JPH0367156A - 発光アッセイの感度を高めるための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、発光アッセイ及びそのようなアッセイの感度
を高めるための方法に関する。

〔背　景〕

広範囲の種類の分析技法が、複合体を形成する分析物と
相互作用する特異的結合化合物を用いて開発されて来た
。そのような技法は、不均一アッセイ（ここで特異的結
合化合物／分析物複合体が未反応分析物及び結合化合物
から分離される）及び均一アッセイ（ここでそのような
分離は必要とされない）に広く分けられ得る。結合シス
テムの１又は複数の成分に結合される１又は複数のシグ
ナル発生ラベルを用いて、複合体の形成を指摘する。

これらの技法は、１９６０年代に通常使用されたラジオ
イムノアッセイにより例示されるように、ラベルとして
放射性同位体を用いてまず開発された。

競争ラジオイムノアッセイにおいては、下記等式１にお
いて例示されるように、このアッセイは、特異的結合化
合物（抗体；　Ａｂ）上の抗体結合部位の制限された数
のために標的分析物（抗原；　Ａｇ）と既知量のラベル
された抗原（Ａｇ”）との間の競争に基づかれており、
遊離及び結合状態の間にラベルの分配をもたらす。次に
、遊離又は結合されたラベル抗原のいずれかが、測定さ
れ、抗原の定量化を可能にする。

等弐ｌ（非理論的） Ａｇ＋Ａｇ”＋Ａｂ＋Ａｂ−Ａｇ”＋Ａｂ−Ａｇ＋Ａｇ
”＋Ａｇ特異的結合アッセイのもう１つの例は、ますま
す普及しているサンドイッチアッセイであり、ここで２
種の特異的結き化合物が単一の分析物分子と相互作用す
る（たとえばＡｂ＋　　Ａｇ　　Ａｂｚ）。典型的には
、結合化合物の１つが固体表面に結合し、そしてそれを
用いて、その表面上に分析物を捕獲する。次に、検出可
能なラベルによりラベルされた第二結合化合物が、分析
物上の第二結合部位と結合し、その結果ラベルが容易な
測定のために固体表面上に捕獲される。サントイ・ンチ
アッセイはまた、イムノメトリックアッセイとしても言
及される。本明細書に引用される出版物に記載されるア
ッセイにより例示されるように、特異的結合を利用する
多くの他のアッセイタイプが知られている。

放射性ラベルの他に、多くの他のラベルが特異的結合ア
ッセイに使用されて来た。多くの場合、螢光分子及び酵
素は、放射性ラベルの使用に起因する処理問題を回避す
るために使用されて来た。

発光分子もまた、ラベルとして示唆されて来た。

化学発光及び生物発光化合物の両者も利用できる。

化学発光化合物は、適切な条件（通常、酸化）下で、−
重項電気的励起状態において螢光生成物を生成する化合
物である。基底状態への崩壊は、光の光子を生成する。

化学発光分子の例は、ル≧ノール、イソルミノール、シ
アクリジニウム塩、ロピン及びオキサレートエステルを
包含する。可視光線の発光は容易に測定され、そして定
量化されるので、化学発光ラベルは、あるタイプのイム
ノアッセイに都合良く使用されて来た。化学発光アッセ
イの例は、アメリカ特許第４　＋　２２０，４５０号、
アメリカ特許第４，１０４，０２９号及びイギリス特許
第Ｌ４６１，８７７号に開示される。化学発光イムノア
ッセイの分野における最近の進歩がまた、“Ｌｕｍ１ｎ
ｅｓｃｅｎｔ　Ａｓ５ａｙｓ　、　Ｎ、５ｅｒｉｏ及び
Ｍ、Ｐａｚｚａｇｌｉ＋第１巻。

