JPS62503123A - 免疫複合物の検定のための方法および物品 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 疫複合物の　定のための方法および物品髪弊専＃≠砥欅ｒ）噴上 免疫系統は、感染原に対する生体の主たる防衛機序を表わすものである。

を椎動物の免疫系統には、２つの機構、即ち液素を媒介とするもの、細胞を媒介 とするものがある。液素性免疫は、細胞によってつくられ、分泌される免疫系統 の循環成分、即ち血清中に見られるものである。細胞媒介免疫は、標的異物に対 する種々の白血球細胞の直接的作用によって付与される。

これら２つの関連する系統による協働作用により、広範な伝染病に対する保護が 可能となる。

正常状態においては、感染原の生体への侵入は、液素系統の成分を生成する細胞 からの応答を誘発する。例えば、Ｂ−リンパ球は、特定のタンパク質、即ち抗体 を合成し、これが侵入細菌の特定の部位に結合するに のように、侵入細菌に抗体が結合されると、細胞媒介免疫系統による作用、又は 液素性分画の作用により破壊されるか、もしくは、抗体分子自体により、直接、 不活性化される。

通常は、抗体分子は宿主自身の作用因子に対し、その作用が向けられることはな い。しかし、ある個体において、この免疫系統が、自己の成分を侵入異物と錯覚 する場合がある。

もし、このような現象が生ずると、生体が自己に対し、免疫的攻撃を、異物に対 するのと同様に仕掛ける。

このような自己免疫Ｘ藤の結果は劇的となる。その場合に生ずる病気の徴候とし ては、糖を利用する能力の消失（Ｉ型糖尿病）、関節の破壊（ロイマチス関節炎 ）、腎臓の破壊（紅斑性狼癒、糸球体腎炎、その他のこれに類する病気）、脈管 系の破壊（脈管炎）などが現われる。これらの自己免疫異常は。

長期的なものとなるとともに死亡率も高い。

さらに、自己免疫疾患は、血液中の自己免疫複合体の持続的高濃度化をともなう 。この自己免疫疾患によってもたらされた損傷の多くは、いずれの部位であって も、それらの自己免疫複合物を除去しようとする細胞媒介免疫系統の努力に基づ き探知することができるが、今日まで、これらの疾患の制御は困難であった。な ぜならば、使用されている検定方法では、正常の免疫複合物の濃度レベルと異常 の場合との区別を適切におこなうことができなかったからである。

今日まで、自己免疫疾患を含めて、免疫複合物の形成によって特徴づけられる病 気を探知するための、正確、敏速および安価な免疫複合体測定方法として、多く の様々な技法が試みられてきた。これらの中には、巧妙なものも少なくないが、 全体として適当な方法は末だ見出されていない、これら従来法の欠点として１次 の点を挙げることができる。

第１に、エイ類細胞検定（Ｒａｊｉ　ｃａｌｌ　ａｓｓａｙ）は免疫複合物のた めの細胞表面受容体の存在に依存し、しかも、これら受容体は、培養における成 長の正確な時期にしか現われない。

第２に、補体分画又はそれに対する抗体は、しばしば放射免疫又は酵素結合免疫 吸収検定に用いられている。しかし、残念ながら、これら補体および補体を非可 動化するための抗体は不安定なタンパク質である。この不安定性は、感度、特異 性および再現性の損失につながる。そのため、直接的又は抗体媒介による吸着に より、補体を非可動化することに基づく方法は、その不安定性のため、臨床テス ト用として十分に信頼し得るものとならない。

第３に、免疫グロブリン綱およびサイズは、補体に基づく検定の利用を制限させ る。エイ類細胞検定法および補体ベース検定法のいずれも、免疫複合物中の抗体 の全ての綱および亜綱について検定することは一般にできず、検定範囲は、Ｉｇ Ｍ、ＩｇＧ、、　ＩｇＧ２およびＩｇＧ３　に限られる。さらに、エイ類細胞法 および他の補体ベース方法は、一般に分子の大きさが、１．０００，０００ダル トンより大きな複合物しか検定できない。

これら２つの基準は、エイ類細胞法および補体ベース検定法を最も制限するもの となっている。

最後に、ポリエチレングリコール、デキストラン又は黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐ ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅａｓ）タンパク質Ａのような物質を用いて析出 させることを利用する物理化学的液体技法は小さく、しかも、しばしば凝集する 析出物を取扱う困難性のため、操作性の問題がある。

さらに、免疫学的に無関係の免疫グロブリンが析出物に偶然的に結合することが あり、したがって、テストの性能をさらに悪くしている。

これらの困難性のため、免疫複合体測定に、これらの物理化学的方法を利用する ことが妨げられている。これらの制約を解決するためには、種々のテストを繰り 返しておこなう必要があるが、その場合、患者の費用負担の増大を招くことにな る。したがって、通常は、患者の病状進行を正確にモニターし得る程度に十分な 頻度で１種々のテストをおこなうことはしない。

このような問題を解決するためには、免疫複合物を固体支持体に吸着させること ができ、安価で５選択性があり、かつ効果的な手段の開発が必要となる。

従って１本発明の目的は、免疫複合物の広範な綱および亜綱について効果的に検 定することができる免疫複合物の選択的吸着又は固定方法１組成物および物品を 提供することにある。

本発明の他の目的は、血清等の体液中の免疫複合物の検定、除去を目的とした、 固体表面へ免疫複合物を吸着させるすべての方法における上述の選択性、安定性 および取扱い性についての上記問題点を解決し得る方法を提供することである。

さらに本発明の目的は、免疫複合物を支持体に固定させたのち、この免疫複合物 の成分を検定するための、新規で適応性が良く、かつ容易に利用し得る手段を提 供すること、およびその手段により、ヒト又はを椎動物の医療上の適用に関連し て、免疫複合物を検定、除去、濃度測定、その他に利用することである。

澄訓ＬＩＬ艮 本発明は、血清あるいは他の体液から免疫複合物を、その同定、定量又は除去を 目的とし、その機構の如何を問わず、直接選択的吸収、吸着又は付着をおこなう ための新規な組成物、方法および物品を提供する。

本発明は、最も広い意味において、免疫複合物を付着するための特別の親和性を 有する免疫学的に非特異的ペプチド結合アミノ酸を利用するものである。

本明細書中に記載したように、免疫学的に非特異的ペプチド結合アミノ酸および 類似する修飾ペプチド結合アミノ酸は、血清又は他の体液からの免疫複合物を直 接的および選択的に固定するために用いられる。

本発明において有利に使用し得る免疫学的に非特異的ペプチド結合アミノ酸の例 としては、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、および改質又は置換さ れたオリゴペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質である。

特に、グリコジル化されたポリペプチドおよびタンパク質、又は官能的に等価の 置換基、例えばチオ糖、ヒドロキシ−又はチオ−アミノ酸、ヒドロキシ−又はチ オ−脂質、もしくは化学的に関連する、又は同様の物質で修飾されたポリペプチ ドおよびタンパク質が、好適に免疫複合物と直接結合し得ることが見出された。

より好ましくは、グリコジル化タンパク質（以下、糖タンパク質と称呼する）が 利用され、最も好ましくは、あるグロブリン分画、例えば免疫学的に非特異的γ −グロブリンが、本発明の実施において有効である。

免疫複合物が抗体の如何なる綱又は亜綱からなるか否が、また免疫複合物を含む 液体が体内からのものか、あるいは体外からのものであるかは、本発明の利用に 制限を与えるものでないと思われる。

なぜならば、これらの抗体が抗原と結合したのち、これら抗体に対し物理化学的 変化が付与され、これら抗体が、選択的に非可動化され易くなるためである。

本発明で使用するために選ばれる糖タンパク質の材料は、特に精製されたγ−グ ロブリン分画である〔コーン、イー・ジェイ（Ｃｏｈｎ、　Ｅ、Ｊ、）、　（１ ９４６）、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ（Ｊ、　Ａ ｍｅｒｉｃａｎ　ＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ）６８．４５９）。

これら糖タンパク質は、ヒトタンパク質又はこれから得られる免疫複合物に対し て免疫されていない動物から得られる。

したがって、これら糖タンパク質は、Ｆａｂ結合部位とアナライト中の抗原性決 定因子との如何なる反応を介しても、免疫複合物を固定することができないと思 われる。

実際にＩｎしたところによれば、これら糖のタンパク質は、むしろ抗体分子のｒ ＦｃＪ部分に主として見出される炭水化物部分の相互作用により免疫複合物を固 定するものと思われる。

このように、本発明は、従来の免疫複合物のタンパク質固定についての方法と全 く異なるものである。

このような糖タンパク質製剤は、固体支持体に対する遊離抗体の偶然的吸着を防 止するために用いられてきたが、固体支持体上の糖タンパク質のコーティング層 が、抗原に免疫学的に結合された抗体を選択的に固定することを見出したことは ユニークであり、かつ極めて驚くべきことである。即ち、免疫複合物はγ−グロ ブリンのコーティング層に吸着されるが、遊離抗体は吸着されない。

本発明は、血清、血液あるいは他の体液中の免疫複合物を検定するための実質的 に改良された方法を提供するものである。

また本発明は、自己免疫疾患および免疫複合物の形成により特徴づけられる他の 病気のものの血液から、そのような免疫複合物を選択的に除去するための極めて 有効な方法を提供するものである。

本発明の好ましい実施態様によれば、本明細書に記載した群から選ばれた糖タン パク質のフィルムを、最初に固体支持媒体に固定し、これに体液を接触させて、 体液中に存在する免疫複合物を固定するための選択的吸着剤として利用する。

この糖タンパク質コーティング層は、上述のように免疫複合物を固定し得るもの であれば、如何なるものであってもよいが１本明細書中に記載したようにして得 られる、免疫学的に非特異的ウシチーグロブリン分画が好ましい。

この糖タンパク質コーティング層を固体支持媒体に固定したのち、このコーティ ングされた支持体は、このコーティング層に接触された如何なる免疫複合体含有 液体からも、それに含まれる免疫複合物を選択的に吸着することができる。

この固定された免疫複合物は、ついで。

（１）任意の免疫検定法、好ましくは酵素結合免疫吸着検定法により、その任意 の成分についての検定をおこなうか。

（２）濃縮および精製をおこなうか、又は（３）所望により、臨床的治療用とし て免疫複合物を除去した体液を患者に戻すようにしてもよい。

以下の実施例で記載されたフィルムは、選ばれたγ−グロブリン分画をＰＨ−依 存性変性にさらすことによって形成さ九たものである。

しかし、選ばれた糖タンパク質の固定の仕方としては、そのフィルムの免疫複合 物に対する特異的、選択的固定機能が保持し得る限り、如何なる形態によるもの であってもよい。

