CN111855626B - 一种时间分辨荧光共振能量转移体系及其应用 - Google Patents

一种时间分辨荧光共振能量转移体系及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种时间分辨荧光共振能量转移体系及其应用，该体系利用带对称羧基和对称氨基的极性稀土配合物荧光分子作为长寿命荧光供体；高摩尔消光系数、高荧光量子产率的有机荧光小分子作为长寿命荧光受体，构成时间分辨荧光共振能量转移探针配对。长寿命荧光供体是笼状稀土铕配合物，带有负电荷衍生基团；受体分子是一种具备高摩尔消光系数和高荧光量子产率的有机荧光染料，其摩尔消光系数大于等于250,000cm‑1M‑1，荧光量子产率≥28％。受体分子为Alexa Fluor647或者Dylight650。该体系用于核酸检测、免疫检测，实现高灵敏均相检测。

Description

一种时间分辨荧光共振能量转移体系及其应用
技术领域
本发明涉及一种时间分辨荧光共振能量转移体系及应用，属于免疫分析领域。
背景技术
半个多世纪以来，主流的免疫检测技术历经放射免疫分析、酶联免疫分析、化学发光免疫分析等阶段，放射免疫分析由于放射性问题目前用量已经很少，酶联免疫分析由于检测时间长正逐渐被替代，化学发光免疫分析是目前的主流免疫分析技术。在急诊等即时检测领域，化学发光由于技术复杂和成本高而难以广泛运用，这些需求催生了即时检测类免疫检测技术，如胶体金免疫分析、荧光层析免疫分析、胶体比浊免疫分析等，但是即时检测免疫分析技术存在精度差的共同问题，仅能作为辅助初筛检测手段，最终还需要化学发光免疫分析来确认。化学发光免疫分析技术诞生于上世纪七十年代，采用的主流技术是磁微粒化学发光，其核心假设在于“通过磁分离一定可以实现特异性免疫复合物和生物基质的分离”，但在临床实际应用中，由于临床标本的多样性，不可避免出现磁分离失效的案例，例如纤维蛋白黏连引起非特异性吸附导致的“跳值”现象，以及异嗜性抗体导致的假阳性等。对仪器自身而言，一半的故障是磁清洗故障引起的。因此免清洗的免疫分析技术近二三十年一直是研究热点，西门子、贝克曼等公司都有相关技术储备，国内企业北京科美生物公司基于西门子专利光激化学发光技术推出一系列高通量免疫分析系统，首次实现了免清洗检测在临床的应用，这一技术存在的问题在于发射光在不同样本中透过率存在较大差异，当检测溶血、高血脂样本时准确度较差。
时间分辨荧光共振能量转移免疫分析技术(time-resolved FRET,TR-FRET)，最早由德国勃拉姆斯(brahms)公司基于法国诺贝尔化学奖得主Jean-Marie Lehn发现的超分子稀土穴醚探针开发而成，克服了均相检测中由于溶血、高血脂、黄疸等样本异常对准确度的影响。与其他免疫检测技术相比具有众多优势，该技术无需固相载体与固相探针，精密度和准确度好，操作简单，易于自动化和微型化等等。
时间分辨荧光共振能量转移方法的核心是两个荧光分子，分别叫供体和受体，其中供体可以吸收激发光，自身可以发出荧光，也可以通过荧光共振能量转移方式传递给受体，由受体发出荧光。只有两种荧光分子很好配合，发生免疫反应时，才能产生明显的信号。
具体而言，其是利用具有穴状结构的稀土元素的螯合标记物作为荧光供体，以及与荧光供体具有良好光谱重叠的短寿命荧光分子作为荧光受体，在稀土元素穴状化合物的供体与受体(第二荧光标记物)之间发生荧光共振能量转移(FRET)。在荧光共振能量转移中，受体发射荧光的寿命接近供体的发射荧光的寿命。因为供体荧光衰减周期较长，所以供体会诱导受体长时间地发射荧光，受体激发后产生的荧光便能持续较长时间，这样通过时间分辨就可以区分那些短寿命的自身散射的荧光，这样从短寿命荧光背景中就很容易区分出FRET信号。
具体原理是：如图1所示，当生色团被光照射时，被照射激发的分子可以通过散发能量来返回到基态。光能可被生色团在10-15秒内吸收而在10-9秒内再发射出来。然而，也有可能被激发分子并不发光而将能量传递给别的生色团或是另外的荧光素，这些荧光素可以在相同的时间量级内发荧光，这后一种现象称为荧光共振能量转移(FluorescenceResonance Energy Transfer,FRET)。FRET是通过分子间的电偶极相互作用将供体激发态能量转移给受体激发态的过程，是一种非辐射跃迁。当FRET发生时，供体的荧光减弱而受体的荧光增强。荧光素在激发态的寿命是10-9秒，在发射荧光、非辐射性发射和将激发能传递给周围的介质三者之间存在竞争。如果荧光能量转移发生，激发态能就会从供体传递给受体，荧光光子由受体发出。