Ｒａｖｉｎ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８２に要約されている
。

均一化学発光イムノアッセイは、エネルギー移行に基づ
いて説明されて来た（Ｐａｔｅｌ　ｔｉｅ、、　Ｂｉｏ
。

Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　Ｔｒａｎｓ、＋　１９８３．１
１：１９６）。アミノブチルエチルイソルミノールはラ
ベルとして抗原に結合され、そしてその対応する抗体は
、エネルギー移行受容体、すなわち螢光分子、たとえば
フルオレセインによりラベルされた。ラベルされた抗原
がそれらのそれぞれの螢光ラベルされた抗体に結合され
る場合、５２５ｎｍ　（緑）での発光に対する４６０ｎ
ｍ（青）での発光の割合における変化（シフト）が観察
される。このエネルギー移行方法が、いくつかの抗原の
ための均一化学発光アッセイを開発するために使用され
た。

化学発光分の他に、生物発光分子もまた、ラベルとして
使用され得る。化学発光及び生物発光分子は、生物発光
アッセイにおいて、タンパク質相互作用のための必要条
件、−船釣に光トリガー酵素、たとえばルシフエラτゼ
又は実際の発光分子を結合するが、しかし外部トリガー
、たとえばカルシウムイオンの不在下で光を生成しない
光タンパク質のいずれかにより区別される。多くのその
ようなア・７セイは、Ｗｉｌｆｒｉｄ　Ｒ，Ｖｕｔｔに
より出版された″Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏａ
ｓｓａｙ”のチャプター５（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　ａｎｄ
　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｓ５ａ　ｓ　　Ｍａｒｃ
ｅｌＤｅｋｋａｒ、　Ｉｎｃ、を第１４巻、　１９８４
］及びＰａｔｅｌ　ａｎｄＣｏｒｍｉｅｒ＋　Ａｎａｌ
　ｔｉｃａｌ　Ａ　　１ｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｂｉ
ｏ−１ｕｍｉｎｅｓｃｅｎｅｅ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｌ
ｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓ
ｓ、　Ｉｎｃ、　、　２７３〜２７６ページ、　１９８
４に記載される。また、生物発光及び化学発光アッセイ
に関連する“Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｏｒ　Ｑｕａｎｔｉ
ｆｙｉｎｇ　ＳｕｂｓｔａｎｃｅｓＵｓｉｎｇ　Ｌａｂ
ｅｌｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”の標題のアメリ
カ特許第４７８，８１７号、及び１９８７年６月５日に
出願された”Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｉｍｍｕ
ｒｉｏａｓｓａｙｓ　ＩＪｔｉｌｉｚｉｎｇＣｏｅｌｅ
ｎｔｅｒａｔｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓ
ｅｓ　ａｎｄ　Ｐｈｏｔ。

ｐｒｏｔｅｉｎｓ”の標題のアメリカ山間第０５９．１
３７号も参照のこと。

生物発光アッセイの利点は、処理問題を伴わないそのよ
うな化合物のために利用できる高い理論的な感度である
。１０−２°Ｍの濃度での生物発光ラベルの検出が、理
論的に可能である。しかしながら、この理論的な限界へ
は通常、近づくことはできない。なぜならば、分析が行
われる反応容器の表面への生物発光アッセイで見出され
るタンパク質の非特異的結合及びこれらのタンパク質性
分子と反応媒体に存在する他の成分との非特異的結合相
互作用が存在するからである。

特にガラス表面へのタンパク質の゛付着性パは良く知ら
れている。本発明の前、無関係なタンパク質、たとえば
血清アルブミンを用いて、反応容器の表面を予備被覆す
れば、アッセイに使用されるタンパク質はその表面に付
着しないであろう。

しかしながら、そのようなアプローチは最大の感度を付
与しない。なぜならば、反応媒体中の種々の表面及び成
分のための被覆タンパク質の結合親和性は、ラベルタン
パク質の親和性と異なるからである。

