CN1201150C

CN1201150C - 一种组合物,化学发光体系及其应用

Info

Publication number: CN1201150C
Application number: CN95194681.1A
Authority: CN
Inventors: 乔治·W·卡特西罗米特斯
Original assignee: Georgew Katsilometes
Current assignee: Georgew Katsilometes
Priority date: 1994-06-24
Filing date: 1995-06-22
Publication date: 2005-05-11
Anticipated expiration: 2015-06-22
Also published as: EP0766825A4; HK1001416A1; KR100382399B1; CN1155931A; US5866335A; EP0766825B1; JPH10502346A; DE69535764D1; WO1996000392A1; EP0766825A1; ATE397214T1; JP3989537B2; JP2006292771A

Abstract

本发明公开10，10′-取代的-9，9′-双吖啶分子及其衍生物的合成。这些分子已被证明在pH约10.0-约14.0的信号溶液的存在下通过化学发光可催化光的产生，在产生化学发光信号有效的浓度下，它具有螯合剂、亚砜、还原糖、氧化剂或氧化剂组合物、醇以及四硼酸钠水溶液。这些10，10′-取代的-9，9′-双吖啶可单独或接合到半抗原或大分子上使用并可在化学发光，同种或异种测定的制剂中作为标记使用。它们还可与其它的化学发光标记分子结合使用以产生多种分析物的化学发光测定。

Description

一种组合物、化学发光体系及其应用

技术领域

本发明涉及新型的10，10′-取代的-9，9′-双吖啶鎓(biacridinium)衍生物的合成，用于由这些新分子生产光的新型化学溶液的制备，以及这些分子在发光反应和测定中的用途。更准确地说，本发明描述了合成10，10′-对-甲苯甲酸-9，9′-双吖啶的N-羟基丁二酰亚胺衍生物并证实这种新分子与其它分子如抗体共价结合的能力以及由这种结合的化学发光标记分子产生可测量光的能力。本发明进一步涉及一种在四硼酸钠水溶液中含有至少一种氧化剂、亚砜、螯合剂、还原糖、和醇的发光信号溶液，以在化学测定、核酸测定以及免疫测定中产生有用的高效率光子发射。

发明背景

在各种介质中检测有无物质存在或测定物质浓度中使用光能测量正成为一种非常有吸引力的方法。现已有许多生物发光和化学发光的反应体系(Schroeder，et al.，Methods in Enzymology 17：24-462(1978)；Zeigler，M.M，和T.O.Baldwin，Current Topics In Bioenergetics，D.Rao Sanadi ed.，(AcademicPress)pp.65-113(1981)；Deluca，M.，Non-Radiometric Assays：Technologyand Application in Polypeptide and Steroid Hormone Detection，(Alan R.Liss，Inc.)pp.47-60和61-77(1988)；DeJong，G.J.，和P.J.M.Kwakman，J.ofChromatography 492：319-343(1989)；McCapra，F.等，J.Biolumin.Chemilumin.4：51-58(1989)；Diamandis，E.P.，Clin.Biochem.23：437-443(1990)；Gillevet，P.M.，Nature 348：657-658(1990)；Kricka，L.J.，Amer.Clin Lab.，Nov/Dec：30-32(1990)。

发光是借助于包括光激发或化学反应的任何手段而产生光。化学发光是仅通过化学反应而发射光。它还可定义为在返回到化学反应电子激发产物的基态过程中发射的光(Woodhead，J.S.等，Complementary Immuno-assays.W.P.Collins ed.，(John Wiley & Sons Ltd.)，pp.181-191(1988))。化学发光反应可分成酶媒介的反应和非酶催反应。一些时候以来已知发光反在氧化还原酶的酶类(辣根过氧化物酶、黄嘌呤氧化酶、葡糖氧化酶)、H₂O₂、某些无机金属离子催化剂或分子(铁、锰、铜、锌)、以及螯合剂存在下，在中性-碱性条件中(pH 7.0-10.2)可以被氧化，还知道这种氧化作用可导致产生受激中间产物(3-氨基苯二甲酸)，它在衰变返回基态时发光(Schroeder，H.R.等，Anal.Chem.48：1933-1937(1976)；Simpson，J.S.A.等。Nature279：646-647(1979)；Baret，A.，U.S.Patent No，4,933,276))。其它用于引起发光的特异性分子和衍生物除鲁米诺以外包括环状二酰基酰肼(例如异鲁米诺(isoluminols))、双环氧丙烷(dioxetane)衍生物、吖啶衍生物以及过氧氧化物(peroxyoxylates)(Messeri，G.等，J.Biolum.Chemilum.4；154-158(1989)；Schaap.A.P.等，Tetrahedron Lett.28：935-938(1987)；Givens，R.S等.ACSSymposium Series 383；Luminescence Applications，M.C.Goldberg ed.，(Amer.Chem.Soc.，Wash.D.C.，pp.127-154(1989))。能发光并已被用于分子的超灵敏测量中的另外分子是多环的和还原硝基多环芳族烃、多环芳族胺、荧光胺(fluorescamine)标记的儿萘酚胺、以及其它荧光衍生的制剂如香豆素、茚三酮、O-苯二醛、7-氟-4-硝基苯基-2，1，3-噁二唑、萘-2，3-二羧醛(dicarboxaldehydes)、氰苯基[f]异吲哚(isoindoles)以及丹磺酰氯(Simons，S.S.，Jr.and D.F.Johnson，J.Am.Chem.Soc.98：7098-7099(1976)；Roth，M.，Anal.Chem.43：880-882(1971)；Dunges.W.，同上，49；442-445(1977)；Hill，DW.等，同上，51：338-1341(1979)；Lindroth，P.and K.Mopper，同上，51：1667-1674(1979)；Sigvardson，K.W.and J.W.Birks，同上，55：432-435(1983)；Sigvardson，K.W.et al.，同上，56：1096-1102(1984)；de Montigny，P.et al.，同上，59：1096-1101(1987)；Grayeski，M.L.and J.K.DeVasto，ibid，59：1203-1206(1987)：Rubinstein，M.et al，Anal.Biochem.95：117-121(1979)；Kobayashi.S-I.，et al.，同上，112：99-104(1981)；Watanabe，Y.和K.Imai，同上，116：471-472(1981)；Tsuchiya，H.，J.Chromatog.231：247-254(1982)；DeJong.C.等，同上，241：345-359(1982)；Miyaguchi，K等，同上，303：173-176(1984)；Sigvardson，K.W.和J.W.Birks，同上，316：507-508(1984)；Benson，J.R和P.E.Hare，Proc.Nat.Acad Sci.72：619-622(1975)；Kawasaki，T.等，Biomed.Chromatog.4：113-118(1990))。

