CN110100180B - 均相检测方法 - Google Patents

均相检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110100180B
CN110100180B CN201780001782.2A CN201780001782A CN110100180B CN 110100180 B CN110100180 B CN 110100180B CN 201780001782 A CN201780001782 A CN 201780001782A CN 110100180 B CN110100180 B CN 110100180B
Authority
CN
China
Prior art keywords
enzyme
aptamer
reactive protein
detected
concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201780001782.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110100180A (zh
Inventor
张建亮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Langji Life Science And Technology Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Langji Life Science And Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Langji Life Science And Technology Co ltd filed Critical Shenzhen Langji Life Science And Technology Co ltd
Publication of CN110100180A publication Critical patent/CN110100180A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110100180B publication Critical patent/CN110100180B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • G01N2333/938—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. beta-galactosidase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种均相检测方法，该均相检测方法包括如下步骤：提供适配体和酶，所述适配体可特异性识别待测物，将所述适配体连接到所述酶上，得适配体‑酶复合物；配置不同浓度的待测物标准溶液，将所述适配体‑酶复合物和所述酶作用的底物加入到所述待测物标准溶液中进行酶促反应，测得酶促反应信号，获取酶促反应信号与待测物含量的方程；将所述适配体‑酶复合物和所述底物加入到含有所述待测物的样品溶液中进行酶促反应，测得酶促反应信号，根据所述方程计算所述样品溶液中的待测物含量。该均相检测方法具有灵敏度高、重复性好、抗干扰能力强、检测速度快和成本低的特点，可检测各种生物分子，应用非常广泛。

Description

均相检测方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种均相检测方法。
背景技术
目前，生物大分子测定技术有胶乳增强免疫比浊技术(LETIA)、化学发光免疫分析技术(CLIA)。LETIA通过在高分子乳胶微球表面交联的单克隆抗体，在抗原存在的条件下，偶联微球的单克隆抗体与抗原在短时间内迅速结合聚集在一起，从而改变反应溶液的吸光度；反应液吸光度的改变与被测抗原的浓度在一定范围内具有线性关系，从而可用来反映被测抗原的浓度。CLIA是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法，该方法具有很高的灵敏度和良好的线性范围。