その固定の例としては、熱的凝集、カオトロピズムの開放（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ ）、グルタルアルデヒドのような化学薬品による架橋、乾燥、凍結等があるが、 これらに限定されるものでない。

その後の免疫複合物の定性的、定量的検定は、任意の免疫グロブリン綱に対し特 異的な酵素抱合抗体が容易に入手できるから、比較的容易におこなうことができ よう。

支持基体に吸着した免疫複合物の視覚的又は機械的判読による定量は、ＥＬＩＳ Ａ法によりおこなうことができる。この方法は、最初にエングバル（Ｅｎｇｖａ ｌｌ）およびパールマン（Ｐｅｒｌｍａｎ）　（（１９７１）　、イムノケミス トリー（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）８゜８７１〜８７４；および（１９ ７２）　、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）１ ０９．１２９〜２３５）、さらにポーラ−・エイ（Ｖｏｌｌｅｒ、　Ａ）　；ビ ドウェル・ディー・イー（Ｂｉｄｖｅｌｌ、　Ｄ、Ｅ、）　；およびバートレッ ト・エイ（Ｂａｒｔｌｅｔｔ、　Ａ）（ダイナチク・ラボラドリース・インコー ホレイテッド（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

イム・リンクド・イムノソーベント・アッセイ（Ｔｈｅ　ＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋ ｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ）（ＥＬＩＳＡ）により発表さ れたもので、ここに参照のために示す。

さらに、特定の複合物結合抗原の存在も、その抗原に対し結合する酵素抱合抗体 の使用により検定することができる。

図面の簡単な説明 第１図は、本発明の一実施例における正常および病気の状態の特定の免疫検定に おいての吸収度の棒グラフを示す。

第２図は、正常血清および免疫複合物を含む血清の特定の免疫検定をコーティン グ層非形成ポリスチレンプレートを用いておこなった場合の吸収度を示す棒グラ フである。

第３図は、種々の原料からの免疫学的非特異的糖タンパク質を用いて、特定の免 疫検定をおこなった場合の吸収度を示す棒グラフである。

第４図は、予め免疫学的に非特異的糖タンパク質で処理したカラム内において、 免疫複合物を吸着させる前、および吸着させた後の血清についての免疫検定の結 果を示す棒グラフである。

第５図は、本発明の他の実施例における結果を示す棒グラフである。

第６図は、全血を用いて本発明を実施した場合の結果を示す棒グラフである。

第７図は、本発明に従って相対的な免疫複合物を相対的に除去する場合を示す棒 グラフである。

第８図は、ヒト血清のゲル濾過と、これからの免疫複合物の溶解および検定を示 すグラフである。

第９図は、第８図に示すゲル濾過における分子量較正を示すグラフである。

第１０図は１本発明の物品を形成するために用いられ、かつ、免疫検定に極めて 有用なマイクロ滴定プレートの上面図である。

第１１図は、第１０図のマイクロ滴定プレートの■−■線に沿う拡大部分断面図 である。

発明の詳細な説明 次に、本発明の特徴を明確にするため、用語の定義について説明する。

学的にμ特　的ペプチド結合アミノ酸：これは、オリゴペプチド、ポリペプチド 、タンパク質、改質オリゴペプチド、改質ポリペプチド、又は改質タンパク質で あって、テスト対象の動物種又はこの動物種に関連するものの任意の部分から得 られる任意の抗原性決定因子に対し、又はこれから得られる免疫複合物に対し免 疫されていない生物から得られるものであって、この動物種中に存在する免疫複 合体に対し、そのまま付着又は固定あるいは非可動化する合アミノ酸をも含むこ とを意味する。この合成は、ペプチド合成装置又は同様の化学的プロセスを介し ておこなうことができる。そのほか、現在又は新しく生成したビールス、バクテ リア、糸状細菌、酵母、その地組換え体、雑種細胞ベクター又は宿主の遺伝変態 によって製造することができる。

したがって、上記のオリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、改質オリゴペ プチド、改質ポリペプチド、改質タンパク質であって、ある動物種から得られ、 他の動物種に対して免疫されていないもの、又は上述のように合成されたものは 、テストされる動物種中に存在する免疫複合物に付着又は固定するか、あるいは 非可動化し得るものであれば、本発明の実施に有用である。

豊久乞バグｌ土 これは、多糖と、タンパン質あるいは免疫学的に純ぼく（ｎａｉｖｅ）な、又は 免疫学的に非特異的なペプチド結合アミノ酸から得られるポリペプチドとの任意 の組合せ、即ち多糖とタンパク質／ポリペプチドとの間で、２重結合を介して結 合したものを意味する。

γ−グロブリン： 処理されるべき血清タンパク質のγ部位に電気泳動移動度を有する球状糖タンパ ク質の一つを云う。

免　グロブリン： 他の物質に対し、化学的結合能力を有するγ−グロブリン分画を意味する。この 場合の他の物質には、タンパク質。

炭水化物、核酸、複合脂質、単純な有機化合物、あるいはｒＦａｂＪ部位におい て位相的に決定される結合を介して免疫グロブリンと相互作用する他の化合物が 含まれる。

抗　体： タンパク質の免疫グロブリン綱の一つ０ｗｌ！乳動物の抗体分子は、少なくとも ２つのＦａｂと１つのＦｃ部位をその構造中抗体分子のＦａｂ部位に見られる結 合部位を介して、抗体分子が結合する対象となる任意の化合物。

逸　グロブリンＭ４（ｃｌａｓｓｅｓ　：電気泳動移動度に従って分離される免 疫グロブリン。この免疫グロブリンの認められている綱としては、免疫グロブリ ンＡ、Ｄ、Ｅ、ＧおよびＭであるが、これに限定されるものではない。これらの 綱は、ＩｇＡ、　ＩｇＤ、ＩｇＥ、　ＩｇＧおよびＩｇＭとして略称される。

文兼ＪＬＩ飢二 抗体のＦａｂ部位と抗原の位相的特徴部との間の相互作用を介して結合されてい る抗体と抗原との任意の組合せを意味する。

逸Ｊ口彷笠」− 特定の免疫系統の任意の応答であり、その間、特定の抗原がそれに向けられる抗 体の形成を促し、又は細胞防衛機構の特定の活性化を促し、これによって抗原の 飲み込み、細胞毒性応答、その他細胞又は細胞媒介系統による作用がもたらされ る。

疫学的に純ぼく： ヒトを含めた動物、又は動物群における免疫系統が、液素媒介、又は細胞媒介の いずれにせよ、免疫応答の生産物をつくるような状態で抗原にさらされたことの ない状態を意味する。

学的にμ特　的； 本発明の目的において、「免疫学的に非特異的」とは、テストにおいて、検査の 対象である免疫複合体の成分に対し選択性又は指向性を持っていない抗体又は抗 原を指す。このような非特異的抗体は、免疫複合物の成分に対し免疫学的に純ぼ くである動物の血清中に見られる。

他方、免疫学的に特異的抗体は、免疫複合物（全複合物又はその一部を含めて） の成分に免疫化された動物に見出される。

方ｙリリケエ 上述の免疫学的に非特異的と同じである。

、　補　体： 血清中に通常存在する熱不安定性物質であって、特定の補体固定抗体より感知さ れる成る種のバクテリア、および細胞にとって破壊的となる。

血　清： 任意の体液から細胞および凝集性タンパク性、例えばフィブリンを適当な物理的 、化学的又は物理化学的手段により除去した残りの液状成分を云う。典型的には 、この用語は、血液を凝集させ、この凝集物を除去したのちに残留する水性の液 体を指すが、広い意味において、この用語は、脳を髄液、尿液、介在液、細胞質 等の液状成分を含むものである。

アルカリ性　酸塩　衝液： 別設の指示がない限り、脱ミネラル水９００ｍＱに重炭酸ナトリウムを１／１０ モルを溶解させた溶液を意味する。

Ｐ）ｌは、水酸化ナトリウムで９．６に調整され、溶液の量は、脱ミネラル水の 添加することによりＩＱに調整されている。

ウシチーグロブリン゛　： 精製ウシツーグロブリン［コーン・イー・ジェイ（Ｃｏｈｎ＋Ｅ、Ｊ、）　（１ ９４６）、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアテイ（Ｊ、　Ａ ｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃ、）６８．４５９）をアルカリ性炭 酸塩緩衝液に１．０ｍｇ（ウシチーグロブリン）／ｍＱの濃度となるようにして 溶解させたものである。

悲友１級！辰よ 塩化ナトリウムを、水に対し、最終濃度が９ｇＩＱとなるように添加した。この 溶液に、リン酸カリウム（単塩基性）　０．０１モルを加えた。この溶液のｐＨ を７．４に調整し、脱ミネラル水を添加することにより、溶液量を正確にＩＱに したものである。

ツウィーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０： ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートである０本発明において、この化 合物は、いくつかの工程において、りん酸緩衝液に加えられた。このツウィーン −２０は＋　０．０５％（ｖ／ｖ）の濃度で使用した。ツウィーン−２０の如き 非イオン性浄化剤は、タンパク質の偶然的結合を防止するために用いられる。

抱合抗体： 酵素免疫検定のため、ヒト免疫グロブリン分画に対して向けられた抗体を得た。

これら抗体を、ワサビダイコンペルオキシダーゼと化学的に抱合させ検′出剤と して用いた。この抗体製剤を、使用に先立ち、ツウイージー２０を含むりん酸緩 衝液にて、５００〜２０００倍に稀釈したものである。

基１り逢腋」− ワサビダイコンペルオキシダーゼを定量するため、オルトフェニレンジアミン（ ４００μｇ／ｎ＋Ｑ）を、過酸化水素１０μＨとともにりん酸緩衝液中に溶かし た溶液をつくった。この溶液は。

