KR102210227B1

KR102210227B1 - Api5 및 fgf2의 결합 저해 물질 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR102210227B1
Application number: KR1020190097467A
Authority: KR
Inventors: 이병일; 봉승민
Original assignee: 국립암센터
Priority date: 2019-08-09
Filing date: 2019-08-09
Publication date: 2021-01-29
Also published as: WO2021029565A1

Abstract

본 발명은 i) FGF2 외부에 시스테인(Cysteine)을 도입하는 단계;
ii) 상기 단계 i)의 시스테인이 도입된 FGF2에 형광물질을 표지하는 단계;
iii) 상기 단계 ii)의 형광물질이 표지된 FGF2, FGF2와 결합 가능한 단백질 및 이들의 결합을 저해할 수 있는 후보물질을 혼합하는 단계; 및
iv) 상기 단계 iii)의 혼합된 물질들의 형광 세기를 측정하는 단계;
를 포함하는 FGF2 결합 저해물질 스크리닝 방법 및 이의 용도에 대한 것이다.
본 발명의 스크리닝 방법을 이용하는 경우 FGF2에 시스테인을 추가적을 도입함으로써 형광물질이 보다 효율적으로 표지될 수 있게 하여 형광 편광 분석방법 등으로 측정한 형광 편광값을 증폭시켜 FGF2와 API5의 결합(상호작용)력 내지 이를 저해하는 물질을 효과적으로 스크리닝할 수 있다.

Description

API5 및 FGF2의 결합 저해 물질 스크리닝 방법 {Screening method for binding inhibitors of API5 and FGF2}

본 발명은 i) FGF2 외부에 시스테인(Cysteine)을 도입하는 단계;

ii) 상기 단계 i)의 시스테인이 도입된 FGF2에 형광물질을 표지하는 단계;

iii) 상기 단계 ii)의 형광물질이 표지된 FGF2, FGF2와 결합 가능한 단백질 및 이들의 결합을 저해할 수 있는 후보물질을 혼합하는 단계; 및

iv) 상기 단계 iii)의 혼합된 물질들의 형광 세기를 측정하는 단계;

를 포함하는 FGF2 결합 저해물질 스크리닝 방법 및 이의 용도에 대한 것이다.

단백질-단백질, 핵산(DNA, RNA)-단백질간의 상호작용 또는 적절한 핵산분해효소, 단백질가수분해 효소의 활성 등은 세포의 발생, 성장 및 항상성 유지 등 정상적인 생리학적 반응 이외에도 암을 비롯한 다양한 질병 발생과 관련된 비정상적인 생리학적 반응에도 거의 모든 세포 신호전달체계(signal transduction)에 관여한다. 따라서 진단 및 치료를 위해 유기 또는 무기 저분자 화합물(small molecule), 압타머(aptamer), 펩타이드(peptide), 치료용 단백질, 항체 등의 물질들이 발 빠르게 개발되고 있다. 그러므로 이러한 약리후보물질의 효능을 검증하기 위한 저분자 화합물-단백질, 핵산-단백질, 펩타이드-단백질, 단백질-단백질간 결합력(상호작용) 또는 핵산분해효소, 단백질분해효소 활성의 정량적 분석이 매우 중요하다고 할 수 있다.

현재 이용되고 있는 분자간의 결합력(상호작용) 또는 효소활성 분석 방법은 크게 이질성(heterogeneous) 방법과 동질성(homogeneous) 방법으로 나눌 수 있다. 이질성 방법의 대표적인 예로 효소면역측정법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 마이크로어레이(microarray), 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 등을 들 수 있다. 이러한 이질성 방법들은 결합력(상호작용) 또는 효소활성 분석을 위해 기판 위에 분자를 고정(immobilization)하는 단계와 세척(washing) 단계가 필수적이다. 더 나아가 최종 결합력(상호작용) 분석 또는 효소활성 측정을 위해 분석하고자 하는 물질(저분자 화합물 또는 핵산 또는 단백질)과 결합해있는 물질 및 반응생성물만 순수하게 분리(separation)하는 과정 또한 필수적이다.

