NO870391L - Fremgangsmaate og artikkel for paavisning av immunkomplekser - Google Patents

Abstract

Anvendelse av immunologisk ikke-spesifikke peptidforbundne aminosyreholdige forbindelser som har evne til å immobilisere sirkulerende immun-komplekser for formålet med påvsning eller fjerning fra kroppsfluider, f.eks. serum eller blod, idet slike forbindelser inkluderer oligopeptider, modifiserte oligopeptider, polypeptider, modifiserte polypeptider, proteiner, modifiserte proteiner og spesielt glykosylerte polypeptider og proteiner .

Description

Bakgrunn for oppfinnelsen

Immunsystemet representerer kroppens hovedforsvarsmeka-nisme mot infeksjonsmidler. Det er to funksjonelle avdelinger i det vertebra-immune system; humoral- og cellemediert. Humoral-immunitet representerer sirkulerende komponenter i immunsystemet som produseres av celler og utskilles og således kan finnes i serum. Celle-mediert immunitet kommer av direkte innvirkning av diverse leukocyttceller på den målsøkte fremmed-substans. Planlagt virkning av disse to interforbundne systemer gir beskyttelse mot et stort utvalg av infeksjonssystemer.

Under normale omstendigheter fremkaller invasjon i kroppen av infeksjonsmidler en respons fra de celler som er komponenter i humoralsystemet. Spesifikt syntetiseres B-lymfocytter spesifikke proteiner, dvs. antistoffer, som binder seg til utvalgte punkter på den invaderende organisme. Etter at antistoffene binder seg til de invaderende organismer, kan de invaderende organismer så bli ødelagt ved innvirkning av det celle-medierte immunsystem, eller innvirkning av humoral-fraksjoner, eller direkte bli inaktivert av antistoffmolekylene selv.

Vanligvis er antistoffmolekyler ikke rettet mot vertens egne eller "selv"-midler. Hos visse individer misoppfatter imidlertid immunsystemet selvkomponenter for fremmede invaderere. Når dette inntreffer, bygger kroppen opp et immunangrep mot

seg selv, svært meget på samme måte som den ville gjøre mot en fremmed invaderer. Resultatene av en slik autoimmun konflikt er traumatiske. Symptomer på slike sykdommer inkluderer mang-lende evne til å utnytte sukker (diabetes av type I), destruksjon av ledd (rheumatoid arthritis) nyredestruksjon (systemisk lupus erythematosus, glomerulonephritis, og lignende sykdommer), samt destruksjon av det vaskulære ssystem (vasculitis). Hver autoimmun forstyrrelse fører til forlenget lidelse sammen med forhøyede dødsrater.

Autoimmune sykdommer er ledsaget av vedvarende høye kon-sentrasjoner av blod-bårne autoimmun-komplekser. Meget av den skade som forårsakes av åutoimmunsykdommen kan spores til anstrengelsene hos det celle-medierte immunsystem til å eliminere disse autoimmun-komplekser, hvor de enn kan være å finne. Kon-troll av disse sykdommer har vist seg vanskelig tidligere, delvis fordi de påvisningsmetoder som har vært anvendt, inade- kvat diskriminerte mellom nivåer av immunkomplekser som reflek-terte enten normal eller sykdomsstatus.

Mange forskjellige teknikker er blitt forsøkt i forskning etter nøyaktige, hurtige og rimelige metoder for immunkompleks-påvisning av sykdomstilstanderkarakterisert vedimmunkompleks-dannelse inklusive autoimmune sykdommer. Skjønt de ofte er svært sinnrike, har ikke noen metode vist seg å være fullstendig adekvat. Eksempler på begrensningene i metodene fra teknikkens stand angående påvisning følger.

For det første beror den såkalte Raji-celle-assay på nærvær av celleoverflatereseptorer for innumkomplekser, og disse reseptorer opptrer bare til presise tidspunkter under veksten av kulturen.

For det annet anvendes komplementfraks joner eller antistoffer som er rettet mot dem, ofte i radio-immuno- eller enzymforbundne immunsorbantassays. Dessverre er både komplement og antistoff som anvendes for å immobilisere komplementet, labile proteiner. Denne ustabilitete fører til tap av sensibilitet, spesifisitet og reproduserbarhet. Følgelig er metoder som avhenger av komplement-immobilisering enten ved direkte eller antistoffmediert adherens, ikke tilstrekkelg pålitelige for klinisk testing pga. denne labile egenskap.

For det tredje begrenser immunoglobulin-klasse og -stør-relse nytten av komplementbaserte assays. Hverken Raji-celle-eller komplementbaserte assays kan generelt påvise alle klasser og underklasser av antistoffer i immunkomplekset; de er begrenset til IgM, IgCj , IgG2og IgG^. Raji-celle og andre komplementbaserte metoder kan også generelt bare påvise komplekser med større molekylvekt enn 1 000 000 dalton. Disse to krite-rier er de mest begrensende for Raji-celle- og komplementbaserte assay-systemer.

Endelig er væske-fysikokjemiske teknikker hvor det benyttes utfelling med slike substanser som polyetylenglykol, dekstran eller Staphylococcus aureas protein A, uholdbare pga.

de vanskeligheter som er iboende ved håndtering av små og ofte flokkulente utfellinger. Dessuten vil tilfeldig binding av immunologisk ubeslektede immunoglobuliner til utfellingen ytterligere forringe resultatet av slike tester. Disse vanskeligheter vil samlet hindre nytten ved disse metoder for immunkom-

pleksmåling. For å overvinne disse begrensninger må tallrike tester utføres, og derved øke omkostningene for pasienten.

Som en konsekvens blir de forskjellige tester normalt ikke utført med tilstrekkelig hyppighet for på riktig måte å over-våke utviklingen av en pasients sykdom. Utvikling av et rime-lig, selektivt, effektivt hjelpemiddel for å adherere immunkomplekset til en fast.bærer er vesentlig for å overvinne disse problemer.

Det er derfor et formål med foreliggende oppfinnelse

å tilveiebringe preparater, fremgangsmåter og gjenstander for selektiv adsorpsjon eller fiksering av immunkomplekser som vil være effektive for å påvise et stort utvalgt av klasser og underklasser av immunkomplekser. Det er et ytterligere formål med oppfinnelsen å overvinne de foran nevnte selektivi-tets-, stabilitets- og håndteringsulemper som er iboende i alle andre fremgangsmåter for immunkompleks-adsorpsjon til faste overflater for formålene med assay, fjerning av immunkomplekser fra serum og lignende. Det er videre et formål med oppfinnelsen å tilveiebringe nye, i høy grad tilpasningsdyktige og lett utnyttbare hjelpemidler for påvisning av komponenter av nevnte komplekser etter fiksering til en bærer, og videre å anvende slike teknikker for formålene med klinisk påvisning, fjerning, konsentrering eller hvilket som helst annet formål som assosieres med human- eller veterinær-medisinske anvendelser .

Kort oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse inkluderer nye preparater, nye fremgangsmåter og artikler for direkte selektiv absorpsjon, adsorpsjon eller tilkobling, ved hvilken som helst mekanisme, av immunkomplekser fra serum eller andre kroppsfluider, for formålet med identifisering, kvantifisering eller fjerning. Foreliggende oppfinnelse benytter, i sin bredeste forstand, immunologisk ikke-spesifikke peptid-bundne aminosyrer, som har spesiell affinitet for tilkobling av immunkomplekser. Som her beskrevet, anvendes de immunologisk ikke-spesifikke peptid-bundne aminosyrer og lignende modifiserte peptidbundne aminosyrer for direkte og selektivt å fiksere immunkomplekser fra serum eller andre kroppsfluider.

De immunologisk ikke-spesifikke peptidbundne aminosyrer som med fordel kan anvendes ved utførelse av foreliggende oppfinnelse inkluderer oligopeptider, polypeptider og proteiner såvel som modifiserte eller substituerte oligopeptider, polypeptider og proteiner. Fortrinnsvis har polypeptider og proteiner som er glykosylert eller modifisert med funksjonelt ekvivalente substituenter, f.eks. tiosukkere, hydroksy- eller tioaminosyrer, hydroksy- eller tiolipider, eller kjemisk beslektede eller lignende substanser, vist seg å ha evne til direkte binding med immunkomplekser. Mer å foretrekke benyttes glykosylerte proteiner (i det frølgende kalt glykoproteiner) og mest å foretrekke er visse globulinfraks joner, f.eks. immunologisk ikke-spesif ikke gammaglobuliner, som er spesielt effektive ved utførelse av foreliggende oppfinnelse.

Hva enten immunkompleksene omfatter en enkelt klasse eller underklasse av antistoff eller hva enten fluidet som inneholder immunkompleksene har corporeal eller extracorporeal opprinnelse, synes ikke å være begrensende for nytten ved foreliggende oppfinnelse, da fysikokjemiske endringer av antistoffene, etter binding til antigener, gjør dem selektivt utsatt for immobilisering.

Kilden for de glykoproteiner som velges for anvendelse her, er en spesiell renset gammaglobulinfraks jon (Cohn, E.J.

(1946), J. American Chemical Society 68, 459). Disse glykoproteiner stammet fra dyr som ikke var immunisert mot humanprote-iner eller immunkomplekser som stammet fra dem; derfor viser de midler seg å ikke fiksere immunkomplekser via noen reaksjon i et Fab-bindingspunkt med en antigen determinant i analytten. I stedet viser de seg, hvilket er bevist, å fiksere komplekser via reaksjon mellom karbohydratandelen som hovedsakelig finnes i "Fc"-delen i antistoffmolekylet. På denne måte er foreliggende oppfinnelse helt forskjellig fra tidligere kjente metoder som beskriver proteinfiksering av immunkomplekser.

Mens slike glykoproteinpreparater lenge har vært anvendt for å forhindre tilfeldig adherens av frie antistoffer til faste bærere, så er det unikt og svært overraskende å finne at et belegg av glykoproteiner på en fast bærer selektivt fikserer antistoffer som er immunologisk bundet til antigener. Således vil immunkomplekser bli adsorbert til et belegg av gammaglobuliner mens frie antistoffer ikke vil det. Forelig gende oppfinnelse tilveiebringer nå en måte å i det vesentlige forbedre påvisningsmetoder på for immunkomplekser i serum og i blod og andre kroppsfluider. Den tilveiebringer også en spesielt nyttig fremgangsmåte for selektiv fjerning av slike komplekser fra blodet og den som lider av autoimmun- og andre sykdommer som erkarakterisert veddannelse av immunkomplekser.

I henhold til den foretrukne utførelse av foreliggende oppfinnelse blir en film av glykoproteiner, valgt fra den gruppe som her er beskrevet, først fiksert til et fast understøttel-sesmedium for å tjene som et selektivt adsorpsjonsmiddel for fiksering av ethvert immunkompleks som kan være tilstede i det fluid som skal bringes i kontakt med filmen. Glykoproteinbelegget kan være ethvert som er i besittelse av den beskrevne evne til å fiksere immunkomplekset, en immunologisk ikke-spesifikk bovin-gammaglobulinfraks jon oppnådd som beskrevet, foretrekkes .

