CN105246511A - 治疗和预防癌症药物抗性的方法 - Google Patents

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Abstract

本文中提供使用FGFR信号传导的拮抗剂治疗病理疾患(诸如癌症)的组合疗法。

Description

治疗和预防癌症药物抗性的方法
对相关申请的交叉引用
本申请要求2013年3月6日提交的美国专利申请No.61/773,720的优先权，通过提述将其完整收录。
发明领域
本文中提供使用FGFR信号传导的拮抗剂治疗病理疾患(诸如癌症)的组合疗法。
发明背景
相对快速获得对癌症药物的抗性仍然是成功癌症疗法的一项关键障碍。阐明此类药物抗性的分子基础的巨大努力已揭示了多种机制，包括药物外流、靶物的药物结合缺陷突变体的获得、备选存活途径的卷入、后生改变。用EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗包含活化性EGFR突变的NSCLC患者导致对疗法的抗肿瘤应答，然而患者最终由于获得药物抗性而在治疗的情况下进展。已知的抗性机制包括EGFR基因中的继发突变(EGFRT790M)或MET基因扩增，然而在约40-45％的案例中根本的抗性机制仍然有待阐明。需要新的治疗方法来成功解决癌症细胞群体内的异质性和癌细胞对药物治疗的抗性的出现。
发明概述
本文中提供使用FGFR信号传导的拮抗剂和EGFR拮抗剂的组合疗法。
特别地，本文中提供在个体中治疗癌症的方法，其包括对该个体伴随施用(a)FGFR信号传导的拮抗剂和(b)EGFR拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂和所述EGFR拮抗剂各自的量有效延长癌症敏感性的时段和/或延迟癌症形成对所述EGFR拮抗剂的抗性。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂和所述EGFR拮抗剂各自的量有效提高包含EGFR拮抗剂的癌症治疗的功效。例如，在一些实施方案中，与包括在没有所述FGFR信号传导的拮抗剂的情况下(在所述FGFR信号传导的拮抗剂缺失下)施用有效量的所述EGFR拮抗剂的标准治疗相比，所述FGFR信号传导的拮抗剂和所述EGFR拮抗剂各自的量有效提高功效。在一些实施方案中，与包括在没有所述FGFR信号传导的拮抗剂的情况下(在所述FGFR信号传导的拮抗剂缺失下)施用有效量的所述EGFR拮抗剂的标准治疗相比，所述FGFR信号传导的拮抗剂和所述EGFR拮抗剂各自的量有效提高响应(例如完全响应)。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂和所述EGFR拮抗剂各自的量有效提高和/或恢复癌症对所述EGFR拮抗剂的敏感性。
本文中还提供在个体中治疗对EGFR拮抗剂治疗有抗性的癌细胞的方法，其包括对该个体施用有效量的FGFR信号传导的拮抗剂和有效量的所述EGFR拮抗剂。另外，本文中提供在个体中治疗对EGFR拮抗剂有抗性的癌症的方法，其包括对该个体施用有效量的FGFR信号传导的拮抗剂和有效量的所述EGFR拮抗剂。
本文中提供提高和/或恢复对EGFR拮抗剂的敏感性的方法，其包括对该个体施用有效量的FGFR信号传导的拮抗剂和有效量的所述EGFR拮抗剂。
本文中还提供在个体中提高包含EGFR拮抗剂的癌症治疗的功效的方法，其包括对该个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导的拮抗剂和(b)有效量的所述EGFR拮抗剂。
本文中提供在个体中治疗癌症的方法，其包括对该个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导的拮抗剂和(b)有效量的EGFR拮抗剂，其中所述癌症治疗具有与包含在没有所述FGFR信号传导的拮抗剂的情况下(在所述FGFR信号传导的拮抗剂缺失下)施用有效量的所述EGFR拮抗剂的标准治疗相比升高的功效。
另外，本文中提供在个体中延迟和/或阻止癌症形成对EGFR拮抗剂的抗性，其包括对该个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导的拮抗剂和(b)有效量的所述EGFR。
本文中提供治疗形成对EGFR拮抗剂的抗性的可能性升高的具有癌症的个体的方法，其包括对该个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导的拮抗剂和(b)有效量的所述EGFR拮抗剂。
本文中进一步提供在具有癌症的个体中提高对EGFR拮抗剂的敏感性的方法，其包括对该个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导的拮抗剂和(b)有效量的所述EGFR拮抗剂。
本文中还提供在具有癌症的个体中延长EGFR拮抗剂敏感性的时段的方法，其包括对该个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导的拮抗剂和(b)有效量的所述EGFR拮抗剂。
本文中提供在具有癌症的个体中延长对EGFR拮抗剂的响应的持续时间的方法，其包括对该个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导的拮抗剂和(b)有效量的所述EGFR拮抗剂。
在任何所述方法的一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是抗体抑制剂、小分子抑制剂、结合多肽抑制剂、和/或多核苷酸拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是结合多肽抑制剂。在一些实施方案中，所述结合多肽抑制剂包含与Fc域连接的FGFR胞外域的一个区域(例如与免疫球蛋白铰链和Fc域连接的FGFR胞外域的一个区域)。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是FGFR1信号传导的拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是FGFR2信号传导的拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是FGFR3信号传导的拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是FGFR4信号传导的拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是小分子。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是抗体。
在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂结合和/或抑制FGFR1b、FGFR1c、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、和FGF10中一项或多项。在一些实施方案中，所述小分子是N-[2-[[4-(二乙基氨基)丁基]氨基]-6-(3,5-二甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]-N'-(1,1-二甲基乙基)-脲(N-[2-[[4-(diethylamino)butyl]amino]-6-(3,5-dimethoxyphenyl)pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-yl]-N'-(1,1-dimethylethyl)-urea)或其药学可接受盐。在一些实施方案中，所述小分子是BGJ398(Novartis)、AZD4547(AstraZeneca)、和/或FF284(Chugai/Debiopharm(Debio1347))。在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂是抗FGF2抗体。在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂是抗FGFR1抗体。在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂是抗FGFR1-IIIb抗体。在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂是抗FGFR1-IIIc抗体。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是能够结合超过一种FGFR多肽的抗FGFR抗体。
在任何所述方法的一些实施方案中，所述EGFR拮抗剂是N-(3-乙炔基苯基)-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺(N-(3-ethynylphenyl)-6,7-bis(2-methoxyethoxy)-4-quinazolinamine)和/或其药学可接受盐。在一些实施方案中，所述EGFR拮抗剂是N-(3-乙炔基苯基)-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺。在任何所述方法的一些实施方案中，所述EGFR拮抗剂是N-(3-氯-4-氟-苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉-4-基丙氧基)喹唑啉-4-胺(N-(3-chloro-4-fluoro-phenyl)-7-methoxy-6-(3-morpholin-4-ylpropoxy)quinazolin-4-amine)和/或其药学可接受盐。在一些实施方案中，所述EGFR拮抗剂是N-(3-氯-4-氟-苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉-4-基丙氧基)喹唑啉-4-胺。
在任何所述方法的一些实施方案中，所述癌症是肺癌。在一些实施方案中，所述肺癌是NSCLC。在一些实施方案中，所述癌症已经经历上皮-间充质转变。
附图简述
图1A-C。|HCC4006-ER细胞对厄洛替尼有抗性。A，在所示浓度的厄洛替尼存在下72小时时测定亲本(HCC4006)和厄洛替尼选择的HCC4006细胞(HCC4006-ER)的细胞存活力。B，将HCC4006和HCC4006-ER细胞用或不用1μM厄洛替尼处理72小时，用碘化丙啶(PI)和膜联蛋白V染色，并通过FACS分析以定量膜联蛋白阳性细胞。C，将HCC4006和HCC4006-ER细胞用所示浓度的厄洛替尼处理8小时，并用所示抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。
图2A-D。|HCC4006-ER细胞展现EMT的特征。A，将亲本和厄洛替尼抗性HCC4006细胞裂解物对上皮相关蛋白质和间充质相关蛋白质(分别是E-钙粘着蛋白和波形蛋白)进行免疫印迹。B，在抓伤测定法中测量HCC4006和HCC4006-ER细胞的迁移率，并通过ImaginonIncucyte监测伤口闭合。C，在1％或10％胎牛血清(FBS)存在下在透孔(transwell)测定法中测量细胞侵入。D，在所示时间点测量HCC4006和HCC4006-ER细胞的细胞存活力。
图3A-C。|在HCC4006-ER细胞中AXL抑制不能克服对厄洛替尼的抗性。A，在所示浓度的AXL激酶抑制剂R428和/或厄洛替尼存在下培养72小时后，测量亲本和厄洛替尼抗性HCC4006细胞的细胞存活力。B，在siRNA介导的AXL敲低或对照siRNA之后，在所示浓度的厄洛替尼存在下测量厄洛替尼抗性HCC4006-ER细胞的细胞存活力。C，免疫印迹对照，演示靶向AXL的siRNA对AXL表达水平的影响。
图4A-C。|FGFR1和特定FGF配体在HCC4006-ER细胞中显著升高。A，与HCC4006细胞相比，HCC4006-ER中FGF家族受体和配体的基因表达的倍数变化(log)，基于微阵列序型分析。B，qRT-PCR对选定基因的确认。C，FGF2蛋白质水平在HCC4006-ER细胞的上清液和裂解物中均升高，通过ELISA检测。
图5A-C。|在HCC4006-ER细胞中对配体依赖性FGFR信号传导的特异性抑制克服对厄洛替尼的抗性。A，在所示浓度的厄洛替尼或PD173074存在下72小时时测定HCC4006(左)和HCC4006-ER(右)细胞中的细胞存活力。B，将HCC4006和HCC4006-ER细胞用所示药物处理2小时，并用所示抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。用外源FGF2+肝素刺激细胞充当FGFR激活的阳性对照。C，在重组可溶性FGFR-Fc(用于中和FGF配体)和对照存在下处理72小时后HCC4006和HCC4006-ER细胞中的细胞存活力。
图6。|在HCC4006细胞中FGFR抑制阻抑形成对厄洛替尼的抗性。用厄洛替尼(1μM)、PD173074(0.5μM)或组合连续处理细胞(1x105个)，之后固定并用结晶紫染色。未处理的和PD173074处理的培养物在4周时染色，而厄洛替尼和组合处理的培养物在6周时染色。
图7A-B。|FGFR而非AXL抑制使另一种与EMT有关的厄洛替尼抗性模型HCC827-ER对EGFR抑制的存活效应部分再敏化。A，在所示浓度的厄洛替尼、R428、或PD173074存在下72小时时测定HCC827-ER细胞中的细胞存活力。B，在重组可溶性FGFR-Fc(用于中和FGF配体)和对照存在下处理72小时后HCC827和HCC827-ER细胞中的细胞存活力。
图8。|在厄洛替尼存在或缺失下在HCC4006-ER细胞中对一组小分子抑制剂的筛选揭示了FGFR抑制剂PD173074能逆转对厄洛替尼的抗性。显示了生长抑制剂IC50。
发明详述
I.定义
感兴趣多肽的“拮抗剂”(可互换称作“抑制剂”)是干扰感兴趣多肽的活化或功能，例如部分或完全阻断、抑制、或中和由感兴趣多肽介导的生物学活性的药剂。例如，多肽X的拮抗剂可以指部分或完全阻断、抑制、或中和由多肽X介导的生物学活性的任何分子。抑制剂的例子包括抗体；配体抗体；小分子拮抗剂；反义和抑制性RNA(例如shRNA)分子。优选地，抑制剂是结合感兴趣多肽的抗体或小分子。在一个特定实施方案中，抑制剂具有约1,000nM或更少的对感兴趣多肽的结合亲和力(解离常数)。在另一个实施方案中，抑制剂具有约100nM或更少的对感兴趣多肽的结合亲和力。在另一个实施方案中，抑制剂具有约50nM或更少的对感兴趣多肽的结合亲和力。在一个特定实施方案中，抑制剂共价结合至感兴趣多肽。在一个特定实施方案中，抑制剂以1,000nM或更少的IC50抑制感兴趣多肽的信号传导。在另一个实施方案中，抑制剂以500nM或更少的IC50抑制感兴趣多肽的信号传导。在另一个实施方案中，抑制剂以50nM或更少的IC50抑制感兴趣多肽的信号传导。在某些实施方案中，拮抗剂将感兴趣多肽的表达水平或生物学活性降低或抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施方案中，感兴趣多肽是FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、和/或FGFR4)或FGF(例如FGF1-23)。在一些实施方案中，感兴趣多肽是EGFR。
除非另有说明，如本文中使用的，术语“多肽”指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳类动物，诸如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠))的任何天然感兴趣多肽。该术语涵盖“全长”、未加工多肽以及源自细胞中加工的任何形式的多肽。该术语还涵盖多肽的天然发生变体，例如剪接变体或等位变体。
