JP3202772B2 - ヘリコバクターピロリ検出用の抗原調製物 - Google Patents
ヘリコバクターピロリ検出用の抗原調製物Info
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- G01N2333/205—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Campylobacter (G)
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- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヘリコバクターピロリ
（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）に特異的
な抗体の存在を検出し得る抗原の調製物に関する。さら
に詳細には、界面活性剤で可溶化されたＨ．ｐｙｌｏｒ
ｉ抗原の、分子量−排除型クロマトグラフィーにより単
離された抗原の混合物に関する。本発明はさらに、Ｈ．
ｐｙｌｏｒｉに特異的な抗体の存在を検出するための方
法およびキットにも関する。
（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）に特異的
な抗体の存在を検出し得る抗原の調製物に関する。さら
に詳細には、界面活性剤で可溶化されたＨ．ｐｙｌｏｒ
ｉ抗原の、分子量−排除型クロマトグラフィーにより単
離された抗原の混合物に関する。本発明はさらに、Ｈ．
ｐｙｌｏｒｉに特異的な抗体の存在を検出するための方
法およびキットにも関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒ
ｉ（以前は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒ
ｉとして知られていた）は、Ｂ．Ｊ．Ｍａｒｓｈａｌｌ
らのＬａｎｃｅｔ （１９８４） Ｉ：１３１１−１３
１４に記述されている通り、１９８３年に発見された、
ヒトの胃で繁殖するバクテリアである。慢性進行性胃
炎、胃潰瘍疾患および十二指腸潰瘍疾患、および非潰瘍
性の消化不良の様な胃の疾患と、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉとの
関わりは、消化器系の医療分野に大きな興味を引き起こ
している。消化器の潰瘍疾患におけるＨ．ｐｙｌｏｒｉ
の正確な役割は、まだ解明されていない。しかしなが
ら、この菌と胃疾患との関係は、ヒトの胃の中のこの微
生物の検出方法の開発の、多大な努力のもととなった。
検出は二つの方法で行われる。すなわち：（１）直接胃
生検を、組織学的方法あるいは細胞培養分離法でまたは
両方で調べる；または、（２）間接的に、末梢血血清中
を循環しているＨ．ｐｙｌｏｒｉに対する抗体を調べ
る。簡便性および経済性（患者および医師の両方にとっ
て）の点から、後者の血清学的方法が特に魅力的であ
る。
ｉ（以前は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒ
ｉとして知られていた）は、Ｂ．Ｊ．Ｍａｒｓｈａｌｌ
らのＬａｎｃｅｔ （１９８４） Ｉ：１３１１−１３
１４に記述されている通り、１９８３年に発見された、
ヒトの胃で繁殖するバクテリアである。慢性進行性胃
炎、胃潰瘍疾患および十二指腸潰瘍疾患、および非潰瘍
性の消化不良の様な胃の疾患と、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉとの
関わりは、消化器系の医療分野に大きな興味を引き起こ
している。消化器の潰瘍疾患におけるＨ．ｐｙｌｏｒｉ
の正確な役割は、まだ解明されていない。しかしなが
ら、この菌と胃疾患との関係は、ヒトの胃の中のこの微
生物の検出方法の開発の、多大な努力のもととなった。
検出は二つの方法で行われる。すなわち：（１）直接胃
生検を、組織学的方法あるいは細胞培養分離法でまたは
両方で調べる；または、（２）間接的に、末梢血血清中
を循環しているＨ．ｐｙｌｏｒｉに対する抗体を調べ
る。簡便性および経済性（患者および医師の両方にとっ
て）の点から、後者の血清学的方法が特に魅力的であ
る。
【０００３】Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに対する抗体の血清学的
試験の精度は、抗体に結合させる抗原調製物の性質に依
存している。現在の試験に使用されている抗原調製物
は、完全な全微生物体から、一つの主要な抗原分子から
構成される高度に精製された物質までの、広い範囲にわ
たる。
試験の精度は、抗体に結合させる抗原調製物の性質に依
存している。現在の試験に使用されている抗原調製物
は、完全な全微生物体から、一つの主要な抗原分子から
構成される高度に精製された物質までの、広い範囲にわ
たる。
【０００４】Ｍｅｎｇｅら編集の、Ｃａｍｐｙｌｏｂａ
ｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｐｐ．１５７−１６３、Ｓｐ
ｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ （１９８８）の中で、
Ｈ．Ｖｏｎ Ｗｕｌｆｆｅｎは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉのク
ルードな細胞溶解物を、胃疾患患者の感染の有無を検出
するのに用いた。Ｍ．Ｊ． Ｂｌａｓｅｒによる欧州特
許出願公開第０３２９５７０号は、これと同様なクルー
ドな細胞溶解物が、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ抗体の検出に用い
得ることを教示している。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの酸性グリ
シン抽出物を、酵素結合免疫吸着アッセイ（”ＥＬＩＳ
Ａｓ”）用の抗原調製物として用いたことが、Ｃ．Ｓ．
Ｇｏｏｄｗｉｎらの、Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ
Ｄｉｓｅａｓｅｓ （１９８７） １５５：４８８−４
９４に記述されている。Ｆ．Ｊ． Ｂｏｌｔｏｎらの、
Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈｏｌ． （１９８９） ４
２：７２３−７２６においては、胃疾患患者の血清のス
クリーニングに、細胞表面抗原調製物およびウレアーゼ
調製物、および酸性グリシン抽出物が使用されている。
ｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｐｐ．１５７−１６３、Ｓｐ
ｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ （１９８８）の中で、
Ｈ．Ｖｏｎ Ｗｕｌｆｆｅｎは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉのク
ルードな細胞溶解物を、胃疾患患者の感染の有無を検出
するのに用いた。Ｍ．Ｊ． Ｂｌａｓｅｒによる欧州特
許出願公開第０３２９５７０号は、これと同様なクルー
ドな細胞溶解物が、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ抗体の検出に用い
得ることを教示している。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの酸性グリ
シン抽出物を、酵素結合免疫吸着アッセイ（”ＥＬＩＳ
Ａｓ”）用の抗原調製物として用いたことが、Ｃ．Ｓ．
Ｇｏｏｄｗｉｎらの、Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ
Ｄｉｓｅａｓｅｓ （１９８７） １５５：４８８−４
９４に記述されている。Ｆ．Ｊ． Ｂｏｌｔｏｎらの、
Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈｏｌ． （１９８９） ４
２：７２３−７２６においては、胃疾患患者の血清のス
クリーニングに、細胞表面抗原調製物およびウレアーゼ
調製物、および酸性グリシン抽出物が使用されている。
【０００５】これらのクルードな調製物には多くの欠点
がある。全組織あるいはクルードな細胞溶解物の使用
は、血清学的試験の特異性においてしばしば問題を引き
起こす。調製物中になんらかの望ましくない物質が存在
すると、他の抗体に「非特異」結合し、Ｈ．ｐｙｌｏｒ
ｉに対して特異的な抗体を持たない個体の「擬陽性の」
試験結果をもたらす。擬陽性はまた、他のＨ．ｐｙｌｏ
ｒｉ関連微生物と共有している共通抗原を含んだ調製物
によってももたらされる。これらの微生物により感染し
た個体は、このＨ．ｐｙｌｏｒｉ調製物と交差反応する
抗体を産生し得る。従って、好ましい調製物は、高度に
反応性の、種特異的な抗原に富み、関連微生物に共通し
た抗原を十分に交差反応するレベルでは含まないもので
ある。
がある。全組織あるいはクルードな細胞溶解物の使用
は、血清学的試験の特異性においてしばしば問題を引き
起こす。調製物中になんらかの望ましくない物質が存在
すると、他の抗体に「非特異」結合し、Ｈ．ｐｙｌｏｒ
ｉに対して特異的な抗体を持たない個体の「擬陽性の」
試験結果をもたらす。擬陽性はまた、他のＨ．ｐｙｌｏ
ｒｉ関連微生物と共有している共通抗原を含んだ調製物
によってももたらされる。これらの微生物により感染し
た個体は、このＨ．ｐｙｌｏｒｉ調製物と交差反応する
抗体を産生し得る。従って、好ましい調製物は、高度に
反応性の、種特異的な抗原に富み、関連微生物に共通し
た抗原を十分に交差反応するレベルでは含まないもので
ある。
【０００６】クルードな調製物の他の欠点は、Ｈ．ｐｙ
ｌｏｒｉ特異的抗体の存在の検出が、しばしばできない
ことである。これらの「擬陰性」の試験結果は；（１）
調製物中の他の成分との相互作用によって、Ｈ．ｐｙｌ
ｏｒｉ特異的な抗原性の物質が抗体と結合させるのに簡
単に用いられない；（２）調製過程がこのＨ．ｐｙｌｏ
ｒｉ特異的な抗原性の物質を変性させ、抗体との反応性
が低くなる；あるいは、（３）Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ特異的
な抗原性の物質が、望ましくない物質の存在により余り