Etter fiksering av det beskrevne belegg til det faste understøttelsesmedium kan den glykoproteinbelagte bærer deretter selektivt adsorbere immunkomplekser fra ethvert fluid som inneholder immunkomplekser som bringes i kontakt med belegget. De fikserte immunkomplekser kan så enten bli: 1) analysert med hensyn på sine komponenter, ved hjelp av enhver immuno-assaymetode, idet den enzymforbundne immunosorpsjons-assaymetode foretrekkes; eller 2) konsentrert og renset; eller 3) fluidet kan bli returnert til pasienten uten de fjernede immunkomplekser, om ønsket, for en klinisk terapeutisk nytte.

I de følgende eksempler dannes den beskrevne film ved

å eksponere den valgte gammaglobulinfraks jon for pH-avhengig denaturering; imidlertid er enhver form for fiksering av det valgte glykoprotein egnet når bare filmens evne til spesifikt og selektivt å fiksere immunkomplekser er bevart. Slike eksempler på fiksering inkluderer, men er ikke begrenset til, varmeaggregering, chaotropisk utbretting, tverrbinding med kjemiske midler, f.eks. glutaraldehyd, tørking, frysing og lignende metoder.

Påfølgende kvalitativ og kvantitativ påvisning av komplekset gjøres derved relativt lettvint, siden enzym-konjugerte antistoffer som er spesifikke for enhver immunoglobulinklasse er lett tilgjengelige. Den aktuelle visuelle eller maskin- avlesbare kvantifisering av immunkompleksene sod: adhererer til bæreren, foretas ved anvendelse av de ELISA-teknikker som først var beskrevet av Engvall og Perlman (1971) Immunochemi-stry 8, 871 - 874 og (1972) J. Immunology 109, 129 - 235),

og The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) av Voller, A., Bidwell, D.E. og Bartlett, A., (1979) Dynatech Laboratories, Ind., Alexandria, Virginia, hvorav begge i sin helhet herved inkorporeres ved referanse. Det er også mulig å påvise nærvær av spesifikke kompleksbundne antigener ved anvendelse av enzym-konjugerte antistoffer som er rettet mot antigenet.

Kort beskrivelse av tegningene

FIG. 1 er et søylediagram over absorbansverdier for spesifikke immunoassays for normale og sykdomstilstander foretatt i henhold til foreliggende oppfinnelse. FIG. 2 er et søylediagram over absorbansverdier for spesifikke immunoassays for normalt serum og serum som inneholder immunkomplekser, foretatt på ubelagte polystyrenplater. FIG. 3 er et søylediagram over absorbansverdier for spesifikke immunoassays under anvendelse av immunologisk ikke-spesifikke glykoproteiner fra de angitte kilder. FIG. 4 er et søylediagram over immunoassayresultater på

sera før og etter adsorpsjon av immunkompleksene i en kolonne som er blitt forhåndsbehandlet med immunologisk ikke-spesifikke glykoproteiner.

FIG. 5 er et søylediagram over resultatene av en annen

utførelsesform av foreliggende oppfinnelse.

FIG. 6 er et søylediagram over resultatene av å anvende

foreliggende oppfinnelse på helt blod.

FIG. 7 er et søylediagram som viser den relative fjerning av relative immunkomplekser i henhold til foreliggende oppfinnelse. FIG. 8 er et diagram som viser gelfiltrering av human-serum og oppløsning og påvisning av immunkomplekser fra dette. FIG. 9 er et diagram som viser molekylvekt-vektkalibrering

av gelfiltreringen som er vist i fig. 8.

FIG. 10 er et topp-plan-riss av en mikrotiterplate som

er tilpasset for å danne artikkelen i henhold til

oppfinnelsen og som er spesielt nyttig i immunoassays av den; og

FIG. 11 er et fragmentert tverrsnitt, tatt langs linjen 11-11 i fig. 10 i forstørret målestokk, som viser mikrotiterplaten preparert for bruk.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

De følgende definisjoner gis for formålene med å klargjøre aspekter ved denne oppfinnelse.

Immunologisk ikke-spesifikke peptidforbundne aminosyrer: Brukt her, betyr dette oligopeptider, polypeptider og proteiner såvel som modifiserte oligopeptider, polypeptider og proteiner, som stammer fra organismer som ikke er blitt immunisert mot noen antigen determinant som stammer fra noen del av dyrearten som testes eller ellers er assosiert med en slik art, eller immunkomplekser som stammer fra disse og har den funksjonelle evne å feste seg til, adherere, fiksere eller på annen måte immobilisere in situ, immunkomplekser som er tilstede i en slik art. I tillegg til de foran nevnte naturlig forekommende substanser, inluderer denne definisjon også peptidforbundne aminosyrer som skapes syntetisk. Slik syntese kan foretas i en peptid-syntetisator eller via lignende kjemiske prosesser, eller produseres ved genetisk endring av eksisterende eller nyskapte virus, bakterier, sopp, gjær eller annen rekombinant, eller hybridcellevektorer eller verter. Det inkluderes derfor at de definerte oligopeptider, polypeptider og proteiner, og modifiserte oligopeptider, polypeptider og proteiner, som stammer fra én art som ikke er blitt immunisert mot en annen art, eller syntetisert som beskrevet, skulle være nyttig ved utfø-relse av foreliggende oppfinnelse hvis de oppviser evne til å feste seg til, adherere, fiksere eller på annen måte immobilisere, in situ, immunkomplekser som er tilstede i den testede art.

Glykoprotein: Brukt her skal det bety enhver kombinasjon av polysakkarid og protein eller polypeptid fra en immunologisk naiv eller immunologisk ikke-spesifik peptidforbundet aminosyre for hvilken de to midler er knyttet via kovalente bindinger mellom polysakkaridet og protein/polypeptidet.

Gammaglobulin: Ethvert medlem av globulære glykoproteiner som har elektroforetisk mobilitet i "gamma"-regionen av serum-proteiner som utsettes for metoden.

Immunoglobulin: Ethvert medlem av gammaglobulinfraksjonen som har kjemisk evne til å binde til et annet middel, idet slike midler inkluderer proteiner, karbohydrater, nukleinsyrer, komplekse lipider, enkle organiske forbindelser eller enhver annen forbindelse som øver vekselvirkning med immunoglobulinet via topografisk bestemt binding ved "Fab"-regionen.

Antistoff: Et medlem av immunoglobulinklassen av proteiner. Melkekjertel-antistoffmolekyler omfatter minst to Fab-og én Fc-region i sine strukturer.

Antigen: Enhver forbindelse mot hvilken antistoffmolekyler kan være rettet forutsatt at binding inntreffer til antistoffet ved det bindingspunkt som finnes i Fab-delen av antistoffmolekylet .

Immunoglobulinklasser: Immunglobuliner separert i henhold til elektroforetisk mobilitet. Gjenkjente klasser av immunoglobuliner inkluderer, men er ikke begrenset til, immuno-globulinene A, D, E, G og M. Disse klasser blir forkortet henholdsvis IgA, IgD, IgE, IgG og IgM.

Immunkompleks: Enhver kombinasjon av antistoffer og antigener i hvilke bindingen inntreffer via vekselvirkning mellom Fab- punkter på antistoffet og topografiske trekk i antigenet.

Immunrespons: Enhver respons av et spesielt immunsystem under hvilket spesifikke antigener tjener til å forårsake dannelse av antistoffer rettet mot antigenet eller å forårsake spesifik aktivering av cellulær defensmekanisme som resulterer i antigen-oppsluking, cytotoksisk respons eller annen virkning av celler eller cellemediert system.

Immunologisk naiv: Tilstanden til immunsystemet i et

dyr eller en gruppe av dyr, inklusive mennesker, som aldri har vært eksponert for et antigen på en slik måte at det produseres et produkt av en immunrespons, enten humoralt eller celle-mediert .

Immunologisk ikke-spesifik: For formålene med denne patentsøknad skal betegnelsen "immunologisk ikke-spesifik"

bety antistoffer eller antigener som ikke er selektive for eller rettet mot komponenter av immunkomplekset som er til

undersøkelse under testen. Slike ikke-spesifikke antistoffer ville være forventet å være sunne i serumet hos dyr som er immunologisk naive overfor komponentene i immunkomplekset, mens immunologisk spesifikke antistoffer ville bli funnet hos dyr som var blitt immunisert mot enhver komponent i immunkomplekset, inklusive hele komplekset eller enhver del derav.

Ikke-spesifik: Immunologisk ikke-spesifik (se ovenfor).

Komplement: En termolabil substans, normalt tilstede

i serum, som er destruktiv overfor visse bakterier og andre celler som er sensibilisert av et spesifikt komplementfikserende antistoff.

Serum: Menes å bety den fluide komponent i ethvert kroppsfluid som blir igjen etter celler og koagulerbare proteiner, f.eks. fibrin, som kan være tilstede i slike kroppsfluidiske komponenter er blitt fjernet ved passende fysisk, kjemisk eller fysikokjemisk vei. Typisk refererer denne betegnelse til det resterende vannaktige fluid som blir igjen etter at blodet har levret seg og det størknede blod er fjernet, men i dens brede betydning menes det å inkludere den fluidiske komponent i cerebrospinalfluid, urin, skive-fluid, cellulært cytoplasma og lignende.

Alkalisk karbonatpuffer: Med mindre annet er spesifisert, skal dette bety en løsning som er fremstilt for å være ekviva-lenten av 1/10 mol natriumbikarbonat oppløst i 900 ml demineralisert vann. pH-verdien ble justert til 9,6 med natriumhyd-roksyd, og volumet av løsningen ble justert til 1 liter ved tilsetning av demineralisert vann.

Bovin-gammaglobulinløsning: Rensede bovin-gamma-globuli-ner (Cohn, E.J. (1946) J. American Chemical Soc. 68, 459) ble oppløst i alkalisk karbonatpuffer i en grad av 1,0 mg bovin-gammaglobuliner/ml av løsning.

Fosfatpuffret saltløsning: Natriumklorid ble satt til vann til den endelige konsentrasjon 9 g/l. Til denne løsning ble tilsatt 0,01 mol kaliumfosfat (monobasisk). pH-verdien ble justert til 7,4, og løsningens volum ble bragt til nøyaktig 1,00 liter ved tilsetning av demineralisert vann.

Tween-20: Et polyoksyetylen-sorbitan-monolaureat: I beskrivelsen ble denne forbindelse satt til fosfatpuffret salt-løsning i noen trinn. Hvor det er angitt, ble Tween-20 anvendt i en konsentrasjon av 0,05 vol/vol-%. Ikke-ioniske syntetiske vaskemidler som f.eks. Tween-20 anvendes for å forhindre ytterligere binding av proteiner.

Konjugerte antistoffer: For enzym-immunoassay-delen

av bestemmelsen ble det oppnådd antistoffer rettet mot human-immunoglobulinfraksjoner. Disse antistoffer var blitt kjemisk konjugert med pepperrot-peroksydase for å tjene som påvisnings-middel. Nevnte antistoffpreparater ble fortynnet mellom 500 og 2000 ganger i fosfatpuffret saltløsning inneholdende Tween før bruk.

Substratløsning: For å kvantifisere pepperrot-peroksyda-sen ble"en løsning av ortofenylendiamin (400 ug/ml) fremstilt sammen med 10 uM hydrogenperoksyd i fosfatpuffret saltløsning. Løsningen ble fremstilt like før bruk og lagret i mørke for

å forhindre fotolytisk dekomponering.

