括但不限于化疗和干细胞移植治疗)有抗性或没有响应。
如本文中使用的，术语“分泌型磷蛋白1”(secretedphosphoprotein1)或“SPP1”或“骨桥蛋白”(osteopontin)指来自任何脊椎动物来源的任何天然SPP1，包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)，除非另有说明。该术语涵盖“全长”未加工SPP1以及源自细胞中加工的任何形式的SPP1。该术语还涵盖SPP1的天然发生变体，例如剪接变体或等位变体。一种例示性人SPP1的氨基酸序列显示于图11。
短语“实质性降低”或“实质性不同”在用于本文时指两个数值之间足够高的差异程度(通常一个与分子有关，另一个与参照/比较分子有关)，以致本领域技术人员将认为在用所述数值(例如Kd值)所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有统计学显著性。
术语“基本上相似”或“基本上相同”在用于本文时指两个数值之间足够高的相似程度(例如一个与本发明的抗体有关，另一个与参照/比较抗体有关)，以致本领域技术人员将认为在用所述数值(例如Kd值)所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有很小的或没有生物学和/或统计学显著性。
术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
在用于本文时，“治疗”(及其语法变化形式，诸如“处理”或“处置”)指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在有些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的发生/发展，或用于减缓疾病的进展。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构，其中每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)。(见例如Kindt等KubyImmunology,第6版,W.H.FreemanandCo.,第91页(2007))。单个VH或VL域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合特定抗原的抗体。见例如，Portolano等,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等,Nature352:624-628(1991)。
在用于本文时，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及整合入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
II.组合物和方法
一方面，本发明部分基于抑制刻缺蛋白途径成分来治疗肝癌。
在一个方面，提供了在有所需要的个体中治疗肝癌的方法，该方法包括对该个体施用有效量的刻缺蛋白2信号传导抑制剂的步骤。在一些实施方案中，该肝癌是肝细胞癌、肝瘤、胆管瘤、肝母细胞瘤、肝癌、肝血管肉瘤、或转移性肝癌。在一些实施方案中，该肝癌是顽固性癌症。
刻缺蛋白2信号传导抑制剂的例子是本领域已知的，而且本文中例示了一些，包括但不限于可溶性刻缺蛋白受体、可溶性刻缺蛋白配体变体(例如显性负配体变体)、结合刻缺蛋白2或Jag1的适体或寡肽、特异性干扰刻缺蛋白2信号传导的有机或无机分子、抗刻缺蛋白2拮抗性抗体和抗Jag1拮抗性抗体。刻缺蛋白2特异性拮抗剂的例子包括美国专利申请公开文本No.US2010/0111958和etal.，J.Clin.Invest.118(1)：217-228(2008)中记载的那些。
在某些实施方案中，该刻缺蛋白2信号传导抑制剂是抗刻缺蛋白2拮抗性抗体。在一个此类实施方案中，该抗刻缺蛋白2拮抗性抗体是结合刻缺蛋白2胞外域且实现降低的刻缺蛋白2信号传导的抗体。在一个此类实施方案中，该抗刻缺蛋白2拮抗性抗体是抗刻缺蛋白2NRR抗体。抗刻缺蛋白2NRR抗体包括但不限于国际申请公开文本No.WO2010039832中披露的任何抗刻缺蛋白2NRR抗体，明确通过提述完整收入本文。此类抗体包括但不限于结合刻缺蛋白2NRRLNR-A和HD-C域的抗刻缺蛋白2NRR抗体。例示性抗刻缺蛋白2NRR抗体是本文中称作抗体B、抗体B-1、抗体B-2、和抗体B-3的单克隆抗体。结合刻缺蛋白2NRR的抗体B是自噬菌体文库分离的。对该抗体进行亲和力成熟以产生抗体B-1、抗体B-2、和抗体B-3。抗体B、抗体B-1、抗体B-2、和抗体B-3的重链和轻链高变区(HVR)的序列分别显示于图12和13。抗体B、抗体B-1、抗体B-2、和抗体B-3的重和轻链可变域的序列显示于图14和15。如下提供了抗刻缺蛋白2NRR抗体的又一些实施方案。
在一个方面，提供了特异性结合刻缺蛋白2NRR的拮抗性抗体，其中该抗体包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下述的HVR：
(a)包含SEQIDNO：1的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：3的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：4的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含符合SEQIDNO：9的共有序列的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含符合SEQIDNO：14的共有序列的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含符合SEQIDNO：19的共有序列的氨基酸序列的HVR-L3。
在又一个方面，该抗体包含包含SEQIDNO：4的氨基酸序列的HVR-H3和至少一种、两种、三种、四种、或五种选自上文(a)、(b)、(d)、(e)、和(f)的HVR。在又一个方面，该抗体包含上文(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、和(f)。关于(a)、(d)、(e)、和(f)，涵盖下述实施方案中的任何一个或多个：包含SEQIDNO：1的氨基酸序列的HVR-H1；包含选自SEQIDNO：5-8的氨基酸序列的HVR-L1；包含选自SEQIDNO：10-13的氨基酸序列的HVR-L2；和包含选自SEQIDNO：15-18的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，提供了特异性结合刻缺蛋白2NRR的抗体，其中该抗体包含：包含SEQIDNO：1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQIDNO：3的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQIDNO：4的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面，提供了特异性结合刻缺蛋白2NRR的抗体，其中该抗体包含：包含符合SEQIDNO：9的共有序列的氨基酸序列的HVR-L1，包含符合SEQIDNO：14的共有序列的氨基酸序列的HVR-L2，和包含符合SEQIDNO：19的共有序列的氨基酸序列的HVR-L3。涵盖任意组合的下述实施方案：包含选自SEQIDNO：5-8的氨基酸序列的HVR-L1；包含选自SEQIDNO：10-13的氨基酸序列的HVR-L2；和包含选自SEQIDNO：15-18的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，结合刻缺蛋白2NRR的抗体包含包含SEQIDNO：5的氨基酸序列的HVR-L1；包含SEQIDNO：10的氨基酸序列的HVR-L2；和包含SEQIDNO：15的氨基酸序列的HVR-L3。在另一个实施方案中，结合刻缺蛋白2NRR的抗体包含包含SEQIDNO：6的氨基酸序列的HVR-L1；包含SEQIDNO：11的氨基酸序列的HVR-L2；和包含SEQIDNO：16的氨基酸序列的HVR-L3。在另一个实施方案中，结合刻缺蛋白2NRR的抗体包含包含SEQIDNO：7的氨基酸序列的HVR-L1；包含SEQIDNO：12的氨基酸序列的HVR-L2；和包含SEQIDNO：17的氨基酸序列的HVR-L3。在另一个实施方案中，结合刻缺蛋白2NRR的抗体包含包含SEQIDNO：8的氨基酸序列的HVR-L1；包含SEQIDNO：13的氨基酸序列的HVR-L2；和包含SEQIDNO：18的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个实施方案中，提供了特异性结合刻缺蛋白2NRR的抗体，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：1的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：3的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：4的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：5的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：10的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：15的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个实施方案中，提供了特异性结合刻缺蛋白2NRR的抗体，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：1的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：3的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：4的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：6的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：11的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：16的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个实施方案中，提供了特异性结合刻缺蛋白2NRR的抗体，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：1的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：3的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：4的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：7的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：12的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：17的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个实施方案中，提供了特异性结合刻缺蛋白2NRR的抗体，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：1的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：3的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：4的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：8的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：13的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：18的氨基酸序列的HVR-L3。
在某些实施方案中，任何上文抗体进一步包含至少一种选自VH亚组III共有框架和VL亚组I共有框架的框架。
在某些实施方案中，抗刻缺蛋白2NRR抗体是亲和力成熟的。例如，可以任意组合地进行所述HVR位置(Kabat编号)中的下述替代中的任何一项或多项：
-在HVR-L1(SEQIDNO：5)中：S28N；I29N或V；S30R或K；S31R；Y32F
-在HVR-L2(SEQIDNO：10)中：G50R；S53I或T；A55E
-在HVR-L3(SEQIDNO：15)中：S93I或R；L96S或H
本文中公开的具体抗体(抗体B以及抗体B的亲和力成熟形式(B-1、B-2、和B-3)可进行进一步的亲和力成熟。因而，提供任何本文所述抗体的亲和力成熟形式。
在某些实施方案中，该刻缺蛋白2信号传导抑制剂是抗Jag1拮抗性抗体。在一个此类实施方案中，该抗Jag1拮抗性抗体是结合Jag1胞外域且实现降低的刻缺蛋白2信号传导的抗体。在一个此类实施方案中，该抗Jag1拮抗性抗体是抗Jag1EGF1-4抗体。抗Jag1抗体包括但不限于本文中公开的任何抗Jag1抗体。
在又一些实施方案中，该抗体是抗Jag1抗体。在一些实施方案中，该抗体包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下述的HVR：(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO：84的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO：87的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO：92的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含：(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO：82的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO：85的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO：90的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个实施方案中，该抗体包含：(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO：82的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO：86的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO：91的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含：(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO：83的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO：85的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO：90的氨基酸序列的HVR-L3。
在某些实施方案中，具有任何上文HVR序列的抗刻缺蛋白2NRR抗体或抗Jag1抗体可进一步包含任何合适框架可变域序列，前提是分别对刻缺蛋白2NRR和Jag1的结合活性得到实质性保留。在某些实施方案中，抗刻缺蛋白2NRR抗体或抗Jag1抗体包含人可变重(VH)共有框架序列，如图16A和16B中所示任何VH共有框架序列。在一个实施方案中，该VH共有框架序列包含人亚组III重链框架共有序列，例如如图16A和16B中所示。在另一个实施方案中，该VH共有框架序列包含“受体2”框架序列，例如如图16A和16B中所示。在一个特定实施方案中，该VH框架共有序列包含受体2B或受体2D的FR1-FR4，其中该FR4包含SEQIDNO：35(图16A和16B)，其中SEQIDNO：35的最后一个残基(S11)任选用丙氨酸替代。在又一个特定实施方案中，该VH框架共有序列包含SEQIDNO：50；51；57或59；和35的序列，其中SEQIDNO：35的S11任选用丙氨酸替代。
在某些实施方案中，具有任何上文HVR序列的抗刻缺蛋白2NRR抗体或抗Jag1抗体可进一步包含如图17中所示的人可变轻(VL)共有框架序列。在一个实施方案中，该VL共有框架序列包含人VL卡帕亚组I共有框架(κv1)序列，例如如图17中所示。在另一个实施方案中，该VL框架共有序列包含如图18或19中所示的huMAb4D5-8FR1-FR4。在一个特定实施方案中，该VL框架共有序列包含SEQIDNO：60、61、62、和63的序列。
在另一个方面，抗刻缺蛋白2NRR抗体包含与SEQIDNO：20的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的VH序列相对于参照序列含有替代(例如保守性替代)、插入、或删除，但是包含该序列的抗刻缺蛋白2NRR抗体保留结合刻缺蛋白2NRR的能力。在某些实施方案中，在SEQIDNO：20的氨基酸序列中替代，插入和/或删除了总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，该替代，插入，或删除发生在HVR以外的区域中(即在FR中)。在一个特定实施方案中，该VH包含一种、两种或三种选自下述的HVR：(a)包含SEQIDNO：1的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQIDNO：3的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQIDNO：4的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面，提供了特异性结合刻缺蛋白2NRR的抗体，其中该抗体包含与选自SEQIDNO：22-25的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的VL序列相对于参照序列含有替代(例如保守性替代)、插入、或删除，但是包含该序列的抗刻缺蛋白2NRR抗体保留结合刻缺蛋白2NRR的能力。在某些实施方案中，在选自SEQIDNO：22-25的氨基酸序列中替代、插入和/或删除了总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，该替代、插入、或删除发生在HVR以外的区域中(即在FR中)。在一个特定实施方案中，该VL包含一种、两种或三种选自下述的HVR：(a)包含符合SEQIDNO：9的共有序列的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含符合SEQIDNO：14的共有序列的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含符合SEQIDNO：19的共有序列的氨基酸序列的HVR-L3。在一个此类实施方案中，该VL包含一种、两种或三种选自下述的HVR：(a)包含选自SEQIDNO：5-8的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含选自SEQIDNO：10-13的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含选自SEQIDNO：15-18的氨基酸序列的HVR-L3。在一个此类实施方案中，该VL包含一种、两种或三种选自下述的HVR：(a)包含SEQIDNO：5的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO：10的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO：15的氨基酸序列的HVR-L3。在另一个此类实施方案中，该VL包含一种、两种或三种选自下述的HVR：(a)包含SEQIDNO：6的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO：11的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO：16的氨基酸序列的HVR-L3。在另一个此类实施方案中，该VL包含一种、两种或三种选自下述的HVR：(a)包含SEQIDNO：7的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO：12的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO：17的氨基酸序列的HVR-L3。在另一个此类实施方案中，该VL包含一种、两种或三种选自下述的HVR：(a)包含SEQIDNO：8的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO：13的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO：18的氨基酸序列的HVR-L3。
在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，替代、插入、或删除可发生在HVR中。在此类实施方案中，替代、插入、或删除可发生在一种或多种HVR内，只要此类改变没有实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中进行没有实质性降低结合亲和力的保守性改变。在某些情况中，HVR中的改变可实际改善抗体亲和力。可以在HVR“热点”(即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基)中进行此类改变以提高抗体亲和力(参见例如Chowdhury，MethodsMol.Biol.207：179-196，2008)。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每种HVR或是保守的(未改变的)，或是含有不超过一处氨基酸替代，插入或删除。
在另一个方面，提供了特异性结合刻缺蛋白2NRR的抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含与SEQIDNO：20的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的VH和与SEQIDNO：22的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的VL。在一个此类实施方案中，该VH包含一种、两种或三种选自下述的HVR：(a)包含SEQIDNO：1的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQIDNO：3的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQIDNO：4的氨基酸序列的HVR-H3，且该VL包含一种、两种或三种选自下述的HVR：(a)包含SEQIDNO：5的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO：10的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO：15的氨基酸序列的HVR-L3。在一个特定实施方案中，该抗体包含包含SEQIDNO：20的氨基酸序列的VH和包含SEQIDNO：22的氨基酸序列的VL。
在另一个实施方案中，特异性结合刻缺蛋白2NRR的抗刻缺蛋白2NRR抗体包含与SEQIDNO：20的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的VH和与选自SEQIDNO：23-25的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的VL。在一个此类实施方案中，该VH包含一种、两种或三种选自下述的HVR：(a)包含SEQIDNO：1的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQIDNO：3的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQIDNO：4的氨基酸序列的HVR-H3，且该VL包含一种、两种或三种选自下述的HVR：(a)包含选自SEQIDNO：6-8的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含选自SEQIDNO：11-13的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含选自SEQIDNO：16-18的氨基酸序列的HVR-L3。在特定实施方案中，该抗体包含包含SEQIDNO：20的氨基酸序列的VH和包含选自SEQIDNO：23-25的氨基酸序列的VL。
在另一个方面，提供了特异性结合Jag1的抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含与选自SEQIDNO：93-95的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的VH和与选自SEQIDNO：96-98的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的VL。在一个此类实施方案中，该VH包含一种、两种或三种选自下述的HVR：(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQIDNO：82的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQIDNO：85的氨基酸序列的HVR-H3，且该VL包含一种、两种或三种选自下述的HVR：(a)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO：90的氨基酸序列的HVR-L3。在一个特定实施方案中，该抗体包含包含SEQIDNO：93的氨基酸序列的VH和包含SEQIDNO：96的氨基酸序列的VL。
