JPH10239314A

JPH10239314A - 結合分析の高感度化方法

Info

Publication number: JPH10239314A
Application number: JP5557897A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Okuma; 博大熊; Yoshiaki Seto; 義明瀬戸; Hiroki Tatsumi; 宏樹辰巳; Masaru Fukuda; 賢福田
Original assignee: Kikkoman Corp; Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Kikkoman Corp; Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 1997-02-24
Filing date: 1997-02-24
Publication date: 1998-09-11

Abstract

(57)【要約】【目的】リガンドとレセプターの特異的結合を利用した
結合分析において、さらなる高感度化と非特異反応の低
減を実現する。【解決手段】結合成分と酵素の双方にビオチンを結合
し、結合成分に結合したビオチンと酵素に結合したビオ
チンをアビジンを介して結合することにより結合成分を
標識し、この標識を追跡することによって特異的結合反
応を検出する方法において、酵素にルシフェラーゼを用
いて、ビオチンを結合したルシフェラーゼとアビジンを
あらかじめ結合しておくことを特徴とする。【効果】高い感度と、低いバックグランドならびに反応
時間の短縮を容易に実現することができる。特に固相免
疫分析等において有効である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、特異的な結合反応
を利用した分析方法における感度の向上と非特異結合の
低減に関するものである。より具体的には、結合成分と
酵素の双方にビオチンを結合し、結合成分に結合したビ
オチンと酵素に結合したビオチンをアビジンを介して結
合することにより結合成分を標識し、この標識した結合
成分を追跡する方法において、あらかじめビオチン化し
た酵素とアビジンを結合させておくことによる特異的結
合反応を検出する方法の高感度化、ならびに非特異結合
の低減に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】臨床および他の応用分野においてリガン
ドとレセプターからなる特異的な結合を利用した分析方
法が微量物質の分析のために利用されている。一般的に
リガンドとレセプターの結合反応と呼ばれるものには抗
原抗体反応、相補的な核酸のハイブリダイゼーション、
糖とレクチン、あるいはホルモンとホルモン受容体とい
った物質同士の結合をあげることができる。これらの物
質同士の結合は特異的かつ親和性の高いものであり、類
似性の高い他の物質が混在していても互いの結合相手で
あるリガンドあるいはレセプターを識別し、強固に結合
することができる。このような特異的結合による分析方
法（アッセイ）としては、競合アッセイ、サンドイッチ
アッセイ等が利用されている。

【０００３】検出の対象となる物質は、いずれも検体中
においてごく微量にしか存在しないため、通常その分析
においては特異的な結合に関わる結合成分を標識成分に
より標識して、その標識成分を検出するという方法が採
られている。標識成分としては放射性同位元素、蛍光物
質、発光物質、および各種酵素等が用いられる。放射性
同位元素による標識は、比較的簡便であり高感度が得ら
れるが、半減期の問題があり、作業者の安全管理や廃棄
物の処理も煩雑なため、酵素等の非放射性物質による標
識が広く普及してきている。

【０００４】酵素標識による特異的反応の検出系の代表
的なものに、酵素免疫測定法があげられる。酵素免疫測
定法では、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ、あるいはペルオキシダーゼ等を用いた吸光法に
よる検出系が一般的である。検出感度を上げるためには
結合成分により多くの標識成分を結合させればよいが、
先にあげた酵素は比較的分子量が大きく、そのために結
合成分に導入可能な酵素の分子数には自ずと制限があ
る。また、吸光法による検出系ではその原理上およそ10
^-9mol/lが測定感度の限界である（酵素免疫測定法蛋
白質核酸酵素別冊No.31 51-56(1987)）。

【０００５】より微量に存在する物質を検出するための
高感度の検出系として、近年発光法を利用した酵素免疫
測定法が実用化されつつあり、例えば、発光蛋白質であ
るリコンビナントAEQUORIN(AQUALITERSeaLite Science
s,Inc.)を用いたものがある。また、化学発光法を利用
した免疫(酵素)測定法も、様々な改良、工夫がなされさ
らに有用なものになりつつある。例えば、検出反応に電
気化学的な発光反応を用い、抗原・抗体などを測定する
ものがある（臨床化学 39:673-677,1995）。一方、従来
から量子効率の面から生物発光法が優れているといわれ
ており、特にホタルルシフェラーゼによる生物発光はそ
の量子効率が0.88と大きい。しかし、酵素や発光基質自
身の安定性の問題もあり実用化された例は少ない。