하지만 동질성 방법은 이질성 방법에서 요구되는 고정(immobilization), 세척(washing) 또는 분리(separation) 과정이 요구되지 않기 때문에, 간단하고 신속하게 분자간의 결합력(상호작용) 또는 효소활성 분석이 가능하다는 장점이 있다. 동질성 방법의 대표적인 예로 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer, FRT) 및 형광 편광(fluorescence polarization, FP) 등이 기술이 존재한다. 현재 형광 공명 에너지 전이 측정법은 분자간의 결합력(상호작용) 또는 효소활성 측정에 널리 이용되고 있지만, 공여체(donor) 및 수여체(acceptor)의 요구로 인해 결합력을 분석하고자 하는 두 분자에 모두 형광물질을 표지해야 하는 치명적인 단점이 존재한다.

반면에, 한 가지 분자에만 형광물질을 표지하여도 분자간의 결합력(상호작용) 또는 효소활성 분석이 가능한 형광 편광 측정법은 용액 내의 형광물질을 여기(excitation)시킬 때 발생하는 형광 편광을 측정하는 방법이다. 형광물질이 여기되어 안정한 상태를 유지하고 있는 경우에는 형광 편광을 방사하고, 형광 분자가 여기될 때 들뜬 경우에서는 브라운 운동에 의해 회전하여 여기 평면과 다른 평면으로 형광을 방사하게 되어 형광 편광이 소실되는 원리를 이용하는 것이다. 이러한 원리에 기초하여 분자간의 결합에 의해 분자량이 증가하면 형광편광도가 증가하고, 해리나 분해에 의해 분자량이 감소하면 형광편광도가 감소하기 때문에, 저분자 화합물-단백질, 핵산-단백질, 펩타이드-단백질, 단백질-단백질, 수용체-리간드, 효소-기질, 핵산-핵산 등의 결합력(상호작용) 및 효소활성 분석에 있어 강력한 기술이라 할 수 있다.

대한민국 등록특허 제10-1576363호는 신호가 증폭된 형광 편광 측정방법에 대한 것으로서, 바이오틴 및 스트렙트아비딘을 이용하여 형광 편광 값을 증폭시켜 두 분자간의 결합력(상호작용) 분석 또는 효소 활성 측정이 가능함을 개시하고 있다.

그러나 FGF2의 결합, 특히 FGF2와 API5의 결합을 억제하는 저해물질을 스크리닝하기 위해 형광 편광을 활용하는 연구 내지 기재는 개시된 바 없다.

이에 본 발명자들은 저분자 화합물과 단백질 등의 결합(상호작용)력, 특히 FGF2와 API5의 결합력 내지 이를 억제하는 저해물질들을 효과적으로 스크리닝할 수 있는 방법을 제공하고자 예의 노력한 결과, FGF2에 시스테인을 도입하여 API5와 반응시킨 후 스크리닝 하는 경우 높은 효율로 FGF2와 API5의 결합력 내지 이를 억제하는 저해물질들을 스크리닝할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 i) FGF2 외부에 시스테인을 도입하는 단계;

를 포함하는 FGF2 결합 저해물질 스크리닝 방법 내지 이의 용도를 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 i) FGF2 외부에 시스테인을 도입하는 단계;