目前有四种已知的非酶催体系：吖啶鎓衍生物(McCapra等，英国专利British Patent No.1,461,877；Wolf-Rogers J.等，J.Immunol.Methods 133：191-198(1990)；异鲁米诺、金属卟啉(Forgione等，美国专利U.S.Patent No.4,375,972)以及非金属的四吡咯(Katsilometes，PCT国际专利说明书No.Wo93/23756)。这些体系优于酶催体系，它们具有能在数秒钟内即可导致峰值光输出量的更快速的动力学。金属卟啉是很小的半抗原分子，它能减少抗原结合中的空间位阻问题。此外，已知是发光的金属卟啉分子是那些含有具有发射率在10⁴以上的顺磁金属离子的金属卟啉分子(Gouterman，M.，Theporphyrins，Vol.III，Dolphin，D.，ed.，(Academic Press)：48-50，78-87，115-117，154-155(1978)；Canters，G.W and J.H.Van Der Waals，同上，577-578)。还已知金属卟啉、低卟啉(hypospor phyrin)、伪准(Pseudoriormal)金属卟啉以及类金属卟啉(metalloporphyrin-like)分子如金属二氢卟酚，血红素、细胞色素、叶绿素、镧系元素和锕系元素经受氧化/还原反应处理，这些反应无论是初次或二次结构扰动，但都发生在这些分子的金属中心，并且还已知它们催化产生化学发光的反应能力已归属于这些分子的金属中心(Eastwood，Dand M.Gouterman，J.Mol.Spectros.35：359-375(1970)；Fleischer，E.B.和M.Krishnamurthy，Anmals N.Y.Academy of Sci.206：32-47(1973)；Dolphin，D.等，同上，206：177-201；Tsutsui，M.和T.S.Srivastava，同上，206：404-408；Kadish，K.M.和D.G.Davis，同上。，206：495-504；Felton，R.H.等，同上，206：504-516；Whitten，D.G.等，同上，206：516-533；Wasser，P.K.W.andJ.-H.Fuhrhop，同上，206：533-549；Forgione等，U.S.Patent No.4,375,972；Reszka，K.和R.C.Sealy，Photochemistry and Photobiology 39：293-299(1984)；Gonsalves，A.M.d′A.R.等，Tetrahedron Lett.32：1355-1358(1991))。由于反应体中可能存在的铁和其它金属离子而改变这些反应，而且这些金属离子能干扰并能极大地混淆金属卟啉共轭浓度的测定(Ewetz，L.和A.Thore，Anal.Biochem.71：564-570(1976))。不同的金属会强烈地影响金属卟啉的寿命和发光性能。

非金属卟啉次卟啉-IX HCl已被证实是引起溶液中鲁米诺产生光的媒介(Katsilometes，G.W.，上文)。

在化学发光反应中和在非同位素配位体结合测定的研究中，使用发光的吖啶酯和酰胺衍生物已有报导和评论(Weeks，I.等，Clin.Chem. 298：1474-1479(1983)；Weeks，I.和J.S.Woodhead，Trends in Anal，Chem.72：55-58(1988))。在有H₂O₂和NaOH氧化试剂(pH 13.0)存在下产生闪烁型动力学光子的极短暂的有效发射(＜5秒)是这种体系的特征。

吖啶酮和各种取代的吖啶和吖啶酮的制备方法已有综述(Acridines，Acheson，R.M.和L.H.Orgel，(Interscience Publishers，N.Y.)pp.8-33，60-67，76-95，105-123，148-173，188-199，224-233(1956))。以前还对在碳-9原子中两个吖啶残基结合而形成双吖啶进行过描述和评论(Gleu，K.R.Schaarschmidt，Berichte 8：909-915(1940))。这些努力导致合成10，10′-二甲基-10，10′-二苯基-和10，10′-二乙基-9，9′-双吖啶鎓硝酸盐分子。还报导了这些分子在暴露于碱性溶液中的过氧化氢时可发出光(Gleu，K.和W.Petsch，Angew.Chem.48：57-59(1935)；Gleu，K.和R.Schaarschmidt，Berichte8：909-915(1940))。

由光泽精(10，10′-二甲基-9，9′-双吖啶鎓硝酸盐)产生光的机理已广泛地研究并把该机理归因于一系列氢氧化物的离子亲核加成到吖啶鎓盐及其还原产物(颇哪醇)中，通过主要的最终产品N-甲基吖啶酮的氧化作用而完结(Janzen，E.G.等，J.Organic Chem，35：88-95(1970)；Maeda.K.等，Bul.Chem.Soc.Japan 50：473-481(1977)；Maskiewicz，R.等，J.Am.Chem.Soc.，101/18：5347-5354(1979)；Maskiewicz，R.等，同上，101/18：5355-5364(1979))。

10-甲基吖啶在碳-9原子上的改性和衍生作用促使产生具有不同程度稳定性的一些有用的化学发光分子(Law，S.-J.，等，J.Biolum.Chemilum.4：88-98(1989))。当这些分子暴露于0.1mol/L硝酸中的0.5％w/v过氧化氢后接着暴露于单独的含0.25mol/L的氢氧化钠溶液后会产生持续不到5秒钟的闪光。

发光衍生物、发光衍生的分子或衍生的发光分子按本发明定义是一种由官能团或能改变前体分子的化学反应性和性能的基团共价结合产生的分子，而结果导致形成适于结合到分析物或特定结合配体的发光分子，希望在测定的发展中使用。在10，10′两个位置中的一个或两个上，N-羟基丁二酰胺的衍生作用是本发明优选的发光衍生物。只有衍生化合物或分子是通过第一化合物或第一分子反应而形成(或能使其形成)新化合物或新分子时，这种化合物或这种分子才能是第一化合物或第一分子的“衍生物”，在保留第一化合物或第一分子至少部分结构时，新化合物或新分子或小于或大于第一化合物或第一分子。当用于本发明时，术语“衍生物”还可包括“发光的衍生物”。

在本发明之前，就已完成了衍生发光的10，10′-取代的-9，9′-双吖啶的合成。以前，知道的发光的双吖啶(例如光泽精)不含有可以使该分子与另外分子共轭的活性基团(单个或多个)。直到现在，双吖啶也仅有学术意义而用于研究光产生和反应离子类相互反应的机理上。

在光导材料(例如光学纤维束)的表面上使用发光反应是研究发光传感器或探针的基础(Blum，L.J.等，Anal.Lett.21：717-726(1988))。这种发光可通过特异性蛋白结合(抗体)而调节并能在探针表面的微型环境中进行。然后在同种(无分离)试样的制剂中用光子测量设备测量光输出量(Messeri，G-等，Clin，Chem.30：653-657(1984)；Sutheland，R.M.等，ComplementaryImmunoassays，Collins，W.P.，ed.，(John Wiley & Sons，Ltd.)pp.241-261(1988))。

现已证明带电荷的合成聚合物(聚-N-乙基-4-乙烯基吡啶鎓溴化物，PEVP)通过带电荷的共轭分子经静电的相互作用而能完全抑制光的产生。这一点在由带负电荷的过氧化物酶的酶催化提高鲁米诺的化学发光反应中特别予以研究。低分子量电解质的加入将会消除这一抑制作用从而支持了所观察作用的静电性质(Valsenko，S.13.等，J.Biolum.Chemilum.4：164-176(1989))。

发光的毛细管电泳凝胶、凝胶转移或印迹(Southern，Western，Northernand Dot)是提供蛋白和核酸基因材料定量测定技术的实例。这些技术可配合放大分析物表达的方法，例如探针、PCR(聚合酶链反应)带、RFLP(限制性片段长度多态现象)法以及放大基因表达的其它方法和其它分析物而使用(Stevenson，R.，Biotech，Lab.8：4-6(1990))。

提高通过合成能产生大量光子发射的双吖啶分子和通过改进现存的信号溶液的化学发光反应所得的光输出量，并具有在化学发光反应期间能提供更高光强度的新信号溶液，将有利于改进测定的灵敏度。经信号溶液配方的操作来调制光输出动力学的能力，特别有利于制作对各种用途的测定方法(所述用途如基因探针、传感器、激素等)。

发明概述

本发明一方面是检测样品中双吖啶发光衍生物存在的方法。该方法包括该样品与一种信号溶液接触以便通过化学发光产生可测量的发射光并用测光仪器或装置测量发射的光。

测光仪器或装置测量发射的光。

本发明第二方面是合成发光衍生的10，10′-取代的-9，9′-双吖啶分子的方法，所述双吖啶分子能结合到分析物或结合到分析物的结合配体或结合到分析物结合配体的配位体。这些分子在其分子的其它位置上，如碳原子1-8，都可能具有另外的取代基。