にも高度に希釈されている；場合に起こる。
ｌｏｒｉ特異的抗体の存在の検出が、しばしばできない
ことである。これらの「擬陰性」の試験結果は；（１）
調製物中の他の成分との相互作用によって、Ｈ．ｐｙｌ
ｏｒｉ特異的な抗原性の物質が抗体と結合させるのに簡
単に用いられない；（２）調製過程がこのＨ．ｐｙｌｏ
ｒｉ特異的な抗原性の物質を変性させ、抗体との反応性
が低くなる；あるいは、（３）Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ特異的
な抗原性の物質が、望ましくない物質の存在により余り
にも高度に希釈されている；場合に起こる。
【０００７】抗原調製物の別の極端な局面として、ＰＣ
Ｔ出願第ＷＯ ８９／０９４０７号では、精製したＨ．
ｐｙｌｏｒｉのウレアーゼの調製物を使用したＨ．ｐｙ
ｌｏｒｉ感染の診断法を教示している。Ｈ．ｐｙｌｏｒ
ｉは、血清診断に用い得る、種特異的なウレアーゼを含
んでいる。単一クローン化されたＨ．ｐｙｌｏｒｉ遺伝
子から製造された物質を用いた他の調製物もまた、使用
し得る。例えば、Ｄ．Ｃｈｅｖｒｉｅｒらの、Ｊ． Ｃ
ｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏ． （１９８９） ２７：３２１
−３２６。
Ｔ出願第ＷＯ ８９／０９４０７号では、精製したＨ．
ｐｙｌｏｒｉのウレアーゼの調製物を使用したＨ．ｐｙ
ｌｏｒｉ感染の診断法を教示している。Ｈ．ｐｙｌｏｒ
ｉは、血清診断に用い得る、種特異的なウレアーゼを含
んでいる。単一クローン化されたＨ．ｐｙｌｏｒｉ遺伝
子から製造された物質を用いた他の調製物もまた、使用
し得る。例えば、Ｄ．Ｃｈｅｖｒｉｅｒらの、Ｊ． Ｃ
ｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏ． （１９８９） ２７：３２１
−３２６。
【０００８】精製された単一抗原調製物、あるいはクロ
ーン化された遺伝子産物によって、上述した擬性の結果
の原因のいくつかが排除される。しかしながら、クロー
ン化された遺伝子からの調製物は、別の擬陽性の試験結
果を与え得る、表現系の副産物分子をもたらし得る。さ
らに、高度に精製された抗原調製物、あるいはクローン
化された遺伝子からの調製物は、変性され天然にはない
構造で抗体との反応性の低い関連抗原を生成し得るた
め、これによって擬陰性の試験結果となる。
ーン化された遺伝子産物によって、上述した擬性の結果
の原因のいくつかが排除される。しかしながら、クロー
ン化された遺伝子からの調製物は、別の擬陽性の試験結
果を与え得る、表現系の副産物分子をもたらし得る。さ
らに、高度に精製された抗原調製物、あるいはクローン
化された遺伝子からの調製物は、変性され天然にはない
構造で抗体との反応性の低い関連抗原を生成し得るた
め、これによって擬陰性の試験結果となる。
【０００９】さらに、感染した個体は典型的には、数種
類の抗原を認識する、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに対する抗体を
産生することが、ウエスタンブロットにより示された。
単一の精製された抗原性分子あるいは遺伝子産物を含む
調製物は、抗体の認識する範囲を不必要に制限し、そし
て、使用した特定の抗原に対する抗体がないかあるいは
少ない感染者に、擬陰性の結果を与え得る。
類の抗原を認識する、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに対する抗体を
産生することが、ウエスタンブロットにより示された。
単一の精製された抗原性分子あるいは遺伝子産物を含む
調製物は、抗体の認識する範囲を不必要に制限し、そし
て、使用した特定の抗原に対する抗体がないかあるいは
少ない感染者に、擬陰性の結果を与え得る。
【００１０】Ｅｖａｎｓらの米国特許第４，８８２，２
７１号（以下”Ｅｖａｎｓ”）には、上記の両極端のあ
いだの抗原調製物を得る方法が記述されている：この方
法では、３００，０００から７００，０００ダルトンの
間の分子量を有する２，３の主要な抗原性成分のみを含
んでいる。Ｅｖａｎｓの調製物は、顕著なウレアーゼ酵
素活性を有する、高い分子量の範囲で定義された、分子
量−排除型クロマトグラフィー分離からの、フラクショ
ンを集めることにより得られる。Ｅｖａｎｓは、さらな
る精製は不必要であるが、開示された調製物の精製は、
アッセイにおいて十分な感度および特異性を与える程度
必要であると示唆している。
７１号（以下”Ｅｖａｎｓ”）には、上記の両極端のあ
いだの抗原調製物を得る方法が記述されている：この方
法では、３００，０００から７００，０００ダルトンの
間の分子量を有する２，３の主要な抗原性成分のみを含
んでいる。Ｅｖａｎｓの調製物は、顕著なウレアーゼ酵
素活性を有する、高い分子量の範囲で定義された、分子
量−排除型クロマトグラフィー分離からの、フラクショ
ンを集めることにより得られる。Ｅｖａｎｓは、さらな
る精製は不必要であるが、開示された調製物の精製は、
アッセイにおいて十分な感度および特異性を与える程度
必要であると示唆している。
【００１１】Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに感染した個体は、事
実、多くの異なる抗原に応答する。我々の研究で、Ｈ．
ｐｙｌｏｒｉに対する抗体用の、より高感度でより特異
的な試験が構築され得ることが示される。この試験に
は、本明細書に記載の抽出法および精製法が用いられ、
以前には認識されていなかった、より広範囲のＨ．ｐｙ
ｌｏｒｉに特異的で反応性の抗原を含む、優れたＨ．ｐ
ｙｌｏｒｉ抗原抽出物が製造される。
実、多くの異なる抗原に応答する。我々の研究で、Ｈ．
ｐｙｌｏｒｉに対する抗体用の、より高感度でより特異
的な試験が構築され得ることが示される。この試験に
は、本明細書に記載の抽出法および精製法が用いられ、
以前には認識されていなかった、より広範囲のＨ．ｐｙ
ｌｏｒｉに特異的で反応性の抗原を含む、優れたＨ．ｐ
ｙｌｏｒｉ抗原抽出物が製造される。
【００１２】
【発明の要旨】従って、本発明の目的は、界面活性剤に
より可溶化されたＨ．ｐｙｌｏｒｉ細胞由来の抗原の混
合物を用い、そして、従来用いられたものよりも高い精
度および信頼性で、生物学的試料中のＨ．ｐｙｌｏｒｉ
感染の存在の有無を調べることを可能とする、抗原調製
物を提供することである。
より可溶化されたＨ．ｐｙｌｏｒｉ細胞由来の抗原の混
合物を用い、そして、従来用いられたものよりも高い精
度および信頼性で、生物学的試料中のＨ．ｐｙｌｏｒｉ
感染の存在の有無を調べることを可能とする、抗原調製
物を提供することである。
【００１３】本発明のさらなる目的は、Ｈ．ｐｙｌｏｒ
ｉ感染の存在を調べるための抗原調製物を提供すること
であり、この調製物は、擬陰性率を最小化することによ
り、感染が存在するときに陽性の応答率を最大化し、ア
ッセイの感度を改良する。同様に、この調製物は、擬陽
性率を最小化することにより、感染が存在しないときに
陰性の応答率を最大化し、アッセイの特異性を改良す
る。
ｉ感染の存在を調べるための抗原調製物を提供すること
であり、この調製物は、擬陰性率を最小化することによ
り、感染が存在するときに陽性の応答率を最大化し、ア
ッセイの感度を改良する。同様に、この調製物は、擬陽
性率を最小化することにより、感染が存在しないときに
陰性の応答率を最大化し、アッセイの特異性を改良す
る。
【００１４】本発明のさらなる目的は、広い範囲で高度
に反応性のＨ．ｐｙｌｏｒｉ特異的抗原に富んだ抗原調
製物を用いて、最大の「Ｓ／Ｎ比」で、生物学的試料中
のＨ．ｐｙｌｏｒｉ感染の存在を調べる方法を提供する
ことである。
に反応性のＨ．ｐｙｌｏｒｉ特異的抗原に富んだ抗原調
製物を用いて、最大の「Ｓ／Ｎ比」で、生物学的試料中
のＨ．ｐｙｌｏｒｉ感染の存在を調べる方法を提供する
ことである。
【００１５】本発明の別の目的は、最大の「Ｓ／Ｎ比」
で、生物学的試料中のＨ．ｐｙｌｏｒｉ感染の存在を調
べるのに用いるキットを提供することである。
で、生物学的試料中のＨ．ｐｙｌｏｒｉ感染の存在を調
べるのに用いるキットを提供することである。
【００１６】本発明の他の目的、利点、および新規な特
性の一部が以下の詳細な説明に記述され、以下の説明を
検討することにより、あるいは、本発明の実施による修
得により、その一部が当業者には明らかとなる。
性の一部が以下の詳細な説明に記述され、以下の説明を
検討することにより、あるいは、本発明の実施による修
得により、その一部が当業者には明らかとなる。
【００１７】本発明の一つの局面では、Ｈ．ｐｙｌｏｒ
ｉ細胞付着タンパクから精製した抗原を含む組成物が提
供され、該抗原は、還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による
測定で、約１６，０００から約１２０，０００ダルトン
の間の分子量を有し、そして、低ウレアーゼ活性を有し
ている。
ｉ細胞付着タンパクから精製した抗原を含む組成物が提
供され、該抗原は、還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による
測定で、約１６，０００から約１２０，０００ダルトン
の間の分子量を有し、そして、低ウレアーゼ活性を有し
ている。
【００１８】本発明は他の局面では、Ｈｅｌｉｃｏｂａ
ｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ細胞付着タンパクから精製した
抗原を含む組成物が提供され、該組成物は：Ｈｅｌｉｃ
ｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ細胞を１０％のウシ胎児
血清を補った培養培地中で成長させ、そして、対数増殖
期が終わり始めるときに該細胞を回収する工程；ｎ−オ
クチル−β−Ｄ−グルコピラノシドを約１％含有するリ
ン酸緩衝食塩水中で、少なくとも約３０分間該細胞を可
溶化し、細胞タンパク溶液を得る工程；該細胞タンパク
溶液を、ＰＢＳで一晩透析し、次に、該溶液を中速度で
遠心分離し、上清を得る工程；該上清を６ＦＦ−Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ分子量−排除型カラムにかける工程；該カ
ラムを０．０２５％のアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ
のＴｒｉｓバッファーで溶出し、そして、該溶出したフ
ラクションを回収する工程；ウレアーゼ活性の大部分を
有する高分子量のタンパクピークを除外する工程；そし
て、残りの低分子量の低ウレアーゼ活性のあるタンパク
フラクションをプールする工程；により得られる。
ｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ細胞付着タンパクから精製した
抗原を含む組成物が提供され、該組成物は：Ｈｅｌｉｃ
ｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ細胞を１０％のウシ胎児
血清を補った培養培地中で成長させ、そして、対数増殖
期が終わり始めるときに該細胞を回収する工程；ｎ−オ
クチル−β−Ｄ−グルコピラノシドを約１％含有するリ
ン酸緩衝食塩水中で、少なくとも約３０分間該細胞を可
溶化し、細胞タンパク溶液を得る工程；該細胞タンパク
溶液を、ＰＢＳで一晩透析し、次に、該溶液を中速度で
遠心分離し、上清を得る工程；該上清を６ＦＦ−Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ分子量−排除型カラムにかける工程；該カ
ラムを０．０２５％のアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ
のＴｒｉｓバッファーで溶出し、そして、該溶出したフ
ラクションを回収する工程；ウレアーゼ活性の大部分を
有する高分子量のタンパクピークを除外する工程；そし
て、残りの低分子量の低ウレアーゼ活性のあるタンパク
フラクションをプールする工程；により得られる。
【００１９】本発明の他の局面では、生物学的試料中の
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ感染を検出す
る方法が提供され、該方法は：上述の方法で得られるＨ
ｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ細胞付着タンパ
クから精製した抗原を含む組成物を試料と接触させ、反
応複合体を形成する工程；そして、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃ
ｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ感染の存在を示す抗原抗体複合体
の存在の有無を該反応複合体で試験する工程；を包含す
る。
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ感染を検出す
る方法が提供され、該方法は：上述の方法で得られるＨ
ｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ細胞付着タンパ
クから精製した抗原を含む組成物を試料と接触させ、反
応複合体を形成する工程；そして、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃ
ｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ感染の存在を示す抗原抗体複合体
の存在の有無を該反応複合体で試験する工程；を包含す
る。
【００２０】本発明の別の局面では、生物学的試料中の
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ感染の検出に
使用されるキットが提供され、該キットは、上述の方法
により得られた、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏ
ｒｉ細胞付着タンパクから精製した抗原を含む。
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ感染の検出に
使用されるキットが提供され、該キットは、上述の方法
により得られた、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏ
ｒｉ細胞付着タンパクから精製した抗原を含む。
【００２１】
定義：本発明でいう「抗原」とは、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃ
ｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ細胞から抽出される「細胞付着タ
ンパク」である。「細胞付着タンパク」には、細胞外膜
に付着するタンパクおよび細胞表面タンパクが含まれ
る。細胞付着タンパクは、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グル
コピラノシド（ＢＯＧ）、および同じ機能を行い得る他
の界面活性剤の様な、非イオン性の界面活性剤を用い
て、細胞を破壊して開けることなく、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ
細胞より抽出され得る。これらの細胞付着タンパクは、
これらのタンパク上の抗原決定基を認識する抗体の形態
で、免疫応答を開始させ得る。
ｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ細胞から抽出される「細胞付着タ
ンパク」である。「細胞付着タンパク」には、細胞外膜
に付着するタンパクおよび細胞表面タンパクが含まれ
る。細胞付着タンパクは、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グル
コピラノシド（ＢＯＧ）、および同じ機能を行い得る他
の界面活性剤の様な、非イオン性の界面活性剤を用い
て、細胞を破壊して開けることなく、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ
細胞より抽出され得る。これらの細胞付着タンパクは、
これらのタンパク上の抗原決定基を認識する抗体の形態
で、免疫応答を開始させ得る。
【００２２】本明細書の用語「生物学的試料」は、Ｈ．
ｐｙｌｏｒｉ感染の存在を試験されるヒト患者からの、
血液、血清、血漿、リンパ節の抽出物あるいは他の抽出
物、を意味する。
ｐｙｌｏｒｉ感染の存在を試験されるヒト患者からの、
血液、血清、血漿、リンパ節の抽出物あるいは他の抽出
物、を意味する。
【００２３】本明細書の用語「高分子量のウレアーゼ活
性を有するタンパクフラクション」は、一般的に３０
０，０００ダルトンより大きい（サイジングカラムクロ
マトグラフィーにより測定される）の分子量のタンパク
を含む、２８０ｎｍに顕著な吸光を有する、そして、顕
著なウレアーゼ活性を示す、クロマトグラフィーフラク
ションを指す。本明細書の用語「低分子量の低ウレアー
ゼ活性タンパクフラクション」は、２８０ｎｍに顕著な
吸光を有し、そして、低ウレアーゼ活性を示す低分子量
のフラクションを指す。
性を有するタンパクフラクション」は、一般的に３０
０，０００ダルトンより大きい（サイジングカラムクロ
マトグラフィーにより測定される）の分子量のタンパク
を含む、２８０ｎｍに顕著な吸光を有する、そして、顕
著なウレアーゼ活性を示す、クロマトグラフィーフラク
ションを指す。本明細書の用語「低分子量の低ウレアー
ゼ活性タンパクフラクション」は、２８０ｎｍに顕著な
吸光を有し、そして、低ウレアーゼ活性を示す低分子量
のフラクションを指す。
【００２４】本明細書の用語「低ウレアーゼ活性」は、
実施例２に記述するウレアーゼ触媒の尿素の加水分解に
おいて測定される、０．３４より少ないＯＤ550／Ａ280
単位である、特定の活性を指す。
実施例２に記述するウレアーゼ触媒の尿素の加水分解に
おいて測定される、０．３４より少ないＯＤ550／Ａ280
単位である、特定の活性を指す。
【００２５】抗原調製物：本発明の抗原調製物は、Ｈ．
ｐｙｌｏｒｉ細胞に由来する細胞付着タンパクである。
この細胞を非イオン性の界面活性剤で可溶化し、そし
て、この結果得られた上清を分子量−排除型カラムクロ
マトグラフィーにかけ、次いで選択したカラムフラクシ
ョンをプールする。本発明のこのプールされたフラクシ
ョンは、顕著なウレアーゼ酵素活性の大部分を有するフ
ラクションは含まない。その代わり、低分子量のウレア
ーゼ活性に欠けた抗原を含む一連のフラクションをプー
ルして最終の抗原調製物を得た。
ｐｙｌｏｒｉ細胞に由来する細胞付着タンパクである。
この細胞を非イオン性の界面活性剤で可溶化し、そし
て、この結果得られた上清を分子量−排除型カラムクロ
マトグラフィーにかけ、次いで選択したカラムフラクシ
ョンをプールする。本発明のこのプールされたフラクシ
ョンは、顕著なウレアーゼ酵素活性の大部分を有するフ
ラクションは含まない。その代わり、低分子量のウレア
ーゼ活性に欠けた抗原を含む一連のフラクションをプー
ルして最終の抗原調製物を得た。
【００２６】本発明の抗原は、いくつもの方法で調製し
得る。好ましい実施態様では、抗原は、Ｂｒｕｃｅｌｌ
ａ ｂｒｏｔｈの様な生育培地中でＨ．ｐｙｌｏｒｉ微
生物を生育させることにより調製した。この培地には、
栄養補填物が含まれている。好ましい補填物は、ウシ胎
児血清である。この細胞は、ＣＯ2、Ｏ2、およびＮ2の
混合ガス中で、回転させられているフラスコ中で、培養
される。この細胞は、対数増殖期が終わり始めるとき
に、中速度の遠心分離により回収される。Ｈ．ｐｙｌｏ
ｒｉ細胞はまた、例えば、血液寒天プレート上の様なプ
レートに蒔いて育成され得て、次いで回収する。
得る。好ましい実施態様では、抗原は、Ｂｒｕｃｅｌｌ
ａ ｂｒｏｔｈの様な生育培地中でＨ．ｐｙｌｏｒｉ微
生物を生育させることにより調製した。この培地には、
栄養補填物が含まれている。好ましい補填物は、ウシ胎
児血清である。この細胞は、ＣＯ2、Ｏ2、およびＮ2の
混合ガス中で、回転させられているフラスコ中で、培養
される。この細胞は、対数増殖期が終わり始めるとき
に、中速度の遠心分離により回収される。Ｈ．ｐｙｌｏ
ｒｉ細胞はまた、例えば、血液寒天プレート上の様なプ
レートに蒔いて育成され得て、次いで回収する。
【００２７】Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ細胞を回収した後、これ
らを洗浄し、そして可溶化のためにバッファー中に懸濁
し得る。好適な実施態様では、この可溶化バッファー
は、非イオン性の界面活性剤を含んだ、リン酸緩衝食塩
