KR100382399B1

KR100382399B1 - 유도체화된10,10'-치환된-9,9'-비아크리딘발광분자및신호용액을제조하는방법

Info

Publication number: KR100382399B1
Application number: KR1019960707400A
Authority: KR
Inventors: 더블유. 캣실로미츠 조오지
Original assignee: 더블유. 캣실로미츠 조오지
Priority date: 1994-06-24
Filing date: 1995-06-22
Publication date: 2003-10-10
Also published as: JP2006292771A; EP0766825A4; CN1155931A; JPH10502346A; DE69535764D1; EP0766825A1; JP3989537B2; HK1001416A1; ATE397214T1; WO1996000392A1; US5866335A; EP0766825B1; CN1201150C

Abstract

본 발명은 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 분자 및 이것의 유도체를 합성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 분자는, 킬레이트화제, 슬폭시화물, 환원당, 산화제 또는 산화제들의 조합물, 알코올 및 수성 사붕산나트륨을 화학발광 신호의 생성에 유효한 농도로 10.0 내지 14.0의 pH로 함유하는 신호 용액의 존재하에서, 화학발광에 의한 광 생성을 촉매화하는 것으로 나타난다. 본 발명의 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘은 단독으로 사용되거나 또는 햅텐이나 거대 분자에 부착되어 사용되고, 균일하거나 불균일한 화학발광 검정의 준비단계에서 표지로 이용된다. 본 발명의 분자가 다른 화학발광 표지 분자와 함께 사용되면 복합 분석물 화학발광 검정이 가능해진다.

Description

유도체화된 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 발광 분자 및 신호 용액을 제조하는 방법

발명의 배경

광에너지 측정은 다양한 매질중에서 물질의 존재 또는 농도를 관측하는 매우 매력적인 방법으로 부상하고 있다. 많은 생물발광 및 화학발광 반응계가 고안되었다[참고문헌: Schroeder et al., Methods in Enzymology, 17:24-462 (1978);Zeigler, M.M., and T.O. Baldwin, Current Topics In Bioenergetics, D. RaoSanadi ed., (Academic Press) pp. 65-113 (1981); DeLuca, M., Non-Radiometric Assay: Technology and Application in Polypeptide and Steroid Hormone Detection, (Alan R Liss, Inc.) pp. 47-60 및 61-77 (1988); DeJong, G.J., and P.J.M. Kwakman, J. of Chromatography 492: 319-343 (1989); McCapra, F. et al., J. Biolumin. Chemilumin. 4:51-58 (1989); Diamandis, E.P., Clin. Biochem. 23:437-443 (1990); Gillevet, P.M., Nature 348:657-658 (1990); Kricka, L.J., Amer. Clin Lab. , Nov/Dec:30-32 (1990)].

발광은 광여기 또는 화학 반응을 포함하는 어떠한 수단에 의해 광이 생성되는 것이다. 화학발광이란 단지 화학 반응에 의해서만 광이 방출되는 것이다. 이러한 화학발광은 화학 반응으로 인해 전자적으로 여기된 생성물이 기저 상태로 복귀하는 동안 발생하는 광의 방출로서 더 규정될 수 있다[참고문헌: Woodhead, J.S. et al., Complementary Immunoassays, W.P. Collins ed., (John Wiley & Sons Ltd.), pp. 181-191 (1988)]. 화학발광 반응은 효소 매개성 반응 및 비효소 반응으로 나눌 수 있다. 발광 반응물 루미놀(luminol)은 산화환원 효소 (예: 양고추냉이 페록시다아제, 크산틴 옥시다아제, 글루코오스 옥시다아제), H₂O₂, 특정한 무기 금속 이온 촉매 또는 분자 (예: 철, 망간, 구리, 아연), 및 킬레이트화제의 존재하에 중성 내지 알칼리 조건(pH7.0 - 10.2)에서 산화될 수 있고, 이러한 산화로 기저 상태로 복귀하는 동안 광을 방출하는 여기된 중간물(3-아미노프탈산)이 생성된다는것이 한 동안 공지되었다[참고문헌: Schroeder, H,R et al., Anal Chem. 48:1933-1937 (1976); Simpson, J.S.A. et al., Nature 279:646-647 (1979); Baret, A., U.S. Patent No. 4,933,276]. 발광시키는데 사용되는 다른 특이적인 분자 및 유도체에는 루미놀(예: 이소루미놀) 이외에 시클릭 디아실 히드라지드, 디옥세탄 유도체, 아크리디늄 유도체 및 퍼옥시옥실레이트가 포함된다[참고문헌: Messeri, G. et al., J. Biolum. Chemilum. 4:154-158 (1989); Schaap, A.P. et al., Tetrahedron Lett. 28:935-938 (1987); Givens, R.S. et al., ACS Symposium Series 383; Luminescence Applications, M.C, Goldberg ed., (Amer. Chem, Soc., Wash. D.C., pp. 127 - 154 (1989)). 광을 발생시키고 분자의 초감도 측정에서 사용된 추가의 분자는 폴리시클릭 및 환원된 니트로폴리시클릭 방향족 탄화수소, 폴리시클릭 방향족 아민, 형광아민-표지된 카테콜아민, 및 쿠마린, 닌히드린, o-프탈알데히드, 7-플루오로-4-니트로벤즈-2,1,3-옥시다졸, 나프탈렌-2,3-디카르복스알데히드, 시아노벤즈[f]이소인돌 및 염화 단실과 같은 다른 형광 유도체화제이다[참고문헌: Simons, S.S., Jr. and D.F. Johnson, J. Am. Chem. Soc. 98:7098-7099 (1976); Roth, M. Anal. Chem. 43:880-882 (1971); Dunges, W., ibid, 49:442-445 (1977); Hill, D.W. et al., ibid, 51:1338-1341 (1979); Lindroth, P. and K. Mopper, ibid, 51:1667-1674 (1979); Sigvardson, K.W. and J.W. Birks, ibid, 55:432-435 (1983); Sigvardson, K.W. et al., ibid, 56:1096-1102 (1984); de Montigny, P. et al., ibid, 59:1096-1101 (1987); Crayeski, M.L, and J.K. DeVasto, ibid, 59:1203-1206 (1987); Rubinstein, M. et al., Anal. Biochem. 95:117-121 (1979);Kobayashi, S.-I., et al., ibid, 112:99-104 (1981); Watanabe, Y. and K. Imai, ibid, 116:471-472 (1981); Tsuchiya, H., J. chromatog. 231:247-254 (1982); DeJong, C. et al., ibid, 241:345-359 (1982); Miyaguchi, K. et al., ibid, 303:173-176 (1984); Sigvardson, K.W. and J.W. Birks, ibid, 316:507-518 (1984); Benson, J.R. and P.E. Hare, Proc. Nat. Acad. Sci. 72:619-622 (1975); Kawasaki, T. et al., Biomed. Chromatog. 4:113-118 (1990)].

최근에 공지된 4개의 비효소 시스템은 하기와 같다: 아크리디늄 유도체[참고문헌: McCapra et al., British Patent No. 1,461,877; Wolf-Rogers J. et al., J. Immunol. Methods 133:191-198 (1990)]; 이소루미놀, 메탈로포르피린[참고문헌: Forgione et al., U.S, Patent No. 4,375,972] 및 비금속 테트라피롤[참고문헌: Katsilometes, PCT International Publication No. WO 93/23756]. 상기 시스템들의 장점은 효소-매개성 시스템에 비해 보다 빠른 반응 속도를 가져 수 초내에 피크광 출력을 발생시킨다는 것이다. 메탈로포르피린은 항원 결합에서 스테아르 방해문제를 경감시키는 소분자의 합텐이다. 부가하여, 발광성으로 공지된 메탈로포르피린 분자는 상자성 금속 이온을 함유하고 방출 수율이 10^-4이상인 분자이다[참고문헌: Gouterman, M., The Porphyrins, Vol. III, DoIphin, D., ed., (Academic Press): 48-50, 78-87, 115-117, 154-155 (1978); Canters, G.W and J.H. Van Der Waals, ibid, 577-578]. 메탈로포르피린, 하이포스포르피린, 슈도노말(pseudonormal) 메탈로포르피린, 및 금속 염소, 헴(heme), 시토크롬, 엽록소, 란탄족 원소 및 악티늄족원소와 같은 메탈로포르피린 유사 분자는 상기 분자의 금속 중심에서 발생하는 구조적 섭동(perturbation)에 대해 1차 또는 2차적 산화/환원반응을 겪고, 화학발광의 발생을 촉매화하는 이들 분자의 반응력은 상기 분자의 금속 중심에 기인하는 것으로 또한 공지되었다[참고문헌: Eastwood, D. and M. Gouterman, J. Mol. Spectros, 35:359-375 (1970); Fleischer, E.B. 및 M. Krishnamurthy, Annals N.Y. Academy of Sci. 206:32-47 (1973); Dolphin, D. et al., ibid, 206:177-201; Tsutsui, M. 및 T.S. Srivastava, ibid, 206:404-408; Kadish, K.M. and D.G. Davis, ibid, 206:495-504; Felton, R.H. et al., ibid, 206:504-516; Whitten, D.G. et al., ibid, 206:516-533; Wasser, P.K.W. and J.-H. Fuhrhop, ibid, 206:533-549; Forgione et al., 미국특허 제 4,375,972호; Reszka, K. and R.C. Sealy, Photochemistry and Photobiology 39:293-299 (1984); Gonsalves, A.M.d'A. R. et al., Tetrahedron Lett. 32:1355-1358 (1991)]. 이들 반응은 반응물내에 존재할 수 있는 철 및 다른 금속 이온에 의해 변화될 수 있고, 상기 금속 이온은 메탈로포르피린 컨쥬게이트 농도의 검정을 간섭하고 매우 혼동시킬 수 있다[참고문헌: Ewetz, L. and A. Thore, Anal. Biochem. 71:564-570 (1976)]. 상이한 금속들은 메탈로포르피린의 수명 및 발광 특성에 강력한 영향을 줄 것이다.