本发明第三方面是针对适用于化学测定、配位体结合测定、免疫测定或核苷酸测定中发射可测量光的化学发光体系。该体系包括在大约10.0-约14.0范围的pH下，具有活化和氧化势比能的10，10′-取代的-9，9′-双吖啶，结合到分析物、或结合到分析物的结合配体或结合到分析物结合配体的配位体上并含有能克服该双吖啶固有氧化势的氧化剂或氧化剂组合物。在该体系中双吖啶起发光标记(触发器或标签)的作用以适用于化学测定、同种、异种竞争性和多层免疫测定、配位体结合测定以及核苷酸测定中产生化学发光。在双吖啶标记接触具有亲核反应剂和氧化剂或多种氧化剂的信号溶液时会产生出光。

作为标记特别有利的10，10′-取代的-9，9′-双吖啶比已知的化学发光标记更灵敏(即可检测更少量的分析物)，并且能通过控制信号溶液配方而进行光产生动力学的改进，结果导致持续至少0.1秒并可长达6秒钟的稳定光产生的动力学。

本发明第四方面是合成具有强有力的发光性能的新颖10-取代的双吖啶的方法。该方法包括取代基的酯化、原料(吖啶酮)的烷基化，这种分子的二聚作用和必要时的用N-羟基丁二酰胺衍生化。

本发明第五方面是化学发光的信号溶液，该溶液与一种是发光分子的化学发光标记起反应时能产生化学发光。该信号溶液在约10.0-约14.0的pH下，含有0.02M四硼酸钠(硼砂)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二甲基亚砜(DMSO)、D(-)果糖、过氧化钾(KO₂)和2-甲基-2-丙醇。在化学发光标记是吖啶鎓衍生物、光泽精、光泽精发光衍生物、双吖啶、双吖啶鎓发光衍生物、环状二酰基酰肼或蝶啶场合下，所述反应在1ng/ml标记浓度时，将会产生至少20∶1的噪声光子发射比的信号，持续至少0.1秒。按标记和信号溶液成分浓度的变化而定，在1ng/ml标记浓度下，信号比可为50∶1、100∶1、200∶1、500∶1，甚至700∶1和更高。还可控制发射持续多达6秒钟或更长时间。

还要说明的是这种信号溶液能激发吖啶衍生物，光泽精和10，10′-取代的-9，9′-双吖啶化学发光，在光输出中引起显著的提高，并由用以前已知的信号溶液所得的输出改变光输出动力学。

本发明第六方面是提供一种组合物，它含有结合到抗原、抗体或半抗原的10，10′-取代的-9，9′-双吖啶。

本发明第七方面是提供一种组合物，它含有在取代的双吖啶10和/或10′-活性位置上结合到抗原、抗体或半抗原的10，10′-对-甲苯甲酸-9，9′-双吖啶鎓二硝酸盐。

附图的简要说明

图1是表示实验结果的直方图，该实验是在用本发明信号溶液闪烁时比较信号试剂(零)、光泽精和10，10′-对-甲苯甲酸-9，9′-双吖啶的相对化学发光。

图2是表示在本发明标记与抗体接合时从其扫描分光光度测量得到的结果图。

图3是代表信号的线性曲线，该信号是10，10′-取代的-9，9′-双吖啶标记的抗体与本发明信号溶液闪烁时获得的。

图4是说明在不同的本发明信号试剂配方下所得的光输出动力学的变化性的动力学研究。

图5是合成10，10′-对-甲苯甲酸-9，9′-双吖啶二硝酸盐的N羟基丁二酰胺衍生物的优选方法图示流程图。

本发明的详细描述

尽管本申请中的单词和术语具有其标记的定义，但下列定义还是用于本发明的具体实施方案中。

正如本发明所定义的，一种信号溶液含有一种试剂或一组试剂，当试剂与特异性发光分子或特导性发光媒介分子结合时，将会引起光的产生。发光标记或标签按本发明的描述是一种结合到分析物、分析物的结合配体或分析物结合配体的配位体上的物质，这种结合可以是直接的(例如共价地)或间接的(例如，通过特异性合物质(蛋白)、生物素-抗生物素蛋白或生物素-链霉抗生物素蛋白桥)结合，当这种物质与信号溶液结合时或发生光或引起要产生的光。发光标记是一种发光分子(即发出光的物质)。

按本发明定义，发光分子是一种物质，这种物质在受到化学溶液成分的电子激发后，在轨道电子衰减到基态时将会发出光子(多个光子)。

如本发明中所用，发光反应剂是一种游离的发光分子(即未结合到分析物、分析物的结合配体或分析物结合配体的配位体的发光分子)。同样如本发明中所用，单个术语“发光分子”也能包括多个“发光分子”。此外，如本发明中所用，单个术语“发光媒介分子”也能包括多个发光媒介分子。

如本发明中所用，信号溶液是由游离分子(即未结合到分析物、分析物的结合配体或分析物结合配体的配位体的)所组成。同样如本发明中所用单个术语“发光分子”也包括多个“发光分子”。另外，如本发明中所用，单个术语“发光媒介分子”也包括多个发光媒介分子。

本发明针对合成能直接或间接地结合到分析物、分析物的结合配体、或分析物结合配体的配位体的发光的10，10′-取代的-9，9′-双吖啶衍生物分子的方法。

本发明还针对用于在样品中检测具有活化和氧化势比能的10，10′-取代的-9，9′-双吖啶发光衍生物的存在方法。该方法包括将样品与信号溶液接触，该信号溶液含有至少一种能降低10，10′-取代的-9，9′-双吖啶活化或氧化势比能的氧化剂。10，10′-取代的-9，9′-双吖啶和氧化剂反应通过化学发光而产生发射光。用于说明10，10′-取代的-9，9′-双吖啶的化学发光产生光的假设机理是在将亲核试剂如氢氧化物离子开始加入到双吖啶，结果导致9，9′-碳原子间的二聚物分裂。按上文Janzen等人，Maeda等人、和Maskiewicz等人的讨论，这种分裂将产生能被氧化以产生光的两个N-甲基吖啶酮分子。电子从适当的发光分子中排除导致受激中间体的形成；该中间体在发光分子衰减至基能态时发射光子。然后优选地是用光度测量仪或装置如Berthold Lumat LB 950发光计对光进行测量。由于没有干扰和没有用于检测溶液中荧光团所用的通常荧光法所存在的自身吸收问题，这种方法是更灵敏也更准确。

过氧化钾对于克服10，10′-取代的-9，9′-双吖啶的氧化势是优选的。然而，过氧化钾和其它氧化剂如四氧化锇或过氧化氢一起，同样是能克服10，10′-取代的-9，9′-双吖啶固有的氧化势的另外的氧化剂混合物。

本发明还针对适于发射用于化学测定.配位体结合测定如免疫测定或核苷酸测定中的可测量光的化学发光体系，这种体系含有在约10.0-约14.0的pH下，结合到分析物或分析物的结合配体或分析物的结合配体的配位体的具有氧化势的10，10′-取代的-9，9′-双吖啶发光衍生物，和至少一种能降低10，10′-取代的-9，9′-双吖啶氧化势的氧化剂。10，10′-取代的-9，9′-双吖啶主要起标记(即标签或示迹物)作用并且在化学发光反应中能产生光。免疫测定可以是同种的或异种的以及是竞争性的或多层的测定。当把10，10′-取代的-9，9′-双吖啶暴露于一种或多种氧化剂时，10，10′-取代的-9，9′-双吖啶借助于化学发光而产生光。