水（ＰＢＳ）である。非イオン性の界面活性剤には、エ
チレンオキサイドあるいはプロピレンオキサイドと：
（１）Ｃ6からＣ22のアルキルフェノール；あるいは
（２）一級の、あるいは二級の直鎖状、あるいは分枝
状、脂肪族アルコール；との反応生成物が含まれる。他
の非イオン性の界面活性剤には、長鎖の三級アミンオキ
サイド、長鎖の三級ホスフィンオキサイド、およびジア
ルキルスルフォキサイドが含まれる。非イオン性の界面
活性剤は、好ましい実施態様では０．１から３．０％
（重量／体積）の濃度の、そして最も好ましくは１．０
％の濃度の、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド
である。
らを洗浄し、そして可溶化のためにバッファー中に懸濁
し得る。好適な実施態様では、この可溶化バッファー
は、非イオン性の界面活性剤を含んだ、リン酸緩衝食塩
水（ＰＢＳ）である。非イオン性の界面活性剤には、エ
チレンオキサイドあるいはプロピレンオキサイドと：
（１）Ｃ6からＣ22のアルキルフェノール；あるいは
（２）一級の、あるいは二級の直鎖状、あるいは分枝
状、脂肪族アルコール；との反応生成物が含まれる。他
の非イオン性の界面活性剤には、長鎖の三級アミンオキ
サイド、長鎖の三級ホスフィンオキサイド、およびジア
ルキルスルフォキサイドが含まれる。非イオン性の界面
活性剤は、好ましい実施態様では０．１から３．０％
（重量／体積）の濃度の、そして最も好ましくは１．０
％の濃度の、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド
である。
【００２８】洗浄されたＨ．ｐｙｌｏｒｉ細胞は、１０
０ｍｇの湿重量の細胞当り約０．１から１０ｍｌの可溶
化バッファーに懸濁され、さらに好適には、１００ｍｇ
の湿重量の細胞当り約１ｍｌの可溶化バッファーに懸濁
される。この懸濁液は、インキュベートし、そして少な
くとも約３０分間、室温で攪拌される。この結果得られ
る可溶化した細胞懸濁液を、通常は一晩、ＰＢＳで透析
し、そして、中速度の遠心分離により上清を回収する。
０ｍｇの湿重量の細胞当り約０．１から１０ｍｌの可溶
化バッファーに懸濁され、さらに好適には、１００ｍｇ
の湿重量の細胞当り約１ｍｌの可溶化バッファーに懸濁
される。この懸濁液は、インキュベートし、そして少な
くとも約３０分間、室温で攪拌される。この結果得られ
る可溶化した細胞懸濁液を、通常は一晩、ＰＢＳで透析
し、そして、中速度の遠心分離により上清を回収する。
【００２９】この結果得られる上清は次ぎに、通常は分
子量−排除型のクロマトグラフィーである、サイジング
分離にかける。好適な実施態様では、上清を６ＦＦ−Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ分子量−排除型のカラムに入れ、約
０．０２５％のアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭのＴｒ
ｉｓバッファー（ｐＨ８．０）で溶出する。次に、フラ
クションを回収し、そして２８０ｎｍの吸光度とウレア
ーゼ活性をモニターし、分画化プロフィールを調べる。
子量−排除型のクロマトグラフィーである、サイジング
分離にかける。好適な実施態様では、上清を６ＦＦ−Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ分子量−排除型のカラムに入れ、約
０．０２５％のアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭのＴｒ
ｉｓバッファー（ｐＨ８．０）で溶出する。次に、フラ
クションを回収し、そして２８０ｎｍの吸光度とウレア
ーゼ活性をモニターし、分画化プロフィールを調べる。
【００３０】ウレアーゼ活性の大部分を有する、高分子
量のウレアーゼ活性を含むタンパクフラクションを捨
て、残りの低分子量の低ウレアーゼフラクションをプー
ルする。このプールが、本発明の抗原抽出物を構成す
る。この抽出物は、還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で、２
００，０００ダルトンより小さい分子量、さらに特定的
には、約１６，０００から約１２０，０００ダルトンの
分子量を有する抗原から構成される。好適な実施例で
は、この抽出物は図１のフラクション３４から５２をプ
ールして作られる。
量のウレアーゼ活性を含むタンパクフラクションを捨
て、残りの低分子量の低ウレアーゼフラクションをプー
ルする。このプールが、本発明の抗原抽出物を構成す
る。この抽出物は、還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で、２
００，０００ダルトンより小さい分子量、さらに特定的
には、約１６，０００から約１２０，０００ダルトンの
分子量を有する抗原から構成される。好適な実施例で
は、この抽出物は図１のフラクション３４から５２をプ
ールして作られる。
【００３１】方法：生物学的試料中のＨ．ｐｙｌｏｒｉ
に対する抗体を検出するために、本発明では、種々の血
清学的アッセイを使用し得る。酵素結合免疫吸着アッセ
イ（ＥＬＩＳＡｓ）、ラピッド−フロースルーアッセ
イ、ラテックス凝集反応アッセイ、イムノブロットアッ
セイ、およびラテラルフローアッセイ、の様な特性のよ
くわかったアッセイは全て本発明に使用できる。放射免
疫アッセイ、補体固定法、間接赤血球凝集反応、等のア
ッセイも全て本発明に使用できる。
に対する抗体を検出するために、本発明では、種々の血
清学的アッセイを使用し得る。酵素結合免疫吸着アッセ
イ（ＥＬＩＳＡｓ）、ラピッド−フロースルーアッセ
イ、ラテックス凝集反応アッセイ、イムノブロットアッ
セイ、およびラテラルフローアッセイ、の様な特性のよ
くわかったアッセイは全て本発明に使用できる。放射免
疫アッセイ、補体固定法、間接赤血球凝集反応、等のア
ッセイも全て本発明に使用できる。
【００３２】好適な実施態様では、血清学的アッセイ
は、ＥＩＡマイクロタイター法で行われる。この方法で
は、マイクロタイタープレートのウェルは、上述の本発
明の抗原調製物でコートされ、そして、４℃で一晩イン
キュベートされる。次に、この調製物溶液は捨てられ、
そしてウェルは、３７℃で２時間乾燥される。次に、試
験される生物学的試料を、ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）を含んだＰＢＳで種々の希釈濃度に調製し、ウェル
に加える。２５℃で３０分間インキュベートした後、生
物学的試料を除去し、そしてウェルを界面活性剤Ｔｗｅ
ｅｎ ２０を含んだＰＢＳで洗浄する。次に、酵素標識
した、ヒト免疫グロブリンＧ（「抗ヒトＩｇＧ」）を認
識する、ウサギの抗体調製物を加え、そして、ウェルを
さらにインキュベートする。溶液を再び捨てて、さらに
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０洗浄を行う。最後に、この標
識した酵素に対する基質を含んだ溶液を加える。
は、ＥＩＡマイクロタイター法で行われる。この方法で
は、マイクロタイタープレートのウェルは、上述の本発
明の抗原調製物でコートされ、そして、４℃で一晩イン
キュベートされる。次に、この調製物溶液は捨てられ、
そしてウェルは、３７℃で２時間乾燥される。次に、試
験される生物学的試料を、ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）を含んだＰＢＳで種々の希釈濃度に調製し、ウェル
に加える。２５℃で３０分間インキュベートした後、生
物学的試料を除去し、そしてウェルを界面活性剤Ｔｗｅ
ｅｎ ２０を含んだＰＢＳで洗浄する。次に、酵素標識
した、ヒト免疫グロブリンＧ（「抗ヒトＩｇＧ」）を認
識する、ウサギの抗体調製物を加え、そして、ウェルを
さらにインキュベートする。溶液を再び捨てて、さらに
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０洗浄を行う。最後に、この標
識した酵素に対する基質を含んだ溶液を加える。
【００３３】もし生物学的試料中にヒトのＨ．ｐｙｌｏ
ｒｉに対する抗体が存在するならば、ウサギの抗ヒトＩ
ｇＧ抗体はウェルに結合し、そして、標識された酵素
は、基質と反応し、存在する抗体の量を反映する色の変
化が生じる。好適な実施態様では、酵素は西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ、および基質は２，２’−アミノ−ビス
（３−エチルベンズチアゾリンスルフォン酸）ジアンモ
ニウム塩（ＡＢＴＳ）である。
ｒｉに対する抗体が存在するならば、ウサギの抗ヒトＩ
ｇＧ抗体はウェルに結合し、そして、標識された酵素
は、基質と反応し、存在する抗体の量を反映する色の変
化が生じる。好適な実施態様では、酵素は西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ、および基質は２，２’−アミノ−ビス
（３−エチルベンズチアゾリンスルフォン酸）ジアンモ
ニウム塩（ＡＢＴＳ）である。
【００３４】他の免疫アッセイは、ＥＩＡマイクロタイ
ターアッセイに似ているが、多孔性ナイロン膜に吸着さ
れた抗原調製物を利用する、ラピッドフロースルーＥＩ
Ａアッセイである。このナイロン膜を、次に、吸収剤パ
ッドの上に置き、そして、プラスチックホルダーに入れ
て、膜をさらす。生物学的試料は希釈され、そして、膜
を通して流される。次に、酵素標識したウサギ抗ヒトＩ
ｇＧ抗体を通して流し、さらに洗浄液を、通して流す。
最後に、標識した酵素に対する基質を含んだ溶液を加
え、そして、ＥＬＩＳＡ法と同様に色の変化を生成させ
る。
ターアッセイに似ているが、多孔性ナイロン膜に吸着さ
れた抗原調製物を利用する、ラピッドフロースルーＥＩ
Ａアッセイである。このナイロン膜を、次に、吸収剤パ
ッドの上に置き、そして、プラスチックホルダーに入れ
て、膜をさらす。生物学的試料は希釈され、そして、膜
を通して流される。次に、酵素標識したウサギ抗ヒトＩ
ｇＧ抗体を通して流し、さらに洗浄液を、通して流す。
最後に、標識した酵素に対する基質を含んだ溶液を加
え、そして、ＥＬＩＳＡ法と同様に色の変化を生成させ
る。
【００３５】ラテックス凝集反応アッセイでは、抗原調
製物は、ラテックスビーズに吸着させられる。次に、生
物学的試料をスライド上でラテックスビーズと共に直接