使用直前につくり、暗所中に保存し、光分解を防止するようにした。

ラベル付き抗体： あるグループの抗原を選択的に認識するため、その抗原物質を、ある分子又はイ オンと共有結合、その他を介して結合させた。

コノような付加分子又はイオンとしては、酵素、蛍光物質、放射性核種等を用い ることができる。

ユベ水豆皇五虱土 あるグループの抗原を選択的に認識するため、その抗原物質を、ある分子又はイ オンと共有結合、その他を介して結合させた。

このような付加分子又はイオンとしては、酵素、蛍光物質。

放射性核種等を用いることができる。

学濃度（ＯＤ）又は口取： サンプルの色吸収度を表わす数値である。光学濃度は、サンプルを通過する光の 百分率との関連で示され、次の式によって表わされる。

００００−２−１ｏパ一セント通過度）タンパク質およびポリペプチド（糖タン パク質およびグリコペプチドを含めて）は、プラスチックあるいはポリマー。

樹脂、ガラス等の固体支持体に固定させることができる。この固定は、所定のｐ ｔ＋での変性、共有結合、熱凝集、紫外線媒介架橋反応（化学的架橋剤を伴ない 、又は伴なわずに）、その他の化学的又は物理的手段、又はこれらの組合せによ っておこなわれる。さらに固体支持体は、糖タンパク質、グリコポリペプチド、 あるいは同様のタンパク質物質からなり、化学的又は物理的、あるいは物理化学 的に変性され、ついで、不溶性のタンパク質繊維に紡がれたもの（他の補助又は 添加物質、たとえばポリマー、樹脂、畦土質又は鉱物質の繊維をともない、又は ともなわずして）、又は紡糸以外の処理により所望の糖タンパク質、グリコポリ ペプチド、その地間様の物質を含む固相物質として用いることもできる。

後述の如く、このような糖タンパク質のフィルム又は不溶性材料は、液体サンプ ル中に存在する免疫複合物を選択的に吸着するという特別の予測を超えた特徴を 有する。この場合の液体サンプルは、生物学的なもの、又はそれ以外のもので、 フィルム状にコーティングされた固体支持体と接触され、又は糖タンパク質材料 と接触される。

以下、本発明のコーティング層の好ましい具体例を、免疫複合物（体液サンプル 中に見出されるところのもの）の好ましい吸着法、ならびに固体支持体に結合し た免疫複合物の検定法ととも記載する。

以前にヒト血清タンパク質との関係で挑戦されたことのない動物集団からのγ− グロブリンが、この方法の好ましｔ１実施例となっている。

工程１；　糖タンパク　コーティング層の固精製つシγ−グロブリンを０．１モ ルの重炭酸ナトリウムからなる緩衝液（ＰＨ＝９．６）と接触させる。得られた 溶液のγ−グロブリン最終濃度は、１．０ｍｇ／ｍｌｌ（ｗ／ｖ）である、この 溶液を。

糖タンパク質コーティング層の形成のために用いた。

受理表面に、このウシγ−グロブリンの薄し１フイルムを固定させるため、上記 のウシツーグロブリン溶液２００μΩを。

９６個の受け穴を有する滴定プレート（Ｐ）（例えばＤｙｎａｔｅｃｈＩｍｍｕ ｌｏｎ　Ｕプレートで一連の受け穴（２０）を有するもの）の各穴に加えた。

第１０図および第１１図に示すように、プレート（Ｐ）の穴（２０）は、各々の 特定の穴を指示するための指示システムを備え。

縦横の列に分割されている。第１０図に示すシステムレこおり）では、縦の穴の 列は１から１２までの数で示され、横の列は、ＡからＨまでの文字で示され、被 検サンプルと結果との正確な関係が保たれている。第１０図のプレートは、明ら かに９６個の受け穴を有するが、その数は適当に変えてもよい。

このプレートを、３７℃に維持した加湿室内に導入し、４時間後に取り出す。

以下に記載の実施例では、９６個の受け穴を有するマイクロ滴定プレートを用い たが、この発明の検定方法は、プラスチック試験管（表面積を大きくするため内 部フィンを設けた試験管を含めて）を用いても、同様におこなうことができる。

コーティング時間、およびウシツーグロブリン濃度は、プレートの増感に必要な 値から極めて若干変更させた。

得られた結果は、フィンの存在又は不存在での試験管で検定をおこなった場合と 、プレートで検定をおこなった場合と同等であった。

結合されないウシチーグロブリンタンパク質は、溶液を振動させることによりプ レートから除去する。ついで、このプレートを、　０．０１モルのりん酸カリウ ムを含む０．９％（％ｌ／ν）食塩溶液（ｐＨ＝７．４）で３回洗い、その結果 、結合されたγ−グロブリンタンパク質の薄いコーティング層（２１）が残る。

好ましくは（但し絶対的なものでない）、第１１図に示すように、穴（２０）の 開口面に適当なポリマー材料からなる保護層又はフィルム（２２）を固着させる ようにする。

盃」虹Ｌ」ｊユ又ユ怠りＶじう：上茎夾創ｉ＊＊ｔｓｉ−させる 上記のようにしてつくられたプレートに体液を接触させる前に、りん酸緩衝液に 少量の血清を加えることにより、この体液を適当に稀釈する。この稀釈は、工程 ３（酵素結合検定）。

において適当な色の量を生じさせるために必要である。

下記実施例のほとんどにおいて、この検定のための最適な稀釈割合は、１：１５ （血清容量：希釈剤容量）である、しかし、検定されるべき体液の性質、採用さ れる検定方法によって。

この稀釈率は適当に変えることができる。この体液溶液の調剤において、免疫学 的に非特異的ペプチド結合アミノ酸（上記定義のもの）をこの体液溶液に加えて もよい。

この体液の稀釈溶液は、ついで滴定プレートの適当な受け穴に導入される。この サンプル中に含まれる免疫複合物の吸着は、３７℃で１０分以上保温することに より増大させることができる。

下記の実施例においては、この場合の保温操作を３０分以上継続させた。

この免疫複合物の吸着を達成させるための保温ののち、サンプルを振動させるこ とにより、サンプル中の非複合化抗体とともに受け穴から振り落される。これは 、複合物として結合されている抗体よりも多い遊離抗体が存在し、この残留する 遊離抗体が背面の吸収度を高めるおそれがあるからである。

ついで、このプレートを、りん酸緩衝液で上記工程１と同様にして３回洗う。こ の緩衝された媒体に対し、０．０５％（ｖ／ｖ）のツウィーン−２０を加えて、 遊離抗体が偶然に結合する可能性を減少させる。

工　３：　プレートに固　された　の 前述の標準酵素結合検定法を免疫複合物の検定に用いる。

しかし、放射能ラベリング、蛍光体等による他の適当な検定法を用いることもで きる。

後述の実施例においては、ヤギに導入された抗ヒトＩｇＧを用い、免疫複合物が ヒトＩｇＧを含むか否かを確めた。これらの抗血清は、ワサビダイコンペルオキ シダーゼ、即ち基体（受媒質）の一つが過酸化水素とともに存在する場合に着色 生成物を生じさせる酵素に結合される。この基体は、抗体に加えられる酵素活性 に一致するものを選ぶべきである。後述の実施例においては、この基体は、オル ト−フェニレンジアミンである。

この条件下で、ワサビダイコンペルオキシダーゼによる触媒で生ずる反応生成物 は、ニトロアニリンであり、これは。

酸溶液中において、くるみ様褐色を示す、この酵素について、他の多くの基体が 存在し、これは、他の酵素についても同様である。

例えば、ペルオキシダーゼはテトラメチルベンジジンの酸化を促し濃い青色生成 物に変え、これは肉眼で容易に検出できる。

アルカリ性のホスファターゼは１種々の基体、例えばＰ−ニトロフェニルホスフ ェートからホスフェート基の除去を促す。

このＰ−ニトロフェニルホスフェート反応による生成物は、Ｐ−ニトロフェノー ルであって、濃黄色を呈する。他の基体、例えばチモール−ホスフェートは、ホ スファターゼの作用を受けた時、別の色を生ずる。

この具体的な記載は、ワサビダイコンペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファタ ーゼ、ベータガラクトシダーゼ等の酵素による直接的結合に基づく単一の検定手 段に、本発明の検定法を限定するものでなく、また、化学的反応手段に限定され るものでもない。

本発明の検定法は、検出方式のいかんにかかわりなく、良好に実施し得るもので ある。この検出方式は１例えば酵素結合免疫検定法であって、免疫複合物の存在 を検出するために用いられる酵素を、抗体又は抗原、さらには固定された免疫複 合物の存在に対し、選択性を有する他の成分に付着させる方式；蛍光抗体法であ って、蛍光物質を抗体、抗原、又はコーティング層に固定された免疫複合物の存 在を検出し得る他の物質に、化学的、物理的、化学物理的手段により、又は他の 手段により付着させる方式；その他、コーティング層により固定された免疫複合 物の存在を検出し得る任意の直接的方式を採用し得る。

さらに１本発明の免疫捏合物検定法において、間接的検出法を同様に採用するこ とができる。この間接的方式としては。

例えば第２抗体法、ビオチン−アビジン又はビオチン−ストレプトアビジン、あ るいは同様の補助剤による増強法、その他、コーティング層中の免疫複合物の存 在を検出するための間接的手段を適宜採用し得る。また、免疫複合物の存在を検 出するための生物学的手段をコーティング層に固定させるようにしてもよい。

そのような手段として、細胞培養、生活又は死亡生物から得られる生活細胞、又 は死亡細胞（これら細胞は未成熟細胞、成熟細胞のいかんを問わず、さらに集落 性のもの、又は孤立性のものを問わず）を使用する方法がある。

このような生物学的材料から得られる成分は、例えば核酸。

核成分、細胞質又は膜質成分、レクチン、レセプタ、オプソニン等を含めて、コ ーティング層に固定された免疫複合物の存在を検出するのに使用し得る。但し、 その場合、レクチン、レセプタ、オプソニン等が、免疫複合物又はその成分と相 互作用し得るものでなければならない。

最後に、コーティング層に固定された免疫複合物の化学的又は物理的検出法を、 本明細書に記載した具体例による検定成績に対して適用することもできる。

その方法としては、例えば溶液Ｐ）ｌ又は光の極性の変化、屈折厚みの変化、電 気的特性、例えば導電性、圧電現象、キャパシタの誘電率の変化１表面の比熱の 変化を知る方法である。

その他、他のものに極めて接近して存在するあるものの検出に用い得る他の任意 の物理的手段を採用することができる。

上述のようにして得た酵素抱合ヤギ抗体溶液を、ついで。

滴定プレートの各穴に加える。

上記複合物のヒト１．Ｇ分画に対するこれら探知用抗体の結合を、３７℃で少な くとも１５分間おこなう０次に、このプレートを保温室から取り出し、内容物を 空にし、上記工程２のようにして洗う。なお、最後の洗浄は、ツウィーンを添加 しない緩衝液を用い、ワサビダイコンペルオキシダーゼ酵素の付着を防止するよ うにする。