를 포함하는 FGF2 결합 저해물질 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 시스테인은 FGF2의 C-말단에 도입되는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 ii)의 형광물질은 FITC(fluorescein isothiocyanate), TRITC(tetramethylrhodamine), FAM(fluorescein amidite), Rhodamine, TAMRA (Carboxytetramethylrhodamine), Cy™, CF™ (Cyanine-based fluorescent dye) 및 Alexa Fluor 으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iii)의 FGF2와 결합 가능한 단백질은 FGF2 보다 분자량이 크거나 같은 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 iii)의 FGF2와 결합 가능한 단백질은 플래그(FLAG), 히스티딘(Histidine), CBD, MBP, TRX 및 GST(Glutathione S-transferase)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 태그가 융합된 단백질일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iii)의 FGF2와 결합 가능한 단백질은 API5 인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iv)의 형광 세기를 측정하는 것은 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer), BRET(Bioluminescence Resonance Energy Transfer), FP(Fluorescence Polarization), HCS(High-content Screening) 및 HTS(High Throughput Screening) 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 방법을 이용하여 측정하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, v) 상기 단계 iv)에서 측정한 형광 세기가, 상기 단계 iii)의 후보물질을 혼합하기 전에 비하여 50% 내지 100% 수준으로 감소한 경우 FGF2 결합 저해물질로 판단하는 단계를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 스크리닝 방법으로 선별된 FGF2 결합 저해물질을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 결합은 FGF2와 API5의 결합인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 FGF2 결합 저해물질을 포함하는 항암제 내성 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 스크리닝 방법을 이용하는 경우 FGF2에 시스테인을 추가적을 도입함으로써 형광물질이 보다 효율적으로 표지될 수 있게 하여 형광 편광 분석방법 등으로 측정한 형광 편광값을 증폭시켜 FGF2와 API5의 결합(상호작용)력 내지 이를 억제하는 물질을 효과적으로 스크리닝할 수 있다.

도 1은 FP 분석방법 기반 단백질-단백질(펩타이드) 결합 또는 결합 저해물질을 분석하는 방법 내지 스크리닝 하는 방법의 원리를 나타낸다. 단백질-단백질(펩타이드) 결합을 분석할 때에는 FP 신호가 증가하는 경우 단백질과 단백질(펩타이드)가 결합한 것을 의미하고, 단백질-단백질(펩타이드) 결합 저해물질을 스크리닝할 때에는 FP 신호가 감소하는 경우 단백질과 단백질(펩타이드)의 결합이 저해된 것을 의미한다.
도 2는 본 발명의 API5 및 FGF2의 결합을 저해하는 물질 스크리닝 방법의 원리를 나타낸다.
도 3은 C 말단에 시스테인이 도입된 FGF2 단백질을 나타낸다. 붉은색이 FGF2 단백질 외부에 새로 도입된 시스테인이며, 노란색은 기존에 존재하던 FGF2 단백질 내부를 향한 시스테인을 나타낸다.
도 4는 C 말단에 시스테인이 도입된 FGF2 단백질(하늘색)과 결합한 API5 단백질(초록색)을 나타낸다. FGF2에는 기존에 167번(C167) 및 234번(C234) 위치에 시스테인이 존재(노란색)하였으나 이는 FGF2 단백질 내부를 향해 있으며, 새로 도입한 289번 시스테인(C289, 붉은색)은 FGF2 단백질 외부에 위치한다.
도 5는 API5 및 FGF2 결합을 형광 편광 분석방법에 기반하여 측정한 결과를 나타낸다. His-API5 단백질에 Alexa Fluor 488로 표지된 His-FGF2와 결합시키는 경우 FP 값이 188에서 272로 증가하였다. GST-API5 단백질에 Alexa Fluor 488로 표지된 His-FGF2와 결합시키는 경우 FP 값이 183에서 258로 증가하였다.
도 6은 본 발명의 방법을 이용하여 API5 및 FGF2 결합 억제제 후보 물질들을 스크리닝한 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 “FGF2 (단백질) 외부”는 FGF2 단백질에서 단백질 내부가 아닌 외부로 향해있는 FGF2 단백질의 부위를 의미한다. 이에 상응하여 “FGF2 (단백질) 내부”는 FGF2 단백질에서 단백질 외부가 아닌 내부로 향해있는 FGF2 단백질의 부위를 의미한다.

본 발명의 “항암제 내성 억제”는 암세포의 항암제에 대한 저항 내지 내성을 감소 내지 완화시켜 항암제의 암세포에 대한 항암 효과가 완전히 나타날 수 있도록 하는 모든 효과를 의미한다.