在另一个实施方案中，特异性结合Jag1的抗Jag1抗体包含与SEQIDNO：94的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的VH和与SEQIDNO：97的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的VL。在一个此类实施方案中，该VH包含一种、两种或三种选自下述的HVR：(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQIDNO：82的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQIDNO：86的氨基酸序列的HVR-H3，且该VL包含一种、两种或三种选自下述的HVR：(a)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO：91的氨基酸序列的HVR-L3。在特定实施方案中，该抗体包含包含SEQIDNO：94的氨基酸序列的VH和包含SEQIDNO：97的氨基酸序列的VL。
在另一个实施方案中，特异性结合Jag1的抗Jag1抗体包含与SEQIDNO：95的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的VH和与SEQIDNO：98的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的VL。在一个此类实施方案中，该VH包含一种、两种或三种选自下述的HVR：(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQIDNO：83的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQIDNO：85的氨基酸序列的HVR-H3，且该VL包含一种、两种或三种选自下述的HVR：(a)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO：90的氨基酸序列的HVR-L3。在特定实施方案中，该抗体包含包含SEQIDNO：95的氨基酸序列的VH和包含SEQIDNO：98的氨基酸序列的VL。
在某些实施方案中，提供了任何上文抗体的亲和力成熟形式。在又一些实施方案中，提供了特异性结合刻缺蛋白2NRR或Jag1的重组蛋白，其中该重组蛋白包含任何上文抗体的抗原结合位点。在一个此类实施方案中，重组蛋白包含上文提供的HVR中的任何一个或多个。
在某些实施方案中，提供了编码任何上文抗体的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了包含该多核苷酸的载体。在一个实施方案中，提供了包含该载体的宿主细胞。在一个实施方案中，该宿主细胞是真核的。在一个实施方案中，该宿主细胞是CHO细胞。在一个实施方案中，提供了生成抗刻缺蛋白2NRR抗体的方法，其中该方法包括在适合于编码该抗体的多核苷酸表达的条件下培养该宿主细胞，并分离该抗体。
在另一个实施方案中，提供了与本文中提供的抗体结合相同表位的分离的抗体。在一个实施方案中，提供了与选自抗体B、抗体B-1、抗体B-2、和抗体B-3的抗体结合相同表位的分离的抗刻缺蛋白2NRR抗体。在另一个实施方案中，本发明提供与选自抗体B、抗体B-1、抗体B-2、和抗体B-3的抗体竞争结合的抗刻缺蛋白2NRR抗体。在另一个实施方案中，提供了结合至少一种选自刻缺蛋白2LNR-A域和HD-C域的域的分离的抗体。在一个此类实施方案中，该抗体结合LNR-A域和HD-C域二者。在另一个此类实施方案中，该抗体进一步结合LNR-B和/或HD-N域。
在一个实施方案中，提供了与选自抗体A、抗体A-1、和抗体A-2的抗体结合相同表位的分离的抗Jag1抗体。在另一个实施方案中，本发明提供与选自抗体A、抗体A-1、和抗体A-2的抗体竞争结合的抗Jag1抗体。在另一个实施方案中，提供了结合至少一种选自Jag1DSL域和EGF域的域的分离的抗体。在一个此类实施方案中，该抗体结合Jag1的EGF1-4。
本文中提供的任何刻缺蛋白2信号传导抑制剂可以在本文所述方法中使用。
本发明还提供用于为具有肝癌的患者选择治疗性处理的方法，该方法包括在自该患者获得的样品中测定刻缺蛋白2、Jag1和SPP1中一项或多项的表达。在一些实施方案中，如果在该患者样品中检测到刻缺蛋白2、Jag1和SPP1中一项或多项的表达的话，选择该患者进行刻缺蛋白2信号传导抑制剂治疗。在一些实施方案中，自该患者获得的样品中刻缺蛋白2、Jag1和Spp1中一项或多项的表达相对于对照升高，则该患者鉴定为适合于接受本文所述刻缺蛋白2信号传导抑制剂治疗。在一些实施方案中，采用别的参数(诸如例如医师检查，活检的组织学评估，表征该肝癌的血清水平的测定)来鉴定接受该刻缺蛋白2信号传导抑制剂治疗的患者。
在一些实施方案中，使用本领域中公知的方法(诸如例如定量PCR分析)对来自该患者的样品或活检分析刻缺蛋白2、Jag1和Spp1中一项或多项的mRNA表达，并与自对照个体获得的活检中相同基因的表达比较或与参照值比较。在一些实施方案中，使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定表达。在一些实施方案中，对来自该患者的样品或活检分析刻缺蛋白2活化，例如通过检测本文所述刻缺蛋白2的活化形式。
在一个方面，提供了用于在有风险患上肝癌的个体中预防肝癌的方法，其包括对该个体施用有效量的刻缺蛋白2信号传导抑制剂的步骤。在一些实施方案中，该个体具有选自下组的肝状况：乙型或丙型肝炎、肝硬化、良性肝肿瘤、血管瘤、肝的腺瘤、和局灶性结节增生。在一些实施方案中，该方法进一步包括施用至少一种别的治疗剂。别的治疗剂的例子包括生长抑制剂，诸如细胞毒剂、肽、小分子和抗体。
在另一个方面，提供了用于抑制表达分泌型磷蛋白1(SPP1)的细胞生长的方法，其包括使该细胞与刻缺蛋白2信号传导抑制剂接触，由此抑制该细胞生长。在一个实施方案中，SPP1蛋白包含图11中所示氨基酸序列。在一个实施方案中，使该细胞与该刻缺蛋白2信号传导抑制剂接触降低该细胞中的SPP1表达。例如，使该细胞与该刻缺蛋白2信号传导抑制剂接触将该细胞中的SPP1表达降低至少约50％、60％、70％、80％、90％、或90％。可以通过本领域中任何方法测定SPP1mRNA或蛋白质的表达。在一些实施方案中，该细胞是肝癌细胞。在一些实施方案中，该肝癌细胞表达EpCAM、AFP、AFP和EpCAM、刻缺蛋白2、Jag1、刻缺蛋白2和Jag1、核刻缺蛋白2ICD、Ras、Prom1、Spp1、FoxM1、Plk1、ccnb1、Aurkb、Wnt2、Axin2、或Glul、或其任意组合。在一些实施方案中，使该细胞与该刻缺蛋白2信号传导抑制剂接触导致该细胞中EpCAM、AFP、刻缺蛋白2、刻缺蛋白2ICD、Jag1、Prom1、Spp1、FoxM1、Plk1、ccnb1和Aurkb中至少一项的表达降低。在一些实施方案中，施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂导致该细胞中Wnt2、Axin2和Glul中至少一项的表达升高。在一些实施方案中，通过RNAseq、微阵列分析、免疫组织化学、酶联免疫吸附测定法、和Western印迹测定表达。
在另一个方面，提供了用于治疗性处理具有肝癌的哺乳动物的方法，该肝癌包含表达Spp1基因的细胞，该Spp1基因编码包含与图11中所示多肽具有至少90％同一性的氨基酸序列的肽，该方法包括对该哺乳动物施用治疗有效量的刻缺蛋白2信号传导抑制剂，由此有效治疗该哺乳动物。
在另一个方面，提供了用于治疗或预防与与图8C中所示多肽具有至少90％氨基酸序列同一性的蛋白质的表达或活性升高有关的肝细胞增殖性病症的方法，其包括对需要此类治疗的个体施用有效量的抗Jag1拮抗性抗体，由此有效治疗或预防该肝细胞增殖性病症。在一些实施方案中，该细胞增殖性病症是癌症，诸如肝癌。在一些实施方案中，该个体具有选自下组的肝状况：乙型或丙型肝炎、肝硬化、良性肝肿瘤、血管瘤、肝的腺瘤、和局灶性结节增生。
在一个方面，提供了用于在个体中降低血清SPP1蛋白质水平的方法，该方法包括对该个体施用有效量的刻缺蛋白2信号传导抑制剂，由此降低该个体中的血清SPP1水平。在一些实施方案中，降低是相对于施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂之前该个体中的血清SPP1水平。在一些实施方案中，降低是相对于参照水平。在一个实施方案中，该个体具有肝癌。在一个实施方案中，对该个体施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂之前的血清SPP1蛋白质水平为至少约80ng/ml。在某些实施方案中，对该个体施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂之前的血清SPP1蛋白质水平介于约80ng/ml和约500ng/ml之间，介于约86ng/ml和约250ng/ml之间，介于约120ng/ml和约170ng/ml之间，或约165ng/ml。在一些实施方案中，对该个体施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂导致血清SPP1蛋白质水平低于80ng/ml。在具体的实施方案中，施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂之前的血清SPP1蛋白质水平为施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂之前24小时。可以通过任何适宜方法(诸如酶联免疫吸附测定法)测定施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂之前或之后的血清SPP1蛋白质水平。在具体的实施方案中，血清SPP1蛋白质水平在施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂之后约1、2、3、6或12个月降低。
在一个方面，提供了用于在哺乳动物中治疗性处理肝肿瘤的方法，其中该肝肿瘤的生长至少部分依赖于刻缺蛋白2信号传导的生长强化效应，该方法包括使该肿瘤与结合刻缺蛋白2或Jag1的抗体接触，由此有效治疗该肿瘤。在一个实施方案中，该抗体对该肿瘤的结合拮抗刻缺蛋白2的生长强化活性。
在一个方面，提供了用于预防肝癌复发的方法，其包括对已经治疗肝癌且具有升高的血清SPP1蛋白质水平的个体施用有效量的刻缺蛋白2信号传导抑制剂。在一个实施方案中，该个体的血清SPP1蛋白质水平为至少约80ng/ml。在某些实施方案中，对该个体施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂之前的血清SPP1蛋白质水平介于约80ng/ml和约500ng/ml之间，介于约86ng/ml和约250ng/ml之间，介于约120ng/ml和约170ng/ml之间，或约165ng/ml。在一些实施方案中，对该个体施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂导致血清SPP1蛋白质水平低于80ng/ml。
在一些方面，提供了用于治疗具有肝癌的个体的方法，其包括下述步骤：对该个体施用刻缺蛋白2信号传导抑制剂；并测定刻缺蛋白2信号传导，其中治疗之后的刻缺蛋白2信号传导与治疗之前的刻缺蛋白2信号传导相比降低指示该个体中的肝癌减轻。在一些实施方案中，通过测量刻缺蛋白2ICD核定位(例如通过免疫组织化学分析)来测定刻缺蛋白2信号传导。在一些实施方案中，通过测量选自下组的基因的表达来测定刻缺蛋白2信号传导：刻缺蛋白2、Jag1、Hes和Hey1。在一些实施方案中，该肝癌是肝细胞癌、肝瘤、胆管瘤、肝母细胞瘤、肝癌、肝血管肉瘤、和转移性肝癌。在一些实施方案中，该刻缺蛋白2信号传导抑制剂是siRNA、小分子抑制剂或抗体。在一些实施方案中，该抗体是拮抗性抗体，诸如抗刻缺蛋白2拮抗性抗体或抗Jag1拮抗性抗体。
在一些方面，用于抑制细胞增殖的方法包括用针对刻缺蛋白2或Jag1的抗体处理哺乳动物肝癌细胞，由此抑制该肝癌细胞增殖。在某些实施方案中，该抗体是本文所述抗刻缺蛋白2或抗Jag1拮抗性抗体。在某些实施方案中，该抗体是人抗体、人源化抗体、或嵌合抗体。在某些实施方案中，上述实施方案的任何抗体是抗体片段。在某些实施方案中，该细胞在患者中。在某些实施方案中，该细胞在培养液中。
本发明的刻缺蛋白2信号传导抑制剂(诸如抗刻缺蛋白2和抗Jag1抗体)可以在治疗中单独或与其它药剂组合使用。例如，本发明的抗体可以与至少一种别的治疗剂共施用。
上文所述此类组合疗法涵盖组合施用(其中在同一或分开的配制剂中包括两种或更多种治疗剂)和分开施用(在此情况中，本发明的拮抗剂的施用可以发生在别的治疗剂和/或佐剂的施用之前、同时、和/或之后。本发明的刻缺蛋白2信号传导抑制剂也可以与放射疗法组合使用。
可以通过任何已知方法将拮抗剂施用于人患者，诸如静脉内施用，例如推注或通过一段时间里的连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、表面、或吸入路径。可以作为蛋白质或作为编码蛋白质的核酸施用刻缺蛋白2信号传导抑制剂(参见例如国际申请公开文本No.WO96/07321)。可以将其它治疗方案与施用刻缺蛋白2信号传导抑制剂组合。组合施用包括使用分开的配制剂或单一药物配制剂的共施用，和任意次序的序贯施用，其中优选有一段时间所有活性剂同时发挥它们的生物学活性。在一些实施方案中，此类组合疗法导致协同性治疗效果。
施用的剂量和模式会由医师根据已知标准来选择。抗体或其它刻缺蛋白2信号传导抑制剂的适宜剂量会取决于要治疗的疾病的类型、疾病的严重性和过程、施用抗体、寡肽或有机分子是出于预防还是治疗目的、在先疗法、患者的临床历史和对刻缺蛋白2信号传导抑制剂的响应、及主治医师的判断。可以一次性地或在一系列处理里将刻缺蛋白2信号传导抑制剂施用于患者。
可以通过评估肝功能和恢复的参数来监测肝癌治疗的成功。此类参数包括但不限于改良的肝功能测试(例如评估血清清蛋白、胆红素、胆汁酸、总蛋白质、凝固时间)、肝酶(例如丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、γ谷氨酰转肽酶)，组织学外观(例如显示改善的肝体系结构的针刺活检)，和成像形态(例如用于纤维化和肝大小的超声、磁共振成像)。还可以通过测量SPP1蛋白的血清水平来监测治疗的成功，其中经过治疗的患者中的血清水平与治疗前水平相比降低指示成功的治疗。
在又一个方面，刻缺蛋白2信号传导抑制剂是任何上述实施方案中使用的抗体，其单一地或组合地掺入下文1-7节中描述的任何特征：
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文中提供的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM的解离常数(Kd)(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)。
在一个实施方案中，Kd是通过放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的。在一个实施方案中，用Fab型式的感兴趣抗体及其抗原实施RIA。例如，通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况中用最小浓度的(125I)标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了建立测定法的条件，将多孔板(ThermoScientific)用50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(CappelLabs)包被过夜，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清清蛋白于室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM125I-抗原与连续稀释的感兴趣Fab(例如与Presta等,CancerRes.57:4593-4599(1997)中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致)混合。然后将感兴趣的Fab温育过夜；然而，温育可持续更长时间(例如约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板，于室温温育(例如1小时)。然后除去溶液，并用PBS中的0.1％聚山梨酯20洗板8次。平板干燥后，加入150μl/孔闪烁液(MICROSCINT-20TM；Packard)，然后在TOPCOUNTTM伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20％的浓度用于竞争性结合测定法。
依照另一个实施方案，Kd是使用表面等离振子共振测定法测量的。例如，于25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)使用或(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)实施测定法。在一个实施方案中，依照供应商的用法说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠pH4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射以获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，于25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％聚山梨酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(EvaluationSoftwareversion3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过106M-1S-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(AvivInstruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的情况中，测量PBSpH7.2中20nM抗抗原抗体(Fab形式)于25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、和scFv片段，及下文所描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述，见Hudson等Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，见例如Pluckthün,于ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,(Springer-Verlag,NewYork),第269-315页(1994)；还可见WO93/16185；及美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基，并且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，见美国专利No.5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。见例如EP404,097；WO1993/01161；Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)；及Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)。
单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；见例如美国专利No.6,248,516B1)。
可以通过多种技术，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成来生成抗体片段，如本文中所描述的。
3.嵌合的和人源化的抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体记载于例如美国专利No.4,816,567；及Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，自小鼠、大鼠、仓鼠、家兔、或非人灵长类，诸如猴衍生的可变区)和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换的”抗体，其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如CDR(或其部分)自非人抗体衍生，而FR(或其部分)自人抗体序列衍生。任选地，人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的相应残基替代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，并且进一步记载于例如Riechmann等,Nature332:323-329(1988)；Queen等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA86:10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；Kashmiri等,Methods36:25-34(2005)(描述了特异性决定区(SDR)嫁接)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“重修表面”)；Dall’Acqua等,Methods36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；及Osbourn等,Methods36:61-68(2005)和Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”方法)。
可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区(见例如Sims等J.Immunol.151:2296(1993))；自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区(见例如Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；及Presta等J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和通过筛选FR文库衍生的框架区(见例如Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)及Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地，人抗体记载于vanDijk和vandeWinkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。
可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述，见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还可见例如美国专利No.6,075,181和6,150,584，其描述了XENOMOUSETM技术；美国专利No.5,770,429，其描述了技术；美国专利No.7,041,870，其描述了K-M技术，和美国专利申请公开文本No.US2007/0061900，其描述了技术)。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。
也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系(见例如KozborJ.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,第51-63页(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987)；及Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。其它方法包括那些例如记载于美国专利No.7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)和Ni,XiandaiMianyixue,26(4):265-268(2006)(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma技术)也记载于Vollmers和Brandlein,HistologyandHistopathology,20(3):927-937(2005)及Vollmers和Brandlein,MethodsandFindingsinExperimentalandClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)。
也可以通过分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变域序列生成人抗体。然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。
5.文库衍生的抗体
