CN114324862A - 一种非洲猪瘟病毒均相检测反应试剂及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种非洲猪瘟病毒均相检测反应试剂及检测方法，均相反应试剂盒包括试剂A、试剂B。当试样中的非洲猪瘟病毒与试剂A、试剂B种特异抗体结合形成免疫反应结合物，就将荧光供体和荧光受体形成荧光共振体，供体在激发光激发下，受体发射共振荧光。受体发射的共振荧光强度直接与试样中的非洲猪瘟病毒含量有关。该方法无需包埋、分离，可减少在除弃游离标记物的过程影响检测准确性的干扰因素，使检测的准确性和敏感性得到提高。

Description

一种非洲猪瘟病毒均相检测反应试剂及检测方法

技术领域

本发明属于均相免疫分析技术领域，尤其涉及一种非洲猪瘟病毒均相检测反应试剂及检测方法。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的猪的一种急性、烈性、高度接触性传染性疾病。ASFV形态为正二十面体，直径约200纳米，由多层物质构成：中央为内含拟核的蛋白质核壳，由内向外分别还有一层脂质包膜和蛋白质衣壳。衣壳由8280个主要的衣壳蛋白p72和60个戊蛋白构成，此外至少有三种蛋白质通过对临近蛋白的粘连来保持衣壳结构的稳定。

其临床特征主要为全身出血、呼吸系统和神经系统功能紊乱为主要特征，发病率和死亡率高，对养猪业的危害巨大。且目前尚无有效的疫苗和特效抗病毒药物可以有效的在疫情爆发时及时控制病毒的传播，主要通过检疫后扑杀来控制其爆发和流行。因此，建立科学有效的检测诊断方法对于非洲猪瘟的防范具有重要意义。

根据抗原抗体反应后是否需要将免疫结合的标记物和未免疫结合的游离标记物进行分离进行分类，将免疫分析技术分为均相免疫分析和非均相免疫分析。目前免疫分析技术金标、酶标、时间分辨荧光以及化学发光均属于非均相免疫分析方法。均相免疫分析不需要包埋、冲洗等多种除弃未免疫结合的游离标记物步骤，免除了包埋、分离繁琐的操作，更主要是可大大减少在除弃未免疫结合的游离标记物的过程中带来影响检测结果准确性的干扰因素。因此近年来，基于荧光共振能量转移原理的新建立的均相免疫分析方法，以其简捷、准确的操作和低廉的成本，受到广泛关注。

时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluoroim-munoassay，TRFIA)属于荧光免疫分析，是1979年由Soini和Hemmila首次提出，他们将稀土离子用于标记技术，很好的避免了荧光免疫分析中生物材料的自发荧光和荧光染料的易淬灭性的问题，建立了继放射免疫定量测定之后的在标记免疫分析领域具有里程碑意义的一种高灵敏免疫分析技术。

荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量共振转移给受体，使受体发射荧团之间，如果一个荧光基团(供体的发射光谱)与另一个荧光基团(受体的吸收光谱)部分有效重叠，当这两个基团间的距离满足能量交换条件时(一般小于10nm)，供体和受体之间发生能量共振能量传递，即供体在激发光激发下，电子从基态能级跃迁到高激发态，返回基态过程中，将部分激发能量传给相邻的受体，使受体发出荧光。而供体和受体的发射的荧光信号强弱直接与能产生共振的供体和受体的量相关。此方法具有优良的特异性，可消除非特异反应产生的背景荧光信号。

目前非洲猪瘟病毒检测方法较多，例如非洲猪瘟病毒酶标检测试剂，由于结合的和游离的标记物靠清洗进行分离，在清洗过程将非游离标记物也随之清洗掉，且清洗过程很容易产生不一致性，或清洗不干净，游离标记物产生背景影响，直接导致影响检测的灵敏度。

