JP2012194019A - 酸化ストレス防御酵素ec−sodの測定法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】以下のステップ(1)〜(6)、即ち、(1)固相化された抗EC-SOD抗体を用意するステップ;(2)検体を作用させるステップ;(3)一次抗体として抗EC-SODモノクローナル抗体を作用させるステップ;(4)ビオチン標識二次抗体を作用させるステップ;(5)ストレプトアビジン又はアビジンとビオチン標識酵素との複合体を反応させるステップ;(6)前記酵素の基質を反応させ、発色を検出するステップによって、検体中のEC-SODを測定する。
【選択図】図1
Description
[1]以下のステップ(1)〜(6)を含む、EC-SOD測定法、
(1)固相化された抗EC-SOD抗体を用意するステップ、
(2)検体を作用させるステップ、
(3)一次抗体として抗EC-SODモノクローナル抗体を作用させるステップ、
(4)ビオチン標識二次抗体を作用させるステップ、
(5)ストレプトアビジン又はアビジンとビオチン標識酵素との複合体を反応させるステップ、
(6)前記酵素の基質を反応させ、発色を検出するステップ。
[2]ステップ(1)が以下のステップ(1a)〜(1d)を含む、[1]に記載のEC-SOD測定法、
(1a)不溶性支持体に抗EC-SOD抗体を作用させるステップ、
(1b)洗浄するステップ、
(1c)ブロッキングするステップ、
(1d)ブロッキング液を除去するステップ。
[3]固相化された抗EC-SOD抗体がポリクローナル抗体である、[1]又は[2]に記載のEC-SOD測定法。
[4]前記複合体がストレプトアビジンとビオチン標識酵素との複合体である、[1]〜[3]のいずれか一項に記載のEC-SOD測定法。
[5]前記酵素がアルカリフォスファターゼである、[1]〜[4]のいずれか一項に記載のEC-SOD測定法。
[6]前記検体が唾液である、[1]〜[5]のいずれか一項に記載のEC-SOD測定法。
[7]固相化された抗EC-SOD抗体と、一次抗体としての抗EC-SODモノクローナル抗体と、ビオチン標識二次抗体と、ストレプトアビジン又はアビジンとビオチン標識酵素との複合体と、を含む、EC-SOD測定キット。
[8]捕捉用抗EC-SOD抗体と、一次抗体としての抗EC-SODモノクローナル抗体と、ビオチン標識二次抗体と、ストレプトアビジン又はアビジンとビオチン標識酵素との複合体と、を含む、EC-SOD測定キット。
(1)固相化された抗EC-SOD抗体を用意するステップ
(2)検体を作用させるステップ
(3)一次抗体として抗EC-SODモノクローナル抗体を作用させるステップ
(4)ビオチン標識二次抗体を作用させるステップ
(5)ストレプトアビジン又はアビジンとビオチン標識酵素との複合体を反応させるステップ
(6)前記酵素の基質を反応させ、発色を検出するステップ
(1a)不溶性支持体に抗EC-SOD抗体を作用させるステップ
(1b)洗浄するステップ
(1c)ブロッキングするステップ
(1d)ブロッキング液を除去するステップ
(1)抗EC-SODポリクローナル抗体:常法に従い、ウサギに300μgのヒトEC-SODを2週間の間隔で5回、免疫した。十分な抗体価が得られたことを確認した後、採血し、イオン交換カラムクラマトグラフィーで精製した後、抗EC-SODポリクローナル抗体とした。
(2)抗EC-SODモノクローナル抗体:上掲の文献(Clinica Chimica Acta, 212(1992)89-102)に記載の方法、即ち、50μgの組換えヒトEC-SODを2週間の間隔で4回BALB/cマウスに免疫した後、50%ポリエチレングリコール4000を使用して脾臓細胞をマウスミエローマ細胞と融合する方法によって、抗EC-SODモノクローナル抗体を得た。
(3)ビオチン標識抗マウスIgG抗体:市販のビオチン標識抗マウスIgG抗体(例えばベクターラボラトリー社、カタログ番号BA−2000)を使用した。
(4)ストレプトアビジン/ビオチン標識アルカリフォスファターゼ複合体:市販のストレプトアビジン/ビオチン標識アルカリフォスファターゼ複合体(例えばベクターラボラトリー社、カタログ番号AK−5000)
(5)洗浄液:0.15 M NaCl,0.05% Tween 20,0.05% NaN3を含むリン酸緩衝生理食塩水
(6)ブロッキング液:1% ウシ血清アルブミン,0.15 M NaCl,0.05% Tween 20,0.05% NaN3を含むリン酸緩衝生理食塩水
(7)アルカリフォスファターゼ活性測定用基質溶液:0.5 mM MgCl2, 0.02% NaN3を含む0.1 Mジエタノールアミン緩衝液(pH 9.8)に使用直前にp-ニトロフェニルリン酸を3 mMになるように溶解した。
(1)96ウェルイムノプレートの各ウェルに20μg/mLの濃度の抗EC-SODポリクローナル抗体を80μLずつ添加し、4℃にて一晩放置する。次の日にプレートを洗浄液にて3回洗浄した後、ブロッキング液を300μLずつ添加し、使用時まで4℃にて保管する。
(2)EC-SOD標準液と検体は予めブロッキング液にて適宜希釈する。イムノプレートのブロッキング液を除去した後、希釈したEC-SOD標準液、検体を70μLずつウェルに添加し、室温にて3時間(または4℃にて一晩)反応させる。
(3)プレートを洗浄液にて5回洗浄した後、抗EC-SODモノクローナル抗体を80μLずつ添加し、室温にて3時間反応させる。
(4)プレートを洗浄液にて5回洗浄した後、ビオチン標識抗マウスIgG抗体を80μLずつ添加し、室温にて3時間反応させる。
(5)プレートを洗浄液にて5回洗浄した後、ストレプトアビジン/ビオチン標識アルカリフォスファターゼ複合体を80μLずつ添加し、室温にて30分反応させる。
(6)プレートを洗浄液にて5回洗浄した後、アルカリフォスファターゼ活性測定用基質溶液を150μLずつ添加し、室温にて10分反応させた後、5N NaOH溶液を50μLずつ添加し酵素反応を停止させ、415 nmの吸光度を測定する。
上記測定法の有効性を検証した。