因此，FRET发生的基本条件是：(1)供体和受体的距离必须达到一定的数量级(2-10nm)；(2)受体的吸收光谱必须与供体的发射光谱相重叠；(3)供体和受体能量转移偶极子的方向必须近似地平行。只有当两个分子间距离满足FRET发生基本条件时，光源(闪烁氙灯或者激光或者脉冲LED)激发的供体会将能量转移给受体，从而发出特定波长的荧光。由于以上光谱特性，不需要物理分离未结合分子，即可检测到表明“供体-受体复合物”形成的特异性FRET信号。真正的均相检测不需要任何诸如离心、清洗、过滤、层析或者磁分离之类的分离步骤。
荧光供体和受体可以共价连接到不同的配对分子上，例如，蛋白二聚体、DNA互补链、抗原和抗体、配体和受体等。传统的FRET荧光化合物容易受到样品(血清、血浆、缓冲液、蛋白质、化学物质和细胞裂解液)背景荧光干扰。这种背景荧光的寿命极短(10-9秒量级)，很容易通过时间分辨的方法去除这种干扰。时间分辨荧光共振能量转移(time-resolvedFRET,TR-FRET)技术结合了FRET技术和时间分辨荧光测量，去除了极短寿命的背景荧光。瞬时的光激发后，延迟50-150微秒后非特异性短寿命发射光降为零。而TR-FRET荧光团发出长寿命荧光参与FRET过程。因此长寿命受体发射光代表了分子结合时的能量转移。
分子邻位特性决定了只有当供体和受体的距离足够小时才会发生FRET效应。Forster半径(Forster’s radius)R0为FRET效率为50％时供受体之间的距离，是FRET系统的特征参数。均相时间分辨荧光免疫分析(Homogenous Time-Resolved FluorescenceImmunoassay,HTR-FIA)的R0为7-9.5nm，基于具有镧系元素的供体与高效受体之间的荧光共振能量转移。在FRET中，高效受体发射荧光的寿命等同于镧系元素供体发射荧光的寿命。
目前临床应用的均相时间分辨荧光配对主要由法国cisbio公司提供的，被德国brahms公司用于临床。brahms公司采用的两种荧光分子分别是：
供体是小分子的Eu-TBP，是一种元素铕的三联吡啶笼状分子，见图2。
受体是大分子荧光蛋白，别藻蓝蛋白APC的一种，商品名XL665。
有关技术文献有：
文献1.Rare Earth Cryptates and Homogeneous Fluoroimmunoassays withHuman Sera,CLIN.CHEM.39/9,1953-1959(1993)
文献2.US PATENT 5,512,493
XL665存在的主要问题是分子量大，空间结构位阻大，导致反应速度慢；XL665同时也会发出620纳米荧光，与供体有重叠。
均相时间分辨荧光免疫分析技术应用于临床，还需要解决一系列干扰问题，两种荧光分子的发射波长应当不受临床标本的影响，目前满足临床需求的检测波长主要有620nm和665nm，其中检测波长为620nm的探针，主要是稀土荧光探针，作为荧光共振能量转移的供体，检测波长为665nm的探针，可以是小分子荧光探针和大分子荧光蛋白，作为荧光共振能量转移的受体。
发明内容
为了克服传统的荧光共振能量转移，采用的荧光分子寿命都很短，因此检测灵敏度比较差的问题，本发明提供一种时间分辨荧光共振能量转移体系，利用了时间分辨的高灵敏度和荧光共振能量转移的高特异性，从而实现高灵敏均相检测。
为解决上述技术问题，本发明是这样实现的：
激发光照射，分子吸收特定频率的光子后电子能级到达激发态S1(图3)，激发态电子不稳定经过振动弛豫和系间窜跃能级降到最低振动能级(D mission level)，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量。
这一过程总的荧光量子产率为φT＝φ1×φ2×φ3。