【０００６】天然型のホタルルシフェラーゼを標識酵素
とする酵素免疫測定法は、その酵素自身の安定性の問題
により実用化が困難であった(特開昭60-138463)。増田
らはゲンジボタル(Luciola cruciata)の発光器の細胞か
らルシフェラーゼ遺伝子のｍＲＮＡを取り出し、逆転写
酵素などを用いて、ルシフェラーゼを大量生産できる大
腸菌を作り出した。さらに、梶山らはBiochemistry,Vo
l.32,No.50,1993に記載の方法により耐熱性のルシフェ
ラーゼの作製に成功した。この酵素は化学修飾によるビ
オチン化は可能であったが、このビオチン化ルシフェラ
ーゼは、その発光活性がアビジンの共存により阻害され
（特開平4-99500）、その阻害程度はアビジン量に依存
するものであった。

【０００７】辰巳らはこの問題を解決するために遺伝子
組み換えによるビオチン化ホタルルシフェラーゼの製造
法に関する発明を行った(特開平8-308578号)。すなわ
ち、細胞内にはビオチン化配列と呼ばれるビオチンホロ
エンザイムシンセターゼの作用によりビオチンが結合す
る１０〜１２０残基程度のペプチドが存在するが(J.Bio
l.Chem., 263, 6461(1988))、ビオチン化配列をコード
する遺伝子とホタルルシフェラーゼの遺伝子を連結し、
該連結遺伝子を微生物に導入して融合蛋白質を発現する
ことによりビオチン化ルシフェラーゼを得るというもの
である。ビオチンは生体に必須の微量栄養成分の一つで
あり、生体内に普遍的に存在するので、融合蛋白質は宿
主細胞が保有するビオチンホロエンザイムシンセターゼ
の作用によりビオチン化蛋白質として回収される(Biol.
Chem., 265, 10327(1990))。そのためビオチン化配列を
含む蛋白質のビオチン化には特別な操作を必要としな
い。また、天然のホタルルシフェラーゼに比べて安定性
が向上しており、アビジン分子が結合しても発光阻害を
起こさない。このようにして製造されたビオチン化ルシ
フェラーゼを用いた生物発光による酵素免疫測定法は特
開平8-308578に開示されている。

【０００８】また、特開昭60-138463や特開平8-308578
の発明とは異なる方法のビオチンとアビジンを用いた酵
素標識法は感度を上昇させる方法の一つとして古くから
用いられてきた。すなわち酵素にビオチンを２分子以上
導入し、あらかじめアビジンとビオチン化酵素を結合し
ておくことで（アビジン−ビオチン化酵素）nの繰り返
し構造を持つ巨大複合体を形成し、検出感度を上げると
いうものである。この方法ではビオチンとアビジンの結
合が強固であることと、ビオチンが低分子であるため結
合成分や標識成分に比較的容易に結合できることも利点
である。この特徴を利用した核酸や抗体の検出キットは
ENZO Biochem社よりDETEK（登録商標）Signal Generati
ng Systemsとして市販されている。

【０００９】特異的な結合分析における非特異反応の問
題は解決のために多大な努力が払われてきた。分析対象
が検体中の微量成分であるため、非特異反応が大きいと
分析対象のシグナルはバックグラウンドに容易に埋もれ
てしまうことになる。非特異反応を抑制する方法として
は、酵素免疫測定法の分野では以下のようなものがあげ
られる。 1)試薬の純度を上げて非特異反応の原因となる不純物の
除去 2)緩衝剤の組成の検討や界面活性剤の添加 3)抗体をＦ（ａｂ）’２にする（血清検体中のリューマ
トイド因子に効果あり） 4)反応に関与しないＩｇＧ（ＩｇＧ断片）の添加 5)ＢＳＡ、ゼラチン、その他ブロッキング剤の添加 6)洗浄液の組成の検討や界面活性剤の添加 7)反応時間、温度の調節核酸のハイブリダイゼーションを酵素標識により検出す
る場合にも、非特異反応を抑制するために試薬組成の検
討、各種ブロッキング剤の添加、あるいはハイブリダイ
ズに関与しないランダムな配列を持つ核酸の添加等が行
われている。