这种体系对检测分析物如核酸、抗体、抗原、半抗原或半抗原的共轭物、大分子、蛋白或聚合物是特别有效的。在该体系中对分析物的结合配体可以是核苷酸探针、抗体、抗原、半抗原、半抗原共轭物、大分子、蛋白或聚合物。

用于本发明的配位体意指连接的或结合的分子并且可包括抗原、抗体、半抗原、半抗原共轭物、大分子、蛋白或除了蛋白的聚合物如聚烃、聚甘油酯或多糖。

用于本发明中的半抗原共轭物是连接到另外分子的小分子(即分子量低于6000道尔顿的分子)。特别合适的半抗原共轭物是甾类分子-10，10′-取代的-9，9′-双吖啶共轭物。通过生物素-抗生物素蛋白或生物素-链霉抗生素蛋白桥分析物可结合到结合配体或结合配体可结合到配位体。配位体也可以是生物素、抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，而分析物也可通过生物素-抗生物素蛋白、生物素-链霉抗生物素蛋白体系而结合到10，10′-取代的-9，9′-双吖啶。当该体系包含10，10′-取代的-9，9′-双吖啶，发光标记和作为氧化剂的过氧化钾时，该体系可提供高灵敏度(抗体或抗原检测可高达10^-6-10^-20摩尔)。当该体系含有螯合剂、DMSO、D(-)果糖、2-甲基-2-丙醇、含水四硼酸钠和能克服氧化势的氧化剂组合物时，可获得更高的灵敏度(抗体或抗原检测可高达10^-22摩尔)。

尽管化学发光体系在pH约10-约14范围内是有效的，但优选pH是约12.5-13.5。

该体系中的10，10′-取代的-9，9′-双吖啶标签与其它试剂一起的化学发光性能使该体系特别适合于开发许多的半抗原和大分子分析物的超灵敏测定，对分析物10，10′-取代的-9，9′-双吖啶能直接或间接地接合例如激素、维生素、毒素、蛋白、传染性和接触传染试剂、化学品、药品、肿瘤标记、受体、生物素、抗生物素蛋白，链霉抗生物素蛋白和基因材料。10，10′-取代的-9，9′-双吖啶还能直接或间接地连接到特异性结合蛋白如用于化学发光测定研究中的抗体。

本发明还进一步针对发射用于化学测定、免疫测定、配位体结合测定或核酸测定中的可测量光的化学发光体系，该体系包括具有特定氧化势的10，10′-取代的-9，9′-双吖啶，结合到分析物、分析物的结合配体或分析物的结合配体的配位体并且还包括信号溶液，该溶液含有在约10.0-约14.0的pH下的氧化剂、过氧化钾或含四氧化锇和过氧化钾的氧化剂组合物。

在本发明与信号溶液一起使用的发光分子实例是吖啶鎓衍生物、蝶啶、蝶啶衍生物、光泽精、光泽精衍生物、荧光素、荧光素衍生物、环状二酰基酰肼(鲁米诺或异鲁米诺)，吖啶鎓衍生物如二甲基吖啶鎓酯或荧光素和光泽精衍生物如由N′-羟基二丁酰胺衍生产生的衍生物是优选的。

此外，这种化学发光体系适合同种和异种测定，包括竞争性和多层免疫测定。如上所述当信号溶液含有EDTA、DMSO、D(-)果糖、至少一种氧化剂、2-甲基-2-丙醇和含水的四硼酸钠时，该体系的灵敏度特别高。另外，分析物可以是核酸、抗原、抗体、半抗原、半抗原共轭物、大分子、蛋白或聚合物。同种测定将包括使用标记发光的抑制剂如聚离子。聚阳离子如聚(4-乙烯基吡啶鎓重铬酸盐)可抑制例如未结合的次卟啉IX二盐酸盐(DPIX)所标记的化合物，而聚阳离子如聚(乙烯基烷基)将抑制未结合的带正电荷的10，10′-取代的-9，9′-双吖啶所标记的化合物。在测定的情况下未结合意指如果化合物例如是抗原-标记共轭物，那么就不结合到例如抗体上或者如果化合物是抗体-标记共轭物，则就不结合到抗原，以此类推。

本发明还针对在化学发光异种测定中使用10，10′-取代的-9，9′-双吖啶检测样品中二元分析物的存在方法。适于检测的合适分析物是核酸、抗体、抗原、半抗原、半抗原共轭物、大分子、聚合物或蛋白。另外，该方法可以是化学测定法、核苷酸测定法或配位体结合测定法如免疫测定法。该法还可以是所有这些测定法中的任何组合。本发明还涉及10，10′-取代的-9，9′-双吖啶标签结合到第一分析物或结合到该分析物的结合配体或结合到该分析物结合配体的配位体以及将不同的标签或标记如非金属四吡咯发光分子或能引起化学发光的分子如酶结合到第二分析物或第二分析物的结合配体或第二分析物结合配体的配位体。分析物可以是聚核苷酸链、化学活性化合物质如二氢卟酚 e或免疫活性化合物如抗体、抗原、半抗原、半抗原共轭物、大分子、蛋白或聚合物。

一般来说，在二元多层型免疫测定中，在第一分析物上的位点的结合配体接合到固相如玻璃、聚丙烯、聚碳酸酯或聚苯乙烯上，因而，使该涂覆过的固相与样品和该分析物上第二位点的第二结合配体相接触。第二结合配体与标记(例如10，10′-取代的-9，9′-双吖啶衍生物)结合。对于第二分析物来说存在着同样情况只是标记和结合配体当然不同。洗涤固相并使结合的共轭物暴露在合适的一种或多种信号溶液中。一般来说，在竞争性测定中，固相是被涂上有限浓度的对所关心的各分析物是特异性的结合配体。然后使该固相与样品和具有可测量的结合到10，10′-取代的-9，9′-双吖啶的第一分析物和可测量的结合到其它发光标记的第二分析物相接触。接触后，洗涤固相以除去任何未结合的共轭物。在多层型或竞争性两种测定情况下，洗过的固相可分开处理，首先只使用两种标记中的一种特异性信号溶液，其中标记和溶液反应以引起发射光，有关该特异性标记的分析物量可用测量发射出的光而确定的，然后使固相分开与另外的化学发光信号溶液接触，该信号溶液对有关另一个分析物的第二标记或标签是特异性的，从而该标记和信号溶液反应也会产生发射光。再测量，从第二反应发出的光，就决定样品中所存在的第二分析物的量。

因为作为两种不同标记的结果所产生的光具有不同的性质(即通过各标记放出的光，波长可以不同或在两种标记间每秒钟反应产生的实际光量不同)，所以不可能用一种信号溶液去处理洗过的固相，该信号溶液通过两共轭物同时产生光，微分运算产生的光并测量光以确定样品中每个分析物的量。人们能够利用时间解析的发光分析如在荧光计中所用的进行微分运算作为两种不同的标记结果发出的光(lovgren，T.and K.Pettersson，luminescenceImmunoassay and Molecular Applications，Van Dyke，K.and R.Van Dyke eds.，CRC Ress，Boca Raton，Ann Arbor，Boston，MA，pp.233-254(1990))。

也可利用发射性能方面的差异如波长(Kleinerman，M等，Luminescenceof Organic and Inorganic Materials，Kallmann.H.P.和G.M.Sprush eds.，International Conference，New York University Washington Square，Sponsored byAir Force Aeronautical Research Laboratory，Army Research Office，CurhamOffice of Naval Research，N.Y.U.，pp.197 225(1961))