インキュベートする。短い時間の後に、Ｈ．ｐｙｌｏｒ
ｉ抗原に対する抗体の存在を示す、架橋あるいは凝集し
たラテックスビーズの存在により反応を調べる。
製物は、ラテックスビーズに吸着させられる。次に、生
物学的試料をスライド上でラテックスビーズと共に直接
インキュベートする。短い時間の後に、Ｈ．ｐｙｌｏｒ
ｉ抗原に対する抗体の存在を示す、架橋あるいは凝集し
たラテックスビーズの存在により反応を調べる。
【００３６】キット：本発明はさらに、上述の抗原調製
物を含んだキットにも使用できる。そしてこのキット
は、上述の本発明の方法を実施するために使用し得る。
物を含んだキットにも使用できる。そしてこのキット
は、上述の本発明の方法を実施するために使用し得る。
【００３７】好適な実施態様では、このキットには、上
述のように調製された抗原調製物が含まれ、そして、固
相担体に固定され、血清学的アッセイに使用される。
述のように調製された抗原調製物が含まれ、そして、固
相担体に固定され、血清学的アッセイに使用される。
【００３８】以下の実施例は、本発明を説明するためで
あり、その範囲を制限することを意図したものではな
い。
あり、その範囲を制限することを意図したものではな
い。
【００３９】
（実施例１） 生育および抽出の方法 〔Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの生育〕ウシ胎児血清を補ったＢｒ
ｕｃｅｌｌａ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ製）をＨ．ｐｙｌｏｒｉ生育用培地として
用い、３５℃で、ＣＯ2、Ｏ2、およびＮ2の混合ガス中
で、培養した。生育培地の試料２０ｍｌに、１ｍｌの凍
結保存したＨ．ｐｙｌｏｒｉを接種し、培養し、そして
次の４８時間から７２時間の間に１Ｌの生育用培地に拡
大し、８ｘ１０7 ＣＦＵ（コロニー形成単位）／ｍｌ
から１０ｘ１０7 ＣＦＵ／ｍｌとした。中速度の遠心
分離で細胞を回収し、脱イオン水で洗浄し、そして中速
度の遠心分離で細胞をペレット化し、１ｍｇの湿細胞ペ
レット当り１ｘ１０6細胞を得た。
ｕｃｅｌｌａ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ製）をＨ．ｐｙｌｏｒｉ生育用培地として
用い、３５℃で、ＣＯ2、Ｏ2、およびＮ2の混合ガス中
で、培養した。生育培地の試料２０ｍｌに、１ｍｌの凍
結保存したＨ．ｐｙｌｏｒｉを接種し、培養し、そして
次の４８時間から７２時間の間に１Ｌの生育用培地に拡
大し、８ｘ１０7 ＣＦＵ（コロニー形成単位）／ｍｌ
から１０ｘ１０7 ＣＦＵ／ｍｌとした。中速度の遠心
分離で細胞を回収し、脱イオン水で洗浄し、そして中速
度の遠心分離で細胞をペレット化し、１ｍｇの湿細胞ペ
レット当り１ｘ１０6細胞を得た。
【００４０】〔Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ細胞からの超音波処理
した抽出物 〕超音波処理したＨ．ｐｙｌｏｒｉからの
抗原抽出物である調製は、ＰｅｒｅｚらがＡｎｎ．Ｉｎ
ｔ．Ｍｅｄ． １０９：１１ （１９８８）に記述した
ものと同様である。中速度の遠心分離による最初の細胞
回収の後、この細胞を無菌の等張食塩水で三回洗浄し
た。最終の細胞ペレットは、１ｍｌの脱イオン水当り、
１０ｍｇ（湿重量）の細胞の濃度で懸濁した。典型的に
は、１０ｍｌから１５ｍｌの細胞懸濁液をアイスバスで
冷却しながら、Ｍｏｄｅｌ ３００ ＳｏｎｉｃＤｉｓ
ｍｅｍｂｒａｔｏｒ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ Ｃｏ．，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， ＰＡ）を用
い、マイクロチップを装着して二回、２分間の最大出力
で破砕した。得られた超音波処理物は、−７０℃で凍結
し、次に解凍し、そして上記のように遠心分離した。こ
の上清を回収し、そして２８０ｎｍの吸光度を読みタン
パク含量を見積った。
した抽出物 〕超音波処理したＨ．ｐｙｌｏｒｉからの
抗原抽出物である調製は、ＰｅｒｅｚらがＡｎｎ．Ｉｎ
ｔ．Ｍｅｄ． １０９：１１ （１９８８）に記述した
ものと同様である。中速度の遠心分離による最初の細胞
回収の後、この細胞を無菌の等張食塩水で三回洗浄し
た。最終の細胞ペレットは、１ｍｌの脱イオン水当り、
１０ｍｇ（湿重量）の細胞の濃度で懸濁した。典型的に
は、１０ｍｌから１５ｍｌの細胞懸濁液をアイスバスで
冷却しながら、Ｍｏｄｅｌ ３００ ＳｏｎｉｃＤｉｓ
ｍｅｍｂｒａｔｏｒ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ Ｃｏ．，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， ＰＡ）を用
い、マイクロチップを装着して二回、２分間の最大出力
で破砕した。得られた超音波処理物は、−７０℃で凍結
し、次に解凍し、そして上記のように遠心分離した。こ
の上清を回収し、そして２８０ｎｍの吸光度を読みタン
パク含量を見積った。
【００４１】〔Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ細胞からのグリシン抽
出物〕抗原の酸性グリシン抽出物の調製は、Ｂｌａｓｅ
ｒおよびＤｕｎｃａｎが、Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕ
ｎ． ４４：２９２ （１９８４）に記述した、Ｃ．ｊ
ｅｊｕｎｉのものと同様であった。中速度の遠心分離に
よる最初の細胞回収の後、この細胞を無菌の等張食塩水
で三回洗浄し、２５℃で、１ｍｌのバッファー当り１０
ｍｇ（湿重量）の細胞の濃度で、０．２Ｍのグリシン−
塩酸バッファー（ｐＨ２．２）に懸濁した。１５分後
に、細胞懸濁液を再び遠心分離した。この上清を回収
し、１２キロダルトンから１４キロダルトンの分子量の
カットオフのチューブに入れ、冷水中で一晩透析した。
この保留物を回収し、そして２８０ｎｍの吸光度を読み
タンパク含量を見積った。
出物〕抗原の酸性グリシン抽出物の調製は、Ｂｌａｓｅ
ｒおよびＤｕｎｃａｎが、Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕ
ｎ． ４４：２９２ （１９８４）に記述した、Ｃ．ｊ
ｅｊｕｎｉのものと同様であった。中速度の遠心分離に
よる最初の細胞回収の後、この細胞を無菌の等張食塩水
で三回洗浄し、２５℃で、１ｍｌのバッファー当り１０
ｍｇ（湿重量）の細胞の濃度で、０．２Ｍのグリシン−
塩酸バッファー（ｐＨ２．２）に懸濁した。１５分後
に、細胞懸濁液を再び遠心分離した。この上清を回収
し、１２キロダルトンから１４キロダルトンの分子量の
カットオフのチューブに入れ、冷水中で一晩透析した。
この保留物を回収し、そして２８０ｎｍの吸光度を読み
タンパク含量を見積った。
【００４２】〔Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ細胞のｎ−オクチル−
β−Ｄ−グルコピラノシド（ＢＯＧ）抽出〕典型的な実
験においては、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ培養物は中速度の遠心
分離によって細胞回収し、そしてこの細胞を無菌の脱イ
オン水に二回懸濁することにより洗浄し、次いで遠心分
離した。最終の細胞ペレットは、アジ化ナトリウムおよ
び１％（ｗ／ｖ）のｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラ
ノシド（ＢＯＧ）を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）
に、１００ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁し、２５℃で、３０
分間インキュベートした。この懸濁液を、１２キロダル
トンから１４キロダルトンの分子量のカットオフのチュ
ーブに入れ、アジ化ナトリウムを含むＰＢＳで４℃で一
晩透析し、そして中速で遠心分離した。この上清を回収
し、そして２８０ｎｍの吸光度を読み、抽出物中のタン
パク含量を見積った。
β−Ｄ−グルコピラノシド（ＢＯＧ）抽出〕典型的な実
験においては、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ培養物は中速度の遠心
分離によって細胞回収し、そしてこの細胞を無菌の脱イ
オン水に二回懸濁することにより洗浄し、次いで遠心分
離した。最終の細胞ペレットは、アジ化ナトリウムおよ
び１％（ｗ／ｖ）のｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラ
ノシド（ＢＯＧ）を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）
に、１００ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁し、２５℃で、３０
分間インキュベートした。この懸濁液を、１２キロダル
トンから１４キロダルトンの分子量のカットオフのチュ
ーブに入れ、アジ化ナトリウムを含むＰＢＳで４℃で一
晩透析し、そして中速で遠心分離した。この上清を回収
し、そして２８０ｎｍの吸光度を読み、抽出物中のタン
パク含量を見積った。
【００４３】（実施例２） 〔Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ抗原のＢＯＧ抽出物の調製および分
析〕上述のＢＯＧ抽出物を、０．０２５％（ｗ／ｖ）の
アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−塩酸バッ
ファー（ｐＨ８．０）で平衡化した６ＦＦ−セファロー
ズ樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）に入れた。７０個のフ
ラクション（それぞれがカラムの容量の２％に等しい）
を回収し、そして２８０ｎｍの吸光度でモニターした。
ＢＯＧ抽出物の典型的なフラクションプロフィールを図
１に示す。
析〕上述のＢＯＧ抽出物を、０．０２５％（ｗ／ｖ）の
アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−塩酸バッ