【００１０】しかしながら、上にあげた非特異反応の抑
制方法は一般的なものであり、実際には個々の測定対象
や使用する抗体あるいはプローブに応じて至適となる条
件や添加物を選択しなければならないのが実状である。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明が解決すべき課
題は、結合成分と酵素の双方にビオチンを結合し、結合
成分に結合したビオチンと酵素に結合したビオチンをア
ビジンを介して結合することにより結合成分を標識し、
この標識した結合成分を追跡することによって特異的結
合反応を検出する方法においてさらなる高感度化と非特
異結合の低減を提供することである。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
の解決のために鋭意検討を行った。その結果、結合成分
と酵素の双方にビオチンを結合し、結合成分に結合した
ビオチンと酵素に結合したビオチンをアビジンを介して
結合することにより結合成分を標識し、この標識した結
合成分を追跡することによって特異的結合反応を検出す
る方法において、酵素にルシフェラーゼを用いてビオチ
ン化ルシフェラーゼとアビジンをあらかじめ結合してお
くことで感度が大幅に上昇し、非特異反応が減少するこ
とを見いだした。

【００１３】本発明において検出の対象となる特異的結
合反応は、先にあげたようなリガンドとレセプターの特
異的な結合を利用した反応系であれば、どのようなもの
であってもかまわない。たとえば、競合アッセイ、サン
ドイッチアッセイ等をあげることができる。

【００１４】ビオチンは分子量約２００の化合物でアビ
ジンと特異的に結合する。別名ビタミンＨと呼ばれるこ
とからもわかるように、生体に必要不可欠な微量成分の
一つである。アビジンとの親和性がきわめて高い上に安
定であるので、蛋白質や核酸をアビジンを介して標識し
たり固相化するのに用いられる。蛋白質や核酸と結合す
るために各種の官能基を導入したビオチンの誘導体が市
販されている。

【００１５】アビジンは分子量約６６０００の塩基性蛋
白質で４個のサブユニットから構成される。熱や蛋白質
分解酵素に対しては安定であり、４個のビオチン結合部
位を持つ。卵白から精製されたアビジンやStreptomyces
avidiniiから精製されたストレプトアビジンが代表的
である。ストレプトアビジンの方が非特異結合が少ない
ことから、アッセイ系にはストレプトアビジンがよく用
いられ、一般的にアビジンといえばストレプトアビジン
を指すことが多い。アビジンとビオチンの結合反応は二
つの物質を混合するだけで特別な反応条件を必要としな
い。

【００１６】アビジンはビオチン４分子と結合可能なの
でビオチン化した結合成分にアビジンを結合させてお
き、ビオチン化した酵素を加えると、結合成分にはアビ
ジンを介して酵素が３分子結合できることになり、検出
感度を上昇させることができると考えられる。ビオチン
アビジンを利用した検出システムの多くが、このことを
もとに単純な酵素標識検出システムよりも高感度になる
ことを強調している。しかしながら、アビジン分子の４
個のビオチン結合部位は均等に分布しておらず、２個の
接近した結合部位を持つ２対の結合部位からなっている
ので各対の結合部位ではその１個のみがビオチン化した
蛋白質と結合する。したがってアビジンは結合の増幅因
子としてではなく、２個のビオチン化した蛋白質の架橋
剤としてのみ作用する（エンザイムイムノアッセイ東
京化学同人20-28(1989)）。

【００１７】本発明において標識成分として使用される
酵素はホタルルシフェラーゼである。ルシフェラーゼに
は細菌由来のものとホタル由来のものがあるが、量子効
率が大きいことからホタルルシフェラーゼを使用するの
が好ましい。ホタルルシフェラーゼは不安定な蛋白質で
あるため、天然のホタルルシフェラーゼと他の蛋白質を
架橋剤により結合させると、架橋剤によりダメージを受
けると同時に、結合した他の蛋白質との立体障害により
酵素活性が著しく損なわれる。そのためホタルルシフェ
ラーゼを標識成分として用いる際には、標識される相手
側の物質は低分子であるビオチンを用いるのが好まし
く、本発明においては特開平8-308578において開示され
ている遺伝子組み換えにより得られたビオチン化ルシフ
ェラーゼを用いる。遺伝子組み換えにより得られたビオ
チン化ルシフェラーゼは、化学修飾でビオチンを導入し
たものと比較して、修飾反応によるダメージを受けてお
らず、修飾部位や導入されたビオチンの数も一定である
など酵素標識に使用するのに好ましい利点を兼ね備えて
いる。