最后一步分子(图4)，从最低振动能级返回基态，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量。这一过程的辐射转化效率：
Figure BDA0002559958980000041
其中kR表示辐射跃迁效率，kNR表示非辐射跃迁效率，两者的总和为kD。
对于FRET情形，转移效率如下表示：
Figure BDA0002559958980000042
通常，转移效率kT与总量子产率φT有关。
kT＝k0(r/R0)-6
其中r表示供体和受体之间距离，R0表示转移效率为50％时供体受体之间距离。R0与受体的荧光量子产率QD有关，由下列公式计算：
Figure BDA0002559958980000043
к2表示偶极子方向因子(范围从0-4；当供体和受体的排列是随机时к2＝2/3)，QYD表示在没有受体时供体的量子产量，n表示折射系数，J(λ)表示光谱重叠积分
J(λ)＝∫∈A(λ)·FD(λ)·λ4dλcm3M-1
其中：∈A表示受体淬灭系数，FD表示总荧光强度中供体荧光强度部分。
时间分辨荧光共振能量转移的测量信号，是一种无量纲数值，由受体荧光强度与供体荧光强度比值计算得到，因此测量信号S可用公式近似表示：
Figure BDA0002559958980000044
其中E为能量转移效率，φA表示受体的量子产率，φ3为供体的辐射转化效率。
各参数计算公式如下：
Figure BDA0002559958980000045
Figure BDA0002559958980000046
kT＝k0JR-6K
其中E，kT，kR和kD定义如前所述，J表示光谱重叠积分，R是测试时供受体之间距离，K＝n-4×5.87×1023，n为介质的折射率，其中R的单位为
Figure BDA0002559958980000047
J的单位为cm3M-1。
因此E可以用如下公式表示：
Figure BDA0002559958980000051
时间分辨荧光共振能量转移的测量信号S可如下表示：
Figure BDA0002559958980000052
基于以上理论分析，可知，brahms公司采用的技术路线是采用φA数值大的荧光受体增强信号，XL665具有较高量子产率，φA更大。在推导的公式中，由于参数φ3的数值不大，因此信号对配对分子距离R十分敏感。
基于以上理论分析，本发明提供一种时间分辨荧光共振能量转移体系，在保证φA数值一定时，可以使其距离R尽可能缩短的方案，从而使检测系统具有较明显的信号和灵敏度。
能量供体和受体对之间发生有效能量转移的条件是苛刻的，主要包括：(1)能量供体的发射光谱与能量受体的吸收光谱必须重叠；(2)能量供体与能量受体的荧光生色团必须以适当的方式排列；(3)能量供体、能量受体之间必须足够接近，这样发生能量转移的几率才会高。此外，对于合适的供体、受体分子在量子产率、消光系数、水溶性、抗干扰能力等方面还有众多的要求。特别的，对于临床检测而言，还需考虑信号特异性、抗干扰能力、灵敏度等各种因素。可见，要找到一个合适的供体-受体配对是很不容易的。
本发明提供的时间分辨荧光共振能量转移体系，采用供体-受体荧光分子配对，且两种荧光分子的分子量都较小，可以使荧光发色团在空间上可以尽可能接近。因为距离尽可能的短，从而实现最优检测效果。
通过将两种荧光分子，分别标记不同的单克隆抗体，通过两两交叉配对，检测不同浓度的待测抗原，从中筛选具备较高分析性能的荧光标记抗体配对。
临床应用中均相时间分辨荧光免疫分析通常采用的两个检测波长分别是620nm和665nm，在本发明中，发明人将665nm和620nm的荧光强度的比值，作为本发明信号强度的绝对值，与免疫反应进行程度相关，建立与待测物的浓度关系的曲线。
通过测定一系列已知浓度样本的信号强度的绝对值，通过线性拟合、四参数拟合可建立浓度与两种测量值之间关系的拟合曲线，检测未知样本时，通过拟合曲线可分别计算检测物质的浓度。