ファー（ｐＨ８．０）で平衡化した６ＦＦ−セファロー
ズ樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）に入れた。７０個のフ
ラクション（それぞれがカラムの容量の２％に等しい）
を回収し、そして２８０ｎｍの吸光度でモニターした。
ＢＯＧ抽出物の典型的なフラクションプロフィールを図
１に示す。
【００４４】図１のフラクションプロフィールには５つ
の識別可能な成分が認められる： （１）プールＡ（フラクション１７から１９を含む）
は、最初の高分子量ピークであり、そしてＨ．ｐｙｌｏ
ｒｉのウレアーゼ活性は殆どない；（２）プールＢ（フ
ラクション２０から３３）は、「ピークの谷」にあり、
そしてウレアーゼ活性の大部分を有している；（３）プ
ールＣ（フラクション３４から５２）は低分子量の低ウ
レアーゼタンパクを含んでいる；（４）プールＤ（フラ
クション５３から５８）第二のタンパクピークの下り坂
部分である；そして最後の（５）プールＥ（フラクショ
ン５９から６３）は、第二のピークのテーリング端であ
り低分子量である。
の識別可能な成分が認められる： （１）プールＡ（フラクション１７から１９を含む）
は、最初の高分子量ピークであり、そしてＨ．ｐｙｌｏ
ｒｉのウレアーゼ活性は殆どない；（２）プールＢ（フ
ラクション２０から３３）は、「ピークの谷」にあり、
そしてウレアーゼ活性の大部分を有している；（３）プ
ールＣ（フラクション３４から５２）は低分子量の低ウ
レアーゼタンパクを含んでいる；（４）プールＤ（フラ
クション５３から５８）第二のタンパクピークの下り坂
部分である；そして最後の（５）プールＥ（フラクショ
ン５９から６３）は、第二のピークのテーリング端であ
り低分子量である。
【００４５】これらのフラクションは、０．１％（ｗ／
ｖ）のＳＤＳの存在下で、０．１５ｘ１２ｘ１５ｃｍの
ゲル［１２％（ｗ／ｖ）のアクリルアミドと、０．３２
％（ｗ／ｖ）のＮ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミド］
の還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うことにより分析した。
低分子量および高分子量のタンパク標準物質（ＢｉｏＲ
ａｄ Ｌａｂｓ製）をフラクション試料と共に電気泳動
した。電気泳動は、トラッキング染料（確認物質）であ
るブロモフェノールブルーがゲルの下端に移動するまで
（２．５時間から３時間）２５ｍＡ／ｐｌａｔｅ（スタ
ッキングゲル）あるいは４０ｍＡ／ｐｌａｔｅ（ランニ
ングゲル）で行われた。次にゲルを、５０％（ｖ／ｖ）
のメタノールと１０％（ｖ／ｖ）の酢酸に溶解した、
０．２％（ｗ／ｖ）のクーマシーブリリアントブルーＲ
２５０で６０分間染色し、そして最後に、５０％（ｖ／
ｖ）のメタノールと１０％（ｖ／ｖ）の酢酸で脱色し
た。
ｖ）のＳＤＳの存在下で、０．１５ｘ１２ｘ１５ｃｍの
ゲル［１２％（ｗ／ｖ）のアクリルアミドと、０．３２
％（ｗ／ｖ）のＮ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミド］
の還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うことにより分析した。
低分子量および高分子量のタンパク標準物質（ＢｉｏＲ
ａｄ Ｌａｂｓ製）をフラクション試料と共に電気泳動
した。電気泳動は、トラッキング染料（確認物質）であ
るブロモフェノールブルーがゲルの下端に移動するまで
（２．５時間から３時間）２５ｍＡ／ｐｌａｔｅ（スタ
ッキングゲル）あるいは４０ｍＡ／ｐｌａｔｅ（ランニ
ングゲル）で行われた。次にゲルを、５０％（ｖ／ｖ）
のメタノールと１０％（ｖ／ｖ）の酢酸に溶解した、
０．２％（ｗ／ｖ）のクーマシーブリリアントブルーＲ
２５０で６０分間染色し、そして最後に、５０％（ｖ／
ｖ）のメタノールと１０％（ｖ／ｖ）の酢酸で脱色し
た。
【００４６】Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ細胞のＢＯＧ抽出物の６
ＦＦセファローズ分画した後に得られる、プールしたＡ
からＥのフラクション（前に定義した）のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ分析により、表１のように、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ特異
的抗原および共通抗原に関して濃縮されている範囲が示
されている。プールＡおよびＢの高分子量の抗原（ＭＷ
＞２００，０００）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に必要と
される消化および還元の結果、低分子量のバンド（ＭＷ
＜１２０，０００）として、還元型ＰＡＧＥゲル上に出
現する。
ＦＦセファローズ分画した後に得られる、プールしたＡ
からＥのフラクション（前に定義した）のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ分析により、表１のように、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ特異
的抗原および共通抗原に関して濃縮されている範囲が示
されている。プールＡおよびＢの高分子量の抗原（ＭＷ
＞２００，０００）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に必要と
される消化および還元の結果、低分子量のバンド（ＭＷ
＜１２０，０００）として、還元型ＰＡＧＥゲル上に出
現する。
【００４７】
【表１】
【００４８】表１は、プールＣがＨ．ｐｙｌｏｒｉ特異
抗原に相対的に富んでいることを示している。
抗原に相対的に富んでいることを示している。
【００４９】各フラクションのウレアーゼ活性は、Ｍｏ
ｂｌｅｙらが、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ． （１９８
６） ５４：１６１−１６９に記述した方法の変法によ
り測定し、ウレアーゼ触媒による尿素の加水分解により
生成したアンモニアにより起こるｐＨの変化の測定を包
含している。各フラクションのアリコート５０μｌを、
ウレアーゼ基質バッファー（１０ｍＭの尿素、４．５ｍ
Ｍのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．８）、７０
μｇ／ｍｌのフェノールレッド）７８０μｌに加え、そ
して、この混合物を室温で３０分間インキュベートし
た。つぎに、１００μｌのアリコートの５５０ｎｍでの
光学密度（ＯＤ）を、ＭＲ ７００型のマイクロタイタ
ープレートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）を用いて測定した。特異的ウレアーゼ活
性は、ＯＤ550／Ａ280の比で表現された。図１は、ＢＯ
Ｇ抽出物の２８０ｎｍにおける６ＦＦセファローズフラ
クションプロフィール、および、プールＢおよびＣの特
異的ウレアーゼ活性、を示している。
ｂｌｅｙらが、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ． （１９８
６） ５４：１６１−１６９に記述した方法の変法によ
り測定し、ウレアーゼ触媒による尿素の加水分解により
生成したアンモニアにより起こるｐＨの変化の測定を包
含している。各フラクションのアリコート５０μｌを、
ウレアーゼ基質バッファー（１０ｍＭの尿素、４．５ｍ
Ｍのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．８）、７０
μｇ／ｍｌのフェノールレッド）７８０μｌに加え、そ
して、この混合物を室温で３０分間インキュベートし
た。つぎに、１００μｌのアリコートの５５０ｎｍでの
光学密度（ＯＤ）を、ＭＲ ７００型のマイクロタイタ
ープレートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）を用いて測定した。特異的ウレアーゼ活
性は、ＯＤ550／Ａ280の比で表現された。図１は、ＢＯ
Ｇ抽出物の２８０ｎｍにおける６ＦＦセファローズフラ
クションプロフィール、および、プールＢおよびＣの特
異的ウレアーゼ活性、を示している。
【００５０】（実施例３） 〔プールＢ、プールＣおよび他の抗原の比較〕 この実施例は以下に記述する様に、ウレアーゼ活性の大
部分を含むプールＢ（フラクション２０から３３）、お
よび低ウレアーゼ活性のプールＣ（３４−５２）を、ヒ
ト血清中の抗−Ｈ．ｐｙｌｏｒｉＩｇＧ抗体の検出能力
に関して比較している。
部分を含むプールＢ（フラクション２０から３３）、お
よび低ウレアーゼ活性のプールＣ（３４−５２）を、ヒ
ト血清中の抗−Ｈ．ｐｙｌｏｒｉＩｇＧ抗体の検出能力
に関して比較している。
【００５１】〔患者血清標本〕胃生検の培養および組織
学的検査の結果から、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ陽性あるいは陰
性のいづれかであると判断された個体からの、血清およ
び血漿標本を、胃腸科の病院で集めた。これらの試料
は、臨床的に診断された胃腸病の症候によりさらに細分
類された。
学的検査の結果から、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ陽性あるいは陰
性のいづれかであると判断された個体からの、血清およ
び血漿標本を、胃腸科の病院で集めた。これらの試料
は、臨床的に診断された胃腸病の症候によりさらに細分
類された。
【００５２】〔Ｈ．ｐｙｌｏｒｉのフロースルーＥＩＡ
アッセイ〕吸着材パッドから構成される固相の部品構成
物を容器の鋳型底に置き、さらに、１平方インチの８Ｓ
レーヨン、および１．２μ Ｂｉｏｄｙｎｅ Ａナイロ
ン膜を置いた。このナイロン膜に、抗原スポット用溶液
で希釈したＨ．ｐｙｌｏｒｉ抽出物をスポットし、次い
で、アジ化ナトリウムを含んだＰＢＳで希釈したヒトＩ
ｇＧをスポットした。この膜を、アルキル化したＢＳＡ
溶液を用いて室温で３０分間ブロックし、次に、４５℃
で１０から２０分間乾燥した。スポットされた領域を可
視部分の中央になるようにしながら、処理したナイロン
の上に容器の鋳型の蓋を置き、そして、ソニックで溶着
させた。予備（前）フィルター部品を、溶着されたユニ