“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶，或者通过合成反应掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。若存在的话，对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在合成后进一步修饰，诸如通过与标记物缀合。其它类型的修饰包括例如“帽”，将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代，核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷连接(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有带电荷连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰，含有悬垂模块(pendantmoiety)诸如例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰，具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的修饰，含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰，含有烷化剂的修饰，具有经修饰连接(例如α端基异构核酸(anomericnucleicacid)等)的修饰，以及未修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖类中的任何羟基基团可以用例如膦酸(phosphonate)基团、磷酸(phosphate)基团替换，用标准保护基团保护，或活化以制备与别的核苷酸的别的连接，或者可缀合至固体或半固体支持物。可磷酸化或者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团模块取代5’和3’末端OH。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸也可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括例如2’-氧-甲基-、2’-氧-烯丙基-、2’-氟-或2’-叠氮-核糖，碳环糖类似物，α-端基异构糖，差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无环类似物及脱碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于以下实施方案，其中磷酸酯用P(O)S(“硫代酸酯”(thioate))、P(S)S(“二硫代酸酯”(dithioate))、(O)NR2(“酰胺酯”(amidate))、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(“甲缩醛”(formacetal))替代，其中R或R’各自独立为H或者取代或未取代的烃基(1-20个C)，任选含有醚(-O-)连接、芳基、烯基、环烃基、环烯基或芳烃基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。前述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
术语“小分子”指具有约2000道尔顿或更小，优选约500道尔顿或更小的分子量的任何分子。
“分离的”抗体指已经与其天然环境的组分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述，见例如Flatman等人，J.Chromatogr.B848：79-87(2007)。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
术语“抗感兴趣多肽抗体”和“结合感兴趣多肽的抗体”指能够以足够亲和力结合感兴趣多肽，使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向感兴趣多肽的抗体。在一个实施方案中，根据例如通过放射免疫测定法(RIA)的测量，抗感兴趣多肽抗体结合无关的、非感兴趣多肽的蛋白质的程度小于该抗体对感兴趣多肽的结合的约10％。在某些实施方案中，结合感兴趣多肽的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10-8M或更少、例如10-8M至10-13M、例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗感兴趣多肽抗体结合在来自不同物种的感兴趣多肽中保守的感兴趣多肽表位。在一些实施方案中，感兴趣多肽是FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)。在一些实施方案中，感兴趣多肽是EGFR。
“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体是抑制或降低其结合的抗原的生物学活性的抗体。优选的阻断性抗体或拮抗性抗体实质性或完全抑制抗原的生物学活性。
“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1：1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)来表述。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性的实施方案。
“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体中结合完整抗体结合的抗原的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，且相反，参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50％或更多。
术语“嵌合”抗体指其中的重和/或轻链的一部分自特定的来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体。
术语“全长抗体”、“完整抗体”、和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有Fc区的重链的抗体。
如本文中使用的，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特性，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。
“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体，例如非人抗体的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。
“免疫缀合物”指与一种或多种异源分子，包括但不限于细胞毒剂缀合的抗体。
“个体响应”或“响应”可使用指示对个体益处的任何终点评估，包括但不限于：(1)一定程度地抑制疾病进展(例如癌症进展)，包括减缓和完全阻滞；(2)缩小肿瘤尺寸；(3)抑制(即减轻、减缓或完全终止)癌细胞浸润入临近周围器官和/或组织；(4)抑制(即减轻、减缓或完全终止)转移；(5)一定程度地减轻与疾病或病症(例如癌症)有关的一种或多种症状；(6)无进展存活的长度延长；和/或(8)治疗后给定时间点的死亡率降低。
术语“基本上相同”在用于本文时表示两个数值之间足够高的相似程度，以致本领域技术人员将认为在用所述数值(例如Kd值或表达)所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有很小的或没有生物学和/或统计学显著性。作为参照/比较值的函数，所述两个数值之间的差异例如小于约50％，小于约40％，小于约30％，小于约20％，和/或小于约10％。
短语“实质性不同”在用于本文时表示两个数值之间足够高的差异程度，以致本领域技术人员将认为在用所述数值(例如Kd值)所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有统计学显著性。作为参照/比较分子值的函数，所述两个数值之间的差异例如大于约10％，大于约20％，大于约30％，大于约40％，和/或大于约50％。
物质/分子(例如药物组合物)的“有效量”指在必需的剂量和时间段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。
物质/分子的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和重量及该物质/分子在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还指物质/分子的治疗有益效果胜过任何有毒或有害效果的量。“预防有效量”指在必需的剂量和时间段上有效实现期望的预防结果的量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病之前或在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效量将低于治疗有效量。
术语“药物配制剂”指其形式容许其中含有的活性成分的生物学活性是有效的，且不含对会施用该配制剂的受试者产生不可接受的毒性的别的成分的制剂。
“药学可接受载体”指药物配制剂中除了活性成分外对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂、或防腐剂。
如本文中使用的，“药学可接受盐”指化合物的药学可接受有机或无机盐。
如本文中使用的，“治疗/处理”(及其语法变型)指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在一些实施方案中，使用本发明的抗体来延迟疾病的形成或减缓疾病的进展。
术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212、和Lu的放射性同位素)、化疗剂或化疗药物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱类(vincaalkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)、生长抑制剂、酶及其片段、诸如溶核酶、抗生素、和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体；及下文披露的各种抗肿瘤药或抗癌药。下文记载了其它细胞毒剂。杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。
“个体”或“受试者”指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如牛、绵羊、猫、犬、和马)、灵长类(例如人和非人灵长类诸如猴)、兔、和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
术语“伴随”在本文中用于指施用两种或更多种治疗剂，给药的时间足够接近，其中各种治疗剂的效果在时间上交叠。因而，并行施用包括在中止施用一种或多种药剂后继续施用一种或多种其它药剂的给药方案。在一些实施方案中，伴随施用是并行地，序贯地，和/或同时地。
“降低或抑制”指引起20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或更大的总体降低的能力。降低或抑制可以指所治疗的病症的症状、转移的存在或大小、或原发性肿瘤的大小。
术语“包装插页”用于指通常包括在治疗用产品的商业包装中的说明书，它们包含有关涉及此类治疗用产品应用的适应征、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
“制品”是包含至少一种试剂，例如用于治疗疾病或病症(例如癌症)的药物或用于特异性检测本文所述生物标志物的探针的任何制造物(例如包装或容器)或试剂盒。在某些实施方案中，制造物或试剂盒以用于实施本文所述方法的单位推销、分销或销售。
如本领域技术人员理解的，本文中提述“约”某值或参数包括(且描述)针对该值或参数本身的实施方案。例如，提述“约X”的描述包括对“X”的描述。
应当理解，本文中描述的本发明的方面和实施方案包括由和/或基本上由各方面和实施方案“组成”。如本文中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述/该”包括复数提及物，除非另外指示。
II.方法和用途
本文中提供利用FGFR信号传导的拮抗剂和/或EGFR拮抗剂来治疗癌症的方法。
特别地，本文中提供在个体中治疗癌症的方法，其包括对该个体伴随施用(a)FGFR信号传导的拮抗剂和(b)EGFR拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂和EGFR拮抗剂各自的量有效延长癌症敏感性的时段和/或延迟癌症形成对所述EGFR拮抗剂的抗性。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂和EGFR拮抗剂各自的量有效提高包含EGFR拮抗剂的癌症治疗的功效。例如，在一些实施方案中，与包括在没有所述FGFR信号传导的拮抗剂的情况下(在所述FGFR信号传导的拮抗剂缺失下)施用有效量的所述EGFR拮抗剂的标准治疗相比，所述FGFR信号传导的拮抗剂和EGFR拮抗剂各自的量有效提高功效。在一些实施方案中，与包括在没有所述FGFR信号传导的拮抗剂的情况下(在所述FGFR信号传导的拮抗剂缺失下)施用有效量的所述EGFR拮抗剂的标准治疗相比，所述FGFR信号传导的拮抗剂和EGFR拮抗剂各自的量有效提高响应(例如完全响应)。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂和所述EGFR拮抗剂各自的量有效提高和/或恢复癌症对所述EGFR拮抗剂的敏感性。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是FGFR1信号传导的拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂结合和/或抑制FGFR1b、FGFR1c、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、和FGF10中一项或多项。在一些实施方案中，所述EGFR拮抗剂是厄洛替尼(erlotinib)或吉非替尼(gefitinib)。
本文中提供在个体中治疗对EGFR拮抗剂治疗有抗性的癌细胞的方法，其包括对该个体施用有效量的FGFR信号传导的拮抗剂和有效量的所述EGFR拮抗剂。本文中还提供在个体中治疗对EGFR拮抗剂有抗性的癌症的方法，其包括对该个体施用有效量的FGFR信号传导的拮抗剂和有效量的所述EGFR拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是FGFR1信号传导的拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂结合和/或抑制FGFR1b、FGFR1c、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、和FGF10中一项或多项。在一些实施方案中，所述EGFR拮抗剂是厄洛替尼或吉非替尼。
本文中还提供提高和/或恢复对EGFR拮抗剂的敏感性的方法，其包括对个体施用有效量的FGFR信号传导的拮抗剂和有效量的所述EGFR拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是FGFR1信号传导的拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂结合和/或抑制FGFR1b、FGFR1c、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、和FGF10中一项或多项。在一些实施方案中，所述EGFR拮抗剂是厄洛替尼或吉非替尼。
本文中进一步提供在个体中提高包含EGFR拮抗剂的癌症治疗的功效的方法，其包括对该个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导的拮抗剂和(b)有效量的所述EGFR拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是FGFR1信号传导的拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂结合和/或抑制FGFR1b、FGFR1c、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、和FGF10中一项或多项。在一些实施方案中，所述EGFR拮抗剂是厄洛替尼或吉非替尼。
本文中提供在个体中治疗癌症的方法，其包括对该个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导的拮抗剂和(b)有效量的EGFR拮抗剂，其中所述癌症治疗具有与包含在没有所述FGFR信号传导的拮抗剂的情况下(在所述FGFR信号传导的拮抗剂缺失下)施用有效量的所述EGFR拮抗剂的标准治疗相比升高的功效。另外，本文中提供在个体中延迟和/或阻止癌症形成对EGFR拮抗剂的抗性的方法，其包括对该个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导的拮抗剂和(b)有效量的所述EGFR拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是FGFR1信号传导的拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂结合和/或抑制FGFR1b、FGFR1c、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、和FGF10中一项或多项。在一些实施方案中，所述EGFR拮抗剂是厄洛替尼或吉非替尼。