对于使用双吖啶衍生物的二元分析物测定的优选发光标记是一种吖啶衍生物，如二甲基吖啶鎓酯或者非金属四吡咯，然而一些其它的以上讨论过的发光标记也是合适的。优选非金属四吡咯是DPIX。对于通过DPIX标记引起发射光的优选信号溶液包括在pH约10.0-约14.0下，反，反-5-(4-硝基苯基)-2，4-戊二醛(Pentadienal)、二-2-乙基己基磺基丁二酸钠、发光反应剂鲁米诺、葡萄糖、苄基三甲基氢氧化铵、氢过氧化枯烯、仲高碘酸三钠、过氧化钾和EDTA。最适于使结合的10，10′-取代的-9，9′-5-(4-硝基苯基)-2，4-戊二醛(Pentadienal)、二-2-乙基己基磺基丁二酸钠、发光反应剂鲁米诺、葡萄糖、苄基三甲基氢氧化铵、氢过氧化枯烯、仲高碘酸三钠、过氧化钾和EDTA。最适于使结合的10，10′-取代的-9，9′-双吖啶闪光的信号溶液包括在约10.0-约14.0pH下的0.02M硼砂、EDTA、DMSO、D(-)果糖、过氧化钾、2-甲基-2-丙醇和含水的四硼酸钠。假若分析物共轭物中之一是酶标记的分析物共轭物，则对该酶的底物可包含在信号溶液中。

另外，本发明针对用于样品中检测二元分析物的化学发光同种测定。在竞争性测定中，固相被涂上对每种不同分析物是特异性的结合配体。在四吡咯用作一种标记的场合下，固相可另外涂上发光反应剂。然后将这样涂覆过的固相接触样品，已结合到10，10′-取代的-9，9′-双吖啶标记的已知量的一种分析物、已结合到不是双吖啶的发光标记的、已知量的另一种分析物和聚离子(如聚N-乙基-4-乙烯基吡啶鎓溴化物、重铬酸聚-4-乙烯基嘧啶嗡(pyrimidinium)、聚氯乙烯、聚(乙烯醇)、或聚(乙烯苄基氯))，它能通过阻止克服未结合共轭物的发光标记的氧化势而抑制未结合的双吖啶发光标记共轭物如抗-TSH-10，10′-取代的-9，9′-双吖啶(Vlasenko，S.B.等，J.Biolum.Chemilum.4：164-176(1989))。在必须抑制未结合发光标记的抗体共轭物如DPIX抗体共轭物的测定中，可使用聚阳离子。接触后，固相再用一种信号溶液处理，这种信号溶液既能通过两共轭物同时产生发射光，也能分别使固相与一种对标记有特异性的信号溶液接触并测量发射光，然后再单独使固相与对借助于另外共轭物的标记而发射光是特异性的一种信号溶液接触。

本发明另外还针对一种化学发光信号溶液，该溶液包含在约10.0-约14.0的pH下约150mM-约450mM过氧化钾的水溶液，优选在缓冲溶液中有300mM。优选缓冲剂是四硼酸钠但另外的溶液如氨基丁三醇(trizma)碱和硼酸也能起良好的作用。与这种信号溶液一起的优选用作标记的发光分子是吖啶鎓和10，10′-取代的-9，9′-双吖啶衍生物。然而当与KO₂信号溶液一起使用时单一的异鲁米诺和次卟啉IX·2HCl与发光反应剂鲁米诺也是合适的标记。当缓冲过的信号溶液中的KO₂与发光分子如10，10′-取代的-9，9′-双吖啶或其衍生物或发光标记共轭物如雌甾二醇17B-10，10′-取代的-9，9′-双吖啶或抗-TSH-10，10′-取代的-9，9′-双吖啶起反应达6秒钟或更长。

本发明还进一步针对一种发光信号溶液，该溶液包含在约10.0-约14.0的pH下，含有0.02M硼砂水溶液、EDTA、DMSO、D(-)果糖，、过氧化钾、和2-甲基-2-丙醇。该信号溶液可触发10，10′-取代的-9，9′-双吖啶衍生物共轭物化学发光，使光输出大大增加并使用上面已知信号溶液所得的输出改变光输出动力学。当这种溶液与发光标记或发光标记共轭物如10，10′-取代的-9，9′-双吖啶-抗体或抗-TSH-10，10′-取代的-9，9′-双吖啶反应时，在1ng/ml的标记浓度下可产生噪声光子发射比为500∶1的信号持续至少0.1秒(见图3)。另外，根据溶液和特定标记共轭物的变化，在1ng/ml的标记浓度下信号比可以是50∶1、100∶1甚至700∶1和更高。也可把发射控制到持续多达6秒钟或更长。

另外，本发明针对一种信号溶液，该溶液包含在约10.0-约14.0pH下，在硼砂水溶液中，有EDTA、DMSO、D(-)果糖、过氧化钾和2-甲基-2-丙醇。优选的用该信号溶液的本发明的所有方面中，就成分、成分加入顺序以及成分浓度而言，该信号溶液是按实施例2所说明的程序制备的。然而，成分也可以按另一种顺序加入并且其它也合适的浓度可以是：

-硼砂：0.005-0.05M的缓冲水溶液

-EDTA：0.002-02mM

-DMSO：0-8μl/ml的上述硼砂缓冲溶液

-D(-)果糖，2-mg/ml的缓冲溶液

-过氧化钾：210-365mM

-2-甲基-2-丙醇：0.05-0.25ml/ml的缓冲溶液

当这种溶液与发光标记如10，10′-取代的-9，9′-双吖啶起反应时，发光反应剂在1ng/ml的发光标记下，可产生噪声光子发射比至少为300∶1的信号。另外，根据标记，在1ng/ml的标记浓度下，信号比可以是50∶1、100∶1、200∶1等等。发射也可控制持续多达6秒钟或更长。

实施例1

10，10′-取代的-9，9′-双吖啶衍生物的合成

合成衍生的发光双吖啶分子的这条途径包括按上面Acheson和Orgel所述通过二苯基胺-2-羧酸和N-苯甲酰基-二苯基胺-2-羧酸的环化而合成吖啶酮。(所有的化学品和溶剂都是由Sigma/Aldrich，st.Louis，U.S.A和Pacific Pac公司，Hollister，CA获得的)。吖啶酮也可从Sigma/Aldrich购买。

除了制备吖啶酮以外，可以合成取代分子的甲基脂以便在吖啶酮的10-碳原子上共价结合。本文用于双吖啶分子衍生用的取代基分子是一种具有一官能团的分子，该官能团能使双吖啶进一步衍生或使双吖啶连结到另外分子如抗原、抗体等。通常本发明过程中所用的取代基分子的分子量约10,000或10000以下。在本实施例中，进行了取代基分子α-溴-对-甲苯甲酸的甲基酯化。在分子的一端具有良好的离去基团(一个或多个)(如卤原子(一个或多个))而在该分子的另一处有官能团(一个或多个)的其它分子，该分子也可作为取代基分子并且能成功地酯化。这种类型的另外取代基分子的优良实例是碘乙酸。使取代基分子在10％的三氟化硼的甲醇溶液中反应(每克取代基分子优选加入25ml的三氟化硼-甲醇)而完成酯化。反应可在室温下持续至少10小时并在分液漏斗中用二氯甲烷萃取甲酯。萃取液用H₂O洗两次，用0.1M碳酸氢钠洗一次再用H₂O洗两次。在rotavapor RE120旋转式汽化器上于60℃使体积减少至干。甲酯合成的另一方法是用醚接着加入重氮甲烷再使用含5％浓硫酸的甲醇处理。