비금속 포르피린인 듀터로포르피린(deuteroporphyrin)-IX HCl은 용액중의 루미놀로부터의 광 생성을 매개하는 것으로 입증되었다[참고문헌: Katsilometes, G.W. 서두].

발광 아크리디늄 에스테르 및 아미드 유도체를 화학발광 반응 및 비-동이원소(nonisotropic) 리간드 결합 검정의 개발에서 사용하는 방법이 발표 및 검토되었다[참고문헌: Weeks, I. et al., Clin. Chem. 29/8:1474-1479 (1983); Weeks, I. and J.S. Woodhead, Trends in Anal. Chem. 7/2:55-58 (1988)]. 이러한 시스템의 특징은 H₂O₂및 NaOH 산화 시약(pH 13.0)의 존재하에서 섬광-유형 반응과정을 생성하는 광자의 방출 시간( < 5초)이 매우 짧다는 것이다.

아크리돈, 및 다양하게 치환된 아크리딘과 아크리돈의 제조 방법은 문헌[Acridines, Acheson, R.M. and L.E. Orgel, (Interscience Publishers, N.Y.) pp. 8-33, 60-67, 76-95, 105-123, 148-173, 188-199, 224-233 (1956)]에 기술되었다. 탄소-9 원자에 위치한 2개의 아크리딘 잔기를 결합시켜 비아크리딘을 형성하는 것은 종래에 기술되고, 검토되었다[참고문헌: Gleu, K. and R. Schaarschmidt, Berichte 8:909-915 (1940)]. 이들 연구는 10,10' -디메틸, 10,10' -디페닐 및 10,10' -디에틸-9,9' -비아크리디늄 질산염 분자를 합성하였다. 상기 분자가 염기성 용액중에서 과산화수소에 노출되면 광을 발생시킨다는 것도 발표되었다[참고문헌: Gleu, K. and W. Petsch, Angew. Chem. 48:57-59 (1935); Gleu, K. and R. Schaarschmdt, Berichte 8:909-915 (1940)].

루시제닌(lucigenin)(10,10' -디메틸-9,9' -비아크리디늄 질산염)에 의한 광생성 기작은 광범위하게 연구되었고, 이는 주요 최종 생성물인 N-메틸아크리돈의 산화에 의해 완결되는 아크리디늄염 및 이것들의 환원 생성물(피나콜(pinacols))로의 일련의 수산화 이온 친핵성 첨가에 기인하는 것으로 생각되었다 [참고문헌:Janzen, E.G, et al., J. Organic Chem. 35:88-95 (1970); Maeda, K. et al., Bul. Chem. Soc. Japan 50:473-481 (1977); Maskiewicz, R. et al., J. Am. Chem. Soc., 101/18:5347-5354 (1979); Maskiewicz, R. et al., ibid, 101/18:5355-5364 (1979)].

9번 탄소 원자 위치에서 10-메틸 아크리딘을 변형 및 유도시켜 가변적인 안정도를 갖는 유용한 여러가지 화학발광 분자를 생성하였다 [참고문헌: Law, S.-J., et al., J. Biolum. Chemilum. 4:88-98 (1989)]. 상기 분자들을 0.1mol/L 질산중의 0.5% w/v 과산화수소에 노출시키고 0.25mol/L의 수산화나트륨을 함유하는 별도의 용액에 노출시키면 5초 이내 동안 지속되는 섬광을 발생시킨다.

본원에서 규정된 바와 같은 발광 유도체, 발광 유도체화 분자, 또는 유도체화된 발광 분자는, 전구체 분자의 화학적 반응성 및 특성을 변화시켜 분석물 또는 특수한 결합 파트너에 적절히 컨쥬게이트되는 발광 분자를 생성시키는 작용기 또는 기의 공유결합에 의해 생성되며, 본 발명의 당업자가 검정법 개발에서 사용하고자하는 분자이다. 비아크리딘을 두 개의 10,10' 위치중 하나 또는 둘 모두의 위치에서 N-히드록시 숙신이미드 유도체화시키면 본 발명의 바람직한 발광 유도체가 생성된다. 제 1 화합물 또는 제 1 분자의 반응에 의해 제 1 화합물 또는 제 1 분자에 비해 크거나 작지만 제 1 화합물 또는 제 1 분자 구조의 일부를 유지하는 신규한 화합물 또는 신규한 분자가 생성된다면 (또는 생성될 수 있다면), 이러한 화합물 또는 분자를 제 1 화합물 또는 제 1 분자의 "유도체"라고 한다. 본원에서 사용하는 용어인 "유도체"에는 "발광 유도체"도 포함될 수 있다.

본 발명이 있기 전까지, 유도체화된 발광 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘을 합성하지 못했다. 종래에 공지된 발광 비아크리딘(예: 루시제닌)은 분자를 또 다른 분자에 컨쥬게이트시키는 반응성기를 전혀 함유하지 않는다. 현재까지, 비아크리딘은 단지 학술적인 관심의 대상이었으며, 광 생성의 기작 및 반응성 이온 종의 상호작용을 연구하기 위해 사용되었다.

광 전도 물질(예: 광섬유 다발)의 표면에서의 발광 반응을 사용하는 것은 발광 센서 또는 프로브 개발의 기초이다[참고문헌: Blum, L.J. et al., Anal. Lett. 21:717-726 (1988)]. 이러한 발광은 특이적인 단백질 결합(항체)에 의해 조절될 수 있고, 프로브 표면에서 마이크로환경하에서 생성될 수 있다. 그 후에 광 생성은 광자 측정기에 의해 공식화된 균일한(이탈이 없는) 검정으로 측정된다[참고문헌: Messeri, G. et al., Clin. Chem 30:653-657 (1984); Sutherland, R.M. et al., Complementary Immunoassays, Collins, W.P., ed., (John Wiley & Sons, Ltd.) pp. 241-261 (1988)].

하전된 합성 중합체(브롬화 폴리-N-에틸-4-비닐피리디늄, PEVP)가 하전된 컨쥬게이트 분자에 의한 정전기적 상호작용을 통해 광 생성을 완전히 억제할 수 있다는 것이 증명되었다. 이러한 것은 음으로 하전된 페록시다아제에 의해 촉매화된 증대된 루미놀 화학발광 반응에서 연구되었다. 저분자량의 전해질을 첨가하면 상기 억제가 사라져 관찰된 효과의 정전기적 성질이 유지된다[참고문헌: Valsenko, S.B. et al., J. Biolum. Chemilum. 4:164-176 (1989)].

발광성 모세관 전기영동겔, 겔 전달 또는 블롯법(서던, 웨스턴, 노던 및 도트)은 단백질 및 핵산 유전 물질의 정량적 측정법을 제공하는 기술의 예이다. 이러한 측정법은, 예를 들어 프로브, PCR(폴리머라아제 연쇄 반응) 밴드, RFLP(제한 단편 길이 다형성)과 같이 분석물 발현을 증폭시키는 방법 및 유전자와 다른 분석물 발현을 증폭시키는 다른 방법과 함께 이용될 수 있다[참고문헌: Stevenson, R., Biotech. Lab. 8.4-6 (1990)]. 보다 많은 광자를 방출시킬 수 있는 비아크리딘을 합성하고 현존하는 신호 용액을 개선시켜 화학발광 반응으로부터 수득되는 광 출력을 증가시키고, 화학발광 반응 동안에 광의 세기를 더 강하게 제공하는 신규한 신호 용액을 생성하는 것이 검정 감도를 개선하는데 이익이 된다. 신호 용액 제형의 조작을 통해 광 출력의 반응과정을 조절하는 능력은 다양한 용도(유전 프로브, 센서, 호르몬 등)를 위한 테일러링(tailoring) 검정에서 특히 유리하다.

발명의 요약

본 발명의 한 관점은 샘플중의 비아크리딘 발광 유도체의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 샘플을 신호 용액에 접촉시켜 화학발광에 의해 측정가능한 방출광을 발생시키는 단계 및 방출광을 광도측정 기계 또는 기기로 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 일면은 분석물, 분석물의 결합 파트너, 또는 분석물의 결합 파트너의 리간드와 결합할 수 있는 발광 유도체화된 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 분자를 합성하는 방법을 제공한다. 이러한 분자들은 1번 내지 8번 탄소 원자와 같은 분자 상의 다른 자리에서 추가로 치환될 수 있다.

본 발명은 또 다른 일면은 화학 검정, 리간드 결합 검정, 면역검정, 또는 뉴클레오티드 검정에서 유용한 측정 가능한 광을 방출시키는 화학발광 시스템에 관한것이다. 이러한 시스템은, 약 10.0 내지 약 14.0의 pH 범위에서, 분석물, 분석물의 결합 파트너, 또는 분석물에 대한 결합 파트너의 리간드와 결합하고 특정 활성화 에너지 및 산화 전위를 갖는 10,10' -치환된- 9,9' -비아크리딘 및 비아크리딘의 고유한 산화 전위를 극복할 수 있는 산화물 또는 산화물들의 조합물을 포함한다. 이러한 시스템에서 비아크리딘은, 화학 검정, 동종, 이종 경쟁적 면역검정 및 샌드위치 면역검정, 리간드 결합 검정 및 뉴클레오티드 검정에서의 화학발광의 생성을 위한 발광 표지(트리거 (trigger) 또는 태그(tag))로 작용한다. 따라서, 친핵성 반응물 및 1종 이상의 산화제가 포함된 신호 용액에 비아크리딘이 노출되는 동안에 광이 생성된다.

10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘이 표지로 사용되면 공지된 화학발광 표지에 비해 더욱 감도가 높아 보다 소량의 분석물을 검출할 수 있고, 상기 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘은 신호 용액의 제형을 조작하여 광생성 반응과정을 변형시켜 0.1초 이상 내지 6초 동안의 안정한 광생성 반응과정을 겪게 된다.