本发明与CN201711203146.6的原理和检测方法都不相同，本发明的能量共振的特异性更强，利于检测的灵敏度的提升。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供一种非洲猪瘟病毒均相检测反应试剂及试剂盒及检测方法，该检测方法采用均相时间分辨荧光技术来检测非洲猪瘟病毒，灵敏度高，特异性强，操作高效方便，无需分离游离的标记物和非游离的标记物，无需清洗，适用于现场检测，且采用些方法便于实现高通量检测。

解决以上技术问题的一种非洲猪瘟病毒均相检测试剂，其特征在于：包括有反应试剂A和反应试剂B，

所述反应试剂A由作为荧光供体的式Ⅳ所示镧系穴状化合物和偶联的捕获非洲猪瘟病毒抗体分子组成；

所述反应试剂B由作为荧光受体的别藻蓝蛋白和偶联的检测分子组成；所述检测分子为非洲猪瘟病毒抗体。

所述非洲猪瘟病毒抗体为针对非洲猪瘟病毒的任意特异抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体；所述捕获分子与所述检测分子相同或不同。

所述反应试剂B所述检测分子为非洲猪瘟病毒任意特异抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体；所述捕获分子与所述检测分子相同或不同。

其优选：所述反应试剂A以反应试剂A溶液的形式存在；其中反应所述捕获分子使用的是一株单克隆抗体，所述检测分子使用的是另一株单克隆抗体。

所述反应试剂A以反应试剂A溶液的形式存在。

所述反应试剂B以反应试剂B溶液的形式存在。

所述反应剂的一种非洲猪瘟病毒均相检测方法，其特征在于；包括如下步骤：

(1)试剂A、检测样本和试剂B需要按比例配置反应；优选：1:2:1比例进行免疫反应。

(2)试剂A、检测样本和试剂B同时反应或有序反应，优选：试剂A、检测样本先进行免疫反应，再与试剂B反应。

采用时间分辨荧光检测技术分别检测615nm和665nm中心波长的荧光检测信号。

本发明中采用0.05mg/ml的非洲猪瘟P30蛋白标准品用缓冲液至少稀释三个梯度样本，即10、100、1000倍稀释，再分别进行615nm和665nm时间分辨荧光检测，采用665nm/615nm和标准品的浓度作标准曲线。

本发明中方法对家猪、野猪进行非洲猪瘟病毒含量检测。

优化方案中所述反应试剂A中，式Ⅰ所示镧系穴状化合物和捕获分子可通过链霉亲和素-生物素系统偶联。

所述链霉亲和素-生物素系统偶联具体可通过如下步骤进行：

(1)将式Ⅰ所示镧系穴状化合物标记到链霉亲和素上，得到式Ⅱ所示镧系穴状化合物——链霉亲和素；

(2)将生物素偶联所述捕获非洲猪瘟病毒抗体，得到捕获抗体—生物素偶联物。

所述试剂A为：镧系穴状化合物-链霉亲和素中的链霉亲和素和所述捕获抗体-生物素中的生物素特异性结合，得到所述试剂A(式Ⅲ所示)。

在本发明的具体实例中，利用生物素标记试剂盒偶联捕获分子。

进一步优化方案中，所述反应试剂B中，别藻蓝蛋白和检测分子可利用别藻蓝蛋白标记试剂盒偶联检测分子。

所述非洲猪瘟病毒抗体可为针对非洲猪瘟病毒的任意抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体。

所述捕获分子与所述检测分子可相同或不同。

在本申请具体实例中，所述捕获分子使用的是一株单克隆抗体；所述检测分子使用的是另一株与所述捕获分子不同的单克隆抗体。

所述反应试剂A由作为荧光供体镧系穴状化合物和偶联的捕获分子组成；所述捕获分子为非洲猪瘟病毒抗体，如式Ⅳ所示：

所述反应试剂B由作为荧光受体的别藻蓝蛋白和偶联的检测分子组成；所述检测分子为非洲猪瘟病毒抗体。

本发明中一种非洲猪瘟病毒均相检测的反应试剂的应用，反应试剂应用在于均相检测非洲猪瘟病毒或应用于制备检测非洲猪瘟病毒的产品。

应用之一，本发明中一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，包括以上反应剂，即反应试剂A和反应试剂B。