具体而言，本发明利用带对称羧基和对称氨基的极性稀土配合物荧光分子作为长寿命荧光供体(记载在申请号为CN201610802501，名称为-一种镧系金属穴醚配合物及其制备方法与用途的专利申请文件中)；利用高摩尔消光系数、高荧光量子产率的有机荧光小分子作为短寿命荧光受体(市售商品)，构成时间分辨荧光共振能量转移探针配对，降低空间位阻，提高能量转移效率，提高敏感性，用于临床检测。
其中，荧光供体是笼状稀土铕配合物，带有负电荷衍生基团，增强分子极性，且对称结构容易合成，并且其光谱特性更适合，与其他结构相比具有更高的摩尔消光系数，激发波长红移易于激发。结构见图6：
为方便标记，氨基引入马来酰亚胺和琥珀酰亚胺。
加入氟离子，与Eu3+形成配位，一方面增强偶极矩，另一方面改善荧光。
氟离子在反应体系中终浓度10-900mM，优选的50-600mM，更优选350-450mM。
为与供体分子更好搭配，通过筛选确定荧光受体是有机荧光小分子，分子量小于1500。受体分子是一种具备较高摩尔消光系数和较高荧光量子产率的有机荧光染料，其摩尔消光系数大于等于250,000cm-1M-1，荧光量子产率大于等于28％。
优选的商品化受体分子包括Alexa Fluor647(图5)和Dylight 650。
检测时，激发波长采用中心波长约320nm，检测波长采用中心波长约620nm和665nm。分别采集两种波长荧光强度后，通过比值计算出特异性信号，利用信号与浓度关系计算未知样品浓度。
本发明时间分辨荧光共振能量转移体系用于核酸检测、免疫检测的用途，因探针对缩短距离，信号进一步改善。
附图说明
图1是荧光共振能量转移(FRET)的工作原理示意图。
图2是brahms公司的供体—小分子的Eu-TBP的分子结构图。
图3激发光照射，分子吸收特定频率的光子后能级跃迁示意图。
图4分子从最低振动能级返回基态示意图。
图5是受体分子Alexa Fluor647的分子式。
图6是荧光供体的分子式。
图7是实施例3，根据表1的数据，在浓度与信号正相关的范围内，采用四参数进行拟合，生成的校准曲线。
图8是实施例3的对比例，根据表1的数据，在浓度与信号正相关的范围内，采用四参数进行拟合，生成的校准曲线。
图9是实施例4，根据表1的数据，在浓度与信号正相关的范围内，采用四参数进行拟合，生成的校准曲线。
图10是实施例4的对比例，根据表1的数据，在浓度与信号正相关的范围内，采用四参数进行拟合，生成的校准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的详细说明。
以下实施例所采用的荧光供体记载在申请号为CN201610802501，名称为-一种镧系金属穴醚配合物及其制备方法与用途的专利申请文件中。
以下实施例采用的仪器是具有多波长时间分辨荧光，检测功能的仪器，进行测定，例如帝肯的多功能酶标仪f200，也可采用具备全自动加样功能的测量仪器。
以下实施例的测量程序：检测体系包括待测样本反应试剂r1和反应试剂r2组成，两种试剂分别标记荧光供体和荧光受体，其中，荧光供体可发出长寿命的620nm荧光，荧光受体本身只发出短寿命荧光，但是当接供体能量时也可发出长寿命的荧光，只有当形成免疫复合物这一荧光共振能量转移过程才能发生。
混合温育方案是：AFP项目：将2.5uL样品和各9uL测定试剂r1和r2,混合，温育9分钟；PCT项目：将9.5uL样品和各6.5uL测定试剂r1和r2,混合，温育15分钟。
信号测量：采用时间分辨测量仪器分别测量620nm和666nm的时间分辨荧光，计算比值作为计算用测量信号。
生成校准曲线：分别利用测量信号与浓度的浓度的关系，可以建立校准曲线，在浓度与信号正相关的范围内，采用四参数进行拟合，生成校准曲线。
抗体稀释缓冲液：HEPES 2.38g，KF 4.65g,BSA 0.4g,proclin-300 0.1ml，吐温200.1ml，水200ml。
实施例1：供体标记抗体
采用双功能偶联剂，通过连接游离氨基，将供体与抗体偶联。
通过对标记抗体进行系列稀释，通过正交试验或者棋盘滴定法可进一步优化其使用浓度，在本案中抗体使用浓度约为2nM，稀释即得到试剂r1。
实施例2：受体标记抗体
经市售购得Alexa Fluor647(Thermofisher)，按照说明书操作，完成受体标记。