본 발명의 또 다른 일면은 강력한 발광 특성을 갖는 신규한 10-치환된 비아크리딘을 합성하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 치환체를 에스테르화시키는 단계, 출발물질(아크리돈)을 알킬화시키는 단계, 상기 아크리돈을 이량체화시키는 단계 및 (필요에 따라) N-히드록시숙신이미드로 유도체화시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 일면은 발광 분자인 화학발광 표지와 반응하면 화학발광을 생성시키는 화학발광 신호 용액에 관한 것이다. 이러한 신호 용액은 약 10.0 내지 약 14.0의 pH 범위에서, 0.02M의 사붕산나트륨(붕사), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디메틸 술폭시화물(DMSO), D-프룩토오스, 과산화칼륨(KO₂) 및 2-메틸-2-프로판올을 포함한다. 화학발광 표지가 아크리디늄 유도체, 루시제닌, 루시제닌 발광 유도체, 비아크리딘, 비아크리디늄 발광 유도체, 시클릭 디아실 하이드라지드 또는 프테리딘이면, 반응은 1ng/ml의 표지 농도에서 20:1 이상의 신호 대 잡음 광자 방출비를 0.1초 이상 동안 생성시킬 것이다. 신호비는 표지 및 신호 용액 성분의 농도 변화에 의존하여 1ng/ml 이상의 표지 농도에서 50:1, 100:1, 200:1, 500:1 및 심지어 700:1이 될 수 있다. 방출을 조작하여 발광을 6초 이하로 또는 6초 이상으로 지속시킬 수도 있다.

상기 신호 용액이 아크리디늄 유도체, 루시제닌 및 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘의 화학발광을 일으켜 광 생성을 현저히 증가시키고, 종래에 공지된 신호 용액에서 수득되는 광 출력으로부터 광 출력 반응과정을 변화시킬 수 있다는 것도 입증되었다.

본 발명은 신규한 10,10' -치환된-9,9' -비아크리디늄 유도체를 합성하는 방법, 이러한 신규한 분자로부터 광을 발생시키기 위한 신규한 화학 용액을 제조하는 방법, 및 발광 반응과 검정에서의 이러한 신규한 분자의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 10,10' -파라-톨루산-9,9' -비아크리딘의 N-히드록시숙신이미드 유도체를 합성하는 방법 및 이러한 신규한 분자를 항체와 같은 또 다른 분자에 공유결합(컨쥬게이트)시키는 능력 및 이러한 결합된 화학발광 표지 분자로부터 측정 가능한 광을 발생시키는 능력을 입증하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 또한 화학적 검정, 핵산 검정 및 면역검정에서 유용한 고율의 광자 방출을 생성시키기 위해 수성 사붕산나트륨중에서 하나 이상의 산화제, 술폭시화물, 킬레이트화제, 환원당, 및 알코올을 포함하는 발광 신호 용액에 관한 것이다.

도 1은 본 발명의 신호 용액으로 섬광을 발생시키는 경우에, 신호 시약 (제로), 루시제닌 및 10,10' -파라-톨루산-9,9' -비아크리딘의 상대적 화학발광을 비교한 실험 결과를 나타낸 막대그래프이다.

도 2는 항체와 컨쥬게이트 결합되는 경우에, 본 발명의 표지를 주사 분광 광도계로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 표지된 항체를 본 발명의 신호 용액으로 섬광 발생시키는 경우에 수득된 신호의 선형도를 나타낸 곡선이다.

도 4는 본 발명의 신호 시약의 제형을 변화시켜 수득한 광 출력 반응과정에서의 가변성을 설명하는 전형적인 반응과정이다.

도 5는 10,10' -파라-톨루산-9,9' -비아크리딘 이질산염의 N-히드록시숙신이미드 유도체를 합성하는 바람직한 방법의 개략적인 플로우 다이어그램이다.

본원내의 단어 및 용어는 일반적인 정의를 가지지만, 하기 정의가 본 발명의 바람직한 구체예에 적용된다.

본원에서 정의한 바와 같이, 신호 용액은 특이적인 발광 분자 또는 특이적인 매개 분자와 조합되면 광을 발생시키는 시약 또는 시약군을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 발광 표지 또는 태그는 신호 용액과 조합되면 광을 발생하거나 광을 발생시키는 분석물, 분석물의 결합 파트너, 또는 분석물의 결합 파트너의 리간드와 직접적으로(예를 들어, 공유결합) 또는 간접적으로(예를들어, 특이적인 결합물질(단백질), 비오틴-아비딘 또는 비오틴-스트렙타비딘 브리지에 의해) 결합하는 물질이다. 발광 표지는 발광 분자(즉, 광을 방출하는 물질)이다.

본원에서 정의한 바와 같이, 발광 분자는 화학 용액의 성분에 의해 전자적으로 여기된후 궤도 전자가 기저 상태로 복귀하는 동안 광자를 방출하는 물질이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 발광 반응물은 유리된 상태의 발광 분자(즉, 분석물, 분석물의 결합 파트너, 또는 분석물의 결합 파트너의 리간드와 결합하지않은 발광 분자)이다. 또한, 본원에 사용되는 바와 같이, 단수형의 "발광 분자"에는 복수형의 "발광 분자들"도 포함될 수 있다. 또한, 본원에 사용되는 바와 같이, 단수형의 "발광 매개성 분자"에는 복수형의 "발광 매개성 분자들"도 포함될 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, 신호 용액은 유리된 상태의 분자(즉, 분석물, 분석물의 결합 파트너, 또는 분석물의 결합 파트너의 리간드와 결합하지 않은 분자)로 이루어져 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 단수형의 "발광 분자"는 복수형의 "발광분자들"도 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 단수형의 "발광 매개성 분자"는 복수형의 "발광 매개성 분자들"도 포함할 수 있다.

본 발명은 분석물, 분석물의 결합 파트너, 또는 분석물의 결합 파트너의 리간드와 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있는 발광 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 유도체 분자를 합성하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 고유의 활성화 에너지 및 산화 전위를 갖는 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 발광 유도체의 존재를 샘플중에서 검출하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 샘플을 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘의 고유의 활성화 에너지 또는 산화 전위를 저하시킬 수 있는 산화제를 하나 이상 포함하는 신호 용액과 접촉시키는 것을 포함한다. 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘과 산화제가 반응하면 화학발광에 의해 광이 방출된다. 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘에 의한 화학발광적 광 출력에 대하여 가정된 기작은 수산화물 이온 같은 친핵체를 비아크리딘에 첨가하여 9,9' -탄소 원자 간의 이량체를 분리시킴으로써 개시된다. 앞서잔젠(Janzen) 등, 매다(Maeda) 등 및 마스키에위츠(Maskiewicz) 등에 의해 논의된 바와 같이, 이량체의 분리로 인하여, 산화되면 광을 발생시킬 수 있는 2개의 N-메틸 아크리돈 분자가 생성된다. 적당한 발광 분자로부터 전자가 추출되면, 발광 분자는 기저 에너지 상태로 복귀하는 동안 광자를 방출하는 여기된 중간물을 형성한다. 그후에, 베르톨트 루맷(Berthold Lumat) LB 950 광도계와 같은 광도측정 기계 또는 기기로 광을 측정하는 것이 바람직하다. 이러한 방법은 용액중의 형광단 검출에 사용되는 통상의 형광측정법에 수반되는 간섭 및 자체 흡수 문제를 해결하므로, 감도가 더욱 높고 정확하다.

과산화칼륨은 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘의 산화 전위를 극복하는데 바람직하다. 그러나, 과산화칼륨은 사산화 오스뮴 또는 과산화수소와 같은 다른 산화제와 함께, 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘의 고유의 산화 전위를 또한 극복 할 수 있는 또 다른 산화제 혼합물이다.

본 발명은 또한 화학 검정, 면역검정과 같은 리간드 결합 검정, 또는 뉴클레오티드 검정에서 유용한, 측정 가능한 광을 방출시키기 위한 화학발광 시스템에 관한 것이다. 상기 시스템은 약 10.0 내지 약 14.0의 pH 범위에서, 분석물, 분석물의 결합 파트너, 또는 분석물의 결합 파트너의 리간드와 결합하고 산화 전위를 갖는 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 발광 유도체, 및 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘의 산화 전위를 감소시킬 수 있는 하나 이상의 산화제를 포함한다. 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘은 본질적으로 표지(즉, 태그 또는 트레이서)로서 작용하고, 화학발광 반응에서 광을 발생시킨다. 면역검정은 동종 또는 이종, 경쟁적 검정 또는 샌드위치 검정일 수 있다. 광은 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘이 산화제 또는 산화제들에 노출되는 동안 일어나는 화학발광에 의해 생성된다.

상기 시스템은 핵산, 항체, 항원, 합텐 또는 합텐 컨쥬게이트, 거대 분자, 단백질, 또는 중합체와 같은 분석물을 검출하는 데에 특히 유용하다. 이러한 시스템에서 분석물에 대한 결합 파트너는 뉴클레오티드 프로브, 항체, 항원, 합텐, 합텐 컨쥬게이트, 거대 분자, 단백질 또는 중합체일 수 있다.