本文中提供治疗形成对EGFR拮抗剂的抗性的可能性升高的具有癌症的个体的方法，其包括对该个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导的拮抗剂和(b)有效量的所述EGFR拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是FGFR1信号传导的拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂结合和/或抑制FGFR1b、FGFR1c、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、和FGF10中一项或多项。在一些实施方案中，所述EGFR拮抗剂是厄洛替尼或吉非替尼。
本文中进一步提供在具有癌症的个体中提高对EGFR拮抗剂的敏感性的方法，其包括对该个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导的拮抗剂和(b)有效量的所述EGFR拮抗剂。另外，本文中提供在具有癌症的个体中延长EGFR拮抗剂敏感性的时段的方法，其包括对该个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导的拮抗剂和(b)有效量的所述EGFR拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是FGFR1信号传导的拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂结合和/或抑制FGFR1b、FGFR1c、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、和FGF10中一项或多项。在一些实施方案中，所述EGFR拮抗剂是厄洛替尼或吉非替尼。
本文中还提供在具有癌症的个体中延长对EGFR拮抗剂的响应的持续时间的方法，其包括伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导的拮抗剂和(b)有效量的所述EGFR拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是FGFR1信号传导的拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂结合和/或抑制FGFR1b、FGFR1c、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、和FGF10中一项或多项。在一些实施方案中，所述EGFR拮抗剂是厄洛替尼或吉非替尼。
在任何所述方法的一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是抗体抑制剂、小分子抑制剂、结合多肽抑制剂、和/或多核苷酸拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是结合多肽抑制剂。在一些实施方案中，所述结合多肽抑制剂包含与Fc连接的FGFR胞外域的一个区域(例如FP-1039(FivePrime))。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是FGFR1信号传导的拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是FGFR2信号传导的拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是FGFR3信号传导的拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是FGFR4信号传导的拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是小分子。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是抗体。
在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂结合和/或抑制FGFR1b、FGFR1c、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、和FGF10中一项或多项。在一些实施方案中，所述小分子是N-[2-[[4-(二乙基氨基)丁基]氨基]-6-(3,5-二甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]-N'-(1,1-二甲基乙基)-脲或其药学可接受盐。在一些实施方案中，所述小分子是BGJ398(Novartis)、AZD4547(AstraZeneca)、和/或FF284(Chugai/Debiopharm(Debio1347))。在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂是抗FGF2抗体。在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂是抗FGFR1抗体。在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂是抗FGFR1-IIIb抗体。在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂是抗FGFR1-IIIc抗体。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是能够结合超过一种FGFR多肽的抗FGFR抗体。
对本文中使用的疗法具有抗性的癌症包括对疗法不响应和/或产生显著响应(例如部分响应和/或完全响应)的能力降低的癌症。抗性可以是在治疗方法过程中产生的获得性抗性。在一些实施方案中，所述获得性药物抗性是瞬时和/或可逆药物耐受。对疗法的瞬时和/或可逆药物抗性包括其中所述药物抗性能够在所述治疗方法暂停后再获得对疗法的敏感性。在一些实施方案中，所述获得性抗性是永久抗性。对疗法的永久抗性包括赋予药物抗性的遗传变化。
对本文中使用的疗法具有敏感性的癌症包括响应和/或能够产生显著响应(例如部分响应和/或完全响应)的癌症。
对疗法评估抗性获得和/或敏感性维持的测定方法是本领域已知的且在实施例中描述。可以通过如实施例和Sharma等人中所述测定药物耐受坚持者的生长来评估抗性获得和/或敏感性维持(诸如药物耐受)的变化。可以通过如实施例和Sharma等人中所述测定药物耐受扩大坚持者的生长来评估抗性获得和/或敏感性维持(诸如永久抗性和/或扩大抵抗者)的变化。在一些实施方案中，可以通过IC50，EC50的变化或药物耐受坚持者和/或药物耐受扩大坚持者中肿瘤生长的降低来指示抗性。在一些实施方案中，所述变化大于约50％、100％、和/或200％任一。另外，可以在体内评估抗性获得和/或敏感性维持的变化，例如通过评估对疗法的响应、响应持续时间、和/或进展前时间，例如部分响应和完全响应。抗性获得和/或敏感性维持的变化可以基于一群个体中对疗法的响应、响应持续时间、和/或进展前时间的变化，例如部分响应和完全响应的数目。
在任何所述方法的一些实施方案中，所述癌症是实体瘤癌症。在一些实施方案中，所述癌症是肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))。在一些实施方案中，所述癌症是上皮组织的癌症。在一些实施方案中，所述癌症是腺癌。开始包含所述FGFR信号传导的拮抗剂和所述EGFR拮抗剂的治疗方法时本文所述任何组合疗法方法中的癌症可以是对包含单独的所述EGFR拮抗剂的治疗方法敏感性的(敏感性的例子包括但不限于响应和/或能够产生显著响应(例如部分响应和/或完全响应))。开始包含所述FGFR信号传导的拮抗剂和所述EGFR拮抗剂的治疗方法时本文所述任何组合疗法方法中的癌症可以不是对包含单独的所述EGFR拮抗剂的治疗方法抗性的(抗性的例子包括但不限于不响应和/或能够产生显著响应(例如部分响应和/或完全响应)的能力降低和/或不能产生显著响应(例如部分响应和/或完全响应))。在一些实施方案中，所述癌症已经经历上皮-间充质转变(EMT)。在一些实施方案中，EMT是通过测定上皮相关蛋白质/RNA(例如E-钙粘着蛋白)和/或间充质相关蛋白质/RNA(例如波形蛋白)的表达来检测的。在一些实施方案中，所述癌症具有野生型EGFR(即所述癌症不具有EGFR中的突变)。在一些实施方案中，所述癌症具有EGFR中的突变。
在任何所述方法的一些实施方案中，依照任何上述实施方案的个体可以是人。
在任何方法的一些实施方案中，上文记载的组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在相同或分别的配制剂中)，和分开施用(在该情况中本发明的拮抗剂可以在别的治疗剂和/或佐剂施用之前、同时、序贯、并行和/或之后施用)。在一些实施方案中，组合疗法进一步包含放射疗法和/或别的治疗剂。
可以通过任何合适的手段，包括口服、胃肠外、肺内、和鼻内，及若期望用于局部治疗的话，损伤内施用来施用FGFR信号传导的拮抗剂和EGFR拮抗剂。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。部分根据施用是短暂的还是长期的，给药可以通过任何合适的路径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射进行。本文中涵盖各种给药日程表，包括但不限于单次施用或在多个时间点里的多次施用、推注施用、和脉冲输注。
本文中描述的FGFR信号传导的拮抗剂(例如抗体、结合多肽、和/或小分子)和EGFR拮抗剂可以一种符合良好的医学实践的方式配制、确定剂量及施用。在此背景中考虑的因素包括在治疗的特定病症、在治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状态、病症原因、药剂递送部位、施用方法、施用日程以及其它为从业医生所知的因素。FGFR信号传导的拮抗剂和EGFR拮抗剂无需但可任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所述病症的药剂一起配制。这类其它药剂的有效量取决于配方中所存在的FGFR信号传导的拮抗剂和EGFR拮抗剂的量、病症或治疗的类型、以及其它上述讨论的因素。这些药剂通常以相同的剂量使用并具有本文中所描述的施用途径，或以约1-99％的本文所描述的剂量使用，或以任何剂量并通过任何途径使用，所述剂量和途径是凭经验确定的/经临床测定合适的。
为了预防或治疗疾病，本文中描述的FGFR信号传导的拮抗剂和EGFR拮抗剂(当单独或与一种或多种其它别的治疗剂联合使用时)的合适剂量应取决于所要治疗的疾病的类型、疾病的严重性和病程、施用FGFR信号传导的拮抗剂和EGFR拮抗剂是出于预防还是治疗目的、之前的治疗、患者的临床史和对FGFR信号传导的拮抗剂和EGFR拮抗剂的响应、以及主治医师的斟酌决定。FGFR信号传导的拮抗剂和EGFR拮抗剂适合于在一次或一系列的治疗中给予患者。对于在数天或更长时间内的重复施用，根据状况，治疗一般将持续直至发生期望的对疾病症状的抑制。这类剂量可间歇施用，如每周或每三周施用，例如使得患者接受约2-约20剂，或例如约6剂的FGFR信号传导的拮抗剂和EGFR拮抗剂。可施用初始较高的负荷剂量，接着施用一个或多个较低的剂量。例示性的给药方案包括施用。然而，可使用其它给药方案。通过常规技术和测定法易于监测该治疗的进展。
理解可以使用免疫缀合物作为FGFR信号传导的拮抗剂和/或EGFR拮抗剂来实施任何上述配制剂或治疗方法。
III.治疗性组合物
本文中提供包含FGFR信号传导的拮抗剂和EGFR拮抗剂的组合。在某些实施方案中，该组合提高单独施用的该靶向治疗剂的功效。在某些实施方案中，该组合延迟和/或阻止癌症形成对该靶向治疗剂的抗性。在某些实施方案中，该组合在具有癌症的个体中延长该靶向治疗剂敏感性的时段。
本文中提供可用于本文所述组合疗法方法的FGFR信号传导的拮抗剂和EGFR拮抗剂。在一些实施方案中，该FGFR信号传导的拮抗剂和/或EGFR拮抗剂是抗体、结合多肽、结合小分子、和/或多核苷酸。
多种FGFR和FGF的氨基酸序列是本领域已知的且公众可得的。参见例如FGFR1(例如UniProtKB/Swiss-ProtP11362-1、P11362-2、P11362-3、P11362-4、P11362-5、P11362-6、P11362-7、P11362-8、P11362-9、P11362-10、P11362-11、P11362-12、P11362-13、P11362-14、P11362-15、P11362-16、P11362-17、P11362-18、P11362-19、P11362-20、和/或P11362-21)、FGFR2(例如UniProtKB/Swiss-ProtP21802-1(即FGFR2-IIIc)、P21802-2、P21802-3(即FGFR2-IIIb)、P21802-4、P21802-5、P21802-6、P21802-7、P21802-8、P21802-9、P21802-10、P21802-11、P21802-12、P21802-13、P21802-14、P21802-15、P21802-16、P21802-17、P21802-18、P21802-19、P21802-20、P21802-21、P21802-22、和/或P21802-23)、FGFR3(例如UniProtKB/Swiss-ProtP22607-1(即FGFR3-IIIc)、P22607-2(即FGFR3-IIIb)、P22607-3、和/或P22607-4)、FGFR4(例如UniProtKB/Swiss-ProtP22455-1和/或P22455-2)、FGF1(例如UniProtKB/Swiss-ProtP05230-1和/或P05230-2)、FGF2(例如UniProtKB/Swiss-ProtP09038-1、P09038-2、P09038-3、和/或P09038-4)、FGF3(例如UniProtKB/Swiss-ProtP11487)、FGF4(例如UniProtKB/Swiss-ProtP08620)、FGF5(例如UniProtKB/Swiss-ProtP12034-1和/或P12034-2)、FGF6(例如UniProtKB/Swiss-Prot10767)、FGF7(例如UniProtKB/Swiss-ProtP21781)、FGF8(例如UniProtKB/Swiss-ProtP55075-1、P55075-2、P55075-3和/或P55075-4)、FGF9(例如UniProtKB/Swiss-ProtP31371)、FGF10(例如UniProtKB/Swiss-ProtO15520)、FGF11(例如UniProtKB/Swiss-ProtQ92914)、FGF12(例如UniProtKB/Swiss-ProtP61328-1和/或P61328-2)、FGF13(例如UniProtKB/Swiss-ProtQ92913-1、Q92913-2、Q92913-3、Q92913-4,和/或Q92913-5)、FGF14(例如UniProtKB/Swiss-ProtQ92915-1和/或Q92915-2)、FGF16(例如UniProtKB/Swiss-ProtO43320)、FGF17(例如UniProtKB/Swiss-ProtO60258-1和/或O60258-2)、FGF18(例如UniProtKB/Swiss-ProtO76093)、FGF19(例如UniProtKB/Swiss-ProtO95750)、FGF20(例如UniProtKB/Swiss-ProtQ9NP95)、FGF21(例如UniProtKB/Swiss-ProtQ9NSA1)、FGF22(例如UniProtKB/Swiss-ProtQ9HCT0)、和/或FGF23(例如UniProtKB/Swiss-ProtQ9GZV9)。
在任何所述方法的一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是抗体抑制剂、小分子抑制剂、结合多肽抑制剂、和/或多核苷酸拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是结合多肽抑制剂。在一些实施方案中，所述结合多肽抑制剂包含与Fc连接的FGFR胞外域的一个区域。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是小分子。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是抗体。
在任何所述方法的一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是FGFR1信号传导的拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂结合和/或抑制FGFR1-IIIb、FGFR1-IIIc、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、和FGF10中一项或多项。在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂结合和/或抑制FGFR1(例如FGFR1-IIIb和/或FGFR1-IIIc)。在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂结合和/或抑制FGF2。在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂结合和/或抑制FGF5。