Merkede antistoffer: Enhver antistoffsubstans som er blitt kovalent eller på annen måte kombinert med et molekyl eller ion for det formål selektivt å identifisere nevnte gruppe av antistoffer.. Slike adduktmolekyler eller ioner inkluderer enzymer, fluorescerende substanser, radionuklider og lignende.

Merkede antigener: Enhver antigensubstans som er blitt kovalent eller på annen måte kombinert med et molekyl eller ion for det formål selektivt å identifisere nevnte gruppe av antigener. Slike adduktmolekyler eller ioner inkluderer enzymer, fluorescerende substanser, radionuklider og lignende.

Optisk densitet (OD) eller absorbans: Et tall som refererer til farveabsorbansen til en prøve. Optisk densitet er beslektet med prosent lys som transmitteres gjennom prøven i henhold til følgende formel:

OD = 2 - log(% transmittans)

Proteiner og polypeptider, inklusive glykoproteiner og glykopeptider, kan bli fiksert på plast eller andre faste bærere inklusive polymerer, harpikser, glass og lignende, ved denaturering ved forhåndsbestemt pH-verdi eller ved kovalent kobling, eller ved andre fysikalske eller kjemiske metoder, f.eks. varmeaggregering, ultrafiolett-mediert tverrbinding med eller uten kjemiske tverrbindingsmidler, eller ved andre kjemiske eller fysiske hjelpemidler eller enhver kombinasjon derav. I tillegg kan faste bærere bestå av glykoproteinene eller glykopolypeptidene, eller lignende proteinholdige materialer enten kjemisk eller fysikalsk eller både kjemisk eller fysikalsk modifisert og den enten spunnet til uløselige protein-fibre med eller uten ytterligere understøttende og konstitutive materialer som f.eks. polymerer, harpiks-, silisiumdioksyd-eller mineral-fibre, eller anvendes etter behandlinger som er andre enn spinning, hvilket resulterer i et fastfasemateri-ale som inneholder det ønskede glykoprotein, glykopolypeptid eller annet lignende materiale. Som beskrevet senere, er slike glykoproteinfilmer eller uløselige preparater i besittelse av de uvanlige og uventede karakteristikker hos selektivt adhe-rerende immunkomplekser som kan være tilstede i en prøve av fluider, inklusive, men ikke begrenset til, fluider av biologisk opprinnelse som er bragt i kontakt med den filmbelagte faste bærer eller er bragt i kontakt med glykoproteinpreparatet. Det som følger er en beskrivelse av en foretrukken utførelsesform av beleggene i henhold til foreliggende oppfinnelse, sammen med de foretrukne fremgangsmåter for å adherere immunkomplekser, f.eks. slik som kan finnes i en prøve av kroppsfluid, inklusive metoden for å påvise kompleksene som er slik bundet til den faste bærer. Gammaglobuliner oppnådd fra en dyrepopulasjon som ikke tidligere er blitt angrepet med humanserumproteiner er en foretrukken utførelsesform av denne metode.

Trinn 1: FIKSERING AV GLYKOPROTEINBELEGGET

Rensede bovin-gammaglobuliner bringes i kontakt med en puffer som omfatter 0,1 molar natriumbikarbonat, pH 9,6. Den endelige konsentrasjon av gammaglobuliner i den resulterende løsning er 1,0 mg/ml (vekt/volum). Den løsning anvendes for fremstilling av glykoproteinbelegget.

For å fiksere en tynn film av bovin-gammaglobulinet til en mottagende overflate settes 200 [ xl av den tidligere frem-stilte løsning av bovin-gammaglobuliner til hver brønn i en 96 brønners titerplate P, f.eks. Dynatech Immulon II plate med en serie av brønner 20. Som det ses i fig. 10 og 11, er brøn-nene 20 i plate P delt opp i både horisontale og vertikale rader, med passende indekssystemer for å indikere hver spesifikk brønn. I det system som er vist i fig. 10, kan brønnene i de vertikale rader være identifisert ved tall, som f.eks.

1 - 12, mens brønnene i de horisontale rader kan være identifi sert ved bokstaver, som f.eks. A-H, for å gi en nøyaktig korrelasjon av resultatene med de prøver som skal testes. Det vil tydelig fremgå at det er 96 brønner som er vist på platen i fig. 10, selv om det spesifikke antall brønner kan varieres etter ønske. Platen anbringes i et fuktet kammer holdt på 37°C, og blir fjernet fra kammeret etter 4 timer. Selv om den utførelsesform som beskrives i det følgende, er beskrevet for 96 brønners mikrotiterplater, virker assay-metoden like godt i plastrør, inklusive rør som er støpt med interne finner for å øke overflatearealet. Belegningstiden og bovin-gammaglo-bulinkonsentrasjonen avviker bare litt fra hva som kreves for platesensibilisering, og resultatene er sammenlignbare når metoden utføres i rør, med eller uten finner, eller i plater.

Ubundne bovin-gammaglobulinproteiner fjernes ved å ryste løsningen fra platen, deretter vaske platen tre ganger med en 0,9% (vekt/volum) saltløsning som inneholder 0,01 molar kaliumfosfat, pH 7,4, og etterlater et tynt belegg 21 av bundne gamma-globulinproteiner. Fortrinnsvis, men ikke nødvendigvis, kan et beskyttende lag eller en film 22 dannet av et passende polymert materiale bli fiksert over åpne brønner 2D som vist i fig. 11.

Trinn 2: ADHERERING AV IMMUNKOMPLEKSER TIL PLATEN PREPARERT I HENHOLD TIL TRINN 1

Før kroppsfluidet bringes i kontakt med den preparerte plate, fortynnes fluidet riktig ved tilsetning av alikvoter av serum til fosfatpuffret saltløsning. Fortynning er nødven-dig for å gi passende mengder av farve i trinn 3 (den enzymforbundne assay). For de fleste av de følgende eksempler er den optimalt foretrukne fortynning for denne assay 1:15 (volum serum:volum fortynningsmiddel), selv om vide fortynningsrammer kan anvendes, avhengig av naturen av det kroppsfluid som utsettes for metoden, og de assay-påvisningsteknikker som anvendes. Preparering av fluidet kan også inkludere å tilsette immunologisk ikke-spesifikke peptidforbundne aminosyrer (som her definert) til fluidet.

Den fortynnede prøve av kroppsfluid anbringes deretter

i passende brønner i titerplaten. Adherens av immunkompleksene som inneholdes i prøvene, til den faste bærer ble forster-

ket ved inkubert ved 3 7°C i ikke mindre enn 10 min. I de føl-gende assay-eksempler ble den adherens-inkubasjon som er beskrevet i dette avsnitt fortsatt i 30 min.

Etter inkubasjon for å oppnå kompleks-adherens rystes prøvene fra brønnene sammen med slike ikke-kompleksdannede antistoffer som er tilstede i prøven. Dette gjøres siden det er mange flere frie antistoffer enn det er antistoffer bundet i komplekser, og resterende frie antistoffer ville forhøye bakgrunns-absorbansverdiene. 'Platene vaskes deretter tre ganger med fosfatpuffret saltløsning, som beskrevet under trinn 1 ovenfor. Til dette puffrede medium, settes også 0,05% (volum/ volum) Tween-20 for ytterligere å redusere ytterligere binding av de frie antistoffer.

Trinn 3: ASSAY FOR IMMUNKOMPLEKS FIKSERT TIL PLATEN

Standard enzymforbundne assay-teknikker, beskrevet tidligere, anvendes for assay av immunkomplekser, selv om hvilke som helst egnede hjelpemidler for påvisning, f.eks. radiaktiv merking, fluorescens eller lignende, kan anvendes. For de eksempler som beskrives senere, ble anti-human-IgG indusert i geiter anvendt for å bringe på det rene om komplekset inneholdt human-IgG. Disse antisera ble forbundet med pepperrot-peroksydase, et enzym som gir et farvet produkt hver gang et av dets substrater er tilstede sammen med hydrogenperoksyd. Substratet bør bli valgt å være i overensstemmelse med den enzymaktivitet som settes til antistoffet. For de eksempler som beskrives i det følgende, var substratet orto-fenylendiamin. Produktet fra reaksjonen katalysert av pepperrot-peroksydase under disse omstendigheter er nitroanilin, som har en kastanje-brun farve i sur løsning. Mange andre substrater eksisterer for dette enzym, og for andre enzymer også. For eksempel katalyserer peroksydase oksydasjonen av tetrametylbenzidin til et intenst blått produkt som lett kan påvises med det blotte øye. Alaklisk fosfatase katalyserer fjerning av fosfatgrupper fra

et stort utvalgt av substrater, inklusive p-nitrofenylfosfat. Produktet av p-nitrofenylfosfatreaksjonen er p-nitrofenol,

som selv er intenst gult av farve. Andre substrater, f.eks. tymolfosfat, gir forskjellige farver når de utsettes for fosfa-taseinnvirkning. Beskrivelsen av denne utførelsesform begrenser ikke assay-metoden til noe enkelt middel for påvisning,

enten ved direkte tilknytning av enzymer som f.eks. pepperrot-peroksydase, alkalisk fosfatase, beta-galaktosidase eller lignende, eller til kjemiske reaktantmidler, snarere vil assay-metoden virke like godt uten hensyntagen til det påvisnings-skjerna som velges. Slike påvisningsskjemaer kan være, men er ikke begrenset til, enzymforbundne immunoassaymetoder, hvorved det enzym som anvendes for å påvise nærvær av komplekset, kan være knyttet enten til et antistoff eller til et antigen eller en annen komponent som er selektiv for nærvær av det immunkompleks som fikseres til belegget, metoder med fluorescerende antistoff hvorved hvilken som helst fluorescerende substans til antistoffet eller antigenet eller en annen substans som anvendes for å påvise nærvær av de immunkomplekser som er fiksert til belegget av et kjemisk, fysikalsk, fysikokjemisk eller annet slags hjelpemiddel, eller enhver annen direkte metode for påvisning av nærvær av immunkomplekser som kan fikseres ved belegning. I tillegg er indirekte hjelpemidler for påvisning også like brukbare for påvisning av immunkomplekser ved denne assaymetode. Slike indirekte hjelpemidler inkluderer, men er ikke begrenset til, annet-antistoff-teknikker, biotin-avidin eller biotin-streptavidin eller lignende adjunktive for-sterkningsskjemaer, eller ethvert annet indirekte hjelpemiddel for påvisning av nærvær av immunkomplekser i belegget. Videre er assaymetoden like brukbar hvis biologiske hjelpemidler for å påvise nærværet av immunkomplekset fikseres til belegget. Slike hjelpemidler inkluderer anvendelse av levende eller drepte celler oppnådd enten fra cellekultur eller fra levende eller døde organismer, hva enten de er prokaryote eller eukaryote,

og uten hensyntagen til koloni- eller solitærorganisasjon. Enhver komponent som stammer fra slike biologiske preparater, inklusive, men ikke begrenset til nukleinsyrer, nukleære komponenter, cytoplasmiske eller membrankomponenter, lektiner, reseptorer, opsoniner og lignende materialer, kan anvendes for å påvise nærvær av immunkomplekser fisert til belegget, forutsatt at slike lektiner, reseptorer, opsoniner, eller lignende har evne til å øve vekselvirkning med immunkomplekser eller enhver komponent derav. Endelig er påvisning av immunkomplekser som er fiksert til belegget ved hvilket som helst hjelpemiddel enten kjemisk eller fysikalsk, også like anvendelig på assayprotokollen som strekker seg fra den utførelsesform

som her er angitt. Slike hjelpemidler kan inkludere, men er ikke begrenset til, endringer i løsningens pH-verdi, lysets polaritet, endringer i refraktive tykkelser, endringer i elek-troniske karakteristikker såsom ledningsevne eller piezoelek-trisk oppførsel eller dielektrisitetskonstanter hos kapasitorer, endringer _l. overflatens spesifikke varmeinnhold, eller eventuelle andre fysikalske midler som anvendes for å påvise nærvær av materialene i tett nærhet til annet materiale.