본원에서 사용하는 리간드는 연결 또는 결합 분자를 의미하며, 항원, 항체, 합텐, 합텐 컨쥬게이트, 거대 분자, 단백질, 또는 단백질 이외에 폴리탄화수소, 폴리글리세리드 또는 다당류와 같은 중합체를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 합텐 컨쥬게이트는 또 다른 분자에 부착되는 소분자(즉, 분자량이 6000 달톤 미만인 분자) 이다. 특히 적당한 합텐 컨쥬게이트는 스테로이드 분자-10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 컨쥬게이트이다. 분석물이 결합 파트너에 결합될 수 있거나, 결합 파트너가 비오틴-아비딘 또는 비오틴-스트렙타비딘 브리지에 의해 리간드에 결합될 수도 있다. 리간드는 비오틴, 아비딘, 또는 스트렙타비딘일 수 있고, 분석물은 비오틴-아비딘 또는 비오틴-스트렙타비딘 시스템에 의해 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘에 결합될 수도 있다. 상기 시스템은 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 발광 표지 및 산화제로서 과산화칼륨을 포함하면 고감도(항체 또는 항원을 10^-16내지 10^-20몰 이하까지 검출)의 시스템이 된다. 상기 시스템이 킬레이트화제, DMSO, D-프룩토오스, 2-메틸-2-프로판올, 수성 사붕산나트륨 및 산화 전위를 극복할 수 있는 산화제의 조합물을 포함하면 더욱 고감도(항체 또는 항원을 10^-22몰 이하까지 검출)의 시스템이 된다.

화학발광 시스템은 약 10 내지 약 14의 pH 범위에서 유효하겠지만, pH가 12.5 내지 13.5인 것이 바람직하다.

시스템중에서 다른 시약과 함께 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 태그의 화학발광 특성은 상기 시스템을, 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘이 직접 또는 간접적으로 컨쥬게이트될 수 있는, 호르몬, 비타민, 독소, 단백질, 감염성 및 전염성 제제, 화학물질, 약물, 종양 마커, 수용체, 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 및 유전 물질과 같은 많은 합텐 및 거대 분자 분석물에 대한 초감도 검정의 개발에 특히 적당한 시스템으로 만든다. 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘은 화학발광측정 검정 개발에서의 사용을 위해 항체와 같은 특이적인 결합 단백질에 직접 또는 간접적으로 컨쥬게이트될 수도 있다.

본 발명은 또한, 화학 검정, 면역검정, 리간드 결합 검정 또는 핵산 검정에서 유용한, 측정가능한 광을 방출하는 화학발광 시스템에 관한 것으로서, 분석물, 또는 분석물의 결합 파트너, 또는 분석물의 결합 파트너의 리간드와 결합하고 고유의 산화 전위를 갖는 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘, 및 10.0 내지 14.0의 pH 범위에서 산화제인 과산화칼륨, 또는 사산화오스뮴 및 과산화칼륨을 포함하는 산화제들의 조합물을 포함하는 신호 용액을 포함한다.

본 발명에서 신호 용액과 함께 사용되는 발광 분자의 예는 아크리디늄 유도체, 프테리딘, 프테리딘 유도체, 루시제닌, 루시제닌 유도체, 루시페린, 루시페린 유도체, 시클릭 디아실 히드라지드(루미놀 또는 이소루미놀)가 있고, 디메틸 아크리디늄 에스테르와 같은 아크리디늄 유도체 또는 N-히드록시 숙신이미드의 유도체화로부터 생성되는 분자와 같은 루시페린 및 루시제닌 유도체가 바람직하다.

재언급하자면, 본 발명의 화학발광 시스템은 경쟁적 면역검정 및 샌드위치 면역검정을 포함하는 동종 및 이종 검정에 알맞다. 상기 시스템의 감도는 신호 용액이 전술된 EDTA, DMSO, D-프룩토오스, 하나 이상의 산화제, 2-메틸-2-프로판올 및 수성 사붕산나트륨을 포함하면 매우 높아진다. 재언급하면, 분석물은 핵산, 항원, 항체, 합텐, 합텐 컨쥬게이트, 거대 분자, 단백질 또는 중합체일 수 있다. 동종 검정은 폴리이온과 같은 표지 발광의 억제제의 사용을 포함할 것이다. 폴리(4-비닐피리디늄 중크롬산염)과 같은 폴리양이온이 예를 들어 결합되지 않은 듀터로포르피린 IX 디히드로클로라이드(DPIX) 표지된 화합물을 억제하는 반면에, 폴리(비닐 알킬)과 같은 폴리양이온은 결합되지 않은 양으로 하전된 10,10' -치환된-9,9' -비아크리디늄 표지된 화합물을 억제할 것이다. 이러한 검정의 경우에, "결합되지 않은"이란 예를 들어 화합물이 항원-표지 컨쥬게이트이면 예를 들어 항체에 결합되지 않는 것을 의미하고, 화합물이 항체-표지 컨쥬게이트이면 항원 등에 결합되지 않는 것을 의미한다.

본 발명은 또한 샘플중에서 이중 분석물의 존재를 검출하는 이종 화학발광 검정에서 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘을 사용하는 방법에 관한 것이다. 검출에 적합한 분석물은 핵산, 항체, 항원, 합텐, 합텐 컨쥬게이트, 거대 분자, 중합체또는 단백질이다. 재언급하면, 검정은 화학적 검정, 뉴클레오티드 검정, 또는 면역검정과 같은 리간드 결합 검정일 수 있다. 검정은 이러한 검정들이 조합된 형태일 수도 있다. 본 발명은 제 1 분석물 또는 이 분석물의 결합 파트너 또는 이 분석물의 결합 파트너의 리간드로의 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 태그의 컨쥬게이션을 포함하고, 비금속성 테트라피롤 발광 분자 또는 효소와 같이 화학발광을 매개하는 분자와 같은 다른 태그 또는 표지의 제 2 분석물 또는 제 2 분석물의 결합 파트너 또는 제 2 분석물의 결합 파트너의 리간드로의 결합을 포함한다. 분석물은 폴리뉴클레오티드 가닥, 염소와 같이 화학적으로 활성인 화합물 또는 항체, 항원, 합텐, 합텐 컨쥬게이트, 거대 분자, 단백질 또는 중합체와 같은 면역학적으로 활성인 화합물일 수 있다.

일반적으로, 이중 샌드위치형 면역검정에서, 제 1 분석물 상의 한 자리에 대한 결합 파트너는 유리, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트 또는 폴리스티렌과 같은 고체상에 부착되고, 이와 같이 코팅된 고체상은 샘플 및 분석물상의 제 2 자리에 대한 제 2 결합 파트너와 접촉된다. 제 2 결합 파트너는 표지 (예를 들어, 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 유도체)에 컨쥬게이트된다. 표지 및 결합 파트너만이 원래 다르고 나머지는 동일한 환경이 제 2 분석물에 대해서도 존재한다. 고체상을 세척하고, 결합된 컨쥬게이트를 적당한 신호 용액 또는 신호 용액들에 노출시킨다. 경쟁적 검정에서, 고체상은 관심있는 각 분석물에 특이적인 결합 파트너의 제한된 농도로 피복되는 것이 일반적이다. 그 후에, 고체상은 샘플, 및 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘에 컨쥬게이트된 측정량의 제 1 분석물 및 다른 발광 표지에 컨쥬게이트된 측정량의 제 2 분석물과 접촉한다. 접촉된 후에, 고체상을 세척하여 모든 비결합된 컨쥬게이트를 분리시킨다. 샌드위치형 또는 경쟁형 검정 모두, 세척된 고체상은 2개의 표지중 하나에만 특이적인 신호 용액으로 먼저 별도로 처리될 수 있고, 이러한 과정에서 표지와 용액이 반응하여 광을 방출시키고, 이러한 특이적인 표지와 관련된 분석물의 양은 방출되는 광량을 측정하여 결정할 수 있고, 그 후에 고체상은 다른 분석물에 관련된 제 2 표지 또는 태그에 특이적인 또 다른 화학발광 신호 용액과 별도로 접촉되어 표지와 신호 용액이 반응하여 방출광을 생성한다. 재언급하자면, 제 2 반응으로부터 광을 측정하면 샘플중에 존재하는 제 2 분석물의 양을 결정할 수 있다.

2개의 다른 표지의 결과로서 생성되는 광이 다른 특성(즉, 각 표지에 의해 방출되는 광파장이 다르거나 반응 매초 마다 생성되는 실제 광량이 2개의 표지 간에 다를 수 있다)을 가지기 때문에, 양 컨쥬게이트 모두에 의해 광을 동시에 생성하고, 생성된 광을 분화시키고, 광을 측정하여 샘플중의 각 분석물의 양을 결정하는 신호 용액으로 세척된 상을 처리할 수 있다. 본 발명의 당업자는 형광 측정법에서 사용된 것과 같은 시간 분석형 발광 분석법을 이용하여 2개의 다른 표지의 결과로서 방출되는 광을 분화시킬 수 있다[참고문헌: Lovgren, T. and K. Pettersson, Luminescence Immuno assay and Molecular Application, Van Dyke, K. and R.Van Dyke eds., CRC Ress, Boca Raton, Ann Arbor, Boston, MA, pp. 233-254(1990)].

파장과 같은 방출 특성에서의 차이를 이용할 수도 있다[참고문헌: Kleinerman, M. et al., Luminescence of Organic and Inorganic Materials,Kallmann, H.P. and G.M. Spruch eds., International Conference, New York University Washington Square, sponsored by Air Force Aeronautical Research Laboratory, Army Research Office, Curham Office of Naval Research, N.Y.U., pp. 197-225 (1961)].

비아크리디늄 유도체를 사용하는 이중 분석물 검정에 바람직한 발광 표지는 디메틸 아크리디늄 에스테르와 같은 아크리디늄 유도체 또는 비금속성 테트라피롤이지만, 앞서 논의된 다른 수 개의 발광 표지도 적당하다. 바람직한 비금속성 테트라피롤은 DPIX이다. DPIX 표지에 의해 발광시키는데 바람직한 신호 용액은, 약 10.0 내지 약 14.0의 pH 범위에서, 트랜스,트랜스-5-(4-니트로페닐)-2,4-펜타디에날, 나트륨 디-2-에틸헥실 술포숙시네이트, 발광 반응물 루미놀, 글루코오스, 수산화 벤질트리메틸암모늄, 큐멘 히드로퍼옥시드, 트리소듐 파라 퍼요오데이트(periodate), 과산화칼륨 및 EDTA를 포함한다. 결합된 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘을 가장 잘 섬광 발생시키는 신호 용액은 약 10.0 내지 약 14.0의 pH 범위에서, 0.02의 붕사중에, EDTA, DMSO, D-프룩토오스, 과산화칼륨, 2-메틸-2-프로판올 및 수성 사붕산 나트륨을 포함한다. 분석물 컨쥬게이트중 하나가 효소-표지된 분석물 컨쥬게이트이면, 상기 효소에 대한 기질이 신호 용액에 포함될 수 있다.