ットに挿入し、乾燥剤を含む箔の小袋にいれ、加熱シー
ルした。
アッセイ〕吸着材パッドから構成される固相の部品構成
物を容器の鋳型底に置き、さらに、１平方インチの８Ｓ
レーヨン、および１．２μ Ｂｉｏｄｙｎｅ Ａナイロ
ン膜を置いた。このナイロン膜に、抗原スポット用溶液
で希釈したＨ．ｐｙｌｏｒｉ抽出物をスポットし、次い
で、アジ化ナトリウムを含んだＰＢＳで希釈したヒトＩ
ｇＧをスポットした。この膜を、アルキル化したＢＳＡ
溶液を用いて室温で３０分間ブロックし、次に、４５℃
で１０から２０分間乾燥した。スポットされた領域を可
視部分の中央になるようにしながら、処理したナイロン
の上に容器の鋳型の蓋を置き、そして、ソニックで溶着
させた。予備（前）フィルター部品を、溶着されたユニ
ットに挿入し、乾燥剤を含む箔の小袋にいれ、加熱シー
ルした。
【００５３】〔ラピッドフロスルーＥＩＡアッセイ用の
試験方法〕患者試料（血清あるいは血漿のいづれか）
を、３０μｌのキャピラリーの分注装置を用いて、１５
０μｌの試料希釈液の入ったプラスチックカップに入れ
た。希釈した試料を、上述のアッセイ用器材に入れ、そ
して、フィルターを完全に通り流れる様にした。次に、
アルカリフォスファターゼ結合ウサギ抗ヒトＩｇＧを加
え、再び完全に通り流れる様にした。フィルターを、
０．５ｍｌの洗浄溶液で洗浄し、そして、このカートリ
ッジ（器材）に３−インドキシルフォスフェート溶液
（発色基質）を２１０μｌ加えた。５分間インキュベー
トした後に、試験を終了させるために、この膜を完全に
洗浄した。次に、以下の判断基準を用いて、免疫アッセ
イの結果を１５分以内に読みとった：「陰性結果」は、
膜の中央を交差する青いネガティブバーの出現により示
された。「陽性結果」は、膜上の対照のネガティブバー
の上に載った全体が青い円の出現によって示された。青
いバーおよび全体が青い円の両者の欠如は、試験が解釈
不能であることを示し、試験を再度行わなければならな
い。
試験方法〕患者試料（血清あるいは血漿のいづれか）
を、３０μｌのキャピラリーの分注装置を用いて、１５
０μｌの試料希釈液の入ったプラスチックカップに入れ
た。希釈した試料を、上述のアッセイ用器材に入れ、そ
して、フィルターを完全に通り流れる様にした。次に、
アルカリフォスファターゼ結合ウサギ抗ヒトＩｇＧを加
え、再び完全に通り流れる様にした。フィルターを、
０．５ｍｌの洗浄溶液で洗浄し、そして、このカートリ
ッジ（器材）に３−インドキシルフォスフェート溶液
（発色基質）を２１０μｌ加えた。５分間インキュベー
トした後に、試験を終了させるために、この膜を完全に
洗浄した。次に、以下の判断基準を用いて、免疫アッセ
イの結果を１５分以内に読みとった：「陰性結果」は、
膜の中央を交差する青いネガティブバーの出現により示
された。「陽性結果」は、膜上の対照のネガティブバー
の上に載った全体が青い円の出現によって示された。青
いバーおよび全体が青い円の両者の欠如は、試験が解釈
不能であることを示し、試験を再度行わなければならな
い。
【００５４】〔ヒト血清中のＨ．Ｐｙｌｏｒｉに対する
抗体を検出するための、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ抗原抽出物の
プールＣの適性〕ヒト血清標本に対する擬陽性の頻度を
調べるために、異なる抗原調製物に対しラピッドＥＩＡ
を用いた。使用した抗原調製物は上述の：ＢＯＧ抗原抽
出物のプールＡおよびＣ；および超音波処理物、および
グリシン抽出物、である。結果は表２に表した。
抗体を検出するための、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ抗原抽出物の
プールＣの適性〕ヒト血清標本に対する擬陽性の頻度を
調べるために、異なる抗原調製物に対しラピッドＥＩＡ
を用いた。使用した抗原調製物は上述の：ＢＯＧ抗原抽
出物のプールＡおよびＣ；および超音波処理物、および
グリシン抽出物、である。結果は表２に表した。
【００５５】
【表２】
【００５６】ＢＯＧ抗原抽出物のプールＣが、最も低い
頻度の擬陽性（１４％に対し、他の抗原抽出物は４１％
から７７％）であることがみて取れる。
頻度の擬陽性（１４％に対し、他の抗原抽出物は４１％
から７７％）であることがみて取れる。
【００５７】〔ＢＯＧ抗原抽出物のプールＣを用いた
Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉに対する抗体のヒト血清に対する精度
相関検討〕１８３の血清および血漿標本が、３つの胃腸
科病院から集められた。ＢＯＧ抗原抽出物のプールＣ
を、ラピッドＥＩＡアッセイに用いた。試験結果は、ア
ッセイを終了後即座に視覚的に判定した。結果の一致し
ない標本は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに対するＩｇＧ抗体を検
出する、ＢｉｏｍｅｔｒａマイクロタイターＥＬＩＳＡ
テストにより試験した。
Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉに対する抗体のヒト血清に対する精度
相関検討〕１８３の血清および血漿標本が、３つの胃腸
科病院から集められた。ＢＯＧ抗原抽出物のプールＣ
を、ラピッドＥＩＡアッセイに用いた。試験結果は、ア
ッセイを終了後即座に視覚的に判定した。結果の一致し
ない標本は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに対するＩｇＧ抗体を検
出する、ＢｉｏｍｅｔｒａマイクロタイターＥＬＩＳＡ
テストにより試験した。
【００５８】培養、および組織学的試験結果に対する、
本アッセイ結果の相関を、表３に表す。
本アッセイ結果の相関を、表３に表す。
【００５９】
【表３】
【００６０】一致しない結果の標本は、Ｂｉｏｍｅｔｒ
ａＥＬＩＳＡ試験を用いて、感染陽性あるいは感染陰性
を確認した（表４）。
ａＥＬＩＳＡ試験を用いて、感染陽性あるいは感染陰性
を確認した（表４）。
【００６１】
【表４】
【００６２】培養および組織学的試験で陰性であり、ラ
ピッドＥＩＡ試験で陽性の、血清の１５のうち１４が、
ＢｉｏｍｅｔｒａＥＬＩＳＡ試験により、陽性であるこ
とが確認された。これらの補正によりラピッドＥＩＡ試
験は、感度および特異性が、それぞれ、９６％および９
９％であることが示された（表５）。
ピッドＥＩＡ試験で陽性の、血清の１５のうち１４が、
ＢｉｏｍｅｔｒａＥＬＩＳＡ試験により、陽性であるこ
とが確認された。これらの補正によりラピッドＥＩＡ試
験は、感度および特異性が、それぞれ、９６％および９
９％であることが示された（表５）。
【００６３】
【表５】
【００６４】 〔ヒト血清中のＨ．ｐｙｌｏｒｉに対する抗体を検出す
るための「ウレアーゼに 富んだ」抗原抽出物とプールＣとの、適性に関する比
較〕 「ウレアーゼに富んだ」抗原調製物（プールＢ）は、Ｅ
ｖａｎｓらの、米国特許第４，８８２，２７１号に記述
されている様に調製した。そして、ラピッドＥＩＡ試験
において、ヒト血清中のＨ．ｐｙｌｏｒｉに対するＩｇ
Ｇ抗体を検出する能力を「低ウレアーゼ」のプールＣ抗
原と比較した。表６に、ヒト血清標本で得られた結果を
示す。
るための「ウレアーゼに 富んだ」抗原抽出物とプールＣとの、適性に関する比
較〕 「ウレアーゼに富んだ」抗原調製物（プールＢ）は、Ｅ
ｖａｎｓらの、米国特許第４，８８２，２７１号に記述
されている様に調製した。そして、ラピッドＥＩＡ試験
において、ヒト血清中のＨ．ｐｙｌｏｒｉに対するＩｇ
Ｇ抗体を検出する能力を「低ウレアーゼ」のプールＣ抗
原と比較した。表６に、ヒト血清標本で得られた結果を
示す。
【００６５】
【表６】
【００６６】表６は、低ウレアーゼのプールＣ抗原は、
ウレアーゼに富んだＥｖａｎｓの抗原調製物よりも低い
頻度での擬陽性があることを示している（各々、６％に
対して、２５％である）。
ウレアーゼに富んだＥｖａｎｓの抗原調製物よりも低い
頻度での擬陽性があることを示している（各々、６％に
対して、２５％である）。
【００６７】（実施例４） ４つの異なるＨ．ｐｙｌｏｒｉ抗原調製物（プールＡ、
プールＣ、（低ウレアーゼ）、超音波処理物、およびグ
リシン抽出物）と、ヒト血清標本に関する培養および組
織学的データとを、マイクロタイターＥＬＩＳＡのフォ
ーマットで比較した。
プールＣ、（低ウレアーゼ）、超音波処理物、およびグ
リシン抽出物）と、ヒト血清標本に関する培養および組
織学的データとを、マイクロタイターＥＬＩＳＡのフォ
ーマットで比較した。
【００６８】〔Ｈ．ｐｙｌｏｒｉのＥＩＡマイクロタイ
ターアッセイ〕９６穴の、平底の、集合させたマイクロ
タイタープレートを、４℃で一晩、最適化された濃度の
４種の抗原でコートした。抗原溶液を除去した後、この
プレートを、空気乾燥し、そして、袋にいれた。免疫ア
ッセイを行うために、このウェルを、室温でマイクロタ
イター洗浄溶液（０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２
０および０．０１％（ｗ／ｖ）のＴｈｉｍｅｒｏｓａｌ
を含んだＰＢＳ）の３００μｌで再水和した。次に、こ
の溶液を除去し、引き続く工程を２５℃で行った。ＢＳ
Ａを含んだＰＢＳで１００倍に希釈された血清標本を、
ウェルに入れ（１００μｌ／ウェル）、そして３０分間
インキュベートした。このプレートを、各３００μｌの
洗浄溶液で５回洗浄し、そして、ペルオキシダーゼ結合
ウサギ抗ヒトＩｇＧと３０分間インキュベートした。こ
のプレートを再度、各３００μｌの洗浄溶液で５回洗浄
し、そして、２，２’−アミノ−ビス（３−エチルベン
ズチアゾリンスルフォン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴ
Ｓ）および過酸化水素から構成される新しく調製された
基質溶液と１５分間インキュベートする。０．２５Ｍの
シュウ酸５０μｌを加えて、反応を停止させ、そして、
ＭＲ７００プレートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で、４１０ｎｍの吸光度を読ん
だ。
ターアッセイ〕９６穴の、平底の、集合させたマイクロ
タイタープレートを、４℃で一晩、最適化された濃度の
４種の抗原でコートした。抗原溶液を除去した後、この
プレートを、空気乾燥し、そして、袋にいれた。免疫ア
ッセイを行うために、このウェルを、室温でマイクロタ