可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离本发明的抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库并对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom等于MethodsinMolecularBiology178:1-37(O’Brien等编,HumanPress,Totowa,NJ,2001)，并且进一步记载于例如McCafferty等,Nature348:552-554；Clackson等,Nature352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,于MethodsinMolecularBiology248:161-175(Lo编,HumanPress,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004)；及Lee等,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体，如记载于Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)的。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如自人)克隆天然全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由Griffiths等,EMBOJ,12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通过自干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如：美国专利No.5,750,373、和美国专利公开文本No.2005/0079574,2005/0119455,2005/0266000,2007/0117126,2007/0160598,2007/0237764,2007/0292936和2009/0002360。
认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对Jag1，而另一种针对任何其它抗原。在某些实施方案中，结合特异性之一针对刻缺蛋白2，而另一种针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合Jag1的两个不同表位。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合刻缺蛋白2的两个不同表位。也可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂定位于表达Jag1和/或刻缺蛋白2的细胞。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。
用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(见Milstein和Cuello,Nature305:537(1983))、WO93/08829、和Traunecker等,EMBOJ.10:3655(1991))、和“节-入-穴”工程化(见例如美国专利No.5,731,168)。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(见例如美国专利No.4,676,980,及Brennan等,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(见例如Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(见例如Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994))；及如例如Tutt等J.Immunol.147:60(1991)中所描述的，制备三特异性抗体来生成多特异性抗体。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”(见例如US2006/0025576A1)。
本文中的抗体或片段还包括包含结合Jag1或刻缺蛋白2及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF”(见例如US2008/0069820)。
7.抗体变体
在某些实施方案中，涵盖本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可以期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将合适的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除、和/或插入和/或替代。可以进行删除、插入、和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如，抗原结合。
a)替代、插入、和删除变体
在某些实施方案中，提供了具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。保守替代在表1中在“优选的替代”的标题下显示。更实质的变化在表1中在“例示性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC。
表1
依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸,Met,Ala,Val,Leu,Ile；
(2)中性、亲水性的：Cys,Ser,Thr,Asn,Gln；
(3)酸性的：Asp,Glu；
(4)碱性的：His,Lys,Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly,Pro；
(6)芳香族的：Trp,Tyr,Phe。
非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。
一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力、降低的免疫原性)和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。
可以对HVR做出变化(例如，替代)，例如以改善抗体亲和力。可以对HVR“热点”，即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基(见例如Chowdhury,MethodsMol.Biol.207:179-196(2008))，和/或接触抗原的残基做出此类变化，其中对所得的变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经记载于例如Hoogenboom等于MethodsinMolecularBiology178:1-37(O’Brien等编,HumanPress,Totowa,NJ,(2001))。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组、或寡核苷酸指导的诱变)将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉HVR指导的方法，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定牵涉抗原结合的HVR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，可以在一个或多个HVR内发生替代、插入、或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以对HVR做出保守变化(例如，保守替代，如本文中提供的)，其不实质性降低结合亲和力。例如，此类变化可以在HVR中的抗原接触残基以外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR是未改变的，或者含有不超过1、2或3处氨基酸替代。
一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所描述的。在此方法中，将残基或靶残基的组(例如，带电荷的残基诸如arg、asp、his、lys、和glu)鉴定，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外，利用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原间的接触点。作为替代的候选，可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合，及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体的糖基化位点的添加或删除。
在抗体包含Fc区的情况中，可以改变其附着的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的、双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2域的Asn297。见例如Wright等TIBTECH15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖、和唾液酸，以及附着于双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供了抗体变体，其具有缺乏附着(直接或间接)于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中的岩藻糖量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过相对于附着于Asn297的所有糖结构(例如，复合的、杂合的和高甘露糖的结构)的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过MALDI-TOF质谱术测量的，例如如记载于WO2008/077546的。Asn297指位于Fc区中的约第297位(Fc区残基的Eu编号方式)的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。见例如美国专利公开文本No.US2003/0157108(Presta,L.)；US2004/0093621(KyowaHakkoKogyoCo.,Ltd)。涉及“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的出版物的例子包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够生成脱岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请NoUS2003/0157108A1,Presta,L；及WO2004/056312A1,Adams等，尤其在实施例11)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(见例如Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；及WO2003/085107)。
进一步提供了具有两分型寡糖的抗体变体，例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利No.6,602,684(Umana等)；及US2005/0123546(Umana等)。还提供了在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO1997/30087(Patel等)；WO1998/58964(Raju,S.)；及WO1999/22764(Raju,S.)。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中，本发明涵盖拥有一些但不是所有效应器功能的抗体变体，所述效应器功能使其成为如下应用的期望候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应器功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中汇总了造血细胞上的FcR表达。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子记载于美国专利No.5,500,362(见例如Hellstrom,I.等Proc.Nat’lAcad.Sci.USA83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA82:1499-1502(1985)；5,821,337(见Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者，可以采用非放射性测定方法(见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.MountainView,CA；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如披露于Clynes等Proc.Nat’lAcad.Sci.USA95:652-656(1998)的。也可以实施C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。见例如WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以实施CDC测定法(见例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods202:163(1996)；Cragg,M.S.等,Blood101:1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域中已知的方法来实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定(见例如Petkova,S.B.等,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效应器功能的抗体包括那些具有Fc区残基238,265,269,270,297,327和329中的一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两处或更多处具有替代的Fc突变体，包括残基265和297替代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。
描述了具有改善的或降低的对FcR的结合的某些抗体变体(见例如美国专利No.6,737,056；WO2004/056312，及Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一处或多处氨基酸替代，例如Fc区的位置298、333、和/或334(残基的EU编号方式)的替代的Fc区。
在一些实施方案中，对Fc区做出改变，其导致改变的(即，改善的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如记载于美国专利No.6,194,551、WO99/51642、及Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)的。
具有延长的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体记载于US2005/0014934A1(Hinton等)，新生儿Fc受体(FcRn)负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)及Kim等,J.Immunol.24:249(1994))。那些抗体包含其中具有改善Fc区对FcRn结合的一处或多处替代的Fc区。此类Fc变体包括那些在Fc区残基238,256,265,272,286,303,305,307,311,312,317,340,356,360,362,376,378,380,382,413,424或434中的一处或多处具有替代，例如，Fc区残基434的替代的(美国专利No.7,371,826)。
还可见Duncan和Winter,Nature322:738-40(1988)；美国专利No.5,648,260；美国专利No.5,624,821；及WO94/29351，其关注Fc区变体的其它例子。
d)经半胱氨酸工程化改造的抗体变体
在某些实施方案中，可以期望创建经半胱氨酸工程化改造的抗体，例如，“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在具体的实施方案中，替代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其它模块，诸如药物模块或接头-药物模块缀合，以创建免疫缀合物，如本文中进一步描述的。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸替代下列残基之任一个或多个：轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。可以如例如美国专利No.7,521,541所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三口恶烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)、和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体要改进的具体特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。
在另一个实施方案中，提供了抗体和可以通过暴露于辐射选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，并且包括但不限于对普通细胞没有损害，但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。
B.重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物来生成抗体，例如，如记载于美国专利No.4,816,567的。在一个实施方案中，提供了编码本文中所描述的抗Jag1抗体的分离的核酸。在一个实施方案中，提供了编码本文中所描述的抗刻缺蛋白2抗体的分离的核酸。此类核酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻和/或重链)。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的一种或多种载体(例如，表达载体)。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用下列载体转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸，所述第二载体包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了生成抗Jag1抗体的方法，其中该方法包括在适合于表达抗体的条件下培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，如上文提供的，并且任选地，自宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收抗体。在一个实施方案中，提供了生成抗刻缺蛋白2抗体的方法，其中该方法包括在适合于表达抗体的条件下培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，如上文提供的，并且任选地，自宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收抗体。
对于抗Jag1抗体或抗刻缺蛋白2抗体的重组生成，将编码抗体的核酸(例如如上文所描述的)分离，并插入一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规规程将此类核酸容易地分离并测序(例如，通过使用寡核苷酸探针来进行，所述寡核苷酸探针能够特异性结合编码抗体的重和轻链的基因)。
适合于克隆或表达抗体编码载体的宿主细胞包括本文中所描述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中生成抗体，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，见例如美国专利No.5,648,237,5,789,199和5,840,523(还可见Charlton,MethodsinMolecularBiology,第248卷(B.K.C.Lo编,HumanaPress,Totowa,NJ,2003),第245-254页，其描述了抗体片段在大肠杆菌(E.coli.)中的表达)。表达后，可以将抗体在可溶性级分中自细菌细胞团糊分离，并可以进一步纯化。
在原核生物外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是适合于抗体编码载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化样式的抗体的真菌和酵母菌株。见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004),及Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
适合于表达糖基化抗体的宿主细胞也自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞一起使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞。
也可以利用植物细胞培养物作为宿主。见例如美国专利No.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978和6,417,429(其描述了用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适合于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如记载于例如Graham等,J.GenVirol.36:59(1977)的)；幼年仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如记载于例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)的)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；牛鼠(buffalorat)肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠乳房肿瘤(MMT060562)；TRI细胞，如记载于例如Mather等,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)的；MRC5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适合于抗体生成的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，见例如Yazaki和Wu,MethodsinMolecularBiology,第248卷(B.K.C.Lo编,HumanaPress,Totowa,NJ),第255-268页(2003)。
C.测定法
可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的抗体鉴定、筛选、或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。
1.结合测定法和其它测定法
一方面，对本发明的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA或Western印迹等来进行。
另一方面，可使用竞争测定法来鉴定与抗体A、A-1或A-2竞争对Jag1的结合的抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合与抗体A、A-1或A-2所结合表位相同的表位(例如线性或构象表位)。另一方面，可使用竞争测定法来鉴定与抗体B、B-1、B-2或B-3竞争对刻缺蛋白2的结合的抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合与抗体B、B-1、B-2或A-3所结合表位相同的表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体所结合表位的详细例示性方法见Morris(1996)“EpitopeMappingProtocols”,MethodsinMolecularBiologyvol.66(HumanaPress,Totowa,NJ)。
在一种例示性竞争测定法中，在包含第一经标记抗体(其结合Jag1，例如抗体A、A-1或A-2)和第二未标记抗体(其要测试与第一抗体竞争对Jag1的结合的能力)的溶液中温育固定化Jag1。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在包含第一经标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中温育固定化Jag1。在允许第一抗体结合Jag1的条件下温育后，除去过量的未结合抗体，并测量与固定化Jag1联合的标记物的量。如果测试样品中与固定化Jag1联合的标记物的量与对照样品相比实质性降低，那么这指示第二抗体与第一抗体竞争对Jag1的结合。参见HarlowandLane(1988)Antibodies:ALaboratoryManualch.14(ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY)。在另一种例示性竞争测定法中，在包含第一经标记抗体(其结合刻缺蛋白2，例如抗体A、B-1、B-2或B-3)和第二未标记抗体(其要测试与第一抗体竞争对刻缺蛋白2的结合的能力)的溶液中温育固定化刻缺蛋白2。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在包含第一经标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中温育固定化刻缺蛋白2。在允许第一抗体结合刻缺蛋白2的条件下温育后，除去过量的未结合抗体，并测量与固定化刻缺蛋白2联合的标记物的量。如果测试样品中与固定化刻缺蛋白2联合的标记物的量与对照样品相比实质性降低，那么这指示第二抗体与第一抗体竞争对刻缺蛋白2的结合。
2.活性测定法
一方面，提供了用于鉴定具有生物学活性的刻缺蛋白2信号传导抑制剂抗体(诸如抗Jag1抗体和抗刻缺蛋白2抗体)的测定法。生物学活性可包括例如抑制或降低刻缺蛋白2活性(例如刻缺蛋白2信号传导)、抑制或降低Jag1介导的刻缺蛋白信号传导(例如Jag1介导的刻缺蛋白2信号传导)。还提供了在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗体。