【００１８】本発明ではビオチン化ルシフェラーゼとし
てルシフェラーゼ１分子に対してビオチン１分子が導入
された融合蛋白質を用いるので、アビジンと結合する際
には２つの物質の混合比率は特に限定しない。しかし、
ビオチン化ルシフェラーゼと結合していないフリーのア
ビジンは、ビオチン化した結合成分がアビジン−ビオチ
ン化ルシフェラーゼと結合する際に阻害因子として働く
ので、ビオチン化ルシフェラーゼが過剰に存在する方が
望ましい。また、フリーのアビジンをビオチン化ルシフ
ェラーゼとの混合後にゲルろ過等で除くことができれば
理想的である。

【００１９】ビオチン化ルシフェラーゼにビオチンを２
分子以上導入することができれば、アビジンと反応させ
たときに多数の分子が結合した複合体を形成することが
でき、最終的に結合成分に多数の標識成分を結合させて
感度の上昇をはかることができる。この場合のビオチン
化ルシフェラーゼとアビジンの混合比率やフリーの物質
を除くことの利点は前記と同様である。ただし、ビオチ
ン化ルシフェラーゼとアビジンの複合体を形成する際に
は溶解性や反応速度の低下に十分注意しなければならな
い。

【００２０】本発明において結合成分として使用される
物質は、一般的にはリガンドあるいはレセプターと呼ば
れる特異的結合を構成する物質であり、抗原と抗体、二
本鎖を構成しうる相補的な核酸、糖とレクチン、あるい
はホルモンとホルモン受容体等の組み合わせのどちらの
物質であっても構わない。

【００２１】ビオチンを結合成分に導入するには、ビオ
チンに各種の官能基をリンカーを介して導入したビオチ
ンの誘導体が用いられる。蛋白質にビオチンを導入する
際にはSulfosuccinimidyl N-[N'-(D-biotinyl)-6-amino
hexanoyl]-6'-aminohexanoate等が、核酸にビオチンを
導入する際にはbiotin-11-dUTP等が用いられる。また、
結合成分が蛋白質である場合には、酵素にビオチンを導
入する場合と同様に遺伝子操作技術を応用して本来の機
能を損なわない範囲でビオチン結合配列との融合蛋白質
を作成し、発現した蛋白質にビオチンを導入することも
可能である。

【００２２】結合成分に導入されるビオチンの数は特に
限定しない。結合成分の活性を損なわない範囲で結合成
分に対して複数のビオチンを導入することで、より多く
の酵素がアビジンを介して結合して高感度が得られるこ
とは、ビオチン化プローブを用いる核酸の検出系等で広
く知られた技術である。

【００２３】本発明ではアビジンと結合した酵素を加え
るのは、ビオチン化結合成分が関わる特異的な結合反応
の前でも後でもどちらでもよい。ただし、特異的な結合
反応の後にアビジンと結合した酵素を加える場合には、
未反応のビオチン化結合成分はすでに特異的な結合反応
を終えたビオチン化結合成分とアビジンとの結合反応に
競合するので除いておくのが望ましい。また、分析対象
の検体が血清等の体液や細胞の培養上清である場合には
検体中のビオチンが混入しないようにしなければならな
い。すでに述べたように、ビオチンは生体に必要不可欠
な微量成分の一つであるため、上記検体は通常ビオチン
を含んでいるからである。

【００２４】

【作用および効果】本発明は、結合成分と酵素の双方に
ビオチンを結合し、結合成分に結合したビオチンと酵素
に結合したビオチンをアビジンを介して結合することに
より結合成分を標識し、この標識した結合成分を追跡す
ることによって特異的結合反応を検出する方法におい
て、酵素としてルシフェラーゼを用いてあらかじめアビ
ジンと結合しておくことで大幅な高感度化と非特異反応
の低減を達成したものである。酵素としてアルカリフォ
スファターゼやペルオキシダーゼを用いた高感度な検出
系はENZO Biochem社よりDETEK（登録商標）Signal Gene
rating Systems（以下DETEK Systemと略す）として市販
されている。しかし、酵素としてルシフェラーゼを用い
ることでさらに大幅に感度が上昇し、非特異反応が減少
することは全く新しい知見である。