Den enzymkonjugerte geite-antistoffløsning, preparert

som beskrevet, settes deretter til hver av brønnene i titerplaten. Binding av disse probe-antistoffer til human-IgG-fraksjonen til komplekset tillates i minst 15 min. ved 37°C. Platen fjernes fra inkuberingskammeret, tømmes for sitt innhold og vaskes som i trinn 2. Siste vasking utføres best med TVeen-

fri puffer for å unngå inhibering av feste av pepperrot-peroksydase-enzymet.

Mengden av enzym-markør, som beskrevet tidligere, bestemmes ved å inkubere platene med en løsning av fosfatpuffret salt-løsning som inneholder orto-fenylamin-diamin (400 ug/ml) og 3-10 mikromolart hydrogenperoksyd ved romtemperatur i mørke. Reaksjonen tillates å fortsette i 10 min., eller inntil tilstrekkelig farve kan avleses på den spektrofotometriske innretning som anvendes. Reaksjonen stanses etterpå via tilsetning av samme volum av 2,5 molar svovelsyre, og farveintensiteten (den optiske densitet, eller OD eller absorbans) avleses med et spektrofotometrisk instrument, f.eks. Dynatech MR600 eller lignende.

Som ved enhver enzymforbundet immun-assay er reaksjons-produktets resulterende farve proporsjonal med antall konjugerte antistoffer som har bundet seg til immunkomplekset. For de fleste tilfeller er et antall bundne konjugerte antistoffer lineært beslektet med antall human-IgG-molekyler som er tilstede i immunkomplekset. Derfor, etterhvert som mengden av immunkompleks som er fiksert på filmen øker, så gjør også den optiske densitet det, eller absorbansen av enzymreaksjonen.

EKSEMPLER

EKSEMPEL 1

Selektivitet av glykoproteinfilmer for absorpsjon av immunkomplekser fra serum

En polystyrenplate ble belagt med en film av bovin-gammaglobuliner ved følgende metode: 1) Rensede bovin-gammaglobuliner fra et Cohn-preparat fraksjon II ble oppløst i en alkalisk puffer (0,1 M natriumkarbo-nat, pH 9,6). 2) Den alkaliske løsning som inneholdt bovin-gammaglobulinene ble bragt i kontakt med platen i 4 timer ved 37°C. 3) Belegningsløsningen ble rystet fra platen, etter inkube-ring. Platen ble vasket tre ganger med en løsning av natriumklorid (0,15 M), puffret med kaliumfosfat (0,01 M, pH 7,4)

for fjerning av ubundne gammaglobulinproteiner.

Den bovin-gammaglobulin-belagte plate ble så anvendt

for å bestemme nærvær av immunkomplekser i humanserumprøver tatt fra personer med:

1) ingen synlig patologi; (NORMAL)

2) systemisk lupus erythematosus i remis jon (REM SLE); 3) moderat systemisk lupus erythematosus eller avan-sert systemisk lupus erythematosus, (SVR SLE);

og

4) moderat rheumatoid arthritis (MOD RA).

Disse sera hadde på forhånd vist seg å inneholde immun-komplekser som er passende for deres patologiske status ved Clq ELISA-tester og radial-immunodiffusjonsmetoder.

En representativ immunkompleks-assay, som skal beskrives senere, ved anvendelse av de bovin-gammaglobulinbelagte plater, preparert som tidligere beskrevet, er vist i tabell 1 og grafisk i fig. 1. De anvendte metoder for å utlede disse data er opp-summert nedenunder: 1) Sera ble fortynnet på riktig måte med en løsning av 0,15 M NaCl i 0,01 M natriumfosfatpuffer (pH 7,4) før testen (i det følgende betegnet PBS). I dette eksempel ble et volum serum fortynnet med

15 volumer PBS.

2) 0,1 ml alikvoter av de fortynnede sera ble anbragt i passende merkede brønner. For dette eksempel ble 7 replikatbestemmelser utført på hvert prøveek-semplar, og det ble tatt gjennomsnitt av dem. 3) Platen som inneholdt prøveeksemplarene ble anbragt i en fuktet inkubator ved 37°C i 30 min. Etter inkuberingen ble platen tatt ut av inkubatoren, væsken rystet ut og platen vasket tre ganger med PBS som inneholdt 0,5 ml polyoksyetylensorbitan-monolaurat (Tween-20) pr. liter løsning. 4) Platen ble eksponert for en blanding som inneholdt pepperrot-peroksydase-konjugerte antistoffer som var spesifikke for gammakjeden av human-imunoglobu-lin C. Platene ble inkubert ved 37°C i 15 min. for å feste det konjugerte anti-IgG. Etter inkuberingen ble platene vasket tre ganger med PBS for fjerning

av de ubundne enzym-konjugerte antistoffer.

5) Hver brønn i platen ble undersøkt med hensyn på pepperrot-peroksydase-aktivitet ved tilsetning av PBS som inneholdt o-fenylendiamin og hydrogenperoksyd. Nærvær av komplekser ble således påvist ved den intense kastanje-brune farve som viste seg etter at reaksjonen var avsluttet med svovelsyre. Farven ble kvantifisert ved 490 nm ved anvendelse av et Dynatech MR 500 plate avlesningsspektrofoto-meter. Reagensblindprøver for spektrofotometrisk kalibrering var brønner i platen som ikke var bragt i kontakt med human-serum.

Forklaringer:

De tall som er angitt under GJENNOMSNITTLIG OPTISK DENSITET (MIDDEL ADSORBANS) referer til den optiske densitet avlest ved 490 nm, oppnådd under den assay som er beskrevet ovenfor.

De tall som er gitt, er gjennomsnitt av resultatene

fra 7 assays pr. prøve.

Tallet under Overskriften Standard feil referer til standardfeil for gjennomsnittet.

Forkortelser:

SLE: Systemisk Lupus Erythematosus

RA: Rheumatoid Arthritis

Evnen hos bovin-gammaglobul-behandlede understøttelsesme-dier til å adsorbere immunkomplekser er demonstrert ved den økede absorbans som vises i brønner som er eksponert for serum tatt fra personer som er diagnostisert å lide av immunkompleks-sykdom. Videre ble det observert god overensstemmelse mellom alvorlighetsgrad for sykdommen og mengden av farve funnet ved metoden. Normalt human-serum trakk ikke ut særlig farve ved undersøkelsen, hvilket ga ytterligere bevis på belagte platers spesifisitet for immunkomplekser. Den samme metode er vist å virke like godt for helt blod og antikoagulert plasma.

EKSEMPEL 2

Adsorpsjon av immunkomplekser fra serum ved ubelagte polystyrenplater

For å demonstrere den velgjørende effekt av glykoproteinbelegg ble en polystyrenplate etterlatt ubelagt, men ble ekspo nert for de sera som er beskrevet i eksempel 1 under identiske inkubasjonsbetingelser. Platen ble så eksponert for peroksyd-konjugert anti-IgG og undersøkt med hensyn på peroksydase som tidligere. Som ventet, vises bare svak selektivitet av ubehandlede plater. I tillegg ble det også observert svært høye bakgrunnsverdier, ulik den selektivitet og de bakgrunnsverdier som finnes for plater som er forhåndsbelagt med glykoproteiner som f.eks. bovin-gammaglobuliner. De resultater som ble oppnådd ved denne manipulering er vist i tabell 2 og grafisk i fig.

2. Hver stolpehøyde som er vist i fig. 2 representerer middel-adsrobansen for 7 replikat-assays.

Forklaringer:

Som i tabell 1, idet de tall som er angitt under overskriften Optisk densitet refererer til GJENNOMSNITTLIG OPTISK DENSITET (MIDDEL ADSORBANS) ved 490 nm oppnådd under den assay som er beskrevet ovenfor.

De tall som er gitt, er gjennomsnitt av resultatene

fra 7 assays pr. prøve.

Tallet under overskriften Standard feil refererer

til standardfeil for gjennomsnittet.

Spektrofotometrisk blindprøver ble utført ved anvendelse av ubelagte plast-brønner som ikke var blitt utsatt for human-serum. Slike blindprøver ble behandlet

med alle følgende trinn, inklusive å utsette dem for konjugerte antistoffer og peroksydase-assay. Blindprø-vene viste ingen synlig farve.

Forkortelser:

SLE: Systemisk Lupus Erythematosus

RA: Rheumatoid Arthritis

EKSEMPEL 3

Rensede gammaglobuliner fra et utvalg av arter ble anvendt for platebehandling som beskrevet i eksempel 1. Platene ble etterpå eksponert for immunkompleks-rike eller immunkompleks-fattige sera som beskrevet i eksempel 1. Etter eksponering og vasking ble platene undersøkt med hensyn på nærvær av til-knyttede immunkomplekser under anvendelse av pepperrot-peroksydase-konjugert anti-IgG som beskrevet i eksempel 1. Resultatene fra disse behandlinger er vist i tabell 3 og grafisk i fig. 3.

Forklaringer:

Tallene angitt i tabell 3 refererer til MIDDEL OPTISK DENSITET (MIDDEL ADSORBANS) ved 490 nm oppnådd ved å følge den behandling som er nevnt ovenfor for plater belagt med gammaglobulin-fraks joner utvunnet fra artene listet i venstre kolonne i tabellen.

Serumkilder er angitt langs øvre kant av tabellen. Forkortelser:

SLE: Systemisk Lupus Erythematosus

RA: Rheumatoid Arthritis

Det faktum at gammaglobulin medierer evnen hos belagte bærere til spesifikt å fiksere immunkomplekser er illustrert ved sammenligning mellom tabell 3 og tabell 1. Hver av beleg-ningsgruppene var i stand til å fiksere immunkomplekser fra sertifiserte human-sera som var riktige for den patologiske status hos human-kilden. Derfor medførte alle gammaglobulin-belegg som ble forsøkt, selektivitet for immunkompleks-adsorpsjon, selv om forskjellige kvaliteter kan bli observert for forskjellige belegg. Den samme metode skulle virke like godt for helt blod eller antikoagulert plasma.

EKSEMPEL 4

Fjerning av immunkomplekser ved belagte polystyrenperler

Et alkalisk preparat av bovin-gammaglobuliner (1 mg bovin-gammaglobuliner/ml i pH 9,6 karbonatpuffer, som i eksempel 1) ble anvendt for å behandle polystyrenperler (BioBeads, SM4,

20 - 50 mesh, BioRad Laboratories, Richmond, California) for det formål å adherere immunkomplekset til perlene. Serumholdige immunkomplekser, tidligere undersøkt med hensyn på sitt immun-kompleksnivå som i eksempel 1, ble ført gjennom en kolonne av nevnte perler som ble holdt på 3 7°C, og mengden av immunkomplekser ble bestemt både før og etter kolonnefiltrering. Resultatene fra denne metode er vist i tabell 4 og grafisk i fig. 4.