在某些实施方案中，对本发明的抗体测试此类生物学活性。在某些实施方案中，对本发明的抗体测试其抑制降低Spp1表达的能力。实施例中提供了一种例示性测定法。在某些其它实施方案中，对本发明的抗体测试其抑制响应刻缺蛋白2信号传导的报告基因表达的能力。在某些其它实施方案中，对本发明的抗体测试其抑制响应Jag1介导的信号传导(例如Jag1介导的刻缺蛋白2信号传导)的报告基因表达的能力。在一种例示性测定法中，将稳定转染刻缺蛋白2或瞬时转染含有其它刻缺蛋白受体的质粒的NIH-3T3细胞用刻缺蛋白响应性TP-I(12XCSL)萤火虫萤光素酶报告物和组成性有活性海肾(Renilla)萤光素酶报告物(pRL-CMV，Promega)(作为转染效率的对照)共转染。容许细胞自转染恢复6小时至过夜。使用抗体和稳定转染配体的NIH-3T3细胞的处理来刺激受体细胞。20小时后，用DualGIo萤光素酶测定系统(Promega)测量萤火虫和海肾萤光素酶。对每种条件分析复制品，即萤火虫信号除以海肾信号(作为转染效率的对照)。计算均值和标准偏差，并将数值针对用未转染配体的NIH-3T3细胞刺激的共培养物的计算值标准化。
在某些实施方案中，对本发明的抗体测试其在体外抑制细胞生长或增殖的能力。用于抑制细胞生长或增殖的测定法是本领域中公知的。以本文中所描述的“细胞杀伤”测定法例示的用于细胞增殖的某些测定法测量细胞存活力。一种此类测定法是CellTiter-GloTM发光细胞存活力测定法，其可购自Promega(Madison,WI)。所述测定法基于指示代谢活性细胞的所存在的ATP的定量来测定培养物中的活细胞的数目。见Crouch等(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88，美国专利No.6602677。可以以96或384孔形式进行测定法，使其适合于自动化高通量筛选(HTS)。见Cree等(1995)AntiCancerDrugs6:398-404。该测定法规程牵涉对培养的细胞直接添加单一试剂(Reagent)。这导致细胞裂解，并产生由萤光素酶反应生成的发光信号。发光信号与存在的ATP量成比例，所述ATP量与存在于培养物中的活细胞数目成正比。可以通过发光计或CCD照相机成像装置记录数据。发光输出表示为相对光单位(RLU)。
用于细胞增殖的另一种测定法是“MTT”测定法，即一种比色测定法，其测量线粒体还原酶将3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物氧化成甲月替(formazan)。与CellTiter-GloTM测定法一样，此测定法指示细胞培养物中存在的代谢活性细胞的数目。见例如Mosmann(1983)J.Immunol.Meth.65:55-63及Zhang等(2005)CancerRes.65:3877-3882。
在一方面，对本发明的抗体测试其在体外诱导细胞死亡的能力。用于诱导细胞死亡的测定法是本领域中公知的。在一些实施方案中，此类测定法测量例如膜完整性的丧失，如通过碘化丙啶(PI)、锥虫蓝(见Moore等(1995)Cytotechnology,17:1-11)、或7AAD的摄取指示的。在一种例示性的PI摄取测定法中，将细胞在补充有10％热灭活的FBS(Hyclone)和2mML-谷氨酰胺的Dulbecco氏改良的Eagle培养基(D-MEM):Ham氏F-12(50:50)中培养。如此，在没有补体和免疫效应细胞的情况中实施测定法。将细胞在100x20mm皿中以每皿3x106的密度接种，并容许附着过夜。将培养基除去，并用单独的新鲜培养基或含有各个浓度的抗体或免疫缀合物的培养基更换。将细胞温育3天的时段。在处理后，将单层用PBS清洗，并通过胰蛋白酶处理分离。然后，将细胞以1200rpm于4℃离心5分钟，将团粒在3ml冷的Ca2+结合缓冲液(10mMHepes,pH7.4,140mMNaCl,2.5mMCaCl2)中重悬，并等分取样入35mm滤网加帽的12x75mm管中(每管1ml，每个处理组3管)以除去细胞块。然后，管接受PI(10μg/ml)。使用FACSCANTM流式细胞仪和FACSCONVERTTMCellQuest软件(BectonDickinson)分析样品。如此，鉴定诱导统计学显著水平的细胞死亡的抗体，如通过PI摄取测定的。
在一方面，对本发明的抗体测试其在体外诱导凋亡(程序性细胞死亡)的能力。一种用于诱导凋亡的抗体或免疫缀合物的例示性测定法是膜联蛋白结合测定法。在一个例示性的膜联蛋白结合测定法中，将细胞培养，并在皿中接种，如前一段中所讨论的。将培养基除去，并用单独的新鲜培养基或含有0.001至10μg/ml的抗体或免疫缀合物的培养基替换。在3天温育期后，将单层用PBS清洗，并通过胰蛋白酶处理分离。然后，将细胞离心，在Ca2+结合缓冲液中重悬，并等分取样入管中，如前一段中所讨论的。然后，管接受经标记的膜联蛋白(例如膜联蛋白V-FITC)(1μg/ml)。使用FACSCANTM流式细胞仪和FACSCONVERTTMCellQuest软件(BDBiosciences)分析样品。如此，鉴定相对于对照诱导统计学显著水平的膜联蛋白结合的抗体。用于诱导凋亡的抗体或免疫缀合物的另一种例示性测定法是用于检测基因组DNA的核小体间降解的组蛋白DNAELISA比色测定法。可以使用例如细胞死亡检测ELISA试剂盒(Roche,PaloAlto,CA)实施此类测定法。
在任何上述体外测定法中使用的细胞包括天然表达刻缺蛋白2和/Jag1或已经工程化改造为表达刻缺蛋白2和/或Jag1的细胞或细胞系。此类细胞包括相对于同一组织起源的正常细胞过表达刻缺蛋白2和/或Jag1的肿瘤细胞。此类细胞还包括表达刻缺蛋白2和/或Jag1的细胞系(包括肿瘤细胞系)和在正常情况下不表达刻缺蛋白2和/或Jag1，但是已经用编码刻缺蛋白2和/或Jag1的核酸转染的细胞系。本文中提供的用于任何上述体外测定法的例示性细胞系包括NIH-3T3细胞。
在一方面，对本发明的抗体测试其在体内抑制细胞生长或增殖的能力。在某些实施方案中，对抗Jag1抗体测试其在体内抑制肿瘤生长的能力。在某些实施方案中，对抗刻缺蛋白2抗体测试其在体内抑制肿瘤生长的能力。可以使用体内模型系统，诸如异种移植物模型来进行此类测试。在一种例示性的异种移植物系统中，将人肿瘤细胞导入适当地免疫受损的非人动物，例如，无胸腺“裸”鼠中。对动物施用本发明的抗体。测量抗体抑制或降低肿瘤生长的能力。在上述异种移植物系统的某些实施方案中，人肿瘤细胞是来自人患者的肿瘤细胞。此类异种移植物模型可购自OncotestGmbH(Frieberg,Germany)。在某些实施方案中，人肿瘤细胞是来自人肿瘤细胞系(诸如HepG2、Hep3B、PCL/PRF/5、Snu387、Snu398、Snu423、Snu449、Snu475、Huh-7、HLE、HLF、JHH1、JHH4、JHH5和JHH7)的细胞。在某些实施方案中，通过皮下注射或通过移植入合适的部位，诸如乳房脂肪垫中来将人肿瘤细胞导入适当地免疫受损的非人动物中。
要理解，任何上述测定法可以使用本发明的免疫偶联物替换或补充刻缺蛋白2信号传导抑制剂来进行。
D.免疫缀合物
本发明还提供了包含与一种或多种细胞毒剂，诸如化疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素，细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，或其片段)、或放射性同位素缀合的本文中的抗刻缺蛋白2抗体或抗Jag1抗体的免疫缀合物。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，包括但不限于美登木素生物碱(见美国专利No.5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP0425235B1)；auristatin诸如单甲基auristatin药物模块DE和DF(MMAE和MMAF)(见美国专利No.5,635,483和5,780,588及7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物(见美国专利No.5,712,374,5,714,586,5,739,116,5,767,285,5,770,701,5,770,710,5,773,001和5,877,296；Hinman等,CancerRes.53:3336-3342(1993)；及Lode等,CancerRes.58:2925-2928(1998))；蒽环类抗生素诸如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(见Kratz等,CurrentMed.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey等,Bioorganic&Med.Chem.Letters16:358-362(2006)；Torgov等,Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:829-834(2000)；Dubowchik等,Bioorg.&Med.Chem.Letters12:1529-1532(2002)；King等,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；及美国专利No.6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)诸如多西他赛(docetaxel)、帕利他塞、larotaxel、tesetaxel、和ortataxel；单端孢霉素(trichothecene)；和CC1065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文中所描述的抗体，所述酶活性毒素包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutitesfordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(tricothecenes)。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的如本文中所描述的抗体。多种放射性同位素可用于生成放射性缀合物。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。在使用放射性缀合物进行检测时，它可以包含供闪烁法研究用的放射性原子，例如tc99m或I123，或供核磁共振(NMR)成像(又称为磁共振成像，mri)用的自旋标记物，诸如再一次的碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以使用多种双功能蛋白质偶联剂来生成抗体和细胞毒剂的缀合物，诸如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可以如Vitetta等,Science238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感性接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等,CancerRes52:127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。
本文中的免疫缀合物或ADC明确涵盖，但不限于用交联试剂制备的此类缀合物，所述交联试剂包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC、和sulfo-SMPB，及SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，它们是商品化的(例如，来自PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。
E.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文中提供的任何抗体可用于检测生物学样品中刻缺蛋白2或其片段或者Jag1或其片段的存在。在用于本文时，术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物学样品包含细胞或组织，诸如肝细胞、肝癌细胞和肝肿瘤组织。
在一个实施方案中，提供了在诊断或检测方法中使用的抗刻缺蛋白2抗体。在又一方面，提供了检测生物学样品中刻缺蛋白2的存在的方法。在某些实施方案中，提供了检测生物学样品中刻缺蛋白2胞内域(ICD)的存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括在容许抗刻缺蛋白2抗体结合刻缺蛋白2的条件下使生物学样品与本文所述抗刻缺蛋白2抗体接触，并检测是否在抗刻缺蛋白2抗体与刻缺蛋白2之间形成复合物。此类方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，使用抗刻缺蛋白2抗体来选择适合用上文所述抗刻缺蛋白2抗体治疗的受试者，例如其中刻缺蛋白2(特别是活化的刻缺蛋白2)是一种用于选择患者的生物标志。
在一个实施方案中，提供了在诊断或检测方法中使用的抗Jag1抗体。在又一方面，提供了检测生物学样品中Jag1的存在的方法。在某些实施方案中，提供了检测生物学样品中Jag1胞内域(ICD)的存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括在容许抗Jag1抗体结合Jag1的条件下使生物学样品与本文所述抗Jag1抗体接触，并检测是否在抗Jag1抗体与Jag1之间形成复合物。此类方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，使用抗Jag1抗体来选择适合用上文所述抗Jag1抗体治疗的受试者，例如其中Jag1(特别是活化的Jag1)是一种用于选择患者的生物标志。
可使用本发明的抗体来诊断的例示性病症包括肝癌，具体是肝细胞癌。
在某些实施方案中，提供了经标记的抗刻缺蛋白2或抗Jag1抗体。标记物包括但不限于直接检测的标记物或模块(诸如荧光、发色、电子致密、化学发光、和放射性标记物)、及例如经由酶反应或分子相互作用间接检测的模块，诸如酶或配体。例示性的标记物包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H、和131I、荧光团诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明(rhodamine)及其衍生物、丹酰、伞形酮、萤光素酶，例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利No.4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶(其与采用过氧化氢氧化染料前体的酶诸如HRP偶联)、乳过氧化物酶、或微过氧化物酶、生物素/亲合素、自旋标记物、噬菌体标记物、稳定的自由基、等等。
F.药物配制剂
通过混合具有期望纯度的此类抗体与一种或多种任选的药学可接受载体(Remington’sPharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.编(1980))以冻干配制剂或水性溶液形式制备如本文中所描述的抗刻缺蛋白2或抗Jag1抗体的药物配制剂。一般地，药学可接受载体在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括但不限于缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性的药学可接受载体进一步包含间质药物分散剂诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(BaxterInternational,Inc.)。某些例示性的sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20记载于美国专利公开文本No.2005/0260186和2006/0104968。在一方面，将sHASEGP与一种或多种别的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。
例示性的冻干抗体配制剂记载于美国专利No.6,267,958。水性抗体配制剂包括那些记载于美国专利No.6,171,586和WO2006/044908的，后一种配制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性组分，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。例如，可能希望与抗刻缺蛋白2或抗Jag1抗体一起进一步提供化疗剂或另一种治疗性抗体。在一些实施方案中，配制剂可含有抗刻缺蛋白2抗体和抗Jag1抗体。此类活性组分适于以有效用于所需目的的量组合存在。
活性成分可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)，或在粗滴乳状液中。此类技术披露于Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版,Osol,A.编(1980)。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形商品形式，例如膜，或微胶囊。
用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可容易地实现，例如通过穿过无菌滤膜过滤。
G.治疗性组合物
本文中还提供了制品，该制品包含：(a)容器；(b)容器内装的用于治疗肝癌的包含抗刻缺蛋白2抗体或抗锯齿蛋白1抗体和载剂的组合物；和(c)贴在容器上的标签(label)或与容器一起包括的包装插页(packageinsert)，其涉及所述组合物用于治疗性处理或诊断性检测肝癌的用途。
可以单独或与疗法中的其它药剂组合使用本发明的抗体。例如，可以与至少一种其它的治疗剂共施用本发明的抗体。在某些实施方案中，其它的治疗剂是化疗剂。
上文记录的此类联合疗法涵盖联合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在相同或不同配制剂中)，和分开施用，在该情况中，可以在施用一种或多种其它的治疗剂之前、同时、和/或之后发生本发明的抗体的施用。在一个实施方案中，施用抗刻缺蛋白2或Jag1抗体和施用其它的治疗剂彼此在约1个月内、或在约1、2或3周内、或在约1、2、3、4、5或6天内发生。也可以与放射疗法组合使用本发明的抗体。
可以通过任何合适的手段，包括胃肠外、肺内、和鼻内，及若期望用于局部治疗的话，损伤内施用来施用本发明的抗体(和任何其它的治疗剂)。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。部分根据施用是短暂的还是长期的，剂量给药可以通过任何合适的路径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表，包括但不限于单次施用或在多个时间点里的多次施用、推注施用、和脉冲输注。
本发明的抗体应当以一种符合良好的医学实践的方式配制、确定剂量及给药。关于这一点考虑的因素包括在治疗的特定病症、在治疗的特定哺乳动物、患者个体的临床状态、病因、药物递送部位、给药方法、服药日程以及其它为开业医生所知的因素。抗体无需但可任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所述病症的药物一起配制。上述其它药物的有效量取决于配方中所存在的抗体的量、所治疗病症的类型、以及其它上述讨论的因素。这些药物通常以相同的剂量使用并具有本文中所描述的给药途径，或以约1-99％的本文所描述的剂量使用，或以任何剂量并通过任何途径使用，所述剂量和途径是凭经验确定的/经临床测定合适的。
为了预防或治疗疾病，本发明的抗体(当单独或与一种或多种其它的治疗剂联合使用时)的合适剂量应取决于所要治疗的疾病的类型、抗体的种类、疾病的严重性和病程、所给予抗体的预防或治疗目的、之前的治疗、患者的临床史和对抗体的应答、以及主治医师的斟酌决定。抗体适合于在一次或一系列的治疗中给予患者。对于几天或更长时间的重复给药，取决于病情，治疗应通常持续直至出现病症得到期望的抑制为止。可给予初始较高的负荷剂量，接着给予一个或多个较低的剂量。然而，可使用其它给药方案。通过常规技术和测定方法易于监测该治疗的进展。
应当理解，可以替换抗刻缺蛋白2或抗Jag1抗体或在抗刻缺蛋白2或抗Jag1抗体外使用本发明的免疫缀合物实施任何上述配制剂或治疗性方法。
H.制品
在本发明的另一方面，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上文所描述的病症的材料。制品包含容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。例如，提供了制品，该制品包含：(a)容器；(b)容器内装的用于治疗肝癌的包含抗刻缺蛋白2抗体或抗锯齿蛋白1抗体和载剂的组合物；和(c)贴在容器上的标签(label)或与容器一起包括的包装插页(packageinsert)，其涉及所述组合物用于治疗性处理或诊断性检测肝癌的用途。
合适的容器包括例如瓶、管形瓶、注射器、IV溶液袋、等等。容器可以由多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器容纳单独或与另一种组合物组合有效治疗、预防和/或诊断状况的组合物，并且可以具有无菌存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射针可穿过的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋)。组合物中的至少一种活性剂是刻缺蛋白2信号传导抑制剂，例如抗刻缺蛋白2抗体或抗Jag1抗体。标签或包装插页指示使用组合物来治疗肝的增殖性病症，诸如肝癌。此外，制品可以包含(a)具有其中含有的组合物的第一容器，其中组合物包含本发明的抗体；和(b)具有其中含有的组合物的第二容器，其中组合物包含其它的细胞毒性或其它方面治疗性的药剂。在本发明的此实施方案中的制品可以进一步包含包装插页，其指示可以使用组合物来治疗肝的增殖性病症，诸如肝癌。或者/另外，制品可以进一步包含第二(或第三)容器，其包含药学可接受缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包含从商业和用户观点看期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针、和注射器。
应当理解，任何上述制品可包括本发明的免疫缀合物来代替或补充抗刻缺蛋白2或抗Jag1抗体。
III.实施例
下面是本发明的方法和组合物的实施例。要理解，鉴于上文提供的一般描述，可实施各种其它实施方案。
实施例1：肝癌的鼠模型
如先前所述(Hoetal.,C.,Hepatology55:833-845(2012))，对FVB-N小鼠(CharlesRiver，Hollister)进行Ras、AKT、和睡美人(SleepingBeauty)转座酶编码质粒的流体动力学尾静脉注射。简言之，在大约2mL盐水溶液(0.9％NaCl)中稀释10ugpT3-CAGGS-NRasV12、10ugpT3-EF1A-AKT、和0.8ugCMV-SB(Hoetal.,Hepatology55:833-845(2012)；Yantetal.,Mol.Cell.Biol.24:9239-9247(2004))，并在5至8秒中注射入FVB-N小鼠的侧面尾静脉中。
为了模拟肝癌的发生，如上所述及如先前所述(Hoetal.,C.,Hepatology55:833-845(2012))，对小鼠进行编码致癌性Ras和组成性有活性AKT连同睡美人转座酶的质粒的流体动力学尾静脉注射。此模型容许有效且稳定转染肝细胞及可靠表达转染的癌基因。在流体动力学尾静脉注射后的5周内，小鼠发生众多肝内肿瘤块。很多正常肝实质被肿瘤上皮置换，而且这些小鼠的肝扩大到它们初始大小的10倍。与先前的报告一致，在这些小鼠中发生的肿瘤包含广谱的肝肿瘤类型，包括肝细胞癌(HCC)和胆管瘤(CC)。大约80％的肿瘤结节达到了肝细胞癌的组织病理学标准，而20％达到了鉴定为胆管瘤的组织病理学标准。
每叶肝包含数十个肿瘤，每一个均表达一种给定标志物或标志物组合，诸如AFP(图1A)和EpCAM(图1C)。一些肿瘤表达AFP和EpCAM二者(图1B)。此模型中的肿瘤在它们的HCC和CC特异性肿瘤标志物表达方面有变化(图1A)。在携带肿瘤的肝中约12.8％的细胞中检测到HCC特异性的甲胎蛋白(AFP)的表达(图1D)，比较而言正常的不携带肿瘤肝中少于1％。胆管瘤标志物EpCAM的表达(图1B)在此模型中不太流行，所有肝细胞的平均约5％中检测到，比较而言正常的不携带肿瘤的肝中约1％。还观察到表达HCC和CC特异性标志物二者的肿瘤(图1C)。这些组合型HCC-CC(cHCC-CC)肿瘤特征在于特具攻击性的临床特征(American-Cancer-Society.2012.CancerFacts&Figures2012.Atlanta:AmericanCancerSociety)，而与肝先祖细胞共享基因表达样式(Coulouarnetal.,Carcinogenesis33:1791-1796(2012))。
实施例2：刻缺蛋白2信号传导的激活
为了确定肝癌是否与刻缺蛋白2激活有关，对源自AKT/RasHTV小鼠的肝的肿瘤实施了免疫荧光分析。在O.C.T.TM冷冻介质中包埋和冷冻肝组织，并以8μm冷冻切片。在4％低聚甲醛(PFA)中固定切片，并使用一抗针对刻缺蛋白2(CellsignalingTechnology)、EpCAM(BioLegend)、和AFP(R&DSystems)染色。对于图像分析，使用Ariol载玻片扫描系统(Leica)扫描免疫荧光染色的载玻片。
在AFP+/EpCAM+肿瘤中观察到高水平的刻缺蛋白2激活(通过核刻缺蛋白2的免疫荧光检测确定)(图1E)，而且在EpCAM+肿瘤中观察到降低的程度(图1E，图1F)。在其它肿瘤细胞类型中观察到不太突出的针对活化的刻缺蛋白2的染色(图1E)。
实施例3：抗体的生成。
为了确定刻缺蛋白2信号传导对于驱动肝癌发生或生长(特别是在双重阳性肿瘤中)是否是重要的，如实施例1所述对小鼠进行AKT/Ras构建物的流体动力学尾静脉注射，并用抗刻缺蛋白2抗体、抗Jag1抗体或同种型对照(抗豚草)抗体处理。
a.文库分选和筛选以鉴定抗锯齿蛋白1抗体