化学小分子的测定技术有克隆酶供体免疫测试(cloned enzyme donorimmunoassay，CEDIA)、酶放大免疫测试(EMIT)、荧光偏振免疫测试(FPIA)。CEDIA是利用重组DNA技术制备β-半糖苷酶的两个片段：大片段称为酶受体(enzyme acceptor，EA)，小片段称为酶供体(enzyme donor，ED)，两个片段本身均不具酶活性，但在合适的条件下结合在一起就具有酶活性，利用这两相片段的特性建立的均相酶免疫测定称为克隆酶供体免疫测定。ED标记的半抗原与抗体结合后由于空间位阻，不再能与EA结合。当样品中含有待测半抗原时，会与ED标记的半抗原竞争结合抗体，使被抑制的ED恢复自由状态，能够与EA互补，酶活性恢复。CEDIA主要用于药物和小分子物质的测定，也有专利将蛋白分子的特定表位连接到ED片段上，从而实现了对生物大分子的检测，但目前CEDIA技术都是使用竞争法进行测试，待测物浓度与酶活力大小成正比。EMIT的基本原理是半抗原与酶结合成酶标半抗原，保留半抗原和酶的活性。当酶标半抗原与抗体结合后，所标的酶与抗体密切接触，使酶的活性中心受到影响而活性被抑制，当样品中含有待测半抗原时，会与酶标半抗原竞争结合抗体，使被抑制的酶活性恢复。EMIT技术使用竞争法进行测试，待测物浓度与酶活力大小成正比。FPIA的试剂为荧光素标记的小分子待测物和抗药物的抗体，模式为均相竞争法。荧光偏振免疫测试的原理如下，荧光物质经单一平面的偏振光蓝光(波长485nm)照射后，可吸收光能跃入激发态；在恢复至基态时，释放能量并发出单一平面的偏振荧光(波长525nm)。偏振荧光的强度与荧光物质受激发时分子转动的速度成反比。大分子物质旋转慢，发出的偏振荧光强；小分子物质旋转快，其偏振荧光弱。将待测小分子连接到荧光分子上，同时在检测环境中添加针对待测小分子的抗体，当检测环境中含有待测小分子时，该待测小分子会与标记了荧光分子的待测小分子竞争结合抗体，使部分标记了荧光分子的待测物释放出来，检测环境中的偏振光强度下降。该方法为竞争法测试，待测物浓度与偏振光强度呈反比，利用这一现象建立了荧光偏振免疫测定用于小分子物质特别是药物的测定。
上述方法中，LETIA技术最高可以只能实现0.1mg/L的分析灵敏度，但对于一些灵敏度要求更高的分析就无能为力了。CLIA方法是一种非均相的测试，测试过程中涉及到清洗分离步骤，测试速度较慢，测试成本很高，且非均相反应导致测试的重复性较差，而且以上方法由于需要使用抗体，还会存在类风湿因子(RF)、人抗动物免疫球蛋白(HAAA)等干扰，均可能严重影响测试结果的准确性。CEDIA、EMIT、FPIA均为竞争法测试，最适合用来测试小分子物质，检测大分子时非常受限，且同等情况下，竞争法灵敏度较非竞争法低。因此，现有技术有待改进。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种均相检测方法，旨在解决现有检测方法灵敏度和重复性较差、成本高，以致使其应用受限的技术问题。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供一种均相检测方法，该均相检测方法包括如下步骤：
提供适配体和酶，所述适配体可特异性识别待测物，将所述适配体连接到所述酶上，得适配体-酶复合物；
配置不同浓度的待测物标准溶液，将所述适配体-酶复合物和所述酶作用的底物加入到所述待测物标准溶液中进行酶促反应，测得酶促反应信号，获取酶促反应信号与待测物含量的方程；
将所述适配体-酶复合物和所述底物加入到含有所述待测物的样品溶液中进行酶促反应，测得酶促反应信号，根据所述方程计算所述样品溶液中的待测物含量。
本发明提供的均相检测方法，是一种全新的均相非竞争法，该方法利用可特异性识别待测物的适配体对酶进行标记，先根据待测物标准溶液中酶促反应的酶促反应信号，推导出酶促反应信号与待测物含量之间关系的方程，然后根据该方程，检测样品溶液中酶促反应的酶促反应信号，就可以计算出样品溶液中的待测物含量；由于该酶促反应信号与待测物含量成一定比例，所以根据样品溶液中的酶促反应信号可以快速计算出待测物含量。因此，本发明与现有技术相比，具有灵敏度高、重复性好、抗干扰能力强、检测速度快和成本低的特点，可检测各种生物分子，应用非常广泛。
附图说明
图1为本发明实施例1中的C-反应蛋白检测的原理图；
图2为本发明实施例2中的C-反应蛋白检测的原理图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供了一种均相检测方法，该均相检测方法包括如下步骤：
S01：提供适配体和酶，所述适配体可特异性识别待测物，将所述适配体连接到所述酶上，得适配体-酶复合物；
S02：配置不同浓度的待测物标准溶液，将所述适配体-酶复合物和所述酶作用的底物加入到所述待测物标准溶液中进行酶促反应，测得酶促反应信号，获取酶促反应信号与待测物含量的方程；
S03：将所述适配体-酶复合物和所述底物加入到含有所述待测物的样品溶液中进行酶促反应，测得酶促反应信号，根据所述方程计算所述样品溶液中的待测物含量。