【００２５】アルカリフォスファターゼやペルオキシダ
ーゼによる検出系は発色系によるものであり、ルシフェ
ラーゼによる検出系は発光系によるものである。一般に
発色による検出系よりも発光による検出系の方が測定範
囲が広いことから、酵素としてルシフェラーゼを用いた
場合に、より高感度となることは予測されるが、本発明
で示されたほどの高感度化が達成できるとは当業者とい
えども予測し得なかったことである。本発明における高
感度化のメカニズムは明らかになっていない。DETEK Sy
stemでは２分子以上のビオチンを導入した酵素がアビジ
ンを介して（アビジン−ビオチン化酵素）nの繰り返し
構造を持つ巨大複合体を形成し高感度となることが示さ
れているが、本発明で使用しているビオチン化ルシフェ
ラーゼは、遺伝子組み換えによりビオチン化配列を一本
だけ導入された融合蛋白質であるので、DETEK Systemの
ような巨大複合体を形成することがないのは明らかであ
る。したがってビオチン化配列を２本接続したルシフェ
ラーゼ遺伝子を融合蛋白質として発現し、ビオチンを２
分子導入したビオチン化ルシフェラーゼが得られれば、
本発明の効果に加えて（アビジン−ビオチン化酵素）n
の繰り返し構造を持つ巨大複合体の効果も加わり、さら
に高感度となることが予想される。本発明では感度上昇
の効果が非常に大きいために、使用する試薬の量を減ら
してもなお従来以上の高感度を維持することができる。
これにより反応時間の短縮と試薬コストの低減という好
ましい効果を二次的に得ることができる。

【００２６】

【実施例】以下の実施例ではビオチン化ルシフェラーゼ
とアビジンの添加順序と酵素の種類による効果の違いを
確認した。実施例におけるアッセイ系の概念図を図１に
示す。実施例１抗体の固相化 96穴白色マイクロプレート(DYNATECH社製)に、50mMりん
酸緩衝液(pH7.5)で1μg/mlに調整したAnti-hTSH IgG-fr
actionモノクローナル抗体(MEDIX BIOCHEMICA社製）を1
00μl加え、室温で一昼夜固相化した。次に、抗体溶液
を除去後、PBST（0.9% NaCl、0.05% Tween20を含む50mM
りん酸緩衝液(pH7.5)）で3回洗浄し、30%BLOCK ACE（30
% BLOCK ACE（大日本製薬社製）を含む20mMりん酸緩衝
液(pH7.5)）300μl加え、室温で3時間ポストコートし、
抗体固相化プレートを得た。

【００２７】実施例２ビオチン化抗体の調製 Anti-hTSH IgG-fractionモノクローナル抗体（MEDIX BI
OCHEMICA社製）溶液(8.26mg/ml)12.1μl、精製水34μ
l、100mMカーボネート緩衝液(pH8.5)、Sulfosuccinimid
yl N-[N'-(D-biotinyl)-6-aminohexanoyl]-6'-aminohex
anoate（同仁化学社製）溶液（1mg/ml）4μlを混合し、
室温で１時間反応させた。次にゲルろ過後、適当なフラ
クションを採取し、ビオチン化抗体溶液を得た。

【００２８】実施例３アビジン溶液の調製 STREPTAVIDIN from Streptomyces avidinii（SIGMA社
製）は0.2% BSA、0.1%アジ化ナトリウムを含む50mMりん
酸緩衝液(pH7.5)で溶解し、1×10^-7〜1×10^-11MのSTREP
TAVIDIN溶液を調製した。

【００２９】実施例４ビオチン化ルシフェラーゼ溶液の調製ビオチン化ルシフェラーゼbL248（特開平8-308578記
載）は0.2% BSA、10% 硫酸アンモニウムを含む50mMりん
酸緩衝液(pH7.5)で溶解し、15.625〜125ng/mlのビオチ
ン化ルシフェラーゼ溶液を調製した。