Forklaringer:

Separat ble serumprøver fra ikke-angrepne og fra kjente tilfeller av systemisk lupus erythematosus ført over kolonne som var behandlet med alkaliske bovin-gammaglobuliner som beskrevet tidligere.

Immunkompleks-assays ble utført før og etter behandling (pre- og post-kolonne).

De optiske densiteter som ble vist av prøvene før og

etter behandling er anført i tabellen.

Forkortelser:

SLE: Systemisk Lupus Erythematosus

Polystyrenperler belagt med bovin-gammaglobuliner på denne måte adsorberte selektivt og raskt immunkomplekser. Tilnærmet 90% av kompleksene ble fjernet ved én passasje gjennom kolonnen. Alkalisk gammaglobulinbehandling av polystyrenperler er således effektivt med hensyn til relativt hurtig å fjerne disse midler fra serumprøver. Derfor skulle en tilstrekkelig stor kolonne som er separert med lignende glykoproteiner fjerne signifikante mengder av immunkomplekser når helt blod føres gjennom kolonnen ved gjennomstrømningshastigheter som kan mulig-gjøre foreliggende oppfinnelse og bli anvendt i terapeutiske behandlingsmetoder. Serumbehandling vil på denne måte forenkle selektiv fjerning av sirkulerende immunkomplekser som er tilstede. Videre vil kolonneisolering av immunkomplekser fra store mengder av blod tilveiebringe konsentrering av nevnte komplekser, idet det ble mulig å påvise små komponenter som f.eks. immunoglobulin-idiotyper, sjeldne underklasser av antistoffer og sjeldne eller sekvesterte antigener som kan være tilstede i nevnte komplekser. Den samme metode skulle virke like godt for antikoagulert plasma.

EKSEMPEL 5

Formålet med dette eksempel er å illustrere den nyttige effekt ved væskefase-bovin-gammaglobulin på immunkompleks-assays utført på immobiliserte glykoproteinbelegg. Dette tillegg viste seg sterkt effektivt ved reduserende basislinjeverdier for denne normale serumprøve som inneholdt lave nivåer av immun-komplekser. For dette eksempel ble to serumprøver testet.

Den første av disse prøver stammet fra et individ som ikke viste noen synlig klinisk patologi, men allikevel reagerte positivt i immunkompleks-assays som beskrevet tidligere. Den annen serumprøve ble oppnådd fra et individ som hadde et alvor lig tilfelle av systemisk lupus erythematosus. Disse to serum-prøver ble fortynnet med 0,15 M NaCl som inneholdt 0,01 M kaliumfosfat pH 7,4 (fosfat-puffret saltløsning), eller med fosfatpuffret saltløsning inneholdende bovin-gammaglobulin ved en konsentrasjon av 1 mg bovin-gammaglobulin pr. ml puffer.

Etter fortynning av prøvene ble hvert av de fire preparater testet på immunkomplekser i henhold til fastfase-assays som beskrevet tidligere, men spesielt i eksemplene 1-3. Denne kastanjebrune farve som stammet fra den enzymforbundne del av metoden, ble avlest ved 490 nm på en Dynatech MR600 plate-avleser, og resultatene er både angitt i den ledsagende tabell og avtegnet på et stolpediagram.

Forklaringer:

Serum fra levret blod ble anvendt for testene i oven-stående tabell. Betegnelsen "normal" benyttes her for å betegne serum som stammer fra et individ som ikke viser noen klinisk tilsynelatende manifestasjon av sykdom på tidspunktet for flebo-tomi. Betegnelsen "SLE" anvendes i dette eksempel for å betegne serum som stammer fra et individ som klinisk er diagnostisert å lide av systemisk lupus erythematosus. Før denne assay ble 1 del serum fortynnet med 15 deler fortynningsmiddel. For kolonnen "BGG Fraværende" var det fortynningsmiddel som ble anvendt i dette eksempel 0,15 M NaCl puffret til pH 7,4 med 0,01 M kaliumfosfat. For kolonnen "BGG Tilstede" ble bovin-gammaglobulin oppløst i fosfatpuffret saltløsning (definert tidligere) i en utstrekning av 0,5 mg bovin-gammaglobulin pr.

ml fosfatpuffret saltløsning.

De fortynnede sera ble utsatt for den immunkompleks-assay som er beskrevet i eksemplene 1-3. De tall som presenteres i tabellen representerer gjennomsnittlig absorbans for fire replikatbestemmelser.

I fig. 5 er det vist resultater fra serumprøver fortynnet enten med fosfatpuffret saltløsning eller med fosfatpuffret saltløsning som inneholdt 1 mg bovin-gammaglobulin pr. ml. Etter fortynning ble prøvene undersøkt med hensyn på immunkomplekser under anvendelse av den fastfase-assay som er beskrevet i eksemplene 1, 2 og 3. Høyden på stolpen på fig. 5 representerer gjennomsnittlig absorbans funnet etter 4 replikant-assays. I fig. 5 refererer normalt til serum som er oppnådd fra et individ som ikke viser noen synlig klinisk patologi. SLE refererer til serum oppnådd fra et individ som lider av alvorlig systemisk lupus erythematosus. -BGG refererer til serum som er fortynnet i fosfatpuffret saltløsning alene, mens +BGG refererer til serum som er fortynnet i fosfatpuffret saltløsning inneholdende 1 mg bovin-gammaglobulin pr. ml.

Tilsetning av bovin-gammaglobulin til serumfortynningsmid-delet reduserte den absorbans som ble funnet i den normale serumprøve tilnærmet 40 ganger. Faktisk var svært lite farve å observere da denne assay ble utført på bovin-gammaglobulin-fortynnet normalt serum. Motsatt ga fortynning av serum oppnådd fra et individ med en autentisk auto-immun forstyrrelse med bovin-gammaglobulin-holdig puffer svært liten forandring i farve, enten visuelt eller som påvist ved hjelp av den spektrofotometriske innvirkning. Følgelig ble en 16 gangers diffe-ranse mellom serum i normal og auto-immun tilstand notert etter fortynning med bovin-gammaglobulinholdig puffer mens ingen differensiering eksisterte uten slik tilsetning. I ytterligere lignende assay-forsøk eliminerer denne metode faktisk falske positive for individer uten synlig patologi mens individer med signifikant sykdom forblir forhøyet. Disse resultater indikerer tydelig den nyttige effekt ved innlemmelse av proteiner lik bovin-gammaglobulin i fortynningsmidler, idet en slik effekt er effektiv med hensyn til å eliminere den falske positive rate uten i vesentlig grad å endre den samme positive rate.

EKSEMPEL 6

De foranstående eksempler illustrerer nytten av immunkompleks-filtreringsmetoden beskrevet her. De data som presenteres i dette eksempel demonstrerer at de fikseringsteknikker som er beskrevet tidligere også kan anvendes på plasma og helt blod, uten hensyntagen til hvilken felles antikoagulant som anvendes.

For dette eksempel ble blod tatt fra en frisk donor og fra et individ med rheumatoid arthritis. Fire glass ble tatt fra hver donor. Det første glass inneholdt ingen antikoagulanter. De tre gjenværende glass inneholdt antikoagulanter. Det annet glass inneholdt tilstrekkelig etylendiamin-tetraacetat (EDTA) til å gjøre sluttkonsentrasjonen 1,5 mg EDTA/ml blod; det tredje glass inneholdt tilstrekkelig heparin til å gjøre sluttkonsentrasjonen 28 USP-enheter heparin/ml blod; det fjerde glass inneholdt tilstrekkelig natriumcitrat til å gjøre slutt-konsentras jonen 3,5 mg natriumcitrat/ml blod.

Prøvene ble tillaget og analysert som følger:

Det første prøvepar (ett hver fra normale og CIC-forhøy-ede personer) ble tillatt å levre seg normalt, og seraene ble oppsamlet. Disse sera ble utsatt for de immunkompleks-assaymetoder som er beskrevet i eksemplene 1 og 5.

En alikvot av helt blod ble tatt fra hvert av det annet par av prøver antikoagulert med EDTA og utsatt for immunkom-pleksassay som beskrevet i eksemplene 1 og 5. Plasmakomponentene fra hvert prøveeksemplar ble separert ved sentrifugering og plasmaprøvene analysert med hensyn på immunkomplekser som beskrevet i eksemplene 1 og 5.

En alikvot av helt blod ble tatt fra hvert av det tredje par av prøveeksemplarer, antikoagulert med heparin og analysert som ovenfor. Plasmaet fra hvert par av prøveeksemplarer ble separert ved sentrifugering og analysert som ovenfor.

En alikvot av helt blod ble tatt ut fra hver av det fjerde par av prøveeksemplarer, antikoagulert med natriumcitrat og analysert som ovenfor. Plasmakomponentene fra hvert prøveeksem-plar ble separert ved sentrifugering og analysert som ovenfor.

Resultatene av disse undersøkelser er angitt i tabell 6, og illustrert grafisk i fig. 6.

Under henvisning til tabell 6 er det klart at tilsetning av antikoagulant til helt blod for det formål å forhindre klump-dannelser er uten skadelig effekt på metodens evne til å diskri-minere prøveeksemplarer som inneholder normale og forhøyede mengder av immunkomplekser. Generelt syntes tilsetning av antikoagulanter å forbedre analysens ytelse svakt, hvilket er bevist av de mangeldobbelte verdier som er observert for serum i motsetning til plasma eller prøver av helt blod. Dette funn stenger fundamentalt ut mekanismer ved immunkompleksadhe-rens i denne metode basert på komponenter i serum som f.eks. komplement eller konglutinin. Slike midler krever kalsiumio-ner for aktivitet, og tilsetning av enten EDTA eller citrat fjerning fritt kalsium fra blod. Som følge av dette kan det sies at dette eksempel både illustrerer nytten ved tynn-glyko-proteinfilm-metoden til immunkompleksfiksering og setter de overraskende egenskaper ved slike tynn-glykoproteinfilmer som anvendt ved metoden, i relieff.

Serumprøver fra personer som viser immunkompleksforstyr-relser er signifikant forhøyet sammenlignet med slike fra normale individer, hva enten blodet fra disse individer er blitt inhibert mot levring eller ikke, og uten hensyntagen til den antikoagulant som er brukt. På grunn av denne oppførsel kan den metode som er beskrevet for fiksering av immunkomplekser bli anvendt med plasma- eller helblod-prøver for analyse eller for fjerning av slike komplekser som kunne være tilstede i dem i henhold til de beskrevne prosesser. Det er innlysende av de foranstående tester at det ikke er noen grunn til å tro at fremgangsmåten med å fjerne immunkomplekser som her er beskrevet er begrenset til slike som finnes i serum, plasma eller blod. Det er innlysende at immunkomplekser som er tilstede i diverse kilder som f.eks. urin, ascites-fluid, cerebro-spinal-fluid eller fra in vitro-blandinger som er foretatt i laboratoriet, vil ha evne til å bli fiksert til glykoproteinbelegget som her er beskrevet og derved i høy grad forsterker nytten ved den her beskrevne oppfinnelse. Som vist i eksempel 7, passer også prinsippet med immunkompleksfjerning fra antikoagulert helt blod og/eller plasma ved passasje gjennom en kolonne som er fremstilt av glykoproteinbelagte perler, også

på den terapeutiske aferitiske fjerning av immunkomplekser fra pasienter som er angrepet av auto-immune forstyrrelser.