본 발명의 "API5(Apoptosis inhibitor 5)"는 1997년 성장인자 없이도 세포사멸이 이루어 지지 않은 세포의 cDNA 분석을 통해 증가된 유전자로 발견되어 AAC-11이라고 명명되었다. API5는 여러 암세포에서 암의 생존 증가에 관여한다고 보고되었는데, Acinus(ACIN1)와 물리적인 결합을 통해 Acinus 매개성 DNA 절편을 통한 세포사멸 유도를 억제하고 세포사멸 단백질인 Caspase-3의 활성을 막는다. 뿐만 아니라 E2F1에 유도되는 세포사멸을 효과적으로 억제하며 API5 발현을 저하하면 항암제의 세포독성이 증가되는 것이 확인되었다. 또한, 암세포의 이동과 침윤에 관여하여 암의 전이와 관련이 깊고, 최근 암세포의 면역 회피에도 중요한 역할을 한다는 사실이 밝혀졌다.

본 발명의 "FGF2(fibroblast growth factor 2)"는 23개의 FGF 구성원으로 이루어진 커다란 섬유아세포 성장 인자들 패밀리 중의 하나로서, 중추신경계 내의 FGF 구성원 중 가장 풍부하다. 이는 다양한 세포 형태에 있어서, 증식, 분화, 발달 및 생존의 조절 매개체로서 중요한 역할을 하고 신경계에서 분열 촉진 활성(mitogenic activity)을 가진다. 또한, FGF2는 잠재적인 혈관형성(angiogenic) 효과, 평활근 세포(smooth muscle cells)의 성장 촉진, 상처 치유 및 조직 회복과 더불어, 인간 및 마우스 배아줄기(embryonic stem; ES) 세포의 다분화능(pluripotent) 상태를 유지하는 것으로 보고되었다. FGF2는 고분자량(high molecular weight; 22, 22.5, 24 또는 34 kDa) 및 저분자량(low molecular weight; 18 kDa) 두 종류가 존재한다. 고분자량 FGF2는 N 말단에 핵 위치 신호(nuclear localization signal; NLS)가 존재하여 고분자량 FGF2가 핵에 위치하도록 하는 반면, 저분자량 FGF2는 N 말단에 NLS는 존재하지 않는 반면 C 말단의 비전형적인 이분 NLS로 인해 일부 저분자량 FGF2가 핵에 위치하도록 조절한다.

본 발명의 “FGF2 결합 저해물질”은 FGF2가 다른 단백질과 결합하는 것을 억제하는 물질을 의미하며, 본 발명에서는 FGF2와 API5가 결합하는 것을 억제하는 물질을 의미할 수 있다.

본 발명의 FGF2 결합 저해물질 스크리닝 방법에서, 시스테인을 FGF2 단백질의 외부에 위치하도록 도입하는 경우 Alexa Fluor 488 등의 형광물질이 FGF2에 보다 높은 효율로 표지될 수 있었다(실시예 2). 상기 Alexa Fluor 488이 표지된 FGF2, His 및 GST로 태그된 API5와 API5 및 FGF2의 결합 억제제 후보물질들을 한번에 반응시킨 후 형광 편광 분석방법으로 분석한 결과 형광 편광값이 유의적으로 상승하여 다양한 API5 및 FGF2의 결합 억제제 후보물질들을 효과적으로 스크리닝할 수 있었다(실시예 3).

따라서, 본 발명은 i) FGF2 외부에 시스테인(Cysteine)을 도입하는 단계;

를 포함하는 FGF2 결합 저해물질 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 상기 단계 i)의 시스테인은 FGF2의 C-말단에 도입되는 것일 수 있다. FGF2는 본래 C167 및 C234 위치에 시스테인을 포함하고 있으나, 이는 FGF2 단백질 내부를 향해있어서 Alexa Fluor 488 등 형광물질이 결합하는데에 어려움이 있었다. 이에 FGF2의 C 말단에 시스테인을 도입(C289)하는 경우 Alexa Fluor 488 등 형광물질과의 결합 효율이 증가할 수 있다.