在任何所述方法的一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂是结合多肽。在一些实施方案中，所述结合多肽是包含FGFR1多肽胞外域和融合配偶的FGFR1融合蛋白。在一些实施方案中，所述FGFR1是FGFR1-IIIb。在一些实施方案中，所述FGFR1是FGFR1-IIIb。在一些实施方案中，所述胞外域由FGFR1-IIIc的氨基酸22-360或22-592构成。在一些实施方案中，所述FGFR1融合蛋白是US7678890中记载的蛋白质，在此通过提述将其完整收录。
在任何所述方法的一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂是抗体。在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂是抗FGF2抗体。在一些实施方案中，所述融合配偶是Fc多肽。在一些实施方案中，所述抗体是FGF2抗体，例如US20090304707中记载的，在此通过提述将其完整收录，例如由杂交瘤PTA-8864生成的抗体和/或其人源化抗体。在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂是抗FGFR1抗体。在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂是抗FGFR1-IIIb抗体。在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂是抗FGFR1-IIIc抗体。在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂是能够结合超过一种FGFR多肽的抗FGFR1抗体。
在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂是小分子。在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂是N-[2-[[4-(二乙基氨基)丁基]氨基]-6-(3,5-二甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]-N'-(1,1-二甲基乙基)-脲或其药学可接受盐。在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂是BGJ398(Novartis，即3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基}-1-甲基-脲和/或其药学可接受盐；CAS#872511-34-7)。在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂是AZD4547(AstraZeneca；即N-(5-(3,5-二甲氧基苯乙基)-1H-吡唑-3-基)-4-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)苯基酰胺和/或其药学可接受盐)。在一些实施方案中，所述FGFR1信号传导的拮抗剂是FF284(Chugai/Debiopharm(Debio1347))。
在任何所述方法的一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是FGFR2信号传导的拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR2信号传导的拮抗剂结合和/或抑制FGFR2-IIIb、FGFR2-IIIc、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF6、FGF7、FGF9、FGF10、FGF17、FGF18和FGF22中一项或多项。在一些实施方案中，所述FGFR2信号传导的拮抗剂结合和/或抑制FGFR2(例如FGFR2-IIIb和/或FGFR2-IIIc)。在一些实施方案中，所述FGFR2信号传导的拮抗剂结合和/或抑制FGF2。在一些实施方案中，所述FGFR2信号传导的拮抗剂结合和/或抑制FGF9。
在任何所述方法的一些实施方案中，所述FGFR2信号传导的拮抗剂是结合多肽。在一些实施方案中，所述结合多肽是包含FGFR2多肽胞外域和融合配偶的FGFR2融合蛋白。例子包括但不限于WO2008/065543和WO2007/014123中记载的那些，通过提述将其完整收录。在一些实施方案中，所述FGFR2信号传导的拮抗剂是抗FGFR2抗体。在一些实施方案中，所述FGFR2信号传导的拮抗剂是抗FGFR2-IIIb抗体。在一些实施方案中，所述FGFR2信号传导的拮抗剂是抗FGFR2-IIIc抗体。在一些实施方案中，所述FGFR2信号传导的拮抗剂是能够结合超过一种FGFR多肽的抗FGFR2抗体。FGFR2抗体的例子是本领域已知的，而且包括但不限于US8,101,723、US8,101,721、WO2001/79266、WO2007/144893、和WO2010/054265中记载的抗体，通过提述将其完整收录。
在一些实施方案中，所述FGFR2信号传导的拮抗剂是小分子。在一些实施方案中，所述FGFR2信号传导的拮抗剂是BGJ398(Novartis，即3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基}-1-甲基-脲和/或其药学可接受盐；CAS#872511-34-7)。在一些实施方案中，所述FGFR2信号传导的拮抗剂是AZD4547(AstraZeneca；即N-(5-(3,5-二甲氧基苯乙基)-1H-吡唑-3-基)-4-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)苯基酰胺和/或其药学可接受盐)。在一些实施方案中，所述FGFR2信号传导的拮抗剂是FF284(Chugai/Debiopharm(Debio1347))。
在任何所述方法的一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是FGFR3信号传导的拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR3信号传导的拮抗剂结合和/或抑制FGFR3-IIIb、FGFR3-IIIc、FGF1、FGF2、FGF4、FGF8、FGF9、FGF17、FGF18和FGF23中一项或多项。在一些实施方案中，所述FGFR3信号传导的拮抗剂结合和/或抑制FGFR3(例如FGFR3-IIIb和/或FGFR3-IIIc)。在一些实施方案中，所述FGFR3信号传导的拮抗剂结合和/或抑制FGF2。在一些实施方案中，所述FGFR3信号传导的拮抗剂结合和/或抑制FGF9。
在任何所述方法的一些实施方案中，所述FGFR3信号传导的拮抗剂是结合多肽。在一些实施方案中，所述结合多肽是包含FGFR3多肽胞外域和融合配偶的FGFR3融合蛋白。在一些实施方案中，所述FGFR3信号传导的拮抗剂是抗FGFR3抗体。在一些实施方案中，所述FGFR3信号传导的拮抗剂是抗FGFR3-IIIb抗体。在一些实施方案中，所述FGFR3信号传导的拮抗剂是抗FGFR3-IIIc抗体。在一些实施方案中，所述FGFR3信号传导的拮抗剂是能够结合超过一种FGFR多肽的抗FGFR3抗体。FGFR3抗体的例子是本领域已知的，而且包括但不限于US8,101,721、WO2010/111367、WO2001/79266、WO2002/102854、WO2002/10972、WO2007/144893、WO2010/002862、和/或WO2010/048026中记载的抗体，通过提述将其完整收录。
在一些实施方案中，所述FGFR3信号传导的拮抗剂是小分子。在一些实施方案中，所述FGFR3信号传导的拮抗剂是BGJ398(Novartis，即3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基}-1-甲基-脲和/或其药学可接受盐；CAS#872511-34-7)。在一些实施方案中，所述FGFR3信号传导的拮抗剂是AZD4547(AstraZeneca；即N-(5-(3,5-二甲氧基苯乙基)-1H-吡唑-3-基)-4-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)苯基酰胺和/或其药学可接受盐)。在一些实施方案中，所述FGFR3信号传导的拮抗剂是FF284(Chugai/Debiopharm(Debio1347))。在任何所述方法的一些实施方案中，所述FGFR3拮抗剂是Brivanib、Dovitinib(TKI-258)、和/或HM-80871A。
在任何所述方法的一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂是FGFR4信号传导的拮抗剂。在一些实施方案中，所述FGFR4信号传导的拮抗剂结合和/或抑制FGFR4-IIIb、FGFR4-IIIc、FGF1、FGF2、FGF4、FGF6、FGF8、FGF9、FGF16、FGF17、FGF18、和FGF19中一项或多项。在一些实施方案中，所述FGFR4信号传导的拮抗剂结合和/或抑制FGFR4(例如FGFR4-IIIb和/或FGFR4-IIIc)。在一些实施方案中，所述FGFR4信号传导的拮抗剂结合和/或抑制FGF2。在一些实施方案中，所述FGFR4信号传导的拮抗剂结合和/或抑制FGF9。
在任何所述方法的一些实施方案中，所述FGFR4信号传导的拮抗剂是结合多肽。在一些实施方案中，所述结合多肽是包含FGFR4多肽胞外域和融合配偶的FGFR4融合蛋白。在一些实施方案中，所述FGFR4信号传导的拮抗剂是抗FGFR4抗体。在一些实施方案中，所述FGFR4信号传导的拮抗剂是能够结合超过一种FGFR多肽的抗FGFR4抗体。FGFR4抗体的例子是本领域已知的，而且包括但不限于WO2008/052796和WO2005/037235中记载的抗体，通过提述将其完整收录。
在一些实施方案中，所述FGFR4信号传导的拮抗剂是小分子。在一些实施方案中，FGFR4信号传导的弱拮抗剂是BGJ398(Novartis，即3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基}-1-甲基-脲和/或其药学可接受盐；CAS#872511-34-7)。在一些实施方案中，FGFR4的弱拮抗剂是AZD4547(AstraZeneca；即N-(5-(3,5-二甲氧基苯乙基)-1H-吡唑-3-基)-4-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)苯基酰胺和/或其药学可接受盐)。在一些实施方案中，FGFR4的弱拮抗剂是FF284(Chugai/Debiopharm(Debio1347))。
例示性FGFR拮抗剂是本领域已知的，而且包括但不限于US5288855、US6344546、WO94/21813、US20070274981、WO2005/066211、WO2011/068893、US5229501、US6656728、US7678890、WO95/021258、US6921763、US6713474、US6610688、US6297238、US20130053376、US20130039855、US2013004492、US20120316137、US20120251538、US20120195851、US20110129524、US20110053932、US20050227921、EP1761505、WO2012/125124、WO2012/123585、WO2011/099576、WO2011/035922、WO2009148928、WO2008/149521、WO2005/079390、WO2003/080064、WO2008/075068(特别是实施例80)、WO2005/080330，通过提述将其完整收录。
在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂可以是FGFR/FGF的特异性抑制剂，例如FGFR1的特异性抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂可以是双重抑制剂或泛抑制剂，其中所述FGFR信号传导的拮抗剂抑制FGFR/FGF和一种或多种其它靶多肽和/或一种或多种FGFR/FGF。
本文中还提供可用于本文所述方法的EGFR拮抗剂。EGFR意指受体酪氨酸激酶多肽表皮生长因子受体(记载于Ullrichetal.,Nature(1984)309:418-425，或者称作Her-1和c-erbB基因产物)及其变体，诸如EGFRvIII。EGFR的变体还包括删除、替代和插入变体，例如Lynchetal.(NEJM2004,350:2129),Paezetal.(Science2004,304:1497),Paoetal.(PNAS2004,101:13306)中记载的那些。在一些实施方案中，EGFR是野生型EGFR，其一般指包含天然发生EGFR蛋白质的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，该EGFR拮抗剂是抗体、结合多肽、结合小分子、和/或多核苷酸。
例示性EGFR拮抗剂(抗EGFR抗体)包括抗体，诸如称作nimotuzumab(YMBiosciences)的人源化单克隆抗体、完全人ABX-EGF(panitumumab，AbgenixInc.)以及称作E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3和E7.6.3且记载于US6,235,883的完全人抗体；MDX-447(MedarexInc)。Pertuzumab(2C4)是一种直接结合HER2但干扰HER2-EGFR二聚化由此抑制EGFR信号传导的人源化抗体。结合EGFR的抗体的其它例子包括GA201(RG7160；RocheGlycartAG)、MAb579(ATCCCRLHB8506)、MAb455(ATCCCRLHB8507)、MAb225(ATCCCRL8508)、MAb528(ATCCCRL8509)(参见美国专利No.4,943,533，Mendelsohn等人)及其变体，诸如嵌合化225(C225或Cetuximab；)和重定型式人225(H225)(参见WO96/40210，ImcloneSystemsInc.)；IMC-11F8，一种完全人的EGFR靶向性抗体(Imclone)；结合II类突变型EGFR的抗体(美国专利No.5,212,290)；结合EGFR、记载于美国专利No.5,891,996的人源化和嵌合抗体；和结合EGFR的人抗体，诸如ABX-EGF(参见WO98/50433，Abgenix)；EMD55900(Stragliotto等人，Eur.J.Cancer32A：636-640(1996))；EMD7200(matuzumab)，一种针对EGFR、与EGF和TGF-α二者竞争EGFR结合的人源化EGFR抗体；和mAb806或人源化mAb806(Johns等人，J.Biol.Chem.279(29)：30375-30384(2004))。抗EGFR抗体可以缀合有细胞毒剂，如此生成免疫缀合物(参见例如EP659,439A2，MerckPatentGmbH)。在一些实施方案中，该抗EGFR抗体是cetuximab。在一些实施方案中，该抗EGFR抗体是panitumumab。在一些实施方案中，该抗EGFR抗体是zalutumumab、nimotuzumab、和/或matuzumab。
可用于该方法的抗EGFR抗体包括以足够亲和力和特异性结合EGFR且能降低或抑制EGFR活性的任何抗体。选择的抗体通常会具有足够强的对EGFR的结合亲和力，例如抗体可以以介于100nM-1pM之间的Kd值结合人c-met。可以通过例如基于表面等离振子共振的测定法(诸如PCT申请公开号WO2005/012359中记载的BIAcore测定法)；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；和竞争测定法(例如RIA)测定抗体亲和力。优选地，本发明的抗EGFR抗体可作为治疗剂用于靶向和干扰牵涉EGFR/EGFR配体活性的疾病或状况。还有，该抗体可以进行其它生物学活性测定法，例如为了评估其作为治疗剂的有效性。此类测定法是本领域已知的且取决于靶抗原和抗体的预定用途。在一些实施方案中，可以将EGFR臂与结合白细胞上触发性分子诸如T-细胞受体分子(例如CD2或CD3)，或IgG的Fc受体(FcγR)，诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂组合，从而将细胞防御机制聚焦于表达EGFR的细胞。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位至表达EGFR的细胞。这些抗体拥有EGFR结合臂和结合细胞毒剂(例如皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可以作为全长抗体或抗体片段(例如F(ab')2双特异性抗体)制备双特异性抗体。