本发明实施例提供的上述均相检测方法，是一种全新的均相非竞争法，该方法利用可特异性识别待测物的适配体对酶进行标记，先根据待测物标准溶液中酶促反应的酶促反应信号，推导出酶促反应信号与待测物含量之间关系的方程(在具体实施例中，可以是线性方程或非线性方程)，然后根据该方程，检测样品溶液中酶促反应的酶促反应信号，就可以计算出样品溶液中的待测物含量；由于该酶促反应信号与待测物含量成一定比例，所以根据样品溶液中的酶促反应信号可以快速计算出待测物含量。
因适配体分子量较低，将一段特异性的适配体连接到酶或具有互补活性的酶片段(酶供体或酶受体)上，适配体本身不影响酶的活性或酶片段的互补活性，与酶连接后也不会影响酶的活性或酶片段的互补活性，但当样本溶液中含有待测物时，待测物与适配体直接特异性结合，由于空间位阻效应，酶的活性或酶片段的互补活性丧失，待测物浓度越高酶活力越低，待测物浓度与酶活力成反比，因此检测到酶促反应信号(与酶活力对应)后可以快速计算出样品溶液中的待测物浓度。该均相检测方法具有灵敏度高、重复性好、抗干扰能力强、检测速度快和成本低的特点，可检测各种生物分子，应用非常广泛。
具体地，本发明实施例的上述均相检测方法中，该酶是具有催化活性的酶，即该酶是全酶，也可以是具有互补活性的酶供体和酶受体(酶供体和酶受体组成一个具有催化活性的全酶)；另外，该酶可以是天然酶或人工酶，人工酶是可以通过基因工程的方法对以上全酶或酶片段进行改造，以改变其活力、特异性，来对本检测方法的灵敏度、线性范围、检测特异性、稳定性等性能进行优化。
当所述酶为全酶时，将所述适配体连接到所述全酶上，得到步骤S01中的所述适配体-酶复合物，然后进行酶促反应。当然，当所述酶是具有互补活性的酶供体和酶受体时，适配体可单独连接在酶供体或酶受体上，后续再进行均相检测，以上三种情况都可以取得本发明的效果，都在本发明的保护范围内。具体地，适配体单独连接在酶供体或酶受体上的两种情况如下：
一种均相检测方法，包括如下步骤：
S011：提供适配体和酶，所述适配体可特异性识别待测物，所述酶包括具有互补活性的酶供体和酶受体，将所述适配体连接到所述酶供体上，得适配体-酶供体复合物；
S012：配置不同浓度的待测物标准溶液，将所述适配体-酶供体复合物、所述酶受体和所述酶作用的底物加入到所述待测物标准溶液中进行酶促反应，测得酶促反应信号，获取酶促反应信号与待测物含量的方程；
S013：将所述适配体-酶供体复合物、所述酶受体和所述底物加入到含有所述待测物的样品溶液中进行酶促反应，测得酶促反应信号，根据所述方程计算所述样品溶液中的待测物含量。
一种均相检测方法，包括如下步骤：
S021：提供适配体和酶，所述适配体可特异性识别待测物，所述酶包括具有互补活性的酶供体和酶受体，将所述适配体连接到所述酶受体上，得适配体-酶受体复合物；
S022：配置不同浓度的待测物标准溶液，将所述适配体-酶受体复合物、所述酶供体和所述酶作用的底物加入到所述待测物标准溶液中进行酶促反应，测得酶促反应信号，获取酶促反应信号与待测物含量的方程；
S023：将所述适配体-酶受体复合物、所述酶供体和所述底物加入到含有所述待测物的样品溶液中进行酶促反应，测得酶促反应信号，根据所述方程计算所述样品溶液中的待测物含量。
具体地，在步骤S011中，所述适配体连接到所述酶供体上时，步骤S012或S013中的适配体-酶供体复合物和酶受体在反应液中结合，就形成了S01中的适配体-酶复合物。同理，在步骤S021中，所述适配体连接到所述酶受体上时，步骤S022或S023中的适配体-酶受体复合物和酶供体在反应液中结合，就形成了S01中的适配体-酶复合物。
进一步地，在上述均相检测方法中，所述适配体包括核酸适配体、多肽适配体和肽核酸适配体中的至少一种。优选地，适配体分子量一般小于10kDa，本发明实施例中，优选适配体分子量小于3kDa，该范围内适配体性能最佳。在一具体实施例中，适配体为多肽适配体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示：EWACNDRGFNCQLQR。更进一步优选地，上述适配体为修饰的适配体，修饰方式包括环化修饰(如形成分子内二硫键)、甲基化修饰和磷酸化修饰中的至少一种。将适配体进行修饰，可以进一步以提高适配体的稳定性、亲和力或特异性。当然，如果是待测物的拮抗小分子或其衍生物，也具有适配体的相同功能，也属于本发明实施例中的适配体范围内。
进一步地，在上述均相检测方法中，所述待测物包括蛋白质、脂质体、激素、核酸、病毒、细菌、真菌、细胞和组织中的至少一种；即本方面实施例的均相检测方法可检测各种生物大分子、细胞体或组织，优选地，待测物的分子量一般大于10kDa，分子量越大，检测灵敏度越高，进一步优选待测物为分子量大于50kDa的物质，其检测灵敏度更佳。