Forklaringer: Prøver ble oppnådd enten fra et individ som var fritt for klinisk synlig patologi (Normal) eller fra individer med rheumatoid arthritis (RA) eller vaskulitis. Serum refererer til serumprøver oppnådd etter sentrifugering av levret blod. Plasma refererer til den supernatant som er oppnådd etter sentrifugering av helt blod som inneholder en antikoagulant. Antikoagulanter er forkortet som følger: hep, heparin; EDTA, etylendiamintetraacetat; eit, citrat. Når det er angitt i tabellen, ble antikoagulert helt blod testet. Faktorer refererer til volumkorreksjoner som er nødvendige pga. tilføyd volum (citrat) eller cellevolum i helt blod. Citratløsninger utgjorde 10% av sluttvolumet. Hematokriter ble tatt som 34% av blodvolum for normale verdier og 44% for CIC-forhøyede prø-ver. Ganger forhøyelse refererer til adsorbansen i enhver gitt CIC-forhøyet prøve dividert med det som er funnet for

den respektive normale verdi.

Fire blodprøver ble tatt fra hvert individ, én i et glass som ikke inneholdt antikoagulanter og tre separat som inneholdt forskjellige antikoagulanter. De følgende forkortelser refererer til den antikoagulant som var inneholdt i således oppnådde prøver: 1) hep - heparin, 2 8 IU/ML; 2) EDTA - etylendiamintetraacetat, 1,5 mg/ml; 3) eit - natriumcitrat, 3,5 mg/ml. Helt blod, plasma eller serum (SER) tatt fra prøvene ble utsatt for den assay som er beksrevet fullstendig i eksemplene 1 og 5.

I figuren representerer høyden på stolpen den absorbans som

ble målt ved å følge assaymetoden. Dataene fra denne tabell er vist grafisk i fig. 6.

EKSEMPEL 7

Som indikert i eksempel 3, oppviser kolonner som er fremstilt av glykoproteinbelagte faste bærere den kapasitet å ekstrahere immunkomplekser fra serumprøver. Videre nytte av slike kolonner gis av de data som er presentert i dette eksempel. Prøver av kroppsfluider som f.eks. blod, blir ofte for-hindret fra å levre seg ved tilsetning av antikoaguleringsmid-ler, f.eks. heparin, etylendiamintetraacetat (EDTA) eller salter av sitronsyre. Slike forbindelser inhiberer levring enten ved å interferere med de proteolytiske trinn som fører til fibrinaktivering (heparin)., eller ved chelatering av kalsium (EDTA eller citrat). I dette eksempel er det vist at slike midler som heparin, EDTA eller citrat er uten effekt på evnen hos glykoproteinbelagte faste bærere til å adsorbere eller fiksere immunkomplekser uten hensyntagen til om prøven passerte gjennom kolonnen var helt blod eller plasma som stammer fra dette. Videre var immunkompleksfiksering i nærvær av disse antikoagulanter minst lik den for serum som ikke inneholdt antikoagulanter. Konsentrasjonene av antikoagulanter som ble testet for dette eksempel, var høyere enn dem som normalt anvendes for aferetiske formål hos mennesker. Fordi disse konsentra-sjoner av antikoagulanter ikke viste noen skadelige effekter på immunkompleksadsorpsjon, er det innlysende at de intermediære antikoagulantkonsentrasjoner anvendt for aferetiske formål vil likeledes være uten skadelige effekter på immunoadsorpsjon av komplekser.

For formålet med dette eksempel ble det tatt blodprøver fra et individ som var angrepet av rheumatoid arthritis, i glass som inneholdt enten heparin, EDTA eller natriumcitrat. En kontrollprøve ble også hatt i et glass som ikke inneholdt noe antikoagulant. Kontrollprøven ble tillatt å levre og serumet reservert. Immunkompleks-assay ble utført som beskrevet i eksempel 1, med unntagelse av at inkubasjonen for immunkom-plekspåvisning (annen inkubasjon) ble utført med pepperrot-peroksydase-konjugert geite-antiserum, rettet mot immunklasser IgG, -M og -A ble anvendt istedenfor de IgG-spesifikke antistoffer som ble anvendt i eksempel 1. Anvendelse av slike flerverdige antistoffer som disse (IgG, -M og -A-spesifikke) forsterker ytterligere den kjemiske sensibilitet ved testen og forbedrer derved den generelle anvendelighet av adsorpsjonsme-toden som her presenteres.

Etter utført immunkompleks-assay ble 0,25 ml alikvoter av ufortynnede prøver satt til kolonner som var preparert med BGG-belagte polystyrenperler som beskrevet for eksempel 3. Kolonnene ble inkubert ved 37° i 30 minutter, som tidligere.

Så ble prøven eluert som en bolus, og ble derfor ikke særlig fortynnet. Ytterligere fosfat-puffret saltløsning ble ført gjennom kolonnen for å lage den endelige fortynning 1:16 og for å jage eventuelle løst bundne immunkomplekser vekk fra kolonnen. Det resulterende fortynnede eluat ble etterpå under-søkt med hensyn på immunkomplekser uten ytterligere fortynning. En ytterligere kontrollprøve ble også preparert i hvilken serum ble inkubert i kontakt med ubehandlede polystyrenperler. Elu-ater fra denne kolonne ble også undersøkt som angitt ovenfor.

Prosent immunkomplekser som ble fjernet ved metoden,

ble beregnet som følger:

Resultatene fra denne metode er vist i tabell 7 og illustrert grafisk i fig. 7.

Under henvisning både til tabell 7 og fig. 7, går det tydelig frem at nærværet av antikoagulanter er uten skadelig effekt på evnen hos glykoprotein-behandlede bærere til å fjerne immunkomplekser fra enten plasma eller helt blod. Dette er forventet, da kalsium ikke kreves for den glykoprotein-immunkompleks-vekselvirkning som fikserer kompleksene til bæreren slik det læres i de foregående eksempler. Ubelagte polystyren-bærermaterialer var ute av stand til å fiksere signifikante mengder av immunkompleks, igjen i overensstemmelse med de prin-sipper som læres i eksemplene 1-3.

Som demonstrert ved læren i dette eksempel, vil glykoproteinfilmer som påføres på egnede understøttelsesmaterialer være svært nyttige for formålet med å fjerne immunkomplekser fra helt blod eller fra plasma, uten hensyntagen til den antikoagulant som kan være tilstede. Dette gjør det mulig å adsorbere immunkomplekser fra blodet for terapeutisk behandling av enhver immunkompleks-assosiert sykdom eller forstyrrelse. Det adderer også til nytten ved fremgangsmåten siden kolonnen kan tjene til å konsentrere visse sjeldne antistoff- eller antigen-typer som er tilstede i immunkompleksene. Etter eluering av de konsentrerte komplekser fra slike kolonner, kan påvisning av sjeldne antigener eller antistoffer bli utført med stor letthet ved hjelp av den assay-metode som læres i eksemplene 1 og 5.

Forklaringer: Fjerning av immunkomplekser fra serum, plasma og helt blod under anvendelse av kolonner av glykoproteinbelagte polystyrenperler.

Blod ble tappet i separate "vacutainer"-glass som hvert inneholdt et annet antikoagulerende middel. Glassene ble merket

som følger:

Heparin, endelig blodkonsentrasjon 28USP enheter/ml. Citrat, endelig blodkonsentrasjon av natriumcitrat på

3,5 mg/ml.

EDTA, endelig blodkonsentrasjon av natrium-EDTA på 1,5 mg/ml.

Etter oppsamling ble en alikvot av hver blodprøve utsatt for sentrifugering og plasmaet tappet av. Disse plasmaprøver ble anvendt i hvert tilfelle som er angitt i tabellen. Helt blod refererer til den antikoagulerte prøve før sentrifugering. Serum refererer til en blodprøve som ble tappet i et glass

og tillatt å levre seg før separering av den fluide komponent.

For kolonneekstraksjon av immunkomplekser ble 0,25 ml alikvot av hver prøve som er angitt i tabellen, satt til hver av 8 kolonner og fikk inkubere i 30 min. ved 37°C. De gjenværende serumkomponenter ble eluert fra kolonnene med 3,76 ml PBS og eluatet analysert med hensyn på immunkomplekser. Prosent komplekser som ble fjernet, ble beregnet som angitt i den ledsagende tekst.

For sammenligningsformål ble også serumkontrollprøver ført gjennom kolonner preparert med tynne glykoproteinfilmer på polystyrenbærere. Serum refererer til en blodprøve som ble tappet ut i et glass og tillatt å levre seg før separering av den fluide komponent. Slike serum-kontrollprøver var fri for antikoagulerende midler. Formålet med slike serum-kontroll-prøver var å demonstrere at det, uten hensyntagen til hvor høy eller lav antikoagulant-konsentrasjonen var, ikke var noen skadelig effekt av nevnte antikoagulanter på evnen hos glykoproteinbelagte substrater til å fjerne immunkomplekser fra fluider for enten formål med assay eller immunkompleks-immunoadsorpsjon fra blod eller plasma for formålet med terapeutiske aferetiske anvendelser.

For kolonneekstraksjon av immunkomplekser ble 0,25 ml alikvoter av hver prøve som angitt i tabellen, satt til hver av 8 kolonner og inkubert i 30 min. ved 37°C. De gjenværende serumkomponenter ble eluert fra kolonnene med 3,75 ml PBS og eluatet undersøkt med hensyn på immunkomplekser. Den prosent-del av komplekser som ble fjernet, ble beregnet som angitt i den ledsagende tekst.

I fig. 7 er den prøve som ble satt til kolonnen angitt under stolpen. Høyden på stolpen representerer prosent immun-komplekser fjernet fra prøven. De anvendte forkortelser' er som følger:

SER: Serum

N/C: Serum passert over en kolonne av ikke-belagt

polystyren

H/WB: Heparin-behandlet helt blod.

H/P: Plasma som stammer fra heparinbehandlet

helt blod.

C/WB: Citrat-behandlet helt blod.

C/P: Plasma som stammer fra citratbehandlet helt

blod.

E/WB: EDTA-behandlet helt blod.

E/P: Plasma som stammer fra EDTA-behandlet helt blod.

EKSEMPEL 8

Filmer av glykosylerte polypeptider har evne til å fiksere immunkomplekser som omfatter vide variasjoner i molekylstørrelse og sammensetning. For å illustrere denne kapasitet ble plasma som stammet fra et individ som led av systemisk lupus erythematosus utsatt for kolonnekromatografi over en sylindrisk kolonne av agarose A-15M (BioRad) som målte 1,6 x 35 cm og som har den evne å separere molekylsubstanser i henhold til størrelse over et område av 40 000 - 15 000 000 dalton. Kolonnen ble eluert med fosfatpuffret saltløsning. Proteininnholdet ble overvåket i eluatet via anvendelse av en Isco UV-monitor, inn-stilt på 280 nm. Eluatet ble så fraksjonert i 2,8 ml alikvoter etterhvert det strømmet ut av kolonnen, og hver fraksjon ble undersøkt med hensyn på immunkompleksinnhold som beskrevet i eksemplene for IgG-, IgM- og IgA-holdige komplekser ved anvendelse av peroksidase-merket antihuman IgG, IgM eller IgA som aktuelt for metoden.