부가하여, 본 발명은 샘플내의 이중 분석물을 검출하는 동종 화학발광 검정에 관한 것이다. 경쟁적 유형의 검정에서, 고체상은 각각의 상이한 분석물에 특이적인 결합 파트너로 피복된다. 고체상은 테트라피롤이 표지중의 하나로 사용되는경우에 발광 반응물로 추가로 피복될 수 있다. 그 후, 이와 같이 피복된 고체상은 샘플, 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 표지에 컨쥬게이트된 공지량의 분석물, 비아크리딘 이외의 발광 표지에 컨쥬게이트된 공지량의 다른 분석물, 및 비결합된 컨쥬게이트의 발광 표지의 산화 전위를 극복하는 것을 저해하여, 안티-TSH-10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘과 같은 비결합된 비아크리딘 발광 표지 컨쥬게이트를 억제할 수 있는 폴리이온(브롬화 폴리-N-에틸-4-비닐피리디늄, 중크롬산 폴리-4-비닐 피리미디늄, 폴리염화비닐, 폴리(비닐알코올), 또는 폴리(염화비닐벤질))과 접촉한다[참고문헌: Vlasenko, S.B. et al., J. Biolum. Chemilum. 4:164-176 (1989)]. DPIX 항체 컨쥬게이트와 같은 비결합된 발광 표지 항체 컨쥬게이트를 억제하는 것이 필요한 검정에서는, 폴리양이온을 사용할 수 있다. 접촉 후에, 고체상을 2개의 컨쥬게이트 모두에 의해 동시에 방출광을 생성시킬 수 있는 신호 용액으로 처리하거나, 1개의 표지에 특이적인 신호 용액에 고체상을 개별적으로 접촉시키고, 방출광을 측정하고, 그 후에 나머지 컨쥬게이트의 표지에 의한 방출광에 대해 특이적인 신호 용액에 고체상을 개별적으로 접촉시킨다.

본 발명은 부가하여, 약 10.0 내지 약 14.0의 PH 범위에서, 완충용액중의 150mM 내지 450mM, 바람직하게는 300mM의 과산화칼륨 수용액을 포함하는 화학발광성 신호 용액에 관한 것이다. 바람직한 완충제는 사붕산나트륨이지만, 트리즈마염기 및 붕산과 같은 다른 용액도 적당하다. 이러한 신호 용액과 함께 표지로 사용되는 바람직한 발광 분자는 아크리디늄 및 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 유도체이다. 그러나, KO₂신호 용액과 함께 사용시에는 단독의 이소루미놀 및 발광반응물 루미놀과 함께 듀터로포르피린 IX·2HCl도 적당한 표지이다. 완충된 신호용액내의 KO₂가 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 또는 이것의 유도체와 같은 발광분자, 또는 에스트라디올 17β-10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 또는 안티-TSH-10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘과 같은 발광 표지 컨쥬케이트와 반응하면, 1ng/ml의 표지 농도에서 20:1 이상의 신호 대 잡음 광자 방출비가 0.1초 이상 동안에 생성된다. 표지에 의존하여, 신호비는 이러한 신호 용액 및 다양한 비아크리딘 표지된 컨쥬게이트를 사용하여 1ng/ml의 표지 농도에서 50:1, 100:1 또는 200:1 이상이 될 수 있다. 방출은 6초 이상 동안 지속되도록 조작할 수 있다.

본 발명은, 약 10.0 내지 약 14.0의 pH 범위에서, 0.02M의 수성 붕사, EDTA, DMSO, D-프룩토오스, 과산화칼륨, 및 2-메틸-2-프로판올을 포함하는 화학발광성 신호 용액에 관한 것이다. 이러한 신호 용액은 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 유도체 컨쥬게이트의 화학발광을 일으켜 광생성을 현저하게 증가시키고, 종래에 공지된 신호 용액을 사용하여 수득되는 광 출력 반응과정을 변화시킨다. 이러한 용액이 발광 표지, 또는 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘-항체 또는 안티-TSH-10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘과 같은 발광 표지 컨쥬게이트와 반응하면, 1ng/ml의 농도에서 500:1의 신호 대 잡음 광자 방출비가 0.1초 이상 동안 생성된다(도 3 참조). 재언급하지만, 1ng/ml의 표지 농도에서 용액 및 특수하게 표지된 컨쥬게이트에서의 변화에 의존하여 신호비는 50:1, 100:1 및 심지어 700:1 이상일 수 있다. 6초 이하또는 그 이상 동안 방출이 지속되도록 조작할 수도 있다.

부가하여, 본 발명은 약 10.0 내지 약 14.0의 pH 범위에서, 붕사 수용액중에 EDTA, DMSO, D-프룩토오스, 수산화칼륨 및 2-메틸-2-프로판올을 포함하는 신호 용액에 관한 것이다. 성분, 성분 첨가 순서 및 성분 농도에 관하여 실시예 2에 기재한 방법에 따라 제조하는 것이 신호 용액이 사용되는 본 발명의 모든 측면에서 바람직하다. 그러나, 성분의 첨가 순서는 변할 수 있고, 하기와 같은 다른 성분 농도도 적당하다:

-붕사: 0.005 - 0. 05M의 완충 수용액

-EDTA: 0.002-0.2mM

-DMSO: 0-8μl/ml의 상기 붕사 완충용액

-D-프룩토오스: 2-10 mg/ml의 완충용액

-과산화칼륨: 210-365mM

-2-메틸-2-프로판올: 0.05-0.25 ml/ml의 완충용액

상기 용액이 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘과 같은 발광 표지와 반응하면, 발광 반응물은 1ng/ml의 발광 표지 농도에서 300:1 이상의 신호 대 잡음 광자 방출비를 생성한다. 재언급하지만, 표지에 의존하여, 신호비는 1ng/ml의 표지 농도에서 50:1, 100:1, 200:1 등 일 수 있다. 6초 이하 또는 이상 동안 방출이 지속되도록 조작할 수 있다.

실시예 1

10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 유도체의 합성

유도체화된 발광 비아크리딘 분자를 합성하는 방법은 아케손 및 오르겔(Acheson 및 Orgel)에 의해 기술된 바와 같은 디페닐아민-2-카르복실산 및 N-벤조일-디페닐아민-2-카르복실산의 고리화에 의한 아크리돈의 합성을 포함한다(모든 화학물질 및 용매는 미국 세인트루이스에 소재한 시그마/알드리치(Sigma/Aldrich) 및 캘리포니아 홀리스터에 소재한 퍼시픽 팩 인코포레이티드(Pacific Pac Inc.)로부터 구입가능). 아크리돈은 시그마/알드리치(Sigma/Aldrich)로부터도 구입될 수 있다.

아크리돈의 제조에 부가하여, 아크리돈의 10-탄소 원자에서의 공유 부착을 위하여 치환체 분자의 메틸 에스테르를 합성하였다. 본원에서 사용되는 비아크리딘 분자를 유도체화시키는 치환체 분자는 비아크리딘을 추가 유도체화시키거나 항원, 항체 등과 같은 다른 분자에 비아크리딘을 부착시키는 작용기를 갖는 분자이다. 본 발명에 걸쳐 사용되는 치환체 분자의 분자량은 약 10,000 이하인 것이 보통이다. 본 실시예에서는, 치환체 분자인 알파-브로모-파라-톨루산의 메틸 에스테르화를 수행하였다. 분자의 한 쪽 말단에 양호한 이탈기 (예: 할로겐 원자)를 갖고, 분자에 대한 임의 자리에 작용기가 있는 다른 분자는 치환체 분자로도 작용하고, 성공적으로 에스테르화될 수 있다. 이러한 유형의 또 다른 치환체 분자의 좋은 예는 요오드아세트산이다. 메탄올중의 10%의 삼플루오르화 붕소(g 치환체 분자당 25ml의 삼플루오르화붕소-메탄올을 첨가하는 것이 바람직하다)내에서 치환체 분자를 반응시켜 에스테르화 반응을 수행하였다. 이것을 실온에서 10시간 이상 동안 반응시키고, 메틸 에스테르를 분리 깔때기에서 염화 메틸로 추출하였다. 추출된 메틸 에스테르를 H₂O로 2회 세척하고, 0.1M의 중탄산나트륨으로 1회 세척하고, H₂O로 2회 재세척하였다. 로타증기 RE120 회전 증발기상에서 60℃로 건조하여 부피를 감소시켰다. 메틸 에스테르를 합성하는 또 다른 방법은 에테르를 사용하고, 그후에 디아조메탄을 첨가하고 5%의 진한 황산을 함유하는 메탄올을 사용하는 것이다.