上述试剂盒中，所述反应试剂A所述偶联具体实例中，利用生物素标记试剂盒偶联捕获分子，即链霉亲和素-生物素系统偶联，可通过如下步骤进行：

(1)将链霉亲和素标记到式Ⅰ所示镧系穴状化合物上，得到式Ⅱ所示镧系穴状化合物/链霉亲和素；

(2)将生物素偶联所述捕获抗体，得到捕获抗体/生物素(式Ⅲ)；

(3)使所述式Ⅲ所示镧系穴状化合物/链霉亲和素中的链霉亲和素和所述捕获抗体/生物素中的生物素特异性结合，得到所述试剂A(式Ⅳ)。

在本发明的具体所述反应试剂B中，别藻蓝蛋白和检测分子具体可利用别藻蓝蛋白标记试剂盒偶联检测分子。

上述的试剂盒中，所述非洲猪瘟病毒抗体可为针对非洲猪瘟病毒的任意抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体。

所述捕获分子与所述检测分子可相同或不同，在本发明中具体实例中。

进一步优化方案中，所述反应试剂A可以反应试剂A溶液的形式存在；所述反应所述捕获分子使用的是一株单克隆抗体；所述检测分子使用的是另一株单克隆抗体。试剂A溶液中非洲猪瘟单克隆抗体的浓度可为0.3mg/ml，溶剂为中性缓冲液或纯化水；

所述反应试剂B可以反应试剂B溶液的形式存在；所述反应试剂B溶液中非洲猪瘟单克隆抗体的浓度可为0.25mg/ml，溶剂为中性缓冲液或纯净水。

在本发明具体实例中，所述中性缓冲液为PBS缓冲液。

本发明中一种非洲猪瘟病毒均相检测方法，包括如下步骤：

(3)采用非洲猪瘟P30蛋白(0.05mg/ml)标准品用PBS缓冲液稀释10、100、1000稀释三个梯度样本。

(4)先取10μl试剂A、与20μl检测样本P30蛋白孵育免疫反应10min，再加10μl试剂B，混合进行孵育免疫反应20min。

(5)孵育完毕后，取30μl混合液，在自制的均相共振时间分辨荧光分析仪进行时间分615nm和665nm荧光检测。

上述的检测方法中，所述反应试剂A中，式Ⅳ所示镧系穴状化合物和捕获分子可通过链霉亲和素-生物素系统偶联。

在本发明的具体实例中，利用生物素标记试剂盒偶联捕获分子。

所述反应试剂B中，别藻蓝蛋白和检测分子具体可利用别藻蓝蛋白标记试剂盒偶联检测分子。

检测方法中所述非洲猪瘟病毒抗体可为针对非洲猪瘟病毒的任意抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体。

所述捕获分子与所述检测分子可相同或不同；在本发明具体实例中，所述捕获分子使用的是一株单克隆抗体；所述检测分子使用的是一株与所述捕获分子不是同一来源的单克隆抗体。

本发明中检测方法采用均相时间分辨荧光技术来检测非洲猪瘟病毒，灵敏度高，特异性强，操作高效方便，无需分离游离的标记物和非游离的标记物，无需清洗，适用于现场检测，且采用些方法便于实现高通量检测。

本发明中均相试剂盒包括试剂A、试剂B。当试样中的非洲猪瘟病毒与试剂A、试剂B种特异抗体结合形成免疫反应结合物，就将荧光供体和荧光受体形成荧光共振体，供体在激发光激发下，受体发射共振荧光。本发明依据穴状化合物式1的光谱特性(图2)和别藻蓝蛋白的荧光特性，采用340nm光激发，接收615nm和665nm两种荧光信号。受体发射的共振荧光强度直接与试样中的非洲猪瘟病毒含量有关。本发明中方法无需包埋、分离，可减少在除弃游离标记物的过程影响检测准确性的干扰因素，提高了检测的准确性和敏感性。