(1)検量線の作成
検量線を作成し、比較した結果、従来法(図1の白丸)では50 pg/mLの最小測定感度であったのに対し、新規測定法(図1の黒丸)は5 pg/mLの最小測定感度であり、10倍高感度であることを確認した。
ミドリザル腎尿細管上皮細胞COS7はEC-SODを高濃度に発現している細胞である。本細胞の培養上清を希釈して測定した結果、その希釈曲線(図2の黒ダイヤ)は検量線(図2の白丸)とほとんど重なっていた。この結果より、新規測定法は、細胞の培養上清を正確に測定できることが判明した。
ヒト単球細胞U937はEC-SOD発現量が少ない細胞である。本細胞をシグナル経路活性化試薬Aにて24時間或いは48時間処理した後、その培養上清を回収し、新規測定法によって測定した結果、図3に示すように、EC-SODの発現が試薬Aにより低下していることが明らかとなった。また、このEC-SOD濃度は、従来法では検出できない低濃度である。
生体成分には夾雑物が多量に含まれるため、特定の成分を測定する場合、サンプルの希釈あるいは目的物質の分離が必要となる。従来法では生体成分を20倍希釈してEC-SODを測定している。生体成分のうち、血清、尿、硝子体などのEC-SOD含量は比較的高く、従来法でも測定可能であった(図4)。しかし、より非侵襲的であり、随時、簡便に採取できる唾液を検体として測定する場合、従来法では検出が困難な低濃度であった。これに対して新規測定法では、図4に示す通り、20倍希釈した唾液中のEC-SODを測定することが可能であった。
新規測定法は従来法より格段に高感度であることが示された。新規測定法によれば、EC-SODの発現が非常に低い細胞を用いなければならない実験においてもEC-SOD発現量を正確に測定することが可能であり、疾病予防に向けた有用化合物探索研究におけるスクリーニング法として有用性が高い。また、生体成分のうち、より非侵襲的に随時、簡便に入手できる半面、低濃度である唾液等を検体として測定する場合、高感度の測定が可能な新規測定法によりはじめて定量が可能である。従って、新規測定法は唾液等を用いる診断にも適応可能であるといえる。
Claims (8)
- 以下のステップ(1)〜(6)を含む、EC-SOD測定法、
(1)固相化された抗EC-SOD抗体を用意するステップ、
(2)検体を作用させるステップ、
(3)一次抗体として抗EC-SODモノクローナル抗体を作用させるステップ、
(4)ビオチン標識二次抗体を作用させるステップ、
(5)ストレプトアビジン又はアビジンとビオチン標識酵素との複合体を反応させるステップ、
(6)前記酵素の基質を反応させ、発色を検出するステップ。 - ステップ(1)が以下のステップ(1a)〜(1d)を含む、請求項1に記載のEC-SOD測定法、
(1a)不溶性支持体に抗EC-SOD抗体を作用させるステップ、
(1b)洗浄するステップ、
(1c)ブロッキングするステップ、
(1d)ブロッキング液を除去するステップ。 - 固相化された抗EC-SOD抗体がポリクローナル抗体である、請求項1又は2に記載のEC-SOD測定法。
- 前記複合体がストレプトアビジンとビオチン標識酵素との複合体である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のEC-SOD測定法。
- 前記酵素がアルカリフォスファターゼである、請求項1〜4のいずれか一項に記載のEC-SOD測定法。
- 前記検体が唾液である、請求項1〜5のいずれか一項に記載のEC-SOD測定法。
- 固相化された抗EC-SOD抗体と、一次抗体としての抗EC-SODモノクローナル抗体と、ビオチン標識二次抗体と、ストレプトアビジン又はアビジンとビオチン標識酵素との複合体と、を含む、EC-SOD測定キット。
- 捕捉用抗EC-SOD抗体と、一次抗体としての抗EC-SODモノクローナル抗体と、ビオチン標識二次抗体と、ストレプトアビジン又はアビジンとビオチン標識酵素との複合体と、を含む、EC-SOD測定キット。
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JP2011057517A JP2012194019A (ja) | 2011-03-16 | 2011-03-16 | 酸化ストレス防御酵素ec−sodの測定法 |
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JP (1) | JP2012194019A (ja) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JPH10239314A (ja) * | 1997-02-24 | 1998-09-11 | Eiken Chem Co Ltd | 結合分析の高感度化方法 |
-
2011
- 2011-03-16 JP JP2011057517A patent/JP2012194019A/ja active Pending
Patent Citations (1)
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JPH10239314A (ja) * | 1997-02-24 | 1998-09-11 | Eiken Chem Co Ltd | 結合分析の高感度化方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
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JPN6014042714; Adachi T et al: 'Quantitative analysis of extracellular-superoxide dismutase in serum and urine by ELISA with monoclo' Clin Chim Acta 212(3), 19921130, 89-102 * |
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