通过对标记抗体进行系列稀释，通过正交试验或者棋盘滴定法可进一步优化其使用浓度，在本案中抗体使用浓度约为20nM，稀释即得到试剂r2。
实施例3：甲胎蛋白(AFP)检测
分别利用测量信号值与浓度的关系，如表1所示：所述的信号值是665nm和620nm的荧光强度比值。
表1
序号 浓度值 对比例 浓度值 实施例信号值
1 0.665 445 0.58 146
2 1.33 492 1.17 156
3 4.64 464 2.34 185
4 18.92 668 9.37 346
5 99.36 1403 37.5 999
6 190.2 1917 150 3271
7 387.3 2793 300 5992
8 528.5 3054 600 8902
9 647.6 3604 850 9877
10 801.2 4024
根据表1的数据，在浓度与信号正相关的范围内，采用四参数进行拟合，生成本申请校准曲线，如图7所示。
检测未知样品时，通过测定反应的信号值，代入定标曲线，即可出计算未知样品的浓度。
对比例为采用XL665标记抗体，分别与本发明供体K标记抗体组合，检测AFP，所得信号及定标曲线如上表1和图8中所示。
可见本发明的技术方案，信号与浓度倍比关系更明显，本底信号(0值样品)更低，有助于提升检测精密度和灵敏度。
实施例4：降钙素原(PCT)检测
分别利用测量信号与浓度的浓度的关系，如表2所示：
表2
序号 浓度值 对比例 浓度值 实施例信号值
1 0.024 387 0 131.3
2 0.085 389 0.1 145.5
3 0.184 412 0.2 157.5
4 0.341 415 0.5 193
5 1.21 504 2 362.5
6 2.37 595 10 1316
7 11.88 1320 50 6404.3
8 25.43 1944 100 9587.5
9 39.73 2290
10 61.91 2475
分别利用测量信号与浓度的浓度的关系，可以建立定标曲线(图9)。
在浓度与信号正相关的范围内，检测未知样品的信号值，利用定标曲线，即可计算未知样品浓度。
对比例为采用XL665标记抗体(标准曲线见图10)，与本发明供体K标记抗体组合，检测PCT所得信号，可见本发明的技术方案，所得信号更优，信号与浓度倍比关系更明显，本底信号(0值样品)更低，有助于提升检测精密度和灵敏度。
上述具体实施方式不以任何形式限制本发明的技术方案，凡是采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案均落在本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种时间分辨荧光共振能量转移体系，其特征在于：
利用带对称羧基和对称氨基的极性稀土配合物荧光分子作为长寿命荧光供体；
高摩尔消光系数、高荧光量子产率的有机荧光小分子作为长寿命荧光受体，构成时间分辨荧光共振能量转移探针配对；
所述的长寿命荧光供体是笼状稀土铕配合物，带有负电荷衍生基团；为方便标记，氨基引入马来酰亚胺和琥珀酰亚胺；加入氟离子，与Eu3+形成配位，增强偶极矩、改善荧光；氟离子在反应体系中终浓度350-450mM；
受体分子为Alexa Fluor647或者Dylight 650。
2.权利要求1所述的时间分辨荧光共振能量转移体系用于核酸检测、免疫检测的用途应用，是将荧光供体、荧光受体，分别标记不同的单克隆抗体，通过两两交叉配对，检测不同浓度的待测抗原，从中筛选具备较高分析性能的荧光标记抗体配对；
检测时，激发波长采用中心波长320nm，检测波长采用中心波长620nm和666nm，以665nm和620nm的荧光强度比值，作为信号强度的绝对值，测定一系列已知浓度样本的信号强度的绝对值，通过线性拟合、四参数拟合，建立与待测物的浓度的标准曲线；检测未知样本的信号强度的绝对值，通过标准曲线，获得未知样本的浓度。
CN202010603408.3A 2020-06-29 2020-06-29 一种时间分辨荧光共振能量转移体系及其应用 Active CN111855626B (zh)

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