进一步地，在上述均相检测方法中，所述酶包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-半乳糖苷酶、过氧化物酶、荧光素酶、碱性磷酸酶和荧光蛋白(如绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白等)中的至少一种，但不限于以上几种。所述酶作用的底物为显色底物、发光底物和荧光底物中的任意一种，具体可以根据不同灵敏度、线性范围等要求从中选择合适的底物。而酶促反应信号可为比色信号、发光信号和荧光信号中的任意一种。在本发明实施例中，优选β-半乳糖苷酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，对应的底物分别为邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷和葡萄糖-6-磷酸，同时，将β-半乳糖苷酶分为ED片段和EA片段，ED片段和适配体融合表达，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶作为全酶与适配体连接。
进一步地，在上述均相检测方法中，所述酶连接所述适配体的方式为化学偶联、亲和吸附(如生物素-亲和素连接)和基因融合表达中的任意一种。适配体、酶或酶的片段可以通过化学合成或基因表达获得，优选基因融合表达方式将酶连接适配体，更进一步优选地，所述酶可通过连接肽与所述适配体相连，即可以在适配体与全酶或酶片段之间添加一段连接肽进行连接，该连接肽可以使适配体与全酶或酶片段保持其独立的生物学属性。在本发明一实施例中，ED-CA融合蛋白即为将β-半乳糖苷酶的ED片段与识别C-反应蛋白的适配体融合表达，两者中间增加一段连接肽(序列为：GGGGS)。
进一步地，在上述均相检测方法中，所述酶连接有一种或多种所述适配体。即所述酶可以连接针对同一待测物的一株或多株所述适配体，实现对一种待测物的检测，采用一株或多株针对同一待测物的适配体标记的方法，在防止假阴性时具有明显的技术优势；当然，也可以选择针对不同待测物的适配体对不同的酶或酶片段进行标记，实现多重待测物的同步检测。以上方法都在本发明保护范围内，都受本发明保护。
进一步地，在上述均相检测方法中，在进行所述酶促反应的过程中，还加入了化学物质，该化学物质包括但不限于表面活性剂、环糊精、牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、氨基酸、螯合剂、核苷酸、亲水高分子、还原剂、氧化剂、防腐剂、缓冲盐、多糖、醇和金属离子中的至少一种。上述物质的加入，或可改变适配体标记的酶片段的互补活性，或改变适配体标记的酶与待测物之间的亲和性，以减少待测物类似物导致的干扰，或改善所制备试剂的稳定性、抗干扰能力等性质。
进一步地，在上述均相检测方法中，所述均相检测包括管式检测、板式检测、微流控检测和层析检测中的任意一种。同时，根据该均相检测方法中使用的试剂，可以制备成液体、干粉或者两者组合的形式的试剂盒。
另外，本发明实施例可以将酶的两个片段(酶供体片段和酶受体片段)分别替换成两个不同的、可发生荧光共振能量转移的荧光基团(供体荧光基团和受体荧光基团)，也能起到前述检测方法相同的技术效果。
具体地，该替代的均相检测方法，包括如下步骤：
E01：提供适配体、可发生荧光共振能量转移的供体荧光基团和受体荧光基团，所述适配体可特异性识别待测物；
E02：配置不同浓度的待测物标准溶液，将所述供体荧光基团和所述受体荧光基团均连接所述适配体后，加入到所述待测物标准溶液中，测得所述供体荧光基团的荧光强度，获取荧光强度与待测物含量的方程；
E03：将连接有所述适配体的供体荧光基团和连接有所述适配体的受体荧光基团加入到含有所述待测物的样品溶液中，测得所述供体荧光基团的荧光强度，根据所述方程计算所述样品溶液中的待测物含量。
荧光共振能量转移是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团(供体Donor)的发射光谱与另一个基荧光共振能量转移团(受体Acceptor)的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时(一般小于
Figure BDA0001489010070000081
)，就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即以前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光。在供体荧光基团和受体荧光基团上，分别标记一种或多种适配体，当加入待测物时，两个荧光基团上的适配体与待测物形成夹心结构，并使两个荧光基团距离拉近，发生荧光共振能量转移，根据该荧光共振能量转移信号检测荧光基团发射的荧光强度，该荧光强度与待测物浓度呈方程关系，因此，可以快速计算出待测物浓度。