酵素ラベルの量は、上述の如く、プレートを、オルトフェニルアミンジアミン（ ４００μｇ／ｍｆｌ）および過酸化水素（３−１０μＭ）含むりん酸緩衝液を用 いて、室温、暗所にて保温することにより判定される。この反応は、１０分間お こなうか、又はスペクトル光度測定装置で判読するのに十分な発色が得られるま でおこなう。

この反応は、のちに、等量の２．５モル硫酸を添加することにより停止され、つ いで、その色強度（光密度、ＯＤ又は吸収度）を、スペクトル光度測定装置（例 えばＤｙｎａｔｅｃｈ　ＭＲ６００）を用いて判読する。

すべての酵素結合免疫検定と同様に１反応生成物の発色は、免疫複合物に結合さ れた抱合抗体の数に比例する。はとんどの場合、結合された抱合抗体の数は、免 疫複合物中のヒトＩｇＧ分子の数と直線状に比例する。従って、フィルム上に固 定された免疫複合物の量が増大するにつれ、光学密度も増大し、酵素反応の吸収 度も増大する。

Ｌ夫１」ＬＬ 実施例１ 血清中の　反複合物の吸収に対する糖タンパク　フィルムの選択性 ポリスチレンからなるプレートにウシツーグロブリンのフィルムを、以下の手順 により形成させた。

（１）　精製ウシツーグロブリン（コーンフラクション■製剤から得たもの）を 、アルカリ性緩衝液（０，１Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ＝９．６）に溶解させた。

（２）このウシツーグロブリンを含むアルカリ性溶液を、３７℃で４時間に亘り 、上記プレートと接触させた。

（３）このコーティング用溶液を、上記保温工程ののち、上記プレートから振り 落し、ついでこのプレートを、塩化ナトリウム溶液（０，０ＩＭ、　ＰＨ＝７． ４のりん酸カリウムで緩衝させたもの）で３回洗い、結合されていないγ−グロ ブリンタンパク質を除去した。

このウシチーグロブリン塗布プレートを、下記特徴を有する個体から得たヒト血 清サンプル中の免疫複合物の存在の判定のために用いた。

（個体の特徴） （１）特に明らかな病状はない（正常）。

（２）寛解傾向の紅斑性狼疹（ＲＥＭ　５ＬＥ）。

（３）軽い紅斑性狼癒又は進行した紅斑性狼ＩＮ（ＳＶＲ５ＬＥ）−（４）軽い ロイマチス関節炎。

これらの血清は、予め、それらの病状に対応する免疫複合物が含まれていること が、Ｃ１ｑ　ＥＬＩＳＡテスト、および放射免疫拡散法により確認されている。

前述のようにして得られたウシツーグロブリン塗布プレートを用いた典型的免反 複合物検定の結果を、表１および第１図に示す。これらのデータは、以下の手順 を用いて得たものである。

（１）テストに先立ち、０．０１Ｍのりん酸ナトリウム緩衝液（ｐ）Ｉ　＝　７ ．４）中に、ＮａＣ１０，１５Ｍを溶かした溶液（以下、　ＰＢＳと略称する） を用いて、血清を正しく稀釈した。この実施例では、血清１容量部を、　ＰＢＳ 　１５容量部で稀釈した。

（２）この稀釈した血清を０．１ｍｆｌずつ、指定された受け穴に導入した。こ の実施例では、各標本について、７回繰り返して判定をおこない、その平均をと った。

（３）標本を収容したプレートを、加湿保温器において、３７℃で３０分間保温 した。この保温ののち、プレートを保温器から取り出し、液体を振り落し、つい で、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ツウィーン−２０）を、溶 液ＩＱ当り０．５ｍＱを含むＰＢＳ溶液で３回洗滌した。

（４）このプレートを、ヒト免疫グロブリンＧのγ−鎖に特異性を有するワサビ ダイコンペルオキシダーゼ抱合抗体を含む溶液と接触させた。ついで、このプレ ートを、３７℃、１５分間保温して上記抱合抗−ＩｇＧを付着させた。保温のの ち、このプレートを、ＰＢＳで３回洗滌して、結合されていない酵素抱合抗体を 除去した。

（５）プレートの各穴に、オルトフェニレンジアミンと過酸化水素とを含むＰＢ Ｓを加えることにより、ワサビダイコンペルオキシダーゼの活性につき検定をお こなった。

免疫複合物の存在は、反応を硫酸で停止させたのちに現われた濃いくるみ様褐色 によって検定した。

この発色を、「ダイナチック（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）Ｊ　（商標）ＭＲ６００プレ 一ト判読用スペクトル光度測定装置を用い、波長４９０ｎｍで定量化した。なお 、このスペクトル光度測定で試薬が空白の部分は、プレート中の穴がヒト血清と 接触しなかった場合を示す。

表　１ （糖タンパクコーティングによる免疫複合物の吸着）正常　０．１３３　０．０ ０４ 寛解傾向ＳＬＥ　Ｏ，２６９０，００６重いＳＬＥ　０．６１７　０．００８ 軽いＲＡ　Ｏ，８６９０，０１３ （注釈） 平均光密度（平均吸着度）の下の数値は、この検定において得られた波長４９０ ｎｍでの光密度である。また、この数値は。

１つのサンプル当り７回の検出をおこなった結果の平均値である。

標準偏差の下の数値は、平均値の襟章偏差を示す。

曵−笠土 ＳＬＥ：紅斑性狼癒 ＲＡ；ロイマチス関節炎 ウシチーグロブリンにより処理した支持媒体の免疫複合物を吸着する能力は、免 反複合物疾患と診断された個体から得られた血清に接触された穴での吸収の増大 により証明されている。病気の重さと、この方法で発色された色の量との関係′ も良好であることが見出された。

正常のヒト血清は、この検定において発色はほとんどなく。

このコーティングされたプレートの免疫複合物に対する特異性を証明するもので あった。この同じ方法を、全血および抗凝固化された血漿に対して適用したとこ ろ、同様に良好な結果が得られることが証明された。

失胤且Ｉ コーティングされていないポリスチレンプレートによる血清　の　Ａ物の 糖タンパク質の有益な効果を実証するため、ポリスチレンプレートをコーティン グしない状態で、実施例１の血清を用い、同一保温条件で血清に接触、保温させ た。ついで、このプレートを過酸化物−抱合抗−ＩｇＧに接触させ、前と同様に ペルオキシダーゼについて検定した。

その結果、予想通り、無処理のプレートではほとんど選択性を示さず、ウシチー グロブリンの如き糖タンパク質でコーティングされたプレートに見られるような 選択性とバックグラウンド（背景）と異なり、極めて高いバックグラウンドが認 められた。

この操作で得られた結果を、表２および第２図に示す、第２図に示す各バーの高 さは、７回の繰り返し検定における平均吸収度を示す。

表　２ （コーティングされていないポリスチレンによる免疫複合物の吸着）正常　０． ４３１　０．０２０ 寛解傾向ＳＬＥ　０．６８２　０．０２１重いＳＬＥ　Ｏ，５９９０，０４１ 軽いＲＡ　Ｏ，７８１０，０３１ （注釈） 表１と同様に、平均光密度（平均吸着炭）の下の数値は、この検定において得ら れた波長４９０ｎ［１１での光密度である。また、この数値は、１つのサンプル 当り７回の検出をおこなった結果の平均値である。

標準偏差の下の数値は、平均値の標準偏差を示す。

スペクトル光度測定におけるブランクスは、ヒト血清に接触されなかった非コー テイングプラスチック穴を用いておこなったものであり、このブランクスは抱合 抗体への接触、ペルオキシダーゼについての検定等を含むすべての後工程に供し た。このブランクスの穴には、発色は認められなかった。

略　称： ＳＬＥ：　紅斑性狼癒 ＲＡ：　ロイマチス関節炎 大呈五且工 種々の動物種からの精製γ−グロブリンを用い、実施例１と同様にプレートの処 理をおこなった。

このプレートを、実施例１と同様にして、免疫複合物を多く含む血清、免疫複合 物の少ない血清に接触させた。この接触および洗浄ののち、プレートを、実施例 １と同様のワサビダイコンペルオキシダーゼ抱合抗−ＩｇＧを用い、付着した免 疫複合物の存在についての検定をおこなった。その結果を、下記表３および第３ 図に示す。

表　３ （種々の動物種からのγ−グロブリンを用いて、コーティングしたポリスチレン プレートによる血清中の免疫複合物の吸着）０．１０８ イヌ　０．０５２　０．４８３ ０．１３６ ウマ　０，００１　１．０４０ ｏ、ｏｏｔ ウサギ　０．０６８　１．０４５ ０．１７８ ヒツジ　Ｑ、１３１　１．０２４ ０．１５４ （注釈） 表３に記載されている数値は、表の左側ｔこ記載した動物種から得られたγ−グ ロブリン分画でコーティングしたプレートで処理して得られた波長４９０ｎｍで の平均光密度（平均吸着炭）を示している。

血消原は、表の上部角部に示されている。

略　称： ＳＬＥ：紅斑性狼癒 ＲＡ：ロイマチス関節炎 γ−グロブリンが、コーティングされた支持体しこよる免疫複合物の特異的固定 機能を媒介するとｔｌう事実番よ、表３と表１との比較から証明される。コーテ ィングされた各グループは、ヒトの病状に対応して、証明されたヒト血清中の免 疫複合物を固定することができた。

したがって、試験されたすべてのγ−グロブリンコーティング層は、免反複合物 吸収について選択性を示した。しかし、コーティングの差により、品質的に異っ た結果が認められた。

同様の方法を、全血および抗凝固化された血漿について適用した場合も、同様の 良好な結果が得られるであろう。

叉鳳孤生 （コーティングされたポリスチレン球に上る免疫複合物の除去） ウシツーグロブリンのアルカリ性製剤（実施例１と同様に。

ＰＨ＝９．６の炭酸塩緩衝液中にウシツーグロブリンを、１ｍｇ／ｍＱの割合で 溶かしたもの）を用い、ポリスチレン球［バイオビーズ（ＢｉｏＢｅａｄｓ）Ｊ 　（商標）、５Ｍ４．２０〜５０メツシュ、バイオラド・ラバラドリース（Ｂｉ ｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、リッチモンド。

カルフォニア州、米国）を処理し、このポリスチレン球↓こ免疫複合物を付着さ せた。

実施例１と同様に、予め免疫複合物のレベルを検定した免疫捏合物含有血清を、 ３７℃でこのポリスチレン球を詰めたカラムに通過させ、このカラム濾過の前後 における免疫複合物の量を測定した。この処理の結果を１表４および第４図に示 す。