본 발명의 상기 단계 ii)의 형광물질은 FITC(fluorescein isothiocyanate), TRITC(tetramethylrhodamine), FAM(fluorescein amidite), Rhodamine, TAMRA (Carboxytetramethylrhodamine), Cy™, CF™ (Cyanine-based fluorescent dye) 및 Alexa Fluor 으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 FITC(fluorescein isothiocyanate) 또는 Alexa Fluor 인 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 Alexa Fluor 인 것이 가장 바람직하다. 상기 Alexa Fluor은 Alexa Fluor 488 일 수 있다.

형광 편광 분석방법에 기반하여 단백질-단백질(펩타이드) 결합 내지 이를 억제하는 억제제를 스크리닝하는 경우, 단백질-단백질(펩타이드) 결합이 이루어진다면 형광 편광값은 증가하는 것으로, 단백질-단백질(펩타이드) 결합이 억제된다면 형광 편광값이 억제하는 것으로 예측할 수 있다.

본 발명에서 FGF2에 시스테인을 도입하는 것은 형광 편광 분석방법에서 형광 편광 값의 차이를 보다 극대화시키기 위해서는 분자량이 작은 물질에 형광물질을 표지하여야하기 때문에, FGF2에 시스테인을 도입함으로써 형광물질과의 결합 효율을 증폭시키기 위함이다(도 2). 따라서, 상기 단계 iii)의 FGF2와 결합 가능한 단백질은 FGF2 보다 분자량이 크거나 같은 것일 수 있으며, 바람직하게는 FGF2 보다 분자량이 큰 것일 수 있다. 상기 FGF2와 결합 가능한 단백질은 FGFR 또는 API5 일 수 있고, 바람직하게는 API5일 수 있다. FGF2 전장(residue 1-288)의 분자량은 약 30.8 kDa 이며, FGF2(residue 135-288)의 분자량은 17.1 kDa이고, N 말단에 His-tag 및 C 말단에 시스테인을 도입한 FGF2(residue 135-288)의 분자량은 약 19.8 kDa이다. His-API5의 분자량은 약 61 kDa, GST가 표지된 His-API5의 분자량은 약 170kDa 이다.

본 발명의 상기 iii)의 FGF2와 결합 가능한 단백질에 플래그(FLAG), 히스티딘(Histidine), CBD, MBP, TRX 및 GST(Glutathione S-transferase)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 태그를 융합하는 것일 수 있다. 바람직하게는 히스티딘(Histidine), GST(Glutathione S-transferase) 또는 히스티딘 및 GST를 모두 융합하는 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 단계 iv)의 형광 세기를 측정하는 것은 바람직하게 형광 편광의 세기를 측정하는 것일 수 있으며, FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer), BRET(Bioluminescence Resonance Energy Transfer), FP(Fluorescence Polarization), HCS(High-content Screening) 및 HTS(High Throughput Screening) 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 방법을 이용하여 측정하는 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 FP(Fluorescence Polarization) 또는 HTS(High Throughput Screening) 방법을 이용하여 측정하는 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 스크리닝 방법은 v) 상기 단계 iv)에서 측정한 형광 세기가, 상기 단계 iii)의 후보물질을 혼합하기 전에 비하여 50% 내지 100% 수준으로 감소한 경우 FGF2 결합 저해물질로 판단하는 단계를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다. 바람직하게는 형광 세기가 55% 내지 90% 수준으로 감소한 경우 FGF2 결합 저해물질로 판단하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 60% 내지 70% 수준으로 감소한 경우 FGF2 결합 저해물질로 판단하는 것이 바람직하다.

결과적으로, 본 발명은 상기 스크리닝 방법으로 선별된 FGF2 결합 저해물질을 제공할 수 있다.

본 발명의 상기 결합은 FGF2와 API5의 결합인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 FGF2 결합 저해물질을 포함하는 항암제 내성 억제용 조성물을 제공할 수 있다.

상기 항암제는 독소루비신, 5-플루오로우라실, 카르보플라틴, 시스플라틴, 카르무스틴, 다카바진, 에토포사이드, 비노렐빈, 토포테칸, 이리노테칸 및 에스트라무스틴으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석하지 않는 것은 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.

재조합 단백질 준비

FGF2 및 API5의 결합을 억제하는 저해물질의 스크리닝 효율을 증가시키기 위하여 FGF2 및 API5의 형광물질에의 친화도를 증폭시키고자 하였다.