使用人噬菌体抗体文库(其在选定互补决定区中具有合成多样性，模拟人IgG全集的天然多样性)淘选在M13噬菌体颗粒表面上展示的Fab片段。使用人Jag1-DSL-EGF1-4(SEQIDNO：10)作为抗原进行文库分选。于4℃用靶抗原(10μg/ml)包被Nunc96孔Maxisorp免疫板过夜，并于室温用噬菌体封闭缓冲液PBST(磷酸盐缓冲盐水(PBS)和1％(w/v)牛血清清蛋白(BSA)和0.05％(v/v)Tween-20)封闭1小时。分开添加抗体噬菌体文库VH(参见例如Leeetal.,J.Immunol.Meth.284:119-132(2004))和VH/VL(参见Liangetal.,JMB.366:815-829(2007))至抗原板，并于室温温育过夜。次日，用PBT(含0.05％Tween-20的PBS)清洗抗原包被板10次，用50mMHCl和500mMNaCl洗脱结合的噬菌体30分钟，并用等体积的1MTris碱(pH7.5)中和。在大肠杆菌XL-1Blue细胞中扩增回收的噬菌体。在后续选择轮次期间，抗体噬菌体与抗原包被板的温育缩短至2-3小时，并逐渐提高板清洗的严格性。
4轮淘选之后，观察到显著富集。自VH和VH/VL文库分选各挑取96个克隆以测定它们是否特异性结合人锯齿蛋白1。对这些克隆的可变区进行PCR测序以鉴定独特序列克隆。使用点竞争ELISA对噬菌体抗体的亲和力排序。使用竞争性噬菌体结合ELISA进一步测定噬菌体抗体IC50值。选择特异性结合人锯齿蛋白1(且不结合锯齿蛋白2)、或锯齿蛋白1和锯齿蛋白2二者的独特噬菌体抗体，并重定形式成全长IgG，用于体外细胞测定法中的评估。
通过分别将各个克隆的VL和VH区克隆入含有人卡帕恒定域的pRK哺乳动物细胞表达载体(pRK.LPG3.HumanKappa)和编码全长人IgG1恒定域的表达载体(pRK.LPG4.HumanHC)(Shieldsetal.,JBiolChem2000；276:6591-6604)，将感兴趣克隆重定形式成IgG。然后在哺乳动物CHO细胞中瞬时表达抗体，并用蛋白A柱纯化。
b.用于亲和力改进自VH或VHVL文库衍生的克隆的文库的构建
自噬菌粒pV0350-2b(Leeetal.,J.Mol.Biol340:1073-1093(2004))衍生、在所有CDR-L3位置含有终止密码子(TAA)且在M13噬菌体的表面上展示单价Fab的噬菌粒pW0703充当文库模板用于嫁接来自VH文库的感兴趣克隆的重链可变域(VH)进行亲和力成熟。使用硬和软随机化策略二者进行亲和力成熟。对于硬随机化，一个轻链文库有三个轻链CDR的选定位置使用设计成模拟天然人抗体的氨基酸随机化，而且设计DNA简并性如Leeetal.,J.Mol.Biol340:1073-1093(2004)所述。为了实现在选定位置处引入大约50％突变率的软随机化条件，以有利于野生型核苷酸的70-10-10-10碱基混合物合成诱变DNA(Gallopetal.,J.Med.Chem.37:1233-1251(1994))。对于软随机化，靶向CDR-L3位置91-96，CDR-H1位置30-33、35，CDR-H2位置50、52、53-54、和56，CDR-H3位置95-98处的残基；并选择三种不同CDR环组合(H1/L3、H2/L3、和H3/L3)进行随机化。
对于源自VHVL文库的克隆，个别地生成在每个CDR中含有4个终止密码子(TAA)且在M13噬菌体的表面上展示单价Fab的噬菌粒，并充当kunkel诱变的模板用于构建亲和力成熟文库。只有软随机化策略用于自VHVL文库衍生的克隆，即在未免疫文库中构建CDR-L3的多样性。为了实现软随机化条件，靶向CDR-L1位置28-31，CDR-L2位置50、53-55，CDR-L3位置91-96，CDR-H1位置30-35，CDR-H2位置50-56，CDR-H3位置95-100处的残基；并选择四种不同CDR环组合(H1/L3*、H2/L3*、和H3/L3*和L1/L2/L3*，其中*表示模板上终止密码子的位置)进行随机化。
c.噬菌体分选策略以产生亲和力改进
对于亲和力改进选择，首先在限制试剂条件下生物素化Jag1抗原。对噬菌体文库进行一轮板分选和严格性渐增的五轮溶液分选。对于第一轮板分选，首先在Maxisorp板上包被10μg/ml抗原，并用封闭缓冲液(含1％BSA和0.05％Tween20的PBS)预封闭。将封闭缓冲液中的3O.D./ml噬菌体输入与抗原板温育3小时。用PBS-0.05％Tween20清洗孔10次。用150μl/孔50mMHCl、500mMKCl洗脱结合的噬菌体30分钟，随后通过50μl/孔1MTrispH8来中和，滴定，并扩增进行下一轮。对于后续轮次，以溶液相进行噬菌体文库淘选，其中于室温将噬菌体文库与100μl含1％Superblock(PierceBiotechnology)和0.05％Tween20的缓冲液中的100nM生物素化靶蛋白(浓度基于亲本克隆噬菌体IC50值)温育2小时。用1％Superblock进一步稀释混合物10倍，并于室温在温和摇动中将100μl/孔应用于中性亲合素包被孔(10μg/ml)30分钟。为了测定背景结合，在中性亲合素包被板上捕捉含有噬菌体的对照孔。然后如关于第一轮所述清洗结合的噬菌体，洗脱并扩增。再以渐增的选择严格性进行总共五轮溶液分选。其中头两轮为通过生物素化靶蛋白浓度自100nM降低至0.1nM进行的结合速率选择，而其中末两轮为通过于室温添加过量的非生物素化靶蛋白(多300至1000倍)以竞争掉更弱结合物进行的解离速率选择。
d.高通量亲和力筛选ELISA(单点竞争)
自第六轮筛选挑取菌落。于37℃在96孔板(Falcon)中在含50μg/ml羧苄青霉素和1x1010/mlM13KO7的150μl/孔2YT培养基中培养菌落过夜。自同一块板，挑取一个亲本噬菌体感染的XL-1菌落作为对照。于4℃用100μl/孔PBS中的Jag1或Jag2(0.5μg/ml)包被96孔NuncMaxisorp板过夜。用150μl含1％BSA和0.05％Tween20的PBS20封闭板1小时。
用75μl含或不含5nMJag1或Jag2的ELISA(酶联免疫吸附测定法)缓冲液(含0.5％BSA、0.05％Tween20的PBS)稀释35μl噬菌体上清液，并在F板(NUNC)中让其于室温温育1小时。将95μl混合物并排转移至抗原包被板。将板温和摇动15分钟，并用PBS-0.05％Tween20清洗10次。如下量化结合，即添加ELISA缓冲液中(1:2500)的缀合有辣根过氧化物酶(HRP)的抗M13抗体，并于室温温育30分钟。用PBS-0.05％Tween20清洗板10次。接着，添加100μl/孔过氧化物酶底物至孔，并于室温温育5分钟。如下停止反应，即添加100μl0.1M磷酸(H3PO4)至每个孔，并让其于室温温育5分钟。于450nm使用标准ELISA读板仪测定每个孔中的黄色的O.D.(光密度)。在与亲本噬菌体孔(100％)的OD450nm降低(％)的比较中，挑取OD450nm降低(％)低于50％的克隆进行序列分析。选择独特克隆进行噬菌体制备以测定针对Jag1的结合亲和力(噬菌体IC50)，这通过与各自亲本克隆比较来进行。然后将亲和力改进最大的克隆重定格式成人IgG1进行抗体生成。
亲本抗体A和亲和力成熟抗体A-1和A-2特异性结合人和鼠Jag1(具体是Jag1DSL-EGF1-4)，但是不结合人或鼠Jag2。
某些抗刻缺蛋白2NRR抗体的生成和表征先前已有描述。参见PCT申请No.PCT/US09/059028。
实施例4：刻缺蛋白2信号传导抑制剂处理降低肿瘤负荷
在流体动力学尾静脉注射那天开始，用抗刻缺蛋白2抗体(15mg/kg，1x/周)、抗Jag1抗体(10mg/kg，1x/周)或同种型对照抗体处理实施例1所述AKT/RasHTV小鼠。对肝成像并在尸检时在标准实验室天平上称重。用对照抗体处理的小鼠在流体动力学尾静脉注射后5周发生重肿瘤负荷(图2A)，其中它们的肝的大小从正常的不携带肿瘤的小鼠中的1.2g或5.8％体重升高至约8.9g或大约31％体重(图2B)。抗刻缺蛋白2或抗Jag1抗体任一处理显著阻碍肿瘤发生(图2A和B；p<0.0001，n>8)。用抗刻缺蛋白2抗体处理的小鼠发生显著更小的肿瘤负荷，其中它们的肝生长至平均5.1g或19.3％体重(图2B)。抗Jag1处理具有甚至更大的效果。在这些小鼠中，最终的肝重量平均为4.3g或15.8％体重(图2B)。
肿瘤的EpCAM+和AFP+/EpCAM+子集(图1E)(其中刻缺蛋白2信号传导比EpCAM-肿瘤中更加高度激活，如通过经免疫荧光检测核刻缺蛋白2测定的)对刻缺蛋白2途径抑制高度易感。用抗刻缺蛋白2抗体或抗Jag1抗体任一处理后，EpCAM+肿瘤(AFP-/EpCAM+和AFP+/EpCAM+肿瘤)的面积显著缩小(图3A，图3B)。AFP+/EpCAM-肿瘤中的刻缺蛋白2信号传导没有高度激活(图1E)，提示这些肿瘤可能不受刻缺蛋白2途径抑制影响。然而，与预期相反，抗刻缺蛋白2处理和抗Jag1处理均导致AFP+肿瘤面积显著缩小(图3C)。总之，这些结果证明在肝癌的这种模型中抗刻缺蛋白2或抗Jag1抗体处理阻断广泛肝肿瘤发生。成功的抗刻缺蛋白2和抗Jag1抗体处理导致总体肿瘤负荷降低，包括HCC样和胆管瘤样肿瘤二者，如抗刻缺蛋白2和抗Jag1抗体处理后AFP和EpCAM染色的显著缩小指示的。
实施例5：刻缺蛋白1和刻缺蛋白3的抑制
抑制Jag1具有与抑制刻缺蛋白2相似的作用，提示Jag1和刻缺蛋白2在同一途径中起作用，具体而言，Jag1在支持肿瘤形成方面起刻缺蛋白2的配体的作用。为了确定抑制其它刻缺蛋白受体是否也能降低肝癌形成或生长，如实施例1所述对小鼠进行Ras/AKT构建物的流体动力学尾静脉注射，并用抗刻缺蛋白1拮抗性抗体(10mg/kg，1x/周)或抗刻缺蛋白3拮抗性抗体(30mg/kg，3x/周)处理。在Ras/AKTHTV小鼠中抗刻缺蛋白1抗体处理与同种型对照相比降低肝重量，而抗刻缺蛋白3抗体处理对肝重量没有显著影响(图2D；p<0.02，n≥7)。虽然抗刻缺蛋白2或抗Jag1处理降低EpCAM转录物的水平(图3E，p<0.005，n≥7)，但是抑制刻缺蛋白1增大肝中EpCAM阳性肿瘤的断面积(图3D，图3E，p<0.02，n≥7)且提高胆管瘤标志物细胞角蛋白19(CK19)的表达(图3F)。用针对抗刻缺蛋白1或抗刻缺蛋白3的拮抗性抗体处理对肝先祖细胞和先祖细胞样肿瘤标志物和胆管瘤样肿瘤标志物Sox9的表达没有影响，而用抗刻缺蛋白2或抗Jag1抗体处理在mRNA(图3G)和蛋白质水平(图3H)二者显著降低Sox9。
如此，抗刻缺蛋白1或抗刻缺蛋白3抗体处理没有显著降低肿瘤负荷。事实上，抑制刻缺蛋白1引起EpCAM+胆管瘤样肿瘤数目增多和占据的断面积增大。这些结果与抗刻缺蛋白1处理后胆管瘤样损害增多/增大的观察结果一起，进一步支持刻缺蛋白2和刻缺蛋白1在肝癌中有相反作用的结论。
实施例6：抗刻缺蛋白2或抗Jag1抗体处理降低刻缺蛋白2激活
对于免疫组织化学分析，在10％中性缓冲的福尔马林中固定组织，在石蜡中包埋，并切片。对4μm厚福尔马林固定石蜡包埋人组织进行染色。对于Jag1IHC染色，使用Ventana检测试剂(VentanaMedicalSystems，Tucson，AZ)在VentanaDiscoveryXT自动染色仪上进行所有步骤。在EZPrep溶液中对组织切片脱石蜡，并使用标准温育时间用cellConditioner1进行预处理。然后将组织切片与0.2μg/ml山羊多克隆抗Jag1一抗(SantaCruzBiotechnologyInc，SantaCruz，CA；Cat#sc-6011)一起于室温温育32分钟，接着与7.5μg/ml生物素化家兔抗山羊IgG抗体(VectorLabs，Burlingame，CA)一起于室温温育32分钟。在含10％正常人血清(JacksonImmunoResearch)的3％BSA中稀释一抗和二抗二者。随后将切片与抗家兔OmniMAP-HRP试剂一起于室温温育16分钟。
对于刻缺蛋白2IHC，利用Ventana检测试剂(VentanaMedicalSystems，Tuscon，AZ)在VentanaDiscoveryXT平台上进行所有步骤。使用EZPrep对切片脱石蜡，并使用标准温育时间用CellConditioner1实现预处理。将切片与8μg/ml家兔单克隆抗刻缺蛋白2一抗(克隆D76A6，CellSignalingTechnologies，Beverley，MA)一起于37℃温育60分钟，接着与抗家兔OMNIMAP-HRP试剂一起温育32分钟。
对于Hes1，使用DAKO清洗缓冲液和DAKO靶物修复溶液在Dako自动染色仪上进行所有步骤。对切片脱石蜡，再水合，然后与DAKO靶物修复溶液一起于99℃温育20分钟，用3％H2O2淬灭4分钟，然后用亲合素生物素封闭试剂盒(VectorLaboratories：cat#sp-2001)封闭。将切片与1ug/ml抗HES-1(克隆NM1；MBLInternational)一起于室温温育45分钟，然后与5ug/ml二抗Bt-Dk抗大鼠(JacksonImmunoResearch)一起温育15分钟，接着与扩增稀释液中的生物素化酪胺(1:50)一起温育3分钟。随后将切片与DAB和苏木精II试剂一起温育进行显色检测和复染色。将载玻片再水合，在二甲苯中清洁，并盖上盖玻片。随后将所有切片与DAB和苏木精II试剂一起温育进行显色检测和复染色。将载玻片再水合，在二甲苯中清洁，并盖上盖玻片。对于图像分析，使用Nanozoomer载玻片扫描系统(Hamamatsu)扫描免疫组织化学载玻片。
使用用于使用7900HTRT-PCR系统(AppliedBiosystems)进行的一步反应的TaqMan一步RT-PCR试剂盒及TaqMan探针(AppliedBiosystems)实施定量实时PCR(QRTPCR)。使用的探针是刻缺蛋白1(Mm00435245_m1，Hs01062014_m1)、刻缺蛋白2(Mm00803077_m1，Hs01050719_m1)、刻缺蛋白3(Mm00435270_m1，Hs01128541_m1)、刻缺蛋白4(Mm00440525)、Jag1(Mm00496902_m1)、Jag2(Mm01325629_m1)、DLL1(Mm01279269_m1)、DLL3(Mm00432854_m1)、DLL4(Mm00444619)、Hey1(Mm00516555_m1)、CK19(Mm00492980_m1)和Sox9(Mm00448840_m1)。
与刻缺蛋白2和Jag1抑制对肿瘤形成的更宽作用一致，抗刻缺蛋白2或抗Jag1任一处理后，刻缺蛋白2信号传导(通过经由免疫荧光检测核刻缺蛋白2蛋白质测定)遍及携带肿瘤的肝显著降低(图4A；p<0.05，n≥7)。此降低看来是由于对刻缺蛋白2蛋白质激活的直接作用，因为刻缺蛋白2表达的总体水平(通过定量RT-PCR测定)没有变化。与抗刻缺蛋白2或抗Jag1抗体处理阻断刻缺蛋白2激活一致，针对Hes1(刻缺蛋白2信号传导途径的一种下游转录靶)的免疫染色降低。用对照处理的Ras/AKTHTV肝显示高水平的Hes1染色(图4D)。然而，抗刻缺蛋白2或抗Jag1抗体处理显著降低Hes1染色，与用抗体处理的肝中刻缺蛋白2信号传导的有效阻断一致(图4C，图4D，p≤0.0001，n>10)。定量RT-PCR分析揭示刻缺蛋白途径靶基因HeyL也随抗刻缺蛋白2或抗Jag1抗体处理任一强烈降低(图4E，p<0.0001，n>7)，确认刻缺蛋白2信号传导被阻断。
在每种情况中，抗Jag1抗体处理具有与抗刻缺蛋白2抗体处理相同的效果，进一步支持Jag1在支持肝癌形成和生长中主要经由刻缺蛋白2(即作为刻缺蛋白2的配体)起作用的结论。总之，这些结果证明抗刻缺蛋白2或抗Jag1抗体处理任一导致刻缺蛋白2激活降低。
实施例7：刻缺蛋白抑制性抗体对刻缺蛋白信号传导途径成分的表达的 影响
用针对刻缺蛋白1(10mg/kg，1x/周)，刻缺蛋白2(10mg/kg，2x/周)，刻缺蛋白3(30mg/kg，3x/周)，或Jag1(10mg/kg，1x/周)的拮抗性抗体处理进行AKT/RasHTV的小鼠。以30mg/kg，3x/周施用抗豚草抗体作为阴性对照。5周后，收获肝，并对分离的RNA实施定量实时PCR以测定处理对刻缺蛋白信号传导途径成分的转录物的影响。抑制个别刻缺蛋白家族受体没有导致其它刻缺蛋白受体家族成员的表达的补偿性升高。
如上所述，抑制个别刻缺蛋白受体，刻缺蛋白1、刻缺蛋白2、和刻缺蛋白3在肝肿瘤发生的AKT/Ras模型中具有独特作用。此结果提示个别刻缺蛋白受体在肝癌中并非必然彼此补偿。为了确定抑制个别刻缺蛋白受体和配体对刻缺蛋白受体家族成员的表达的影响，用抗刻缺蛋白1、抗刻缺蛋白2、抗刻缺蛋白3、抗Jag1抗体或同种型对照抗体任一处理后评估注射实施例1中所述AKT/Ras构建物的小鼠中的表达。用三种抑制性抗体任一抑制后没有观察到个别刻缺蛋白受体任一的受体转录物表达升高(图5A-C)。相反，用特异性抑制性抗体抑制刻缺蛋白2导致刻缺蛋白3和刻缺蛋白4二者的表达水平显著降低(p<0.05，n≥7)。抑制刻缺蛋白3也导致它自己表达降低(p<0.005，n≥7)。这与先前刻缺蛋白2和刻缺蛋白3二者控制刻缺蛋白3转录的观察结果(Wangetal.,PLoSONE7:e37365(2012)；Liuetal.,CirculationResearch107:860-870(2010))一致。就刻缺蛋白配体Jag1和DLL1的表达而言，拮抗性抗体处理的作用甚至更大。刻缺蛋白2抑制导致Jag1表达显著降低(图5E)，有可能是这些肝中Jag1表达性胆管瘤和先祖样肿瘤减少/缩小的结果。Jag1抑制具有相似的作用，进一步确认Jag1和刻缺蛋白2在此肿瘤模型中一起起作用。形成对比，抑制刻缺蛋白1显著提高刻缺蛋白配体Jag2和DLL1的表达(图5F，图5G)。这个结果可能至少部分有助于解释观察到用抗刻缺蛋白1拮抗性抗体处理的肝中胆管瘤样损害的增多/增大。
综上所述，刻缺蛋白2抑制后没有观察到其它刻缺蛋白受体的表达的补偿性升高，提示成功的抗刻缺蛋白2或抗Jag1抗体处理不会经由上调备选刻缺蛋白信号传导成分导致抗性。事实上，刻缺蛋白2或Jag1拮抗性抗体任一处理实际上导致降低的Jag1配体表达，而且抗刻缺蛋白2处理导致降低的刻缺蛋白3表达。
实施例8：抗刻缺蛋白2或抗Jag1抗体处理阻断先祖样和胆管瘤样肝肿瘤 生长
为了解决刻缺蛋白2抑制导致肿瘤负荷降低的机制，实施了高通量RNA测序分析。用针对刻缺蛋白2(10mg/kg，2x/周)、Jag1(10mg/kg，1x/周)的拮抗性抗体或抗豚草对照(30mg/kg，3x/周)处理进行AKT/RasHTV的小鼠。5周后，收获肝，并对RNA进行高通量测序。
抗刻缺蛋白2和抗Jag1抗体处理后，携带肿瘤的肝中的先祖细胞和胆管瘤样HCC表达签名基因表达下调。EpCAM和CK19表达显著下调，就像CD133/Prom1(图6A和未显示的数据)和Spp1(图6B)的表达，二者均为肝先祖细胞的标志物。因为先前显示了一般地(Xiaetal.,Carcinogenesis33:2250-2259(2012))及具体地在肝癌Ras/Akt模型中(Hoetal.,Hepatology55:833-845(2012))FoxM1在HCC增殖中发挥作用，所以我们检查了它的表达且能够显示刻缺蛋白2和Jag1抑制二者导致FoxM1表达降低(图6C)。此外，FoxM1靶基因(Laoukilietal.,NatCellBiol7:126-136(2005))，PLK1(图6D)、Ccnb1(图6E)、和Aurkb(图6F)也在用抗刻缺蛋白2或抗Jag1抗体处理的携带肿瘤的肝中与对照相比降低。Wnt信号传导的标志物在刻缺蛋白2或Jag1抑制后升高。具体而言，Wnt2配体升高(图6G)，就像Wnt途径靶基因Axin2(图6H)。终末分化的肝细胞的一个子集的标志物谷氨酰胺合成酶(Glul)的表达(图6I)在用抗刻缺蛋白2或抗Jag1抗体任一处理的携带肿瘤的肝中也与对照相比升高。这些与刻缺蛋白2抑制经由FoxM1下调诱导降低的肿瘤细胞增殖及经由诱导Wnt信号传导诱导差异化肝细胞命运的观察结果(Boulteretal.,Nat.Med.18(4):572(2012))一致。可能的是肝癌中的刻缺蛋白2信号传导抑制招致肿瘤细胞终末分化成肝细胞。与这种假说一致，刻缺蛋白2和Jag1抑制导致终末分化肝细胞的转录标志物以及Wnt信号传导升高，已知它在自先祖细胞分化肝细胞中是重要的(Boulteretal.,Nat.Med.18(4):572(2012))。刻缺蛋白2和Jag1抑制可能还通过降低增殖和提高肿瘤细胞死亡来起作用。
实施例9：人肝细胞癌中刻缺蛋白2的表达和激活
使用定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)对人HCC细胞系和原发性人HCC肿瘤分析刻缺蛋白信号传导成分的表达。HCC细胞系HepG2、Hep3B、PCL/PRF/5、Snu387、Snu398、Snu423、Snu449、Snu475得自ATCC(Manassas，Virginia)。HCC细胞系Huh-7、HLE、HLF、JHH1、JHH4、JHH5、JHH7得自日本生物资源细胞库保藏中心(Osaka，Japan)。使用Definiens软件分析整个染色组织切片。
在16种培养的HCC细胞系中的15种中，刻缺蛋白2以比刻缺蛋白1或刻缺蛋白3任一更高的水平表达(图7A)。在许多情况中，在将表达相对于参照基因(RPL19)标准化时，刻缺蛋白2表达超出其它刻缺蛋白家族成员表达超过10倍(图7A)。与此结果一致，在76份人原发性HCC样品中的28份(37％)中观察到突出的刻缺蛋白2表达(通过IHC测定)。在这28份人原发性HCC样品中的15份(54％)中，刻缺蛋白2显示程度变化的核定位(图7B)，指示刻缺蛋白2途径激活。在检查的59份人原发性HCC样品中的34份(57％)中观察到Jag1表达(通过IHC评估)(图7B)。在评估刻缺蛋白2和Jag1二者的56份人原发性HCC样品中，发现15份(27％)具有刻缺蛋白2和Jag1二者的表达。在那15份具有交叠表达的组织中，11份(73％)显示一些程度的刻缺蛋白2核定位，指示有活性的刻缺蛋白2信号传导。
虽然出于清楚理解的目的，前述发明已经作为例示和例子相当详细地进行了描述，但是说明书和实施例不应解释为限制本发明的范围。通过提及而明确将本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容完整收录。

Claims (292)

1.一种在有所需要的个体中治疗肝癌的方法，该方法包括对该个体施用有效量的刻缺蛋白2信号传导抑制剂的步骤。
2.权利要求1的方法，其中该肝癌选自下组：肝细胞癌、肝瘤、胆管瘤、肝母细胞瘤、肝癌、肝血管肉瘤、和转移性肝癌。
3.权利要求1的方法，其中该刻缺蛋白2信号传导抑制剂选自下组：抗体、siRNA和小分子抑制剂。
4.权利要求3的方法，其中该抗体是单克隆抗体。
5.权利要求3的方法，其中该抗体是拮抗性抗体。
6.权利要求3的方法，其中该抗体是抗刻缺蛋白2抗体。
7.权利要求6的方法，其中该抗体是抗刻缺蛋白2NRR抗体。
8.权利要求6的方法，其中该抗体对除刻缺蛋白2以外的刻缺蛋白家族成员没有显著结合。
9.权利要求6的方法，其中该抗体结合小鼠刻缺蛋白2NRR和人刻缺蛋白2NRR。
10.权利要求6的方法，其中该抗体以≤10nM的Kd结合刻缺蛋白2NRR。
11.权利要求6的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO:3的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含符合SEQIDNO:9的共有序列的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含符合SEQIDNO:14的共有序列的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含符合SEQIDNO:19的共有序列的氨基酸序列的HVR-L3。
12.权利要求3的方法，其中该抗体是抗Jag1抗体。
13.权利要求12的方法，其中该抗体包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下述的HVR：
(a)包含SEQIDNO:81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO:84的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO:87的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO:88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO:89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO:92的氨基酸序列的HVR-L3。
14.权利要求12的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO:81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO:82的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO:85的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO:88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO:89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO:90的氨基酸序列的HVR-L3。
15.权利要求12的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO:81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO:82的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO:86的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO:88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO:89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO:91的氨基酸序列的HVR-L3。
16.权利要求12的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO:81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO:83的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO:85的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO:88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO:89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO:90的氨基酸序列的HVR-L3。
17.权利要求13-16任一项的方法，其中该抗体进一步包含如下的轻链可变域框架LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3、和LC-FR4，该轻链可变域框架LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3、和LC-FR4依次包含图18的huMAb4D5-8轻链可变域框架LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3、和LC-FR4的氨基酸序列。
18.权利要求13-16任一项的方法，其中该抗体进一步包含如下的重链可变域框架HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3、和HC-FR4，该重链可变域框架HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3、和HC-FR4依次包含图18的huMAb4D5-8重链可变域框架HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3、和HC-FR4的氨基酸序列。
19.权利要求13-16任一项的方法，其中该抗体进一步包含如下的轻链可变域框架LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3、和LC-FR4，该轻链可变域框架LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3、和LC-FR4依次包含图19的huMAb4D5-8轻链可变域框架LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3、和LC-FR4的氨基酸序列。
20.权利要求13-16任一项的方法，其中该抗体进一步包含如下的重链可变域框架HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3、和HC-FR4，该重链可变域框架HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3、和HC-FR4依次包含图19的huMAb4D5-8重链可变域框架HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3、和HC-FR4的氨基酸序列。
21.权利要求3的方法，其中该抗体是结合Jag1的分离的抗体，其包含
(a)与SEQIDNO:93的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；
(b)与SEQIDNO:96的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；
或
(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。
22.权利要求21的方法，其中该抗体包含SEQIDNO:93的VH序列。
23.权利要求21的方法，其中该抗体包含SEQIDNO:96的VL序列。
24.权利要求21的方法，其中该抗体包含SEQIDNO:93的VH序列和SEQIDNO:96的VL序列。
25.权利要求3的方法，其中该抗体是结合Jag1的分离的抗体，其包含：
(a)与SEQIDNO:94的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；
(b)与SEQIDNO:97的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；
或
(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。
26.权利要求25的方法，其中该抗体包含SEQIDNO:94的VH序列。
27.权利要求25的方法，其中该抗体包含SEQIDNO:97的VL序列。
28.权利要求25的方法，其中该抗体包含SEQIDNO:94的VH序列和SEQIDNO:97的VL序列。
29.权利要求3的方法，其中该抗体是结合Jag1的分离的抗体，包含：
(a)与SEQIDNO：95的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；
(b)与SEQIDNO：98的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；
或
(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。
30.权利要求29的方法，其中该抗体包含SEQIDNO：95的VH序列。
31.权利要求29的方法，其中该抗体包含SEQIDNO：98的VL序列。
32.权利要求29的方法，其中该抗体包含SEQIDNO：95的VH序列和SEQIDNO：98的VL序列。
33.权利要求1-32任一项的方法，其中该抗体是全长IgG1或IgG2a抗体。
34.权利要求1-32任一项的方法，其中该抗体是抗体片段。
35.权利要求1-32任一项的方法，其中该抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
36.权利要求1-32任一项的方法，其中该抗体是缀合至生长抑制剂的。
37.权利要求36的方法，其中该抗体是缀合至细胞毒剂的。
38.权利要求37的方法，其中该细胞毒剂选自下组：毒素、抗生素、放射性同位素和溶核酶。
39.权利要求1-32任一项的方法，其中该抗体是在细菌中生成的。
40.权利要求1-32任一项的方法，其中该抗体是在CHO细胞中生成的。
41.权利要求1-32任一项的方法，其中该抗体引起癌细胞死亡。
42.权利要求1-32任一项的方法，其进一步包含施用至少一种别的治疗剂。
43.权利要求42的方法，其中该别的治疗剂是化疗剂。
44.权利要求42的方法，其中该别的治疗剂是抗体。
45.权利要求1-32任一项的方法，其中该肝癌包含表达EpCAM、AFP、刻缺蛋白2、Jag1、Sox9、CK19、Ras、Prom1、Spp1、FoxM1、Plk1、ccnb1、Aurkb、Wnt2、Axin2、或Glul中至少一项的细胞。
46.权利要求45的方法，其中该肝癌包含具有核刻缺蛋白2的细胞。
47.权利要求45的方法，其中该肝癌包含具有活化的Ras的细胞。
48.权利要求45的方法，其中该肝癌包含表达EpCAM的细胞且其中施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂导致该细胞中的EpCAM表达降低。
49.权利要求45的方法，其中该肝癌包含表达AFP的细胞且其中施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂导致该细胞中的AFP表达降低。
50.权利要求45的方法，其中施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂导致该肝癌中Prom1、Spp1、FoxM1、Plk1、ccnb1和Aurkb中至少一项的表达与施用该抑制剂之前的表达相比降低。
51.权利要求45的方法，其中施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂导致该肝癌中Wnt2、Axin2和Glul中至少一项的表达升高。
52.一种在有风险患上肝癌的个体中预防肝癌的方法，该方法包括对该个体施用有效量的抗Jag1抗体的步骤。
53.权利要求52的方法，其中该抗体是单克隆抗体。
54.权利要求52的方法，其中该抗体是拮抗性抗体。
55.权利要求52的方法，其中该抗体是抗体片段。
56.权利要求52的方法，其中该抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
57.权利要求52的方法，其中该抗体是缀合至生长抑制剂的。
58.权利要求52的方法，其中该抗体是缀合至细胞毒剂的。
59.权利要求52的方法，其中该细胞毒剂选自下组：毒素、抗生素、放射性同位素和溶核酶。
60.权利要求52的方法，其中该抗体是在细菌中生成的。
61.权利要求52的方法，其中该抗体是在CHO细胞中生成的。
62.权利要求52的方法，其中该抗体包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下述的HVR：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：84的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：87的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：92的氨基酸序列的HVR-L3。
63.权利要求62的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：82的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：85的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：90的氨基酸序列的HVR-L3。
64.权利要求62的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：82的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：86的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：91的氨基酸序列的HVR-L3。
65.权利要求62的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：83的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：85的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：90的氨基酸序列的HVR-L3。
66.权利要求52-65任一项的方法，其进一步包括施用至少一种别的治疗剂。
67.权利要求66的方法，其中该别的治疗剂是抗体。
68.权利要求67的方法，其中该别的治疗剂是抗刻缺蛋白2拮抗性抗体。
69.权利要求的方法，其中该个体具有选自下组的肝状况：乙型或丙型肝炎、肝硬化、良性肝肿瘤、血管瘤、肝的腺瘤、和局灶性结节增生。
70.一种抑制表达分泌型磷蛋白1(SPP1)的肝癌细胞增殖的方法，该方法包括使该细胞与刻缺蛋白2信号传导抑制剂接触，由此抑制该细胞生长。
71.权利要求70的方法，其中施用该抗体降低该肝癌细胞中的SPP1表达。
72.权利要求71的方法，其中施用该抗体将该肝癌细胞中的SPP1表达降低至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。
73.权利要求70的方法，其中使用聚合酶链式反应分析测定表达。
74.权利要求70的方法，其中该SPP1蛋白包含图11中所示氨基酸序列。
75.权利要求70的方法，其中该刻缺蛋白2信号传导抑制剂是结合选自下组的蛋白质的抗体：刻缺蛋白2和Jag1
76.权利要求75的方法，其中该抗体是抗刻缺蛋白2抗体。
77.权利要求76的方法，其中该抗体是抗刻缺蛋白2NRR抗体。
78.权利要求77的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：1的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：3的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：4的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含符合SEQIDNO：9的共有序列的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含符合SEQIDNO：14的共有序列的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含符合SEQIDNO：19的共有序列的氨基酸序列的HVR-L3。
79.权利要求75的方法，其中该抗体是抗Jag1抗体。
80.权利要求79的方法，其中该抗体包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下述的HVR：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：84的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：87的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：92的氨基酸序列的HVR-L3。
81.权利要求80的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：82的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：85的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：90的氨基酸序列的HVR-L3。
82.权利要求80的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：82的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：86的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：91的氨基酸序列的HVR-L3。
83.权利要求80的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：83的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：85的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：90的氨基酸序列的HVR-L3。
84.权利要求70-83任一项的方法，其中该抗体是单克隆抗体。
85.权利要求70-83任一项的方法，其中该抗体是拮抗性抗体。
86.权利要求70-83任一项的方法，其中该抗体是抗体片段。
87.权利要求70-83任一项的方法，其中该抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
88.权利要求70-83任一项的方法，其中该抗体是缀合至生长抑制剂的。
89.权利要求88的方法，其中该抗体是缀合至细胞毒剂的。
90.权利要求70-83任一项的方法，其中该抗体是在细菌中生成的。
91.权利要求70-83任一项的方法，其中该抗体是在CHO细胞中生成的。
92.权利要求70-83任一项的方法，其中该抗体诱导细胞死亡。
93.权利要求70-83任一项的方法，其中该肝癌细胞表达EpCAM。
94.权利要求70-83任一项的方法，其中该肝癌细胞表达AFP。
95.权利要求70-83任一项的方法，其中该肝癌细胞表达AFP和EpCAM。
96.权利要求70-83任一项的方法，其中该肝癌细胞表达刻缺蛋白2。
97.权利要求70-83任一项的方法，其中该肝癌细胞表达细胞表达Jag1。
98.权利要求70-83任一项的方法，其中该肝癌细胞表达刻缺蛋白2和Jag1。
99.权利要求70-83任一项的方法，其中该肝癌细胞包含核刻缺蛋白2。
100.权利要求70-83任一项的方法，其中该肝癌细胞包含活化的Ras。
101.权利要求70-83任一项的方法，其中使该细胞与该抗体接触导致该细胞中EpCAM、AFP、Prom1、Spp1、FoxM1、Plk1、ccnb1和Aurkb中至少一项的表达降低。
102.权利要求70-83任一项的方法，其中该细胞与该抗体接触导致该细胞中Wnt2、Axin2和Glul中至少一项的表达升高。
103.权利要求70-83任一项的方法，其中该细胞在个体中。
104.一种治疗性处理具有肝癌的哺乳动物的方法，该肝癌包含表达Spp1基因的细胞，该Spp1基因编码包含与图11中所示多肽具有至少90％同一性的氨基酸序列的肽，该方法包括对该哺乳动物施用治疗有效量的刻缺蛋白2信号传导抑制剂，由此有效治疗该哺乳动物。
105.权利要求104的方法，其中该肝癌选自下组：肝细胞癌、肝瘤、胆管瘤、肝母细胞瘤、肝癌、肝血管肉瘤、和转移性肝癌。
106.权利要求104的方法，其中该哺乳动物是人。
107.权利要求104的方法，其中该刻缺蛋白2信号传导抑制剂选自下组：抗体、siRNA和小分子抑制剂。
108.权利要求107的方法，其中该抗体是抗刻缺蛋白2抗体。
109.权利要求108的方法，其中该抗体是抗刻缺蛋白2NRR抗体。
110.权利要求109的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：1的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：3的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：4的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含符合SEQIDNO：9的共有序列的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含符合SEQIDNO：14的共有序列的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含符合SEQIDNO：19的共有序列的氨基酸序列的HVR-L3。
111.权利要求107的方法，其中该抗体是抗Jag1抗体。
112.权利要求111的方法，其中该抗体包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下述的HVR：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：84的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：87的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：92的氨基酸序列的HVR-L3。
113.权利要求112的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：82的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：85的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：90的氨基酸序列的HVR-L3。
114.权利要求112的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：82的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：86的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：91的氨基酸序列的HVR-L3。
115.权利要求112的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：83的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：85的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：90的氨基酸序列的HVR-L3。
116.权利要求104-116任一项的方法，其中该抗体是单克隆抗体。
117.权利要求104-116任一项的方法，其中该抗体是拮抗性抗体。
118.权利要求104-116任一项的方法，其中该抗体是抗体片段。
119.权利要求104-116任一项的方法，其中该抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
120.权利要求104-116任一项的方法，其中该抗体是缀合至生长抑制剂的。
121.权利要求104-116任一项的方法，其中该抗体是缀合至细胞毒剂的。
122.权利要求121的方法，其中该细胞毒剂选自下组：毒素、抗生素、放射性同位素和溶核酶。
123.权利要求104-116任一项的方法，其中该抗体是在细菌中生成的。
124.权利要求104-116任一项的方法，其中该抗体是在CHO细胞中生成的。
125.权利要求104-116任一项的方法，其中该抗体引起癌细胞死亡。
126.权利要求104-116任一项的方法，进一步包含施用至少一种别的治疗剂。
127.权利要求126的方法，其中该别的治疗剂是化疗剂。
128.权利要求127的方法，其中该别的治疗剂是抗体。
129.权利要求104-116任一项的方法，其中该肝癌包含表达EpCAM的细胞。
130.权利要求104-116任一项的方法，其中该肝癌包含表达AFP的细胞。
131.权利要求130的方法，其中该肝癌包含表达EpCAM的细胞。
132.权利要求104-116任一项的方法，其中该肝癌包含表达刻缺蛋白2的细胞。
133.权利要求104-116任一项的方法，其中该肝癌包含表达Jag1的细胞。
134.权利要求104-116任一项的方法，其中该肝癌包含表达刻缺蛋白2和Jag1的细胞。
135.权利要求104-116任一项的方法，其中该肝癌包含具有核刻缺蛋白2的细胞。
136.权利要求104-116任一项的方法，其中该肝癌包含具有活化的Ras的细胞。
137.权利要求104-116任一项的方法，其中施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂导致该肝癌中的EpCAM表达降低。
138.权利要求104-116任一项的方法，其中施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂导致该肝癌中的AFP表达降低。
139.权利要求104-116任一项的方法，其中施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂导致该肝癌中Prom1、Spp1、FoxM1、Plk1、ccnb1和Aurkb中至少一项的表达降低。
140.权利要求104-116任一项的方法，其中施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂导致该肝癌中的SPP1表达降低。
141.权利要求104-116任一项的方法，其中施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂导致该肝癌中Wnt2、Axin2和Glul中至少一项的表达升高。
142.权利要求的方法，其中通过选自下组的方法测定表达：RNAseq、微阵列分析、免疫组织化学、酶联免疫吸附测定法、基因表达序型分析、聚合酶链式反应、SAGE、MassARRAY技术、荧光原位杂交和Western印迹。
143.一种用于治疗与如下的蛋白质的表达或活性升高有关的肝细胞增殖性病症的方法，该蛋白质与图8C中所示多肽具有至少90％氨基酸序列同一性，该方法包括对需要此类治疗的个体施用有效量的抗Jag1拮抗性抗体，由此有效治疗或预防该肝细胞增殖性病症。
143.权利要求143的方法，其中该细胞增殖性病症是癌症。
144.权利要求143的方法，其中该个体具有选自下组的肝状况：乙型或丙型肝炎、肝硬化、良性肝肿瘤、血管瘤、肝的腺瘤、和局灶性结节增生。
145.权利要求143的方法，其中该抗体是抗体片段。
146.权利要求143的方法，其中该抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
147.权利要求143的方法，其中该抗体是缀合至生长抑制剂的。
148.权利要求143的方法，其中该抗体是缀合至细胞毒剂的。
149.权利要求148的方法，其中该细胞毒剂选自下组：毒素、抗生素、放射性同位素和溶核酶。
150.权利要求143的方法，其中该抗体包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下述的HVR：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：84的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：87的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：92的氨基酸序列的HVR-L3。
151.权利要求150的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：82的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：85的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：90的氨基酸序列的HVR-L3。
152.权利要求150的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：82的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：86的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：91的氨基酸序列的HVR-L3。
153.权利要求150的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：83的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：85的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：90的氨基酸序列的HVR-L3。
154.一种在具有肝癌的个体中降低血清SPP1蛋白质水平的方法，该方法包括对该个体施用有效量的刻缺蛋白2信号传导抑制剂，由此降低该个体中的血清SPP1水平。
155.权利要求154的方法，其中对该个体施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂之前的血清SPP1蛋白质水平为至少约80ng/ml。