进一步地，在该均相检测方法中，所述供体荧光基团和所述受体荧光基团为配对的荧光蛋白、配对的有机染料和配对的半导体量子点中的任意一种。现在市场上已经有很多商品化的荧光染料，可作为本均相检测方法中配对的两个荧光基团，包括但不限于荧光蛋白(如青色荧光蛋白与黄色荧光蛋白的配对，)、有机染料(如，GE Healthcare公司的Cyanine系列染料)、半导体量子点等。
该依据荧光共振能量转移信号的均相检测方法中，与前述依据酶促反应信号的方法相比，在适配体选择上是一样的，适配体可以包括核酸适配体、多肽适配体和肽核酸适配体中的至少一种，也可进行修饰。待测物的选择也可以是一样的，包括蛋白质、脂质体、激素、核酸、病毒、细菌、真菌、细胞和组织中的至少一种。供体荧光基团和受体荧光基团连接适配体的方式也可以是化学偶联、亲和吸附(如生物素-亲和素连接)和基因融合表达中的任意一种，当然如果是半导体量子点，则是化学偶联或亲和吸附。总之，除了不需要添加酶底物，其他步骤的选择都可以一样。
本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。
实施例1：
一种C-反应蛋白检测方法，使用的试剂和步骤如下：
实验材料：磷酸钠(购自国药)、EDTA(乙二胺四乙酸，购自国药)、ONPG(邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷，购自sigma)、吐温-20(购自国药)、防腐剂proclin-300(购自sigma)、C-反应蛋白(购自南京立顶)、ED-CA融合蛋白(本公司构建表达，序列为SEQ ID NO:2)、EA酶片段(本公司构建表达，在野生型β-半乳糖苷酶基础上敲除了11-41位氨基酸序列)。
试剂1的配制：200mM的磷酸钠，调整pH到7.3，加入5mM的EDTA、0.1％的proclin-300、1％的BSA、0.05uM的ED-CA融合蛋白。
试剂2的配制：200mM的磷酸钠，调整pH到7.3，加入5mM的EDTA、0.1％的proclin-300、1％的BSA、0.05uM的EA酶片段、0.2g/L的ONPG。
C-反应蛋白标准液：配制1mg/L、10mg/L、100mg/L、1000mg/L四个浓度梯度的标准液。
其中，ED-CA融合蛋白为将β-半乳糖苷酶的ED片段与识别C-反应蛋白的适配体(SEQ ID NO:1：EWACNDRGFNCQLQR)融合表达(ED-CA)，两者中间增加一段连接肽(序列为：GGGGS)，SEQ ID NO:2的序列如下
ITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDRPSQQLRSLNGGGGGSEWACNDRGF NCQLQR。
检测步骤：在反应容器中，先加入2ul的C-反应蛋白标准液，再加入100ul的试剂1，37℃孵育5分钟，加入100ul的试剂2，37℃下进行酶促反应，检测415nm波长下吸光度的变化，吸光度变化速度(反应度)与C-反应蛋白的浓度呈反比，以C-反应蛋白标准液的浓度与反应度建立标准曲线(即存在关系方程)。测试待测样本溶液的反应度，根据标准曲线可计算出样品溶液中的C-反应蛋白浓度。
本实施例的原理见图1：由于在ED片段上增加的适配体氨基酸很少，不影响ED-CA和EA互补形成有活力的酶，当检测环境中含有C-反应蛋白时，C-反应蛋白与ED-CA结合，由于C-反应蛋白分子量约为110kd，两者结合的空间位阻，阻碍了ED-CA与EA片段的结合，导致两者无法形成有活力的酶，C-反应蛋白浓度越高无活力的酶越多，酶促反应的信号值越低，根据酶促反应的信号值可以计算出C-反应蛋白的浓度。
实施例2：
一种C-反应蛋白检测方法，使用的试剂和步骤如下：
实验材料：TRIS(三羟甲基氨基甲烷，购自阿拉丁)、EDTA(购自国药)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(购自罗氏)、葡萄糖-6-磷酸(购自罗氏)、氧化型辅酶II(购自罗氏)、防腐剂proclin-300(购自sigma)、MES(2-吗啉乙磺酸，购自sigma)、C-反应蛋白(购自南京立顶)、EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，购自sigma)。