합성의 다음 단계로 아크리돈을 알킬화시켰다. 아크리돈의 알킬화를 위하여, 5.4mM의 아크리돈 및 6.5mM의 수소화 나트륨을 100ml의 무수 테트라히드로푸란(THF)에 첨가하였다. 그 후에 상기 혼합물을 70℃에서 2시간 동안 아르곤 기체하에서 교반하면서 환류시켰다. 상기 혼합물에 5.5mM의 치환체 메틸 에스테르(예를 들어, 알파-브로모-파라-톨루산 메틸 에스테르)를 첨가하고, 이 조합물을 70℃에서 10 - 13시간 동안 교반하면서 환류시켰다. 이때, 염화 메틸렌중의 2%의 메탄올을 사용하여 실리카겔 박층 크로마토그래피(Banker Chemical Co. Phillipsburg, PA)를 수행하였더니, 가수분해된 아크리돈-10-치환체에 대하여 R_f=0.2인 제 1 스포트가 나타났고; 미반응된 아크리돈에 대하여 R_f=0.4인 제 2 스포트가 나타났고; 미지의 부산물에 대하여 R_f=0.5인 제 3 스포트(매우 작음)가 나타났고; 아크리돈-10-치환체 메틸 에스테르(아크리돈-10-파라-톨루산 메틸 에스테르)에 대하여 R_f=0.6인 제 4 스포트가 나타났고; 미반응된 치환체-메틸 에스테르에 대하여 R_f=0.9인 제 5 스포트가 나타났다. 반응혼합물은 침전물을 함유하는 연한 레몬-브라운색이었다. 상기 침전물(가수분해된 아크리돈-10-치환체를 주로 함유)을 여과시키고, 버렸다. 여과물을 분리 깔때기에서 에틸 아세테이트와 물로 추출하여 잔류 염 및 가수분해된 물질을 제거하였다. 수성상에는 불순물들이 남아 있었다. 로타증발기상에서 60℃로 건조시켜 유기 상(에틸아세테이트 상)의 부피를 감소시켰다. 그 후에 염화메틸렌을 첨가하고, 미반응된(불용성) 아크리돈 침전물을 여과시켰다. 그 후에 염화 메틸렌 추출물을 용리시키고, 실리카-60 컬럼상에서 염화 메틸렌중의 3%의 에틸 아세테이트로 정제하였다. 아크리돈-10-파라-톨루산 메틸 에스테르를 용리시키고 제 1 노란색 밴드에 함유시켰다. 염화 에틸 아세테이트-메틸렌 용리액을 메탄올로 치환시켜 (로타증발기상의 연속 공급 튜브를 통해) 상기 물질을 로타증발기상에서 재농축시켰다. 정제된 아크리돈-10-치환체 메틸 에스테르는 연한 노란색 결정성 물질로 침전되었다. 이러한 침전물을 여과시키고, 메탄올로 세척하였다 (수율은 약 50%). 이러한 분자 및 이것들의 산 전구체는, 예를 들어 403nm에서 여기되고 440nm에서 방출되는 아크리돈-10-파라-톨루산과 이것의 NHS 유도체; 및 398nm에서 여기되고 438nm에서 방출되는 아크리돈-10-아세트산과 이것의 NHS 유도체를 갖는 활성 형광단이었다.

아크리돈-10-치환된 중간물(예를 들어, 아크리돈-10-아세트산)은 8.45g의 2-클로로벤조산, 7.8og의 N-페닐글리신, 11.00g의 무수 탄산 칼륨 및 0.30g의 Cu⁺⁺분말을 6ml의 H₂O중에서 잘 혼합시켜 직접 합성하였다. 그 후에 이러한 혼합물을 오일욕에서 160℃로 밤새 환류시켰다. 에탄올을 서서히 첨가하고, 생성물을 수중에 용해시키고, 여과시키고, HCI로 침전시켰다. 전체 혼합물을 재여과시켜 소모되지 않는 2-클로로벤조산을 제거하고, 상기 여과물에 남아있는 오일을 결정화시켰다. 여과물을 NaOH중에서 용해시키고, 여과시키고, 아세트산을 첨가하고, 혼합물을 재여과시켜 미반응된 2-클로로벤조산을 더 제거하였다. 생성물은 HCl을 첨가하여 침전시키고(산 생성물), 건조하였다. 그 후에, 생성물을 과량의 벤젠을 사용하여 추출하였고, 아세트산 나트륨 용액중에서 용해시키고, 활성탄으로 비등시키고, HCl로 재침전시켜 더 정제하였다. 순 생성물을 재여과시키고, 묽은 에탄올로부터 결정화시켜 흰색 침전물(mp. 165-167℃)을 생성하였다.

아크리돈-10-치환된 분자(예를 들어, 아크리돈-10-아세트산)도, 500mg(2.7mM)의 아크리돈, 미네랄 오일중의 130mg의 80% NaH 및 50ml의 무수 THF의 혼합물을 아르곤 기체하에서 2-4시간 동안 환류시켜서 합성하였다. 그 후에 요오드아세트산(540mg, 2.7mM)을 첨가하고, 이 혼합물을 아르곤 기체하에서 10시간 더 환류시켰다. 침전물을 여과시키고, 여과물을 20-30%의 에탄올 용리하에 역상 칼럼상에서 정제하였다. 그 후에 이러한 정제된 물질을 건조하고, THF중에 취하고, 4N의 NaOH로 10시간 동안 가수분해하였다. 물을 첨가하고, 혼합물을 여과시켰다. 필터를 H₂O로 세척하고, 1N의 HCl을 사용하여 혼합물의 pH를 8.0으로 조정하였다. 10 내지 30%의 수중 메탄올로 역상 실리카겔 칼럼상에서 최종 정제를 수행하였다. 로타증발기(예를 들어, RE120)상에서 부피를 감소시키고, pH 2.5에서 1N의 HCl로 밤새 재침전시켰다. 원심분리를 수행하여 생성물을 모으고, 물로 1회 세척하였다. 생성물을냉동 건조기상에서 건조하였다(수율 약 40%).

아크리돈-10-파라-톨루산 메틸 에스테르의 사급화된(quaternized) 9-클로로-아크리딘-10-파라-톨루산 메틸 에스테르로의 전환은 아크리돈-10-치환된 메틸 에스테르와 옥시염화인(POCl₃)을 반응시켜 달성하였다. POCl₃1ml를 50mg의 정제된 메틸 에스테르에 각각 첨가하고, 이 혼합물을 120℃로 오일욕에서 1시간 동안 환류시켰다.

9-클로로-아크리딘-10-파라-톨루산 메틸에스테르의 이량체화 및 탈-에스테르화는, 1g의 저온 아연 금속 및 1 내지 10시간 동안 모든 위치에 대한 냉동 조건하에서 반응하는 10ml의 냉동된 저온 농축된 HCl/100mg의 9-클로로-아크리딘-10-파라-톨루산 메틸 에스테르를 첨가하여 달성하였다. 상기 반응은 격렬하고, 냉동 조건하에서 1-10시간 동안 수행해야만 한다. 그 후에 침전물을 여과시키고, 물로 세척하였다. 산 여과물은 실리카겔 C-18역상 칼럼상에서 정제하였다. 상기 칼럼을 메탄올, 그 후에 0.1N의 질산, 그 후에 0.01M의 인산 완충액으로 전처리하였다. 여과물을 0.01M의 인산 완충액중의 메탄올로 먼저 용리시켜, 부산물, 미반응 물질 및 염을 제거하였다. 그 후에 칼럼의 상단에 부착되는 생성물(10,10' -파라-톨루산-9,9' -비아크리딘염, 이치환된 비아크리딘)을 0.1N의 질산중에서 30% 내지 90%의 메탄올로 용리시켰다(메탄올 세기를 30%에서 90%로 증가시켜 모든 생성물을 제거해야 한다). 생성물을 0.1N의 질산중의 약 50% 메탄올을 사용하여 노란색 밴드로 용리하였다. 그 후에 양성자를 첨가해 정제한 이량체-이질산염(10,10' -파라-톨루산-9,9' -비아크리딘 이질산염)을 60℃의 로타증발기상에서 작은 부피(5ml)로 농축하고, 동결건조시켰다. 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer) 552 분광계상에서의 주사 분광측정법에 의해 밝혀진 특성적인 흡광도는 하기와 같다: 460nm에서 전단 쇼울더(shoulder), 435nm에서 제 1 피크, 415nm에서 제 2 쇼울더, 370nm에서 주 피크, 및 355nm에서 후미 피크가 나타났다(도 2 참조). 브루커(Bruker) ARX 400 기기(Rheinstetten-FO, 독일)상에서의 NMR 플롯은 3.9ppm에서 피크를 제시하며, 이는 이량체상의 10 위치 질소에 메틸렌 탄소가 부착되어 있음을 나타내고, 7 내지 9 ppm 범위에서 다수의 방향족 탄소 피크가 존재함을 나타낸다.

N-히드록시숙신이미드(NHS)에 의한 이량체의 추가 유도체화는 211uM의 디시클로헥실카르보디이미드를 건조 디메틸포름아미드(DMF) 중의 141uM의 이량체(이량체 1mg 당 0.5ml)에 (교반과 함께) 첨가하여 달성하였다. 211uM의 N-히드록시숙신이미드를 상기 혼합물에 첨가하고, 10시간 동안 실온에서 반응되게 하였다. 상기 반응 동안에 형성된 요소 침전물을 여과시켰다. 표지의 이러한 NHS-에스테르는 호박 바이알내에서 매우 안정하다(1년 이상). 역상 TLC상에서 주요 피크는 0.01M의 인산 완충액중의 90%의 메탄올로 용리시키는 동안 이동하지 않았고(장파장 U.V.광하에서 원점에 위치한 노란색 스포트), 0.1의 질산/70%의 메탄올(v/v) 중에서 R_f=0.2로 이동한다.

10,10' -파라-톨루오-NHS-9,9' -비아크리디늄 이질산염 유도체를 함유한 100 마이크로리터의 DMF 용액을 pH 7.4의 PBS중의 1mg의 항체에 첨가하여, 상기 유도체및 항체와의 컨쥬게이션을 개시하였다. 본 실시예에서는, 갑상선 자극 호르몬의 베타-사슬에 대한 폴리클로날 항체를 컨쥬게이트시키는 것이지만, 어떠한 항체, 분석물, 중합체 또는 결합 단백질도 이용할 수 있다. 이러한 혼합물을 실온에서 10시간 동안 반응시키고, 그 후에 54 마이크로리터의 d-L-리신의 1mg/ml 용액을 항체-유도체 혼합물에 첨가하고, 3시간 더 반응시켰다. 이러한 단계는 발광 유도체-항체 컨쥬게이트상의 미반응된 NHS 자리를 차지하게 하는데 필요하다.