表４ （コーティングされたポリスチレン球による血清中の免疫複合物の除去） 正常　０．１５５　０．０３３ 重いＳＬＥ　Ｏ，６０１０，０３５ （注釈） 無病の個体からの血清サンプルと、紅斑性狼疹疾息の個体からの血清サンプルを 、別々に前記のアルカリ性つシγ−グロブリン処理カラムに通過させた。

免疫捏合物検定は、カラムによる処理前後についておこなった・ この処理前後におけるサンプルに現われた光密度を、上記ＳＬＥ：紅斑性狼疹 このようにして、ウシツーグロブリンでコーティングしたポリスチレン球は１選 択的に、かつ、迅速に免疫複合物を吸収した。この複合物の約９０％は、この方 ラム中への１回の通γ−グロブリンによる処理は、血清サンプルから免疫複合物 を比較的迅速に除去するのに有効である。

したがって、同様の糖タンパク質を用いて十分に大きいカラムとした場合は、全 血をこのカラムに交換完了速度で流した場合、可成の量の免疫複合物を除去し得 るものと考えられ、したがって１本発明を治療法にも適用することができる。

このように血清を処理することにより循環する免疫複合物の選択的除去を容易に することができる。さらに、多量の血液から免疫複合物をカラムで分離すること により、この複合物の濃縮を図ることができる。したがって、この複合物中に存 在する微量成分、例えば免疫グロブリン遺伝型、抗体の希少亜綱、希少又は隠蔽 抗原の検出が可能となる。これと同じ方法が抗凝固血漿に対しても、同様に良好 に適用し得るであろう。

実施例５ この実施例は、非可動化された糖タンパク質コーティングを用いて、免疫複合物 の検定をおこなう場合の液相ウシγ−グロブリンの有益な効果を説明するための ものである。この添加は、免疫複合物を少ないレベルで含む正常血清サンプルに ついての基準線値を減少させるのに極めて有効である。本実施例では、２つの血 清サンプルがテストされた。

第１のサンプルは明らかな病状を示さないが、前述の免疫捏合物検定において陽 性反応を示す個体から得られたものであり、第２の血清サンプルは、重い紅斑性 狼癒を有する個体から得られたものである。

これら２つの血清サンプルは、　０．ＯＩＭのりん酸カリウム（Ｐ）Ｉ　＝　７ ．４）を含む０．１５ＭのＮａＣ１溶液（りん酸緩衝液）、又はウシツーグロブ リンを、緩衝液１ｍＱ当り１■の濃度で含むりん酸緩衝液で稀釈した。

このサンプルを稀釈したのち、実施例上ないし３に記載した固相検定に従って、 免疫複合物についての４つの製剤を、それぞれテストした。この検定の酵素結合 部分から生ずるくるみ様褐色を、「ダイナチック（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）Ｊ　（商 標）　ＭＲ６００プレートリーダを用いて、波長４９０ｎｍで測定した。その結 果を、表５および第５図にプロットして示した６正常　０．７３９　０．０２０ ＳＬＥ　Ｏ，３９００，３２３ （注釈） 上記表においては、テストのため凝固血液からの血清を用いた。

「正常」とは、静脈切開時には臨床的に明らかな病状を示さない個体から得た血 清を意味する。ｒｓＬＥＪとは、本実施例においては紅斑性狼癒を示していると 診断された個体から得た血清を意味する。検定に先立ち、血清１容量部を稀釈剤 １５容量部で稀釈した。

ｒ　ＢＧＧ欠如」の列では、稀釈剤として０．ＯＩＭりん酸カリウムでｐＨ７， ４に調整した０、１５Ｍ　ＮａＣ１溶液を用いた。

ｒ　ＢＧＧ存在」の列では、稀釈剤としてウシツーグロブリンをりん酸緩衝液に 、緩衝液１ｍＱ当り０．５■の割合で溶解させたものを用いた。

この稀釈血清溶液を、実施例上ないし３と同様にして、免疫複合物の検定に供し た。表５中の数値は、４回の検定の繰り返しの平均吸収度を示す。

第５図は、血清サンプルを、りん酸緩衝液又はウシツーグロブリンを、緩衝液１ ｍρ当り１■含むりん酸緩衝液を用いて稀釈した結果を示すものである。

稀釈ののち、サンプルを実施例１，２および３の固相検定法を用いて、免疫複合 物についての検定をおこなった。第５図のバーの高さは、４回の繰り返し検定の 平均吸収度を表わしている。

第５図において、正常とは明らかな病状を示さない個体から得られた血清を意味 し、ＳＬＥとは、紅斑性独癒を示す個体から得られた血清を意味する。

−ＢＧＧとは、りん酸緩衝液で稀釈された血清を意味し、＋ＢＧＧとは、ウシツ ーグロブリンを１■／ｍＱの割合で含むりん酸緩衝液で稀釈した血清を意味する 。

血清稀釈剤にウシツーグロブリンを添加することにより、正常血清サンプルに見 られる吸収度を約４０倍減少させる。実際に、ウシツーグロブリン稀釈正常血清 で検定をおこなった場合、発色はほとんど認められない。

反対に、真正自己免疫異常を持つ個体から得た血清を、ウシチーグロブリン含有 緩衝液で稀釈した場合は、肉眼的にも、スペクトル光度測定装置による場合でも 、発色において殆んど変化は見られない。

従って、ウジツーグロブリン含有緩衝液によって稀釈した場合は、正常血清と自 己免疫血清との間に１６倍の差異が認められだが、ウシチーグロブリン含有緩衝 液を用いない場合は。

差異は全く認められなかった。

さらに同様の検定テストにおいて、この手法により、病気を持たない個体につい て偽りの陽性発生が防止され、病気を持った個体の検出は高められた。

この結果から、タンパク質様つシγ−グロブリンを稀釈液に添加することによる 有益な効果が明確に示された。すなわち、偽りの陽性の発生割合を減少させ、真 正の陽性の検出割合を実質的に変えることがなかった。

来電孤立 前記実施例は、本発明に係る免反複合物固定方法の利用について説明するもので ある。

本実施例によるデータは、前記の固定方法が、どのような一般的な抗凝固剤が用 いられるか否かに拘わらず、血漿および全血の場合にも適用し得ることを証明す るものである。

本実施例において、血液は、健康な供血者およびロイマチス関節炎の個体から集 められた。各供血者から、４個の採血管により採血された。

第１の採血管↓こは抗凝固剤が添加されなかった。残りの３本の採血管には、抗 凝固剤が添加された。第２の採血管には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ） を、最終濃度が１．５■ＥＤＴＡ／ｍｌ１（血液）となるように添加した。第３ の採血管には、ヘパリンを最終濃度が２８ＵＳＰ単位ヘパリン／ＩＩＱ（血液） となるように添加した。第４の採血管には、クエン酸ナトリウムを最終濃度が３ ．５■ク工ン酸ナトリウム／ｍｆｌ（血液）となるように添加し標本を、以下の ようにしてつくり、検定をおこなった。

第１の１対の標本（正常およびＣＩＣ上昇被検者からそれぞれ１つずつ）を１通 常通りに凝固させ、血清を分取した。これら血清は、実施例１および５の方法で 免疫複合物の検定に供した。

第２の１対の標本から、それぞれ全血の一部を分取し、ＥＤＴＡで抗凝固化させ 、実施例１および５の免疫複合物検定法に供した。各標本の血漿成分を遠心分離 により分離し、この血漿サンプルについて、実施例１および５の方法で、免疫複 合物の検定をおこなった。

第３の１対の標本から、全血の一部をそれぞれ分取し、ヘパリンを用いて抗凝固 化させ、上述の如く検定した。標本の各対の血漿を、遠心分離により分離し、上 述のように検定した。

第４の１対の標本から、全血の一部を分取し、クエン酸ナトリウムで抗凝固化さ せ、ついで上述の如く検定した。各標本の血漿成分を、遠心分離により分離し、 上述のように検定した。

これらの検査の結果を、表６および第６図に示す。

表６から、凝固形成防止のための全血への抗凝固剤の添加は、正常量の免疫複合 物質を含む標本を、多量の免疫複合物質を含む標本から区別する検定機能に対し 、悪影響を及ぼすものでないことが証明された。

一般に、抗凝固剤の添加は、検定性能を僅かに改良させることが、血清について の値が、血漿又は全血サンプルについての値より何倍も高められることから証明 された。この現象は、血清成分、例えば補体又はコングルチニンに基づくとする この方法における免疫複合物の付着機能を根本的に除外するものである。

これら薬剤は、活性のためにカルシウムイオンを必要とし、ＥＤＴＡ又はクエン 酸液の添加により、血液から遊離カルシウムが除去される。従って、この実施例 は、免疫複合物質定のための薄膜糖タンパク質フィルム法の利用を説明するとと もに。

この検定に用いられる糖タンパク質薄膜の驚くべき特性を示すものである。

免疫複合物質常を示す個体からの血清サンプルは、正常個体からのサンプルと比 較して、可成り効果の上昇が認められた。これは１個体からの血液の凝固防止が 図られたか否かに関係なく、かつ使用された抗凝固剤にも関連がない。

このような動作からして、免疫複合体の固定のための手法は、血漿又は全血に対 しても、免疫複合物の検定を目的として適用することができる。前記テストから 、ここに記載した免疫複合物を除去する方法が、血清、血漿又は全血に対しての みに限られないことは明らかである。

尿、腹水、脳背髄液等の広範の体液に存在し、又、実験室でつくられる生体混合 物中から得られる免疫複合物が、ここに記載した糖タンパク質コーティング層に 固定され得ることは明らかである。

したがって１本発明の利用範囲は広範なものとなる。実際に、第７図に示すよう に、抗凝固化された全血、および／又は血漿を、糖タンパク質塗布ビーズを用い てつくられたカラムに通過させ、免疫複合物を除去する原理を応用して、自己免 疫異常の患者から免疫複合物を除去する治療にも適用することができる。