适配体标记葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD-CA)：配制5g/L的MES缓冲液，调整PH到6.5，加入50mg/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和2mg/L的C-反应蛋白适配体(SEQ ID NO:1：EWACNDRGFNCQLQR)，搅拌均匀后加入100mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，25℃下反应1小时，加入10g/L的BSA终止反应，使用20kd的透析袋过夜透析，去掉未反应的C-反应蛋白适配体。
试剂1的配制：200mM的TRIS缓冲液，调整pH到8.0，加入10％上述标记好的G6PD-CA、0.1％的proclin-300、1％的BSA。
试剂2的配制：纯水中加入2g/L的葡萄糖-6-磷酸、4g/L的氧化型辅酶II、0.1％的proclin-300。
C-反应蛋白标准液：配制1mg/L、10mg/L、100mg/L、1000mg/L四个浓度梯度的标准液。
检测步骤：反应容器中，先加入2ul的C-反应蛋白标准液，再加入200ul的试剂1，37℃孵育5分钟，加入50ul的试剂2，37℃下进行反应，检测340nm波长下吸光度的变化，吸光度变化速度(反应度)与C-反应蛋白的浓度呈反比，以C-反应蛋白标准液的浓度与反应度建立标准曲线(即存在关系方程)。测试待测样本溶液的反应度，根据标准曲线可以计算出样品溶液中的C-反应蛋白浓度。
本实施例的原理见图2：将识别C-反应蛋白的适配体通过偶联剂，如1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，按照一定比例，偶联到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶上，形成酶-适配体复合物(G6PD-CA)，由于适配体很小，对酶的催化活性影响很小。当检测环境中含有C-反应蛋白时，C-反应蛋白与G6PD-CA结合，由于C-反应蛋白分子量约为110kd，覆盖了酶的催化中心，导致酶活力降低，C-反应蛋白浓度越高，酶活力越低，酶促反应的信号值越低，根据酶促反应的信号值可以计算出C-反应蛋白的浓度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 深圳琅技生命科技有限公司
<120> 均相检测方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial）
<400> 1
Glu Trp Ala Cys Asn Asp Arg Gly Phe Asn Cys Gln Leu Gln Arg
1 5 10 15
<210> 2
<211> 74
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial）
<400> 2
Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Trp Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro Pro Phe Ala
20 25 30
Ser Trp Arg Asn Ser Glu Glu Ala Arg Thr Asp Arg Pro Ser Gln Gln
35 40 45
Leu Arg Ser Leu Asn Gly Gly Gly Gly Gly Ser Glu Trp Ala Cys Asn
50 55 60
Asp Arg Gly Phe Asn Cys Gln Leu Gln Arg
65 70

Claims (2)

1.一种C-反应蛋白的均相检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和多肽适配体，所述多肽适配体特异性识别C-反应蛋白，所述多肽适配体的序列为SEQ ID NO:1所示的序列；
制备葡萄糖-6-磷酸脱氢酶–多肽适配体复合物：配制5g/L的MES缓冲液，调整pH到6.5，加入50mg/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和2mg/L的所述多肽适配体，搅拌均匀后加入100mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，25℃下反应1小时，加入10g/L的BSA终止反应，使用20kd的透析袋过夜透析，去掉未反应的所述多肽适配体；
试剂1的配制：200mM的TRIS缓冲液，调整pH到8.0，加入各组分使得溶液中包含10％所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶–多肽适配体复合物、0.1％的proclin-300、1％的BSA；