合成中的下一个步骤是吖啶酮的烷基化。为完成这一点，往100ml的无水四氢呋喃(THF)中加5.4mM吖啶酮和6.5mM氢化钠。再使该混合物于70℃下氩气中搅拌回流2小时。往该混合物中加5.5mM的取代基甲酯(例如α-溴-对-甲苯甲酸甲酯)再使混合物在70℃下搅拌回流10-13小时。在用2％甲醇的二氯甲烷溶液进行硅胶薄层色谱(Baker化学公司，Phillipsburg，PA)发现：R_f＝0.2的斑点表示水解的吖啶酮-10-取代基；R_f＝0.4的第二斑点表示未反应的吖啶酮；R_f＝0.5的第三斑点(非常小)是未知副产物；R_f＝0.6的第四斑点是吖啶酮-10-取代基甲酯(吖啶酮-10-对-甲苯甲酸甲酯)；R_f＝0.9的第五斑点是未反应的取代基甲酯。反应混合物是呈含沉淀物的淡柠檬黄-棕色，沉淀物(含有基本上水解的吖啶酮-10-取代基)过滤掉后弃去。滤液用乙酸乙酯和水在分液漏斗中萃取以除去剩余的盐和水解的物质。杂质留在水相中。有机相(乙酸乙酯相)的体积用旋转汽化器于60℃下减少至干。然后加入二氯甲烷，未反应的(不溶解)吖啶酮沉淀物过滤掉。再把二氯甲烷萃取液在二氧化硅-40柱上用3％乙酸乙酯的二氯甲烷溶液洗脱并纯化。吖啶酮-10-对-甲苯甲酸甲酯经洗脱后含在第一黄色谱带内。用甲醇代替乙酸乙酯-二氯甲烷洗脱液再次使这物质用旋转汽化器浓缩(经该旋转汽化器上部的连续的加料管)。纯化过的吖啶酮-10-取代基甲酯沉淀成为淡黄色结晶物质。该沉淀物过滤后用甲醇洗(产率约50％)。这些分子及其酸前体是具有(例如)吖啶酮-10-对-甲苯甲酸及其NHS衍生物的活性荧光团，在403nm下激发，并在440nm下发射；而吖啶酮-10-乙酸及其NHS衍生物，在398nm下激发，并在438nm下发射。

吖啶酮-10-取代的中间体(例如吖啶酮-10-乙酸)通过把8.45g的2-氯苯甲酸、7.80g N-苯基甘氨酸、11.00g无水碳酸钾和0.30g Cu⁺⁺粉剂在6ml H₂O中充分混合而可直接进行合成。然后使该混合物置于160℃下的油浴上回流过夜。缓慢地加入乙醇再把产物溶解于水中，过滤后用HCl沉淀。把整个的混合物再次过滤以便除去未消耗掉的2-氯苯甲酸然后使留在那种滤液中的油状体结晶。使滤液溶于NaOH中，过滤，加乙酸后再次过滤混合物以便进一步除去未反应的2-氯苯甲酸。产物通过加入HCl而沉淀(酸性产物)再干燥。然后用过量的苯萃取并通过溶解在乙酸钠溶液中并在活性炭下煮沸，用HCl再次沉淀而进行一步地纯化。纯化产物经再次过滤并由稀甲醇中结晶而得到白色沉淀物(熔点：165-167℃)。

也可以合成吖啶酮-10-取代的分子(例如吖啶酮-10-乙酸)，通过将500mg(2.7mM)吖啶酮、矿物油中的130mg 80％NaH和50ml无水THF的混合物在氩气下回流2-4小时。然后加入碘乙酸(540mg，2.7mM)并将混合物在氩气下再继续回流10小时。过滤沉淀物再使滤液在反相柱在20-30％的乙醇洗脱条件下加以纯化。然后使这种纯化物料干燥并溶解于THF中，用4N NaOH水解10小时。加水后过滤混合物滤器用水洗涤，再用1N HCl使混合物的pH达到8.0。最终的纯化是在用10-30％甲醇水溶液的反相硅胶柱上进行的，在旋转汽化器(例如RE 120)上使体积减小并用1N HCl于pH2.5下进行再沉淀过夜。通过离心收集产物再用水洗一次。于冻干器上干燥(产率接近40％)。

通过吖啶酮-10-取代基甲酯与三氯氧化磷(POCl₃)反应而进行吖啶酮-10-对-甲苯甲酸甲酯向季铵化的9-氯-吖啶10-对-甲苯甲酸甲酯的转化。在每一50mg纯化甲酯中加入1ml的POCl₃然后使该混合物在120℃的油浴上回流1小时。

通过加入1g冷锌金属和10ml冷冻的冷的浓HCl/100mg的9-氯-吖啶-10-对-甲苯甲酸甲酯，可以在冷冻条件下反应1-10小时，而进行9-氯-吖啶-10-对-甲苯甲酸甲酯的二聚化和脱酯化。这一反应是剧烈的，并必须在冷冻条件下进行1-10小时。然后把沉淀过滤掉再用水洗。酸性滤液的纯化是在硅胶C-18的反相柱上完成的。该柱先用甲醇预处理接着用0.1N硝酸再用0.01M的磷酸盐缓冲剂处理。滤液的洗脱首先用0.01M磷酸盐缓冲液中的甲醇来进行以除去副产物、未反应的物料和盐。附着在柱顶端的产物，(10，10′-对-甲苯甲酸-9，9′-双吖啶盐，一种双取代的双吖啶)，再用30-90％甲醇的0.1N硝酸液洗脱(甲醇的浓度可从30％提高到90％以除去所有的产物)。用约50％甲醇的0.1N硝酸液洗脱的产物是黄色谱带。然后将质子化纯化的二聚物-二硝酸盐(10，10′-对-甲苯甲酸-9，9′-双吖啶二硝酸盐)在60℃下在旋转汽化器使之浓缩至很小体积(5ml)再冻干至干。用Perkin-Elmer 552分光光度计的扫描分光光度测定法揭示其特征性吸光度，在460nm处有一初始肩状峰，435nm处是第一峰，415nm处是第二个肩状峰，370nm处是主峰，而在355nm处是肩状拖尾峰(见图2)。用Bruker ARX 400仪器(Rhheinstetten-FO，德国)的NMR曲线可在3.9ppm处产生一个峰，它表明有连结到二聚体10位氮上的亚甲基碳和在7-9ppm间有多个芳族碳峰。

二聚物和N-羟基丁二酰胺(NHS)通过加入(在搅拌下)211微摩尔(μM)的二环己基碳化二亚胺于无水二甲基甲酰胺(DMF)中的141μM的二聚物中(0.5ml/mg的二聚物)而进行衍生化。往该混合物中加211μM的可以在室温下反应10小时的N-羟基丁二酰胺。把在该反应过程中形成的脲沉淀物过滤掉。这种标记的NHS-酯在琥珀色小瓶内是非常稳定的(至少一年)。在反相TLC上主峰在用0.01M磷酸盐缓冲液中的90％甲醇洗脱时不移动(在长波长的紫外光下起点处有一黄色斑)，但用0.1硝酸/70％甲醇(v/v)时，移动R_f＝0.2。

10，10′-对-甲苯酰-NHS-9，9′-双吖啶二硝酸盐衍生物与抗体的接合始于把100μl的衍生物DMF溶液加到在pH 7.4 PBS中的1mg抗体中。在本实施例中多克隆抗体结合到刺激甲状腺激素的β-链上，然而，任何抗体、分析物、聚合物或结合蛋白都可使用。这种混合物可以在室温下反应10小时然后往抗体-衍生物混合物中加入54μl的1mg/ml的d-L-赖氨酸并使其再反应3小时。这一步骤对于充满在发光衍生物-抗体共轭物上的未反应NHS位点是必须的。