구체적으로, 대장균(E. coli)에서 대량 발현을 위해 FGF2에서 C211S 및 C229S로 돌연변이시켰다. FGF2 단백질 외부인 C 말단에 289번째 아미노산으로서 시스테인(Cysteine; Cys) 잔기를 도입하였다(Cys289, 도 3). 단백질 정제 효율을 높이기 위하여 FGF2 및 API5에 모두 His tag을 하였다. 단백질 정제 효율 높이고 FGF2와 분자량 차이를 보다 크게 하기 위하여 API5에 GST(Glutathion S-transferase)을 융합한 재조합 API5도 추가로 제작하였다.

단백질에 형광물질 표지

시스테인(Cysteine, Cys)의 도입이 FGF2와 형광물질(염료) 표지 효율에 영향을 미치는지 여부를 확인하고자 하였다.

구체적으로, TCEP 용액(pH 7.5)를 Cys를 도입하지 않은 FGF2 또는 상기 <실시예 1>에서 제조한 FGF2의 100배(molar ratio) 넣어준 다음 10분 동안 실온에서 반응시킨다. 10분 후에 염료 Alexa Fluor 488을 넣고(Dye/protein ratio = 0.5-3), 바로 pipetting으로 섞은 후 table top centrifuge로 spin down한다. 그리고 실온에서 2시간 동안 반응시키는데, 그때, 30분 마다 pipetting을 해준다. 마지막으로 호일로 감싼 후, 4℃에서 15시간 반응시킨다(단백질-형광물질 반응). FGF2에 결합하지 않은 염료는 HiTrap Desalting column을 이용하여 제거한다(과잉 형광물질 제거). Desalting column을 해서 얻은 profile peak을 확인하고 그 peak안에 들어가는 튜브를 수거한다. 튜브 각각의 용액을 280nm 및 494nm에서 각각 흡광도를 측정한 후, 하기 [수학식 1] 및 [수학식 2]를 통하여 표지 효율을 확인하였다. [수학식 2]의 염료(M)/단백질(M) 값이 1 이하인 경우 표지 효율이 높은 것으로 판단하였으며, 값이 1보다 큰 경우는 단백질과 과반응 되었거나 반응하지 않은 염료가 섞인 것으로 판단하였다.

단백질 몰 흡광계수(protein molar extinction coefficient)는 16,055 cm^-1M^-1) 이고, 염료 몰 흡광계수(dye molar extinction coefficient; Alexa Fluor 488)는 71,000 cm^-1M^-1 으로 하였다. Amax 는 최대 파장에서 측정한 염료의 흡광도(Alexa Fluor 488: Abs 495) 이며, CF 는 보정계수(Correction factor; Alexa Fluor 488: 0.11) 이며, 희석 배율(Dilution factor) 은 흡광도를 측정하기 전 희석된 샘플의 양 을 나타낸다.

[수학식 1]

단백질 농도(M) = [A₂₈₀-(A₄₉₄ × 0.11)]× 희석배율 / 단백질 몰 흡광계수

[수학식 2]

염료(M)/단백질(M) = A₄₉₄ × 희석배율 / 염료 물 흡광계수 × 단백질 농도(M)

그 결과, Cys을 도입하지 않은 FGF2의 경우, 일정 시간 경과 후 형광 편광 값이 매우 낮아지는 현상이 나타났는데, 이는 FGF2 내부에 존재하는 기존 Cys 잔기가 단백질 표면에 충분히 노출되지 않아 이에 형광 물질이 공유결합을 통한 표지가 적절히 이루어지지 않은 것으로 판단하였다. 반면에, C 말단에 Cys를 도입하여 Cys를 단백질 외부로 노출시킨 FGF2의 경우, 오랜 기간 형광 표지가 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, C 말단에 Cys를 도입한 FGF2의 표지 효율값은 대부분 약 0.3~0.8을 나타내어 도입된 Cys에 Alexa Fluor 488이 적절하게 공유결합하여 표지된 것으로 판단하였다.