Ved henvisnig til fig. 8 fremgår det at topp-immunkompleks-bindingen, som fremkommer ved immunkompleks-assaymetoden, var signifikant forskjøvet fra proteintoppene (avslørt av OD280-monitoren). Videre oppførte komplekser som inneholder en over-veiende klasse av immunoglobulin seg på distinkt måte som ved kalibrering av kolonnen (fig. 9), avslørte at immunkompleksene som finnes hos denne pasient hadde molekylvekter som varierte fra 200 000 til mer enn 5 000 000 dalton. Nytten av assay- metoden som er beskrevet her, kan best forstås i lys av slike karakteriseringsstudier. Svært få assaymetoder har så vide områder av anvendelse overfor måling av immunkomplekser. Forklaring: Fig. 8 Agarose A15M-gelfiltrering av human-immunkomplekser i serum.

Immunkomplekser ble separert etter størrelse på en kolonne av Agarose A15M måler med diameter 1,6 cm og lengde 35 cm. Abscissen og koordinaten indikerer henholdsvis elueringsfraksjons-nummer og adsorbans. Ett kolonnevolum tilsvarer tilnærmet 25 fraksjoner. En 1,0 ml prøve av human-serum oppnådd fra et indiivid som lider av systemisk lupus erythematosus ble på-ført på toppen av kolonnen ved fraksjon 0. Separasjon og eluering ble utført med fosfat-puffret saltløsning som er beskrevet tidligere (0,15M NaCl med 0,01 M kaliumfosfa, pH 7,4.

I fig. 8, representerer P absorbansen som ble overvåket ved 280 nm med en Isco-kolonne-monitor. Tomromvolumet i kolonnen er merket ved pilen Vq. Absorbansene som resulterer fra immunkompleks-assays som er spesifikke for IgG, IgA og IgM

er angitt ved passende linje (merket G, A eller M). Absorbansen for IgM-holdige komplekser (kurve M9 er resultatet av for-sterket sensibilitet av den IgM-probe som ble anvendt for ana-lysen. Sensibiliteten til G- og A-spesifikke antistoffer viser seg å være tilnærmet like under styrte betingelser i laboratoriet .

Forklaring: Fig. 9: Kalibrering av Agarose A15M-kolonne:

Den kromatografikolonne som er beskrevet i forklaringen til fig. 9, ble utsatt for kalibrering under anvendelse av et utvalg av proteiner for å bestemme molekylvektområdet for immunkomplekser påvist ved immunkompleks-assay. Fem forskjellige kolonne-elueringer ble utført, én hver med renset aldolase (M.V. 158 000), IgG (M:V. 170 000) katalase (M.V. 232 000), ferritin (M.V. 440 000) og tyroglobulin (M.V. 670 000). Det tomme volum ble bestemt i et sjette forsøk ved anvendelse av både aggregert protein (M.V. >20 000) og blått dekstran (M.V.-område mellom 1 000 000 og 50 000 000). Kolonnevolumet ble bestemt ved kromatografi av ribonuklease (M.V. 13 000). Elue-rings-K^-verdien som er angitt på ordinaten ble beregnet med følgende formel:

Molekylvektens log er avsatt på abscissen i fig. 9. Den resulterende linje ble ekstrapolert til Y-avskjæringe, hvilket ga en utelukkelsesgrense på 10 000 000 dalton, godt innen produ-sentens anslag på 15 000 000. Molekylvekter for proteinfraks joner utsatt for kromatografi på dette medium kan bestemmes ved først å beregne Kav, deretter henvise til fig. 9 for molekyl-vekten.

EKSEMPEL 9

Hensikten med dette eksempel er å illustrere ytterligere nytten av assay-metoden for immunkomplekser som beskrevet tidligere. Mange auto-immun-forstyrrelser, f.eks. systemisk lupus erythematosus, er det vanskelig for legen å diagnostisere i tidlig stadium, men allikevel gir de komplekser som omfatter et antigen eller en liten familie av antigener. Hvis disse immunkomplekser kunne bli testet med hensyn på sine antigene komponenter, ville det i stor grad forenkle sykdomserkjennelsen og diagnosen.

Hvis man bringer de belagte plater som er beskrevet i eksempel 1 i kontakt med blodserum eller plasma eller helt blod, så vil immunkompleksene, inklusive de antigene komponenter og eksponerte Fab-bindingspunkter derav, adherere til belegget og således til den faste bærer. Tilsetning av enten enzymmerkede antistoffer som er spesifikke for antigener eller fami-lier av antigener som er unike for den gitte auto-immunsykdom, eller enzymmerkede antigener som kan finnes i komplekset, som kan binde seg til eksponerte Fab-deler i immunkomplekset, vil så demonstrere nærvær av det kompleksdannede, sykdomsspesifikke, antigen som det er spørsmål om, ved utvikling av den karakteris-tiske farve som kommer etter tilsetning av substrat. På den annen side bør immunkompleksene ikke inneholde hverken slike antigener og heller ikke Fab-regioner som kan være spesifikke eller selektive for sykdommen, for da vil tilsetning av enzymmerkede antistoffer eller antigener svikte med hensyn til å danne farve etter substrat-tilsetning. Som følge av dette vil antigenspesifisitet for immunkomplekstesting i høy grad forenkle arbeidet med auto-immunsykdomsdiagnose og overvåkning av sykdommens utvikling, hvilket er nødvendig for god medisinsk pleie og øvelse. Nytten ved denne metode kan lett innses av fagmannen på helbredelsesområdet.

De foranstående eksempler tjener til å illustrere effek-tiviteten og nytten ved tynne glykoproteinfilmer for å fiksere immunkomplekser til faste bærere. Mens de illustrerende eksempler har vist at antistoffmolekylene som er tilstede i kompleksene lett kan bestemmes, så er det ingen grunn til å begrense påvisningsmetoden til de antistoffklasser eller -subklasser som inneholdes deri. Videre nytte av metoden gis ved anvendelse av antigenspesifikke påvisningsmidler hvorved sykdomstilstanden kan bestemmes. De følgende beskrivelser illustrerer måter å utføre slik påvisning på.

Antigen- og antistoffkomponenter i immunkomplekser har uokkuperte bindingspunkter som kan påvises via spesifikk vekselvirkning med merkede eller konjugerte materialer. Som følge av dette vil immunkompleksfiksering som beskrevet i eksemplene 1, 3 og 4, fulgt av inkubasjon med et enzymkonjugert antigen, føre til påfølgende fiksering av det konjugerte antigen. Denne egenskap vil føre til antigenspesifikk enzymkatalysert reaksjon hvis antistoffene som er rettet mot antigenet er tilstede i komplekset. Som følge av dette vil enzym-immunoassay-metoden være positiv hvis komplekset inneholder antistoffer som er rettet mot den antigene substans, mens enzym-immunoassay-metoden vil være negativ hvis disse komponenter er fraværende. Denne metode tilbyr ytterligere nytte ved å tillate sykdomsspesifikk forespørsel med hensyn til den nøyaktige antistoffsammensetning av komplekser. Konjugasjon trenger ikke å være begrenset til enzymer. Tilsetning av fluorescerende kjemikalier, f.eks. fluorescein eller lignende til antigenet vil medføre fluorescens til komplekset hvis nevnte antistoffsubstanser er tilstede; likeledes vil konjugasjon av antigenet med et radionuklid gi radioaktivitet til komplekset forutsatt at nevnte antistoffsubstanser er tilstede i det på forhånd fikserte kompleks. Mange andre påvisningsmetoder eksisterer også og hver av disse metoder vil gi positive indikasjoner forutsatt at antistoffkomponenten eksisterer i det kompleks som er fiksert i henhold til de metoder som her er beskrevet.

Likeledes vil nærværet av presise antigener i komplekser, som her er beskrevet, også tillate påvisning av slike antigener under anvendelse av konjugerte antistoffer som er rettet mot dette antigen. Som en følge av dette, hvis man inkuberer enzymkonjugerte antistoffer med et immobilisert immunkompleks, fremstilt ved de metoder som her er beskrevet, vil den enzym-katalyserte reaksjon indikere nærvær av nevnte antigener i komplekset. Konjugasjon trenger igjen ikke å være begrenset til enzymer. Tilsetning av fluorescerende kjemikalier som f.eks. fluorescein eller lignende til antistoffet vil medføre fluorescens til komplekset hvis nevnte antigene substanser er tilstede. Likeledes vil konjugasjon av antistoffet med et radionuklid medføre radioaktivitet til komplekset forutsatt at nevnte antigene substanser er tilstede i det på forhånd fikserte kompleks. Som med påvisning av antistoffer som er beskrevet, eksisterer også mange andre påvisningsmetoder for antigenene, og hver av disse metoder vil gi positive indikasjoner forutsatt at den antigene komponent eksisterer i det kompleks som er fiksert ved de metoder som her er beskrevet.

Den beskrevne teknologi for belegningsbærere med immunologisk ikke-spesifikke peptidforbundne aminosyrer inklusive oligopeptider, modifiserte oligopeptider, polypeptider, modifiserte polypeptider, proteiner og modifiserte proteiner, som har evne til direkte og selektivt å fiksere immunkomplekser ved absorpsjon, adsorpsjon eller andre mekanismer for tilknytning, har bred nytte enten når det gjelder å analysere kroppsfluider på nærvær av sirkulerende immunkomplekser og for å fjerne sirkulerende immunkomplekser. Spesielt bør glykosylering av enhver av de tidligere beskrevne immunologisk ikke-spesifikke peptidforbundne aminosyrebaserte klassifikasjoner produsere de mest nyttige materialer for isolasjon og identifikasjon av immunkomplekser. Lettheten ved å anvende og den vidstrakte anvendelighet av denne teknologi vil lett innses av fagmannen på området, etter at han har satt seg grundig inn i metoden. Be-handlingen av faste bærere på denne måte gir mange viktige og nyttige løsninger på påvisning og behandling av autoimmunsykdom-mer, idet det antydes et stort utvalgt av nye metoder. Slike metoder kan inkludere, men er ikke begrenset til, påvisning av antistoffklasse- og -subklassesammensetningen av immunkomplekset, bestemmelsen av den antigene natur av immunkomplekset og fjerning av slike komplekser som kan være tilstede i serum, annet kroppsfluid eller fluid fra enhver kilde, hva enten det er korporlig eller ekstrakorporlig. De teknikker som her er be skrevet har derfor vidstrakt anvendelighet og bred nytte for direkte å påvise sirkulerende immunkomplekser i serum og for direkte å fjerne sirkulerende immunkomplekser fra serum.

Uten å være bundet til noen spesifikk teori, er det inkludert at varierende grader av glykosylering eller andre lignende, funksjonelt ekvivalente substituenter for immunologisk naive arter av de beskrevne oligopeptider, polypeptider og proteiner, vil produsere en familie av materialer som har evne til direkte å skape tilknytning til immunkomplekser som er tilstede i serum, for formålet med påvisning og fjerning.

Det er inkludert at de her beskrevne oppfinneriske ideer kan varieres på annen måte, og det er hensikten at de ledsagende krav skal oppfattes å inkludere alternative utførelsesformer av oppfinnelsen med unntagelse av det som begrenser den ved teknikkens stand.