表６ （全血から得られた標本の免疫複合物検定法）条件　吸収度　修正　最終吸収度 　上昇度（倍）正常 血清　０．１２８　１．００　０．１２８　１血漿−ｈａｐ　Ｏ，１０７１，０ ００，１０７１血漿−ＥＤＴＡ　Ｏ，１１８１，０００，１１８１血漿−ｃｉｔ 　Ｏ，０９９１，１１０，１１０１全血−ｈｅｐ　Ｏ，１０７１，４９０，１５ ９１全血−ＥＤＴＡ　Ｏ，０９５！、４９　０．１４２　１全血−ｃｉｔ　Ｏ， ０７５１，６６０，１２４１ＲＡ血漿　０．７６５　１．００　０．７６５　６ 血漿−ｈｅｐ　Ｏ，８６４１，０００，８６４８血漿−ＥＤＴＡ　１．０３１　 １．００　１．０３１　９血漿−ｃｉｔ　Ｏ，８３０１，１１０，９２１８全血 −ｈａｐ　Ｏ，６３７１，８０１，１４５７全血−ＥＤＴＡ　Ｏ，７３３１，８ ０１，３１８９全血−ｃｉｔ　Ｏ，５？９　２．１２　１．２２７　１０明らか な病状を示さない個体、又はロイマチス関節炎（ＲＡ）。

又は脈管炎を持つ個体からサンプルを得た。

血清は、凝固血液を遠心分離したのちに得られた血清標本を意味する。血漿は、 抗凝固剤を含む全血を遠心分離したのちに得られる上澄液を意味する。抗凝固剤 の略称は、以下の通りである。　ｈｅｐはヘパリン；　ＥＤＴＡはエチレンジア ミン四酢酸；　ｃｉｔはクエン酸塩である。

表に明示した如く、抗凝固化全血をテストした。容量修正についての因数は、全 血中に加えられたクエン酸塩又は細胞量を示すために必要である。クエン酸塩溶 液は、最終量の１０％を構成する。

ヘマトクリット値は、正常サンプルについては血液量の３４％、ＣＩＣ上昇サン プルについては４４％とした。上昇倍率は。

任意のＣＩＣ−上昇標本における吸収度を、各正常標本のもので割った値である 。

４個の血液標本は各個体から採られたものであり、１つは、抗凝固剤を含まない 採血管内に収容したもの、残りの３つは、それぞれ異なる抗凝固剤を添加した採 血管に収容した。

次の略称は、このようにしてつくられた標本中の抗凝固剤を示す−（１）　ｈｅ ｐ−ヘパリン、　２８ＩＵ／＋ｎＱ　；　（２）　ＥＤＴＡ−エチレンジアミン 四酢酸、１．５■／ｍＱ　；　（３）　ｃｉｔ−クエン酸ナトリウム。

３．５■／　ｍ　Ｑ　ｍ これら標本から得られた全血、血漿、血清（ＳＥＲ）を、実施例１および５に詳 述した検定法に供した。第６図中のバーの高さは、検定につづいて測定した吸収 度を示している。この表６のデータは、第６図にグラフ化されている。

ヌ１［辺！＝ 実施例３に示したように、糖タンパク質塗布固体支持体からつくられたカラムは 、血清サンプルから免疫複合物を抽出する機能を有する。このカラムの利用は、 本実施例のデータにより与えられている。

血液等の体液サンプルは、しばしば、抗凝固剤、例えばヘパリン、エチレンジア ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸塩等の添加により凝固防止が図られる。

これら化合物は、タンパク分解作用と干渉し、フィブリン活性化により凝固を防 止したり（ヘパリン）、カルシウムをキレート化することにより凝固防止を図っ ている（ＥＤＴＡ又はクエン酸塩）。

本実施例において、これらヘパリン、ＥＤＴＡ、クエン酸塩は糖タンパク質被覆 個体支持体が、免疫複合物を吸着又は固定する機能に対し影響を及ぼさない。こ れは、カラムに通過させるサンプルが全血であろうが、それから取り出された血 漿であるかにはかかわりがない。

さらに、これら抗凝固剤の存在下での免疫複合物の固定は、抗凝固剤を含まない 血清の場合と異ならない。

本実施例での抗凝固剤の濃度は、ヒトに対して通常用いられるものより高いもの であった。このように高い濃度の抗凝固剤の使用が、免疫複合体検定に対し悪影 響を及ぼさないから、除去を目的として用いられる抗凝固剤の中間濃度のものも 、この複合物の免疫吸着に対しても悪影響を及ぼさないことは明らかであろう。

本実施例の目的において、ロイマチス関節炎登有する個体からの血液標本を、ヘ パリン、ＥＤＴＡ、又はクエン酸ナトリウムを添加した採血管内に採血した。対 照標本として、抗凝固剤を添加しない採血管に採血した。この対照標本を凝固さ せ、血清を保存した。免疫複合物検定は、実施例１と同様にしておこなった。但 し、免疫複合物検定のための保温（第２の保温）は、ワサビダイコンペルオキシ ダーゼ抱合ヤギ抗血清を用いておこない、また実施例１のＩｇＧ特異的抗体の代 わりに、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡを用いた。

これら多価抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、　ＩｇＡ特異的）の使用によりテストの化学 的感度が、さらに高められ１本吸着法の適用性が改善された。

免疫複合体検定につづいて、実施例３で記載されたＢＧＧコーティングポリスチ レン球（ビーズ）を用いたカラムに、未稀釈サンプル０．２５ｍＱを加えた。こ のカラムを、前記同様、３７℃で３０分間保温した。次に、このサンプルを塊と して溶出した。したがって、それほどは稀釈されなかった。

さらに、りん酸緩衝液を、このカラムに通過させ、最終稀釈を１：１６とし、ゆ るく結合した免疫複合物を、すべてカラムから除去した。その結果得られた稀釈 溶出液を、さらに稀釈することなく、免疫複合物について検定した。別の対象と して、血清を未処理ポリスチレンビーズと接触させて保温したものをつくった。

このカラムからの溶出液についても、上記同様に検定した。

この操作により除去された免疫複合物の百分率は、次の式によりめられる。

この方法による結果を１表７および第７図に示す。

表７および第７図から、抗凝固剤の存在は、血漿又は全血から免疫複合物を除去 するための糖タンパク質処理支持体の能力に全く悪影響を与えないことが明らか である。これは、前記実施例同様に、免疫複合物を支持体に固定するところの糖 タンパク質−免反複合物相互作用が、カルシウムの存在を必要としていないこと からも予測できる。

非コーテイングポリスチレン支持体は、免疫複合物を十分量固定することができ なかった。これは、実施例１〜３で示すところと一致している。

本実施例で証明された如く、糖タンパク質フィルムを、適当な支持体に適用した ものは、全血又は血漿から免疫複合物を除去するのに極めて有用である。このこ とは、抗凝固剤の有無にかかわりない。

この特性は、免疫複合物に関連する病気、異常の治療として、血液から免疫複合 物を吸着、除去するのに適用することができる。その他、この方法の利用として 、カラムを用いて稀少抗体又は抗原（免疫複合物に存在する）を濃縮させること もできる。カラムから、この濃縮複合物を溶出させ、ついで、実施例１および５ と同様の方法により、稀少抗体、抗原の検出を容易におこなうことができる。

表７ カラム充填物　除去された複合物（％）血清　２８％ 血清１　８％ ヘパリン処理全血　３４％ ヘパリン処理血漿　３１％ クエン酸処理全血　４０％ クエン酸処理血漿　３７％ ＥＤＴＡ処理全血　４８％ ＥＤＴＡ処理血漿　６４％ （注釈）：　糖タンパク質コーティングポリスチレンビーズのカラムを用いた血 清、血漿、全血からの免疫複合物の除去。

血液は、それぞれ異なる抗凝固剤を添加した真空採血管に採血された。この採血 管は以下の如く指示された。

ヘパリン；最終血液濃度において、２８ＵＳＰ単位３．５■１ｍ党。

クエン酸塩；最終血液濃度において、クエン酸ナトリウム３．５■／ｍΩ。

ＥＤＴＡ　；最終血液濃度において、ナトリウムＥＤＴＡ１．５■／ＩＩＩＱ。

採血ののち、各血液標本の一部を、遠心分離し、血漿を分取した。これら血漿サ ンプルを１表に示したように用いた。

全血とは、遠心分離前の抗凝固化された標本を意味する。血清とは、採血管に採 血され、凝血させたのちに得られる液状成分を表わす。

免疫複合物のカラム抽出のため、各サンプル０　、２５ｍ１２を、８個のカラム の各々に添加し、３７℃で３０分間保温した。残る血清成分は、３．７５ｍｆｌ のＰＢＳを用いて、カラムから溶出させ、これを免疫複合物の検定に用いた。除 去された複合物の百分率を、別記の如く計算した。

比較のため、ポリスチレン支持体に薄い糖タンパク質フィルムを形成させてつく ったカラムに血清対照物を通過させた。

血清とは、採血管に採血され、凝血させたのち分離される液体成分からなる血液 種本を表わす、この血清対照物は、抗凝固剤を含まないものである。

この血清対照物の目的は、抗凝固剤の濃度の如何にかかわらず、糖タンパク質塗 布基体の免疫捏合物除去機能に対する抗凝固剤による悪影響は全くないことを証 明するためのものである。なお、この糖タンパク質塗布基体は、血液又は血漿か らの免疫収着による免疫複合物の検定、又は治療を目的とした免疫複合物の除去 のために用いられる。

第７図において、各バーの下に示された標本を、カラムに加えた。このバーの高 さは、標本から除去された免疫複合物の百分率を表わしている。なお、略称は、 次の通りである。

ＳＥＲ：　血清 Ｎ／Ｃ：　非コーテイング処理ポリスチレンのカラムを通過させた血清。

Ｈ／ＶＢ　：ヘパリンで処理した全血。

Ｈ／Ｐ　：　ヘパリンで処理した全血から得られた血漿。

Ｃ／ＷＢ　：クエン酸塩で処理した全血。

Ｃ／Ｐ　：　クエン酸塩で処理した全血から得られた血漿。

Ｅ／ＷＢ　：　ＥＤＴＡテ処理した全血。

Ｅ／Ｐ：　ＥＤＴＡで処理した全血から得られた血漿。

来電桝互 グリコジル化ポリペプチドフィルムは１分子量及び組成になうことができる。

この機能を説明するため、紅斑性狼疹の個体から得た血漿を、アガロースＡ−１ ５Ｍ（商標、ＢｉｏＲａｄ社製）の筒状カラム（１，６ｘ３５ａｎ）を用いてカ ラムクロマトグラフィー分析をおこなった。このアガロースＡ−１５Ｍは１分子 の大きさに従って、４０．０００〜１５，０００，０００ダルトンに亘って分子 を分離することができる。