本发明中所述615nm和665nm荧光信号只与样本中非洲猪瘟病毒与试剂A、试剂B抗原抗体免疫反应结合量有关，可消除其他荧光背景的干扰，提高检测灵敏度。

附图说明

图1为荧光共振能量转移(FRET)的工作原理示意图；

图2为本发明实施例中式所示镧系穴状化合物的荧光光谱图

(其中，A为激发谱图，B为发射谱图)。

具体实施方式

本发明中采用的均相时间分辨荧光技术结合了荧光共振能量转移(FRET)和时间分辨技术(TR)，是用来检测均相体系中待测物的一种方法。

如图1所示，本发明中反应试剂A和反应试剂B分别为能量供体和不同与现有的基于镧系元素的均相免疫学检测方法，本发明针对非洲猪瘟病毒利用式Ⅰ所示镧系穴状化合物作为反应试剂A中的镧系穴状化合物，式Ⅰ所示镧系穴状化合物的荧光光谱图如图2所示。

链霉亲和素标记步骤参考了孙延文的《穴状稀土螯合剂的免疫标能量受体》，其中能量供体为长寿命荧光，受体荧光物为短寿命荧光，荧光供体的发射光经过共振转为荧光受体的激发光，使用时，将上述两种试剂与待测样本进行孵育，通过抗原抗体免疫复合反应，免疫供体和受体之间的距离很近，满足共振能量传递的条件。

链霉亲和素标记步骤参考孙延文《穴状稀土螯合剂的免疫标记技术研究》[D].吉林大学,2018。首先依次进行镧系穴状化合物和链霉亲和素的活化，将活化后的物质等比混合，充分反应后至Filtration tube中，12000×g离心10min分离得到目标产物。

实施例1

一种非洲猪瘟病毒均相检测试剂，包括有反应试剂A和反应试剂B，

反应试剂A由作为荧光供体的式Ⅰ所示镧系穴状化合物和偶联的捕获分子组成；

所述捕获分子为非洲猪瘟病毒抗体；

所述反应试剂B由作为荧光受体的别藻蓝蛋白和偶联的检测分子组成；所述检测分子为非洲猪瘟病毒抗体。

反应试剂A中，式Ⅰ所示镧系穴状化合物和捕获分子通过链霉亲和素-生物素系统偶联。

链霉亲和素-生物素系统偶联具体可通过如下步骤进行：

(1)将式Ⅰ所示镧系穴状化合物标记到链霉亲和素上，得到式Ⅱ所示镧系穴状化合物——链霉亲和素；

(2)将生物素偶联所述捕获非洲猪瘟病毒抗体，得到捕获抗体—生物素偶联物式Ⅲ；

(3)镧系穴状化合物-链霉亲和素中的链霉亲和素和所述捕获抗体-生物素中的生物素特异性结合，得到所述试剂A，式Ⅳ所示，

反应试剂B中，别藻蓝蛋白和检测分子利用别藻蓝蛋白标记试剂盒偶联检测分子。

非洲猪瘟病毒抗体可为针对非洲猪瘟病毒的任意抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体；所述捕获分子与所述检测分子相同或不同。

反应试剂A由作为荧光供体镧系穴状化合物和偶联的捕获分子组成，如式Ⅳ所示；所述捕获分子为非洲猪瘟病毒抗体：

实施例2

非洲猪瘟病毒均相检测试剂盒，包括以上实施例1中反应剂，即反应试剂A和反应试剂B。

实施例3

非洲猪瘟病毒均相检测试剂盒，包括以上实施例1中反应剂，即反应试剂A和反应试剂B。反应试剂A以反应试剂A溶液的形式存在；其中反应所述捕获分子使用的是一株单克隆抗体，所述检测分子使用的是另一株单克隆抗体；所述反应试剂B可以反应试剂B溶液的形式存在。