试剂2的配制：纯水中包含2g/L的葡萄糖-6-磷酸、4g/L的氧化型辅酶II、0.1％的proclin-300；
C-反应蛋白标准液的配制：配制1mg/L、10mg/L、100mg/L、1000mg/L四个浓度梯度的标准液；
检测步骤：反应容器中，先加入2μl的C-反应蛋白标准液，再加入200μl的试剂1，37℃孵育5分钟，加入50μl的试剂2，37℃下进行反应，检测340nm波长下吸光度的变化，将吸光度变化速度作为反应度，所述反应度与C-反应蛋白的浓度呈反比，以C-反应蛋白标准液的浓度与反应度建立标准曲线；测试待测样本溶液的反应度，根据标准曲线计算出样品溶液中的C-反应蛋白浓度。
2.一种C-反应蛋白的均相检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供ED-CA融合蛋白和EA酶片段，所述ED-CA融合蛋白的序列为SEQ ID NO:2所示的序列，所述EA酶片段为在野生型β-半乳糖苷酶基础上敲除11-41位氨基酸序列；
试剂1的配制：200mM的磷酸钠，调整pH到7.3，加入各组分使得溶液中包含5mM的EDTA、0.1％的proclin-300、1％的BSA、0.05μM的所述ED-CA融合蛋白；
试剂2的配制：200mM的磷酸钠，调整pH到7.3，加入各组分使得溶液中包含5mM的EDTA、0.1％的proclin-300、1％的BSA、0.05μM的所述EA酶片段、0.2g/L的ONPG；
C-反应蛋白标准液的配制：配制1mg/L、10mg/L、100mg/L、1000mg/L四个浓度梯度的标准液；
检测步骤：在反应容器中，先加入2μl的C-反应蛋白标准液，再加入100μl的试剂1，37℃孵育5分钟，加入100μl的试剂2，37℃下进行酶促反应，检测415nm波长下吸光度的变化，将吸光度变化速度作为反应度，所述反应度与C-反应蛋白的浓度呈反比，以C-反应蛋白标准液的浓度与反应度建立标准曲线；测试待测样本溶液的反应度，根据标准曲线计算出样品溶液中的C-反应蛋白浓度。
CN201780001782.2A 2017-11-29 2017-11-29 均相检测方法 Active CN110100180B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2017/113570 WO2019104529A1 (zh) 2017-11-29 2017-11-29 均相检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110100180A CN110100180A (zh) 2019-08-06
CN110100180B true CN110100180B (zh) 2022-04-29

Family

ID=66663765

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780001782.2A Active CN110100180B (zh) 2017-11-29 2017-11-29 均相检测方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20200371108A1 (zh)
CN (1) CN110100180B (zh)
WO (1) WO2019104529A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113588612B (zh) * 2021-07-27 2023-08-01 中国科学院成都生物研究所 一种atp在线检测方法及设备

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4708929A (en) * 1984-10-29 1987-11-24 Microgenics Corporation Methods for protein binding enzyme complementation assays
US5604091A (en) * 1984-03-01 1997-02-18 Microgenics Corporation Methods for protein binding enzyme complementation
ATE110469T1 (de) * 1987-09-21 1994-09-15 Microgenics Corp Nichttrennender festphasen-enzymtest.