例示性EGFR拮抗剂还包括小分子，诸如US5616582、US5457105、US5475001、US5654307、US5679683、US6084095、US6265410、US6455534、US6521620、US6596726、US6713484、US5770599、US6140332、US5866572、US6399602、US6344459、US6602863、US6391874、WO9814451、WO9850038、WO9909016、WO9924037、WO9935146、WO0132651、US6344455、US5760041、US6002008、和/或US5747498中记载的化合物。具体的小分子EGFR拮抗剂包括OSI-774(CP-358774，厄洛替尼，OSIPharmaceuticals)；PD183805(CI1033，2-丙烯酰胺，N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-，二盐酸盐，PfizerInc.)；(ZD1839，吉非替尼，AstraZeneca)；ZM105180(6-氨基-4-(3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉，Zeneca)；BIBX-1382(N8-(3-氯-4-氟-苯基)-N2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5,4-d]嘧啶-2,8-二胺，BoehringerIngelheim)；PKI-166((R)-4-[4-[(1-苯基乙基)氨基]-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-酚)；(R)-6-(4-羟基苯基)-4-[(1-苯基乙基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶；CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉基]-2-丁炔酰胺)；EKB-569(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺)；拉帕替尼(Tykerb，GlaxoSmithKline)；ZD6474(Zactima，AstraZeneca)；CUDC-101(Curis)；canertinib(CI-1033)；AEE788(6-[4-[(4-乙基-1-哌嗪基)甲基]苯基]-N-[(1R)-1-苯基乙基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺，WO2003013541，Novartis)和PKI166(4-[4-[[(1R)-1-苯基乙基]氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-酚，WO9702266，Novartis)。在一些实施方案中，该EGFR拮抗剂是N-(3-乙炔基苯基)-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺和/或其制药学可接受盐(例如N-(3-乙炔基苯基)-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺-HCl)。在一些实施方案中，该EGFR拮抗剂是吉非替尼和/或其制药学可接受盐。在一些实施方案中，该EGFR拮抗剂是拉帕替尼和/或其制药学可接受盐。在一些实施方案中，该EGFR拮抗剂是吉非替尼和/或厄洛替尼。
在一些实施方案中，该EGFR拮抗剂可以是EGFR的特异性抑制剂。在一些实施方案中，该抑制剂可以是双重抑制剂或泛抑制剂，其中该EGFR拮抗剂抑制EGFR和一种或多种其它靶多肽。
A.抗体
本文中提供结合感兴趣多肽(诸如FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、和/或FGFR4)、FGF(例如FGF1-23)、和/或EGFR)的分离的抗体，供本文所述方法使用。在任何上述实施方案中，抗体是人源化的。另外，依照任何上述实施方案的抗体为单克隆抗体，包括嵌合、人源化或人抗体。在一个实施方案中，抗体为抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双抗体、或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，抗体为全长抗体，例如“完整IgG1”抗体或本文中定义的其它抗体类或同种型。
在又一个实施方案中，依照上述任何实施方案的抗体可以单独或组合掺入任何特征，如下述部分中描述的：
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文中提供的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在一个实施方案中，Kd是通过放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的。在一个实施方案中，用Fab型式的感兴趣抗体及其抗原实施RIA。例如，通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况中用最小浓度的(125I)标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(见例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。为了建立测定法的条件，将多孔板(ThermoScientific)用50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(CappelLabs)包被过夜，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清清蛋白于室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与连续稀释的感兴趣Fab(例如与Presta等人，CancerRes.57：4593-4599(1997)中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致)混合。然后将感兴趣的Fab温育过夜；然而，温育可持续更长时间(例如约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板，于室温温育(例如1小时)。然后除去溶液，并用PBS中的0.1％聚山梨酯20洗板8次。平板干燥后，加入150μl/孔闪烁液(MICROSCINT-20TM；Packard)，然后在TOPCOUNTTM伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20％的浓度用于竞争性结合测定法。
依照另一个实施方案，Kd是使用表面等离振子共振测定法测量的。例如，使用或(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)于25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)实施测定法。在一个实施方案中，依照供应商的用法说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠pH4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射以获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，于25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％聚山梨酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(EvaluationSoftwareversion3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。见例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过106M-1S-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(AvivInstruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的情况中，测量PBSpH7.2中20nM抗抗原抗体(Fab形式)于25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、和scFv片段，及下文所描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述，见Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)。关于scFv片段的综述，见例如Pluckthün,于ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,(Springer-Verlag,NewYork),第269-315页(1994)；还可见WO93/16185；及美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基，并且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，见美国专利No.5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。见例如EP404,097；WO1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)。
单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；见例如美国专利No.6,248,516)。
可以通过多种技术，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成来生成抗体片段，如本文中所描述的。
3.嵌合的和人源化的抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体记载于例如美国专利No.4,816,567；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984))。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，自小鼠、大鼠、仓鼠、家兔、或非人灵长类，诸如猴衍生的可变区)和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换的”抗体，其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如CDR(或其部分)自非人抗体衍生，而FR(或其部分)自人抗体序列衍生。任选地，人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的相应残基替代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008)，并且进一步记载于例如Riechmann等人，Nature332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA86：10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，Methods36：25-34(2005)(描述了特异性决定区(SDR)嫁接)；Padlan,Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述了“重修表面”)；Dall’Acqua等人，Methods36：43-60(2005)(描述了“FR改组”)；及Osbourn等人，Methods36：61-68(2005)和Klimka等人，Br.J.Cancer,83：252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”方法)。
可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区(见例如Sims等人，J.Immunol.151：2296(1993))；自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区(见例如Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；及Presta等人，J.Immunol.,151：2623(1993))；人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；和通过筛选FR文库衍生的框架区(见例如Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)及Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地，人抗体记载于vanDijk和vandeWinkel,Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)。
可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述，见Lonberg,Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。还可见例如美国专利No.6,075,181和6,150,584，其描述了XENOMOUSETM技术；美国专利No.5,770,429，其描述了技术；美国专利No.7,041,870，其描述了K-M技术，和美国专利申请公开文本No.US2007/0061900，其描述了技术)。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。
也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系(见例如KozborJ.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等人，MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,第51-63页(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987)；及Boerner等人，J.Immunol.,147：86(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103：3557-3562(2006)。其它方法包括那些例如记载于美国专利No.7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)和Ni,XiandaiMianyixue,26(4)：265-268(2006)(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma技术)也记载于Vollmers和Brandlein,Hist.&Histopath.,20(3)：927-937(2005)及Vollmers和Brandlein,MethodsFind.Exp.Clin.Pharmacol.,27(3)：185-91(2005)。
也可以通过分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变域序列生成人抗体。然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。
5.文库衍生的抗体