従って、サンプル中の分析物の存在を検出することに生
物発光ラベルを用いる改良された技法の必要性がある。

（発明の要約〕 従って、生物発光アッセイの感度を高めるための方法を
提供することが本発明の目的である。

すべてのタイプの生物発光アッセイにおいてバックグラ
ウンド発光を減じることもまた、本発明の目的である。

この後、明らかになるであろうような本発明の他の目的
は、サンプル中の分析物の存在を検出するための生物発
光方法の感度を改良するために使用され得る技法を提供
することによって達成された。この方法は、検出される
結合システムの成分上でラベルとして発光分子に結合さ
れ発光タンパク質を使用し、そしてその発光タンパク質
に結合される発光分子により放される光を検出する。発
光タンパク質は、特異的性質、すなわち、外部のトリガ
ーの不在下で光を放さないで発光分子を結合する能力を
有する。バックグラウンド光の発光は、反応媒体へのト
リガーの導入の前、及び好ましくはラベルが反応媒体に
導入される前、結合された発光分子を含まない発光タン
パク質（そのようなタンパク質は一般的にアポ発光タン
パク質として言及される）と反応媒体とを接触すること
によって、反応媒体から減じられる。次に、外部からの
トリガーが、光の発光を引き起こすために反応媒体に添
加される。反応媒体の表面又は成分への生物発光システ
ムのタンパク質成分の付着によりこれまで引き起こされ
て来たバックグラウンド発光が、ラベルとして使用され
る同じタンパク質により防がれるので、感度が高められ
る。

〔特定の態様の記載〕

本発明は、サンプル中の分析物の存在及び／又は量を検
出するために使用される生物発光アッセイの感度を高め
るための方法を提供する。本発明の利点の１つは、本発
明が、不均一又は均一アッセイ、直接的又は競争アッセ
イ、又はいずれ力）他の変法などのいずれのタイプの生
物発光アッセイにおいても、バックグラウ、ンド光の発
光を減じるために使用され得ることである。これは、バ
ックグラウンド光の発光を減じることに関係する要所段
階が、アッセイ自体に関与される段階でないので可能で
ある。代わりに、バックグラウンド光の発光は、生物発
光ラベルとしてその結合された発光分子を有するその対
応する発光タンパク質を用いて、反応媒体とアポ発光タ
ンパク質とを接触することによって減じられる。驚くべ
きことには、アッセイは、発光タンパク質ラベルとアポ
発光タンパク質バックグラウンドブロッカ　［これはバ
ックグラウンド発光を高めるであろう（下げるよりもむ
しろ）］との間の実際の発光分子の交換なしに行われ得
ることが見出された。

本発明のかぎとなる成分は、その発光分子に結合され、
そして検出される成分のために検出可能なラベルとして
使用するために外部トリガーにより引き起こされ得る発
光タンパク質である。対応するアポ発光タンパク質（結
合された発光分子を有さない発光タンパク質）もまた存
在すべきである。この発光タンパク質は、ルシフェラー
ゼ、すなわち生物発光アッセイに使用するために通常報
告されている分子と同じものではない。ルシフェラーゼ
及び発光タンパク質の両者は、発光分子からの光の生成
を触媒し、そして異なった機構により作用する。ルシフ
ェラーゼは通常、酸化反応の前、有意な期間、発光分子
を結合しないが、しかし代わりに、（酸素の存在下で）
ルシフェリンとすぐに反応し、光を発生せしめる。

本発明の方法により使用される特定の生物発光ラベル（
発光タンパク質）は、ルシフェリンに結合することがで
きるタンパク質又は関連分子（たとえば糖タンパク質）
、又は他の光発光分子を含んで成り、そして外部トリガ
ーにより開始せしめられる。発光タンパク質は、光を発
光しないで、酸素の存在下で実際の発光分子を結合する
それらの能力による初期結合に基づいて発光反応を開始
せしめるルシフェラーゼ及び他の酵素と容易に区別でき
る。他のトリガー分子の使用を必要としないで酸素の存
在下で光を発生するルシフェラーゼ及び他の酵素は特に
、発光タンパク質の定義から排除される。