156.权利要求155的方法，其中对该个体施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂之前的血清SPP1蛋白质水平介于约80ng/ml和约500ng/ml之间。
157.权利要求156的方法，其中对该个体施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂之前的血清SPP1蛋白质水平介于约86ng/ml和约250ng/ml之间。
158.权利要求157的方法，其中对该个体施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂之前的血清SPP1蛋白质水平介于约120ng/ml和约170ng/ml之间。
159.权利要求154的方法，其中对该个体施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂导致血清SPP1蛋白质水平低于80ng/ml。
160.权利要求154的方法，其中施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂之前的血清SPP1蛋白质水平为施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂之前24小时。
161.权利要求154的方法，其中通过酶联免疫吸附测定法测定施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂之前的血清SPP1蛋白质水平。
162.权利要求154的方法，其中血清SPP1蛋白质水平在施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂之后约一个月降低。
163.权利要求154的方法，其中血清SPP1蛋白质水平在施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂之后约两个月降低。
164.权利要求154的方法，其中血清SPP1蛋白质水平在施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂之后约三个月降低。
165.权利要求154的方法，其中该肝癌选自下组：肝细胞癌、肝瘤、胆管瘤、肝母细胞瘤、肝癌、肝血管肉瘤、和转移性肝癌。
166.权利要求154的方法，其中该刻缺蛋白2信号传导抑制剂选自下组：抗体、siRNA和小分子抑制剂。
167.权利要求166的方法，其中该抗体是抗刻缺蛋白2抗体。
168.权利要求167的方法，其中该抗体是抗刻缺蛋白2NRR抗体。
169.权利要求168的方法，其中该抗体结合小鼠刻缺蛋白2NRR和人刻缺蛋白2NRR。
170.权利要求168的方法，其中该抗体以≤10nM的Kd结合刻缺蛋白2NRR。
171.权利要求168的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：1的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：3的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：4的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含符合SEQIDNO：9的共有序列的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含符合SEQIDNO：14的共有序列的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含符合SEQIDNO：19的共有序列的氨基酸序列的HVR-L3。
172.权利要求166的方法，其中该抗体是抗Jag1抗体。
173.权利要求172的方法，其中该抗体包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下述的HVR：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：84的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：87的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：92的氨基酸序列的HVR-L3。
174.权利要求173的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：82的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：85的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：90的氨基酸序列的HVR-L3。
175.权利要求173的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：82的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：86的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：91的氨基酸序列的HVR-L3。
176.权利要求173的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：83的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：85的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：90的氨基酸序列的HVR-L3。
177.权利要求166的方法，其中该抗体是单克隆抗体。
178.权利要求166的方法，其中该抗体是拮抗性抗体。
179.权利要求166的方法，其中该抗体是抗体片段。
180.权利要求166的方法，其中该抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
181.权利要求166的方法，其中该抗体是缀合至生长抑制剂的。
182.权利要求166的方法，其中该抗体是缀合至细胞毒剂的。
183.权利要求182的方法，其中该细胞毒剂选自下组：毒素、抗生素、放射性同位素和溶核酶。
184.权利要求166的方法，其中该抗体是在细菌中生成的。
185.权利要求166的方法，其中该抗体是在CHO细胞中生成的。
186.一种在哺乳动物中治疗性处理肝癌的方法，该方法包括使至少部分依赖于刻缺蛋白2信号传导的生长强化效应的肿瘤与结合刻缺蛋白2或Jag1的抗体接触，由此有效治疗该肿瘤。
187.权利要求186的方法，其中该抗体对癌的结合拮抗刻缺蛋白2的生长强化活性。
188.权利要求186的方法，其中该肝癌选自下组：肝细胞癌、肝瘤、胆管瘤、肝母细胞瘤、肝癌、肝血管肉瘤、和转移性肝癌。
189.权利要求186的方法，其中该抗体是抗刻缺蛋白2抗体。
190.权利要求189的方法，其中该抗体是抗刻缺蛋白2NRR抗体。
191.权利要求190的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：1的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：3的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：4的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含符合SEQIDNO：9的共有序列的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含符合SEQIDNO：14的共有序列的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含符合SEQIDNO：19的共有序列的氨基酸序列的HVR-L3。
192.权利要求186的方法，其中该抗体是抗Jag1抗体。
193.权利要求192的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：84的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：87的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：92的氨基酸序列的HVR-L3。
194.权利要求193的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：82的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：85的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：90的氨基酸序列的HVR-L3。
195.权利要求193的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：82的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：86的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：91的氨基酸序列的HVR-L3。
196.权利要求193的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：83的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：85的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：90的氨基酸序列的HVR-L3。
197.权利要求186-196任一项的方法，其中该抗体是单克隆抗体。
198.权利要求186-196任一项的方法，其中该抗体是拮抗性抗体。
199.权利要求186-196任一项的方法，其中该抗体是抗体片段。
200.权利要求186-196任一项的方法，其中该抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
201.权利要求186-196任一项的方法，其中该抗体是缀合至生长抑制剂的。
202.权利要求186-196任一项的方法，其中该抗体是缀合至细胞毒剂的。
203.权利要求202的方法，其中该细胞毒剂选自下组：毒素、抗生素、放射性同位素和溶核酶。
204.权利要求186-196任一项的方法，其中该抗体是在细菌中生成的。
205.权利要求186-196任一项的方法，其中该抗体是在CHO细胞中生成的。
206.权利要求186-196任一项的方法，其中该抗体引起癌细胞死亡。
207.权利要求186-196任一项的方法，其进一步包含对该个体施用至少一种别的治疗剂。
208.权利要求207的方法，其中该别的治疗剂是化疗剂。
209.权利要求207的方法，其中该别的治疗剂是抗体。
210.权利要求186-196任一项的方法，其中该肝癌包含表达EpCAM的细胞。
211.权利要求186-196任一项的方法，其中该肝癌包含表达AFP的细胞。
212.权利要求186-196任一项的方法，其中该肝癌包含表达AFP和EpCAM的细胞。
213.权利要求186-196任一项的方法，其中该肝癌包含表达刻缺蛋白2的细胞。
214.权利要求186-196任一项的方法，其中该肝癌包含表达Jag1的细胞。
215.权利要求186-196任一项的方法，其中该肝癌包含表达刻缺蛋白2和Jag1的细胞。
216.权利要求186-196任一项的方法，其中该肝癌包含具有核刻缺蛋白2的细胞。
217.权利要求186-196任一项的方法，其中该肝癌包含具有活化的Ras的细胞。
218.权利要求186-196任一项的方法，其中施用该抗体导致该肝癌中的EpCAM表达降低。
219.权利要求186-196任一项的方法，其中施用该抗体导致该肝癌中的AFP表达降低。
220.权利要求186-196任一项的方法，其中施用该抗体导致该肝癌中Prom1、Spp1、FoxM1、Plk1、ccnb1和Aurkb中至少一项的表达降低。
221.权利要求186-196任一项的方法，其中施用该抗体导致该肝癌中的SPP1表达降低。
222.权利要求186-196任一项的方法，其中施用该抗体导致该肝癌中Wnt2、Axin2和Glul中至少一项的表达升高。
223.一种治疗具有肝癌的个体的方法，其中该方法包括下述步骤：
(a)对该个体施用刻缺蛋白2信号传导抑制剂；并
(b)测定刻缺蛋白2信号传导，其中治疗后的刻缺蛋白2信号传导与治疗前的刻缺蛋白2信号传导相比降低指示该个体中的肝癌减轻。
224.权利要求223的方法，其中通过测量刻缺蛋白2ICD核定位来测定刻缺蛋白2信号传导。
225.权利要求223的方法，其中通过测量选自下组的基因的表达来测定刻缺蛋白2信号传导：刻缺蛋白2、Jag1、Hes和Hey1。
226.权利要求223的方法，其中该肝癌选自下组：肝细胞癌、肝瘤、胆管瘤、肝母细胞瘤、肝癌、肝血管肉瘤、和转移性肝癌。
227.权利要求223的方法，其中该刻缺蛋白2信号传导抑制剂选自下组：抗体、siRNA和小分子抑制剂。
228.权利要求227的方法，其中该抗体是抗刻缺蛋白2抗体。
229.权利要求228的方法，其中该抗体是抗刻缺蛋白2NRR抗体。
230.权利要求229的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：1的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：3的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：4的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含符合SEQIDNO：9的共有序列的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含符合SEQIDNO：14的共有序列的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含符合SEQIDNO：19的共有序列的氨基酸序列的HVR-L3。
231.权利要求227的方法，其中该抗体是抗Jag1抗体。
232.权利要求231的方法，其中该抗体包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下述的HVR：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：84的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：87的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：92的氨基酸序列的HVR-L3。
233.权利要求232的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：82的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：85的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：90的氨基酸序列的HVR-L3。
234.权利要求232的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：82的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：86的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：91的氨基酸序列的HVR-L3。
235.权利要求232的方法，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：83的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：85的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：90的氨基酸序列的HVR-L3。
236.权利要求223-235任一项的方法，其中该抗体是单克隆抗体。
237.权利要求223-235任一项的方法，其中该抗体是拮抗性抗体。
238.权利要求223-235任一项的方法，其中该抗体是抗体片段。
239.权利要求223-235任一项的方法，其中该抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
240.权利要求223-235任一项的方法，其中该抗体是缀合至生长抑制剂的。
241.权利要求223-235任一项的方法，其中该抗体是缀合至细胞毒剂的。
242.权利要求223-235任一项的方法，其中该细胞毒剂选自下组：毒素、抗生素、放射性同位素和溶核酶。
243.权利要求223-235任一项的方法，其中该抗体是在细菌中生成的。
244.权利要求223-235任一项的方法，其中该抗体是在CHO细胞中生成的。
245.权利要求223-235任一项的方法，其中该抗体引起癌细胞死亡。
246.权利要求223-235任一项的方法，进一步包含施用至少一种别的治疗剂。
247.权利要求246的方法，其中该别的治疗剂是化疗剂。
248.权利要求246的方法，其中该别的治疗剂是抗体。
249.权利要求223-235任一项的方法，其中该肝癌包含表达EpCAM的细胞。
250.权利要求223-235任一项的方法，其中该肝癌包含表达AFP的细胞。
251.权利要求223-235任一项的方法，其中该肝癌包含表达AFP和EpCAM的细胞。
252.权利要求223-235任一项的方法，其中该肝癌包含表达刻缺蛋白2的细胞。
253.权利要求223-235任一项的方法，其中该肝癌包含表达Jag1的细胞。
254.权利要求223-235任一项的方法，其中该肝癌包含表达刻缺蛋白2和Jag1的细胞。
255.权利要求223-235任一项的方法，其中该肝癌包含具有核刻缺蛋白2的细胞。
256.权利要求223-235任一项的方法，其中该肝癌包含具有活化的Ras的细胞。
257.权利要求223-235任一项的方法，其中施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂导致该肝癌中的EpCAM表达降低。
258.权利要求223-235任一项的方法，其中施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂导致该肝癌中的AFP表达降低。
259.权利要求223-235任一项的方法，其中施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂导致该肝癌中Prom1、Spp1、FoxM1、Plk1、ccnb1和Aurkb中至少一项的表达降低。
260.权利要求223-235任一项的方法，其中施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂导致该肝癌中的SPP1表达降低。
261.权利要求223-235任一项的方法，其中施用该刻缺蛋白2信号传导抑制剂导致该肝癌中Wnt2、Axin2和Glul中至少一项的表达升高。
262.一种抑制细胞增殖的方法，其包括用针对刻缺蛋白2或Jag1的抗体处理哺乳动物肝癌细胞。
263.权利要求262的方法，其中该细胞在人中。
264.权利要求262的方法，其中该细胞在培养液中。
265.一种制品，其包含：(a)容器；(b)该容器内装的用于治疗肝癌的包含抗刻缺蛋白2抗体或抗Jag1抗体和载剂的组合物；和(c)贴在该容器上的标签或与该容器一起包括的包装插页，其涉及该组合物用于治疗性处理或诊断性检测肝癌的用途。
266.一种抗刻缺蛋白2抗体，其用于治疗肝癌。
267.权利要求267的抗刻缺蛋白2抗体，其中该肝癌是肝细胞癌。
268.权利要求267的抗刻缺蛋白2抗体，其中该抗体是抗刻缺蛋白2拮抗性抗体
269.权利要求268的抗刻缺蛋白2抗体，其中该抗体是抗刻缺蛋白2NRR抗体。
270.一种抗Jag1抗体，其用于治疗肝癌。
271.权利要求270的抗Jag1抗体，其中该肝癌是肝细胞癌。
272.权利要求270的抗Jag1抗体，其中该抗体是抗Jag1拮抗性抗体。
273.权利要求270的抗Jag1抗体，其中该抗体包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下述的HVR：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：84的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：87的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：92的氨基酸序列的HVR-L3。
274.权利要求273的抗体，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：82的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：85的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：90的氨基酸序列的HVR-L3。
275.权利要求273的抗体，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：82的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：86的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：91的氨基酸序列的HVR-L3。
276.权利要求273的抗体，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：83的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：85的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：90的氨基酸序列的HVR-L3。
277.抗刻缺蛋白2抗体在制备用于治疗性处理肝癌的药物中的用途。
278.权利要求277的用途，其中该肝癌是肝细胞癌。
279.权利要求277的用途，其中该抗体是抗刻缺蛋白2拮抗性抗体
280.权利要求277的用途，其中该抗体是抗刻缺蛋白2NRR抗体
281.权利要求277的用途，其中该抗体以≤10nM的Kd结合刻缺蛋白2NRR。
282.权利要求279的用途，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：1的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：3的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：4的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含符合SEQIDNO：9的共有序列的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含符合SEQIDNO：14的共有序列的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含符合SEQIDNO：19的共有序列的氨基酸序列的HVR-L3。
283.抗锯齿蛋白1抗体在制备用于治疗性处理肝癌的药物中的用途。
284.权利要求283的用途，其中该癌肝细胞癌。
285.权利要求283的用途，其中该抗体是抗Jag1拮抗性抗体。
286.权利要求283的用途，其中该抗体包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下述的HVR：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：84的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：87的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：92的氨基酸序列的HVR-L3。
287.权利要求285的用途，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：82的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：85的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：90的氨基酸序列的HVR-L3。
288.权利要求285的用途，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：82的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：86的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：91的氨基酸序列的HVR-L3。
289.权利要求285的用途，其中该抗体包含：
(a)包含SEQIDNO：81的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQIDNO：83的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQIDNO：85的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQIDNO：88的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQIDNO：89的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQIDNO：90的氨基酸序列的HVR-L3。
290.权利要求265要求保护的制品在制备用于治疗肝癌的药物中的用途。
291.权利要求265要求保护的制品在制备用于治疗肝细胞增殖性病症的药物中的用途。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106053812A (zh) * 2016-06-29 2016-10-26 厦门生迪生物技术有限公司 一种用于肝癌早期筛查和诊断的多种自身抗体联合检测elisa试剂盒