可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库并对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom等人，MethodsMol.Biol.178：1-37(O’Brien等人编,HumanPress,Totowa,NJ,2001)，并且进一步记载于例如McCafferty等人，Nature348：552-554；Clackson等人，Nature352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks和Bradbury,MethodsMol.Biol.248：161-175(Lo编,HumanPress,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methods284(1-2)：119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体，如记载于Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12：433-455(1994)的。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如自人)克隆天然全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由Griffiths等人，EMBOJ,12：725-734(1993)描述的。最后，也可以通过自干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227：381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如：美国专利No.5,750,373、和美国专利公开文本No.2005/0079574,2005/0119455,2005/0266000,2007/0117126,2007/0160598,2007/0237764,2007/0292936和2009/0002360。
认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对感兴趣多肽(诸如FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、和/或FGFR4)、FGF(例如FGF1-23)、和/或EGFR)，而另一种针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合感兴趣多肽(诸如FGFR/FGF和/或EGFR)的两个不同表位。也可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂定位于表达感兴趣多肽(诸如FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、和/或FGFR4)、FGF(例如FGF1-23)、和/或EGFR)的细胞。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。
用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(见Milstein和Cuello,Nature305：537(1983))、WO93/08829、和Traunecker等人，EMBOJ.10：3655(1991))、和“隆起-入-空穴”工程化(见例如美国专利No.5,731,168)。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(见例如美国专利No.4,676,980,及Brennan等人，Science,229：81(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(见例如Kostelny等人，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(见例如Gruber等人，J.Immunol.,152：5368(1994))；及如例如Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)中所描述的，制备三特异性抗体来生成多特异性抗体。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”(见例如US2006/0025576A1)。
本文中的抗体或片段还包括包含结合感兴趣多肽(诸如FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、和/或FGFR4)、FGF(例如FGF1-23)、和/或EGFR)及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF”(见例如US2008/0069820)。
7.抗体变体
a)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体的糖基化位点的添加或删除。
在抗体包含Fc区的情况中，可以改变其附着的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的、双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2域的Asn297。见例如Wright等人，TIBTECH15：26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖、和唾液酸，以及附着于双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明的抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供了抗体变体，其具有缺乏附着(直接或间接)于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中的岩藻糖量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过相对于附着于Asn297的所有糖结构(例如，复合的、杂合的和高甘露糖的结构)的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过MALDI-TOF质谱术测量的，例如如记载于WO2008/077546的。Asn297指位于Fc区中的约第297位(Fc区残基的Eu编号方式)的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。见例如美国专利公开文本No.US2003/0157108(Presta,L.)；US2004/0093621(KyowaHakkoKogyoCo.,Ltd)。涉及“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的出版物的例子包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能够生成脱岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美国专利申请NoUS2003/0157108A1,Presta,L；及WO2004/056312A1,Adams等人，尤其在实施例11)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(见例如Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.,94(4)：680-688(2006)；及WO2003/085107)。
进一步提供了具有两分型寡糖的抗体变体，例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利No.6,602,684(Umana等人)；及US2005/0123546(Umana等人)。还提供了在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO1997/30087(Patel等人)；WO1998/58964(Raju,S.)；及WO1999/22764(Raju,S.)。
b)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中，本发明涵盖拥有一些但不是所有效应器功能的抗体变体，所述效应器功能使其成为如下应用的期望候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应器功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)的第464页上的表3中汇总了造血细胞上的FcR表达。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子记载于美国专利No.5,500,362(见例如Hellstrom,I.等人，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA83：7059-7063(1986))和Hellstrom,I.等人，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA82：1499-1502(1985)；5,821,337(见Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))。或者，可以采用非放射性测定方法(见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.MountainView,CA；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如披露于Clynes等人，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA95：652-656(1998)的。也可以实施C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。见例如WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以实施CDC测定法(见例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods202：163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood101：1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood103：2738-2743(2004))。也可以使用本领域中已知的方法来实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定(见例如Petkova,S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
具有降低的效应器功能的抗体包括那些具有Fc区残基238,265,269,270,297,327和329中的一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两处或更多处具有替代的Fc突变体，包括残基265和297替代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。
描述了具有改善的或降低的对FcR的结合的某些抗体变体(见例如美国专利No.6,737,056；WO2004/056312，及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一处或多处氨基酸替代，例如Fc区的位置298、333、和/或334(残基的EU编号方式)的替代的Fc区。在一些实施方案中，对Fc区做出改变，其导致改变的(即，改善的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如记载于美国专利No.6,194,551；WO99/51642；及Idusogie等人，J.Immunol.164：4178-4184(2000)的。
具有延长的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体记载于US2005/0014934A1(Hinton等人)，新生儿Fc受体(FcRn)负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))。那些抗体包含其中具有改善Fc区对FcRn结合的一处或多处替代的Fc区。此类Fc变体包括那些在Fc区残基238,256,265,272,286,303,305,307,311,312,317,340,356,360,362,376,378,380,382,413,424或434中的一处或多处具有替代，例如，Fc区残基434的替代的(美国专利No.7,371,826)。还可见Duncan和Winter,Nature322：738-40(1988)；美国专利No.5,648,260；美国专利No.5,624,821；及WO94/29351，其关注Fc区变体的其它例子。
c)经半胱氨酸工程化改造的抗体变体
在某些实施方案中，可以期望创建经半胱氨酸工程化改造的抗体，例如，“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在具体的实施方案中，替代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其它模块，诸如药物模块或接头-药物模块缀合，以创建免疫缀合物，如本文中进一步描述的。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸替代下列残基之任一个或多个：轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。可以如例如美国专利No.7,521,541所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。
B.免疫缀合物
本文中还提供包含结合感兴趣多肽(诸如FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、和/或FGFR4)、FGF(例如FGF1-23)、或EGFR)的抗体的免疫缀合物，该抗体与一种或多种细胞毒剂诸如化疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素、细菌、真菌、植物、或动物起源的酶活性毒素、或其片段)、或放射性同位素缀合，供本文所述方法使用。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，包括但不限于美登木生物碱(maytansinoid)(参见美国专利No.5,208,020、No.5,416,064和欧洲专利EP0425235B1)；auristatin诸如单甲基auristatin药物模块DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利No.5,635,483和No.5,780,588，及No.7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见美国专利No.5,712,374、No.5,714,586、No.5,739,116、No.5,767,285、No.5,770,701、No.5,770,710、No.5,773,001、和No.5,877,296；Hinman等人，CancerRes.53：3336-3342(1993)；及Lode等人，CancerRes.58：2925-2928(1998))；蒽环类抗生素诸如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(参见Kratz等人，CurrentMed.Chem.13：477-523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic&Med.Chem.Letters16：358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj.Chem.16：717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg.&Med.Chem.Letters12：1529-1532(2002)；King等人，J.Med.Chem.45：4336-4343(2002)；及美国专利No.6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛(vindesine)；紫杉烷诸如多西他赛(docetaxel)、帕利他赛(paclitaxel)、larotaxel、tesetaxel、和ortataxel；单端孢菌素(trichothecene)；和CC1065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含本文所述抗体，该抗体与酶活性毒素或其片段缀合，包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleuritesfordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(tricothecenes)。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含本文所述抗体，该抗体与放射性原子缀合以形成放射缀合物。多种放射性同位素可用于生成放射缀合物。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。在将放射缀合物用于检测时，它可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如Tc99m或I123，或自旋标记物用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的缀合物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta等人，Science238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari等人，CancerRes.52：127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。