次に、このカラムに、りん酸緩衝液を用いて溶出をおこない、この溶出液中のタ ンパク質量を、ｌ５ｃｏυＶモニター（波長を２８０ｎｍにセットして）を用い て検査した１次にこの溶出物を。

カラムが出たところで、２　、８ｍＱずつに分割し、各分画を前記実施例と同様 にして、免疫複合物についての検定をおこなった。この場合、検定のため、ペル オキシダーゼラベル付き抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、　ＩｇＡを用い、ＩｇＧ−、Ｉ ｇＭ−１ＩｇＡ−含有複合物の検出をおこなった。

その結果を第８図で見ると、この免疫複合物検定による免反複合物結合ピーク部 は、タンパク質のピーク部（ＯＤ２゜。モニターで示したもの）から、かなり変 位していることが明らかである。さらに、免疫グロブリンの主な綱（クラス）を 含む複合物は明確な挙動を示し、カラムの較正（第９図）により、この患者に見 られる免疫複合物は、分子質量が２００，０００ないしｓ、ｏｏｏ、ｏｏｏドル トン以上に亘ることか見出された。

本発明の検定法の利用は、このような特徴的研究に徴して評価されるべきである 。このように免疫複合物に関し、広い用途に適用し得る検定法は殆んどなかった ものである。

（注釈） 第８図は、血清中のヒト免疫複合物のアガロースＡ１５によるゲル濾過を示す。

免疫複合物は、アガロースＡ１５Ｍ（直径１．６ＣＩＤ、長さ３５Ｃ）カラムに より、そのサイズに従って分離された。横軸は、溶出分画番号を示し、縦軸は吸 収度を示している。１つのカラムの容量は、約２５分画に相当する。紅斑性狼疹 の個体から得られたヒト血清サンプル１．０ｍＱを、カラムの頂部へ分画Ｏで適 用した０分離および溶出は前述のりん酸緩衝液（０，ＯＩＭりん酸カリウムを添 加した０、１５Ｍ　ＮａＣ１溶液、ＰＨ＝７．４）を用いておこなった。

第８図において、Ｐは、ｌ５ｃｏカラムモニターで波長２８０ｎｍで検査した吸 収度を示している。カラムの空間容積は、矢線■０で示されている。　ＩｇＧ、 ＩｇＡ、　ＩｇＭに対し特異的な免疫複合物検定から得られた吸収度は、それぞ れＧ、　Ａ、　Ｍで示した線により示されている。　ＩｇＭ−含有複合物につい ての吸収度（曲線Ｍ）は、この検定に用いられたＩｇＭプローブの増大感度の結 果によるものである。ＧおよびＡ特異性抗体の感度は、実験室で制御された条件 下ではほぼ等しいものであった。

（注釈）：第９図は、アガロースＡ１５Ｍカラムの較正を示している。

第９図の注釈の項で示されているクロマトグラフィーカラムは、種々のタンパク 質を用いて較正し、この検定法で検出された免疫複合物の分子量を決定した。

５つの異なる溶出をおこなった。１つは、それぞれ精製アルドラーゼ（分子量、 １５８，０００）　；　ＩｇＧ　（分子量、１７０，０００）　；カタラーゼ（ 分子量、２３２，０００）　；フェリチン（分子量、　４４０，０００）および チログロブリン（分子量、６７０，０００）を用いておこなった。空間容積は、 凝集タンパク質（分子量、２０，０００以上）およびプループキシトラン（分子 量、１，０００，０００〜５０，０００，０００）の双方を用い、６回の測定で 決定した。カラム容積は、リボヌクレアーゼ（分子量、１３，０００）のクロマ トグラフィーにより決定した。縦軸の溶出度Ｋａｖは、次の式によって計算され る。

分子量のｌｏｇを、第９図の横軸にプロットした。得られた線をＹ線まで外挿し 、除外限界１０，０００，０００ダルトンが得られた。これは、生産者の予測１ ５，０００，０００より内側である。

この媒体でのクロマトグラフィにかけられたタンパク質分画の分子量は、最初に Ｋａｖを計算し、ついで、第９図の分子質量を参照することにより決定すること もできる。

尖凰貫主 本実施例は、前述の免疫複合物の検定法の利用について。

さらに説明することを目的としている。紅斑性狼疹の如き多くの自己免疫異常は 、その初期段階での診断が困難であるが、抗原又は抗原の小さい集団を生産して いる。もし、これらの免疫複合物を、その抗原性成分について検出することがで きれば、病気の認識、診断が非常に容易となる。

もし、実施例１の如きコーティングされたプレートを、血清、血漿又は全血と接 触させた場合、免疫複合物（抗原性成分および露出したＦｔｂ結合部位を含めて ）は、そのコーティング層に、従って固体支持体に付着することになる。

酵素ラベル付き抗体であって、ある種の自己免疫疾患に特異な抗原又は抗原集団 に特異的なもの、あるいはこの複合物に見出せる酵素ラベル付き抗原（免疫複合 物の露出Ｆ２ｂ部位に結合できるもの）を添加した場合は、問題の複合した病気 特異的抗原の存在をその特徴的発色により実証させることができよう。

他方、免疫複合物がそのような抗原、又はＦ、ｂ部位（その病気に対し特異的又 は選択的なもの）を含むものでなかった場合は、その酵素ラベル付き抗体又は抗 原の添加によっても発色は生じないことになる。

その結果、免疫複合物被検体に対する抗原特異性により、自己免疫異常の診断お よび医療観察、または治療に必要な病気進行のモニターが、極めて容易となる。

この手法の利用は、当業者に容易に理解され得るであろう。

上記実施例は、薄い糖タンパク質のフィルムによる免疫複合物の固体支持体への 固定法の効能、および利用を説明するだめのものである。

これら実施例では、免疫複合物中の抗体分子を容易に判定し得ることを示したが 、この検定方法は、抗体の綱又は属調に限られるものでなく、抗原特異性検出手 段の使用により。

病気の状態を確認するのにも利用することができる。

以下の記載は、そのような検出をおこなうための手段を説明するものである。

抗原および抗体成分は、免疫複合物において、占有されていない結合部位を有し 、これが、ラベル付き又は抱合物質との特異的相互作用を介して検知される。そ の結果、実施例１゜３および４のように、免疫複合物を固定し、ついで酵素抱合 抗原とともに保温することにより抱合抗原の固定が可能となる。

この特性は抗原に対向する抗体が免疫複合物中に存在するならば、抗原−特異的 酵素−触媒反応に導くことができる。

その結果、もし、この複合物が抗原性物質に対向する抗体を含むものであれば、 酵素免疫検定の結果は陽性となる。

逆に、そのような抗体成分が存在しないならば、その酵素免疫検定の結果は陰性 となる。この方法は、免疫複合物の正確な抗体組成に対する病気−特異時検査を 可能とし、その利用分野が拡大される。抱合体は、酵素についてのものに限らな い。蛍光性化学物質、例えばフルオレスセイン等を抗原に添加し、上記抗体が存 在した場合に、免疫複合物に蛍光が付与されるようにしてもよい。

同様に、抗原に放射性核種を抱合させて、予め固定された免疫複合物中に、上記 抗体が存在した場合に、この複合物に放射性が付与されるようにしてもよい。

その他多くの検出方法も考えられる。それらのいずれの方法も１本発明の方法に 従って免疫複合物を固定し、その中に抗体が存在する場合に、＠性の指示を与え るようにすることができる。

同様に、上記複合物中の正確な抗原の存在は、その抗原に対向する抱合抗体を用 いることにより、その抗原の検出に利用することを可能とする。したがって、も し酵素−抱合抗体を、本発明の方法によりつくられた非可動化免疫複合体ととも に保温することにより、その酵素−触媒化反応が生じ、この複合物中の上記抗原 の存在を指示することになる。この場合も、抱合物は酵素のものに限定されない 。

フルオレスセイン等のような蛍光物質を、抗体に添加し、上記抗原が存在した場 合に、免疫複合物に蛍光が付与されるようにしてもよい。同様に、抗体に放射性 核種を抱合させて、予め固定された免疫複合物中に上記抗原が存在した場合に、 その複合物に放射性が付与されるようにしてもよい。

上記抗体の検出の場合と同様に、他の多くの検出方法が考えられる。

それらのいずれの方法も、本発明の方法に従って免疫複合物を固定し、その中に 抗原が存在する場合に、陽性の指示を与えるようにすることができる。

オリゴペプチド、改質オリゴペプチド、ポリペプチド、改質ポリペプチド、タン パク質、改質タンパク質等であって、吸収、吸着、その他の付着機構により免疫 複合物を、選択的および直接的に固定する機能を有する免疫学的に非特異的ペプ チド結合アミノ酸を用いて、支持体にコーティングする上記方法は循環免疫複合 物の存在検出のための体液処理、およびこの循環免疫複合物の除去のための体液 処理など広い用途に適用することができる。

特に、上記の免疫学的に非特異的ペプチド結合アミノ酸に基づく分類化合物のグ リコジル化は、免疫複合物の分離、同定のための最も有用な組成物を形成させる 。

この発明の方法を十分に理解すれば、その適用の容易性、および広範な用途を容 易に理解し得るであろう。この方法で、固体支持体を処理することにより、自己 免疫障害の検査、治療への重要で、かつ有用なアプローチが得られ、さらに多く の新しい手法が、これにより示唆されることになるであろう。

そのような手法としては、免疫複合物中の抗体の綱、および属調の組成の検出、 免疫複合物の抗原の性質の判定、さらに血清、その他体液又は体内又は体外から の液体中に存在するこの種の複合物の除去などである。

以上詳述した方法は、血清中の循環免疫複合物の直接的検出、および血清からの 循環免疫複合物の直接的除去などに、広範な適用性および利用性を有するもので ある。

また、特定の理論に拘束されるものではないが、グルコシル化の種々の程度、又 は機能的に同等の置換を、上記オリゴペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質 の免疫学的に純ぼくな種類のものに付与することにより、検定および除去を目的 として、血清中の免疫複合物と直接的に付着する能力を有する物質の集団を形成 することができる。