Claims (12)

1. Fremgangsmåte for utførelse av en immunoassay av en kropps-fluidprøve for å bestemme sammensetningen og/eller konsentrasjonen av immunkomplekser som er tilstede i nevnte prøve, karakterisert ved : å innføre den prøve som skal undersøkes, og en immunologisk ikke-spesifikk peptidforbundet aminosyre på en mottager, idet den nevnte peptidforbundne aminosyre adhererer til nevnte mottager og har evne til å fiksere immunkompleksene som kan være tilstede i nevnte prøve, til nevnte mottager; å tillate nevnte peptidforbundne aminosyrer å fiksere immunkomplekser som er tilstede i nevnte prøve til nevnte mottager; og behandle nevnte fikserte immunkomplekser på en måte som vil produsere en indikasjon av sammensetningen og/eller konsentrasjonen av immunkompleksene og antistoff- og antigenkomponentene som er tilstede i nevnte prøve.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at den inkluderer i trinn i rekkefølge å behandle nevnte mottager med en løsning som inneholder immunologisk ikke-spesifikk peptidbundet aminosyre for å danne et skikt av nevnte peptidbundne aminosyre på nevnte mottager, idet nevnte mottager fortrinnsvis omfatter en fast fase-basis som har hjelpemidler dannet på seg for å motta en prøve som skal undersøkes, og deretter anbringe nevnte prøve som skal undersøkes, på nevnte mottager.

3.F remgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at den immunologisk ikke-spesifikke peptidbundne aminosyre er valgt fra molekyler som består av oligopeptider, modifiserte oligopeptider, polypeptider, modifiserte polypeptider, proteiner og modifiserte proteiner, fortrinnsvis glykosylerte polypeptider og glykosylerte proteiner, hvilke molekyler videre er karakterisert ved sin affinitet for immunkomplekser; idet det glykosylerte protein fortrinnsvis er valgt fra en globulinfraks jon, fortrinnsvis stammer det fra et virveldyr, mer foretrukket en pattedyrart, mest foretrukket bovin-gammaglobulin, equin-gammaglobulin, lagomorf-gammaglobulin, canin-gammaglobulin, human-gammaglobulin, ovin-gammaglobulin, caprin-gammaglobulin, murin-gammaglobulin, procin-gammaglobulin, felin-gammaglobulin, eller Cohn-fraksjonen fra hvilket som helst av de nevnte gammaglobuliner, spesielt Cohn-fraksjonen fra bovin-gammaglobulin; eller hvor nevnte glykosylerte peptid som velges er kjemisk syntetisert, eller ved organismer med endret genetisk struktur som resulterer fra rekombinant- eller hybrid-celleteknikker eller andre teknikker som modifiserer eller endrer celler for å bevirke at de modifiserte celler produserer det ønskede protein.

4. Fremgangsmåte for å fjerne immunkomplekser fra kroppsfluid, karakterisert ved følgende trinn: 1) å fiksere et materiale som inneholder molekyler av immunologisk ikke-spesifikk peptidforbundet aminosyre til et substrat under betingelser som er forhåndsutvalgt for å forenkle fikseringen av et slikt materiale til nevnte substrat for å danne et belegg på dette; 2) å bringe nevnte belegg i kontakt med spesifikt kroppsfluid som inneholder immunkomplekser, på en måte som vil forenkle adherens av de immunkomplekser som inneholdes i kroppsfluidet, til nevnte belegg; hvorved immunkomplekser som er tilstede i nevnte kroppsfluid fikseres til nevnte belegg på nevnte substrat.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at materialet som inneholder immunologisk ikke-spesifikk peptidforbundet aminosyre inneholder peptidforbundne aminosyremolekyler valgt fra molekyler som består av oligopeptider, modifiserte oligopeptider, polypeptider, modifiserte polypeptider, proteiner og modifiserte proteiner, fortrinnsvis glykosylerte peptider og glykosylerte proteiner, hvilke molekyler er ytterligere karakterisert ved sin affinitet for immunkomplekser; idet det glykosylerte protein fortrinnsvis er valgt fra en globulinfraks jon, fortrinnsvis avledet fra et virveldyr, mer foretrukket en pattedyrart, mest foretrukket bovin-gammaglobulin, equin-gammaglobulin, lagomorf-gammaglobulin, canin-gammaglobulin, human-gammaglobulin, ovin-gammaglobulin, caprin-gammaglobulin, murin-gammaglobulin, porcin-gammaglobulin, felin-gammaglobulin eller Cohn-fraksjonen fra hvilket som helst av de nevnte gammaglobuliner, spesielt Cohn-fraksjonen fra bovin-gammaglobulin; eller hvor nevnte glykosylerte peptid som velges er kjemisk syntetisert, eller ved organismer med endret genetisk struktur som resulterer fra rekombinant- eller hybrid-celleteknikker eller andre teknikker som modifiserer eller endrer celler for å bevirke at de modifiserte celler produserer det ønskede protein.

6. Fremgangsmåte for fjerning av immunkomplekser fra kroppsfluid, karakterisert ved følgende trinn: 1) å fiksere et materiale som inneholder et immunologisk ikke-spesifikt peptid-forbundet aminosyremolekyl til et substrat ved inkubasjon ved en forhåndsvalgt temperatur i et tilstrekkelig tidsrom til å fullføre fikseringen av et belegg av slikt materiale på nevnte substrat; 2) å bringe nevnte fikserte belegg på nevnte substrat i kontakt med en løsning som immunkompleks og fosfatpuffret saltløsning; og 3) å fremkalle adherens av de immunkomplekser som inneholdes i løsningen, til nevnte belegg ved inkubasjon ved en forhåndsvalgt temperatur og i et tilstrekkelig tidsrom til å adherere tilstrekkelige immunkomplekser til nevnte belegg; hvorved immunkomplekser som er tilstede i nevnte kroppsfluider vil kunne bli identifisert.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at nevnte materiale som inneholder immunologisk ikke-spesifikke peptidforbundne aminosyrer er alkalisk og inneholder peptidforbundne aminosyremolekyler valgt fra gruppen av molekyler som består av oligopeptider, modifiserte oligopeptider, polypeptider, modifiserte polypeptider, proteiner og modifiserte proteiner, fortrinnsvis glykosylerte peptider og glykosylerte proteiner, hvilke molekyler ytterligere er karakterisert ved sin affinitet for immunkomplekser; idet nevnte glykosylerte protein fortrinnsvis er valgt fra en globulinfraksjon som fortrinnsvis stammer fra et virveldyr, mer foretrukket en pattedyrart, mest foretrukket bovin-gammaglobulin, equin-gammaglobulin, lagomorf-gammaglobulin, canin-gammaglobulin, human-gammaglobulin, ovin-gammaglobulin, caprin-gammaglobulin, murin-gammaglobulin, procin-gammaglobulin, felin-gammaglobulin, eller Cohn-fraksjonen fra hvilket som helst av de nevnte gammaglobuliner, spesielt fra Cohn-fraksjonen fra bovin-gammaglobulin; eller hvor nevnte glykosylerte peptid som velges er kjemisk syntetisert, eller ved organismer med endret genetisk struktur som resulterer fra rekombinant-eller hybrid-celleteknikker eller andre teknikker som modifiserer eller endrer celler for å bevirde at de modifiserte celler produserer det ønskede protein.

8. Gjenstand for selektivt å fjerne immunkomplekser fra kroppsfluid som er bragt i kontakt med en slik gjenstand, karakterisert ved understøttelsesmidler (P) tilpasset til å bringes i kontakt med løsninger som inneholder immunkomplekser; og belegningsmidler (21) som omfatter et materiale som inneholder immunologisk ikke-spesifikke peptidforbundne aminosyreholdige forbindelser som er fiksert til nevnte understøttelses-midler, idet et slikt belegg eller materiale har evne til å adherere immunkomplekser som er tilstede i spesifikk kroppsfluid når slikt kroppsfluid bringes i kontakt med nevnte belegg eller materiale, hvorved immunkomplekser som er tilstede i slikt kroppsfluid selektivt kan knyttes til nevnte belegningsmiddel.

9. Gjenstand som angitt i krav 8, karakterisert ved at nevnte materiale som inneholder immunologisk ikke-spesifikke peptidforbundne aminosyrer inneholder peptidforbundne aminosyremolekyler valgt fra oligopeptider, modifiserte oligopeptider, polypeptider, modifiserte polypeptider, proteiner og modifiserte proteiner, fortrinnsvis glykosylerte peptider og glykosylerte proteiner, hvilke molekyler er karakterisert ved sin affinitet for immun-komplekser, idet det glykosylerte protein fortrinnsvis er valgt fra en globulinfraks jon, som fortrinnsvis stammer fra et virveldyr, mer foretrukket en pattedyrart, mest foretrukket bovin-gammaglobulin, equin-gammaglobulin, lagomorf-gammaglobulin, canin-gammaglobulin, human-gammaglobulin, ovin-gammaglobulin, caprin-gammaglobulin, murin-gammaglobulin, procin-gammaglobu lin, felin-gammaglobulin, eller Cohn-fraksjonen fra hvilket som helst av de nevnte gammaglobuliner, spesielt Cohn-fraksjonen fra bovin-gammaglobulin; eller hvor nevnte glykosylerte peptid som velges er kjemisk syntetisert, eller ved organismer med endret genetisk struktur som resulterer fra rekombinant-eller hybrid-celleteknikker eller andre teknikker som modifiserer eller endrer celler for å bevirke at de modifiserte celler produserer det ønskede protein.

10. Fremgangsmåte for fremstilling av en gjenstand som har . evne til direkte og selektivt å fiksere immunkomplekser til et slikt fremstilt substrat, karakterisert ved følgende trinn: å tilveiebringe et substrat som har en mottageroverflate; å bringe nevnte substrat i kontakt med et materiale som omfatter en del som er valgt blant oligopeptider, modifiserte oligopeptider, polypeptider, modifiserte polypeptider, proteiner og modifiserte proteiner, som har evne til å knytte seg til nevnte substrat for å danne et belegg og som har evne til å adherere immunkomplekser som er tilstede i materialet som bringes i kontakt med nevnte belegg på en måte som tillater påføl-gende identifikasjon av nærvær av nevnte immunkomplekser.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 10, karakterisert ved at nevnte kontaktskapende materiale er i en løsning som har alkalisk pH-verdi, og at nevnte materiale inkuberes i kontakt med nevnte substrat ved en forhåndsvalgt temperatur i et tilstrekkelig tidsrom for oppnåelse av festing av nevnte deler til nevnte substrat.

12. Fremgangsmåte som angitt i krav 10 eller 11, karakterisert ved at nevnte del er valgt fra en globulinfraks jon, som fortrinnsvis stammer fra et virveldyr, mer foretrukket en pattedyrart, mest foretrukket bovin-gammaglobulin, equin-gammaglobulin, lagomorf-gammaglobulin, canin-gammaglobulin, human-gammaglobulin, ovin-gammaglobulin, caprin-gammaglobulin, murin-gammaglobulin, procin-gammaglobulin, felin-gammaglobulin, eller Cohn-fraksjonen fra hvilket som helst av de nevnte gammaglobuliner, spesielt Cohn-fraksjonen fra bovin-gammaglobulin; eller hvor nevnte glykosylerte peptid som velges er kjemisk syntetisert, eller ved organismer med endret genetisk struktur som resulterer fra rekombinant- eller hybrid-celleteknikker eller andre teknikker som modifiserer eller endrer celler for å bevirke at de modifiserte celler produserer det ønskede protein.