本文中的免疫缀合物或ADC明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的此类缀合物，包括但不限于：商品化(如购自PierceBiotechnologyInc.,Rockford,IL,U.S.A)的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC、和sulfo-SMPB、和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。
C.结合多肽
还提供结合多肽，供本文所述方法使用，结合多肽是如下的多肽，其结合，优选特异性结合FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、和/或FGFR4)、FGF(例如FGF1-23)、和/或EGFR。在一些实施方案中，结合多肽为FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)拮抗剂和/或EGFR拮抗剂。结合多肽可以使用已知的多肽合成方法学化学合成，或者可使用重组技术制备和纯化。结合多肽的长度通常是至少约5个氨基酸，或者长度为至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸或更长，其中此类结合多肽能够结合，优选特异性结合靶物(例如FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、和/或FGFR4)、FGF(例如FGF1-23)、或EGFR)，如本文中描述的。结合多肽无需过多试验就可使用公知技术来鉴定。在这点上，注意到用于对多肽文库筛选能够特异性结合多肽靶物的结合多肽的技术是本领域公知的(参见例如美国专利5,556,762,5,750,373,4,708,871,4,833,092,5,223,409,5,403,484,5,571,689,5,663,143；PCT公开号WO84/03506和WO84/03564；Geysen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：3998-4002(1984)；Geysen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：178-182(1985)；Geysen等人，inSyntheticPeptidesasAntigens,130-149(1986)；Geysen等人，J.Immunol.Meth.102：259-274(1987)；Schoofs等人，J.Immunol.140：611-616(1988)；Cwirla,S.E.等人，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：6378；Lowman,H.B.等人，(1991)Biochemistry30：10832；Clackson,T.等人，(1991)Nature352：624；Marks,J.D.等人，(1991),J.Mol.Biol.222：581；Kang,A.S.等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：8363；Smith,G.P.,(1991)CurrentOpin.Biotechnol.2：668)。
产生肽文库和筛选这些文库的方法还公开于美国专利5,723,286,5,432,018,5,580,717,5,427,908,5,498,530,5,770,434,5,734,018,5,698,426,5,763,192,和5,723,323。
D.结合小分子
本文中提供了作为FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、和/或FGFR4)、FGF(例如FGF1-23)、和/或EGFR的小分子拮抗剂使用的结合小分子，供上文所述方法使用。
优选地，结合小分子指本文所定义的结合多肽或抗体以外，结合、优选特异性结合FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、和/或FGFR4)、FGF(例如FGF1-23)、和/或EGFR的有机分子，如本文中描述的。结合有机小分子可以使用已知方法学来鉴定和化学合成(参见例如PCT公开号WO00/00823和WO00/39585)。结合有机小分子的大小通常小于约2000道尔顿，或者其大小小于约1500、750、500、250或200道尔顿，其中此类能够结合、优选特异性结合本文所述多肽的有机小分子无需过多实验就可使用公知技术来鉴定。在这点上，注意到用于对有机小分子文库筛选能够结合感兴趣多肽的分子的技术是本领域公知的(参见例如PCT公开号WO00/00823和WO00/39585)。结合有机小分子可以是例如醛、酮、肟、腙、缩氨基脲(semicarbazone)、卡巴肼(carbazide)、伯胺、仲胺、叔胺、N-取代的肼、酰肼、醇、醚、硫醇、硫醚、二硫化物、羧酸、酯、酰胺、脲、氨基甲酸酯(carbamate)、碳酸酯(carbonate)、缩酮、硫缩酮(thioketal)、缩醛、硫缩醛、芳基卤、芳基磺酸酯(arylsulfonate)、烃基卤、烃基磺酸酯(alkylsulfonate)、芳香族化合物、杂环化合物、苯胺、烯烃、炔烃、二醇、氨基醇、口恶唑烷、口恶唑啉、噻唑烷、噻唑啉、烯胺、磺酰胺(sulfonamide)、环氧化物、吖丙啶(aziridine)、异氰酸酯(isocyanate)、磺酰氯、重氮化合物、酰基氯(acidchloride)等。
E.拮抗剂多核苷酸
本文中提供了多核苷酸拮抗剂，供本文所述方法使用。多核苷酸可以是反义核酸和/或核酶。反义核酸包含至少与感兴趣基因(诸如FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、和/或FGFR4)、FGF(例如FGF1-23)、和/或EGFR基因)的RNA转录物的一部分互补的序列。然而，尽管优选绝对互补性，但是其不是必要的。
本文中提及的“至少与RNA的一部分互补的”序列意指具有足够的互补性以能够与RNA杂交，形成稳定的双链体的序列；在双链反义核酸的情况中，如此可以测试双链体DNA的单链，或者可以测定三链体形成。杂交能力会取决于互补性程度和反义核酸的长度两者。一般地，杂交的核酸越大，与RNA的碱基错配越多，它可以含有且仍形成稳定的双链体(或三链体，情况也可以如此)。本领域技术人员可以通过使用标准规程测定杂交复合物的熔点来确认可容许的错配程度。
与信息5’端(例如5’非翻译序列直至AUG起始密码子且包括AUG起始密码子)互补的多核苷酸在抑制翻译方面应当最有效起作用。然而，已经显示了与mRNA的3’非翻译序列互补的序列也有效抑制mRNA的翻译。一般见Wagner,R.,1994,Nature372：333-335。如此，与基因的5’-或3’-非翻译、非编码区互补的寡核苷酸可以在反义方法中使用以抑制内源mRNA的翻译。与mRNA的5’非翻译区互补的多核苷酸应当包括AUG起始密码子的互补物。与mRNA编码区互补的反义多核苷酸是不太有效的翻译抑制剂，但是可以依照本发明使用。不论设计为与mRNA的5’、3’或编码区杂交，反义核酸的长度应当是至少6个核苷酸，并且优选是长度范围为6至约50个核苷酸的寡核苷酸。在具体的方面，寡核苷酸是至少10个核苷酸、至少17个核苷酸、至少25个核苷酸或至少50个核苷酸。
F.抗体和结合多肽变体
在某些实施方案中，涵盖本文中提供的抗体和/或结合多肽的氨基酸序列变体。例如，可以期望改善抗体和/或结合多肽的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将合适的修饰引入编码抗体和/或结合多肽的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体和/或结合多肽的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体和/或结合多肽的氨基酸序列内的残基的删除、和/或插入和/或替代。可以进行删除、插入、和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如，抗原结合。
在某些实施方案中，提供了具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体和/或结合多肽变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。保守替代在表1中在“优选的替代”的标题下显示。更实质的变化在表1中在“例示性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体和/或结合多肽中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC。
表1
依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸,Met,Ala,Val,Leu,Ile；
(2)中性、亲水性的：Cys,Ser,Thr,Asn,Gln；
(3)酸性的：Asp,Glu；
(4)碱性的：His,Lys,Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly,Pro；
(6)芳香族的：Trp,Tyr,Phe。
非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。
G.抗体和结合多肽衍生物
在某些实施方案中，可进一步修饰本文中提供的抗体和/或结合多肽以包含本领域中已知的且容易获得的别的非蛋白质性质模块。适合于抗体和/或结合多肽衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷(dextran)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三氧杂环戊烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(或是同聚物或是随机共聚物)，右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇(propropyleneglycol)同聚物、聚环氧丙烷(prolypropyleneoxide)/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇，及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而有利于制备。聚合物可以是任何分子量的，且可以是分支的或不分支的。附着于抗体和/或结合多肽的聚合物数目是变化的，且若附着超过一个聚合物，则它们可以是相同的或不同的分子。通常，可基于以下考虑确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，所述考虑包括但不限于，待改进之抗体和/或结合多肽的具体特性或功能，抗体衍生物和/或结合多肽衍生物是否会在限定条件下用于治疗，等等。
在另一个实施方案中，提供了抗体和/或结合多肽与可通过暴露于辐射而选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA102：11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，且包括但不限于不会伤害普通细胞但将非蛋白质性质模块加热至邻近抗体和/或结合多肽-非蛋白质性质模块的细胞被杀死的温度的波长。
IV.筛选和/或鉴定具有期望功能的FGFR信号传导拮抗剂的方法
上文已经描述了感兴趣多肽(诸如FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、和/或FGFR4)、FGF(例如FGF1-23)、和/或EGFR)的别的拮抗剂(包括抗体，结合多肽，和/或小分子)，供本文所述方法使用。别的拮抗剂(诸如本文中提供的抗体，结合多肽，和/或结合小分子)可以通过本领域中已知的各种测定法对其鉴定、筛选、或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。
在某些实施方案中，所包含的存储器包含FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)多肽的原子坐标的计算机系统可作为模型用于理性鉴定结合FGFG信号传导的配体结合位点的化合物。例如，可以从头或通过改良已知化合物来设计此类化合物。在其它情况中，可以通过测试已知化合物以确定它是否“停靠”FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)的分子模型来鉴定结合化合物。此类停靠方法是是本领域普遍公知的。
FGFR信号传导晶体结构数据可以与计算机建模技术联合使用，从而通过分析晶体结构数据来开发各种FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)-结合化合物的结合的模型。位点模型表征位点表面的三维拓扑学，以及包括范德华接触、静电相互作用、和成氢键机会等因素。然后使用计算机模拟技术来定位设计成与模型位点相互作用的官能团(包括但不限于质子、羟基基团、胺基团、二价阳离子、芳香族和脂肪族官能团、酰胺基团、醇基团、等)的相互作用位置。可以将这些基团设计入药效团或候选化合物，预期该候选化合物会特异性结合该位点。如此，药效团设计牵涉考虑落入药效团内的候选化合物经由任何或所有可用类型的化学相互作用(包括成氢键、范德华、静电、和共价相互作用)与位点相互作用的能力，尽管一般而言药效团经由非共价机制与位点相互作用。
在实际分析以外，可以使用计算机建模技术分析药效团或候选化合物结合FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)多肽的能力。可以只合成那些通过计算机建模指示以足够结合能(在一个例子中，结合能对应于10-2M数量级或更紧密的对靶物的解离常数)结合靶物(例如FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)多肽结合位点)的候选，并使用本领域技术人员知道的和/或本文所述的酶测定法测试它们它们结合FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)多肽和抑制FGFR信号传导(如果适用的话)、酶功能的能力。如此，计算评估步骤避免不太可能以适当亲和力结合FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)多肽的化合物的不必要合成。
可以凭借一系列步骤计算评估和设计FGFR信号传导药效团或候选化合物，其中对化学实体或片段筛选和选择它们与FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)多肽上的各个结合靶位点联合的能力。本领域技术人员可使用数种方法之一来对化学实体或片段筛选它们与FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)多肽(更特别的是，FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)多肽上的靶位点)联合的能力。该过程可以以基于FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)多肽坐标或本领域已知的那些坐标的一个子集，在计算机屏幕上目视检测例如靶位点开始。
为了选择诱导癌细胞死亡的拮抗剂，可以相对于参照评估膜完整性的丧失，其通过例如碘化丙啶(PI)、锥虫蓝或7AAD摄取来指示。可以在补体和免疫效应细胞缺失下实施PI摄取测定法。将肿瘤细胞与单独的培养基或含有适宜组合疗法的培养基一起温育。将细胞温育3天时间段。每次处理后，清洗细胞并等分入35mm带过滤器盖的12x75管(每管1ml，每个处理组3管)以去除细胞块。然后管接受PI(10μg/ml)。可以使用流式细胞仪和CellQuest软件(BectonDickinson)分析样品。可以选择那些与单独的培养基和/或单药疗法相比诱导统计学显著水平的细胞死亡(如通过PI摄取测定)的拮抗剂作为细胞死亡诱导性抗体、结合多肽或结合小分子。