イター洗浄溶液（０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２
０および０．０１％（ｗ／ｖ）のＴｈｉｍｅｒｏｓａｌ
を含んだＰＢＳ）の３００μｌで再水和した。次に、こ
の溶液を除去し、引き続く工程を２５℃で行った。ＢＳ
Ａを含んだＰＢＳで１００倍に希釈された血清標本を、
ウェルに入れ（１００μｌ／ウェル）、そして３０分間
インキュベートした。このプレートを、各３００μｌの
洗浄溶液で５回洗浄し、そして、ペルオキシダーゼ結合
ウサギ抗ヒトＩｇＧと３０分間インキュベートした。こ
のプレートを再度、各３００μｌの洗浄溶液で５回洗浄
し、そして、２，２’−アミノ−ビス（３−エチルベン
ズチアゾリンスルフォン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴ
Ｓ）および過酸化水素から構成される新しく調製された
基質溶液と１５分間インキュベートする。０．２５Ｍの
シュウ酸５０μｌを加えて、反応を停止させ、そして、
ＭＲ７００プレートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で、４１０ｎｍの吸光度を読ん
だ。
【００６９】表７に表した結果は、試験した他の抗原調
製物と比較して、プールＣは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ 陽
性、およびＨ．ｐｙｌｏｒｉ陰性のヒト血清の同定する
のに、特異性および感度において、優れていることが示
されている。
製物と比較して、プールＣは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ 陽
性、およびＨ．ｐｙｌｏｒｉ陰性のヒト血清の同定する
のに、特異性および感度において、優れていることが示
されている。
【００７０】
【表７】
【００７１】生物学的試料中のＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅ
ｒ ｐｙｌｏｒｉを検出するための、高感度および特異
的な抗原調製物が開示されている。この調製物は、界面
活性剤で可溶化されたＨ．ｐｙｌｏｒｉ細胞の分子量−
排除型クロマトグラフィーから得られた一連の抗原を用
いている。この改良された抗原調製物を利用した、ＥＬ
ＩＳＡ、ラテックス凝集法、およびラピッドＥＩＡアッ
セイの様な血清学的アッセイ、およびこれらの血清学的
アッセイに用いるためのキットもまた開示されている。
ｒ ｐｙｌｏｒｉを検出するための、高感度および特異
的な抗原調製物が開示されている。この調製物は、界面
活性剤で可溶化されたＨ．ｐｙｌｏｒｉ細胞の分子量−
排除型クロマトグラフィーから得られた一連の抗原を用
いている。この改良された抗原調製物を利用した、ＥＬ
ＩＳＡ、ラテックス凝集法、およびラピッドＥＩＡアッ
セイの様な血清学的アッセイ、およびこれらの血清学的
アッセイに用いるためのキットもまた開示されている。
【図１】ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｂ
ＯＧ）抽出されたＨ．ｐｙｌｏｒｉ抗原の、６ＦＦセフ
ァローズカラムによる典型的なフラクションプロフィー
ル（分画チャート）、およびプールしたフラクションの
ウレアーゼ活性を示している。
ＯＧ）抽出されたＨ．ｐｙｌｏｒｉ抗原の、６ＦＦセフ
ァローズカラムによる典型的なフラクションプロフィー
ル（分画チャート）、およびプールしたフラクションの
ウレアーゼ活性を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (73)特許権者 591270970 10165 ＭｃＫｅｌｌａｒ Ｃｏｕｒｔ, Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏ ｒｎｉａ 92121， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓ ｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 ジャン ダブリュー． ポウラック アメリカ合衆国 カリフォルニア 92007，カーディフ，カミニト セプテ ィモ 1203 (72)発明者 クリスティー エス． コンドン アメリカ合衆国 カリフォルニア 92122，サンディエゴ，カミノ ラポサ 7842 (56)参考文献 特開 平２−35096（ＪＰ，Ａ) 国際公開89／8843（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/569 A61K 39/02 ACJ G01N 33/53 C12P 21/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (9)
- 【請求項１】 Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒ
ｉ抗体の存在を検出するために有用なＨ．ｐｙｌｏｒｉ
由来のタンパク質を含む組成物であって： 該組成物は、ウレアーゼによって触媒されるアッセイに
おいて、ＯＤ550／Ａ280の値が０．３４未満であるウレ
アーゼ特異的活性を有し、そして該組成物中の該Ｈ．ｐ
ｙｌｏｒｉ由来のタンパクが、変性および還元された場
合に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、１２０ｋＤ；６６ｋ
Ｄ；６２ｋＤ；５９ｋＤ；５２ｋＤ；および３１ｋＤの
分子量のＨ．ｐｙｌｏｒｉに特異的な抗原、ならびに８
９ｋＤ；７３ｋＤ；５６ｋＤ；４５ｋＤ；４２ｋＤ；２
９ｋＤ；２５ｋＤ；２１ｋＤおよび１６ｋＤの分子量の
共通抗原からなると特徴付けられ、 そして６６ｋＤおよび５６ｋＤの抗原の量が、上記に示
される残りの個々の抗原のいずれの量よりも多い、組成
物。 - 【請求項２】 請求項１に記載のＨｅｌｉｃｏｂａｃｔ
ｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のタンパクを含む組成物であっ
て、ここで該Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ由来タンパクが、ｎ−オ
クチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＢＯＧ）を用いて
インタクトなＨ．ｐｙｌｏｒｉ細胞を抽出して抽出物を
得る工程；該抽出物をサイジングカラムクロマトグラフ
ィーに供して画分を得る工程；および該サイジングカラ
ムクロマトグラフィーによって決定される約２００ｋＤ
未満の分子量を有する画分を回収して、ウレアーゼ活性
の大部分を含む高分子量タンパクピークを排除する工
程、によって得られ得る、組成物。 - 【請求項３】 生物学的試料中のＨｅｌｉｃｏｂａｃｔ
ｅｒ ｐｙｌｏｒｉ感染から生じる抗体の存在を検出す
るための方法であって、該方法は、以下の工程： （ａ）該試料を、請求項１または２のいずれかに記載の
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ由来のタンパクを含む組成物と接触さ
せる工程； （ｂ）該試料および該組成物が、該試料中に含まれる任
意の抗体についての抗原抗体複合体を形成することを可
能にする工程；および （ｃ）Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ感染の
存在を示す任意の抗原抗体複合体の存在を検出する工
程、 を包含する、方法。 - 【請求項４】 請求項３に記載の方法であって、工程
（ｂ）において、前記抗原複合体が、酵素結合免疫吸着
アッセイ、放射免疫アッセイ、補体固定法、間接赤血球
凝集反応、ラテックス凝集反応、ラピッドフロースルー
アッセイ、およびラテラルフローアッセイ、 から構成される群から選択される方法によって検出され
る、方法。 - 【請求項５】 生物学的試料中の感染から生じるＨｅｌ
ｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ抗体の存在を検出する
ための方法であって、該方法は、以下： （ａ）請求項１または２のいずれかに記載のＨ．ｐｙｌ
ｏｒｉ由来のタンパクを含む組成物を固定化および乾燥
させる工程； （ｂ）乾燥した抗原複合体を、該試料と共にインキュベ
ートし、抗原抗体複合体を形成する工程； （ｃ）酵素を結合した抗ヒトＩｇＧ抗体を、該抗原抗体
複合体に加え、そしてインキュベートし標識化複合体を
形成する工程； （ｄ）該結合された酵素に対する基質を、該標識化複合
体に加え、発色複合体を形成する工程；そして （ｅ）該発色複合体を、該基質の変化についてモニター
して、該試料中に存在するＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ
ｐｙｌｏｒｉに対する抗体の量を決定する工程、 を包含する、検出方法。 - 【請求項６】 工程（ｃ）において、前記抗ヒトＩｇＧ
抗体が、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合されてい
る、請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 生物学的試料中のＨｅｌｉｃｏｂａｃｔ
ｅｒ ｐｙｌｏｒｉ感染に応答して形成される抗体の存
在を決定するためのキットであって、該キットは、請求
項１または２のいずれかに記載のＨ．ｐｙｌｏｒｉ由来
のタンパクを含む組成物を含む、キット。 - 【請求項８】 前記抗原性組成物が、固体支持体上に固
定されている、請求項７に記載のキット。 - 【請求項９】 請求項１に記載の組成物を得るための方
法であって、以下： ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＢＯＧ）で
インタクトなＨ．ｐｙｌｏｒｉ細胞を抽出して、抽出物
を得る工程；該抽出物をサイジングカラムクロマトグラ
フィーに供して、画分を得る工程；および該サイジング
カラムクロマトグラフィーによって決定される約２００
ｋＤ未満の分子量を有する画分を回収して、ウレアーゼ
活性の大部分を含む高分子量タンパクピークを排除する
工程、 を包含する、方法。
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