该抗体-10，10′-取代的-9，9′-双吖啶共轭物是在20cm Biogel P-10柱(BioRad；Hercules，CA)上用pH 7.4的含10mM二元磷酸钾和0.1M NaCl的缓冲液洗脱而进行纯化的。抗体共轭物是在柱的第一馏份中洗脱它可用TLC和分光光度测定法监测。抗体共轭物有两个分光光度峰，在365nm(标记的小峰)和抗体的275nm峰并且用实施例2描述的本发明信号溶液下能成功地闪烁，导致非常迅速的光发射动力学(见图4)。

弱酸性环境(0.01N HNO₃)能稳定标记并能对噪声比给出最强的信号。含0.2μl吐温-20/ml PSS的洗涤液用HNO₃调到0.01N在必须分离的测定中产生良好的影响。在刚要闪烁前使标记暴露于5μl的终洗液中也可增强信号。

实施例2

信号溶液的制备

用于由新型发光分子产生光的信号溶液配制如下：

搅拌下在每100ml 0.02M四硼酸钠中加入下列物质：

a)0.744mg(0.02mM)亚乙基二胺四乙酸(EDTA)

b)100μl二甲基亚砜(DMSO)

c)400mg(0.02M)D(-)果糖

d)1996mg(280mM)过氧化钾(KO₂)

e)17ml 2-甲基-2-丙醇

实施例3

对比10，10′-对-甲苯甲酸-9，9′-双吖啶鎓二硝酸盐和双一N-甲基吖啶鎓二硝酸盐(光泽精)的测定

如图1所示，本例是对由单独信号溶液(条1)、蒸馏水中的1.9nM(毫微摩尔)浓度的光泽精(条2)、和蒸馏水中的1.3nM浓度的10，10′-对-甲苯甲酸-9，9′-双吖啶二硝酸盐(条3)获得的信号进行对比。信号溶液按照实施例2制备。该测定用的条件是在一式三份的12×75mm聚苯乙烯管(VWRScientific公司，Philadelphia，PA)中的5μl水中加入300μl信号溶液，以得到零信号。每个发光分子的信号是通过在Berthold Lumat中用300μl信号溶液稀释5μl的标记闪烁三份而获得的。

实施例4

在提高抗体-TSH-10，10′-对-甲苯酰-9，9′-双吖啶共轭物稀释度条件下验证信号线性的测定

如图3所示，本例验证抗体共轭物的发光功能度和信号与提高稀释度的线性关系。抗体-TSH-10，10′-对-甲苯酰-9，9′-双吖啶共轭物由10⁹g/ml稀释到10^-18g/ml并且用200μl信号试剂使每份5μl稀释液一式三份在Berthold Lumat中闪烁并记录信号的量值。结果如下：

10^-9g/ml-12,000,000计数/秒；10¹²g/ml-570,000计数/秒；

10¹³g/ml-37,119计数/秒；10¹⁴g/ml-3,510计数/秒；10¹⁵g/ml-556计数/秒；10¹⁶g/ml-304计数/秒；10^-17g/ml-240计数/秒；10¹⁸g/ml-229计数/秒；0.0g/ml-102计数/秒。

本说明书中提到的所有出版物和专利申请都作为参考引入本文，与每份单独出版物或专利申请特别地和个别地予以指明的是同样作为参考引入。

现在本发明已充分描述，很明显对本技术领域一般技术人员来说在没有偏离所附权利要求的精神或范围下可以对本发明进行许多变化和改进。

Claims

1、一种组合物，它含有结合到抗原、抗体或半抗原的10，10′-取代的-9，9′-双吖啶。

2、一种组合物，它含有在取代的双吖啶10和/或10′-活性位置上结合到抗原、抗体或半抗原的10，10′-对-甲苯甲酸-9，9′-双吖啶鎓二硝酸盐。

3、一种用于发射对化学测定、免疫测定、配位体结合测定或核苷酸测定有用的可测量光的化学发光体系，所述体系包括在pH10.0-14.0下，具有氧化势的10，10′-取代的-9，9′-双吖啶发光衍生物，具有能克服10，10′-取代的-9，9′-双吖啶发光衍生物的氧化势的一种氧化剂或氧化剂组合物的信号溶液，所述10，10′-取代的-9，9′-双吖啶发光衍生物是结合到分析物、或分析物的结合配体或分析物结合配体的配位体。

4、权利要求3的化学发光体系，其中所述10，10′-取代的-9，9′-双吖啶发光衍生物是10，10′-对-甲苯甲酸-9，9′-双吖啶或10，10′-乙酸-9，9′-双吖啶。

5、权利要求3的化学发光体系，还含有缓冲溶液、螯合剂、亚砜、还原糖、和醇。

6、具有氧化剂组合物的权利要求5的化学发光体系，其中，10，10′-取代的-9，9′-双吖啶发光衍生物是一种10，10′-对-甲苯甲酸-9，9′-双吖啶或10，10′-乙酸-9，9′-双吖啶，缓冲溶液是四硼酸钠水溶液，螯合剂是EDTA、亚砜是DMSO，还原糖是D(-)果糖和醇是2-甲基-2-丙醇。

7、权利要求3的化学发光体系，其中，所述分析物是抗原、抗体、和/或半抗原。

8、权利要求3的化学发光体系，其中，所述结合配体是抗原、抗体、和/或半抗原。

9、权利要求3的化学发光体系，其中，所述配位体是抗原、抗体、和/或半抗原。

10、权利要求4的化学发光体系，其中，所述10，10′-取代的-9，9′-双吖啶发光衍生物通过生物素-抗生物素蛋白或生物素-链霉抗生物素蛋白桥而结合到分析物、分析物的结合配体或分析物结合配体的配位体上。

11、用于发射在化学测定、配位体结合测定或核酸测定中有用的可测量光的化学发光体系包括：结合到分析物或分析物的结合配体或分析物结合配体的配位体的10，10′-取代的-9，9′-双吖啶标记，和一种信号溶液，该溶液含有在约10.0-约14.0pH下的氧化剂过氧化钾或包括四氧化锇和过氧化钾的氧化剂组合物。

12、权利要求11的化学发光体系，其中所述10，10′-取代的-9，9′-双吖啶标记是10，10′-对-甲苯甲酸-9，9′-双吖啶鎓二硝酸盐、10，10′-对-甲苯酰-9，9′-双吖啶鎓二硝酸盐、10，10′-乙酰-9，9′-双吖啶鎓二硝酸盐或10，10′-乙酸-9，9′-双吖啶鎓二硝酸盐。

13、权利要求11的化学发光体系，其中所述信号溶液包含氧化剂组合物并还包含缓冲溶液、螯合剂、亚砜、还原糖、和醇。

14、权利要求11的化学发光体系，其中所述缓冲溶液是含水的四硼酸钠，螯合剂是EDTA、亚砜是DMSO，还原糖是D(-)果糖并且该体积还包含醇2-甲基-2-丙醇。

15、权利要求11的化学发光体系，其中所述双吖啶标记是通过生物素-抗生物素蛋白或生物素-链霉抗生物素蛋白桥结合到分析物、分析物的结合配体或分析物结合配体的配位体上的。

16、一种在化学发光同种试样中使用10，10′-取代的-9，9′-双吖啶以检测样品中分析物的存在或测定其量的方法，该法包括：

(a)提供一种涂有对所述被分析物是特异性的结合配体的固相；

(b)使所述固相与所述样品和预定量的10，10′-取代的-9，9′-双吖啶分析物共轭物以及预定量的能阻止未结合的10，10′-取代的-9，9′-双吖啶-分析物共轭物引起发光的聚阴离子接触，所述10，10′-取代的-9，9′-双吖啶具有氧化势，至少一些所述结合配体与至少一些所述10，10′-取代的-9，9′-双吖啶-分析物共轭物相结合；