이러한 항체-10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 컨쥬게이트는 20cm의 바이오겔(Biogel) P-10 칼럼(BioRad; Herules, CA)상에서 10mM의 이염기성 인산 칼륨 및 0.1M의 NaCl을 함유하는 pH가 7.4인 완충액으로 용리시켜 정제하였다. 항체 컨쥬게이트는 TLC 및 분광측정법에 의해 모니터될 수 있는 컬럼으로부터 제 1 분획으로 용리되었다. 항체 컨쥬게이트는 항체에 대하여 365nm(표지에 대하여 작은 피크) 및 275nm에서 2개의 분광측정 피크를 가지며, 매우 신속한 광 방출 반응과정(도 4 참조)을 생성하는 실시예 2에 기재한 본 발명의 신호 용액으로 성공적으로 섬광을 발생시켰다.

온화한 산성 환경(0.01N의 HNO₃)은 표지를 안정화시키고, 가장 강력한 신호 대 잡음비를 제공한다. HNO₃로 0.01N으로 조정된, 0.2 마이크로리터의 트윈(Tween)-20/ml PSS 를 함유하는 세척 용액은 분리-요구성 검정에서 잘 작용해야 한다. 표지를 섬광 발생시키기 바로 전에 5 마이크로리터의 최종 세척 용액에 노출 시키면 신호를 또한 강화시킬 수 있다.

실시예 2

신호 용액의 제조

신규한 화학발광 분자로부터 광을 발생시키기 위한 신호 용액을 하기와 같이 제형화하였다:

100ml의 0.02M의 사붕산 나트륨에 하기 성분을 교반하면서 첨가하였다:

a) 0,744mg(0.02mM)의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)

b) 100ul의 디메틸술폭시화물(DMSO)

c) 400mg(0.02M)의 D-프룩토오스

d) 1996mg(280mM)의 과산화칼륨(KO₂)

e) 17ml의 2-메틸-2-프로판올

실시예 3

10,10' -파라-톨루산-9,9' -비아크리디늄 이질산염과 비스-N-메틸아크리디늄이질산염(루시제닌)의 비교 검정

도 1에 도시된 바와 같이, 본 실시예에서는 신호용액 만으로 수득된 신호(막대 1), 증류수중의 1.9 나노몰 농도의 루시제닌으로 수득된 신호(막대 2) 및 증류수중의 1.3 나노몰 농도의 10,10' -파라-톨루산-9,9' -비아크리디늄 이질산염으로 수득된 신호(막대 3)를 비교하였다. 신호 용액은 실시예 2에서 기재한 방법에 따라 아래와 같이 제조하였다. 이러한 검정을 위한 조건은 제로 신호를 얻기 위해 300 마이크로리터의 신호 용액을 12 × 75 mm의 폴리스티렌 튜브(VWR Scientific Inc.,펜실베니아주 필라델피아에 소재)내의 5μl의 물에 3회에 걸쳐 첨가하는 것이다. 각 화학발광 분자의 신호는 5μl의 희석된 표지를 버트홀드 루맷 (Berthold Lumat)에서 삼단위로 300μl의 신호 용액으로 섬광 발생시켜 수득하였다.

실시예 4

안티-TSH-10,10' -파라-톨루오-9,9' -비아크리딘 컨쥬게이트의 희석도의 증가에 따른 신호의 선형도를 설명하는 검정

도 3에 도시된 바와 같이, 본 실시예에서는 항체 컨쥬게이트의 화학발광 작용성 및 희석도 증가에 따른 신호의 선형도를 나타냈다. 안티-TSH-10,10' -파라-톨루오-9,9'- 비아크리딘 컨쥬게이트를 10^-9g/ml에서 10^-18g/mg로 희석시키고, 각 희석액의 5μl를 200μl의 신호 시약으로 버트홀드 루맷내에서 삼단위로 섬광 발생시키고, 신호의 세기를 기록하였다. 생성되는 결과는 하기와 같았다:

10^-9g/ml - 12,000,000 계수/초; 10^-12g/ml - 570,000 계수/초; 10^-13g/ml - 37,119 계수/초; 10^-14g/ - 3,510 계수/초; 10^-15/ml - 556 계수/초; 10^-16/ml - 304 계수/초; 10^-17g/ml - 240 계수/초; 10^-18/ml - 229 계수/초; 0.0g/ml- 102 계수/초.

본원에서 언급된 모든 공보물 및 특허 출원들은 이것들이 명확하고 개별적으로 참고문헌으로 각각 나타나있는 것과 같이 동범위로 본원에 참고문헌으로 포함되어 있다.

본 발명을 이제 완전히 설명하였지만, 본 발명의 당업자에게는 첨부된 특허청구의 범위 정신을 벗어나지 않고 많은 변형 및 변화가 있을 수 있다는 것이 분명할 것이다.

Claims

항원, 항체 또는 합텐에 컨쥬게이트된 10,10' -치환된 9,9' -비아크 리딘을 포함하는, 화학 검정, 면역검정, 리간드 결합 검정 또는 뉴클레오티드 검정에서 유용한 측정 가능한 광을 방출시키기 위한 화학발광 조성물.
10,10' -파라-톨루산-9,9' -비아크리딘 이질산염을 포함하는, 화학검정, 면역검정, 리간드 결합 검정 또는 뉴클레오티드 검정에서 유용한 측정 가능한 광을 방출시키기 위한 화학발광 조성물.
화학 검정, 면역검정, 리간드 결합 검정 또는 뉴클레오티드 검정에서 유용한 측정 가능한 광을 방출시키기 위한 화학발광 키트로서,

키트가 10.0 내지 14.0의 pH 범위에서, 산화 전위를 갖는 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 발광 유도체, 및 상기 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 발광 유도체의 산화 전위를 극복할 수 있는 산화제 또는 산화제들의 조합물을 갖는 신호 용액을 포함하며, 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 발광 유도체가 분석물, 분석물의 결합 파트너 또는 분석물에 대한 결합 파트너의 리간드에 결합되는 화학발광 키트.
제 3항에 있어서, 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 발광 유도체가 10,10' -파라-톨루산-9,9' -비아크리딘 또는 10,10' -아세트산-9,9' -비아크리딘인 것을 특징으로 하는 화학발광 키트.
제 3항에 있어서, 완충 용액, 킬레이트화제, 술폭시화물, 환원당 및 알코올을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 화학발광 키트.
제 5항에 있어서, 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 발광 유도체가 10,10' -파라-톨루산-9,9' -비아크리딘 또는 10,10' -아세트산-9,9' -비아크리딘이고, 완충 용액이 수성 사붕산나트륨이고, 킬레이트화제가 에틸렌디아민테트라 아세트산(EDTA)이고, 술폭시화물이 디메틸술폭시화물(DMSO)이고, 환원당이 D-프룩토오스이고, 알코올이 2-메틸-2-프로판올인 산화제들의 조합물을 가짐을 특징으로 하는 화학발광 키트.
제 3항에 있어서, 분석물이 핵산, 항원, 항체, 합텐, 합텐 컨쥬게이트, 거대 분자, 단백질 또는 중합체인 것을 특징으로 하는 화학발광 키트.
제 3항에 있어서, 결합 파트너가 뉴클레오티드 프로브, 항원, 항체, 합텐, 합텐 컨쥬게이트, 거대 분자, 단백질 또는 중합체인 것을 특징으로 하는 화학발광 키트.
제 3항에 있어서, 리간드가 항원, 항체, 합텐, 합텐 컨쥬게이트, 거대 분자, 단백질 또는 중합체인 것을 특징으로 하는 화학발광 키트.
제 4항에 있어서, 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 발광 유도체가 비오틴-아비딘 또는 비오틴-스트렙타비딘 브리지에 의해 분석물, 분석물의 결합 파트너 또는 분석물의 결합 파트너의 리간드와 결합하는 것을 특징으로 하는 화학 발광 키트.
화학 검정, 리간드 결합 검정 또는 핵산 검정에서 유용한 측정 가능한 광을 방출시키기 위한 화학발광 키트에 있어서,

분석물, 분석물의 결합 파트너 또는 분석물에 대한 결합 파트너의 리간드에 결합되는 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 표지, 및 10.0 내지 14,0의 pH 범위에서, 산화제인 과산화칼륨 또는 사산화 오스뮴과 과산화칼륨을 포함하는 산화제의 조합물을 포함하는 신호 용액을 포함하는 키트.
제 11항에 있어서, 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 표지가 10,10' -파라-톨루산-9,9' -비아크리딘 이질산염, 10,10' -파라-톨루오-9,9' -비아크리딘 이질산염, 10,10' -아세토-9,9' -비아크리딘 이질산염 또는 10,10' -아세트산-9,9' -비아크리딘 이질산염인 것을 특징으로 하는 화학발광 키트.
제 11항에 있어서, 신호 용액이 산화제들의 조합물을 포함하고, 완충 용액, 킬레이트화제, 술폭시화물, 환원당 및 알코올을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 화학발광 키트.
제 11항에 있어서, 완충 용액이 수성 사붕산나트륨이고, 킬레이트화제가 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이고, 술폭시화물이 디메틸술폭시화물(DMSO)이고, 환원당이 D-프룩토오스이고, 키트가 알코올 2-메틸-2-프로판올을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 화학발광 키트.
제 11항에 있어서, 비아크리딘 표지가 비오틴-아비딘 또는 비오틴-스트렙타비딘에 브리지에 의해 분석물, 분석물의 결합 파트너 또는 분석물의 결합 파트너의 리간드와 결합함을 특징으로 하는 화학발광 키트.
샘플중의 분석물의 존재를 검출하거나 분석물의 양을 측정하기 위해 화학발광 동종 검정에서 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘을 사용하는 방법으로서,

(a) 분석물에 특이적인 결합 파트너로 피복된 고체상을 제공하는 단계;