단백질 결합 저해물질 스크리닝

1×PBS에 보관중인 정제한 API5 전장(1.2 mM)과 상기 <실시예 2>에서 제조한 Alexa Fluor 488로 표지된 FGF2(residue 135-288; 10 nM) 결합여부를 형광 편광(Fluorescence polarization) 분석방법으로 확인하였다. 그리고 결합체를 스크리닝 하고자 하는 저분자 화합물(small molecule compound)들과 혼합하고 형광 편광 경쟁 분석방법(Fluorescence polarization competition assay)을 수행하여 FGF2-API5(FGF2 결합부위) 결합을 억제하는 물질을 동정하였다.

보다 구체적으로, 1.2 mM 농도의 His tag 또는 GST가 융합된 API5 단백질, 10 nM의 Alexa Fluor 488로 표지된 FGF2, 1.5~2.25 mM의 후보 화합물 6종을 각각의 농도로 준비하고 96-웰 블랙 플레이트에 각각 넣고 혼합하여 상온에서 30분 동안 반응시킨 후 Infinte F200 Pro(TECAN Group Ltd, Switzerland)를 이용해 상온에서 형광편광 값(fluorescence polarization(mp))을 측정하였다. 여기(Excitation) 파장은 485 nm, 방출(Emission) 파장은 535 nm로 하였다. 상기 후보 화합물 6종은 각각 API5 유래 펩타이드(1), FGF2 유래 펩타이드(2), Thermal shift assay에서 도출된 API5 결합물질(3), 3번 후보물질의 유도체(4), 3번 후보물질의 다른 유도체(5) 및 음성대조군(6) 이다.

그 결과, 화합물을 넣지 않은 경우(No inhibitor) 형광 편광 값이 279로 측정된 것과 비교하여 저해 후보물질을 첨가한 경우 약 152 에서 250 범위의 다양한 형광편광 값이 나타났으며, 특히 3번 후보물질의 경우 형광편광값이 약 50% 수준으로 감소한 것으로 나타났다. 형광 편광값 감소 수준을 결합 억제 비율(% of inhibition)로 나타내는 경우, [도 6]에서 나타나는 바와 같이 후보물질들 사이의 결합 저해 정도가 분명하게 구별될 수 있어 FGF2와 API5 의 결합을 억제할 수 있는 저해후보물질들을 효과적으로 스크리닝 할 수 있음을 확인하였다.

Claims

i) FGF2 외부 C-말단에 시스테인(Cysteine)을 도입하는 단계;
ii) 상기 단계 i)의 시스테인이 도입된 FGF2에 형광물질을 표지하는 단계;
iii) 상기 단계 ii)의 형광물질이 표지된 FGF2, FGF2와 결합 가능한 단백질 및 이들의 결합을 저해할 수 있는 후보물질을 혼합하는 단계; 및
iv) 상기 단계 iii)의 혼합된 물질들의 형광 세기를 측정하는 단계; 및
v) 상기 단계 iv)에서 측정한 형광 세기가, 상기 단계 iii)의 후보물질을 혼합하기 전에 비하여 50% 내지 100% 수준으로 감소한 경우 FGF2 결합 저해물질로 판단하는 단계;
를 포함하는 FGF2 결합 저해물질 스크리닝 방법으로서,
상기 단계 iii)의 FGF2와 결합 가능한 단백질은 FGF2 보다 분자량이 크거나 같은 API5 인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
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제1항에 있어서, 상기 단계 ii)의 형광물질은 FITC(fluorescein isothiocyanate), TRITC(tetramethylrhodamine), FAM(fluorescein amidite), Rhodamine, TAMRA (Carboxytetramethylrhodamine), Cy™, CF™ (Cyanine-based fluorescent dye) 및 Alexa Fluor　으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
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제1항에 있어서, 상기 단계 iv)의 형광 세기를 측정하는 것은 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer), BRET(Bioluminescence Resonance Energy Transfer), FP(Fluorescence Polarization), HCS(High-content Screening) 및 HTS(High Throughput Screening) 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 방법을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
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