(c)使来自(b)的固相与信号溶液接触，该信号溶液在pH约10.0-约14.0下，含有能克服10，10′-取代的-9，9′-双吖啶在结合的10，10′-取代的-9，9′-双吖啶-分析物共轭物中的氧化势的一种氧化剂或氧化剂组合物进行发射光；和

(d)测量在(c)中所发射的光量，其中所述发射光的量与所述样品中存在的分析物量成正比。

17、权利要求16的方法，其中所述10，10′-取代的-9，9′-双吖啶是10，10′-对-甲苯甲酸-9，9′-双吖啶衍生物或10，10′-乙酸-9，9′-双吖啶衍生物。

18、权利要求16的方法，其中信号溶液还包含缓冲剂水溶液、螯合剂、亚砜、还原糖和醇。

19、权利要求16的方法，其中所述信号溶液包含氧化剂四氧化锇和过氧化钾并且还包含含水的四硼酸钠、EDTA、DMSO、D(-)果糖和2-甲基-2-丙醇。

20、一种在化学发光的异种测定中使用10，10′-取代的-9，9′-双吖啶以检测样品中第一和第二分析物的存在的方法，该法包括：

(a)提供一种涂有第一特异性结合配体和第二特异性结合配体的固相，所述第一结合配体对所述第一分析物是特异性的而所述第二结合配体对所述第二分析物是特异性的；

(b)使所述固相与所述样品和与非-双吖啶标记-第一分析物共轭物和10，10′-取代的-9，9′-双吖啶标记-第二分析物共轭物接触，至少一些所述第一分析物共轭物结合到至少一些所述第一结合配体和至少一些所述第二分析物共轭物结合到至少一些所述第二结合配体上；

(c)通过洗涤所述接触的固相而把未结合的共轭物从结合的共轭物中分离出来；

(d)使(c)中所述洗涤过的固相通过化学反应或与对所述10，10′-取代的-9，9′-双吖啶是特异性的信号溶液或与对所述非双吖啶标记是特异性的信号溶液接触以产生光；

(e)检测或测量从(d)中所述反应中产生的所述光；

(f)使来自(d)的固相与对所述10，10′-取代的-9，9′-双吖啶标记是特异性的信号溶液接触，只要(d)中的信号溶液对所述非双吖啶标记是特异性的溶液，或与对所述非双吖啶标记是特异性的信号溶液接触，只要(d)中的溶液是对所述10，10′-取代的-9，9′-双吖啶标记是特异性的溶液，以便通过化学反应产生光；

(g)检测或测量由(f)中的所述反应发出的所述光；和

(h)由步骤(e)和(g)中所检测或测量的光而检测所述第一和所述第二分析物和确定所述第一或所述第二分析物的量。

21、权利要求20的方法，其中，所述10，10′-取代的-9，9′-双吖啶标记是10，10′-对-甲苯甲酸-9，9′-双吖啶鎓二硝酸盐、10，10′-对-甲苯酰-9，9′-双吖啶鎓二硝酸盐、10，10′-乙酰-9，9′-双吖啶鎓二硝酸盐或10，10′-乙酸-9，9′-双吖啶鎓二硝酸盐。

22、权利要求20的方法，其中，非双吖啶标记是次卟啉IX·2HCl。

23、权利要求22的方法，其中，来自(c)的洗涤固相在步骤(f)中与对次卟啉IX·2HCl是特异性的所述信号溶液接触，所述信号溶液在约10.0-约14.0pH下，包括反，反-5-(4-硝基苯基)-2，4-戊二醛、二-2-乙基己基磺基丁二酸钠、鲁米诺或异鲁米诺、葡萄糖、苄基三甲基铵氢氧化物、氢过氧化枯烯、仲高碘酸三钠、和EDTA。

24、权利要求21的方法，其中，来自(c)的洗涤固相在步骤(f)中与对10，10′-取代的-9，9′-双吖啶是特异性的所述信号溶液接触，所述溶液包括四硼酸钠水溶液、EDTA、DMSO、D(-)果糖、KO₂和2-甲基-2-丙醇。

25、用于测定流体样品中未知量生物活性分析物的存在或测量其浓度的配位体结合测量方法中，这种存在或浓度是通过使用标记和信号溶液而确定的，以产生可检测或可测量的反应产物，其改进包括使用10，10′-取代的-9，9′-双吖啶作标记和一种在四硼酸钠水溶液中的EDTA、DMSO、D(-)果糖、KO₂和2-甲基-2-丙醇混合物作信号溶液。

26、用于经化学发光多层测定法而检测样品中分析物的存在或其量的方法中，采用了信号溶液和发光分子标记的化合物，该化合物结合到所述分析物或所述分析物的结合配体或所述被分析物结合配体的配位体上，其改进包括：

使用10，10′-取代的-9，9′-双吖啶-标记化合物作为所述发光分子标记的化合物，能阻止未结合双吖啶标记的化合物中的双吖啶引起发光的预定量聚阴离子，以及作为所述信号溶液的一种溶液，该溶液包括在约10.0-约14.0pH下，在四硼酸钠水溶液中的EDTA、DMSO、D(-)果糖、过氧化钾和2-甲基-2-丙醇。

27、一种用于产生可测量光的化学发光体系，它通过至少两种不同的分子产生并用于化学测定、配位体结合测定、免疫测定或核苷酸测定以检测样品中一种以上分析物，该体系包括在约10.0-约14.0pH下，结合到第一分析物或所述第一分析物的结合配体或所述第一分析物结合配体的配位体的次卟啉IX·2HCl，结合到第二分析物或所述第二分析物的结合配体或所述第二分析物结合配体的配位体的10，10′-取代的-9，9′-双吖啶发光标记，含有反，反-5-(4-硝基苯基)-2，4-戊二醛、二-2-乙基己基磺基丁二酸钠、鲁米诺、葡萄糖、苄基三甲基铵氢氧化物、氢过氧化枯烯、仲高碘酸三钠、过氧化钾以及亚乙基二胺四乙酸的混合物的第一信号溶液和包含在四硼酸钠水溶液中的EDTA、DMSO、D(-)果糖、KO₂和2-甲基-2-丙醇的混合物的第二信号溶液。

28、权利要求27的发光体系，它还包含预定量的聚阳离子。

29、权利要求27的发光体系，它还包含预定量的聚阴离子。

30、一种制备10，10′-取代的-9，9′-双吖啶衍生物的方法包括：

(a)合成取代基分子的甲酯，所述取代基分子具有至少一个官能团；

(b)通过吖啶酮、氢化钠、无水四氢呋喃以及来自步骤(a)的甲酯化合而使吖啶酮烷基化以形成吖啶酮-10-取代基-甲酯；

(c)使来自步骤(b)的所述吖啶酮-10-取代基-甲酯与三氯氧化磷反应以形成季铵化的9-氯-吖啶-10-取代基-甲酯；

(d)使来自步骤(c)的9-氯-吖啶-10-取代基-甲酯与锌金属和浓盐酸反应以形成季铵化的、脱酯的、二聚的、10，10′-取代基-9，9′-双吖啶盐；

(e)使来自步骤(d)的双吖啶盐与硝酸反应以形成10，10′-取代基-9，9′-双吖啶鎓二硝酸盐，和

(f)通过使所述二聚体二硝酸盐与碳化二亚胺和N-羟基丁二酰胺在二甲基甲酰胺中反应而使来自步骤(e)的所述二聚体二硝酸盐再衍生化以形成双-NHS-10，10′-取代基-9，9′-双吖啶鎓二硝酸盐。

31、一种组合物，它包含在取代的双吖啶10和/或10′-活性位置上结合到抗原、抗体或半抗原的双-NHS-10，10′-对-甲苯酰-9，9′-双吖啶鎓二硝酸盐。