光をすぐに発光しないで、ルシフェリン及び関連する光
−発光分子を結合する分子は一般的に、発光タンパク質
と呼ばれる。腔腸動物由来の発光タンパク質は、特に本
発明の実施のために有用である。腔腸動物由来の発光タ
ンパク質の例は、エクオリン、オペリン、ムネミオプシ
ン及びベロビンである。これらの分子は、多くの技術出
版物、たとえばＷａｒｄ　ｆ＆５．、　　Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、υＳ八（１９７５）
　７２　：　２５３０〜２５３４に記載される。そのよ
うな腔腸動物由来のタンパク質は、遊離カルシウムイオ
ンの不在下で安定しており、そして腔腸動物のルシフェ
リン及びそのタンパク質に結合される酸素の両者を含む
。カルシウムイオン、すなわち腔腸動物由来の発光タン
パク質のための生物発光トリガーが発光タンパク質によ
りラベルされた溶液に添加される場合、約４６９ｎｍの
最大波長を有する青色の光が生成される。そのようなラ
ベルは、１９８７年６月５日に出願されたアメリカ出願
第０５９、１３７号に詳細に説明される。遺伝子工学の
技法により調製されたアポ発光タンパク質の形が、１９
８８年２月２９日に出願されたアメリカ出願第１６５゜
４２２号及び１９８８年３月１７日に出願されたアメリ
カ出願第１７３．０４５号に記載されており、そしてこ
れらの両者の表題は、”Ｒｅｃｏｍｂｔｎａｎｔ　ＤＮ
Ａ　ＶｅｃｔｏｒｓＣａｐａｂｌｅ　ｏｆ　Ｅｘｐｒｅ
ｓｓｉｎｇ　Ａｐｏａｅｑｕｏｒｉｎ”である。

分析物及び特異的結合システムの他の成分への生物発光
ラベルの結合を記載する出版物の例は、”Ｂｉｏｌｕｍ
ｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ　Ｕｔｉ
ｌｉｚｉｎｇＣｏｅｌｅｎｔｅｒａｔｅ−Ｄｅｒｉｖｅ
ｄ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｓ　ａｎｄ　Ｐｈｏｔ。

ｐｒｏｔｅｉｎｓ”の表題の１９８７年６月５日出願さ
れたアメリカ出願第０５９，１３７号、及び”Ｄｅｔｅ
ｃｔｉｎｇ　ｏｒ１１ｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ　５ｕｂｓ
ｔａｎｃｅｓ　（Ｉｓｉｎｇ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　Ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ″の表題のアメリカ特許第４７８，
８１７号を包含する。

アポ発光タンパク買上への及びそれから発光分子の負荷
及び取出し条件は現在知られており、そして発光タンパ
ク質とアポ発光タンパク質との間の発光分子の交換が生
じないように反応媒体のための条件を選択することが可
能である。これらの環境下で、ラベルとして使用される
唯一の発光タンパク質は、それらの外部トリガー（腔腸
動物由来の発光タンパク質のためにはカルシウムイオン
）により開始せしめられる場合、光を発光するであろう
。なぜならばバックグラウンド発光を排除するために使
用されるアポ発光タンパク質は、発光分子を含まないか
らである。

発光分子（たとえばルシフェリン）は、発光タンパク質
を形成するためにアポ発光タンパク質に容易に結合され
得る。この工程は一般的に、発光タンパク質の充電（ｃ
ｈａｒｇｉｎｇ）　（又は負荷（ｌｏａｄｉｎｇ）］と
して言及される。充電は、アポ発光タンパク質がその正
常な形態を保持するような生理学的条件下で及びチオー
ル含有化合物、典型的には還元剤、たとえばメルカプト
エタノール（肝）又はジチオトレチオール（ＤＴＴ）の
存在下で生じる。その他の点で、充電条件に対する特定
の制限は存在しない。

通常、充電は、水溶液中において４〜４０°Ｃ１好まし
くは１０〜３０’Ｃ１及びより好ましくは約２０〜２５
゛ｃで生じるであろう。通常、充電媒体のｐｉは、５〜
１０、好ましくは６〜８である。発光分子は典型的には
、急速な充電を確保するために、アポ発光タンパク質の
濃度よりも高い濃度で存在する。発光分子二発光タンパ
ク質の濃度比は、典型的には１ｒｉ〜２０：１、好まし
くは２：１〜５：１の範囲である。