在任何筛选和/或鉴定方法的一些实施方案中，所述候选FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)拮抗剂是抗体，结合多肽，结合小分子，或多核苷酸。在一些实施方案中，所述FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)拮抗剂是抗体。在一些实施方案中，所述FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)拮抗剂是小分子。
V.药物配制剂
通过将具有期望纯度的此类抗体与一种或多种任选的药学可接受载体(Remington’sPharmaceuticalSciences,第16版,Osol,A.编(1980))混合以冻干配制剂或水性溶液形式制备如本文中所描述的FGFR信号传导的拮抗剂和EGFR的拮抗剂的药物配制剂。在一些实施方案中，FGFR信号传导的拮抗剂和/或EGFR拮抗剂是结合小分子、抗体、结合多肽、和/或多核苷酸。一般地，药学可接受载体在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括但不限于缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性的药学可接受载体进一步包含间质药物分散剂诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(BaxterInternational,Inc.)。某些例示性的sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20记载于美国专利公开文本No.2005/0260186和2006/0104968。在一个方面，将sHASEGP与一种或多种别的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。
例示性的冻干配制剂记载于美国专利No.6,267,958。水性抗体配制剂包括那些记载于美国专利No.6,171,586和WO2006/044908的，后一种配制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性组分，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的组分。此类活性组分适于以有效用于所需目的的量而组合存在。
活性成分可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)，或在粗滴乳状液中。此类技术披露于Remington’sPharmaceuticalSciences,第16版,Osol,A.编(1980)。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的例子包括含有FGFR信号传导的拮抗剂和EGFR拮抗剂的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形商品形式，例如膜，或微胶囊。
用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可容易地实现，例如通过穿过无菌滤膜过滤。
VI.制品
在本发明的另一个方面，提供了含有上文所述可用于治疗、预防和/或诊断病症的材料的制品。所述制品包括容器和所述容器上或与所述容器相连的标签或包装插页。合适的容器包括例如药瓶、药管、注射器、IV溶液袋、等。所述容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。所述容器装有独自或与另一组合物组合有效治疗、预防和/或诊断所述疾患的组合物，而且可以具有无菌存取口(例如所述容器可以是静脉内溶液袋或带有皮下注射针可刺穿的塞子的管形瓶)。所述组合物中的至少一种活性药剂是本文所述FGFR信号传导的拮抗剂和EGFR拮抗剂。所述标签或包装插页指明该组合物用于治疗选择的疾患。此外，制品可包括(a)其中装有组合物的第一容器，其中所述组合物包括FGFR信号传导的拮抗剂和EGFR拮抗剂；和(b)其中装有组合物的第二容器，其中所述组合物包括别的细胞毒剂或其它治疗剂。
在一些实施方案中，所述制品包含容器、所述容器上的标签和所述容器内含有的组合物；其中所述组合物包含一种或多种试剂(例如结合一种或多种生物标志物的一抗，或针对本文所述一种或多种生物标志物的探针和/或引物)，指示该组合物可用于评估样品中一种或多种生物标志物的存在的容器上的标签，和用于使用所述试剂来评估样品中一种或多种生物标志物的存在的说明书。所述制品可进一步包括一套用于制备样品和利用试剂的说明书和材料。在一些实施方案中，所述制品可以包含试剂如一抗和二抗两者，其中二抗缀合于一种标记物，例如酶标记物。在一些实施方案中，所述制品包含针对本文所述一种或多种生物标志物的一种或多种探针和/或引物。
在任何制品的一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂和/或EGFR拮抗剂是抗体、结合多肽、结合小分子、或多核苷酸。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂和/或EGFR拮抗剂是小分子。在一些实施方案中，所述FGFR信号传导的拮抗剂和/或EGFR拮抗剂是抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人的、人源化的或嵌合的抗体。在一些实施方案中，所述抗体是抗体片段且该抗体片段结合FGFR信号传导和/或抑制剂。
本发明的此实施方案中的制品还可包括指示所述组合物可用于治疗特定疾患的包装插页。或者/另外，所述制品可进一步包括第二(或第三)容器，其中装有药学可接受的缓冲液，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格(Ringer)氏溶液和右旋糖溶液。它可进一步包括从商业和用户立场出发需要的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头、和注射器。
制品中的其它任选成分包括一种或多种缓冲液(例如封闭缓冲液、清洗缓冲液、底物缓冲液等)、其它试剂诸如被酶标记物化学改变的底物(例如色原)、表位修复液、对照样品(阳性和/或阴性对照)、对照载玻片等。
要理解，任何上述制品可包括本文所述免疫缀合物代替或补充FGFR信号传导的拮抗剂和EGFR拮抗剂。
实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，鉴于上文提供的一般描述，可以实施各种其它实施方案。
实施例1
鉴定了获得性厄洛替尼抗性的两种模型，它们与EMT表型和抗性对自分泌FGF-FGFR信号传导的依赖性有关。厄洛替尼抗性细胞群中FGFR途径激活的证据包括FGF2、FGFR1和磷酸-FRS2的升高。使用小分子激酶抑制剂抑制FGFR信号传导或用FGFR1-Fc中和FGFR1配体使抗性细胞对厄洛替尼再敏化。再敏化是通过抑制下游信号传导实现的。相反，抑制AXL(最近在一些临床前模型中鉴定为厄洛替尼抗性的EMT相关驱动物的一种激酶)未能使厄洛替尼抗性细胞再敏化。这些发现与自分泌FGFR途径激活一致，即在外源配体来源缺失下FGF配体中和能使细胞对厄洛替尼再敏化。最后，在敏感性亲本细胞中FGFR途径抑制阻抑形成对厄洛替尼的抗性。这些数据指示FGFR激活充当与EMT有关的病例中获得性厄洛替尼抗性的一种机制，而且组合抑制EGFR和FGFR信号传导在治疗此类病例中可能是有益的。
材料和方法
细胞培养
于37℃在5％CO2下在补充有5％胎牛血清(FBS)和L-谷氨酰胺的RPMI培养基(高葡萄糖)中维持所有细胞。
细胞存活力测定法
在384孔板的每个孔中分配103个细胞。分配后24小时，对每个孔添加所示浓度的药物。给药后72小时，对每个孔添加CellTiter-Glo试剂(CellTiterGlo发光细胞存活力测定法，Promega)，将板于室温温育10分钟，通过EnVision2101多标记物读数仪(PerkinElmer)记录发光。
膜联蛋白V测定法
在10cm2板中分配5x104个细胞。分配后24小时，除去培养基，并用含有所示浓度的药物的培养基更换72小时。收获细胞，并用膜联蛋白V和PI(FITC膜联蛋白V凋亡检测试剂盒，BDBiosciences)染色。通过FACScalibur(BDBiosciences)分析细胞。
抓伤测定法(ScratchWoundAssay)
于室温用20ug/ml胶原I包被Essen图像锁定板30分钟，除去胶原I，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗。在每个孔中分配6x104个细胞。分配后24小时，使用96孔制伤器(ESSENBioscience)抓孔。创伤后，自每个孔吸去培养基，并用PBS清洗每个孔两次。清洗后，添加培养基，并将板放置在IncuCyte(IncuCyteFLR，ESSENBioscience)内部。以2小时间隔拍摄伤口图像48小时。通过相对伤口密度分析数据。
细胞侵入测定法
在BDInsertHts96W板8UM的顶孔中分配0.1％BSARPMI1640培养基中的1.25x104个细胞。在底孔中添加200μl所示条件培养基。分配后16小时，自顶和底孔除去培养基。于4℃在底孔中用冷甲醇固定细胞30分钟。吸去甲醇，让板于室温干燥，然后用YO-PRO(Lifetechnologies)染色10分钟。用PBS清洗两次。用SpectraMaxM5(MolecularDevices)于485/538nm进行荧光定量。
产克隆测定法(ClonogenicAssay)
在10cm2板中分配105个细胞。分配后24小时，除去培养基，并用含有所示药物的培养基更换。每3-4天更换新鲜培养基，直至细胞达到汇合(4周)或6周停止培养。除去培养基，用PBS清洗细胞，然后于室温用0.5％结晶紫染色20分钟。除去染料，用水清洗细胞单层，干燥板，并拍照记录。
厄洛替尼抗性系的生成
将药物敏感性细胞(HCC4006和HCC827)用2uM厄洛替尼处理2个月。每3-4天更换含有2uM厄洛替尼的新鲜培养基。收集存活细胞作为厄洛替尼抗性细胞。
结果
如图1A-C所示，HCC4006-ER细胞对厄洛替尼有抗性。在对厄洛替尼有抗性之外，HCC4006-ER细胞还展现EMT的特征，如图2A-D所示。HCC4006表达上皮相关蛋白质，诸如E-钙粘着蛋白，而HCC4006厄洛替尼抗性细胞表达间充质相关蛋白质，波形蛋白。并且，在抓伤测定法中测量HCC4006和HCC4006-ER细胞的迁移率，并测量HCC4006和HCC4006-ER细胞的伤口闭合、细胞侵入、和细胞存活力。HCC4006和HCC4006-ER细胞之间在细胞侵入能力中存在惊人差异，而亲本和厄洛替尼抗性细胞之间在总体存活力中没有显著差异。如图3A-C所示，通过使用AXL激酶抑制剂(R428)和siRNA介导的敲低，在HCC4006-ER细胞中AXL抑制不能克服对厄洛替尼的抗性。
在分析HCC4006和HC4006-ER细胞时，如图4所示，FGFR1和特定FGF配体在HCC4006-ER细胞中显著升高，基于微阵列序型分析并通过qRT-PCR和ELISA确认。在厄洛替尼存在或缺失下在HCC4006-ER细胞中筛选一组小分子抑制剂揭示了FGFR抑制剂PD173074能逆转对厄洛替尼的抗性。见图8。在HCC4006-ER细胞中小分子抑制剂PD173074或重组可溶性FGFR-Fc对配体依赖性FGFR信号传导的特异性抑制克服了对厄洛替尼的抗性，如图5A-C所示。并且，在HCC4006细胞中用PD173074抑制FGFR能阻抑形成对厄洛替尼的抗性。见图6。一致地，如图7所示，FGFR而非AXL抑制(使用PD173074或重组可溶性FGFR-Fc进行)使另一种与EMT有关的厄洛替尼抗性模型HCC827-ER对EGFR抑制的存活效应部分再敏化。
尽管为了理解清楚的目的，上述发明已经通过例示和实施例较为详细地描述，描述和实施例不应解释为限制本发明的范围。通过提述明确完整收录本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容。

Claims (21)

1.一种在个体中治疗癌症的方法，其包括对该个体伴随施用(a)FGFR信号传导的拮抗剂和(b)EGFR拮抗剂。
2.权利要求1的方法，其中所述FGFR信号传导的拮抗剂和所述EGFR拮抗剂各自的量有效延长癌症敏感性的时段和/或延迟癌症形成对所述EGFR拮抗剂的抗性。
3.权利要求1的方法，其中所述FGFR信号传导的拮抗剂和所述EGFR拮抗剂各自的量有效提高和/或恢复癌症对所述EGFR拮抗剂的敏感性。
4.一种在个体中治疗对EGFR拮抗剂治疗有抗性的癌细胞的方法，其包括对该个体施用有效量的FGFR信号传导的拮抗剂和有效量的所述EGFR拮抗剂。
5.一种在个体中治疗对EGFR拮抗剂有抗性的癌症的方法，其包括对该个体施用有效量的FGFR信号传导的拮抗剂和有效量的所述EGFR拮抗剂。
6.一种提高和/或恢复对EGFR拮抗剂的敏感性的方法，其包括对个体施用有效量的FGFR信号传导的拮抗剂和有效量的所述EGFR拮抗剂。
7.一种在个体中提高包含EGFR拮抗剂的癌症治疗的功效的方法，其包括对该个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导的拮抗剂和(b)有效量的所述EGFR拮抗剂。
8.一种在个体中延迟和/或阻止癌症形成对EGFR拮抗剂的抗性的方法，其包括对该个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导的拮抗剂和(b)有效量的所述EGFR拮抗剂。
9.一种治疗形成对EGFR拮抗剂的抗性的可能性升高的具有癌症的个体的方法，其包括对该个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导的拮抗剂和(b)有效量的所述EGFR拮抗剂。
10.一种在具有癌症的个体中提高对EGFR拮抗剂的敏感性的方法，其包括对该个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导的拮抗剂和(b)有效量的所述EGFR拮抗剂。
11.一种在具有癌症的个体中延长EGFR拮抗剂敏感性的时段的方法，其包括对该个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导的拮抗剂和(b)有效量的所述EGFR拮抗剂。
12.一种在具有癌症的个体中延长对EGFR拮抗剂的响应的持续时间的方法，其包括对该个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导的拮抗剂和(b)有效量的所述EGFR拮抗剂。
13.权利要求1-12任一项的方法，其中所述癌症是肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))。
14.权利要求1-13任一项的方法，其中所述癌症已经经历上皮-间充质转变。
15.权利要求1-14任一项的方法，其中所述FGFR信号传导的拮抗剂是抗体抑制剂、小分子抑制剂、结合多肽抑制剂、和/或多核苷酸拮抗剂。
16.权利要求1-15任一项的方法，其中所述FGFR信号传导的拮抗剂是FGFR1信号传导的拮抗剂。
17.权利要求1-15任一项的方法，其中所述FGFR1信号传导的拮抗剂结合FGFR1b、FGFR1c、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、和FGF10中一项或多项。
18.权利要求15-17任一项的方法，其中所述FGFR信号传导的拮抗剂是结合多肽抑制剂，且所述结合多肽抑制剂包含与Fc连接的FGFR胞外域的一个区域。
19.权利要求15-17任一项的方法，其中所述FGFR信号传导的拮抗剂是小分子，且所述小分子是N-[2-[[4-(二乙基氨基)丁基]氨基]-6-(3,5-二甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]-N'-(1,1-二甲基乙基)-脲(N-[2-[[4-(diethylamino)butyl]amino]-6-(3,5-dimethoxyphenyl)pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-yl]-N'-(1,1-dimethylethyl)-urea)或其药学可接受盐。
20.权利要求1-19任一项的方法，其中所述EGFR拮抗剂是N-(3-乙炔基苯基)-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(N-(3-ethynylphenyl)-6,7-bis(2-methoxyethoxy)quinazolin-4-amine)或其药学可接受盐。
21.权利要求1-19任一项的方法，其中所述EGFR拮抗剂是N-(3-氯-4-氟-苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉-4-基丙氧基)喹唑啉-4-胺(N-(3-chloro-4-fluoro-phenyl)-7-methoxy-6-(3-morpholin-4-ylpropoxy)quinazolin-4-amine)或其药学可接受盐。
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