(b) 고체상을 샘플 및 소정량의 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘-분석물 컨쥬게이트와 접촉시키고, 결합되지 않은 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘-분석물 컨쥬게이트가 발광을 매개하지 못하게 하는 소정량의 폴리음이온과 접촉시키는 단계로서, 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘이 산화 전위를 가지며, 결합 파트너의일부 또는 전부가 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘-분석물 컨쥬게이트의 일부 또는 전부와 결합하는 단계;

(c) 단계 (b)로부터의 고체상을, 결합된 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘-분석물 컨쥬게이트중의 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘의 산화 전위를 극복하는 산화제 또는 산화제들의 조합물을 10.0 내지 14.0의 pH 범위에서 포함하는 신호 용액과 접촉시켜 광을 방출시키는 단계; 및

(d) 단계(c)에서 방출된 광의 양이 샘플에 존재하는 분석물의 양에 간접적으로 비례하게 될 것이라는 점을 이용하여 단계 (c)에서 방출되는 광의 양을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
제 16항에 있어서, 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘이 10,10' -파라-톨루산-9,9' -비아크리딘 유도체 또는 10,10' -아세트산-9,9' -비아크리딘 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 신호 용액이 완충 수용액, 킬레이트화제, 술폭시화물, 환원당 및 알코올을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 신호 용액이 산화제로 사산화오스뮴 및 과산화칼륨을 포함하고, 수성 사붕산나트륨, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디메틸술폭시화물(DMSO), D-프룩토오스 및 2-메틸-2-프로판올을 추가로 포함하는것을 특징으로 하는 방법.
샘플중의 제 1 분석물 및 제 2 분석물의 존재를 검출하기 위한 이종 화학발광 검정에서 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘을 사용하는 방법으로서,

(a) 제 1 분석물에 특이적인 제 1 결합 파트너 및 제 2 분석물에 특이적인 제 2 특이적인 결합 파트너로 피복된 고체상을 제공하는 단계;

(b) 고체상을 샘플, 및 비-비아크리딘 표지-제 1 분석물 컨쥬게이트 및 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 표지-제 2 분석물 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계로서, 제 1 분석물 컨쥬게이트의 일부 또는 전부가 제 1 결합 파트너의 일부 또는 전부와 결합하고, 제 2 분석물 컨쥬게이트의 일부 또는 전부가 제 2 결합 파트너의 일부 또는 전부와 결합하는 단계;

(c) 접촉된 고체상을 세척하여 비결합된 컨쥬게이트를 결합된 컨쥬게이트로 부터 분리하는 단계;

(d) 단계 (c)에서 세척된 고체상을 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘에 특이적인 신호 용액 또는 비-비아크리딘 표지에 특이적인 신호 용액과 접촉시켜 화학반응에 의해 광을 발생시키는 단계;

(e) 단계 (d)에서의 반응으로부터 발생되는 광을 검출하거나 측정하는 단계;

(f) 단계 (d)에서의 신호 용액이 상기 비-비아크리딘에 특이적인 용액인 경우에, 단계 (d)의 고체상을 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 표지에 특이적인 신호 용액과 접촉시키거나, 단계 (d)에서의 신호 용액이 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 표지에 특이적인 용액인 경우에, 단계 (d)의 고체상을 비-비아크리딘 표지에 특이적인 신호 용액과 접촉시키는 단계;

(g) 단계 (f)에서의 반응으로부터 발생되는 광을 검출하거나 측정하는 단계;및

(h) 단계 (e) 및 (g)에서 검출되거나 측정된 광으로부터, 제 1 분석물 및 제 2 분석물을 검출하거나, 제 1 분석물 또는 제 2 분석물의 양을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
제 20항에 있어서, 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 표지가 10,10' -파라-톨루산-9,9' -비아크리디늄 이질산염, 10,10' -파라 톨루오-9,9' -비아크리디늄 이질산염, 10,10' -아세토-9,9' -비아크리디늄 이질산염 또는 10,10' -아세트산-9,9' -비아크리디늄 이질산염인 것을 특징으로 하는 방법.
제 20항에 있어서, 비-비아크리딘 표지가 듀터로포르피린 IX·2HCl인 것을 특징으로 하는 방법.
제 22항에 있어서, 단계 (f)에서, 단계 (c)로부터 세척된 고체상을, 10.0 내지 14.0의 pH 범위에서 트랜스,트랜스-5-(4-니트로페닐)-2,4-펜타디에날, 나트륨 디-2-에틸헥실 술포숙시네이트, 루미놀 또는 이소루미놀, 글루코오스, 수산화 벤질트리메틸암모늄, 큐멘 히드로퍼옥시드, 삼나트륨 파라 퍼요오데이트, 및 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)를 포함하고, 듀터로포르피린 IX·2HCl에 특이적인 신호 용액과 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 21항에 있어서, 단계 (f)에서, 단계 (c)로부터 세척된 상을, 사붕산나트륨 수용액중에서, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디메틸술폭시화물(DMSO), D-프룩토오스, KO₂, 및 2-메틸-2-프로판올을 포함하고, 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘에 특이적인 신호 용액과 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.
10.0 내지 14.0의 pH 범위에서, 완충 수용액, 킬레이트화제, 술폭시화물, 환원당, 1종 이상의 산화제, 및 알코올을 포함하는 화학발광 신호 용액.
표지 및 신호 용액을 사용하여 검출 또는 측정 가능한 반응 생성물을 생성시켜, 유체 샘플중의 생활성 분석물의 존재를 결정하거나 또는 미지량의 생활성 분석물의 농도를 측정하는 리간드 결합 검정 방법으로서,

표지로서 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘을 사용하고, 신호 용액으로서 수성 사붕산나트륨중의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디메틸술폭시화물(DMSO), D-프룩토오스, KO₂및 2-메틸-프로판올의 혼합물을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
신호 용액, 및 분석물, 분석물의 결합 파트너 또는 분석물의 결합 파트너의 리간드에 결합하는 발광 분자 표지된 화합물을 사용하는 샌드위치식 화학발광 검정에 의해 샘플중의 분석물의 존재 또는 분석물의 양을 검출하는 방법으로서,

발광 분자 표지된 화합물로서 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘-표지된 화합물, 결합되지 않은 비아크리딘-표지된 화합물 중의 비아크리딘이 발광을 매개하지 못하게 하는 소정량의 폴리음이온, 및 신호 용액으로서 10.0 내지 14.0의 pH 범위에서 사붕산나트륨 수용액중의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디메틸술폭시화물(DMSO), D-프룩토오스, 과산화칼륨 및 2-메틸-2-프로판올을 포함하는 용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
2개 이상의 다른 종류의 분자에 의해 측정 가능한 광을 발생시키고, 샘플중의 하나 이상의 분석물을 검출하기 위한 화학 검정, 리간드 결합 검정, 면역검정 또는 뉴클레오티드 검정에서 유용한 화학발광 키트에 있어서,

10.0 내지 14.0의 pH 범위에서, 제 1 분석물, 제 1 분석물의 결합 파트너 또는 제 1 분석물의 결합 파트너의 리간드에 커플링되는 듀터로포르피린 IX·2HCl, 제 2 분석물, 제 2 분석물의 결합 파트너 또는 제 2 분석물의 결합 파트너의 리간드에 커플링되는 10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 발광 표지, 트랜스,트랜스-5-(4-니트로페닐)-2,4-펜타디에날, 나트륨 디-2-에틸헥시 술포숙시네이트, 루미놀, 글루코오스, 벤질트리메틸암모늄 히드록사이드, 큐멘 히드로퍼옥시드, 삼나트륨 파라 퍼요오데이트, 과산화칼륨 및 에틸렌디아민테트라아세트산의 혼합물을 포함하는제 1 신호 용액, 및 수성 사붕산나트륨중에서의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디메틸술폭시화물(DMSO), D-프룩토오스, KO₂및 2-메틸-2-프로판올의 혼합물을 포함하는 제 2 신호 용액을 포함하는 화학발광 키트.
제 28항에 있어서, 소정량의 폴리양이온을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 화학발광 키트.
제 28항에 있어서, 소정량의 폴리음이온을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 화학발광 키트.
10,10' -치환된-9,9' -비아크리딘 유도체를 제조하는 방법으로서,

(a) 하나 이상의 작용기를 갖는 치환체 분자의 메틸 에스테르를 합성하는 단계;

(b) 수소화 아크리돈 나트륨, 무수 테트라히드로푸란 및 단계 (a)에서의 메틸 에스테르를 조합시킴으로써 아크리돈을 알킬화시켜, 아크리돈-10-치환체-메틸 에스테르를 생성시키는 단계;

(c) 단계 (b)로부터 생성된 아크리돈-10-치환체-메틸 에스테르를 옥시 염화인과 반응시켜 사급화된 9-클로로-아크리딘-10-치환체-메틸 에스테르를 생성시키는단계;

(d) 단계 (c)로부터 생성된 9-클로로-아크리딘-10-치환체-메틸 에스테르를 금속 아연 및 진한 염산과 반응시켜 사급화되고, 탈-에스테르화되고, 이량체화된 10,10' -치환체-9,9' -비아크리딘염을 생성시키는 단계;

(e) 단계 (d)로부터 생성된 비아크리딘염을 질산과 반응시켜 10,10' -치환체-9,9' -비아크리딘 이질산염을 생성시키는 단계; 및

(f) 단계 (e)로부터 생성된 이량체 이질산염을 디메틸포름아미드중에서 카르보디이디드 및 N-히드록시숙신이미드와 반응시킴으로써 이량체 이질산염을 추가로 유도체화시켜, 비스-NHS-10,10' -치환체-9,9' -비아크리딘 이질산염을 생성시키는 단계를 포함하는 방법.
비스-NHS-10,10' -파라-톨루오-9,9' -비아크리디늄 이질산염을 포함하는, 화학 검정, 면역검정, 리간드 결합 검정 또는 뉴클레오티드 검정에서 유용한 측정 가능한 광을 방출시키기 위한 화학발광 조성물.