チオール含有試薬は、充電された発光タンパク質からチ
オールの容易な分離を可能にするために、典型的には、
５００以下の分子量を有する小さな有機分子である。分
離は、大きさに従って化合物の分離を可能にするクロマ
トグラフィー、透析又は他の技法により実施され得る。

チオール含有化合物は通常、アポ発光タンパク質の濃度
よりも高い濃度で存在する。充電溶液中のアポ発光タン
パク質の濃度は通常測定されないので、１〜１０ｍＭの
範囲のチオール濃度が典型的には、出発物質として使用
され、そして所望する結果（有効な充電）を達成するた
めに、必要な場合、上下に調節され得る。発光分子の有
意な交換は、可溶性チオールの不在下で、アポ発光タン
パク質と発光タンパク質との間で生じないことが見出さ
れた。従って、アッセイは、チオール含有化合物の実質
的な不在下で実施され得、そして発光タンパク質からア
ポ発光タンパク質への発光分子の移行は生じないであろ
う。従って、バックグラウンド発光は、反応媒体とアポ
発光タンパク質とをまず接触せしめ、そして次に、チオ
ール含有化合物の実質的な不在下で、すでに充電された
発光クンバク質を用いて、反応を実施することによって
排除される。

バックグラウンド発光を排除するためにアポ発光タンパ
ク質を用いることに関与する段階は、他のタンパク質、
たとえば血清アルブミンを用いてのこれまで使用されて
来た段階と同じである。典型的には約０．Ｏｌ〜約１０
ｍＭ、より好ましくは０．１〜１ｍＭの濃度のアポ発光
タンパク質の希釈溶液が使用される。反応媒体が置かれ
る反応容器の表面との結合を減じるために使用されるほ
とんどの従来の技術は、非妨害タンパク質溶液により反
応容器の表面を被覆し、続いて過剰の液体を除くために
排出することを包含する。反応容器の表面とアポ発光タ
ンパク質とを接触するためには、この技法又は他のいず
れかの技法が行われ得る。さらに、発光タンパク質ラベ
ルと他の分子、特に他の高分子、たとえば反応媒体に存
在する抗体との間の非特異的結合を防ぐために反応媒体
溶液に直接、アポ発光タンパク質を添加することが可能
である。

発光タンパク質からアポ発光タンパク質への発光分子の
移行がないように、そのような結合を実質的に排除する
ために、過剰のアポ発光タンパク質が供給され得る。

分析溶液中の反応媒体は典型的には、分析者の制御下に
あるので、チオールは、反応媒体にそれらを添加しない
で排除され得る。チオールがサンプル中に存在すること
が知られている場合、反応媒体からチオールを排除する
段階が取られる。たとえば、分析物が高分子である場合
、透析が、小さな可溶性チオール含有化合物を除去する
ために使用され得る。分析物が、透析によりまた除去さ
れ得る小さな分子である場合、酸素が、チオールと反応
せしめるためにサンプルを通してあわだたせられ、モし
てチオールを排除する。

さらに、チオールがエクオリンの活性に影響を及ぼすこ
とを示唆する証拠はない。チオールは充電のために必要
とされるけれども、いったん充電されれば、ルシフェ゛
Ｊン分子は、上記アッセイ条件下で、エクオリンからチ
オールにより置換される。

サンプルは、分析される分析物を含むと思われるいずれ
かのサンプルであり、そして集められるサンプルのタイ
プに関連する標準方法に従って取り扱われるであろう。

典型的なサンプルは、血清（血清、血漿又は完全な血液
のいずれか）、尿、唾液、糞、組織サンプル及び同様の
ものを包含する。サンプルは、それが元来得られる形で
、又はそれがアッセイのために適切な形で分析物を供給
するために種々の加工段階にゆだねられ得る形のいずれ
かで使用され得る。たとえば、分析物が細胞の細胞質に
通常見出される場合、細胞壁が破壊され、反応媒体中に
分析物が放される。