【００３０】実施例５アビジン−ビオチン化ルシフェラーゼ複合体の調製実施例３で調製したSTREPTAVIDIN溶液のうち1×10^-9〜1
×10^-11Mのものと実施例４で調製したビオチン化ルシフ
ェラーゼ溶液のうち15.625〜62.5ng/mlのものを各濃度
のマトリックスをなすような組み合わせで1:1の比率で
混合し、室温1時間静置後、アビジン−ルシフェラーゼ
複合体溶液を得た。この複合体溶液は未反応物質の除去
は行わずに以下の実験に供した。

【００３１】測定例１実施例１で作成した抗体固相化プレートに、順次希釈し
た標準hTSH 50μl及び実施例２で作成したビオチン化抗
体溶液を抗体希釈液（0.2% BSA、30% FCS、5% デキスト
ランT40、0.1mM EDTA-2Na、0.1% アジ化ナトリウムを含
む50mMりん酸緩衝液(pH7.5)）で1000倍に希釈したもの
を50μl加え、37℃1時間反応した。次に、PBSTで3回洗
浄後、実施例５で作成した各種のアビジン−ビオチン化
ルシフェラーゼ複合体溶液を100μl加え、25℃15分反応
した。さらに、PBSTで3回洗浄後、発光溶液（470μM ル
シフェリン、530μM ATP、1.25mg/ml DTT、0.13mM EDTA
-2Na、8mM 硫酸マグネシウム、0.1mM ピロりん酸カリウ
ム、0.1% BSA、0.08%サッカロースを含む20mMTricine緩
衝液(pH7.5)）を100μl加え、ルミネッセンスリーダー
で5秒間積算した。

【００３２】対照例１実施例１で作成した抗体固相化プレートに、順次希釈し
た標準hTSH 50μl及び実施例２で作成したビオチン化抗
体溶液を抗体希釈液で1000倍に希釈したものを50μl加
え、37℃1時間反応した。次に、PBSTで3回洗浄後、実施
例３で作成した1×10^-7〜1×10^-9MのSTREPTAVIDIN溶液
を100μl加え、25℃15分反応後、PBSTで3回洗浄した。
洗浄後さらに、実施例４で作成した62.5〜125ng/mlのビ
オチン化ルシフェラーゼ溶液を100μl加え、25℃15分反
応後、PBSTで3回洗浄し、実施例６で作成した発光試薬
を100μl加え、ルミネッセンスリーダーで5秒間積算し
た。

【００３３】結果測定例１の結果を表１に、対照例１の結果を表２に示
す。

【表１】

【表２】

【００３４】あらかじめビオチン化ルシフェラーゼとア
ビジンを結合しておいた場合（測定例１）には、対照例
１と比較して発光強度で約３倍、S/N比で約１０倍の高
感度となる。しかも必要な試薬の量はビオチン化ルシフ
ェラーゼは1/2、アビジンは1/100から1/10000である。
また、アビジンとビオチン化ルシフェラーゼの濃度が同
一の組み合わせ（表１と表２の斜字体の部分）ではアビ
ジン−ビオチン化ルシフェラーゼの複合体を用いた方が
バックグラウンドの発光強度は小さい。

【００３５】各濃度のTSHを測定例１と対照例１で測定
した結果を図２に示す。

【００３６】実施例８ビオチン化ペルオキシダーゼ溶液の調製ビオチン化ペルオキシダーゼ（ZYMED社製）は0.2% BS
A、10% 硫酸アンモニウムを含む50mMりん酸緩衝液(pH7.
5)で1000〜200000倍に希釈して、ビオチン化ペルオキシ
ダーゼ溶液を調製した。

【００３７】実施例９アビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体の調製実施例３で調製したSTREPTAVIDIN溶液のうち1×10^-10〜
1×10^-11Mのものと実施例８で調製したビオチン化ペル
オキシダーゼ溶液のうち20000〜200000倍希釈のものを
各濃度のマトリックスをなすような組み合わせで1:1の
比率で混合し、室温1時間静置後、アビジン−ビオチン
化ペルオキシダーゼ複合体溶液を得た。この複合体溶液
は未反応物質の除去は行わずに以下の実験に供した。