试剂A溶液中非洲猪瘟单克隆抗体的浓度可为0.3mg/ml，溶剂为中性缓冲液或纯化水；所述反应试剂B溶液中非洲猪瘟单克隆抗体的浓度可为0.25mg/ml，溶剂为中性缓冲液或纯净水；优化方案中，所述中性缓冲液为PBS缓冲液。

实施例3

按照生物素标记试剂盒说明书偶联捕获抗体，步骤如下：

(1)取1mg待标记的捕获抗体于Filtration tube中，并加入相应体积的LabelingBuffer至总体积为0.5mL，12,000×g离心10min。

(2)溶解NH₂-Reactive-Biotin：加入30μL DMF至NH₂-Reactive-Biotin瓶中，静置10min，待其充分溶解。

(3)立即加入13.3μL NH₂-Reactive-Biotin和适量Labeling Buffer至上述Filtration tube中，使抗体的终浓度为2mg/mL，并轻轻吹打混匀。放入37℃恒温箱中避光温育30min。

(4)12,000×g离心10min。

(5)加入适量Labeling Buffer至上述Filtration tube中，使终体积为0.5mL，并轻轻吹打混匀，12,000×g离心10min。并重复操作一次。

(6)加0.2mL Labeling Buffer至Filtration tube中，轻轻吹打。将滤芯倒转放置于另一个离心管中，6,000×g离心10min。

(7)收集离心管中的溶液，即为生物素标记的捕获抗体。

按照如下步骤通过链霉亲和素-生物素系统偶联捕获分子，将标有链霉亲和素的镧系穴状螯合剂和生物素偶联的捕获抗体，按浓度比2:1均匀混合，于37℃反应20min，得到反应试剂A。

别藻蓝蛋白标记试剂盒购自Frdbio，其货号为ARL0023k-1；

检测分子为抗非洲猪瘟病毒的另一单克隆抗体，与捕获抗体识别不同位点。

实施例4

按照别藻蓝蛋白标记试剂盒说明书偶联检测分子，步骤如下：

一、APC蛋白的活化和检测分子的修饰

1、检测分子的修饰：

(1)抗体修饰试剂(购自Frdbio，其货号为ARL0023k-1)；溶解于ddH2O配制成2mg/ml的抗体修饰试剂溶液。

(2)取待标记抗体(纯度>90％)，浓度调整到5mg/ml以上为宜，按照每毫克抗体加入5μl抗体修饰试剂溶液，轻轻混匀，在室温下搅拌反应60-90min。

(3)超滤管内芯添加标记缓冲液，通过超滤管多次离心置换溶液，去除多余抗体修饰试剂，超滤管内芯收集液为修饰抗体，并调节浓度至3mg/ml。

2、APC蛋白的活化

(1)取APC蛋白悬液4℃12,000rpm离心5min，小心吸掉上清，尽量不留残液；

(2)底部沉淀用标记缓冲液重新溶解沉淀，4℃12,000rpm离心5min，取上清蓝色溶液部分为APC蛋白溶液；

(3)将APC蛋白活化试剂(购自Frdbio，其货号为ARL0023k-1)溶解于ddH2O，配制成5mg/ml溶液，按照每毫克APC蛋白加入100ul的比例加入到APC蛋白溶液，室温避光反应2小时；

(4)反应完毕，通过超滤管离心4次，每次120，00rpm 5min，置换为标记缓冲液,以去除游离的APC蛋白活化试剂，滤芯内溶液即为活化APC蛋白。

二、活化APC蛋白与抗体偶联：

(1)活化APC蛋白浓度调整为5mg/ml；

(2)将修饰抗体与活化APC蛋白，按照质量比1:2比例(每毫克修饰抗体对应2毫克活化APC蛋白)混合，室温避光反应2小时；

(3)将封闭试剂管中加入200ul DMSO，配置成10mg/ml封闭试剂溶液；按照每毫克抗体3.4ul的体积加入步骤2)反应产物中，封闭未反应完的活性基团；

(4)标记好的抗体分装，4℃保存备用，或加入适当保护剂，-20℃保存备用。

下述实施例中所用的PBS缓冲液的pH为7.4，其配制过程如下:4.06g Na₂HPO₄·12H₂O，0.27g KH₂PO₄，0.20g KCl，加入1000mL纯化水溶解。