いったん分析的な結合相互作用が起これば、結合システ
ムの複合体化された又は複合体化されていないラベルさ
れた成分における検出可能なラベルの存在又は量を検出
するための段階が取られる。

本発明の技法が適用され得る広範囲の種類の分析タイプ
のために、これらの測定は広く変化することができる。

たとえばアッセイが均一アッセイである場合、クエンチ
ングを用いて、溶液中に存在するラベルされた分析物と
クエンチャ−により標識された特異的結合分子により複
合体化されるラベルされた分析物とを区別することがで
きる。反応が固相及び液相が分離されている不均一アッ
セイである場合、固相受容体複合体からの反応媒体の分
離が、固相複合体又は複合体化されていない検出的にラ
ベルされた液相成分のいずれかにおけるラベルの測定を
可能にする。検出可能なラベル及び２種の成分のうち１
つの成分の存在又は量を測定するために必要であろう特
定の段階は、使用されるラベルのタイプ及び特定のタイ
プのアッセイ（たとえば生成物又は未反応基質の均−又
は不均一測定）から、臨床化学に熟練した人にとって容
易に明らかであろう。上記で論議されるように、発光の
発生を誘発するために測定される媒体に適切なトリガー
を添加した後、発光が測定される。

実際の結合アッセイの個々の段階は、均−及び不均一ア
ッセイを実施するために利用できる種々の技法に従って
広く異なるであろう。アッセイは本発明の一部でないの
で、利用できるアッセイの種類を説明する必要はない。

たとえば生物発光アッセイの本明細書の背景セクション
に列挙される出版物を参照のこと。

次の例は例示的であって、本発明を制限するものではな
い。

マイクロタイタープレート上での　　　の本発明は、レ
クチンにより固体表面に結合される糖脂質を検出する分
析的技法においてバックグラウンド発光を滅じ、そして
感度を高めるために使用された。

へりクスポマチア（Ｈｅｌｉｘ　〃４匹罰）からのレク
チンが、糖脂質についてのアッセイにおいて特異的結合
化合物として使用された。レクチンは市販されており　
（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｎ＋１ｃａｌ　Ｃｏ、）　、そし
てその特異性は十分に文書で証明されている〔最近の研
究については、Ｔｏｒｒｅｓ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ、　
Ａｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　（１９８８）２
６２　：　１〜１１を参照のこと］。フォルスマン糖脂
質及びヒト血清グループアッセイは、それぞれ羊又はヒ
ト赤血球の合計脂質抽出物を複合混合物として利用でき
る。精製された糖脂質は、これらの赤血球膜の粗抽出物
から一回のアフィニティークロマトグラフィー処理段階
で得られた（Ｔｏｒｒｅｓ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ、　１
９８８）。

このアッセイにおける主要試薬は、ヘリクスボマチアの
レクチン、組換えエクオリン及びストレブタビジンであ
った。天然のエクオリンは、クラゲなどのエクオレア互
え上ｌヱ（ハ旧肛竺ｖｉｃｔｏ−ｒｉａ）からの２０．
０００ドルトンの生物発光タンパク質である。タンパク
質の個々の分子は、充電される場合、腔腸動物型の発色
団、すなわちルシフェリンの１分子を含む（Ｓｈｉｍｏ
ｍｕｒａ、　ｔ　ｅ　、、　Ｊ、Ｃｅ１ｌ。