ここに記載された発明の概念は、様々に変えて具体化させることができる。請求 の範囲は、従来技術により制限されない限り、他の具体例をも含むものである。

ＦＩＧ、　１ 正　％７・　ＲＥＭ　ＳＬＥ　５ＶＲＳＬＥ　ＭＯＤ　ＲＡＦＩＧ、　２ Ｖ坂゛　イ又　ウマ　ウサギ　ヒツン ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、７ 国際調査報告 １１１１＃１１１“′°′″ｌ　ＡＨｉ“°““７°ＰＣＴ／Ｕ！Ｊ６１００１ １７８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．体液標本中の免疫複合物の組成、又は濃度を判定するための体液標本の免疫 検定方法において、検定すべき標本、および免疫学的に非特異的ペプチド結合ア ミノ酸を、受理手段上に導入する工程（但し、該ペプチド結合アミノ酸は該受理 手段に吸着し、かつ該標本中の免疫複合物を該受理手段へ固定させる機能を有す る）と、該ペプチド結合アミノ酸を介して、該標本中の免疫複合物を該受理手段 に固定させる工程と、 この固定された免疫複合物を、該標本中の免疫複合物、抗体および抗原成分の組 成又は濃度についての指示が生ずるように処理する工程と を具備することを特徴とする方法。 ２．上記受理手段を、免疫学的に非特異的ペプチド結合アミノ酸を含む溶液で処 理し、該受理手段上に、該ペプチド結合アミノ酸の層を形成させ（但し、該受理 手段は、好ましくは検定されるべき標本を受理するための手段を備える固相ベー スからなるもの）、ついで、検定されるべき上記標本を、該受理手段上に導入す る工程を含むことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．上記免疫学的に非特異的なペプチド結合アミノ酸が、オリゴペプチド、改質 オリゴペプチド、ポリペプチド、改質ポリペプチド、タンパク質、改質タンパク 質、好ましくはグリコシル化ポリペプチドおよびグルコシル化タンパク質の分子 群から選ばれるものであり、さらに該分子群が、免疫複合物に対し親和性を有し 、上記グリコシル化タンパク質が、好ましくは背椎動物、より好ましくは、哺乳 動物種、最も好ましくはウシγ−グロブリン、ウマγ−グロブリン、ウサギγ− グロブリン、イヌγ−グロブリン、ヒトγ−グロブリン、ヒツジγ−グロブリン 、ヤギγ−グロブリン、ネズミγ−グロブリン、ブタγ−グロブリン、ネコγ− グロブリンから得られるグロブリン分画、又は上記のいずれかのγ−グロブリン のコーンフラクション、特にウシγ−グロブリンのコーンフラクションから選ば れ、上記グリコシル化ポリペプチドが、化学的に合成されたもの、又は組換えも しくは雑種細胞技法、あるいはその他の方法で細胞を改質もしくは変態させ、そ の細胞を介して、所望のグルコシル化タンパク質を生成せしめることにより得ら れた変態遺伝構造を有する生物により合成されたものであることを特徴とする請 求の範囲第１項又は第２項に記載の方法。 ４．体液から免疫複合物を除去する方法であって、以下の工程、即ち、 （１）免疫学的非特異的ペプチド結合アミノ酸分子を含む組成物を、該組成物の 固定を容易にする所定の条件下で基体に固定させ、該基体上にコーティング層を 形成させる工程と、 （２）上記コーティング層に、免疫複合物を含む特定の体液を、該免疫複合物が 上記基体に容易に吸着するようにして接触させる工程 とにより、体液中の免疫複合物を上記基体上のコーティング層に固定させること を特徴とする方法。 ５．免疫学的に非特異的ペプチド結合アミノ酸を含む上記組成物が、オリゴペプ チド、改質オリゴペプチド、ポリペプチド、改質ポリペプチド、タンパク質、改 質タンパク質、好ましくはグリシル化ペプチド、グリシル化タンパク質のうちか ら選ばれるペプチド結合アミノ酸分子を含み、さらに該ペプチド結合アミノ酸分 子が、免疫複合物に対し親和性を有し、上記グリコシル化タンパク質が好ましく は脊椎動物、より好ましく哺乳動物種、最も好ましくはウシγ−グロブリン、ウ マγ−グロブリン、ウサギγ−グロブリン、イヌγ−グロブリン、ヒトγ−グロ ブリン、ヒツジγ−グロブリン、ヤギγ−グロブリン、ネズミγ−グロブリン、 ブタγ−グロブリン、ネコγ−グロブリンから得られるグロブリン分画、又は上 記のいずれかのγ−グロブリンのコーンフラクション、特にウシγ−グロブリン のコーンフラクションから選ばれ、上記グリコシル化ポリペプチドが、化学的に 合成されたもの、又は組換えもしくは雑種細胞技法あるいはその他の方法で細胞 を改質もしくは変態させ、その細胞を介して、所望のグリコシル化タンパク質を 生成せしめることにより得られた変態遺伝構造を有する生物により合成されたも のであることを特徴とする請求の範囲第４項に記載の方法。 ６．体液から免疫複合物を除去する方法であって、以下の工程、即ち、 （１）免疫学的に非特異的ペプチド結合アミノ酸分子を含む組成物を、固定化に 必要な所定温度にて十分な時間培養することにより、基体上への該組成物のコー ティング層の固定をおこなう工程、 （２）該基体上に固定されたコーティング層を、免疫複合体およびりん酸緩衝溶 液を含む溶液と接触させる工程、（３）該溶液中の免疫複合物を、吸着に必要な 所定温度にて十分な時間培養することにより、上記コーティング層への該免疫複 合物の十分な吸着を促進する工程を具備することを特徴とする方法。 ７．免疫学的に非特異的ペプチド結合アミノ酸を含む上記組成物が、アルカリ性 であって、オリゴペプチド、改質オリゴペプチド、ポリペプチド、改質ポリペプ チド、タンパク質、改質タンパク質、好ましくはグリコシル化ポリペプチドおよ びグリコシル化タンパク質の分子群から選ばれるペプチド結合アミノ酸分子を含 み、さらに該分子群が、免疫複合物に対し親和性を有し、上記グリコシル化タン パク質が好ましくは背椎動物、より好ましくは哺乳動物種、最も好ましくはウシ γ−グロブリン、ウマγ−グロブリン、ウサギγ−グロブリン、イヌγ−グロブ リン、ヒトγ−グロブリン、ヒツジγ−グロブリン、ヤギγ−グロブリン、ネズ ミγ−グロブリン、ブタγ−グロブリン、ネコγ−グロブリンから得られるグロ ブリン分画、又は上記のいずれかのγ−グロブリンのコーンフラクション、特に ウシγ−グロブリンのコーンフラクションから選ばれ、上記グリコシル化ポリペ プチドが、化学的に合成されたもの、又は組換えもしくは雑種細胞技法、あるい はその他の方法で細胞を改質もしくは変態させ、その細胞を介して、所望のグリ コシル化タンパク質を生成せしめることにより得られた変態遺伝構造を有する生 物により合成されたものであることを特徴とする請求の範囲第６項に記載の方法 。 ８．体液との接触により、体液から免疫複合物を選択的に除去するための物品で あって、 免疫複合物を含む溶液と接触し得るようにした支持手段（Ｐ）と、 該支持手段に固定される免疫学的に非特異的ペプチド結合アミノ酸含有化合物を 含む組成物からなるコーティング手段であって、該コーティング手段又は組成物 が、特定の体液中の免疫複合物と接触したとき、体液中の免疫複合物を吸着し得 るものであるもの とからなり、これによって、体液中の免疫複合物を、上記コーティング手段に選 択的に付着させるようにしたことを特徴とする物品。 ９．免疫学的に非特異的ペプチド結合アミノ酸を含有する上記組成物が、オリゴ ペプチド、改質オリゴペプチド、ポリペプチド、改質ポリペプチド、タンパク質 、改質タンパク質、好ましくはグリコシル化ペプチドおよびグリコシル化タンパ ク質から選ばれるペプチド結合アミノ酸分子を含み、さらにこれら分子が、免疫 複合物に対して親和性を有するものであり、上記グリコシル化タンパク質が、好 ましくは背椎動物、より好ましくは哺乳動物種、最も好ましくはウシγ−グロブ リン、ウマγ−グロブリン、ウサギγ−グロブリン、イヌγ−グロブリン、ヒト γ−グロブリン、ヒツジγ−グロブリン、ヤギγ−グロブリン、ネズミγ−グロ ブリン、ブタγ−グロブリン、ネコγ−グロブリンから得られるグロブリン分画 、又は上記のいずれかのγ−グロブリンのコーンフラクション、特にウシγ−グ ロブリンのコーンフラクションから選ばれ、上記グリコシル化ポリペプチドが化 学的に合成されたもの、又は組換えもしくは雑種細胞技法、あるいはその他の方 法で細胞を改質もしくは変態させ、その細胞を介して、所望のグリコシル化タン パク質を生成せしめることにより得られた変態遺伝構造を有する生物により合成 されたものであることを特徴とする請求の範囲第８項に記載の物品。 １０．基体に直接的および選択的に免疫複合物を固定し得る機能を有する物品を 作製する方法であって、以下の工程、即ち、 受理表面を有する基体を形成する工程、上記基体に、該基体に付着してコーティ ング層を形成し得るオリゴペプチド、改質オリゴペプチド、ポリペプチド、改質 ポリペプチド、タンパク質、改質タンパク質から選ばれる分子を含む組成物（但 し、これらは上記コーティング層に体液が接触したとき体液中の免疫複合物を吸 着し、のちに該免疫複合物の存在の同定を可能とするものである）を接触させて 、上記コーティング層を形成させる工程を具備してなることを特徴とする方法。 １１．上記の接触させるべき組成物が、アルカリ性ｐＨを有する溶液であり、上 記基体と接触した状態で、該基体への上記分子の付着を可能ならしめるべき所定 温度および時間、保持、培養をおこなうことを特徴とする請求の範囲第１０項に 記載の方法。 １２．上記分子が、好ましくは背椎動物、より好ましくは哺乳動物種、最も好ま しくはウシγ−グロブリン、ウマγ−グロブリン、ウサギγ−グロブリン、イヌ γ−グロブリン、ヒトγ−グロブリン、ヒツジγ−グロブリン、ヤギγ−グロブ リン、ネズミγ−グロブリン、ブタγ−グロブリン、ネコγ−グロブリンから得 られるグロブリン分画、又は上記のいずれかのγ−グロブリンのコーンフラクシ ョン、特にウシγ−グロブリンのコーンフラクションから選ばれ、上記グリコシ ル化ポリペプチドが化学的に合成されたもの、又は組換えもしくは雑種細胞技法 、あるいはその他の方法で細胞を改質もしくは変態させ、その細胞を介して、所 望のグリコシル化タンパク質を生成せしめることにより得られた変態遺伝構造を 有する生物により合成されたものであることを特徴とする請求の範囲第１０項又 は第１１項に記載の方法。