下述实施例中采用自制均相时间分辨荧光光谱仪在室温下分别测量615nm和665nm处的时间分辨荧光，计算面积作为测量信号。

实施例5非洲猪瘟病毒检测

按照如下步骤对非洲猪瘟病毒进行检测：

以PBS为溶剂，分别取10ul三个非洲猪瘟病毒P30梯度样本10、100、1000稀释的非洲猪瘟病毒标准溶液。与20ul试剂A和10ul试剂B混合在37℃孵育30min。

孵育完毕后采用自制的均相共振荧光免疫分析仪分别检测受体615nm和665nm处的荧光信号，供体荧光由于共振将部分荧光能量传递给受体，使供体荧光有些减弱(很微弱，视为稳定值)，受体荧光由于结合物增加，共振能量增加，随之受体荧光增加。经665nm/615nn运算，制作非洲猪瘟病毒P30浓度与荧光的标准曲线。非洲猪瘟病毒P30浓度与非洲猪瘟病毒的含量成正比，依据制定的非洲猪瘟病毒P30浓度与荧光的标准曲线和检测方法，即可检测家猪和野猪的非洲猪瘟病毒的含量。

该方法检测操作简单、特异性好，试剂盒的试剂组分为试剂A、试剂B和缓冲液(或稀释液)，无需清洗分离检测样品，极利于实现大通量的检测。

通过检测得到荧光值表明：随着检测样本增加，上述实施/试验例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种非洲猪瘟病毒均相检测试剂，其特征在于：包括有反应试剂A和反应试剂B，

所述反应试剂A由作为荧光供体的式Ⅳ所示镧系穴状化合物和偶联的捕获非洲猪瘟病毒抗体分子组成；

所述反应试剂B由作为荧光受体的别藻蓝蛋白和偶联的检测分子组成；所述检测分子为非洲猪瘟病毒抗体。

2.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒均相检测试剂，其特征在于：所述非洲猪瘟病毒抗体为针对非洲猪瘟病毒的任意特异抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体；所述捕获分子与所述检测分子相同或不同。

3.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒均相检测试剂，其特征在于：所述反应试剂B所述检测分子为非洲猪瘟病毒任意特异抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体；所述捕获分子与所述检测分子相同或不同。

4.根据权利要求1所述，其优选：所述反应试剂A以反应试剂A溶液的形式存在；其中反应所述捕获分子使用的是一株单克隆抗体，所述检测分子使用的是另一株单克隆抗体。

5.根据权利要求2所述，所述反应试剂A以反应试剂A溶液的形式存在。

6.根据权利要求1所述，所述反应试剂B以反应试剂B溶液的形式存在。

7.根据权利要求1所述反应剂的一种非洲猪瘟病毒均相检测方法，其特征在于；包括如下步骤：

(1)试剂A、检测样本和试剂B需要按比例配置反应；优选：1:2:1比例进行免疫反应。

(2)试剂A、检测样本和试剂B同时反应或有序反应，优选：试剂A、检测样本先进行免疫反应，再与试剂B反应。

8.根据权利要求7所述一种非洲猪瘟病毒均相检测方法，其特征在于：采用时间分辨荧光检测技术分别检测615nm和665nm中心波长的荧光检测信号。

9.根据权利要求8所述，采用0.05mg/ml的非洲猪瘟P30蛋白标准品用缓冲液至少稀释三个梯度样本，即10、100、1000倍稀释，再分别进行615nm和665nm时间分辨荧光检测，采用665nm/615nm和标准品的浓度作标准曲线。

10.根据权利要求7要求，对家猪、野猪进行非洲猪瘟病毒含量检测。

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