【００３８】測定例２実施例１で作成した抗体固相化プレートに、順次希釈し
た標準hTSH 50μl及び実施例２で作成したビオチン化抗
体溶液を抗体希釈液で1000倍に希釈したものを50μl加
え、37℃1時間反応した。次に、PBSTで3回洗浄後、実施
例９で作成した各種のアビジン−ビオチン化ペルオキシ
ダーゼ複合体溶液を100μl加え、25℃15分反応した。さ
らに、PBSTで3回洗浄後、基質溶液（0.112% ABTS、0.00
5%過酸化水素を含む50mMくえん酸緩衝液(pH4.0)）を100
μl加え、30分間反応後、反応停止液（0.2% アジ化ナト
リウム水溶液）を50μl加え、405nmで吸光度測定した。

【００３９】対照例２実施例１で作成した抗体固相化プレートに、順次希釈し
た標準hTSH 50μl及び実施例２で作成したビオチン化抗
体溶液を抗体希釈液で1000倍に希釈したものを50μl加
え、37℃1時間反応した。次に、PBSTで3回洗浄後、実施
例３で作成した1×10^-7〜1×10^-8MのSTREPTAVIDIN溶液
を100μl加え、25℃15分反応後、PBSTで3回洗浄した。
洗浄後さらに、実施例８で作成した1000〜2500倍希釈の
ビオチン化ペルオキシダーゼ溶液を100μl加え、25℃15
分反応後、PBSTで3回洗浄し、基質溶液を100μl加え、3
0分間反応後、反応停止液を50μl加え、405nmで吸光度
測定した。

【００４０】結果測定例２の結果を表３に、対照例２の結果を表４に示
す。

【表３】

【表４】

【００４１】酵素にビオチン化HRPを用いた場合（測定
例２）でも対照例２に比較して吸光度が高くなり、S/N
比も向上するが、酵素にビオチン化ルシフェラーゼを用
いた場合に比較するとその効果は小さい。また、バック
グラウンドの吸光度は測定例２も対照例２も約０．１で
同等である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明によるアッセイ系の概念図

【図２】測定例１と対照例１で測定した結果

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者辰巳宏樹千葉県野田市野田339 キッコーマン株式会社内 (72)発明者福田賢千葉県野田市野田339 キッコーマン株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】特異的結合反応を構成する結合成分とルシ
フェラーゼの双方にビオチンを結合し、結合成分に結合
したビオチンとルシフェラーゼに結合したビオチンをア
ビジンを介して結合することにより結合成分を標識し、
この標識した結合成分を追跡することによって特異的結
合反応を検出する方法において、あらかじめビオチンを
結合したルシフェラーゼとアビジンを結合しておくこと
を特徴とする結合分析の高感度化方法。
【請求項２】特異的結合反応後に反応に参加しなかった
結合成分を分離する請求項１の結合分析の高感度化方法
【請求項３】結合成分を固相に捕捉することによって反
応に参加しなかった結合成分を分離する請求項２の結合
分析の高感度化方法
【請求項４】ルシフェラーゼが、遺伝子操作によって得
た組み換え体、およびアミノ酸配列に変異を持つルシフ
ェラーゼ誘導体から選択される請求項１の結合分析の高
感度化方法
【請求項５】ルシフェラーゼへのビオチンの結合がルシ
フェラーゼとビオチン化配列を持つペプチドとの融合蛋
白質にビオチンが結合するものである請求項４の結合分
析の高感度化方法
【請求項６】特異的結合反応を構成する結合成分が抗
原、抗体、核酸、糖、レクチン、ホルモン受容体、およ
びこれらの誘導体である請求項１の結合分析の高感度化
方法
【請求項７】特異的結合反応を構成する結合成分が、抗
体または核酸である請求項６の結合分析の高感度化方法
【請求項８】結合成分が抗体であり、固相化された抗体
に結合した抗原を認識するものである請求項７の結合分
析の高感度化方法
【請求項９】結合成分が核酸であり、固相化された核酸
にハイブリダイズした核酸のハイブリダイズした領域と
は異なる領域においてハイブリダイズする配列を持つ請
求項８の結合分析の高感度化方法
【請求項１０】特異的結合反応を構成する結合成分が蛋
白質であり、この結合成分とビオチン化配列を持つペプ
チドとの融合蛋白質のビオチン結合部位にビオチンが結
合したものである請求項１の結合分析の高感度化方法