Ｃｏ　　、　Ｐｈ　５ｉｏ１．　（１９６２）　５９　
：　２２３〜２３８　；　Ｗａｒｄａｎｄ　Ｃｏｒｍｉ
ｅｒ、　　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、　ＵＳＡ（１９７５）　７２　：　２５３０〜２５
３４　）。そのタンパク質は、Ｃａ”の存在下で青色の
光（λ−−−＝４６９ｎｍ）を生成する。量子収量は、
エクオリンがＩＱ−１９〜１０−”Ｈの範囲で検出でき
るような量である。エクオリンは、前記のようにクロー
ン化され、そして発現されたエクオリン（この光発生性
質は天然のエクオリンと実質的に同一である）のダラム
量が利用できる。ビオチン化されたエクオリン（Ｂ−Ａ
ＥＱ）　は、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍ
ｐａｎｙからのＮＯ３−ＬＣビオチンを用いて調製され
た。エポエクオリンを、約１．０＋ｎｇ／ｄの濃度で０
．１ＭのＮａＨＣＯｓ　、０．２ＭのＮａＣｌ溶液（ｐ
Ｈ８，４）中に溶解した。次に、ＮＯ３−ＬＣピオチン
誘導体を添加し、アポエクオリンよりも３倍過剰モルの
ビオチンを付与し、そしてその混合物を４°Ｃで４時間
インキュベートした。その反応を、ＩＭのグリシン２５
ｕ１１を０．１？ＩのＮａ１ｌＣＤ、溶液（ｐＨ８）に
添加することによって停止した。反応の副生成物を、５
ｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラム（ＰｈａｒｍａｃｉａＰ
Ｄ−１０又は同等物）上でビオチン化されたアポエクオ
リンから分離し、そしてそのビオチン化されたタンパク
質を、５０ｍＭのトリス、０．２ＭのＮａＣ１゜５ｄの
ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８）中に４°Ｃで貯蔵した。

ストレブタビジンは、ストレブトマイセスアビジニ（Ｓ
ｔｒｅ　ｔｏｎ　ｃｅｓ　ａｖｉｄｉｎｉｉ）からの６
０，０００ドルトンのビオチン結合タンパク質である。

そのタンパク質の個々の分子は、ビオチン４分子を結合
することができる（Ｃｈａｌｅｔ　ａｎｄ　Ｗｏｌｔ、
　　Ａｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ　　ｓ、　（１９６４）　１
０６　：　１）　、市販のストレブタビジンは、ビオチ
ンに高い親和性で結合する（　Ｋ　ｏ−約１０引’Ｍ）
。

チニン（Ｂ−１１ＰＡ）を、ビオチン化された緩衝液（
０，１ｈの硼酸ナトリウム、ｐ）１８．５）２ＩＦｆｆ
ｌ中、純粋なタンパクＨ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ　Ｃｏ、）　　５ｍｇを溶解することによって調製し
、そして３倍過剰モルのＮＨＳＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅ
ｒｃｅ）を添加し、そして室温で１時間インキュベート
することによってビオチン化した。この反応の生成物を
、５ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ−Ｅ
ＤＴＡ）に対して透析し、そして−８０°Ｃで貯蔵した
。他の試薬は市販されている。

糖脂質をメタノールに溶解し、そしてｏ、ｏｏｉ〜２５
ｎｇの糖脂質を含む希釈溶液のアリコート（５０ｕｎ　
をマイクロタイタープレート（Ｆａｌｃｏｎ　１１３９
１１）の壁に添加した。メタノールを室温で一晩蒸発せ
しめ、マイクロタイタープレートの壁の表面に糖脂質を
結合せしめた。フォルスマン糖脂質を検出するための結
合及び洗浄段階を、続いて次の順序で行った： １）ビオチン化されたエクオリンの非特異的結合を防ぐ
ために、壁を、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ中、アポエクオリン（
１ｍｇ／ｄ）の溶液により３０分間処理し、そして続い
てＰＢＳ−ＥＤＴＡにより洗浄した。

２）　Ｂ−ＨＰＡ（ＰＢＳ−ＥＤＴＡ中において０．１
ｍｇ／ｍ）を添加し、３０分間インキュベートした。

３）　ＰＢＳ−ＥＤＴＡによる洗浄。

４）ストレブタビジン（ＳＡ　：　ＰＢＳ−ＥＤＴＡ中
において０．１■／ｍ２）と共に３０分間のインキュベ
ーション。

５）　ＰＢＳ−ＥＤＴＡによる洗浄。

６）　Ｂ−ＡＥＱ　（ＰＢＳ−ＥＤＴＡ中において１ｄ
ｇ／ｍ）と共に３０分間のインキュベージ３ン。

７）　ＰＢＳ−ＥＤＴＡによる洗浄。

インキュベージジン及び洗浄のために使用される溶液の
体積は２００　ｕ　ｌであり、そして段階は５〜７は４
°Ｃで行われた。段階７の後、マイクロタイター壁は、
三重複合体の糖脂質−（Ｂ−ＨＰＡ）−ＳＡ（Ｂ−ＡＥ
Ｑ）を含む。結合されたＢ−ＡＥＱを、２５＋ｍＭのＧ
ａ１ＮＡｃを含むＰＢＳ−ＥＤＴＡを有するウェルの３
０分間のインキュベーションにより溶離した。糖脂質に
結合されたＢ−ＡＥＱを含む溶離液のアリコートを、Ｃ
ａｚ＋の添加の後、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ　Ｌｕｒｎｉｎｏ
ｍｅＬｅｒ　Ｍｏｄｅ１９５００により光子として定量
化した。この予備実験の結果は図に示される。このアッ
セイはフォルスマン糖脂質に対して特異的であり：すな
わちグロボシドと反応せず、末端β１，３−結合Ｇａ１
ＮＡｃを有するフォルスマン構造体への前駆体であり、
そしてこの反応は、Ｇａ１ＮＡｃが反応混合物中に含ま
れる場合、完全に阻止される。

このアッセイにおいて、マイクロタイターウェルにおけ
るフォルスマン糖脂質のための検出の信頼きる限界は、
６２．５ピコグラム（４２フ工ムトモル）である。これ
らの結果は、その測定の前、三重複合体からエクオリン
の溶離を必要とする原型アッセイにより、フォルスマン
糖脂質をフェムトモルレベルで検出する本発明の能力を
確認する。阻止剤としてアポエクオリンを用いないで実
施された類似するアッセイは、１０００ピコグラムの検
出限界を有した。

本明細書に引用されるすべての出版物及び特許出願は、
引用により本明細書に組込まれる。

前述の発明は、明確に理解するために例示的且つ測的に
いくらか詳細に記載されているけれども、特許請求の範
囲内で修飾及び変更を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

この図は、分析物の存在及び不在における光の発光を示
す図である（すなわち所望する光の発光及びバックグラ
ウンド）。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、反応媒体中において特異的結合化合物と分析物との
   相互反応により複合体を形成することによってサンプル
   中の分析物の存在を検出するための方法であって、ここ
   で前記複合体の形成が、複合体を形成する特異的結合系
   の成分上でラベルとして使用される発光分子により放さ
   れる光の測定により検出されることを特徴とし： ａ、発光分子に結合される発光タンパク質を前記ラベル
   として使用し、ここで前記発光分 子は、外部トリガーの不在下で光を放さな いで前記発光タンパク質に結合したまま存 続し； ｂ、前記反応媒体と前記発光タンパク質のアポ発光タン
   パク質とを接触せしめ、ここで前 記アポ発光タンパク質は、前記反応媒体に 前記発光タンパク質ラベルを導入する前、 前記発光分子の不在下で前記発光タンパク 質を含有し； ｃ、前記複合体の形成の後、前記反応媒体に前記トリガ
   ーを添加することを含んで成る方 法。 ２、前記特異的結合化合物が、エチレン、抗体又は細胞
   表面受容体である請求項１記載の方法。 ３、前記特異的結合化合物が固体表面上に結合され、そ
   れによって固相複合体が前記特異的結合化合物と前記分
   析物との間に形成される請求項１記載の方法。 ４、前記ラベルされた成分が液相反応媒体に存在し、そ
   して前記固相複合体が、前記光の測定の前、前記液相反
   応媒体から分離される請求項３記載の方法。 ５、前記発光タンパク質が腔腸動物の発光タンパク質で
   ある請求項１記載の方法。 ６、前記発光タンパク質がエクオリンであり、そして前
   記アポ発光タンパク質がアポエクオリンである請求項１
   記載の方法。 ７、前記トリガーの添加が、エクオリンにより放される
   光の測定のすぐ前で、前記反応媒体にカルシウムイオン
   を添加することを含んで成る請求項６記載の方法。