CN108187050A (zh) * 2018-01-18 2018-06-22 石河子大学 抑制食管癌细胞增殖的药物

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201401287SA (en) 2011-10-05 2014-05-29 Genentech Inc Methods of treating liver conditions using notch2 antagonists
EP2882776B1 (en) 2012-08-13 2018-05-02 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-jagged anitbodies and methods of use
WO2014141064A1 (en) 2013-03-13 2014-09-18 Novartis Ag Notch2 binding molecules for treating respiratory diseases
BR112015020290A2 (pt) 2013-03-15 2017-10-10 Genentech Inc métodos para tratar um câncer, para prevenir câncer, para inibir proliferação, para tratar terapeuticamente um mamífero, para tratar uma disfunção, para reduzir níveis de proteína spp1, para tratar terapeuticamente um câncer, para tratar um indivíduo e para inibir proliferação celular, artigo, anticorpos e usos
SG10201808259TA (en) 2014-02-12 2018-10-30 Genentech Inc Anti-jagged1 antibodies and methods of use
CA2978902A1 (en) * 2015-03-06 2016-09-15 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody therapeutics that bind jag1
CN104990905B (zh) * 2015-06-30 2017-12-29 曲凯 一种基于固相酶联免疫荧光斑点的肝癌转移诊断试剂盒
WO2017205651A1 (en) * 2016-05-25 2017-11-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Human notch1 based fusion proteins as decoy inhibitors of jagged-notch signaling and dll-notch signaling
JOP20190259A1 (ar) 2017-05-31 2019-10-31 Amgen Inc بروتينات ربط مولد ضد مضادة لـ jagged1
WO2019195959A1 (en) 2018-04-08 2019-10-17 Cothera Biosciences, Inc. Combination therapy for cancers with braf mutation
KR102325972B1 (ko) * 2020-05-06 2021-11-16 아주대학교산학협력단 간암 치료 반응 예측용 spp1 바이오마커 및 이의 용도
WO2022061595A1 (en) * 2020-09-23 2022-03-31 Xiang Li Notch1 biomarkers for cancer therapy

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011063237A2 (en) * 2009-11-19 2011-05-26 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Jagged-binding agents and uses thereof
CN102316897A (zh) * 2008-07-08 2012-01-11 昂考梅德药品有限公司 Notch 结合剂和拮抗剂及其应用方法

Family Cites Families (111)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5750373A (en) 1990-12-03 1998-05-12 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins having altered binding properties, M13 phagemids, and growth hormone variants
AU634186B2 (en) 1988-11-11 1993-02-18 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
ATE255131T1 (de) 1991-06-14 2003-12-15 Genentech Inc Humanisierter heregulin antikörper
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
CA2116774C (en) 1991-09-19 2003-11-11 Paul J. Carter Expression in e. coli antibody fragments having at least a cysteine present as a free thiol. use for the production of bifunctional f(ab') 2 antibodies
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US6004924A (en) 1991-12-11 1999-12-21 Imperial Cancer Research Technology, Ltd. Protein sequences of serrate gene products
DE69333807T2 (de) 1992-02-06 2006-02-02 Chiron Corp., Emeryville Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
CA2149329C (en) 1992-11-13 2008-07-15 Darrell R. Anderson Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
WO1994029351A2 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Celltech Limited Antibodies
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5910486A (en) 1994-09-06 1999-06-08 Uab Research Foundation Methods for modulating protein function in cells using, intracellular antibody homologues
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
CA2293829C (en) 1997-06-24 2011-06-14 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US6602677B1 (en) 1997-09-19 2003-08-05 Promega Corporation Thermostable luciferases and methods of production
DE69840412D1 (de) 1997-10-31 2009-02-12 Genentech Inc Methoden und zusammensetzungen bestehend aus glykoprotein-glykoformen
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
ES2375931T3 (es) 1997-12-05 2012-03-07 The Scripps Research Institute Humanización de anticuerpo murino.
ATE375365T1 (de) 1998-04-02 2007-10-15 Genentech Inc Antikörper varianten und fragmente davon
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DE69942021D1 (de) 1998-04-20 2010-04-01 Glycart Biotechnology Ag Glykosylierungs-engineering von antikörpern zur verbesserung der antikörperabhängigen zellvermittelten zytotoxizität
PL220113B1 (pl) 1999-01-15 2015-08-31 Genentech Inc Wariant macierzystego polipeptydu zawierającego region Fc, polipeptyd zawierający wariant regionu Fc o zmienionym powinowactwie wiązania receptora Fc gamma (FcγR), polipeptyd zawierający wariant regionu Fc o zmienionym powinowactwie wiązania noworodkowego receptora Fc (FcRn), kompozycja, wyizolowany kwas nukleinowy, wektor, komórka gospodarza, sposób otrzymywania wariantu polipeptydu, zastosowanie wariantu polipeptydu i sposób otrzymywania wariantu regionu Fc
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP2270150B2 (en) 1999-04-09 2019-08-07 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
CA2385347C (en) 1999-10-04 2009-12-15 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes
AU7950400A (en) 1999-10-19 2001-04-30 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Process for producing polypeptide
CA2393869A1 (en) 1999-12-15 2001-06-21 Genetech,Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
AU767394C (en) 1999-12-29 2005-04-21 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
CN100390288C (zh) 2000-04-11 2008-05-28 杰南技术公司 多价抗体及其应用
US6984522B2 (en) 2000-08-03 2006-01-10 Regents Of The University Of Michigan Isolation and use of solid tumor stem cells
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
MXPA03002974A (es) 2000-10-06 2004-05-05 Kyowa Hakko Kogyo Kk Celulas que producen composiciones de anticuerpo.
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US7041870B2 (en) 2000-11-30 2006-05-09 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
CA2838062C (en) 2001-08-03 2015-12-22 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
WO2003035835A2 (en) 2001-10-25 2003-05-01 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
EA200401325A1 (ru) 2002-04-09 2005-04-28 Киова Хакко Когио Ко., Лтд. Клетки с модифицированным геномом
CA2481925A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Therapeutic agent for patients having human fc.gamma.riiia
AU2003236017B2 (en) 2002-04-09 2009-03-26 Kyowa Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition
JPWO2003085118A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物の製造方法
DE60336548D1 (de) 2002-04-09 2011-05-12 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
EP1498491A4 (en) 2002-04-09 2006-12-13 Kyowa Hakko Kogyo Kk METHOD FOR INCREASING THE ACTIVITY OF AN ANTIBODY COMPOSITION FOR BINDING TO THE FC GAMMA RECEPTOR IIIA
WO2003102157A2 (en) 2002-06-03 2003-12-11 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20040101847A1 (en) 2002-11-22 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of Notch2 expression
US20050191302A1 (en) 2002-08-29 2005-09-01 University Of Southampton Treatment for liver disease
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
BRPI0316779B8 (pt) 2002-12-16 2023-02-28 Genentech Inc Anticorpo anti-cd20 humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, seus usos, composição, artigo manufaturado e formulação líquida
WO2004065416A2 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
JPWO2005035586A1 (ja) 2003-10-08 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 融合蛋白質組成物
JPWO2005035778A1 (ja) 2003-10-09 2006-12-21 協和醗酵工業株式会社 α１，６−フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制するＲＮＡを用いた抗体組成物の製造法
ES2341009T3 (es) 2003-11-05 2010-06-14 Roche Glycart Ag Anticuerpos cd20 con afinidad de union a receptores fc y funcion efectora.
NZ583292A (en) 2003-11-06 2012-03-30 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
MXPA06011199A (es) 2004-03-31 2007-04-16 Genentech Inc Anticuerpos anti-tgf-beta humanizados.
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
WO2005100402A1 (en) 2004-04-13 2005-10-27 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
BRPI0516284A (pt) 2004-09-23 2008-09-02 Genentech Inc anticorpo construìdo com cisteìna, método de selecionar anticorpos, compostos conjugados de droga-anticorpo, composição farmacêutica, método para matar ou inibir a proliferação de células de tumor, métodos de inibir a proliferação celular e o crescimento de células de tumor, artigo manufaturado e método para produzir um composto
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
AT502055B1 (de) 2005-06-21 2007-11-15 Univ Wien Med Anti tumor medikament
ES2577292T3 (es) 2005-11-07 2016-07-14 Genentech, Inc. Polipéptidos de unión con secuencias hipervariables de VH/VL diversificadas y consenso
WO2007064919A2 (en) 2005-12-02 2007-06-07 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
AU2007249408A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
US20080241150A1 (en) 2006-05-15 2008-10-02 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Functional negative regulatory domain sequences from human NOTCH1 and 2 and isolated LNR domains from human NOTCH1
PL2059533T3 (pl) 2006-08-30 2013-04-30 Genentech Inc Przeciwciała wieloswoiste
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
WO2008140826A1 (en) 2007-05-15 2008-11-20 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for diagnosing and treating cancer
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
PE20090321A1 (es) 2007-06-04 2009-04-20 Genentech Inc Anticuerpos anti-notch1 nrr, metodo de preparacion y composicion farmaceutica
EP3663318A1 (en) 2008-01-07 2020-06-10 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
US8557965B2 (en) 2008-04-07 2013-10-15 Ablynx N.V. Single variable domains against notch pathway members
KR20110057244A (ko) 2008-09-19 2011-05-31 메디뮨 엘엘씨 Ｄｌｌ4에 대한 항체 및 이의 용도
WO2010039832A1 (en) 2008-10-01 2010-04-08 Genentech, Inc. Anti-notch2 antibodies and methods of use
SG11201401287SA (en) * 2011-10-05 2014-05-29 Genentech Inc Methods of treating liver conditions using notch2 antagonists
BR112014031689A2 (pt) 2012-06-22 2017-07-25 Cytomx Therapeutics Inc anticorpos reativos cruzados anti-jagged 1/jagged 2, anticorpos anti-jagged ativáveis e métodos de uso deles
EP2882776B1 (en) * 2012-08-13 2018-05-02 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-jagged anitbodies and methods of use
BR112015020290A2 (pt) 2013-03-15 2017-10-10 Genentech Inc métodos para tratar um câncer, para prevenir câncer, para inibir proliferação, para tratar terapeuticamente um mamífero, para tratar uma disfunção, para reduzir níveis de proteína spp1, para tratar terapeuticamente um câncer, para tratar um indivíduo e para inibir proliferação celular, artigo, anticorpos e usos
SG10201808259TA (en) 2014-02-12 2018-10-30 Genentech Inc Anti-jagged1 antibodies and methods of use

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102316897A (zh) * 2008-07-08 2012-01-11 昂考梅德药品有限公司 Notch 结合剂和拮抗剂及其应用方法
WO2011063237A2 (en) * 2009-11-19 2011-05-26 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Jagged-binding agents and uses thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MICHAEL T. DILL等: "Constitutive Notch2 Signaling Induces Hepatic Tumors in Mice", 《HEPATOLOGY》 *
SHIN-ICHI NISHINA等: "Restored expression of the tumor suppressor gene RUNX3 reduces cancer stem cells in hepatocellular carcinoma by suppressing Jagged1-Notch signaling", 《ONCOLOGY REPORTS》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106053812A (zh) * 2016-06-29 2016-10-26 厦门生迪生物技术有限公司 一种用于肝癌早期筛查和诊断的多种自身抗体联合检测elisa试剂盒
CN106053812B (zh) * 2016-06-29 2017-12-08 厦门生迪生物技术有限公司 一种用于肝癌早期筛查和诊断的多种自身抗体联合检测elisa试剂盒
CN108187050A (zh) * 2018-01-18 2018-06-22 石河子大学 抑制食管癌细胞增殖的药物

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Publication number Publication date
CA2902765A1 (en) 2014-09-25
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