US5244785A (en) * 1991-02-01 1993-09-14 Microgenics Corporation Determination of high molecular weight analytes using a β-galactosidase complementation assay
ATE447611T1 (de) * 2003-08-18 2009-11-15 Univ California Polypeptid-display-bibliotheken und verfahren zur herstellung und verwendung davon
US7795009B2 (en) * 2005-06-15 2010-09-14 Saint Louis University Three-component biosensors for detecting macromolecules and other analytes
CN101051047A (zh) * 2006-04-04 2007-10-10 张薇 一种新颖的化学发光酶免疫分析方法
WO2009014726A1 (en) * 2007-07-26 2009-01-29 The Regents Of The University Of California Methods for enhancing bacterial cell display of proteins and peptides
JP6192638B2 (ja) * 2011-06-23 2017-09-06 ディスカヴァーエックス コーポレイション β−ガラクトシダーゼレポーターフラグメント相補性を用いるタンパク質輸送のモニタリング
CN102662057A (zh) * 2012-06-07 2012-09-12 广州易航生物科技有限公司 CEDIA ImmunoChip毒品检测试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
US20200371108A1 (en) 2020-11-26
CN110100180A (zh) 2019-08-06
WO2019104529A1 (zh) 2019-06-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101396673B1 (ko) 측정 대상 성분의 면역 측정법
EP2390663B1 (en) Reagents, kits and methods for detecting biological molecules by energy transfer from an activated chemiluminescent substrate to an energy acceptor dye
US7635598B2 (en) Inducible fluorescence assay
CN107918022B (zh) 一种cTnI检测试剂盒及其使用方法
KR20120003903A (ko) 생물학적 시료중의 물질을 검출하는 방법
JP2000508075A (ja) 発光特異的結合アッセイ
CN115469105B (zh) 一种一步法非洲猪瘟elisa抗体快速检测试剂盒
CN114594262A (zh) 基于双功能融合蛋白的真菌毒素磁化学发光免疫分析试剂盒及其应用
CN114878833A (zh) 一种检测抗过氧化物还原酶-1-IgG抗体的试剂盒
JP2002207039A (ja) Ｈｉｖプロテアーゼインヒビターの免疫測定法
CN107209177A (zh) 用于高正电荷蛋白的免疫测定法
CN110100180B (zh) 均相检测方法
CN113321715A (zh) 新型冠状病毒抗原及其检测用途
CN114324862A (zh) 一种非洲猪瘟病毒均相检测反应试剂及检测方法
WO2020014883A1 (zh) 一种特异性识别妥布霉素的单链dna适配体及其应用
CN111273033A (zh) 一种高尔基体蛋白73的测定试剂盒及其化学发光测定方法
Haugland Antibody conjugates for cell biology
KR102451039B1 (ko) 산화환원조절 단백질을 포함하는 바이오티올 검출용 조성물
US20170276675A1 (en) Identification of modulators of binding properties of antibodies reactive with a member of the insulin receptor family
CN101278194A (zh) 用于分析物检测的协同指示系统、组分以及方法
CN115060908A (zh) 检测抗丝状肌动蛋白成帽蛋白β-IgG抗体的试剂盒
JP2007225603A (ja) 試料中の測定対象物の免疫測定方法および免疫測定試薬
CN110862438B (zh) 一种复合物及其制备方法与应用
Maeda et al. Urinary carboxylesterase 5A fragment as an early diagnostic marker of cat chronic kidney disease
CN109917124A (zh) 一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant